UA80895C2

UA80895C2 - Transformed plant

Info

Publication number: UA80895C2
Application number: UAA200600678A
Authority: UA
Inventors: Michel Lebrun; Alain Sailland; Georges Freyssinet; Eric Degryse
Original assignee: Bayer Cropscience Sa
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1996-07-18
Publication date: 2007-11-12
Also published as: CU23172A3; HU226089B1; HU226302B1; CZ295649B6; ES2255534T3; SI1217073T1; IL122941A0; CN1196088A; FR2736926A1; HU0700738D0; BG102247A; BR9609792A; SI0837944T1; AP9801195A0; ATE321866T1; RO120849B1; SK6498A3; EA199800138A1; CN1154734C; ES2256863T3

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується нової 5-єнолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (або ЕРБРОБ), яка відзначається 2 підвищеною толерантністю стосовно гербіцидів, яка являє собою конкурентні інгібітори по відношенню до фосфоенолпірувантної (РЕР) активності ЕРБРЗ. Це більш толерантна ЕРЗРЗ-синтаза відзначається, як мінімум, однією заміною "треонін на ізолейцин". Цей винахід стосується також гена, що кодує такий білок, рослинних клітин, трансформованих за допомогою химерних генних конструкцій, що містять цей ген, рослин, регенерованих з цих клітин, а також рослин, одержаних внаслідок схрещування з використанням цих трансформованих рослин. 70 Гліфосат, сульфосат і фосаметин являють собою системні гербіциди широкого спектра фосфонометилгліцинової родини. По суті, вони діють як конкурентні інгібітори

Б-єнолпірувілшикімат-З-фосфатсинтази (ЕС 2.5.1.193 або ЕРБЗР5, по відношенню до РЕР (фосфоєнолпірувату).

Після їх нанесення на рослину, вони переміщаються в дану рослину, де акумулюються в її частинах, які швидко ростуть, зокрема, у верхівках стебел та коріння, спричинюючи пошкодження у відповідній точці руйнування 19 чутливих рослин.

Пластидна ЕРБРЗ, на яку головним чином спрямована дія цих продуктів, являє собою фермент біосинтетичного шляху ароматичних амінокислот, який кодується одним або кількома ядерними генами і синтезується у формі цитоплазматичного попередника, що імпортується потім в ці пластиди, де він нагромаджується у вигляді своє? зрілої форми.

Толерантність рослин до гліфосату і до продуктів даної родини досягають шляхом стійкої Інтродукції в їхній геном гена ЕРЗР5 рослинного або бактеріального походження, який є мутантним або інакшим стосовно характеристик інгібування продукту цього гена гліфосатом. Враховуючи тип дії гліфосату і міру толерантності до гліфосату продуктів генів, які використовуються, це надає перевагу в здібності експресувати продукт трансляції цього гена з погляду можливості нагромадження його в пластидах в значних кількостях. с

ЇЗ патенту США 4535060), наприклад, відомо, що для надання рослині толерантності до гербіциду Ге) вищезгаданого типу, особливо М-фосфонометилгліцину або гліфосату, в геном рослини інтродукують ген, що кодує ЕРБР5, який несе, як мінімум, одну мутацію, яка робить цей фермент більш резистентним до його конкурентного інгібітора (гліфосату) після розміщення даного ферменту в пластидному компартменті. Однак, ці методи необхідно вдосконалювати, з метою досягнення більш високої надійності застосування цих рослин в о умовах сільського господарства. Ге»)

У цьому описі "рослина" являє собою поняття для позначення будь-якого диференційованого багатоклітинного організму, здатного до фотосинтезу, а "рослинна клітина" являє собою поняття для позначення со будь-якої клітини, що походить з рослини і є здатною створювати недиференційовані тканини, такі як кап юси, Га») або диференційовані тканини, такі як зародки чи частини рослини або насіння.

Зо Мета цього винаходу полягає в одержанні трансформованих рослин, що відзначаються підвищеною со толерантністю до гербіцидів фосфонометилгліцинової родини, шляхом регенерації клітин, трансформованих через нові химерні гени, що містять ген толерантності до цих гербіцидів.

Метою цього винаходу є також химерний ген для надання рослинам підвищеної толерантності щодо « гербіциду, об'єктом дії якого є ЕРБР5 і який включає такі елементи, призначені для керування транскрипцією: З 70 промоторну ділянку, необов'язково - ділянку транзитного пептиду, послідовність гена, що кодує фермент с толерантності до гліфосату, і ділянку нетранслюємого сигналу поліаденілювання на 3'-кінці, який відрізняється

Із» тим, що ген толерантності до гліфосату містить - стосовно гена, з якого він одержаний - заміну "треонін 102 на ізолейцин" в "агоА"-ділянці (ЕРБРО). У способі, якому віддається перевага, він включає, крім того, в тій самій ділянці, заміну "пролін 106 на серин". Ці заміни можуть бути інтродукованими або присутніми в

ЕРБР5-послідовності будь-якого походження, зокрема, рослинного, бактеріального, водоростевого або со грибкового походження. ав! Транзитні пептиди, які використовуються в галузі, можуть бути, рег зе, рослинного походження, наприклад, походити з кукурудзи, соняшника, гороху або подібних до них культур. Перший та другий транзитні пептиди со можуть бути ідентичними, аналогічними або різними. Кожний з них може включати, крім того, одну або декілька (Те) 20 одиниць транзитного пептиду, відповідно до Європейської Патентної Заявки ЕР 0508909. Значення цієї характеристичної ділянки полягає в тому, щоб дозволити вивільнення зрілого та нативного білку, і, особливо, сл згаданої вище мутантної ЕРЗР5, в плазмідний компартмент з максимальною ефективністю.

Промоторна ділянка відповідного химерного гена, згідно з цим винаходом, переважно складається, як мінімум, з одного генного промотору або промоторного фрагменту, який експресується в рослинах природним 29 способом (тубулін, інтрони, актин, гістон).

ГФ) Нетранслюєма ділянка сигналу термінації транскрипції на 3'-кінці даного химерного гена може бути юю будь-якого походження, наприклад, бактеріального походження, такого як ділянка гена нопалінсинтази, або рослинного походження, такого як ділянка гістону Н4АА748 з Агарідорзіз (Наїїапа., згідно з |Європейською

Патентною Заявкою (Європейська заявка 633317)|. 60 Химерний ген згідно з цим винаходом включає, крім вищезгаданих основних частин, як мінімум, одну проміжну (лінкерну) нетранслюєму ділянку, яка може бути розташованою між ділянками, що транскрибуються диференційно, описаними вище. Ця проміжна ділянка може бути будь-якого походження, наприклад, бактеріального, вірусного або рослинного походження.

Виділення кКДНК, що кодує ЕРБРЗ кукурудзи: бо Нижче описані різні стадії, які призводять до отримання кКДНК ЕРБЗРЗ кукурудзи, яка служить субстратом для інтродукції двох мутацій. Всі операції, описані нижче, даються як приклад, згідно з вибором, зробленим на підставі використання різних способів, придатних для досягнення того ж самого результату. Цей вибір не впливає на відповідну якість одержуваного результату, і через це будь-який з відповідних методів може Використовуватися фахівцями для отримання того ж самого результату. Більшість цих методів, за принципом техніки здобуття фрагментів ДНК, (описані в "Сигтепі Ргоїосоїв іп МоіІесшаг Віоіоду", Том 1 і 2, А!:зибеї! Е.М. зі співавт., опублікованому видавництвами Сгеепе Рибіїзпіпу Аззосіаїез та УМіеу-Іпіегвсіепсе (1989)) (надалі посилання на умови експериментів, описані в даній роботі, будуть позначатися як "геї. СРМВ"). Операції, які стосуються ДНК, що їх здійснювали згідно з умовами експериментів, описаних в цій роботі, полягають, зокрема, 7/о У таких діях: лігування ДНК-фрагментів, обробка за допомогою ДНК-полімерази "льонова і Т4-ДНК-полімерази, одержання плазміди і ДНК-бактеріофага 5, у вигляді мініпрепарату або у вигляді максипрепарату, і, відповідно, аналіз ДНК і РНК згідно з Саузерн- і Нозерн-методами, відповідно. Інші методи, описані в даній роботі, були супутніми, і нижче описані тільки суттєві модифікації і доповнення до цих умов експериментів.

Приклад 1: 1. Одержання фрагменту ЕРБР5 з Агарідорзів ІНайіапа а) Два 20-ланкових олігонуклеотиди відповідної послідовності: 5-ССТСТОСТСАТОТСТОСТОС-3 5-ССССОСССТТОАСАААСААА-З синтезували з послідовності ЕРБРО-гена Агарідорзівз (пайапа |Кіее Н.). зі співавт. (1987) Мої. беп. Зепеї,, 210, 437-442). Ці два олігонуклеотиди знаходяться, відповідно, в позиціях 1523-1543 і 1737-1717, опублікованої послідовності і в протилежних напрямах. б) Тотальна ДНК Агарбідорзіз (Паїїапа (маг. Соїштбіа) одержана від СіІопіесй (каталогове посилання: 6970-1). в) 50 нанограмів (нг) ДНК змішували з ЗООнг кожного з цих олігонуклеотидів і піддавали 35 циклам ампліфікації в апараті РегКкіп-ЕІтег 9600, в умовах стандартного середовища для ампліфікації, яке с рекомендоване постачальником. Одержуваний 204 п.н.-фрагмент складає ЕРЗРЗ-фрагмент Агабідорзіз (Наїйіапа. 2. Створення бібліотеки кДНК з ВМ5 лінії клітин кукурудзи о а) Б5г відфільтрованих клітин подрібнюють в рідкому азоті, і тотальну нуклеїнову кислоту екстрагують згідно з методом, описаним у Зпиєге зі співавт., з такими модифікаціями: - РН лізуючого буфера доводять до рНО,О; ою - після осадження за допомогою ізопропанолу, осад піднімається у воді і, після розчинення, доводять до 2,5М ГОСІ. Після інкубації протягом 12год. при С осад, здобутий після центрифугування протягом 15хв. при іа 300009 та 42С, розчиняли повторно. Далі повторювали І ІСІ-осадження. Цей перерозчинений осад являє собою ее фракцію РНК загальної нуклеїнової кислоти. о б) Роїу (А)"-РНК-фракцію з фракції РНК отримували шляхом хроматографії на оліго(ат) - целюлозній колонці, як це (описано в "Ситепі Ргофосоїв іп МоІесшаг Віоіоду"|. с в) Синтез дволанцюгової КДНК, що має синтетичний ЕсокКіІ-кінець: це здійснюють відповідно до протоколу постачальника різних реагентів, необхідних для такого синтезу, у вигляді набору: "колійний набір" від компанії Іп Мігодеп. «

Два однониткові та частково комплементарні олігонуклеотиди відповідних послідовностей: 5-ААТТСССОбО-3 ші с 5-ССбСвоо-3 (остання є фосфорильованою) лігували з тупими кінцями дволанцюгових кДНК. м Це лігування адаптерів призводить до утворення Зтаї!-сайтів, приєднаних до двохланцюгових КДНК і я ЕсокіІ-сайтам у липкій формі на кожному кінці цих двохланцюгових кКДНК. г) Створення бібліотеки:

Ці кКдНК, що відзначаються наявністю штучних липких ЕсоКі-сайтів на своїх кінцях, лігували з КДНК со бактеріофага хамй0, який розрізали ЕсокКІ!І і дефосфорилювали відповідно до протоколу постачальника Мем о Епадіапа Віоїарзв.

Аліквоту з реакції лігування інкапсулювали іп мйго за допомогою інкапсулюючих екстрактів, а саме бо Сідараск Соїа, згідно з інструкціями постачальника; цю бібліотеку титрували з використанням бактерії Е сої со 250 СбООпИ1. Одержану таким чином бібліотеку ампліфікували і зберігали згідно з інструкціями того ж самого постачальника, і створювали кДНК-бібліотеку суспензії ВМ5-клітин кукурудзи. сл 3. Скринінг КкДНК-бібліотеки суспензії клітин ВМ5 кукурудзи за допомогою ЕРЗР5-зонда Агабідорзіз (Наііапа

Наведений нижче протокол являв собою умови, взяті з "Сигтепі Ргоїосоїв іп МоіІесціаг Віоіоду", томи 1 і2,

А!йЄзцре! Б.М. зі співавт., опублікованих у ОСгеепе Рибіїзпіпу Аззосіафез і УМПеу-іпіегзсіепсе (1989) (СРМВ). 22 Якщо викласти стисло, приблизно 109 рекомбінантних фагів поміщали на І В-чашки при середній густині

ГФ) 10Офагів/см. Здобуті літичні бляшки реплікували повторно на мембрани Атегепат Нубопа М. т ДНК фіксували на фільтрах шляхом обробки 1600КЮЮШМ (зігаїадепе 5ігайа|йпКег). Ці фільтри прегібридизувапи в бхЗЗС/0,1956 505/0,25 збираного молока протягом 2год. при 6523. Пробу ЕРБРБ5 Агарідорзів Іпаійапа помічали бо за допомогою І2Р)|ЇСТР шляхом випадкового праймування відповідно до інструкцій постачальника (Рпаптасіа

Кеаду ю Со Кі). Одержана специфічна активність становить порядку ТОсрт на мкг фрагменту. Після денатурації протягом бхв. при 1002 цю пробу додавали до вказаного прегібридизаційного середовища, і гібридизацію продовжували протягом 14 годин при 5520. Одержані фільтри піддавали флюорографії протягом 48год. при -8022; з плівкою Кодак ХАК5 та підсилюючими екранами Атегзпат Нурегзсгееп КРМ. Співставлення позитивних 65 плям на фільтрі з чашками, з яких вони походять, дає можливість зонам, що відповідають фагам, які показують позитивну гібридизаційну відповідь із зондом ЕРБР5 Агабідорзіз (Наїїапа, бути відібраними з чашки. Ця стадія посіву, перенесення, гібридизації та витягання повторюється доти, поки всі плями на чашці послідовно очищуваних фагів не засвідчать 10095-ий позитив в гібридизації. Незалежну пляму фагового лізису відбирають потім в розбавленому середовищі 7, (Тріс-НСІ рН7,5; 10-мМ Мо95зО,; 0,1М Масі; 0,195 желатин); ці фаги в розчині утворюють ЕРЗРЗ-позитивні клони суспензії ВМЗ клітин кукурудзи. 4. Одержання та аналіз ДНК з ЕРЗР5 клонів суспензії ВМ5 клітин кукурудзи

Близько 5Х109 фагів додавали до 20мл бактерій СбООНІЇ при значенні ООсоонм 2/мл та інкубували протягом хвилин при 372С. Цю суспензію розбавляли потім в 200мл бактеріального ростового середовища в 1-1

Ерленмейерівській склянці та перемішували на ротаційній мішалці при 250об./хв. Лізис реєстрували, коли це 70 середовище ставало прозорим, що свідчило про лізис бактерій, які каламутили середовище, приблизно через 4год. перемішування. Потім цей супернатант обробляли згідно з описом в "Ситепі Ргоїосоіїв іп Моіесшаг

Віоіоду". Одержувана ДНК відповідає згаданим ЕРЗРО5-клонам із суспензії ВМ5-клітин кукурудзи.

Від одного до двох мкг цієї ДНК розрізали за допомогою ЕсоК! та розділяли в 0,8906-ому І! ЗТА/ТВЕ агарозному гелі (геї. СРМВ). Остаточне здійснення контролю полягає у перевірці того, щоб виділена ДНК дійсно 75 проявляла гібридизаційний сигнал з ЕРБРО-пробою Агабрідорзів (паїйапа. Після електрофорезу одержані фрагменти ДНК переносили на мембрани Атегейпат Нуропа М відповідно до протоколу Саузерн-аналізу, описаного в "Ситепі РгоїосоЇв іп Моіесціаг Віоюду" Одержаний фільтр гібридизували з ЕРЗРОЗ-Пробою

Агарідорзіз (пайапа згідно з умовами, описаними у наведеному вище розділі З. Клон, що виявляє гібридизаційний сигнал з ЕРЗРЗ-пробою Агабрідорзіз (паійапа і вміщує найбільш довгий ЕсоКіІ-фрагмент, має ділянку, за оцінкою в гелі, приблизно у вигляді 1,7т.п.н. 5. Одержання клону РКРА-МІ -711

Десять мкг фагового клону, що містив 1,7т.п.н. вставку, розщеплювали за допомогою ЕсокіІ та розділяли у 0,8 І ОТА/ТВЕ агарозному гелі (геї. СРМВ). Одержаний у гелі фрагмент, що містив згадану 1,7т.п.н. вставку, вирізали з цього гелю після забарвлення ЕтБ, і гелевий фрагмент обробляли за допомогою В-агарази відповідно СМ до протоколу постачальника, Мем" Епдіапа Віоіарв. ДНК, що виділяється з 1,7т.п.н. фрагменту, лігували при 1220 (5) протягом 14год. із ДНК з плазміди рус 19 (Мем Епдіапа Віоїіарв), різали за допомогою ЕсокіІ відповідно до умов експерименту з лігування, описаного в "Сигтепі РгоїосоЇв іп МоіІесшціаг Віоіоду". Два мкл з одержаної згідно з наведеним вище описом суміші для лігування використовували для трансформації аліквоти електрокомпетентної Е. сої ЮОНІТОВ; трансформацію виконували шляхом електропорації з використанням Іс) наведених нижче умов: суміш з компетентних бактерій та лігуючого середовища поміщали до кювети для Фу електропорації товщиною 0,2см (Віогад), заздалегідь охолоджену до 09С. Фізичні умови електропорації, з використанням електропоратора від фірми Віогай, такі: 2500 вольт, 25 тКЕ та 200 о. У цих умовах середній час 09 розряджання конденсатора становить порядку 4,2 мілісекунд. Потім бактерії поміщають в їмл ЗОС-середовища о (геї СРМВ) і перемішують протягом 1 години при 200об./хв. на ротаційній мішалці в 15-мілілітрових ретортоподібних пробірках. Після поміщення на І В/агарове середовище, з додаванням 10Омкг/мл карбеніциліну, со мініпрепарати з бактеріальних клонів, які росли протягом ночі при 37 «С, одержували відповідно до умов експерименту, описаного в "Ситепі Ргоїосоїів іп МоіІесціаг Віоіоду". Після розщеплення ДНК за допомогою Есокі і розділення електрофорезом в 0,895 | ЗТА/ТВЕ агарозному гелі (геї. СРМВ), зберігали клони, що мали 1/7т.п.н. « вставку. Остаточний контроль здійснювали перевіркою, в якій виділена ДНК дійсно виявляє гібридизаційний сигнал з ЕРЗРЗ-зондом Агарідорзіз ІНайапа. Після електрофорезу одержані фрагменти ДНК переносили на не) с мембрани Атегзпате Нубопа М відповідно до умов Саузерн-аналізу, |описаного в "Сигтепі Ргоїосої!з іп МоіІесшаг з» Віоісду"|. Одержаний фільтр гібридизували з ЕРЗРЗ-зондом Агабідорзіз (пайійапа відповідно до умов, описаних у наведеному вище розділі 3. Плазмідний клон, що мав 1,7т.п.н. вставку і гібридизується з ЕРБРОЗ-ЗОНДОМ

Агарідорзіз (паіїапа, одержували в найбільшій кількості, а ДНК, що одержується після лізису бактерій, очищали в градієнті СеСі, як це описано в "Ситепі Ргоїосоіїв іп Моїіесшіаг Віооду|. Очищену ДНК частково бо секвенували за допомогою набору Рагтасіа, відповідно до інструкцій постачальника, прямий та зворотний о універсальні праймери, М13, що поставляються тим самим постачальником, використовували як праймери.

Одержувана неповна послідовність охоплює приблизно 0,бт.п.н. Одержувана амінокислотна послідовність. у бо відповідній ділянці цього зрілого білка (близько 50 амінокислотних залишків) свідчить про 10095-ну

Те) 20 ідентичність з відповідною амінокислотною послідовністю зрілої ЕРБРЗ кукурудзи, (описаною в Американському патенті ОБР 4971908). Цей клон, що відповідає 1,7т.п.н. ЕсоКІ-фрагменту ДНК ЕРЗРЗ із суспензії ВМ5-клітин сл кукурудзи, позначили як рКРА-МІ-711. Повну послідовність цього клону визначали в обох ланцюгах з використанням протоколу набору РНапгтасіа і синтезу комплементарних олігонуклеотидів і олігонуклеотидів протилежної орієнтації, кожний, приблизно, по 250п.н. Повна послідовність, одержана з цього 1713Зп.н. клону, надається у ЗЕО ІЮ Мо.1. (ФІ 6. Одержання клону РКРА-МІ -715

Аналіз послідовності одержаного клону рКРА-МІ-711, і, особливо, порівняння одержаної амінокислотної ді послідовності з послідовністю з кукурудзи, свідчать про подовження послідовності на 92п.н. вище від кодону осо, що кодує МНо-кінцевий аланін зрілої частини ЕРЗРО кукурудзи | Американський Патент ОБР 4971908). 60 Аналогічно спостерігали подовження на 288п.н. нижче від кодону ААТ, що кодує СООН-кінцевий аспарагін зрілої частини ЕРБРОЗ кукурудзи |Американський Патент ОБР 4971908). Ці дві частини могли б відповідати, у разі

МН»е-кінцевого подовження, частині послідовності транзитного пептиду, для локалізації у пластиді, а у разі

СООнН-кінцевого подовження, - 3'-нетранслюємій ділянці кКДНК.

Для одержання кДНК, що кодує зрілу частичу кКДНК ЕРБРО кукурудзи, як (описано в ОБР 49719081), бо виконували такі операції:

а) Видалення З3'-нетранслюємої ділянки: конструювання рКРА-МІ -712:

Клон рКРА-МІ-711 розрізали за допомогою рестрикційного ферменту Азеї, і кінці, одержані внаслідок цього розщеплення, затупляли шляхом обробки за допомогою фрагменту "льонова ДНК-полімерази І, згідно з протоколом, описаним в СРМВ. Далі виконували розщеплення за допомогою ферменту рестрикції Засії. ДНК, що її одержували у цих операціях, розділяли в 195-ому І СТА/ТВЕ агарозному гелі (геї. СРМВ).

Гелевий фрагмент, що містив 0,4т.п.н. вставку "АзеІ з тупими кінцями/Засії" вирізали з цього гелю і очищали відповідно до протоколу, описаного у наведеному вище розділі 5. ДНК, одержану з клону РКРА-МІ -711, різали за допомогою рестрикційного ферменту Ніпаїй по Ніпаї-11-сайті, локалізованому в полілінкері 7/0 Кклонуючого вектора рост, і кінці, одержувані внаслідок цього розщеплення, затупляли обробкою за допомогою фрагменту "льонова ДНК-полімерази І. Після цього здійснювали розщеплення за допомогою ферменту рестрикції Засії. ДНК, що одержували внаслідок цих маніпуляцій, розділяли електрофорезом в 0,795-ному

І ОТА/ТВЕ агарозному гелі (геї. СРМВ).

Фрагмент гелю, що містив приблизно 3,7 т.п.н. вставку НіпаїїЇ з тупими кінцями/ЗасіЇ, вирізали з цього у/5 Телю і виділяли очищенням відповідно до протоколу, описаного у наведеному вище розділі 5.

Ці дві вставки лігували, і 2мкл лігуючої суміші використовували для трансформації Е соїї ОНІОВ, як описано вище у розділі 5.

Плазмідну ДНК з різних клонів аналізували згідно з методикою, описаною для рКекРА-МІ-711. Один з відібраних плазмідних клонів містив приблизно 1,45бт.п.н. вставку ЕсокКіІ-Ніпаїїї. Послідовність кінців цього Клону показує, що 5-кінець даної вставки точно відповідає кінцю рКРА-МІ-711, Її що 3-кінець відзначається такою послідовністю: "Б-...ААТТААОСТСТАСАСТСОАССТОСАОСОСАТОСААСОСТТ-3".

Підкреслена послідовність відповідає кодону СООН-термінальної амінокислоти аспарагіна, а наступний кодон відповідає стоп-кодону трансляції. Нуклеотиди, розташовані нижче, відповідають елементам послідовності сч об З полілінкера рОост19. Цей клон, який включає послідовність РКРА-МІ -711, аж до сайта термінації трансляції зрілої ЕРБРЗ кукурудзи, і наступні послідовності з полілінксера риОС19, аж до НіпайП-сайта, був позначені як і) рРЕРА-МІ-712. б) Модифікація 5'-кінця РКРА-МІ -712: конструювання рКРА-МІ -715:

Клон рКРА-МІ-712 розрізали за допомогою ферментів рестрикції Рей і Ніпаїїї. ДНК, яку одержували ю зо внаслідок цих маніпуляцій, розділяли електрофорезом у 0,896-ому /ЗТА/ТВЕ агарозному гелі (геї. СРМВ).

Фрагмент гелю, що містив 1,3т.п.н. вставку Рвй-МУсокКІ, вирізали з цього гелю і очищали відповідно до Ме) протоколу, описаного у наведеному вище розділі 5. Цю вставку лігували в присутності еквімолярної кількості со кожної з двох частково комплементарних олігонуклеотидних послідовностей:

Олігонуклеотід 1: о г) 5-вдасСсоАдОаСстТоСАтТсаСсСОСасССОАОСАСАТСОТОСТОСА-З' Олігонуклеотід 2: 5'-бСАССАТСТОСТоОСОСОССООССАТеаСАаСТОоСОСтТо-3", « дю а також у присутності ДНК плазміди рОсС19, розщепленої рестрикційними ферментами Ватні і Ніпай!!. з

Два мкл цієї лігуючої суміші використовували для трансформації Е. соїї ОНІТОВ, як описано вище у розділі с 5. Після аналізу плазмідної ДНК з різних клонів згідно з методикою, описаною вище у розділі 5, один з клонів, :з» що має приблизно 1,3т.п.н. вставку, зберігали для наступних аналізів. Послідовність з 5-кінця відібраного клону виявляє, що послідовність ДНК в цій ділянці є такою: послідовність з полілінкера рОсС19 від сайта Есокі до сайта Ватні, за якою слідує послідовність олігонуклеотидів, що використовуються для клонування, після чого бо 15 слідує залишок послідовності, представленої в РКРА-МІ -712. Цей клон позначили як рРКРА-МІ-713. Цей клон має метіоніновий АТО-кодон, включений у МесоІ-сайт вище М-термінального аланінового кодону зрілої (ав) ЕРБР5-синтази. Крім того, аланіновий і гліциновий кодони М-кінця були збережені, але модифіковані за третьою бо варіабельною основою: початкова ССО дає модифіковану ОССООС.

Клон рКЕРА-МІ-713 розрізали за допомогою рестрикційного ферменту Ніпаїй, і кінці цього розщеплення (Се) затупляли шляхом обробки за допомогою фрагменту "льонова ДНК-полімерази 1. Далі здійснювали сп розщеплення за допомогою рестрикційного ферменту Зай. ДНК, що її одержували після цих маніпуляцій, розділяли електрофорезом в 0,89о-ному І ЗТА/ТВЕ агарозному гелі (геї. СРМВ). Фрагмент гелю, що містив 1,3т.п.н. вставку "Ніпа ПІ з тупими кінцями/Засі", вирізали з цього гелю і очищали відповідно до протоколу, описаного у наведеному вище розділі 5. Цю вставку лігували в присутності ДНК плазміди рОС19, розщепленої за допомогою рестрикційного ферменту Хваї, і кінці цього розщеплення затупляли шляхом обробки за допомогою

ГФ) фрагменту "льонова ДНК-полімерази 1. Потім здійснювали розщеплення за допомогою рестрикційного ферменту 7 Зай. Два мкл цієї лігуючої суміші використовували для трансформації Е соїї ОНІТОВ, як описано вище у розділі 5. Після аналізу плазмідної ДНК з різних клонів, згідно з методом, описаним вище у розділі 5, один з цих клонів, що має вставку приблизно 1,3т.п.н., зберігали для наступних аналізів. Послідовність одержаних кінців бо відібраного клону показує, що послідовність ДНК є такою: послідовність з полілінкера рИОсС19 від сайта Есокі до сайта Засі, за якою слідує послідовність олігонуклеотидів, що використовуються для клонування, з якої видаляли 4п.н. ЗАТСС з олігонуклеотиду І описаного вище, за якою слідує залишок послідовності, представленої в рКРА-МІ -712 аж до Ніпаї|І-сайта, і послідовність з полілінкера рОсС19 від Хваї до Ніпайї|. Цей клон позначили як РКРА-МІ -715. бо 7. Одержання кКДНК, що кодує мутантную ЕРБРЗ кукурудзи

Усі стадії мутагенезу здійснювали за допомогою набору для мутагенезу РНпагтасіа ШО.5.Е., відповідно до інструкцій постачальників. Принцип цієї системи мутагенезу полягає у таких операціях: плазмідну. ДНК денатурують нагріванням і реасоціюють у присутності молярного надлишку, в одному випадку - олігонуклеотиду,

Що використовується для мутагенезу, а в іншому випадку, - олігонуклеотиду, що дає можливість унікальному сайтові рестрикційного ферменту, присутньому в полілінкері, бути елімінованим. Після стадії реасоціації здійснювали синтез комплементарного ланцюга під впливом Т4-ДНК-полімерази в присутності Т4-ДНК-лігази і гена 32 білка у відповідному буфері, що додається.

Одержаний продукт синтезу інкубують у присутності рестрикційного ферменту, для якого допускається 7/0 Зникнення сайта під час мутагенезу. Штам Е. соїі, який відзначається, зокрема, мутацією тиї5, використовують як хазяїн для трансформації цієї ДНК. Після вирощування в рідкому середовищі одержували тотальну плазмідну

ДНК і інкубували в присутності раніше використаного рестрикційного ферменту. Після цих обробок, штам Е. сої використовували як хазяїн для трансформації. Одержували плазмідну ДНК з виділених клонів, а наявність інтродукованої мутації контролювали секвенуванням.

А) - модифікація сайтів або послідовностей без принципового впливу на характер ЕРЗР5-стійкості кукурудзи до продуктів, які є конкурентними інгібіторами синтазної активності ЕРБР: елімінація внутрішнього МсоіІ-сайта з РАРА-МІ -715.

Послідовність РКРА-МІ-715 нумерували довільно шляхом поміщення першої основи М-термінального ал ані нового кодону в позицію 1. Ця послідовність має МсоІ-сайт в позиції 1217. Сайт-модифікуючий олігонуклеотид 2о має таку послідовність: 5-ССАСАССАТООСОАТООССТТСТОСО-3

Після секвенування, згідно з посиланнями, наведеними вище, послідовність, що зчитується після мутагенезу, відповідає послідовності використаного олігонуклеотиду. МесоіІ-сайт був дійсно елімінований, і трансляція амінокислот в цій ділянці зберігає початкову послідовність, присутню в рРКРА-МІ -715. сч

Цей клон позначили як РКРА-МІ -716. 1340п.н. послідовність, одержана з цього клону, представлена в ЗЕО ІЮО Мо.2 і ЗЕО ІЮ Мо.3. (8)

Б) - модифікації послідовності, що забезпечують можливість підвищення ЕРЗРЗ-стійкості до продуктів, які є конкурентними інгібіторами синтазної активності ЕРБР5.

Використовували такі олігонуклеотиди: ю зо а) мутація Тиг 102. хе. 5-СААТОСТОСААТСОСААТОСООССАТТОАСАСС-3! о б) мутація Рго 106. »Зег. со 5-СААТОСТОСААСТОСААТОСООСТССТТОАСАСС-3! в) мутація Су 101. 5Аїа і Тиг 102. хе. о 5Б-СТТОСОБбААТОСТОССАТСОСААТОСОСССАТТО-3! (ее) г) мутації Тиг 102. хе і Рго 106. »5ег. 5-СБОБААТОСТОСААТСОСААТОСООСТССТТОАСАСС-3!

Після секвенування послідовність, що зчитується після мутагенезу по трьох мутантних фрагментах, була « ідентичною батьківській ДНК-послідовності РКРА-МІ -716, за винятком мутагенізованоТ ділянки, яка відповідає ділянці використаних для мутагенезу олігонуклеотидів. Ці клони були позначені: - с рКРА-МІ-717 для мутації ТАг 102. Пе, РКРА-МІ-718 для мутації Рго 106. »5зег, рРКРА-МІ -719 для мутації Су ч» 101. 5Аїа і Тиг 102. хе і РКРА-МІ -720 для мутації ТАг 102- хе і Рго 106. »5ег. " 134О0п.н. послідовність з РКРА-МІ -720 представлена в ЗЕО І Мо. 4 і ЗЕО ІЮ Мо.5. 1395п.н. вставка МесоІ-НіпаЦ є основою всіх конструкцій, що використовуються для трансформації рослин, для інтродукції стійкості до гербіцидів, які є конкурентними до інгібіторів ЕРБР5, і, особливо - для бо інтродукції стійкості до гліфосату. Ця вставка буде позначатися в іншій частині опису як "подвійний мутант о ЕРЗРБ кукурудзи".

Приклад 2; бо Толерантність до гліфосату для різних Іп міго мутантів со 020 2. а: Екстрагування ЕРЗРО-синтази

Різні гени ЕРЗРО-синтази, які інтродукуються у вигляді касети МесоіІ-Ніпа!їЇ в плазмідний вектор рТгс99а сл (Рпагтасіа, геї. 27-5007-01), розрізали за допомогою Месо! і НіпаїїЇ. Рекомбінантні бактерії Е. соїї ОНІОВ, які надекспресують різні ЕР5Р5-синтази, обробляли ультразвуком в 40мл буфера на 10г осаджених клітин, і промивали тим же буфером (200мМ Тріс-НСІ рнН7,8, 5ОММ меркаптоетанолу, 5ММ ЕДТА і ТММ РМ5РЕ), до якого го додавали г полівінілліролідону. Цю суспензію перемішували протягом 15 хвилин при 4 9С і потім

ГФ) центрифугували протягом 20 хвилин при 270009 і 496.

До супернатанту додавали сульфат амонію, щоб довести цей розчин до 4095-го насичення сульфатом о амонію. Одержану суміш центрифугували протягом 20 хвилин при 270009 і 40. Сульфат амонію додавали до одержаного нового супернатанту, щоб довести цей розчин до 7095-го насичення по відношенню до сульфату 60 амонію. Одержану суміш центрифугували протягом ЗО хвилин при 270009 і 42С. ЕРБР5-синтазу, присутню в цьому білковому осаді, відбирали в їмл буфера (20мМ Тріс-НСІ рнН7,8, 5О0ММ меркаптоетанолу). Цей розчин діалізували протягом доби проти двох літрів цього ж буфера при 420. 2. 6: Ферментативна активність в5 Активність кожного ферменту, як і їх стійкість до гліфосату, вимірювали іп міго протягом 10 хвилин при 372 у такій реакційній суміші: 100мММ малеїнової кислоти рН5,б, їмМ фосфоенолпірувату, ЗММ шикімат-3-фосфату

(приготовленого згідно з |Кпом/евзв Р.Б. і Зргіпвоп О.В. 1970. Меїйодвз іп Епгуто!ї 17А, 351-352 з Аегорасіег аегодепезі, штам АТСС 25597) і 10ММ фториду калію. Екстракт ферменту додавали в останній момент після додавання гліфосату, остаточна концентрація якого варіювала від 0 до 20мММ.

Активність вимірювали шляхом кількісного визначення фосфату, що вивільнювався, згідно |з методикою

ТацзкКу Н.А. і Зпогт Е. 1953. 3). Віої. Спет. 202, 675-685).

У цих умовах природний фермент (М/Т) інгібується вже на 8595 при концентрації гліфосату 0,12мМ. При цій концентрації мутантний фермент, відомий як бег106, інгібується лише на 5095, а інші три мутанти, ІТе102,

Ме102/Зетоб і АІа101/1е102, демонструють низьку інгібіцію або взагалі не інгібуються. 70 Концентрацію гліфосату збільшували на порядок, тобто до 1,2мММ, з метою досягнення 5095-го інгібування мутантного ферменту ІТе102, мутантів ІТе102/Зег106, АїІа/Іте і Аа, які до цієї концентрації не інгібувалися.

Слід зазначити, що активність мутантів АІа/ЛтТе і Аа не інгібується аж до концентрації гліфосату 1ОММ, і що активність мутанта ІТе102/5ег106 не знижується навіть при збільшенні концентрації гліфосату вдвічі, тобто, до 20мММ.

Приклад 3:

Резистентность трансформованих тютюнових рослин 1-1 - Трансформація

Вектор РКРА-КО-173 інтродукувапи в дгорасіегішт (штегасіепз штам ЕНАТО1 (Нооа зі співавт., 1987), несучий косміду РГУК291 ІКопагі зі слівавт., 1986). Техніка трансформації заснована на методі Ногегй зі співавт. (1985). 1-2 - Регенерація

Регенерацію тютюну РВОб (джерело ЗЕІЇТА Егапсе) здійснювали з листових експлантатів в основному середовищі Мигазпіде і 5кКоосд (М5), що включає ЗОг/л сахарози, а також 200мкг/мл канаміцину. Листові експлантати видаляли з рослин, що культивуються в оранжереї або іп мійго, і трансформували згідно з методикою листових дисків |Зсіепсе, 1985, МоіІ.227, рр.1229-1231) на протязі трьох послідовних стадій: перша сч ов Включає індукцію проростання, протягом 15 днів, у середовищі з додаванням ЗОг/л сахарози, яка містить

О0,О5мг/л нафтилоцтової кислоти (МАА) і 2мг/л бензиламінопурину (ВАР). Кільчики, одержані під час цієї стадії, і) розвиваються далі протягом 10 днів при культивуванні на М5-середовищі, з додаванням Зб0г/л сахарози, але яке не містить ніякого гормону. Далі розвинуті кільчики видаляли та культивували на М5-середовищі для вкорінення, яке мале половинний вміст солей, вітамінів та цукру і не містило ніякого гормону. Приблизно через 15 днів, ю

Зо Вкорінені кільчики переносили в грунт. 1-3-Стійкістьдо гліфосату Ме

Регенерували двадцять трансформованих рослин і переносили їх до оранжереї для конструювання со рРКРА-КО-173. Ці рослини обробляли в оранжереї, на стадії 5-го листа, водною суспензією КоцпаОр, яка відповідає 0,8кг активної речовини гліфосату на гектар. о

Відповідні результати показників спостережень фітотоксичности протоколювали через З тижні після обробки. со

За цих умов встановлено, що рослини, трансформовані за допомогою конструкції РКРА-КО-173, виявили дуже хорошу толерантність, тоді як нетрансформовані контрольні рослини повністю гинули.

Ці результати ясно свідчать, що таке поліпшення викликане використанням химерного гена згідно з цим винаходом замість такого ж гена, що кодує толерантність до гліфосату. «

Приклад 4: з с Трансформація та селекція клітин кукурудзи . ВМ5 (Віаск Мехісап Зуеем)-клітин кукурудзи в експонентній фазі росту бомбардували конструкцією и?» рРКРА-КО-130 згідно зі специфікою та умовами експерименту, |описаними у Кіеїп зі співавт. 1987 (Кіевїп Т.М.,

Мой БО. МУ Кк. і Бапатога 3.С. (1987): Нідн меїосйу тісгорго|)есійев ог деїїмегіпуд писіеіс асідв іпо

Міпу сеїв, МАТОКЕ Мої.327 рр.70-73)).

Го! Через два дні після бомбардування ці клітини переносили в те ж саме середовище, що містило 2ММ

М-(фосфонометил) гліцину. о Через 8 тижнів селекції на цьому середовищі, кал юси, які виросли, відбирали, потім ампліфікували та

Го! аналізували за допомогою РСК і виявляли очевидну присутність химерного ОТР-ЕРЗРО5-гена.

Клітини, які не піддавали бомбардуванню і які не росли на тому ж середовищі, що містило 2мММ ік М-(фосфонометил) гліцину, блокувалися гербіцидом і не розвивалися. сп Рослини, трансформовані згідно з цим винаходом, можуть бути використані як батьківські для одержання ліній та гібридів, які відзначаються фенотипічною ознакою, що відповідає експресії інтродукованого химерного гена.

Опис конструкцій плазмід рРКРА-КО-124: До рКРА-МІ -720 додавали "пов" поліаденілюючий сигнал для створення клонуючої касети, що

Ф) містить подвійний мутант ЕРЗР5-гена кукурудзи (ТАК 102-»е і Рго 106-»5ег). РКРА-МІ -720 розщеплювали за ко допомогою Ніпаїїї та обробляли фрагментом "льонова ДНК-полімерази І Е. соїї для одержання тупого кінця.

Друге розщеплення здійснювали за допомогою Місої, ії одержаний фрагмент ЕРЗР5 очищали. Потім ЕРЗР5-ген бо лігували з очищеною рКРА-КО-12 (клонуюча касета, що містила сигнал поліаденілювання нопалінсинтази) для одержання рКРА-КО-124. Для того, щоб одержати практично чистий вектор рРКРА-КЕ-12, останній необхідно завчасно розщепити за допомогою заї), обробити ДНК-полімеразою Кльонова і потім другий раз розщепити за допомогою МІсоЇ. рАКРА-КЕ-125: До рКРА-КО-124 додавали оптимізований транзитний пептид (ОТР) для створення клонуючої б5 касети, що містить ЕРЗР5-ген, націлений на плазміди. РКРА-КО-7 |Європейська Патентна Заявка ЕР 652286) розщеплювали за допомогою рії, обробляли за допомогою Т4-ДНК-полімерази і потім розщеплювали за допомогою Зреї, а одержаний фрагмент ОТР очищали. Цей ОТР-фрагмент клону вал и в РКРА-КО-124, який заздалегідь розщеплювали за допомогою МсоіІ, обробляли за допомогою ДНК-полімерази Кльонова для видалення виступаючої 3'-частини і потім розщеплювали за допомогою Зреї!. Далі цей клон секвенували з метою гарантування правильного трансляційного злиття між згаданим ОТР і згаданим ЕРБР5-геном. Після цього одержували рРКРА-КО-125. рРКРА-КО-130: До рфРА-КО-125 додавали послідовність НЗС4 кукурудзяного гістонового промотора і послідовність інтрону 1 адп1 з рРКРА-КО-123 |Патентна Заявка ЕР 507698), з метою створення касети для експресії в рослинах подвійного мутантного ЕРЗРО-гена в тканинах однодольних. рРКРА-КО-123 (касета, що 7/0 Містить згаданий НЗСА кукурудзяний гістоновий промотор, злитий із згаданим інтроном. 1 адн1, розщеплювали за допомогою Мсо! і Засі. Фрагмент ДНК, що містив вказаний промотор, одержаний з РКРА-КО-123, після цього очищали і лігували з РКРА-КО-125, яку заздалегідь розщеплювали за допомогою Мсої і засі. рРКРА-КО-159: До рКРА-КО-125 додавали гістоновий подвійний промотор НАА748 Агабрідорзіз (Патентна

Заявка ЕР 507698), з метою створення касети для експресії в рослинах, для експресії "ОТР-подвійного /5 Мутантного ЕРБР5-гена", гена в тканинах дводольних. рРКРА-КО-132 (касета, що містить згаданий подвійний промотор НАА748 (Патентна Заявка ЕР 507698) розщеплювали за допомогою М(сої! і Засі. Одержаний очищений фрагмент промотора клонували після цього в РКРА-КО-125, яку розщеплювали за допомогою Есої і засі. рРКРА-КО-173: До плазміди рКРА-ВІ-ЛО5ОА |Європейська Патентна Заявка 508909| додавали "Н4А748 промотор-ОТР-подвійний мутантний ЕРБР5-ген), ген з РКРА-КО-159, для створення з Адгорасіегіт (шптегасіепз 2о трансформуючого вектора. РКРА-КО-159 розщеплювали за допомогою Мої! і обробляли полімеразою Кльонова.

Цей фрагмент клонували після цього в РКРА-ВІ -150А за допомогою Зтаї.

Claims

Формула винаходу с

1. Трансформована рослина з поліпшеною толерантністю до гербіцидів о фосфометилгліцинової родини, одержана шляхом регенерації трансформованих клітин, що містять химерний ген, який включає в напрямку транскрипції: промоторну ділянку, яка складається принаймні з одного генного промотору або промоторного фрагмента, ю зо який експресується в рослинах природним способом, ділянку транзитного пептиду, яка дозволяє націлювання зрілого білка в пластидний компартмент, (2) послідовність гена, що кодує фермент толерантності до гліфосату, та со 3З--нсетрансльовану ділянку сигналу термінації транскрипції, яка відрізняється тим, що ферментом толерантності до гліфосату є мутована (2 35 Б-енолпірувіл-шикімат-3-фосфатсинтаза (ЕРЗРО5) рослинного походження, що містить принаймні одну заміну со "треонін 102 на ізолейцин" та одну заміну "пролін 106 на серин".

2. Трансформована рослина за п. 1, яка відрізняється тим, що ЕРБР5 походить з кукурудзи.

З. Трансформована рослина за п. 2, яка відрізняється тим, що ЕРБР5 включає пептидну послідовність, представлену в 5ЕО ІО Мо. 5. «

4. Трансформована рослина за п. З, яка відрізняється тим, що послідовність гена, що кодує фермент 73 с толерантності до гліфосату, включає кодуючий сегмент послідовності ДНК, представленої в ЗЕО ІО Мо. 4.

5. Трансформована рослина за будь-яким з пп. 1-4, яка відрізняється тим, що промоторна ділянка включає :з» промотор рослинного вірусу.

6. Трансформована рослина за будь-яким з пп. 1-5, яка відрізняється тим, що промоторна ділянка включає рослинний промотор. оо

7. Трансформована рослина за будь-яким з пп. 1-6, яка відрізняється тим, що промоторна ділянка включає генний промоторний фрагмент, який експресується в рослинах природним способом.

о

8. Трансформована рослина за п. 7, яка відрізняється тим, що промоторним фрагментом, який експресується о в рослинах природним способом, є актин інтрон.

9. Трансформована рослина за будь-яким з пп. 1-8, яка відрізняється тим, що ділянка транзитного пептиду ре) включає одну або більше одиниць транзитного пептиду. с

10. Трансформована рослина за будь-яким з пп. 1-9, яка відрізняється тим, що 3'-нетрансльована ділянка сигналу термінації транскрипції вибрана з такого гена нопалінсинтази або ділянки гістону НАА748 Агарідорзів ІНнаїапа. Ф) іме) 60 б5