CN101259405B

CN101259405B - 以活性蓝4为配基的尼龙亲和膜的制备方法及应用

Info

Publication number: CN101259405B
Application number: CN2007101722397A
Authority: CN
Inventors: 朱利民; 苏赛男; 聂华丽; 陈天翔
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2007-12-13
Filing date: 2007-12-13
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2027-12-13
Also published as: CN101259405A

Abstract

本发明涉及以Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜的制备方法及应用，制备：活化后的尼龙膜经壳聚糖改性；改性后的尼龙膜浸入Reactive Blue 4染料，保温后加入NaCl溶液反应，升温后加入Na₂CO₃溶液，继续反应，分别用热的去离子水、甲醇溶液、NaCl溶液、尿素溶液和去离子水洗涤，得Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜；应用：木瓜粉上样于Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜，Tris-HCl缓冲液冲洗，用NaSCN溶液洗脱，得木瓜蛋白酶；测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。该方法快速、简便、分离量大、提取的酶活性好、纯度高，适用于规模化生产。

Description

以活性蓝4为配基的尼龙亲和膜的制备方法及应用

技术领域

本发明属尼龙亲和膜领域，特别是涉及一种以Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜的制备方法及应用。

背景技术

木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)是一类巯基蛋白酶，广泛存在于番木瓜(Carica papaya)的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。广泛地应用于食品行业，如啤酒的澄清和肉质的嫩化以及皮革、纺织、日化和制药工业。木瓜蛋白酶的纯化大部分是采用沉淀法，但是这种方法仍然混有其他的蛋白酶，不能达到制药工业的需求。

目前，分离纯化木瓜蛋白酶的方法包括粗分离和精制分离，其中粗分离包括盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂分级分离法等，精制分离包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、疏水层析以及共价层析等。尽管这些方法都有一定的优点，但都存在操作繁琐、样品活性回收率低、纯化效果不理想等缺点，尤其是从大体积的稀溶液中提取少量的生物活性物质时。

亲和膜色谱技术的应用可使蛋白质纯化倍数提高，而且具有选择特异性好、压降小、耗时短、生物大分子在分离过程中变性几率小、允许较快的加料速度、可以重复利用有效降低成本等特点，与柱亲和色谱相比，更易实现规模化纯化分离。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用先进的亲和膜色谱技术快速提纯木瓜蛋白酶的方法，该方法快速、简便、分离量大、提取的酶活性好，纯度高，适用于规模化生产。

本发明的一种以Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜的制备方法，包括下列步骤：

(1)活化后的尼龙膜，浸入壳聚糖溶液中，室温反应后，80-90℃烘干，用1vol.％醋酸和去离子水冲，进行尼龙膜的改性；

(2)经壳聚糖改性后的尼龙膜浸入Reactive Blue 4染料溶液中，保温30-50min后，加入质量分数为15％～20％NaCl溶液，55℃～60℃恒温振荡反应30-40min，然后升高水浴温度，加入Na₂CO₃溶液，65℃～80℃继续恒温振荡反应4-5h，分别用热的去离子水，甲醇溶液，2mol/LNaCl溶液，尿素溶液和去离子水充分洗涤，得以Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜。

所述的尼龙膜活化是指尼龙膜在25-30℃1mol/LHCl中水解后，用甲醛进行活化；

所述壳聚糖溶液是指质量分数为2％的壳聚糖溶液(以1vol.％醋酸溶解)；

所述的Reactive Blue 4染料溶液浓度为5mg/mL～15mg/mL，优选8mg/mL～12mg/mL；

所述的Na₂CO₃溶液是指质量分数为15％～20％Na₂CO₃溶液；

所述的甲醇溶液是指体积分数为10％甲醇溶液；

所述的尿素溶液是指6mol/L尿素溶液。

本发明的以Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜的应用，包括步骤：

(1)Tris-HCl缓冲液中的木瓜粉，上样于以Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜，Tris-HCl缓冲液冲洗后，用NaSCN溶液洗脱，得到木瓜蛋白酶；

(2)测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。

所述的Tris-HCl缓冲液是0.05mol/L～1mol/L pH 8.0～8.5的Tris-HCl缓冲液，优选0.05mol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液；

所述的木瓜粉溶液是10.0～15.0mg/mL的木瓜粉溶液；

所述的NaSCN溶液是指1mol/L pH 6.0的NaSCN溶液。

本发明的有益效果：

(1)本发明的方法操作简单，耗时较少，纯化倍数和酶活性较高；

(2)样品来源方便，便于大规模提取纯化。

附图说明

图1是利用尼龙亲和膜从木瓜粉中分离纯化木瓜蛋白酶的吸附洗脱曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

尼龙膜的活化和键合壳聚糖进行改性，具体步骤如下：

(1)尼龙膜先在25℃1mol/LHCl中水解24h，然后用甲醛进行活化。10张水解的尼龙膜浸入20mL甲醛溶液(＞36.5wt.％)，加入0.2mL磷酸(85wt.％)，于60℃反应7h，40-50℃热水水洗多次。

(2)将上述甲醛活化的尼龙膜，浸入10mL质量分数为2％的壳聚糖溶液(以1vol.％醋酸溶解)，室温反应1h，然后转入80℃烘箱，1h后取出，分别用1vol.％醋酸和去离子水洗去未反应的壳聚糖。尼龙膜上的壳聚糖含量可按茚三酮的方法进行测试。

实施例2

以Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜的制备，具体步骤如下：

上述经壳聚糖改性后的尼龙膜浸入浓度为10mg/mL的Reactive Blue 4染料溶液中，60℃保温40min后，加入质量分数为20％NaCl溶液，恒温振荡反应30min，然后升高水浴温度至80℃，加入质量分数为25％Na₂CO₃溶液，继续恒温振荡反应4h，分别用热的去离子水，体积分数为10％的甲醇溶液，2mol/L NaCl溶液，6mol/L尿素溶液和去离子水充分洗涤，直到洗涤液呈无色为止，得到以Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜，保存于双蒸水中。

实施例3

以干酪素为底物的紫外分光光度法酶活的表征，具体步骤如下：

取0.1mL的酶液，加入0.7mL 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，再加入0.2mL的木瓜蛋白酶激活剂(上述缓冲液内含0.5mol/L的L-cysteine和0.02mol/L的EDTA，pH8.0)35℃保温恒定，加入同样预热的1％(W/V)酪蛋白溶液(上述缓冲液配制)1mL，35℃反应15mim，加入3mL 5％三氯乙酸(TCA)溶液终止反应(对照组实验先加TCA后加底物)。静置，8000转/分离心20min，取滤液于280nm波长下比色。

实施例4

利用尼龙亲和膜从木瓜粉溶液中分离纯化木瓜蛋白酶，具体步骤如下：

15张尼龙亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，首先以0.05mol/L pH为8.5的Tris-HCl缓冲液平衡15min，流速为1.0mL/min，随后以蠕动泵送入35mL的10mg/mL的木瓜粉溶液通过膜桥，然后以0.05mol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液洗去未吸附上的蛋白质；最后以1mol/L的NaSCN的洗脱液(pH6.0)进行洗脱，得到目标蛋白质木瓜蛋白酶。

Claims

1.一种以Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜的制备方法，包括下列步骤：

(2)经壳聚糖改性后的尼龙膜浸入Reactive Blue 4染料溶液中，保温30-50min后，加入质量分数为15％～20％NaCl溶液，55℃～60℃恒温振荡反应30-40min，然后升高水浴温度，加入Na₂CO₃溶液，65℃～80℃继续恒温振荡反应4-5h，分别用热的去离子水、甲醇溶液、NaCl溶液、尿素溶液和去离子水充分洗涤，得以Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜；

尼龙膜活化是指尼龙膜在25-30℃1mol/L HCl中水解后，用甲醛进行活化；

所述的Reactive Blue 4染料溶液浓度为5mg/mL～15mg/mL；

所述的Na₂CO₃溶液是指质量分数为15％～20％Na₂CO₃溶液；

所述的洗涤是分别用热的去离子水、体积分数为10％甲醇溶液、2mol/LNaCl溶液、6mol/L尿素溶液和去离子水充分洗涤；

所述壳聚糖溶液是以1vol.％醋酸溶解的质量分数为2％的壳聚糖溶液。

2.根据权利要求1所述的以Reactive Blue 4为配基的尼龙亲和膜的制备方法，其特征在于：所述的Reactive Blue 4染料溶液浓度为8mg/mL～12mg/mL。