COMPOSICIONES DE CELULASA TRATADAS CON PROTEASA Y
PURIFICADAS, Y MÉTODOS PARA REDUCIR EL RETRO-TEÑIDO
DURANTE LAVADO ENZIMÁTICO CON PIEDRAS
Campo dß la Invención Esta invención se refiere a composiciones y métodos para reducir o impedir el retro-teñido del colorante azul índigo sobre mezclilla durante el lavado con piedras de tela y prendas de vestir de mezclilla utilizando enzimas celulasa. Antecedentes de la Invención La mezclilla es una tela de algodón tejido en la cual se ha teñido el urdimbre, habitualmente de azul, con el colorante índigo. Una característica deseable de la tela de mezclilla teñida con índigo es la apariencia creada por filamentos alternantes azules y blancos de los hilos de urdimbre y trama, los que al ocurrir desgaste y uso normales dan a la mezclilla una apariencia de blanco sobre azul. Una vista popular de la mezclilla es la vista lavada con piedras. Esta vista lavada con piedras consiste en un color azul generalmente mas claro que la mezclilla no lavada, con áreas localizadas, particularmente alrededor de las costuras, de color incluso mas claro. El material lavado con piedras a menudo tiene una textura mas suave y mantiene el contraste deseado de blanco sobre azul. Tradicionalmente, se ha llevado a cabo el lavado con piedras lavando el material de mezclilla en presencia de piedra pómez, lo que da como resultado una tela que tiene una apariencia gastada o usada y el contraste deseado de blanco sobre azul antes descrito. Se usan actualmente en el procesamiento de mezclilla enzimas, particularmente celulasas. En particular, se usan celulasas para dar una apariencia de lavado con piedras sin la necesidad de una carga tan elevada de piedra pómez que la usada en el lavado con piedras tradicional. Este método de procesamiento es referido en la presente como "lavado con piedras" enzimático, incluso si no hay piedras presentes en la lavadora. El uso de enzimas para lavado con piedras se ha tornado cada vez mas popular debido a que el uso de piedras tiene varias desventajas. Por ejemplo, las piedras usadas en el proceso ocasionan desgaste y esfuerzo sobre la maquinaria, problemas de desechos ambientales debido a los granos de arena producidos y dan como resultado elevados costos de mano de obra asociados con la remoción manual de piedras de las máquinas y las bolsas de las prendas de vestir. En consecuencia, puede ser deseable la reducción o eliminación de piedras en el lavado. En forma contraria al uso de piedras pómez, las enzimas
(particularmente celulasas) son seguras para la máquina, dan como resultado poco o ningún problema de desechos, y reducen drásticamente los costos de mano de obra. Por tanto, puede ser benéfico usar enzimas para lavado con piedras. Sin embargo, aun cuando el uso de enzimas tales como celulasa puede ser benéfico en comparación con piedras, hay algunos problemas asociados con el uso de enzimas para este fin. Por ejemplo, un problema con algunas celulasas, tales como las celulasas del hongo que pudre raíces Trichoderma, es lo que puede describirse como una "re-depositación" o "retro-teñido" (se usan ambos términos en la presente en forma intercambiable) de algo del colorante de vuelta sobre la tela durante el proceso enzimático de lavado con piedras. Tal re-depositación o retro-teñido lleva a una coloración azul sobre los hilos blancos de la mezclilla, dando como resultado menos contraste entre los hilos azules y blancos y los puntos de abrasión (es decir, una vista de azul sobre azul en vez de la vista preferida de blanco sobre azul) . Ver American Dyestuff Repórter, septiembre 1990, pp. 24-28. La re-depositación o retro-teñido es objetable para algunos usuarios. Por ejemplo, aunque las celulasas de Trichoderma exhiben una actividad específica mucho mas elevada sobre el material de mezclilla que las celulasas de Humicola, a menudo se prefieren las celulasas de Humicola debido a su menor nivel de retro-teñido. Esto es cierto, incluso aunque la mucho mas elevada potencia de la celulasa de Trichoderma permite el uso de menores cantidades de enzima para lograr un mayor grado de abrasión en tiempos de procesamiento considerablemente mas cortos . El problema de la re-depositación del colorante durante el lavado con piedras ha sido una preocupación para quienes procesan mezclilla. Intentos previos por atender el problema con composiciones de celulasa de Trichoderma incluyen la adición de productos químicos adicionales contra la re-depositación, tales como tensioactivos u otros agentes, en el lavado de celulasa para ayudar a dispersar el colorante índigo suelto y reducir la re-depositación. Además, quienes procesan mezclilla han tratado de usar celulasas con menos actividad específica sobre la mezclilla, junto con enjuagues adicionales. Esto da como resultado costos adicionales de productos químicos y mayores tiempos de procésamiento. Otro método que intenta atender el problema de la re-depositación incluye añadir un agente tenue de blanqueo o agente de remoción de colorante en el proceso. Este método afecta el tono final de la prenda de vestir e incrementa el tiempo de procesamiento . Aunque estos métodos ayudan en cierto grado limitado en la reducción de la re-depositación, los métodos no son totalmente satisfactorios y continúa existiendo algo de retro-teñido objetable. El uso de enzimas y piedras en forma conjunta puede ser ventajoso para reducir el grado de re-depositación; sin embargo, deja al procesador algunos de los problemas asociados con el uso de piedras solas. Otro método, como se describe por Clarkson y colaboradores en la publicación PCT No. WO 94/29426 (en lo sucesivo " Clarkson y colaboradores" ) , ha sido capaz de incluir una enzima proteasa añadida en el tratamiento de lavado con piedras. Se encontró que el tratamiento de mezclilla con una composición que comprende una celulasa de re-depositación y una proteasa añadida mejora el contraste entre los hilos blancos y azules y reduce la re-depositación de colorante. Actuando en la máquina lavadora, se piensa que las proteasas impiden que las proteínas celulasa aglutinen las partículas coloreadas de vuelta sobre la superficie de la mezclilla y, todavía, cuando se usan con moderación, no tienen un efecto negativo severo sobre la vista derivada de abrasión resultante ocasionada por la acción de la celulasa. Este método, aunque proporciona algunas ventajas, es costoso y requiere de un cuidadoso control debido a que las proteasas, por su propia naturaleza, tienden a destruir las enzimas celulasa. El técnico debe jugar con el balance entre el efecto proteolítico deseable al reducir el retro-teñido y el efecto proteolítico indeseable al reducir la actividad de la celulasa. En el proceso de Clarkson y colaboradores , la proteasa es usada esencialmente como un removedor de colorante o inhibidor de teñido y debe incluirse en el proceso de lavado. Clarkson y colaboradores enseñan tres opciones: (1) añadir la proteasa directamente a la lavadora con la enzima celulasa, (2) añadir la proteasa al ciclo de enjuague después de un tratamiento con celulasa, o (3) mezclar físicamente la proteasa con la celulasa antes del lavado. Con relación al proceso básico de añadir la proteasa y la celulasa juntas, añadir la proteasa al ciclo de enjuague evita ataque proteolítico considerable sobre la celulasa, pero tiene la desventaja de añadir un paso adicional de procesamiento. La pre-mezcla física de celulasa y proteasa, por otra parte, permite una formulación sencilla, fácil de usar, pero da como resultado un difícil balance entre el efecto proteolítico deseable al remover el colorante y el efecto proteolítico indeseable al destruir la actividad de la celulasa. Por ejemplo, una proteasá altamente activa puede destruir por completo la enzima celulasa durante el tiempo normal que requiere para almacenamiento y embarque. Este problema de estabilidad en estante puede ser manejado, pero requiere de: (1) selección de una proteasa que tenga buen poder anti-teñido, pero pueda digerir celulasa, cuando mas, en un grado limitado (la elección preferida son las subtilisinas, que no son altamente activas contra la celulasa pero son bien conocidas como potentes removedores de colorantes) , y (2) una pre-incubación de la proteasa y la celulasa seleccionadas a una temperatura elevada para asegurar que el ataque proteolítico que esté presente sobre la celulasa sea llevado hasta completarse y que una formulación comercial será estable durante almacenamiento y embarque . La acción de proteasas mas potentes, particularmente la papaína proteasa sobre celulasas de Trichoderma, ha sido investigada en forma extensa. Se ha encontrado que cantidades limitadas de digestión de papaína pueden dividir los dominios nucleares de celobiohidrolasas de Trichoderma de sus dominios de ligadura naturales. Esto tiene el efecto de eliminar esencial-mente cualquier actividad medible que tienen estas enzimas contra la celulosa cristalina, tal como Avicel, o algodón, mientras todavía conservan su actividad contra sustratos solubles tales como beta-glucano. Como resultado, los investigadores anteriores concluyeron que el dominio de ligadura natural juega un papel crítico para habilitar el ataque de la enzima celobiohidrolasa sobre celulosa cristalina. El grado de tratamiento necesario para que la papaína elimine totalmente la actividad de CBH sobre la celulosa cristalina fue a grandes rasgos de 0.1 a 0.5 gramos de la proteína papaína por gramo de proteína celulasa, multiplicados por el tiempo de tratamiento en minutos (g min/g) , es decir la relación en peso de la proteína proteasa a la proteína celulasa multiplicada por el tiempo de tratamiento. Con base en las limitaciones de los métodos intentados previamente para reducir o impedir la re-depositación, existe una necesidad de métodos mas fácilmente controlados y mas efectivos desde el punto de vista de costos para atender el tema de la re-depositación o retro-teñido del colorante durante el tratamiento de lavado con piedras . En consecuencia, sería deseable encontrar una composición enzimática o método que sea efectivos desde la perspectiva de los costos, tenga buena estabilidad en estante, alta potencia, y no incluya una celulasa que se re-deposite o retro-tiña. Sumario de la Invención Los inventores de la presente invención ("los invento-res") han encontrado que lavar mezclilla de algodón teñida con índigo con una composición de la enzima celulasa de bajo retro-teñido, hecha sometiendo una celulasa de Trichoderma que contiene a las enzimas celobiohidrolasa y endoglucanasa a una proteólisis limitada (es decir, un tratamiento limitado con proteasa) y el retiro posterior de la proteasa añadida, es una mejora sobre el uso de una preparación de celulasa que re-deposita o una que incluye tanto una celulasa como una proteasa. La mezclilla producida por el tratamiento con tal composición inesperadamente tiene un nivel reducido de re-depositación de colorante y por ende buen contraste entre los hilos azul y blanco en la mezclilla. La composición es estable en estante, requiere de considerablemente menos proteasa que los métodos previos, y tiene un nivel sorprendentemente bajo de re-depositación aun cuando no está presente la "composición inhibidora de retro-teñido" (es decir, la proteasa) enseñada como requerida por Clarkson y colaboradores . Los inventores también han provisto métodos para recuperar y reciclar proteasa de modo que este costoso ingrediente pueda ser re-utilizado. En el proceso de lavado de mezclilla, un pequeño porcentaje de tensioactivo químico activo en superficie puede añadirse opcionalmente a las composiciones o métodos descritos en la presente. Si se añade un agente tensioactivo, puede añadirse ya sea con la celulasa en el lavado o como o enjuague de post-tratamiento. Además, el proceso de lavado de mezclilla puede ser llevado a cabo con o sin piedras añadidas a las composiciones descritas en la presente. Descripción Detallada de la Invención La mezclilla que es lavada con piedras con una composición de enzima celulasa de Trichoderma que ha sido sometida a un tratamiento limitado con proteasa y purificación posterior para retirar la proteasa, muestra una reducción dramática en el nivel de retro-teñido y un incremento visible en el contraste entre hilos blancos y azules. Aunque los inventores no desean ser limitados por ninguna teoría en particular, una posible explicación de las observaciones aparentemente contradictorias de que, por una parte se requiere proteasa en la lavadora ( Clarkson y colaboradores) y, por otra parte, que no necesita estar presente (esta invención) , es que hay dos mecanismos separados y distintos mediante los cuales las proteasas pueden afectar el retro-teñido en un proceso de lavado de mezclilla. El primer mecanismo es el descrito por Clarkson y colaboradores , donde la proteasa simplemente actúa como un agente de remoción de colorante en la lavadora. Este mecanismo es consistente con los descubrimientos de Clarkson en el sentido de que las proteasas pueden retirar el colorante re-depositado aun después de que ha teñido la mezclilla blanca en un tratamiento previo con celulasa. También es consistente con el bien conocido uso de las proteasas como removedores de manchas en sistemas detergentes . No es sorprendente que las manchas a base de colorante creadas por las proteínas celulasa puedan ser removidas por uno de los bien conocidos enfoques para tratar manchas relacionadas con las proteínas: proteasas. Sin embargo, bajo este primer mecanismo, los técnicos en la materia no esperarían que las proteasas fuesen capaces de mitigar el retro-teñido en la lavadora si nunca son puestas en la lavadora. Para explicar el sorprendente descubrimiento de los inventores en el sentido de que las proteasas parecen hacer justo eso, los inventores sugieren que hay un segundo mecanismo que es mas sutil y menos obvio que el primero. En particular, los inventores creen que un tratamiento limitado con proteasa cambia el modo de acción de las enzimas celulasa, haciendo que las pequeñas partículas fácilmente dispersas no retro-tiñan. Aunque se ha reportado que las proteasas pueden hacer que los componentes de celobiohidrolasa presentes en el complejo de la enzima celulasa de Trichoderma sean inactivos contra celulosa cristalina rompiendo sus dominios naturales de ligadura con celulosa, los inventores tienen la hipótesis de que tal tratamiento puede todavía dejar las enzimas celobiohidrolasa capaces de hacer pequeños cortes en la celulosa que no son detectables por si mismos pero que, cuando se usan en combinación con otros componentes en el complejo de la enzima celulasa de Trichoderma, es decir las endoglucanasas, lleven a abrasión sustancial en un ambiente de lavado de mezclilla. Los inventores sugieren adicionalmente que, debido a que las celobiohidrolasas modifica-das no tienen dominios de ligadura, su acción contra celulosa cristalina es factible de ser menos localizada y mas uniformemente distribuida sobre las fibras de mezclilla que bajo tratamiento con la celulasa de Trichoderma intacta. Para enzimas de celulasa de Trichoderma intactas, su modo de acción altamente localizado puede llevar a que se liberen partículas relativamente grandes del cuerpo principal de la celulosa pues las enzimas cortan directamente a través de partes grandes de la fibra. En contraste, el patrón de acción mas distribuido de las composiciones de celulasa de Trichoderma tratadas con proteasa puede llevar a partículas mas pequeñas, mas fácilmente dispersables que quedan sueltas del cuerpo principal de la celulosa en un ambiente donde hay una cantidad considerable de esfuerzo cortante o mezclado. Como resultado, habría menos retro-teñido. Este segundo mecanismo, aunque no era todavía reconocí-do, probablemente estaba jugando un papel menor en los tratamientos con celulasa y proteasa combinadas descritos por Clarkson . Pasó desapercibido debido a que los investigadores anteriores se enfocaron en explotar el uso mas obvio de la proteasa para remover manchas en la lavadora . No f e explotado plenamente debido a que, si se planea hacer una sola composición comercial de enzimas conteniendo tanto enzimas celulasa como proteasa, es difícil operar la reacción de proteólisis en forma efectiva. En las propias palabras de Clarkson, hay un difícil compromiso y se debe "balancear entre el efecto proteolítico al reducir el retro-teñido y el efecto proteolítico al reducir la abrasión" . De esta manera, para hacer una composición de enzimas celulasa/proteasa combinadas que pueda añadirse directamente a una lavadora, los técnicos en la materia ciertamente quieren evitar el uso de proteasas tales como la papaína, que son conocidas por destruir la actividad sobre celulosa cristalina en favor de otras mas conocidas por sus propiedades anti-teñido en detergentes, por ejemplo, subtilisina. Sorprendentemente, los inventores han encontrado que se logran mejores resultados (1) abandonando los beneficios de este primer mecanismo "anti-teñido" (es decir, removiendo la proteasa de la preparación enzimática y con ello del lavado de mezclilla) , y (2) aprovechando este cambio para modificar las condiciones de la reacción proteolítica para obtener un tratamiento mas intenso y mas agresivo y con ello maximizar el impacto del segundo mecanismo previamente no reconocido. Del todo, las nuevas composiciones que son resultado de este enfoque permiten un lavado de mezclilla superior y mas efectivo en costos. Antes de discutir esta invención en mayor detalle, se definirán los siguientes términos. El término "composición de celulasa de Trichoderma" comprende al menos una o mas de las enzimas celobiohidrolasas (CBH) , y una o mas de las enzimas endoglucanasas (EG) producidas por el microorganismo fungal Trichoderma sp. Cuando la composición es producida por un microorganismo Trichoderma natural, y cada uno de estos componentes es encontrado en la proporción producida naturalmente por el microorganismo, la composición es referida en ocasiones en la presente como una "composición de celulasa de Trichoderma completa o natural". Se contempla que las composiciones de celulasa de Trichoderma de la presente invención también puedan referirse a cualquier composición de celulasa que contenga tanto una celobiohidrolasa como endoglucanasa que se obtienen de Trichoderma sp. que haya sido genéticamente manipulado de modo de sobreproducir, subproducir o no producir uno o mas de los componentes CBH y/o EG de celulasa. Estas endoglucanasas y celobiohidrolasas pueden incluir no solo enzimas que son una parte de la composición de celulasa de Trichoderma natural, sino también tales composiciones de celulasa modificada como proteínas de celulasa truncas que comprenden ya sea el dominio de ligadura o el dominio de núcleo de las CBHs o EGs, o una porción o derivación de las mismas. Otros ejemplos de composiciones de celulasa modificada pueden incluir alteraciones en el grado de glicosilación o sustitución de aminoácido (s) en la estructura primaria de las celulasas o celulasas truncas. También se contempla que cualesquiera versiones naturales o modificadas de las celulasas de Trichoderma naturales, tales como las señaladas anteriormente, deben considerarse como composiciones de celulasa de Trichoderma incluso si se producen en un microorganismo anfitrión genéticamente modificado distinto a Trichoderma . El término "celulasa de Trichoderma tratada con proteasa" se refiere a una composición de celulasa de Trichoderma en la cual una fracción significativa de los dominios de núcleo CBH han tenido sus dominios de ligadura CBH cortados, por ejemplo por tratamiento con una enzima proteasa añadida. Sin embargo, las composicio-nes de celulasa de Trichoderma tratadas con proteasa no deben tener ninguna proteasa activa residual o incremental significativa sobre la cantidad que es producida naturalmente por el microorganismo. Tal cantidad incremental debe ser, por ejemplo, menor de 0.1% de la cantidad total de proteína en la composición de enzima celulasa. Se contempla que las composiciones de celulasa tratadas con proteasa de la presente invención puedan incluir tanto preparaciones en las cuales se usa una enzima proteasa añadida para cortar los dominios de núcleo y de ligadura CBH como composiciones de celulasa modificada en las cuales el dominio de núcleo CBH es producido directamente sin su dominio de ligadura por medio de un microorganismo genéticamente modificado. En todos los casos, no obstante lo anterior, una composición de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa debe contener actividad endoglucanasa así como la proteína de núcleo CBH. Los métodos de la presente invención comprenden poner en contacto mezclilla para ser lavada con piedras en forma enzimática parcial o totalmente con una composición de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa en una cantidad suficiente para lograr el nivel deseado de retiro de colorante de la prenda de vestir. El uso de tal enzima dará como resultado una prenda de vestir con excelente contraste entre los hilos azules y blancos y un bajo nivel de retro-teñido. La enzima misma tendrá una buena estabilidad y no estará en peligro de degradación considerable de proteasa. En una forma de realización de esta invención, la composición de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa es producida poniendo en contacto una composición de celulasa de Trichoderma con una enzima proteasa añadida, donde el grado de tratamiento, como se define por la relación en peso de la proteína proteasa a la proteína celulasa, multiplicada por el tiempo promedio de tratamiento, está en la gama de entre 1.0 y 10,000 g min/g. La proteasa es entonces removida de la celulasa usando una separación cromatográfica. En una forma de realizáción adicional de esta invención, esta composición de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa es añadida a una máquina lavadora con mezclilla teñida con colorante índigo y usada para crear una apariencia de abrasión, con un elevado contraste entre las fibras azules y blancas de la mezclilla. Enzimas Celulasa Las composiciones de celulasa de Trichoderma son típicamente producidas en cultivo sumergido del hongo Trichoderma , y métodos para su producción y recuperación están bien documentados en la literatura y son ampliamente conocidos por los técnicos en la materia. Las fuentes comerciales de estas enzimas incluyen a Iogen Corporation, Genencor International, Novo Nordisk, Gist-Brocades, Sigma Chemicals y Enzyme Development Corporation. Una de las composiciones de celulasa de Trichoderma preferidas de esta invención es la producida por cepas del hongo Trichoderma longibrachiatum en las cuales las concentraciones relativas de las enzimas CBH1, CBH2, EGl, EG2 y EG3 son todas esencialmente consistentes con las que se encuentran en una composición de celulasa de Trichoderma completa o natural. Las preparaciones de celulasa comerciales no son 100% proteína celulasa y a menudo incluyen rellenos, amortiguadores, estabilizadores y otros ingredientes. La proteína celulasa total puede ser medida por medio de diversos métodos de ensaye conocidos en la materia. El ensaye usado de preferencia es el ensaye Biorad Coomassie Blue Protein comercialmente asequible vendido por Biorad Company, de Los Ángeles, California, Estados Unidos, usando proteína celulasa altamente purificada como estándar. Proteasa Añadida Las proteasas están disponibles de diversas fuentes, incluyendo fuentes microbianas, de plantas y animales, y están documentadas en la literatura. Algunas fuentes proteolíticas microbianas importantes incluyen Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, y Aspergillus oryzae . Fuentes importantes de proteasas de plantas incluyen papaya para papaína y pina para bromelaína.
Proteasas adecuadas para la invención incluyen serina, cisteína, ácido aspártico y metalo proteasas. Una de las proteasas preferidas es la cisteína proteasa papaína. Las proteasas están asequibles comercialmente en forma oportuna de firmas tales como Sigma Chemicals en varias formas diferentes, incluyendo soluciones líquidas, polvos o como enzimas insolubles unidas a soportes sólidos. En una forma de realización preferida de esta invención, la proteasa papaína es usada en una suspensión líquida. Las preparaciones de proteasa comerciales no son 100% proteína proteasa y a menudo incluyen rellenos, amortiguadores, estabilizadores y otros ingredientes. La proteína proteasa total puede ser medida por medio de diversos métodos de ensaye conocidos en la materia. El ensaye usado de preferencia en la presente es el ensaye Biorad Coomassie Blue Protein disponible comercialmente, vendido por Biorad Company de Los Ángeles, California, Estados Unidos. Tratamiento con Proteasa El tratamiento limitado con proteasa de esta invención comprende poner en contacto una composición líquida de celulasa de Trichoderma con una proteasa añadida bajo condiciones de reacción controladas por un período de tiempo definido. Un técnico en la materia reconocerá que la medida apropiada de tratamiento dependerá de la temperatura, el pH, la concentración escogida para preparar la mezcla y la actividad específica de la enzima proteasa que haya sido seleccionada y reconocerán, además, que pueden usarse procedimientos rutinarios de prueba para seleccionar un conjunto óptimo de condiciones de proceso para una composición de celulasa y proteasa añadida dadas. En una forma de realización preferida, el tratamiento limitado con proteasa es llevado a cabo a una temperatura elevada entre 20 y 60°C, y con mayor preferencia entre 30 y 50°C. En la forma de realización mas preferida, se empleó una temperatura de alrededor de 37°C. En una forma de realización preferida, el tratamiento limitado con proteasa es llevado a cabo a un pH de entre 3.0 y 8.0, y con mayor preferencia entre 4 y 7. En la forma de realización mas preferida, el pH es de entre 4 y 5. En una forma de realización preferida, el tratamiento limitado con proteasa es llevado a cabo con una concentración de la proteína celulasa entre 5 y 250 g/l y, con mayor preferencia, entre 50 y 200 g/l. En la forma de realización mas preferida, la concentración de la proteína celulasa es de alrededor de 100 g/l. En una forma de realización preferida, el tiempo de tratamiento limitado con proteasa es de entre cinco minutos y cuatro semanas, y con mayor preferencia entre 1 y 120 horas. En la forma de realización mas preferida, donde la proteasa es papaína, el tiempo de tratamiento es de alrededor de 24 a 48 horas . En una forma de realización preferida, el grado de tratamiento, como se define por la relación en peso de la proteína proteasa a la proteína celulasa, multiplicada por el tiempo promedio de tratamiento, está en la gama de entre 1.0 y 10,000 g min/g, y con mayor preferencia entre 10 y 1,000 g min/g. En la forma de realización mas preferida, donde la proteasa es papaína, el grado de tratamiento está en la gama de alrededor de 200 g min/g. Bajo estas condiciones preferidas, esto significa que la concentración de la papaína es de alrededor de 14 g/l. Un método preferido de seguir el progreso de una reacción de proteólisis es usar los ensayes de papel filtro y CMC que miden, respectivamente, FPUs y CMCUs de actividad de celulasa (Ghose 1987) . De preferencia, el tratamiento con proteasa sería corrido en una medida que la celulasa pierda al menos 5% de su actividad inicial medida en unidades de papel filtro (FPUs) y no mas de 50% de su actividad inicial como se mide ésta en unidades CMC. Aun de manera mas preferida, la celulasa debe ser tratada en un grado en que pierda al menos 10% de su actividad de celulasa inicial, como se mide en FPUs, y mantenga sustancialmente entre 70 y 100% de su actividad inicial como se mide en CMCUs. Aun de manera mas preferida, la celulasa debe ser tratada en un grado en que pierda alrededor de 50% de su actividad de celulasa inicial, como se mide en FPUs, y menos de 10% de su actividad inicial, como se mide en CMCUs. Remoción y Recuperación de Proteasa El método de esta invención requiere además que la reacción proteolítica sea detenida cuando ha alcanzado el grado deseado de tratamiento, tal que cantidades considerables de proteasa exógena no contaminen la composición enzimática de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa de esta invención. La reacción puede ser detenida, por ejemplo, por enfriamiento súbito o ajustando el pH. La proteasa añadida puede entonces ser separada del complejo celulasa. Un técnico en la materia reconocerá que hay varios medios para remover selectivamente proteasa añadida de una composición enzimática de celulasa de Trichoderma, incluyendo separación cromatográfica, precipitación selectiva, ultra-filtración o filtración (si se usa una enzima insoluble en un soporte sólido) . El método apropiado de remoción dependerá de la naturaleza específica y la forma de la proteasa que haya sido seleccionada para el tratamiento. Un método preferido de lograr esta separación es ligar una proteasa disuelta a un material sólido y luego lavar la celulasa de éste. Un medio de ligadura semejante, usado en la presente, es una resina de intercambio catiónico comercialmente asequible, S-Sepharose, vendida por Pharmacia Biotech, de Uppsala, Suecia, la cual ligará muchas enzimas proteasa comerciales cuando se ponen en contacto con una solución de celulasa y proteasa a un pH por debajo de 6.0. Un método preferido de usar S-Sepharose, que es aplicable para remover la proteasa papaína de una preparación enzimática de celulasa de Trichoderma, es dialisar una mezcla de celulasa y proteasa a una conductividad de 3,000 µ-S o menos y entonces pasarla sobre una resina S-Sepharose a un pH de entre 4.5 y 5.0 y a una temperatura por debajo de 20°C. En una forma de realización preferida, la proteasa es recuperada y vuelta a usar en otra carga de celulasa de Trichoderma . Un método preferido de recuperar la proteasa es ligarla a una resina S-Sepharose a un pH de entre 4.5 y 5.0 y una temperatura inferior a 20°C. La resina S-Sepharose puede ligar aproximadamente 100 g/l de la proteasa papaína. La mezcla de celulasa y papaína es pasada sobre la resina y cuando ésta está totalmente cargada con papaína, es lavada con agua ablandada para retirar cualquier celulasa que contamine y luego lavada con una solución de cloruro de sodio 1 M para desorber la papaína. La solución de papaína es entonces dialisada para remover el exceso de sal y está entonces lista para volverse a usar. Durante esta operación de recuperación, es importante mantener un ambiente reductor debido a que la papaína está sujeta a una inactivación oxidativa reversible. Formulación de Producto Las composiciones de celulasa de esta invención pueden también comprender diversos coadyuvantes conocidos por los técnicos en la materia. Por ejemplo, sería útil en las composiciones de la presente invención un tensioactivo (aniónico o no iónico) compatible con la composición de celulasa. Los tensioac-tivos preferidos son no iónicos, tales como los alcoholes polioxietilados encontrados en la serie Tritón (marca registrada) de tensioactivos (tensioactivos no iónicos de octilfenoxipolieto-xietanol) que están comercialmente disponibles en Union Carbide. Deberá notarse que la inclusión de un tensioactivo puede mejorar adicionalmente el contraste relativo entre los hilos blancos y azules y reducir la cantidad de re-depositación de colorante. También pueden usarse otros materiales con o colocarse en la composición, según se desee, incluyendo piedras, rellenos, solventes, amortiguadores, estabilizadores de enzima, agentes de control de pH, activadores de enzima, edificantes, otros agentes contra la re-depositación y similares. La composición de enzima puede ser formulada como un producto sólido donde el sólido puede ser granular, secado por rocío o aglomerado. En forma alternativa, la composición de enzima puede ser formulada como un líquido, un gel o un producto en pasta. Se prefiere en la presente una preparación líquida. Lavado de Mezclilla El lavado de mezclilla para crear una apariencia "lavada con piedras" puede lograrse sustancialmente usando un proceso con piedras o libre de piedras en el cual la mezclilla o las prendas de mezclilla son agitadas mecánicamente en una máquina lavadora con una composición acuosa que contiene las composiciones de celulasa de Trichoderma tratadas con proteasa. La cantidad de la composición usada para tratar mezclilla dependería de la concentración de la proteína celulasa en la composición de celulasa, la cantidad del sustrato de mezclilla en la lavadora, y la cantidad deseada del efecto de lavado con piedras, y otros parámetros bien conocidos para los técnicos en la materia. La cantidad preferida de la composición de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa es generalmente de entre 500 y 200,000 unidades CMC de enzima por kilogramo de mezclilla, y con mayor preferencia entre alrededor de 5,000 y 100,000 unidades CMC por kilogramo de mezclilla'. En una forma de realización preferida, el tratamiento de lavado de mezclilla es llevado a cabo a una temperatura elevada de entre 30 y 70°C y con mayor preferencia entre 45 y 55°C. En una forma de realización preferida, el tratamiento de lavado de mezclilla es llevado a cabo a un pH de entre 4.0 y 7.5, y con mayor preferencia entre 4.5 y 6.5. En la forma de realización mas preferida, el pH para el tratamiento de mezclilla es de alrededor de 6.0. Además de la composición de celulasa, el paso de lavado de mezclilla puede también usar una variedad de otros coadyuvan-tes de proceso. Por ejemplo, sería útil añadir a la lavadora un tensioactivo (aniónico o no iónico) compatible con la composición de celulasa, en los métodos de la presente invención. Tensioactivos preferidos son los no iónicos, tales como los alcoholes polioxietilados encontrados en la serie Tritón (marca registrada) de tensioactivos (tensioactivos no iónicos de octilfenoxipolieto-xietanol) , comercialmente asequibles de Union Carbide. Deberá notarse que la inclusión de un tensioactivo puede mejorar adicionalmente el contraste relativo entre hilos blancos y azules y reducir la cantidad de re-depositación de colorante. También pueden usarse otros materiales con o colocarse en la lavadora, según se desee, incluyendo piedras, rellenos, solventes, amortiguadores, estabilizadores de enzima, agentes de control de pH, activadores de enzima, edificantes, otros agentes contra la re-depositación, y similares. Ei emplos La anterior descripción proporciona una discusión de las composiciones de la invención y los métodos de hacer y usar las composiciones en el "lavado con piedras" de artículos de vestir de tela. Los siguientes ejemplos proporcionan detalles específicos respecto de las composiciones y los métodos de la invención. Serán evidentes a los técnicos en la materia, con base en las enseñanzas contenidas en la presente, otras opciones de proteasa añadida y celulasa, así como condiciones de lavado tales como la concentración, la medición, el pH, la temperatura y similares. Ejemplo 1 Preparación de una Composición de Celulasa de Trichoderma Tratada con Proteasa Se produjeron aproximadamente 600 litros de una preparación de celulasa de Trichoderma natural mediante la fermentación de Trichoderma longibrachiatum y se dialisaron a una conductividad de 450 µ-S. Aunque este producto no fue estabilizado o conservado, está disponible en una forma estabilizada y conservada como celulasa logen a partir de logen Corporation. Un material sustancialmente similar puede ser preparado simplemente dialisando celulasa logen para remover estabilizadores y conservadores. Entonces se concentró a un volumen de 500 litros por ultrafiltración. El producto dialisado resultante tiene una concentración de proteína de 140 g/l y una actividad endoglucana-sa de 1,599 unidades CMC/ml usando el método de Ghose (1987) . Se retiraron 150 litros de la preparación y la preparación remanente fue entonces mezclada con 150 litros de agua blanda y 40 kg de polvo de papaína Biocon, disponible de Quest International
(producto número 5x98490) y teniendo una concentración de papaína de 105 g/kg y una actividad de 1,000 unidades coagulantes de leche (MCU) /mg de polvo de papaína, como se especifica por Quest International. El pH fue ajustado a 4.8 usando benzoato de sodio y la mezcla fue incubada a grandes rasgos a 35-40°C por 42 horas. El grado de tratamiento resultante fue de aproximadamente 216 g min/g. Se perdió 49% de la actividad inicial de celulasa durante este tratamiento con proteasa, como se midió en FPUs, y menos de 10%, como se midió en CMCUs. La mezcla fue entonces enfriada súbitamente a 20°C durante un período de una hora. La mezcla fue entonces aclarada en un plato pre-revestido con tierra de diatomáceas y un filtro de marco. Con agua de enjuague, la preparación fue diluida a un volumen de alrededor de 960 litros. La proteasa fue removida de la mezcla de proteasa y celulasa, pasando la preparación sobre una resina de intercambio catiónico S-Sepharose, de acuerdo con las instrucciones del fabricante de resina (manual técnico de Pharmacia 18-1022-19 "Ion Exchange Chromatography: Principies and Methods", 1991). Se equilibró primero S-Sepharose a un pH de 4.7 con amortiguador de acetato; posteriormente, la mezcla de proteasa/celulasa fue cargada a la resina en una medida de aproximadamente 13 g de proteína papaína por litro de resina empacada. La resina fue lavada con amortiguador de acetato, pH de 4.7. Los efluentes combinados de las fases de carga de columna y de lavado consistieron en celulasa pura, libre de papaína: la actividad de la papaína en la celulasa estuvo por debajo de los límites de detección, con base en la actividad contra azo-caseína. La papaína ligada con S-Sepharose fue recuperada posteriormente haciendo pasar cloruro de sodio 1.0 M, pH de 4.8, sobre la resina. El volumen de la preparación de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa fue de alrededor de 2,700 litros. La preparación de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa resultante fue conservada ajustando su pH a 4.0 y añadiendo benzoato de sodio. Esta composición fue entonces concentrada por ultrafiltración y estabilizada convencionalmente ("Enzyme Applications", Encyclopedia of Chemical Technology, vol. 9, cuarta edición, 1994) a una concentración final de aproximada-mente 1,800 unidades CMC/ml .
Ejemplo 2 Lavado de Mezclilla con una Composición de Celulasa de Trichoderma Tratada con Proteasa Se usó una máquina lavadora/extractora UniMac de 35 Ib. Se colocaron en la máquina aproximadamente 5.1 kg de prendas de vestir de mezclilla desarmadas. La mezclilla consistió en 3 piernas de pantalón cosidas, de 30 cm de longitud y 5 piezas de un metro cuadrado de mezclilla Swift de 14 onzas, No. 37628, y tres piernas de pantalón cosidas de 30 cm de longitud de mezclilla Swift de 12 onzas, No. 25113, todas hechas por Swift, de Drummondville, Quebec, Canadá. La mezclilla fue desarmada mediante tratamiento por 15 minutos a 70°C con 30 g de la enzima alfa-amilasa Rapidase UC, disponible de Gist-Brocades . La máquina fue llevada con 51 litros de agua caliente y llevada a 50°C. La relación del licor fue de 10:1 (peso del licor a peso de las prendas de vestir) . El licor fue amortiguado a un pH de 6.0 con 300 g de ácido fosfórico al 85% y 114 g de perlas de hidróxido de sodio. La máquina fue agitada por un minuto para dispersar el amortiguador y establecer la temperatura. En este punto, se añadieron a la máquina 70 ml de la preparación de celulasa tratada con proteasa del Ejemplo 1. Las prendas de vestir fueron lavadas a 47 rpm por 60 minutos. Después de lo anterior, se retiró el baño. El baño fue entonces llenado con agua a 50°C y se añadieron 2 g/l de sosa cáustica en escamas para ajustar el pH hasta 9.0-11.0 para destruir la actividad de la celulasa. La máquina fue agitada por 10 minutos y luego se retiró el baño. Las prendas de vestir fueron entonces enjugadas con agua fría por 5 minutos y agua caliente por 30 segundos. Esto fue seguido por dos enjuagues de 10 minutos a 50°C, luego se retiró el baño y se hizo girar. Las prendas de vestir fueron entonces secadas en una secadora doméstica convencional por 30 minutos. Las prendas de vestir fueron entonces retiradas de la secadora y planchadas sin vapor de agua. Se tomaron lecturas de brillantez de la mezclilla usando un medidor de brillantez Elrephro. Las lecturas de brillantez de la pierna de pantalón No. 37628 fueron usadas para estimar la remoción neta de colorante y se convirtieron en la cantidad neta de retiro de colorante índigo de la tela al comparar con muestras de contenido conocido de índigo. Los resultados son reportados como un porcentaje del índigo en la mezclilla no lavada. Las lecturas de brillantez de la pierna de pantalón No. 25113 fueron usadas para estimar el grado de retro-teñido y se convirtieron en la cantidad neta de colorante índigo re-depositado sobre la tela por comparación con muestras de contenido conocido de índigo. Los resultados son reportados como un porcentaje del índigo en la mezclilla no lavada. El procedimiento fue repetido con 88 ml de celulasa logen, una enzima celulasa que se re-deposita, convencional. Los resultados son los mostrados en la Tabla 1. Tabla 1 Comparación de Celulasa de Trichoderma Tratada con Proteasa y No Tratada
Como es evidente de la Tabla 1 para aproximadamente el mismo grado de retiro de colorante, la mezclilla expuesta a la celulasa tratada con proteasa exhibe mucho menos retro-teñido que en el caso de la celulasa que se re-deposita. Ej emplo 3 Lavado de Mezclilla con Tensioactivo Añadido Usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 2, salvo lo señalado, se usaron las siguientes enzimas en el lavado de mezclilla: a. 80 ml de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa del Ejemplo 1, usada como en el Ejemplo 2. b. 80 ml de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa del Ejemplo 1, usada como en el Ejemplo 2, salvo que se añadieron 40 ppm de Tritón (marca registrada) X100 a la lavadora al inicio del lavado con celulasa. c. 80 ml de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa del Ejemplo 1, usada como en el Ejemplo 2, salvo que se añadieron 80 ppm de Tritón (marca registrada) XlOO a la lavadora al inicio del lavado con celulasa. d. 80 ml de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa del Ejemplo 1, usada como en el Ejemplo 2, salvo que se añadieron 160 ppm de Tritón (marca registrada) XlOO a la lavadora al inicio del lavado con celulasa. Tabla 2 Demostración del Efecto del Tensioactivo Añadido
Como lo demuestra la Tabla 2, la adición del tensioactivo reduce adicionalmente el retro-teñido sin pérdida significativa de liberación neta de colorante. Ejemplo 4 Resultados Comparativos de Lavado de Mezclilla Usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 2, se usaron las siguientes enzimas en el lavado de mezclilla: a. Celulasa tratada con proteasa del Ejemplo 1 y probada en el Ejemplo 2. b. Siguiendo los protocolos de Clarkson y colaborado- res, se añadió celulasa logen (la cual consiste en 142 mg/ml de proteína) como celulasa de Trichoderma que se re-deposita y respectivamente 0.02, 0.10, 0.5, 2.5 y 12.5 ml de subtilisina Rapidase WSL-2, disponible de Gist-Brocades, fueron añadidos como proteasa. Esta proteasa consiste en 110 mg/ml de proteína. La cantidad de celulasa logen usada fue de 88 ml, salvo por la corrida con 12.5 ml de proteasa, la cual tuvo 78 ml de celulasa. Los niveles de adición de proteasa fueron respectivamente de 0.02, 0.08, 040, 2.0 y 10% en peso de la proteína subtilisina con base en el peso de la proteína celulasa. El nivel mínimo deseable enseñado por Clarkson y colaboradores fue de 0.1%. Como se sugiere por Clarkson y colaboradores , el pH en la lavadora fue ajustado a 5.0 con 152 g de ácido acético glacial y 55 g perlas de hidróxido de sodio. Todos los demás procedimientos fueron como en el Ejemplo 2. Los resultados son reportados en la Tabla 3 y demuestran que la composición de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa dio un nivel mucho menor de retro-teñido que el método de Clarkson y colaboradores . Aunque los resultados contradicen la enseñanza de Clarkson y colaboradores sobre la necesidad de proteasa en el lavado, apoyan sus enseñanzas cuando se añaden juntas celulasa y proteasa a la máquina lavadora, se reduce considerablemente el retro-teñido con mas de 0.1% de proteasa con relación a la celulasa presente.
Tabla 3 Comparación de Composiciones de Enzima Celulasa Que No Re-Depositan
Tratadas con Proteasa Se produjeron aproximadamente 1,000 litros de una preparación de celulasa de Trichoderma natural por fermentación de Trichoderma longibrachiatum y se dialisaron a una conductividad de 310 µS . Aunque este producto no fue estabilizado ni conservado, está disponible en una forma estabilizada y conservada como celulasa logen a partir de logen Corporation. Un material sustancialmente similar puede ser preparado simplemente dialisando celulasa logen para retirar estabilizadores y conservadores. Fue entonces concentrado a un volumen de 725 litros por ultrafiltración. El producto dialisado resultante tuvo una concentración de proteína de 98 g/l y una actividad de endoglucanasa de 1,325 unidades CMC/ml usando el método de Ghose (1987) . Se retiraron 375 litros de la preparación y la prepara-ción remanente fue entonces mezclada con 150 litros de agua blanda y 15.75 kg de papaína Folexco 300 MCU, disponible de Folexco Incorporated, y teniendo una concentración de proteína de papaína activa estimada en 32 g/kg y una actividad estimada de 300 unidades coagulantes de lecho (MCU) /mg de polvo de papaína. El pH fue ajustado a 4.8 usando benzoato de sodio y la mezcla fue incubada aproximadamente a 35-50°C por 27 horas. El grado de tratamiento resultante fue de aproximadamente 24 g min/g. Los inventores estiman que aproximadamente 20% de la actividad FPU y nada de la actividad CMCU fueron perdidas durante este tratamien-to con proteasa. La mezcla fue entonces enfriada súbitamente a aproximadamente 10°C durante un período de dos horas. La mezcla fue entonces aclarada sobre una plata pre-revestida de tierra de diatomáceas y un filtro de marco. Con agua de enjuague, la preparación fue diluida a un volumen de aproximadamente 800 litros. Se retiró proteasa de la mezcla de proteasa y celulasa haciendo pasar la preparación sobre una resina de intercambio catiónico de S-Sepharose de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la resina (manual técnico de Pharmacia 18-1022-19 "Ion Exchange Chromatography: Principies and Methods", 1991). Primero se equilibró S-Sepharose a un pH de 4.7 con amortiguador de acetato; posteriormente, la mezcla de proteasa/celulasa fue cargada a la resina en un grado de aproximadamente 5 g de proteína papaína por litro de resina empacada. La resina fue lavada con amortiguador de acetato, pH 4.7. Los efluentes combinados de las fases de carga de columna y de lavado consistieron en celulasa pura, libre de papaína: la actividad de papaína en la celulasa estuvo debajo de los límites de detección con base en actividad contra azo-caseína. La papaína ligada con S-Sepharose fue posteriormente recuperada haciendo pasar cloruro de sodio 1.0 M, pH 4.8, sobre la resina. El volumen de la preparación de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa fue de alrededor de 1,600 litros. La preparación de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa resultante fue conservada ajustando su pH a 4.0 y añadiendo benzoato de sodio. Esta composición fue entonces concentrada por ultrafiltración y estabilizada convencionalmente ("Enzyme Applications" , Encyclopedia of Chemical Technology, vol. 9, cuarta edición, 1994) a una concentración final de aproximadamente 2,000 unidades CMC/ml . Ejemplo 6 Lavado de Mezclilla con Composiciones de Celulasa de Trichoderma Tratadas con Proteasa Usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 2, salvo como se apunta, se usaron las siguientes enzimas en el lavado de mezclilla: a. 86 ml de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa del Ejemplo 5, usada como en el Ejemplo 2. b. 70 ml de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa del Ejemplo 1, usada como en el Ejemplo 2. c. 88 ml de celulasa logen, como se describe y prueba en el Ejemplo 2. Los resultados son reportados en la Tabla 4 y demuestran que los niveles inferiores de tratamiento de papaína empleados en el Ejemplo 5 (24 g min/g) no dan tan buen funcionamiento como los tratamientos mas severos del Ejemplo 1 (216 g min/g) . Tabla 4 Comparación de Celulasa de Trichoderma Tratada con Proteasa y No Tratada
Ejemplo 7 Resultados Comparativos de Lavado de Mezclilla Usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 2, se usaron las siguientes enzimas en el lavado de mezclilla: a. Celulasa tratada con proteasa del Ejemplo 1 y probada en el Ejemplo 2.
b. 80 ml de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa del Ejemplo 1, probada como en el Ejemplo 3 con 40 ppm de Tritón XlOO añadido a la lavadora al inicio del lavado con celulasa. c. Euro L, un producto comercial de celulasa de Genecor
International que se cree contiene la enzima proteasa, una celulasa de Trichoderma que se re-deposita y un tensioactivo, se añadió en una cantidad de 100 ml . De acuerdo con la sugerencia del fabricante, se ajustó el pH a 5.5 con 150 g de ácido acético glacial y 85 g de perlas de hidróxido de sodio. Todos los demás procedimientos fueron como en el Ejemplo 2. d. Se añadió Euro L a la lavadora en una cantidad de 100 ml . Se añadieron también 40 ppm de Tritón XlOO a la lavadora al inicio del lavado con celulasa. De conformidad con la sugerencia del fabricante, se ajustó el pH a 5.5 con 150 g de ácido acético glacial y 85 g de perlas de hidróxido de sodio. Todos los demás procedimientos fueron como en el Ejemplo 2. e. Denimax L, un producto comercial de Novo Nordisk que se cree contiene enzima de bajo retro-teñido elaborada por medio de Humicola insolens, fue añadido en una cantidad de 250 ml . De conformidad con la sugerencia del fabricante, se ajustó el pH a 6.5 con 297 g de ácido fosfórico y 125 g de perlas de hidróxido de sodio. Todos los demás procedimientos fueron como en el Ejemplo 2. f . Se añadió Denimax L a la lavadora en una cantidad de 250 ml. También se añadieron 44 ppm de Tritón XlOO a la lavadora al inicio del lavado con celulasa. De conformidad con la sugerencia del fabricante, se ajustó el pH a 6.5 con 297 g de ácido fosfórico y 125 g de perlas de hidróxido de sodio. Todos los demás procedimientos fueron como en el Ejemplo 2. Los resultados son reportados en la Tabla 5 y demuestran que, para liberación similar de colorante, la composición de celulasa de Trichoderma tratada con proteasa da a la mezclilla un menor nivel de retro-teñido que Euro L o Denimax L. Este buen desempeño de la celulasa de Trichoderma tratada con proteasa sin tensioactivo, con relación a Euro L, es logrado aun cuando Euro L contiene tensioactivos de mejoramiento de desempeño. La baja potencia de la celulasa de Humicola insolens es evidente del hecho de que se requirió de dos a tres veces mas Denimax L para desvanecer la mezclilla que el caso de otras enzimas. Tabla 5 Comparación de Composiciones de Enzima Celulasa Que No Se Re-Depositan
Aunque se han mostrado y descrito formas de realización preferidas de la invención, la invención deberá ser definida únicamente por los alcances de las reivindicaciones anexas .