MXPA99001794A - Metodo,instrumentos y conjunto o equipo para transplante autologo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para el trasplante efectivo de condrocitos/cartilago a un defecto superficial de la union articular, asi como una descripcion de ciertos instrumentos y un juego o conjunto para la practica de la invencion.

Description

MÉTODO, INSTRUMENTOS Y CONJUNTO O EQUIPO PARA TRANSPLANTE AUTOOGO Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo del trasplante de condrocitos, al injerto de huesos y cartílago, al sanado o cicatrización, a la reparación de articulaciones y a la prevención de patologías artríticas. En particular a los métodos para la preparación del sitio de injerto, a los instrumentos para tal preparación y al trasplante autólogo de las células al sitio de injerto preparado.

Antecedentes de la Invención Más de 500,000 procedimientos artroplásticos y reemplazos de articulaciones totales son efectuados cada año en los Estados Unidos de América. Aproximadamente el mismo número de procedimientos similares son efectuados en Europea. Incluidos en estos números están aproximadamente 90,000 reemplazos de rodillas totales y alrededor de 50,000 procedimientos para reparar los defectos en la rodilla por año en Europa. El número de procedimientos son esencialmente los mismos en los Ref.029544 Estados Unidos de América (En: Praemer A., Furner S., Rice, D.P., Musculoskeletal Conditions in the United States, American Academy of Orthopaedic Surgeons, Park Ridge, III., 1992, 125). Un método para la regeneración-tratamiento de los cartílagos sería muy útil, y podría ser efectuado en una etapa inicial del daño a la articulación, reduciendo así el número de pacientes que tengan la necesidad de cirugía de reemplazo de articulación artificial. Con tales métodos preventivos de tratamiento, el número de pacientes que desarrollan osteoartritis también se reduciría. Las técnicas utilizadas para resuperficiar o volver a hacer una superficie sobre la estructura del cartílago en las articulaciones han intentado principalmente inducir la reparación del cartílago utilizando taladrado subcondrial, abrasión y otros métodos por medio de los cuales existe una escisión de cartílago enfermo y hueso subcondrial, dejando el hueso canceloso vascularizado expuesto (Insall, J., Clin. Orthop. 1974, 101,61; Ficat R.P. et al., Clin. Orthop. 1979, 144, 74; Johnson L.L., En: Operative Anthroscopy, McGinty J.B., Ed., Raven Press, New York, 1991, 341). Coon y Cahn (Science 1966, 153, 1116) describieron una técnica para el cultivo de células sintetizadoras del cartílago de las somitas de embrión de pollo. Por último Cahn y Lasher (PNAS EUA 1967, 58, 1131) utilizaron el sistema para el análisis del involucramiento de la síntesis del ADN como un pre-requisito para la diferenciación del cartílago. Los condrocitos responden tanto a EFG como FGF por el crecimiento (Gospodarowicz y Mescher, J. Cell Physiology 1977, 93, 117), pero pierden por último su función diferenciada (Benya et al., Cell 1978, 15, 1313). Los métodos para hacer crecer los condrocitos fueron descritos y están siendo utilizados principalmente con ajustes menores por Brittberg, M. et al. (New Engl. J. Med. 1994, 331, 889) . Las células que crecen utilizando estos métodos fueron utilizadas como trasplantes autólogos en articulaciones de pacientes. Adicionalmente, Kolettas (J. Cell Science 1995, 108, 1991) examinó la expresión de las moléculas específicas del cartílago tales como los colágenos y los proteoglicanos bajo un cultivo celular prolongado. Se encontró que a pesar de los cambios morfológicos durante el cultivo, en cultivos monocopa (Aulthouse, A. et al., In vitro Cell Dev. Biol., 1989, 25, 659; Archer, C. et al., J. Cell Sci. 1990, 97, 361; Hansel ann, H. et al., J. Cell Sci. 1994, 107, 17; Bonaventure, J. et al., Exp. Cell Res. 1994, 212, 97), cuando se compara con los cultivos de la suspensión que crecen sobre geles de agarosa, las perlas o glóbulos de alginato o como cultivos de cebo artificial (que retienen una morfología de célula redonda) probados por varios científicos no cambiaron los marcadores expresados por condrocitos tales como los colágenos de los tipos II y IX y los proteoglicanos de gran agregación, aggrecan, versican y proteínas de enlace, no cambiaron (Kolettas, E. et al., J. Cell Science 1995, 108, 1991). Los condrocitos articulares son células derivadas mesenquimales especializadas encontradas exclusivamente en el cartílago. El cartílago es un tejido avascular cuyas propiedades físicas dependen de la matriz extracelular producida por los condrocitos. Durante la osificación endocondrial los condrocitos padecen una maduración que conduce a la hipertrofia celular, caracterizada por el inicio de la expresión del colágeno del tipo X (Upholt, W.B. y Olsen, R.R., En: Cartilage Molecular Aspects (Hall, B & Newman, S. Eds.) CRC Boca Ratón 1991, 43; Reichenberger, E. et al., Dev. Biol. 1991, 148, 562; Kirsch, T. et al., Differentiation, 1992, 52, 89; Stephens, M. et al., J. Cell Sci. 1993, 103, llll) . La degradación excesiva del colágeno del tipo II en las capas externas o las superficies articulares de las articulaciones, también es provocada por la osteoartritis. La red de colágeno en consecuencia es debilitada y subsiguientemente desarrolla fibrilación, por lo cual las substancias de la matriz tales como los proteoglicanos son perdidas y eventualmente desplazadas por completo. Tal fibrilación del cartílago osteoartrítico debilitado puede alcanzar gradualmente al cartílago calcificado y puede avanzar hacia el hueso subcondrial (Kempson, G.E. et al., Biochim. Biophys. Acta 1976, 428, 741; Roth, V. y Mow, V.C., J. Bone Joint Surgery, 1980, 62A, 1102; Woo, S.L. -Y. et al, en Handbook of Bioengineering (R. Skalak y S. Chien eds.), McGraw-Hill, New York, 1987, pp. 4.1-4.44). Las descripciones del desarrollo básico, la anatomía histológica y microscópica del hueso, el cartílago y otros de tales tejidos conectivos se pueden encontrar por ejemplo en Wheater, Burkitt y Daniels, Functional Histology, 2/a. Edición, (Churchill Livingstone, Londres, 1987, Cap. 4). Las descripciones de la anatomía histológica básica de los defectos en el hueso, cartílago y otros tejidos conectivos se pueden encontrar por ejemplo en Wheater, Burkitt, Stevens y Lowe, Basic Histopathology, (Churchill Livingstone, Londres, 1985, Cap. 21). A pesar de los avances en el cultivo de los condrocitos, y la manipulación del hueso y el cartílago, no ha existido un gran éxito con los intentos de trasplantar cartílago o condrocitos para la reparación de las superficies de articulación dañadas. Las enseñanzas de la presente invención proporcionan medios efectivos y eficientes para promover el trasplante de cartílago y/o condrocitos en un defecto en una unión de articulación u otra superficie de hueso cubierta por cartílago, por lo cual el cartílago es regenerado para fijar el defecto. La presente invención también proporciona instrumentos quirúrgicos los cuales están diseñados para preparar el sitio de injerto para facilitar la integración eficiente del material injertado con respecto al sitio de injerto.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un método para el tratamiento efectivo del cartílago superficial de las uniones de articulación por el trasplante de condrocitos en una matriz adecuada, a una superficie que va a ser tratada, con una barrera hemostática y un parche de cobertura libre de células, que comprende; primero colocar una barrera hemostática próxima a la superficie que va a ser tratada, colocar condrocitos en una matriz adecuada sobre la superficie que va a ser tratada alejada de la barrera hemostática, cubrir la superficie que va a ser tratada con un parche de cobertura libre de células.

Una barrera hemostática, como será descrita posteriormente de manera adicional, es una barrera la cual inhibe o previene la penetración de células o tejidos de vascularización en el material injertado. En particular, el presente método proporciona una barrera hemostática que es un material semipermeable, resorbible, el cual inhibe o prohibe la infiltración vascular a través de la barrera. En una modalidad la barrera hemostática contiene colágeno. Libre de células, es utilizado aquí como en la técnica, y significa un material que está substancialmente libre de células intactas las cuales son capaces de división celular adicional, promulgación o actividad biológica. En una modalidad preferida, un material libre de células está libre de células nucleadas totalmente intactas. En una modalidad, el presente método abarca el uso de un parche de cobertura libre de células que contiene una matriz de colágeno semipermeable. En una modalidad preferida del método, la superficie porosa del parche de cobertura libre de células está dirigido hacia el material de implante. La presente invención provee además el trasplante autólogo del colágeno o los condrocitos a un sitio de injerto, en donde el sitio de injerto ha sido preparado primero por manipulación quirúrgica para aceptar mejor el material injertado. En una modalidad, el sitio de injerto es esculpido de tal modo que las paredes del sitio de injerto sean contorneadas en una configuración ondulante de tal modo que el material injertado, cuando se coloca dentro del sitio de injerto y se expanda en contacto con la pared del sitio de injerto, será resistente contra la remoción o expulsión del injerto completo desde el sitio de injerto. La presente invención provee además instrumentos quirúrgicos diseñados para esculpir el sitio de injerto como es enseñado por el método de la invención. La invención provee además un juego o conjunto para el trasplante de cartílagos y/o condrocitos sobre la superficie de una unión articular en donde el juego o conjunto comprende una barrera hemostática, un parche de cobertura semipermeable libre de células, y un encolado orgánico. En una modalidad adicional, el juego o conjunto puede proporcionar además opcionalmente uno o más instrumentos quirúrgicos los cuales pueden ser utilizados para esculpir el sitio de injerto de acuerdo con los métodos de la presente invención.

Breve Descripción de los Dibujos La presente invención será mejor entendida por el examen de las siguientes Figuras las cuales ilustran ciertas propiedades de la presente invención, en donde: La Figura ÍA es un dibujo que muestra un extremo de articulación típica de un hueso. Típicamente, el material óseo está cubierto sobre la superficie de articulación con una substancia cartilaginosa. La Figura IB muestra un ejemplo de donde puede ocurrir un defecto o daño a la tapa cartilaginosa (hueco en un cartílago) , y tal defecto puede ser tratado directamente, agrandado ligeramente, o esculpido para aceptar el material injertado por procedimientos quirúrgicos previo al tratamiento. La Figura ÍC muestra como la barrera hemostática (numerada 1) es colocada dentro del defecto en la tapa cartilaginosa para inhibir o prevenir la vascularización en la regeneración del cartílago, del hueso subyacente. Los condrocitos que van a ser implantados en la cavidad defectuosa son estratificados entonces sobre la parte superior de la barrera hemostática. La Figura 2 es un dibujo que muestra el defecto tratado (hueco en el cartílago) en la capa cartilaginosa cubierta por un material semipermeable libre de células (numerado 2) el cual es utilizado para formar un parche/tapa o vendaje sobre el sitio del defecto. Esta tapa es fijada en su lugar, ya sea suturada al borde de la cavidad en el cartílago sano, o fijada de otra manera. Esta tapa está cubriendo el área defectuosa de la unión en la cual el trasplante de cartílago/condrocitos ha sido colocada, o será colocada bajo la tapa fijada parcialmente. La Figura 3A es un diagrama que ilustra la respuesta diferencial a las fuerzas de compresión y cizallamiento por el cartílago más duro o más blando con la zona de demarcación subsiguiente. La Figura 3B ilustra el sitio de injerto, después que el defecto ha sido esculpido para que tenga paredes ondulantes. La Figura 3C ilustra el sitio de injerto esculpido con la barrera hemostática (1), el material trasplantado (3), y el parche de cobertura (2) libre de células, en su lugar dentro del cartílago superficial articular (4) . La Figura 4A ilustra una modalidad del dispositivo quirúrgico de la presente invención que muestra dientes cortantes (5) y el perno de colocación sobresaliente (6). Las ilustraciones de la sección transversal a la derecha muestran dos posibles configuraciones de las hojas cortantes. La Figura 4B ilustra una segunda modalidad del dispositivo quirúrgico de la presente invención. La Figura 5 es un diagrama que ilustra la respuesta diferencial modificada a las fuerzas de compresión y de cizallamiento por el cartílago más duro y el cartílago más blando después de esculpir el sitio del in erto. La Figura 6A es una imagen de MRI de una rodilla de cerdo que muestra el defecto del cartílago en el cóndilo izquierdo (medial) . La Figura 6B es una imagen de MRI de la misma rodilla de cerdo tres meses después del tratamiento.

Descripción Detallada de la Invención Esta invención se refiere al uso de ciertos productos que inhiben la formación del tejido vascular, por ejemplo tales como los bucles capilares que se proyectan en el cartílago que es establecido, durante el proceso de trasplante autólogo de los condrocitos en los defectos en el cartílago. La formación del tejido vascular a partir del hueso subyacente tenderá a proyectarse hacia el nuevo cartílago que va a ser formado, conduciendo a la aparición de células diferentes de los condrocitos especializados mesenquimales deseados. Las células contaminantes introducidas por la vascularización pueden ocasionar la invasión y el sobrecrecimiento en el cartílago que va a ser formado por los condrocitos implantados. Uno de los tipos de productos comerciales los cuales pueden ser utilizados en esta invención es Surgicel® (Ethicon Ltd., UK) el cual es absorbible después de un período de 7-14 días. El uso de este material en el método de la presente invención es contrario al uso normal de un dispositivo hemostático, tal como Surgicel® como se describe en el inserto del paquete o empaque de Ethicon Ltd. Sorprendentemente, se ha encontrado que en una situación en donde se desea inhibir la revascularización en el cartílago, un material hemostático actuará de manera semejante a un coagulado artificial semejante a un gel. Si las células sanguíneas rojas deben estar presentes dentro del defecto de grosor completo del cartílago articular que está cubierto por tal barrera hemostática, estas células sanguíneas serán cambiadas químicamente a hematina, y por consiguiente serán incapaces de inducir el crecimiento vascular. Por consiguiente, un producto hemostático utilizado como una barrera inhibidora de revascularización con o sin adhesivos de fibrina, tal como por ejemplo el Surgicel®, es efectivo para el método contemplado como se enseñó por la presente invención. Otra parte de esta invención es el uso de un componente libre de células, que es utilizado como un parche que cubre el área defectuosa de la unión dentro de la cual el cartílago/condrocitos cultivados estén siendo trasplantados, utilizando condrocitos autólogos para el trasplante. El método de la invención también contempla el uso de condrocitos alogénicos o condrocitos xenogénicos adecuados para la reparación de un defecto del cartílago. Por consiguiente la presente invención enseña métodos para la reparación o tratamiento efectivo de los defectos del cartílago en las superficies óseas de las uniones articulares, los cuales comprenden administrar un agente o dispositivo para bloquear la invasión vascular en el sitio del cartílago que va a ser reparado, y también proporcionar una barrera libre de células la cual aisle el sitio de reparación y mantenga a las células trasplantadas en su lugar. Por consiguiente la presente invención también proporciona un juego o conjunto que comprende un componente de barrera hemostática para la inserción en el sitio que va a ser reparado, de tal modo que existe una inhibición efectiva de la vascularización en el sitio que va a ser reparado; y una vez que los condrocitos que van a ser trasplantados son colocados en el sitio que va a ser reparado, una barrera semipermeable libre de células es recubierta sobre el sitio de reparación de tal modo que los condrocitos trasplantados sean mantenidos en su lugar, pero todavía son capaces de tener acceso a los nutrientes. Ciertos aspectos de la invención han sido ejemplificados utilizando un sistema in vitro para estudiar el comportamiento de los condrocitos cuando esté en contacto con un cierto producto o una combinación de ciertos productos que inhiben la formación del tejido vascular. Esta prueba in vitro predice la capacidad de ciertos materiales probados para inhibir la vascularización, como ocurrirá in vivo en donde los bucles capilares se proyectan hacia el cartílago que es establecido durante el proceso del trasplante autólogo de los condrocitos en los defectos en el cartílago. Los productos hemostáticos adecuados estarán caracterizados porque tienen la capacidad de inhibir el crecimiento, o la invasión del tejido vascular, los osteocitos, los fibroblastos, etc., en el cartílago en desarrollo. Un material hemostático adecuado logrará la meta del método de la presente invención en que la invasión vascular y celular en el cartílago en desarrollo debe ser prevenida para optimizar la formación del cartílago y lograr la reparación del grosor completo de cualesquiera defectos en el cartílago articular. Idealmente, la barrera hemostática será estable durante un período de tiempo prolongado suficiente para permitir la reparación completa del cartílago, y luego será capaz de ser resorbida o rota de otra manera gradualmente durante el transcurso del tiempo. Un material identificado como adecuado es llamado Surgicel® W1912 (un hemostato absorbible que contiene celulosa estéril regenerada, oxidada; Lote GG3DH, Ethicon Ltd. UK) . Otro ejemplo de un material adecuado es BioGide® (una almohadilla de matriz de colágeno del tipo I disponible comercialmente; Geistlich Sdhne, Suiza) . El material de encolado orgánico adecuado puede ser encontrado comercialmente, tal como por ejemplo Tisseel® o Tissucol® (adhesivo a base de fibrina; Immuno AG, Austria), Adhesive Protein (Cat . #A-2707, Sigma Chemical, EUA), y Dow Corning Medical Adhesive B (Cat. #895-3, Dow Corning, EUA) . Los instrumentos quirúrgicos contemplados por la presente invención pueden ser fabricados de metal y/o de plástico adecuado para fabricar instrumentos quirúrgicos desechables de un solo uso, o instrumentos quirúrgicos reutilizables de usos múltiples. El instrumento cortante puede contener dientes cortantes que son completamente circulares o planos, o algún otra cosa entre los mismos. Como el cartílago es un material relativamente blando, el mismo puede ser ventajoso para fabricar bordes cortantes de plástico endurecido los cuales serán capaces de esculpir el cartílago sin que sean capaces de dañar el hueso. Tales instrumentos cortantes pueden ser fabricados para incorporar aberturas para la administración del fluido, la remoción por succión de los desechos cortantes y el fluido, y hebras de fibra óptica para la iluminación y visualización del sitio del defecto. Ciertos aspectos de la presente invención pueden ser mejor entendidos como es ilustrado por los siguientes ejemplos, los cuales se entienden a manera de ilustración y no de limitación.

Ejemplo 1 Para que el Surgicel® sea utilizado de acuerdo con la invención para prevenir el desarrollo de los vasos sanguíneos en el cartílago o los condrocitos implantados autólogos, el Surgicel® fue tratado primero con un agente de fijación, tal como el aldehido glutárico. Brevemente, el Surgicel® se trató con aldehido glutárico al 0.6% durante 1 minuto, seguido por diversos lavados para eliminar los residuos de aldehido glutárico que de otra manera pueden ser tóxicos para el tejido. Alternativamente, el Surgicel® fue tratado con el adhesivo de fibrina llamado Tiseel® previo al tratamiento con aldehido glutárico como se describió en el Ejemplo 2. Se encontró que el Surgicel® fijado por ejemplo con un agente de fijación tal como el aldehido glutárico, lavado con solución salada fisiológica estéril (0.9%) y almacenado en el refrigerador, no se disuelve durante 1 a 2 meses. En general, el Surgicel es resorbido en un período de entre 7 y 14 días. Este tiempo sería demasiado breve, a causa de que un tiempo más prolongado es necesario para prevenir el desarrollo de los vasos sanguíneos o la vascularización como tal de la estructura ósea en el cartílago implantado antes de que los condrocitos implantados hayan crecido en una capa de cartílago sólido que proporciona sus requerimientos de nutrición del cartílago próximo. En otras palabras es necesaria una inhibición suficiente de la vascularización durante un período de tiempo más prolongado tal como por ejemplo un mes. Por lo tanto, el producto no debe ser absorbido significativamente previo a este tiempo. Por la otra parte, la resorción es necesaria eventualmente. Por consiguiente, el material orgánico utilizado como una barrera de inhibición tendrá estas capacidades, y se ha encontrado que el Surgicel® tratado de esta manera proporciona esta función.

Ejemplo 2 El Surgicel® también es recubierto con un encolado orgánico, en este ejemplo el encolado utilizado fue Tisseel® pero también se pueden utilizar otros. Este producto, junto con el Surgicel® produce una barrera utilizable para el propósito particular de la invención. Cualquier otra barra de inhibición del hemostato o vascular podría ser utilizado. El Tisseel® se mezcló como se describió anteriormente. El Surgicel® se recubrió entonces con Tisseel® por rociado del material de Surgicel® sobre ambos lados hasta que está remojado. El Tisseel® (encolado de fibrina) se permitió entonces que se solidifique a temperatura ambiente. Inmediatamente previo a que se complemente la solidificación, el Surgicel® recubierto se colocó entonces en aldehido glutárico al 0.6% durante 1 minuto y luego se lavó con una solución salada fisiológica estéril (0.9%). El pH se ajustó entonces por PBS y/o con NaOH hasta que el pH fue estable en 7.2 a 7.4. Después de esto el Surgicel® así tratado fue lavado entonces en el medio de cultivo del tejido tal como el medio esencial mínimo/Fl2 con solución amortiguadora Hepes 15 mM. Como se mencionó en este ejemplo se ha utilizado el Tisseel® como el adhesivo de fibrina para recubrir el Surgicel®. Además el adhesivo de fibrina o encolado también puede ser aplicado directamente sobre la parte inferior de la lesión hacia el hueso, sobre el cual el Surgicel® es encolado. El sistema in vitro utilizado, en lugar de una prueba in vivo, consistió de una placa desechable estéril de 6 cavidades NUNCLON® Delta para el trabajo de investigación de la célula (NUNC, InterMed, •Roskílde, Dinamarca) . Cada cavidad mide aproximadamente 4 cm de diámetro. En la invención el adhesivo de fibrina puede ser cualquier adhesivo el cual junto con el componente de fibrina producirá un encolado que puede ser tolerado en seres humanos (Ihara, N, et al., Burns Incl. Therm. Inj . , 1984, 10, 396) . La invención también anticipa cualquier otro componente de encolado que pueda ser utilizado en lugar del adhesivo de fibrina. En esta invención, se utilizó el Tisseel® o Tissucol® (Immuno AG, Vienna, Austria) . El juego o conjunto Tisseel® consiste de los siguientes componentes: Tisseel®, un Sellador inactivado con un virus, liofilizado, que contiene proteína coagulable, del mismo: fibrinógeno, Plasma fibronectina (CIG) y Factor XIII, y Plasminógeno. Solución de Aprotinina (bovino) Trombina 4 (bovino) Trombina 500 (bovino) Solución de Cloruro de Calcio El juego o conjunto Tisseel® contiene un Sistema de aplicación DUPLOJECT®. El adhesivo de fibrina o el agente de sellado de dos componentes que utiliza el Juego o conjunto Tisseel® es combinado de la siguiente manera de acuerdo con la hoja de inserto del producto Immuno AG: Ejemplo 3 Los condrocitos se hicieron crecer en un medio de cultivo esencial mínimo que contiene HAM F12 y solución amortiguadora Hepes 15 mM y 5 a 7.5% de suero autólogo en un incubador de C02 a 37 °C y se manejó en un laboratorio Class 100 en Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenague, Dinamarca. Otras composiciones del medio de cultivo pueden ser utilizadas para cultivar los condrocitos. Las células fueron tripsinadas utilizando tripsina EDTA durante 5 a 10 minutos y se contaron utilizando el teñido de viabilidad Trypan Blue en una cámara de Bürker-Türk. El conteo de las células se ajustó a 7.5 x 105 células por ml . Una placa NUNCLON® fue desprovista de su cubierta en el laboratorio Class 100. La barrera hemostática Surgicel® se cortó a un tamaño- adecuado para el equipamiento o adaptación en el fondo de la cavidad en la placa de cultivo del tejido NUNCLON®. En este caso un círculo, de un tamaño de aproximadamente 4 cm (pero podría ser de cualquier tamaño posible) y colocado bajo condiciones asépticas sobre el fondo en la cavidad en una placa desechable estéril de 6 cavidades NUNCLON® Delta para el trabajo de investigación de la célula (NUNC, InterMed, Roskilde, Dinamarca) . La barrera hemostática que va a ser colocada sobre el fondo de la cavidad se pretrató como se describe en el Ejemplo 1. Este tratamiento retarda la absorción del Surgicel significativamente. Esta barrera hemostática fue lavada entonces varias veces en agua destilada y subsiguientemente varias veces hasta que el glutaraldehido que no reaccionó fue retirado por lavado. Una cantidad pequeña del medio de cultivo celular que contiene el suero fue aplicada para que sea absorbida en la barrera hemostática y al mismo tiempo manteniendo la barrera hemostática húmeda en el fondo de la cavidad. Aproximadamente 106 células en 1 ml del medio de cultivo fueron colocadas directamente sobre la parte superior de la barrera hemostática, dispersadas sobre la superficie de la barrera hemostática pretratada con glutaraldehido al 0.4 % como se describió anteriormente. La placa fue incubada entonces en un incubador de C02 a 37 °C durante 60 minutos. Una cantidad de 2 a 5 ml del medio de cultivo del tejido que contiene 5 a 7.5% del suero fue agregada cuidadosamente a la cavidad que contiene las células evitando el esparcimiento de las células manteniendo la punta de la pipeta tangencial al lado de la cavidad cuando se está expulsando el medio. Parece que el pH del medio fue demasiado bajo (pH -6.8). El pH se ajustó entonces a 7.4-7.5. El siguiente día algunos condrocitos han empezado a crecer sobre la barrera hemostática distribuidos en grupos. Algunas de las células han muerto debido a la exposición al pH bajo previo al ajuste del pH. La placa se incubó durante 3 a 7 días con un cambio del medio en el día 3. Al final del período de incubación el medio se decantó y se agregó glutaraldehido al 2.5% refrigerado, frío que contiene sal de sodio 0.1M del ácido dimetilarsínico, (también llamado cacodilato de sodio, el pH es ajustado con HCl a 7.4), como un agente de fijación para la preparación de la célula y el soportador (barrera hemostática) para la preparación final para la microscopía electrónica.

Ejemplo 4 Los condrocitos se hicieron crecer en un medio de cultivo esencial mínimo que contiene HAM F12 y solución amortiguadora Hepes 15 mM y 5 a 7.5% de suero autólogo en un incubador de C02 a 37 °C y se manejó en un laboratorio Class 100 en Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenague, Dinamarca. Otras composiciones del medio de cultivo pueden ser utilizadas para cultivar los condrocitos. Las células fueron tripsinadas utilizando tripsina EDTA durante 5 a 10 minutos y se contaron utilizando el teñido de viabilidad Trypan Blue en una cámara de Bürker-Türk. El conteo de las células se ajustó a 7.5 x 105 células por ml. A una placa NUNCLON® se le retiró la cubierta en el laboratorio Class 100. El Surgicel® (para su uso como la barrera hemostática) se trató con aldehido glutárico al 0.6% durante un minuto como se describió en el Ejemplo 1, y se lavó con una solución de cloruro de sodio estéril al 0.9% o, preferentemente, con una solución amortiguadora tal como una solución amortiguadora de PBS o el medio de cultivo tal como MEM/F12, a causa de que el pH después del tratamiento con aldehido glutárico es de 6.8 y preferentemente debe ser de 7.0 a 7.5. El Tisseel® se aplicó sobre ambos lados del Surgicel® utilizando el sistema DUPLOJECT®, recubriendo así ambos lados del Surgicel®, el parche propuesto para que sea utilizado, con un adhesivo de fibrina. El encolado se deja que se seque bajo una condición aséptica durante al menos 3 a 5 minutos. La barrera hemostática "recubierta" se colocó sobre el fondo de la cavidad en una placa desechable estéril de 6 cavidades NUNCLON® Delta para el trabajo de investigación de la célula. Una cantidad pequeña del medio de cultivo del tejido que contiene el suero se aplicó para que sea absorbido en la barrera hemostática. Aproximadamente 106 células en 1 ml del suero que contiene el medio de cultivo del tejido se colocaron directamente sobre la parte superior del Hemostat, dispersadas sobre la superficie de la barrera hemostática. La placa se incubó entonces en un incubador de C02 a 37 °C durante 60 minutos. Una cantidad de 2 a 5 ml del medio de cultivo del tejido que contiene 5 a 7.5 % de suero fue agregada cuidadosamente a la cavidad que contiene las células evitando la dispersión de las células manteniendo la punta de la pipeta tangencial al lado de la cavidad cuando se expulsa el medio. Después de 3 a 6 días, el examen microscópico mostró que las células se estuvieron adheriendo a y crecieron en el Surgicel® de una manera satisfactoria, sugiriendo que el Surgicel® no mostró toxicidad con respecto a los condrocitos y que los condrocitos crecieron de una manera satisfactoria en el Surgicel®. La placa se incubó durante 3 a 7 días con el cambio del medio en el día 3. Al final del período de incubación, el medio se decantó y se agregó 2.5% de glutaraldehido refrigerado, frío, que contiene la sal de sodio 0.1M del ácido dimetilarsínico, también llamado cacodilato de sodio, el pH es ajustado con HCl a 7.4, como un agente de fijación para la preparación de la célula y el soportador (barrera hemostática) para la preparación final para microscopía electrónica.

Ejemplo 5 Los condrocitos se hicieron crecer en un medio de cultivo esencial mínimo que contiene HAM F12 y solución amortiguadora Hepes 15 mM y 5 a 7.5% de suero autdlogo en un incubador de C02 a 37 °C y se manejó en un laboratorio Class 100 en Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenague, Dinamarca. Las células fueron tripsinadas utilizando tripsina EDTA durante 5 a 10 minutos y se contaron utilizando el teñido de viabilidad Trypan Blue en una cámara de Bürker-Türk. El conteo de las células se ajustó a 7.5 x 105 hasta 2 x 106 células por ml . A una placa NUNCLON® se le retiró la cubierta en el laboratorio Class 100. Se ha encontrado que el Bio-Gide® puede ser utilizado como una membrana de bicapa resorbible la cual será utilizada como el parche o vendaje que cubre el área defectuosa de la articulación en la cual los condrocitos cultivados están siendo trasplantados, así como la barrera hemostática. El Bio-Gide® es una membrana de colágeno puro obtenida por procesos de fabricación controlados, estandarizados (por E.D. Geistlich Sóhne AG, CH-6110 Wolhusen) . El colágeno es extraído de los cerdos certificados veterinarios y es purificado cuidadosamente para evitar las reacciones antigénicas, y esterilizado en vesículas dobles por irradiación ?. La membrana de bicapa tiene una superficie porosa y una superficie densa. La membrana está hecha de colágeno del tipo I y del tipo II sin reticulación adicional o tratamiento químico. El colágeno es resorbido en el transcurso de 24 semanas. La membrana retiene su integridad estructural aún cuando está húmeda y la misma puede ser fijada por suturas o clavos. La membrana también puede ser "encolada" utilizando el adhesivo de fibrina tal como el Tisseel® al cartílago o tejido próximo ya sea en lugar de las suturas o junto con las suturas. El Bio-Gide® fue desprovisto de su cobertura en un laboratorio Class 100 y se colocó bajo condiciones asépticas sobre el fondo de las cavidades en una placa desechable estéril de 6 cavidades NUNCLON® Delta para el trabajo de investigación de la célula, -ya sea con la superficie porosa de la membrana de bicapa enfrentada hacia arriba o con la superficie densa enfrentada hacia arriba. Aproximadamente 106 células en 1 ml del medio de cultivo del tejido que contiene el suero se colocaron directamente sobre la parte superior del Bio-Gide®, dispersados ya sea sobre la superficie densa o porosa del Bio-Gide®. La placa fue incubada entonces en un incubador de C02 a 37 °C durante 60 minutos. Una cantidad de 2 a 5 ml del medio de cultivo del tejido que contiene 5 a 7.5 % del suero fue agregada cuidadosamente a la cavidad que contiene las células evitando la dispersión de las células manteniendo la punta de la pipeta tangencial al lado de la cavidad cuando se expulsa el medio. El día 2 después de que los condrocitos fueron colocados en la cavidad que contiene el Bio-Gide®, las células fueron examinadas en un microscopio Nikon Inverted. Se apreció que algunos de los condrocitos se han adherido al borde del Bio-Gide. Por supuesto que no fue posible ser capaz de observar el propio Bio-Gide® utilizando este microscopio. La placa se incubó durante 3 a 7 días con el cambio del medio en el día 3. Al final del período de incubación, el medio se decantó y se agrega glutaraldehido al 2.5% refrigerado, frío que contiene sal de sodio 0.1M del ácido dimetilarsínico, también llamado cacodilato de sodio, el pH es ajustado con HCl a 7.4, como un agente de fijación para la preparación de la célula y el soportador de Bio-Gide® con las células ya sea cultivadas sobre la superficie porosa o la superficie densa. Los parches Bio-Gide® fueron enviados entonces para microscopía electrónica al Departamento de Patología, Herlev Hospital, Dinamarca. La microscopía electrónica mostró que los condrocitos cultivados sobre la superficie densa del Bio-Gide® no crecieron en la estructura de colágeno del Bio-Gide®, mientras que las células cultivadas sobre la superficie porosa realmente crecieron en la estructura de colágeno y además, mostraron la presencia de proteoglicanos y ninguna señal de estructuras de fibroblastos. Este resultado muestra que cuando el parche de colágeno, como por ejemplo un parche Bio-Gide® es cosido como un parche que cubre un defecto de cartílago, la superficie porosa deberá estar enfrentada hacia abajo, hacia el defecto en el cual los condrocitos cultivados van a ser inyectados. Los mismos serán capaces entonces de penetrar el colágeno y producir una superficie de cartílago liso en línea con la superficie intacta, y en esta área una capa lisa de proteoglicanos será construida. Mientras tanto, si la superficie densa del colágeno está enfrentada hacia abajo hacia el defecto, los condrocitos que van a ser implantados no serán integrados con el colágeno, y las células no producirán la misma superficie lisa que se describió anteriormente.

Ejemplo 6 Los condrocitos se hicieron crecer en un medio de cultivo esencial mínimo que contiene HAM F12 y solución amortiguadora Hepes 15 mM y 5 a 7.5% de suero autólogo en un incubador de C02 a 37 °C y se manejó en un laboratorio Class 100 en Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenague, Dinamarca. Las células fueron tripsinadas utilizando tripsina EDTA durante 5 a 10 minutos y se contaron utilizando el teñido de viabilidad Trypan Blue en una cámara de Bürker-Türk. El conteo de las células se ajustó a 7.5 x 105 a 2 x 106 células por ml. Una placa NUNCLON® fue desprovista de su cubierta en el laboratorio Class 100. El Bio-Gide® utilizado como una membrana de bicapa resorbible también puede ser utilizado junto con un encolado orgánico tal como Tisseel® con un contenido significativamente más elevado, adicional, de Aprotinina, que el encontrado normalmente en Tisseel®, como se describió en el inserto del producto. Incrementado el contenido de Aprotinina a aproximadamente 25,000 KlU/ml, la resorción del material será retardada en semanas en lugar de la extensión o prolongación normal de días. Para probar esta característica in vitro, el Tisseel® es aplicado al fondo de la cavidad de la placa NUNCLON®, y se le permitió solidificarse de manera incompleta. Un parche de colágeno tal como un Bio-Gide® es aplicado entonces sobre el Tisseel® y se encoló al fondo de la cavidad. Esta combinación de Bio-Gide® y Tisseel® se diseñó para que sea una barrera hemostática que inhibirá o prevendrá el desarrollo o la infiltración de los vasos sanguíneos en el área de trasplante de los condrocitos. Este parche de colágeno híbrido puede ser utilizado ahora tanto como una barrera hemostática en el fondo de la lesión (más próximo a la superficie que va a ser reparada) pero también como un soporte para la formación del cartílago a causa de que la superficie alejada puede ser el lado poroso del parche de colágeno y por consiguiente estimular la infiltración de los condrocitos y la matriz del cartílago. Por consiguiente este parche de colágeno híbrido también puede ser utilizado para cubrir la parte superior del implante con la superficie porosa de colágeno dirigida hacia abajo, hacia los condrocitos implantados y la barrera que forma la parte superior. El parche de colágeno híbrido, con el componente de Aprotinina elevado también puede ser utilizado sin algún encolado orgánico tal como Tisseel® y colocado dentro del defecto directamente, adheriéndose por las fuerzas naturales. Por consiguiente el parche de colágeno puede ser utilizado tanto como la barrera hemostática, como la cobertura libre de células del sitio de reparación/trasplante, con las superficies porosas de los parches orientadas hacia los condrocitos/cartílago implantados. Otra variante sería el uso del parche de colágeno el cual consiste de colágeno del tipo II (es decir de Geistlich Sohne AG, CH-6110 Wolhusen) . Por consiguiente, la presente invención proporciona un parche de colágeno híbrido en donde el parche es una matriz de colágeno con niveles elevados del componente de aprotinina, preferentemente de manera aproximada 25,000 KlU/ml, en asociación con un encolado de matriz orgánica, en donde el componente de colágeno es similar al material de bicapa resorbible Bio-Gide® o colágeno del Tipo II, y el encolado orgánico es similar al material Tisseel®. En otra modalidad, el parche de colágeno híbrido no utiliza ningún encolado orgánico para adherirse al sitio de la reparación.

Ejemplo 7 A causa de la estructura debilitada del cartílago osteoartrítico, la adherencia de los condrocitos autólogos cultivados trasplantados a un sitio de injerto en un cartílago defectuoso puede ser inhibida, creando así una zona marginal (zona de demarcación) entre el cartílago/condrocitos recientemente implantados y el cartílago establecido circundante. Esta zona marginal será más pronunciada si el sitio de injerto es preparado para el injerto creando paredes lisas, rectas, cortadas de un modo lineal. Las fuerzas de cizallamiento u compresión a través de tal zona marginal (como se ilustra en la Figura 3A) ejercerán una gran fuerza para desalojar el injerto cuando el sitio del injerto es cortado de una manera lineal. Esta zona marginal, y el movimiento diferencial de los materiales a lo largo de esta zona inhibirán el sanado confluente entre el material injertado y el material circundante. Este cizallamiento de la zona marginal es agravado cuando la dureza del material de empalme es diferente. En muchos casos, el material de injerto es más suave que el material circundante, sin embargo, en algunos casos de enfermedad de osteoartritis, el cartílago circundante puede ser más blando en efecto que los condrocitos/cartílago implantados . Por lo tanto, para resolver este problema, el método, de la invención enseña el uso de instrumentos quirúrgicos para esculpir las paredes del sitio de injerto de tal modo que las paredes sean no lineales, y por consiguiente proporcionen superficies onduladas las cuales reducirán el cizallamiento de la zona marginal y proveerán el anclaje del material injertado. También es posible conformar el sitio de injerto de tal modo que el diámetro del sitio próximo a la superficie del hueso sea de una dimensión más grande, y entonces la abertura alejada del hueso y la superficie del cartílago sean reparadas tal como si existiera un efecto de "embudo inverso". Una abertura estrecha en la superficie ayudará a reducir el cizallamiento de la zona marginal y la expulsión del material de injerto del sitio de injerto. Una modalidad preferida describe la escultura de las paredes del sitio de injerto de una manera similar a una abertura roscada para recibir un perno o tornillo (como se ilustra en la Figura 3B) , proporcionando así resistencia mecánica a la compresión y/o a la expulsión del material injertado desde el sitio de injerto, lo cual puede ser descrito como un roscado "macho" y "hembra". Los instrumentos quirúrgicos contemplados por la presente invención pueden ser fabricados de metal y/o de plástico adecuado para obtener instrumentos quirúrgicos desechables de un solo uso, o instrumentos quirúrgicos reutilizables de usos múltiples. Como el cartílago es un material relativamente suave, el mismo puede ser ventajoso para fabricar bordes cortantes de plástico endurecido los cuales serán capaces de esculpir el cartílago sin que sean capaces de dañar el hueso. Tales instrumentos cortantes pueden ser fabricados para incorporar aberturas para la administración de un fluido, la remoción por succión de los desechos del corte y del fluido, y roscas de fibra óptica para la iluminación y visualización del sitio del defecto. En ciertas modalidades del instrumento, la base del instrumento puede tener un punto sobresaliente o estructura semejante a un perno, la cual ayudará a guiar y colocar el instrumento en el sitio de injerto. Por supuesto, tal perno será diseñado para un daño minimizado al hueso subyacente.

Aunque la superficie cortante del instrumento puede ser de una configuración de un solo diente, o de dientes múltiples, o descrita como una configuración semejante a una sierra tal como aquella en un macho de roscar metálico utilizado para generar orificios rocados en partes metálicas, la característica requerida del instrumento cortante es que los lados esculpidos resultantes del sitio de injerto sean ondulados, y no lineales. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el borde cortante del instrumento puede ser conformado similar a aquel mostrado en la Figura 4A, o como en la Figura 4B. El borde cortante puede ser plano, o circular porque el mismo se enrolla alrededor del diámetro del instrumento cortante. Muchas otras formas pueden ser diseñadas para efectuar el propósito del método de la invención para crear una interfase la cual proporcione una resistencia mecánica a la reacción diferencial a las fuerzas de compresión y cizallamiento sobre el material trasplantado y el material circundante.

Ejemplo 8 Un cerdo de raza Yorkshire mestizo de cuatro meses de edad se sometió a anestesia general y se colocó sobre su espalda. El cerdo se lavó y se envolvió en un juego quirúrgico completo en el Harrington Arthritis Research Center, Phoenix, Arizona. El procedimiento quirúrgico completo se efectuó asépticamente. La pata trasera izquierda y el área inguinal y del abdomen adyacente se limpiaron con yodo. La articulación de la rodilla se localizó, y la patella se localizó. Se efectuó una incisión media aproximadamente a 3 cm desde la parte posterior de la patella y las diversas capas y ligamentos musculares, y del subcutis, fueron cortadas aproximadamente para proveer acceso al cóndilo femoral medial. Utilizando un cortador circular se preparó una lesión en el cartílago blanco sobre la parte medial del cóndilo medial, dejando un margen de 0.5 a 1 cm con respecto al borde del cartílago que cubre la parte medial-posterior del cóndilo (cóndilo izquierdo, Figura 6A) . El defecto de 0.5 a 1 cm se colocó en una parte de soporte del peso caudal del cóndilo medial. El procedimiento quirúrgico completo se hizo sin torniquete sobre el fémur izquierdo. Las diferentes capas y la piel se suturaron apropiadamente. El día 3 el animal fue llevado nuevamente al sitio quirúrgico y se colocó como anteriormente sobre la mesa de cirugía y se le aplicó anestesia general. La pata trasera izquierda, el abdomen y la región inguinal se yodaron como se describió anteriormente. Las suturas fueron cortadas y se abrió el área. Se apreció que un hematoma moderado estuvo presente en la articulación de la rodilla. El coágulo de sangre fue removido y se inspeccionó el defecto. Existió un coágulo de sangre en el defecto el cual fue removido. Un instrumento quirúrgico estéril diseñado con un borde cortante de rosca o filete macho, con un tamaño que corresponde a, o ligeramente más grande que la circunferencia de la lesión, fue atornillado cuidadosamente de manera gradual en el defecto. Una almohadilla BioGide® fue cortada a un tamaño igual al fondo del defecto. El primer encolado usado, llamado Adhesive Protein (A-2707, Sigma Chemical, EUA) se aplicó sobre el lado denso de la almohadilla de barrera hemostática recortada, y la almohadilla se colocó en el lado denso descendiendo hacia el fondo de la lesión, utilizándola como una barrera como se describió anteriormente. Se encontró que esta encoladura parece que no se seca muy rápido. El sangrado ligero desde el fondo del defecto se detuvo inmediatamente. Un segundo BioGide® se cortó algo más grande en su circunferencia que la lesión y se colocó con el lado denso hacia arriba (por consiguiente el lado poroso volteado hacia el injerto) como se describió anteriormente. Esta almohadilla de cobertura no celular fue suturada entonces sobre la cavidad, dejando un borde abierto, en donde el condrocito que va a ser explantado podrían ser inyectado en el sitio de injerto. La parte circundante del borde de la almohadilla se cubrió con el segundo encolado, Dow Corning Medical Adhesive B (Cat. #895-3, Dow Corning, EUA) . Este segundo encolado se secó mucho más rápido y más eficientemente que el primer encolado. Se encontró que durante este procedimiento particular, el primer encolado no se secó lo suficientemente para retener a la barrera hemostática en su lugar cuando se intenta la sutura de la tapa. La barrera principal formada sobre la superficie próxima del sitio de injerto fue por el propio encolado. Usando una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 16, la suspensión de células de condrocitos (aproximadamente 0.6 ml) se extrajo hacia el barril o cilindro de la jeringa. Una aguja corta de calibre 23 se cambió por la aguja de calibre 16, y la suspensión celular se inyectó bajo la parte de cubierta suturada en el sitio del injerto (aproximadamente 10 x 106 células) . El borde abierto de la tapa se encoló entonces previo a la remoción de la aguja, y la aguja se extrajo cuidadosamente. No se observó ninguna fuga de células. La herida fue suturada y como anteriormente, no se utilizó ningún torniquete, no se observó ninguna hemorragia. Las capas finales de la piel fueron suturadas. Ninguna protuberancia de la piel ocurrió después de la suturación, lo cual indica que no existió hematoma. La recuperación posoperativa fue sin acontecimientos notables. Como se esperaba, los condrocitos injertados produjeron suficiente matriz del cartílago para reparar el defecto hecho en la superficie del cartílago articular de la articulación de la rodilla del cerdo de prueba. La Figura 6A es una imagen de MRI de una rodilla de cerdo que muestra el defecto del cartílago creado en la rodilla (cóndilo izquierdo, el cóndilo medial), y la Figura 6B es una imagen de MRI de la misma rodilla del cerdo tres meses después del tratamiento, que muestra la reparación del defecto.

Ejemplo 9 Un juego o conjunto que comprende los componentes útiles para la práctica del método de la invención, permitirá la práctica conveniente del método de la invención en un medio ambiente quirúrgico. En una modalidad preferida, un juego o conjunto de la invención proporcionará componentes estériles adecuados para un uso facilitado en el medio ambiente quirúrgico, y proveerán una barrera hemostática adecuada, un parche de cobertura adecuado, y si es necesario un encolado orgánico. Un juego o conjunto de la invención también puede proporcionar un material de matriz libre de células, estéril, adecuado para soportar los condrocitos autólogos que van a ser implantados en un defecto superficial de la unión articular. En una modalidad, un juego o conjunto de la invención contiene una barrera hemostática Surgicel® y un parche de cobertura Bio-Gide® con un recubrimiento adecuado de encolado orgánico Tisseel®, en donde el Surgicel® y el Bio-Gide® han sido tratados de acuerdo con las enseñanzas de la invención para incrementar la -resorción del depósito glacial temporal. En los casos en donde el Tisseel® es pre-recubierto, en una modalidad el Tisseel® es suplementado con aprotinina adicional para incrementar la resorción del depósito glacial temporal. En otra modalidad preferida, la barrera hemostática y el parche de cobertura son ambos una matriz de colágeno semipermeable la cual es tratada para extender la resorción del depósito glacial temporal del material. También es posible proveer el encolado de Tisseel® en una forma mejorada como un componente separado que va a ser aplicado cuando sea necesario a causa de la variabilidad inherente y las circunstancias únicas que se encontrarán en cada procedimiento de reparación/trasplante.

Una modalidad adicional de un juego o conjunto de la invención incluirá un instrumento quirúrgico como se describió en el Ejemplo 7 anterior, o variaciones adecuadas del mismo. Será apreciado por las personas expertas en la técnica que se pueden hacer numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención mostrada en las modalidades específicas sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se describió.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (18)

REIVliroiCACIONES

1. Un método para el tratamiento efectivo del cartílago de la superficie de la unión de articulación por el transplante de los condrocitos en una matriz adecuada, a una superficie que va a ser tratada, con una barrera hemostática y un parche de cobertura, caracterizado porque comprende; colocar una barrera hemostática próxima a la superficie que va a ser tratada, colocar los condrocitos en una matriz adecuada sobre la superficie que va a ser tratada, alejada de la barrera hemostática, y cubrir la superficie que va a ser tratada con un parche de cobertura.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el parche de cobertura es adherido primero a la superficie del cartílago que cubre un sitio de injerto, y luego los condrocitos son colocados bajo el parche de cobertura en el sitio de injerto.

3. Un método de conformidad con las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el parche de cobertura contiene una matriz de colágeno semipermeable.

4. Un método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el parche de cobertura contiene una matriz de colágeno semipermeable con una superficie porosa.

5. Un método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la superficie porosa hace contacto con los condrocitos injertados.

6. Un método de conformidad con las reivindicaciones 3, 4 y 5, caracterizado porque el parche de cobertura contiene una matriz de colágeno semipermeable la cual está substancialmente libre de células intactas.

7. Un método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la barrera hemostática es un material semipermeable resorbible el cual inhibe o prohibe la infiltración vascular a través de la barrera.

8. Un método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la barrera hemostática contiene colágeno.

9. Un método para el trasplante de los condrocitos en una matriz adecuada, a una superficie que va a ser tratada, con un sitio de injerto, una barrera hemostática y un parche de cobertura, caracterizado porque comprende: primero esculpir el sitio del injerto de tal modo que las paredes del sitio del injerto sean no lineales y/u ondulantes, colocar una barrera hemostática próxima a la superficie que va a ser tratada dentro del sitio de injerto esculpido, colocar los condrocitos en una matriz adecuada dentro del sitio de injerto sobre la barrera hemostática, y cubrir la superficie que va a ser tratada con un parche de cobertura.

10. Un método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el parche de cobertura es fijado parcialmente previo a la colocación de los condrocitos, dentro de un sitio de injerto, sobre una barrera hemostática.

11. Un método de conformidad con las reivindicaciones 9 y 10, caracterizado porque la barrera hemostática es de un material semipermeable resorbible el cual inhibe o prohibe la infiltración vascular a través de la barrera.

12. Un método de conformidad con las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la barrera hemostática contiene colágeno.

13. El método de conformidad con las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque el parche de cobertura es una matriz de colágeno semipermeable libre de células.

14. Un equipo o conjunto para el trasplante de condrocitos y opcionalmente de cartílago, sobre la superficie de una unión articular, caracterizado porque el juego o conjunto comprende una barrera hemostática pretratada para resistir la resorción la cual puede ser adaptada para colocar sobre la superficie, un parche de cobertura pretratado para resistir la resorción, el cual puede ser adaptado para cubrir la superficie, y el encolado orgánico el cual puede ser adaptado para fijar la barrera hemostática y/o el parche de cobertura a la superficie.

15. Un equipo o conjunto para la práctica del método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende una barrera hemostática tratada para inhibir la resorción, un parche de cobertura tratado para inhibir la resorción, un encolado orgánico, y opcionalmente un instrumento quirúrgico para esculpir las paredes del sitio de injerto, y opcionalmente un material de matriz adecuado para soportar los condrocitos colocados dentro del sitio de injerto.

16. Un instrumento quirúrgico para esculpir un sitio de injerto, caracterizado porque comprende paredes y un fondo dentro de una superficie de cartílago óseo de articulación que comprende un borde cortante fijado a una varilla o manija de tal modo que cuando sea girado o inscrito en una dirección circular dentro del sitio de injerto, el sitio de injerto es esculpido de tal modo que las paredes del sitio de injerto sean no lineales u opcionalmente ondulantes.

17. Un instrumento quirúrgico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la hoja o cuchilla está configurada como en las Figuras 4A o 4B.

18. Un instrumento quirúrgico de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la hoja o cuchilla está configurada como una hoja helicoidal que se mueve en espiral sobre la superficie de una varilla tubular o circular.