MX2013015208A - Planta y semilla de alfalfa correspondiente al evento transgenico kk 179-2 y metodos de deteccion de las mismas. - Google Patents
Planta y semilla de alfalfa correspondiente al evento transgenico kk 179-2 y metodos de deteccion de las mismas.Info
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Abstract
La presente invención provee un evento transgénico KK179-2 de alfalfa; la invención también proporciona células, partes de plantas, semillas, plantas, productos básicos relacionados al evento, y moléculas de ADN que son únicas al evento y que se crearon mediante la inserción de ADN transgénico al genoma de una planta de alfalfa; además, la invención proporciona métodos para detectar la presencia de secuencias nucleotidicas de dicho evento de alfalfa en una muestra, sondas y cebadores para usarse en la detección de las secuencias nucleotídicas que son diagnósticos para la presencia de dicho evento de alfalfa.
Description
PLANTA Y SEMILLA DE ALFALFA CORRESPONDIENTE AL EVENTO TRANSGÉNICO KK 179-2 Y MÉTODOS DE DETECCIÓN DE LAS MISMAS
REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud tiene derecho a la prioridad conforme a 35 U.S.C. § 119 (e) a la solicitud de patente estadounidense provisional N° 61/503,373, presentada el 30 de junio de 2011 , y a la solicitud de patente estadounidense provisional N° 61/664,359, presentada el 26 de junio de 2012, las divulgaciones de la cual se incorporan por referencia en su totalidad.
Incorporación del listado de secuencias
El archivo del listado de secuencia denominado "57978_seq_listing.txt, que cuenta con 10.564 bitios (medido por MS-WINDOWS) presentado de manera electrónica y que fue creado el 1 de mayo de 2012, incorporado en este por referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al evento transgénico KK179-2 de alfalfa. La invención además proporciona células, partes de plantas, semillas, plantas, productos de consumo, y las moléculas ADN que son únicas al evento y que fueron creadas por la inserción de ADN transgénico al
genoma de una planta de alfalfa. La invención proporciona además métodos para detectar la presencia de dichas secuencias de nucleótidos de eventos de alfalfa en una muestra, sondas y cebadores de uso en la detección de secuencias de nucleótidos que son de diagnóstico para la presencia de dicho evento la alfalfa.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La alfalfa (Medicago sativa) es la legumbre más cultivado en el mundo entero, con EE.UU. el productor de alfalfa más grande. Se han aplicado los métodos de biotecnología a la alfalfa para mejorar los rasgos agronómicos y la calidad del producto. Uno de tales rasgos agronómicos es el contenido de lignina.
La lignina constituye el segundo biopolímero terrestre más abundante y representa el 30% del carbono orgánico. La lignina es esencial para la integridad estructural de la pared celular y aporta rigidez y resistencia al tallo. El contenido de lignina se correlaciona inversamente con la digestibilidad del forraje para el ganado lechero. Es posible lograr una reducción en la lignina en plantas transgénicas mediante la expresión de un constructo para la supresión de ARN capaz de proveer tal reducción mientras que proveen un aumento en la digestibilidad de alfalfa al mismo tiempo. Se sabe que la expresión de genes extraños o moléculas de supresión en las plantas está influenciada por muchos factores, tales como los elementos
reguladores usados, la posición cromosomática de la inserción transgénica, la proximidad de cualquier elemento endógeno regulador cerca del sitio de la inserción transgénica y los factores ambientales como la luz y la temperatura. Por ejemplo, se ha observado que puede haber una variación en el nivel global de la supresión transgénica o en el patrón espacial o temporal de la supresión transgénica entre eventos que se han producido de manera semejante. Con este motivo, frecuentemente es necesario examinar cientos de eventos de transformación independientes a fin de identificar por último un evento útil para los fines agrícolas comerciales. Tal evento, una vez identificado como tener el fenotipo de supresión deseado, las características moleculares y el rasgo mejorado, podrá entonces ser usado para introgresar el rasgo mejorado a otros fondos genéticos usando los métodos de cultivo de plantas. La progenie resultante contendría el evento transgénico y tendría por eso las mismas características de este rasgo del transformante original. Esto puede usarse para producir un número de variedades diferentes de cultivos que comprenderán el rasgo mejorado y son adaptados adecuadamente a las condiciones locales de crecimiento.
Sería ventajoso ser capaz de detectar la presencia del ADN de una planta particular para determinar si la progenie de un cruce sexual contenga el ADN transgénico/genómico de interés. Además, un método para la detección de una planta particular sería muy útil al cumplir con los reglamentos que requieren la aprobación previa a la comercialización y el etiquetado de los alimentos derivados de las plantas transgénicas.
La presencia o ausencia de un elemento de supresión se puede detectar por cualquier método bien conocido para la detección del ácido nucleico, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación de ADN utilizando sondas de ácidos nucleicos. Estos métodos de detección se centran generalmente en el uso frecuente de elementos genéticos, tales como promotores, terminadores, genes marcadores, etc. Como resultado, es posible que estos métodos no sea útiles para discriminar entre los diferentes eventos de transformación, en particular aquellos producidos utilizando el mismo ADN constructo a menos que la secuencia de ADN cromosómica adyacente al ADN insertado ("ADN flanqueante") es conocida. Un ensayo PCR específica de evento se analiza, por ejemplo, de Taverniers et al. (J. Agrie. Food Chem., 53: 3041-3052, 2005) en el que un sistema de rastreo de eventos específicos para las líneas Bt11 , Bt176, y GA21 de maíz transgénico y del evento GT73 de cañóla se ha demostrado. En este estudio, cebadores y sondas específicos al evento fueron diseñados en base a las secuencias del genoma/uniones transgénicas para cada evento. Los métodos de detección de ADN por eventos específicos de plantas transgénicas también se han descrito en las Patentes estadounidenses Nos 7,632,985; 7,566,817; 7,368,241 ; 7,306,909; 7,718,373; 7,189,514, 7,807,357 y 7,820,392.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un evento transgénico de alfalfa denominado evento KK179-2, con el depósito de una muestra representativa de la semilla en la American Type Culture Collection (ATCC) bajo el Número de Acceso PTA-11833.
La invención proporciona una planta, semilla, célula, planta progenie o parte de la planta que comprende el evento derivado de una planta, célula, parte de la planta, semilla o evento que comprende el evento KK179-2. Así, la invención incluye, pero no se limita a polen, óvulos, flores, brotes, raíces y hojas.
Un aspecto de la invención proporciona composiciones y métodos para detectar la presencia de una región de la unión ADN transgénico/genómico del evento KK179-2 de la planta o la semilla de alfalfa. Se proveen moléculas de ADN que comprenden al menos una molécula de ADN de unión transgénica/genómica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2 y complementos de los mismos, en donde la molécula de unión abarca el sitio de inserción. Un evento KK179-2 de alfalfa y las semillas que comprende estas moléculas de ADN es un aspecto de esta invención.
Una molécula de ADN novedosa se provee que es una región de ADN transgénico/genómico SEQ ID NO: 3 o el complemento del mismo, a partir del evento KK179-2 de alfalfa. Una planta y semilla de alfalfa que
comprende SEQ ID NO: 3 en su genoma es un aspecto de esta invención. En otro aspecto de la invención, se provee una molécula de ADN que es una región de ADN transgénico/genómico SEQ ID NO: 4 o el complemento del mismo, en donde esta molécula de ADN es novedosa en el evento KK179-2 de alfalfa. Una planta y semilla de alfalfa constándose de SEQ ID NO: 4 en su genoma es un aspecto de esta invención.
La invención provee moléculas de ADN relacionadas con el evento KK179-2. Estas moléculas de ADN pueden constar de secuencias de nucleótidos que representan o se derivan de la unión de la inserción transgénica y flanqueando el ADN genómico de evento KK179-2, y/o una región del ADN genómica flanqueando el ADN insertado, y/o una región del ADN transgénico integrado flanqueando el sitio de inserción, y/o una región del cásete de expresión transgénica integrada, y/o una secuencia contigua de cualquiera de esta regiones. La invención también provee moléculas de ADN útiles como cebadores y sondas de diagnóstico para el evento. Las plantas, células, partes de plantas, productos básicos, la progenie y las semillas que contienen estas moléculas se proporcionan.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona composiciones y métodos para detectar la presencia de una región de inserción transgénica/genómica de la planta novedosa de alfalfa denominada KK179-2. Se proveen moléculas de ADN que comprenden al menos una molécula de ADN de unión transgénica/genómica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 (correspondiente a las posiciones de 1038 hasta
1057 de SEQ ID NO: 6, Figura 1 [F]), y SEQ ID NO: 2 (correspondiente a las posiciones de 3620 hasta 3639 de SEQ ID NO: 6, Figura 1 [F]), y complementos del mismo; en donde una secuencia de unión es una secuencia de nucleótido que abarca el punto en que se inserta el ADN heterólogo a la genoma está conectado con el ADN genómico de las células de alfalfa y la detección de esta secuencia en una muestra biológica que contiene ADN de alfalfa es diagnóstico para la presencia del ADN del evento KK179-2 de alfalfa en dicha muestra (Figura 1). El evento KK179-2 de alfalfa y de las semillas que comprende estas moléculas de ADN es un aspecto de esta invención.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, dos moléculas de ADN se proporcionan para uso en un método de detección de ADN, en donde una primera molécula de ADN comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de longitud suficiente de polinucleótido consecutivo de cualquier porción de la región transgénica de la molécula de ADN de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5 y una segunda molécula de ADN de longitud similar de cualquier porción de una región 5' del ADN genómica flanqueante de la SEQ ID NO: 3, donde dichas moléculas de ADN funcionan como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con una plantilla derivada del evento KK179-2 para producir un amplicón diagnóstico para el ADN del evento KK179-2 en una muestra. Cualquier amplicón producido por cebadores de ADN homólogos o complementarios a cualquier porción de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, y cualquier amplicón que
comprende SEQ ID NO: 1 es un aspecto de la invención.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, dos moléculas de ADN se proveen para uso en un método de detección de ADN, en donde una primera molécula de ADN comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de longitud suficiente de polinucleótido consecutivo de cualquier porción de la región transgénica de la molécula de ADN de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 y una segunda molécula de ADN de longitud similar de cualquier porción de una región 3' del ADN genómica flanqueante de alfalfa de la SEQ ID NO: 4, donde dichas moléculas de ADN funcionan como cebadores de ADN cuando se usan juntos en una reacción de amplificación con una plantilla derivada del evento KK179-2 para producir un amplicón diagnóstico para el ADN del evento KK179-2 en una muestra. Cualquier amplicón producido por cebadores de ADN homólogos o complementarios a cualquier porción de la SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, y cualquier amplicón que comprende SEQ ID NO: 2 es un aspecto de la invención.
La invención proporciona métodos, composiciones y kits útiles para detectar la presencia de ADN derivada del evento KK179-2 de alfalfa. Ciertos métodos comprenden (a) el contacto con una muestra que comprende ADN con un juego de cebadores que al usar en una reacción de amplificación de ácido nucleicos con ADN genómico del evento KK179-2 evento de alfalfa produce un amplicón de diagnostico para el evento; (b) realizando una reacción de amplificación de ácido nucleico produciendo con ello el amplicón; y (c) la detección del amplicón, en donde dicho amplicón comprende la SEQ
g
ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 2. La invención también provee un método de detección del evento al (a) ponerse en contacto con una muestra que comprende ADN con una sonda que al usarse en una reacción de hibridación con el ADN genómico del evento hibridiza a una molécula de ADN específica para el evento; (b) someterse la muestra y la sonda a las condiciones estrictas de hibridación; y (c) detectarse la hibridación de la sonda a la molécula de ADN. Kits que comprenden los métodos y composiciones de la invención útiles para detectar la presencia de ADN derivada del evento también se proveen.
Además, la invención provee un método de producir una planta de alfalfa que comprende: (a) el cruce de una planta de alfalfa KK179-2 con una segunda planta de alfalfa, produciendo con ello una semilla; (b) la cultivación de dicha semilla para producir una pluralidad de plantas progenies; y (c) la selección de una planta progenie que comprende 179-2 o una planta progenie con contenido reducido de lignina.
Los aspectos anteriores y otros de la invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Representación esquemática de la inserción transgénica en el genoma del evento KK179-2 de alfalfa; [A] correspondiente a las posiciones relativas de SEQ ID NO: 1 formando la unión entre SEQ ID
NO: 3 y SEQ ID NO: 5; [B] correspondiente a la posición relativa de SEQ ID NO: 2 formando la unión entre SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5; [C] correspondiente a la posición relativa de SEQ ID NO: 3, que contiene la región flanqueante de alfalfa genómica y una porción del extremo designado arbitrariamente 5' del inserto de ADN transgénico; [D] corresponde a la posición relativa de SEQ ID NO: 4, que contiene la región flanqueante de alfalfa genómica y una porción del extremo designado arbitrariamente 3' del inserto de ADN transgénico; [E] representa SEQ ID NO: 5, que es la secuencia del inserto de ADN transgénico incluyendo el cásete de supresión CCOMT integrado en el genoma del evento KK179-2; [F] representa SEQ ID NO: 6, que es la secuencia contigua que comprende, según representado en la figura de la izquierda a la derecha, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 4, en que SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 están incorporados según anteriormente establecidos, ya que estas secuencias están presentes en el genoma de evento KK179-2. LB: refiere al borde izquierdo de T-ADN; RB: refiere al borde derecho de T-ADN.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS
El archivo del listado de secuencia denominado "57978_seq_listing.txt', que cuenta con 10.564 bitios (medido por MS-WINDOWS) presentado de manera electrónica y que fue creado el 1 de mayo de 2012, incorporado en este por referencia.
SEQ ID NO: 1 - Una secuencia de nucleótido de 20 bp representando la unión del borde izquierdo entre el ADN de alfalfa genómica y el inserto de ADN integrado. Esta secuencia corresponde a las posiciones de 1038 hasta 1057 de SEQ ID NO: 6, y a las posiciones de 1038 hasta 1047 de SEQ ID NO: 3 ([C] de Figura 1) En adición, SEQ ID NO: 1 corresponde al borde izquierdo integrado del cásete de expresión en posiciones de 1 hasta 10 de SEQ ID NO: 5 ([E] de la Figura 1).
SEQ ID NO: 2 - Una secuencia de nucleótido de 20 bp representando la unión del borde derecho entre el inserto de ADN integrado y el ADN genómico de alfalfa. Esta secuencia corresponde a las posiciones 3620 a 3639 de SEQ ID NO: 6, y a las posiciones de 91 hasta de SEQ ID NO: 4 ([D] de Figura 1). En adición, SEQ ID NO: 2 corresponde a las posiciones de 2573 hasta 2582 SEQ ID NO: 5 ([E] de la Figura 1).
SEQ ID NO: 3 Una secuencia de nucleótidos de 1147 bp incluyendo la secuencia 5' genómica de alfalfa (1047 bp) flanqueando el ADN insertado del evento KK179-2 más una región (100 bp) del ADN integrado. Esta secuencia corresponde a las posiciones de 1 hasta 1047 de SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 4 - Una secuencia de nucleótidos de 1356 bp incluyendo la secuencia 3' genómica de alfalfa (1256 bp) flanqueando el ADN insertado del evento KK179-2 más una región (100 bp) del ADN integrado. Esta secuencia corresponde a las posiciones de 3529 hasta 4885 de SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 5 - La secuencia del cásete de expresión integrado, incluyendo las secuencias del borde izquierdo y del borde derecho después de integración. SEQ ID NO: 5 correspondiente a las posiciones de nucleótidos de 1048 hasta 3639 de SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 6 - Una secuencia de nucleótidos de 4885 bp representando el contig de la secuencia 5' flanqueando el ADN insertado de KK179-2 (SEQ ID NO: 3), la secuencia del inserto de ADN integrado (SEQ ID NO: 5) y la secuencia 3' flanqueando el ADN insertado de KK179-2 (SEQ ID NO: 4).
SEQ ID NO: 7 - La secuencia del cebador SQ20901 usada para identificar el evento KK179-2. Producción de un amplicón PCR de 81 bp usando la combinación de cebadores SQ20901 y SQ23728 (SEQ ID NO: 8) es un resultado positivo para la presencia del evento KK179-2.
SEQ ID NO: 8 - La secuencia del cebador SQ223728 usada para identificar el evento KK179-2.
SEQ ID NO: 9 - La secuencia de la sonda PB10164 usada para identificar el evento KK179-2. Es un oligonucleótido sintético con etiqueta 6FAM™.
SEQ ID NO: 10 - La secuencia de la sonda SQ1532 usada como un control interno en los ensayos de punto final TAQMAN®.
SEQ ID NO: 11 - La secuencia del cebador SQ1533 usada como un control interno en los ensayos de punto final TAQMAN®.
SEQ ID NO. 12 - La secuencia de la sonda oligonucleótido
sintético PB0359 con etiqueta VIC™ usada como un control interno en los ensayos de punto final TAQMAN®.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DÉ LA INVENCIÓN
Las siguientes definiciones y métodos se proveen para definir mejor la presente invención y para servir de una guía para aquellos que tienen conocimientos básicos en la materia en la práctica de la presente invención. A menos que se indique lo contrario, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por aquellos que tienen conocimientos básicos en la materia relevante. Definiciones de términos comunes de biología molecular pueden también encontrarse en Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5ta edición, Springer-Verlag: Nueva York, 1991 ; y Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nueva York, 1994.
La presente invención provee el evento transgénico KK179-2 de alfalfa. El término "evento" usado en éste se refiere a las plantas, semillas, progenie, células, partes de plantas de las mismas, y las moléculas de ADN producidas como un resultado de la integración del ADN transgénico en la genoma de la planta en una posición particular en un cromosoma. El evento KK179-2 se refiere a las plantas, semillas, progenie, células, partes de plantas de las mismas, y las moléculas de ADN producidas como un resultado de la inserción ADN transgénico con una secuencia provista en éste como SEQ ID NO: 5 en una posición cromosomática particular en el genoma Medicago
sativa. Se ha depositado una muestra conteniendo KK179-2 en la American Type Culture Collection (ATCC) bajo el Número de Acceso PTA-11833.
Como usado en éste, el término "alfalfa" significa Medicago sativa e incluye todas las variedades de plantas que pueden reproducirse con alfalfa, incluyendo las especies silvestres de alfalfa. La alfalfa también se conoce como medicago, el nombre de cualquier planta del género Medicago hierbas del Viejo Mundo con flores de color azul o amarillo, similares a las de los tréboles relacionados. A diferencia del maíz o la soja, las plantas de alfalfa son autotetraploide; por lo que cada rasgo se determina por los genes que residen en cuatro cromosomas en lugar de dos. Esto complica la investigación genética y también aumenta la dificultad de mejorar la alfalfa. La semilla de alfalfa comercial frecuentemente está formado de una mezcla de clones que pueden constituir un cultivar sintético generado por interpolinización al azar entre los clones seleccionados, seguido de una a tres generaciones de polinización abierta de forma aislada. Además, un cultivar de alfalfa compuesto también puede ser desarrollado mediante la mezcla de semillas de dos o más clones o mediante la interpolinización de clones en forma aislada. Cuando se forma un cultivar compuesto, cantidades iguales de semillas de cada clon de componentes se mezclan para formar la semilla de primera reproducción de cepa inicial.
Se produce un "evento" transgénico mediante la transformación de las células de planta con ADN heterólogo, como tal, un constructo de ácido nucleico que incluye la supresión ARN de un gene de interés, la regeneración
de una población de plantas transgénicas transformadas independientemente resultando de la inserción del cásete transgénico al genoma de la planta, y la selección de una planta particular con características moleculares deseables, tal como la inserción del transgén a una posición particular del genoma. Una planta que comprende el evento pueden referirse al transformante original que incluye el transgén insertado a la posición particular en el genoma de la planta. Una planta que comprende el evento también puede referirse a la progenie del transformante original que retiene el transgén en la misma posición particular en el genoma de la planta. Tal progenie puede producirse por cruce exterior entre el transformante, o su progenie, y otra planta. Dicha otra planta puede ser una planta transgénica que comprende el mismo transgén u otra diferente; o puede ser una planta no-transgénica, tal como una de otra variedad. Incluso después de repetidas retrocruzamientos a un progenitor recurrente, el evento ADN del progenitor transformado está presente en la progenie del cruce en la misma posición genómica.
Una molécula ADN que comprende el evento KK179-2 se refiere a una molécula ADN que comprende por lo menos una porción del ADN transgénico insertado (provisto como SEQ ID NO: 5) y por lo menos, una porción del ADN genómico flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado. Como tal, una molécula de ADN que comprende el evento KK 79-2 tiene una secuencia de nucleótidos que representa al menos una porción del inserto de ADN transgénico y por lo menos una porción de la región particular del genoma de la planta en el cual el ADN transgénico fue insertado. La
disposición del ADN insertado en el evento KK179-2 en relación con el genoma de la planta que la rodea es específica y única al evento KK179-2 y, como tal, la secuencia de nucleótidos de dicha molécula de ADN es de diagnóstico e identificador del evento KK179-2. Se proveen ejemplos de la secuencia de dicha molécula de ADN en éste como SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6. Dicha molécula de ADN es también una parte integral del cromosoma de una planta que comprende KK179-2 y puede ser transmitida a las progenies de la planta.
Como se usa aquí, una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que comprende una combinación de moléculas de ADN que no se produciría naturalmente juntos y que es el resulto de la intervención humana, por ejemplo, una molécula de ADN que se compone de una combinación de al menos dos moléculas de ADN que son mutuamente heterólogos, y/o una molécula de ADN que se sintetiza artificialmente y comprende una secuencia de polinucleótidos que se desvía de la secuencia de polinucleótido que normalmente existiera en la naturaleza, y/o una molécula de ADN que comprende un transgén artificialmente incorporado en el ADN genómico de una célula huésped y el ADN flanqueante asociado del genoma de la célula huésped. Un ejemplo de una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN que se describe en este documento como resultado de la inserción del transgén en el genoma Medicago sativa, que por ende puede resultar en la supresión de un ARN recombinante y/o una molécula de proteína en ese organismo. La secuencia de nucleótidos o
cualquier fragmento de derivados de los mismos también sería considerado una molécula de ADN recombinante si la molécula de ADN puede ser extraída de las células o tejidos, o homogenato de una planta o semilla o tejido vegetal; o puede producirse como un amplicón de ADN o ARN extraído de las células, o tejidos, o homogenato de una planta o semilla o tejido vegetal, cualquiera de los cuales se deriva de tales materiales derivados del evento KK179-2. En realidad, las secuencias de unión como se establece en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y las secuencias de nucleótidos derivadas del evento KK179-2 que también contienen estas secuencias de unión se consideran como ADN recombinante, si estas secuencias están presentes en el genoma de las células del evento KK 79-2 o presentes en cantidades detectables en los tejidos, progenie, muestras biológicas o productos básicos derivados del evento KK179-2. De acuerdo con el uso descrito en éste, el término "transgén" refiere a una molécula de nucleótido artificialmente incorporado en el genoma de una célula huésped. Tal transgén puede ser heterólogo a la célula huésped. El término "planta transgénica" se refiere a una planta que comprende tal transgén. Una "planta transgénica" incluye una planta, parte de la planta, una célula de la planta o semilla cuyo genoma ha sido alterado por la integración estable de ADN recombinante. Una planta transgénica incluye una planta regenerada a partir de una célula de planta transformada originalmente y la progenie de plantas transgénicas de las generaciones posteriores o cruces de una planta transformada. Como resultado de tal alteración genómica, la planta transgénica es claramente diferente de la planta
de tipo silvestre correspondiente. Un ejemplo de una planta transgénica es una planta descrita en éste que comprende el evento KK179-2.
Como se utiliza en la presente, el término "heterólogo" se refiere a una secuencia que no está presente normalmente en un genoma del huésped dado en el contexto genético en el cual se encuentra actualmente la secuencia. A este respecto, la secuencia puede ser nativa para el genoma del huésped, pero puede reorganizar con respecto a otras secuencias genéticas dentro de la secuencia huésped.
La presente invención proporciona moléculas de ADN y sus secuencias de nucleótidos correspondientes. Tal como se usa aquí, los términos "secuencia de ADN", "secuencia de nucleótidos" y "secuencia polinucleotídica" se refieren a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN, por lo general presentadas a partir del extremo 5' (aguas arriba) al extremo 3' (aguas abajo). La nomenclatura utilizada en este documento es la que requiere el Título 37 del Código de Reglamentaciones Federales de los Estados Unidos § 1.822, y se establece en los cuadros de la Norma WIPO ST.25 (1998), Anexo 2, cuadros 1 y 3. La presente invención se divulga con referencia a sólo una cadena de las dos cadenas de secuencias de nucleótidos que se proporcionan en el evento transgénico KK179-2. Por lo tanto, por implicación y derivación, las secuencias complementarias, se menciona también en la técnica como el complemento completo o las secuencias complementarias inversas, están dentro del alcance de la presente invención y por lo tanto también se pretende que estén dentro del
alcance de la materia reivindicada.
La secuencia de nucleótido correspondiente a la secuencia completa de nucleótido del ADN transgénico insertado y segmentos sustanciales del ADN genómico de Medicago sativa flanqueando cualquiera de los extremos del ADN transgénico insertado provisto en éste como SEQ ID NO: 6. Una subsección de esto es el ADN transgénico insertado provisto como SEQ ID NO: 5. La secuencia de nucleótido del ADN genómico flanqueando el extremo 5' del ADN transgénico insertado y una porción del extremo 5' del ADN insertado se provee en éste como SEQ ID NO: 3. La secuencia de nucleótido del ADN genómico flanqueando el extremo 3' del ADN transgénico insertado y una porción del extremo 3' del ADN transgénico insertado provisto en éste como SEQ ID NO: 4. La región que abarca la posición donde el ADN se conecta a y es vinculado al ADN genómico al que se refiere en éste como la unión. Una "secuencia de unión" o "región de la unión" se refiere a una secuencia de ADN y/o la molécula ADN correspondiente que abarca el ADN transgénico insertado y el adyacente ADN genómico flanqueante. Se proveen ejemplos de la secuencia de dicha molécula de ADN en éste como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. La identificación de una de estas uniones de secuencias en una molécula de nucleótido derivada de una planta o semilla de alfalfa es concluyente de que el ADN se obtuvo a partir del evento KK179-2 y es de diagnóstico para la presencia de ADN de evento KK179-2. SEQ ID NO: 1 es una secuencia de nucleótido de 20 bp abarcando la unión entre el ADN genómico y el extremo 5'
del ADN insertado. SEQ ID NO: 2 es una secuencia de nucleótido de 20 bp abarcando la unión entre el ADN genómico y el extremo 3' del ADN insertado. Cualquier segmento del ADN derivado del evento transgénico KK179-2 que incluye los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 está dentro del alcance de la presente invención. Cualquier segmento de ADN derivado del evento transgénico KK179-2 que incluye los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 2 está dentro del alcance de la presente invención. Además, cualquier molécula de polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias descritas en este párrafo está dentro del alcance de la presente invención. La Figura 1 es una representación de la inserción ADN transgénico en el genoma del evento KK179-2 de alfalfa, y las posiciones relativas de SEQ ID NO: 1 a 6 dispuesto 5' a 3'.
La presente invención además provee moléculas ejemplares de ADN que se pueden usar como cebadores o sondas para diagnosticar la presencia de ADN derivado del evento K 79-2 en una muestra. Tales cebadores o sondas son específicos para una secuencia de ácido nucleico objetivo y como tal son útiles para la identificación de la secuencia de ácido nucleico del evento KK179-2 mediante los métodos de la invención descritos en éste.
Una "sonda" es un ácido nucleico aislado al cual se conecta una etiqueta detectable o una molécula reportero, por ejemplo, un isótopo radioactivo, ligando, agente quimioluminiscente, o enzima. Tal sonda es complementaria a la cadena de un ácido nucleico objetivo, en el caso de la
presente invención, a una cadena de ADN genómico del evento KK179-2 de alfalfa, ya sea de una planta de alfalfa o de una muestra que comprende ADN del evento. Las sondas según la presente invención incluyen no solo los ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos, sino también las poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN objetivo y la detección de tales uniones pueden usarse para diagnosticar/determinar/confirma la presencia de aquel secuencia de ADN en una muestra particular.
Un "cebador" es típicamente un polinucleótido aislado que está diseñado para uso en los métodos específicos de recocido o hibridación a fin de hibridar una cadena DNA objetiva para formar un híbrido entre el cebador y la cadena DNA objetiva, y que entonces se extiende a lo largo de la cadena DNA objetiva mediante una polimerasa, por ejemplo, una polimerasa de ADN. Un par de cebadores podrá usarse con la plantilla ADN, tal como una muestra del ADN genómico de Medicago sativa, en una amplificación térmico o isotérmico, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), u otros métodos de amplificación de ácido nucleico, para producir un amplicón, donde el amplicón producido de tal reacción tendría una secuencia de ADN correspondiendo a la secuencia de la plantilla ADN ubicada entre los dos sitios donde los cebadores hibridados a la plantilla. De acuerdo con el uso descrito en éste, un "amplicón" es un pedazo o fragmento de ADN que se ha sintetizado usando las técnicas de amplificación, tal como el producto de una reacción de amplificación. En un modo de realización de la presente
invención, un amplicón diagnóstico para el evento KK179-2 comprende una secuencia que no se encuentra de manera natural en el genoma Medicago sativa. Los pares de cebadores, como se usan en la presente invención, se pretenden referirse al uso de dos cebadores que unen las cadenas opuestas de un segmento de nucleótido de doble cadena con el objetivo de amplificar de manera lineal el segmento polinucleótido entre las posiciones identificadas para la unión por las partes individuales del par de cebadores, típicamente en una reacción de amplificación térmico o isotérmico u otros métodos de amplificación de ácido nucleico. Los ejemplares de moléculas de ADN útiles como cebadores se proveen como SEQ ID NO: 7-9, pueden usarse como una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN que es diferente que la primera molécula de ADN, y ambas moléculas tienen cada una la longitud suficiente de nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 o los complementos de los mismos para funcionar como cebadores de ADN de manera que, al usarse juntos en una reacción de amplificación con la plantilla ADN derivada del evento KK179-2, un amplicón que es específico y único al evento transgénico KK179-2 se produciría. El uso del término "amplicón" excluye específicamente los iniciadores-dímeros que pudieran ser formados en la reacción de amplificación de ADN.
Las sondas y cebadores según la presente invención pueden tener una identidad de secuencia completa a la secuencia objetiva, aunque las sondas y cebadores que difieran de la secuencia objetiva que retienen la capacidad de hibridar de preferencia a las secuencias objetivas pueden
diseñarse por métodos tradicionales. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como un cebador o una sonda sólo necesita ser suficientemente complementarios en la secuencia para poder formar una estructura de doble cadena estable en las concentraciones particulares del solvente y sales empleadas. Cualquier método de amplificación o hibridación de ácido nucleico puede usarse para identificar la presencia de ADN transgénico del evento KK179-2 en una muestra. Por lo general las sondas y los cebadores tienen por lo menos 1 1 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 24 nucleótidos, y por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos o más en longitud. Tales sondas y cebadores hibridan específicamente a una secuencia objetiva en condiciones de alta rigurosidad de hibridación.
Los métodos para preparar y usar sondas y cebadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en adelante, "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York, 1992 (con actualizaciones periódicas) (en adelante, "Ausubel et al., 992"); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Se puede derivar pares de PCR-iniciadores de una secuencia conocida, por ejemplo, al usar programas de computadora diseñados para este propósito tal como Primer (versión 0,5, © 1991 , Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Los cebadores y sondas basados en ADN flanqueante y las secuencias de inserción reveladas en éste pueden usarse para confirmar las secuencias descritas mediante métodos conocidos, por ejemplo, por la reclonación y secuenciación de dichas secuencias.
Los cebadores y sondas de ácidos nucleicos de la presente invención hibridan en condiciones rigurosas con una secuencia de ADN objetiva. Cualquier método de hibridación o amplificación de ácido nucleico puede usarse para identificar la presencia de ADN a partir de un evento transgénico en la muestra. Las moléculas de ácido nucleico o fragmentos de las mismas son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácido nucleico en ciertas circunstancias. De acuerdo con el uso descrito en éste, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente el uno con el otro si las dos moléculas son capaces de formar una estructura antiparalela de ácido nucleico y de doble cadena. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si exhiben una complementariedad completa. De acuerdo con el uso descrito en éste, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas exhiben "complementariedad mínima" si pueden hibridarse entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan recocidas entre sí en por lo menos condiciones de "baja rigurosidad". De modo semejante, se dice que las moléculas son "complementarias" si pueden hibridar entre sí con
suficiente estabilidad para permitir que permanezcan recocidas entre sí en condiciones "altamente rigurosas". Las condiciones de rigurosidad se describen por Sambrook et al., 1989, y por Haymes et al., En: Nucleic Acid Hybrídization, A Practica! Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Las partidas de una complementariedad completa son, por tanto, admisibles, siempre que dichas partidas no prevengan por completo la capacidad de las moléculas para formar una estructura de doble cadena. Para que una molécula de ácido nucleico sirva como un cebador o una sonda sólo necesita ser suficientemente complementaria en secuencia para poder formar una estructura de doble cadena estable en las concentraciones particulares del solvente y sales empleadas.
De acuerdo con el uso descrito en éste, una secuencia sustancialmente homologa es una secuencia de ácido nucleico que se híbrida específicamente al complemento de la secuencia de ácido nucleico al cual se compara en condiciones altamente rigurosas. Las condiciones apropiadas de rigurosidad que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, 6.0 x sodio cloruro/sodio citrato (CSC) a aproximadamente 45°C, seguido por un lavado de 2.0 x CSC a 50°C, son conocidas por aquellos bien versados en la materia o pueden encontrarse en Current Protocols ¡n Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6, 3, 1-6, 3, 6. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede seleccionarse de un nivel bajo de rigurosidad de aproximadamente 2.0 x CSC a 50°C hasta un nivel alto de rigurosidad aproximadamente de 0.2 x CSC a 50°C. Además, la temperatura en la etapa
de lavado puede aumentarse de las condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, de aproximadamente 22°C, a condiciones altamente rigurosas a aproximadamente 65°C. Tanto la temperatura y la sal pueden variarse, o pueden mantenerse constantes la temperatura o la concentración de la sal mientras que la otra variable se cambia. En un modo de realización, un ácido nucleico de la presente invención se híbrida específicamente a una o más de las moléculas de ácido nucleicos establecidos en la SEQ ID NO: 1 , y SEQ ID NO: 2, o complementos o fragmentos de los mismos en condiciones altamente rigurosas. La hibridación de la sonda a la molécula de ADN objetivo puede detectarse por una variedad de métodos conocidos por aquellos bien versados en el material. Estos pueden incluir, pero no se limiten a, etiquetas fluorescentes, etiquetas radioactivas, etiquetas basadas en anticuerpos, y etiquetas quimioluminiscentes.
Con respecto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, por PCR) usando un par de cebadores de amplificación particular, "condiciones rigurosas" son condiciones que permiten que el par de cebadores hibriden únicamente a la secuencia de ácido nucleico objetivo al cual un cebador con la secuencia del tipo silvestre correspondiente (o su complemento) se unirían y preferentemente producirían un producto de amplificación única, el amplicón, en una reacción de amplificación ADN. Ejemplos de los métodos de amplificación de ADN incluyen PCR, Amplificación por Recombinasa Polimerasa (RPA) (vea por ejemplo la patente estadounidense N° 7,485,428), Amplificación por Desplazamiento de Cadena
(SDA) (vea por ejemplo la patente estadounidense N° 5,455,166 y 5,470,723), Amplificación Mediada por Transcripción (TMA) (vea por ejemplo, Guatelli et al., Proc Nati Acad Sci USA 87:1874-1878 (1990)), Amplificación por Círculo Rodante (ACR) (vea por ejemplo, Fire y Xu, Proc Nati Acad Sci USA 92:4641-4645 (1995); Lui, et al., J Am Chem Soc 118:1587-1594 (1996); Lizardi, et al., Nature Genetics 19:225-232 (1998), patentes estadounidense Nos 5,714,320 y 6,235,502), Amplificación Dependiente de Helicasa (HDA) (vea por ejemplo Vincent et al., EMBO Reports 5(8): 795-800 (2004); patente estadounidense Nos 7,282,328), Amplificación por Desplazamiento Múltiple (MDA) (vea por ejemplo Dean et al., Proc. Nati. Acad Sci. USA 99:5261-5266 (2002)).
El término "específico para (una secuencia objetivo)" indica que una sonda o cebador híbrida en condiciones rigurosas de hibridación únicamente a la secuencia objetiva en una muestra que comprende la secuencia objetivo.
De acuerdo con el uso descrito en éste, el término "aislado" se refiere a la separación de por lo menos una molécula de otras moléculas asociadas normalmente con ésta en su estado nativo o natural. En un modo de realización, el término "aislado" se refiere a una molécula de ADN que es por lo menos separada de manera parcial de los ácidos nucleicos que normalmente flanquean la molécula de ADN en su estado nativo o natural. Así, las moléculas de ADN fusionadas a las secuencias reguladoras o de codificación con que no están normalmente asociados, o un ejemplo como el resultado de técnicas recombinantes, consideradas aisladas en éste. Dichas
moléculas se consideran aisladas, incluso cuando se integran en el cromosoma de una célula huésped o presentes en una solución de ácido nucleico con otras moléculas de ADN.
Una variedad de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica pueden usarse para aislar y manipular una molécula de ADN, o fragmento del mismo, como descrito en la presente invención. Por ejemplo, puede usarse la tecnología PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para amplificar una determinada molécula de ADN de partida y/o para producir variantes de la molécula original. Las moléculas de ADN o fragmentos de las mismas, también pueden obtenerse mediante otras técnicas tales como por síntesis directa del fragmento por medios químicos, como se practica comúnmente mediante el uso de un sintetizador de oligonucleótidos automatizado.
Las moléculas de ADN y las secuencias de nucleótidos correspondientes descritas en éste son por tanto útiles para, entre otras cosas, la identificación del evento KK179-2, la selección de variedades de plantas o híbridos que comprende el evento KK179-2, la detección de la presencia de ADN derivado del evento KK179-2 en una muestra, y el monitoreo de muestras para la presencia y/o la ausencia del evento KK179-2 o plantas y partes de plantas que comprende el evento KK179-2.
La presente invención proporciona las plantas, la progenie, las semillas, las células de plantas, las partes de plantas tales como polen, óvulos, vaina, flores, tejido de la raíz o el tallo y las hojas. Estas plantas,
progenie, semillas, células de plantas, partes de plantas y productos básicos contienen una cantidad detectable de un polinucleótido de la presente invención, tales como un polinucleótido que comprende por lo menos una de las secuencias provistas como nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 , y los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 2. Las plantas, progenie, semillas, células de plantas, partes de plantas y productos básicos de la presente invención también pueden contener uno o más objetivos de supresión adicionales.
La presente invención proporciona plantas, progenie, semillas, células de plantas y partes de plantas tales como el polen, el óvulo, la vaina, las flores, los tejidos de la raíz o el tallo y hojas derivadas de una planta transgénicas que comprende el evento KK179-2. Una muestra representativa de la semilla que comprende el evento KK179-2 se ha depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest a fin de posibilitar la presente invención. El repositorio seleccionado para recibir el depósito es el American Type Culture Collection (ATCC) con dirección en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EE.UU., código postal 20110. El depósito ATCC ha asignado el Número de Acceso PTA-11833 al evento KK179-2 de semillas
La presente invención proporciona un microorganismo que comprende una molécula de ADN con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que comprende de los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 , los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 2. Un ejemplo de tal microorganismo es una célula de planta transgénica. Los microorganismos,
tal como una célula de planta de la presente invención, son útiles en muchas aplicaciones industriales, incluyendo pero no limitado a: (i) de uso como una herramienta de investigación para la investigación científica; (ii) de uso en cultivo para producir carbohidratos endógenos o recombinantes, lipidos, ácidos nucleicos, enzimas o productos proteicos o moléculas pequeñas que pueden usarse para la investigación científica ulterior o como productos industriales; y (iii) de uso con las modernas técnicas de cultivo de tejidos vegetales para producir plantas transgénicas o cultivos de tejidos vegetales que luego pueden usarse para la investigación o producción agrícolas. La producción y uso de microorganismos tales como las células vegetales transgénicas utiliza las técnicas microbiológicas modernas y la intervención humana para producir un microorganismo único hecho por el hombre. En este proceso, se introduce el ADN recombinante al genoma de la célula de la planta para crear una célula de planta transgénica que es única y aparte de las células vegetales que ocurren en forma natural. Esta célula de la planta transgénica luego puede cultivarse al igual que las bacterias y células de levadura utilizando las técnicas microbiológicas modernas y puede existir en un estado indiferenciado y unicelular. La composición genética y fenotipo de la nueva célula de la planta es un efecto técnico creado por la integración del ADN heterólogo al genoma de la célula. Otro aspecto de la presente invención es un método de usar un microorganismo de la presente invención. Los métodos de usar microorganismos de la presente invención, tales como las células vegetales transgénicas, incluyen (i) métodos de producir células por la
integración del ADN recombinante al genoma de la célula y luego usar esta célula para derivar células adicionales procesando e mismo ADN heterólogo; (i¡) métodos de cultivar células que contienen ADN recombinante utilizando las técnicas microbiológicas modernas; (iii) métodos de producir y purificar carbohidratos endógenos o recombinantes, lípidos, ácidos nucleicos, enzimas o productos proteicos de células cultivadas; y (iv) métodos de usar las técnicas del cultivo de tejidos vegetales con las células vegetales transgénicas para producir plantas transgénicas o cultivos de tejidos vegetales.
De acuerdo con el uso descrito en éste, "progenie" incluye cualquier planta, semilla, célula vegetal y/o parte regenerable de plantas que comprende el evento ADN derivado de una planta ancestro y/o una polinucleótido con por lo menos una de las secuencias provistas como los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 2. Las plantas, progenie y semillas pueden heterócigas para la presencia de la secuencia transgénica. La progenie puede crecerse de semillas producidas por una planta que comprende el evento KK179-2 y/o de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta que comprende el evento KK179-2.
Las plantas progenie pueden ser por cruce exterior, por ejemplo, cultivada con otra planta, para producir una semilla o planta varietal o híbrida. La otra planta puede ser transgénica o no transgénica. Una semilla o planta varietal o híbrida de la presente invención puede así ser derivados al cruzar un primer progenitor que carece de la ADN específico y único del evento
KK179-2 con un segundo progenitor que comprende el KK179-2, lo que resulta en un híbrido que comprende el ADN específico y único del evento KK179-2. Cada progenitor puede ser un híbrido o una variedad endogámica, siempre que los resultados del cruce o fitomejoramiento en una planta o semilla de la presente invención, tal como, un semilla con por lo menos un alelo que comprende el ADN específico y único del evento KK179-2 y/o los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. El retrocruzamiento a una planta progenitor y cruzamiento exogámico con una planta no transgénica son previstos también, como es la propagación vegetativa. Las descripciones de métodos de fitomejoramiento que se utilizan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de varias referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed, American Society of Agronomy, Madison Wl (1987).
El cruce sexual de una planta con otra, como, la polinización cruzada puede lograrse o facilitarse mediante la intervención humana, por ejemplo: la colección de polen de una planta por manos humanos y haciendo que tenga contacto este polen con el estilo o el estigma de una segunda planta; por manos humanos y/o acciones humanas para eliminar, destruir o cubrir los estambres o anteras de una planta (por ejemplo, por intervención manual o por la aplicación de una gametocida química) de manera que se previene la autofecundación natural y la polinización cruzada tendría que realizarse para que ocurra la fertilización; mediante la colocación por humanos
de los insectos polinizadores en una posición de "polinización dirigida" (por ejemplo, al colocar colmenas en huertos o campos o enjaular las plantas con insectos polinizadores); con la abertura o eliminación por humanos de las partes de la flor para permitir la colocación de o contacto con polen extraño en el estilo o estigma; mediante el posicionamiento selectivo de plantas (por ejemplo, la siembra de plantas en proximidad de la polinización); y/o mediante la aplicación de sustancias químicas para precipitar la floración o para promover receptividad (de la estigma para el polen).
Cuando práctica este método, la etapa del cruce sexual de una planta consigo misma, tal como, la autofecundación o autopolinización, puede lograrse o facilitarse mediante la intervención humana, por ejemplo: la colección del polen de la planta por manos humanos y haciendo que tenga contacto este polen con el estilo o el estigma de la misma planta y, a continuación, opcionalmente, la prevención de la fertilización adicional de la planta; por manos humanos y/o acciones humanas para eliminar, destruir o cubrir el estambre o anteras de otras plantas cercanas (por ejemplo, al despanojarla o por la aplicación de una gametocida química) de manera que se previene la polinización cruzada natural y la autofecundación tendría que realizarse para que ocurra la fertilización; mediante la colocación por humanos de los insectos polinizadores en una posición de "polinización dirigida" (por ejemplo, al enjaular las plantas solas con insectos polinizadores); mediante la manipulación humana del flor o de sus partes para permitir la autofecundación; mediante el posicionamiento selectivo de plantas (por
ejemplo, la siembra de plantas en proximidad de la polinización); y/o mediante la aplicación de sustancias químicas para precipitar la floración o para promover receptividad (de la estigma para el polen).
La presente invención proporciona una parte de planta que se derive de una planta que comprende el evento KK179-2. De acuerdo con el uso descrito en éste, una "parte de planta" se refiere a cualquier parte de una planta que comprende el material derivado de una planta que comprende el evento KK179-2. Partes de plantas incluyen, pero no se limitan al polen, el óvulo, la vaina, las flores, los tejidos de la raíz o el tallo, fibras y hojas. Las partes de planta pueden ser viables, no viables, regenerables y/o no regenerables.
La presente invención proporciona un producto básico que se derive de una planta que comprende el evento KK179-2. De acuerdo con el uso descrito en éste, un "producto básico" se refiere a una composición o producto que está compuesto de material derivado de una planta, semilla, célula vegetal o parte de planta que comprende el evento KK179-2. Los productos básicos pueden venderse a los consumidores y pueden ser viables o no viables. Los productos básicos no viables incluyen pero no se limitan a las semillas y granos no viables; semillas, partes de semillas y partes de plantas procesadas; el tejido de planta deshidratado, tejido de planta congelado y tejido de planta procesado; semillas y partes de plantas procesadas para pienso para consumo por animales terrestres y/o acuáticos, aceite, sémola, harina, escamas, hojuelas, salvado, fibra y cualquier otra
comida para consumo humano; y biomasa y combustibles. Las alfalfas procesadas constituyen la fuente más grande de legumbres para forraje en el mundo. Así, una planta que comprende el evento KK179-2 puede usarse para manufacturar cualquier producto básico que típicamente se adquiere de una planta de alfalfa. Cualquiera de estos productos que se deriva de las plantas que comprende el evento KK179-2 puede contener por lo menos una cantidad detectable del ADN específico y único correspondiente del evento KK179-2, y específicamente puede contener una cantidad detectable de un polinucleótido con una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos consecutivos del SEQ ID NO: 1 y los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 2. Cualquier método regular para la detección de moléculas de polinucleótidos puede usarse incluyendo los métodos de detección divulgados en éste. Un producto básico está dentro del alcance de la presente invención si hay cualquier cantidad detectable de los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 o los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 2, en el producto básico.
La planta, la progenie, la semilla, la célula vegetal (tales como el polen, el óvulo, la vaina, las flores, los tejidos de la raíz o el tallo y hojas), y productos básicos de la presente invención so por tanto útiles para, entre otras cosas, el cultivo de plantas para los fines de producir semillas y/o partes vegetales que comprende el evento KK179-2 para fines agrícolas, la producción de progenie que comprende el evento KK179-2 para fines de fltomejoramiento y de investigación, el uso con las técnicas microbiológicas para las aplicaciones industriales y de investigación, y de venta a los
consumidores.
La presente invención proporciona métodos para producir plantas con lignina reducida y plantas que comprende el evento KK179-2. La planta de evento KK179-2 fue producida por un método de transformación mediado por Agrobacterium parecido al que se describe en la patente estadounidense 5,914,451 , usando una línea de alfalfa con el constructo pFG118. El constructo pFG118 contiene un cásete de supresión vegetal para la regulación decreciente del enzima CCOMT en las células de las plantas de alfalfa. Las células transgénicas de alfalfa se regeneraron en plantas de alfalfa intactas y plantas individuales fueron seleccionadas de la población de plantas transgénicas transformadas independientemente que mostraron características moleculares deseables, tales como la integridad del cásete transgén, la ausencia de la secuencia del constructo de la columna vertebral, la pérdida del cásete de selección de la resistencia a la kanamicina disociada. Además, los análisis PCR y por secuencia de ADN se realizaron para determinar las uniones de inserción a la planta del genoma 5' y 3', para confirmar la organización de los elementos dentro del inserto (Figura 1), y para determinar la secuencia de ADN completa del inserto en el evento de alfalfa de KK179-2 (SEQ ID NO: 5). Adicionalmente, las plantas transgénicas fueron evaluadas y seleccionadas para lignina reducida en condiciones de campo. Una planta de alfalfa que contiene dentro de su genoma el cásete de supresión de pFG118 es un aspecto de la presente invención.
Los métodos para producir una planta con lignina reducida que
comprende el evento transgénico KK179-2 se proveen. Las plantas transgénicas usadas en estos métodos pueden ser heterócigo para el transgén. Las plantas progenie producidas por estos métodos pueden ser plantas varietales o híbridas; pueden crecer a partir de semillas producidas por una planta y/o de semilla que comprende el evento KK179-2 producida por una planta fertilizada con polen de una planta que comprende el evento KK179-2; y pueden ser homocigosas o heterócigas para el transgén. Ulteriormente, las plantas progenie pueden ser autofecundadas para generar una línea genéticamente pura de plantas, como tal, plantas homocigosas para el transgén, o de manera alterna pueden ser por cruce exterior, por ejemplo, cultivada con otra planta no relacionada, para producir una semilla o planta varietal o híbrida. De acuerdo con el uso descrito en éste, el término "cigosidad" se refiere a la semejanza del ADN en una posición (locus) cromosomática específica en una planta. En la presente invención, el ADN específicamente refiere al inserto transgénico junto con la secuencia de la unión (evento de ADN). Una planta se considera homocigosa si el inserto transgénico con la secuencia de la unión esté presente en la misma posición en cada cromosoma de un par de cromosomas (4 alelos). Una planta se considera heterocigosa si el inserto transgénico con la secuencia de la unión esté presente en sólo un cromosoma de un par de cromosomas (1 alelo). Una planta de tipo silvestre es nula para el evento de ADN.
Las plantas y semillas progenie abarcadas por estos métodos y producidas al usar estos métodos son distintas de otras plantas, por ejemplo,
debido a que las plantas y semillas progenie son recombinantes y como tal creado por intervención humana; contienen por lo menos un alelo que consiste en el ADN transgénico de la presente invención; y/o contener una cantidad detectable de una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo consistiendo en los nucleótidos consecutivos del SEQ ID NO: 1 , o los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 2. Una semilla puede seleccionarse de una planta progenie individual, y siempre que la semilla comprende SEQ ID NO: 1 , o SEQ ID NO: 2, estará dentro del alcance de la presente invención.
Las plantas, la progenie, las semillas, las células de plantas, las partes de plantas (tales como polen, óvulos, vaina, flores, tejido de la raíz o el tallo y las hojas), y productos básicos de la presente invención puede ser evaluados para la composición de ADN, la expresión génica y/o expresión proteica. Esta evaluación se puede realizar mediante el uso de diversos métodos como la PCR, la secuenciación, la transferencia de Northern, la prueba de Southern Blot, Western Blot, inmuno-precipitación y ELISA o mediante el uso de los métodos de detección y/o los kits de detección previstas en este documento.
Los métodos de detección de la presencia de composiciones específicas al evento KK179-2 en una muestra se proveen. Uno de los métodos consiste en la detección de la presencia del ADN específico a y derivado de una célula, un tejido, una semilla, una planta o partes de planta que comprende el evento KK179-2. El método establece una muestra de una plantilla ADN a estar en contacto con un par de cebadores capaces de
producir un amplicón del ADN del evento KK179-2 al sujetarlo a condiciones adecuadas para amplificación, en particular un amplicón que comprende SEQ ID NO: 1 , y/o SEQ ID NO: 2, o los complementos de los mismos. Se produce el amplicón de una molécula de la plantilla ADN derivada del evento KK179-2, siempre que la molécula de la plantilla ADN incorpore las secuencias de nucleótidos específicas y únicas al SEQ ID NO: 1 , o SEQ ID NO: 2. El amplicón puede ser ADN o ARN de cadena única o doble, según la polimerasa seleccionada de uso en la producción del amplicón. El método establece la detección de la molécula de amplicón producida en cualquier reacción de amplificación de este tipo, y la confirmación dentro de la secuencia de la amplicón de la presencia de los nucleótidos correspondientes a SEQ ID NO: 1 , o SEQ ID NO: 2, o los complementos de los mismos. La detección de los nucleótidos correspondientes al SEQ ID NO: 1 , y/o SEQ ID NO: 2, o los complementos de los mismos en el amplicón son determinativos y/o diagnósticos para la presencia del ADN específico al evento KK179-2 y por tanto el material biológico que comprende el evento KK179-2 en la muestra.
Se provee otro método para la detección de la presencia de una molécula ADN correspondiendo al SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 en una muestra consistiendo en material derivado de la planta o el tejido de planta. El método consiste en (i) la obtención de una muestra de ADN de una planta o de un grupo de plantas diferentes, (¡i) el contacto con la muestra de ADN con una molécula ADN de cebador que comprende los nucleótidos según establecido en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, (iii) permitiendo que la sonda y
la muestra de ADN hibriden en condiciones estrictas de hibridación; y luego (¡v) la detección de un evento de hibridación entre la sonda y la muestra de ADN objetivo. La detección de la composición híbrida es diagnóstico para la presencia del SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, según el caso, en la muestra de ADN. La ausencia de hibridación es diagnóstico alternamente de la ausencia del evento transgénico en la muestra si los controles positivos adecuados se realicen concomitantemente. De forma alternativa, la determinación que una planta en particular contiene una o ambas secuencias correspondientes al SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o los complementos de los mismos, es determinante que la planta contiene por lo menos un alelo correspondiente al evento KK179-2.
Así es posible detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico de la presente invención mediante cualquiera de los métodos bien conocidos para la amplificación y detección del ácido nucleico tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por recombinasa polimerasa (RPA) o hibridación de ADN usando sondas de ácido nucleico. Un ensayo PCR específico al evento se examina, por ejemplo, por Taverniers et al. (J. Agrie. Food Chem., 53: 3041-3052, 2005) en que un sistema de rastreo de eventos específicos para las líneas Bt11, Bt176, y GA21 de maíz transgénico y del evento RT73 de cañóla se ha demostrado. En este estudio, cebadores y sondas específicos al evento fueron diseñados en base a las secuencias del genoma/uniones transgénicas para cada evento. Los métodos de detección de ADN por eventos específicos de plantas transgénicas también
se han descrito en las Patentes estadounidenses Nos 7,632,985; 7,566, 817; 7,368,241 ; 7,306,909; 7,718,373; 7,189,514; 7,807,357 y 7,820,392.
Se proveen kits de detección de ADN. Un tipo de kit contiene por lo menos una molécula de ADN de una longitud suficiente de nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 para funcionar como un cebador o sonda de ADN específico para la detección de la presencia de ADN derivado del evento transgénico KK179-2 en una muestra. La molécula ADN que se detecta con el kit comprende los nucleótidos contiguos de la secuencia según establecido en SEQ ID NO: 1. Alternativamente, el kit contiene por lo menos una molécula de ADN de una longitud suficiente de nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6 para funcionar como un cebador o sonda de ADN específico para la detección de la presencia de ADN derivado del evento transgénico KK179-2 en una muestra. La molécula ADN detectada con el kit comprende nucleótidos contiguos establecidos en SEQ ID NO: 2.
Un kit alternativo emplea un método en el cual la muestra del ADN objetivo se pone en contacto con un par de cebadores según descrito anteriormente, luego se realiza una reacción de amplificación de ácido nucleico suficiente para producir un amplicón que comprende las secuencias de nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 , y SEQ ID NO: 2. La detección del amplicón, y la determinación de la presencia de los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 , y SEQ ID NO: 2 o los complementos de los mismos dentro de la secuencia del amplicón es diagnóstico para la presencia
del ADN específico al evento KK179-2 en una muestra de ADN.
Una molécula de ADN suficiente para el uso como una sonda de ADN se provee que es útil para determinar, detectar o diagnosticar la presencia o aun la ausencia del ADN específico y único al ADN del evento KK179-2 en una muestra. La molécula de ADN contiene los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 , o los complementos de la misma, y los nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 2, o los complementos de los mismos.
La amplificación de ácidos nucleicos puede realizarse por cualquiera de los diversos métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica, incluyendo métodos de amplificación térmica e isotérmica. La secuencia del inserto de ADN heterólogo, las secuencias de unión o las secuencias flanqueantes de evento KK179-2 (con muestras representativas de la semilla que comprende el evento KK179-2 como ATCC PTA-1 1883) puede ser verificada mediante la amplificación de dichas secuencias del evento utilizando cebadores derivados de las secuencias proporcionadas aquí seguido por secuenciación de ADN regular del amplicón o del ADN clonado.
El amplicón producido por estos métodos puede detectarse por una pluralidad de técnicas. Uno de tales métodos es el Análisis Genético de Bits (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994) donde un oligonucleótido de ADN está diseñado que se superpone tanto la secuencia flanqueante de ADN genómico adyacente y la secuencia de ADN de inserción.
El oligonucleótido se inmoviliza en pocilios de una placa de micropocillos. Después de la amplificación térmica de la región de interés (usando un cebador en la secuencia de inserción y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), un amplicón de cadena única puede hibridarse al oligonucleótido inmovilizado y servir de plantilla para una reacción de extensión de base única utilizando una polimerasa de ADN y con una etiqueta de ddNTPs específicos para la próxima base anticipada. La lectura puede ser fluorescente o en base ELISA. La detección de una señal fluorescente u otra señal indica la presencia de la secuencia de inserción/flanqueante debido al éxito de la amplificación, hibridación, y una extensión de base única.
Otro método es la técnica de Pirosecuenciamiento según descrito por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). En este método se diseña un oligonucleótido que sobrepone el ADN genómico adyacente y la unión del inserto de ADN. El oligonucleótido se híbrida a un amplicón de una sola cadena de la región de interés (un cebador en la secuencia de inserción y uno en la secuencia genómica flanqueante), e incubado en la presencia de una polimerasa de ADN, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosína 5' fosfosulfato y luciferina. Se agregan los ddNTPs de manera individual y la incorporación resulta en una señal luminosa que se mide. Una señal luminosa indica la presencia de una secuencia transgénica de inserción/flanqueante debido al éxito de la amplificación, hibridación y la extensión de base única o múltiple.
La polarización fluorescente según descrita por Chen, et al.,
(Genome Res. 9:492-498, 1999) es un método que puede usarse para detectar el amplicón. El uso de este método implica el diseño de un oligonucleótido que sobrepone a la unión del ADN genómico flanqueante y el inserto de ADN. Se híbrida el oligonucleótido a un amplicón de una sola cadena de la región de interés (un cebador en el ADN de inserción y uno en la secuencia de ADN genómico flanqueante) y se incuba en la presencia de una polimerasa de ADN y un ddNTP con etiqueta fluorescente. La extensión de base única resulta en la incorporación del ddNTP. Puede medir la incorporación como un cambio en polarización usando un fluorometro. Un cambio en la polarización indica la presencia de una secuencia transgénica de inserción/flanqueante debido al éxito de la amplificación, hibridación y la extensión de base única.
También puede usarse TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) para detectar y/o cuantificar la presencia de una secuencia de ADN usando las instrucciones provistas por el fabricante. En pocas palabras, una sonda FRET de oligonucleótido se diseña que sobrepone a la unión del ADN genómico flanqueante y del inserto de ADN. La sonda FRET y los cebadores de amplificación (un cebador en la secuencia del ADN de inserción y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en la presencia de un polimerasa termoestable y dNTPs. La hibridación de la sonda FRET resulta en la segmentación y la liberación de la fracción fluorescente fuera de la fracción de enfriamiento en la sonda FRET. Una señal luminosa indica la presencia de la secuencia de inserción flanqueante/transgénica debido al éxito de la
amplificación y hibridación.
Se han descrito las balizas moleculares para uso en la detección de secuencia como se describe en Tyangi, et al. (Nature Biotech.14:303-308, 1996). En pocas palabras, una sonda FRET de oligonucleótido se diseña que sobrepone a la unión del ADN genómico flanqueante y del inserto de ADN. La estructura única de la sonda FRET resulta en que contiene una estructura secundaria que mantiene las fracciones fluorescentes y enfriadoras en estrecha proximidad. La sonda FRET y los cebadores de amplificación (un cebador en la secuencia del ADN de inserción y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en la presencia de un polimerasa termoestable y dNTPs. Después de una amplificación exitosa, la hibridación de la sonda FRET a los resultados de la secuencia objetiva en la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de las fracciones fluorescentes y enfriadoras resultantes en la producción de una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia de inserción flanqueante/transgénica debido al éxito de la amplificación y hibridación.
Otros métodos descritos, tales como la microfluídica (Publicación de Patente de EE.UU. N° 2006068398, Patente de EE.UU. N° 6,544,734), proporcionan métodos y dispositivos para separar y amplificar las muestras de ADN. Los colorantes ópticos se utilizan para detectar y medir las moléculas específicas de ADN (WO/05017181). Los dispositivos de nanotubos (WO/06024023) que comprenden un sensor electrónico para la detección de
moléculas de ADN o nanobeads que unen las moléculas de ADN específicas y, a continuación se pueden detectar.
Es posible desarrollar kits de detección de ADN usando las composiciones divulgadas en éste y los métodos bien conocidos en la técnica de detección de ADN. Son útiles los kits para la identificación del evento KK179-2 en una muestra y puede ser de aplicación a los métodos para fitomejoramiento que contienen el evento de ADN apropiado. Los kits pueden contener sondas o cebadores de ADN que son parecidos o complementarios al SEQ ID NO: 1-6, o fragmentos o complementos de los mismos.
Los kits y los métodos de detección de la presente invención son por tanto útiles para, entre otras cosas, la identificación del evento KK179-2, la selección de variedades de plantas o híbridos que comprende el evento KK179-2, la detección de la presencia de ADN derivado del evento KK179-2 en una muestra, y el monitoreo de muestras para la presencia y/o la ausencia del evento KK179-2 o plantas, partes de plantas o productos básicos que comprende el evento KK179-2.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ejemplos de ciertos modos de realización de la invención. Aquellos que son bien versados en el material deberán apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos a continuación representan métodos que los inventores han encontrado que funcionan bien en la práctica de la invención, y por lo tanto se puede considerar que constituyen ejemplos de los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos que son bien versados en el material deberán, en vista
de la presente divulgación, apreciar que muchos cambios pueden efectuarse en los modos de realizaciones específicos que se describen y aún obtener un resultado análogo o parecido sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1
Aislamiento de las secuencias flanqueantes usando PCR inverso e identificación de las secuencias flanqueantes mediante el
secuenciamiento
Este ejemplo describe el aislamiento de las secuencias genómica de ADN de alfalfa flanqueante el inserto de ADN transgénico usando PCR inverso para el evento KK179-2, y la identificación de las secuencias flanqueantes mediante el secuenciamiento.
Las secuencias flanqueantes el inserto T-ADN en el evento KK179-2 fueron determinadas usando PCR inverso según descrito en Ochman et al., 1990 (PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.). El ADN genómico de plantas fue aislado tanto del tipo silvestre R2336 como la línea transgénica de tejidos cultivados en condiciones de invernadero. Los tejidos de hojas fueron trituradas con mortero y maja en nitrógeno líquido o por trituración mecánica, seguido por la extracción de ADN
usando métodos conocidos en la técnica. Aquellos que son bien versados en el material pueden modificar este método para la extracción de ADN de cualquier tejido, incluyendo, pero no limitado a semillas.
Una alícuota de ADN de cada muestra fue digerida con endonucleasas de restricción seleccionadas basadas en el análisis del ADN transgénico. Después de la auto-ligación de los fragmentos de restricción, se realizó amplificación por PCR usando cebadores diseñados de la secuencia transgénica que amplificaría las secuencias que se extienden fuera de los extremos 5' y 3' del ADN transgénico. Se pueden usar una variedad de sistemas Taq de polimerasas y amplificación. El cuadro 2 da un ejemplo de la amplificación por PCR para el aislamiento de la secuencia flanqueante usando Phusion High Fidelity DNA Polymerase (Cat. N° F531S o F531L, New England Biolabs), y Thermalcyclers Applied Biosystems GeneAmp 9700, ABI 9800 Fast Thermal Cycler y MJ Opticon.
CUADRO 1
Un ejemplo de amplificación por PCR inversa para aislamiento de la secuencia flanqueante
Los productos PCR fueron separados mediante electroforesis por gel agarosa y purificados usando un kit de purificación por gel QUIAGEN (Qiagen, Valencia, CA). Los productos subsecuentes fueron secuenciados directamente usando protocolos normales de secuenciamiento. Usando estos dos métodos, la secuencia flanqueante 5', que se extiende a la secuencia borde izquierda del inserto de ADN integrado que incluye el cásete de supresión CCOMT, se identificó y se presenta como SEQ ID NO: 3 ([C] de Figura 1) La secuencia flanqueante 3', que se extiende a la secuencia borde
derecha del inserto de ADN integrado que incluye el cásete de supresión CCOMT, se identificó y se presenta como SEQ ID NO: 4 ([D] de Figura 1). El ADN transgénico integrado al ADN genómico R2336 se presenta como SEQ ID NO: 5 ([E] de la Figura 1).
Las secuencias aisladas se compararon a la secuencia T-ADN para identificar las secuencias flanqueantes y los fragmentos co-aislados de T-ADN. La confirmación de la presencia del cásete de expresión se logró por PCR con cebadores diseñados en base de los datos deducidos de la secuencia flanqueante y la secuencia de T-ADN conocidos. La secuencia R2336 del tipo silvestre correspondiente a la misma región en la cual se integró el T-ADN se aisló en la línea transformada usando cebadores diseñados de las secuencias flanqueantes en KK179-2. Las secuencias flanqueantes en KK179-2 y la secuencia R2336 del tipo silvestre se analizaron contra bases de datos múltiples de nucleótidos y proteínas. Esta información se utilizó para examinar la relación del transgén con el genoma de plantas y para mirar la integridad en el sitio de inserción. La secuencia flanqueante y las secuencias del tipo silvestre se usaron para diseñar cebadores para ensayos del extremo TAQMAN® usados para identificar los eventos descritos en el ejemplo 2.
EJEMPLO 2
Punto final específico al evento (Event-specific endpoint TAQMAN®)
Este ejemplo describe un método TAQMAN® del punto final que es específico al evento de amplificación térmica para la identificación del ADN del evento KK179-2 en una muestra.
Unos ejemplos de condiciones útiles con el método TAQMAN® del punto final específico al evento KK179-2 se describen en el cuadro 2 y el cuadro 3. Los cebadores de ADN usados en los ensayos de punto final son cebadores SQ20901 (SEQ ID NO: 7) y SQ23728 (SEQ ID NO: 8) y una sonda oligonucleotídica PB10164 etiquetada 6-FAM™ (SEQ ID NO: 9). 6FAMTM es un colorante fluorescente producto de Applied Biosystems (Foster City, CA) conectado a la sonda de ADN. Para las sondas TAQMAN® MGB (Minor Groove Binding), la actividad exonucleasa 5' de la polimerasa de ADN Taq segmenta la sonda del extremo 5', entre el fluoróforo y el extintor. Cuando hibridados a la cadena ADN objetivo, el extintor y el fluoróforo están lo suficientemente separados para producir una señal fluorescente.
Los cebadores SQ20901 (SEQ ID NO: 7) y SQ23728 (SEQ ID NO: 8) cuando usados como descrito con la sonda PB10164 (SEQ ID NO: 9) produce un amplicón de 81 nt que es diagnostico para ADN del evento KK179-2. El análisis incluye un control positivo de alfalfa que se sabe que contiene ADN del evento KK179-2, un control negativo de alfalfa no transgénica y un control negativo que no contiene una plantilla ADN.
Estos ensayos son optimizados para uso con el Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700, ABI 9800 Fast Thermal Cycler y MJ Research DNA Engine PTC-225. Otros métodos y aparatos conocidos a aquellos expertos en la técnica pueden usarse para producir amplicones que identifican el ADN del evento KK179-2.
CUADRO 2
Específico al evento del extremo (Event-specific endpoint TAQMAN®) para el evento KK179-2 de alfalfa Condiciones de PCR
CUADRO 3
Condiciones del termociclador del método TAQMAN® del punto final
(Endpoint)
Un depósito de una muestra representativa de la semilla de alfalfa del evento KK179-2 descrito anteriormente y recitado en las
reivindicaciones, se ha hecho bajo el Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110. El número de acceso de la ATCC es el PTA-11833. Permanecerá el depósito en el depositario durante un periodo de 30 años, o de 5 años después de la última petición, o durante la vida efectiva de la patente, que sea más largo, y se reemplazará según necesario durante este periodo.
Habiéndose ilustrado y descrito los principios de la presente invención, debería ser evidente para las personas expertas en la técnica que la invención se puede modificar en disposición y detalle sin apartarse de tales principios. Reivindicamos todas las modificaciones que están dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLO 3
Mediciones ADL en el tallo inferior de los eventos de lignina reducida de alfalfa
CUADRO 4
Mediciones ADL del tallo inferior para 6 eventos de lignina reducida de alfalfa en dos germoplasmas de latencia otoñal (FD) de 3 ubicaciones en
2008
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
ADL = Lignina detergente ácido, % del material reseco LSD = Mínima diferencia significativa
FD = Latencia otoñal
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor
Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Las plantas positivas del evento en el cuadro 4 mostraron una reducción significativa (p<0.05) en el ADL del tallo inferior que varió desde 18 hasta 31% cuando se compara con el control negativo total. El KK179-2 de alfalfa tiene un fenotipo de lignina reducida identificado por el método de selección de la "zona óptima".
CUADRO 5
Mediciones ADL del tallo inferior para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas de latencia otoñal (FD)
cultivados en 4 ubicaciones en 2009.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
ADL = Lignina detergente ácido, % del material reseco LSD = Mínima diferencia significativa
FD = Latencia otoñal
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa
Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control
(Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control
(Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor
Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
CUADRO 6
Mediciones ADL del tallo inferior para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas de latencia otoñal (FD)
cultivados en 2 ubicaciones en 2009.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación: ADL = Lignina detergente ácido, % del material reseco LSD = Mínima diferencia significativa
FD = Latencia otoñal
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control
(Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
CUADRO 7
Mediciones ADL del tallo inferior para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas no latentes (ND) cultivados
en 4 ubicaciones en 2009.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
ADL = Lignina detergente ácido, % del material reseco LSD = Mínima diferencia significativa
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control
(Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
CUADRO 8
Mediciones ADL del tallo inferior para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas no latentes (ND) cultivados
en 2 ubicaciones en 2009.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
ADL = Lignina detergente ácido, % del material reseco LSD = Mínima diferencia significativa
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor
Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Cuadros 6-8 muestran datos de 2009 para el ADL del tallo inferior en germoplasmas de latencia otoñal (FD) y no latentes (ND) en 4 y 2 ubicaciones respectivamente. Los 6 líneas positivas del evento mostraron una reducción significativa (p<0.05) en ADL variando de 12 a 26 % al compararse con el control negativo total, con el evento principal KK179 mostrando una reducción en ADL de 18 a 22%.
EJEMPLO 4
Mediciones NDFD en el tallo inferior de los eventos de lignina reducida de alfalfa
CUADRO 9
Mediciones NDFD del tallo inferior para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en qermoplasmas de latencia otoñal (FD)
cultivados en 3 ubicaciones en 2008.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
NDFD = Digestibilidad de la fibra de detergente neutro, % de fibra de NDF (NDF = fibra de detergente neutro. Representa los componentes indigeribles y lentamente digeribles en la pared celular vegetal (la celulosa, la hemicelulosa, la lignina (unidades =% de materia reseca))
FD = Latencia otoñal
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa
Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor
Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Mediciones NDFD del tallo inferior para los 6 eventos de lignina reducida en germoplasmas de latencia otoñal (FD) en 3 ubicaciones. Las plantas positivas del evento mostraron un aumento significativo (p<0.05) en el NDFD del tallo inferior que varió desde 18 hasta 35% cuando se compara con el control negativo total.
CUADRO 10
Mediciones NDFD del tallo inferior para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas de latencia otoñal (FD)
cultivados en 4 ubicaciones en 2009.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
NDFD = Digestibilidad de la fibra de detergente neutro, % de fibra de NDF (NDF = fibra de detergente neutro. Representa los componentes indigeribles y digeribles lentamente en la pared celular vegetal (la celulosa, la hemicelulosa, la lignina (unidades =% de materia reseca))
FD = Latencia otoñal
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control
(Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
CUADRO 11
Mediciones NDFD del tallo inferior para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas no latentes (ND) cultivados
en 2 ubicaciones en 2009
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
NDFD = Digestibilidad de la fibra de detergente neutro, % de fibra de NDF (NDF = fibra de detergente neutro. Representa los componentes indigeribles y digeribles lentamente en la pared celular vegetal (la celulosa, la hemicelulosa, la lignina (unidades =% de materia reseca))
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control
(Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
CUADRO 12
Mediciones NDFD del tallo inferior para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas de latencia otoñal (FD)
cultivados en 4 ubicaciones en 2009.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
NDFD = Digestibilidad de la fibra de detergente neutro, % de fibra de NDF (NDF = fibra de detergente neutro. Representa los componentes indigeribles y digeribles lentamente en la pared celular vegetal (la celulosa, la
hemicelulosa, ia lignina (unidades =% de materia reseca))
FD = Latencia otoñal
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control
(Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
CUADRO 13
Mediciones NDFD del tallo inferior para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas no latentes ÍND) cultivados
en 2 ubicaciones en 2009.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
NDFD = Digestibilidad de la fibra de detergente neutro, % de fibra de NDF (NDF = fibra de detergente neutro. Representa los componentes indigeribles y digeribles lentamente en la pared celular vegetal (la celulosa, la hemicelulosa, la lignina (unidades =% de materia reseca))
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa
Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Cuadros 11-13 muestran datos de 2009 para el NDFD del tallo inferior en germoplasmas de latencia otoñal (FD) y no latentes (ND) en 4 y 2 ubicaciones respectivamente. Los 6 eventos positivos para los eventos de lignina reducida de alfalfa mostraron un aumento significativo (p<0.05) en NDFD variando de 22 a 36 % al compararse con el control negativo total, con el evento principal KK179 mostrando una reducción en NDFD de 22 a 28%.
EJEMPLO 5
La clasificación de vigor para los eventos de lignina reducida de alfalfa
CUADRO 14
Las clasificaciones de vigor para los 2 eventos de lignina reducida de alfalfa. JJ266 y KK179-2 en comparación con verificaciones comerciales v los controles nulos en 3 ubicaciones. El evento KK179-2 de lignina reducida resultó en ningunas aberraciones de la escala de clasificación de vigor
Los datos recopilados de estos ensayos son los siguientes: el vigor de la planta (puntuación 1 a 10, siendo 10 el mejor) tomada 21 días después de la cosecha anterior y la segunda semana de mayo para la puntuación de primavera, la tolerancia al encamado (puntuación 1 a 10, siendo 10 en una posición perfectamente vertical) tomadas de 1 a 5 días antes de la cosecha por temporada. Rendimiento de la planta (gramos de materia reseca (DM) por planta) tomado después de secar las plantas, NDFD
(con calibración CAI NIR para la alfalfa RL) y ADL (con calibración NIR para alfalfa RL).
EJEMPLO 6
Mediciones ADL en la planta entera para los eventos de lignina reducida de alfalfa
CUADRO 15
Mediciones ADL de heno de la planta entera para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas de latencia otoñal (FD) cultivados en 4 ubicaciones en 2009.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
ADL = Lignina detergente ácido, % del material reseco LSD = Mínima diferencia significativa
FD = Latencia otoñal
KK 79 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
CUADRO 16
Mediciones ADL de heno de la planta entera para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas de latencia otoñal (FD) cultivados en 2 ubicaciones en 2009
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
ADL = Lignina detergente ácido, % del material reseco LSD = Mínima diferencia significativa
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa
Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor
Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
CUADRO 17
Mediciones ADL de heno de la planta entera para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas de latencia otoñal (FD) cultivados en 4 ubicaciones en 2009
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
ADL = Lignina detergente ácido, % del material reseco
LSD = Mínima diferencia significativa
FD = Latencia otoñal
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0. 0
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor
Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Los datos del ADL de la planta entera de 2009 en 4 ubicaciones se muestran en el cuadro 17 y 19. Los eventos positivos del evento de lignina reducida en germoplasma de latencia otoñal mostraron una reducción significativa (p<0.05) en el ADL que variaban desde 8 hasta 19% cuando se compara con el control negativo total. El evento KK179-2 tenía una reducción de 9.8% y de 9.45 en ADL en los germoplasmas de latencia otoñal respectivamente.
CUADRO 18
Mediciones ADL de heno de la planta entera para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en qermoplasmas de latencia otoñal (FD) cultivados en 2 ubicaciones en 2009.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
ADL = Lignina detergente ácido, % del material reseco LSD = Mínima diferencia significativa
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa
Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Los datos del ADL de la planta entera de 2009 en 2 ubicaciones se muestran en el cuadro 18 y 20. Los 6 eventos positivos de lignina reducida en germoplasmas no latentes mostraron una reducción significativa (p<0.05) en el ADL que variaban desde 10 hasta 16% cuando se compara con el control negativo total. Cinco de los 6 eventos mostraron una reducción significativa en el ADL que variaban desde 10 hasta 18% cuando se compara con el control negativo total. El evento KK179-2 tenía una reducción de 12.3% y de 10.9% en ADL en los germoplasmas no latentes respectivamente.
CUADRO 19
Mediciones ADL de heno de la planta entera para el evento KK179-2 de lignina reducida de alfalfa en dos germoplasmas de latencia otoñal (FD) cultivados en 4 ubicaciones en 2009 en comparación con las
verificaciones comerciales.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
ADL = Lignina detergente ácido, % del material reseco FD = Latencia otoñal
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control
(Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
CUADRO 20
Mediciones ADL de heno de la planta entera para el evento KK179-2 de lignina reducida de alfalfa en dos germoplasmas no latentes (ND) cultivados en 2 ubicaciones en 2009 en comparación con las
verificaciones comerciales
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
ADL = Lignina detergente ácido, % del material reseco ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa
Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor
Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Los cuadros 19 y 20 contienen datos del ADL de la planta entera para el evento KK179-2 de lignina reducida de alfalfa en comparación con las verificaciones comerciales. El evento KK179-2 mostró una reducción significativa (p ).1) en ADL al compararse a 3 de las 4 verificaciones comerciales de los de latencia otoñal que variaban entre 6.8 y 16.7% (cuadro 19, datos de 4 ubicaciones). El evento KK179-2 en germoplasma de fondo no latente (ND1) mostró una reducción (p£0.2) en ADL al compararse a cada una de las 4 verificaciones comerciales para los no latentes que variaban entre 7.6 y 10.6% (cuadro 20, datos de 2 ubicaciones). El evento KK179-2 en germoplasma de fondo no latente (ND2) mostró una reducción global (p<0.2) en ADL al compararse a cada una de las 4 verificaciones comerciales para los no latentes con una reducción significativa (p£0.1) de 8.8% en comparación con el evento comercial 4 (ND2, datos de 2 ubicaciones).
EJEMPLO 7
Mediciones NDFD en la planta entera para los eventos de lignina
reducida de alfalfa
CUADRO 21
Mediciones NDFD de heno de la planta entera para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en qermoplasmas de latencia otoñal (FD) cultivados en 4 ubicaciones en 2009
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
NDFD = Digestibilidad de la fibra de detergente neutro, % de fibra de NDF (NDF = fibra de detergente neutro. Representa los componentes indigeribles y digeribles lentamente en la pared celular vegetal (la celulosa, la hemicelulosa, la lignina (unidades =% de materia reseca))
FD = Latencia otoñal
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control
(Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
CUADRO 22
Mediciones NDFD de heno de la planta entera para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas no latentes
(ND) cultivados en 2 ubicaciones en 2009
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación: NDFD = Digestibilidad de la fibra de detergente neutro, % de fibra de NDF (NDF = fibra de detergente neutro. Representa los componentes indigeribles y digeribles lentamente en la pared celular vegetal (la celulosa, la hemicelulosa, la lignina (unidades =% de materia reseca))
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa
Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
CUADRO 23
Mediciones NDFD de heno de la planta entera para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en qermoplasmas de latencia otoñal (FD) cultivados en 4 ubicaciones en 2009
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
NDFD = Digestibilidad de la fibra de detergente neutro, % de fibra de NDF (NDF = fibra de detergente neutro. Representa los componentes indigeribles y digeribles lentamente en la pared celular vegetal (la celulosa, la hemicelulosa, la lignina (unidades =% de materia reseca))
FD = Latencia otoñal
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa
Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Los datos NDFD de la planta entera de 2009 en 4 ubicaciones se muestran en el cuadro 23 y 25. Los 6 eventos positivos de lignina reducida en germoplasma de latencia otoñal mostraron un aumento significativo (p<0.05) en el NDFD que variaban desde 7 hasta 16% cuando se compara con el control negativo total. El evento KK179-2 tenía un aumento de 7.5% y de 9.2% en NDFD en los germoplasmas de latencia otoñal respectivamente.
CUADRO 24
Mediciones NDFD de heno de la planta entera para los 6 eventos principales de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas no latentes
(ND) cultivados en 2 ubicaciones en 2009
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
NDFD = Digestibilidad de la fibra de detergente neutro, % de fibra de NDF (NDF = fibra de detergente neutro. Representa los componentes indigeribles y digeribles lentamente en la pared celular vegetal (la celulosa, la hemicelulosa, la lignina (unidades =% de materia reseca))
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa
Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Los datos NDFD de la planta entera de 2009 en 2 ubicaciones se muestran en el cuadro 24 y 26. Los 6 eventos positivos de lignina reducida en germoplasma no latentes mostraron un aumento significativo (p<0.01) en el NDFD que variaban desde 8 hasta 15% cuando se compara con el control negativo total. El evento KK179-2 tenía un aumento de 14.0% y de 11.5% en NDFD en los germoplasmas no latentes respectivamente.
CUADRO 25
Mediciones NDFD de heno de la planta entera para el evento KK179-2 de lignina reducida de alfalfa en dos germoplasmas de latencia otoñal (FD) cultivados en 4 ubicaciones en 2009 en comparación con las
verificaciones comerciales
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
NDFD = Digestibilidad de la fibra de detergente neutro, % de fibra de NDF (NDF = fibra de detergente neutro. Representa los componentes indigeribles y digeribles lentamente en la pared celular vegetal (la celulosa, la hemicelulosa, la lignina (unidades =% de materia reseca))
FD = Latencia otoñal
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control
(Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
r
CUADRO 26
Mediciones NDFD de heno de la planta entera para el evento KK179-2 de lignina reducida de alfalfa en dos germoplasmas no latentes (ND) cultivados en 2 ubicaciones en 2009 en comparación con las
verificaciones comerciales.
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
NDFD = Digestibilidad de la fibra de detergente neutro, % de fibra de NDF (NDF = fibra de detergente neutro. Representa los componentes indigeribles y digeribles lentamente en la pared celular vegetal (la celulosa, la hemicelulosa, la lignina (unidades =% de materia reseca))
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control
(Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Los cuadros 25 y 26 contienen datos del NDFD de la planta entera para el evento KK179-2 de lignina reducida de alfalfa en comparación con las verificaciones comerciales. El evento KK179-2 mostró un aumento significativo (p< .2) en NDFD al compararse a 3 de las 4 verificaciones comerciales de los de latencia otoñal que variaban entre 4.2 y 16.8% (cuadro 25, datos de 4 ubicaciones). El evento KK179-2 mostró un aumento significativo (p<0.2) en NDFD al compararse a cada una de las 4 verificaciones comerciales de los no latentes (ND1) que variaban entre 9.8 y 19.4% (cuadro 26, datos de 2 ubicaciones). El evento KK179-2 mostró un aumento significativo (pi0.2) en NDFD al compararse a cada una de las 4 verificaciones comerciales de los no latentes (ND2) que variaban entre 8.8 y 16.3% (cuadro 26, datos de 2 ubicaciones).
EJEMPLO 8
El rendimiento del análisis de ubicación para los eventos de lignina reducida de alfalfa
CUADRO 27
Análisis del rendimiento de ubicación para los 6 eventos de lignina reducida en los de fondo de latencia otoñal (FD) y no latente (ND) en comparación con el control negativo total
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación: Rendimiento = Rendimiento calculado sobre una base en gramos por planta
FD = Latencia otoñal
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa
Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control (Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor
Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Los datos en el cuadro 27 muestran el análisis del rendimiento de ubicación para los 6 eventos de lignina reducida en germoplasma de latencia otoñal (FD) y no latente (ND) en comparación con el control negativo total. No había reducciones significativas en el rendimiento detectadas para KK179-2 en comparación con los controles negativos totales.
CUADRO 28
Análisis del rendimiento de ubicación para el evento KK179-2 en
comparación con las verificaciones comerciales
Abreviaturas usadas en los cuadros a continuación:
Rendimiento = Rendimiento calculado sobre una base en gramos por planta
FD = Latencia otoñal
ND = No latente
KK179 = evento principal KK179-2 de lignina reducida de alfalfa Delta = diferencia entre el Evento y los medios de control (Evento - Control)
% Dif = diferencia en el porcentaje entre el Evento y el Control
(Delta/Control * 100)
Delta LCI @90% = Intervalo de confianza más bajo del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Delta UCI @90% = Intervalo de confianza superior del valor Delta usando un nivel alfa de 0.10
Valor P = probabilidad de una mayor diferencia absoluta bajo la hipótesis nula (prueba de dos colas para importancia).
Los datos de rendimiento para el evento principal de lignina reducida de alfalfa en germoplasmas de latencia otoñal y no latente resultaron en ninguna reducción significativa en comparación con 8 verificaciones comerciales.
Claims (16)
1.- Una semilla de la planta de alfalfa designado KK179-2, con el depósito de una semilla representativa en la American Type Culture Collection (ATCC) con la designación del depósito de patente de PTA-11833.
2.- Una planta de alfalfa KK179-2 o partes de la misma producida al cultivar la semilla de la reivindicación 1.
3.- La planta de alfalfa KK179-2 o partes de la misma de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque comprende el polen, el óvulo, las flores, los brotes, las raíces u hojas.
4. - Una planta progenie o partes de la misma de la planta de alfalfa KK179-2 de la reivindicación 2, en donde dicha planta progenie o partes de la misma comprende el evento KK179-2 de alfalfa.
5. - La planta progenie o partes de la misma de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque comprende adicionalmente el polen, el óvulo, las flores, los brotes, las raíces u hojas.
6. - La planta de alfalfa KK179-2 o semillas o partes de la misma de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el genoma de la cual produce un amplicón que comprende una molécula de ADN seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
7. - Una molécula de ADN recombinante que comprende a. una molécula de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; b. una molécula de polinucleótido con por lo menos 90% de identidad al SEQ ID NO: 6; o c. una molécula de polinucleótido complementaria a a) o b).
8. - La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicha molécula de ADN se deriva del evento KK179-2, una muestra representativa de la semilla se ha depositado bajo el N° de acceso ATCC de PTA-11833.
9.- La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicha- molécula de ADN es un amplicón producido de una molécula de plantilla derivada del ADN del evento KK179-2.
10. - Una sonda polinucleotídica para diagnosticar la presencia de ADN del evento KK179-2 en donde dicha sonda polinucleotídica es de una longitud suficiente para unirse a una molécula de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 1 , y SEQ ID NO: 2, o complementos del mismo, y en donde dicha sonda polinucleotídica híbrida en condiciones rigurosas de hibridación con una molécula de ADN que comprende SEQ ID NO: 1 , o SEQ ID NO: 2, o complementos del mismo, y no híbrida en condiciones rigurosas de hibridación con una molécula de ADN que no comprende SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, o complementos del mismo.
11. - Un método de detección de la presencia de una molécula de ADN derivado del evento KK179-2 en una muestra de ADN, el método que comprende: a. contacto con dicha muestra de ADN con la sonda polinucleotídica de la reivindicación 6; b. someterse dicha muestra de ADN y dicha sonda polinucleotídica a condiciones estrictas de hibridación; y c. detección de hibridación de dicha sonda polinucleotídica a dicha molécula de ADN derivada del evento KK179-2 en dicha muestra de ADN.
12 - Un par de moléculas de ADN que consiste en una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN que es diferente que la primera molécula de ADN, en donde dichas primera y segunda moléculas de ADN comprenden una molécula de polinucleotido con una secuencia de nucleótidos de una longitud suficiente de nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 6, o un complemento del mismo, para funcionar como cebadores de ADN cuando se usan en conjunto, en una reacción de amplificación con una plantilla derivada del evento KK179-2 para producir un amplicón diagnóstico para el evento KK179-2 en una muestra.
13.- Un kit de detección de ADN que comprende por lo menos una molécula de polinucleotido de una longitud suficiente de nucleótidos consecutivos de SEQ ID NO: 6, o complementos del mismo, para funcionar como un cebador de ADN o una sonda polinucleotídica específica para detectar la presencia de ADN derivado del evento KK179-2, en donde la detección de dicho ADN es diagnóstico para la presencia de dicho ADN de KK179-2 en una muestra.
14.- El kit para la detección de ADN de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque por lo menos una molécula de polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 , y SEQ ID NO: 2.
15.- Un microorganismo que comprende la molécula de ADN de la reivindicación 7.
16.- El microorganismo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho microorganismo es una célula vegetal.
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