MXPA98000562A - 5-enol piruvilshikimato-3-fosfato sintasa mutada,gen que codifica para esta proteina, y plantas transformadas que contienen el gen - Google Patents

Abstract

La presente invención describe un gen de resistencia al glifosato mutado de 5-enol piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que incluye al menos una substitución de treonina 102 por isoleucina, yútil para producir plantas transformadas resistentes al glifosato.

Description

-ENOL PIRUV LSHIKIMATO-3-FOSFATO SINTASA MUTADA, GEN QUE CODIFICA PARA ESTA PROTEINA, Y PLANTAS TRANSFORMADAS QUE CONTIENEN EL GEN DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a una nueva 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (o EPSPS) que exhibe una tolerancia mejorada con respecto a herbicidas que son inhibidores competitivos con respecto a fosfoenolpiruvato (PEP) de actividad de EPSPS. Esta EPSPS sintasa más tolerante posee al menos una substitución de "treonina por isoleucina". La invención también se relaciona a un gen que codifica para tal proteina, a células de plantas transformadas por construcciones de genes quiméricos que contienen este gen, a las plantas regeneradas a partir de estas células, y también a las plantas que se originan a partir del cruce usando estas plantas transformadas. El glifosato, sulfosato y fosa etine son herbicidas sistémicos de amplio espectro de la familia de la fosfonometilglicina. Actúan esencialmente como inhibidores competitivos de la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EC 2.5.1.19) o EPSPS con respecto al PEP (fosfoenolpiruvato) . Después de su aplicación a la planta, son translocados en la planta, en donde se acumulan en las partes que crecen rápidamente, en particular el caulino y REF: 26706 ápices de las raices, causando daño, al punto de destrucción de plantas sensibles. El EPSPS de plástido, el objetivo principal de estos productos, es una enzima del camino de biosintesis de amino ácidos aromáticos, la cual es codificada por uno o más genes nucleares, y sintetizada en forma de un precursor citoplásmico, luego importada dentro del plástido, en donde se acumula en su forma madura. La tolerancia de las plantas al glifosato y a productos de la familia se obtiene por la introducción estable dentro de su genoma de un gen de EPSPS, de origen vegetal o bacteriano, el cual es mutado o tratado de otra manera respecto de las características de inhibición por el glifosato del producto de este gen. En vista del modo de acción del glifosato y el grado de tolerancia al glifosato del producto de los genes que se usan, es ventajoso ser capaz de expresar el producto de la translocación de este gen para permitirle que se acumule en cantidades substanciales en los plástidos. Se conoce, por ejemplo de la Patente Norteamericana No. 4,535,060, como conferir sobre una planta una tolerancia a un herbicida del tipo de arriba, especialmente N-fosfonometilglicina o glifosato, introduciendo en el genoma de las plantas un gen que codifica para un EPSPS que lleva al menos una mutación que hace a esta enzima más resistente a su inhibidor competitivo (glifosato) después de la localización de la enzima en el compartimento del plástido. Estas técnicas, sin embargo, necesitan ser mejoradas, para obtener una mayor confiabilidad en el uso de estas plantas bajo condiciones agrícolas. En la presente descripción, se entiende que "planta" significa cualguier organismo multicelular diferenciado capaz de fotosíntesis, y se entiende que "célula de planta" significa cualquier célula que se origina de una planta, y es capaz de constituir tejidos no diferenciados tales como callos, o tejidos diferenciados tales como embriones o partes de plantas o semillas. El sujeto de la presente invención es la producción de plantas transformadas que tienen una tolerancia mejorada a herbicidas de la familia de fosfonometilglicina, por regeneración de células transformadas por medio de nuevos genes quiméricos que contienen un gen para la tolerancia a estos herbicidas. El sujeto de la invención es también un gen quimérico para conferir sobre plantas una tolerancia incrementada con respecto a un herbicida que tiene a la EPSPS como su objetivo, que comprende, en la dirección de transcripción: una región promotora, opcionalmente una región de péptido de tránsito, una secuencia de un gen que codifica para una enzir-a de tolerancia al glifosato, y una región de señal de poliadenilación no transladada en el extremo 3' , caracterizado porque el gene de tolerancia al glifosato contiene, relativo al gen del cual se deriva, una substitución de "treonina 102 por isoleucina" en la región de "aroA" (EPSPS) . Preferiblemente, comprende, además, en la nisma región, una substitución de "prolina 106 por serir.a". Estas substituciones pueden ser introducidas o estar presentes en una secuencia de EPSPS de cualquier origen, en particular de origen vegetal, bacteriano, algal o fúngico. Los péptidos de tránsito que pueden ser usados en la región del péptido de tránsito pueden ser, conocidos per se, ?e origen vegetal, por ejemplo los que se originan del ai?, girasol, guisante, tabaco o similares. El primero y el segundo péptido de tránsito pueden ser idénticos, similares o diferentes. Pueden, además, cada uno comprender una o más unidades de péptido de tránsito de acuerdo a la Solicitud de Patente Europea EP 0 508 909. Es el papel de esta región caracteristica permitir la liberación de una proteina madura y natural, y especialmente la EPSPS mutada de arriba, con máxima eficacia en el compartimento del plásnido.

La región promotora del gen quimérico de acuerdo a la invención puede estar ventajosamente compuesto de al menos un gen promotor o fragmento de promotor que se expresa naturalmente en plantas (tubulina, intrones, actina, histona) . La región de señal de terminación de transcripción no transladada en el extremo 3' del gen quimérico puede ser de cualquier origen, por ejemplo de origen bacteriano, tal como aquella del gen de la nopalina sintasa, o de origen vegetal, tal como aquella del gen de H4A748 de histona de Arabidopsis t a-liana de acuerdo a la Solicitud de Patente Europea (Solicitud Europea 633 317) . Ei gen quimérico de acuerdo a la invención puede comprender, además de las porciones esenciales de arriba, al menos una región intermediaria (enlazadora) no transladada, que puede estar localizada entre las diferentes regiones transcritas descritas arriba. Esta región intermediaria puede ser de cualquier origen, por ejemplo de origen bacteriano, viral o vegetal. Aislamiento de un cADN que codifica para una EPSPS de maiz Las diferentes etapas que dan lugar a la obtención de cADN de EPSPS de maiz, que sirvió como substrato para la introducción de las dos mutaciones, están descritas abajo.

Todas las operaciones descritas abajo se dan por via de ejemplo, y corresponden a una selección hecha de entre los diferentes métodos disponibles para llegar al mismo resultado. Esta selección no tiene efecto sobre la calidad del resultado, y consecuentemente cualquier método adecuado puede ser usado por una persona experta en la técnica para llegar al mismo resultado. La mayoría de estos métodos de construcción de fragmentos de ADN están descritos en "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes 1 y 2, Ausubel F. M. et al., publicado por Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience (1989) (en lo sucesivo, la referencia a los protocolos descritos en este trabajo se designará "ref. CPMB") . Las operaciones relacionadas a ADN que se realizaron de acuerdo a los protocolos descritos en este trabajo son especialmente los siguientes: ligado de fragmentos de ADN, tratamiento con ADN polimerasa de Klenow y ADN polimerasa de T4, preparación de ADN de plásmido y de bacteriófago ?, ya sea como una minipreparación o como una maxipreparación, y análisis de ADN y ARN de acuerdo a las técnicas de Southern y Northern, respectivamente. Se siguieron otros métodos descritos en este trabajo, y solamente las modificaciones significativas o las adiciones a estos protocolos se han descrito abajo.

Ejemplo 1: 1. Obtención de un fragmento de EPSPS de Arabidopsis thaliana a) Dos oligonucleótidos de 20-mer de las secuencias respectivas : 5' -GCTCTGCTCATGTCTGCTCC-3' 5' -GCCCGCCCTTGACAAAGAAA-3' se sintetizaron a partir de la secuencia de un gen de EPSPS de Arabidopsis thaliana (Klee, H. J. et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210, 437-442). Estos dos oligonucleótidos están en las posiciones 1523 a 1543 y 1737 a 1717, respectivamente, de la secuencia publicada, y en orientaciones opuestas. b) Se obtuvo ADN total de Arabidopsis thaliana (var. columbia) de Clontech (referencia de catálogo: 6970-1) . c) 50 nanogra os (ng) de ADN se mezclaron con 300 ng de cada uno de los oligonucleótidos, y se sujetaron a 35 ciclos de amplificación con un aparato de Perkin-Elmer 9600, bajo las condiciones de medio estándar para amplificación que se recomiendan por el proveedor. El fragmento resultante de 204 pb constituye el fragmento de EPSPS de Arabidopsis thaliana. 2. Construcción de una biblioteca de un cADN de una linea celular de maiz BMS a) 5 g de células filtradas se molieron en nitrógeno liquido, y se extrajeron los ácidos nucleicos totales de acuerdo al método descrito por Shure et al. Con las siguientes modificaciones: - el pH de la solución amortiguadora de lisis se ajustó a un pH de 9.0; - después de la precipitación con isopropanol, el pelet se disolvió en agua y, después de disolución, se ajustó a 2.5 M en LiCl. Después de incubación por 12 hr a ° C, el pelet de la centrifugación por 15 minutos a 30,000 g a 4o C se volvió a solubilizar. Se repitió luego la etapa de precipitación con LiCl. El pelet vuelto a solubilizar constituye la fracción de ARN de los ácidos nucleicos totales. b) La fracción de ARN de poli (A)* de la fracción de ARN se obtuvo por cromatografía sobre una columna de oligo(dT) -celulosa, como se describe en "Current Protocols in Molecular Biology". c) Sintesis de cADN de doble hebra, que tiene un extremo de EcoRI sintético: ésta se lleva a cabo de acuerdo al protocolo del proveedor de los diferentes reactivos necesarios para esta sintesis en la forma de un estuche: el "estuche de copia" de la compañía In Vitrogen. Dos oligonucleótidos de una sola hebra, y parcialmente complementarios de las secuencias respectivas: 5'-AATTCCCGGG-3' 5'-CCCGGG-3' (el último está fosforilado) se ligaron con los cADNs de doble hebra de extremo pegajoso. Esta ligadura de los adaptadores resulta en la creación de sitios S al unidos a los cADNs de doble hebra, y sitios EcoRI en forma cohesiva en cada extremo de los cADNs de doble hebra. d) Creación de la biblioteca: Los cADNs que poseían los sitios de EcoRI cohesivos artificiales en sus extremos se ligaron con cADN ?gtlO de bacteriófago, que habia sido cortado con EcoRI y desfosforilado de acuerdo al protocolo del proveedor New England Biolabs. Una alícuota de la reacción de ligadura se encapsidó in vitro con extractos de encapsidación, es decir Gigapack Gold, de acuerdo a las instrucciones del proveedor; esta biblioteca se valoró usando la bacteria E. coli C600hfl. La biblioteca obtenida por este medio se amplificó y se almacenó de acuerdo a las instrucciones del mismo proveedor, y constituye la biblioteca de cADN de suspensión de células de maiz BMS. 3. Selección de la biblioteca de cADN de suspensión de células de maiz BMS con la sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana El protocolo seguido es aquel de "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes 1 y 2, Ausubel, F. M. et al., publicado por Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience (1989) (CPMB) . Brevemente, aproximadamente 10€ fagos recombinantes se sembraron en placa, sobre discos LB, en una densidad promedio de 100 fagos/cm2. Las placas liticas se replicaron por duplicado sobre membranas Amersham Hybond N. El ADN se fijó a los filtros por tratamiento por UV de 1600 kJ (Stratagene Stratalinker) . Los filtros se hibridaron previamente en 6xSSC/0.1 % SDS/0.25 leche descremada por 2 horas a 65° C. La sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana se marcó con [32P]dCTP por adición de iniciador aleatoriamente, de acuerdo a las instrucciones del proveedor (estuche de Pharmacia Ready to Go) . La actividad especifica obtenida es del orden de 10? cpm por µg de fragmento. Después de desnaturalización por 5 minutos a 100° C, la sonda se agregó al medio de prehibridación, y la hibridación se continuó por 14 horas a 55° C. Los filtros se sometieron a fluorografía por 48 horas a -80° C con una película Kodak XAR5 y pantallas de incremento RPN de Amersham Hyperscreen. La alineación de las manchas positivas sobre el filtro con los discos de los cuales se originaron permite que zonas que corresponden a los fagos que exhiben una respuesta de hibridación positiva con la sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana se recuperen del disco. Esta etapa de sembrado en placa, transferencia, hibridación y recuperación se repite hasta que todas las manchas en el disco de los fagos purificados sucesivamente resultaron 100 % positivos en la hibridación. Una placa independiente de lisis de fagos se recuperó en medio ? diluente (Tris-Cl pH 7.5; MgS04 10 mM; NaCl 0.1 M; gelatina 0.1 %); estos fagos en solución constituyen los clones positivos a EPSP de la suspensión de células de maíz de BMS. 4. Preparación y análisis del ADN de los clones de EPSP de la suspensión de células de maíz de BMS Se agregaron aproximadamente 5 x 108 fagos a 20 ml de bacterias C600hfl, en un valor de D060on de 2/ml, y se incubaron por 15 minutos a 37° C. Esta suspensión se diluyó luego en 200 ml de medio de crecimiento bacteriano, en un matraz Erlenmeyer de 1 litro, y se agitó en un agitador giratorio a 250 rpm. La lisis se nota cuando el medio se clarifica, correspondiendo a la lisis de la bacteria turbia, y toma lugar después de aproximadamente 4 horas de agitación. Este sobrenadante se trató luego como se describe en "Current Protocols in Molecular Biology". El ADN obtenido corresponde a los clones de EPSP de la suspensión de células de maíz de BMS. Uno a dos µg de este ADN se cortaron con EcoRI, y se separaron sobre gel de agarosa con 0.8 % de LGTA/TBE (ref. CPMB) . Una verificación final consiste en verificar que el ADN purificado verdaderamente exhibe una señal de hibridación con la sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana. Después de la electroforesis, los fragmentos de ADN se transfirieron sobre membranas Amersham Hybond N de acuerdo al protocolo de Southern descrito en "Current Protocols in Molecular Biology". El filtro se híbrido con la sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana de acuerdo a las condiciones descritas en la sección 3 de arriba. El clon que exhibía una señal de hibridación con la sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana, y que contenía el fragmento de EcoRI más grande tiene un tamaño estimado sobre gel de aproximadamente 1.7 kpb.

. Obtención del clon pRPA-ML-711 Diez µg de clon de fago que contenía el inserto de 1.7 kpb se digirió con EcoRI, y se separó sobre gel de agarosa con 0.8 % de LGTA/TBE (ref. CPMB). El fragmento de gel que contenía el inserto de 1.7 kpb se cortó del gel por tinción con BET, y el fragmento se trató con ß-agarasa de acuerdo al protocolo del proveedor, New England Biolabs. El ADN purificado del fragmento de 1.7 kpb se ligó a 12° C por 14 horas con el ADN del plásmido pUC 19 (New England Biolabs) cortado con EcoRI de acuerdo al protocolo de ligadura descrito en "Current Protocols in Molecular Biology". Dos µl de la mezcla de ligadura de arriba se usaron para la transformación de una alícuota de E. coli DH10B electrocompetente; la transformación se logró por electroporación, usando las siguientes condiciones: la mezcla de bacteria electrocompetente y el medio de ligado se introdujeron en una celda de electroporación de un grosor de 0.2 cm (Biorad) previamente enfriada a 0 C. Las condiciones físicas de la electroporación, usando un electroporador hecho por Biorad son 2500 voltios, 25 µF y 200 O. Bajo estas condiciones, el tiempo de descarga promedio del condensador es del orden de 4.2 milisegundos. Las bacterias se suspendieron luego en 1 ml de medio SOC (ref. CPMB), y se agitaron por 1 hora a 200 rpm sobre un agitador giratorio en tubos de Corning de 15 ml. Después de sembrar en placa sobre medio LB/agar suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina, se produjeron minipreparaciones de los clones bacterianos que habían crecido después de una noche a 37° C, de acuerdo al protocolo descrito en "Current Protocols in Molecular Biology". Después de la digestión del ADN con EcoRI y separación por electroforesis sobre gel de agarosa con 0.8 % de LGTA/TBE (ref. CPMB), se retuvieron los clones que poseían un inserto de 1.7 kpb. Una verificación final consiste en verificar que el ADN purificado realmente exhiba una señal de hibridación con la sonda de Arabidopsis thaliana. Después de electroforesis, los fragmentos de ADN se transfirieron sobre membranas Amersham Hybond N, de acuerdo al protocolo de Southern descrito en "Current Protocols in Molecular Biology". El filtro se híbrido con la sonda de Arabidopsis thaliana de acuerdo a las condiciones descritas en la sección 3 de arriba. El clon del plásmido que poseía un inserto de 1.7 kpb, y se híbrido con la sonda de EPSPS de Arabidopsis thaliana se preparó en una escala más grande, y el ADN que resultó de la lisis de las bacterias se purificó sobre un gradiente de CsCl como se describe en "Current Protocols in Molecular Biology". Al ADN purificado se le determinó parcialmente la secuencia con un estuche de Pharmacia, de acuerdo a las instrucciones del proveedor, y usando como iniciadores los iniciadores universales directos e inversos M13 ordenados del mismo proveedor. La secuencia parcial producida cubre aproximadamente 0.5 kpb. La secuencia de amino ácidos derivada en la región de la proteína madura (aproximadamente 50 residuos de amino ácidos) exhibe 100 % de identidad con la secuencia correspondiente de amino ácidos de la EPSPS del maíz maduro descrita en la Patente Americana USP 4,971,908. Este clon, que corresponde a un fragmento de EcoRI de 1.7 kpb del ADN del EPSPS de la suspensión de células de maíz de BMS, se designó pRPA-ML-711. La secuencia completa de este clon se determinó en ambas hebras, usando el protocolo del estuche de Pharmacia, y sintetizando oligonucleótidos complementarios, y aquellos de la orientación opuesta cada 250 pb aproximadamente. La secuencia completa obtenida de este clon de 1713 pb se presenta en SEQ ID No. 1. 6. Obtención del clon pRPA-ML-715 El análisis de la secuencia del clon pRPA-ML-711, y especialmente la comparación de la secuencia de amino ácidos derivada con aquella del maíz, muestra una extensión de secuencia de 92 pb corriente arriba del codon GCG que codifica para la alanina NH2-terminal de la EPSPS de maíz (Patente Norteamericana USP No. 4,971,908). Similarmente, se observa una extensión de 288 pb corriente abajo del codon AAT que codifica para la asparagina COOH terminal de la porción madura de la EPSPS de maíz (Patente Norteamericana USP No. 4,971,908). Estas dos porciones podrían corresponder, en el caso de la extensión NH2-terminal, a una porción de la secuencia de un péptido de tránsito para la localización del plástido, y, en el caso de la extensión COOH terminal, a la región 3' no transladada del cADN. Para obtener un cADN que codifica para la porción madura del cADN de la EPSPS del maíz, como se describe en USP No. 4,971,908, se llevaron a cabo las siguientes operaciones: a) Eliminación de la región 3' no transladada: construcción de pRPA-ML-712: El clon pRPA-ML-711 se cortó con la enzima de restricción Asel, y los extremos que resultaron de esta hidrólisis se volvieron pegajosos por tratamiento con el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I de acuerdo al protocolo descrito en CPMB. Se realizó luego una hidrólisis con la enzima de restricción SacII. El ADN resultante de estas operaciones se separó por electroforesis sobre gel de agarosa con 1 % de LGTA/TBE (ref. CPMB) .

El fragmento de gel que contenía el inserto de 0.4 kpb "Asel-extremos pegajosos/SacII" se cortó del gel, y se purificó de acuerdo al protocolo descrito en la sección 5 de arriba. El ADN del clon pRPA-ML-711 se cortó con la enzima de restricción HindIII en el sitio HindIII localizado en el polienlazador del vector de clonado pUC19, y los extremos resultantes de esta hidrólisis se volvieron pegajosos por tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I. Lego se realizó una hidrólisis con la enzima de restricción SacII. El ADN resultante de estas manipulaciones se separó por electroforesis sobre gel de agarosa con 0.7 % de LGTA/TBE (ref. CPMB). El fragmento de gel que contenía el inserto de aproximadamente 3.7 kpb de HindIII-extremos pegajosos/SacII se cortó del gel, y se purificó de acuerdo al protocolo descrito en la sección 5 de arriba. Los dos insertos se ligaron, y 2 µl de la mezcla de ligado se usaron para transformar E. coli DH10B, como se describe arriba en la sección 5. El contenido de ADN de plásmido de diferentes clones se analizó de acuerdo al procedimiento descrito para pRPA-ML-711. Uno de los clones de plásmido seleccionados contenía un inserto de EcoRI-HindIII de aproximadamente 1.45 kpb. La secuencia de los extremos terminales de este clon reveló que el extremo 5' del inserto corresponde exactamente al extremo correspondiente de pRPA-ML-711, y que el extremo terminal 3' posee la siguiente secuencia: "5' -„AATTAAGCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3' . La secuencia subrayada corresponde al codon del amino ácido asparagina COOH terminal, el siguiente codon corresponde al codon de terminación de translación. Los nucleótidos corriente abajo corresponden a elementos de secuencia del polienlazador pUC19. Este clon, que comprende la secuencia pRPA-ML-711 hasta el sitio de terminación de la translación de la EPSPS del maíz maduro, y seguido por secuencias del polienlazador pUC 19 hasta el sitio de HindIII se designó pRPA-ML-712. b) Modificación del extremo 5' de pRPA-ML-712: construcción de pRPA-ML-715: El clon pRPA-ML-712 se cortó con las enzimas de restricción PstI y HindIII. El ADN resultante de estas manipulaciones se separó por electroforesis sobre gel de agarosa con 0.8 % de LGTA/TBE (ref. CPMB). El fragmento de gel que contenía el inserto de PstI-EcoRI de 1.3 kpb se cortó del gel y se purificó de acuerdo al protocolo descrito en la sección 5 de arriba. Este inserto se ligó en presencia de una cantidad equimolecular de cada uno de los dos oligonucleótidos parcialmente complementarios de secuencia: Oligo 1: 5' -GAGCCGAGCTCCATGGCCCGGCGCCGAGGAGATCGTGCTGCA-3' Oligo 2: 5'-GCACGATCTCCTCGGCGCCGGCCATGGAGCTCGGCTC-3' así como también en presencia de ADN de pUC19 de plásmido digerido con las enzimas de restricción BamHl y HindIII. Dos µl de la mezcla de ligado se usaron para transformar E. coli DH10B como se describe arriba en la sección 5. Después del análisis de contenido de ADN del plásmido de diferentes clones de acuerdo al procedimiento descrito arriba en la sección 5, uno de los clones, que poseía un inserto de aproximadamente 1.3 kpb se retuvo para su análisis subsecuente. La secuencia del extremo 5'-ter inal de los clones seleccionados reveló que la secuencia de ADN en esta región es la siguiente: secuencia del polienlazador pUC19 de los sitios EcoRI a BamHl, seguida por la secuencia del oligonucleótido usado en el clonado, seguida por lo restante de la secuencia presente en pRPA-ML-712. Este clon se designó pRPA-ML-713. Este clon posee un codon ATG de metionina incluido en un sitio Ncol corriente arriba del codon de alanina N-terminal de la sintasa de EPSPS madura. Adicionalmente, los codones de alanina y glicina del extremo N-terminal han sid preservados, pero modificados sobre la tercer base variable: el GCGGGT inicial da el GCCGGC modificado. El clon pRPA-ML-713 se cortó con la enzima de restricción HindIII, y los extremos de esta hidrólisis se volvieron pegajosos por tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I. Se realizó luego una hidrólisis con la enzima de restricción Sacl. El ADN que resultó de estas manipulaciones se separó por electroforesis sobre gel de agarosa con 0.8 % de LGTA/TBE (ref. CPMB) . El fragmento de gel que contenía el inserto de "HindIII-extremos pegajosos/Sací" de 1.3 kpb se cortó del gel y se purificó de acuerdo al protocolo descrito en la sección 5 de arriba. Este inserto se ligó en presencia de ADN de pUC19 de plásmido, digerido con la enzima de restricción Xbal, y los extremos de esta hidrólisis se volvieron pegajosos por tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I. Se realizó luego una hidrólisis con la enzima de restricción Sacl. Dos µl de la mezcla de ligado se usaron para transformar E. coli DH10B como se describe arriba en la sección 5. Después del análisis de contenido de ADN del plásmido de diferentes clones de acuerdo al procedimiento descrito arriba en la sección 5, uno de los clones, que poseía un inserto de aproximadamente 1.3 kpb se retuvo para su análisis subsecuente. La secuencia de los extremos terminales de los clones seleccionados reveló que la secuencia de ADN es la siguiente: secuencia del polienlazador de pUC19 de los sitios de EcoRI a Sacl, seguido por la secuencia de los oligonucleótidos usados en el clonado, de los cuales el GATCC de 4 pb del oligonucleótido 1 descrito arriba ha sido suprimido, seguido por lo restante de la secuencia presente en pRPA-ML-712 hasta el sitio de HindIII, y la secuencia del polienlazador pUC19 desde Xbal a HindIII. Este clon se designó pRPA-ML-715. 7. Obtención de un cADN que codifica para una EPSPS de maíz mutada Todas las etapas de la mutagénesis se llevaron a cabo con el estuche de mutagénesis de Pharmacia U.S.E. de acuerdo a las instrucciones del proveedor. El principio de este sistema de mutagénesis es como sigue: el ADN del plásmido se desnaturaliza por calor, y se vuelve a asociar en presencia de un exceso molar de, por un lado el oligonucleótido de mutagénesis, y por el otro lado un oligonucleótido que permite que se elimine un sitio de enzima de restricción único presente en el polienlazador. Después de la etapa de reasociación , se llevó a cabo la síntesis de la hebra complementaria por la acción de ADN polimerasa de T4, en presencia de ADN ligasa de T4 y proteína del gen 32 en una solución amortiguadora adecuada que se suministra. El producto de la síntesis se incubó en presencia de la enzima de restricción para la cual se asume que ha desaparecido el sitio por mutagénesis. La cepa de E. coli que posee, en particular, la mutación mutS se usa como huésped para la transformación de este ADN. Después de cultivo en medio líquido, el ADN total del plásmido se preparó e incubó en presencia de la enzima de restricción usada antes. Después de estos tratamientos, se usó la cepa de E. coli DH10B como huésped para la transformación. Se preparó el ADN de plásmido de los clones aislados, y la presencia de la mutación introducida se verificó por la determinación de la secuencia. A) - modificación de sitios de secuencias sin en principio afectar el carácter de resistencia de EPSPS del maíz a productos que son inhibidores competitivos de la actividad de la EPSPS sintasa: eliminación de un sitio Ncol interno de pRPA-ML-715. La secuencia de pRPA-ML-715 se numeró arbitrariamente, colocando la primera base sobre el codon GCC de alanina N-terminal en la posición 1. Esta secuencia posee un sitio de Ncol en la posición 1217. El oligonucleótido con modificación de sitio posee la secuencia: 5'-CCACAGGATGGCGATGGCCTTCTCC-3' .

Después de determinar la secuencia de acuerdo a las referencias dadas arriba, la secuencia leída después de la mutagénesis corresponde a aquella del oligonucleótido usado. El sitio de Ncol ha sido eliminado realmente, y la translación en amino ácidos en esta región preserva la secuencia inicial presente en pRPA-ML-715. Este clon se designó pRPA-ML-716. La secuencia de 1340 pb de este clon se presenta en SEQ ID No. 2, y SEQ ID No. 3. B) modificaciones de secuencia que permiten que se incremente el carácter de resistencia de EPSPS del maíz a productos que son inhibidores competitivos de la actividad de EPSPS sintasa. Se usaron los siguientes oligonucleótidos: a) mutación Thr 102 ? He. 5' -GAATGCTGGAATCGCAATGCGGCCATTGACAGC-3' b) mutación Pro 106 ? Ser. 5' -GAATGCTGGAACTGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' c) mutaciones Gly 101 ? Ala y Thr 102 ? He. 5' -CTTGGGGAATGCTGCCATCGCAATGCGGCCATTG-3' d) mutaciones Thr 102 ? He y Pro 106 ? Ser. 5' -GGGGAATGCTGGAATCGCAATGCGGTCCTTGACAGC-3' Después de la determinación de la secuencia, la secuencia leída después de la mutagénesis sobre los tres fragmentos mutados es idéntica a la secuencia de pRPA-ML-716 padre, con la excepción de la región mutagenizada que corresponde a aquella de los oligonucleótidos de mutagénesis usados. Estos clones se designaron: pRPA-ML-717 para la mutación Thr 102 ? He, pRPA-ML-718 para la mutación Pro 106 -> Ser, pRPA-ML-719 para las mutaciones Gly 101 ? Ala y Thr 102 ? He y pRPA-ML-720 para las mutaciones Thr 102 ? He y Pro 106 -• Ser. La secuencia de 1340 pb de pRPA-ML-729 se presenta en SEQ ID No. 4 t SEQ ID No. 5. El inserto de NcoI-HindII de 1395 pb es la base de todas las construcciones usadas para la transformación de platas para la introducción de la resistencia a herbicidas que son inhibidores competitivos de la EPSPS, y especialmente la resistencia al glifosato. Este inserto se designará en lo restante de la decripción "el mutante doble de EPSPS de maíz". Ejemplo 2: Tolerancia a glifosato de los diferentes mutantes in vitro 2.a: Extracción de la EPSPS sintasa Los diferentes genes de la EPSPS sintasa se introdujeron en forma de un cásete de NcoI-HindIII en el vector pTrc99a de plásmido (Pharmacia, ref: 27-5007-01) cortado con Ncol e HindIII. Bacterias de E. coli DH10B recombinantes, que sobreexpresaban las diferentes EPSPS sintasas se sonicaron en 40 ml de solución amortiguadora por 10 ml de células como pelets, y se lavaron con esta misma solución amortiguadora (200 mM Tris-HCl de pH 7.8, 50 mM en mercaptoetanol, 5 mM en EDTA y 1 mM en PMSF) , a la cual se agregó 1 g de polivinilpirrolidona. La suspensión se agitó por 15 minutos a 4o C, y luego se sometió a centrifugación por 20 minutos a 27,000 g y 4° C. Se agregó sulfato de amonio al sobrenadante, para llevar la solución a 40 % de saturación con respecto al sulfato de amonio. La mezcla se sometió a centrifugación por 20 minutos a 27,000 g y 4° C. Se agregó sulfato de amonio al nuevo sobrenadante, para llevar a la solución a 70 % de saturación con respecto al sulfato de amonio. La mezcla se sometió a centrifugación por 30 minutos a 27,000 g y 4o C. La EPSPS sintasa presente en este pelet de proteína se suspendió en 1 ml de solución amortiguadora (20 mM en Tris-HCl de pH 7.8 y 50 mM en mercaptoetanol). Esta solución se dializó toda la noche contra dos litros de esta misma solución amortiguadora a 4o C. 2.b: Actividad enzimática La actividad de cada enzima, así como también su resistencia al glifosato, se midió in vitro durante 10 minutos a 37° C en la siguiente mezcla de reacción: 100 mM en ácido maleico de pH 5.6, 1 mM en fosfoenolpiruvato, 3 mM en shikimato 3-fosfato (preparado de acuerdo a Knowles, P. F. y Sprinson, D. B. 1970. Methods in Enzymol. 17A, 351-352 de Aerobacter aerogenes cepa ATCC 25597) y 10 mM en fluoruro de potasio. El extracto de enzima se agregó en el último momento, después de la adición del glifosato, la concentración final del cual varió desde 0 a 20 mM. La actividad se midió ensayando el fosfato liberado de acuerdo a la técnica de Tausky, H. A. y Shorr, E. 1953. J. Biol. Chem., 202, 675-685. Bajo estas condiciones, la enzima de tipo natural (WT) está ya 85 % inhibida en una concentración de glifosato de 0.12 mM. En esta concentración, la enzima mutante conocida como Serl06 está solamente 50 % inhibida, y los otros tres mutantes, Hel02, Hel02/Serl06 y Alal01/Hel02, muestran poca o ninguna inhibición. La concentración de glifosato tiene que ser multiplicada por diez, esto es 1.2 mM, para producir una inhibición del 50 % de la enzima mutante Hel02, los mutantes Hel02/Serl06, Ala/He y Ala todavía no están inhibidas. Debe notarse que la actividad de los mutantes Ala/He y Ala no está inhibida hasta las concentraciones de glifosato de 10 mM, y que aquella del mutante Ilel02/Serl06 no está reducida aún si la concentración de glifosato se multiplica por 2, esto es por decir 20 mM. Ejemplo 3: Resistencia de plantas de tabaco transformadas 1-1 Transformación El vector pRPA-RD-173 se introdujo dentro de Agrobacterium tumefaciens cepa EHA101 (Hood et al., 1987) llevando el cosmido pTVK291 (Komari et al., 1986). La técnica de transformación se basó en el procedimiento de Horsch et al. (1985) . 1-2 Regeneración la regeneración de tabaco PBD6 (fuente SEITA Francia) a partir de explantes de hojas se llevó a cabo sobre un medio basal de Murashige y Skoog (MS) , que comprendía 30 g/litro de sacarosa, así como también 200 µg/ml de kanamicina. Los explantes de hojas se extrajeron de plantas cultivadas en el invernadero o in vitro, y se transformaron de acuerdo a la técnica de disco de hoja (Science, 1985, Vol. 227, páginas 1129-1231) en tres etapas sucesivas: la prinera comprende la inducción de yemas sobre un medio suplementado con 30 g/litro de sacarosa, que contenía 0.05 mg/litro de ácido naftilacético (NAA) y 2 mg/litro de bencilaminopurina (BAP) por 15 días. Las yemas formadas durante esta etapa se desarrollaron luego por 10 días cultivándolas sobre un medio de MS suplementado con 30 g/litro de sacarosa, pero que no contenia ninguna hormona. Las yemas que se desarrollaron se extrajeron luego, y se cultivaron sobre un medio para enraizado de MS que tenía la mitad del contenido de sales, vitaminas y azúcar, y que no contenia ninguna hormona. Después de aproximadamente 15 días, las yemas con raicillas se transfirieron a tierra. 1-3 Resistencia al glifosato Veinte plantas transformadas se regeneraron y se transfirieron al invernadero para la construcción de pRPA-RD-173. Estas plantas se trataron en el invernadero en la etapa de 5 hojas con una suspensión acuosa de RoundUp que correspondía a 0.8 kg de substancia activa de glifosato por hectárea. Los resultados corresponden a la observación de índices de fitotoxicidad registrados 3 semanas después del tratamiento. Bajo estas condiciones, se encontró que las plantas transformadas con la construcción pRPA-RD-173 exhiben una tolerancia muy buena, mientras que las plantas de control no transformadas son destruidas completamente. Estos resultados muestran claramente la mejora traída por el uso de un gen quimérico de acuerdo a la invención para el mismo gen que codifica para la tolerancia al glifosato. Ejemplo 4 : Transformación y selección de células de maíz Células de maíz BMS (Black Mexican Sweet) , en una fase de crecimiento exponencial se bombardearon con la construcción de pRPA-RD-130 de acuerdo al principio y el protocolo descritos por Klein et al. 1987 (Klein, T. M., Wolf, E. D., Wu, R. y Sandford, J. C. (1987): High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells, NATURE Vol. 327, páginas 70-73). Dos días después del bombardeo, las células se transfirieron al mismo medio, que contenía N- (fosfonometil) glicina 2 mM. Después de 8 semanas de selección sobre este medio, los callos que se desarrollaron se seleccionaron, luego se amplificaron y se analizaron por PCR, y revelaron claramente la presencia del gen OTP-EPSPS quimérico. Las células que no se bombardearon y se cultivaron sobre el mismo medio que contenía N- {fosfonometil) glicina 2 mM estaban bloqueadas por el herbicida, y no se desarrollaron. Las plantas transformadas de acuerdo a la invención pueden ser usadas como padres para obtener líneas e híbridos que tienen el carácter fenotípico que corresponde a la expresión del gen. quimérico introducido. Descripción de las construcciones de los plásmidos pRPA-RD-124: Adición de una señal de poliadenilación "nos" a pRPA-ML-720 con creación de un cásete de clonado que contiene el gen de EPSPS mutante doble de maíz {Thr 102 ? He y Pro 106 ? Ser) . PRPA-ML-720 se digirió con HindIII, y se trató con el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I de E. coli para producir un extremo pegajoso. Se realizó una segunda digestión con Ncol, y se purificó el fragmento de EPSPS. El gen de EPSPS se ligó luego con pRPA-RD-12 purificado (un cásete de clonado que contenía la señal de poliadenilación de la nopalina sintasa) para dar pRPA-RD-124. Para obtener el vector pRPA-RD-12 purificado útil, fué necesario que el último se digiriera previamente con Salí, se tratara con ADN polimerasa de Klenow, y luego se digiriera una segunda vez con Ncol. PRPA-RD-125: Adición de un péptido de tránsito optimizado (OTP) a pRPA-RD-124 con creación de un cásete de clonado que contenía el gen de EPSPS dirigido sobre los plásmidos. PRPA-RD-7 (Solicitud de Patente Europea EP 652 286) se digirió con Sphl, se trató con ADN polimerasa de T4, y luego se digirió con Spel, y el fragmento de OTP se purificó. Este fragmento de OTP se clonó en pRPA-RD-124, el cual se había digerido previamente con Ncol, tratado con ADN polimerasa de Klenow para eliminar la porción 3' que sobresalía, y luego digerido con Spel. A este clon se le determinó luego la secuencia, para asegurar la correcta fusión translacional entre el OTP y el gen de EPSPS. Se obtuvo luego pRPA-RD-125. pRPA-RD-130: Adición del promotor de histona de maíz H3C4 y las secuencias de intrón 1 de adhl de pRPA-RD-123 (Solicitud de Patente EP 507 698) a pRPA-RD-125 con creación de un cásete para la expresión en plantas, para la expresión del gen de EPSPS mutante doble en los tejidos de monocotiledonias. pRPA-RD-123 (un cásete que contenía el promotor de histona de maíz H3C4 fusionado con el intron 1 de adhl) se digirió con Ncol y Sacl. El fragmento de ADN que contenía el promotor derivado de pRPA-RD-123 se purificó luego, y se ligó con pRPA-RD-125, el cual previamente se había digerido con Ncol y Sacl. pRPA-RD-159: Adición del promotor doble de histona de Arabidopsis H4A748 (Solicitud de Patente EP 507 698) a pRPA-RD-125 con creación de un cásete para la expresión en plantas, para la expresión del gen de "OTP-gen de EPSPS mutante doble" en los tejidos de dicotiledonias. pRPA-RD-132 (un cásete que contenía el promotor doble H4A748 (Solicitud de Patente EP 507 98)) se digirió con Ncol y Sacl. El fragmento de promotor purificado se clonó luego en pRPA-RD-125, el cual había sido digerido con Ecol y Sacl. pRPA-RD-173: Adición del gen "promotor H4A748-OTP-gen de EPSPS mutante doble" de pRPA-RD-159 a pRPA-RD-150A de plásmido (Solicitud de Patente Europea 508 909) con creación de un. vector de transformación de Agrobacterium tumefaciens. pRPA-RD-159 se digirió con Notl, y se trató con polimerasa de Klenow. Este fragmento se clonó luego en pRPA-BL-150A con S al.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTES: Lebrun, Michel Freyssinet, Georges Sailland, Alain (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: 5-enol piruvilshikimato-3-fosfato sintasa mutada, gen que codifica para esta proteína, y plantas transformadas que contienen el gen. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 5 (iv) DOMICILIO PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Francois Chretien (B) DOMICILIO: 1420 rué de Pierre baizet (C) CIUDAD: Lyon Cedex 09 (E) PAÍS: Francia (F) CÓDIGO POSTAL: 69263 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) ELEMENTOS DE PROGRAMACIÓN: Patentln Reléase # 1.0, Versión # 1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD PRESENTE: (A) NUMERO DE LA SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (VIII) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE (a) NOMBRE: Chretien, Francoise (IX) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN (A) TELEFONO: (33) 72-29-26-46 (B) TELEFAX: (33) 72-29-28-43 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1713 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Zea mays (B) cepa: Black Mexican Sweet (C) TIPO DE TEJIDO: Callo (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: lambda gtlO (B) CLON: pRPA-ML-711 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 AMCMirt jbacMßM? cMcuaoie aaw-ruco jutrranooe aocucBCSTß «0 120 ISO 210 300 M0 420 C?ßTtACTOC IlCTOCTW-» AMOCM TG JXJimem TaeMRM3-? JafiM?WßQO 100 $40 TCCTTCCCAC TC?CTKpt? Ltt nuftc TC?A CfiAAT CGSAOGGCTA ccrsctsocA ßoo AGCTG??GCT CTCTCO UJ ATCAGCATGTC A6r*crrc« toerrrcctc ATpfictcctc «M C?TTßOCTCT TGQO??TCTG WBATP?AAA TCATTCATAA A.TTAA : TrCT ATTCSTAOB JÍ0 TOBAAATCA ATTSMATTr; ATOCOCTT T7QCTOTCAA ACCMMBCKT T TGATACCT 7ß0 CCßAOnATT TACATTAAG CSAßßTCMA A?TACMCTC CCCGJ AKAT GCCTATCTTC •40 AACCTGATCC CTC CaeC*. ACCTATTICT TOO TGGTOC COA1 AC7 0BMBCSM7IC 900 M0 1020 1000 1140 1200 1200 1320 1300 )440 isoo L.I I...?.. c.ii Acscc ATTA?CTGTG OM?CTGTAA CCTTAU?UI ?CTAGCMC 11*0 1 ! H.IATTTC CßATCTÍAAß 7TrCTGO»CT CTM0CCM? 1..UU . X ? JUMSTGCTTC IC20 GTTGGMT?? TA?C?ATAA? ???TTAC-TTT TOIGT6AAAA AAAAAA??AA AAAAAAAAAA .«•0 1113 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1340 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Zea ays (B) cepa: Black Mexican Sweet (C) TIPO DE TEJIDO: Callo (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: pRPA-ML-716 (ix) ASPECTOS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 4...1337 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2 ec OM OM Ate oro ere XTC AM GM ATC 4T Al* ßly Ala Olw ßlw Xla Val Lmt ßl* *t tía Lr* ßlu Z a 1 s 10 TOC OQC ACC ßTC AM CW Oaj ßOß TCCAM TOB Crr TOC AAC CS6 ATC ts tme ßlr Thr V l Lfw Lau ff» ßlr aVor Lr* |*r Lau Oar Aan Ara lia i» 2ß xs ao ere CTA CTC ßcc occ ero tec CAO ose ACÁ ACÁ OTO OT 8 AAC ese J Lau Lau Law Ala Ala Lau »ar Olw €Xf Tkr Thr Val Val Aaa Aan Lau » 40 4> ere AAC AOT CM CAT ore sc TAC ATS ere oaß ßcc TTB MS Acr CTT iti Lau A*n Oar 61M Aaa> Val N a Tyr Ha* Lau ßlr Ala Lau Ara Th* Lau 10 »» *ß c.tt CTC ?rt CTC CAÁ cas CAC AAA OCT GCC AAA AC CCT CTA srt CTT JI Cir » $*» *•• C At* ??t> t,rt Ai» * e » *rg AI* V»Í V.«I JI ib »0 7* GT ver t¡m w *?«ttc? Acrrr cA*eAT GC AAA CAc cAA trc cC «> ctr Crc ciy ßiy cr* "»• •»»» Vßl Ci" *-"" **• LV« Gl" Ciu v*1 ln 40 SS 40 A O A TTC ACÁ CCA CCT 335 CTC TTC Tr. CCC AAT CCT CSA ACT CCA CSS CC Thr Ala Ala n Ala Cly Tnr Al* Mat Aura rro Law Lau fhß Lau Cly Aa IOS UO 15 100 TS CTT CAT OSA CTA OCA 303 CTT ACT CCT CCT CCT OCA AAT OCA ACT TM G v»? Tnr Ala Ala ßly ßly Aan Ala Thr Tyr Val Law Aap Cly val rrß US 120 431 ACÁ ATC ACC CM ACÁ CCC ATT CSC CM TTC 6TT Arg Nat Ara Clw Ara fro ?l* 61y no Uu Val 120 135 A CCT CTT 47t CTT GGT CCA CAT CTT CAT TCT TTC CTT CSC ACT CAC TCC CC ya rhß Law ßly Thr Aap cya rro reo V Lag ßly Ala Aßp Val Aßp C al 14S ISO US CCC AM ßTC AM CTO TCT 527 CCT GTC AAT 06A ?TC CCA CßC CTA CCT CST Ara Val Aan ßly Xla Cly ßly Law rrß ßly ßly Ly» Val Lyß Law Ser ICO 1SS 170 CCC TTC CTC ATC CCT CCT CCT 575 OOC CC ATC ACC MT CM TAC TTC ACT Sar Sar ßlrt Tyr Law aar Ala Lau Lau Mat Ala ?la rro ßly Sar 11* 190 PS 100 íes CAT GTC CM ATT CAÁ ATC ATT CAT AAA TT? ATC TCC «23 TTC ß r CTT CCS Uu Ala Law ßly Am» Val ßlw Zl* ßlu Zla Zlß Aap Lyß Lau lia Sar 1*S 200 205 C CAÁ ATS ACÁ TTS AGA TTC ATC CM CCT TTT CCT ere «71 ATT CCS TA lia rro Va T Thr Law Arq Uu Mat Clu Ara rrtß ßly l yr val Clu Nat 210 21S 220 ASA TTC TAC ATT AM ßßA CCT Til AAA CCA CAC C?T CT 6AT MC TOß CM Lft Ala Clu Mía Sar Aßp Ser Tr» Aa» Ara Pha Tyr Zla Lyß ßly ßly 22S 220 235 r AAA AAT OCC TAT CTT CAÁ 6ßT CAT CCC TCA 7«1 CAÁ AAA TM AM TCC er Sin Lf» Tyr Lya Sar rra Lya Aan Ala Val ßlw Cly Aßp Ala S e 140 24S 250 ACC CCA ACC TAT TC TTC OCT CCT OCT OCA ATT ACT OCA CCC ACT GTC •15 Sar Ala Sar Tyr m* Law Ala ßly Ala Ala Zla Thr Cly ßly Thr al 255 200 2«S 270 ACT CTC CAÁ CCT TCT CCC ACC ACC MT TTß CM CCT CAT GTC AM TTT •<3 Thr val ßlw Cly Cya ßly Thr Thr Sar UN ßLn ßly Aa» Val Lyß rhß 200 20S OCT CAC CTA ere CM ATC ATO CCA ees AM ßTT ACÁ TOß ACC ßM ACT 111 Ala ßlw Val Law ßlw Mat Hat ßly Al* Lyß Val Thr Trp Thr ßlu Thr 200 MC CTA Mß AAA CAC 151 Car Val Ara .Lya Hiß 1007 CTC AM ATT CAT ere AM ATO AM AM ATO ccT CAT ere ece «re Law Lyß Ala Zla Aa» Val Aan Mat Aßn Lya Mat rra Aap Val Ala Hac 220 22S SSO ACT CTT ecT CTß ßTT ere TTT ßcc CAT ßße CCS ACÁ ßOC ATC ASA 10SS Thr Lau Ala va. 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Val Lya Aan 435 ««o 7AA 1340 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 444 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: Al* ßly Al* ßlu ßlu Zl* Val Law ßln rra ?la Lyß ßlu Zlß Ser Cly 1 5 10 13 Thr Val Lya Uw rro ßly Sar Lya Ser Uu Ser Aan Ara Zlß Uu Uu 20 25 30 Uu Ala Ala Uw Ser ßlu ßly Thr Thr Val Val Aap Aan Lau Uu Aßn 35 40 45 Ser ßlu Aa» Val Ml* Tyr N*t Uu Cly Al* Uu Ara Thr Uu Cly Uu 50 55 «O S*r val ßlu A * Aa» Ly* Al* Al* Lya Ara Al* Val Val Val ßly Cyß «I 0 15 SO ßly ßly Lyß me rß va l ßlu Aß» Ala Ly* ßlu ßlu Val ßln Lau me SS M 15 Uw ßly Aan Al* ßly Thr Ala Mat Aro frß Lau Thr Ala Ala Val Thr 100 OS 110 Ala Ala ßly ßly Aan Al Thr Tyr Val Uu Aap Cly Val rro Ara Mat 115 120 125 Ara ßlu Ara rro Zle ßly Aa» Uw Val Val ßly Uu Lyß ßln Lau ßly 130 135 140 Ala Aap Val Aap Cyß fha Uw O y Thr Aßp Cyß rrß rrß Val Ara Val 145 150 155 1«0 Aan ßly t a ßly ßly Uu rro ßly ßlr Lr* *•* Lya Law Sar ßly Mr 1«S 170 17S Zlß Ser Sar ßln Tyr Uw Ser Ala Uw Uw Mat Ala Ala rro Lau Ala 100 IOS ISO Law ßly Aßp Val ßlw Zlß ßlu Zlß Zlß Aßp Lyß Leu XI a Sar Zla rra 115 200 20S Tyr Val ßlw Mat Thr Uw Ara Uu Mat ßlw Ara rha ßly Val Lyß Ala 210 215 220 ßlw Hta ser Aßp Ser Trp Aßp Ara rho Tyr Zlß Lyß ßly «y ßln Ly» 225 230 235 240 Tyr Lyß Ser rro Lye Aan Ala Tyr Val ßlu ßly Aßp Ala Ser flor Ala 245 2S0 2SS Wtf Tyr fft* La» la Cly Ate Ala ?ie Thr Cly Cty Thr Val Thr Va| 1*0 :«t 2to AUClv C? 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Thr a Val Lyß Aan (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1340 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Zea mays (B) cepa: Black Mexican Sweet (vii) FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: pRPA-ML-720 (ix) ASPECTOS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) POSICIÓN: 4...1337 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4 CCATß ßCC ßOC CCC CM CM ATC CTß CTß CM CCC ATC AM CM ATC 47 Ala ßlr Ala ßlw ßlu Zle Val Lau ßln rro lia ?* Clu Zla * 5 10 TCC ccc ACC ere AM ero ees ßeß roe AM TCB CTT TCC AM eso ATC ts Sor ßlr TTtr Val Ly* Lau tim ßlr Sor Lr» ßßr Lau Sor Aßn Ara Zla " 20 25 30 CTC CTA CTC ccc oce ero TOC ßM ßßß ACÁ ACÁ ere ott CAT AM CTC 143 Lau Ala Ala Law Ser ßlu ßlr Thr Thr Val Val Aßp Aßn Law 35 «0 45 CTO AM AßT CM CAT OTC CM TM ATß CTC eße ßOC TTO C ACT CTT ltl Ser ßlw Aap val Kla Tyr Met Law ßly Ala Lau Ara Tnx Lau 50 SS «0 ßeT CTC TCT CTC CAA ßCS ßM AAA ßcr OCC AAA AflA OCT OTA ßTT OTT 23 S ßlr Lau Car Val ßlw Ala Aap Lyß Ala Ala Lr» Arg Ala Val Val Val ** 70 7S CeC TCT C«JT GCA AC TTÍ CCA CTT C*C CAT CCT AAA CAC CAÁ CTC CAC J»»1 Cí? 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A l* C ly Xle Al * Met Aro Ser >w Th r A l« Al» qrs ion US 1 1 CTT ?CT CCT CCT CßT <WA AAT CCA ACT TAC TG CTT UAT OSA A CCA JOJ v«l Th Ala Ala C.y Cly Aan Ala Tnr Tyr a l Lau Aßp tíly Val rro U* 120 1=5 ASA ATC ACC CAC MA CCC ATT CCC CAC TTC CTT CTC GCA TTS AM CM 431 Aro Mee Ara C w Arq rro Zl* Cly Aßp Leu Val Val Cly Lau Lyß Gln 130 133 140 CTT CCT CCA CAT CTT CAT TCT TTC CTT CeC ACT CAC TGC OCA CCT CTT 47» Leu Cly Al* Aap Va l Aa» Cyß rhe Lau Cly Thr Aap Cyß rro Pro Val 1 130 155 CCT CTC AAT CGA ATC OCA ßßß CTA CCT CCT CßC AAC CTC AAC CTG TCT 527 Ara Val Aan Cly Zla Cly Cly Law rro Cly Cly Ly» Val Lyß Lau Ser 1«0 ICS 170 eae TCC ATC AGC ACT CM TM TTC MT eee TTC CTC AG CCT CCT CCT 5?S Cly Ser Zla Sor sime ßln Tyr Lau »ßr Ala Lau Lau Met Ala Ala rro 17S 100 IOS 1S0 TTC CCT CTT cec CAT ere CAC ATT CAÁ ATC ATT GAT AAA TTA ATC TCC «23 Lau Ala Lau Cly Aßp Val Clu Zla Clw Zla ?la Aap Lya Lau Zla Sar ItS 200 205 ATT CCC TM CTC CAÁ ATß ACÁ TTC AßA TTC ATC CAC CCT TTT CCT CTC «T :i* rro Tyr val Clu Mßt Thr Law Ara Law Mat Clu A e Phe Cly Val 210 215 220 AAA CCA GAS CAT TCT CAT ACC TCC CAC AßA TTC TAC ATT AM CCA CCT US Lya Ala Clw Hla Sar Aap *ar Trp Aap Arq r e Tyr ?lß Lyo Gly Gly 225 230 235 CAÁ AAA TM AAC TCC CCC TAT CTT CAÁ CCT CAT CCC TCA 7«7 Sin Ly* Tyr Ly* Ser rro Ly* Aan Ala Tyr Val Clw ßly Aap Ala Sar 240 24S 250 ACC CCA MC TAT TTC TTS 6CT COT CCT SCA ATT ACT COA CCC ACT CTC 815 Ser Al* %ee Tyr Pho uu Al* Cly Al* Al* Zl* Thr Cly Cly Thr Val rss 2S0 2CS 270 ACT 5TS CAÁ COT TCT cec ACC ACC ACT rrc C CCT CAT CTC AM TTT sß3 Thr Val Clw Cly Cy* ßly Thr Thr S*r Law ßln Cly Aap Val Lyo rha 275 2S0 205 CCT CAC CTA CTß CAS ATC ATC CCA CCS AM CTT ACÁ TCC ?CC CAC ACT Sil Al* ßlu Val Law ßlw Met Met ßly Ala Lya Val Thr Trp Thr Clu Thr 200 2S5 300 MC CTA ACT ßTT ACT CßC OCA CCS CBß CM OCA TTT COß AOC AAA CAC SSf Sor Val Thr val Thr ßly rro rro Ara ßlw rr» rhß ßlr Arq Lyß Kla SOS Jio 313 CTC AAO oes ATT ßAT ere AM ATß AM AM ATO CCT ßAT CTC CCC ATO 1007 Law Lyß Ale Zle Aap Val A n Mat Aßn Lyo Mat rro Aap Val Ala Mee 320 223 330 ACT CTT OCT OTC ßTT OCC CTC TTT ßCC ßAT ?ßC CCS AC GCC ATC MA 1055 Thr Law Ale Vßl Vßl Ale Law rhe Al* Aap ßlr rro Thr Ala Zla Ara 335 J4ß 545 350 CAC ere OCT TCC TOB MA OTA AM OM ACC CAO Aßß ATO CTT ees ATC nos Aap Val Ala Ser Trp Ara Val Ly» ßlw Thr ßlw Arq Mat Val Ala Zla 3SS SCO 303 CSC ACC GM CTA ACC AM CTß ßßA OCA TCT 6TT CAS 6AA ßßß CCS ßAC 1151 Ara Thr ßlu Law Thr Lyo Lau ßly Ala Oor Val ßlu ßlu ßly rrß Aap 370 37S TM TOC ATC ATC ACC CCS CCS CAS AM CTC AAC 676 ACS ßCß ATC ßAC 11»* Tyr Cyß Zlß He Thr rra rro ßlu Lyo Lau Aan Val Thr Ala Zla Aap SOS SSO 3fS MC TM CAC GAC CAC MC ATB CCC ATC OCC TTC TCC CTT CCC CCC TGT 1247 Thr Tyr ?Sp Aa Ac¿ Ara Met Al* Mat Al a rhe Ser Law Ala Ala Cy* « 0 <0t 410 CCT CAC CTJC CCC CTC ACC ATC CSC CAC CCT ßßß TGC ACC V; AAC ACC 12»* Ala C V* "ro «al Thr T U Ara AS» rrß ßl y Cy« Thr Arj Ly» Thr us 1:0 4¿S «JO TTC CCC SM T T G?T GTG CTÍ ACC ACT TTC CTC AM AAT IJJ7 fh* fro Aap Tyr fhe Aßp Val Leu S*r Thr rhe Val Lyß Aan «1S 440 TAA lS40 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 444 amino ácidos (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: Ala Cly Ale ßlw ßlw llß Val Leu ßln rro Zlß Ly» ßlu Zlß time Cly 1 S 10 13 Thr Val Lyo Law rro Cly Ser Lyß Sar Lau Ser Aan Arq Zlß Lau Lau 20 23 30 Leu Ala Ala Law Ser ßlw Cly Thr Thr Val Val Aap Aßn Lau Lau Aßn 35 40 45 Ser ßlu Aap Val NI* Tyr Met Law ßlr Al* Leu Arq Thr Lau Cly Leu 50 SS «0 * t Val Glu Ala Aa» Lyo Al* Al* Ly* Ara Al* Val Val Val Gly Cyß •S 70 71 SO ßly ßly Lyß fh* rro val ßlw Aap Al* Ly* ßlw ßlw Val ßln Lau rha OS M »S Lau ßly Aan Ala ßly I I* Ala Met Ara %mt Law Thr Ala Ala Val Thr 100 101 110 Ala Ala ßly ßly ?a* it Thr Tyr Val Lew Aßp ßly Val rro Arq Mot 115 120 12S Ara ßlw Ara rro l i* ßly Aßp Law val Val ßly Law Lyß ßln Lau Cly 130 11» 140 Ala Aap Val Aßp Cy* rhe Lew ßly Thr Aap Cyß rro rro Val Arq Val 141 ISO 1SS ICO Aßn Gly He ßly ßly Le Pro ßlr ßlr Lyo Vßl Lyß Leu Ser ßly Ser 1CS 170 175 Zlß Ser Ser Cln Tyr Law Ser Ala Law Lau Mßt ?la Ala rro Lau Ala iso IOS ISO Lau ßly Aap Val ßlw lia ßlw Zla Zla Aap Ly* Leu ?lß Ser Zlß rro 1SS 200 205 Tyr al ßlu Mat Thr Law Ara Lau Mot ßlu Ara rho ßly Val Lv» Ale 210 ??$ 220 ßlw Hlß Sar Aap Ser Trp Aap Ara P o Tyr Zlß Lvß ßr ßl ßln r» 225 230 235 240 Tyr Lyß Ala Tyr val ßlw ßly Aßp Ala ßßr Sor Ala 24 S 230 234 Ser Tyr rhß Lew Ala ßlr Ala Ala Zla Thr ßlr ßl Thr Val Thr Val 200 2CS 270 ßlw ßlr Cyß ßlr Thr Thr Ser Lau ßln ßlr Aßp Val Lyo Pho Ala ßlu 27S 200 205 val Lau Clu Met. r Cly Ala Ly» Val Thr Trp Thr Clu Thr Sor al 2*0 2*\ 300 Thr vji Thr Cly Pra Pro Arg Clu Pro Pho Cly Arg Lys Hla Leu Lys JOS JIO JI* J:O Ato Il« Aso Val Aßh Mat Aon Ly» Met Pro Aßp Val Ala Mae Thr Lau 32» JJ0 JJ* Ala vai al AI* Lau Pho Ala Aap Cly Pra Thr Ala Zl» ?rg Asp val J40 343 SSO Ala Ser Trp Arg v l X.y» Clu Thr Glu ?rg Hot Val ?la ?lo ?rg Thr 333 3C0 JßS ßlu Lau Thr Ly» Lam Cly ?la Sor Val Clu Glu Cly Pre ?ßp Tyr Cyß 970 37S 300 rio Zlß Thr Pro Pro Clu Lyß Lau Aan Val Thx ?la II» ?jrp Thr Tyr 305 3*0 393 400 ?sp Aop Hlß Arg Hot Ala Mßt ?la Phß S r Leu Ala ?la Cy* ?la Clu 40S 410 41S Val Pro val Thr ?l* ?rg Aßp Pro Gly Cy» Thr Arg Ly» Thr Phß Pro 420 423 430 Aap Tyr Phß Aap Val LOAI Ser Thr Fhe Val Lyß ?an Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES 1. Gen de ADN que codifica para una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) mutada, caracterizado porque comprende al menos una substitución treonina 102 -> isoleucina.
2. 2. Gen de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende, además, al menos una segunda mutación en el EPSPS, diferente de la primera mutación.
3. 3. Gen de ADN de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque comprende, además, una mutación que consiste de una substitución de prolina 106 por serina.
4. 4. Gen de ADN de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque comprende, además, una mutación que consiste de una substitución de glicina 101 por alanina.
5. 5. Gen de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque es de origen bacteriano.
6. 6. Gen de ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque se origina de una bacteria del género Salmonella typhimurium.
7. 7. Gen de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque es de origen vegetal.
8. 8. Gen de ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque es de origen del maiz.
9. 9. Proteina de EPSPS mutada, caracterizada porque comprende al menos una substitución de treonina 102 por isoleucina.
10. 10. Gen quimérico que comprende una secuencia de codificado, asi como también elementos reguladores en las posiciones 5' y 3', los cuales son heterólogos y capaces de funcionar en plantas, caracterizado porque comprende como secuencia de codificado al menos una secuencia de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
11. 11. Gen quimérico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende un promotor de virus de planta.
12. 12. Gen quimérico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende un promotor de planta (por ejemplo a-tubulina, histona, intrones, actina, etc.).
13. 13. Vector para la transformación de plantas, caracterizado porque comprende al menos un gen de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
14. 14. Célula de planta, caracterizada porque comprende al menos un gen de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.
15. 15. Planta, caracterizada porque se obtiene por regeneración de una célula de conformidad con la reivindicación 14.
16. 16. Método para la producción de plantas con tolerancia mejorada a un herbicida que tiene la EPSPS sintasa como su objetivo, caracterizado porque se transforman células de plantas o protoplastos con un gen de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y porque las células transformadas se sujetan a regeneración.
17. 17. Método de tratamiento de plantas con un herbicida que tiene EPSPS como su objetivo, caracterizado porque el herbicida se aplica a plantas de conformidad con la reivindicación 15.
18. 18. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque se aplica glifosato o un precursor de glifosato.