DE112009002048T5

DE112009002048T5 - Nukleinsäure, die Desaturasen kodieren, und modifiziertes Planzenöl

Info

Publication number: DE112009002048T5
Application number: DE112009002048T
Authority: DE
Inventors: Dr. Bauer Jörg; Dr. Senger Toralf; Dr. Zank Thorsten; Prof. Dr. Qiu Xiao; Dr. Wu Guohai
Original assignee: Bioriginal Food and Science Corp; BASF Plant Science GmbH
Current assignee: Bioriginal Food and Science Corp; BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-08-26
Filing date: 2009-08-25
Publication date: 2012-01-26
Also published as: EP2331695B1; US9090902B2; CA2734810A1; AU2017228560C1; JP5757870B2; AU2017228560A1; AU2009286755B2; AU2016200386A1; EP2331695A2; WO2010023202A3; US20110162105A1; AU2017228560B2; AU2016200386B2; AU2009286755A1; CA2734810C; JP2012500640A; WO2010023202A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die von Drechslera tritici-repentis, Cylindorcarpoodorum, Microdochium nivalae und Periplaneta americana stammen. Die Erfindung betrifft auch die einzelnen kodierenden Sequenzen und Proteine, die von diesen Sequenzen kodiert werden, in Kombination mit anderen Sequenzen sowie ein Verfahren zur Umwandlung von Ölsäure in Linolsäure und die Herstellung von Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure in einer Pflanze.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die von Drechslera tritici-repentis, Cylindorcarpon herteronema, Diploida natalensis, Microdochium nivalae, Periplaneta americana und Stagonospora nodorum stammen. Die Erfindung betrifft auch die einzelnen kodierenden Sequenzen und Proteine, die von diesen Sequenzen kodiert werden, in Kombination mit anderen Sequenzen sowie ein Verfahren zur Umwandlung von Ölsäure in Linolsäure und die Herstellung von Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und/oder Docosahexaensäure.
Fettsäuren und Triacylglyceride finden zahlreiche Anwendungen in der Nahrungsmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und auf dem pharmakologischen Sektor. Je nachdem, ob es sich um freie gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren oder auch Triacylglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, eignen sie sich für sehr verschiedene Anwendungen. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren, wie Linolsäure und Linolensäure, sind essenziell für Säuger, weil diese sie nicht selbst herstellen können. Mehrfach ungesättigte ω3-Fettsäuren und ω6-Fettsäuren sind deshalb ein wichtiger Bestandteil in der tierischen und menschlichen Ernährung.
Im Folgenden werden mehrfach ungesättigte Fettsäuren als PUFA, PUFAs, LCPUFA oder LCPUFAs (mehrfach ungesättigte Fettsäuren, engl. poly unsaturated fatty acids, PUFA, langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren, engl. long chain poly unsaturated fatty acids, LCPUFA) bezeichnet.
Die verschiedenen Fettsäuren und Triglyceride werden hauptsächlich aus Mikroorganismen, wie Mortierella und Schizochytrium, oder aus ölproduzierenden Pflanzen, wie Sojabohne, Raps, Algen, wie Crypthecodinium oder Phaeodactylum, und anderen erhalten, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride (= Triglyceride = engl. triglycerols) erhalten werden. Sie können jedoch auch aus Tieren, wie zum Beispiel Fisch, erhalten werden. Die freien Fettsäuren werden vorteilhafterweise durch Hydrolyse hergestellt. Sehr langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren, wie Docosahexaensäure (= DHA, C22:6^{Δ4,7,10,13,16,19}), Eicosapentaensäure (= EPA, C20:5^{Δ5,8,11,14,17}), Arachidonsäure (= ARA, C20:4^Δ5,8,11,14), Dihomo-γ-linolensäure (C20:3^Δ8,11,14) oder Docosapentaensäure (DPA, C22:5^{Δ7,10,13,16,19}), werden in Ölpflanzen, wie Raps, Sojabohne, Sonnenblume oder Färberdistel, nicht synthetisiert. Herkömmliche natürliche Quellen für diese Fettsäuren sind Fische, wie Hering, Lachs, Sardine, Rotbarsch, Aal, Karpfen, Forelle, Heilbutt, Makrele, Zander oder Thunfisch, oder Algen.
Je nach der beabsichtigten Verwendung sind Öle mit gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren bevorzugt. Bei der menschlichen Ernährung sind zum Beispiel Lipide mit ungesättigten Fettsäuren, insbesondere mehrfach ungesättigten Fettsäuren, bevorzugt. Den mehrfach ungesättigten ω3-Fettsäuren wird nachgesagt, dass sie eine positive Wirkung auf den Cholesterinspiegel im Blut und somit auf die Möglichkeit, Herzkrankheiten zu verhindern, haben. Das Risiko für Herzkrankheiten, Schlaganfall oder Bluthochdruck kann durch Zugabe dieser ω3-Fettsäuren zur Nahrung deutlich verringert werden. ω3-Fettsäuren haben zudem eine positive Wirkung auf entzündliche, insbesondere chronisch entzündliche, Vorgänge in Verbindung mit Immunkrankheiten, wie rheumatoider Arthritis. Deshalb werden sie zu Nahrungsmitteln, insbesondere zu diätetischen Nahrungsmitteln, hinzugefügt oder in Arzneimitteln eingesetzt. ω6-Fettsäuren, wie Arachidonsäure, haben aufgrund unserer normalen Aufnahme mit der Nahrung eine Tendenz zu einer negativen Wirkung auf diese Störungen in Zusammenhang mit diesen rheumatischen Erkrankungen.
ω3- und ω6-Fettsäuren sind Vorläufer von Gewebshormonen, die man als Eicosanoide kennt, wie die Prostaglandine, die von Dihomo-γ-linolensäure, Arachidonsäure und Eicosapentaensäure stammen, und die Thromboxane und Leukotriene, die von Arachidonsäure und Eicosapentaensäure herrühren. Eicosanoide, die aus ω6-Fettsäuren gebildet werden, (als PG₂-Reihe bekannt) fördern in der Regel Entzündungsreaktionen, während Eicosanoide aus ω3-Fettsäuren (als PG₃-Reihe bekannt) wenig oder keine proinflammatorische Wirkung besitzen.
Aufgrund der positiven Eigenschaften der mehrfach ungesättigten Fettsäuren gab es in der Vergangenheit keinen Mangel an Versuchen, Gene, die an der Synthese dieser Fettsäuren oder Triglyceride beteiligt sind, für die Herstellung von Ölen mit einem modifizierten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren in verschiedenen Organismen verfügbar zu machen. So beschreiben die WO 91/13972 und ihr US-Äquivalent eine Δ9-Desaturase. WO 93/11245 beansprucht eine Δ15-Desaturase und WO 94/11516 eine Δ12-Desaturase. Weitere Desaturasen werden zum Beispiel in EP–A-0 550 162 , WO 94/18337 , WO 97/30582 , WO 97/21340 , WO 95/18222 , EP-A-0 794 250 , Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144–20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200–203 oder Huang et al., Lipids 34, 1999: 649–659 beschrieben. Die biochemische Charakterisierung der verschiedenen Desaturasen ist jedoch bis heute unzureichend, weil die Enzyme, die membrangebundene Proteine sind, bei ihrer Isolation und Charakterisierung große Schwierigkeiten bereiten (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141–12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777–792). In der Regel werden membrangebundene Desaturasen charakterisiert, indem sie in einen geeigneten Organismus eingebracht werden, der anschließend hinsichtlich seiner Enzymaktivität analysiert wird, indem man die Ausgangsmaterialien und die Produkte analysiert. Δ6–Desaturasen werden in WO 93/06712 , US 5,614,393 , US5614393 , WO 96/21022 , WO 00/21557 und WO 99/27111 beschrieben und die Anwendung für die Herstellung von Fettsäuren in transgenen Organismen ist in WO 98/46763 , WO 98/46764 und WO 98/46765 beschrieben. In diesem Zusammenhang ist die Expression verschiedener Desaturasen und die Bildung mehrfach ungesättigter Fettsäuren auch in WO 99/64616 oder WO 98/46776 beschrieben und beansprucht. Hinsichtlich der Expressionseffizienz von Desaturasen und ihrer Wirkung auf die Bildung mehrfach ungesättigter Fettsäuren muss darauf hingewiesen werden, dass die bis heute beschriebene Expression einer einzigen Desaturase nur zu niedrigen Gehalten an ungesättigten Fettsäuren/Lipiden, wie zum Beispiel γ-Linolensäure und Stearidonsäure, geführt hat. Außerdem wurde in der Regel ein Gemisch von ω3- und ω6-Fettsäuren erhalten.
Besonders geeignete Mikroorganismen für die Herstellung von PUFAs sind Mikroalgen, wie Phaeodactylum tricornutum, Porphiridium-Spezies, Thraustochytrium-Spezies, Schizochytrium-Spezies oder Crypthecodinium-Spezies, Ciliaten, wie Stylonychia oder Colpidium, Pilze, wie Mortierella, Entomophthora oder Mucor, und/oder Moose, wie Physcomitrella, Ceratodon und Marchantia (R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553–558; K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060–1062; M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and Biotechnology 73: 269–278). Stammselektion führte zur Entwicklung einer Reihe von Mutantenstämmen der in Frage kommenden Mikroorganismen, die eine Reihe wünschenswerter Verbindungen, einschließlich PUFAs, produzieren. Die Mutation und Selektion von Stämmen mit verbesserter Produktion eines bestimmten Moleküls, wie der mehrfach ungesättigten Fettsäuren, ist jedoch ein zeitraubendes und schwieriges Verfahren. Aus diesem Grund sind Rekombinationsverfahren, wie vorstehend beschrieben, wann immer möglich bevorzugt.
Eine Vielzahl von Synthesewegen wird für die Synthese von Arachidonsäure, Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) diskutiert (1). So werden EPA oder DHA in Meeresbakterien, wie Vibrio sp. oder Shewanella sp., über den Polyketid-Weg produziert (Yu, R. et al. Lipids 35: 1061–1064, 2000; Takeyama, H. et al. Microbiology 143: 2725–2731, 1997).
Eine alternative Strategie ist die abwechselnde Aktivität von Desaturasen und Elongasen (Zank, T. K. et al. Plant Journal 31: 255–268, 2002; Sakuradani, E. et al., Gene 238: 445–453, 1999). Eine Modifikation des vorstehend beschriebenen Wegs über Δ6-Desaturase, Δ6-Elongase, Δ5-Desaturase, Δ5-Elongase und Δ4-Desaturase ist der Sprecher-Weg (Sprecher 2000, Biochim. Biophys. Acta 1486: 219–231) bei Säugern. Anstelle der Δ4-Desaturierung wird hier ein weiterer Elongationsschritt durchgeführt, wobei C₂₄ erhalten wird, gefolgt von einer weiteren Δ6-Desaturierung und schließlich β-Oxidation, so dass die Kettenlänge C₂₂ erhalten wird. Der so genannte Sprecher-Weg (siehe 1) ist jedoch nicht für die Produktion in Pflanzen und Mikroorganismen geeignet, weil die Regulationsmechanismen nicht bekannt sind.
Je nach ihrem Desaturierungsmuster lassen sich die mehrfach ungesättigten Fettsäuren in zwei große Klassen unterteilen, nämlich ω6- oder ω3-Fettsäuren, die sich hinsichtlich ihrer metabolischen und funktionellen Aktivitäten unterscheiden (1).
Das Ausgangsmaterial für den ω6-Stoffwechselweg ist die Fettsäure Linolsäure (18:2^Δ9,12), wohingegen der ω3-Weg über Linolensäure (18:3^Δ9,12,15) abläuft. Linolensäure wird durch die Aktivität einer ω3-Desaturase gebildet (Tocher et al. 1998, Prog. Lipid Res. 37, 73–117; Domergue et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105–4113).
Säuger und somit auch Menschen besitzen keine entsprechende Desaturase-Aktivität (Δ12- und ω3-Desaturase) und müssen diese Fettsäuren (essenzielle Fettsäuren) über die Nahrung aufnehmen. Ausgehend von diesen Vorstufen werden die physiologisch wichtigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren Arachidonsäure (= ARA, 20:4^Δ5,8,11,14), eine ω6-Fettsäure, und die beiden ω3-Fettsäuren Eicosapentaensäure (= EPA, 20:5^{Δ5,8,11,14,17}) und Docosahexaensäure (DHA, 22:6^{Δ4,7,10,13,17,19}) über die Abfolge von Desaturase- und Elongase-Reaktionen synthetisiert. Die Applikation von ω3-Fettsäuren zeigt die vorstehend beschriebene therapeutische Aktivität bei der Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen (Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, 100–108), Entzündungen (Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 345–358) und Arthritis (Cleland und James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305–2307).
Die Elongation von Fettsäuren durch Elongasen um 2 oder 4 C-Atome ist für die Herstellung von C₂₀- bzw. C₂₂-PUFAs von entscheidender Bedeutung. Dieser Vorgang verläuft über 4 Schritte. Der erste Schritt ist die Kondensation von Malonyl-CoA mit dem Fettsäure-Acyl-CoA durch Ketoacyl-CoA-Synthase (KCS, im Folgenden als Elongase bezeichnet). Darauf folgt ein Reduktionsschritt (Ketoacyl-CoA-Reduktase, KCR), ein Wasserabspaltungsschritt (Dehydratase) und ein abschließender Reduktionsschritt (Enoyl-CoA-Reduktase). Man hat postuliert, dass die Elongase-Aktivität die Spezifität und die Geschwindigkeit des gesamten Vorgangs beeinflusst (Millar und Kunst, 1997 Plant Journal 12: 121–131).
In der Vergangenheit gab es eine Reihe von Versuchen, Elongase-Gene zu erhalten. Millar und Kunst, 1997 (Plant Journal 12: 121–131) und Millar et al. 1999, (Plant Cell 11: 825–838) beschreiben die Charakterisierung von Pflanzen-Elongasen für die Synthese einfach ungesättigter langkettiger Fettsäuren (C22:1) und für die Synthese sehr langkettiger Fettsäuren für die Bildung von Wachsen in Pflanzen (C₂₈-C₃₂). Beschreibungen hinsichtlich der Synthese von Arachidonsäure und EPA findet man zum Beispiel in WO0159128 , WO0012720 , WO02077213 und WO0208401 . Die Synthese mehrfach ungesättigter C₂₄-Fettsäuren ist zum Beispiel in Tvrdik et al. 2000, JCB 149: 707–717 oder der WO0244320 beschrieben.
Höhere Pflanzen umfassen mehrfach ungesättigte Fettsäuren, wie Linolsäure (18:2^Δ9,12) und Linolensäure (18:3^Δ9,12,15). ARA, EPA und DHA werden überhaupt nicht oder nur in winzigen Mengen im Samenöl höherer Pflanzen gefunden (E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales [Neues Wörterbuch der Pflanzenöle]. Technique & Documentation – Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0). Die Herstellung von LCPUFAs in höheren Pflanzen, vorzugsweise in Ölpflanzen, wie Raps, Lein, Sonnenblume und Sojabohnen, wäre jedoch vorteilhaft, weil große Mengen qualitativ hochwertiger LCPUFAs für die Nahrungsmittelindustrie, die Tierernährung und für pharmazeutische Zwecke ökonomisch erhalten werden könnten. Zu diesem Zweck ist es vorteilhaft, wenn man in Ölpflanzen Gene, die Enzyme der LCPUFA-Biosynthese kodieren, über Rekombinationsverfahren einbringt und sie darin exprimiert. Diese Gene können vorteilhafterweise aus Mikroorganismen und niederen Pflanzen isoliert werden, die LCPUFAs produzieren und sie in die Membranen oder in Triacylglyceride einbauen. So ist es bereits gelungen, Δ6-Desaturase-Gene aus dem Moos Physcomitrella patens und Δ6-Elongase-Gene aus P. patens und dem Nematoden C. elegans zu isolieren.
Die ersten transgenen Pflanzen, die Gene umfassen und exprimieren, die LCPUFA-Biosynthese-Enzyme kodieren, und die folglich LCPUFAs produzieren, wurden erstmals zum Beispiel in WO2003/064638 , WO2003/093482 (Verfahren für die Herstellung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Pflanzen) beschrieben. Diese Pflanzen produzieren jedoch LCPUFAs in Mengen, die eine weitere Optimierung für die Verarbeitung der Öle, die in den Pflanzen vorhanden sind, erforderlich machen. Steigerungen der PUFA-Spiegel wurden in WO2004/071467 für die Sojabohne und in WO2005/083093 für Brassica juncea demonstriert.
Obwohl die Biotechnologie einen attraktiven Weg für die Herstellung von PUFA bietet, sind die derzeitigen Techniken kein effizientes Mittel für die Produktion im großen Maßstab. Demnach besteht ein Bedarf an einem verbesserten und effizienten Verfahren für die Herstellung von PUFA, wie ARA, EPA und DHA.
Die technische Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, lässt sich als die Bereitstellung von Mitteln und Verfahren ansehen, die den vorstehend genannten Bedarf erfüllen. Die technische Aufgabe wird durch die Ausführungsformen gelöst, die in den Ansprüchen und hier nachstehend charakterisiert sind.
Somit zieht die vorliegende Erfindung im Prinzip Nukleinsäuremoleküle in Betracht, die neue Desaturasen aus den Pilzen Drechslera tritici-repentis, Cylindrocarpon heteronema, Diplodia natalensis, Microdochium nivalae, Periplaneta americana und Stagonospora nodorum kodieren. Insbesondere sind die Drechslera tritici-repentis-delta-12-Desaturase, die Diplodia natalensis-delta-12-Desaturase, die Microdochium nivalae-delta-12-Desaturase, die Periplaneta americana-delta-12-Desaturase und die Stagonospora nodorum-delta-12-Desaturase, weiterhin die Cylindrocarpon heteronema-delta-15-Desaturase und die Microdochium nivalae-d12-Desaturase identifiziert worden. Außerdem wird die Verwendung dieser Nukleinsäuren bei dem Verfahren zur Herstellung hoher Spiegel an ARA, EPA und DHA bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Polynukleotide, die eine Nukleinsäure umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

a) einer Nukleinsäure mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer der SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35 oder 37 dargestellt;
b) einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie in einer der SEQ ID Nr.: 2, 4, 6, 8, 32, 34, 36, oder 38 dargestellt, kodiert;
c) einer Nukleinsäure mit einer Nukleinsäuresequenz, die mindestens 60% identisch zu der Nukleinsäuresequenz, wie in einer der SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35 oder 37 dargestellt, ist, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit Desaturase-Aktivität kodiert;
d) einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens 74,1% identisch zu der Aminosäuresequenz ist, die in einer der SEQ ID Nr.: 2, 4, 6, 8, 32, 34, 36, oder 38 dargestellt ist, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit Desaturase-Aktivität kodiert;
e) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine Nukleinsäure gemäß a) bis d) hybridisiert, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit Desaturase-Aktivität kodiert;
f) einer Nukleinsäure, die ein Fragment eines Polypeptids, das von einer Nukleinsäuresequenz gemäß a) bis e) kodiert wird, mit Desaturase-Aktivität kodiert; und
g) einer Nukleinsäure, die mindestens 15 aufeinander folgende Nukleotide einer Nukleinsäure gemäß a) bis f) umfasst.

Der Begriff ”Polynukleotid”, wie er hier verwendet wird, betrifft Nukleinsäuremoleküle, die entweder DNA oder RNA sind, sowie chemisch modifizierte Derivate davon, z. B. biotinylierte oder methylierte Nukleinsäuremoleküle. DNA, wie hier verwendet, schließt cDNA und genomische DNA ein. Die Polynukleotide können linear oder zirkulär sowie einzel- oder doppelsträngig sein.
Erfindungsgemäß hat man herausgefunden, dass die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Polynukleotide Polypeptide kodieren, die Desaturase-Aktivität besitzen, d. h. Desaturasen sind.
Der Begriff ”Desaturase” betrifft eine enzymatische Aktivität, die allgemein die Einführung von Doppelbindungen in Kohlenhydrate ermöglicht. Erfindungsgemäß werden besonders Desaturasen bevorzugt, die eine Doppelbindung an Position 12 oder 15 in eine Fettsäure einführen. Stärker bevorzugt ist die erfindungsgemäß angegebene Desaturase-Aktivität deshalb eine delta-12- oder delta-15-Desaturase-Aktivität. Am stärksten bevorzugt ermöglicht die delta-12- oder delta-15-Desaturase die Umwandlung von Substraten in Produkte, wie nachstehend in den beigefügten Figuren dargestellt. Insbesondere kodieren Polynukleotide, die Nukleinsäuren mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer der SEQ ID Nr.: 2, 6, 8, 32, oder 34 dargestellt, oder Varianten davon, wie vorstehend angegeben, umfassen, vorzugsweise Desaturasen, die eine delta-12-Desaturase-Aktivität aufweisen, wohingegen Polynukleotide, die Nukleinsäuren mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer der SEQ ID Nr.: 4 dargestellt, oder Varianten davon, wie vorstehend angegeben, umfassen, vorzugsweise Desaturasen kodieren, die eine delta-15-Desaturase-Aktivität aufweisen. Polynukleotide, die das Polypeptid gemäß den SEQ ID Nr.: 36 oder 38 kodieren, oder die vorstehend erwähnten Varianten davon kodieren Desaturase-Enzyme. Ein Polypeptid, das von einem Polynukleotid kodiert wird, kann vorzugsweise hinsichtlich seiner Desaturase-Aktivität getestet werden, wie nachstehend in den beigefügten Beispielen beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide umfassen auch Polynukleotidvarianten derjenigen, die vorstehend anhand spezifischer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen beschrieben werden. Diese Polynukleotidvarianten schließen Homologe, vorzugsweise allelische Varianten, Paraloge oder Orthologe ein. Solche Polynukleotidvarianten umfassen vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, die dadurch charakterisiert ist, dass die Sequenz von den vorstehend erwähnten spezifischen Nukleinsäuresequenzen, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35 oder 37 gezeigt sind, durch mindestens eine Nukleotidsubstitution, -addition und/oder -deletion abgeleitet sein kann, wobei die Nukleinsäuresequenzvariante immer noch ein Polypeptid mit Desaturase-Aktivität, wie vorstehend angegeben, kodieren soll. Varianten umfassen auch Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die in der Lage ist, mit den vorstehend erwähnten spezifischen Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, zu hybridisieren. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6 finden. Ein bevorzugtes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungsbedingungen in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (= SSC) bei etwa 65°C, vorzugsweise gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65°C. Der Fachmann weiß, dass diese Hybridisierungsbedingungen sich je nach dem Typ der Nukleinsäure und, wenn zum Beispiel organische Lösungsmittel vorliegen, im Hinblick auf die Temperatur und Konzentration des Puffers unterscheiden. Zum Beispiel unterscheidet sich unter ”Standard-Hybridisierungsbedingungen” die Temperatur je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42°C und 58°C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 × SSC (pH 7,2). Wenn organisches Lösungsmittel in dem vorstehend genannten Puffer vorliegt, zum Beispiel 50% Formamid, beträgt die Temperatur unter Standardbedingungen etwa 42°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride sind vorzugsweise 0,1 × SSC und 20°C bis 45°C, vorzugsweise zwischen 30°C und 45°C. Die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA Hybride sind vorzugsweise 0,1 × SSC und 30°C bis 55°C, vorzugsweise zwischen 45°C und 55°C. Die vorstehend genannten Hybridisierungstemperaturen werden zum Beispiel für eine Nukleinsäure mit etwa 100 bp (= Basenpaare) Länge und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie man die erforderlichen Hybridisierungsbedingungen bestimmt, indem er sich auf Lehrbücher, wie das vorstehend genannte Lehrbuch, oder die folgenden Lehrbücher bezieht: Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames und Higgins (Hrsg.) 1985, "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsg.) 1991, "Essential Molecular Biology: A Practical Approach", IRL Press at Oxford University Press, Oxford. Alternativ sind Nukleinsäuremolekülvarianten durch Techniken auf PCR-Basis, wie DNA-Amplifikation auf Basis gemischter Oligonukleotid-Primer, d. h. unter Verwendung von degenerierten Primern gegen konservierte Domänen der erfindungsgemäßen Polypeptide, erhältlich. Konservierte Domänen des erfindungsgemäßen Polypeptids können durch einen Sequenzvergleich der Nukleinsäuresequenz des Nukleinsäuremoleküls oder der Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Polypeptids mit anderen Desaturase-Sequenzen identifiziert werden, siehe auch 2, nachstehend. Als PCR-Primer geeignete Oligonukleotide sowie geeignete PCR-Bedingungen werden in den beigefügten Beispielen beschrieben. Als Matrize kann DNA oder cDNA aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen oder Tieren verwendet werden. Weiterhin schließen Varianten Nukleinsäuremoleküle ein, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die mindestens 74,1%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 86%, mindestens 87%, mindestens 88%, mindestens 89%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% identisch zu den in SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35 oder 37 gezeigten Nukleinsäuresequenzen sind und die Desaturase-Aktivität beibehalten. Außerdem werden auch Nukleinsäuremoleküle umfasst, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die Aminosäuresequenzen kodieren, die mindestens 74,1%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 86%, mindestens 87%, mindestens 88%, mindestens 89%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% identisch zu den in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 32, 34, 36 oder 38 gezeigten Aminosäuresequenzen sind, wobei das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz umfasst, Desaturase-Aktivität beibehält. Die prozentualen Identitätswerte werden vorzugsweise über den gesamten Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzbereich berechnet. Eine Reihe von Programmen, die auf einer Vielzahl von Algorithmen basieren, ist für den Fachmann für den Vergleich verschiedener Sequenzen verfügbar. In diesem Zusammenhang liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Zur Durchführung der Sequenzalignments sollten das Programm PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351–360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151–153) oder die Programme Gap und BestFit (Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443–453 (1970)) und Smith und Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482–489 (1981))), die Teil des GCG-Softwarepakets [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991)] sind, verwendet werden. Die vorstehend in Prozent (%) genannten Sequenzidentitätswerte sollten vorzugsweise unter Verwendung des Programms GAP über den gesamten Sequenzbereich mit den folgenden Einstellungen bestimmt werden: Lückengewicht: 50, Längengewicht: 3, durchschnittlicher Match: 10.000 und durchschnittlicher Mismatch: 0.000, was immer als Standard-Einstellungen für Sequenzalignments verwendet werden soll, wenn nicht anders angegeben.
Ein Polynukleotid, das ein biologisch aktives Fragment des Polypeptids kodiert, das von den vorstehend erwähnten erfindungsgemäßen Polynukleotiden kodiert wird, d. h. ein Fragment, das Desaturase-Aktivität aufweist, wie vorstehend angegeben, wird ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. Folglich kann das Polypeptid die Domänen des erfindungsgemäßen Polypeptids, die die biologische Aktivität verleihen, umfassen oder daraus bestehen. Ein Fragment, wie hier gemeint, umfasst vorzugsweise mindestens 15, mindestens 20, mindestens 50, mindestens 100, mindestens 250 oder mindestens 500 aufeinander folgende Nukleotide von einer der vorstehend erwähnten Nukleinsäuresequenzen oder kodiert eine Aminosäuresequenz, die mindestens 5, mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 50, mindestens 80, mindestens 100 oder mindestens 150 aufeinander folgende Aminosäuren von einer der vorstehend erwähnten Aminosäuresequenzen umfasst.
Die vorstehend beschriebenen Polynukleotidvarianten kodieren vorzugsweise Polypeptide, die mindestens 10%, mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% oder mindestens 90% der Desaturase-Aktivität, die das in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 oder 32, 34, 36 oder 38 dargestellte Polypeptid aufweist, beibehalten. Die Aktivität kann getestet werden, wie in den beigefügten Beispielen beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle bestehen entweder im Wesentlichen aus den vorstehend erwähnten Nukleinsäuresequenzen oder umfassen die vorstehend erwähnten Nukleinsäuresequenzen. So können sie auch weitere Nukleinsäuresequenzen enthalten. Vorzugsweise kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül weitere untranslatierte Sequenz am 3'- und am 5'-Terminus der kodierenden Genregion umfassen: mindestens 500, vorzugsweise 200, stärker bevorzugt 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5'-Terminus der kodierenden Region und mindestens 100, vorzugsweise 50, stärker bevorzugt 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Terminus der kodierenden Genregion. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül Fusionsproteine kodieren, wobei ein Partner des Fusionsproteins ein Polypeptid ist, das von einer vorstehend genannten Nukleinsäuresequenz kodiert wird, und der andere Partner des Fusionsproteins ein heterologes Polypeptid ist. Solche Fusionsproteine können als zusätzlichen Teil andere Enzyme des Fettsäure- oder Lipid-Biosynthesewegs, Polypeptide zur Überwachung der Expression (z. B. grün, gelb, blau oder rot fluoreszierende Proteine, alkalische Phosphatase und dergleichen) oder so genannte ”Tags” umfassen, die als nachweisbarer Marker oder als ein zusätzliches Mittel zu Reinigungszwecken dienen können. Tags für die verschiedenen Zwecke sind im Stand der Technik bekannt und umfassen FLAG-Tags, 6-Histidin-Tags, MYC-Tags und dergleichen.
Polynukleotidvarianten, auf die erfindungsgemäß verwiesen wird, können aus verschiedenen natürlichen sowie künstlichen Quellen erhalten werden. Zum Beispiel können Nukleinsäuremoleküle durch in vitro- und in vivo-Mutagenese-Ansätze unter Verwendung der vorstehend genannten spezifischen Nukleinsäuremoleküle als Basis erhalten werden. Außerdem können Nukleinsäuremoleküle, die Homologe oder Orthologe sind, aus verschiedenen Tier-, Pflanzen- oder Pilz-Spezies erhalten werden. Vorzugsweise werden sie aus Pflanzen, wie Algen, zum Beispiel Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus oder Crypthecodinium, Algen/Diatomeen, wie Phaeodactylum oder Thraustochytrium, Moosen, wie Physcomitrella oder Ceratodon, oder höheren Pflanzen, wie den Primulaceae, wie Aleuritia, Calendula stellata, Osteospermum spinescens oder Osteospermum hyoseroides, Mikroorganismen, wie Pilzen, wie Aspergillus, Thraustochytrium, Phytophthora, Entomophthora, Mucor, Drechslera, Diplodia, Microdochium, Periplaneta, Stagonospora, Cylindrocarpon, Microdochium oder Mortierella, Bakterien, wie Shewanella, Hefen oder Tieren erhalten. Bevorzugte Tiere sind Nematoden, wie Caenorhabditis, Insekten oder Vertebraten. Unter den Vertebraten können die Nukleinsäuremoleküle vorzugsweise von Euteleostomi, Actinopterygii; Neopterygii; Teleostei; Euteleostei, Protacanthopterygii, Salmoniformes; Salmonidae oder Oncorhynchus, stärker bevorzugt, aus der Ordnung der Salmoniformes, am stärksten bevorzugt der Familie der Salmonidae, wie der Gattung Salmo, zum Beispiel aus den Gattungen und Spezies Oncorhynchus mykiss, Trutta trutta oder Salmo trutta fario, stammen. Außerdem können die Nukleinsäuremoleküle aus Diatomeen, wie der Gsttung Thallasiosira oder Crypthecodinium, erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide sollen vorzugsweise entweder als isoliertes (d. h. aus seinem natürlichen Zusammenhang, wie einem Genlocus isoliertes) Nukleinsäuremolekül oder in genetisch modifizierter Form bereitgestellt werden. Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül kann zum Beispiel weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nukleotidsequenzen, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure herrührt, flankieren, umfassen. Das Nukleinsäuremolekül ist vorzugsweise doppel- oder einzelsträngige DNA, einschließlich cDNA oder RNA. Der Begriff umfasst einzel- sowie doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle. Außerdem werden auch chemisch modifizierte Nukleinsäuremoleküle, einschließlich natürlicherweise vorkommender modifizierter Nukleinsäuremoleküle, wie glykosylierter oder methylierter Nukleinsäuremoleküle, oder künstlich modifizierter, wie biotinylierter Nukleinsäuremoleküle, mit umfasst.
Insbesondere sind Polynukleotide, die Polypeptide mit einer Δ12-Desaturase kodieren, Varianten des Polynukleotids, das eine solche Desaturase kodiert und in SEQ ID Nr.: 1 gezeigt ist, wobei die Varianten Polypeptide kodieren, die auf Aminosäureebene mindestens 75,1% Identität zu der SEQ ID Nr.: 2 aufweisen.
Außerdem sind Polynukleotide, die Polypeptide mit einer Δ15-Desaturase kodieren, Varianten des Polynukleotids, das eine solche Desaturase kodiert und in SEQ ID Nr.: 3 gezeigt ist, wobei die Varianten Polypeptide kodieren, die auf Aminosäureebene mindestens 74,1% Identität zu der SEQ ID Nr.: 4 aufweisen.
Außerdem sind Polynukleotide, die Polypeptide mit einer Δ12-Desaturase kodieren, Varianten des Polynukleotids, das eine solche Desaturase kodiert und in SEQ ID Nr.: 5 gezeigt ist, wobei die Varianten Polypeptide kodieren, die auf Aminosäureebene mindestens 74,1% Identität zu der SEQ ID Nr.: 6 aufweisen.
Außerdem sind Polynukleotide, die Polypeptide mit einer Δ12-Desaturase kodieren, Varianten des Polynukleotids, das eine solche Desaturase kodiert und in SEQ ID Nr.: 7 gezeigt ist, wobei die Varianten Polypeptide kodieren, die auf Aminosäureebene mindestens 95% Identität zu der SEQ ID Nr.: 8 aufweisen.
Außerdem sind Polynukleotide, die Polypeptide mit einer Δ12-Desaturase kodieren, Varianten des Polynukleotids, das eine solche Desaturase kodiert und in SEQ ID Nr.: 31 gezeigt ist, wobei die Varianten Polypeptide kodieren, die auf Aminosäureebene mindestens 75% Identität zu der SEQ ID Nr.: 32 aufweisen.
Außerdem sind Polynukleotide, die Polypeptide mit einer Δ15-Desaturase kodieren, Varianten des Polynukleotids, das eine solche Desaturase kodiert und in SEQ ID Nr.: 33 gezeigt ist, wobei die Varianten Polypeptide kodieren, die auf Aminosäureebene mindestens 75% Identität zu der SEQ ID Nr.: 34 aufweisen.
Außerdem sind Polynukleotide, die Polypeptide mit einer Desaturase kodieren, Varianten des Polynukleotids, das eine solche Desaturase kodiert und in SEQ ID Nr.: 35 oder 37 gezeigt ist, wobei die Varianten Polypeptide kodieren, die auf Aminosäureebene mindestens 75% Identität zu der SEQ ID Nr.: 36 bzw. 38 aufweisen.

In den Studien, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegen, wurden vorteilhafterweise Polynukleotide identifiziert, die neue Desaturasen aus verschiedenen Pilzen kodieren, die für die Herstellung von PUFAs und LCPUFAs, wie hier angegeben, angewendet werden können. Einen Überblick über die Desaturasen gibt die folgende Tabelle:

Bezeichnung	Organismus	Aktivität	SEQ ID Nr.
D12Des(Dt)	Drechslera tritici-repentis	D12-Desaturase	1
D15Des(Cyh)	Cylindrocarpon heteronema	D15-Desaturase	3
D12Des(Dn)	Diplodia natalensis	D12-Desaturase	5
D12Des(Sn)	Stagonospora nodorum	D12-Desaturase	7
D12Des(Mn)	Microdochium nivalae	D12-Desaturase	31
D15Des(Mn)	Microdochium nivalae	D15-Desaturase	33
dXDes(Pa)	Periplaneta americana	Desaturase	35
dXDes(Pa)_2	Periplaneta americana	Desaturase	37

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polynukleotidvarianten, die von den erfindungsgemäßen Polynukleotiden stammen und in der Lage sind, die Transkription oder Translation der erfindungsgemäßen Polynukleotide zu stören. Solche Polynukleotidvarianten schließen Antisense-Nukleinsäuren, Ribozyme, siRNA-Moleküle, Morpholino-Nukleinsäuren (Phosphordiamidat-Morpholino-Oligos), eine Dreifachhelix bildende Oligonukleotide, inhibitorische Oligonukleotide oder mikro-RNA-Moleküle ein, die sämtlich das erfindungsgemäße Polynukleotid spezifisch erkennen sollen. Diese Techniken sind dem Fachmann bekannt. Geeignete Polynukleotidvarianten der vorstehend erwähnten Art können leicht auf Basis der Struktur der erfindungsgemäßen Polynukleotide gestaltet werden.
Die vorliegende Erfindung zieht auch Polynukleotide in Betracht, die Acyltransferasen kodieren. Für eine weitere Erhöhung spezieller Fettsäuren, wie ARA, EPA und/oder DHA, oder für die Erhöhung der Gesamtproduktion an neuen Fettsäuren sind solche Acyltransferasen nützlich. Diese Enzyme sind daran beteiligt, verschiedene Fettsäuren aus ihren jeweiligen Produktionspools (Phospholipide, Acyl-CoA) zu verschieben oder die neuen Fettsäuren mit verschiedenen Molekülen (Diacylglycerin, Lysophosphatidsäure, Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerin, Lysophosphatidylinositol, Lysophosphatidylserin, 1-Acylphosphatidylcholin usw.) zu verestern. Wie die Enzyme anzuwenden sind, ist in den beigefügten Beispielen und z. B. in WO2004/076617 oder WO2004/087902 beschrieben.
Somit zieht die Erfindung Acyltransferase-kodierende Polynukleotide in Betracht, die eine Nukleinsäure umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

a) einer Nukleinsäure mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer der SEQ ID Nr.: 102, 104, 106, 108, 110, 112,135, 137 oder 139 dargestellt;
b) einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz eines Polypeptids kodiert, das von einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer der SEQ ID Nr.: 102, 104, 106, 108, 110, 112, 135, 137 oder 139 dargestellt, kodiert wird;
c) einer Nukleinsäure mit einer Nukleinsäuresequenz, die mindestens 60% identisch zu der in a) angegebenen Nukleinsäuresequenz ist, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit Acyltransferase-Aktivität kodiert;
d) einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens 60% identisch zu der Aminosäuresequenz ist, die von einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer der SEQ ID Nr.: 102, 104, 106, 108, 110, 112, 135, 137 oder 139 dargestellt, kodiert wird, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit Acyltransferase-Aktivität kodiert;
e) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer der Nukleinsäuren gemäß a) bis d) hybridisiert, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit Desaturase-Aktivität kodiert;
f) einer Nukleinsäure, die ein Fragment eines Polypeptids, das von einer der Nukleinsäuresequenzen gemäß a) bis e) kodiert wird, mit Acyltransferase-Aktivität kodiert; und
g) einer Nukleinsäure, die mindestens 15 aufeinander folgende Nukleotide von einer der Nukleinsäuren gemäß a) bis f) umfasst.

Die vorstehend für die erfindungsgemäßen Desaturase-kodierenden Polynukleotide genannten Definitionen gelten mutatis mutandis auch für die Acyltransferase-kodierenden Polynukleotide.
Der Begriff ”Acyltransferase-Aktivität” oder ”Acyltransferase”, wie er hier verwendet wird, umfasst sämtliche enzymatischen Aktivitäten und Enzyme, die in der Lage sind, PUFA und insbesondere LCPUFA durch einen Umesterungsvorgang aus dem AcylCoA-Pool oder den Membranphospholipiden auf die Triglyceride, aus dem Acyl-CoA-Pool auf Membranlipide und aus den Membranlipiden in den Acyl-CoA-Pool zu überführen oder an dieser Überführung beteiligt sind. Es sollte selbstverständlich sein, dass diese Acyltransferase-Aktivität zu einer Erhöhung der mit Triglyceriden, z. B. Samenölen, veresterten LCPUFA führt. Es wird insbesondere in Betracht gezogen, dass diese Acyltransferasen in der Lage sind, Triglyceride mit veresterter ARA, EPA oder sogar DHA herzustellen, oder dass diese Acyltransferasen in der Lage sind, die Synthese von gewünschten PUFA zu verstärken, indem sie den Fluss spezifischer Zwischenprodukte der gewünschten PUFA zwischen dem Acyl-CoA-Pool (der Elongationsstelle) und den Membranlipiden (der hauptsächlichen Stelle der Desaturierung) erhöhen. Insbesondere betrifft Acyltransferase-Aktivität, wie hier verwendet, die Lysophospholipid-Acyltransferase-(LPLAT-)Aktivität, vorzugsweise die Lysophosphophatidylethanolamin-Acyltransferase-(LPEAT-)Aktivität. Insbesondere kodieren die Acyltransferase-kodierenden Nukleinsäuresequenzen, wie in SEQ ID Nr.: 102, 104 und 106 sowie 135, 137 und 139 dargestellt, eine LPLAT-Aktivität. Die Acyltransferase-kodierenden Nukleinsäuresequenzen, wie in SEQ ID Nr.: 108, 110, und 112 gezeigt, kodieren eine LPEAT-Aktivität.
Die erfindungsgemäßen Acyltransferase-Polynukleotide umfassen auch Polynukleotidvarianten derjenigen, die vorstehend durch spezifische Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen beschrieben sind. Diese Polynukleotidvarianten schließen Homologe, vorzugsweise allelische Varianten, Paraloge oder Orthologe, ein. Solche Polynukleotidvarianten umfassen vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, die dadurch charakterisiert ist, dass die Sequenz von den vorstehend erwähnten spezifischen Nukleinsäuresequenzen die in SEQ ID Nr.: 102, 104, 106, 108, 110, 112, 135, 137 oder 139 gezeigt sind, um mindestens eine Nukleotidsubstitution, -addition und/oder -deletion abgeleitet sein kann, wobei die Nukleinsäuresequenzvariante immer noch ein Polypeptid mit Desaturase-Aktivität, wie vorstehend angegeben, kodieren soll. Varianten umfassen auch Nukleinsäuremoleküle, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die in der Lage ist, an die vorstehend erwähnten spezifischen Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, zu hybridisieren. Alternativ sind Nukleinsäuremolekülvarianten durch Techniken auf Basis von PCR, wie hier an anderer Stelle ausgeführt, erhältlich. Weiterhin schließen Varianten Nukleinsäuremoleküle ein, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die mindestens 60%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 86%, mindestens 87%, mindestens 88%, mindestens 89%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% identisch zu den in SEQ ID Nr.: 102, 104, 106, 108, 110, 112, 135, 137 oder 139 gezeigten Nukleinsäuresequenzen sind und Acyltransferase-Aktivität beibehalten. Außerdem werden auch Nukleinsäuremoleküle umfasst, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die Aminosäuresequenzen kodieren, die mindestens 60%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 86%, mindestens 87%, mindestens 88%, mindestens 89%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% identisch mit den Aminosäuresequenzen sind, die von den in SEQ ID Nr.: 102, 104, 106, 108, 110, 112, 135, 137 oder 139 gezeigten Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, wobei das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz umfasst, Acyltransferase-Aktivität beibehält.
Ein Polynukleotid, das ein biologisch aktives Fragment des Polypeptids kodiert, das von den vorstehend erwähnten erfindungsgemäßen Polynukleotiden kodiert wird, d. h. ein Fragment, das Acyltransferase-Aktivität, wie vorstehend angegeben, aufweist, wird ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorstehend beschriebenen Polynukleotidvarianten kodieren vorzugsweise Polypeptide, die mindestens 10%, mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% oder mindestens 90% der Acyltransferase-Aktivität beibehalten, die ein Polypeptid aufweist, das von einer Nukleinsäuresequenz, wie in SEQ ID Nr.: 102, 104, 106, 108, 110, 112, 135, 137 oder 139 gezeigt, kodiert wird. Die Aktivität kann getestet werden, wie in den beigefügten Beispielen beschrieben.
Die vorliegende Erfindung zieht einen Vektor in Betracht, der das erfindungsgemäße Polynukleotid (d. h. die Desaturase- oder Acyltransferase-kodierenden Polynukleotide) umfasst.
Der Begriff ”Vektor” umfasst vorzugsweise Phagen-, Plasmid-, virale oder retrovirale Vektoren sowie künstliche Chromosomen, wie künstliche Bakterien- oder Hefe-Chromosomen. Außerdem betrifft der Begriff auch Zielsteuerungskonstrukte, die eine zufallsgemäße oder stellenspezifische Integration des Zielsteuerungskonstrukts in die genomische DNA gestatten. Solche Zielkonstrukte umfassen vorzugsweise DNA mit einer ausreichenden Länge entweder für die homologe oder die heterologe Rekombination, wie nachstehend im Einzelnen beschrieben. Der Vektor, der das erfindungsgemäße Polynukleotid umfasst, umfasst vorzugsweise weiterhin Selektionsmarker für die Vermehrung und/oder Selektion in einem Wirt. Der Vektor kann in eine Wirtszelle durch verschiedene im Stand der Technik bekannte Techniken eingebracht werden. Wenn er in eine Wirtszelle eingebracht worden ist, kann der Vektor im Cytoplasma verbleiben oder in das Genom eingebaut werden. Im letzteren Fall sollte es selbstverständlich sein, dass der Vektor weiterhin Nukleinsäuresequenzen umfassen kann, die eine homologe Rekombination oder heterologe Insertion gestatten. Vektoren können in prokaryotische oder eukaryotische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingebracht werden. Die Begriffe ”Transformation” und ”Transfektion”, Konjugation und Transduktion, wie sie im vorliegenden Zusammenhang verwendet werden, sollen eine Reihe von Verfahren des Standes der Technik zum Einbringen von fremder Nukleinsäure (zum Beispiel DNA) in eine Wirtszelle umfassen, einschließlich Calciumphosphat-, Rubidiumchlorid- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofektion, natürlicher Kompetenz, Cluster auf Kohlenstoffbasis, chemisch vermitteltem Transfer, Elektroporation oder Partikelbeschuss. Geeignete Verfahren für die Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, lassen sich in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laborhandbüchern, wie Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, finden. Alternativ kann ein Plasmidvektor durch Hitzeschock- oder Elektroporationstechniken eingebracht werden. Sollte der Vektor ein Virus sein, kann dieses in vitro unter Verwendung einer geeigneten Verpackungszelllinie vor dem Aufbringen auf Wirtszellen verpackt werden. Retrovirale Vektoren können replikationskompetent oder replikationsdefizient sein. Im letzteren Fall erfolgt die Virusvermehrung gewöhnlich nur in (einem) komplementierenden Wirt/Zellen.
Vorzugsweise ist der hier angegebene Vektor als Klonierungsvektor geeignet, d. h. in mikrobiellen Systemen replizierbar. Solche Vektoren gewährleisten eine effiziente Klonierung in Bakterien und vorzugsweise Hefen oder Pilzen und ermöglichen die stabile Transformation von Pflanzen. Diejenigen, die erwähnt werden müssen, sind insbesondere verschiedene binäre und co-integrierte Vektorsysteme, die für die T-DNA-vermittelte Transformation geeignet sind. Solche Vektorsysteme sind in der Regel dadurch charakterisiert, dass sie mindestens die vir-Gene enthalten, die für die Agrobacterium-vermittelte Transformation benötigt werden, und die Sequenzen, die die T-DNA begrenzen (T-DNA-Grenze). Diese Vektorsysteme umfassen vorzugsweise weiterhin auch cis-regulatorische Regionen, wie Promotoren und Terminatoren, und/oder Selektionsmarker, mit denen geeignete transformierte Wirtszellen oder Organismen identifiziert werden können. Während co-integrierte Vektorsysteme die vir-Gene und die T-DNA Sequenzen auf demselben Vektor angeordnet haben, basieren binäre Systeme auf mindestens zwei Vektoren, von denen einer die vir-Gene, aber keine T-DNA trägt, wohingegen ein zweiter die T-DNA, aber keine vir-Gene trägt. Infolgedessen sind die letztgenannten Vektoren relativ klein, leicht zu manipulieren und können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium repliziert werden. Diese binären Vektoren schließen Vektoren aus der pBIB-HYG-, pPZP-, pBecks-, pGreen-Reihe ein. Erfindungsgemäß werden vorzugsweise Bin19, pBI101, pBinAR, pGPTV und pCAMBIA verwendet. Einen Überblick über binäre Vektoren und ihre Verwendung lässt sich in Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451 finden. Weiterhin können die Polynukleotide unter Verwendung geeigneter Klonierungsvektoren in Wirtszellen oder -organismen, wie Pflanzen oder Tiere, eingebracht und somit zur Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie denjenigen, die in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225 veröffentlicht und genannt sind.
Stärker bevorzugt ist der erfindungsgemäße Vektor ein Expressionsvektor. In einem solchen Expressionsvektor ist das Nukleinsäuremolekül funktionsfähig mit Expressionskontrollsequenzen (auch als ”Expressionskassette” bezeichnet) verknüpft, die eine Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen oder isolierten Fraktionen daraus gestatten. Die Expression des Polynukleotids umfasst die Transkription des Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise in eine translatierbare mRNA. Regulatorische Elemente, die eine Expression in eukaryotischen Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, gewährleisten, sind im Stand der Technik bekannt. Sie umfassen vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die die Initiation der Transkription gewährleisten, und gegebenenfalls Poly-A-Signale, die eine Termination der Transkription und die Stabilisierung des Transkripts gewährleisten. Zu weiteren regulatorischen Elementen können Transkriptions sowie Translationsenhancer gehören. Mögliche regulatorische Elemente, die eine Expression in prokaryotischen Wirtszellen gestatten, umfassen z. B. den lac-, trp- oder den tac-Promotor in E. coli und Beispiele für regulatorische Elemente, die eine Expression in eukaryotischen Wirtszellen gestatten, sind der AOX1- oder der GAL1-Promotor in Hefe oder der CMV-, der SV40-, der RSV-Promotor (Rous-Sarkom-Virus), der CMV-Enhancer, der SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Säuger- und anderen tierischen Zellen. Außerdem können induzierbare Expressionskontrollsequenzen in einem Expressionsvektor verwendet werden, der von der vorliegenden Erfindung umfasst wird. Solche induzierbaren Vektoren können tet- oder lac-Operatorsequenzen umfassen oder Sequenzen, die durch Hitzeschock oder andere Umweltfaktoren induzierbar sind. Geeignete Expressionskontrollsequenzen sind im Stand der Technik bekannt. Neben Elementen, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, können solche regulatorischen Elemente auch Transkriptionsterminationssignale, wie die SV40-Poly-A-Stelle oder die tk-Poly-A-Stelle, stromabwärts des Polynukleotids umfassen. Vorzugsweise ist der Expressionsvektor auch ein Gentransfer- oder Zielsteuerungsvektor. Expressionsvektoren, die von Viren, wie Retroviren, Vaccinia-Virus, adeno-assoziiertem Virus, Herpes-Viren oder Rinder-Papillomvirus, stammen, können für die Zuführung des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder Vektors zu der angesteuerten Zellpopulation verwendet werden. Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können zur Konstruktion rekombinanter viraler Vektoren verwendet werden; siehe zum Beispiel die Techniken, die in Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N. Y. (1994) beschrieben sind.
Geeignete Expressionsvektoren, wie der Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene) oder pSPORT1 (GIBCO BRL), sind im Stand der Technik bekannt. Weitere Beispiele für typische Fusionsexpressionsvektoren sind pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B., und Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), in denen Glutathion-S-transferase (GST), Maltose-E-bindendes Protein bzw. Protein A mit dem rekombinanten Zielprotein fusioniert sind. Beispiele für geeignete induzierbare Nicht-Fusions-E. coli-Expressionsvektoren sind u. a. pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60–89). Die Zielgen-Expression von dem pTrc-Vektor basiert auf der Transkription eines Hybrid-trp-lac-Fusionspromotors durch die RNA-Polymerase des Wirts. Die Zielgen-Expression von dem pET 11d-Vektor basiert auf der Transkription von einem T7-gn10-lac-Fusionspromotor, die durch eine co-exprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) aus einem residenten λ-Prophagen, der ein T7 gn1-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV5-Promotors enthält, bereitgestellt. Dem Fachmann sind andere Vektoren geläufig, die für prokaryotische Organismen geeignet sind; diese Vektoren sind zum Beispiel in E. coli pLG338, pACYC184, die pBR-Reihe, wie pBR322, die pUC-Reihe, wie pUC18 oder pUC19, die M113mp-Reihe, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 oder pBdCl, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667. Beispiele für Vektoren für die Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYeDesaturasec1 (Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren für die Konstruktion von Vektoren, die für die Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, geeignet sind, umfassen solche, die im einzelnen in: van den Hondel, C. A. M. J. J., & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge, oder in: More Gene Manipulations in Fungi (J. W. Bennett & L. L. Lasure, Hrsg., S. 396–428: Academic Press: San Diego) beschrieben werden. Weitere geeignete Hefevektoren sind zum Beispiel pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Als Alternative können die erfindungsgemäßen Polynukleotide auch in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die für die Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (zum Beispiel Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31–39).
Die folgenden Promotoren und Expressionskontrollsequenzen können vorzugsweise in einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor verwendet werden. Die cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder λ-PL-Promotoren werden vorzugsweise in Gram-negativen Bakterien verwendet. Für Gram-positive Bakterien können die Promotoren amy und SPO2 verwendet werden. Von den Hefe- oder Pilz-Promotoren werden vorzugsweise die ADC1-, MFα-, AC-, P-60-, CYC1-, GAPDH-, TEF-, rp28-, ADH-Promotoren verwendet oder aus Pflanze die Promotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285–294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. In diesem Zusammenhang sind ebenfalls induzierbare Promotoren bevorzugt, wie die in EP A 0 388 186 (Benzylsulfonamid-induzierbar), Plant J. 2, 1992: 397–404 (Gatz et al., Tetracyclin-induzierbar), EP A 0 335 528 (Abscisinsäure-induzierbar) oder WO 93/21334 (Ethanol- oder Cyclohexenol-induzierbar) beschriebenen Promotoren. Weitere geeignete Pflanzen-Promotoren sind der Promotor von cytosolischer FBPase oder der ST-LSI-Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445), der Phosphoribosylpyrophosphat-Amidotransferase-Promotor aus Glycine max (Genbank Zugangs-Nr. U87999) oder der in EP-A-0 249 676 beschriebene Nodien-spezifische Promotor. Besonders bevorzugt sind Promotoren, die eine Expression in Geweben ermöglichen, die an der Biosynthese von Fettsäuren beteiligt sind. Ebenfalls besonders bevorzugt werden in Übereinstimmung mit der Ausführung samenspezifische Promotoren, wie der USP-Promotor, aber auch andere Promotoren, wie die LeB4-, DC3-, Phaseolin- oder Napin-Promotoren. Weitere besonders vorteilhafte Promotoren sind samenspezifische Promotoren, die für monokotyle oder dikotyle Pflanzen verwendet werden können und beschrieben sind in US 5,608,152 (Napin-Promotor aus Raps), WO 98/45461 (Oleosin-Promotor aus Arobidopsis, US 5,504,200 (Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris), WO 91/13980 (Bce4-Promotor aus Brassica), von Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233–239 (LeB4-Promotor aus einer Fabaceae), wobei diese Promotoren für Dikotyledonen geeignet sind. Die folgenden Promotoren sind zum Beispiel für Monokotyledonen geeignet: Ipt-2- oder Ipt-1-Promotor aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ), Hordein-Promotor aus Gerste und andere Promotoren, die geeignet und in der WO 99/16890 beschrieben sind. Im Prinzip ist es möglich, alle natürlichen Promotoren zusammen mit ihren regulatorischen Sequenzen, wie den vorstehend genannten, für die neuen Verfahren zu verwenden. Ebenso ist es möglich und vorteilhaft, synthetische Promotoren entweder zusätzlich oder allein zu verwenden, besonders wenn sie eine samenspezifische Expression vermitteln, wie zum Beispiel in der WO 99/16890 beschrieben.
Das erfindungsgemäße Polynukleotid kann in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen), siehe Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239–251 und die darin genannten Literaturstellen, und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (zum Beispiel Spermatophyten, wie anbaufähigen Kulturpflanzen) unter Verwendung von Pflanzen-Expressionsvektoren exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die im einzelnen beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M. W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38. Eine Pflanzenexpressionskassette umfasst vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die in der Lage sind, die Genexpression in Pflanzenzellen zu steuern, und die funktionsfähig verknüpft werden, so dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, wie Transkriptionstermination, zum Beispiel Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind solche, die von Agrobacterium tumefaciens-T-DNA stammen, wie das Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5, das als Octopinsynthase bekannt ist (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff.), oder funktionelle Äquivalente davon, aber alle anderen Terminatoren, die in Pflanzen funktionell aktiv sind, sind ebenfalls geeignet. Weil die Pflanzengenexpression sehr oft nicht auf die Transkriptionsspiegel beschränkt ist, umfasst eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere funktionsfähig verknüpfte Sequenzen, wie Translationsenhancer, zum Beispiel die Overdrive-Sequenz, die die 5'-untranslatierte Leadersequenz des Tabak-Mosaikvirus umfasst, die das Protein/RNA-Verhältnis erhöht (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711). Wie vorstehend beschrieben, muss die Pflanzengenexpression funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verknüpft sein, der die Expression des Gens auf zeitgerechte, zellspezifische oder Gewebe-spezifische Weise durchführt. Promotoren, die verwendet werden können, sind konstitutive Promotoren (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195–2202), wie solche, die von Pflanzenviren stammen, wie 35S CAMV (Franck et al., Cell 21 (1980) 285–294), 19S CaMV (siehe auch US 5352605 und WO 84/02913 ), oder Pflanzenpromotoren, wie der Promotor der kleinen Untereinheit der Rubisco, der in US 4,962,028 beschrieben ist. Andere bevorzugte Sequenzen, die in Pflanzengenexpressionskassetten funktionell verknüpft werden können, sind Zielsteuerungssequenzen, die für die Zielsteuerung des Genprodukts in sein entsprechendes Zellkompartiment erforderlich sind (eine Übersicht siehe in Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285–423 und die dann genannten Literaturstellen), zum Beispiel in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Plastiden, wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den Extrazellularraum, die Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen. Wie vorstehend beschrieben, kann die Pflanzengenexpression auch über einen chemisch induzierbaren Promotor erleichtert werden (eine Übersicht siehe in Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108). Chemisch induzierbare Promotoren sind besonders dann geeignet, wenn gewünscht ist, dass Gene auf zeitspezifische Weise exprimiert werden. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor ( WO 95/19443 ), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor. Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind ebenfalls geeignete Promotoren, zum Beispiel der Pathogen-induzierte PRP1-Gen-Promotor (Ward et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993) 361–366), der hitzeinduzierbare hsp80-Promotor aus Tomate ( US 5,187,267 ), der kälteinduzierbare alpha-Amylase-Promotor aus Kartoffel ( WO 96/12814 ) oder der wundeninduzierbare pinII-Promotor ( EP A 0 375 091 ). Die Promotoren, die besonders bevorzugt sind, sind solche, die die Expression von Genen in Geweben und Organen, in denen die Fettsäure-, Lipid- und Ölbiosynthese erfolgt, in Samenzellen, wie den Zellen des Endosperms und des sich entwickelnden Embryos, bewirken. Geeignete Promotoren sind der Napin-Gen-Promotor aus Raps ( US 5,608,152 ), der USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., Mol. Gen. Genet., 1991, 225 (3): 459–67), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis ( WO 98/45461 ), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris ( US 5,504,200 ), der Bce4-Promotor aus Brassica ( WO 91/13980 ) oder der Legumin B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233–9) und Promotoren, die eine samenspezifische Expression in monokotylen Pflanzen, wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis und dergleichen, bewirken. Geeignete Promotoren, die in Betracht gezogen werden sollten, sind der Ipt2- oder Ipt1-Genpromotor aus Gerste ( WO 95/15389 und WO 95/23230 ) oder solche, die in WO 99/16890 beschrieben sind (Promotoren aus den Hordein-Gen der Gerste, dem Glutelin-Gen von Reis, dem Oryzin-Gen von Reis, dem Prolamin-Gen von Reis, dem Gliadin-Gen aus Weizen, dem Glutelin-Gen aus Weizen, dem Zein-Gen aus Mais, dem Glutelin-Gen aus Hafer, dem Kasirin-Gen aus Sorghum, dem Secalin-Gen aus Roggen). Ebenfalls besonders geeignet sind Promotoren, die die plastidenspezifische Expression bewirken, weil Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Vorläufer und einige Endprodukte der Lipidbiosynthese synthetisiert werden. Geeignete Promotoren, wie der virale RNA-Polymerase-Promotor, werden in WO 95/16783 und WO 97/06250 beschrieben, und der in WO 99/46394 beschriebene clpP-Promotor aus Arabidopsis.
Die vorstehend genannten Vektoren geben nur einen kleinen Überblick über Vektoren, die erfindungsgemäß verwendet werden sollten. Weitere Vektoren sind dem Fachmann bekannt und werden zum Beispiel beschrieben in: Cloning Vectors (Hrsg. Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018). Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgb., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Aus dem Vorstehenden folgt, dass der Vektor vorzugsweise ein Expressionsvektor ist. Stärker bevorzugt steht das erfindungsgemäße Polynukleotid unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors in dem erfindungsgemäßen Vektor. Ein bevorzugter samenspezifischer Promotor, wie hier gemeint, ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus Conlinin 1, Conlinin 2, Napin, LuFad3, USP, LeB4, Arc, Fae, ACP, LuPXR und SBP besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Wirtszelle, die das erfindungsgemäße Polynukleotid umfasst oder die mit dem erfindungsgemäßen Vektor transformiert wird.
Vorzugsweise ist die Wirtszelle eine Pflanzenzelle und stärker bevorzugt eine Pflanzenzelle, die aus einer Ölfruchtpflanze erhalten wird. Stärker bevorzugt wird die Ölfruchtpflanze aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Flachs (Linum sp.), Raps (Brassica sp.), Sojabohne (Glycine und Soja sp.), Sonnenblume (Helianthus sp.), Baumwolle (Gossypium sp.), Mais (Zea mays), Olive (Olea sp.), Färberdistel (Carthamus sp.), Kakao (Theobroma cacoa), Erdnuss (Arachis sp.), Hanf, Leindotter, Crambe, Ölpalme, Kokosnüssen, Erdbirnen, Sesamsamen, Rizinussamen, Lesquerella, Talgbaum, Sheanüssen, Tungnüssen, Kapokfrucht, Mohnsamen, Jojobasamen und Perilla.
Ebenfalls bevorzugt ist die Wirtszelle eine mikrobielle Zelle. Stärker bevorzugt wird die mikrobielle Zelle aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Yarrowia, Thraustochytrium, Pythium, Schizochytrium und Crythecodinium.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Pflanze oder Pflanzensamen, die das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül, den erfindungsgemäßen Vektor oder die erfindungsgemäße Wirtszelle umfassen.
Bevorzugte Pflanzen, die zum Einbringen des erfindungsgemäßen Polynukleotids oder des erfindungsgemäßen Vektors verwendet werden sollten, sind Pflanzen, die in der Lage sind, Fettsäuren zu synthetisieren, wie sämtliche dikotylen oder monokotylen Pflanzen, Algen oder Moose. Es sollte selbstverständlich sein, dass Wirtszellen, die von einer Pflanze stammen, ebenfalls zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Pflanze verwendet werden können. Vorteilhafte Pflanzen werden aus der Gruppe der folgenden Pflanzenfamilien ausgewählt: Adelotheciaceae, Anacardiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Betulaceae, Boraginaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Caricaceae, Cannabaceae, Convolvulaceae, Chenopodiaceae, Crypthecodiniaceae, Cucurbitaceae, Ditrichaceae, Elaeagnaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Geraniaceae, Gramineae, Juglandaceae, Lauraceae, Leguminosae, Linaceae, Prasinophyceae oder Gemüsepflanzen oder Zierpflanzen, wie Tagetes. Beispiele, die genannt werden können, sind die folgenden Pflanzen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus: Adelotheciaceae, wie die Gattung Physcomitrella, wie die Gattung und Spezies Physcomitrella patens, Anacardiaceae, wie die Gattungen Pistacia, Mangifera, Anacardium, zum Beispiel die Gattung und Spezies Pistacia vera [Pistazie], Mangifer indica [Mango] oder Anacardium occidentale [Cashew], Asteraceae, wie die Gattungen Calendula, Carthamus, Centaurea, Cichorium, Cynara, Helianthus, Lactuca, Locusta, Tagetes, Valeriana, zum Beispiel die Gattung und Spezies Calendula officinalis [Ringelblume], Carthamus tinctorius [Färberdistel], Centaurea cyanus [Kronblume], Cichorium intybus [Wegwarte], Cynara scolymus [Artischocke], Helianthus annus [Sonnenblume], Lactuca sativa, Lactuca crispa, Lactuca esculenta, Lactuca scariola L. ssp. sativa, Lactuca scariola L. var. integrata, Lactuca scariola L. var. integrifolia, Lactuca sativa subsp. romana, Locusta communis, Valeriana locusta [Salatgemüse], Tagetes lucida, Tagetes erecta oder Tagetes tenuifolia [Afrikanische oder Französische Studentenblume], Apiaceae, wie die Gattung Daucus, zum Beispiel die Gattung und Spezies Daucus carota [Karotte], Betulaceae, wie die Gattung Corylus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Corylus avellana oder Corylus colurna [Haselnuss], Boraginaceae, wie die Gattung Borago, zum Beispiel die Gattung und Spezies Borago officinalis [Borretsch], Brassicaceae, wie die Gattungen Brassica, Melanosinapis, Sinapis, Arabadopsis, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Raps], Sinapis arvensis Brassica juncea, Brassica juncea var. juncea, Brassica juncea var. crispifolia, Brassica juncea var. foliosa, Brassica nigra, Brassica sinapioides, Melanosinapis communis [Senf], Brassica oleracea [Gemüsekohl] oder Arabidopsis thaliana, Bromeliaceae, wie die Gattungen Ananas, Bromelia (Ananas), zum Beispiel die Gattungen und Spezies Ananas comosus, Ananas ananas oder Bromelia comosa [Ananas], Caricaceae, wie die Gattung Carica, wie die Gattung und Spezies Carica papaya [Indianerbanane], Cannabaceae, wie die Gattung Cannabis, wie die Gattung und Spezies Cannabis sativa [Hanf], Convolvulaceae, wie die Gattungen Ipomea, Convolvulus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Ipomoea batatus, Ipomoea pandurata, Convolvulus batatas, Convolvulus tiliaceus, Ipomoea fastigiata, Ipomoea tiliacea, Ipomoea triloba oder Convolvulus panduratus [Süßkartoffel, Batate], Chenopodiaceae, wie die Gattung Beta, wie die Gattungen und Spezies Beta vulgaris, Beta vulgaris var. altissima, Beta vulgaris var. vulgaris, Beta maritima, Beta vulgaris var. perennis, Beta vulgaris var conditiva oder Beta vulgaris var. esculenta [Zuckerrübe], Crypthecodiniaceae, wie die Gattung Crypthecodinium, zum Beispiel die Gattung und Spezies Cryptecodinium cohnii, Cucurbitaceae, wie die Gattung Cucurbita, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cucurbita maxima, Cucurbita mixta, Cucurbita pepo oder Cucurbita moschata [Kürbis/Squash], Cymbellaceae, wie die Gattungen Amphora, Cymbella, Okedenia, Phaeodactylum, Reimeria, zum Beispiel die Gattung und Spezies Phaeodactylum tricornutum, Ditrichaceae, wie die Gattungen Ditrichaceae, Astomiopsis, Ceratodon, Chrysoblastella, Ditrichum, Distichium, Eccremidium, Lophidion, Philibertiella, Pleuridium, Saelania, Trichodon, Skottsbergia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Ceratodon antarcticus, Ceratodon columbiae, Ceratodon heterophyllus, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus, Ceratodon purpureus ssp. convolutus, Ceratodon, purpureus spp. stenocarpus, Ceratodon purpureus var. rotundifolius, Ceratodon ratodon, Ceratodon stenocarpus, Chrysoblastella chilensis, Ditrichum ambiguum, Ditrichum brevisetum, Ditrichum crispatissimum, Ditrichum difficile, Ditrichum falcifolium, Ditrichum flexicaule, Ditrichum giganteum, Ditrichum heteromallum, Ditrichum lineare, Ditrichum lineare, Ditrichum montanum, Ditrichum montanum, Ditrichum pallidum, Ditrichum punctulatum, Ditrichum pusillum, Ditrichum pusillum var. tortile, Ditrichum rhynchostegium, Ditrichum schimperi, Ditrichum tortile, Distichium capillaceum, Distichium hagenii, Distichium inclinatum, Distichium macounii, Eccremidium floridanum, Eccremidium whiteleggei, Lophidion strictus, Pleuridium acuminatum, Pleuridium alternifolium, Pleuridium holdridgei, Pleuridium mexicanum, Pleuridium ravenelii, Pleuridium subulatum, Saelania glaucescens, Trichodon borealis, Trichodon cylindricus oder Trichodon cylindricus var. oblongus, Elaeagnaceae, wie die Gattung Elaeagnus, zum Beispiel die Gattung und Spezies Olea europaea [Olive], Ericaceae, wie die Gattung Kalmia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Kalmia latifolia, Kalmia angustifolia, Kalmia microphylla, Kalmia polifolia, Kalmia occidentalis, Cistus chamaerhodendros oder Kalmia lucida [Berglorbeer], Euphorbiaceae, wie die Gattungen Manihot, Janipha, Jatropha, Ricinus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Manihot utilissima, Janipha manihot, Jatropha manihot, Manihot aipil, Manihot dulcis, Manihot manihot, Manihot melanobasis, Manihot esculenta [Manihot] oder Ricinus communis [Rizinusölpflanze], Fabaceae, wie die Gattungen Pisum, Albizia, Cathormion, Feuillea, Inga, Pithecolobium, Acacia, Mimosa, Medicajo, Glycine, Dolichos, Phaseolus, Soja, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Pisum sativum, Pisum arvense, Pisum humile [Erbse], Albizia berteriana, Albizia julibrissin, Albizia lebbeck, Acacia berteriana, Acacia littoralis, Albizia berteriana, Albizzia berteriana, Cathormion berteriana, Feuillea berteriana, Inga fragrans, Pithecellobium berterianum, Pithecellobium fragrans, Pithecolobium berterianum, Pseudalbizzia berteriana, Acacia julibrissin, Acacia nemu, Albizia nemu, Feuilleea julibrissin, Mimosa julibrissin, Mimosa speciosa, Sericanrda julibrissin, Acacia lebbeck, Acacia macrophylla, Albizia lebbek, Feuilleea lebbeck, Mimosa lebbeck, Mimosa speciosa [seidenbaum], Medicago sativa, Medicago falcata, Medicago varia [Alfalfa], Glycine max Dolichos soja, Glycine gracilis, Glycine hispida, Phaseolus max, Soja hispida oder Soja max [Sojabohne], Funariaceae, wie die Gattungen Aphanorrhegma, Entosthodon, Funaria, Physcomitrella, Physcomitrium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Aphanorrhegma serratum, Entosthodon attenuatus, Entosthodon bolanderi, Entosthodon bonplandii, Entosthodon californicus, Entosthodon drummondii, Entosthodon jamesonii, Entosthodon leibergii, Entosthodon neoscoticus, Entosthodon rubrisetus, Entosthodon spathulifolius, Entosthodon tucsoni, Funaria americana, Funaria bolanderi, Funaria calcarea, Funaria californica, Funaria calvescens, Funaria convoluta, Funaria flavicans, Funaria groutiana, Funaria hygrometrica, Funaria hygrometrica var. arctica, Funaria hygrometrica var. calvescens, Funaria hygrometrica var. convoluta, Funaria hygrometrica var. muralis, Funaria hygrometrica var. utahensis, Funaria microstoma, Funaria microstoma var. obtusifolia, Funaria muhlenbergii, Funaria orcuttii, Funaria plano-convexa, Funaria polaris, Funaria ravenelii, Funaria rubriseta, Funaria serrata, Funaria sonorae, Funaria sublimbatus, Funaria tucsoni, Physcomitrella californica, Physcomitrella patens, Physcomitrella readeri, Physcomitrium australe, Physcomitrium californicum, Physcomitrium collenchymatum, Physcomitrium coloradense, Physcomitrium cupuliferum, Physcomitrium drummondii, Physcomitrium eurystomum, Physcomitrium flexifolium, Physcomitrium hookeri, Physcomitrium hookeri var. serratum, Physcomitrium immersum, Physcomitrium kellermanii, Physcomitrium megalocarpum, Physcomitrium pyriforme, Physcomitrium pyriforme var. serratum, Physcomitrium rufipes, Physcomitrium sandbergii, Physcomitrium subsphaericum, Physcomitrium washingtoniense, Geraniaceae, wie die Gattungen Pelargonium, Cocos, Oleum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Cocos nucifera, Palargonium grossularioides oder Oleum cocois [Kokosnuss], Gramineae, wie die Gattung Saccharum, zum Beispiel die Gattung und Spezies Saccharum officinarum, Juglandaceae, wie die Gattungen Juglans, Wallia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Juglans regia, Juglans ailanthifolia, Juglans sieboldiana, Juglans cinerea, Wallia cinerea, Juglans bixbyi, Juglans californica, Juglans hindsii, Juglans intermedia, Juglans jamaicensis, Juglans major, Juglans microcarpa, Juglans nigra oder Wallia nigra [Walnuss], Lauraceae, wie die Gattungen Persea, Laurus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Laurus nobilis [Lorbeer], Persea americana, Persea gratissima oder Persea persea [Avocado], Leguminosae, wie die Gattung Arachis, zum Beispiel die Gattung und Spezies Arachis hypogaea [Erdnuss], Linaceae, wie die Gattungen Linum, Adenolinum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Linum usitatissimum, Linum humile, Linum austriacum, Linum bienne, Linum angustifolium, Linum catharticum, Linum flavum, Linum grandiflorum, Adenolinum grandiflorum, Linum lewisii, Linum narbonense, Linum perenne, Linum perenne var. lewisii, Linum pratense oder Linum trigynum [Leinsamen], Lythrarieae, wie die Gattung Punica, zum Beispiel die Gattung und Spezies Punica granatum [Granatapfel], Malvaceae, wie die Gattung Gossypium, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Gossypium hirsutum, Gossypium arboreum, Gossypium barbadense, Gossypium herbaceum oder Gossypium thurberi [Baumwolle], Marchantiaceae, wie die Gattung Marchantia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Marchantia berteroana, Marchantia foliacea, Marchantia macropora, Musaceae, wie die Gattung Musa, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Musa nana, Musa acuminata, Musa paradisiaca, Musa spp. [Banane], Onagraceae, wie die Gattungen Camissonia, Oenothera, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Oenothera biennis oder Camissonia brevipes [Nachtkerze], Palmae, wie die Gattung Elacis, zum Beispiel die Gattung und Spezies Elaeis guineensis [Ölpalme], Papaveraceae, wie die Gattung Papaver, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Papaver orientale, Papaver rhoeas, Papaver dubium [Mohn], Pedaliaceae, wie die Gattung Sesamum, zum Beispiel die Gattung und Spezies Sesamum indicum [Sesam], Piperaceae, wie die Gattungen Piper, Artanthe, Peperomia, Steffensia, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Piper aduncum, Piper amalago, Piper angustifolium, Piper auritum, Piper betel, Piper cubeba, Piper longum, Piper nigrum, Piper retrofractum, Artanthe adunca, Artanthe elongata, Peperomia elongata, Piper elongatum, Steffensia elongata [Cayennepfeffer], Poaceae, wie die Gattungen Hordeum, Secale, Avena, Sorghum, Andropogon, Holcus, Panicum, Oryza, Zea (Mais), Triticum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Hordeum vulgare, Hordeum jubatum, Hordeum murinum, Hordeum secalinum, Hordeum distichon, Hordeum aegiceras, Hordeum hexastichon, Hordeum hexastichum, Hordeum irregulare, Hordeum sativum, Hordeum secalinum [Gerste], Secale cereale [Roggen], Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida [Hafer], Sorghum bicolor, Sorghum halepense, Sorghum saccharatum, Sorghum vulgare, Andropogon drummondii, Holcus bicolor, Holcus sorghum, Sorghum aethiopicum, Sorghum arundinaceum, Sorghum caffrorum, Sorghum cernuum, Sorghum dochna, Sorghum drummondii, Sorghum durra, Sorghum guineense, Sorghum lanceolatum, Sorghum nervosum, Sorghum saccharatum, Sorghum subglabrescens, Sorghum verticilliflorum, Sorghum vulgare, Holcus halepensis, Sorghum miliaceum, Panicum militaceum [Echte Hirse], Oryza sativa, Oryza latifolia [Reis], Zea mays [Mais], Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Trticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare [Weizen], Porphyridiaceae, wie die Gattungen Chroothece, Flintiella, Petrovanella, Porphyridium, Rhodella, Rhodosorus, Vanhoeffenia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Porphyridium cruentum, Proteaceae, wie die Gattung Macadamia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Macadamia intergrifolia [Macadamia], Prasinophyceae, wie die Gattungen Nephroselmis, Prasinococcus, Scherffelia, Tetraselmis, Mantoniella, Ostreococcus, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Nephroselmis olivacea, Prasinococcus capsulatus, Scherffelia dubia, Tetraselmis chui, Tetraselmis suecica, Mantoniella squamata, Ostreococcus tauri, Rubiaceae, wie die Gattung Coffea, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Coffea spp., Coffea arabica, Coffea canephora oder Coffea liberica [Kaffee], Scrophulariaceae, wie die Gattung Verbascum, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Verbascum blattaria, Verbascum chaixii, Verbascum densiflorum, Verbascum lagurus, Verbascum longifolium, Verbascum lychnitis, Verbascum nigrum, Verbascum olympicum, Verbascum phlomoides, Verbascum phoenicum, Verbascum pulverulentum oder Verbascum thapsus [Kleinblütige Königskerze], Solanaceae, wie die Gattungen Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lycopersicon, zum Beispiel die Gattungen und Spezies Capsicum annuum, Capsicum annuum var. glabriusculum, Capsicum frutescens [Pfeffer], Capsicum annuum [Paprika], Nicotiana tabacum, Nicotiana alata, Nicotiana attenuata, Nicotiana glauca, Nicotiana langsdorffii, Nicotiana obtusifolia, Nicotiana quadrivalvis, Nicotiana repanda, Nicotiana rustica, Nicotiana sylvestris [Tabak], Solanum tuberosum [Kartoffel], Solanum melongena [Aubergine], Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum [Tomate], Sterculiaceae, wie die Gattung Theobroma, zum Beispiel die Gattung und Spezies Theobroma cacao [Kakao] oder Theaceae, wie die Gattung Camellia, zum Beispiel die Gattung und Spezies Camellia sinensis [Tee]. Insbesondere sind bevorzugte Pflanzen, die erfindungsgemäß als transgene Pflanzen verwendet werden können, Ölfruchtpflanzen, die große Mengen von Lipidverbindungen umfassen, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Färberdistel, Mohn, Senf, Hanf, Rizinusölpflanze, Olive, Sesam, Calendula, Punica, Nachtkerze, Königskerze, Distel, Wildrosen, Haselnuss, Mandel, Macadamia, Avocado, Lorbeer, Kürbis/Squash, Leinsamen, Sojabohne, Pistazien, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss, Walnuss) oder Erntepflanzen, wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Baumwolle, Maniok, Pfeffer, Tagetes, Solanaceae-Pflanzen, wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa oder buschige Pflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies und ausdauernde Gräser und Futterpflanzen. Bevorzugte erfindungsgemäße Pflanzen sind Ölpflanzen, wie Erdnuss, Raps, Canola, Sonnenblume, Färberdistel, Mohn, Senf, Hanf, Rizinusölpflanze, Olive, Calendula, Punica, Nachtkerze, Kürbis/Squash, Leinsamen, Sojabohne, Borretsch, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss). Besonders bevorzugt werden Sonnenblume, Färberdistel, Tabak, Königskerze, Sesam, Baumwolle, Kürbis/Squash, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Leinsamen, Hanf, Distel oder Färberdistel. Ganz besonders bevorzugte Pflanzen sind Pflanzen, wie Färberdistel, Sonnenblume, Mohn, Nachtkerze, Walnuss, Leinsamen oder Hanf.
Bevorzugte Moose sind Physcomitrella oder Ceratodon. Bevorzugte Algen sind Isochrysis, Mantoniella, Ostreococcus oder Crypthecodinium und Algen/Diatomeen, wie Phaeodactylum oder Thraustochytrium. Stärker bevorzugt werden die Algen oder Moose aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus: Shewanella, Physcomitrella, Thraustochytrium, Fusarium, Phytophthora, Ceratodon, Isochrysis, Aleurita, Muscarioides, Mortierella, Phaeodactylum, Cryphthecodinium, insbesondere aus den Gattungen und Spezies Thallasiosira pseudonona, Euglena gracilis, Physcomitrella patens, Phytophtora infestans, Fusarium graminaeum, Cryptocodinium cohnii, Ceratodon purpureus, Isochrysis galbana, Aleurita farinosa, Thraustochytrium sp., Muscarioides viallii, Mortierella alpina, Phaeodactylum tricornutum oder Caenorhabditis elegans oder besonders vorteilhafterweise Phytophtora infestans, Thallasiosira pseudonona und Cryptocodinium cohnii.
Transgene Pflanzen können durch Transformationstechniken erhalten werden, wie sie veröffentlicht und genannt sind in: Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38; B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225. Vorzugsweise können tansgene Pflanzen durch T-DNA-vermittelte Transformation erhalten werden. Solche Vektorsysteme sind in der Regel dadurch charakterisiert, dass sie mindestens die vir-Gene enthalten, die für die Agrobacterium-vermittelte Transformation benötigt werden, und die Sequenzen, die die T-DNA begrenzen (T-DNA-Grenze). Geeignete Vektoren werden im Einzelnen an anderer Stelle in der Beschreibung beschrieben.
Die erfindungsgemäße Wirtszelle ist stärker bevorzugt in der Lage, die nachstehend im Einzelnen angegebenen ungesättigten Fettsäuren zu produzieren. Zu diesem Zweck können weitere Enzyme, einschließlich anderer Desaturasen oder Elongasen, je nach der enzymatischen Ausstattung, die endogen in der Wirtszelle vorhanden ist, erforderlich sein. Es sollte selbstverständlich sein, dass weitere Enzyme, die für die Herstellung der ungesättigten Fettsäure erforderlich sein können, exogen bereitgestellt werden können, z. B. durch Transformieren der Wirtszelle mit exprimierbaren Polynukleotiden, die die Enzyme kodieren. Alternativ kann die Aktivität ungewünschter, endogen vorhandener Enzyme inhibiert werden, z. B. indem man Antisense-Nukleinsäuren, Ribozyme, siRNA-Moleküle, Morpholino-Nukleinsäuren (Phosphordiamidat-Morpholino-Oligos), Dreifachhelix-bildende Oligonukleotide, inhibitorische Oligonukleotide oder mikro-RNA-Moleküle anwendet. Insbesondere umfasst die Wirtszelle, die von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird, stärker bevorzugt mindestens eine enzymatische Aktivität, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Δ-4-Desaturase-, Δ-5-Desaturase-, Δ-5-Elongase-, Δ-6-Desaturase-, Δ12-Desaturase-, Δ15-Desaturase-, ω3-Desaturase- und Δ-6-Elongase-Aktivität. Außerdem sollte selbstverständlich sein, dass die erfindungsgemäßen Desaturasen und Acyltransferasen zur Steigerung der PUFA-Produktion und insbesondere für die Herstellung von ARA, EPA und/oder DHA co-exprimiert werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids bereit, das das Züchten der erfindungsgemäßen Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium umfasst, um dadurch das Polypeptid, das von einem erfindungsgemäßen Polynukleotid kodiert wird, zu produzieren.
Das Polypeptid kann zum Beispiel durch alle herkömmlichen Reinigungstechniken erhalten werden, einschließlich Affinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie, Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Ausfälltechniken, einschließlich Antikörperfällung. Es sollte selbstverständlich sein, dass das Verfahren – obwohl bevorzugt – nicht notwendigerweise eine im Wesentlichen reine Präparation des Polypeptids ergeben kann. Ein durch das Verfahren erhaltenes Polypeptid schließt Polypeptidvarianten ein, die posttranslational modifiziert, z. B. phosphoryliert oder myristyliert, oder auf RNA- oder Protein-Ebene prozessiert werden.
Im Prinzip betrifft die vorliegende Erfindung jedoch ein Polypeptid, das von dem erfindungsgemäßen Polynukleotid kodiert wird.
Der Begriff ”Polypeptid”, wie er hier verwendet wird, umfasst im Wesentlichen gereinigte Polypeptide oder Polypeptidzubereitungen, die außerdem andere Proteine umfassen. Außerdem schließt der Begriff vorzugsweise auch Polypeptide ein, die in einer Wirtszelle, einer Pflanze oder in einem Pflanzensamen vorliegen, wobei die Wirtszelle, die Pflanze oder der Pflanzensamen nicht die biologische Quelle ist, in der das Polypeptid natürlicherweise vorkommt. Weiterhin betrifft der Begriff auch die Fusionsproteine oder Polypeptidfragmente, die zumindest teilweise von dem vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Polynukleotid kodiert werden. Außerdem schließt er chemisch modifizierte Polypeptide ein. Solche Modifikationen können künstliche Modifikationen oder natürlicherweise vorkommende Modifikationen sein, wie Phosphorylierung, Glykosylierung, Myristylierung und dergleichen. Die Begriffe ”Polypeptid”, ”Peptid” oder ”Protein” werden in dieser gesamten Beschreibung austauschbar verwendet. Wie vorstehend beschrieben, soll das erfindungsgemäße Polypeptid Dehydratase-Aktivität aufweisen und kann somit für die Herstellung von ungesättigten Fettsäuren, entweder in einer Wirtszelle oder in einem transgenen Tier oder einer transgenen Pflanze, wie an anderer Stelle in dieser Beschreibung beschrieben, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Antikörper, der insbesondere das erfindungsgemäße Polypeptid erkennt.
Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Polypeptide können durch bekannte Verfahren unter Verwendung eines gereinigten erfindungsgemäßen Polypeptids oder eines daraus stammenden geeigneten Fragments als Antigen hergestellt werden. Ein Fragment, das als Antigen geeignet ist, kann durch im Stand der Technik bekannte die Antigenität bestimmende Algorithmen identifiziert werden. Solche Fragmente können entweder aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid durch proteolytischen Verdau erhalten werden oder können ein synthetisches Peptid sein. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Antikörper ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein einkettiger Antikörper, ein humaner oder humanisierter Antikörper oder ein primatisierter, chimerisierter oder ein Fragment davon. Von der vorliegenden Erfindung werden als Antikörper auch ein bispezifischer Antikörper, ein synthetischer Antikörper, ein Antikörperfragment, wie Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente usw., oder ein chemisch modifiziertes Derivat von einem von diesen umfasst. Der erfindungsgemäße Antikörper soll insbesondere an das erfindungsgemäße Polypeptid binden (d. h. nicht mit anderen Polypeptiden oder Peptiden kreuzreagieren). Die spezifische Bindung kann durch verschiedene bekannte Techniken getestet werden.
Antikörper oder Fragmente davon können unter Verwendung von Verfahren erhalten werden, die z. B. in Harlow und Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 beschrieben sind. Monoklonale Antikörper können durch die Techniken hergestellt werden, die ursprünglich in Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495, und Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, beschrieben wurden, die die Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen, die von immunisierten Säugern stammen, umfassen.
Die Antikörper können zum Beispiel für die Immunfällung, Immunlokalisierung oder Reinigung (z. B. durch Affinitätschromatographie) der erfindungsgemäßen Polypeptide sowie für die Überwachung des Vorliegens der Polypeptidvarianten, zum Beispiel in rekombinanten Organismen, und für die Identifizierung von Verbindungen, die mit den erfindungsgemäßen Proteine wechselwirken, verwendet werden.
Von der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer ungesättigten Fettsäure umfasst, das das Züchten der erfindungsgemäßen Wirtszelle oder der erfindungsgemäßen Pflanze oder des erfindungsgemäßen Pflanzensamens, so dass die ungesättigte Fettsäure produziert wird, umfasst. Es sollte selbstverständlich sein, dass das Verfahren vorzugsweise weitere Schritte umfassen kann, die zur Isolation der ungesättigten Fettsäure aus der Wirtszelle erforderlich sind.
Es wird auch ein Verfahren zur Modulation der Herstellung einer ungesättigten Fettsäure in Betracht gezogen, das das Züchten der erfindungsgemäßen Wirtszelle oder der erfindungsgemäßen Pflanze oder des erfindungsgemäßen Pflanzensamens, so dass eine Modulation der Herstellung einer ungesättigten Fettsäure auftritt, umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt der Gewinnung der ungesättigten Fettsäure aus der Kultur.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer ungesättigten Fettsäure, das das Zusammenbringen einer Zusammensetzung, die mindestens ein Desaturase-Zielmolekül umfasst, mit mindestens einem erfindungsgemäßen Polypeptid unter derartigen Bedingungen umfasst, dass die ungesättigte Fettsäure produziert wird.
Der Begriff ”ungesättigte Fettsäure” oder ”verlängerte Fettsäure”, wie hier verwendet, umfasst vorzugsweise Verbindungen mit einer Struktur, wie in der allgemeinen Formel I dargestellt
wobei die Variablen und Substituenten in Formel I folgende sind:
R¹ = Hydroxyl, Coenzym A (Thioester), Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerin, Lysodiphosphatidylglycerin, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol, Sphingobase oder ein Rest der Formel II
R² = Wasserstoff, Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerin, Lysodiphosphatidylglycerin, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol oder gesättigtes oder ungesättigtes C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl,
R³ = Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl oder R² und R³ sind unabhängig von einander ein Rest der Formel Ia:
n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 9, m = 2, 3, 4, 5 oder 6 und p = 0 oder 3;
Vorzugsweise ist R¹ in der allgemeinen Formel I Hydroxyl, Coenzym A (Thioester), Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerin, Lysodiphosphatidylglycerin, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol, Sphingobase oder ein Rest der Formel II
Die vorstehend genannten Reste von R¹ werden an die Verbindungen der allgemeinen Formel I immer in Form ihrer Thioester gebunden.
Vorzugsweise ist R² in der allgemeinen Formel II Wasserstoff, Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerin, Lysodiphosphatidylglycerin, Lysophosphatidylserin, Lysophosphatidylinositol oder gesättigtes oder ungesättigtes C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl. Außerdem sind Alkylreste, die genannt werden können, substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl-Ketten, wie Ethylcarbonyl, n-Propylcarbonyl, n-Butylcarbonyl, n-Pentylcarbonyl, n-Hexylcarbonyl, n-Heptylcarbonyl, n-Octylcarbonyl, n-Nonylcarbonyl, n-Decylcarbonyl, n-Undecylcarbonyl, n-Dodecylcarbonyl, n-Tridecylcarbonyl, n-Tetradecylcarbonyl, n-Pentadecylcarbonyl, n-Hexadecylcarbonyl, n-Heptadecylcarbonyl, n-Octadecylcarbonyl, n-Nonadecylcarbonyl, n-Eicosylcarbonyl, n-Docosanylcarbonyl oder n-Tetracosanylcarbonyl, die eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Gesättigte oder ungesättigte C₁₀-C₂₂-Alkylcarbonylreste, wie n-Decylcarbonyl, n-Undecylcarbonyl, n-Dodecylcarbonyl, n-Tridecylcarbonyl, n-Tetradecylcarbonyl, n-Pentadecylcarbonyl, n-Hexadecylcarbonyl, n-Heptadecylcarbonyl, n-Octadecylcarbonyl, n-Nonadecylcarbonyl, n-Eicosylcarbonyl, n-Docosanylcarbonyl oder n-Tetracosanylcarbonyl, die eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen, sind bevorzugt. Bevorzugt werden gesättigte und/oder ungesättigte C₁₀-C₂₂-Alkylcarbonylreste, wie C₁₀-Alkylcarbonyl-, C₁₁-Alkylcarbonyl-, C₁₂-Alkylcarbonyl-, C₁₃-Alkylcarbonyl-, C₁₄-Alkylcarbonyl-, C₁₆-Alkylcarbonyl-, C₁₈-Alkylcarbonyl-, C₂₀-Alkylcarbonyl- oder C₂₂-Alkylcarbonylreste, die eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Besonders bevorzugt sind gesättigte oder ungesättigte C₂₀-C₂₂-Alkylcarbonylreste, wie C₂₀-Alkylcarbonyl- oder C₂₂-Alkylcarbonylreste, die eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Diese bevorzugten Reste können zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen umfassen. Die besonders bevorzugten Reste mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette umfassen bis zu sechs Doppelbindungen, vorteilhafterweise zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen, besonders vorzugsweise zwei, drei oder vier Doppelbindungen. Sämtliche vorstehend genannten Reste stammen von den entsprechenden Fettsäuren.
R³ in der Formel II ist vorzugsweise Wasserstoff, gesättigtes oder ungesättigtes C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl. Alkylreste, die genannt werden können, sind substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte C₂-C₂₄-Alkylcarbonyl-Ketten, wie Ethylcarbonyl, n-Propylcarbonyl, n-Butylcarbonyl, n-Pentylcarbonyl, n-Hexylcarbonyl, n-Heptylcarbonyl, n-Octylcarbonyl, n-Nonylcarbonyl, n-Decylcarbonyl, n-Undecylcarbonyl, n-Dodecylcarbonyl, n-Tridecylcarbonyl, n-Tetradecylcarbonyl, n-Pentadecylcarbonyl, n-Hexadecylcarbonyl, n-Heptadecylcarbonyl, n-Octadecylcarbonyl, n-Nonadecylcarbonyl, n-Eicosylcarbonyl, n-Docosanylcarbonyl oder n-Tetracosanylcarbonyl, die eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Gesättigte oder ungesättigte C₂₀-C₂₂-Alkylcarbonylreste, wie n-Decylcarbonyl, n-Undecylcarbonyl, n-Dodecylcarbonyl, n-Tridecylcarbonyl, n-Tetradecylcarbonyl, n-Pentadecylcarbonyl, n-Hexadecylcarbonyl, n-Heptadecylcarbonyl, n-Octadecylcarbonyl, n-Nonadecylcarbonyl, n-Eicosylcarbonyl, n-Docosanylcarbonyl oder n-Tetracosanylcarbonyl, die eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen, sind bevorzugt. Bevorzugt werden gesättigte und/oder ungesättigte C₁₀-C₂₂-Alkylcarbonylreste, wie C₁₀-Alkylcarbonyl-, C₁₁-Alkylcarbonyl-, C₁₂-Alkylcarbonyl-, C₁₃-Alkylcarbonyl-, C₁₄-Alkylcarbonyl-, C₁₆-Alkylcarbonyl-, C₁₈-Alkylcarbonyl-, C₂₀-Alkylcarbonyl- oder C₂₂-Alkylcarbonylreste-, die eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Besonders bevorzugt sind gesättigte oder ungesättigte C₂₀-C₂₂-Alkylcarbonylreste, wie C₂₀-Alkylcarbonyl- oder C₂₂-Alkylcarbonylreste, die eine oder mehrere Doppelbindungen umfassen. Diese bevorzugten Reste können zwei, drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen umfassen. Die besonders bevorzugten Reste mit 20 oder 22 Kohlenstoffatomen in der Fettsäurekette umfassen bis zu sechs Doppelbindungen, vorteilhafterweise zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen, besonders bevorzugt zwei, drei oder vier Doppelbindungen. Sämtliche vorstehend genannten Reste stammen von den entsprechenden Fettsäuren.
Die vorstehend genannten Reste R¹, R² und R³ können auch mit Hydroxyl- und/oder Epoxygruppen substituiert sein und/oder können Dreifachbindungen umfassen.
Die erfindungsgemäßen ungesättigten Fettsäuren sind vorzugsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs). Die erfindungsgemäßen mehrfach ungesättigten Fettsäuren umfassen vorteilhafterweise mindestens zwei, vorteilhafterweise drei, vier, fünf oder sechs Doppelbindungen. Die Fettsäuren umfassen besonders vorteilhafterweise zwei, drei, vier oder fünf Doppelbindungen. Ungesättigte Fettsäuren umfassen vorzugsweise 20 oder 22 Kohlenstoffatome in der Fettsäurekette. Gesättigte Fettsäuren werden vorteilhafterweise in vernachlässigbarem Maß oder gar nicht durch die bei dem Verfahren verwendeten Nukleinsäuren umgesetzt. In vernachlässigbarem Maß soll so verstanden werden, dass es bedeutet, dass die gesättigten Fettsäuren mit weniger als 5% der Aktivität, vorteilhafterweise weniger als 3%, besonders vorteilhafterweise mit weniger als 2% der Aktivität in Vergleich zu mehrfach ungesättigten Fettsäuren umgesetzt werden. Diese Fettsäuren, die produziert worden sind, können bei dem Verfahren als einzelnes Produkt produziert werden oder in einem Fettsäuregemisch vorliegen.
Vorteilhafterweise sind die Substituenten R² oder R³ in den allgemeinen Formeln I und II unabhängig voneinander gesättigtes oder ungesättigtes C₂₀-C₂₂-Alkylcarbonyl; besonders vorteilhaft sind sie unabhängig voneinander ungesättigtes C₂₀- oder C₂₂-Alkylcarbonyl mit mindestens zwei Doppelbindungen.
Die erfindungsgemäßen mehrfach ungesättigten Fettsäuren sind vorzugsweise in Membranlipiden und/oder Triacylglyceriden gebunden, können aber in den Organismen auch als freie Fettsäuren oder auch in Form anderer Fettsäureester gebunden vorkommen. In diesem Zusammenhang können sie als ”reine Produkte” oder auch vorteilhafterweise in Form von Gemischen verschiedener Fettsäuren oder Gemischen verschiedener Glyceride vorhanden sein. Die verschiedenen Fettsäuren, die in den Triacylglyceriden gebunden sind, können von kurzkettigen Fettsäuren mit 4 bis 6 C-Atomen, Fettsäuren mittlerer Kettenlänge mit 8 bis 12 C-Atomen oder langkettigen Fettsäuren mit 14 bis 24 C-Atomen stammen. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die langkettigen Fettsäuren, besonders die langkettigen PUFAs (LCPUFAs) von C₂₀- und/oder C₂₂-Fettsäuren, bevorzugt.
Bevorzugte ungesättigte Fettsäuren im Sinne der vorliegenden Erfindung werden aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus ARA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17) und DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19). Die ARA, EPA und/oder DHA, die bei dem Verfahren produziert werden, können, wie vorstehend beschrieben, in Form von Fettsäurederivaten, zum Beispiel Sphingolipiden, Phosphoglyceriden, Lipiden, Glykolipiden, Phospholipiden, Monoacylglycerin, Diacylglycerin, Triacylglycerin oder anderen Fettsäureestern, vorliegen. Die ARA, EPA und/oder DHA und andere mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die vorliegen, können zum Beispiel durch Behandlung mit Alkali, zum Beispiel wässrigem KOH oder NaOH, oder saurer Hydrolyse, vorteilhafterweise in Anwesenheit eines Alkohols, wie Methanol oder Ethanol, oder über enzymatische Spaltung freigesetzt werden und zum Beispiel durch Phasentrennung und anschließende Ansäuerung, zum Beispiel mit H₂SO₄, isoliert werden. Die Fettsäuren können auch direkt ohne den vorstehend beschriebenen Arbeitsschritt freigesetzt werden.
Der Begriff ”Desaturase-Zielmolekül” umfasst vorzugsweise Substrate der erfindungsgemäßen Polypeptide. Bei einem besonders bevorzugten Zielmolekül handelt es sich um Ölsäure, Linolsäure, γ-Linolensäure, α-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure (n-3), Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosapentaensäure.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für die Herstellung von Öl bereit, das die Schritte der vorstehend erwähnten Verfahren und den weiteren Schritt der Formulierung oder Isolation eines Öls, das die ungesättigte Fettsäure umfasst, umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, einer Pflanze oder eines Pflanzensamens, die/der in der Lage ist, eine ungesättigte Fettsäure zu erzeugen, umfassend das Einbringen des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder des erfindungsgemäßen Vektors in die Wirtszelle, die Pflanze oder den Pflanzensamen.
Die vorliegende Erfindung umfasst Öl, das durch die erfindungsgemäße Pflanze oder den erfindungsgemäßen Pflanzensamen produziert wird und durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist, oder durch eine Wirtszelle, eine Pflanze oder einen Pflanzensamen, die/der durch das vorstehend erwähnte Verfahren produziert wird, erhältlich ist.
Der Begriff ”Öl” betrifft ein Fettsäuregemisch, das ungesättigte oder gesättigte, vorzugsweise veresterte, Fettsäure(n) umfasst. Das Öl enthält vorzugsweise viel mehrfach ungesättigte freie oder vorteilhafterweise veresterte Fettsäure(n), insbesondere die bevorzugten LCPUFAs, wie hier vorstehend angegeben. Die Menge an ungesättigten veresterten Fettsäuren macht vorzugsweise bis etwa 30% aus, ein Gehalt von 50% ist stärker bevorzugt, ein Gehalt von 60%, 70%, 80% oder mehr ist noch stärker bevorzugt. Für die Analyse kann der Fettsäuregehalt zum Beispiel durch GC bestimmt werden, nachdem die Fettsäuren durch Umesterung in die Methylester umgewandelt wurden. Das Öl kann verschiedene andere gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren umfassen, zum Beispiel Calendulinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Stearinsäure, Ölsäure und dergleichen. Der Gehalt der verschiedenen Fettsäuren in dem Öl oder Fett kann, insbesondere je nach dem Ausgangsorganismus, variieren. Das Öl soll jedoch in Bezug auf die Zusammensetzung und den Gehalt an ungesättigten Fettsäuren eine nicht-natürlicherweise vorkommende Zusammensetzung haben. Außerdem kann das erfindungsgemäße Öl auch andere Molekülspezies umfassen. Insbesondere kann es kleinere Verunreinigungen mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen umfassen. Solche Verunreinigungen können jedoch nur durch hochempfindliche Techniken, wie PCR, nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung schließt auch ein Verfahren für die Herstellung eines Arzneimittels ein, das die Schritte der erfindungsgemäßen Verfahren und den weiteren Schritt der Formulierung eines Arzneimittels, das die ungesättigte Fettsäure umfasst, umfasst.
Der Begriff ”Arzneimittel” wird hier austauschbar mit dem nachstehend im Einzelnen erläuterten Begriff ”pharmazeutische Zusammensetzung” verwendet. Der Begriff ”Arzneimittel” oder ”pharmazeutische Zusammensetzung”, wie er hier verwendet wird, umfasst die erfindungsgemäßen Verbindungen und gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als pharmazeutisch annehmbare Salze formuliert werden. Annehmbare Salze sind u. a. Acetat, Methylester, HCl, Sulfat, Chlorid und dergleichen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden vorzugsweise topisch oder systemisch verabreicht. Geeignete Verabreichungswege, die herkömmlicherweise für die Arzneistoffverabreichung verwendet werden, sind orale, intravenöse oder parenterale Verabreichung sowie Inhalation. Je nach der Art und Weise der Wirkung einer Verbindung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen jedoch auch auf anderen Wegen verabreicht werden. Zum Beispiel können Polynukleotidverbindungen in einem Gentherapieansatz unter Verwendung von viralen Vektoren oder Viren oder Liposomen verabreicht werden.
Außerdem können die Verbindungen in Kombination mit anderen Arzneistoffen entweder in einer gemeinsamen pharmazeutischen Zusammensetzung oder als getrennte pharmazeutische Zusammensetzungen verabreicht werden, wobei die getrennten pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form eines Kits von Teilen bereitgestellt werden können.
Die Verbindungen werden vorzugsweise in herkömmlichen Dosierungsformen verabreicht, die hergestellt werden, indem man die Arzneistoffe mit pharmazeutischen Standard-Trägern gemäß herkömmlichen Verfahren vereinigt. Diese Verfahren können Mischen, Granulieren oder Lösen der Inhaltsstoffe, wie angemessen, zu der gewünschten Zubereitung beinhalten. Man erkennt, dass die Form und Art der pharmazeutisch annehmbaren Träger oder des pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittels durch die Menge an Wirkstoff, mit dem er vereinigt werden soll, dem Verabreichungsweg und anderen bekannten Variablen vorgegeben wird.
Der (die) Träger muss/müssen in dem Sinne annehmbar sein, dass er/sie mit den anderen Inhaltstoffen der Formulierung kompatibel ist/sind und für deren Empfänger nicht schädlich ist/sind. Der eingesetzte pharmazeutische Träger kann zum Beispiel entweder ein Feststoff, ein Gel oder eine Flüssigkeit sein. Beispielhaft für feste Träger sind Lactose, Kaolin, Saccharose, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Gummiarabicum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen. Beispielhaft für flüssige Träger sind phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Sirup, Öl, wie Erdnussöl und Olivenöl, Wasser, Emulsionen, verschiedene Typen von Benetzungsmitteln, sterile Lösungen und dergleichen. Ebenso kann der Träger oder das Verdünnungsmittel ein im Stand der Technik bekanntes Zeitverzögerungsmaterial, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder mit einem Wachs einschließen. Diese geeigneten Träger umfassen die vorstehend genannten und andere im Stand der Technik bekannte, siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Das (die) Verdünnungsmittel wird/werden derart gewählt, dass es (sie) die biologische Aktivität der Kombination nicht beeinflussen. Beispiele für solche Verdünnungsmittel sind destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Ringer-Lösungen, Dextroselösung und Hank-Lösung. Außerdem kann die pharmazeutische Zusammensetzung oder Formulierung auch andere Träger, Adjuvantien, oder nichttoxische, nichttherapeutische, nichtimmunogene Stabilisatoren und dergleichen einschließen.
Eine therapeutisch wirksame Dosis betrifft eine Menge der Verbindungen, die in einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden sollen, die die Symptome, die eine Krankheit oder einen Zustand begleiten, die/der in dieser Beschreibung genannt wird, verhindert, verbessert oder behandelt. Therapeutische Wirksamkeit und Toxizität solcher Verbindungen können durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren bestimmt werden, z. B. ED50 (die Dosis, die in 50% der Population therapeutisch wirksam ist) und LD50 (die Dosis, die für 50% der Population letal ist). Das Dosisverhältnis zwischen therapeutischen und toxischen Wirkungen ist der therapeutische Index, der als das Verhältnis LD50/ED50 ausgedrückt werden kann.
Das Dosierungsschema wird durch den behandelnden Arzt und andere klinische Faktoren; vorzugsweise gemäß einem der vorstehend beschriebenen Verfahren, bestimmt. Wie auf dem medizinischen Fachgebiet bekannt ist, hängen die Dosierungen für einen Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe, der Körperoberfläche, dem Alter des Patienten, der bestimmten Verbindung, die verabreicht werden soll, dem Geschlecht, der Zeit und dem Weg der Verabreichung, dem allgemeinen Gesundheitszustand und anderen Arzneistoffen, die gleichzeitig verabreicht werden. Ein Fortschritt kann durch periodische Untersuchung überwacht werden. Eine typische Dosis kann zum Beispiel im Bereich von 1 bis 1000 μg liegen; es werden jedoch Dosen unterhalb oder oberhalb dieses beispielhaften Bereichs in Betracht gezogen, wobei besonders die vorstehend erwähnten Faktoren berücksichtigt werden. Gewöhnlich sollte das Dosierungsschema als regelmäßige Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung im Bereich von 1 μg bis 10 mg Einheiten pro Tag liegen. Wenn es sich bei dem Schema um eine kontinuierliche Infusion handelt, sollte es ebenfalls jeweils in dem Bereich von 1 μg bis 10 mg Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute liegen. Ein Fortschritt kann durch periodische Untersuchung überwacht werden. Die Menge an Substanzverabreichung kann jedoch je nach dem Individuum und der Verabreichungsweise über einen breiten Bereich variieren.
Die hier angegebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen und Formulierungen werden mindestens einmal verabreicht, um eine in dieser Beschreibung genannte Erkrankung oder einen Zustand zu lindern oder zu verhindern. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können jedoch mehr als einmal, zum Beispiel von ein- bis viermal täglich, bis zu einer unbegrenzten Anzahl von Tagen verabreicht werden.
Spezifische pharmazeutische Zusammensetzungen werden auf eine im pharmazeutischen Fachgebiet bekannte Weise hergestellt und umfassen mindestens einen hier vorstehend angegebenen Wirkstoffe im Gemisch oder anderweitig in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel. Zur Herstellung solcher spezifischer pharmazeutischer Zusammensetzungen wird der (werden die) Wirkstoff(e) in der Regel mit einem Träger oder dem Verdünnungsmittel gemischt oder in eine Kapsel, ein Säckchen, eine Stärkekapsel, ein Papier oder andere geeignete Behälter oder Vehikel eingeschlossen oder eingekapselt. Die erhaltenen Formulierungen müssen an die Verabreichungsweise angepasst werden, d. h. in Form von Tabletten, Kapseln, Suppositorien, Lösungen, Suspensionen oder dergleichen. Dosierungsempfehlungen sollen in den Verschreibungsanweisungen oder Gebrauchsanweisungen angegeben sein, so dass Dosisanpassungen je nach dem betrachteten Empfänger vorweggenommen werden.
Für kosmetische Anwendungen können die hier als pharmazeutische Wirkstoffe der Arzneimittel angegebenen Verbindungen als Haartonikum, Haarwiederherstellungszusammensetzung, Shampoo, Pulver, Gel, Haarspülung, Salbe, Haarlotion, Paste, Haarcreme, Haarspray und/oder Haaraerosol formuliert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel, das das erfindungsgemäße Polynukleotid, den erfindungsgemäßen Vektor, die erfindungsgemäße Wirtszelle, das erfindungsgemäße Polypeptid, die erfindungsgemäße Pflanze oder den erfindungsgemäßen Pflanzensamen oder das erfindungsgemäße Öl umfasst.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Polynukleotids, des erfindungsgemäßen Vektors, der erfindungsgemäßen Wirtszelle, des erfindungsgemäßen Polypeptids, der erfindungsgemäßen Pflanze oder des erfindungsgemäßen Pflanzensamens oder des erfindungsgemäßen Öls zur Herstellung eines Tierfutters, einer Nahrungsergänzung oder eines Nahrungsmittels.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung eine Zelle, die ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

a) einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35, 37, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 135, 137 oder 139 umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül durch mindestens eine Technik disrumpiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition, einer Substitution und homologer Rekombination;
b) einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35, 37, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 135, 137 oder 139 umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül eine oder mehrere Nukleinsäuremodifikationen verglichen mit der in SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35, 37, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 135, 137 oder 139 dargestellten Sequenz umfasst, wobei die Modifikation aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition und einer Substitution; und
c) einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35, 37, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 135, 137 oder 139 umfasst, wobei die regulatorische Region des Nukleinsäuremoleküls verglichen mit der regulatorischen Wildtypregion des Moleküls durch mindestens eine Technik modifiziert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition, einer Substitution und homologer Rekombination.

Die Inhalte sämtlicher in dieser gesamten Anmeldung genannter Literaturstellen werden in Allgemeinen und in Bezug auf ihren vorstehend beschriebenen spezifischen Offenbarungsinhalt durch Bezugsnahme aufgenommen.
FIGUREN
1 zeigt verschiedene Synthesewege für die Biosynthese von ω-6- und ω-3-Fettsäuren.
2 zeigt das Alignment der SEQ ID Nr.: 2, 4, 6, 8, 32, 34, 36 und 38 auf Basis des ClustalW-Algorithmus.
3 zeigt Gaschromatographiespuren, die die Umwandlung von Ölsäure (18:1Δ9) in Linolsäure (18:2Δ9,12) zeigen, was die Δ12-Desaturase-Aktivität von d12Des(Dt) (B), d12Des(Dn) (C) und d12Des(Sn) (D) nachweist. In (A) ist die Vektorkontrolle ohne irgendeine d12-Desaturase-Aktivität gezeigt.
4 zeigt Gaschromatographiespuren, die die Umwandlung von Linolsäure (18:2Δ9,12) in α-Linolensäure (18:3Δ9,12,15) zeigen, was die Δ15-Desaturase-Aktivität von d15Des(Cyh) (A) nachweist. In (B) ist das Fehlen einer Δ12-Desaturase-Aktivität für d15Des(Cyh) gezeigt.
5 zeigt die Konstruktion der binären Vektoren Napin-A, Napin-3, Napin-4, Napin-5 für die Pflanzentransformation.
6 zeigt Gaschromatographiespuren von Samenöl aus Brassica napus-Linien, die mit dem Konstrukt LJB1139, das einen hohen EPA-Spiegel produziert, transformiert wurden.
BEISPIELE
Die Erfindung wird im Folgenden detaillierter anhand der folgenden Beispiele beschrieben, die jedoch in keiner Weise als beschränkend für den Umfang dieser Erfindung angesehen werden sollten.
Beispiel 1: Klonierung von Desaturasen aus Drechslera tritici-repentis, Cylindorcarpon heteronema, Diplodia natalensis, Stagonospora nodorum, Microdochium nivalae und Periplaneta americana
Materialien und Verfahren.
Züchtung und Ernte von Drechslera tritici-repentis, Cylindorcarpon heteronema, Diplodia natalensis, Stagonospora nodorum und Microdochium nivalae

Die Pilze wurden von der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellen, Braunschweig) erhalten und auf Platten unter folgenden Bedingungen gezüchtet:

Drechslera tritici-repentis	2% Malz, 0,8% Agar	18–22°C
Cylindorcarpon heteronema	2% Limabohne, 0,8% Agar	24°C
Diplodia natalensis	2% Malz, 0,8% Agar	22°C
Stagonospora nodorum	CzapekDox-V8-Agar mit 15 g Saccharose	18°C

Die RNA-Isolation erfolgte gemäß dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung des RNAeasy-Kits von Qiagen.
Züchtung und Ernte von P. americana.
Periplaneta americana wurden bei 25–30°C und einer Feuchtigkeit von 70–80% auf Gartenerde gezüchtet. Als Futter wurde Hundefutter, dem frisches Gemüse hinzugefügt wurde, verwendet. Die RNA-Isolation erfolgte, wie in EP0464553 beschrieben.
Nukleinsäuremanipulation und PCR-basierte Klonierung.
Die RNA-Isolation erfolgte, wie vorstehend beschrieben. Die Transkripte wurden mittels reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) analysiert. Die Erststrang-cDNA wurde aus Gesamt-RNA unter Verwendung des SMART RACE cDNA-Amplificationskits (BD-Clontech, Basingstoke, UK) gemäß den Anleitungen des Herstellers synthetisiert. Die einzelsträngigen cDNAs wurden mit folgenden Primern amplifiziert.
Verwendete Primer für die Klonierung der Drechslera tritici-repentis-, Cylindorcarpon heteronema-, Diplodia natalensis-, Stagonospora nodorum- und Microdochium nivalae-Desaturasen:
Verwendete Primer für die Klonierung der Periplaneta americana-Desaturasen:
Degenerierte Primer stehen in der IUPAC-Standardnomenklatur.
Die PCR-Amplifikation erfolgte auf folgende Weise: Die Reaktionen wurden auf 95°C für 2 min erhitzt, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 30 s, 30 s bei Temperaturen im Bereich von 55 bis 72 je nach dem Design des Primers und 72°C für 2 min, anschließend erfolgte ein einzelner Schritt bei 72°C für 10 min. Die PCR-Amplifikationsprodukte wurden in den TOPO-Vektor (Invitrogen) kloniert und durch Sequenzierung überprüft.
Von dem vorstehend beschriebenen Satz von Primern lieferten nur die Primerpaare Zan348-350 und Sen014-015 Fragmente mit Sequenzhomologien zu Desaturasen.
Unter Verwendung des Smart-RACE-Kits (BD-Clontech, Basingstoke, UK) gemäß dem Protokoll des Herstellers wurden die 5'- und 3'-Bereiche der DNA-Abschnitte weiter untersucht.
Volllängen-Sequenzen wurden mit den in Tabelle 1 beschriebenen Primerpaaren erhalten.
Tabelle 1: Amplifikation von Volllängen-Desaturase-Genen

Aus den Volllängen-Fragmenten wurden die ORF-Sequenzen und die Aminosäuresequenzen abgeleitet (Tabelle 2). Tabelle 2: Aminosäuresequenzen von Desaturase-Genen

Bezeichnung des Gens	Aminosäuresequenz-Länge	SEQ ID
D12Des(Dt)	447	2
D15Des(Cyh)	408	4
D12Des(Dn)	493	6
D12Des(Sn)	494	8
D12Des(Mn)	324	32
D15Des(Mn)	402	34
dXDes(Pa)_1	357	36
dXDes(Pa)_2	356	38

PCR-Fragmente für Volllängen-Sequenzen wurden in den pCR-bluntII-TOPO-Vektor (Invitrogen) gemäß dem Protokoll des Herstellers kloniert und durch Sequenzieren überprüft.
Klonierung von Hefe-Expressionsvektoren

Für die Expression und Charakterisierung in Hefe wurden ORF-Sequenzen der neuen Desaturase-Gene in den Vektor pYES2-TOPO (Invitrogen) kloniert, indem die ORF-Sequenz mit Primern unter Hinzufügung einer Kozak-Sequenz am 5'-Ende amplifiziert wurde (Tabelle 3). Es wurde dasselbe PCR-Protokoll verwendet, wie vorstehend beschrieben. Die in Tabelle 4 beschriebenen Vektoren wurden hergestellt und für die funktionelle Charakterisierung der neuen Desaturase-Gene verwendet. Tabelle 3: Primerpaare für die Amplifikation von ORF-Sequenzen aus neuen Desaturasen

Tabelle 4: Hefe-Expressionsvektoren

Bezeichnung des Gens	ORF SEQ ID Nr.:	Expressionsvektor	Kurzbezeichnung des Expressionsvektors
D12Des(Dt)	126	pYES2-bluntII-TOPO-d12Des(Dt)	pYES-Dt
D15Des(Cyh)	127	pYES2-bluntII-TOPO-d12Des(Cyh)	pYES-Cyh
D12Des(Dn)	128	pYES2-bluntII-TOPO-d12Des(Dn)	pYES-Dn
D12Des(Sn)	129	pYES2-bluntII-TOPO-d12Des(Sn)	pYES-Sn
D12Des(Mn)	31	pYES2-bluntII-TOPO-d12Des(Mn)	pYES-12Mn
D15Des(Mn)	130	pYES2-bluntII-TOPO-d12Des(Mn)	pYES-15Mn
dXDes(Pa)_1	131	pYES2-bluntII-TOPO-d12Des(Pa)	pYES-Pa1
dXDes(Pa)_2	132	pYES2-bluntII-TOPO-d12Des(Pa)	pYES-Pa2

Funktionlle Charakterisierung in Saccharomyces cerevisiae.
Der S. cerevisiae-Stamm INVSC (Invitrogen) wurde mit den in Tabelle 4 beschriebenen Konstrukten oder dem leeren Vektor (pYES2-bluntII-TOPO) als Kontrolle transformiert. Die transformierten Zellen wurden in einem Minimalmedium, das Raffinose enthielt, gezüchtet und mit 2% Galactose induziert. Nach 48-stündigem Wachstum wurden die Gesamt-Hefe-Fettsäuren extrahiert und die erhaltenen FAMEs mittels GC analysiert.
Die GC-Analyse von Hefe, die mit pYES-Dt, pYES-Dn und pYES-Sn (3) transformiert worden war, zeigte, dass eine zusätzliche Fettsäure produziert wurde, die als Linolsäure identifiziert wurde, was zeigt, dass das Gen, das wir kloniert hatten, eine delta12-Desaturase kodiert. Hefezellen, die die delta12-Desaturasen exprimieren, sind in der Lage, ein C18:1^Δ9-Substrat zu erkennen. Wenn die Fettsäure 18:2^Δ9,12 zu dem Hefemedium hinzugefügt wurde, konnten weitere Unterschiede zwischen den einzelnen Desaturasen identifiziert werden. Außerdem wird auch eine andere Fettsäure aus der Hefe-Lipidzusammensetzung 16:1^Δ7 in Hefe, die mit pYES-Dn und pYES-Sn transformiert ist, in 16:2^Δ7,10 umgewandelt, wohingegen Zellen mit pYES-Dt diese Aktivität nicht aufweisen.
Die verschiedenen Aktivitäten, wie in Tabelle 5 angegeben, zeigen die funktionelle Aktivität der neuen Desaturasen. Aufgrund ihrer Hauptaktivität werden sie als d12-Desaturase bezeichnet. Weiterhin sind die anderen Aktivitäten der Beweis, dass die neu entdeckten Desaturasen sich voneinander unterscheiden und neue Aktivitäten für diese Enzymklasse aufweisen, was bisher noch nicht gezeigt wurde. Insbesondere war die hohe Aktivität der d12Des(Dn) unerwartet und wurde unseres Wissens nach für keine bekannte d12-Desaturase beschrieben.
Für d15Des(Cyh) konnte eine Aktivität nur mit 18:2^Δ9,12 gezeigt werden, wobei 18:2^Δ9,12 in 18:3^Δ9,12,15 umgewandelt wurde. Daher hat die d15Des(Cyh) eine delta15-Desaturase-Aktivität und wurde deshalb als Δ15-Desaturase bezeichnet.

Die prozentuale Umwandlung zum Beispiel von 18:1^Δ9 in 18:2^Δ9,12 wird anhand folgender Gleichung berechnet:

Tabelle 5: Funktionelle Charakterisierung der neu entdeckten Desaturasen

Bezeichnung des Gens	Umwandlungsrate von 18:1 in 18:2 in %	Umwandlungsrate von 16:1 in 16:2 in %	Umwandlungsrate von 18:2 in 18:3 in %
D12Des(Dt)	27,5	-	6,3
D15Des(Cyh)	-	-	14,9
D12Des(Dn)	76,3	49,3	-
D12Des(Sn)	52,5	31,2	-

Beispiel 2: Herstellung von Konstrukten für die Expression in Pflanzen
Für die Expression neuer Desaturase-Gene in Pflanzen werden binäre Plasmide für die Agrobacterium-Transformation gestaltet.

Weiterhin wurden Konstrukte für die multiple Expression des gesamten Wegs hin zu Eicosapentaensäure konstruiert. Diese Konstrukte nutzen eine Reihe enzymatischer Aktivitäten, nämlich d12-Desaturase (Umwandlung von Öl- in Linolsäure), d15-Desaturase (Umwandlung von Linol- in Linolensäure), d6-Desaturase (Umwandlung von Linol- und Linolensäure in γ-Linolen bzw. Stearidonsäure), d6-Elongase (Umwandlung von γ-Linolen- und Stearidonsäure in Dihomogammalinolen- und Eicosatetraensäure), d5-Desaturase (Umwandlung von Dihomogammalinolen- und Eicosatetraensäure in ARA und EPA), ω3-Desaturase (Umwandlung von ARA in EPA). Ein solches Konstrukt wurde unter Verwendung molekularbiologischer Standardverfahren, die einem Fachmann bekannt sind, zusammengebaut. Die Sequenz des vollständigen binären Vektors (LJB1139) ist in SEQ ID Nr.: 71 aufgelistet. Die Vektorelemente werden in Tabelle 6 beschrieben. Tabelle 6: Funktionelle Elemente des binären Vektors LJB1139, der von SEQ ID Nr.: 68 dargestellt wird.

Element	Beschreibung	Position vom Start	SEQ ID Nr.:
D6Elo(Tp)	D6-Elongase Thalassiosira pseudonana	1780-2598	11
D6Des(Ot)	D6-Desaturase Ostreococcus tauri	3756-5126	19
D12Des(Ps)	D12-Desaturase Phytophtora sojae	6484-7680	21
O3Des(Pi)	ω3-Desaturase Phytophtora infestans	8873-9958	17
D5Des(Tc)	D5-Desaturase Thraustochytrium ssp.	11622-12941	13
D15Des(At)	D15-Desaturase Arabidopsis thaliana	17834-18994	23
BnFae1	Promoter BnFAE1	347-1776	76
t-bnfae1	Terminator bnfae1	2612-3011	77
VfUSP	Promoter VfUSP	3061-3744	78
t-camv	Terminator CaMV-35S	5179-5394	79
BnACP	Promoter BnACP	5466-6465	80
t-bnacp	Terminator BnACP	7694-8075	81
BnNapin	Promoter BnNApin	8206-8869	82
tE9	Terminator tE9	9959-10516	83
LuCon	Promoter LuCon	10545-11583	84
tOCS	Terminator tOCS	12993-13184	85
BnNapin	Promoter BnNApin	13263-13926	82
tE9	Terminator tE9	15348-15905	83
VfSBP	Promoter VfSBP	16827-17824	86
tCatpA	Terminator tCatpA	19022-19256	87

Weiterhin wurden andere binäre Vektoren gemäß den folgenden experimentellen Schritten konstruiert:
Zum Aufbauen der Konstrukte Napin-3, Napin-4 und Napin-5 wurde eine Dreifachkassette, die drei napin-Promotoren, drei verschiedene Mehrfachklonierungsstellen-Linker und drei Octopinsynthase-(OCS-)Terminatoren enthielt, in dem Plasmid pUC19 (Genbank M77789) konstruiert. Eine Drei-Gene-Konstrukt wurde aufgebaut, indem PiΔ6, ein Δ6-Desaturase-Gen aus Pythium irregulare (Hong et al., 2002 High-level Production of γ-linolenic acid in Brassica juncea using a Δ6 desaturase from Pythium irregulare. Plant Physiol. 129, 354–362) (SEQ ID Nr.: 9), TcΔ5, ein Δ5-Desaturase-Gen aus Thraustochytrium sp. ATCC 26185 (Qiu et al., 2001 Identification of a Δ4 fatty acid desaturase from Thraustochytrium sp. involved in the biosynthesis of docosahexanoic acid by heterologous expression in Sacchcaromyces cerevisiae and Brassica juncea. J. Biol. Chem. 276, 31561–31566) (SEQ ID Nr.: 13) und TpElo, ein Elongase-Gen aus Thalassiosira pseudonana (Meyer et al., 2004 Novel fatty acid elongases and their use for the reconstitution of docosahexaenoic acid biosynthesis. J. Lipid Res. 45, 1899–1909) (SEQ ID Nr.: 11) in diese Kassette inseriert wurden. Für das Vier-Gene-Konstrukt Napin-4 wurde ein XhoI/SalI-Fragment, das das Desaturase-Gen CpDesX aus Claviceps purpurea (Meesapyodsuk et al., 2007 Primary structure, regioselectivity, and evolution of the membrane bound fatty acid desaturases of Claviceps purpurea. J. Biol. Chem. 282, 20191–20199) (SEQ ID Nr.: 25), verknüpft mit einem napin-Promotor und OCS-Terminator, enthielt, aus einem Einzel-Gen-Konstrukt entfernt und in das Dreifach-Gen-Konstrukt subkloniert. Für das Fünf-Gene-Konstrukt Napin-5 wurde derselbe Ansatz verwendet, um ein ω3-Desaturase-Gen aus Pythium irregulare (Pi-ω3) (SEQ ID Nr.: 17) hinzuzufügen. Schließlich wurden diese 3-, 4-, und 5-Gene-Konstrukte aus pUC19 durch Spaltung mit AscI ausgeschnitten und in den binären Vektor pSUN2 (5) kloniert. Das Napin-A-Konstrukt, das die gleichen, vorstehend beschriebenen Δ5- und Δ6-Desaturasen plus eine Δ6-Elongase aus Thraustochytrium sp. (SEQ ID Nr.: 15), ein ω3-Desaturase-Gen aus Phytophtera infestans (SEQ ID Nr.: 17) und eine Δ12-Desaturase aus Calendula officianalis (SEQ ID Nr.: 72) enthielt, wurde konstruiert, wie in Wu et al. (2005) Stepwise engineering to produce high yields of very long-chain polyunsaturated fatty acids in plants. Nat. Biotechnol. 23, 1013–1017) beschrieben. Napin-A stellt ein Fünf-Gene-Konstrukt dar, wobei jedes Gen unter der Kontrolle des napin-Promotors steht.
Alle binären Vektoren wurden durch Elektroporation in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 (pMP90) überführt.
Die erhaltenen Agrobacterium-Stämme wurden anschließend für die Herstellung transgener Pflanzen verwendet (Deblaere et al. 1984, Nucl. Acids. Res. 13: 4777–4788).
Beispiel 3: Herstellung transgener Pflanzen
a) Herstellung von transgenen Rapspflanzen (geändertes Protokoll gemäß Moloney et al. 1992, Plant Cell Reports, 8: 238–242)
Für die Transformation von Rapspflanzen wurde eine 1:50-Verdünnung einer Übernachtkultur von positiv transformierten Agrobakterienkolonien, die in Murashige-Skoog-Medium (Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473), angereichert mit 3% Saccharose, (3MS-Medium) gezüchtet worden waren, verwendet. Petiolen oder Hypokotyledonen von sterilen Rapspflanzen wurden in einer Petrischale mit einer 1:50-Agrobakterien-Verdünnung für 5–10 Minuten inkubiert. Darauf folgte eine dreitägige Co-Inkubation im Dunkeln bei 25°C auf 3MS-Medium mit 0,8% Bacto-Agar. Nach drei Tagen wurde die Kultur auf 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit wöchentlich auf MS-Medium umgesetzt, das 500 mg/l Claforan (Cefotaxim-Natrium), 50 mg/l Kanamycin, 20 μM Benzylaminopurin (BAP) und 1,6 g/l Glucose enthielt. Die wachsenden Sprosse wurden auf MS-Medium umgesetzt, das 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar enthielt. Sogar nach drei Wochen wurde keine Wurzelbildung beobachtet, ein Wachstumshormon 2-Indolbutylsäure wurde zu dem Medium hinzugefügt, um die Wurzelbildung zu verstärken.
Die regenerierten Sprosse wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten und zum Austreiben in das Gewächshaus überführt. Nach der Blüte wurden die reifen Samen geerntet und über Lipidanalyse auf die Expression der Gene analysiert, wie in Qui et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561–31566 beschrieben.
b) Herstellung transgener Brassica carinata-Pflanzen (geändertes Protokoll gemäß Moloney et al. 1992, Plant Cell Reports, 8: 238–242)
Samen der B. carinata-Linien C90-1163 (Erucasäure-reiche Linie) und 10H3 (Linie ohne Erucasäure) wurden für die Transformation verwendet. Das von Moloney et al. (1992) beschriebene Protokoll wurde für die B. carinata-Transformation verwendet. Kotyledonen-Petiolen von 5 bis 6 Tage alten Keimlingen wurden ausgeschnitten und mit dem A. tumefaciens-Stamm GV3101 beimpft, der das gewünschte Genkonstrukt enthielt, und für zwei Tage bei 22°C co-kultiviert, bevor sie auf das Regenerationsmedium überführt wurden, das 25 mg/l Kanamycin enthielt.
c) Herstellung transgener Flachspflanzen
Die Herstellung transgener Flachspflanzen kann gemäß dem Verfahren von Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 35(6): 456–465 unter Verwendung von Partikelbeschuss durchgeführt werden. Die Agrobakterien-Transformation kann gemäß Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282–285 durchgeführt werden.
Alle erhaltenen, putativ transgenen Pflanzen wurden für sämtliche Experimente durch PCR-Analyse validiert.
Beispiel 4: Lipidextraktion
Lipide können extrahiert werden, wie in der Standardliteratur beschrieben, einschließlich Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89–90 und S. 443–613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P. A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications.
Alternativ wird die Extraktion durchgeführt, wie in Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22): 12935–12940 und Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152: 141–145 beschrieben. Die quantitative und qualitative Analyse von Lipiden oder Fettsäuren ist beschrieben in Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide – Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952)–16 (1977) u. d. T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN.
Auf der Basis der analysierten Lipide kann die Expression der eingebrachten Gene (Desaturasen und Elongasen) bestimmt werden, weil das Lipidmuster von erfolgreich transformierten Pflanzensamen sich von dem Muster von Kontrollpflanzensamen unterschiedet. Die Fettsäureanalysen von Samen wurden mittels GC durchgeführt, wie von Qiu et al. J. Biol. Chem. 276, 31561–31566 beschrieben.
Beispiel 5: Herstellung neuer Pflanzenöle
Für das Konstrukt LJB1139 (SEQ ID Nr.: 71) wurden transgene Brassica napus-Pflanzen erhalten. Die Fettsäureanalyse von Samen ergab, dass die erwarteten neuen Fettsäuren produziert wurden (6). Öl- und Linolsäure waren im Vergleich zu nicht-transgenem Brassica napus-Öl auf 11,7% bzw. 2,3% verringert. GLA (24,4%) und SDA (6,8%) sind neu produzierte Fettsäuren. Weiterhin konnten hohe Spiegel an EPA (bis zu 21,7% EPA) erzielt werden. Das Öl enthält sehr nützliche Fettsäuren für den menschlichen Verzehr und für Futter.
Weitere Genkombinationen, die nützliche Fettsäurezusammensetzungen produzieren, erhält man durch Entfernen der SEQ ID Nr.: 23 in LJB1139 und durch Hinzufügung der SEQ ID Nr.: 25, SEQ ID Nr.: 27 bzw. SEQ ID Nr.: 29. Weiterhin liefert das Entfernen der SEQ ID Nr.: 11 und das Hinzufügen der SEQ ID Nr.: 133 ein weiteres neues Fettsäurespektrum

Für die Erucasäure-reiche B. carinata-Linie wurden transgene Pflanzen erhalten, die das Napin-A-Konstrukt enthielten. Die Pflanzen produzierten die erwarteten neuen Fettsäuren (Tabelle 7). In diesen Pflanzen machten GLA und SDA durchschnittlich 18,2% bzw. 2,9% der Gesamt-Fettsäuren in Samen aus. Die Menge an ARA reichte von 0,4–4,3% (Durchschnitt: 2,8%), wohingegen EPA einen durchschnittlichen Spiegel von 9,3% erreichte, wobei der höchste beobachtete Wert 13,7% war. Die durchschnittliche Menge an DPA betrug 1,4%. Sowohl ^Δ6- als auch ^Δ5-Desaturasen arbeiteten sehr gut mit Umwandlungsspiegeln von 81,5% bzw. 87,1%, wohingegen die ^Δ6-Elongase einen Umwandlungsspiegel von 42,5% aufwies. Tabelle 7: Gaschromatographische Analyse von Samenöl aus transgenen Erucasäure-reichen B. carinata-Linien.

	Erucasäure-reiche B. carinata-Linie
Fettsäure	Kontrolle	Transgen

16:0	5,3 ± 0,7	6,3 ± 1,2
18:0	^{1,2 ± 0,2}	1,5 ± 0,4
18:1n-9 (OA)	7,3 ± 0,7	5,5 ± 3,9
18:1n-11	1,5 ± 0,2	1,7 ± 0,2
18:2n-9	0,0	0,2 ± 0,3
18:2n-6 (LA)	16,5 ± 0,9	5,8 ± 4,2
18:3n-6 (GLA)	0,0	18,2 ± 4,2
		(8,9-23,3)
18:3n-3 (ALA)	16,0 ± 1,3	2,4 ± 2,1
18:4n-3 (SDA)	0,0	2,9 ± 0,6
		(2,8-4,5)
20:1n-9	6,2 ± 1,0	4,5 ± 0,6
20:1n-7	1,4 ± 0,1	1,7 ± 0,3
20:3n-6 (DGLA)	0,0	0,9 ± 0,2
20:4n-6 (AA)	0,0	2,8 ± 1,5
		(0,4-4,3)
20:4n-3 (ETA)	0,0	1,0 ± 0,4
20:5n-3 (EPA)	0,0	9,9 ± 4,4
		(1,4-13,7)
22:5n-3 (DPA)	0,0	1,4 ± 0,9
Erucasäure	36,1 ± 2,4	25,7 ± 3,6
Andere	8,5 ± 1,5	8,4 ± 1,8

Für die Erucasäure-arme Brassica carinata-Linie wurden transgene Pflanzen erhalten, die das Napin-A-Konstrukt trugen, und die Samen enthielten die erwarteten neuen Fettsäuren in unterschiedlichen Spiegeln (Tabelle 8). Die Mengen an GLA und SDA machten durchschnittlich 29,6% (Bereich: 27,7–31,7%) bzw. 6,2% (Bereich: 3,9–8,1%) der Gesamt-Fettsäuren aus. Während ARA einen durchschnittlichen Spiegel von 6,5% (Bereich: 6,1–6,9%) besaß, erreichte EPA in einem einzelnen Samen 25,0% bei einem Durchschnitt von 20,2%. Der DPA-Gehalt machte durchschnittlich 2,5% aus. Die Gesamtmenge an neuen Fettsäuren erreichte 69,2% der Gesamt-Fettsäuren. Sowohl die ^Δ6- als auch die ^Δ5-Desaturasen arbeiteten sehr gut mit Umwandlungsspiegeln von 91,2% bzw. 87,7%. Die ^Δ6-Elongase zeigte einen Umwandlungsspiegel von 47,9% in der Erucasäure-armen B. carinata-Linie, was höher war als in einer der Erucasäure-reichen B. carinata-Linien beobachtet. Transgene Erucasäure-arme B. carinata produzierten einen der höchsten, bis heute erhaltenen Spiegel an PUFAs mit 22 Kohlenstoffatomen und dies wurde ohne Verwendung einer Elongase erzielt, die für ^Δ5-desaturierte Produkte spezifisch ist. Tabelle 8: Gaschromatographische Analyse von Samenöl aus transgenen Erucasäure-armen B. carinata-Linien.

	Erucasäure-arme B. carinata-Linie
Fettsäure	Kontrolle	Transgen

16:0	7.1 ± 0.6	5.8 ± 0.5
18:0	1.7 ± 0.3	2.1 ± 0.6
18:1n-9 (OA)	18.9 ± 8.0	4.1 ± 3.3
18:1n-11	3.5 ± 0.3	3.8 ± 0.4
18:2n-9	0.0	0.4 ± 0.8
18:2n-6 (LA)	44.1 ± 3.6	4.4 ± 1.2
18:3n-6 (GLA)	0.0	29.6 ± 1.6
		(27.7-31.7)
18:3n-3 (ALA)	21.0 ± 6.4	2.3 ± 0.7
18:4n-3 (SDA)	0.0	6.2 ± 1.7
	0.0	(3.9-8.1)
20:1n-9	0.0	0.0
20:1n-7	0.0	0.0
20:3n-6 (DGLA)	0.0	2.0 ± 0.7
20:4n-6 (AA)	0.0	6.5 ± 0.3
	0.0	(6.1-6.9)
20:4n-3 (ETA)	0.0	2.1 ± 0.7
20:5n-3 (EPA)	0.0	20.2 ± 4.5
	0.0	(15.3-25.0)
22:5n-3 (DPA)	0.0	2.5 ± 0.7
Erucic	0.0	0.0
Other	3.8 ± 0.7	8.1 ± 0.5

Die Wirkungen von zwei Desaturasen auf die EPA-Produktion in B. carinata

Ein minimaler Satz von drei Genen, der eine Δ5-Desaturase, eine Δ6-Desaturase und eine Δ6-Elongase umfasst, ist für die Synthese von ARA und EPA aus endogener LA (18:2^Δ9,12) und ALA (18:3^Δ9,12,15) erforderlich. Um die Beiträge der zwei neuen Desaturase-Gene, CpDesX und Pi-ω3, zu der EPA-Produktion in transgenen Pflanzen zu quantifizieren, mussten wir die Basisspiegel von ARA und EPA in Pflanzen kennen, die den minimalen Satz von drei Transgenen trugen. Zu diesem Zweck wurde ein Genkonstrukt Napin-3 (5), das eine Δ6-Desaturase aus Pythium irregulare (SEQ ID Nr.: 9), eine Δ5-Desaturase aus Thraustochytrium sp. (SEQ ID Nr.: 13) und eine Δ6-Elongase aus Thalassiosira pseudonana (SEQ ID Nr.: 11) enthielt, in die Erucasäure-reiche B. carinata-Linie eingebracht. In transgenen Samen von Pflanzen, die Napin-3 enthielten, machten GLA und SDA durchschnittlich 17,6% bzw. 4,3% der Gesamt-Fettsäuren aus (Tabelle 9). Die Menge an ARA erreichte 12,2% (Durchschnitt: 8,4%), und EPA wies einen durchschnittlichen Spiegel von 2,3% (Bereich: 0,8%–3,5%) auf. Die Δ6- und Δ5-Desaturasen arbeiteten sehr gut mit Substrat-Umwandlungsspiegeln von 73,7% bzw. 85,6%, wohingegen der Umwandlungsspiegel der Δ6-Elongase 36,3% betrug. Die Gesamtmenge der neuen ω-6-Fettsäuren (GLA, DGLA und AA) machte 27,5% der Samenfettsäuren aus, wohingegen die ω3-Fettsäuren (SDA, ETA und EPA) 6,9% ausmachten, was darauf hindeutet, dass der ω6-Weg effizienter arbeitete als der ω3-Weg. Tabelle 9: Gaschromatographische Analyse von Samenöl aus transgenen Erucasäure-reichen B. carinata-Linien, die mit dem Konstrukt Napin-3 transformiert waren.

Fettsäure	Wildtyp	Napin-3

16:0	5,3 ± 0,7	7,2 ± 1,5
18:0	1,2 ± 0,2	1,4 ± 0,4
18:1n-9 (OA)	7,3 ± 0,7	8,2 ± 3,8
18:1n-11	1,5 ± 0,2	2,2 ± 0,7
18:2n-9	0,0	2,0 ± 1,6
18:2n-6 (LA)	16,5 ± 0,9	3,6 ± 6,9
18:3n-6 (GLA)	0,0	17,6 ± 3,8
		(13,7-24,2)
18:3n-3 (ALA)	16,0 ± 1,3	2,0 ± 0,6
18:4n-3 (SDA)	0,0	4,3 ± 1,3
		(2,4-6,3)
20:1n-9	6,2 ± 1,0	4,8 ± 1,3
20:1n-7	1,4 ± 0,1	1,8 ± 0,5
20:3n-6 (DGLA)	0,0	1,5 ± 0,9
20:4n-6 (AA)	0,0	8,4 ± 2,5
		(4,3-12,2)
20:4n-3 (ETA)	0,0	0,3 ± 0,4
20:5n-3 (EPA)	0,0	2,3 ± 0,8
		(0,8-3,5)
Erucasäure	36,1 ± 2,4	25,3 ± 7,3
Andere	8,5 ± 1,5	7,2 ± 1,0

In Experimenten in Hefe war das 18-Kohlenstoffatome-ω3-Desaturase-Gen CpDesX in der Lage, LA in ALA und GLA in SDA umzuwandeln (Meesapyodsuk et al., 2007). Wir waren der Ansicht, dass eine Erhöhung des anfänglichen ω3-Substrats ALA und/oder der Umwandlung von GLA in SDA zu höherer EPA-Produktion führen könnte. Um zu bestimmen, ob CpDesX den Spiegel an ω3-Fettsäuren in Pflanzen erhöhen kann, wurde dieses Gen zu dem Drei-Gene-Konstrukt Napin-3 hinzugefügt, was zu dem Vier-Gene-Konstrukt Napin-4 führte. Transgene Pflanzen wurden erhalten. Die Expression von CpDesX (SEQ ID Nr.: 25) erhöhte im Wesentlichen die Spiegel an ω3-Fettsäuren; SDA erreichte 9,4% in einem einzelnen Samen und der durchschnittliche Spiegel betrug 6,3%, wohingegen sich die durchschnittlichen EPA-Spiegel von den 2,3%, die in transgenen Samen gefunden wurden, die Napin-3 trugen, auf 4,2% erhöhten (Tabelle 10). Die Gesamtmengen an neuen ω6- und ω3-Fettsäuren machten durchschnittlich 19,0% bzw. 10,9% aus, was auf eine Erhöhung des Durchsatzes durch den ω3-Weg aufgrund der Aktivität der CpDesX-Desaturase hindeutet. Diese Steigerung der ω3-Fettsäuren legt nahe, dass CpDesX einen wichtigen Beitrag zur EPA-Produktion in transgenen Pflanzen leisten kann. Tabelle 10: Gaschromatographische Analyse von Samenöl aus transgenen Erucasäure-reichen B. carinata-Linien, die mit dem Konstrukt Napin-4 transformiert waren.

Fettsäure	Wildtyp	Napin-4

16:0	5,3 ± 0,7	6,6 ± 1,5
18:0	1,2 ± 0,2	1,3 ± 0,4
18:1n-9 (OA)	7,3 ± 0,7	7,8 + 2,5
18:1n-11	1,5 ± 0,2	1,8 ± 0,5
18:2n-9	0,0	0,9 ± 0,6
18:2n-6 (LA)	16,5 ± 0,9	4,0 ± 3,0
18:3n-6 (GLA)	0,0	11,8 ± 1,6
		(9,0-15,6)
18:3n-3 (ALA)	16,0 ± 1,3	3,2 ± 1,3
18:4n-3 (SDA)	0,0	6,3 ± 2,0
		(4,1-9,4)
20:1n-9	6,2 ± 1,0	4,6 ± 1,1
20:1n-7	1,4 ± 0,1	1,8 ± 0,7
20:3n-6 (DGLA)	0,0	0,7 ± 0,3
20:4n-6 (AA)	0,0	6,5 ± 1,9
		(1,8-9,5)
20:4n-3 (ETA)	0,0	0,4 ± 0,2
20.:5n-3 (EPA)	0,0	4,2 ± 1,4
		(1,0-5,6)
Erucasäure	36,1 ± 2,4	31,2 ± 5,3
Andere	8,5 ± 1,5	6,9 ± 2,4

Um die Aktivität der 20-Kohlenstoffatome-ω3-Desaturase Pi-ω3 bei der Umwandlung von ARA in EPA in Pflanzen zu testen, wurde Pi-ω3 zu dem Vier-Gene-Konstrukt Napin-4 hinzugefügt. Transgene Pflanzen wurden mit Produktion erhalten, die die erwarteten neuen Fettsäuren in unterschiedlichen Spiegeln enthielten (Tabelle 11). Die Expression der Pi-ω3-Desaturase (SEQ ID Nr.: 17) führte zu einer effizienten Umwandlung von ARA in EPA. Mit der Hinzufügung dieses Gens erhöhte sich der EPA-Gehalt erheblich von einem durchschnittlichen Spiegel von 4,2% in transgenen Samen, die Napin-4 trugen, auf einen durchschnittlichen Spiegel von 9,7% in transgenen Samen mit Napin-5, wobei der höchste beobachtetet Wert 15,5% betrug. Der Spiegel an neuen ω6- und ω3-Fettsäuren machte durchschnittlich 13,0% bzw. 16,5% aus. Der hohe Spiegel an EPA, der in transgenen Samen mit dem Napin-5-Konstrukt erzielt wurde, kann den Aktivitäten der beiden neuen Desaturase-Gene (CpDesX und Pi-ω3) zugeschrieben werden. Tabelle 11: Gaschromatographische Analyse von Samenöl aus transgenen Erucasäure-reichen B. carinata-Linien, die mit dem Konstrukt Napin-5 transformiert waren.

Fettsäure	Wildtyp	Napin-5

16:0	5,3 ± 0,7	6,4 ± 1,1
18:0	1,2 ± 0,2	1,2 ± 0,2
18:1n-9 (OA)	7,3 ± 0,7	6,3 ± 2,3
18:1n-11	1,5 ± 0,2	1,6 ± 0,2
18:2n-9	0,0	1,5 ± 0,9
18:2n-6 (LA)	16,5 ± 0,9	3,7 ± 3,3
18:3n-6 (GLA)	0,0	11,1 ± 2,4
		(4,8-15,3)
18:3n-3 (ALA)	16,0 ± 1,3	3,4 ± 2,9
18:4n-3 (SDA)	0,0	6,2 ± 1,8
		(2,9-10,9)
20:1n-9	6,2 ± 1,0	4,2 ± 1,2
20:1n-7	1,4 ± 0,1	2,1 ± 0,4
20:3n-6 (DGLA)	0,0	0,6 ± 0,3
20:4n-6 (AA)	0,0	1,3 ± 0,4
		(0,6-1,8)
20:4n-3 (ETA)	0,0	0,6 ± 0,2
20:5n-3 (EPA)	0,0	9,7 ± 3,4
		(1,5-15,5)
Erucasäure	36,1 ± 2,4	31,1 ± 3,8
Andere	8,5 ± 1,5	9,0 ± 1,6

Beispiel 6: Optimierung der Herstellung der neuen Ölprodukte
Wie im Beispiel 5 gezeigt wurde, ist es durch Kombination verschiedener Gene und regulatorischer Elemente möglich, signifikante Spiegel von neuen Fettsäuren in dem Samenöl verschiedener Brassica-Spezies zu produzieren. Für die weitere Erhöhung spezieller Fettsäuren, wie ARA, EPA und/oder DHA, oder für die Steigerung der Gesamtproduktion an neuen Fettsäuren können zusätzliche Gene erforderlich sein. Solche zusätzlichen Gene können Funktionen bei der Verschiebung verschiedener Fettsäuren aus ihren jeweiligen Produktionspools (Phospholipide, Acyl-CoA) oder durch Veresterung der neuen Fettsäuren mit verschiedenen Molekülen (Diacylglycerin, Lysophosphatissäure, Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, Lysophosphatidylglycerin, Lysophosphatidylinositol, Lysophosphatidylserin, 1-Acylphosphatidylcholin usw.) ausüben. Acyltransferasen nutzen solche Aktivitäten, wie vorstehend beschrieben. In der Vergangenheit gab es eine Reihe von Ansätzen, um solche Aktivitäten zu isolieren und die Herstellung von neuen Fettsäuren zu erhöhen (zum Beispiel WO2004/076617 , WO2004/087902 ). Neben dem Einbringen neuer Genaktivitäten durch Transformieren der vorstehend beschriebenen Gene in Kombination mit Genen, wie in Beispiel 5 beschrieben, ist ein weiteres Verfahren die Modulation endogener Gene mit Acyltransferase-Aktivitäten durch Überexpression oder Nach-unten-Regulation (Antisense-RNA-, invertierte RNA- oder miRNA-Technologien).
Bei Brassica-Spezies konnte eine Reihe von Acyltransferasen identifiziert werden, die nützliche Acyltransferase-Aktivität im Hinblick auf erhöhte Spiegel an ARA, EPA und/oder DHA oder eine erhöhte Gesamtproduktion von neuen Fettsäuren besitzen.
Unter Verwendung von Arabidopsis-Homologa, wie in Chen et al. (2007) FEBS Lett. 581: 5511–5516 beschrieben, konnte die Klonierung einer Reihe von Lysophosphatidylaktiven Acyltransferasen aus Brassica napus isoliert werden. Für die Isolation der Sequenzen wurden Standard-PCR-Verfahren, wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung der folgenden Primerpaare (Tabelle 12) verwendet. Die PCR-Reaktionen ergaben 6 Fragmente, die für Volllängen-ORF-Sequenzen kodierten, die für Aminosäuresequenzen kodieren (Tabelle 13).

Die in Tabelle 13 gezeigten ORF-Sequenzen können, wie in Beispiel 5 beschrieben, für die Herstellung von überexprimierenden, Antisense-, invertierte RNA- oder miRNA-Konstrukten verwendet werden, um die Expression der entsprechenden Gene nach oben oder nach unten zu regulieren und dadurch Veränderungen in den Spiegeln von neuen Fettsäuren zu fördern. Tabelle 12: Primerpaare für die Amplifikation von Brassica napus-Acyltransferasen.

Tabelle 13: ORF-Sequenzen von Brassica napus-Acyltransferasen.

Bezeichnung	Aktivität	SEQ ID Nr.:
BnLPLAT1_A_40	Lysophospholipid-Acyltransferase	102
BnLPLAT1_C_40	Lysophospholipid-Acyltransferase	104
BnLPLAT2_C_50	Lysophospholipid-Acyltransferase	106
BnLPEAT1_A_50	Lysophosphatidylethanolamin-Acyltransferase	108
BnLPEAT1_C_50	Lysophosphatidylethanolamin-Acyltransferase	110
BnLPEAT2_70	Lysophosphatidylethanolamin-Acyltransferase	112

Weitere Sequenzvarianten von Brassica napus-Acyltransferasen, wie in Tabelle 13 beschrieben, wurden identifiziert. Die weiteren Sequenzen konnten durch einen PCR-Ansatz, wie in Beispiel 6 beschrieben, unter Verwendung von genomischer DNA der Brassica napus-Sorte cv. Kumily als Ausgangsmaterial identifiziert werden. Die Sequenzvarianten wurden durch Überexprimieren des entsprechenden ORF in einer Hefe-KO-Mutante mit einer Defizienz für die LPLAT-Aktivität funktionell untersucht (ähnliche Experimente in Hefe, wie in Beispiel 1 beschrieben). Die folgenden Sequenzvarianten wurden identifiziert:
BnLPLAT1_AA (ORF SEQ ID Nr.: 137) ist eine Variante von BnLPLAT1_A_40 (SEQ ID Nr.: 102);
BnLPLAT1_CC (ORF SEQ ID Nr.: 139) ist eine Variante von BnLPLAT1_C_40 (SEQ ID Nr.: 104); und
BnLPLAT2_AA (ORF SEQ ID Nr.: 135) ist eine Variante von BnLPLAT2_C_50 (SEQ ID Nr.: 106).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 91/13972 [0007]
WO 93/11245 [0007]
WO 94/11516 [0007]
EP 550162 [0007]
WO 94/18337 [0007]
WO 97/30582 [0007]
WO 97/21340 [0007]
WO 95/18222 [0007]
EP 0794250 A [0007]
WO 93/06712 [0007]
US 5614393 [0007, 0007]
WO 96/21022 [0007]
WO 00/21557 [0007]
WO 99/27111 [0007]
WO 98/46763 [0007]
WO 98/46764 [0007]
WO 98/46765 [0007]
WO 99/64616 [0007]
WO 98/46776 [0007]
WO 0159128 [0015]
WO 0012720 [0015]
WO 02077213 [0015]
WO 0208401 [0015]
WO 0244320 [0015]
WO 2003/064638 [0017]
WO 2003/093482 [0017]
WO 2004/071467 [0017]
WO 2005/083093 [0017]
WO 2004/076617 [0040, 0150]
WO 2004/087902 [0040, 0150]
EP 0388186 A [0052]
EP 0335528 A [0052]
WO 93/21334 [0052]
EP 0249676 A [0052]
US 5608152 [0052, 0053]
WO 98/45461 [0052, 0053]
US 5504200 [0052, 0053]
WO 91/13980 [0052, 0053]
WO 95/15389 [0052, 0053]
WO 95/23230 [0052, 0053]
WO 99/16890 [0052, 0052, 0053]
US 5352605 [0053]
WO 84/02913 [0053]
US 4962028 [0053]
WO 95/19443 [0053]
US 5187267 [0053]
WO 96/12814 [0053]
EP 0375091 A [0053]
WO 95/16783 [0053]
WO 97/06250 [0053]
WO 99/46394 [0053]
EP 0464553 [0115]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144–20149 [0007]
Wada et al., Nature 347, 1990: 200–203 [0007]
Huang et al., Lipids 34, 1999: 649–659 [0007]
McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141–12147 [0007]
Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777–792 [0007]
R. Vazhappilly & F. Chen (1998) Botanica Marina 41: 553–558 [0008]
K. Totani & K. Oba (1987) Lipids 22: 1060–1062 [0008]
M. Akimoto et al. (1998) Appl. Biochemistry and Biotechnology 73: 269–278 [0008]
Yu, R. et al. Lipids 35: 1061–1064, 2000 [0009]
Takeyama, H. et al. Microbiology 143: 2725–2731, 1997 [0009]
Zank, T. K. et al. Plant Journal 31: 255–268, 2002 [0010]
Sakuradani, E. et al., Gene 238: 445–453, 1999 [0010]
Sprecher 2000, Biochim. Biophys. Acta 1486: 219–231 [0010]
Tocher et al. 1998, Prog. Lipid Res. 37, 73–117 [0012]
Domergue et al. 2002, Eur. J. Biochem. 269, 4105–4113 [0012]
Shimikawa 2001, World Rev. Nutr. Diet. 88, 100–108 [0013]
Calder 2002, Proc. Nutr. Soc. 61, 345–358 [0013]
Cleland und James 2000, J. Rheumatol. 27, 2305–2307 [0013]
Millar und Kunst, 1997 Plant Journal 12: 121–131 [0014]
Millar und Kunst, 1997 (Plant Journal 12: 121–131) [0015]
Millar et al. 1999, (Plant Cell 11: 825–838) [0015]
Tvrdik et al. 2000, JCB 149: 707–717 [0015]
E. Ucciani: Nouveau Dictionnaire des Huiles Végétales [Neues Wörterbuch der Pflanzenöle]. Technique & Documentation – Lavoisier, 1995. ISBN: 2-7430-0009-0 [0016]
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6 [0025]
Sambrook et al., ”Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 [0025]
Hames und Higgins (Hrsg.) 1985, ”Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford [0025]
Brown (Hrsg.) 1991, ”Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford [0025]
J. Mol. Evolution., 25, 351–360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151–153 [0025]
Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443–453 (1970) [0025]
Adv. Appl. Math. 2; 482–489 (1981) [0025]
Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991) [0025]
Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) [0048]
Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey [0048]
Hellens et al., Trends in Plant Science (2000) 5, 446–451 [0049]
Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993) [0049]
F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38 [0049]
B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 [0049]
Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225 [0049]
Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. [0050]
Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N. Y. (1994) [0050]
Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B., und Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31–40 [0051]
Amann et al. (1988) Gene 69: 301–315 [0051]
Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60–89 [0051]
Baldari et al. (1987) Embo J. 6: 229–234 [0051]
Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933–943 [0051]
Schultz et al. (1987) Gene 54: 113–123 [0051]
van den Hondel, C. A. M. J. J., & Punt, P. J. (1991) ”Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge [0051]
More Gene Manipulations in Fungi (J. W. Bennett & L. L. Lasure, Hrsg., S. 396–428: Academic Press: San Diego) [0051]
Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165 [0051]
Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31–39 [0051]
Franck et al., Cell 21 (1980) 285–294 [0052]
Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993) [0052]
Plant J. 2, 1992: 397–404 (Gatz et al., Tetracyclin-induzierbar) [0052]
Stockhaus et al., EMBO J. 8, 1989, 2445 [0052]
Genbank Zugangs-Nr. U87999 [0052]
Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233–239 [0052]
Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239–251 [0053]
D., Kemper, E., Schell, J., und Masterson, R. (1992) ”New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border”, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197 [0053]
Bevan, M. W. (1984) ”Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721 [0053]
Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38 [0053]
Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff. [0053]
Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693–8711 [0053]
Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195–2202 [0053]
Franck et al., Cell 21 (1980) 285–294 [0053]
Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996) 285–423 und die dann genannten Literaturstellen [0053]
Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108 [0053]
Gatz et al. (1992) Plant J. 2, 397–404 [0053]
Ward et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993) 361–366 [0053]
Baeumlein et al., Mol. Gen. Genet., 1991, 225 (3): 459–67 [0053]
Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233–9 [0053]
Cloning Vectors (Hrsg. Pouwels, P. H., et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) [0054]
Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgb., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 [0054]
Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993) [0062]
F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, 15–38 [0062]
B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128–143 [0062]
Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205–225 [0062]
Harlow und Lane ”Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 [0070]
Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495 [0070]
Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3 [0070]
Hong et al., 2002 High-level Production of γ-linolenic acid in Brassica juncea using a Δ6 desaturase from Pythium irregulare. Plant Physiol. 129, 354–362 [0132]
Qiu et al., 2001 Identification of a Δ4 fatty acid desaturase from Thraustochytrium sp. involved in the biosynthesis of docosahexanoic acid by heterologous expression in Sacchcaromyces cerevisiae and Brassica juncea. J. Biol. Chem. 276, 31561–31566 [0132]
Meyer et al., 2004 Novel fatty acid elongases and their use for the reconstitution of docosahexaenoic acid biosynthesis. J. Lipid Res. 45, 1899–1909 [0132]
Meesapyodsuk et al., 2007 Primary structure, regioselectivity, and evolution of the membrane bound fatty acid desaturases of Claviceps purpurea. J. Biol. Chem. 282, 20191–20199 [0132]
Wu et al. (2005) Stepwise engineering to produce high yields of very long-chain polyunsaturated fatty acids in plants. Nat. Biotechnol. 23, 1013–1017 [0132]
Deblaere et al. 1984, Nucl. Acids. Res. 13: 4777–4788 [0134]
Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473 [0135]
Qui et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561–31566 [0136]
Moloney et al. (1992) [0137]
Bell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 35(6): 456–465 [0138]
Mlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282–285 [0138]
Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89–90 und S. 443–613, VCH: Weinheim (1985) [0140]
Fallon, A., et al., (1987) ”Applications of HPLC in Biochemistry” in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17 [0140]
ehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: ”Product recovery and purification”, S. 469–714, VCH: Weinheim [0140]
Belter, P. A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons [0140]
Kennedy, J. F., und Cabral, J. M. S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons [0140]
Shaeiwitz, J. A., und Henry, J. D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1–27, VCH: Weinheim [0140]
Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications [0140]
Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22): 12935–12940 [0141]
Browse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152: 141–145 [0141]
Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2) [0141]
Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide – Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1) [0141]
”Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952)–16 (1977) u. d. T.: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODEN [0141]
Qiu et al. J. Biol. Chem. 276, 31561–31566 [0142]
Meesapyodsuk et al., 2007 [0148]
Chen et al. (2007) FEBS Lett. 581: 5511–5516 [0152]

Claims

Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäure, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: a) einer Nukleinsäure mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in einer der SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35 oder 37 dargestellt; b) einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie in einer der SEQ ID Nr.: 2, 4, 6, 8, 32, 34, 36, oder 38 dargestellt, kodiert; c) einer Nukleinsäure mit einer Nukleinsäuresequenz, die mindestens 60% identisch zu der Nukleinsäuresequenz, wie in einer der SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35 oder 37 dargestellt, ist, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit Desaturase-Aktivität kodiert; d) einer Nukleinsäure, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die mindestens 74,1% identisch zu der Aminosäuresequenz ist, die in einer der SEQ ID Nr.: 2, 4, 6, 8, 32, 34, 36, oder 38 dargestellt ist, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit Desaturase-Aktivität kodiert; e) einer Nukleinsäure, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an eine Nukleinsäure gemäß a) bis d) hybridisiert, wobei die Nukleinsäure ein Polypeptid mit Desaturase-Aktivität kodiert; f) einer Nukleinsäure, die ein Fragment eines Polypeptids, das von einer Nukleinsäuresequenz gemäß a) bis e) kodiert wird, mit Desaturase-Aktivität kodiert; und g) einer Nukleinsäure, die mindestens 15 aufeinander folgende Nukleotide einer Nukleinsäure gemäß a) bis f) umfasst.
Vektor, der das Polynukleotid nach Anspruch 1 umfasst.
Vektor nach Anspruch 2, der ein Expressionsvektor ist.
Vektor nach Anspruch 3, wobei das Polynukleotid unter der Kontrolle eines samenspezifischen Promotors steht.
Vektor nach Anspruch 4, wobei der samenspezifische Promotor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Conlinin 1, Conlinin 2, napin, LuFad3, USP, LeB4, Arc, Fae, ACP, LuPXR und SBP besteht.
Wirtszelle, die das Polynukleotid nach Anspruch 1 umfasst oder die mit dem Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 3 bis 5 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Pflanzenzelle eine aus einer Ölpflanze erhaltene Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 8, wobei die Ölpflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Flachs (Linum sp.), Raps (Brassica sp.), Sojabohne (Glycine und Soja sp.), Sonnenblume (Helianthus sp.), Baumwolle (Gossypium sp.), Mais (Zea mays), Olive (Olea sp.), Färberdistel (Carthamus sp.), Kakao (Theobroma cacoa), Erdnuss (Arachis sp.), Hanf, Leindotter, Crambe, Ölpalme, Kokosnüssen, Erdbirnen, Sesamsamen, Rizinussamen, Lesquerella, Talgbaum, Sheanüssen, Tungnüssen, Kapokfrucht, Mohnsamen, Jojobasamen und Perilla.
Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei die Zelle eine mikrobielle Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 10, wobei die mikrobielle Zelle aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Rhodosporidium, Yarrowia, Thraustochytrium, Pythium, Schizochytrium und Crythecodinium.
Pflanze oder Pflanzensamen, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 1, den Vektor nach einem der Ansprüche 2 bis 5 oder die Wirtszelle nach einem der Ansprüche 6 bis 9.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, dass das Züchten der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 6 bis 11 in einem geeigneten Kulturmedium umfasst, um dadurch das Polypeptid, das von dem Polynukleotid nach Anspruch 1 kodiert wird, zu produzieren.
Polypeptid, das von dem Polynukleotid nach Anspruch 1 kodiert wird.
Verfahren zur Herstellung einer ungesättigten Fettsäure, umfassend das Züchten der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 6 bis 11 oder der Pflanze oder des Pflanzensamens nach Anspruch 12, so dass die ungesättigte Fettsäure produziert wird.
Verfahren zur Modulation der Produktion einer ungesättigten Fettsäure, umfassend das Züchten der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 6 bis 11 oder der Pflanze oder des Pflanzensamens nach Anspruch 12, so dass eine Modulation der Produktion der ungesättigten Fettsäure auftritt.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Verfahren weiterhin den Schritt Gewinnen der ungesättigten Fettsäure aus der Kultur umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer ungesättigten Fettsäure, umfassend das Zusammenbringen einer Zusammensetzung, die mindestens ein Desaturase-Zielmolekül umfasst, mit mindestens einem Polypeptid nach Anspruch 14 unter solchen Bedingungen, dass die ungesättigte Fettsäure produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Desaturase-Zielmolekül Ölsäure, Linolsäure, γ-Linolensäure, α-Linolensäure, Dihomo-γ-linolensäure, Stearidonsäure, Eicosatetraensäure (n-3), Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Docosapentaensäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die ungesättigte Fettsäure aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus ARA 20:4 (5, 8, 11, 14), EPA 20:5 (5, 8, 11, 14, 17) und DHA 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19).
Verfahren zur Herstellung eines Öls, das die Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 15 bis 20 und den weiteren Schritt der Formulierung oder Isolation eines Öls, das die ungesättigte Fettsäure umfasst, umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, einer Pflanze oder eines Pflanzensamens, die/der in der Lage ist, eine ungesättigte Fettsäure zu erzeugen, umfassend das Einbringen des Polynukleotids nach Anspruch 1 oder des Vektors nach einem der Ansprüche 2 bis 5 in die Wirtszelle, die Pflanze oder den Pflanzensamen.
Öl, das von der Pflanze oder dem Pflanzensamen nach Anspruch 12 produziert wird oder durch das Verfahren nach Anspruch 20 erhältlich ist.
Verwendung des Polynukleotids nach Anspruch 1, des Vektors nach einem der Ansprüche 2 bis 5, der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 6 bis 11, der Pflanze oder des Pflanzensamens nach Anspruch 12 oder des Öls nach Anspruch 23 zur Herstellung eines Tierfutters, einer Nahrungsergänzung oder von Nahrung.
Zelle, die ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: a) einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35 oder 37 umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül durch mindestens eine Technik disrumpiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition, einer Substitution und homologer Rekombination; b) einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35 oder 37 umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül eine oder mehrere Nukleinsäuremodifikationen verglichen mit der in SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7 oder 9 dargestellten Sequenz umfasst, wobei die Modifikation aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition und einer Substitution; und c) einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1, 3, 5, 7, 31, 33, 35 oder 37 umfasst, wobei die regulatorische Region des Nukleinsäuremoleküls verglichen mit der regulatorischen Wildtypregion des Moleküls durch mindestens eine Technik modifiziert ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Punktmutation, einer Verkürzung, einer Inversion, einer Deletion, einer Addition, einer Substitution und homologer Rekombination.