MX2008014615A - Minicromosomas artificiales de plantas. - Google Patents

Abstract

Se describen minicromosomas artificiales de plantas que comprenden un centromero funcional que específicamente enlaza la proteína C centromérica (CENPC) y métodos para hacer dichos minicromosomas.

Description

MINICROMOSOMAS ARTIFICIALES DE PLANTAS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está en el campo de biotecnología de plantas, en particular, esta pertenece a minicromosomas artificiales y a métodos para hacer tales minicromosomas en una planta. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances recientes en la ingeniería de cromosomas han hecho posible alterar el genoma de la planta, así, alterando su fenotipo. Cuando un transgen es integrado en un genoma de planta, es usualmente en un aspecto aleatorio y en un número de copias impredecibles . Por consiguiente, los esfuerzos de investigación se han dirigido hacia el mejor control de la integración del transgen. Dada esta necesidad, los investigadores han deseado saber si la respuesta podría encontrarse en el uso de minicromosomas artificiales. Estas son moléculas de DNA lineales o circulares hechas por el hombre construidas de elementos de secuencia de DNA de acción cis que proporcionan replicación y particionamiento de los minicromosomas construidos . Se cree que la producción de cromosomas artificiales reduciría o eliminaría algunas cuestiones asociadas con las integraciones genómicas aleatorias en un cromosoma de planta nativo, por ejemplo, el arrastre de enlace debido a la asociación del transgen con el material genómico de la planta hospedera. Los cromosomas artificiales también pueden proporcionar medios para suministrar 10-100 veces más genes que los vectores de transformación estándares, y para proporcionar segmentos cromosómicos grandes para la complementación y/o clonación basada en mapa. Tres componentes se han identificado para la replicación, estabilidad y mantenimiento/herencia de cromosoma artificial: (i) secuencias de replicación autónomas que funcionan como un origen de replicación; (ii) telómeros que funcionan para estabilizar y mantener los extremos de los cromosomas lineales; y (iii) centromeros que son el sitio del ensamble de cinetocoro para la segregación de cromosoma apropiada en mitosis y meiosis. Los centromeros aislados de organismos unicelulares, tal como levadura, no funcionan en eucariotas superiores. La patente norteamericana 5,270,201, expedida a Richards y colaboradores el 14 de Diciembre de 1993, describe cromosomas artificiales de plantas basados en telómeros y, opcionalmente un centrómero. La patente norteamericana 7,119,250, expedida a Luo y colaboradores el 10 de Octubre del 2006, describe composiciones de centromeros de plantas. La patente norteamericana 7,132,240, expedida a Richards y colaboradores el 7 de Noviembre del 2006, describe un método para aislar DNA de centromero metilado potencialmente de cualquier centromero en un organismo. La patente norteamericana 7,193,128, expedida a Copenhaver y colaboradores el 20 de Marzo del 2007, describe un método para generar o incrementar el beneficio de cultivos usando secuencias de ácido nucleico de centrómeros de plantas . La solicitud de PCT que tiene el número de publicación WO 2007/030510 que fue publicada el 15 de Marzo del 2007, describe métodos para hacer plantas transformadas con minicromosomas autónomos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a un minicromosoma artificial de planta que comprende un centromero funcional que contiene: (a) por lo menos dos arreglos de' repeticiones en tándem de CentC en una orientación invertida en donde el primer arreglo comprende por lo menos cincuenta copias de CentC y el segundo arreglo comprende por lo menos cincuenta copias de CentC; y (b) por lo menos una copia de un elemento retrotransposable, en donde el elemento retrotransposable está situado entre el primero y el segundo arreglo. En una segunda modalidad, un minicromosoma artificial de planta de la invención comprende un elemento retrotransposable seleccionado del grupo que consiste de CentA, CRM1 y CRM2. En una tercera modalidad, el minicromosoma artificial de planta de la invención también comprende por lo menos un telómero funcional. En una cuarta modalidad, el centrómero funcional, comprendido por el minicromosoma artificial de planta específicamente enlaza la proteína C centromérica (CENPC) . En una quinta modalidad, una planta de maíz puede comprender cualquiera de los minicromosomas artificiales de la invención. En una sexta modalidad, la presente invención se relaciona a un minicromosoma artificial de planta que comprende un centrómero funcional, en donde el centrómero específicamente enlaza la proteína C centromérica (CENPC). En una séptima modalidad, la invención se relaciona a un polinucleótido aislado que comprende: (a) por lo menos dos arreglos de repeticiones en tándem de CentC en una orientación invertida en donde el primer arreglo comprende por lo menos diez copias de CentC y el segundo arreglo comprende por lo menos diez copias de CentC; y (b) por lo menos una copia de un elemento ret otransposable , en donde el elemento retrotransposable está situado entre el primero y el segundo arreglo. En una octava modalidad, el polinucleótido aislado de la invención comprende un elemento retrotransposable que se selecciona del grupo que consiste de CentA, CRM1 y CRM2. En una novena modalidad, la invención se relaciona a un polinucleótido aislado que comprende: (a) por lo menos un arreglo de repeticiones en tándem de CentC, el arreglo que comprende por lo menos 10 copias de CentC y (b) por lo menos una copia de un elemento retrotransposable seleccionado del grupo que consiste de CentA, CRM1 y CRM2. En una décima modalidad, la invención se relaciona a un polinucleótido aislado que comprende: (a) por lo menos un arreglo de repeticiones en tándem de CentC, el arreglo que comprende por lo menos 10 copias de CentC y, (b) por lo menos una copia cada una de CentA, CRM1 y CRM2. En una onceava modalidad, la invención se relaciona a una construcción recombinante que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados de la invención asi como una planta de maíz transgénica que comprende tales construcciones recombinantes . En una doceava modalidad, la invención se relaciona a un método para hacer una planta de maíz transgénica que comprende un minicromosoma artificial de planta que tiene un centrómero funcional, el método que comprende: (a) poner en contacto por lo menos una célula de planta de maíz con una mezcla que comprende una construcción recombinante de la invención; (b) identificar por lo menos una célula de planta de maíz de la etapa (a) que comprende un minicromosoma artificial de planta que tiene un centrómero funcional; y (c) regenerar una planta de maíz fértil de la célula de planta de maíz de la etapa (b) en donde la planta de maíz comprende un minicromosoma artificial de planta que tiene un centrómero funcional. La mezcla también puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido para estimular el crecimiento de célula en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de un wuschel, un baby boom, un RepA o un Lecl. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Este archivo de patente o solicitud contiene por lo menos una figura de dibujo ejecutada en color. Copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con dibujo (s) de color serán proporcionadas por la Oficina en la petición y el pago de los derechos necesarios. La invención puede ser más completamente entendida de la siguiente descripción detallada y los dibujos acompañantes y el listado de secuencias, que forman una parte de esta solicitud. Figura 1. Hibridación in situ fluorescente (FISH) sobre una dispersión cromosómica mitótica de callos embriogénicos de maíz del evento #14 de la acumulación 1 de CMC3 de transformación con Hi-II. Los callos se derivaron de embriones inmaduros transformados con la acumulación 1 del clon BAC linealizado readaptado con Tn5-3. Los núcleos de prometafase (izquierda) y metafase (derecha) ambos muestran los 20 cromosomas nativos más 1 minicromosoma (flechas e inserciones). Ambos minicromosomas son positivos para la repetición especifica del centrómero CentC (verde - color; blanco - escala gris) y la sonda marcadora única 23715 (rojo color; blanco - escala gris) especifica al producto de transformación, con tanto CentC como 23715 que son esencialmente colocalizados en el minicromosoma (inserciones ) . Figura 2. FISH sobre una dispersión cromosómica mitótica de callos embriogénicos de maíz del evento #14 de la acumulación 1 de CMC3 de transformación con Hi-II. Los callos se derivaron de embriones inmaduros transformados con la acumulación 1 del clon BAC linealizado readaptado con Tn5-3. El panel A muestra un núcleo de metafase que muestra los 20 cromosomas nativos más 2 minicromosomas (cuadro) . Ambos minicromosomas son positivos para la repetición especifica de centrómero CentC (verde - color; blanco - escala gris) y la sonda marcadora única 23715 (rojo - color; blanco - escala gris), especifica a la transformación de construcción. Los paneles B-D son aumentos más altos del cuadro que muestran los minicromosomas (puntas de flecha) con: B - DAPI solamente; C - DAPI + sonda 23715 (rojo - color; blanco -escala gris) ; y D - DAPI + sonda CentC (verde - color; blanco - escala gris ) . Figura 3 . Inmunofluorescencia sobre una dispersión cromosómica mitótica de callos embriogénicos de maíz del evento #14 de la acumulación 1 de CMC3 de transformación con Hi-II. Los callos se derivaron de embriones inmaduros transformados con la acumulación 1 del clon BAC linealizado readaptado con Tn5-3. El panel A muestra un núcleo de metafase que muestra los 20 cromosomas nativos más 1 minicromosoma (flecha). Todos los centrómeros de los cromosomas nativos y el minicromosoma son positivos para la Proteína C Centromérica , CENPC (rojo - color; blanco - escala gris), una proteína específica de centrómero/cinetocoro. Los paneles B-C muestran aumento más alto del minicromosoma con: B - DAPI solamente; y C - DAPI + CENPC (rojo - color; blanco - escala gris) . La morfología e inmunolocalización de CENPC indica que el minicromosoma está compuesto de dos cromátidas hermanas cada una que tiene un centrómero funcional. Figura 4 . Panel A - Inmunofluorescencia sobre una dispersión cromosómica mitótica de callos embriogénicos de maíz del evento 1114 de la acumulación 1 de CMC3 de transformación con Hi-II. Los callos se derivaron de embriones inmaduros transformados con la acumulación 1 del clon BAC y linealizado readaptado con Tn5-3. La separación de cromátidas hermanas de los cromosomas nativos y el minicromosoma (cuadro) se observó durante la anafase. Todos los centrómeros de los cromosomas nativos y el minicromosoma son positivos para la Proteina C Centromérica , CENPC (rojo -color; blanco - escala gris) una proteina especifica de centrómero/cinetocoro . El panel B es una imagen de alto aumento del cuadro en ?, que muestra la separación de las cromátidas hermanas de minicromosoma (doble flecha) que indica que el minicromosoma, similar a los cromosomas normales, puede segregarse durante la mitosis. Figura 5. FISH sobre una dispersión cromosómica mitótica de callos embriogénicos de maíz del evento #14 de la acumulación 3 de C C3 de transformación con Hi-II. Los callos se derivaron de embriones inmaduros transformados con la acumulación 3 del clon BAC linealizado readaptado con Tn5-3. Un núcleo de metafase tetra-aneuploide (39 cromosomas, que carece de una copia de ch 6) que muestra los cromosomas nativos más 1 minicromosoma (flecha) es mostrado. El minicromosoma es positivo para repetición especifica de centrómeros CentC (verde - color; blanco - escala gris) y la sonda marcadora única 23715 (rojo - color; blanco - escala gris) especifica a la construcción de transformación. Los paneles B-D son aumentos más altos del área encuadrada que muestra el minicromosoma (puntas de flecha) y un cromosoma nativo con: A - DAPI solamente; C - DAPI + sonda CentC (rojo - color; blanco - escala gris) ; y D - DAPI + sonda 23715 (rojo - color; blanco - escala gris) . La localización bipolar de las repeticiones CentC como es revelado por el manchado de FISH en el minicromosoma indica que está compuesta de dos cromátidas hermanas similares a aquellas observadas en los cromosomas nativos. Figura 6. FISH sobre una dispersión cromosómica mitótica de callos embriogénicos de maiz del evento #12 de la acumulación 3 de CMC3 de transformación con Hi-II. Los callos se derivaron de embriones inmaduros transformados con la acumulación 3 del clon BAC linealizado readaptado con Tn5-3. Panel A - núcleo de metafase tetra-aneuploide (39 cromosomas, que carecen de una copia de ch 6) que muestra los cromosomas nativos más 2 minicromosoma (flecha) es mostrado. Los minicromosomas son positivos para tanto la repetición especifica de centrómeros CentC (verde - color; blanco escala gris) como la sonda marcadora única 23715 (rojo -color; blanco - escala gris) especifica al producto de transformación. El panel B es una imagen de alto aumento de los dos minicromosomas que muestra la variación en la abundancia de repeticiones CentC y el marcador único 23715. Figura 7. FISH sobre una dispersión cromosómica mitótica de callos embriogénicos de maiz del evento #12 de la acumulación 3 de CMC3 de transformación con Hi-II. Los callos se derivaron de embriones inmaduros transformados con la acumulación 3 del clon BAC linealizado readaptado con Tn5-3. Panel A - núcleo tetra-aneuploide (39 cromosomas, que carecen de una copia de ch 6) que muestra la separación de cromáticas hermanas de los cromosomas nativos y los 2 minicromosomas (cuadro) en anafase temprana. Las cromátidas hermanas de ambos minicromosomas son positivos para la repetición especifica de centrómero CentC (verde - color; blanco escala gris) y la sonda marcadora única 23715 (rojo - color; blanco - escala gris) especifica a la construcción de transformación. Los paneles B-C son imágenes de alto aumento de los 2 minicromosomas (flechas dobles) que muestran: B -DAPI + sonda CentC (verde - color; blanco - escala gris); y C - DAPI + sonda 23715 rojo - color; blanco - escala gris) . La separación de los cromátidas hermanas de minicromosoma en anafase sugiere la presencia de centrómeros funcionales, que permiten la segregación durante la mitosis. Figura 8. Inmunofluorescencia sobre una dispersión cromosómica mitótica de callos embriogénicos de maíz del evento #12 de la acumulación 3 de CMC3 de la transformación con Hi-II. Los callos se derivaron de embriones inmaduros transformados con la acumulación 3 del clon BAC linealizado readaptado con Tn5-3. El panel A muestra un núcleo de metafase tetra-aneuploide (39 cromosomas, que carecen de una copia de ch 6) que muestra 39 cromosomas nativos más 2 minicromosomas (flechas). Todos los centrómeros de los cromosomas nativos y los minicromosomas son positivos para la Proteina C Centromérica , CENPC (rojo - color; blanco - escala gris) una proteina especifica de centrómero/cinetocoro. Los paneles B-C son imágenes de alto aumento de los minicromosomas . El patrón de inmunolocalización de CENPC, dos focos por minicromosoma , indica que el minicromosoma está compuesto de dos cromátidas hermanas y cada una tiene un centrómero funcional capaz de formar un complejo de cinetocoro . Figura 9. FISH sobre una dispersión cromosómica mitótica de puntas de raíz de una planta regenerada de un evento de transformación de maíz Hi-II. Las plantas se derivaron de embriones inmaduros transformados con bacm . pkl28. 21 linealizado readaptado con Tn5-3. El panel A muestra un núcleo- de metafase aneuploide que muestra 19 cromosomas nativos más 1 minicromosoma (flecha). El minicromosoma es positivo para la repetición especifica de centrómero CentC (verde - color; blanco - escala gris) y la sonda marcadora única 23715 (rojo - color; blanco - escala gris) especifica de una construcción de transformación. Los paneles B-D son aumentos más altos del minicromosoma con: B -DAPI solamente; C - DAPI -i- sonda CentC (verde - color; blanco - escala gris) ; y D - DAPI + sonda 23715 (rojo - color; blanco - escala gris) . Figura 10. Inmunofluorescencia sobre una dispersión cromosómica mitótica de puntas de raíz de una planta regenerada de un evento de transformación de maíz Hi-II. Las plantas se derivaron de embriones inmaduros transformados con bacm . pkl28. j 21 linealizado readaptado con Tn5-3. El panel A muestra un núcleo de metafase aneuploide que muestra 19 cromosomas nativos más 1 minicromosoma (flecha). Todos los centrómeros de los cromosomas nativos y el minicromosoma son positivos para la Proteina C Centromérica , CENPC (rojo color; blanco - escala gris), una. proteina especifica de centrómero/cinetocoro . Los paneles B-C son aumentos más altos del minicromosoma con: B - DAPI solamente; y C - DAPI + CENPC. El patrón de inmunolocali zación de CNPC, dos focos por minicromosoma, indica que el minicromosoma está compuestos de dos cromátidas hermanas y cada una tiene un centrómero funcional capaz de formar un complejo de cinetocoro. Figura 11. Estructura fina de centrómeros de maíz revelada por fibra-FISH. Cuatro repeticiones centroméricas , CentC (verde - color; blanco - escala gris) y una suma de CentA, CRM1, y CRM2 (rojo - color; gris - escala gris) se utilizaron en FISH multicolor sobre fibras de DNA extendidas de lineas de adición de avena-maíz que contienen cromosomas de maíz individuales. Esto reveló estiramientos de hibridación largos de megabase, que son únicos para cada cromosoma . Figura 12. Modelo de un centrómero de maíz. La organización centromérica se muestra utilizando la nomenclatura de repetición centromérica de maíz. Arreglos ininterrumpidos de CentC pueden estar compuestos de varios cientos a miles de elementos de repetición. Otros elemento retrotransposables específicos de centrómeros de maíz tales como CentA, CRM 1 y/o CRM2 se pueden integrar en un arreglo CentC, entre sí y/o en sí mismo en regiones centroméricas . Además de los retrotransposones específicos de centrómero, otros retrotransposones pueden ser integrados en el arreglo, en elementos tales como CentA, CentC, CRMl y CR 2, y/o en el mismo para formar inserciones que interrumpen los arreglos de repetición en tándem de CentC. Esta figura muestra un modelo de la organización de los elementos CentC de. maíz (puntas de flecha) que forman dos arreglos de repeticiones de cabeza a cola en tándem. Los arreglos CentC se pueden encontrar en una orientación invertida para formar un segmento grande del DNA centromérico . Fibra-FISH junto con FISH sobre cromosomas de anafase meiótica y el análisis de hibridación de manchado de segmentos de DNA centroméricos clonados indicó que las regiones con alta densidad de todas las cuatro repeticiones centroméricas (CentC, CRMl, CentA y CRM2 ) estén involucradas en la formación del cinetocoro. Figura 13 . Readaptación y conversión de un clon BAC en un minicromosoma artificial lineal in vitro. El DNA del clon BAC es readaptado con el transposón Tn5-3 hecho usualmente que comprende el gen de resistencia a ampicilina (APr) , origen de replicación (orí) , marcadores seleccionables (MO-PAT) y visual (DS-RED2) bajo el promotor de ubicuitina (UBI 1ZM PRO) , secuencias teloméricas (TEL) en orientación inversa separadas por un gen de resistencia a canamicina (KANr) , y sitios para albergar enzimas de restricción I-Ppo I, I-Ceu I, y PI-Sce I. ME se establece para los extremos del mosaico de transposón. La digestión de la construcción BAC con la enzima de restricción albergante 1-Ceu I convierte un BAC circular en una molécula de DNA lineal flanqueada con secuencias teloméricas. Figura 14. Núcleo de metafase del callo del evento #14 de la acumulación 1 de CMC3 sondeada para elementos de centrómero y telómero. El análisis de FISH se hizo utilizando sondas fluorescentemente marcadas para la repetición CentC especifica de centrómero (verde - color; blanco - escala gris) y la repetición telo-31' especifica de telómero (rojo -color; blanco - escala gris). La localización de estas sondas es notada para un cromosoma nativo. CentC es denotado por asterisco (*), y telo-31 denotado por flechas dobles. Los paneles B-E muestran aumento más alto del minicromosoma . Panel B - DAPI + CentC -)- telo31 (verde/rojo - color; blanco -escala gris); C - DAPI solamente; D - DAPI + sonda CentC (verde - color; blanco - escala gris); y E - DAPI + sonda 23715 (rojo - color; blanco - escala gris) . El patrón de hibridación de telo-31 sugiere que el minicromosoma (flecha) tiene telómeros funcionales similares a los cromosomas nativos. Figura 15. Núcleo de metafase del callo del evento #27 de la subacumulación 1.3 de CMC3 sondeado para los elementos de centrómero y telómero. El análisis de FISH se hizo utilizando sondas fluorescentemente marcadas para la repetición CentC especifica de centrómero (verde - color; blanco - escala gris) y la repetición telo-31 especifica de telómero (rojo - color; blanco - escala gris) . La localización de estas sondas es notada para un cromosoma nativo, CentC es denotado por asterisco (*), y telo-31 denotado por flechas dobles. Los paneles B-E muestran aumento más alto del minicromosoma . Panel B - DAPI + CentC + telo-31 (verde/rojo - color; blanco - escala gris); C - DAPI solamente; D - DAPI .+ sonda CentC (verde - color; blanco -escala gris) ; y E - DAPI + sonda 23715 (rojo - color; blanco - escala gris). El patrón de hibridación de telo-31 sugiere que el minicromosoma (flecha) tiene telómeros funcionales similares a los cromosomas nativos. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La descripción de cada referencia expuesta aquí es incorporada por la presente por referencia en su totalidad. Como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Asi, por ejemplo, la referencia a "una planta" incluye una pluralidad de tales plantas, referencia a "una célula" incluye una o más células y equivalentes de las mismas conocidas para aquellos expertos en la técnica, y asi sucesivamente. En el contexto de esta descripción, un número de términos y abreviaciones son utilizados. Las siguientes definiciones son proporcionadas. "Estructura de lectura abierta" es abreviada ORF. "Colección Americana de Cultivos Tipo" es abreviada ATCC. El término "minicromosoma artificial de planta" como se utiliza en la presente se refiere a cualquier cromosoma artificialmente creado que comprende un centrómero y telómeros que poseen propiedades comparables a aquellas de un cromosoma nativo, tal como las replicación y segregación durante la mitosis y meiosis y por lo tanto autónomo y transmisible en la división celular. Los términos minicromosoma artificial, minicromosoma y cromosoma artificial se utilizan intercambiablemente en la presente. El término "centrómero funcional" se refiere a la región de unión del huso o eje de un cromosoma eucariótico que funciona de una manera comparable a los centrómeros en un cromosoma nativo. Esta es la región más condensada y restringida de un cromosoma, a la cual la fibra del huso se une durante la mitosis. Durante la mitosis en una célula de planta o de animal típica, cada cromosoma se divide longitudinalmente en dos cromosomas hermanos que eventualmente se separan y viajan a polos opuestos del huso mitótico. En el comienzo de la mitosis, cuando los cromosomas hermanos se han dividido pero todavía están emparejados, cada cromosoma se une al huso en un punto específico a lo largo de su longitud. Ese punto es referido como el centrómero o región de unión del huso. Los centrómeros están compuestos de DNA altamente repetitivo, esto es, secuencias de DNA que están presentes en un genoma en muchas copias. El término "arreglo" se refiere a un arreglo ordenadamente de elementos. El término "repetición en tándem" se refiere a múltiples copias de la misma secuencia de bases en la misma orientación. Así, estas son copias de secuencias de nucleótidos, que se repiten una y otra vez nuevamente un número de veces en tándem, por ejemplo, a lo largo de un cromosoma. Cualquier arreglo de repeticiones en tándem puede comprender múltiples copias de un solo elemento, o puede tener por lo menos otro elemento interdispersado dentro del arreglo, o dentro de un elemento del arreglo. El término "orientación invertida" se refiere a dos o más copias de la misma secuencia presente en una forma invertida . Los términos "elemento retrotransposable" y "retrotransposón" se utilizan intercambiablemente en la presente y se refieren a un elemento genético que se transpone a una nueva ubicación en el DNA al primero hacer una copia de RNA del mismo, luego al hacer una copia de DNA de este RNA con una transcriptasa inversa y luego al insertar la copia de DNA en el DNA objetivo. Los retrotransposones son elementos genéticos que pueden amplificarse por si mismos en un genoma y son componentes ubicuos del DNA de muchos organismos eucarióticos . Ellos son una subclase de transposón. Ellos son particularmente abundantes en plantas, donde son frecuentemente un componente principal del DNA nuclear. El término "telómero funcional" se refiere a estructuras encontradas en los extremos de cromosomas en las células eucariotas. Los telómeros funcionan al proteger los extremos del cromosoma de la recombinación, fusión a otros cromosomas, o degradación por nucleasa. Ellos permiten a las células distinguir entre las rupturas de DNA aleatorias y los extremos de cromosoma. Ellos también desempeñan una función significante en determinar el número de veces que una célula normal puede dividirse. Un telómero es una región de DNA altamente repetido en el extremo de un cromosoma lineal que funciona como un amortiguador desechable. Cada vez que los cromosomas eucarióticos lineales se replican durante la fase S tardía el complejo de DNA polimerasa es incapaz de replicar todo el camino al extremo del cromosoma; si no fueron para telómeros, esto daría por resultado rápidamente la pérdida de la información genética vital, que se necesita para sostener las actividades de una célula. Como se utiliza en la presente, "ácido nucleico" significa un polinucleótido e incluye polímero de una sola o doble hebra de bases de deoxirribonucleótido o ribonucleótido . Los ácidos nucleicos también pueden incluir fragmentos y nucleótidos modificados. Así, los términos "polinucleótidos" , "secuencia de ácido nucleico", "secuencia de nucleótidos" o "fragmento de ácido nucleico" se utilizan intercambiablemente para denotar un polímero de RNA o DNA que es de una sola o doble hebra, que contiene opcionalmente bases de nucleótido sintéticas, no naturales o alteradas. Los nucleótidos (usualmente encontrados en su forma de 5' -monofosfato) son referidos por su designación de una sola letra como sigue: "A" para adenosina o deoxiadenosina (para RNA o DNA, respectivamente) , "C" para citosina o deoxicitosina , "G" para guanosina o deoxiguanosina , "U" para uridina, "T" para deoxitimidina , "R" para purinas (A o G) , "Y" para pirimidinas (C o T) , "K" para G o T, "H" para A o C o T, "I" para inosina y "N" para cualquier nucleótido. Los términos "subfragmento que es funcionalmente equivalente" y " subfragmento funcionalmente equivalente" se utilizan intercambiablemente en la presente. Estos términos se refieren a una porción o subsecuencia de un fragmento de ácido nucleico aislado en el cual la habilidad para alterar la expresión génica o producir un cierto fenotipo es retenida si o no el fragmento o subfragmento codifica una enzima activa. Por ejemplo, el fragmento o subfragmento se puede utilizar en diseño de genes quiméricos para producir el fenotipo deseado en una planta transformada. Los genes quiméricos se pueden diseñar para el uso en la supresión al enlazar un fragmento de ácido nucleico o subfragmento del mismo, si o no codifica una enzima activa, en la orientación de sentido o de antisentido con relación a una secuencia de promotor de planta. El término "dominio conservado" o "porción" significa un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones especificas a lo largo de una secuencia alineada de proteínas evolucionariamente relacionadas. Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre proteínas homologas, los aminoácidos que son altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que son esenciales en la estructura, la estabilidad o la actividad de una proteína. Debido a que se identifican por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteína, ellos se pueden utilizar o identificadores , o "firmas" para determinar si una proteína con una secuencia recientemente determinada pertenece a una familia de proteínas previamente identificada. Los términos "homología", "homólogo", "sustancialmente similar", "sustancialmente idéntico" y "correspondiente sustancialmente" se utilizan intercambiablemente en la presente. Ellos se refieren a fragmentos de ácido nucleico en donde los cambios en una o más bases de nucleótidos no afectan la habilidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la expresión génica o producir un cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención tal como la supresión o inserción de uno o más nucleótidos que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con relación al fragmento no modificado, inicial. Estos términos también se refieren a secuencias de aminoácidos, polipéptidos , fragmentos de péptido con o sin modificaciones, supresiones, inserciones o sustituciones que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales con relación a una secuencia no modificada inicial. Por lo tanto, es entendido, como aquellos expertos en la técnica apreciarán, que la invención abarca más de las secuencias ejemplares específicas. Por otra parte, la persona experta reconoce que las secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares abarcadas por esta invención también son definidas por su habilidad para hibridarse (bajo condiciones moderadamente severas, por ejemplo, 0.5X SSC, SDS 0.1%, 60°C) con las secuencias ejemplificadas en la presente, o a cualquier porción de las secuencias de nucleótidos divulgadas en la presente y que son funcionalmente equivalentes a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico divulgadas en la presente. Las condiciones de severidad se pueden ajustar para clasificar fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homologas de organismos distantemente relacionados, a fragmentos altamente similares,, tales como genes que duplican las enzimas funcionales de los organismos estrechamente relacionados. Los lavados de post-hibridación determinan las condiciones de severidad. El término "selectivamente híbrida" incluyen la referencia a hibridación, bajo condiciones de hibridación severas, de una secuencia de ácido nucleico a una secuencia objetivo de ácido nucleico especificada a un grado detectablemente más grande (por ejemplo, por lo menos dos veces sobre el antecedente) que su hibridación a secuencias de ácido nucleico no objetivo y a la exclusión sustancial de ácido nucleico no objetivo. Las secuencias selectivamente hibridantes típicamente tienen aproximadamente por lo menos 80% de identidad de secuencia, o 90% de identidad de secuencia, hasta e incluyendo 100% de identidad de secuencia (es decir, completamente complementarias) entre sí.

El término "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" incluyen la referencia a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará selectivamente a su secuencia objetivo. Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar la severidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, las secuencias objetivo se pueden identificar que son 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad se pueden ajusfar para permitir alguna desigualación a las secuencias de modo que grados menores de similitud son detectados (sondeo heterólogo) . Generalmente, una sonda es menor que aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud, opcionalmente menor que 500 nucleótidos en longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de ion Na, de manera típica aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion Na (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es por lo menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos). Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes estabilizantes tal como formamida . Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación con una solución reguladora de formamida al 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) en 50 a 55°C. Las condiciones de severidad moderada ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0.1 X SSC a 60 a 65°C. La especificidad es típicamente la función de los lavados de pos t-hibridación , los factores críticos que son la intensidad iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de DNA-DNA, la Tm puede ser aproximada de la ecuación de Meinkoth y colaboradores, ( (1984) Anal Biochem 138:267-284) : Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el DNA, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tra es la temperatura (bajo intensidad iónica y pH definido) en el cual 50% de una secuencia objetivo complementaria híbrida a una sonda perfectamente igualada. La Tm es reducida por aproximadamente 1°C por cada 1% de desigualación; así, Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajusfar para hibridar a secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si las secuencias con >90% de identidad son buscadas, la Tm puede ser disminuida 10°C. Generalmente, las condiciones severas son seleccionadas para ser aproximadamente 5°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia especifica y su complemento en una intensidad iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 1, 2, 3 o 4°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o. un lavado en 6, 7, 8, 9 o 10°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o un lavado en 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) ; Utilizando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y la Tm deseada, aquellos de habilidad ordinaria entenderán que variaciones en la severidad de hibridación y/o soluciones de lavado son inherentemente descritas. Si el grado deseado de desigualación da por resultado una Tra de menor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración SSC de modo que se puede utilizar una temperatura más alta. Una guia extensiva para la hibridación de ácido nucleico se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overvie of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays", Elsevier, New York (1993); y Current Protocole in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel y colaboradores, Eds . , Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). La hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden aplicar por al menos 10, 30, 60, 90, 120 o 240 minutos. El término "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de secuencia de ácido nucleico o de polipéptido se refiere a las bases de ácido nucleico o residuos de aminoácido en dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. El término "porcentaje de identidad de secuencias" se refiere al valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventaja de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleotido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios), como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y al multiplicar los resultados por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Ejemplos útiles de por cientos de identidad de secuencia incluyen, pero no están limitados a. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, o cualquier porcentaje de número entero de 50 a 100%. Estas identidades se pueden determinar utilizando cualquiera de los programas descritos en la presente. Las alineaciones de secuencia y el por ciento de identidad o cálculos de similitud se pueden determinar utilizando una variedad de métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homologas que incluyen, pero no limitados al programa MegAlign™ del sitio de computación de informática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Dentro del contexto de esta solicitud será entendido que donde el software de análisis de secuencias se utiliza para el análisis, que los resultados del análisis estarán basados sobre los "valores de error" del programa referido, a menos que se especifique de otra manera. Como se utiliza en la presente, "valores de error" significará cualquier conjunto de valores o parámetros que originalmente se cargan con el software cuando primero es inicializado . El término "método de alineación Clustal V" corresponde al método de alineación etiquetado Clustal V (descrito por Higgins & Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins y colaboradores, (1992) Comput Appl Biosci 8:189-191) y encontrado en el programa MegAlign™ del sitio de computación de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Para múltiples alineaciones, los valores de error corresponden a la SANCIÓN DE ESPACIO=10 y SANCIÓN DE LONGITUD DE ESPACIO=10. Los parámetros de error para alineaciones emparejadas y el cálculo de por ciento de identidad de las secuencias de proteina utilizando el método Clustal son KTUPLE=1, SANCIÓN DE ESPACI0=3, VENTANA=5 y DIAGONALES SALVADAS=5. Para ácidos nucleicos estos parámetros son KTUPLE=2, SANCIÓN DE ESPACIO=5, VENTANA=4 y DIAGONALES SALVADAS= . Después de la alineación de las secuencias utilizando el programa Clustal V, es posible obtener un "por ciento de identidad" al visualizar la tabla de "distancias de secuencia" en el mismo programa. El término "método de alineación Clustal W" corresponde al método de alineación etiquetado Clustal W (descrito por Higgins & Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins y colaboradores, (1992) Comput Appl Biosci 8:189-191) y encontrado en el programa MegAlign™ v6.1 del sitio de computación de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Los parámetros de error para múltiple alineación son SANCIÓN DE ESPACIO=10, SANCIÓN DE LONGITUD DE ESPACIO=0.2, Delay Divergen Seqs (%)=30, Peso de Transición de DNA =0.5, Matriz de Peso de Proteína=Gonnet Series, Matriz de Peso de DNA=IUB. Después de la alineación de las secuencias utilizando el programa Clustal, es posible obtener un "por ciento de identidad" al visualizar la tabla de "distancias de secuencia" en el mismo programa. El término "método de alineación BLASTN" es un algoritmo proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI) para comparar secuencias de nucleótidos utilizando parámetros de error. Es bien entendido por un experto en la técnica que muchos niveles de identidad de secuencia son útiles en identificar polipéptidos , de otra especie, en donde tales polipéptidos tienen la misma o similar función o actividad. Ejemplos útiles de por cientos de identidades incluyen, pero no están limitados a, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%, o cualquier porcentaje de número entero de 50% a 100%. En realidad, cualquier identidad de aminoácido de número entero de 50% a 100% puede ser útil en describir la presente invención, tal como 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo secuencias reguladoras que preceden (secuencias de no codificación 5' ) y que siguen (secuencias de no codificación 3') la secuencia de codificación. "Gen nativo" se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y de codificación que no se encuentran conjuntamente en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación que son derivadas de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero arregladas de una manera diferente que aquella encontrada en la naturaleza. Un gen "foráneo" se refiere a un gen no encontrado normalmente en el organismo hospedero, pero que se introduce en el organismo hospedero mediante transferencia génica. Los genes foráneos pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. El término "genoma" como se aplica a células de una planta abarca no solamente el DNA cromosómico encontrado dentro del núcleo, sino el DNA de organelo encontrado dentro de componentes subcelulares (por ejemplo, mitocondrios o plástida) de la célula. Un "gen optimizado de codón" o "gen preferido de codón" es un gen que tiene su frecuencia de utilización de codón diseñada para imitar la frecuencia de la utilización de codón preferida de la célula hospedera. Un "alelo" es una de varias formas alternativas de un gen que ocupa una posición dada sobre un cromosoma. Cuando todos los alelos presentes en una posición dada sobre un cromosoma son los mismos esa planta es homocigota en esa posición. Si los alelos presentes en una posición dada sobre ??· cromosoma difieren esa planta es heterocigota en esa posición . El término "secuencia dé codificación" se refiere a una secuencia de polinucleótido que .codifica para una secuencia de aminoácidos especifica. "Secuencias reguladoras" se refieren a secuencias de nucleótidos ubicadas corriente arriba (secuencias de no codificación 5') dentro, o corriente abajo (secuencias de no codificación 3') de una secuencia de codificación, y que influencian la transcripción, procesamiento de RNA o estabilidad, o traducción de la secuencia de codificación asociada. La secuencias reguladoras pueden incluir, pero no estén limitadas a: promotores, secuencias guia de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitios de procesamiento de RNA, sitios de enlace efectores y estructuras de tallo-vuelta . El término "promotor" se refiere a una secuencia de RNA capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o RNA funcional. La secuencia de promotor consiste de elementos corriente arriba próximos y más distantes, los últimos elementos frecuentemente referidos como aumentadores. Por consiguiente, un "aumentador" es una secuencia de DNA que puede estimular la actividad del promotor, y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para aumentar el nivel o especificidad del tejido de un promotor. Los promotores pueden ser derivados en su totalidad de ' un gen nativo, o estar compuesto de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o aun comprender segmentos de DNA sintéticos. Es entendido por aquellos expertos en la técnica que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Además se reconoce que puesto que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamen e, los fragmentos de DNA de alguna variación pueden tener actividad de promotor idéntica. Los promotores que causan que un gen sea expresado en la mayoría de los tipos de células en la mayoría de las veces son comúnmente referidos como "promotores constitutivos". Nuevos promotores de varios tipos útiles en células de plantas están constantemente siendo descubiertos; numerosos ejemplos se pueden encontrar en la compilación por Okamuro & Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. El término "secuencia guia de traducción" se refiere a una secuencia de polinucleótido ubicada entre la secuencia de promotor de un gen y la secuencia de codificación. La secuencia guia de traducción está presente en el mRNA completamente procesado corriente arriba de la secuencia de inicio de traducción. La secuencia guia de traducción puede afectar el procesamiento del transcripto primario a mRNA, la estabilidad de mRNA o la eficiencia de traducción. Ejemplos de secuencias guia de traducción se han descrito (Turner & Foster (1995) Mol Biotechnol 3:225-236). Los términos "secuencias de no codificación 3'", "terminador de transcripción" o "secuencias de terminación" se refieren a una secuencia de DNA ubicadas corriente debajo de una secuencia de codificación e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento del mRNA o la expresión génica. La señal de poliadenilación es usualmente caracterizada al afectar la adición de tractos de ácido poliadenil ico al extremo 3' del precursor de mRNA. El uso de diferentes secuencias de no codificación 3' es ejemplificado por Ingelbrecht y colaboradores, (1989) Plant Cell 1:671-680. El término "transcripto de RNA" se refiere a un producto que resulta de la t anscripción catalizada con RNA polimerasa de una secuencia de DNA. Cuando el transcripto de RNA es una copia complementaria perfecta de la secuencia de DNA, éste es referido como el transcripto primario. Un transcripto de RNA es referido como el RNA maduro cuando es una secuencia de RNA derivada del procesamiento post-transcripcional del transcripto primario. "RNA mensajero" o "mRNA" se refiere al RNA que está sin intrones y que puede ser traducido en proteina por la célula. "cDNA" se refiere a un DNA que es complementario a, y sintetizado de, una plantilla de mRNA utilizando la transcriptasa inversa de enzima. El cDNA puede ser de una sola hebra o convertido en forma de doble hebra utilizando el fragmento Klenow de DNA polimerasa I. RNA de "sentido" se refiere al transcripto de RNA que incluye el mRNA y puede se transducido en proteina dentro de una célula o in vitro. "RNA de antisentido" se refiere a un transcripto de RNA que es complementario o parte de un transcripto primario objetivo o mRNA, y que bloquea la expresión de un gen objetivo (patente norteamericana 5,107,065). La complementariedad de un RNA de antisentido puede ser con cualquier parte del transcripto de gen especifico, es decir, en la secuencia de no codificación 5' , la secuencia de no codificación 3', intrones o la secuencia de codificación. "RNA funcional" se refiere al RNA de antisentido, RNA de ribosima u otro RNA que no puede ser traducido pero que todavía tiene un efecto sobre los procesos celulares. Los términos "complemento" y "complemento inverso" se utilizan intercambiablemente en la presente con respecto a los transcriptos de mRNA, y se proponen para definir el RNA de antisentido del mensaje. El término "operablemente enlazado" se refiere a la asociación de las secuencias de ácido nucleico sobre un solo fragmento de ácido nucleico de modo que la función de uno es regulada por el otro. Por ejemplo, un promotor es operablemente enlazado con una secuencia de codificación cuando es capaz de regular la expresión de esa secuencia de codificación (es decir, la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias de codificación pueden ser operablemente enlazadas a secuencias reguladoras en una orientación de sentido o de antisentido. En otro ejemplo, las regiones de RNA complementarias de la invención pueden ser operablemente enlazadas, ya sea directamente o indirectamente, 5' al mRNA objetivo, o 3' al mRNA objetivo, o dentro del mRNA objetivo, o una primera región complementaria es 5' y su complemento es 3' al mRNA objetivo. Las técnicas de DNA recombinante y de clonación molecular estándares utilizadas en la presente son bien conocidas en la técnica y son descritas más completamente en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989). Los métodos de transformación son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica y son descritos infra. "PC " o "reacción en cadena de polimerasa" es una técnica para la síntesis de segmentos de DNA específicos y consiste de una serie de ciclos repetitivos de desnaturalización, recocido y extensión. Típicamente, un DNA de doble hebra se desnaturaliza con calor, los dos cebadores complementarios a los límites 3' del segmento objetivo se reconocen a baja temperatura y luego se extienden en una temperatura intermedia. Un conjunto de estas tres etapas consecutivas es referido como un "ciclo". El término " recombinante" se refiere a una combinación artificial de dos segmentos separados de otra manera de la secuencia, mediante la síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácido nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética. Los términos "plásmido", "vector" y "cásete" se refieren a un elemento extra cromosómico que lleva frecuentemente genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y usualmente en la forma de fragmentos de DNA de doble hebra circulares. Tales elementos pueden ser secuencias autónomamente replicantes, secuencias integrantes del genoma, secuencias de fago o de nucleótidos lineales o circulares, de DNA de una sola o doble hebra o RNA, derivado de cualquier fuente, en el cual un número de secuencias de nucleótido se han unido o recombinado en una construcción única que es capaz de introducir un fragmento de promotor y la secuencia de DNA para un producto de gen seleccionado junto con la secuencia no traducida 3' apropiada en una célula. "Cásete de transformación" se refiere a un vector especifico que obtiene un gen foráneo y que tiene elementos además del gen foráneo que facilita la transformación de una célula hospedera particular. "Cásete de expresión" se refiere a un vector especifico que contiene un gen foráneo y que tiene elementos además del gen foráneo que permite la expresión de ese gen en un hospedero foráneo. Los términos "construcción recombinante" , "construcción de expresión", "construcción quimérica", "construcción" y "construcción de DNA recombinante" se utilizan intercambiablemente en la presente. Una construcción recombinante comprende una combinación artificial de fragmentos de ácido nucleico, por ejemplo, secuencias reguladoras y de codificación que no se encuentran conjuntamente en la naturaleza. Por ejemplo, una construcción quimérica puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación que son derivadas de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero arregladas de una manera diferente que aquella encontrada en la naturaleza. Tal construcción puede ser utilizada por si misma o se puede utilizar en conjunción con un vector. Si se utiliza un vector, entonces la elección del vector es dependiente del método que será utilizado para transformar células hospederas como es bien conocido para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un vector de plásmido. La persona experta está bien consciente de los elementos genéticos que deben estar presentes sobre el vector con el fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células hospederas que comprenden cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados de la invención. La persona experta también reconocerá que diferentes eventos de transformación independientes pueden dar por resultado diferentes niveles y patrones de expresión (Jones y colaboradores, (1985) EMBO J 4:2411-2418; De Almeida y .colaboradores, (1989) Mol Gen Genet 218:78-86), y asi esos eventos múltiples deben ser clasificados con el fin de obtener lineas que exhiben el nivel de expresión y patrón deseados. Tal clasificación se puede realizar mediante el análisis de Southern del DNA, análisis de Northern de la expresión de mRNA, análisis de inmunomanchado de la expresión de proteina o análisis fenotipico, entre otros. El término "expresión" como se utiliza en la presente, se refiere a la producción de un producto de extremo funcional (por ejemplo, un mRNA o una proteina, en forma ya sea precursora o madura) .

El término "introducido" significa proporcionar un ácido nucleico, (por ejemplo, construcción de expresión) o proteína en una célula. Introducido incluye la referencia de incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica donde el ácido nucleico puede ser incorporado en el genoma de la célula, e incluye la referencia a la provisión transiente de un ácido nucleico o proteína a la célula. Introducido incluye la referencia a métodos de transformación estables o transientes, así como cruzamiento sexual. Así, "introducido" en el contexto de insertar un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, una construcción de DNA recombinante/construcción de expresión) en una célula, significa "transíección" o "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica donde el fragmento de ácido nucleico puede ser incorporado en el genoma de las células (por. ejemplo, cromosoma, plásmido, plástica o DNA mitocóndrico ) convertido en un replicón autónomo, o transientemente expresado (por ejemplo, mRNA transíectado ) . El término proteína "madura" se refiere a un polipéptido post-traduccionalmente procesado (es decir, uno del cual cualquiera de los pre- o propéptidos presentes en el producto de traducción primario sea removido) . Proteína "precursora" se refiere al producto primario de traducción de mRNA (es decir, pre- y propéptidos todavía presentes). Los pre- y propéptidos pueden ser, pero no están limitados a, señales de localización intracelular . El término "transformación estable" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en un genoma de un organismo hospedero, que incluye genomas tanto nucleares como organelares, que dan por resultado herencia genéticamente estable. En contraste, "transformación transiente" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo, u organelo que contiene DNA, de un organismo hospedero que da por resultado la expresión génica sin la integración o herencia estable. Los organismos hospederos que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados son referidos como organismos "transgénicos" . El término " transgénico" se refiere a una planta o una célula, que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. De preferencia, el polinucleótido heterólogo es establemente integrado dentro del genoma tal que el polinucleótido es pasado a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede ser integrado en el genoma solo o como parte de un producto de expresión. Transgénico se utiliza en la presente para incluir cualquier célula, línea de células, callo, tejido, parte de planta o planta, el genotipo del cual se ha alterado por la presencia de ácido nucleico heterólogo que incluye aquellos transgénicos inicialmente asi alterados, asi como aquellos creados por cruzas sexuales o propagación asexual del transgénico inicial. El término "transgénico" como se utiliza en la presente no abarca la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico ) mediante los métodos de reproducción de plantas convencionales o mediante eventos que ocurren naturalmente tal como la fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea . El término "planta" se refiere a plantas completas, órganos de plantas, tejidos de plantas, semillas, células de plantas, semillas y progenie de las mismas. Las células de plantas incluyen, sin limitación, células de semillas, cultivos de suspensión, embriones, regiones meristemáticas , tejido de callo, hojas, raices, retoños, gametofitas, esporofitas, polen y microesporas . Las partes de plantas incluyen tejidos diferenciados y no diferenciados que incluyen, pero no limitados a los siguientes: raices, tallos, retoños, hojas, polen, semillas, tejido de tumor y varias formas de células y cultivos (por ejemplo, células únicas, protoplastos , embriones y tejido de callo). El tejido de planta puede estar en planta o en un órgano de planta, cultivo de tejido o de células. El término "órgano de plantas" se refiere a un tejido de planta o un grupo de tejidos que constituyen una parte morfológicamente y funcionalmente distinta de una planta. El término "genoma" se refiere a lo siguiente: (1) el complemento completo del material genético (genes y secuencias de no codificación) que está presente en cada célula de un organismo, o virus u organelo; y/o (2) un conjunto completo de cromosomas heredado como una unidad (haploide) de un parental. "Progenie" comprende cualquier generación subsecuente de una planta. La presente invención se relaciona a un minicromosoma artificial de planta que comprende un centrómero funcional que contiene: (a) por lo menos dos arreglos de repeticiones en tándem de CentC en una orientación invertida en donde el primer arreglo comprende por lo menos cincuenta copias de CentC y el segundo arreglo comprende por lo menos cincuenta copias de CentC; y, (b) por lo menos una copia de un elemento retrotransposable, en donde el elemento retrotransposable está situado entre el primero y el segundo arreglo. De preferencia, el elemento retrotransposable se selecciona del grupo que consiste de CentA, CRM1 y CRM2. El cromosoma artificial comprende un centrómero funcional que tiene arreglos de repeticiones en tándem de CentC. Cada arreglo de repeticiones de CentC puede comprender por lo menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450 o 500 copias de CentC. Además, cada arreglo de repeticiones en tándem de CentC puede ser interrumpido por otro elemento de secuencia, incluyendo, pero no limitado a un retrotransposón , que es insertado entre las copias de CentC, o dentro de un elemento de CentC, o dentro de un retrotransposón, o cualquier otro elemento de secuencia en el arreglo. Los retrotransposones incluyen, pero no están limitados a, CentA, CRM1, CRM2. En la mayoría de las eucariotas, el centrómero, que es el sitio para la formación de cinetocoro y la unión del uso o eje en los cromosomas, está incrustado en la heterocroma tina . Los cromosomas de S. cerevisiae carecen de secuencias satélite y tienen centrómeros precisamente localizados, pequeños con unión del uso específico con ~125 bp de DNA (Blackburn & Szostak (1984) Ann Rev Biochem 53:163-194) . Sin embargo, los centrómeros de otros linajes fúngales incluyen arreglos de repeticiones más similares a aquellos encontrados en animales y plantas (Fishel y colaboradores, (1988) Mol Cell Biol 8:754-763) . En eucariotas superiores, estudios citológicos y bioquímicos demostraron una asociación física entre los DNAs satélite repetidos en tándem, regiones de centrómero y proteínas asociadas con centrómero específico (Henikoff y colaboradores, (2001) Science 293:1098-1102; Yu & Dawe (2000) J Cell Biol 151:131- 142) . A pesar de la carencia de porciones de secuencia universales, la mayoría de repeticiones satélites centroméricas tienen longitud unitaria notablemente similar entre los organismos (por ejemplo, la unidad satélite básica es de 171 bp en primates, 186 bp en el pez Sparus aurata, y 155 bp en el insecto Chironomus . pallidivittatus (Henikoff y colaboradores, (2001) Science 293:1098-1102) . Los centrómeros de plantas poseen repeticiones de longitud unitaria similares, por ejemplo, repetición 156 bp en el maíz (Ananiev y colaboradores, (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95:13073-13078), repetición 168 bp en el arroz (Dong y colaboradores, (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95:8135-8140), y repetición de 180 bp en ñrabidopsis (Copenhaver (2003) Chromosome Res 11:255-262). En Arabidopsis, los centrómeros típicamente contienen tractos de 2.8-4 Mb de secuencia satélite de 178 bp repetidas en- tándem (Hall y colaboradores, (2004) Curr Opin Plant Biol 7:108-114). En el maíz, un centrómero de cromosoma B supernumerario completamente funcional contiene aproximadamente 500 kb de repeticiones en tándem, en donde las supresiones parciales reducen la transmisión (Alfenito & Birchler (1993) Genetics 135:589-597) . Las dispersiones de cromosoma de maíz que contienen el cromosoma B supernumerario se hibridizaron con sondas de varios elementos repetitivos que incluyen CentC, CRM, y CentA, que localizaron a las regiones centroméricas sobre los cromosomas A. Estos elementos repetitivos, predominantemente encontrados cerca de los centrómeros del cromosoma A, hibridaron a muchos sitios distintos del centrómero sobre el cromosoma B (Lamb y colaboradores, (2005) Chromosoma 113:337-349) . Por lo menos dos ejemplos se desvian de la regla general de la formación de centrómeros sobre la base del DNA satélite centromérico. Primero, el funcionamiento aparentemente normal de los centrómeros extraños en híbridos somáticos o en líneas de introgresión de avena-maíz (Ananiev y colaboradores, (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95:13073-13078) es indicativo de la conservación de la función del centrómero y los complejos de proteína correspondientes. Todas las proteínas centroméricas que sustentan la función de un centrómero extraño que comprende el DNA satélite centromérico no relacionado son aparentemente proporcionadas por el hospedero (Jin y colaboradores, (2004) Plant Cell 16:571-81) . En Segundo, los neocentrómeros son una clase novedosa de centrómeros basados en DNA de no repetición recientemente descritos en humanos y Drosophila (Williams (1998) Nat Genet 18:30-37; Choo (1997) Am J Hum Genet 61:1225-1233) . Encontrados como derivados de cromosomas naturales que resultan de múltiples arreglos, cromosómicos , los neocentrómeros se forman en regiones de DNA aparentemente eucromáticas libres de las repeticiones típicamente asociadas con la función del centrómero. Los cromosomas con neocentrómeros tienen estabilidad mitótica o meiótica variable . La naturaleza y el funcionamiento del centrómero, todavía no es completamente entendido y requiere análisis adicional. Hasta la fecha, la mayoría de los cromosomas artificiales tienen centrómeros funcionales basados en los DNAs satélites centroméricos nativos. Es posible que las repeticiones de nudo, tal como 180 bp y 350 bp (TRI), se pueden utilizar como un componente de un neocentrómero . Se mostró que algunos nudos podrían adquirir función de centrómero en cromosomas de maíz meióticos, estos neocentrómeros comprendieron repeticiones en tándem de 180 bp y 350 bp solamente. El estudio de neocentrómeros en humanos y organismos inferiores ha descifrado un fenómeno previamente insospechado que representa la naturaleza dinámica del DNA centromérico (Choo y colaboradores, (1997) Am J Hum Genet . 61:1225-33) . En el núcleo de este fenómeno, se presenta que es no requerimiento de secuencia de DNA específica para la función del centrómero; más bien, una variedad de secuencias que pueden responder a la influencia epigenética apropiada aparecen para proporcionar esta función. Las caracterizaciones extensivas de las secuencias de centrómero han provenido de estudios en levadura, por ejemplo, S. cerevisa ie y S. pombe, y han definido elementos de centrómero de levadura funcionales y la organización. Por ejemplo, en centrómeros de S. cerevisa ie la estructura y función de tres regiones esenciales, CDEI, CDEII, y CDEIII, que totalizan 125 bp, o 0.006 - 0.06% de cada cromosoma fueron descritos (Carbón y colaboradores, (1990) New Biologist 2:10-19; Bloom (1993) Cell 73:621-624) . Los centrómeros de S. pombe están entre 40-100 kb y consisten de elementos repetitivos que comprenden 1-3% de cada cromosoma (Baum y colaboradores, (1994) Mol Cell Biol 5:747-761). Estudios subsecuentes demostraron que menos de 1/3 del centrómero de S. pombe nativo es suficiente para la función del centrómero (Baum y colaboradores, (1994) Mol Cell Biol 5:747-761) . En S. pombe, se mostró que una región de repetición invertida fue esencial para la función centromérica , pero ni el núcleo central ni un brazo de la repetición invertida sola confirió función. La supresión de una porción de las secuencias repetidas que flanquean el núcleo central no tiene efectos sobre las funciones de la segregación mitótica, o sobre la segregación meiótica de un minicromosoma a la progenie aploide, sino que drásticamente deterioró el mantenimiento mediado por el centrómero del emparejamiento de cromátidas hermanas de homólogos en la meiosis I. Hay variabilidad significante entre cada uno de los tres diferentes cromosomas en S. pombe, y el centrómero de cualquier cromosoma particular puede contener variabilidad significante a través de diferentes cepas de S. pombe . Sin embargo, la porción estructura de DNA básica, específicamente, las repeticiones invertidas, es un parámetro común del centrómero de S. pombe (Clarke y colaboradores, (1993) Cold Spring Harb Symp Quant Biol 58:687-695). Los centrómeros de eucariotas superiores son menos caracterizados. Los fragmentos de DNA que hibridan a regiones centroméricas en eucariotas superiores se han identificado, sin embargo, generalmente poco se muestra acerca de la estructura, organización y/o funcionalidad de estas secuencias. Sin embargo, el arroz es una excepción debido a su tamaño de centrómero diferente. Aunque algunos cromosomas de arroz tienen un centrómero similar en tamaño a aquellos en otras especies (>1 Mb) , los centrómeros de varios cromosomas son sorprendentemente pequeños y pueden ser completamente cubiertos por contiguos BAC construidos utilizando técnicas estándares. La secuenciación completa del centrómero de arroz 4 y 8 reveló la presencia de bloques invertidos de repeticiones en tándem centroméricas dentro del segmento cromosómico considerado el centrómero, similar a la estructura de repetición invertida observada en la levadura (Zhang y colaboradores, (2004) Nucí Acids Res 32:2023-2030; Wu y colaboradores, (2004) Plant Cell 16:967-976). En muchos casos las sondas para repeticiones de centrómeros se correlacionan con la ubicación del centrómero tanto citológicamente como genéticamente, con muchas de estas secuencias presentes como elemento satélite repetidos en tándem y secuencias repetidas dispersadas en arreglos que varían de 300 - 5000 kb en longitud (Willard (1990) Trends Genet 6:410-416) . La hibridación in sifcu ha mostrado que la repetición de 171 bp satélite alfoide que está presente en cada centrómero humano (Tyler-Smith y colaboradores, (1993) Curr Biol 390-397). Si estas repeticiones constituyen centrómeros funcionales todavía no es determinado, y se presenta que el DNA genómico es necesario para conferir heredabilidad al DNA. La transfección de líneas de células con satélites alfoides produjo nuevos cromosomas, sin embargo, estos nuevos cromosomas también contienen DNA del hospedero, que podría contribuir a la actividad del centrómero (Haaf y colaboradores, (1992) Cell 70:681-696; Willard (1997) Nat Genet 15:345-354). Además, los nuevos cromosomas pueden mostrar dispersión de DNA alfoide sobre su longitud completa pero tienen solamente una restricción centromérica , indicando que un bloque de DNA alfoide puede ser insuficiente para conferir función del centrómero. La caracterización genética de los centrómeros de las plantas ha utilizado el análisis de segregación de fragmentos de cromosoma, incluyendo el análisis de cepas trisómicas que llevan un fragmento telocéntrico genéticamente marcado (por ejemplo, Koornneef (1983) Genética 62:33-40). Los elementos repetitivos de centrómero de planta que son genéticamente (Richards y colaboradores, (1991)) o físicamente (Alfenito y colaboradores, (1993) Genetics 135:589-597; Maluszynska y colaboradores, (1991) Plant J 1:159-166) enlazados a un centrómero se han identificado, sin embargo, la importancia de estas secuencias que consideran la función del centrómero no ha sido completamente caracterizada funcionalmente . Los estudios citológicos en Arabidopsis thaliana han correlacionado estructura del centrómero con secuencias de repetición. El manchado con un agente de enlace de DNA fluorescente no específico, tal como 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), permite la visualización de los dominios de cromatina centroméricos en cromosomas de metafase. Una hibridación in situ fluorescente (FISH) sondeó a las secuencias de repetición pALI de 180 bp colocalizadas con la firma DAPI cerca de los centrómeros de todos los cinco cromosomas de Arabidopsis (Maluszynska y colaboradores, (1991) Plant J 1:159-166; Martinez-Zapater y colaboradores, (1986) Mol Gen Genet 204:417-423). ün papel funcional para pALI fue propuesto, sin embargo, estudios más recientes no han detectado etas secuencias cerca de los centrómeros de las especies estrechamente relacionadas a Arabidopsis (Maluszynska y colaboradores, (1993) Ann Botany 71:479-484).

Una especie probada, A. pumila se cree que es un amfidiploide derivado de una cruza de A. thaliana con otro cercano relativo (Maluszynska y colaboradores, (1991) Plant J 1:159-166; Price y colaboradores, (1995) in Arabidopsis, Somerville & Meyerowitz (eds) Cold Spring Harbor Press, NY) . Otra secuencia repetitiva pAtl2, genéticamente mapea dentro de 5cM de centrómeros de cromosoma 1 y la región central del cromosoma 5 (Richards y colaboradores, (1991) Nucí Acids Res 19:3351-3357), pero su papel en la función del centrómero queda para ser establecida. Las regiones de centrómero de planta están compuestas predominantemente de repeticiones especificas de centrómero, retrotransposones centroméricos y unos cuantos de otros elementos repetitivos que son principalmente dispersados a lo largo del genoma de la planta. Por ejemplo, las repeticiones centroméricas tales como CentO y CRR son conocidas del arroz. Cuatro elementos repetitivos de centrómeros se han descrito en maíz: CentA, CentC, CRM1 y CRM2 (SEQ ID NOSrl-4). En el maíz, el primer elemento especifico de centrómero repetido en tándem descubierto fue CentC (Ananiev y colaboradores, (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95:13073-13078). CentC forma múltiples arreglos en tándem de longitud variante, con algunos arreglos en tándem que comprenden hasta 1000 copias de la repetición CentC. La repetición en tándem de CentC interactúa con la proteína CENH3 en el nucleosoma centromérico . El elemento específico de centromero de maíz, CentA, aparece para ser un retrotransposón basado en su estructura y propiedades (Ananiev y colaboradores, (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95:13073-13078; GenBank AF078917) . Otro retrotransposón específico de centromero altamente conservativo del maíz, CRM2, se encontró en 2003 (Nagaki y colaboradores, (2003) Genetics 163:759-770; GenBank AY129008) . Un cuarto retrotransposón específico de centromero CRM1 (SEQ ID NO: 3) , se identificó mediante el análisis comparativo de las secuencias de DNA publicadas de dos clones BAC centroméricos de maíz (Nagaki y colaboradores, (2003) Genetics 163:759-770) y las secuencias de DNA genómicas de maíz patentadas (Ananiev (2005) no publicado) . Algo de homologías se puede detectar entre los elementos de repetición centroméricos de especies estrechamente relacionadas, tal como el sorgo y caña de azúcar (Miller y colaboradores, (1998) Genetics 150:1615-1623; Nagaki y colaboradores, (1998) Chromosome Res 6:295-302; Zwick y colaboradores, (2000) Am J Bot 87:1757-1764) ; y maíz y arroz (Ananiev .y colaboradores, (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95:13073-13078) ; Cheng y colaboradores, (2002) Plant Cell 14 : 1691-1704) . Además, los centrómeros de plantas contienen abundante retrotransposones (CR) , en cereales muchos de los elementos CR caen dentro de una clase filogenética altamente conservada de elementos Ty3/gypsy (Miller y colaboradores, (1998) Theor Appl Genet 96:832-839; Presting y colaboradores, (1998) Plant J 16:721-728; Langdon y colaboradores, (2000) Genetics 156:313-325). La homología de DNA es suficiente de modo que las sondas CR de sorgo o Brachypodium sylvaticum identifican los centrómeros en la mayoría o todos los cromosomas en cereales agronómicamente significantes tales como arroz, maíz, trigo, sorgo, cebada y centeno (Aragon-Alcaide y colaboradores, (1996) Chromosoma 105:261 -268; Jiang y colaboradores, (1996) Proc Nati Acad Sci USA 93:14210-14213; Miller y colaboradores, (1998) Theor Appl Genet 96: 832-839) . Los retrotransposones , también conocidos como elementos transposables clase I, consisten de dos subtipos, la repetición terminal larga (LTR) y los retrotransposones no -LTR. Los subtipos de repetición de terminal larga tiene LTRs directos que varían de -100 bp a arriba de 5 kb en tamaño. Los retrotransposones LTR además se clasifican en los grupos similares a Tyl-copia ( Pseudoviridae) y los similares a Ty3-gypsy (Metaviridae) basados en ambos de su grado de similitud de secuencia y el orden de productos génicos codificados. Los grupos Tyl-copia y Ty3-gypsy de retrotransposones son comúnmente encontrados en alto número de copias (hasta unos cuantos millones de copias por núcleo aploides) en plantas con genomas grandes. Los retrotransposones Tyl-copia son abundantes en especies que varían de algas unicelulares a briofitas, gimnospermas y angiospermas . Los retrotransposones Ty3-gypsy también se distribuyen ampliamente, incluyendo tanto gimnospermas y angiospermas. Los retrotransposones LTR constituyen aproximadamente 8% del genoma humano. Los retrotransposones no de LTR consisten de dos subtipos, elementos nucleares interdispersados largos (LINEs) y elementos nucleares interdispersados cortos (SINEs). Ellos también se pueden encontrar en altos números de copias (hasta 250,000) en especies de plantas. Los transposones de plantas, incluyendo retrotransposones, son revisados por Feschotte y colaboradores, (2002) Nat Rev Genet 3:329-341. Los retrotransposones de planta son revisados por Kumar & Bennetzen (1999) Ann Rev Genet 33:479-532. Los retrotransposones centroméricos son identificables basados en la clasificación unificada de elementos de transcripción inversa utilizados para estudios de filogenia y taxonomía. Los retroelementos completos y retrovirus incluyen dos o más estructuras de lectura abierta (ORFs) que codifican proteínas únicas o poliproteíñas . El orden de los genes en los elementos varía, pero son clasificados sobre la base de alineaciones de aminoácidos y residuos conservados claves o dominios dentro de los genes transcriptasa inversa (RT) , RNasa H15 (RH) , integrasa (INT) y proteasa aspártica (PR) y en un dominio similar a dedo de zinc de cisteina-histidina (CH) conservado. Los retroelementos también comprenden secuencias de repetición terminales largas (LTR) que flanquean la región interna del retroelemento . Cada familia de retrotransposones tiene diferentes LTRs, no hibridantes cruzadamente, y componentes dentro de una familia pueden variar (0-50%) en sus secuencias de LTR. En los procesos de transposición, los dos LTRs son usualmente idénticos en el tiempo de inserción, pero conforme pasa el tiempo las sustituciones pueden causar divergencia de la secuencia. Muchos retroelementos son conocidos, incluyendo retrotransposones específicos de centrómeros (ver, por ejemplo, SanMiguel y colaboradores, (1998) Nat Genet 20:43-45; Turcotte y colaboradores, (2001) Plant J 25:169-179; Feng y colaboradores, (2002) Nature 420:316; Nagaki y colaboradores, (2004) Nat Genet 36:138; Nagaki y colaboradores, (2003) Genetics 163:750-770: Wu y colaboradores, (2004) Plant Cell 16:967-976; Hansen & Haslop-Harrison (2004) Adv Bot Res 41:165-193) . Aun existe variación significante entre los centrómeros de diferentes cromosomas de maíz con respecto a su tamaño relativo y la composición de la repetición. En el CentC de maíz las agrupaciones pueden ser tan pequeñas como aproximadamente 100 kb, o más de aproximadamente 2000 kb en diferentes cromosomas, pero comúnmente en el intervalo de aproximadamente 200 kb a aproximadamente 300 kb. Dado el intervalo de tamaño inferior, es posible que una porción central completa de la región del centrómero de maíz podría ser encontrada dentro de un solo clon BAC . El polimorfismo estructural observado sugiere que un centrómero de maíz está compuesto de bloques funcionales redundantes, cada uno de los cuales puede ser capaz de soportar la función del centrómero. Una variación significante (por lo menos 10 veces) en los tamaños del centrómero como es definido por la longitud y/o número de copias de las repeticiones en tándem centroméricas de CentC se observa entre diferentes cromosomas de maíz. También hay una variación significante en el tamaño del centrómero entre los cromosomas homólogos de diferentes líneas endogámicas. En otro aspecto, el minicromosoma artificial de planta de la invención puede comprender por lo menos un telómero funcional. Los telómeros son terminaciones de nucleoproteína en los extremos de los cromosomas eucarióticos lineales esenciales para el mantenimiento del extremo cromosómico. La síntesis de DN/A de telómero se hace mediante telomerasa, una ribonucleoproteína con actividad de transcriptasa inversa (McKnight y colaboradores, (2002) Plant Mol Biol 48:331-337). La telomerasa adiciona DNA telomérico sobre los extremos 3' de los cromosomas al copiar una secuencia de plantilla corta dentro de sus subunidades de RNA. Los telómeros de la mayoría de los organismos consisten de secuencias repetidas asimétricas cortas altamente conservadas. Muchas secuencias de repetición teloméricas son conocidas, incluyendo CCCCAA (C4A2, Tetrahymena & Paramecium) ; C4A4 {Oxytricha & Euplotes) ; C3TA {Trypanosoma , Leish ania, & Physarum) ; C1-3A ( Saccharomyces) ; Ci_8T (Dictyostelium) ; y C3TA3 (Arabidopsis, humano, ratón, Caenrhabditis) . El número de repeticiones observadas en cromosomas nativos varía ampliamente entre los organismos, por ejemplo, algunos ciliados tienen aproximadamente 50 repeticiones, menos de 350 repeticiones se han observado en Arabidopsis, y repeticiones que totalizan aproximadamente 300-500 bp se observaron en Saccharomyces . La longitud del telómero en plantas, que típicamente varía de aproximadamente 2-75 kb, es controlado mediante factores genéticos y de desarrollo. Las regiones teloméricas se han aislado de Arabidopsis, y muestran repeticiones en tándem heterogéneas en tamaño (Richards & Ausubel (1988) Cell 53:127-136). Una diferencia de 25 veces en las longitudes de los telómeros entre las líneas endogámicas de maíz se encontró, que varía de menos de 2 kb para la línea WF9 a aproximadamente 40 kb para la línea CM37 (Burr y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:953-960). Más cercano hacia el centrómero, la repetición de telómero canónica es frecuentemente encontrada mezclada con otros elementos repetitivos del genoma de la planta. En contraste, Drosophila usa transposones en los extremos de sus cromosomas. Los transposones, elementos HeT-A y TART se encuentran en múltiples copias al final de cada cromosoma. El acortamiento gradual de los telómeros se puede revertir mediante la transposición de nuevas repeticiones de transposón a los extremos. Similar al mantenimiento del telómero por la telomerasa, el modelo para transposición en Drosophila invoca un mecanismo utilizando un intermediario de transposición de RNA que se convierte en DNA de extremo mediante transcriptasa inversa. La replicación de DNA es el proceso mediante el cual las células hacen una copia completa de su información genética antes de la división celular. En E. coli, los virus de mamíferos, y S. cerevisiae, la iniciación de la replicación de DNA es controlada al transaccionar las proteínas iniciadoras que interactúan con las secuencias replicadoras de DNA de acción cis. Para S. cerevisiae, los replicadores abarcan 100-200 bp e incluyen los mayores sitios de origen de replicación donde comienza la síntesis de DNA. Estos replicadores contienen una secuencia replicante autónoma (ARS) de 11 bp conservada que enlaza el complejo de reconocimiento de origen (ORC) para nuclear la formación de complejos de prereplicación (Gilbert (2001) Science 294:96- 100) . En eucariotas superiores la replicación de DNA se puede iniciar simultáneamente en cientos o miles de sitios cromosómicos . Las secuencias de origen definidas no son requeridas, muchos orígenes de replicación potenciales existen que consisten de zonas amplias de sitios de iniciación estrechamente espaciados, algunos de los cuales se pueden utilizar más frecuentemente. Sin embargo, varios orígenes de replicación eucarióticos específicos son conocidos tal como el origen de replicación para rDNA 18S-26S que está localizado en un espaciador no transcrito (Ivessa & Zakian (2002) Genes Dev 16:2459-2 64) . Esta región es capaz de promover la amplificación de construcciones transgénicas (Hemann y colaboradores, (1994) DNA Cell Biol 13:437-445). Otro origen específico se encuentra en la región corriente abajo del gen dihidrofolato reductasa (DHFR) en células de ovario de hámster Chino (CHO) (Altman & Fanning (2001) Mol Cell Biol 21:1098-1110). Sitios preferenciales de iniciación de replicación también se encontraron en el segmento de cromosoma de Drosophila que contiene genes coriónicos (Levine & Spradling (1985) Chromosoma 92:136-142). La maquinaria de replicación de las células de plantas y animales es probablemente capaz de replicar cualquier tipo de DNA introgresado, incluyendo construcciones integradas, episomas, cromosomas completos, o sus fragmentos (Gilbert (2001) Science 294:96-100). Los minicromosomas artificiales son moléculas de DNA lineales o circulares construidas de elementos de secuencia de DNA de acción cis responsables para la replicación apropiada y el particionamiento de cromosomas a células fijas. Los elementos de acción cis incluyen: orígenes de replicación (ori), los sitios para iniciación de replicación de DNA, también conocidas como secuencias de replicación autónomas (ARS) ; centrómeros, los sitios del ensamble de cinetocoro para la segregación apropiada de cromosomas replicados en mitosis y meiosis; y telómeros, estructuras de repetición de DNA especializadas que estabilizan los extremos de los cromosomas lineales y facilitan la replicación completa de los extremos de cromosoma . Varias estrategias para producir minicromosomas eucarióticos están disponibles, incluyendo pero no limitadas al auto-ensamble in vivo de un minicromosoma de elementos componentes mediante la maquinaria de mantenimiento de cromosoma celular endógeno en la célula eucariótica, ensamble de un minicromosoma eucariótico de elementos componentes en una célula procariótica y ensamble in vitro de un minicromosoma eucariótico de elementos componentes. Los minicromosomas artificiales fueron primero construidos en Saccharo yces cerevisiae (Murray y colaboradores, (1985) Mol Cell Biol 6:3166-3172; Blackburn & Szostak (1984) Ann Rev Biochem 53:163-194). Un plásmido circular que comprende el centrómero de 125 bp de levadura, un origen de replicación, un marcador seleccionable y un arreglo palindrómico de dos estiramientos de DNA telomérico se ensambló mediante técnicas de DNA recombinantes convencionales y se introdujo en levadura mediante transformación de esferoplasto donde se resolvió en una molécula lineal simple. Las construcciones lineales de 50 kb en longitud que contienen un centrómero, un origen de replicación, y dos telómeros se replicaron y se segregaron en mitosis ~99% de precisión, y se retuvieron al dividir los cultivos por al menos 20 generaciones. La generación de YACs indicó el potencial para ensamblar cromosomas artificiales en otras eucariotas tales como plantas y animales. Los experimentos sobre YACs indicaron que tres secuencias de DNA de acción cis son necesarias para construir un cromosoma artificial: telómeros; origen (es) de replicación y un centrómero . Los cromosomas artificiales de animales se han generado por dos diferentes procedimientos: generación de cromosomas de novo a partir de segmentos de DNA clonados; o mediante la fragmentación y rearreglo de un cromosoma natural (Brown y colaboradores, (2000) Trends Biotechnol 18:402-403; Cooke (2001) Cloning Stem Cells 3:243-249; Lipps y colaboradores, (20030 Gene 304:23-33). El procedimiento de novo, referido como el ensamble o procedimiento de fondo-arriba, genera cromosomas artificiales al combinar componentes clonados esenciales. La co-transfección de -una mezcla de DNA alfoide humano, telómeros, DNA genómico humano y un marcador seleccionable en células HT1080 dio por resultado la formación de minicromosomas (Harrington y colaboradores, (1997) Nat Genet 15:345-355). La caracterización de los minicromosomas reveló que ellos han tenido estructura citogenéticas complejas, y se mantuvieron establemente en la ausencia de cualquier selección. Se concluyó que los minicromosomas y sus centrómeros se formaron de novo a partir del DNA de entrada por la vía de .rearreglos complejos. Subsecuentemente, otros grupos también utilizaron células HT1080 para introducir construcciones de DNA lineales o circulares que contienen DNA alfoide humano y telómeros clonados en YACs, PACs o BACs (Compton y colaboradores, (1999) Nucleic Acids Res 27:1762- 1765; Grimes y colaboradores, (2001 ) EMBO Rep 2:910-914). Los minicromosomas se observaron con diferentes frecuencias y mostraron diferente estabilidad mitótica. Todos los minicromosomas producidos fueron significativamente más grandes que las construcciones originales, que varían de 5 a 10 Mb . Por lo tanto, un cromosoma de mamífero completamente funcionando podría ser generado iniciando con el DNA clonado que sirve como una estructura principal para el ensamble de novo. La fragmentación y el rearreglo de cromosomas naturales que retienen el centrómero y las regiones teloméricas es otra estrategia para la producción de minicromosomas . Los fragmentos de cromosoma pequeños pueden ser aislados mediante la electroforesis de gel en campo de impulsos, readaptados con genes deseables y reintroducidos en la célula hospedera. Los minicromosomas fragmentados se observaron en células de cáncer, y otros tipos de células después de irradiación, sin embargo, los fragmentos fueron muy grandes para el aislamiento y no hubo manera de controlar la composición del gen. Un procedimiento para controlar la reducción del tamaño del cromosoma se basó en la f agmentación del cromosoma asociado con telómero (TACF) o el truncamiento dirigido al telómero (TDT) (Heller y colaboradores, (1996) Proc Nati Acad Sci USA 93:7125-7130; Shen y colaboradores, (1997) Hum Mol Genet 6:1375-1382) . Éste involucra la fragmentación sucesiva de cromosomas del hospedero humano específicos en minicromosomas más pequeños utilizando un vector de dirección que abarca un segmento de telómero terminal, un marcador seleccionable y algunas veces una región de homología al cromosoma objetivo. Los "minicromosomas diseñados" resultantes permanecen autónomos y se segregan normalmente. Los minicromosomas tan pequeños como 0.5 Mb se han generado conteniendo DNA alfoide como la secuencia de centrómero funcional en humano, lineas híbridas de células somáticas de hámster-humano o células de pollo. Recientemente, los cromosomas artificiales humanos se utilizaron para crear becerros clonados transcromosómicos que producen inmunoglobulina humana. Un vector de minicromosomas humano (HAC) construido mediante translocaciones de cromosoma mediadas por Cre/loxP y truncamientos de cromosoma dirigidos al telómero en células DT40 de pollo proficientes de recombinación homologa se introdujo en fibroblastos fetales primarios bovinos mediante la transferencia de cromosoma mediada por microcélulas (MMCT) . Los núcleos aislados de fibroblastos fetales con HAC se transfirieron en oocitos maduros enucleados para producir becerros clonados (Kuroiwa y colaboradores, (2002) Nat Biotechnol 20:889-894). Un procedimiento in vivo para la generación de cromosomas artificiales se ha desarrollado, basado en la inducción de los mecanismos de amplificación a gran escala, intrínsecos de células mamíferas. La integración dirigida de DNA satélite centromérico y el especiador no transcrito del rDNA sobre un cromosoma específico dio por resultado la purificación a gran escala de regiones centroméricas . Estos cromosomas amplificados llegaron a ser inestables y se sometieron a rearreglos significantes que producen minicromosomas estables preferencialmente compuestos de DNA satélite (Kereso y colaboradores, (1996) Chromosome Res 4:226-239; Hadlaczky (2001) Curr Opin Mol Ther 3:125-132) . Un cromosoma artificial que contiene múltiples sitios aceptadores de recombinación específicos de secuencia se desarrolló (plataforma ACE) . Las secuencias de interés se proporcionan en un vector de dirección, y la enzima lambda integrasa se utilizó para catalizar la recombinación entre la plataforma ACE y el vector de dirección. Procesos similares se han observado en plantas. La fragmentación espontánea de cromosomas nativos en plantas se ha observado. Los minicromosomas se descubrieron en Arabidopsis (Murata y colaboradores, (2006) Chromosoma, publicada en línea el 11 de Abril del 2006) , y maíz (Brock & Pryor (1996) Chromosoma 104:575-584; Kato y colaboradores, (2005) Cytogenet Genome Res 109:156-165). En algunos casos los minicromosomas se indujeron mediante la radiación ionizante (Riera-Lizarazu y colaboradores, (2000) Genetics 156: 327-339) . Un mapa físico del centrómero 5 de arroz se ha construido y podría ser utilizado para crear un cromosoma artificial de arroz (Nonomura & Kurata (2001) Chromosoma 110:284-291). Un procedimiento similar fue propuesto para la construcción de un cromosoma artificial para remolacha, Beta procumbens (Gindullis y colaboradores, (2001) Genome 44:846-855). La concatemeri zación de construcción transgénica, ligaciones y rearreglos se pueden encontrar en eventos de transformación de plantas. La transformación de plantas general con construcciones estándares pueden producir rearreglos complejos, concatamerización y amplificación de construcción (Svitashev & Somers (2001 ) Genome 44:691-697; Svitashev y colaboradores, (2002) Plant J 32:443-445). La co-transformación de plantas con múltiples plásmidos puede producir posiciones transgénicas que contienen combinaciones de los diferentes transgenes (Wu y colaboradores, (2002) Transgenic Res 11:533-541). Similar a los estudios en células de animales, el ensamble de novo de minicromosomas artificiales por la vía de la concatemeri zación espontánea y la ligación de componentes puede ocurrir en células de plantas (ver las Figuras 1-10 y 14-15) . La presente invención se relaciona a un minicromosoma artificial de planta que comprende un centrómero funcional, en donde el centrómero específicamente enlaza a la proteína C centromérica . Los cinetocoros enlazan el DNA centromérico al aparato de fibra del huso. Los autoanticuerpos humanos que enlazan específicamente centrómeros cercanos facilitaron la clonación de las proteínas asociadas al centrómero (CENPs, Rattner (1991) Bioassays 13:51-56). Por lo menos una de estas proteínas pertenece a la superfamilia quinesina de motores de microtúbulo (Yen (1991) EMBO J 10:1245-1254). Las proteínas que enlazan el centrómero de levadura se han identificado a través de estudios genéticos y bioquímicos (Bloom (1993) Cell 73:621-624; Lechner y colaboradores, (1991) Cell 64:717-725). CENH3 es una proteína altamente conservada que reemplaza la histona H3 en centrómeros, se cree que reclutan otras proteínas requeridas para el movimiento del cromosoma. CENH3 está presente por todo el ciclo celular y se colocaliza con la proteína C centrómerica de cinetocoro (CENPC) en células meióticas . Los anticuerpos específicos a las proteínas asociadas al centrómero se pueden utilizar para confirmar el ensamble del centrómero a una construcción de DNA y/o minicromosoma . La inmunolocalización de un CENP, tal como CENH3 y/o CENPC, al centrómero de un minicromosoma indica la formación de un centrómero funcional comprendido de elementos de DNA centroméricos y las proteínas de enlace asociadas. El antisuero a la histona H3 centromérica de maíz (CH3, 17kD) se hizo y se probó sobre cromosomas de maíz nativos (Zhong y colaboradores, (2002) Plant Cell 14:2825-2836). La inmunoprecipitación de cromatina demostró que CentC y CRM2 interactúan específicamente con CENH3. Aproximadamente 38 y 33% de CentC y CRM2 se precipitaron en el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina, confirmando que mucho de CENH3 se colocaliza con CentC. Un homólogo de maíz de CENPC mamífero se aisló por Dawe y colaboradores, ( (1999) Plant Cell 11:1227-1238) y se mostró que es un componente del cinetocoro en maíz. Un péptido conservado de 20 aminoácidos del dominio amino terminal se utilizó para producir antisuero específico al CENPC de maíz, que se marcó directamente y se utilizó para demostrar que CENPC es específicamente localizada al centrómero de minicromosomas nativos y artificiales en el maíz (ver, por ejemplo, las Figuras 3, 4, 8, y 10) . Los elementos de repetición centrómericos CentA, CentC, CRM1 y CRM2 incluyen secuencias que son sustancialmente idénticas a las secuencias de maíz para CentA, CentC, CRM1, y CRM2 de SEQ ID NOs:l-4. Secuencias sustancialmente idénticas incluyen secuencias que tienen una alta homología entre sí como es e emplificado por tener por ciento de identidad de secuencia significante y/o al hibridar selectivamente bajo condiciones severas a una CentA, a CentC, a CRM1 o un CRM2 (SEQ ID NOs:l-4), o un complemento de las mismas. Las secuencias que selectivamente hibridan bajo condiciones de hibridación severas, incluyen secuencias que hibridan a la secuencia objetivo por lo menos dos veces sobre el antecedente y para la exclusión sustancial de ácidos nucleicos no objetivo. Las secuencias selectivamente hibridantes típicamente tienen aproximadamente por lo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad de secuencia a la secuencia objetivo. Cualquiera de las condiciones de hibridación adecuadas y soluciones reguladoras conocidas en la técnica se pueden utilizar, ejemplos de las cuales se han descrito en la presente. La identidad de secuencia se puede utilizar para comparar la estructura primaria de dos secuencias de polinucleótido o polipéptido. La identidad de secuencia mide los residuos en las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para correspondencia máxima. Las relaciones de secuencia se pueden analizar utilizando algoritmos implementados en computadora. La relación de secuencia entre dos o más polinucleótidos , o dos o más polipéptidos se puede determinar al determinar la mejor alineación de las secuencias, y al registrar las igualaciones y los espacios en la alineación, lo cual produce el por ciento de identidad de secuencia y el por ciento de similitud de secuencia. Las relaciones de polinucleótidos también pueden ser descritas basadas en una comparación de los polipéptidos que cada uno codifica. Muchos programas y algoritmos para la comparación y análisis de secuencia son conocidos. A menos que se establezca de otra manera, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 (GCG, Accelrys, San Diego, CA) utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando un Peso, de GAP de 50 y Peso de Longitud de 3, y la matriz de registro en el nwsgapdna . cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando Peso de GAP de 8 y Peso de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:10915-10919) . GAP utiliza el algoritmo de Needleman & Wunsch (1970) J Mol Biol 48:443-453, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios. Sustancialmente idéntico incluye secuencias que tienen por lo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia, en donde las secuencias esperan que retengan la función nativa basada en el por ciento de identidad de secuencia total, la similitud de secuencia, la alineación total de secuencia primaria, la presencia de bloques conservados de residuos, la presencia de elementos conservados y/o dominios, la presencia de dominios funcionales conservados, la presencia de regiones de enlace, la presencia de residuos catalíticos, la estructura ( s ) secundaria y/o terciaria predicha, la disponibilidad de estructuras tridimensionales conocidas y otros criterios utilizados por uno de habilidad en la técnica para identificar y predecir un homólogo funcional de cualquier secuencia particular. Los polinucleotidos variantes incluyen polinucleotidos que tienen por lo menos una supresión, adición y/o sustitución en por lo menos un extremo 5' , extremo 3' y/o sitios internos que incluyen intrones o exones como es comparado con el polinucleót ido nativo. Los polinucleotidos variantes incluyen variantes que incluyen naturalmente asi como polinucleotidos sintéticamente .derivados, por ejemplo, aquellos generados utilizando la mutagénesis dirigida al sitio. Las variantes conservativas incluyen secuencias que mantienen su función, codifican el mismo polipéptido, o codifican un polipéptido variante con identidad, función y/o actividad sustancialmente similares como el polinucleótido nativo. Las variantes se pueden identificar con técnicas conocidas, por ejemplo, la reacción en cadena de polimerasa (PCR), y/o técnicas de hibridación. Generalmente, las variantes de un polinucleótido particular tendrán por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a ese polinucleótido particular. Los polinucleotidos variantes también se pueden evaluar mediante la comparación del por ciento de identidad de secuencia entre los polipéptidos codificados utilizando programas de alineación y parámetros estándares. Cuando se evalúa mediante la comparación del por ciento de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos que cada uno codifica, el por ciento de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es de manera típica por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia. Las proteínas variantes incluyen proteínas que tienen por lo menos una supresión, una adición y/o sustitución en por lo menos uno del extremo N-terminal, extremo C-terminal y/o un sitio interno, como es comparado con el polipéptido nativo. Las proteínas variantes poseen actividad biológica deseada de la proteína. Las variantes incluyen polipéptidos que ocurren naturalmente, así como aquellos generados mediante la manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína típicamente tienen por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos para la proteína nativa como es determinado por los programas de alineación de secuencia. Una variante biológicamente activa de una proteína puede diferir de esa proteína por tan pocos como 1-15 residuos de aminoácido. Las sustituciones conservativas generalmente se refieren al intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares. Por ejemplo, el modelo de Dayhoff y colaboradores, (1978) Atlas of Protein Sequence y Structure (Nati Biomed Res Found, Washington, D. C), proporciona la guia sobre sustituciones de aminoácidos que no se espera que afecten la actividad biológica de la proteína. Los polinucleótidos y proteínas variantes abarcan secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y/o recombinogénicos , tal como la mutagénesis y/o entremezclado de DNA. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son conocidos (ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc Nati Acad Sci USA 82:488-492; Kunkel y colaboradores, (1987) Methods Enzymol 154:367-382; patente norteamericana 4,873,192; Walker & Gaastra, eds . ' (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publ . Co., NY) y las referencias citadas en las mismas) . Por ejemplo, una o más de diferentes secuencias de codificación de recombinasa se pueden manipular para crear y seleccionar una nueva proteína de recombinasa que posee las propiedades deseadas. Típicamente, librerías de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de secuencias relacionadas y pueden ser recombinadas homólogamente in vitro o in vivo (ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri y colaboradores, (1997) Nat Biotechnol 15:436-438; Moore y colaboradores, (1997) J Mol Biol 272:336-347; Zhang y colaboradores, (1997) Proc Nati Acad Sci USA 94:4504-4509; Crameri y colaboradores, (1998) Nature 391:288-291; y las patentes norteamericanas 5,605,793, y 5,837,458). Generalmente, las modificaciones- en un polinucleótido que codifica un polipéptido no deben alterar la estructura de lectura o crear y/o alterar estructura secundaria de DNA o mRNA. Ver, la solicitud de publicación de patente europea No. 75,444. Los oligonucleótidos sobrepuestos, llamados overgos, son pares de cebadores que se extienden aproximadamente 40 bp en longitud y son usualmente constituidos de dos oligonucleótidos de 24 bp que tiene una región de sobreposición de 8 bp en los extremos 3' . Esta característica permite al par de cebadores del overgo cebar entre sí y sintetizar sus hebras complementarias con nucleótidos marcados por el método de llenado de Klenow (McPherson (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Vol . 4, pp. 207-213, ed. Birren y colaboradores, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . Una variedad de nucleótidos marcados pueden ser utilizados, incluyendo pero no limitados a nucleótidos marcados radioactivos o nucleótidos marcados fluorescentes. Esto es útil para la generación de sondas para diferentes métodos de hibridación, incluyendo, pero no limitados a la hibridación de colonias, manchados de puntos, manchados de Southern y la hibridación ín situ, tal como FISH. La ventaja mayor de las sondas overgo sobre las sondas convencionales para la hibridación de librería es que las secuencias para diseñar overgos pueden ser seleccionadas y así las secuencias repetidas presentes en una sonda de fragmento de DNA convencional se pueden evitar; por lo tanto, el problema de hibridación cruzada que está frecuentemente asociada con la clasificación de la librería de DNA de genoma grande se puede minimizar. Debido a esta ventaja, la hibridación de overgo combinada con la estrategia de acumulación de sonda (Cai y colaboradores, (1998) Genomics 54:387-397; Chang y colaboradores, (2001) Genetics 159:1231 -1242; Tao y colaboradores, (2001) Genetics 158:1711-1724; Romanov y colabo.radores , (2003) Cytogenet Genorae Res 101:277-281 ) ha emergido como un método para la clasificación de librería de BAC de alto rendimiento para identificación de clones y el mapeo físico de genes. En algunos ejemplos los genes o polipéptidos codificados que pueden aumentar o estimular el crecimiento de la célula se proporcionan con o dentro de la construcción (es ) de DNA. Los genes que aumentan o estimulan el crecimiento de la célula incluyen genes involucrados en la regulación transcripcional , regulación de gen homeótico, mantenimiento y proliferación de células madre, división celular y/o diferenciación celular tal como los homólogos WUS (Mayer y colaboradores, (1998) Cell 95:805-815; ' WO 01/0023.575; US200 /0166563) ; aintegumenta (ANT) (Klucher y colaboradores, (1996) Plant Cell 8:137-153; Elliott y colaboradores, (1996) Plant Cell 8:155-168; GenBank Acceso Nos. U40256, U41339, Z47554) ; clavata (por ejemplo, CLV1, CVL2, CLV3) (WO03/093450; Clark y colaboradores, (1997) Cell 89:575-585; Jeong y colaboradores, (1999) Plant Cell 11:1925-1934; Fletcher y colaboradores, (1999) Science 283:1911-1914) ; genes de región circundante de Clavata y del Embrión (por ejemplo, CLE) (Sharma y colaboradores, (2003) Plant Mol Biol 51:415-425; Hobe y colaboradores, (2003) Dev Genes Evol 213:371-381; Cock & McCormick (2001) Plant Physiol 126:939-942; Casamit j ana-Martinez y colaboradores, (2003) Curr Biol 13:1435-1441); baby boom (por ejemplo, BNM3, BBM, ODP1, ODP2) (WO00/75530; Boutileir y colaboradores, (2002) Plant Cell 14:1737-1749); Zwille (Lynn y colaboradores, (1999) Dev 126:469-481); cotiledón de hoja (por ejemplo, Lecl, Lec2) (Lotan y colaboradores, (1998) Cell 93:1195-1205; WO00/28058; Stone y colaboradores, (2001) Proc Nati Acad Sci USA 98:11806-11811; Patente norteamericana 6,492,577); sin Meristema de Retoño (STM) (Long y colaboradores, (1996) Nature 379:66-69) ; ultrapetala (ULT) (Fletcher (2001) Dev 128:1323-1333) ; quinasa de proteina activada con mitógenos (MAPK) (Jonak y colaboradores, (2002) Curr Opin Plant Biol 5:415) ; fosfatasa de proteina asociada con quinasa (KAPP) (Williams y colaboradores, (1997) Proc Nati Acad Sci USA 94:10467-10472; Trotochaud y colaboradores, (1999) Plant Cell 11:393-406) ; ROP GTPase (Wu y colaboradores, (2001) Plant Cell 13:2841-2856; Trotochaud y colaboradores, (1999) Plant Cell 11:393-406) ; fasciata (por ejemplo FAS1, FAS2 ) (Kaya y colaboradores, (2001) Cell 104:131-142) ; genes del ciclo celular (patente norteamericana 6,518,487; WO 99/61619; WO02/074909) , Shepherd (SHD) (Ishiguro y colaboradores, (2002) EMBO J. 21:898-908) ; Poltergeist (Yu y colaboradores, (2000) Dev 127:1661-1670; Yu y colaboradores, (2003) Curr Biol 13:179-188) ; Pickle (PKL) (Ogas y colaboradores, (1999) Proc Nati Acad Sci USA 96:13839-13844) ; genes knox (por ejemplo, KN1, KNAT1) (Jackson y colaboradores, (1994) Dev 120:405-413; Lincoln y colaboradores, (1994) Plant Cell 6:1859-1876; Venglat y colaboradores, (2002) Proc Nati Acad Sci USA 99:4730-4735) ; endosperma independiente de fertilización (FIE) (Ohad y colaboradores, (1999) Plant Cell 11:407-415), y los similares. Las combinaciones de polinucleótidos incluyen múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés, y las combinaciones pueden tener cualquier combinación de expresión de regulación hacia arriba y regulación hacia abajo de los polinucleótidos combinados. Las combinaciones pueden o no pueden ser combinadas sobre una construcción para la transformación de la célula hospedera, y por lo tanto se pueden proporcionar secuencialmente o simultáneamente. La célula hospedera puede ser una célula de tipo silvestre o mutante, en un estado normal o aneuploide. Los sistemas de recombinasa específicos del sitio se pueden utilizar con cualquier sistema de minicromosoma . Tanto las integrasas como las recombinasas capaces de catalizar ambas de las reacciones delantera y trasera, son útiles para introducir modificaciones después de que la construcción (es ) de DNA o minicromosoma se ha establecido en la célula de planta. Varias modificaciones intramoleculares, tal como supresión o inversión de secuencias definidas se pueden hacer. Además, las inserciones e intercambios intermoleculares se pueden hacer, incluyendo translocaciones con cromosomas endógenos que comprenden sitios de recombinación específicos del sitio compatibles. Los sistemas de recombinasa también se pueden utilizar para establecer sitios objetivos (sitios de acoplamiento) dentro del minicromosoma para la integración específica del sitio posterior del polinucleótido ( s ) de interés proporcionado por cualquier método, incluyendo el cruzamiento o el suministro directo . Los elementos de los sistemas de recombinación, tales como recombinasas, y sitios de recombinación se pueden utilizar, por ejemplo, en una construcción de DNA, un sitio objetivo y/o un cásete de transferencia. Un sitio objetivo comprende un polinucleótido integrado en el genoma, el polinucleótido que comprende un promotor operablemente enlazado a por lo menos un sitio de recombinación. Un cásete de transferencia comprende por lo menos un primer sitio de recombinación operablemente enlazado a un polinucleótido de interés y/o un polinucleótido que codifica un marcador de selección, en donde el primer sitio de recombinación es recombinogénico con un sitio de recombinación en el sitio objetivo. Una semilla o planta dirigida ha incorporado establemente en su genoma o una construcción de DNA que se ha generado y/o manipulado a través del uso de un sistema de recombinación. Los métodos de recombinación específicos del sitio que dan por resultado varios eventos de integración, alteración y/o escisión para generar la construcción de DNA mencionada se pueden emplear ¦ para generar una semilla dirigida. Ver, por ejemplo, W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855, W099/25853, WO99/23202, W099/55851, WO01/07572, WO02/08409 y WO03/08045. Una recombinasa es un polipéptido que cataliza la recombinación específica del sitio entre sus sitios de recombinación compatibles e incluye secuencias de recombinasa que ocurre naturalmente, variantes y/o fragmentos que retienen la actividad. Un sitio de recombinación es una secuencia de nucleótidos que es específicamente reconocido por una enzima recombinasa y abarca las secuencias del sitio de recombinación que ocurre naturalmente, variantes y/o fragmentos que retienen la actividad. Para revisiones de recombinasas especificas del sitio ver Sauer (1994) Curr Op Biotech 5:521-527; Sadowski (1993) FASEB 7:760-767; Groth & Calos (2004) J Mol Biol 335:667-678; y Smith & Thorpe (2002) Mol Microbiol 44:299-307. Cualquier sistema de recombinación, o combinaciones de sistemas, se puede utilizar incluyendo pero no limitados a recombinasas y sitios de recombinación de las familias integrasa y/o resolvasa, variantes y fragmentos biológicamente activos de las mismas y/o cualquier otra enzima que ocurre naturalmente o recombinantemente producida o variante de la misma que cataliza la recombinación especifica del sitio conservativa entre los sitios de recombinación especificados, y sitios de recombinación que ocurren naturalmente o modificados o variantes de los mismos que son específicamente reconocidos por una recombinasa para generar un evento de recombinación. Los sitios de recombinación empleados pueden ser sitios correspondientes o sitios distintos. Los sitios de recombinación correspondientes, o un conjunto de sitios de recombinación correspondientes, son sitios que tienen una secuencia de nucleótidos idéntica. Un conjunto de sitios de recombinación correspondientes, en la presencia de la recombinasa apropiada eficientemente recombinará entre sí. Los sitios de recombinación distintos de una secuencia distinta, que comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos como es comparada entre si. Los sitios de recombinación dentro de un conjunto de sitios de recombinación distintos pueden ser ya sea recombinogénicos o no recombinogénicos con respecto entre si. Cada sitio de recombinación dentro del conjunto de sitios distintos es biológicamente activo y puede recombinarse con un sitio idéntico. Los sitios recombinogénicos son capaces de recombinarse entre si en la presencia de una recombinasa apropiada. Los sitios recombinogénicos incluyen aquellos sitios donde la eficiencia de escisión relativa de recombinación entre los sitios recombinogénicos está arriba del limite detectable bajo condiciones estándares en un ensayo de escisión como es comparado con el control de tipo silvestre, típicamente, mayor que 2%, 5%, 10%, 20%, 50%, 100% o más grande. Los sitios no recombinogénicos no se recombinarán entre sí en la presencia de la recombinasa apropiada o la recombinación entre los sitios no es detectable. Los sitios de recombinación no recombinogénicos incluyen aquellos sitios que se recombinan entre sí en una frecuencia menor que el límite detectable bajo condiciones estándares en un ensayo de escisión como es comparado con el control de tipo silvestre, típicamente, menor que 2%, 1.5%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.075%, 0.005%, 0.001%. Cualquiera de los sitios de recombinación no recombinogénicos adecuados pueden ser utilizados, incluyendo un sitio FRT o variante activo del mismo, un sitio lox o variante activo del mismo, un sitio att o variante activo del mismo, cualquier combinación de los mismos, o cualquier otra combinación de sitios de recombinación no recombinogénicos . Los sitios de recombinación directamente repetidos en un conjunto de sitios de recombinación recombinogénicos se arreglan en la misma orientación, la recombinación entre estos sitios da por resultado la escisión de la secuencia de DNA de intervención. Los sitios de recombinación invertidos en un conjunto de sitios de recombinación recombinogénicos se arreglan en la orientación opuesta, la recombinación entre estos sitios da por resultado la inversión de la secuencia de DNA de intervención . La familia integrasa de recombinasas tiene arriba de cien miembros e incluye, por ejemplo, FLP, Cre, Dre, Int y R. Para otros miembros de la familia integrasa, ver por ejemplo, Esposito y colaboradores, (1997) Nucleic Acids Res 25:3605-3614; Nunes-Duby y colaboradores, (1998) Nucleic Acids Res 26:391-406; Abremski y colaboradores, (1992) Protein Eng 5:87-91; Groth & Calos (2004) J Mol Biol 335:667- 678; y Smith & Thorpe (2002) Mol Microbiol 44:299-307. Otros sistemas de recombinación incluyen, por ejemplo, phiC31 de bacteriófago de estreptomicete (Kuhstoss y colaboradores, (1991 ) J Mol Biol 20:897-908); bacteriófago ? (Landy (1989) Ann Rev Biochem 58:913-949, y Landy (1993) Curr Op Genet Dev 3:699-707); sistema de recombinación especifico del sitio SSV1 de Sulfolobus shibatae (Maskhelishvili y colaboradores, (1993) Mol Gen Genet 237:334-342); y un sistema de integración basdado en integrasa retroviral (Tanaka y colaboradores, (1998) Gene 17:67-76). En algunos ejemplos, la recombinasa es una que no requiere cofactores o un sustrato superenrollado. Tales recombinasas incluyen Cre, FLP, phiC31 Int, mutante ? Int, R, SSV1, Dre o variantes activas o fragmentos de los mismos. La recombinasa FLP cataliza una reacción especifica del sitio entre dos sitios FRT, y está involucrada en amplificar el número de copias del plásmido de dos mieras de S. cerevisiae durante la replicación de DNA. La proteina FLP se ha clonado y expresado. Ver, por ejemplo, Cox (1993) Proc Nati Acad Sci USA 80:4223-4227. La recombinasa FLP utilizada puede ser derivada del género Saccharomyces . En algunos ejemplos un polinucleótido sintetizado utilizando codones preferidos de planta que codifican la recombinasa es utilizado. La enzima FLP codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende codones preferidos de maíz (FLPm) que cataliza los eventos de recombinación especifico del sitio es conocida (patente norteamericana 5,929,301). Las variantes funcionales adicionales y fragmentos de FLP son conocidos. Ver, por ejemplo, Buchholz y colaboradores, (1998) Nat Biotechnol 16:617-618, Hartung y colaboradores, (1998) J Biol Chem 273:22884-22891, Saxena y colaboradores, (1997) Biochim Biophys Acta 1340:187-204, Hartley y colaboradores, (1980) Nature 286:860-864, Shaikh & Sadowski (2000) J Mol Biol 302:27-48, Voziyanov y colaboradores, (2002) Nucleic Acids Res 30:1656-1663, y Voziyanov y colaboradores, (2003) J Mol Biol 326:65-76. La recorabinasa Pl de bacteriófago Cre cataliza la recombinación especifica del sitio entre dos sitios lox. Ver, por ejemplo, Guo y colaboradores, (1997) Nature 389:40-46; Abremski y colaboradores, (1984) J Biol Chem 259:1509-1514; Chen y colaboradores, (1996) Somat Cell Mol Genet 22:477- 488; Shaikh y colaboradores, (1977) J Biol Chem 272:5695- 5702; y Buchholz y colaboradores, (1998) Nat Biotechnol 16:617-618. Las secuencias de polinucleótidos Cre también se pueden sintetizar utilizando codones preferidos de plantas, por ejemplo, moCre (ver, por ejemplo, O 99/25840), y otras variantes son conocidas ver por ejemplo Vergunst y colaboradores, ' (2000) Science 290:979-982, Santoro & Schulz (2002) Proc Nati Acad Sci USA 99:4185-4190, Shaikh & Sadowski (2000) J Mol Biol 302:27-48, Rufer & Sauer (2002) Nucleic Acids Res 30:2764-2771, ierzbicki y colaboradores, (1987) Mol Biol 195:785-794, Petyuk y colaboradores, (2004) J Biol Chem 279:37040-37048, Hartung & isters-Wolke (1998) J Biol Chem 273:22884-22891, Koresawa y colaboradores, (2000) J Biochem (Tokyo) 127:367-372, patente norteamericana 6,890,726, y Buchholz & Stewart (2001) Nat Biotechnol 19:1047-1052. Un homólogo Cre se ha identificado en fagos relacionados con Pl, la recombinasa aislada del fago D6 es conocido como Dre que es una tirosina recombinasa estrechamente relacionada con Cre, pero que reconoce distintos sitios rox de 32 bp (Sauer & McDermott (2004) Nucleic Acids Res 32:1-10) . La integrasa phiC31 y variantes son conocidos ( ushtoss y colaboradores, (1991) J Mol Biol 222:897-908, WO03/066867, WO05/017170, US2005 /0003540 , y Sclimenti y colaboradores, (2001) Nucleic Acids Res 29:5044-5051. La integrasa ? y cofactores (Hoess y colaboradores, (1980) Proc Nati Acad Sci USA 77:2482-2486, Blattner y colaboradores, (1997) Science 277:1453-1474) , y variantes de los mismos son conocidos, incluyendo las variantes Int independientes de cofactor (Miller y colaboradores, (1980) Cell 20:721-729, Lange-Gustafson y Nash (1984) J Biol Chem 259:12724-12732, Christ y colaboradores, (1998) J Mol Biol 288:825-836, y Lorbach y colaboradores, (2000) J Mol Biol 296:1175-1181) , variantes de reconocimiento del sitio att (Dorgai y colaboradores, (1995) J Mol Biol 252:178-188, Yagu y colaboradores, (1995) J Mol Biol 252:163-167, y Dorgai y colaboradores, (1998) J Mol Biol 277:1059-1070), asi como las secuencias Int, variantes y de cofactor optimizadas en codón de maíz ( O03/08045) . Otras integrasas y variantes son conocidas, tal como la integrasa HK022 (Kolot y colaboradores, (1999) Mol Biol Rep 26:207-213) y variantes tal como las variantes de reconocimiento del sitio att (Dorgai y colaboradores, (1995) J Mol Biol 252:178-188, Yagu y colaboradores, (1995) J Mol Biol 252:163-167, y Dorgai y colaboradores, (1998) J Mol Biol 277:1059-1070). Los sitios de recombinación de tipo silvestre, mutantes o cualquier combinación de sitios de tipo silvestre y/o mutantes pueden ser utilizados. Tales sitios de recombinación incluyen, por ejemplo, sitios lox de tipo silvestre, E'RT y att, y sitios lox mutante, FRT y att. Un análisis de la actividad de recombinación de los sitios lox mutante se presenta en Lee y colaboradores, (1998) Gene 216:55-65. Otros sitios de recombinación y variantes son conocidos, ver por ejemplo, Hoess y colaboradores, (1982) Proc Nati Acad Sci USA 79:3398-3402; Hoess y colaboradores, (1986) Nucleic Acids Res 14:2287-2300; Thomson y colaboradores, (2003) Génesis 36:162-167; Schlake & Bode (1994) Biochemistry 33:12746-12751; Siebler & Bode (1997) Biochemistry 36:1740-1747; Huang y colaboradores, (1991) Nucleic Acids Res 19:443-448; Sadowski (1995) in Progress in Nucleic Acid Research y Molecular Biology Vol. 51, p . 53-91; Cox (1989) in Mobile DNA, Berg & Howe (eds) American Society of Microbiology, Washington D. C, pp . 116-670; Dixon y colaboradores, (1995) Mol Microbiol 18:449-458; Umlauf & Cox (1988) EMBO J 7:1845-1852; Buchholz y colaboradores, (1996) Nucleic Acids Res 24:3118-3119; Kilby y colaboradores, (1993) Trends Genet 9:413-421; Rossant & Geagy (1995) Nat Med 1:592- 594; Bayley y colaboradores, (1992) Plant Mol Biol 18:353-361; Odell y colaboradores, (1990) Mol Gen Genet 223:369-378; Dale & Ow (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88:10558-10562; Qui y colaboradores, (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:1706-1710; Stuurman y colaboradores, (1996) Plant Mol Biol 32:901-913; Dale y colaboradores, (1990) Gene 91:79-85; Albert y colaboradores, (1995) Plant J 7:649-659, patente norteamericana 6,465,254, WO01/23545, W099/55851, y WO01/11058. En algunos ejemplos, conjuntos de sitios de recombinación distintos y correspondientes pueden ser utilizados, por ejemplo sitios de diferentes sistemas de recombinación. Por consiguiente, cualquier sitio de recombinación adecuado conjunto de sitios de recombinación puede ser utilizado, e incluyendo un sitio FRT, una variante biológicamente activa de un sitio FRT, un sitio lox, una variante biológicamente activa de un sitio lox, un sitio att, una variante biológicamente activa de un sitio att, cualquier combinación de los mismos, o cualquier otra combinación de sitios de recombinación. Ejemplos de sitios FRT incluyen, por ejemplo, el sitio FRT de tipo silvestre mínimo (FRT1), y varios sitios FRT mutantes, incluyendo pero no limitados a FRT5, FRT6, y FRT7 (ver la patente norteamericana 6,187,994). Los sitios FRT variantes adicionales son conocidos (ver, por ejemplo, WO01/23545 y la publicación norteamericana 2007/0015195, incorporados en la presente por referencia) .

Otros sitios de recombinación que se pueden utilizar incluyen los sitios att, tal como aquellos divulgados en Landy (1989) Ann Rev Biochem 58:913-949, Landy (1993) Curr Op Genet Dev 3:699-707, patente norteamericana 5,888,732, WO01/07572, y Thygarajan y colaboradores, (2001) Mol Cell Biol 21:3926-3934. La recombinasa ( s ) especifica del sitio utilizada depende de los sitios de recombinación en el sitio objetivo y el cásete de transferencia. Si se utilizan sitios FRT, se proporciona la recombinasa FLP, cuando se utilizan los sitios lox, se proporciona recombinasa Cre, cuando se utilizan sitios ? att, se proporciona ? Int cuando se utilizan sitios phiC31 att, se proporciona phiC31 Int. Si los sitios de recombinación utilizados comprenden sitios de diferentes sistemas, por ejemplo, un sitio FRT y un sitio lox, ambas actividades de recombinasa pueden ser proporcionadas, ya sea como entidades separadas, o como una recombinasa quimérica, por ejemplo, FLP/Cre (ver, por ejemplo, WO 99/25840) . Un marcador proporciona la identificación y/o selección de una célula, planta y/o semilla que expresa el marcador. Los marcadores incluyen, por ejemplo, marcador clasificable, visual y/o seleccionable . Un marcador de selección es cualquier marcador, que cuando se expresa en un nivel suficiente, confiere resistencia a un agente selectivo. Por ejemplo los marcadores visuales se pueden utilizar para identificar células transformadas que comprenden la construcción (es ) de DNA introducida. En un ejemplo, el marcador visual es una proteína fluorescente. Tales proteínas fluorescentes incluyen pero no están limitadas a proteína fluorescente amarilla (YFP) , proteína fluorescente verde (GFP) , proteína fluorescente de ciano (CFP) , y proteína fluorescente roja (RFP). En todavía otros ejemplos, el marcador visual es codificado por un polinucleót ido que tiene codones preferidos de maíz. En ejemplos adicionales, el marcador visual comprende GFPm, AmCyan, ZsAmarillo o DsRojo. Ver, Wenck y colaboradores, (2003) Plant Cell Rep. 22:244-251. Los marcadores de selección y sus agentes selectivos correspondientes incluyen, pero no están limitados a, genes de resistencia a herbicida y herbicidas; genes de resistencia antibiótico y antibióticos; y otros genes de resistencia a sustancias químicas con sus agentes químicos correspondientes. Los genes de resistencia a fármaco bacteriano incluyen, pero no están limitados a, neomicina fosfotransferasa II (nptll) que confiere resistencia a canamicina, paromicina, neomicina y G418, e higromicina fosfotransferasa (hph) que contiene resistencia a higromicina B. Ver también, Bowen (1993) Markers for Plant Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol . 1, Engineering y Utilization; Everett y colaboradores, (1987) Bio/Technology 5:1201-1204; Bidney y colaboradores, (1992) Plant Mol Biol 18:301-313; y . La resistencia también puede ser conferida a herbicidas de varios grupos, incluyendo inhibidores de síntesis de aminoácidos, inhibidores de fotosíntesis, inhibidores de lipido, reguladores de crecimiento, interruptores de la membrana celular, inhibidores de pigmento, inhibidores del crecimiento de plántulas, incluyendo, pero no limitados a imidazolinonas , sulfonilureás , tria zolopirimidinas , glifosato, setoxidim, fenoxaprop, glufosinato, fosf inotricina , triazinas, bromoxinil y los similares. Ver, por ejemplo, Holt (1993) Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 44:203-229; y Miki y colaboradores, (2004) J Biotechnol 107:193-232. Los marcadores de selección incluyen secuencias que confieren resistencia a herbicidas, incluyendo, pero no limitados a, el gen bar, que codifica fosf inotricina acetil transferasa (PAT) que confiere resistencia a glufosinato (Thompson y colaboradores, (1987) EMBO J 6:2519-2523); glifosato oxidoreductasa (GOX) , glifosato N-acetiltransferasa (GAT) , y 5-enol piruvilshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere resistencia a glifosato (Barry y colaboradores, (1992) in Biosynthesis y Molecular Regulation of Amino Acids in Plants, B. K. Singh y colaboradores, (Eds) pp.139-145; Kishore y colaboradores, (1992) Weed Tech 6:626-634; Castle (2004) Science 304:1151-1154; Zhou y colaboradores, (1995) Plant Cell Rep 15:159-163; WO97/04103; WO02/36782; y WO03/092360) . Otros marcadores de selección incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR), que confiere resistencia a metotrexato (ver, por ejemplo, Dhir y colaboradores, (1994) Improvements of Cereal Quality by Genetic Engineering, R.J. Henry (ed) , Plenum Press, New York; y Hauptmann y colaboradores, (1988) Plant Physiol 86:602-606). Las secuencias mutantes de acetohidroxiácido sintasa (AHAS o ALS) conducen a resistencia a imidia zolinonas y/o sulfonilureas tal como imazetapir y/o clorsulfurón (ver, por ejemplo, Zu y colaboradores, (2000) Nat Biotechnol 18:555-558; patentes norteamericanas 6,444,875 y 6,660,910; Sathasivan y colaboradores, (1991) Plant Physiol 97:1044-1050; Ott y colaboradores, (1996) J Mol Biol 263:359-368; y Fang y colaboradores, (1992) Plant Mol Biol 18:1185-1187). Además, los genes de resistencia química además incluyen triptófano decarboxilasa que confiere resistencia 4-metil triptófano (4-mT) (Goodijn y colaboradores, (1993) Plant Mol Biol 22:907-912); y bromoxinil nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinilo. El marcador de selección puede comprender cianamida hidratasa (Cah) , ver, por ejemplo, Greiner y colaboradores, (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88:4260-4264; y Weeks y colaboradores, (2000) Crop Sci 40:1749-1754. La enzima cianamida hidratasa convierte cianamida en urea, para de esta manera conferir resistencia a cianamida. Cualquier forma o derivados de cianamidas se puede utilizar como un agente de selección incluyendo, pero no limitado a, cianamida de calcio (Perlka® (SKW, Trotberg Alemania) y cianamida de hidrógeno (Dormex® (SKW)). Ver también, las patentes norteamericanas 6,096,947 y 6,268,547. Las variantes de polinucleótidos y/o polipéptidos de cianamida hidratasa retendrán la actividad de cianamida hidratasa . Una variante biológicamente activa de cianamida hidratasa retendrá la habilidad para convertir cianamida a urea. Los métodos para analizar tal actividad incluyen el análisis de la resistencia de plantas que expresan la cianamida hidratasa a cianamida. Ensayos adicionales incluyen el ensayo colorimétrico de cianamida hidratasa (ver, por ejemplo, Weeks y colaboradores, (2000) Crop Sci 40:1749-1754; y la patente norteamericana 6,268,547). La presente invención también se relaciona a un polinucleótido aislado que comprende: (a) por lo menos dos arreglos de repeticiones en tándem de CentC en una orientación invertida en donde el primer arreglo comprende por lo menos diez copias de CentC y el segundo arreglo comprende por lo menos diez copias de CentC; y, (b) por lo menos una copia de un elemento retrotransposicionable, en donde el elemento retrotransposicionable está situado entre el primero y el segundo arreglo. Los elementos retrotransposicionables adecuados son discutidos en lo anterior . También dentro del alcance de la invención está un polinucleótido aislado que comprende: (a) por lo menos un arreglo de repeticiones en tándem de CentC, el arreglo que comprende por lo menos diez copias de CentC; y, (b) por lo menos una copia de un elemento retrotransposicionable seleccionado del grupo que consiste de CentA, CR 1 y CRM2. En todavía otro aspecto, la presente invención se relaciona a un polinucleótido aislado que comprende: (a) por lo menos un arreglo de repeticiones en tándem de CentC, el arreglo que comprende por lo menos diez copias de CentC; y, (b) por lo menos una copia cada una de CentA, CR 1 y CRM2. Los polinucleótidos aislados comprenden por lo menos un arreglo de repeticiones en tándem de CentC. Cada arreglo de repeticiones de CentC puede comprender por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 260, 280 o 300 copias de CentC. Además, cada arreglo de repeticiones en tándem de CentC puede ser interrumpido por otro elemento de secuencia, que incluye pero no limitado a un retrotransposón , que es insertado entre copias de CentC, o dentro de un elemento de CentC, o dentro de un retrotransposón, o cualquier otro elemento de secuencia en el arreglo. Los retrotransposones incluyen, pero no están limitados a, CentA, CRM1 y CR 2.

Un polinucleótido incluye cualquier molécula de ácido nucleico, y comprende ribonucleótidos que ocurren naturalmente, sintéticos y/o modificados, deoxirribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y deoxirribonucleótidos . Los polinucleótidos abarcan todas las formas de secuencias que incluyen, pero no limitadas a, de una sola hebra, de doble hebra, lineales, circulares, ramificadas, de horquilla, estructuras de tallo-vuelta y los similares . También dentro del alcance de la invención está una construcción recombinante que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados de la invención. Una construcción de DNA recombinante comprende un polinucleótido que cuando está presente en el genoma de una planta es heterólogo o foráneo a esa ubicación cromosómica en el genoma de la planta. En la preparación de la construcción de DNA, varios fragmentos pueden ser manipulados para proporcionar las secuencias en una orientación apropiada y/o en la estructura de lectura apropiada. Adaptadores o enlazadores se pueden emplear para unir los fragmentos. Otras manipulaciones se pueden utilizar para proporcionar sitios de restricción convenientes, remoción de DNA superfluo o remoción de sitios de restricción. Por ejemplo, la mutagénesis in vitro, reparación de cebador, restricción, recocido, resustituciones, transiciones, transversiones o sistemas de recombinación pueden ser utilizados. Los polinucleótidos de interés se refieren a cualquier molécula de ácido nucleico incluida en la construcción ( es ) de DNA para cualquier propósito, incluyendo pero no limitada a regiones no traducidas, regiones reguladoras, regiones de iniciación de transcripción, regiones de iniciación de traducción, intrónes, exones, polinucleótidos que codifican un RNA, marcadores de selección, marcadores clasificables, marcadores fenotipicos, polinucleótidos que codifican una recombinasa, sitios de recombinación, sitios objetivo, cásete de transferencia, sitios de restricción, sitios de reconocimiento, aisladores, aumentadores , secuencias espaciadoras/rellenadoras, orígenes de replicación, secuencia telomérica, operadores y los similares, se pueden proporcionar en una construcción (es ) de DNA. La construcción puede incluir secuencias reguladoras 5' y 3' operablemente enlazadas a las secuencias apropiadas. La construcción (es) de DNA puede incluir en la dirección 5' a 3' de transcripción por lo menos uno de lo siguiente, una región de iniciación de transcripción y de traducción, el polinucleótido y una región de terminación de transcripción y de traducción funcional en plantas. Alternativamente, la construcción ( es ) de DNA puede carecer de por lo menos un elemento regulador 5' y/o 3' . Por ejemplo, la construcción (es ) de DNA se puede diseñar tal que la introducción en una célula y en la presencia de una recombinasa apropiada un evento de recombinación en el sitio objetivo operablemente enlaza las regiones reguladoras 5' y/o 3' a las secuencias apropiadas de la construcción ( es ) de DNA. Los elementos reguladores se .pueden utilizar en una variedad de maneras dependiendo del elemento de polinucleotido, sitio de recombinación, cásete de t ansferencia y/o sitio objetivo empleado. En algunos ejemplos, las secuencias de intervención pueden estar presentes entre los elementos operablemente enlazados y no interrumpir el enlace funcional. Por ejemplo, un enlace operable entre un promotor y un polinucleotido de interés permite al promotor iniciar y mediar la transcripción del polinucleotido de interés. En algunos ejemplos de un sitio de inicio de traducción es operablemente enlazado a un sitio de recombinación. En algunos ejemplos, un sitio de recombinación está dentro de un intrón. Un cásete puede contener adicionalmente por lo menos una secuencia adicional para ser introducida en la planta. Alternativamente, secuencia (s) adicionales se pueden proporcionar por separado. Las construcciones de DNA se pueden proporcionar con una pluralidad de sitios restricción o sitios de recombinación para la manipulación de los diversos componentes y elementos. Las construcciones de DNA adicionalmente pueden contener genes marcadores seleccionables .

Una región de iniciación transcripcional puede ser nativa, análoga o foránea o heterologa al hospedero de planta o al polinucleótido de interés, y puede ser una secuencia natural, una secuencia modificada o una secuencia sintética. Un número de promotores pueden ser utilizados para expresar una secuencia de codificación. Una variedad de promotores útiles en plantas es revisado en Potenza y colaboradores, (2004) In Vitro Cell Dev Biol Plant 40:1-22. En algunos ejemplos, el promotor que expresa el marcador de selección está activo en la semilla. Los promotores activos en la semilla incluyen promotores constitutivos, por ejemplo, el promotor de núcleo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos divulgados en W099/43838 y la patente norteamericana 6,072,050; el promotor 35S de CaMV de núcleo (Odell y colaboradores, (1985) Nature 313:810-812); el promotor MW de (virus de mosaico mirabilis) (Dey & Maiti (1999) Plant Mol Biol 40:771-782); actina de arroz (McElroy y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:163-171); ubicuitina (Christensen y colaboradores, (1989) Plant Mol Biol .12 : 619-632, y Christensen y colaboradores, (1992) Plant Mol Biol 18:675-689); pEMU (Last y colaboradores, (1991) Theor Appl Genet 81:581-588); MAS (Velten y colaboradores, (1984) EMBO J 3:2723-2730); promotor ALS (patente norteamericana 5,659,026), y los similares. Otros promotores constitutivos incluyen aquellos divulgados en, por ejemplo, las patentes norteamericanas 5,608,149; 5,508,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; y 6, 177, 611. El promotor puede ser un promotor preferido de tejido, para dirigir la expresión aumentada dentro de un tejido de planta particular. En algunos ejemplos, un promotor preferido de semilla se utiliza para expresar el marcador de selección. Los promotores preferidos de semilla incluyen tanto promotores específicos de semilla, activos durante el desarrollo de la semilla, así como promotores de germinación de semilla, activos durante la germinación de la semilla. Ver Thompson y colaboradores, (1989) BioEssays 10:108. Los promotores preferidos de semilla incluyen, pero no están limitados a, Ciml (mensaje inducido por citoquinina ) ; cZ19Bl (zeína de 19 kDa de maíz); milps (mio-inositol-l-fosfato sintasa) (ver WO00/11177, y la patente norteamericana 6,225,529), ß-faseolina de frijol, napina, ß-conglicinina , lectina de soya, cruciferina, zeína de 15 kDa, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa de maíz, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, endl y end2 (WO00/12733) , y los similares. Un promotor regulado químicamente se puede utilizar para modular la expresión a la semilla a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. El promotor puede ser un promotor inducible químicamente, donde la aplicación de la sustancia química induce la expresión génica, o un promotor reprimible químicamente, donde la aplicación de la sustancia química reprime la expresión génica. Los promotores inducibles químicamente incluyen, pero no están limitados a, el promotor In2-2 de maíz, activado por moderadores de herbicida de bencensulfonamida ; el promotor GST de maíz, activado por compuestos electrofílieos hidrofóbicos (por ejemplo, algunos herbicidas pre-emergentes ) y el promotor PR-la de tabaco, activado por ácido salicílico. Otros promotores regulados químicamente de interés incluyen promotores responsivos a esteroides (ver, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoide en Schena y colaboradores, (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88:10421-10425 y McNellis y colaboradores, (1998) Plant J 14:247-257) y promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina (ver, por ejemplo, Gatz y colaboradores, (1991) Mol Gen Genet 227:229-237, y las patentes norteamericanas 5,814,618 y 5, 789, 156) . La construcción (es) de DNA puede comprender unidades de expresión. Las unidades de expresión pueden tener elementos que incluyen, pero no están limitados a intrones, aumentadores , aisladores de guías, espaciadores, regiones que codifican un RNA, genes marcadores, sitios de recombinación, regiones de terminación, secuencias que codifican recombinasas , aumentadores, enlazadores, sitios de reconocimiento, etc. Además, las cons rucciones de DNA pueden comprender cásete de transferencia, sitios objetivos o cualquiera de las porciones o combinaciones de los mismos. La construcción ( es ) de DNA puede ser modificada de una variedad de maneras incluyendo pero limitado a métodos de recombinación/integración específicos del sitio o transposiciones basadas en transposón, para proporcionar un número de variaciones en la construcción (es ) de DNA. Las secuencias de polinucleótido se pueden modificar para la expresión en la planta. Ver, por ejemplo, Campbell & Gowri (1990) Plant Physiol 92:1-11. Los métodos para sintetizar genes preferidos de plantas incluyen, por ejemplo, las patentes norteamericanas 5,380,831, 5,436,391, y Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res 17:477-498. Las modificaciones de secuencia adicionales son conocidas que aumentan la expresión génica en un hospedero celular. Estos incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitio de empalme de exón-intrón, repeticiones similares a transposón, y otras de tales secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia se puede ajusfar a niveles promedio para un hospedero dado, como es calculado por referencia a los genes endógenos expresados en el hospedero. La secuencia también puede ser modificada para evitar estructuras de mRNA secundarias. Los casetes adicionalmente pueden contener secuencias guía 5' en el cásete de DNA que pueden actuar para aumentar la traducción. Las guías de traducción incluyen, por ejemplo, guías de pimaizeavirus tal como la guía EMCV (Elroy-Stein y colaboradores, (1989) Proc Nati Acad Sci USA 86:6126-6130); guías de potivirus tal como la guía TEV (Gallie y colaboradores, (1995) Gene 165:233-238), guía MDMV (Kong y colaboradores, (1988) Arch Virol 143:1791-1799) y la proteína de enlace de cadena pesada inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak y colaboradores, (1991) Nature 353:9094); la guía no traducida del mRNA de proteína de recubrimiento del virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling y colaboradores, (1987) Nature 325:622-625); guía de virus de mosaico de tabaco (TMV) (Gallie y colaboradores, (1989) in Molecular Biology of RNA, ed . Cech (Liss, New York) , pp. 237-256) ; y la guía de virus moteado clorótico de maíz (MCMV) (Lommel y colaboradores, (1991 ) Virology 81:382-385). Ver también, Della-Cioppa y colaboradores, (1987) Plant Physiol 84:965-968. Otros métodos o secuencias conocidas para aumentar la traducción también pueden ser utilizados, tal como intrones y los similares. Las secuencias de interés incluyen, por ejemplo, dedos de zinc, quinases, proteínas de choque térmico, factores de transcripción, reparación de DNA, atributos agronómicos, resistencia a insectos, resistencia a enfermedad, resistencia a herbicida, esterilidad, aceite, proteina, almidón, digestibilidad, tamaño del núcleo, madurez, composición de nutriente, niveles o metabolismo y los similares. Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a pestes tal como el gusano de raíz, el gusano cortador, el Barrenador de Maíz Europeo y los similares. Tales genes incluyen, por ejemplo, genes de proteina tóxica de B. thuringiensis (patentes norteamericanas 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; Geiser y colaboradores, (1986) Gene 48:109) y los similares. Los atributos de resistencia a enfermedad incluyen genes de destoxificación, tal como contra fumonisina (patente norteamericana 5,792,931); genes de avirulencia (avr) y resistencia a enfermedad (R) (Jones y colaboradores, (1994) Science 266:789; Martin y colaboradores, (1993) Science 262:1432; Mindrinos y colaboradores, (1994) Cell 78:1089); y los similares. Los atributos de resistencia a herbicida incluyen genes que codifican para resistencia a herbicidas que incluyen herbicidas de tipo sulfonil urea (por ejemplo, las mutaciones S4 y/o Hra en ALS) , herbicidas que actúan para inhibir la acción de glutamina sintasa, tal como fosfonotricina o basta (por ejemplo, el gen bar) , EPSPS (patentes norteamericanas 6,867,293; 5,188,642; y 5,627,061), GOX (Zhou y colaboradores, (1995) Plant Cell Rep 15:159-163), y GAT (patente norteamericana 6,395,485). Los genes de resistencia a antibiótico también pueden ser utilizados, tal como el nptll que codifica resistencia a los antibióticos canamicina y geneticina. Los genes de esterilidad también pueden ser utilizados, por ejemplo, como una alternativa al desespigamiento, incluyendo genes preferidos de tejido masculino y genes con fenotipo de esterilidad masculina tal como QM (por ejemplo, patente norteamericana 5,583,210), quinasas, y aquellos compuestos de codificación tóxicos para ya sea el desarrollo gametofitico masculino o femenino. La reducción de la actividad de genes específicos, silenciamiento y/o supresión puede ser deseada. Muchas técnicas para el silenciamiento de genes son conocidas, incluyendo pero no limitadas a la tecnología de antisentido (ver, por ejemplo, Sheehy y colaboradores, (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85:8805-8809; y las patentes norteamericanas 5,107,065; 5,453, 566; y 5,759,829); cosupresión (por ejemplo, Taylor (1997) Plant Cell 9:1245; Jorgensen (1990) Trends Biotech 8:340-344; Flavell (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:3490-3496; Finnegan y colaboradores, (1994) Bio/Technology 12:883-888; y Neuhuber y colaboradores, (1994) Mol Gen Genet 244:230-241); interfencia de RNA (Napoli y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:279-289; patente norteamericana 5,034,323; Sharp (1999) Genes Dev 13:139-141; Zamore y colaboradores, (2000) Cell 101:25-33; Javier (2003) Nature 425:257-263; y Montgomery y colaboradores, (1998) Proc Nati Acad Sci USA 95:15502-15507), silenciamiento de gen inducido por virus (Burton y colaboradores, (2000) Plant Cell 12:691-705; y Baulcombe (1999) Curr Op Plant Bio 2:109-113); ribozimas especificas de RNA objetivo (Haseloff y colaboradores, (1988) Nature 334:585-591); estructuras de horquilla (Smith y colaboradores, (2000) Nature 407:319-320; O99/53050; O02/00904; y WO98/53083); ribozimas (Steinecke y colaboradores, (1992) EMBO J 11:1525; patente norteamericana 4,987,071; y, Perriman y colaboradores, (1993) Antisense Res Dev 3:253); modificación dirigida mediada por oligonucleótido (por ejemplo, WO03/076574: y W099/25853); moléculas dirigidas por dedo de Zn (por ejemplo, WO01/52620; WO03/048345 y O00/42219); y otros métodos o combinaciones de los métodos anteriores . La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de transcripción, puede ser nativa con la secuencia de interés de DNA operablemente enlazada o puede ser derivada de otra fuente. Las regiones de terminación convenientes son disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens , tal como las regiones de terminación octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también Guerineau y colaboradores, (1991 ) Mol Gen Genet 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y colaboradores, (1991) Genes Dev 5:141-149; Mogen y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe y colaboradores, (1990) Gene 91:151-158; Bailas y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res 17:7891- 7903; y Joshi y colaboradores, (1987) Nucleic Acids Res 15: 9627-9639. En todavía otro aspecto, la presente invención se relaciona a un método para hacer una planta de maíz transgénica que comprende un minicromosoma artificial de planta que tiene un centrómero funcional, el método que comprende : (a) poner en contacto por lo menos una célula de planta de maíz con una mezcla que comprende una construcción recombinante de la invención; (b) identificar por lo menos una célula de planta de maíz de la etapa (a) que comprende un minicromosoma artificial de planta que tiene un centrómero funcional; y (c) regenerar una planta de maíz fértil de la célula de planta de maíz de la etapa (b) en donde la planta de maíz comprende un minicromosoma artificial de planta que tiene un centrómero funcional. La mezcla además puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido que estimula el crecimiento celular. Ejemplos de polipéptidos que estimulan el crecimiento celular incluyen, pero no están limitados a un wuschel, un baby boom, un RepA, o un Lecl. Cualquier método para introducir una secuencia en una planta puede ser utilizado, mientras que el polinucleótido o polipéptido gane acceso al interior de por lo menos una célula. Los métodos para introducir secuencias en plantas son conocidos e incluyen, pero no están limitados a, transformación estable, transformación transiente, métodos mediados por virus y reproducción sexual. Establemente incorporado indica que el polinucleot ido introducido es integrado en un genoma y es capaz de ser heredado por la progenie. La transformación transiente indica que una secuencia introducida no se integra en un genoma tal que es heredable por la progenie del hospedero. Las plantas y semillas empleadas pueden tener una construcción de DNA establemente incorporado en su genoma. Cualquier protocolo puede ser utilizado para introducir la construcción de DNA, cualquier componente de los sistemas de recombinación específicos del sitio, un polipéptido, o cualquier otro polinucleot ido de interés. La provisión comprende cualquier método que lleva conjuntamente cualquier polipéptido y/o polinucleot ido con cualquiera de otros componentes mencionados. Cualquier medio se puede utilizar para llevar con untamente un sitio objetivo, cásete de transferencia y recombinasa apropiada, incluyendo, por ejemplo, la transformación estable, suministro transiente y cruzamiento sexual (ver, por ejemplo, W099/25884) . En algunos ejemplos, la recombinasa se puede proporcionar en la forma del polipéptido mRNA. Una serie de protocolos se puede utilizar con el fin de llevar conjuntamente los diversos componentes.

Por ejemplo, una célula se puede proporcionar con por lo menos uno de estos componentes por la via de una variedad de métodos que incluyen los métodos de transformación transientes y estables; la co-introducción de una recombinasa DNA, mRNA o proteina directamente en la célula; el empleo de un organismo (por ejemplo, una cepa o linea) que expresa la recombinasa; o crecimiento/cultivo de la célula u organismo que lleva un sitio objetivo, cruzamiento de un organismo que expresa una proteina de recombinasa activa y selección de los eventos en la progenie. Un patrón de integración simple se produce cuando el cásete de transferencia se integra predominantemente en el sitio objetivo. Cualquier promotor, incluyendo un promotor constitutivo, inducible, de desarrollo, temporal y/o espacialmente regulado, etc. que es capaz de regular la expresión del organismo puede ser utilizado . Los protocolos de transformación, asi como protocolos para introducir polipéptidos o secuencias de polinucleótido en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta dirigida para la transformación. Los métodos adecuados para introducir polipéptidos y polinucleótidos en células de plantas incluyen microinyección (Crossway y colaboradores, (1986) Biotechniques 4:320-334, patente norteamericana 6,300,543; y solicitudes norteamericanas 11/427,947 y 11/427,371 todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia), electroporación (Riggs y colaboradores, (1986) Proc Nati Acad Sci USA 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (patentes norteamericanas 5,563,055; y 5,981,840), transferencia de gen directa ( Paszkowski y colaboradores, (1984) EMBO J 3:2717-2722), y aceleración de partículas balísticas (patentes norteamericanas 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244 y 5,932,782; Tomes y colaboradores, (1995) in Plant Cell, Tissue, y Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg & Phillips ( Springer-Verlag , Berlín); McCabe y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:923-926); y transformación de Lecl (WO00/28058 ) . También ver Weissinger y colaboradores, (1988) Ann Rev Genet 22:421-477; Sanford y colaboradores, (1987) Particulate Science y Technology 5:27-37 (cebolla); Christou y colaboradores, (1988) Plant Physiol 87:671-674 (soya); Finer & McMullen (1991) In Vitro Cell Dev Biol 27P: 175-182 (soya); Singh y colaboradores, (1998) Theor Appl Genet 96:319-324 (soya); Datta y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein y colaboradores, (1988) Proc Nati Acad Sci USA 85:4305-4309 (maíz); Klein y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patentes norteamericanas 5,240,855; 5,322,783; y, 5,324,646; Klein y colaboradores, (1988) Plant Physiol 91:440-444 (maíz); Fromm y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren y colaboradores, (1984) Nature 311:763-764; patente norteamericana 5,736,369 (cereales); Bytebier y colaboradores, (1987) Proc Nati Acad Sci USA 84:5345-5349 (Liliáceas); De Wet y colaboradores, (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman y colaboradores, (Longman, New York), pp . 197-209 (polen); Kaeppler y colaboradores, (1990) Plant Cell Rep 9:415-418; y Kaeppler y colaboradores, (1992) Theor Appl Genet 84:560-566 (transformación mediada por whisker) ; D'Halluin y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporacion); Li y colaboradores, (1993) Plant Cell Rep 12:250-255; Christou & Ford (1995) Ann Bot 75:407-413 (arroz); Osjoda y colaboradores, (1996) Nat Biotechnol 14:745-750 (maiz por la vía de ñ. turnefaciens) ; y Ch. 8, pp . 189-253 in Advances in Cellular y Molecular Biology of Plants, Vol . 5, Ed . Vasil, Kluwer Acad Publ (Dordrecht, The Netherlands) 1999. Varios compuestos se pueden utilizar en conjunción con cualquiera de los métodos de suministro directo para la introducción en células de plantas de cualquier polinucleótido, polipéptido o combinaciones de los mismos, que contienen opcionalmente otros componentes. Por ejemplo, los microproyectiles un método de pistola de partícula se puede preparar al asociar construcción ( es ) de DNA con los microproyectiles en la presencia de una solución de lípido catiónica, solución de liposoma, polímero catiónico, proteína que enlaza DNA, proteina catiónica, péptido catiónico, poliaminoácido catiónico o combinaciones de los mismos. En algunos ejemplos, los microproyectiles para un método de pistola de partícula se preparan al asociar la construcción ( es ) de DNA con los microproyectiles en la presencia de Tfx-10, Tfx-20, Tfx-50, Lipofectina, Lipofectamina , Cellfectina, Efecteno, Citofectina GSV, Lípidos Perfectos, DOTAP, DMRIE-C, FuGENE-6, Superfect, Polyfect, polietilenimina , quitosan, protamina CI, proteínas que enlazan DNA, histona Hl, histona CENH3, poli-L lisina, DIVISA, y los similares. El polinucleótido se puede introducir en plantas al poner en contacto las plantas con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales métodos se involucran en la incorporación de un polinucleótido deseado dentro de una molécula de DNA o RNA viral. La secuencia puede inicialmente ser sintetizada en una poliproteína viral y después procesada in vivo o in vitro para producir una proteína deseada. Los promotores útiles abarcan promotores utilizados para la transcripción por RNA polimerasas virales. Los métodos para la introducción de polinucleótidos en plantas y la expresión de una proteína codificada, que involucra moléculas de DNA o RNA virales, son conocidos, ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367; 5,316,931; y Porta y colaboradores, (1996) Mol Biotech 5:209- 221. Varios componentes, que incluyen aquellos de un sistema de recombinación especifico del sitio, se pueden proporcionar a una planta utilizando una variedad de métodos transientes. Tales métodos de transformación transientes incluyen, pero no están limitados a, la introducción de la recombinasa o fragmento activo variante de la misma directamente, la introducción del mRNA de recombinasa o la utilización de un método no integrativo o la introducción de bajos niveles de DNA en la planta. Tales métodos incluyen, por ejemplo, microinyección, bombardeo de partículas, sistemas de vector viral y/o la precipitación del polinucleótido en donde la transcripción ocurre del DNA enlazado a partículas sin liberación sustantiva de la partícula o integración en el genoma, tales métodos generalmente utilizan partículas recubiertas con polietilenimina, (ver, por ejemplo, Crossway y colaboradores, (1986) Mol Gen Genet 202:179-185; Nomura y colaboradores, (1986) Plant Sci 44:53-58; Hepler y colaboradores, (1994) Proc Nati Acad Sci USA 91:2176-2180; y Hush y colaboradores, (1994) J Cell Sci 107:775-784). Las células transformadas pueden ser regeneradas en plantas utilizando protocolos y medios estándares, ver por ejemplo, McCormick y colaboradores, (1986) Plant Cell Rep 5:81-84. Estas plantas luego pueden ser cultivas y autopolinizadas , retrocruzadas y/o cruzadas exteriorícente , y la progenie resultante que tiene la característica deseada identificada. Dos o más generaciones pueden ser cultivadas para asegurar que la característica sea establemente mantenida y heredada y luego las semillas cosechadas. De esta manera la semilla transformada/transgénica que tiene la construcción de DNA mencionada establemente incorporada en su genoma es proporcionada. Una planta y/o una semilla que tiene la construcción de DNA establemente incorporada puede ser además caracterizada para expresión, potencial de integración específico del sitio, agronomía y número de copias (ver, por ejemplo, la patente norteamericana 6,187,994). Los fragmentos y variantes de sitios de recombinación, recombinasas , marcadores de selección y secuencias de nucleótidos de interés se pueden utilizar, y a menos que se establezca de otra manera, indicar que la variante o fragmento retiene por lo menos alguna de la actividad/función de la composición original. En casos donde el polinucleótido codifica una proteína como un fragmento de un polinucleótido puede codificar fragmentos de proteína que retiene la actividad biológica de la proteína de longitud completa. Fragmentos de un polinucleótido pueden variar de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta el polinucleótido de longitud completa. Un fragmento de un I 14 polinucleótido que codifica una porción biológicamente activa de una proteina típicamente codifica por lo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 325, 350, 375, 400, 420 o 450 aminoácidos contiguos, o cualquier número entero en este intervalo hasta e incluyendo el número total de aminoácidos presentes en una proteína de longitud completa. Un fragmento biológicamente activo de un polipéptido se puede preparar al aislar una porción de uno de los polinucleótidos que codifica la porción del polipéptido de interés, al expresar el fragmento de proteína y al estimar la actividad. Alternativamente, un fragmento biológicamente activo de un polipéptido se puede producir mediante segmentación química o proteolítica de manera selectiva del polipéptido de longitud completa, y la actividad medida. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican fragmentos de un polipéptido de recombinasa puede comprender la secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300 o 1,400 nucleótidos, o cualquier número entero en este intervalo hasta e incluyendo el número total de nucleótidos de un polinucleótido de longitud completa. Además, los fragmentos de un sitio de recombinación requieren la actividad biológica del sitio de recombinación, que se somete a un evento de recombinación en la presencia de la recombinasa apropiada. Los fragmentos de un sitio de recombinación pueden variar de por lo menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 nucleótidos, hasta la longitud completa de un sitio de recombinación. Por ejemplo, los sitios de FRT de longitud completa, lox, attB y attP son conocidos y varían de aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 250 nucleótidos, y mínimos completamente activos son conocidos y varían de aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, y 50 nucleótidos. Los ensayos para medir la actividad biológica de los sitios de recombinación y la recombinasa son conocidos (ver, por ejemplo, Senecoll y colaboradores, (1988) J Mol Biol 201:406-421; Voziyanov y colaboradores, (2002) Nucleic Acids Res 30:7; patente norteamericana 6,187,994; WO01/00158; Albert y colaboradores, (1995) Plant J 7:649-659; Hartang y colaboradores, (1998) J Biol Chem 273:22884-22891; Saxena y colaboradores, (1997) Biochim Biophy Acta 1340:187-204; y Hartley y colaboradores, (1980) Nature 280-860-864) . Los ensayos para la actividad de recombinasa generalmente miden la actividad total de la enzima sobre los sustratos de DNA que contienen los sitios de recombinación. Por ejemplo, para analizar para la actividad de FLP, la inversión de una secuencia de DNA en un plásmido circular que contiene dos sitios de FRT invertido se puede detectar como un cambio en la posición de los sitios de enzima de restricción (ver, por ejemplo, Vetter y colaboradores, (1983) Proc Nati Acad Sci USA 80:7284). Alternativamente, la escisión de DNA de una molécula lineal o frecuencia de recombinación intermolecular inducida por la enzima puede ser analizada (ver, por ejemplo, Babineau y colaboradores, (1985) J Biol Chem 260:12313; Meyer-Leon y colaboradores, (1987) Nucleic Acids Res 15:6469; y Gronostaj ski y colaboradores, (1985) J Biol Chem 260:12328) . La actividad de recombinasa también se puede medir mediante la escisión de una secuencia flanqueada por sitios FRT recombinogénicos para activar un gen marcador analizable.- EJEMPLOS La presente invención además es definida en los siguientes ejemplos, en los cuales las partes y porcentajes están en peso y los grados son centígrados, a menos que se establezca de otra manera. Se debe entender que estos ejemplos, mientras que indican modalidades preferidas de la invención, se dan a manera de ilustración solamente. A partir de la discusión anterior de estos ejemplos, un experto en la técnica puede averiguar las características esenciales de esta invención y sin apartarse del espíritu y alcance de la misma, puede hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a varias utilizaciones y condiciones. Así, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones también se proponen que caen dentro del alcance de las reivindicaciones adj untas . El significado de abreviaciones es como sigue: "seg" significa segundo (s), "min" significa minuto (s), "h" significa hora(s), "d" significa dia(s), "µ?" significa microlitro ( s ) , "mi" significa mililitro ( s ) , "L" significa litro (s), "µ?" significa micromolar, "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol (es) , "ymol" significa micromol (es ) , "g" significa gramo (s), "pg" significa microgramo ( s ) , "ng" significa nanogramo ( s ) , "U" significa unidad(es), "bp" significa par (es) de base y "kB" significa kilobase(s). EJEMPLO 1. Identificación y aislamiento de centrómeros del maíz Para evaluar el tamaño, composición y organización estructural de centrómeros individuales, sondas marcadas especificas a un CentC, CentA, CRM1 y/o CRM2, se utilizaron individualmente y/o en un cóctel para la hibridación in situ .fluorescente (FISH) sobre los cromosomas de paquiteno, metafase, anafase I meióticos de maíz y a moléculas de DNA extendidas (fibra-FISH) . Estas cuatro sondas también se utilizaron para clasificar librerías BAC de maíz genómico . A. Hibridación in situ La FISH multi-color a los cromosomas de metafase de maíz revela que estas cuatro repeticiones centroméricas son especificas del centrómero y colocalizadas en regiones centroméricas sobre todos los cromosomas en células somáticas. El análisis FISH mostró que los retrotransposones CRM1, CRM2 y' CentA, ocupan aproximadamente la misma región en los centromeros de maíz. Hay variaciones significantes en la composición de la repetición y el tamaño relativo de las regiones de repetición entre los centromeros de diferentes cromosomas de maíz. Los resultados de FISH mostraron que la sonda CentA tiene la señal de hibridación más débil; la sonda CRM1 mostró un patrón de hibridación similar a gradiente con la señal más fuerte alrededor de la constricción primaria del cromosoma de metafase, con la señal que se debilita gradualmente en la periferia de las regiones de centrómero, y la sonda CRM2 mostró la señal de hibridación más clara y compacta. La intensidad de la señal. de FISH de las repeticiones CentC fue altamente dependiente sobre el número de copias de CentC, que es variable entre los centromeros de diferentes cromosomas de maiz. En algunos centromeros CentC es estrechamente agrupada, mostrando ligera sobreposición con las otras repeticiones centroméricas, en otros cromosomas la distribución de repetición de CentC muestra más sobreposición con todas las otras repeticiones. FISH de los cromosomas de anafase I meióticos en microesporositos con todas las cuatro repeticiones centroméricas reveló que la región centromérica en esta etapa es altamente extendida y solamente un segmento pequeño de la región centromérica completa es realmente unida al cinetocoro. Todas las cuatro repeticiones se colocalizaron en el segmento de unión de microtúbulo, sugiriendo que una región centromérica funcional nativa comprende todas las cuatro repeticiones centroméricas. Fibra-FISH sobre las moléculas de DNA extendidas se utilizó para caracterizar adicionalmente la distribución y el arreglo de las repeticiones centroméricas en una resolución más alta. Las cruzas de avena por maíz generaron embriones Fl que retuvieron uno o más cromosomas de maíz (ver, por ejemplo, Riera-Lizarazu y colaboradores, (1996) Theor Appl Genet 93:123-135; Ananiev y colaboradores, (1997) Proc Nati Acad Sci USA 94:3524-3529). Estas lineas proporcionan un medio para estudiar los cromosomas de maiz individuales sin las complejidades antecedentes de los otros nueve cromosomas de maiz. Un número de lineas de adición de avena-maiz están disponibles de Ron Phillips at University of Minnesota (St. Paul, MN, USA) , incluyendo las lineas de adición de avena-maiz Séneca 60, A188 y B73 utilizadas en la presente. El DNA de las lineas de adición de cromosoma de avena-maiz se utilizó para el análisis de regiones centroméricas de cromosomas de maíz individuales. Fibra-FISH multicolor sobre las líneas de adición de cromosoma de avena-maíz reveló estiramientos de hibridación largos de megabase de repeticiones centroméricas únicas para cada cromosoma (Figura 11) . En los cromosomas 1, 7 y 8 todas las cuatro repeticiones se interdispersaron a lo largo de la región centromérica completa. En los otros cromosomas, CentC estuvo presente como estiramiento relativamente corto (aproximadamente 300 kb) flanqueados por arreglo "suelto" de las otras tres repeticiones centroméricas. La longitud total de las regiones centroméricas varió grandemente entre diferentes cromosomas de maíz como es observado mediante FISH. CentC reveló polimorfismos significantes entre los centrómeros de cromosomas individuales en la abundancia de esta repetición, con una diferencia de tanto como 10 veces observada dentro de cualquier genotipo dado. El cromosoma 7 tiene los bloques másl grandes de repeticiones en tándem de CentC en cromosomas de metafase y paquiteno. De manera similar, la línea de adición de avena-maíz con el cromosoma 7 de maíz tuvo los estiramientos más largos de fibras de DNA que hibridan a la sonda CentC. A la inversa, el centrómero del cromosoma 4 de maíz tuvo el bloque más pequeño de repeticiones de CentC en cromosomas de metafase y los tractos más pequeños de CentC en las líneas de adición del cromosoma 4 de avena-maíz, especialmente en el cromosoma 4 de la línea de maíz B73. Cuando se analiza mediante fibra-FISH los retrotransposones centroméricos CentA, CRM1 y CR 2 mostraron un patrón similar a rayas con espacios grandes entre las señales de hibridación positivas. Cuando las sondas a estos tres retrotransposones se mezclaron conjuntamente y se utilizaron como una sonda de cóctel ellas revelaron fibras de DNA más continuamente marcadas interdispersadas con los bloques de repeticiones de CentC. Los flancos de los retrotransposones centroméricos continuamente marcados mostraron un patrón similar a rayas a lo largo de las moléculas de DNA que indicaron que los retrotransposones centroméricos se interdispersaron con otros tipos de secuencias de DNA, incluyendo elementos específicos no centroméricos. Los retrotransposones centroméricos pueden formar arreglos sueltos de hasta 1 Mb en centrómeros de cromosomas con bloques pequeños de repeticiones de CentC tal como el cromosoma 4. El híbrido de maíz Zapalote chico tuvo un cromosoma B supernumerario. La FISH de los cromosomas meióticos de Zapalote chico indicó que el centrómero funcional del cromosoma de maíz contiene todas las cuatro repeticiones centroméricas , similares a aquellas observadas en todos los cromosomas A. Sin embargo, las agrupaciones de repeticiones de CentC se pueden encontrar también en varios sitios no centroméricos sobre el brazo largo del cromosoma B. Esos sitios están aparentemente libres de otras repeticiones centroméricas . Los resultados de FISH sobre cromosomas mitóticos y meióticos, y fibra FISH sugirió que el segmento centromérico nativo funcional responsable para la formación del cinetocoro sobre un cromosoma de maíz generalmente comprende arreglo de repeticiones en tándem de CentC intermezcladas con tres de otras repeticiones centroméricas, CRM1, CRM2 y CentA (Figura 12) . B. Librerías de BAC Los vectores de BAC permiten la clonación de fragmentos grandes de DNA genómico, hasta aproximadamente 300 kb en tamaño, que pueden ser mantenidos en ' un hospedero bacteriano, típicamente E. coli. Una amplia variedad de librerías de BAC se ha generado de especies de plantas y animales y hechas públicamente disponibles, ver, por ejemplo la información en Clemson University Genome Institute (CUGI; ver el sitio de la red en genome.clemson.edu) y Children's Hospital Oakland Research Institute (CH0RI; ver el sitio de la red en chori.org). Las librerías de BAC genómicas de maíz que representan mayor que 13X de cobertura utilizando múltiples enzimas para la construcción de la librería a partir de dos genotipos de maíz diversos, B73 y Mol7, que representan los grupos heteróticos Dent y Lancaster respectivamente, se clasificaron para secuencias centroméricas de maíz. i. Librería de BAC genómico de Maíz Mol! Los vectores de clonación de BAC pIndigoBac536 (Shizuya, no publicado) y pBeloBACll (Kim y colaboradores, (1996) Genomics 34:213-218) se desarrollaron de pBAC108L (Shizuya y colaboradores, (1992) Proc Nati Acad Sci USA 89:8794-8797). El pBAC108L es un plásmido basado en mini factor F. El factor F codifica para genes que regulan su propia replicación y número de copias en la célula. El vector pBeloBACll se generó al introducir el gen LacZ para facilitar la identificación del clon recombinante mediante fenotipos azules o sin color (blanco) . pBeloBACll tiene tres sitios de clonación únicos: Bam I , Sphl y HindIII, que están flanqueados por los promotores T7 y SP6. Los sitios de restricción cortadores raros Notl, EagI, Xmal , Smal , Bgll y Sfil se pueden utilizar para extirpar el inserto del pBeloBACll. En el vector pIndigoBac536, un sitio £coRI se ha modificado en el gen cloranfenicol (CMR) de modo que el sitio £coRI en el sitio de clonación se puede utilizar para la construcción de librería. Los vectores pBeloBACll y pIndigoBac536 tienen dos marcadores de selección, LacZ y CMR para la selección de transformante . Una librería de BAC genómico de maíz patentada de la línea endogámica pública de maíz Mol7 se construyó en pBeloBACll o p!ndigoBac536 esencialmente como es descrito en Kim y colaboradores, ((1996) Genomics 34:213-218) bajo el contrato con el laboratorio Shizuya en el California Institute of Technology. Brevemente, el DNA genómico de Mol7 se digirió parcialmente con las enzimas de restricción HindIII o EcoRI . Los fragmentos de DNA se fraccionaron por tamaño en gel de agarosa y se clonaron en los sitios HindIII de pBeloBACll o los sitios EcoRI de pIndigoBac536. El tamaño de inserto promedio fue de aproximadamente 150 kb. La librería de BAC genómico de Mol7 completa consiste de 433 placas de 384 cavidades o 166,272 clones BAC totales. La primera mitad de la librería que comprende 214 placas contiene clones BAC con insertos HindIII, mientras que la segunda mitad de la librería que comprende 219 placas, contiene clones BAC con insertos EcoRI. Los clones BAC se mantienen en DH10B de E. coli (BRL Life Technologies) . ii. Librerías de BAC genómico de Maíz B73 Dos librerías de BAC genómico de maíz B73 pública se obtuvieron. La librería ZMMBBb está disponible del Clemson University Genome Institute (CUGI, University of Georgia, Athens, GA, USA) . La librería de BAC de ZMMBBb se creó en CUGI al clonar el DNA genómico del maíz B73 parcialmente digerido con HindIII en el vector pIndigoBac536 que comprende un gen de resistencia de cloramfenicol (CMR) . La librería de BAC de ZMMBBb comprende 247,680 clones BAC totales con un tamaño de inserto promedio de aproximadamente 137 kb, que representa una cobertura genómica 14X. La segunda librería de BAC de B73, CHORI-201 (ZMMBBc) creada por el laboratorio de Pieter de Jong ' s en Children's Hospital Oakland Research Institute (CHORI), está disponible del Centro de Recursos BACPAC en CHORI. Para construir esta librería, el DNA genómico se aisló de los núcleos de maíz B73. El primer segmento de la librería se construyó utilizando DNA parcialmente digerido con una combinación de £coRI y EcoRI metilasa, el segundo segmento se construyó utilizando DNA parcialmente digerido con Mbol . El DNA seleccionado por tamaño se clonó en el vector pTARBAC2.1 (segmento 1, placas 1-288) entre los sitios EcoRI y en el vector pTARBAC1.3 (segmento 2, placas 289-576) entre los sitios BamHI. Los productos de ligación se transformaron en células electrocompetentes DH10B de E. coli (BRL Life Technologies) . Los clones BAC para cada segmento de librería en cada vector se han arreglado en 288 cajas de microtítulo de 384 cavidades. El segmento 1 comprende 106,637 clones BAC individuales con un tamaño de inserto promedio de 163 kb, que representa una cobertura genómica de 6.9X . El segmento 2 comprende 105,579 clones BAC individuales con un tamaño de inserto promedio de 167 kb, que representa una cobertura genómica de 7.0X. La librería de ZMMBBc total comprende 212,216 clones BAC individuales con un tamaño de inserto promedio de 165 kb, que representa una cobertura genómica de 13.9X. C. Clasificación de librería de B7ÁC Las librerías de BAC del maíz B73 y Mol7 se clasificaron con cuatro sondas separadas a la secuencia centromérica CentA, CentC, CRM1 y CRM2. Las sondas se diseñaron como oligonucleótidos OVERGO de 40 bp de largo y fueron únicas a cada elemento centromérico . Al utilizar marcas apropiadas, estas sondas se pueden utilizar para colonia, e hibridación de manchado, y FISH y fibra-FISH. i. Sondas overgo Las sondas overgo típicamente se diseñan como dos oligonucleótidos cortos que tienen una región sobrepuesta complementaria de 8 bp. Los oligonucleótidos cortos están típicamente en el intervalo de 23-28 bp, con 24 bp que es más comúnmente utilizado. Después del recocido, los oligonucleótidos forman dímeros con DNA de una sola hebra de 16 bp sobre ambos lados. La sonda parcialmente de doble hebra es marcada al llenar el 3' terminal ahuecado utilizando la actividad de polimerización de la enzima Klenow en la presencia de nucleótidos marcados. La sonda overgo final comprende una sonda de 40 bp de doble hebra marcada. La TABLA 1 lista los cebadores y sondas utilizados para la generación, clasificación y caracterización de clones BAC, construcciones de DNA y eventos de minicromosoma de maíz.

TABLA 1 SEQ Biocódigo Hombre do Oligo Secuencia 10 5 PCR-Telomero-F AGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG PCR-Telómoco-R CCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACC 7 65644 CentC-OVG-1-40f GGTTCCGGTGGCAAAAACTCGTGC 8 65645 CentC-OVG-1-40r TGTCGGTGCATACAAAGCACGAGT 9 65646 CentC-OVG-51-90f GAATGGGTGACGTGCGACAACGAA 10 65647 CentC-OVG-51-90r GGTGGTTTCTCGCAATTTCGTTGT 11 65648 CentC-OVG-101-140f GTTTTGGACCTAAAGTAGTGGATT 12 104790 CentC-OVG-101-140r CACAACGAACATGCCCAATCCACT 13 69509 CRM1-LTR-OVG1f CTTGGTCTTGGACAGTACCTCACT 14 69510 CRM 1 -LTR-OVG2Í CCCTTGCGATCCGACTACGACGAG 15 69511 CRM1-LTR-OVG3f TCACGAAGATCGTTTCCTGTGCGC 16 69512 CR 1-LTR-OVG4f CAGCGCAGATTAGCGCGTGTTCGA 17 69513 CRM1-LTR-OVG5f CCAACCCTAGGTCGTCCATTATGG 18 69514 CRM1-LTR-OVG6f TTCAATTCTCTTGCACGGGCCCGA 19 69515 CRM1-LTR-OVG1 r TCAGGTCTACTTCATCAGTGAGGT 20 69516 CRM1-LTR-OVG2r TGGCGCCTCGGGCTTGCTCGTCGT 21 69517 CR 1-LTR-OVG3r TGTTCGTTCTTCGATTGCGCACAG 22 69518 CRM1-LTR-OVG4r TTAGCCTTAGCTACTCTCGAACAC 23 69519 CRM1-LTR-OVG5r CCAGCCCAATTGCGGCCCATAATG 24 69520 CRM1-LTR-OVG6r CACCTGGGCCAGTGACTCGGGCCC 69521 CRM2-LTR-OVG1Í TGATGAAGACATCCACACTACTGA 26 69522 CRM2-LTR-OVG2Í TTGAACATGCTGGATTCGGACTGC 27 69523 CRM2-LTR-OVG3f CTGCCCATGGTGCTGCGTCACCCT 28 69524 CRM2-LTR-OVG4f GCGCGTGCTAGTTCAGCCGCCCGT 29 69525 CR 2-LTR-OVG5Í GTATCGGTTGCTAAGGCGCAGCGT 30 69526 CRM2-LTR-OVG1 r TATTGGTATAGATGCATCAGTAGT 31 69527 CR 2-LTR-OVG2r AAGTTGGTGTTCTTCTGCAGTCCG 32 69528 CRM2-LTR-OVG3r CCCATTGGGCCAAAATAGGGTGACG 33 69529 CR 2-LTR-OVG4r TTCCGAAGACAAGAAGACGGGCGG 34 69530 CR 2-LTR-OVG5r CTACAGCCTTCCAAAGACGCTGCG 69531 CentA-LTR-OVG1 f TGATGAGAACATAACCCGCACAGA 69532 CentA-LTR-OVG2f AGGATGATGAGGACATCACTGCCA 69533 CentA-LTR-OVG3f AACCATCTAGAATTTGAGAAGGCA 69534 CentA-LTR-OVG4f GTCCAGAAACTGCCGAGTGAACTC 65535 CentA-LTR-OVG5f GAGAGAGTTTCGTTCTCCATTAGA 69536 CentA-LTR-OVG6f GTTCTTGCTTGTTCTCGATTGCTT 69537 CentA-LTR-OVG7f TTGGTTGTGGTAGTCGGGCAGCCA 69538 CentA-LTR-OVG1r CATTAACATGGTCATATCTGTGCG 69539 CentA-LTR-OVG2r TGGTGTGGTGTATTGATGGCAGTG 69540 CentA-LTR-OVG3r CTTTTATTGCCTTGTTGCCTTCT 69541 CentA-LTR-OVG4r GACTTGGGTAGAGCAGGAGTTCAC 69542 CentA-LTR-OVG5r AGGAATAGAAAGGAGTTCTAATGG 69543 CentA-LTR-OVG6r ACAGCCTTGAACCTGCAAGCAATC 69544 CentA-LTR-OVG7r TGTTGGAGAACGACGTTGGCTGCC 69555 Cent4-250-OVG f TAAGTGCAAACCATTGTTAAATTT 69556 Cent4-250-OVG2f CACAAACCCTTAACTCGAAACTAT 69557 Cent4-250-OVG3f ATCGAAAGATAACTCATATGGCTT 69558 Cent4-250-OVG4f TCCACTAAAGAACCAAGATTGTGA 69559 Cent4-250-OVG1r AATTGTACTATCTCTAAAATTTAA 69560 Cent4-250-OVG2r TTTAGGGTTTGGGGTTATAGTTTC 69561 Cent4-250-OVG3r GACCATAATGGTCAAAAAGCCATA 69562 Cent4-250-OVG4r ATATGTTGGACACAAATCACAATC 69634 18-26SrDNANTS-OvG1f CCGGAAATAAGCAAAGTCCAAGCG 69635 18-26SrONANTS-OvG2f TATGTCTTGGGTGAAGGGCATGGC 69636 18-26SrDNANTS-OvG3f CGCAAGGCGACGGGCGGCATGGCT 69637 18-26SrDNANTS-OvG4f CGAGGGGTTCCCCATGGCGCACGG 69638 18-26SrONANTS-OvG 1 r TCGGTGTCTTTCCACACGCTTGGA 69639 18-26SrDNANTS-OvG2r GTTTTCCCTCCGTTCCGCCATGCC 69640 18-26SrDNANTS-OvG3r AGACGCAAGGCCGAACAGCCATGC 69641 18-26SrDNANTS-OvG4r GGCCTCAGTTTTCGGCCCGTGCGC 74794 subtelo-TR430-OvG2f GACACATGTTTTTGTCGTCGAACA 74795 subtek>-TR430-OvG2r GGAGGCACGAAATCGCTGTTCGAC 74796 subtelo-TR430-OvG3f CGACCGCCACCCATGATTTGACCA 74797 subtelo-TR430-OvG3r ACCTTACCAGTCTCTATGGTCAAA 74799 subtelo-TR430-OvG4f TCCCGTGAGCTATAGCACACGTTT 74800 subtelo-TR430-OvG4r GGTCGCTCGGCCATGAAAACGTGT 74801 subtelo-TR430-OvG5f CCGTGTTCCTCCACACGTG I I I 1 1 74802 subtelo-TR430-OvG5r AAGGTGCTCCGGGGACAAAAACAC 74803 subtelo-TR430-OvG6f TTGGCCTCCCGCGAGCTATATCAC 74804 subtelo-TR430-OvG6r TTGGCCACGGAAATGTGTGATATA 74805 subtelo-TR430-OvG7f TTATGTATCCGACCTGCCACCTTC 74806 subtelo-TR430-OvG7r CTCCCCGGTCTAAAACGAAGGTGG 74807 subtelo-TR430-OvG8f GCCACCCGTGAGCTATAGCACACG 78 74808 subtelo-TR430-OvG8r TAGGTTTCCATAAAATCGTGTGCT 79 65650 180knobOvG21-60f TGTCGAAAATAGCCATGAACGACC 80 65651 180knobOvG21-60r CGGTATTATTGGAAATGGTCGTTC 81 65652 180knobOvG71-110f CCTACGGATTTTTGACCAAGAAAT 82 65653 180knobOvG71-110r ATTTCTAGTGGAGACCATTTCTTG 83 65654 180knobOvG141-180f ATGTGGGGTGAGGTGTATGAGCCT 84 65655 180knobOvG141-180r ATGAGCCTCTGGTCGATGATCAAT 85 65656 5SrDNAOvG1-40f GGATGCGATCATACCAGCACTAAA 86 65657 5SrONAOvG1-40r TGATGGGATCCGGTGCTTTAGTGC 87 65658 5SrONAOvG61-100f CTTGGGCGAGAGTAGTACTAGGAT 88 65659 5SrDNAOvG61-100r TCCCAGGAGGTCACCCATCCTAGT 89 65660 5SrDNAOvG161-200f ACCATAGTAAAAATGGGTGACCGT 90 65661 5SrONAOvG161-200r TAATTTAACACGAGAACGGTCAC 91 65662 5SrDNAOvG261-230f CCGTGGGCGAGCCGAGCACGGAGG 92 65663 5SrDNAOvG261-230r TCCTCTTATGCCCACACCTCCGTG 93 65664 350knobOvG31-70f CTCAAATGACGTTTCTATGATATT 94 65665 350knobOvG31-70r TGAATACAATGCCCTCAATATCAT 95 65666 350knobOvG121-160f CTAGGTTTCCTATAATCCCCTCTA 96 65667 350knobOvG121-160r CTAGGTATGCCTTGAATAGAGGG 97 65668 350knobOvG 61-200f ATGTTGTTTATGTCCACTCAAGTA 98 65669 350knobOvG161-200r ATGGTGTACGGTGTTTTACTTGAG 99 65670 350knobOvG261-300f GTGAGATCTGTCCAAACATAGGTT 100 65671 350knobOvG261-300r GGTGCCTTACAACCGTAACCTATG 101 b010.m7 fis31 GCAAACTTTATGTGATCCCTTCCTCGCTGAACGAGATG AG 102 b108.h15 fis47 GGGACGGCAAGTCACGGTAAGACCAGTCCAACCGAAT GAT 103 Cen3n.pk0001.g11 CCAAACTTGCTGAGATTACTGGGCAATCTGTTCGCTCG CA 104 103022 23715-3101 -3200f CCAGGTAGTTTGAAACAGTATTCT 105 103023 237 5-3501 -360W ATAAAGGAAAAGGGCAAACCAAAC 106 103024 23715-1401-1.500f GATGCCCACATTATAGTGATTAGC 107 103025 23715-2901-3000f CCACATATAGCTGCTGCATATGCC 108 03026 23715-3701-3800f CG G ATCT AAC ACAAACATGAAC AG 109 103027 23715-1-100f CGATGAATTTTCTCGGGTGTTCTC 110 103028 23715-101-200Í CCTGCAGCCCTAATAATTCAGAAG 111 103029 23715-301 -400f CACAGTCGATGAATCCAGAAAAGC 112 03030 23715-901-100W GCGTGCAATCCATCTTGTTCAATC 113 103031 23715-3201-3300 CAACCACACCACATCATCACMCC 114 103032 23715-3601-370OÍ ACTGGCAAGTTAGCAATCAGAACG 115 103033 23715-4901-500OÍ CATGAACGTGTCTTCAACTAGAGG 116 103034 23715-4201-4300Í GACGGCGTTTAACAGGCTGGCATT 117 103035 23715-201 -300f CCAAGCTCTTCAGCAATATCACGG 118 103036 23715-601-700f ATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGT 119 103037 23715-1001-1100f ATCCTTGGCGGCAAGAAAGCCATC 120 103038 23715-1101-1200f GCAAGCTACCTGCTTTCTCTTTGC 121 103039 23715-1601-1700f GCTTCTTGGCCATGTAGATGGACT 122 103040 23715- 801-1900f TTCACGCCGATGAACTTCACCTTG 123 103041 23715-5001-5087Í AAGCTTGCCAACGACTACGCACTA 124 103042 23715-401 -500f CCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCA 125 103043 23715-801-900f AGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGC 126 103044 23715-1301-1400f CAGGATCCCGTAACTATAACGGTC 127 103045 23715-2801 -2900f CGACCTGCAGAAGTAACACCAAAC 128 103046 23715- 3401-3500f ATCTAGAACGACCGCCCAACCAGA 129 103047 23715-3801 -3900f ATTTGGGGGAGATCTGGTTGTGTG 130 103048 23715-3901-4000f GAGGGGGTGTCTATTTATTACGGC 131 103049 23715-4801-4900Í CATGCAAGCTGATCTGAGCTTGGC 132 103050 23715-2101-2200Í TCCATGCGCACCTTGAAGCGCATG 133 103051 23715-501 -600f TTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTC 134 103052 23715-1201- 300f ATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTG 135 103053 23715-4001-4100f GCCACGCAATTTCTGGATGCCGAC 136 103054 23715-701-800Í CGATAGCCGCGCTGCCTCGTCTTG 137 103055 23715-1901-2000Í CACTTGAAGCCCTCGGGGAAGGAC 138 103056 23715-1701-1800f TCCTTCAGCTTCAGGGCCTTGTGG 139 103057 23715-2001-2100Í CACCTTGGAGCCGTACTGGAACTG 140 103058 23715-2601 -2700f TGCGGCTCGGTGCGGAAGTTCACG 141 103059 23715-4101-4200f ACGCGACGCTGCTGGTTCGCTGGT 142 103060 23715-3101-3200r CGTTCTAGATCGGAGTAGAATACT 143 103061 23715-3501-3600r TGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTT 144 33332 23715-1401-1500r GCACACATAGTGACATGCTAATCA 145 103062 23715-2901 -3000r GATATACTTGGATGATGGCATATG 146 103063 23715-3701-3800r CCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCAT 147 103064 23715-1-100G ATTCGAGCCAATATGCGAGAACAC 148 103065 23715-101-200r GCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAA 149 103066 23715- 301-400G ATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCT 150 103067 23715-901-1000r GAGGATCGTTTCGCATGATTGAAC 151 103068 23715-3201-3300r TGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGA 152 103069 23715- 3601-3700r ACCTGTACGTCAGACACGTTCTGA 153 103070 23715-4901-5000G AATTAAGTCAGGCGCGCCTCTAGT 154 103071 23715-4201-4300G CTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAG 155 103072 23715-201-300G ACATAGCGTTGGCTACCCGTGATA 156 103073 23715-601 -700r GATCTCCTGTCATCTCACCTTGCT 157 103074 23715-1001-1100r CCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTT 158 103075 23715-1101 -1200r AAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAG 159 103076 23715-1601-1700r TACCTGGTGGAGTTCAAGTCCATC 160 103077 23715-1801 -1900r ACGGCTGCTTCATCTACAAGGTGA 161 103078 23715-5001 -5087r TGAAGCTCTTGTTGGCTAGTGCGT 162 103079 23715-401-500G GTCTTGTCGATCAGGATGATCTGG 163 103080 23715-801 -900r ATTCGGCTATGACTGGGCACAACA 164 103081 23715-1301-1400r CGCTTCGCTACCTTAGGACCGTTA 165 103082 23715-2801 -2900r CGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTG 166 88245 23715-3401 -3500r G GTTGTGATGATGTG GTCTGGTTG 167 103083 23715-3801-3900r GTTCGGAGCGCACACACACACAAC 168 103084 23715-3901-4000r TTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAAT 169 103085 23715-4801-4900G TAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCT 170 103086 23715-2101-2200r ACGTCATCACCGAGTTCATGCGCT 171 103087 23715-501-600r AGCGAAACATCGCATCGAGCGAGC 172 103088 23715-1201-1300G AAGCCGAATTCCAGCACACTGGCG 173 103089 23715-4O01-4100r TTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCAT 174 103090 23715-701 -800G TGCCCTGAATGAACTGCAAGACGA 175 103091 23715-1901-2000G CCGACTACAAGAAGCTGTCCTTCC 176 103092 23715-1701 -1800r TGCTGAAGGGCGAGACCCACAAGG 177 103093 23715-2001 -2100r GGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCA 178 103094 23715-2601-2700G ACATCGAGACCTCCACCGTGAACT 1 9 103095 23715^101-4200r AGTCTAACGGACACCAACCAGCGA 180 PCRbacmpk108h15f GATCGTCGAATGGGAATCCATGGG 181 PCRbacmpk108h15r CCCTGAGTGAACCATTTAGGAAGATCAG 182 PCRbacmpk108h15- TGCAACATCCAAAGACCCAACATG 2.fis47f 183 PCRbacmpk108h15- TTCCAACATGGTTGGTGGTCAG 2.fis47r 184 PCRbacmpkOI 0m07fis3 TGTCATGACATCTTGTTGCTACCCTG 1f 185 PCRbacmpk010m07fis3 AAACCCGGAGTTTCTATGCAGG 1 r 192 75319 Telo-310vergO cebador1 AGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGGTTTAGGG 193 39612 Tel0-31overg0 cebador2 CCCTAAACCCTAAACCCTAAACCCTAAACCC ii. Resultados de la clasificación de librería de BAC La clasificación de hibridación de colonia identificó una acumulación de aproximadamente 8000 clones BAC que hibridaron a por lo menos una de las cuatro sondas especificas de centrómero. Los 8000 clones BAC se clasificaron en cuatro grupos basados en su perfil de hibridación (Tabla 2). TABLA 2 Basado en la composición de repetición centromérica los clones BAC además se clasificaron en 15 conjuntos basados en la combinación de sondas que hibridaron a cada clon BAC particular (Tabla 3) . TABLA 3 Grupo # de BACs BACs que contienen CentA & CentC & CRM1 & CRM2 247 BACs que contienen CentA & CentC & CR 2; no CRM1 6 BACs que contienen CentA & CentC & CRM1; no CRM2 45 BACs que contienen CentA & CRM1 & CRM2; no CentC 116 BACs que contienen CentC & CRM1 & CR 2; no CentA 730 BACs que contienen CentA & CentC; no CRM1 no CRM2 4 1 BACs que contienen CentA & CRMl; no CentC no CRM2 131 BACs que contienen CentA & CRM2; no CentC no CRMl 27 BACs que contienen CentC & CRM2; no CentA no CRMl 97 BACs que contienen CentC & CRMl; no CentA no CRM2 829 BACs que contienen CRMl & CRM2; no CentA no CentC 749 BACs que contienen CentC; no CentA no CRMl no CRM2 521 BACs que contienen CRM2; no CentA no CentC no CRMl 966 BACs que contienen CRMl; no CentA no CentC no CRM2 3165 BACs que contienen CentA; no CentC no CRMl no CRM2 266 Los clones BAC además se clasificaron basados en la suma de clones BAC que hibridaron a cada sonda particular (Tabla 4) . TABLA 4 Todos los BACs que contienen CentA 842 Todos los BACs que contienen CentA & CentC 302 Todos los BACs que contienen CentA, CentC, & CRMl 292 Todos los BACs que contienen CentA, CentC, & CRM2 253 Todos los BACs que contienen CentA & CRMl 539 Todos los BACs que contienen CentA, CRMl, & CRM2 363 Todos los BACs que contienen CentA & CRM2 396 Todos los BACs que contienen CentA, CentC, CRMl, 247 & CRM2 Todos los BACs que contienen CentC 2479 Todos los BACs que contienen CentC & CRM1 1851 Todos los BACs que contienen CentC & CRM2 1080 Todos los BACs que contienen CentC, CRM1, & CRM2 977 Todos los BACs que contienen CRM1 6012 Todos los BACs que contienen CRM1 & CR 2 1842 Todos los BACs que contienen CRM2 2968 grupo de 247 clones BAC contiene todas las cuatro repeticiones centroméricas . Ellos comprenden 0.15% de genoma de maíz o se pueden presentar sobre un segmento de DNA de aproximadamente 300 kb por centrómero en promedio. Este grupo de clones BAC se identificó como el conjunto de núcleo que es utilizado primero en experimentos para construir un minicromosoma de maíz. El DNA se purificó de todos los 247 BACs en el conjunto de núcleo, se digirió con Xmnl o Rsal , se manchó y se híbrido con cada una de las cuatro repeticiones centroméricas . La hibridación de manchado de Southern, confirmó que los clones en este conjunto de núcleo contuvieron todas las cuatro repeticiones centroméricas. Los BACs mostraron diferencias generales en la composición del fragmento de restricción y los patrones de hibridación, y además se clasificaron en 87 grupos sobre la base de similitud de fragmento de restricción. Uno representativo de cada uno de los 87 grupos (Tabla 5) se tomó para generar las construcciones de DNA del conjunto de núcleo y/o acumulaciones de construcciones del conjunto de núcleo de BAC para la transformación y ensamble de minicromosoma. TABLA 5 No. Nombre Insarto(kb) No. Nombre Inse tólo) 1 bacm.pk101.n23 50 45 bacm2.pk002.g7 125 2 bacm2.pk064.e15 50 46 bacm.pk135.l7 125 3 bacm.pk036.e13 60 47 bacm.pk090.o5 125 4 bacm2.pk179.e1 70 48 bacm2.pk100.j24 130 5 bacm.pk030.a6 70 49 bacm2.pk013.c9 130 6 bacm2.pk179.b 8 75 50 bacm.pk 66.n7 130 7 bacm.pk133.b11 75 51 bacm.pk043.o23 130 8 bacm2.pk066.m12 80 52 bacm.pk001.n1 130 9 bacm.pk119.a23 80 53 bacm.pk106.j20 135 10 bacm.pk098.h2 85 54 bacm.pk015.d19 135 11 bacm2.pk174.e4 90 55 bacm.pk007.a2 140 12 bacm2.pk116.g16 90 56 bacm.pk148.e2 140 13 bacm2.pk023.e24 90 57 bacm.pk141.¡4 140 14 bacm.pk178.c10 90 58 bacm.pk138.e14 140 15 bacm.pk135.l6 90 59 bacm.pk135.j2 140 16 bacm.pk098.f3 90 60 bacm.pk134.f15 140 17 bacm.pk075.l6 90 61 bacm.pk085.k5 140 18 bacm.pk066.j14 95 62 bacm.pk077.b21 140 19 bacm2.pk099.m24 100 63 bacm.pk124.j24 145 20 bacm2.pk093.h11 100 64 bacm.pk023.i5 145 21 bacm2.pk083.a2 100 65 bacm.pk039.m16 150 22 bacm.pk179.d4 100 66 bacm2.pk169.a21 150 23 bacm.pk076.m3 100 67 bacm2.pk130.e20 150 24 bacm.pk070.h17 100 68 bacm.pk156.i17 150 25 bacm.pk064.n1 100 69 bacm.pk143.m18 150 26 bacm.pk011.l8 100 70 bacm.pk112.p1 150 27 bacm.pk068.p16 105 71 bacm.pk102.¡4 150 28 bacm.pk012.n20 105 72 bacm.pk087.m4 150 29 bacm.pk077.k5 110 73 bacm.pk079.m11 150 30 bacm2.pk053.g23 1 10 74 bacm.pk041.e16 150 31 bacm2.pk034.j8 110 75 bacm.pk129.a4 150 32 bacm.pk164.b11 110 76 bacm.pk164.e18 155 33 bacm.pk062.c14 110 77 bacm.pk161.h1 155 34 bacm.pk0 3.m8 110 78 bacm.pk089.l8 155 bacm.pk056.j19 110 79 bacm.pk076.o15 160 36 bacm.pk051.g11 115 80 bacm.pk039.a3 160 37 bacm2.pk179.o14 120 81 bacm.pk019.h24 160 38 bacm2.pk096.d23 120 82 bacm2.pk158.f12 160 39 bacm2.pk070.g7 20 83 bacm2.pk075.n6 170 40 bacm2.pk034.g20 120 84 bacm2.pk137.f2 175 41 bacm2.pk012.g19 120 85 bacm.pk093.d8 175 42 bacm2.pk115.o22 125 86 bacm.pk133.b10 180 43 bacm2.pk094.f14 125 87 bacm.pk178.o20 180 44 bacm2.pk003.g6 125 D. Identificación de arreglos invertidos de repeticiones CentC Librerías de BAC de las líneas de maíz Mol7 y B73 se buscaron para arreglos en tándem de CentC invertido. Una búsqueda BLAST de una base de datos de secuencia de extremo de BAC de Mol7 reveló 591 extremos de BAC que contienen repeticiones CentC. De estos, solamente 45 clones BAC contuvieron repeticiones CentC sobre ambos extremos, y 44 BACs tuvieron repeticiones CentC en la misma orientación, con solamente un BAC que tiene repeticiones CentC en una orientación invertida (bacm. pkl28. j 21 ) . Un segundo clon BAC, bacm.pk008.d20 que tiene repeticiones CentC en una orientación invertida se encontró mediante el análisis de hibridación de Southern. El análisis de Southern de este clon mostró un patrón de hibridación muy similar al patrón observado para bacm. pkl28. j 21. Una búsqueda de BLAST de la base de datos de secuencia de extremo de BAC de B73 pública reveló 136 extremos de BAC que contienen repeticiones CentC. De estos, solamente 5 clones BAC contuvieron repeticiones CentC sobre ambos extremos, y 4 BACs tuvieron repeticiones CentC en la misma orientación, con solamente un BAC que tiene repeticiones CentC en orientación invertida (ZMMBBb0243L15) . El DNA de bacm. pkl28. j 21 y bacm. pk008. d20 se digirieron con la enzima de restricción Xmnl , que segmenta las repeticiones CentC en fragmentos monoméricos o diméricos cortos. Un fragmento Xmnl de 10 kb se aisló, se subclonó y se secuenció. El análisis de secuencia mostró que el elemento CRMl (SEQ ID NO: 191) está localizado entre dos repeticiones CentC invertidas . E. Aislamiento de clones BAC centroméricos del cromosoma 4 de maíz El cromosoma 4 de maíz contiene los arreglos de repetición CentC más cortos. Estos arreglos están presentes en un solo estiramiento de DNA de aproximadamente 300 kb como es estimado mediante fibra-FISH. Este segmento puede contener las secuencias de DNA centroméricas funcionales de núcleo, y podría potencialmente ser representado por 2-4 clones BAC sobrepuestos. Los clones BAC centroméricos específicos del cromosoma 4 se pueden identificar al encontrar secuencias de DNA únicas localizadas en la región centromérica del cromosoma 4. La librería de BAC genómico del maíz Mol7, que comprende 10,965 secuencias de extremo de BAC se analizó para identificar secuencias de extremo de BAC únicas representadas solamente una vez en la librería. 81 secuencias de extremo de BAC únicas se identificaron y se seleccionaron para la caracterización adicional. Un par de cebadores de PCR se diseñó a cada una de las 81 secuencias de extremo de BAC únicas para el mapeo sobre el panel de línea de adición de cromosoma de avena-maíz y cada secuencia única asignó a un cromosoma de maíz individual. La secuencia de extremo de BAC del bacm.pkl08.hl5 (170 kb) de Mol7 se mapeó al cromosoma 4. Es.te BAC se secuenció y 6 secuencias únicas, asi como todas las cuatro repeticiones centroméricas CentA, CentC, CRM1 y CRM2 se encontraron. Utilizando PCR, este BAC se asignó a un contiguo que contiene varios BACs que también hibridan a 'CentC. La secuenciación confirmó que dos clones BAC más de este contiguo, bacm. pkOlO . m7 (170 kb) y bacm.pkl84.c21 (150 kb) parcialmente sobrepuesto con bacm. pkl08. hl5 y comparten algunos marcadores únicos. Tres secuencias de DNA únicas se identificaron dentro de estos tres clones BAC y su localización del cromosoma 4 se confirmó mediante PCR sobre el DNA de la linea de adición de avena-maiz. Las sondas overgo correspondientes (SEQ ID NOs: 102-104 en la Tabla 1) se desarrollaron y se utilizaron para la clasificación de una librería de BAC pública de B73. Siete clones BAC de la librería de BAC de B73 se seleccionaron basados en la hibridación de todas las tres sondas específicas del cromosoma 4. El DNA de estos clones BAC se digirió con Xmnl , se transfirió a una membrana y se híbrido con todas las cuatro sondas de repetición centroméricas. Cuatro de los clones BAC de B73 seleccionados contienen los elementos repetitivos de centrómeros CentC, CRM1 y CRM2: bacb .0424. d20 (150 kb) ; bac .0155. hlS (175 kb) ; bacc.0048.g5 (170 kb) y bacc.0237.m8 (125 kb) . Otros tres clones BAC de B73 contienen solamente elementos repetitivos de centrómeros CRM1 y CRM2 : bacc.0143.19 (205 kb) ; bacc.0237. jl6 (175 kb) ; y bacc.0270.cl (180 kb) . La secuenciación del clon de BAC bacb .0155. hl5 confirmó que éste contiene regiones significantes de homología a los clones de BAC de Mol7 específicos del cromosoma 4 bacm. pkOlO . m7 y bacm.pkl08.hl5. Dos grupos de clones BAC que representan la región centromérica del cromosoma 4 de las líneas endogámicas Mol7 y B73 se utilizaron para la producción de construcciones de DNA para el ensamble de minicromosoma . F. Aislamiento y purificación de fragmentos de DNA centroméricos cromosómicos Esencialmente todo el DNA genómico de maíz es densamente metilado, y este patrón de metilación puede desempeñar un papel en el ensamble, función y/o mantenimiento de los centrómeros de maíz. El DNA genómico de maíz aislado que mantiene la metilación y/u otras características genómicas nativas, tal como el tamaño, organización de elementos y otras modificaciones de nucleótidos nativos, se puede utilizar para generar construcciones de DNA para el ensamble de minicromosoma de maíz, i. Selección de enzima de restricción El análisis de secuencia de las repeticiones centroméricas de maíz identificó un número grande de enzimas de restricción (seis cortadores) sin sitios de reconocimiento dentro de cualquiera de las repeticiones centroméricas CentA, ¦CentC, CRM1 o CRM2 (Tabla 6) . Estas enzimas de restricción deben digerir el volumen de DNA genómico en fragmentos de DNA pequeños, la mayoría de los cuales que son de aproximadamente 1-20 kb en tamaño, mientras que el DNA centromérico se espera que sea significativamente más largo. Las regiones centroméricas cromosómicas del maíz se pueden aislar mediante la digestión parcial o completa del DNA genómico de alto peso molecular (H W) del maíz con por lo menos una de estas enzimas de restricción. La fracción del DNA genómico de HMW digerido que comprende fragmentos grandes de aproximadamente 50 kb - aproximadamente 1000 kb se pueden purificar después de la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) de núcleos de maíz incrustados en bloques de agarosa. ii. Preparación y caracterización del DNA genómico de maíz HMW El DNA genómico de maíz HMW del Mol7 se preparó esencialmente como es descrito por Liu & Whittier ((1994) Nucleic Acids Res 22:2168-2169) del DNA incrustado en bloques de agarosa mediante la digestión con varias enzimas de restricción de la TABLA 6 y el f accionamiento mediante PFGE. Cinco enzimas de restricción, BspTI, AatlI, Cf"r9l, Mbil, MluI, se seleccionaron para los análisis iniciales. De estas, BspTI se seleccionó para todas las preparaciones adicionales. La hibridación de manchado con las sondas centroméricas CentC marcadas reveló que la enzima de restricción BspTI produjo un conjunto de fragmentos de DNA centroméricos genómicos que varían de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 600 kb que fueron bien separados del resto del DNA genómico. La hibridación de los mismos fragmentos de DNA con tres de otras sondas centroméricas (CentA, CRM1 y CRM2) confirmó que estos fragmentos de DNA largos que comprenden todas las cuatro repeticiones centroméricas no tienen esencialmente sitios de restricción ?e??? . Las bandas hibridantes pueden representar fragmentos de DNA centroméricos individuales que se pueden aislar y utilizar para generar construcciones de DNA para el ensamble de minicromosoma . TABLA 6 Enzima Sitio Roe Enzima Sitio Rec Aat\ AGGCCT A/goPIII CCGCGG AatU GACGTC Pac25l CCCGGG AccBS\ CCGCTC Pae14kl CCGCGG AflU CTTAAG Pae5kl CCGCGG Ahy\ CCCGGG PaeAl CCGCGG AspM\ AGGCCT PaeBI CCCGGG Sb/241 ACGCGT PaeQI CCGCGG Bfrí CTTAAG Pcel AGGCCT BpuB5\ CGTACG PÍ/23II CGTACG 8s/WI CGTACG Pme55l AGGCCT SspTI CTTAAG PpuM CGTACG BsrB\ GAGCGG PspM CCCGGG 6sf31 NI CCGCTC PspALI CCCGGG SSÍ98I CTTAAG PspU CGTACG BSÍD102I CCGCTC Sacll CCGCGG BSÍPZ740I CTTAAG Sari AGGCCT BvuB\ CGTACG SchZl CCGCGG Cfr 2\ CCGCGG SenPT14bl CCGCGG c CCCGGG SexBI CCGCGG CfrJ4l CCCGGG SexCI CCGCGG Csc\ CCGCGG Sfr303l CCGCGG Eae46l CCGCGG CCGCGG EaeA\ CCCGGG Sma\ CCCGGG EclR\ CCCGGG spn CGTACG EC0147I AGGCCT Spu\ CCGCGG Eco29kl CCGCGG S/-U30DI AGGCCT Esp4\ CTTAAG SseBI AGGCCT Ga/I CCGCGG Ssp5230l GACGTC GceGLI CCGCGG Ssíll CCGCGG Gcel CCGCGG Sfel AGGCCT Gd I AGGCCT Stu\ AGGCCT pn378l CCGCGG Sun\ CGTACG spl CCGCGG Vha464\ CTTAAG MaeK81 l CGTACG Xcy\ CCCGGG Mbi\ CCGCTC XmaC\ CCCGGG Mlu\ ACGCGT Xma\ CCCGGG MspC\ CTTAAG Zra\ GACGTC NgoAW CCGCGG EJEMPLO 2. Identificación y aislamiento de secuencias teloméricas Cualquier región telomérica funcional, nativa, clonada o sintética, que comprende una repetición telomérica se puede utilizar para hacer las construcciones de DNA. Varias repeticiones de telómero son conocidas, incluyendo aquellas de Tetrahymena , Para ecium , Oxytricha , Euplotes, Dictyostelium , Saccharomyces , Caenorhabditis , Trypanosoma , Leishmania , Physarum , Arabidopsis , humano y ratón. Repetición Telomérica Organismo Ejemplar CCCCAA (C4A2) Tetrahymena , Paramecium CCCCAAAA (C4A4) Oxytricha, Euplotes CCCTA (C3TA) Trypanosoma , Leishmania , Physarum C1-3A Sa ccharomyces Ci_8T Dictyostelium CCCTAAA (C3TA3) Arabidopsis, humano, ratón, Caenrhabdi tis A. Secuencias de Telómeros sintéticas La naturaleza repetitiva altamente conservada de las secuencias teloméricas permiten la síntesis química y/o amplificación de PCR de regiones teloméricas largas adecuadas para la construcción de vector. Tractos largos de repeticiones teloméricas, por ejemplo (CCCTAAA) n para flanquear extremos de minicromosoma pueden ser generados. Estiramientos largos de repeticiones teloméricas en tándem se pueden producir por varias rondas de amplificación de PCR utilizando el par de cebadores SEQ ID NOs : 5 & 6 mediante el cebado mutuo de dos oligonucleótidos teloméricos complementarios y sus productos. Una reacción de PCR usando una baja concentración de los cebadores (<0.1 µ?) puede producir segmentos de DNA de aproximadamente 100-10000 bp. Opcionalmente , las repeticiones teloméricas sintéticas se pueden producir mediante ligación de oligos fosforilados. Los segmentos de DNA teloméricos se clonaron y se utilizaron para producir construcciones de DNA. B. Identificación y Aislamiento de Secuencias Subteloméricas i. Clones BAC que contienen repeticiones teloméricas Los clones BAC que contienen regiones subteloméricas que comprenden repeticiones teloméricas se pueden utilizar para estabilizar los extremos cromosómicos de una construcción de minicrosoma . Un número de secuencias se identificaron previamente como repeticiones subteloméricas , (Burr y colaboradores, (1992) J Plant Cell 4:953-60). La base de datos de la secuencia de Genbank fue la palabra clave buscada para las secuencias teloméricas y subteloméricas. Las secuencias seleccionadas se alinearon y un elemento repetitivo común se identificó (Telo266, SEQ ID NO: 189). Utilizando la SEQ ID NO: 189, varios oligonucleótidos se diseñaron y se utilizaron como sondas para clasificar la librería de BAC Mol7. Un número de BACs se recuperaron, uno se seleccionó (bacm. pkl07. gl) , se marcó y se híbrido a cromosomas de paquiteno. Las secuencias del clon BAC se encontraron en agrupaciones en 6 de entre 20 subtelómeros en cromosomas de maíz. El inserto de BAC bacm. pkl07. gl se subclonó y se secuenció. El análisis de secuencia reveló un elemento repetitivo común (TR430, SEQ ID NO: 190) que se utilizó para diseñar sondas overgo (Tabla 1) . La localización subtelomérica de estas repeticiones se confirmó mediante FISH a los cromosomas de paquiteno de maíz Mol7 y B73. Utilizando las mismas sondas, las librerías de BAC genómico del maíz Mol7 se clasificaron mediante la hibridación de colonia. Aproximadamente 71 clones BAC que contienen bloques de repeticiones subteloméricas de maíz se confirmaron como que tienen la repetición de subtelómero TR430 (Tabla 7) . TABLA 7 bacm.pk155.e24 bacm.pk166.a12 bacm.pk173.m16 bacm.pk203.j15 bacm2.pk022.m14 bacam2.pk092.a9 bacm2.pk1 14.Í4 bacm2.pk169.b21 bacm2.pk177.j18 bacm2.pk190.m10 bacm2.pk220.h7 bacm.pk001.k4 bacm.pk009.c19 bacm.pk024.j15 bacm.pk024.k8 bacm.pk036.g23 bacm.pk038.g6 bacm.pk061.¡6 bacm.pk062.g4 bacm.pk064.f6 bacm.pk070.j17 bacm.pk071.c12 bacm.pk073.m7 bacm.pk082.m9 bacm.pk101 .h5 bacm.pk107.g1 bacm.pk110.h10 bacm.pk1 2.b18 bacm.pk123.e21 bacm.pk125.n6 bacm.pk132.h6 bacm.pk141.p12 bacm.pk142.b15 bacm.pk146.H4 bacm.pk148.j17 bacm.pk154.a21 bacm.pk155.p12 bacm.pk157.d2 bacm.pk164.n4 bacm.pk165.n1 bacm.pk169.n16 bacm.pk171.d3 bacm.pk172.m20 bacm.pk172.n19 bacm.pk172.n16 bacm.pk173.e9 bacm.pk173.¡12 bacm.pk174.g4 bacm.pk176.g2 bacm.pk184.e5 bacm.pk185.o19 bacm.pk189.a10 bacm.pk197.m23 bacm.pk198.f9 bacm.pk198.k3 bacm.pk200.c20 bacm.pk208.j1 bacm.pk213.f2 bacm.pk214.i17 bacm.pk214.k16 bacm.pk214.l1 1 bacm.pk2 4.m20 bacm2.pk007.cJ1 bacm2.pk034.k22 bacm2.pk043.g14 bacm2.pk043.j16 bacm2.pk073.o7 bacm2.pk102.018 bacm2.pk108.a3 bacm2.pk117.h13 bacm2.pk160.l2 bacm.pk203.j15 bacm.pk155.e24 bacm.pk166.a12 baacm.pk173.m16 bacm2.pk169.b21 bacm2.pk022.m14 bacam2.pk092.a9 bacm2.pk1 14. ¡4 bacm.pk001.k4 bacm2.pk177.j18 bacm2.pk190.m10 bacm2.pk220.h7 bacm.pk036.g23 bacm.pk009.c19 bacm.pk024.j15 bacm.pk024.k8 La impresión dactilar de restricción con Dpnl y la hibridación de manchado con las sondas TR430, sondas (CCCTAAA) n, y a las sondas de repetición de 180 bp de prominencia mostraron por lo menos tres tipos de clones BAC subteloméricos . El primer tipo tiene tractos largos de repeticiones relacionadas con TR430 más largas que 10-20 kb. El segundo de los clones BAC tiene repeticiones relacionadas con TR430 que tienen un sitio de restricción dentro de la unidad, en donde el tamaño de la unidad puede ser de 800 bp o 900 bp. Algunos clones BAC contuvieron ambas de estas dos repeticiones. El tercer tipo de clones BAC tiene la unidad relacionada con TR430 bp alrededor de 500 bp. Algunos de estos clones BAC también tienen repeticiones relacionadas teloméricas (CCCTAAA)n. Las repeticiones de 180 bp de protuberancia también están presentes en 37 clones BAC subteloméricos sugiriendo que las repeticiones de 180 bp de protuberancia pueden ser una parte de unas regiones subteloméricas . Los clones BAC representativos de cada tipo se tomaron para análisis adicionales, experimentos de readaptación y experimentos transgénicos : bacm . pk038. g6 ; bacm2.pk063.g24; bacm. pk071. cl2 ; bacm. pkll2. bl8 ; bacm. pkl42. bl5 ; bacm. pkl73. e9. Los insertos de BAC con fragmentos subteloméricos se pueden utilizar en construcciones de DNA para el ensamble de minicromosoma in vitro, o el ensamble en una célula de planta. ii. Aislamiento de fragmentos de DNA teloméricos cromosómicos nativos Los fragmentos teloméricos cromosómicos que retienen por lo menos una característica genómica nativa, tal como el patrón de metilación, se purificaron del DNA genómico de maíz mediante el fraccionamiento por tamaño del DNA genómico de maíz diferido con enzimas de restricción que tienen un sitio de reconocimiento corto de 4 bp o más pequeño. La secuencia telomérica de maíz nativa comprende cientos o miles de repeticiones en tándem de CCCTAAA en cada telómero, esta repetición en tándem de telómero corta no tiene sitio de reconocimiento para cualquier enzima de restricción conocida. Cualquiera de las enzimas de restricción cortadoras cortas que reconocen la secuencia de 2-4 bp se puede utilizar, mientras que no tengan especificidad a la repetición en tándem telomérica canónica (CCCTAAA)n. Los cortadores cortos digieren la mayoría del DNA genómico sobre fragmentos pequeños que se pueden separar del DNA telomérico más grande. Usando una combinación de dos o más enzimas de restricción cortadoras cortas se pueden eliminar otros fragmentos de DNA no teloméricos no fragmentados por la primera enzima. No hay enzimas de restricción conocidas que tengan un sitio de reconocimiento dentro de la repetición telomérica en tándem canónica. El DNA genómico de maíz del Mol7 se digirió con la enzima de restricción Sau3A. La mayor parte del DNA genómico de maíz se redice a fragmentos muy pequeños muy debajo de 1 kb, mientras que la mayoría de fragmentos de DNA teloméricos son más grandes que aproximadamente 15 kb como es determinado mediante la hibridación de manchado. La longitud total de los segmentos de DNA de telómero Sau3A por genoma aploide es aproximadamente 400 kb, o 0.02% del genoma aploide de maíz total. Aproximadamente 1 mg de DNA genómico de maíz total produce aproximadamente 200 ng de fragmentos de DNA teloméricos en la fracción de residuo no digerida. La fracción de DNA telomérica genómica se puede purificar del el gen utilizar para generar construcciones de DNA para el ensamble del minicromosoma . EJEMPLO 3. Origen de Replicacion Las construcciones de DNA son readaptadas con segmentos de DNA que llevan orígenes de replicacion para permitir la replicacion apropiada de la construcción y/o minicromosoma en los núcleos de células de plantas transgénicas . Cualquier origen de replicacion que funciona en una célula de planta puede ser utilizado. Los orígenes de replicacion disponibles son conocidos e incluyen orígenes de replicacion de plantas, y orígenes de replicacion virales. Opcionalmente, si una construcción será mantenida en una célula hospedera no de planta por lo menos un origen de replicacion apropiado puede ser incluido en la construcción, por ejemplo, origen (es) de replicacion bacterianos y/o de levadura . A. Espaciador no transcrito de 18-26S rDNA Un origen de replicacion bien establecido es el espaciador no transcrito de 18-26S rDNA (Ivessa & Zakian (2002) Genes Dev 16:2459-2464) que es probablemente funcional en plantas (Hernández y colaboradores, (1993) EMBO J 12:1475-85) . Las secuencias de DNA de NTS de 18-26S rDNA se pueden aislar de una variedad de diferentes especies de plantas, tales como Zea mays, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Arabidopsis thaliana y/o Glycine max. Estas secuencias son clonadas en construcciones como únicas y múltiples copias dispersadas. Los cromosomas eucarióticos típicamente tienen múltiples orígenes de replicación, por lo tanto la inclusión de múltiples orígenes de replicación en las construcciones de DNA puede ser útil. A menos que se establezca de otra manera, la secuencia NTS de 18-26S rDNA del maíz se utiliza en las construcciones de DNA (Toloczyki & Feix (1986) Nucleic Acids Res 14:4969-86). B. Proteínas iniciadoras (Rep) del virus enano de trigo (WDV) La proteína iniciadora (Rep) del virus enano de trigo (WDV) y su origen de replicación cognado se pueden utilizar para generar construcciones de DNA para el ensamble de minicromosoma . La proteína iniciadora (Rep) del virus enano de trigo (WDV) y su origen de replicación cognado se pueden utilizar para apoyar la replicación de las construcciones de minicromosoma en células de maíz. El origen de replicación de WDV se puede proporcionar sobre la construcción de DNA (en cis) , mientras que los genes necesarios para la proteína Rep iniciadora y la proteína RepA de estimulación del ciclo celular se pueden proporcionar mediante la co-transformación sobre construcciones de plásmido independientes (en trans) (Sanz-Burgos & Gutiérrez (1998) Virology 243: 119-129) . EJEMPLO . Polinucleotidos y polipéptidos que estimulan el crecimiento Los polinucleótidos y/o polipéptidos que aumentan el crecimiento celular al promover la división celular, la entrada en fase S, estimular la división celular y/o el crecimiento en cultivo, o mejorar la transformación se pueden proporcionar antes, durante o después de la introducción de construcciones de DNA que comprenden la secuencia centromérica de maíz y/o el fragmento subtelomérico . Se puede utilizar cualquier composición de tal clase, o combinación de los mismos que incluyen polinucleótidos , polipéptidos y/o otros factores utilizando cualquier método de suministro adecuado . A. Proteina ? asociada con la replicación La proteina A de replicación del virus enano de trigo (WDV) se puede proporcionar para aumentar el crecimiento celular y/o la recuperación de eventos transgénicos . Tanto RepA que retiene la actividad de replicación como una RepA modificada que no apoya la replicación viral pueden ser utilizadas. Por ejemplo, un plásmido que lleva el promotor nos:: RepA puede ser co-suministrado en células de plantas con la construcción ( es ) de DNA. La expresión transiente de RepA durante los primeros tres días se espera que sea suficiente para estimular la división celular y aumentar la recuperación del evento (ver, por ejemplo, WO00/50614, incorporada en la presente por referencia) .

B. Ciclinas Las proteínas ciclinas, involucradas en la modulación del ciclo celular pueden aumentar el crecimiento celular y la recuperación de eventos transgénicos . Por ejemplo, la ciclina D de maíz puede estimular la división celular y el crecimiento del callo en cultivo y mejorar la transformación del maíz. La expresión ectópica de E2F indujo la proliferación celular en Arabidipsis, este efecto se aumentó mediante la co-expresión de DPa (de Veylder y colaboradores, (2002) EMBO J 21:1360-1368). Muchos homólogos del ciclo celular, incluyendo ciclina D, ciclina' E, wee 1, Rb, Rbr3, E2F/DP, y los similares se han aislado de plantas (patente norteamericana 6,518,487; 099/61619; WO00/37645; WO02/074909; Xie y colaboradores, (1996) EMBO J 15:4900-4908; todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia) y se pueden introducir en vectores para el suministro en células de plantas. C. Wuschel Los genes que activan las rutas de desarrollo específicas también son útiles en aumentar el crecimiento celular. Por ejemplo, los miembros de la familia WOX, tal como wuschel (WUS) se presentan para estimular la división celular en ambas células que expresan WUS y células adyacentes. Una construcción que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido WUS se puede utilizar para estimular la división celular mediante la co-transformación con la construcción ( es ) de DNA. Varios homólogos de US son conocidos en plantas, tal como Arabidopsis y maíz (por ejemplo, Mayer y colaboradores, (1998) Cell 95:805-815; WO01/0023575; y US2004 /0166563, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia) , y se pueden utilizar para aumentar el crecimiento de células transformadas. Por ejemplo, una construcción que comprende un gen WUS de maíz se construyó: PHP21139 ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron: :WUS: :pinll D. Proteina 2 de desarrollo de óvulo Otros genes de interés que incluyen aquellos relacionados de la familia AP2/ERF de factores de transcripción que son preferencialmente expresados en embriones en desarrollo y semillas, incluyendo la Proteina 2 de desarrollo de Óvulo (ZmODP2) que es expresada temprano en la embriogénesis de maíz. Cuando se expresa ectópicamente , 0DP2 puede estimular el crecimiento celular en una variedad de tejidos, incluyendo tejidos no embriónicos, que pueden facilitar la recuperación de- eventos transgénicos . Esta familia de genes incluye baby boom (BBM, BNM3, ODP2) que se ha mostrado que induce embriones somáticos ectópicos en plantas (Boutilier y colaboradores, (2002) Plant Cell 14:1737-1749). Los homólogos de BBM/ODP2 son conocidos, incluyendo homólogos de maíz (WO00/75530, incorporada en la presente por referencia) y se pueden suministrar a células de plantas para aumentar el crecimiento celular. Por ejemplo, una construcción que comprende un gen 0DP2 de maíz se construyó: PHP21875 ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron: :0DP2: :pinll E. Nudoso-1 Los genes homeobox, incluyendo miembros de la familia del gen knox, tal como KN1, KNAT1 y STM funcionan en la iniciación del meristema y/o mantenimiento en "plantas (Jackson y colaboradores, (1994) Dev 120:405-413; Lincoln y colaboradores, (1994) Plant Cell 6:1859-1876; Venglat y colaboradores, (2002) Proc Nati Acad Sci USA 99:4730-4735). Muchos, miembros de la familia knox son conocidos en plantas, incluyendo homólogos de maíz (Vollbrecht & Hake (1991) Nature 350:241-243; Kerstetter y colaboradores, (1994) Plant Cell 6:1877-1887; Serikawa y colaboradores, (1996) Plant Mol Biol 32:673-683) y se pueden utilizar para construir vectores para el suministro en células de plantas. F. Lecl Los genes de cotiledón hojoso, tal como Lecl y Lec2, están involucrados en la regulación de la embriogénesis y la actividad transcripcional en plantas (Meinke y colaboradores, (1994) Plant Cell 6:1049-1064; Lotan y colaboradores, (1998) Cell 93:1195-1205; WO00/28058; Stone y colaboradores, (2001) Proc Nati Acad Sci U SA 98:11806-11811; patente norteamericana 6,492,577, incorporadas en la presente por referencia) . Muchos homólogos son conocidos los cuales se pueden utilizar para construir vectores para el suministro en células de plantas. G. Combinación de polinucleótidos de estimulación de crecimiento Una combinación de polinucleótidos y/o polipéptidos que aumentan el crecimiento celular al promover la división celular, la entrada en fase S, estimular la división celular y/o el crecimiento en cultivo, o mejorar la transformación se pueden proporcionar antes, durante o después de la introducción de construcciones de DNA que comprenden secuencia centromérica de maíz y/o fragmento subtelomérico . Por ejemplo los polinucleótidos que codifican un ODP2 (pHP21875) de maiz y un WUS (pHI21139) de maíz se pueden utilizar en experimentos de transformación con construcción (es ) de DNA que comprenden regiones centroméricas y/o subteloméricas de maiz. En general ODP2 y/o WUS en la cotransformación de bombardeo de partículas de embriones de maíz inmaduros, como es descrito en el Ejemplo 6D, mostró un incremento significante en la frecuencia de eventos transgénicos como es determinado por el genotipo BARR y la expresión de proteína marcadora fluorescente (DsRed) . En promedio 1008 eventos/4800 embriones primarios (21%) se observaron cuando se proporcionaron en la mezcla de transformación. Sin PHP21139 o PHP21875, se observaron 8 eventos/706 embriones primarios (~1 %). Los análisis adicionales de eventos transgénicos indicaron que las construcciones co-bombardeadas con ODP2 y/o US no se integraron en el genoma o los minicromosomas ensamblados. EJEMPLO 5. Construcción de vector Los vectores, circulares o lineales, para el suministro en células de plantas utilizando cualquier protocolo de transformación estándar se construyen utilizando protocolos de biología molecular estándares, ver por ejemplo Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed . , Cold Spring Harbor Laboratory Vols. 1-3. Los vectores para la transformación de células de plantas se construyen al combinar elementos cromosómicos aislados, opcionalmente con otros polinucleótidos de interés, utilizando técnicas estándares. Los vectores incluyen aquellos diseñados para ser mantenidos en un sistema hospedero conveniente tal como E. coli, Agrobacterium, o levadura, así como en células de plantas. Típicamente, la construcción además comprende un marcador seleccionable y/o clasificable que funciona en células de plantas para ayudar en el mantenimiento, identificación y/o selección de células de plantas que comprenden la construcción de minicromosoma .

Además, la construcción típicamente comprende varios sitios de restricción únicos donde se pueden clonar polinucleótidos de interés adicionales. La construcción también puede comprender sitios de recombinación específicos del sitio útiles para clonación recombinacional y/o para la dirección posterior y/o modificación del minicromosoma. Las construcciones de DNA derivadas de clones BAC de maíz que comprenden secuencias centroméricas para el suministro directo o la transformación de planta mediada por Agrobacterium se describen enseguida. Varios componentes se pueden suministrar ya sea sobre la construcción del clon BAC, y/o en trans sobre construcciones de DNA separadas. A. Marcadores Una variedad de marcadores se puede utilizar para identificar células transformadas que comprenden la construcción (es) de DNA introducida. Los marcadores visuales incluyen proteínas fluorescentes, tales como AmCyan, ZsAmarillo, o DsRojo (ClonTech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) . Marcadores seleccionables incluyen PAT, BAR, GAT, y los similares. Un cásete de expresión, PHP 23715, para el suministro a células de plantas que comprende una proteína fluorescente roja (DsRojo2) y un marcador seleccionable PAT se construyó que comprende los siguientes componentes operablemente enlazados: ubi pro::ubi 5'UTR::ubi intron: : DsRed2 : :moPAT: : pinll Una construcción de DNA, PHP 23714, que comprende una proteina fluorescente de ciano (AmCyan) para el suministro a células de planta se construye que comprende los siguientes componentes operablemente enlazados: ubi pro::ubi ' 5'UTR::ubi intron: :AmCyanl: :moPAT: :pinll B. Vectores de Agrobacterium Los plásmidos binarios de Agrobacterium se hacen utilizando el sistema híbrido descrito por Komari y colaboradores, ((1996) Plant J 10:165-174). Los derivados de pSBll se construyen como construcciones de T-DNA intermedias que contienen la configuración deseada entre las secuencias de borde de T-DNA. El plásmido pSBll se obtiene de Japan Tobacco Inc. (Tokyo, Japón) . La construcción de pSBll del pSB21, y la construcción de pSB21 de los vectores de inicio, es descrito por Komari y colaboradores, ((1996) Plant J 10:165-174). La descripción de la integración del plásmido T-DNA en el plásmido superbinario pSBl mediante recombinación homologa se puede encontrar en EP672752 Al. El plásmido pSBl también se obtiene de Japan Tobacco Inc. Estos plásmidos se utilizan para la transformación mediada por Agrobacterium después de la elaboración del co-ingregante en LBA4404. Las células electrocompetentes de la cepa de Agrobacterium LBA4404 que alberga pSBl se crean utilizando el protocolo como es descrito por Lin (1995) in Methods in Molecular Biology , ed. Nickoloff, J.A. (Humana Press, Totowa, NJ) . Las células y el DNA se preparan para electroporacion al mezclar 1 µ? de DNA de plásmido (-100 ng) con 20 µ? de células competentes en una probeta de separación de electrodo de 0.15 cm (Whatman Biometra #11608-031) de Life Technologies (ahora Whatman Biometra) . La electroporacion se realiza en un dispositivo de Electroporacion Cell-Porator utilizando la unidad de Control de Impulsos (Whatman Biometra #11604-014) en el ajuste de 330 F junto con el Reforzador de Voltaje (Whatman Biometra #11612-017) ajustado a 4 k . El sistema suministra aproximadamente 1.8 kV a las células de Agrobacterium . La recombinación exitosa se verifica mediante el análisis de restricción del plásmido co-integrante después del aislamiento y la transformación nuevamente en células DH5o¡ de E. coli para amplificación. C. Ensamble In vitro de Construcciones de DNA Lineales por la vía de ligación Los vectores de minicromosoma de la construcción de DNA lineal se producen al preparar los fragmentos de DNA componentes tales como las secuencias centroméricas de maíz, marcadores seleccionables (DsRed2 y AmCyan) , origen (es) de replicación (ori) eucarióticos , secuencias teloméricas (TEL) , y el gen que confiere resistencia a bialafos (pAT) bajo el promotor ubicuitina (ubi) . En un ejemplo, los vectores de minicromosoma lineales se hicieron del clon de BAC centromérico bacm. pkl28. j 21 que comprende repeticiones invertidas de arreglos en tándem de CentC que flanquean un elemento de repetición centromérico CRM1. Los fragmentos de DNA se generaron de bacm. pkl28. j 21 mediante la digestión con Notl y la purificación en gel de agarosa. El fragmento purificado que comprende la región centromérica se combinó con fragmentos de digestión de restricción específicos que comprenden marcador (es) seleccionable y el origen de replicación: ubi pro: :ubi 5' UTR: :ubi int ron : : DsRed : : moPAT-18S-26S rDNA NTS (Notl/Spel), y un segundo cásete marcador seleccionable: ubi pro: :ubi 5' UTR::ubi intron : : AmCyan : : moPAT (Notl/Smal ) , y las secuencias teloméricas (Spel/Xhol o Smal/Kpnl) de sus construcciones. Los fragmentos de DNA se prepararon tal que cada fragmento comprendió sitios de reconocimiento únicos para el ensamble in vitro de una estructura lineal única durante la ligación. El vector linealizado ensamblado comprende: TEL- (Spel) -ubi pro: : ubi 5' UTR:ubi int ron :: AmCyan :: moPAT- (Afotl) -bacm.pkl28. 21- (Notl) -ori-ubi pro: :ubi 5' UTR: :ubi intron: : DsRed: :moPAT- (Smal) -TEL D. Construcciones de DNA - vectores del clon BAC Readaptados Circulares Cualquier clon BAC centromérico y/o subtelomérico o clon de fragmento cromosómico se puede readaptar con componentes adicionales para la transformación de plantas. El sistema de Vector de Construcción de Transposón EPICENTRE EZ::TN™ pMOD™-2 MCS (Epicentre Madison, WI, USA) se utiliza para readaptar polinucleótidos de interés en clones BAC existentes. El pMOD-2 es un plásmido basado en pUC con un origen de replicación colEl y múltiples sitios de clonación (MCS) entre los extremos de mosaico de 19 bp hiperativos (ME) reconocidos por EZ-Tn5 transposasa. El transposón Tn5-2 se integra aleatoriamente en cada DNA objetivo, por lo tanto cada reacción de transposición genera una librería pequeña de construcciones que representan diferentes sitios de integración. Las preparaciones de DNA de clones readaptados individuales o un grupo de clones se pueden utilizar para transformación de células de plantas, i. BACs centroméricos Dos representativos de BACs solamente de CentC, bacm. pk018.113 y bacm2. pkl74. o21 , se seleccionaron basado en sus patrones de digestión de enzima de restricción y de hibridación de Southern. Estos clones de BAC se readaptaron utilizando el sistema de construcción EPICENTRE EZ::TN™ pMOD™-2 MCS para generar construcciones de DNA circulares para la transformación de plantas y en ensamble de minicromosoma . El MCS se utilizó para insertar un fragmento de DNA que comprende marcadores seleccionables : ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron : : DsRed : : moPAT con o sin un 18-26S rDNA NTS orí de maíz para producir una primera versión de una construcción de transposón usual, Tn5-ls. Después de la clonación de las secuencias de DNA de interés, el transposón es generado mediante la digestión de enzima de restricción Ps AI . En la integración las construcciones de BAC se transforman en E. coli, los clones positivos seleccionados mediante la hibridación de colonia con las sondas de transposón, y el DNA aislado de clones positivos seleccionados . ii. BACs subteloméricos Seis clones BAC representativos se seleccionaron de la acumúlación de BAC subtelomérica : pool : bacm. pk038. g06, bacm2.pk063.g24, bacm . pk071. cl2 , bacmpkll2. bl8 , bacm. pkl42. bl5 y bacm. pkl73. e09. Nuevas construcciones de transposón Tn5-2 que comprenden 18-26S rDNA NTS ori-ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron :: DsRed :: moPAT, un gen Kanr y sitios para tres diferentes enzimas de restricción de albergamiento : I-Ppol, I-Ceul y PI-SceI, se construyeron y se utilizaron para readaptar los clones BAC subteloméricos. Las construcciones BAC readaptadas se transforman en E. coli y se seleccionan sobre canamicina y cloramfenicol , el DNA se aisla de clones positivos seleccionados. E. Construcciones de DNA - Clones BAC readaptados linealizados Se generaron construcciones de transposón Tn5-3 hechas a la medida, adicionales. Estos vectores Tn5-3 comprenden 18-26S rD A NTS ori-ubi pro: :ubi 5' UTR: :ubi intron : : DsRed : : moPAT . Las construcciones también comprenden un gen Kanr flanqueado por dos segmentos de DNA en orientación invertida cada una compuesta de dos sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción de albergamiento I-Ceul y PI-SceI, y la secuencia telomérica que comprende arreglos de repeticiones teloméricas. Después de la clonación de las secuencias de DNA de interés, el transposón es generado mediante la digestión de enzima de restricción PshAI . En la integración de las construcciones de BAC se transforman en E. coli y se seleccionan sobre canamicina y cloramfenicol , el DNA se aisla de clones positivos seleccionados. El DNA de BAC readaptado recombinante se digiere in vitro con la enzima de restricción de albergamiento (I-Ceul o PI-SceI) convirtiendo el DNA circular en una construcción de' DNA lineal flanqueada con secuencias teloméricas en la orientación correcta, y removiendo el fragmento que comprende Kanr (Figura 13) . Tres tipos de clones BAC centroméricos se readaptaron con este vector Tn5-3: 1. Clon BAC centromérico con bloques invertidos de repeticiones CentC cent roméricas que flanquean un elemento centromérico CRM1 bacm. pkl28. j 21 , sin secuencias CentA o CRM2 ; 2. Clones BAC centroméricos que pertenecen al conjunto de núcleo de clones BAC centroméricos que contienen todas las cuatro repeticiones especificas de centrómero CentA, CentC, CRM1 y CRM2 (Tabla 8); y, 3. Clones BAC centroméricos del cromosoma 4 de maíz (Tabla 9) . Muestras de DNA de cada clon BAC se fraccionan en un gel de agarosa y la banda que contiene la construcción BAC readaptada lineal se extirpa. El DNA es electrodiluido del agarosa y utilizado para la transformación biolistica de los embriones inmaduros Hi-II de 8-11 DAP (días después de la polinización) . Opcionalmente, estas construcciones se pueden utilizar para la microinyección del DNA, o convertir en vectores para la transformación mediada por Agrobacterium. TABLA 8 bacm.pk007.a2 bacm.pkO11.18 bacm.pk001.n1 bacm.pk109.h24 bacm.pk036.e13 bacm.pk012.n20 bacm.pk023.¡5 bacm.pk039.a3 bacm.pk066.j14 bacm.pk013.m8 bacm.pk043.o23 bacm.pk039.m16 bacm.pk075.l6 bacm.pk062.c14 bacm.pk051.g11 bacm.pk041.e16 bacm.pk076.m3 bacm.pk064.n1 bacm.pk056.¡19 bacm.pk077.b21 bacm.pk119.a23 bacm.pk068.p16 bacm.pk076.o15 bacm.pk079.m1 1 bacm.pk133.b10a bacm.pk070.h17 bacm.pk087.m4 bacm.pk085.k5 bacm.pk133.b10b bacm.pk090.o5 bacm.pk089.l8 bacm.pk098.h2 bacm.pk133.b11 bacm.pk098.f3 bacm.pk093.d8 bacm.pk102.¡4 bacm.pk135.¡6 bacm. pk135.17 bacm.pk106.¡20 bacm.pk112.p1 bacm.pk178.c10 bacm2.pk002.g7 bacm.pk129.a4 bacm.pk124.j24 bacm2.pk023.e24 bacm2.pk003.g6 bacm.pk134.f15 bacm.pk143.m18 bacm2.pk064.e1 S bacm2.pk012.g19 bacm.pk135.¡2 bacm.pk148.e2 bacm2.pk066.m12 bacm2.pk013.c9 bacm.pk138.e14 bacm.pk156.i17 bacm2.pk083.a2 bacm2.pk034.q20 bacm.pk141.j4 bacm.pk164.b1 bacm2.pk093.h1 bacm2.pk053.g23 bacm.pk161.h1 bacm.pk166.n7 bacm2.pk099.m24 bacm2.pk070.q7 bacm.pk164.e18 bacm.pk178.o20 bacm2.pk116.g16 bacm2.pk094.f14 bacm.pk179.d4 bacm2.pkD34.i8 bacm2.pk174.e4 bacm2.pk096.d23 bacm2.pk130.e20 bacm2.pk075.n6 bacm2.pk179.b18 bacm2.pk100.i24 bacm2.pk137.f2 bacm2.pk115.022 bacm2.pk179.e1 bacm2.pk179.o14 bacm2.pk158.f12 bacm2.pk169.a21 TABLA 9 F. Construcciones de DNA - Vectores de combinación de BAC múltiples readaptados Los clones BAC centroméricos que pertenecen al conjunto de núcleo de clones BAC centroméricos que contienen todas las cuatro repeticiones especificas de centrómero CentA, CentC, CRM1 y CRM2 (Tabla 8) también se readaptaron con el vector Tn5-2. Las construcciones Tn5-2 que comprenden ori-ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron : : DsRed2 : : moPAT, un gen Kanr, y sitios para tres enzimas de restricción de albergamiento: I-Ppol, I-Ceul, y PI-SceI. Los BACs readaptados se cortaron con enzimas de restricción de albergamiento I-Ceul y PI-SceI, se separaron mediante la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) bajo condiciones estándares: agarosa al 1%, IX TAE, impulso inicial de 5 seg, impulso final de 10 seg, tiempo de corrida total 12 hrs a 12°C. Los fragmentos grandes se purificaron, y se sometieron a ligación para formar construcciones de DNA multiméricas de hasta 1 Mb de largo. EJEMPLO 6 : Transformación de Plantas Se puede utilizar cualquier método de transformación de plantas adecuado. De manera similar cualquier célula y/o tejido de planta que puede ser transformado, cultivado y/o regenerado en una planta puede ser utilizado. Estas células y tejidos de plantas, asi como medios de cultivo y condiciones, métodos de transformación adecuados y medios de regeneración y condiciones son bien conocidos . A. Tipos de células Una variedad de tipos de células de maíz se evaluaron para su potencial como objetivos para la generación de minicromosoma y suministro de construcción, incluyendo las células de su suspensión del Dulce Mexicano Negro (Black Mexican Sweet) (BMS), células de meristema, cigoto, células escutelares en el embrión inmaduro, células en embriones somáticos cultivados, la célula central y células de endosperma tempranas. Métodos están disponibles para producir embriones aploides al cruzar un genotipo dado a la linea RWS, u otra linea inductora. Los embriones inmaduros haploides podrían ser un buen objetivo para el suministro de minicromosoma, ya sea en células escutelares 10-12 días después de la polinización (DAP) o en los meristemas apicales expuestos de embriones de etapa coleoptilar (7-8 DAP) . Comparaciones importantes sobre el comportamiento de minicromosomas introducidos en ya sea un ambiente diploide o haploide podría ser realizado, por otra parte, si la introducción de minicromosoma es seguido por el duplicamiento de cromosoma químicamente inducido (por ejemplo colquicina, u óxido nitroso) , estos embriones haploides duplicados pueden ser rápidamente regenerados para producir una línea endogámica que contiene minicromosoma. Todos los tipos de células diploides y haploides mencionadas en lo anterior se pueden convertir en cultivos de suspensión y/o protoplastos , o cultivos de suspensión establecidos, tal como BMS que son adecuados y pueden ser utilizados para la transformación. Las células de suspensión y/o protoplastos pueden proporcionar fácil accesibilidad y claridad óptica para el monitoreo microscópico después del suministro de la construcción de DNA. Cualquier método adecuado para el suministro de la construcción al cultivo de protoplastos de planta puede ser utilizado, incluyendo la electroporación estándar y los métodos de suministro directos mediados por PEG, ver por ejemplo, Ch. 8, pp . 189-253 in Advances in Cellular y Molecular Biology of Plants, Vol. 5, Ed. Vasil, Kluwer Acad Publ (Dordrecht, The Netherlands) 1999. B. Microinyección de maíz Cualquier método adecuado para microinyección de células de plantas, tejidos y/o embriones se puede utilizar. Además, cualquier composición o combinación/mezcla de composiciones se puede inyectar, incluyendo polinucleótidos , polipéptidos , cofactores, sustancias químicas, adyuvantes y los similares. El suministro directo en un cigoto proporciona una oportunidad para producir una planta transgénica si las etapas intermedias del cultivo y regeneración de tejido. Por ejemplo, la microinyección de maíz se puede hacer esencialmente como es descrito en la patente norteamericana 6,300,543. Brevemente, los óvulos de maíz inmaduros se seccionan para producir rebanadas nucelares que comprenden el saco embriónico, que es dirigido para el suministro de microinyección de la composición de transformación. Después de la microinyección, los sacos embriónicos se cultivan en los medios apropiados para la propagación y regeneración de plantas . C. Transformación mediada por Agroá cteriu/n La transformación mediada por Agrobacterium del maíz se realiza esencialmente como es descrito por Zhao (W098 /32326 ) . Brevemente, los embriones inmaduros se aislan de óvulos de maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium que contiene un T-DNA, donde las bacterias son capaces de transferir la construcción de DNA a por lo menos una célula de por lo menos uno de los embriones inmaduros. Opcionalmente , el tejido objetivo puede ser co-transformado con múltiples líneas de Agrobacterium que comprenden T-DNAs con diferentes construcciones de DNA y/o polinucleótidos de interés.

Etapa 1: Etapa de Infección. Los embriones inmaduros se sumergen en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la inoculación. Etapa 2: Etapa de Co-cultivo. Los embriones se co-cultivan durante un tiempo con el Agrobacterium . Etapa 3: Etapa de Reposo. Opcionalmente , después del co-cultivo, se puede realizar una etapa de reposo. Los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación del Agrobacterium y para una fase de reposo para las células infectadas . Etapa 4: Etapa de Selección. Los embriones inoculados se cultivan en el medio que contiene un agente selectivo y el callo transformado en crecimiento se recupera. Los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido con un agente selectivo que da por resultado el crecimiento selectivo de células transformadas. Etapa 5: Etapa de Regeneración. Los callos cultivados sobre el medio selectivo se cultivan sobre medio sólido para regenerar las plantas. D. Bombardeo de Partículas del Maíz Los embriones de maíz inmaduros se bombardean con una construcción de DNA circular o lineal que comprende una secuencia centromérica de maíz aislada, y opcionalmente región (es) subtelomérica , origen (es) de replicación, sitio (s) de acoplamiento de recombinación, polipéptido ( s ) y/o marcadores, por ejemplo un gen marcador seleccionable tal como PAT (Wohlleben y colaboradores, (1988) Gene 70:25-37) que confiere resistencia al herbicida Bialaphos, u otro marcador seleccionable adecuado o marcador (es) es clasificable , tal como RFP y/o CFP. La construcción también puede comprender otros genes marcadores, o ser co-transformada con construcciones de polinucleótido adicionales que comprenden marcadores. La transformación se realiza esencialmente como sigue. Mazorcas de maíz inmaduras de 8-11 DAP se esterilizan en la superficie en una solución de blanqueador al 30% más micro detergente de 0.5% durante 20 minutos, y se enjuagan dos veces con agua estéril.' Los embriones inmaduros se extirpan, se coloca el lado del eje del embrión hacia abajo (lado del escutelo hacia arriba) , 50 embriones por placa, en el medio 560L durante 1-3 días a 26°C en la oscuridad. Antes de la transformación los embriones inmaduros se transfieren sobre el medio 560Y durante 4 horas, y luego se alinean dentro de la zona objetivo de 2.5 cm en la preparación para el bombardeo. El DNA se precipita sobre pelotillas de oro de 0.6 ym (diámetro promedio) utilizando un lipido catiónico soluble en gua Tfx™-50 (Cattt E1811, Promega, Madison, WI, USA) como sigue: preparar la solución de DNA sobre hielo utilizando 1 pg de construcción de DNA centromérica de maíz (10 µ?) ; opcionalmente otras construcciones para el co-bombardeo tal como 50 ng (0.5 µ?) de PHP21875 (BBM) , y 50 ng (0.5 µ?) de PHP21139 (WUS) ; mezclar la solución de DNA. Al DNA premezclado adicionar 20 µ? de partículas de oro preparadas (15 mg/ml) en agua; 10 µ? de Tfx-50 en agua; mezclar cuidadosamente. Esto se puede almacenar sobre hielo durante la preparación de macroportadores , de manera típica aproximadamente 10 min. Formar en pelotillas las partículas de oro en una microcentrí fuga 10,000rpm durante 1 min, remover el sobrenadante. Enjuagar cuidadosamente la pelotilla con 100 mi de EtOH al 100% sin resuspender la pelotilla, remover cuidadosamente el enjuague de EtOH. Adicionar 20 µ? de EtOH al 100% y resuspender cuidadosamente las partículas mediante breve sonicación, 10 µ? se manchan sobre el centro de cada macroportador y se deja secar aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Las placas de muestra de los embriones objetivo de maíz se bombardean dos veces por placa utilizando aproximadamente 0.5 µg de DNA por disparo utilizando el dispositivo Bio-Rad PDS-1000/He (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) con una presión de ruptura de 450 PSI, una presión de vacío de 27-28 pulgadas de Hg, y una distancia de vuelo de partícula de 8.5 cm. Después del bombardeo, los embriones se transfieren al medio sólido 560P mantenido en la oscuridad a 26°C durante 4-6 días, luego se transfieren al medio de selección 560R que contiene 3 mg/L de Bialaphos, y se subcultivan cada dos semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callo resistentes a la selección se transfieren al medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la modulación del embrión somático (2-4 semanas), los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren al medio 272V para la germinación y se transfieren al cuarto de cultivo alumbrado. Aproximadamente 7-10 días después, las plantitas en desarrollo se transfieren al medio libre de hormonas 272V en tubos por 7-10 días hasta que las plantitas son bien establecidas. Las plantas luego se transfieren a insertos en cajones semilleros (equivalente a maceta de 2.5") que contiene tierra de maceta y se cultivan durante 1 semana en una cámara de crecimiento, subsecuentemente se cultivan 1-2 semanas adicionales en el invernadero, luego se transfieren a 600 macetas clásicas (1.6 galones) y se cultivan hasta la madurez . E. Bombardeo de Partículas para Soya Un polinucleótido, una mezcla de polinucleótidos , y opcionalmente , polipéptido ( s ) se puede introducir en cultivos de suspensión embriogénicos de soya mediante el bombardeo de partículas utilizando esencialmente los métodos descritos en Parrott y colaboradores, (1989) Plant Cell Rep 7:615-617.

Este método, con modificaciones, es descrito enseguida. La semilla se remueve de las vainas inmaduras y los cotiledones de menos de 4 mm en longitud se seleccionan. Las semillas se esterilizan durante 15 minutos en una solución blanqueadora al 0.5% v/v y luego se enjuagan con agua destilada estéril. Los cotiledones inmaduros sé extirpan al primero cortar lejos de la porción de la semilla que contiene el eje del embrión. Los cotiledones luego se remueven del recubrimiento de semilla al jalar suavemente el extremo distante de la semilla con el extremo despuntado de la cuchilla de escalpelo. Los cotiledones luego se colocan en cajas petri (lado plano hacia arriba) con el medio de iniciación SB1. Las cajas petri se incuban en la luz (16 hr día; 75-80 µ?) a 26°C. Después de 4 semanas de incubación los cotiledones se transfieren al medio SB1 fresco. Después de dos semanas adicionales, los embriones somáticos de etapa globular que exhiben áreas proliferativas se extirpan y se transfieren al medio liquido FN Lite (Samoylov y colaboradores, (1998) In Vitro Cell Dev Biol Plant 34:8-13). Aproximadamente 10 a 12 agrupaciones pequeñas de embriones somáticos se colocan en matraces de 250 mi que contienen 35 mi de medio SB172. Los cultivos de suspensión embriogénicos de soya se mantienen en 35 mi de medio liquido sobre un agitador rotatorio, 150 rpm, a 26°C con luces fluorescentes (20 µ?) sobre un programa de dia/noche de 16:8 horas. Los cultivos se sub-cultivan cada dos semanas al inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio líquido. Los cultivos de suspensión embriogénicos de soya luego se transforman utilizando un bombardeo con pistola de partículas (Klein y colaboradores, (1987) Nature 327:70; patente norteamericana 4,945,050). Un instrumento BioRad Biolisticá PDS1000/HE se puede utilizar para estar transformaciones. Un gen marcador seleccionable se puede utilizar para facilitar la transformación de soya por ejemplo un cásete de expresión se puede utilizar el cual comprende el promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor (Odell y colaboradores, (1985) Nature 313:810-812), el gen higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz y colaboradores, (1983) Gene 25:179-188) y la región 3' del gen nopalina sintasa del T-DNA del plásmido Ti de Agrobacteri um turnefaciens . A 50 µ? de una suspensión de partículas de oro de 1 pm de 60 mg/mL se adiciona (en orden): 5 µ? de DNA (1 pg/pL) , 20 µ? de espermidina (0.1 M) , y 50 µ? de CaCl2 (2.5 M) . La preparación de partículas se agita durante 3 minutos, se gira en una microcentrífuga durante 10 segundos y el sobrenadante se remueve. Las partículas recubiertas de DNA se lavan una vez en 400 µ? de etanol al 70% luego se resuspenden en 40 µ? de etanolanhidro . La suspensión de DNA/partícula se sónica tres veces durante un segundo cada uno. Cinco µ? de las partículas de oro recubiertas de DNA luego se cargan sobre cada disco macroportador. Aproximadamente 300-400 mg del cultivo de suspensión de dos semanas de edad se coloca en una caja petri de 60x15 mm vacía y el líquido residual se remueve del tejido con una pipeta. La presión de ruptura de membrana se ajusta a 1100 psi y la cámara se evacúa a un vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente 8 cm lejos de la criba de retención, y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido se divide a la mitad y se coloca en dos matraces separados con 35 mi del medio FN Lite por matraz. Cinco a siete días después del bombardeo, el medio líquido se intercambia de medio fresco. Siete días de post bombardeo el medio se intercambia con medio fresco que contiene 50 mg/mL de higromicina. Este medio selectivo se renueva cada semana. Siete a ocho semanas después del bombardeo, el tejido transformado verde será observado creciendo de las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. El tejido verde aislado se remueve y se inocula en matraces individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados, clonalmente propagados. Cada nueva línea se trata como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones luego se subcultivan y se mantienen como agrupaciones de embriones inmaduros, o el tejido se regenera en plantas completas mediante maduración y germinación de embriones individuales. Para la regeneración, los eventos se remueven del cultivo liquido y un proceso de maduración se inicia sobre medio sólido. Las agrupaciones embriogénicas se remueven del liquido SB196, se manchan sobre papel filtro estéril, y se colocan sobre medio de agar sólido SB166 durante 1-2 semanas. Grumos de tejido se rompen o se aplastan levemente con una cuchara. Aproximadamente 10-20 grumos de tejido de aproximadamente 4-5 mm de diámetro se subcultivan durante 3 semanas sobre SB103 o SB148, para generar embriones. Los embriones se cultivan durante 4-6 semanas a 26°C bajo bulbos fluorescentes blancos frío y Agro (40 watt) en un fotoperiodo de 16:8 hr con intensidad de luz de 90-120 µ?/???2=. Después de 4-6 semanas de maduración, los embriones individuales se desecan al colocar en una caja petri estéril (60 x 25 mm) grande sellada con cinta de fibra, o se colocan en una caja de plástico (sin cinta de fibra) durante 4-7 días. Los embriones de secado se plantan en medio SB71-4 sólido en ya sea un recipiente de cultivo redondo ventilado (RCV) o en la caja petri de 100x25 mm, y se germinan a 26°C bajo bulbos fluorescentes blancos fríos y Agro (40 watt) en un fotoperiodo de 16:8 hr con intensidad de luz de 90-120 pE/m2s para producir plantitas. Las plantitas se colocan en macetas a charolas de paquetes de células y se colocan en una incubadora en condiciones de fotoperiodo de 16 hr, temperatura de día/noche a 26°C/24°C durante aproximadamente 2 semanas antes del transplante a la tierra para la producción de semilla. F. Medios de cultivo de células de plantas El medio 560L comprende 4.0 g/L de sales básales N6 (Sigma C-1416), 1.0 ml/L de Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X Sigma 1511), 0.5 mg/L de HCl de tiamina, 20 g/L de sacarosa, 1.0 mg/L de 2,4-D y 2.88 g/L de L-prolina (llevada a volumen con H20 D-I después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 2.0 g/L Gelrite® adicionado después de llevar al volumen con H20 D-I); y 8.5 mg/L de nitrato de plata (adicionado después de' esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente) . El medio 560P comprende 4.0 g/L de sales básales N6 (Sigma C-1416), 1.0 ml/L de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000X Sigma 1511), 0.5 mg/L de HCl de tiamina, 30 g/L de sacarosa, 2.0 mg/L 2,4-D, y 0.69 g/L de L-prolina (llevada a volumen con H20 D-I después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 3.0 g/L de Gelrite® (adicionado después de llevar a volumen con H20 D-I); y 0.85 mg/L de nitrato de plata (adicionado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente) . El medio 560Y comprende 4.0 g/L de sales básales N6 (Sigma C-1416), 1.0 ml/L de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000X Sigma 1511), 0.5 mg/L de HCl de tiamina, 120 g/L de sacarosa, 1.0 mg/L de 2,4-D, y 2.88 g/L de L-prolina (llevada a volumen con H20 D-I después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 2.0 g/L de Gelrite® (adicionado después de llevar a volumen con H20 D-I); y 8.5 mg/L de nitrato de plata (adicionado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente) . El medio 560R comprende 4.0 g/L de sales básales N6 (Sigma C-1416), 1.0 ml/L de Mezcla de Vitaminas de Eriksson (1000X Sigma 1511), 0.5 mg/L de HC1 de tiamina, 30.0 g/L de sacarosa y 2.0 mg/L de 2,4-D, (llevado a volumen con H20 D-I después del ajuste a pH 5.8 con KOH) ; 3.0 g/L de Gelrite® (adicionado después de llevar a volumen con H20 D-I); y 0.85 mg/L de nitrato de plata y 3.0 mg/L de bialafos (ambos adicionados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente) . El medio 288 J comprende: 4.3 g/L de sales IMS (Gibco 11117-074), 5.0 ml/L de solución de extracto de vitaminas MS (0.100 g/L de ácido nicotinico, 0.02 g/L de HC1 tiamina, 0.10 g/L de HC1 de piridoxina y 0.40 g/L de glicina llevado a volumen con H20 D-I) (Murashige & Skoog (1962) Physiol Plant 15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 0.5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarosa, y 1.0 ml/L de ácido abscisico de 0.1 mM (llevado a volumen con H20 D-I después de ajustar al pH 5.6); 3.0 g/L de Gelrite (adicionado después de llevar a volumen con H20 D-I); y 1.0 mg/L de ácido indoleacético y 3.0 mg/L de bialafos (adicionado después de esterilizar el medio y enfriar a 60°C) .

El medio 272V comprende: 4.3 g/L de sales S (Gibco 11117-074), 5.0 ml/L de solución de extracto de vitaminas MS (0.100 g/L de ácido nicotinico, 0.02 g/L de HCl de tiamina, 0.10 g/L de HCl de piridoxina y 0.40 g/L de glicina (llevado a volumen con H20 D-I), 0.1 g/L de mio-inositol, y 40.0 g/L de sacarosa (llevado a volumen con H20 D-I después de ajustar el pH a 5.6); y 6 g/L de bacto-agar (después de llevar a volumen con H20 D-I), esterilizado y enfriado a 60°C. El medio SB1 comprende sales MS (Gibco/BRL - Cat# 11117-066, 1 pk/L) , extracto de vitaminas B5 1 ml/L, 20 mg/L de 2,4-D, 31.5 g/L de sacarosa, 8 g/L de TC Agar, pH 5.8. Extracto 1000X de Vitaminas B5 comprende 10 g de mio-inositol, 100 mg de ácido nicotinico, 100 mg de HCl de piridoxina, 1 g de tiamina, H20 D-I a 100 mi, formar en alícuota y almacenar a -20°C. G. Aislamiento de DNA de los Tejidos del Callo y de la Hoja Los eventos de transformación putativos se pueden clasificar para la presencia del transgen. El DNA genómico se puede extraer de callos, hojas u otros tejidos utilizando la separación de núcleos de plantas, lisis y purificación de HMW, o alternativamente utilizando una modificación del método de CTAB (bromuro de cetiltrietilamonio, Sigma H5882) descrito por Stacey & Isaac (1994 In Methods in Molecular Biology Vol . 28, pp . 9-15, Ed. P. G. Isaac, Humana Press, Totowa, NJ) . Aproximadamente 100-200 mg de tejido congelado se muele en polvo en nitrógeno liquido y se homogeniza en 1 mi de solución reguladora de extracción CTAB (CTAB 2%, EDTA 0.02 M, Tris HC1 0.1 M pH 8, NaCl 1.4 M, DTT 25 mM) durante 30 min a 65°C. Las muestras homogenizadas se dejan enfriar a temperatura ambiente durante 15 min antes de que se haga una sola extracción de proteina con aproximadamente 1 mi 24:1 v/v de cloroformo : octanol . Las muestras se centrifugan durante 7 min a 13,000 rpm y la capa superior de sobrenadante se recolecta utilizando puntas de pipeta de boca amplia. El DNA se precipita del sobrenadante mediante incubación en etanol a 95% sobre hielo durante 1 h. Hebras de DNA se acumulan sobre un gancho de vidrio, se lavan en etanol al 75% que contiene acetato de sodio 0.2 M durante 10 min, se secan con aire durante 5 min y se resuspenden en solución reguladora de TE. Cinco µ? de RNAsa A se adiciona a las muestras y se incuba a 37 °C durante 1 h. Para la cuantificación del DNA genómico, la electroforesis en gel se realiza utilizando un gel de agarosa al 0.8% en solución reguladora lx TBE. Un microlitro de cada una de las muestras se fracciona a lo largo de 200, 400, 600 y 800 ng µ?-l ? de marcadores de DNA no cortados. EJEMPLO 7. Resultados de la Transformación Los embriones de maíz Hi-II inmaduros en 8-11 DAP se transformaron mediante el bombardeo de partículas esencialmente como es descrito en el Ejemplo 6D. Junto con la construcción (es) de DNA de BAC readaptado, los embriones se cotransformaron con los vectores ODP2, WUS y/o ODP2+ US. En dos semanas de post-bombardeo, las células transformadas han proliferado para formar un callo embriogénico con múltiples embriones somáticos. Algunos de estos embriones somáticos expresaron el gen marcador DsRed2 fluorescente indicativo de herencia estable. Los embriones somáticos individuales se extirparon y se propagaron como eventos transgénicos independientes sobre el medio de selección de Bialophos. El cultivo de callo clonalmente propagado se estableció de cada evento. Una clasificación primaria de cada evento de transformación se hizo utilizando FISH. Los embriones somáticos individuales se utilizaron para hacer dispersiones cromosómicas para FISH como es descrito en el Ejemplo 8. Cada evento se caracterizó utilizando sondas FISH separadas al marcador mo-PAT/DsRed2 (PHP23715), y la repetición centromérica en tándem de CentC para detectar el marcador transgénico y la herencia de secuencia de DNA centromérica, respectivamente . Después de la clasificación primaria, los eventos de transformación seleccionados de interés se transfirieron a los medios de regeneración para producir plantitas, que se transfirieron eventualmente a la tierra para recuperar las plantas. Después de un periodo de crecimiento, las plantas seleccionadas se clasificaron por una segunda vez mediante el análisis de FISH de aplastamiento de punta de raíz para reafirmar la herencia. A. Experimentos de co-transformación de BACS acumulados Los embriones se co-transformaron con acumulaciones de construcciones de DNA. Estas acumulaciones pueden comprender combinaciones de construcciones de DNA derivadas de clones BAC que comprenden repeticiones centroméricas de maiz, construcciones de DNA derivadas de clones BAC que comprenden segmentos de DNA teloméricos y/o subteloméricos , plásmido de marcador visual PHP23715 y polinucleótidos que codifican proteínas aumentadoras de crecimiento Proteína-2 de Desarrollo de Óvulo, ODP-2 (PHP21875) y plásmidos Wushel (PHP21139). Las construcciones de DNA derivadas de los clones BAC centroméricos incluyeron clones BAC que tienen CentC solamente, CRM2 solamente, CentC y CRM2 solamente, y BACs de núcleo que tienen todas las cuatro repeticiones centroméricas CentA, CentC, CRM 1 y CRM2. El análisis de FISH de 80 callos transformados con BACs acumulados que comprenden DNA centromérico revelaron 42 eventos citogénicamente detectables de nuevas agrupaciones de CentC en sitios de centrómero adicionales a los normales. En algunos casos, los elementos centroméricos de maíz utilizados para la transformación insertados en los cromosomas nativos, dan por resultado estructuras dicéntricas. Estas inserciones de secuencias de DNA centroméricas variaron en tamaño (número de repeticiones) , número de inserciones por cromosoma (hasta 3 detectables en un solo cromosoma) , y número de cromosomas con inserciones (hasta 4 cromosomas con por lo menos una inserción) y todas las inserciones co-localizadas con la sonda de plásmido marcador RFP. Esto indica que los fragmentos de DNA exógenos se pueden ensamblar en bloques grandes e integrar en un cromosoma de maíz. B. Transformación con construcciones de DNA de prototipo de minicromosoma lineales ensambladas mediante la ligación in vitro de un clon BAC centromérico, secuencias teloméricas y secuencias marcadoras. El clon de BAC Mol7, bacm. pkl28. j 21 , con la orientación invertida de repeticiones en tándem de CentC se identificó como es descrito en el Ejemplo ID. Las secuencias teloméricas se generación mediante la amplificación de PCR de oligonucleótidos teloméricos y se clonaron en un vector de plásmido. Una construcción de DNA lineal se generó a partir de este clon BAC mediante el ensamble in vitro con marcadores seleccionables (moPAT, AmCyanl, DsRed2) , un origen de replicación (ori) de 18-26S rRNA NTS y secuencias teloméricas (TEL) . Cada fragmento de DNA tuvo sitios de reconocimiento que permitieron el ensamble de una estructura única en la ligación. La construcción linealizada ensamblada comprende: TEL- (Spel) -ubi pro:: ubi 5' UTR::ubi intron : : AmCyan : : moPAT- (IVotl) -bacm. pk.128 J21- (Notl) -ori-ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron: : DsRed: :moPAT- (Smal) -TEL La mezcla de ligación completa, que contiene la construcción ensamblada asi como subproductos de la ligación, se suministró de embriones Hi-II inmaduros por la vía de la transformación biolistica. Más de 200 eventos se propagaron como clones de callo individuales basados en la selección de marcador fluorescente y seleccionable (PAT) . Tres grupos de clones se recuperaron; aquellos que mostraron solamente rojo (72), solamente azul (83) o ambos marcadores fluorescentes (137) . Los eventos que expresan ambos marcadores se seleccionaron para el análisis adicional mediante FISH. Además de los eventos de integración simples, un número de múltiples eventos de integración se observaron ya sea en el mismo cromosoma, o en diferentes cromosomas. En dos eventos los inventores observaron rearreglos cromosómicos . Los sitios de inserción adicionales de la repetición centromérica CentC co-localizada con la sonda marcadora PHP23715 sugiriere la formación de cromosoma dicéntrico posible. El análisis de división de células en anafase mostró puentes cromosómicos consistentes con la presencia de cromosomas dicéntricos con dos centrómeros funcionales debido a la integración de las secuencias de DNA de CentC centroméricas exógenas. La función centromérica es indicada por la formación de cromosomas dicéntricos, la aparición de puentes cromosómicos en anafases, y la inducción de roturas cromosómicas . Estos resultados indican que los elementos cromosómicos pueden autoensamblarse dentro de la célula de la planta en bloques de multicopias, asociarse con proteínas de cromatina, y algunos casos pueden adquirir función centromérica . Un evento mostró un cromosoma 6 rearreglado que tiene dos sitios de inserción de la construcción de DNA centromérica cercana a la región de organización nucleolar ( OR) , así como una estructura similar a minicromosoma adicional con una región centromérica grande y un sitio de inserción pequeño adicional de la construcción de DNA centromérica. La citología de este evento puede ser una indicación del rompimiento cromosómico debido a la formación de un cromosoma dicéntrico. C. Transformación con clones BAC acumulados readaptados linealizados Varios clones BAC se readaptaron con el transposón hecho a la medida Tn5-3 utilizando el sistema transposasa (EPICENTRE EZ::TN™ pM0D™-2 MCS Transposon Construction Vector system (Epicentre, Madison, WI, USA) ) esencialmente como es descrito en el Ejemplo 5E. Ellos se linealizaron y se utilizaron para la transformación biolística de embriones inmaduros Hi-II de maíz: 1. Siete diferentes variantes del clon bacm . pkl28. j 21 readaptado con bloques invertidos de repeticiones CentC centroméricas que representan diferentes inserciones generadas de transposasa en el mismo clon BAC se acumularon; 2. 84 clones BAC de conjunto de núcleos centroméricos readaptados se combinaron para generar 4 acumulaciones con 21 variantes individuales cada una (Tabla 8) . Cada una de las cuatro acumulaciones se utilizó individualmente para la transformación biolistica; 3. Clones BAC centroméricos readaptados del cromosoma 4 se dividieron en 2 acumulaciones que contienen tres clones BAC de B73 y tres clones BAC de ol7 (Tabla 9) ; y 4. La acumulación 1 de la Tabla 8, se dividió en 4 subacumulaciones de 5 o 6 clones BAC de conjunto de núcleos centroméricos readaptados (Tabla 10). Cada una de las subacumulaciones se utilizó individualmente para la transformación biolistica. TABLA 10 Para cada ejemplo anterior, los embriones inmaduros Hi-II se cotransformaron con los vectores de expresión 0DP2, WUS, y/o 0DP2+WUS y las acumulaciones de BAC readaptadas. Varias clases diferentes de eventos de integración se encontraron cuando las construcciones readaptadas linealizadas de los clones BAC se utilizaron para transformación. Por ejemplo, cuando las construcciones de los bloques invertidos que contienen BAC de repeticiones CentC centroméricas (bacm . pkl28. j 21 ) , o acumulaciones readaptadas o subacumulaciones del conjunto de núcleo de clones BAC se utilizaron para transformación: 1. Integraciones individuales en regiones eucromáticas de cromosomas hospederos; 2. Integraciones múltiples en regiones eucromáticas de cromosomas hospederos; 3. Integraciones individuales en región centromérica de cromosomas hospederos; 4. Integraciones múltiples en las regiones centroméricas de cromosomas hospederos; 5. Integraciones que dieron por resultado rupturas de cromosoma, tal como nuevas variantes inusuales de cromosomas de maíz con brazos cromosómicos reducidos, o duplicación de ciertas regiones cromosómicas, por ejemplo, un cromosoma 6 con dos NORS, o formación de cromosoma dicéntrico; 6. Amplificación local de las construcciones marcadoras y centroméricas en la integración; 7. Amplificación de las construcciones marcadoras y centroméricas en segmentos de cromatina extracromosómicos en algunas células; 8. Creación de nuevos minicromosomas que tienen un centromero funcional similar a cromosomas nativos, por ejemplo segregación autónoma en mitosis. Estas observaciones indican que el clon BAC centromérico readaptado bacm.pkl28.j21 y el conjunto de núcleos readaptado de clones BAC acumulados son capaces de inducir una variedad de efectos citogenéticos tal como la formación de cromosoma dicéntrico, rupturas cromosómicas , amplificación local de construcciones transgénicas y formación de elementos extracromosómicos, es decir, minicromosomas . Los eventos de minicromosoma exitosos que resultaron de la readaptación de un solo BAC o acumulación de BACs específicos de centromero con la construcción Tn5-3 y su linealización subsecuente en una construcción de transformación lineal se describen enseguida: 1) conjunto de núcleo de la Acumulación 1 de BACs específico centromérico (Tabla 8) o subacumulaciones de la Acumulación 1 (Tabla 10); 2) conjunto de núcleo de la Acumulación 3 de BACs específico centromérico (Tabla 8); 3) un solo clon BAC, bacm . pkl28. j 21 , con repeticiones CentC invertidas; y 4) tres clones BAC específicos del centrómero del cromosoma 4 de B73 (Tabla 9) . El primer evento de minicromosoma de maíz (evento #14 de acumulación 1 de CMC3) se encontró entre los eventos generados mediante la transformación biolística con la acumulación 1 de BAC de conjunto de núcleo readaptado de Tn5-3 linealizado (Tabla 8) . En el medio selectivo los callos embriogénicos activamente el crecimiento expresaron el marcador visual DsRed2. Los análisis de FISH en etapa de metafase mostraron 0, 1, 2 o 3 minicromosomas adicionales que tienen varias formas y tamaños (Figuras 1-4). En este evento, 60-80 núcleos examinados tuvieron 1, 2 o 3 minicromosomas junto con el complemento normal de 20 cromosomas nativos. Estos cromosomas artificiales variaron en tamaño de aproximadamente 20% a aproximadamente 50% del cromosoma de maíz nativo promedio como es medido en metafase. Las mediciones preliminares en prometafase muestran los minicromosomas relativamente sin cambio en tamaño, mientras que los cromosomas nativos son aproximadamente 4-5 veces más largos, por lo tanto los minicromosomas medidos en esta etapa son aproximadamente 5% a aproximadamente 15% de la longitud de un cromosoma de prometafase de maíz nativo promedio. Como es determinado por FISH los minicromosomas están predominantemente compuestos de repeticiones centroméricas y componente Tn5-3. Varios ejemplos de formación de cromosoma de anillo que tienen organización más compleja también se observaron. Estos minicromosomas recientemente formados son aparentemente capaces de replicacion y segregación durante la mitosis (Figura 4), sin embargo, la segregación no es perfecta y se observó algo de no disfunción, dando por resultados células con un cambio en el número de minicromosomas. El callo del evento #14 de la acumulación 1 de CMC3 se conservó activamente creciendo bajo selección por al menos 10 meses, se muestreo en varios puntos de tiempo y se analizó mediante FISH para demostrar el mantenimiento estable del minicromosoma a través de muchas rondas de división celular mitótica. Este evento, evento #14 de la acumulación 1 de CMC3, también se analizó mediante FISH para la presencia de telómeros utilizando las sondas overgo Telo-31 (SEQ ID NOS: 192 & 193) utilizando núcleos de metafase de callo. Dos de cuatro focos positivos de telo-31 se observaron sobre cada minicromosoma, en donde los dos focos observados pueden representar 4 focos separados que no pueden ser distinguidos en esta solución. La intensidad de la señal telo-31 fue generalmente más débil sobre el minicromosoma como es comparado con la señal observada para los cromosomas nativos en cada muestra. Las plantas se regeneraron de este evento y sus puntas de raíz se analizaron con FISH para determinar si el minicromosoma ( s ) fue heredable a través de las divisiones mitóticas sucesivas en un ambiente de invernadero. Cinco de 19 plantas regeneradas de este evento de transformación mostraron la presencia de un minicromosoma ( s ) . Cuatro plantas tuvieron una alta incidencia de núcleos con un solo minicromosoma más el complemento normal de 20 cromosomas nativos. La quinta planta tuvo una mayoría de estos núcleos con 1, 2 o 3 rainicromosomas más el complemento normal de 20 cromosomas nativos. Todos los minicromosomas descritos en lo anterior estuvieron comprendidos predominantemente de repeticiones centroméricas y componentes Tn5-3. Subsecuentemente, la acumulación 1 de BAC de conjunto de núcleo readaptada además se dividió en cuatro subacumulaciones que tienen 5-6 de los clones BAC de conjunto de núcleo readaptado (Tabla 10) . Los análisis de FISH demostraron la presencia de minicromosoma ( s ) en callo embriónico generado por las subacumulaciones 1.1 y 1.3. Dos eventos de minicromosoma se produjeron de la subacumulación 1.1: el primer evento tuvo el complemento normal de 20 cromosomas, más 1 minicromosoma que no híbrido al marcador •PHP23715 o CentC a un nivel detectable; el segundo evento mostró 24-28 cromosomas, 3 copias del cromosoma 6 y 1 minicromosoma. Basado en las observaciones de FISH, este minicromosoma fue positivo para CentC, pero no fue consistentemente positivo para la sonda PHP23715. Este evento puede haber sido producido mediante la integración y ruptura de un cromosoma nativo, y/o condiciones producidas por o que resultan de la aneuploide. 5 eventos producidos de la subacumulación 1.3. Tres de los cinco eventos aparecieron para ser formación de minicromosoma de novo y tuvieron el complemento normal de 20 cromosomas más 1 minicromosoma, y los minicromosomas fueron positivos para el marcador PHP23715 y CentC mediante el análisis de FISH de eventos de callo primario en metafase. Uno de estos eventos, evento #27 de la subacumulación 1.3 de C C3, se analizó adicionalmente mediante FISH para la presencia de telómeros utilizando . las sondas overgo Telo-31 (SEQ ID NOS: 192 & 193) utilizando núcleos de metafase de callo. Este evento tiene un minicromosoma muy pequeño con dos focos CentC fuertes y dos focos Telo-31 sobre cada minicromosoma. Los dos focos Telo-31 observados pueden representar cuatro focos separados que no pueden ser distinguidos en esta resolución. Este evento tiene un minicromosoma más pequeño que el observado en eventos previos. Cuando se mide en metafase, el minicromosoma es de aproximadamente 0.5 a 1 miera en longitud, que es aproximadamente un tercio a aproximadamente la mitad del tamaño de los minicromosomas en otros eventos independientes. La señal FISH para telo-31 fue generalmente más débil sobre el minicromosoma que sobre los cromosomas nativos. El callo del evento #27 de la subacumulación 1.3 de C C3 ha estado creciendo activamente bajo la selección durante aproximadamente 10 meses, se muestreó en varios puntos de tiempo y se analizó mediante FISH para demostrar el mantenimiento estable del minicromosoma a través de muchas rondas de división celular mitótica. Los dos de otros eventos de subacumulación 1.3 tuvieron 19 cromosomas normales más 1 minicromosoma, posiblemente como un resultado de la integración y la ruptura del cromosoma. Utilizando el análisis de FISH uno de los dos minicromosomas fue positivo para CentC solamente y el segundo fue positivo para tanto el marcador PHP23715 y CentC. Utilizando FISH sobre los núcleos de metafase del callo, todos los eventos de subacumulación tienen aspecto esencialmente similar a las muestras comparables de otros eventos de minicromosoma generados, como son mostradas en las Figuras 1, 2, 5, 6 y 9. Otro evento de minicromosoma se observó (Figuras 5-8) de un evento de transformación biolistica de un embrión inmaduro Hi-II con la acumulación 3 de clones BAC de conjunto de núcleo readaptado linealizado (Tabla 8). El evento de callo embriogénico resultante fue positivo sobre el medio de selección de Bialophos y expresó la proteína marcadora fluorescente DsRed. El análisis FISH mostró que este evento fue tetra-aneoploide, con solo 39 cromosomas que se observaron debido a que un cromosoma 6 estuvo ausente. Cada núcleo tuvo 0, 1 o 2 minicromosomas en este evento. Como es descrito con el primer evento de minicromosoma de la acumulación 1, los minicromosomas en este evento estuvieron comprendidos predominantemente de repeticiones centroméricas y componentes Tn5-3. En anafase, las cromátidas hermanas del minicromosoma ( s ) fueron capaces de segregarse (Figura 7) indicando la presencia de centrómeros funcionales. Lo anterior indica que los minicromosomas están replicándose autónomamente y muestran estabilidad a través de divisiones mitóticas sucesivas. Otro evento de minicromosoma se observó (Figuras 9-10) de un evento de transformación biolistica de un embrión inmaduro Hi-II con el clon BAC bacm.pkl28.j21 readaptado de Tn5-3, linealizado. Nuevamente, el callo embriogénico de este tercer evento fue positivo sobre el medio de selección de Bialophos y expresó la proteina fluorescente DsRed. Una planta se regeneró de este evento y las puntas de raíz se clasificaron mediante FISH. Cada núcleo tuvo 0 o 1 minicromosoma. En esos núcleos con un minicromosoma, solamente 19 de los 20 cromosomas nativos se observaron. El análisis de FISH sobre dispersiones de metafase mostró que el único minicromosoma estuvo compuesto principalmente de repeticiones centroméricas y componentes Tn5-3. Otro evento de minicromosoma, evento #73 de bCMC4 se observó de un evento de transformación biolistica de un embrión inmaduro Hi-II con tres clones BAC específicos de centrómero del cromosoma 4 de B73 readaptados de Tn5-3, linealizados (Tabla 9) . El evento de callo embriogénico resultante fue positivo sobre el medio de selección de Bialophos y expresó la proteina marcadora fluorescente DsRed. El análisis FISH mostró que este evento fue aneuploide, con solamente 19 cromosomas y 1 o 2 minicromosomas . Similar a los minicromosomas descritos en lo anterior, los minicromosomas en este evento estuvieron comprendidos predominantemente de repeticiones centroméricas y componentes Tn5-3. Las observaciones sobre todos los eventos de minicromosoma indican que los minicromosomas recientemente formados predominantemente resultaron de la concatenación y/o amplificación de las construcciones de DNA lineales primarias suministradas a las células de plantas para producir un minicromosoma de novo. Tres de los eventos de minicromosoma además se analizaron utilizando inmunofluorescencia con un anticuerpo fluorescentemente marcado resaltado contra la proteina especifica de centrómero/cinetocoro, Proteina C Centromérica (CENPC) . El inmunomanchado de dispersiones nucleares reveló que CENPC enlaza, específicamente a la región centromérica de los cromosomas nativos. Además, la CENPC localizada a posiciones distintas' sobre todos los minicromosomas en todos los tres eventos de minicromosoma estudiados (Figuras 3, 4, 8 y 10) . El FISH de acoplamiento con inmunolocalización mostró que la repetición CentC y la localización de sonda marcadora DsRed2 sobrepuesta con CENPC sobre minicromosomas . Como se observa para los minicromosomas nativos, en metafase los minicromosomas tienen dos focos distintos de CENPC (Figuras 3, 8 y 10), y en anafase las cromátidas hermanas de los minicromosomas separados y cada cromátida hermana tiene un solo foco de CENPC (Figura 4) . Los resultados anteriores indican que los minicromosomas pueden reclutar las proteínas necesarias, tal como CENPC, para la formación de cinetocoro, y por lo tanto actuar autónomamente de los cromosomas nativos durante las r.eplicaciones y segregación en células hijas durante la mitosis y meiosis. Varios miles de eventos transgénicos de maíz positivos DsRed resistentes a bialophos se han generado y por lo menos varios cientos se caracterizaron citológicamente . Los eventos muestran una alta incidencia de integración a los cromosomas hospederos, con aproximadamente 60% de eventos que muestran integración detectable mediante FISH. Los marcadores tanto visuales como seleccionables están presentes en casi 39% de los eventos, pero no detectables para el análisis de FISH. Hasta la fecha la mayoría de las combinaciones de construcciones recombinantes produjeron minicromosomas que contienen tanto marcadores como repeticiones de CentC detectables por FISH en solo aproximadamente 1% de los eventos (4 eventos, Figuras 1-10). La excepción es la subacumulación 1.3 que generó minicromosomas que contienen tanto marcadores como repeticiones CentC en aproximadamente 12% de los eventos analizados (4 de entre 34) . D. Mediciones de Tamaño de Minicromosoma Artificial Tres de los eventos con minicromosomas de maíz autónomos además se caracterizaron al medir el tamaño del minicromosoma ensamblado y el cromosoma 6, que es fácilmente identificado por la sonda FISH de 18-26S rDNA. Todas las mediciones se tomaron en núcleos de metafase, que dieron las mediciones más consistentes. Otras etapas son menos definidas y altamente variables en el tamaño del cromosoma, por ejemplo, las mediciones preliminares en prometafase muestran los minicromosomas relativamente sin cambio en tamaño con relación a las mediciones de metafase, mientras que los cromosomas nativos son aproximadamente 4-5 veces más largos, por lo tanto los minicromosomas medidos en esta etapa son aproximadamente 5% a aproximadamente 15% de la longitud de un cromosoma de prometafase de maíz nativo promedio. Por lo tanto, los minicromosomas medidos en metafase probablemente aparecen más grandes con relación a los cromosomas nativos que si es medido en una etapa diferente. Los cromosomas se midieron utilizando un microscopio fluorescente Leica de DMRXA, las imágenes se . capturaron con una cámara CCD Photometries CoolSnap y las mediciones se tomaron en el software de análisis imagen Metamorph® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Todas las mediciones están en mieras. Cromosoma 6 Nativo (n=29) : Medio = .62 (I) y 2.38 (w) Intervalo = 3.16 - 5.78 (I) y 2.06 - 2.70 (w) Minicromosoma (n=37): Medio = 1.29 (I) y 1.67 (w) Intervalo = 0.75 - 3.07 (I) y 1.12 - 3.17 (w) Los minicromosomas de maíz son en promedio aproximadamente 28% del cromosoma 6 en longitud, pero pueden varias de aproximadamente 13-97% de la longitud total del cromosoma 6 en metafase. El tamaño de los minicromosomas de maíz observado también se puede estimar en Mb. Por ejemplo, el genoma de maíz comprende aproximadamente 2500 Mb de DNA total, con los cromosomas que varían en tamaño de aproximadamente 150-350 Mb, el cromosoma 6 es aproximadamente 200 Mb (Séneca 60) . EJEMPLO 8: Métodos El aislamiento de DNA de mazorcas inmaduras u hojas verdes de plantas de maíz se realizó esencialmente como es descrito en Ananiev y colaboradores, (1997) Proc Nati Acad Sci USA 94:3524-3529. El DNA del clon BAC se aisló utilizando el kit de plásmido Nucleobond (BD Biosciences Clontech, California) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La preparación de DNA de alto peso molecular en bloques de agarosa se realizó esencialmente como es descrito en Liu & Whittier Nucleic Acids Res (1994) 22:2168-2169. Las digestiones de restricción de DNA, electroforesis en gel, manchado de Southern, e hibridación en filtro se llevaron a cabo utilizando técnicas estándares como es descrito en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Vols. 1-3. Las referencias anteriores todas se incorporan en la presente por referencia. A. Marcación de la sonda overgo para colonia e hibridación de Southern Los overgos acumulados para cada sonda (5 pmol de cada oligo) se combinaron con 2 µ? de solución reguladora lOx de Klenow, 1 µ? de enzima Klenow (5 U/µ?), 1 µ? de dGTP 1 mM, 1 µ? de dTTP 1 mM, [a-32P]dCTP y [a-32P]dATP - 5 µ? cada uno, y agua estéril a un volumen final de 20 µ?. La mezcla de reacción se incubó a 14 °C durante 2 horas. El porcentaje de incorporación se calculó y se considera aceptable en 50% más grande . B. Preparación de la membrana e hibridación Las membranas se prepararon utilizando 432 placas de 384 cavidades uniformemente distribuidas entre las librerías BAC de EcoRI y HindIII de Mol7. Un patrón cuadriculado de 4 x 4 que permitió que 96 placas con 384 cavidades sean manchadas sobre una sola membrana de nylon Millipore Imobilon N+ (Bedford, MA) se utilizó. Las 96 placas cuadriculadas comprendieron de 90 placas del clon BAC y 6 placas del clon de plásmido utilizadas como marcadores cuadriculados. Después del cuadriculado, las membranas se colocaron cuidadosamente con bacterias del lado de arriba sobre placas de agar Luria-Bertani con 17 pg/mL de cloramfenicol , las placas se cubrieron, se invirtieron y se cultivaron a 37°C durante la noche. Después del crecimiento de la colonia las membranas se removieron de las placas y se desnaturalizaron en NaCL 1.5 M y NaOH 0.5 M durante 5 min cada uno, seguido por la neutralización en NaCl 1.5 M, Tris-HC1 1 M dos veces por 5 min cada uno. Las membranas se secaron y se trataron con proteinasa K (100 mis at 1 mg/mL; Sigma, St . Louis, MO) durante 50 min a 37°C. Cada membrana se empapó en solución 6x SSC, SDS al 0.5% en cajas de plástico. Los filtros se prehibridaron a 56°C en 6x SSC, SDS al 0.5% con agitación constante durante por lo menos 20 minutos. Las sondas overgo acumuladas se desnaturalizaron a 100°C durante 5 min y se adicionaron a la solución de hibridación que se ha utilizado para la prehibridación . La hibridación fue durante 12-16 h a 56°C. Las membranas se lavaron progresivamente durante 1 h cada uno en 56°C en 2x SSC y SDS al 0.1% (lavado 1), 1.5 SSC y SDS al 0.1% (lavado 2) y O.lx SSC y SDS al 0.1% (lavado 3). Las membranas se sellaron en plástico envuelto y se expusieron a película de rayos X durante 3 h durante la noche. Después de la hibridación, los filtros se separaron en 100 mi de O.lx SSC y SDS al 0.1% a 90°C durante 10 min y se almacenó a -20°C. Las membranas se utilizaron múltiples veces. C. Métodos Citológicos Cualquiera de los métodos citológicos adecuados, y composiciones, que incluyen muchos métodos citológicos Estándares, preparaciones y los similares son conocidos en la técnica y se pueden utilizar para examinar tejidos de plantas . i. Preparación de núcleos del tejido de callo de maíz 1. Callos utilizados para hacer preparaciones nucleares primero se gasearon con óxido nitroso a 150 psi durante 3 horas luego se fijaron inmediatamente. El óxido nitroso detiene los núcleos en metafase que permiten dispersiones cromosómicas mejoradas para el análisis de FISH. 2. Fijar la muestra de tejido de callo en ácido acético al 50% durante por lo menos 1 hora. El tejido se puede almacenar indefinidamente en ácido acético al 50% a -20°C. 3. Separar los embriones somáticos del callo y colocar en una gota de 50 µ? de solución reguladora de PIM (CaCl2 50 mM, acetato de sodio 10 mM, pH 5.8) en una caja petri pequeña. 4. Disectar los embriones somáticos en piezas más pequeñas de 0.5 mm. Lavar el tejido en solución reguladora PIM 3-5 veces durante 1 hora para remover el fijador. Pipetear lentamente varias veces para lavar y reemplazar con solución reguladora PIM fresca. Remover cuidadosamente la solución reguladora PIM. Adicionar 50 µ? de solución de digestión de enzima (celulasa al 2% p/v (Cat# CEL, orthington Biochemical Corp. (Lakewood, NJ, USA)), pectinasa al 0.2% p/v (Cat# PASE, Worthington Biochemical Corp. (Lakewood, NJ, USA) ) ; albúmina de suero bocino al 0.5% p/v) . Digerir el tejido a temperatura ambiente, en la oscuridad, en una cámara húmeda durante 1-2 horas. A medida que el tejido comienza a ablandarse, pipetear muy levemente y/o aplastar con la sonda para romper piezas más grandes y liberar células. Remover cuidadosamente la solución de digestión de enzima y reemplazar con aproximadamente 50 µ? de solución reguladora PIM. Transferir las células libres/núcleos a un tubo de microcentrifuga . Adicionar más solución reguladora PIM al tejido digerido restante y pipetear levemente para liberar las células, transferir estas células al tubo de microcentrifuga , repetir como sea necesario.

Formar en pelotillas las células en la microcentrifuga a 500 rpm durante 3 minutos, remover el sobrenadante. Adicionar solución reguladora PIM fresca y resuspender levemente las células. Repetir esta etapa de lavado 3 veces más.- Remover la solución reguladora PIM y reemplazar con ácido acético al 50%. Resuspender levemente las células, formar en pelotilla 500 rpm durante 10 minutos, remover el sobrenadante y adicionar ácido acético al 50%. Repetir. Almacenar los núcleos aislados en ácido acético al 50% a menos 20°C. El volumen final de ácido acético al 50% debe ser 2X el volumen de la pelotilla nuclear. Transferir 5 µ? de núcleos resuspendidos a una platina de vidrio, adicionar una cubierta de 18 mm2. Calentar la platina sobre una placa caliente a 70°C durante 15 segundos. Remover la platina del calor y prensar levemente hacia abajo, sobre la cubierta para aplastar los núcleos . Permitir a la platina que se enfrie brevemente, luego sumergir la platina en nitrógeno liquido durante 10-15 segundos. Remover la platina del nitrógeno liquido y calentar la cubierta con su aliento. 18. Remover rápidamente la cubierta con el borde de una hoja de afeitar. 19. Colocar la platina en dos cambios de EtOh al 100% durante 2 minutos cada uno. 20. Dejar a las platinas secar con aire. Almacenar las platinas a -20°C hasta que sea necesario. ii. FISH seguido por la inmunolocalización directa de núcleos a. Preparación de la sonda overgo para FISH Las sondas overgo son descritos en la Tabla 1. 1. Adicionar 10 µ? de mezcla overgo 100 µ?, que comprende concentraciones iguales de cada overgo, a 5 µ? de agua desionizada . 2. Calentar a 95°C durante 1 min, luego transferir a hielo. 3. Adicionar a la mezcla anterior: - 2 µ? de solución reguladora de DNA polimerasa 10X (Tris-HCl 100 mM, pH 7.5, MgCI2 100 m , DTT 7.5 mM) - 0.5 µ? de fluoroforo dUTP a) dUTP-Cy3 (Amersham) b) dUTP-FITC (Roche) c) dUTP-Texas Red (Molecular Probes) - 2 µ? de dNTPs (200 µ? de A-, G-, CTP; 40 µ? de TTP) - 0.5 µ? de Klenow 4. Incubar a 37°C durante 20 min.

. Limpiar la sonda utilizando el equipo de Extracción de Nucleótidos Quigen. Eluir en 50 mi de formamida al 50% en la solución reguladora de elusión del equipo. b. Hibridación in situ fluorescente (FISH) La FISH de núcleos de maíz sobre platina se hizo esencialmente como sigue: 1. Fijar la platina 10 min en para formaldehido al 1% v/v en solución salina regulada de fosfato (PBS) pH 7.2 2. Lavar 2X 5 min. en PBS 4. Lavar 2 min. En agua destilada/desionizada 5. Secar la platina con aire 6. Hibridar 2 min a 80°C en la sonda fluorescente titulada en formamida al 50% a una concentración final de MgCl2 50 mM 7. Hibridar 30 min - durante la noche en cámara húmeda a 37 °C 8. Lavar 5 min. en 2X SSC 9. Lavar 5 min. en 0.2X SSC 10. Secar con aire la platina 11. Adicionar Vectashield® con DAPI (Cat# H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) y la cubierta (5 mi del medio de montaje/cubierta de 22 mm) 12. Examinar bajo microscopio utilizando equipos de filtro apropiados y/o el aceite de inmersión como sea necesario. c. Inmunolocalización Después del examen y la caracterización de la localización de sonda de FISH, estas mismas muestras se pueden procesar y utilizar para la inmunolocalización utilizando 'una sonda de anticuerpo dirigida directa. La inmunolocalización del anticuerpo anti-CNPC de conejo policlonal con marcación fluorescente se hizo esencialmente como sigue: 1. Remover la cubierta 2. Lavar 5 min. En EtOH al 70% v/v para remover el medio de montaje y el aceite de inmersión 3. Lavar 3X 5 min. en PBS 4. Bloquear 1 hora a 37 °C en una cámara húmeda en suero de conejo normal 5% v/v (Jackson Inmunoresearch , West Grove, PA, USA) en PBS-BT (PBS con BSA al 3% p/v, azida de Na al 0.02% p/v, Tritón X-100 al 0.5% v/v) 5. Enjuagar en PBS 6. Incubar durante la noche a 37°C en una cámara húmeda con el Io anticuerpo en suero de conejo normal al 5% v/v en PBS-BT. El anti-CENPC-Cy3 de conejo (o-FITC) se utilizó a una dilución de 1:200, concentración final 2.5 pg/mL de anticuerpo marcado. 7. Lavar 3X en PBS durante un periodo de 1 hora 8. Secar la platina con aire 9. Adicionar Vectashield® con DAPI (Cat# H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) y la cubierta (5 mi del medio de montaje/cubierta de 22 mm) 10. Sellar la cubierta con esmalte de uñas 11. Examinar bajo microscopio utilizando filtros apropiados y/o aceite de inmersión como sea necesario. d. Producción y marcación del anticuerpo CENPC Un homólogo de maiz de CENPC mamífero se aisló por Dawe y colaboradores, (1999 Plant Cell 11:1227-1238) y se mostró que es un componente del cinetocoro en maíz. Un péptido conservado de 20 aminoácidos del dominio amino terminal se sintetizó y se utilizó para la producción de anticuerpo policlonal en conejos (Openbiosystems, Huntsville, AL, USA). Los anticuerpos resultantes se marcaron directamente con fluoróforos utilizando el equipo de marcación Fluorolink-AbCy3 (GE Healthcare, UK) o el equipo de marcación de proteína de fluoresceína (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, USA) . iii. Fibra-FISH Fibras de DNA extendidas sobre platinas citológicas se prepararon como es descrito en Jackson y colaboradores, (1998) Genome 41:566-572. Las sondas para fibra FISH se marcaron con biotina-ll-dUTP (Roche, Alemania) o DIG-dUTP (Roche, Germany) utilizando el Equipo de Marcación de Traducción Nik (Roche, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de la precipitación, las sondas se redisolvieron en solución reguladora TE y se almacenaron a -20°C. Para fibra-FISH, las sondas se hibridaron a fibras de DNA en una mezcla de formamida al 50% (v/v) , SDS al 10% (v/v) y 2x SSC en un volumen final de 10 pL. Las platinas se cubrieron con cubiertas, se sellaron con cemento de caucho y se incubaron a 80°C durante 2 min para desnaturalizar tanto las sondas como el DNA objetivo, seguido por la incubación a 3 °C. Los lavados de post-hibridación y la detección de señal se realizaron como es descrito por Zhong y colaboradores, (1996) Plant Mol Biol Rep 14: 232-242. Las sondas marcadas con biotina se detectaron con fluoresceina-avidina DN (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) , anti-avidina D biotinilada (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) y nuevamente con fluoresceina-avidina DN (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Las sondas marcadas con DIG se detectaron mediante anticuerpos monoclonales anti-DIG de ratón (Jackson Jackson InmunoResearch , West Grove, PA, USA) y anticuerpos anti-ratón conjugados con Cy3 en carnero (Jackson InmunoResearch, West Grove, PA, USA) . Las platinas luego se montaron en el medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) . Las preparaciones se examinaron utilizando un microscopio fluorescente Leica DMRXA, las imágenes se capturaron con una cámara CCD Photometries CoolSnap. Las imágenes se capturaron utilizando el software de análisis de imagen Metamorph® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) . La fibra-FISH se realizó sobre 3 a 5 preparaciones de cada linea.

Claims (19)

1. REIVI DI C AC I ONE S 1. Un minicromosoma artificial de planta, caracterizado porque comprende un centrómero funcional que contiene: (a) por lo menos dos arreglos de repeticiones en tándem de CentC en una orientación invertida en donde el primer arreglo comprende por lo menos cincuenta copias de CentC y el segundo arreglo comprende por lo menos cincuenta copias de CentC; y (b) por lo menos una copia de un elemento retrotransposable, en donde el elemento retrotransposable está situado entre el primero y el segundo arreglo.
2. 2. El minicromosoma artificial de planta de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el elemento retrotransposable se selecciona del grupo que consiste de CentA, CRM1 y CRM2.
3. 3. El minicromosoma artificial de planta de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el minicromosoma además comprende por lo menos un telómero funcional .
4. 4. El minicromosoma artificial de planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el centrómero funcional específicamente enlaza la proteína C centromérica (CENPC) .
5. 5. Una planta de maíz, caracterizada porque comprende el minicromosoma artificial de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
6. 6. Una planta de maíz, caracterizada porque comprende el minicromosoma artificial de la reivindicación 4.
7. 7. Un minicromosoma artificial de planta, caracterizado porque comprende un centrómero funcional, en donde el centrómero específicamente enlaza a la proteína C centromérica (CENPC) .
8. 8. Una planta de maíz, caracterizada porque comprende el minicromosoma artificial de la reivindicación 7.
9. 9. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende: (a) por lo menos dos arreglos de repeticiones en tándem de CentC en una orientación invertida en donde el primer arreglo comprende por lo menos diez copias de CentC y el segundo arreglo comprende por lo menos diez copias de CentC; y (b) por lo menos una copia de un elemento retrotransposable, en donde el elemento retrotransposable está situado entre el primero y el segundo arreglo.
10. 10. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el elemento retrotransposable se selecciona del grupo que consiste de CentA, CRM1 y CRM2.
11. 11. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende: (a) por lo menos un arreglo de repeticiones en tándem de CentC, el arreglo que comprende por lo menos 10 copias de CentC; y, (b) por lo menos una copia de un elemento retrotransposable seleccionado del grupo que consiste de CentA, CRM1, y CRM2.
12. 12. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende: (a) por lo menos un arreglo de repeticiones en tándem de CentC, el arreglo que comprende por lo menos 10 copias de CentC; y, (b) por lo menos una copia cada una de CentA, CRM1 y CRM2.
13. 13. Una construcción recombinante , caracterizada porque comprende el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 9-12.
14. 14. La construcción recombinante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque además comprende un fragmento de DNA que comprende un arreglo de por lo menos 30 copias de repeticiones teloméricas.
15. 15. Una planta de maíz transgénica, caracterizada porque comprende la construcción recombinante de la reivindicación 13.
16. 16. Una planta de maíz transgénica, caracterizada porque comprende la construcción recombinante de la reivindicación 14.
17. 17. Un método para hacer una planta de maiz transgénica que comprende un minicromosoma artificial de planta que tiene un centrómero funcional, el método caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto por lo menos una célula de planta de maiz con una mezcla que comprende la construcción recombinante de la reivindicación 14; (b) identificar por lo menos una célula de planta de maíz de la etapa (a) que comprende un minicromosoraa artificial de planta que tiene un centrómero funcional; y, (c) regenerar una planta de maíz fértil de la célula de planta de maíz de la etapa (b) en donde la planta de maíz comprende un minicromosoma artificial de planta que tiene un centrómero funcional.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la mezcla además comprende un polipéptido que estimula el crecimiento celular.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de un wuschel, un baby boom, un RepA o un Lecl.