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MX2013009417A - Metodos de preparacion de conjugados. - Google Patents

Metodos de preparacion de conjugados.

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MX2013009417A
MX2013009417A MX2013009417A MX2013009417A MX2013009417A MX 2013009417 A MX2013009417 A MX 2013009417A MX 2013009417 A MX2013009417 A MX 2013009417A MX 2013009417 A MX2013009417 A MX 2013009417A MX 2013009417 A MX2013009417 A MX 2013009417A
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MX
Mexico
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carbon atoms
linear
group
branched
optionally substituted
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Application number
MX2013009417A
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English (en)
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MX343337B (es
Inventor
Nathan Fishkin
Michael Miller
Wei Li
Rajeeva Singh
Original Assignee
Immunogen Inc
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Filing date
Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45755579&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2013009417(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunogen Inc filed Critical Immunogen Inc
Publication of MX2013009417A publication Critical patent/MX2013009417A/es
Publication of MX343337B publication Critical patent/MX343337B/es

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Abstract

La presente invención está dirigida a métodos para preparar un conjugado de un agente aglutinante celular y una droga (tal como un compuesto citotóxico). Los métodos comprenden el uso de un compuesto reactivo a las iminas para permitir la conjugación eficiente de los compuestos citotóxicos con los agentes aglutinadores celulares.

Description

MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE CONJUGADOS REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación bajo 35 U.S.C. §1 19(e), de la solicitud provisional de Estados Unidos núm. 61/443,062, presentada el 15 de febrero de 201 1 , la solicitud provisional de Estados Unidos núm. 61/483,499, presentada el 6. de mayo de 201 1 , y la solicitud provisional de Estados Unidos núm. 61/443,092, presentada el 15 de febrero de 201 1 , cuyos contenidos completos, incluyendo todos los dibujos, fórmulas, descripciones, y reivindicaciones, se incorporan en la presente como referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención describe el uso de reactivos de imina reactiva para la preparación de conjugados de agentes de unión celular con fármacos citotóxicos de unión al ADN que contienen uno o más grupos funcionales imina.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos monoclonales se están explorando cada vez más como agentes terapéuticos contra el cáncer. Muchos anticuerpos monoclonales contra los antígenos de superficie celular del cáncer se aprobaron ya para el tratamiento del cáncer, tales como rituximab para el linfoma no-Hodgkin, trastuzumab para el cáncer de mama, cetuximab para el cáncer de cabeza y cuello y colorectal, cetuximab, panitimumab, y bevacizumab para el cáncer colorectal, y alemtuzumab para leucemia linfocítica crónica (Strome, S. E., Sausviüe, E. A. , y Mann, D., 2007, The Oncologist, 12, 1084-1095). Sin embargo, la actividad citotóxica de un anticuerpo "desnudo" puede limitarse a los mecanismos de inhibición de la función del receptor, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC).
Un enfoque para mejorar la actividad citotóxica del anticuerpo hacia las células de cáncer objetivo es enlazar el anticuerpo con efectores citotóxicos (A. D. Ricart, y A. W. Tolcher, 2007, Nal Clin. Pract. Oncol. 4, 245-255; Lambert, J., 2010, Drugs oí the Future 35, 471 -480). El conjugado anticuerpo-fármaco citotóxico (ADC) se une específicamente a las células de cáncer, seguido por la internalización y degradación del conjugado, lo que resulta en la liberación intracelular del fármaco tóxico y por último a la muerte de las células de cáncer. Los fármacos citotóxicos que se emplearon en el enlace con anticuerpos incluyen fármacos antitubulina tales como maitansinoides y auristatinas, fármacos de unión al ADN tales como calicheamicina que causa escisión del ADN de doble cadena específico a la secuencia. Otra clase de fármacos citotóxicos de unión al ADN incluye pirrolobenzodiazepinas que contienen ¡mina (PBD) tales como ?-2-imidazolil alquil sustituido 1 , 2, 5-benzotiadiazepina-1 , 1 -dióxido, patente de los Estados Unidos núm. 6, 1 56,746), benzo-pirido o dipirido tiadiazepina (WO 2004/069843), derivados de pirrólo [1 ,2-b] [1 ,2,5] benzotiadiazepinas y pirrol [1 ,2-b][1 ,2,5] benzodiazepina (WO2007/015280), derivados de tomaimicina (por ejemplo, pirrolo[1 ,4]benzodiazepinas), tales como los descritos en WO 00/12508, WO2005/085260, WO2007/085930, EP 2019104, y la patente de los Estados Unidos núm. 6, 156,746). Otros fármacos de benzodiazepina de unión al ADN se describen en la publicación de patente de Estados Unidos núm. 201 0/0203007A1 . Estos fármacos de benzodiazepina que contienen enlaces imina se unen al surco menor del ADN e interfieren con la función del ADN, resultando en la muerte de la célula.
Existe una necesidad de nuevos métodos para la preparación de conjugados de agente de unión celular y fármacos citotóxicos que portan un grupo imina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe el uso de reactivos de imina reactiva para el tratamiento de un fármaco que contiene imina, el cual resultó en una mejora inesperada en su reacción de conjugación con agentes de unión celular (CBA) tales como los anticuerpos. Los reactivos son aquellos cuyas propiedades del fármaco para la muerte celular no disminuyen y se mantiene completamente la integridad del CBA (anticuerpo).
En una modalidad, la presente invención se dirige a un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo de enlace, el método comprende reaccionar un compuesto citotóxico con un CBA modificado a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, en donde: a) el CBA modificado comprende un residuo de un agente de reticulación bifuncional unido al CBA, y el residuo comprende el grupo de enlace y un grupo tiol-reactivo; y b) el compuesto citotóxico comprende un grupo tiol, y un grupo representado por: en donde: Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03 o HS02" formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S205: formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23", POS33" o PS43" formada con un catión), tio fosfato éster (RiO)2PS(ORi), R'S-, R'SO, R'S02, RiS03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S20„2" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCH2S02"Na+) o una mezcla de estos, en donde R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo.
En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico se produce al reaccionar un compuesto citotóxico que contiene ¡mina que porta el grupo tiol con un reactivo de ¡mina reactiva.
En otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo de enlace, el método comprende reaccionar el CBA con un compuesto citotóxico que contiene ¡mina, un reactivo de ¡mina reactiva, y un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo de enlace para formar el conjugado.
En otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo de enlace, el método comprende: a) reaccionar un compuesto citotóxico con un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo de enlace, un grupo reactivo con el CBA (tal como un grupo tiol, un grupo maleimida, un grupo haloacetamida, o un grupo amina), y un grupo reactivo con el compuesto citotóxico, para formar un compuesto citotóxico modificado covalentemente unido a un residuo del agente de reticulación bifuncional, en donde el residuo comprende el grupo de enlace y el grupo reactivo con el CBA; en donde el compuesto citotóxico es representado por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: en donde: Y es un grupo saliente, y es un sulfilo (HS03, HS02 o una sal de HS03', S032' o HS02" formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052' formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23", POS33" o PS43' formada con un catión), tio fosfato éster (RiO)2PS(ORi), R'S-, R'SO, R¡S02, R'S03l tiosulfato (HS203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S2042' formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCH2S02'Na+) o una mezcla de estos, en donde R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo; X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o ¡nsustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono; R,, R2, R3, R„, R,', R2', R3' y R4' son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(0CH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03" M+, un sulfato -0S03"M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", clano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R"; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-R0, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; R' y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R , -OR, -SR, -NR'R" , -N02, o, halógeno; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n.-N R9-(CH2)na-, -(CH2)n-0-(CH2)na- y -(CH2)n-S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y R8 son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH , -SH, -COOH , -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CR R'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-, R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo,- alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, o cuando está presente, comprende el grupo tiol, o es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-, un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo es opcionalmente sustituido; y, b) reaccionar el compuesto citotóxico modificado con el CBA a través del grupo reactivo con el CBA, a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, para formar el conjugado.
En cualquiera de las modalidades anteriores, el compuesto citotóxico que contiene imina puede ser representado por cualquiera de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: en donde: X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroanlo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono; R, , R2, 3, R , R R2', R3' y F son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NHZ], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03' M+, un sulfato -OS03"M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R" y el grupo de enlace; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CHgCh^O^-R0, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; R' y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, o halógeno; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH3)n-, -(CH2)n-CR7Ra-(CH2)na-, -(CH2)n.-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-0-(CH2)na- y -(CH2)n-S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y R8 son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-, R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, o cuando está presente, comprende el grupo tiol, y es una unidad- de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-, un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo es opcionalmente sustituido.
En aún otra modalidad, la presente invención se dirige a un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo de enlace, el método comprende reaccionar un compuesto citotóxico modificado con el CBA a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, en donde el compuesto citotóxico modificado comprende: a) un residuo de un agente de reticulación bifuncional unido al compuesto citotóxico, y el residuo comprende el grupo de enlace y un grupo reactivo seleccionado de un éster reactivo y un grupo tiol-reactivo, y, b) un grupo representado por: en donde: Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03', S032" o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052' formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (PO3SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23", POS33' o PS43" formada con un catión), tio fosfato éster (RiO)2PS(ORi), R!S-, R¡SO, R¡S02, R'SOa, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (HS20 o una sal de S2(V' formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02"Na+) o una mezcla de estos, en donde R1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyeme seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R1 puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyeme para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo., En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico modificado se produce al reaccionar un reactivo de imina reactiva con un compuesto citotóxico que porta imina que porta el grupo de enlace y el grupo reactivo.
En cualquiera de las modalidades anteriores, el compuesto citotóxico modificado es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde: Y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03 > S032" o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23', POS33" o PS43" formada con un catión), tio fosfato éster (RiO)2PS(ORi), R'S-, R¡SO, R¡S02, R¡S03. tiosulfato (HS203 o una sal de S2032' formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S2042" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxiladt (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02"Na+) o una mezcla de estos, en donde R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R1 puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene; 1 a 10 átomos de carbono, arilo heterociclilo o heteroarilo; X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 1 0 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; R es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; R i > R2. R3, Ri, Ri', F ', R3' y R son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R\ un sulfonato -S03" M+, un sulfato -OS03'M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R", y el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; FV y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, •NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, halógeno o el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2),y-CR7R8-(CH2)na -, -(CH2)n-NR9-(CH2)na.-, -(CH2)n.-0-(CH2)na- y -(CH2)n-S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y R8 son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR5 y -CRR'N(R5)-; R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, es el grupo de enlace con el 'grupo reactivo unido a este, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-, un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo o alquenilo es opcionalmente sustituido con el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; el fenilo o anillo heterocíclico o heteroarilo puede ser opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente puede ser el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este.
En cualquiera de las modalidades anteriores, el compuesto citotóxico y el grupo de enlace del conjugado es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde: Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03', S032" o HS02" formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23", POS33' o PS„3" formada con un catión), tio fosfato éster (R¡0)2PS(OR¡), FVS-, R¡SO, R¡S02, R'SOa, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032_ formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S20„2' formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02' o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02'Na+) o una mezcla de estos, en donde R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo; X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, el grupo de enlace, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, el grupo de enlace, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo de enlace; R,, R2, R3, R4, R,', R2', R3' y R4' son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C-NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02l -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03' M+, un sulfato -OS03'M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R" y el grupo de enlace; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo,' alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-R°, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; R' y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, halógeno o el grupo de enlace; Z y T son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)„a-, -(CH2)„-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-0-(CH2)na- y -(CH2)n-S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y Rs son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2),r, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-). -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-, R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2),,-; L está ausente, es el grupo de enlace, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-, un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo o alquenilo es opcionalmente sustituido con el grupo de enlace; el fenilo o anillo heterocíclico o heteroarilo puede ser opcionalmente sustituido, en donde el sustituyeme puede comprender el grupo de enlace.
Varios conjugados preferidos que pueden producirse de acuerdo con cualquiera étodos de la invención incluyen: en donde CBA es un agente de unión celular, tal como un anticuerpo, y r es un número entero entre 1 -20, preferentemente entre 1 -10 o 1 -5.
Como se usa en la presente, cuando se hace referencia a un grupo (por ejemplo, Rc, L, X' etc.) "es/ser" (o "no es") el grupo de enlace o el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, significa que el grupo "comprende" (o "no comprende") el grupo de enlace o el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las FIGS. 1 A y 1 B muestran el espectro de masa de conjugados de huMy9-6-2 deglicosilados preparados sin y con bisulfito, que contienen 1 .4 DAR (A) y 3.1 DAR (B), respectivamente. DAR: relación fármaco anticuerpo.
La FIG. 2 muestra la citoxicidad in vitro similar de los conjugados HuMy9-6-Fármaco 2 preparados sin y con bisulfito de sodio contra las células HL60 que expresan el antígeno CD33.
La FIG. 3 muestra la citotoxicidad in vitro similar de los conjugados anti-CD22 Ab-Fármaco 2 preparados sin y con bisulfito de sodio contra las células BJAB que expresan el antígeno CD22.
La FIG. 4 muestra el análisis HPLC de fase reversa del fármaco 2 y el fármaco 2 tratado con bisulfito de sodio.
La FIG. 5 muestra el análisis MS de huMy9-6 deglicosilado-SPDB-fármaco 1 preparado con y sin bisulfito de sodio usando 7 equivalentes molares de 1 por anticuerpo. A) Conjugado preparado sin bisulfito de sodio con promedio 1 .4 fármaco 1/Ab y especies de anticuerpo con hasta tres moléculas del fármacol enlazadas. B) Conjugado preparado con bisulfito de sodio con promedio de 2.5 1/Ab y especies de anticuerpo con hasta siete moléculas de fármaco 1 enlazadas.
La FIG. 6 muestra que la adición de la reacción de conjugación con bisulfito de sodio del fármacol no resultó en la fragmentación del anticuerpo (SDS-PAGE no reductora; análisis de gel en chip).
Las FIG. 7-1 1 muestra métodos ilustrativos de la presente invención para preparar un conjugado agente de unión celular-fármaco.
La FIG. 12 muestra el ánalisis de espectrometría de masa (MS) de My9-6 deglicosilado-SPDB-1 preparado conjugando un compuesto 1 que contiene el éster NHS (método reactivo de una etapa) directamente a lisinas del anticuerpo, o conjugando el compuesto 1 d a un anticuerpo modificado con ditiopiridina (método de dos etapas).
La FIG. 1 3 muestra los datos de MS de My9-6-sulfo-SPDB-1 preparado usando un método de dos etapas bajo diferentes condiciones de pH. El tiempo de reacción aumentado parece que se correlaciona con la citotoxicidad in v/ roaumentada independiente del antígeno CD33 medido en las células HL60-QC pretratadas con 1 í IM de huMy9-6 sin conjugar. La muerte dependiente de antígeno para todos los conjugados fue igualmente alta (~4 pM IC50). Se prefiere un tiempo de reacción corto (1 -3 h) para minimizar la fragmentación del anticuerpo y la muerte celular no específica in vitro para My9-6-sulfo-SPDB-1 .
La FIG. 14 muestra los datos de MS para chKTI-sulfo-SPDB-1 preparado usando un método de dos etapas con diferentes relaciones compuesto 1 d /enlazador.
La FIG. 15 muestra el uso de reactivos de imina covalentes para mejorar las especificaciones del conjugado Ab-fármaco (% de monómero y carga del fármaco).
La FIG. 16 muestra los esquemas para la síntesis en dos etapas de los conjugados representativos anticuerpo-fármaco.
La FIG. 1 7 muestra la citotoxicidad in vitro y especificidad de conjugados hu y9-6- SPDB-1 f contra diversas líneas celulares. Tenga en cuenta que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 18 muestra que la conjugación de los dímeros no reduce la afinidad de la unión del anticuerpo. Tenga en cuenta que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 19 muestra la actividad antitumoral in vivodel conjugado de hu(vly9-6. Tenga en cuenta que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 20 muestra la citotoxicidad in vitro del conjugado huMy9-6-SPDB-1 f contra las células positivas al antígeno. Tenga en cuenta que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 21 muestra la citotoxicidad in vitro de huMy9-6-SPDB-1 f (A), huMy9-6-sulfoSPDB-1 f (B) y huMy9-6-BMPS-1 f (C) contra células HL60/QC (Ag+) con y sin bloqueo de los sitios de unión al antígeno. Tenga en cuenta que en todos los tres experimentos (34A, 34B, y 34C), se adicionaron bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 22 muestra la citotoxicidad in vitro de chB38.1 -SPDB-1 f (A), y chB38.1 -sulfoSPDB-l f (B) contra las células COLO205 (Ag+). Tenga en cuenta que en ambos experimentos, se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 23 muestra la eficacia/n vivo de huMy9-6-SPDB-1 f en ratones que portan HL60/QC. Tenga en cuenta que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación.
La FIG. 24 muestra actividad antiproliferativa comparando (A) huMy9-6-SPDB-1 f, (B) hu y9-6-sulfoSPDB-1 f, y (C) hu y9-6-BMPS-1 f, contra células OCI-AML3 (Ag+) con y sin bloqueo de los sitios de unión al antígeno. Tenga en cuenta que en todos los experimentos, se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 25 muestra la eficacia in vivo de huMy9-6-BMPS-1 f en ratones que portan el tumor MOLM- 1 3. Tenga en cuenta que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 26 muestra un esquema representativo de la síntesis de un conjugado folato sulfonado / compuesto citotóxico. Tenga en cuenta que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 27 muestra la eficacia ¡n vivo de huMy9-6-fármaco 2 en ratones que portan el tumor MOLM- 13. Tenga en cuenta que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 28 muestra la preparación de huMy9-6-sulfo-SPDB-1 d usando el enlazador altamente reactivo 4-nitroPy-sulfo-SPDB.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A continuación se hará referencia en detalle a ciertas modalidades de la invención, cuyos ejemplos se ilustran en las estructuras y fórmulas que se acompañan. Aunque la invención será descrita en conjunto con las modalidades enumeradas, se entenderá que ellas no pretenden limitar la invención a esas modalidades. Por el contrario, se desea que la invención cubra todas las alternativas, modificaciones y equivalentes que se puedan incluir dentro del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones. Una persona con conocimientos en la materia reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente, los cuales podrían usarse en la práctica de la presente invención.
Se debe entender que cualquiera de las modalidades descritas en la presente, que incluyen aquellas descritas bajo diferentes aspectos de la invención {por ejemplo, compuestos, moléculas enlazadoras de compuestos, conjugados, composiciones, métodos para preparar y usar) y partes diferentes de la especificación (que incluyen modalidades descritas solo en los Ejemplos) pueden combinarse con una o más modalidades distintas de la invención, a menos que sea negado o inadecuado. La combinación de las modalidades no se limita a las combinaciones específicas reivindicadas a través de las reivindicaciones multidependientes.
Definiciones "Alquil lineal o ramificado" como se usa en la presente se refiere a un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada saturado de uno a veinte átomos de carbono. Los ejemplos de alquilo incluyen, pero sin limitarse a, metilo, etilo, 1 -propilo, 2-propilo, 1 -butilo, 2-metil-1 -propilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo, 2-metil-2-propilo, 1 -pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-1 -butilo, 2-metil-1 -butilo, 1 -hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-d¡metil-2-butilo, 3,3-dimetil-2-butilo, 1 -heptilo, 1 -octilo, y similares. Preferentemente, el alquilo tiene uno a diez átomos de carbono. Con mayor preferencia, el alquilo tiene uno a cuatro átomos de carbono.
"Alquenilo lineal o ramificado" se refiere un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada de dos a veinte átomos de carbono con al menos un sitio de insaturación, es decir, un enlace doble carbono-carbono, en donde el radical alquenilo incluye radicales que tienen orientaciones "cis" y "trans", o alternativamente, orientaciones "E" y "Z". Los ejemplos incluyen, pero sin limitarse a, etilenilo o vinilo (-CH=CH2), alilo (- CH2CH=CH2), y similares. Preferentemente, el alquenilo tiene dos a diez átomos de carbono. Con mayor preferencia, el alquilo tiene dos a cuatro átomos de carbono.
"Alquinilo lineal o ramificado" se refiere a un radical hidrocarburo monovalente lineal o ramificado de dos a veinte átomos de carbono con al menos un sitio de ínsaturación, es decir, un enlace triple carbono-carbono. Los ejemplos incluyen, pero sin limitarse a, etinilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo, hexinilo, y similares. Preferentemente, el alquinilo tiene dos a diez átomos de carbono. Con mayor preferencia, el alquinilo tiene dos a cuatro átomos de carbono.
El término "carbociclo", "carbociclilo" y "anillo carbocíclico" se refiere a un anillo monovalente no aromático, saturado o parcialmente insaturado que tiene 3 a 12 átomos de carbono como un anillo monocíclico o 7 a 12 átomos de carbono como un anillo bicíclico. Los carbociclos bicíclicos que tienen 7 a 12 átomos pueden disponerse, por ejemplo, como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], o [6,6] , y los carbociclos bicíclicos que tiene 9 o 10 átomos del anillo pueden disponerse como un sistema biciclo [5,6] o [6,6], o como sistemas puenteados tales como biciclo[2.2.1 ]heptano, biciclo[2.2.2]octano y biciclo[3.2.2]nonano. Los ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen, pero sin limitarse a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1 -ciclopent-1 -enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1 -ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1 -ciclohex-1 -enilo, 1 -ciclohex-2-enilo, 1 -ciclohex-3-enilo, ciclohexadienilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo, ciclodecilo, cicloundecilo, ciclododecilo, y similares.
Los términos "alquilo cíclico" y "cicloalquilo" pueden usarse indistintamente. Ellos se refieren a un radical de anillo carbocíclico saturado monovalente. Preferentemente, el alquilo cíclico es un radical de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros. Con mayor preferencia, el alquilo cíclico es ciclohexilo.
El término "alquenilo cíclico" se refiere a un radical de anillo carbocíclico que tiene al menos un enlace doble en la estructura anular.
El término "alquinilo cíclico" se refiere a un radical de anillo carbocíclico que tiene al menos un enlace triple en la estructura anular.
Arilo" significa un radical hidrocarburo aromático monovalente de 6-1 8 átomos de carbono derivados al eliminar un átomo de nitrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema anular aromático parental. Algunos grupos arilo se representan en las estructuras ilustrativas como "Ar." Arilo incluye radicales bicíclicos que comprende un anillo aromático fusionado a un anillo saturado, parcialmente insaturado, o anillo heterocíclico o carbocíclico o aromático. Los grupos arilo típico incluyen, pero sin limitarse a, radicales derivados de benceno (fenilo), bencenos sustituidos, naftaleno, antraceno, indenilo, indanilo, 1 ,2-dihidronaftaleno, 1 ,2,3,4-tetrahidronaftilo, y similares. Preferentemente, el arilo es un grupo fenilo.
Los términos "heterociclo", " eterociclilo", y "anillo heterocíclico" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un radical carbocíclico saturado o uno parcialmente insaturado (es decir, que tiene uno o más enlaces dobles y/o triples dentro del anillo) de 3 a 1 8 átomos del anillo en el cual al menos un átomo del anillo es un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno, fósforo, y azufre, los átomos del anillo restantes son C, donde uno o más átomos del anillo es opcionalmente sustituido independientemente con uno o más sustituyentes descritos más abajo. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene 3 a 7 miembros anulares (2 a 6 átomos de carbono y 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S) o uno biciclo que tiene 7 a 10 miembros anulares (4 a 9 átomos de carbono y 1 a 6 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], o [6,6]. Los heterociclos se describen en Paquette, Leo A.; "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamín, Nueva York, 1 968), particularmente los Capítulos 1 , 3, 4, 6, 7, y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compuestos, A series of onographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 al presente) , en particular los Volúmenes 13, 14, 16, 1 9, y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. "HeterocicMIo" incluye además radicales donde los radicales heterociclo se fusionan con un anillo saturado, parcialmente insaturado, o anillo heterocíclico o carbocíclico o aromático. Los ejemplos de anillos heteroc.íclicos incluyen, pero sin limitarse a, pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanilo, piperazinilo, homopiperazinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, homopiperidinilo, oxepanilo, tiepanilo, oxazepinilo, diazepinilo, tiazepinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piran¡lo, dioxanilo, 1 ,3-dioxolanilo, pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, dihidropiranilo, dihidrotienilo, dihidrofuranilo, pirazolidinilimidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabiciclo[3.1 .0]hexanilo, 3-azabiciclo[4.1 .OJheptanilo, y azabiciclo[2.2.2]hexanílo. Las porciones espiro se incluyen además dentro del alcance de esta definición. Los ejemplos de un grupo heterocíclico en donde los átomos del anillo se sustituyen con porciones oxo (=0) son pirimidinonilo y 1 , 1 -dioxo-tiomorfolinilo.
El término "heteroarilo" se refiere a un radical aromático monovalente de 5- o 6-miembros anulares, e incluye sistemas anulares fusionados (al menos uno de los cuales es aromático) de 5-18 átomos, que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxigeno, y azufre. Los ejemplos de grupos heteroarilo son piridinilo (que incluyen, por ejemplo, 2-hidroxipiridinilo), imidazolilo, ¡midazopiridinilo, pirimidinilo (que incluyen, por ejemplo, 4-hidroxipirimidinilo), pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, cinnolinilo, ¡ndazolilo, indolizinilo, ftalazinilo, piridazinilo, triazinilo, isoindolilo, pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, y furopiridinilo.
Los grupos heterociclo o heteroarilo pueden ser carbono (enlazado al carbono) o nitrógeno (enlazado al nitrógeno) unidos donde esto sea posible. A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos o heteroarilos unidos al carbono están unidos en la posición 2, 3, 4, 5, o 6 de una piridina, posición 3, 4, 5, o 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5, o 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5, o 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4, o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, posición 2, 4, o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, posición 3, 4, o 5 de un isoxazol, pirazol, o isotiazol, posición 2 o 3 de una aziridina, posición 2, 3, o 4 de una azetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una quinolina o posición 1 , 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una isoquinolina.
A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos o heteroarilos unidos al nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, ¡ndol, indolina, 1 H-indazol, posición 2 de un isoindol, o isoindolina, posición 4 de una morfolina, y posición 9 de un carbazol, o O-carbolina.
Los heteroátomos presentes en el heteroarilo o heterociclilo incluyen las formas oxidadas tales como NO, SO, y S02.
El término "halo" o "halógeno" se refiere a F, Cl, Br o I .
El alquilo, alquenilo, alquinilo, alquilo cíclico, alquenilo cíclico, alquinilo cíclico, carbociclilo, arilo, heterociclilo y heteroarilo descritos anteriormente pueden ser opcionalmente sustituidos con uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más) sustituyentes.
Si un sustituyente se describe como "sustituido", un sustituyente no-hidrógeno está en el lugar de un sustituyente hidrógeno en un carbono, oxígeno, azufre o nitrógeno del sustituyente. Así, por ejemplo, un sustituyente alquilo sustituido es un sustituyente alquilo en donde al menos un sustituyente no-hidrógeno está en el lugar de un sustituyente hidrógeno en el sustituyente alquilo. Para ilustrar, el monofluoroalquilo es alquilo sustituido con un sustituyente fluoro, y difluoroalquilo es alquilo sustituido con dos sustituyentes fluoro. Debe reconocerse que si hay más de una sustitución en un sustituyente, cada sustituyente no-hidrógeno puede ser idéntico o diferente (a menos que se declare de cualquier otra forma).
Si un sustituyente se describe como que es "opcionalmente sustituido", el sustituyente puede ser (1 ) no sustituido, o (2) sustituido. Si un carbono de un sustituyente se describe como opcionalmente sustituido con uno o más de una lista de sustituyentes, uno o más de los hidrógenos en el carbono (en la medida en que hay alguno) puede separadamente y/o juntos ser reemplazados con un sustituyente opcional independientemente seleccionado. Si un nitrógeno de un sustituyente se describe como opcionalmente sustituido con uno o más de una lista de sustituyentes, uno o más de los hidrógenos en el nitrógeno (en la medida en que hay alguno) pueden cada uno ser reemplazados con un sustituyente opcional independientemente seleccionado. Un sustituyente ilustrativo puede representarse como -NR'R", en donde R' y R" junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos, pueden formar un anillo heterocíclico. El anillo heterocíclico formado a partir de R' y R" junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos puede ser parcialmente o totalmente saturado. En una modalidad, el anillo heterocíclico consiste 3 a 7 átomos. En otra modalidad, el anillo heterocíclico es seleccionado del grupo que consiste de pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, isoxazolílo, piridilo y tiazolilo.
Esta descripción usa los términos "sustituyente", "radical", y "grupo" indistintamente.
Si un grupo de sustituyentes se describen colectivamente como opcionalmente sustituidos por uno o más de una lista de sustituyentes, el grupo puede incluir: (1 ) sustituyentes insustituibles, (2) sustituyentes sustituibles que no están sustituidos por los sustituyentes opcionales, y/o (3) sustituyentes sustituibles que son sustituidos por uno o más de los sustituyentes opcionales.
Si un sustituyente se describe como opcionalmente sustituido con hasta un número particular de sustituyentes no-hidrógeno, ese sustituyente puede ser (1 ) no sustituido; o (2) sustituido por hasta ese número particular de sustituyentes no-hidrógeno o por hasta el número máximo de posiciones sustituibles eq el sustituyente, el que sea menor. Así, por ejemplo, si un sustituyente se describe como un heteroarilo opcionalmente sustituido con hasta 3 sustituyentes no-hidrógeno, y después cualquier heteroarilo con menos de 3 posiciones sustituibles puede ser opcionalmente sustituido con hasta sólo como muchos sustituyente no-hidrógenos cuando el heteroarilo tiene posiciones sustituibles. Tales sustituyentes, en ejemplos no limitantes, pueden ser seleccionados de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heteroarilo, heterociclilo, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR'00, NR10,R102, -N02, -NR,01COR102, -SR100, un sulfóxido representado por -SOR101, una sulfona representada por -S02R'°1, un sulfonato -S03 , un sulfato -OS03M, una sulfonamida representada por -SO2NR10,R'02, ciano, un azido, -COR'01 , -OCOR,0\ -OCONR,0, R '02 y una unidad de polietilenglicol (-???2??2)??,0' en donde M es H o un catión farmacéuticamente aceptable (tal como Na+ o K+); R101, R'02 y R103 son cada uno independientemente seleccionados de H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-R,M, en donde n es un número entero de 1 a 24, un arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, un anillo heterocíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbonoy un heteroarilo que tiene 5 a 10 átomos de carbono; y R104 es H o un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono, en donde el alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo y heterociclilo en los grupos representados por R100, R101 , R102, R'03 y R'04 son opcionalmente sustituidos con uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más) sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, -OH, -CN, -N02 y alquilo lineal o ramificado insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono. Preferentemente, los sustituyentes para el alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo, alquinilo, alquilo cíclico, alquenilo cíclico, alquinilo cíclico, carbociclilo, arilo, heterociclilo y heteroarilo descritos anteriormente incluyen halógeno, -CN, -NR102R 103, -CF3, -OR 0 , arilo, heteroarilo, heterociclilo, -SR101 , -SOR101 , -S02R101 y -S03M.
El término "compuesto" o "compuesto citotóxico", "dímero citotóxico" y "compuesto dímero citotóxico" se usan indistintamente. Ellos pretenden incluir los compuestos para los cuales una estructura o fórmula o cualquier derivado biológicamente activo de este se ha descrito en la presente invención o una estructura o fórmula o cualquier derivado de este que se incorpora como referencia. El término incluye además, estereoisómeros, isómeros geométricos, tautómeros, solvatos, metabolitos, sales (por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables) y profármacos, y sales del profármaco de un compuesto de todas las fórmulas descritas en la presente invención. El término incluye además cualquier solvato, hidrato, y polimorfos de cualquiera de los anteriores. La mención específica de "estereoisómeros", "isómeros geométricos", "tautómeros", "solvatos", "metabolitos", "sal" "profármaco", "sal de profármaco", "conjugados", "sal de conjugados", "solvato", "hidrato", o "polimorfo" en ciertos aspectos de la invención descritos en esta solicitud no deben interpretarse como una omisión intencional de esas formas en otros aspectos de la invención donde el término "compuesto" se usa sin mención de esas otras formas. En una modalidad, el compuesto citotóxico comprende un grupo de enlace o un grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este.
Alternativamente, el compuesto cltotóxlco no comprende un grupo de enlace o un grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este.
El término "conjugado" como se usa en la presente se refiere a un compuesto descrito en la presente o un derivado de este que está unido a un agente de unión celular.
El término "enlazable a un agente de unión celular" como se usa en la presente se refiere a los compuestos descritos en la presente o derivados de este que comprende al menos un grupo de enlace o un precursor de este adecuado para unir estos compuestos o derivados de este a un agente de unión celular.
El término "precursor" de un grupo dado se refiere a cualquier grupo que puede llevar a ese grupo por cualquier reacción de desprotección, una modificación química, o un acoplamiento.
El término "enlazado a un agente de unión celular" se refiere a una molécula conjugada que comprende al menos uno de los compuestos descritos en la presente (por ejemplo, compuestos y compuestos de unión al fármaco descritos en la presente), o derivado de este unido a un agente de unión celular a través de un grupo de enlace adecuado o un precursor de este.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superposición de imágenes especulares, mientras el término "aquiral" se refiere a moléculas que son superponibles en imágenes especulares.
El término "estereoisómero" se refiere a compuestos que tienen constitución y conectividad química idéntica, pero orientaciones diferentes de sus átomos en el espacio que no pueden interconvertirse por la rotación alrededor de los enlaces simples.
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ejemplo puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales, y reactividades. Las mezclas de diastereómeros pueden separarse bajo procedimientos analíticos de alta resolución tales como cristalización, electroforesis y cromatografía.
Enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.
Las definiciones estereoquímicas y convenciones usadas en la presente descripción generalmente siguen S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1994. Los compuestos de la invención pueden contener centros asimétricos o quirales, y por lo tanto existen en diferentes formas estereoisoméricas. Se pretende que todas las formas estereoisoméricas de los compuestos de la invención, que incluyen pero sin limitarse a, diastereómeros, enantiómeros y atropisómeros, así como mezclas de éstos tales como las mezclas racémicas, forman parte de la presente invención. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tiene la capacidad de rotar el plano del plano de la luz polarizada. Al describir un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L, o R y S, se usan para denotar la configuración absoluta de la molécula alrededor de su(s) centro(s) quiral(es). Los prefijos d e I o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación del plano de la luz polarizada por el compuesto, donde (-) o 1 significa que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos excepto que ellos son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico puede referirse además como un enantiómero, y una mezcla de esos isómeros se llama frecuentemente una mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se refiere como una mezcla racémica o un racemato, lo que puede ocurrir cuando no ha habido estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Los términos "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, desprovista de actividad óptica.
El término "tautómero" o "forma tautomérica" se refiere a isómeros estructurales de diferentes energías que son interconvertibles a través de una barrera de baja energía. Por ejemplo, los tautómeros del protón (además conocidos cono tautómeros prototrópicos) incluyen interconversiones a través de la migración de un protón, tal como isomerizaciones ceto-enol e imina-enamina. Los tautómeros de valencia incluyen interconversiones por reorganización de algunos de los electrones de unión.
El término "profármaco" como se usa en esta solicitud se refiere a un precursor o forma de derivado de un compuesto de la invención que es capaz de ser enzimáticamente o hidrolíticamente activado o convertido en la forma parental más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 61 5th Meeting Belfast ( 1 986) y Stella y otros, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt y otros, (ed.), págs. 247-267, Humana Press ( 1 985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero sin limitarse a, profármacos que contienen éster, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados de D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida, profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse en una forma de profármaco para usar en esta invención incluyen, pero sin limitarse a, compuestos de la invención y agentes quimioterapéuticos como se describió anteriormente.
El término "profármaco" significa además un derivado de un compuesto que se puede hidrolizar, oxidar, o de cualquier otra forma reaccionar bajo condiciones biológicas [in vitro o ¡n vivo) para proporcionar un compuesto de esta invención. Los profármacos solamente se pueden hacer activos con tal reacción bajo condiciones biológicas, o estos pueden tener actividad en sus formas no reaccionadas. Los ejemplos de profármacos contemplados en esta invención incluyen, pero sin limitarse a, análogos o derivados de los compuestos de cualquiera de las fórmulas descritas en la presente que comprenden porciones biohidrolizables tales como amidas biohidrolizables, ésteres biohidrolizables, carbamatos biohidrolizables, carbonatos biohidrolizables, ureidos biohidrolizables, y análogos de fosfato biohidrolizables. Otros ejemplos de profármacos incluyen derivados de compuestos de cualquiera de las fórmulas descritas en la presente que comprenden porciones -NO, -N02, -ONO, o -ON02. Los profármacos pueden prepararse típicamente usando métodos bien conocidos, tales como los descritos por Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery ( 1995) 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff ed. , 5ta ed); ver además Goodman and Gilman's, The Pharmacological basis of Therapeutics, 8va ed., McGraw-Hill, Int. Ed. 1 992, "Biotransformation of Drugs." Una forma preferida del profármaco de la invención incluye compuestos (con o sin grupos enlazadores) y conjugados de la invención que comprenden un aducto formado entre un enlace ¡mina de los compuestos / conjugados y un reactivo de ¡mina reactiva.
El término "reactivo de imina reactiva" se refiere a un reactivo que es capaz de reaccionar con un grupo ¡mina. Los ejemplos de reactivo de ¡mina reactiva incluyen, pero sin limitarse a, sulfitos (H2S03, H2S02 o una sal de HS03", S032" o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono, di, tri, y tetra- tiofosfatos (P03SH3, P02S2H3, P0S3H3, PS„H3 o una sal de P03S3', P02S23", POS33' o PS„3' formada con un catión), tio fosfato ásteres ((RiO)2PS(ORl)1 R'SH, R¡SOH, R'SOaH, R'S03H), varias aminas (hidroxil amina (por ejemplo, NH2OH), hidrazina (por ejemplo, NH2NH2), NHsO-R1, R''NH-R', NHz-R1), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2- tiosulfato (H2S203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (H2S204 o una sal de S2042" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=0)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONIHNH2), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02H o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02'Na+), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de estos, en donde R1 y R' son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y son sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' y R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; y Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo (preferentemente, Rk es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; con mayor preferencia, Rk es metilo, etilo o propilo). Preferentemente, el catión es un catión monovalente, tal como Na+ o K+. Preferentemente, el reactivo de ¡mina reactiva es seleccionado de sulfitos, hidroxil amina, urea e hidrazina. Con mayor preferencia, el reactivo de imina reactiva es NaHS03 o KHS03.
Como se usa en la presente y a menos que se indique de cualquier otra forma, los términos "amida biohidrolizable", "éster biohidrolizable", "carbamato biohidrolizable", " carbonato biohidrolizable ", "ureido biohidrolizable" y "análogo de fosfato biohidrolizable" significa una amida, éster, carbamato, carbonato, ureido, o análogo de fosfato, respectivamente, que: 1 ) no destruye la actividad biológica del compuesto y confiere propiedades ventajosas a los compuestos ¡n vivo, tales como captación, duración de la acción, o inicio de la acción; o 2) es en sí mismo biológicamente inactivo pero se convierte ¡n vivo a un compuesto biológicamente activo. Los ejemplos de amidas biohidrolizables incluyen, pero sin limitarse a, amidas de alquilo inferior, amidas de u-aminoácido, alcoxiacil amidas, y alquilaminoalquilcarbonil amidas. Los ejemplos de ésteres biohidrolizables incluyen, pero sin limitarse a, ásteres de alquilo inferior, alcoxiaciloxi ésteres, ésteres de alquil acilamino alquilo, y ésteres de colina. Los ejemplos de carbamatos biohidrolizables incluyen, pero sin limitarse a, alquilaminas inferiores, etilenodiaminas sustituidas, aminoácidos, hidroxialquilaminas, aminas heterocíclicas y heteroaromáticas, y poliéter aminas. Particularmente los profármacos y sales de profármaco favorecidos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de esta invención cuando tales compuestos se administran a un mamífero.
La frase "sal farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto de la invención. Las sales ilustrativas incluyen, pero sin limitarse a, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfórico, fosfato ácido, ¡somcotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanosulfonato "mesilato", etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenesulfonato, pamoato (es decir, sales de 1 , 1 '-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)), sales de metales alcalinos {por ejemplo, sodio y potasio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), y sales de amonio. Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula tal como un ion acetato, un ion succinato u otro contra ion. El contra ion puede ser cualquier porción orgánica o inorgánica, que estabiliza la carga en el compuesto original. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Los casos en los que múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contra-iones. Por lo tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contra-iones.
Si el compuesto de la invención es una base, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse por cualquier método adecuado disponible en la técnica, por ejemplo, tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido hidrobrómico, ácido sulfúrico, acido nítrico, ácido metanosulfónico, ácido fosfórico y similares, o con un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicilico, un ácido piranosidilo, tal como ácido glucurónico o ácido galacturónico, un ácido alfa hidroxi, tal como ácido cítrico o ácido tartárico, un aminoácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, un ácido aromático, tal como ácido benzoico o ácido cinámico, un ácido sulfónico, tal como ácido p-toluensulfónico o ácido etanosúlfonico, o similares.
Si el compuesto de la invención es un ácido, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse por cualquier método adecuado, por ejemplo, tratamiento del ácido libre con una base inorgánica u orgánica, tal como una amina (primaria, secundaria o terciaria), un hidróxido de metales alcalinos o hidróxido de metal alcalino térreo, o similares. Los ejemplos ilustrativos de sales adecuadas incluyen, pero sin limitarse a, sales orgánicas derivadas de aminoácidos, tales como glicina y arginina, amoníaco, aminas primarias, secundarias o terciarias, y aminas cíclicas, tales como piperidina, morfolina y piperazina, y sales inorgánicas derivadas del sodio, calcio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, aluminio y litio.
Como se usa en la presente, el término "solvato" significa un compuesto que incluye además una cantidad estequiométrica o no-estequiométrica de disolvente tal como, agua, ¡sopropanol, acetona, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético, y etanolamina diclorometano, 2-propanol, o similares, unidos por fuerzas intermoleculares no-covalentes. Los solvatos o hidratos de los compuestos se preparan fácilmente por adición de al menos un equivalente molar de un solvente hidroxílico tales como metanol, etanol, 1 -propanol, 2-propanol o agua al compuesto para dar lugar a la solvatación o hidratación de la porción ¡mina.
Un "metabolito" es un producto producido a través del metabolismo en el cuerpo de un compuesto específico, un derivado de este, o un conjugado de este, o sal de este. Los metabolitos de un compuesto, un derivado de este, o un conjugado de este, puede identificarse usando técnicas de rutina conocidas en la técnica y sus actividades determinadas usando pruebas tales como las descritas en la presente descripción. Tales productos pueden resultar, por ejemplo, a partir de la oxidación, hidroxilación, reducción, hidrólisis, amidación, deamidación, esterificación, desesterificación, escisión enzimática, y similares, del compuesto administrado. En consecuencia, la invención incluye metabolitos de los compuestos, un derivado de este, o un conjugado de este, de la invención, que incluyen compuestos, un derivado de este, o un conjugado de este, producidos por un proceso que comprende contactar un compuesto, un derivado de este, o un conjugado de este, de esta invención con un mamífero por un periodo de tiempo suficiente para obtener un producto metabólico de este.
La frase "farmacéuticamente aceptable" indica que la sustancia o composición debe ser compatible químicamente y/o toxicológicamente, con los otros ingredientes que comprende una formulación, y/o el mamífero que se trata con la misma.
El término "grupo protector" o "porción protectora" se refiere a un sustituyeme que se emplea comúnmente para bloquear o proteger una funcionalidad particular mientras reaccionan otros grupos funcionales en el compuesto, un derivado de este, o un conjugado de este. Por ejemplo, un "grupo protector amina" o una "porción amino-protectora" es un sustituyente unido a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad amino en el compuesto. Tales grupos son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, P. Wuts and T. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, Chapter 7, J. Wiley & Sons, NJ) y ejemplificados por carbamatos tal como metil y etil carbamato, FMOC, etil carbamatos sustituidos, carbamatos escindidos por eliminación 1 ,6-ß (además llamado "auto-inmolativo"), derivados de ureas, amidas, péptidos, alquilo y arilo. Los grupos amino-protectores adecuados incluyen acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc). Para una descripción general de los grupos protectores y su uso, ver P. G. . Wuts & T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 2007.
El término "grupo saliente" se refiere a un grupo de porción cargada o no cargada que se aleja durante un cambio o desplazamiento. Tales grupos salientes son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitarse a, halógenos, ésteres, alcoxi, hidroxilo, tosilatos, triflatos, mesilatos, nitrilos, azida, carbamato, disulfuros, tioésteres, tioéteres y compuestos de diazonio.
El término "agente de reticulación bifuncional", "enlazador bifuncional" o "agentes de reticulación" se refiere a agentes modificadores que poseen dos grupos reactivos conectados a un "grupo de enlace"; uno de cuales es capaz de reaccionar con un agente de unión celular mientras que otro reacciona con el compuesto citotóxico para enlazar las dos porciones juntas. Tales reticuladores bifuncionales son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Isalm and Dent en Bioconjugation capítulo 5, p218-363, Groves Dictionaries Inc. Nueva York, 1999). Por ejemplo, los agentes de reticulación bifuncionales que permiten el enlace a través de un enlace tioéter incluyen A/-succinimidil-4-(N-maleimidometilo)-ciclohexano-1 -carboxilato (SMCC) para introducir grupos maleimido, o con A/-succinimidil-4-(yodoacetilo)-aminobenzoato (SIAB) para introducir grupos yodoacetilo. Otros agentes de reticulación bifuncionales que introducen grupos maleimido o grupos haloacetilo en un agente de unión celular son bien conocidos en la técnica (ver las solicitudes de patente de Estados Unidos 2008/0050310, 20050169933, disponibles de Pierce Biotechnology Inc., P.O. Box 1 17, Rockland, IL 61 105, Estados Unidos) e incluyen, pero sin limitarse a, bis-maleimidopolietilenoglicol (BMPEO), BM(PEO)2, BM(PEO)3, N-(i ,-male¡midopropiloxi)succ¡n¡mida éster (BMPS), N-succinimidil éster del ácido! ¡-maleimidobutírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido l -maleimidocaproico (EMCS), ácido 5-maleimidovalérico NHS, HBVS, N-succinimidil-4-(N-maleimidometilo)-ciclohexano-1 -carboxi-(6-amidocaproato), que es un análogo de SMCC de "cadena larga" (LC-SMCC), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butírico o sal de HCI (MPBH), N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N-succinimidil éster del ácido ' ;-maleimidoundecanoico (KMUA), N-succinimidil 4-(p-maleimidofenilo)-butirato (SMPB), succinimidil-6-(f l-maleimidopropionamido)hexanoato (S PH), succinimidil-(4-vinilsulfonilo)benzoato (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1 ,4-bis-maleimidobutano (BMB), 1 ,4 bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis-maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), sulfosuccinimidil 4-(N-maleimido-metilo)ciclohexano-1 -carboxilato (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-yodo-acetilo)aminobenzoato (sulfo-SIAB), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), N-(i i-maleimidobutriloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-GMBS), N-(i -maleimidocaproiloxi)sulfosuccimido éster (sulfo-EMCS), N-(l -maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-KMUS), y sulfosuccinimidil 4-(p- maleimidofen¡lo)but¡rato (sulfo-SMPB).
Los agentes de reticulación heterobifuncionales son agentes de reticulación bifuncionales que tienen dos grupo reactivos diferentes. Los agentes de reticulación heterobifuncionales que contiene un grupo A/-hidroxisuccinimida amina-reactivo (grupo NHS) y un grupo hidrazina carbonil-reactivo pueden usarse además para enlazar los compuestos citotoxicos descritos en la presente con un agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo). Los ejemplos de tales agentes de reticulación heterobifuncionales comercialmente disponibles incluyen succinimidil 6-hidrazinonicotinamida acetona hidrazona (SANH), hidrocloruro de succinimidil 4-hidrazidotereftalato (SHTH) e hidrocloruro de succinimidil hidrazino nicotinato (SHNH). Los conjugados que portan un enlace ácido-lábil pueden prepararse además usando un derivado de benzodiazepina que porta hidrazina de la presente invención. Los ejemplos de agentes de reticulación bifuncionales que pueden usarse incluyen succinimidil-p-formil benzoato (SFB) y succinimidil-p-formilfenoxiacetato (SFPA).
Los agentes de reticulación bifuncionales que permiten el enlace del agente de unión celular con los compuestos citotoxicos a través de enlaces disulfuro incluyen N-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, y otros agentes conocidos en la técnica que incluyen A/-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), /V-succinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP), /V-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoato (sulfo-SPDB) para introducir grupo ditiopiridilo. Otros agentes de reticulación bifuncionales que pueden usarse para introducir grupos disulfuro son conocidos en la técnica y se describen en las patentes de Estados Unidos 6,91 3,748, 6,716,821 y las publicaciones de patentes de Estados Unidos 20090274713 y 201 0012931 4, todos los cuales se incorporan en la presente como referencia. Alternativamente, pueden usarse también agentes de reticulación tales como 2-¡minot¡olana, homocisteína tiolactona o anhídrido S-acetilsuccínico que introduce grupos tiol.
Un "enlazador", "porción enlazadora", o "grupo de enlace" como se define en la presente se refiere a una porción que conecta dos porciones, tal como un agente de unión celular y un compuesto citotoxico, juntos. Un agente de reticulación bifuncional puede comprender dos grupos reactivos, uno en cada extremo de una porción enlazadora, de modo que un grupo reactivo puede reaccionar primero con el compuesto citotoxico para proporcionar un compuesto que porta la porción enlazadora y un segundo grupo reactivo, que puede reaccionar después con un agente de unión celular. Alternativamente, un extremo del agente de reticulación bifuncional puede reaccionar primero con el agente de unión celular para proporcionar un agente de unión celular que porta una porción enlazadora y un segundo grupo reactivo, que puede reaccionar después con un compuesto citotoxico. La porción enlazadora puede contener un enlace químico que permite la liberación de la porción citotóxica en un sitio particular. Los enlaces químicos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen enlaces disulfuro, enlaces tioéter, enlaces lábiles de ácido, enlaces fotolábiles, enlaces lábiles de peptidasa y enlaces lábiles de esterasa (ver por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5,208,020; 5,475,092; 6,441 , 163; 6,716,821 ; 6,913,748; 7,276,497; 7,276,499; 7,368,565; 7,388,026 y 7,414,073). Los preferidos son los enlaces disulfuro, tioéter y enlaces lábiles de peptidasa. Otros enlazadores que pueden usarse en la presente invención incluyen enlazadores no-escindibles, tales como los descritos en detalle en la publicación de Estados Unidos número 20050169933, o enlazadores cargados o enlazadores hidrófilos y se describen en US 2009/0274713, US 2010/01293140 y WO 2009/134976, cada una de las cuales se incorpora expresamente en la presente como referencia.
En una modalidad, el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a su extremo, tal como un éster reactivo, es seleccionado de la siguiente "Lista 1": -O(CR20R21)m(CR22R23),l(OCH2CH2)p(CR40R4l)pY"(CR24R25)q(CO)lX", -0(CR2oR i)m(CR26=CR27)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4o 4i)p Y"(CR24 25)q(CO)|X -0(CR2oR2,)m(alquinilo)n(CR22R23),1(OCH2CH2)p(CR4oR41)pY"(CR24R25)q(CO)tX", -O(CR20R2l)m(p¡perazino)l(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)pY"(CR24R25)q(CO)tX", -0(CR2oR2,)m(pirrolo)l(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR41)pY"(CR24R25)q(CO)1X", -0(CR2oR2l)mA"m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4l)p"Y"(CR24R25)q(CO),X", -S(CR2oR21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4,)pY"(CR24R25)q(CO),X", -S(CR2oR21)m(CR26=CR27)m.(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4i)p"Y"(CR24R!,5)q(CO)1X" -S(CR2oR2,), (alquinilo),v(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR41)pY"(CR24R25)q(CO)tX", -S(CR2oR2,)m(piperaz¡no)r(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4i)p-Y"(CR24R25)q(CO)lX", -S(CR2oR2,)m(p¡rrolo)1(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4,)p'Y"(CR24R25)q(CO),X", -S(CR2oR2,)mA"m-(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4i)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -NR33(C=0)p-(CR2oR21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4i)p-Y"(CR24Ra5)q(CO)lX"1 -NR33(C=O)p CR2OR2 m(CR26=CR27)nv(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4o ,)p"Y"(CR24R25)q(CO)lX ^R33(C=0)p(CR2oR2,)n1(alqu¡n¡lo)n(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR41)P-Y"(CR24R25)q-(CO)lX" -NR33(C=0)p(CR2oR21)m(piperazino)t(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4,)p"Y,,(CR24R25)q(CO)1X -NR33(C=0)p(CR2oR21)m(pirrolo)r(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4i)p'Y"(CR24R25)q(CO)tX", ^R33(C=0)p.(CR20R2 „,AV(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4,)pY"(CR24R25)q(CO)1X',1 -(CR2oR2,),n(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4,)p-Y"(CR24R25)q(CO),X", -(CR2oR21)m(CR26=CR27)llV(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4,)P"Y"(CR24R25)q(CO)tX", -(CR2oR2))m(alquinilo),1(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4,)pY"(CR24R25)q(CO),X", -(CR2oR2i)m(p¡perazino)l.(CR22R23)(,(OCH2CH2)p(CR4oR4i)p.Y"(CR24R25)q(CO),X,,I -(CR2oR2,)mAV(CR22R23)„(OCH2CH2)p(CR4oR4i)p-Y,,(CR24R25)q(CO)lX"> -(CR2oR21)m(CR2g=N-NR3o)n-(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR4oR4,)p-Y"(CR24R25)q(CO)lX -(CR2oR21)m(CR29=N-NR3o),v(CR26=CR27)nv(CR22R23)rl(OCH2CH2)p(CR4oR4i)p"Y" (CR2„R25)q(CO),X", -(CR^UCR^N- R^ ^ -(CR2oR2,)m(CR29=N-N 30)rf¦A"m··(CR22R23)„(OCH2CH2)p(CR4oR4,)p·Y"(CR24R25)q(CO)tX en donde: m, n, p, q, m', n', t' son un número entero de 1 a 10, o son opcionalmente 0; t, m", n" y p" son 0 o 1 ; X" es seleccionado de OR36, SR37 NR38R39 en donde R36i R37, R38, R39 son H, o alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 20 átomos de carbono y, o, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n, R37, opcionalmente, es un grupo protector tiol cuando t = 1 , COX" forma un éster reactivo seleccionado de N-hidroxisuccinimida ésteres, N-hidroxiftalimida ésteres, N-hidrox¡ sulfo-succinimida ésteres, para-nitrofenil ésteres, dinitrofenil ésteres, pentafluorofenil ésteres y sus derivados, en donde dichos derivados facilitan formación del enlace amida; Y" está ausente o es seleccionado de O, S, S-S o NR32, en donde R32 tiene la misma definición dada anteriormente para R, o cuando Y" no es S-S y t = 0, X" es seleccionado de un grupo maleimido, un grupo haloacelilo o SR37, en donde R37 tiene la misma definición dada anteriormente; A" es un aminoácido seleccionado de glicina, alanina, leucina, valina, lisina, citrulina y glutamato o un polipéptido que contiene entre 2 a 20 unidades de aminoácidos; R20, R21 , R22, R23, R2 , R25, 26, y R27 son iguales o diferentes y son H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 5 átomos de carbono; 29 y R30 son iguales o diferentes y son H o alquilo de 1 a 5 átomos de carbono; R33 es H o alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n, o R33 es -COR3í), - CSR3<). -SOR34, o -SO2R34, en donde R34 es H o alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 20 átomos de carbono o, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n; y uno de R40 y 41 es opcionalmente un grupo funcional negativamente o positivamente cargado y el otro es H o alquilo, alquenilo, alquinilo que tiene 1 a 4 átomos de carbono.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural o aminoácidos que no son de origen natural representados por NH2-C(Raa Raa)-C(=0)OH, en donde Raa Raa son cada uno independientemente H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heteroarilo o heterociclilo. El término "aminoácido" se refiere además al residuo correspondiente cuando un átomo de nitrógeno se elimina de la amina y/o extremo carboxi del aminoácido, tal como -NH-C(Raa'Raa)-C(=0)0-.
El término "catión" se refiere a un ion con carga positiva. El catión puede ser monovalente (por ejemplo, Na+, K+, ere), bivalente (por ejemplo, Ca2+, Mg2+, etc.) o multivalente (por ejemplo, Al3+ etc.). Preferentemente, el catión es monovalente.
El término "cantidad terapéutica eficaz" significa esa cantidad del compuesto activo o conjugado que provoca la respuesta biológica deseada en el sujeto. Tal respuesta incluye alivio de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se trata, prevención, inhibición o un retraso en la reaparición del síntoma de la enfermedad o de la propia enfermedad, un aumento en la longevidad del sujeto comparado con la ausencia del tratamiento, o prevención, inhibición o retraso en la progresión del síntoma de la enfermedad o la propia enfermedad. La determinación de la cantidad eficaz está bien aceptado dentro de la capacidad de las personas expertas en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada que se proporciona en la presente descripción. La toxicidad y eficacia terapéutica del compuesto I puede determinarse por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares y en animales de experimentación. La cantidad eficaz del compuesto o conjugado de la presente invención u otro agente terapéutico que se administra a un sujeto dependerá de la etapa, categoría y estado del mieloma múltiple y características del sujeto, tal como salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia al fármaco. La cantidad eficaz del compuesto o conjugado de la presente invención u otro agente terapéutico que se administra además dependerá de la vía de administración y la forma de dosificación. La cantidad de dosificación y el intervalo puede ajustarse individualmente para proporcionar niveles del compuesto activo que son suficientes para mantener los efectos terapéuticos deseados.
El término "grupo tiol reactivo" se refiere a un grupo funcional que reaccionará con una porción tiol. Los ejemplos de grupo tiol reactivo incluyen, pero sin limitarse a, maleimido, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida, un grupo basado en haloacetilo (por ejemplo, haloacetamido) o un disulfuro (por ejemplo, -SSRd, en donde Rd es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono, fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo, 2-nitropiridilo, 4-nitropiridilo, o 3-carboxi-4-nitropiridilo).
El término "éster reactivo" se refiere a un éster que contiene un grupo saliente que se desplaza fácilmente por un grupo amina o un grupo hidroxilo. Los ejemplos de éster reactivo incluyen, pero sin limitarse a, N-hidroxisuccinimida éster, N-hidroxi sulfosuccinimida éster, nitrofenil éster, dinitrofenil éster, tetrafluorofenil éster, sulfo-tetraflurofenil éster, y pentafluorofenil éster. Preferentemente, el éster reactivo es N-hidroxisuccinimida (NHS) éster.
El término "un fármaco que contiene ¡mina" o "un compuesto citotóxico que contiene ¡mina" se refiere a un compuesto descrito en la presente (sin un grupo enlazador) que tiene al menos un grupo funcional imina. Preferentemente, el fármaco que contiene imina contiene un grupo funcional imina.
Métodos de la presente invención En un primer aspecto, la presente invención se dirige a un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotoxico con un grupo de enlace, el método que comprende reaccionar un compuesto citotoxico con un CBA modificado a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, en donde: a) el CBA modificado comprende un residuo de un agente de reticulación bifuncional unido al CBA, y el residuo comprende el grupo de enlace y un grupo tiol-reactivo; y b) el compuesto citotoxico comprende un grupo tiol, y un grupo representado por: en donde: Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03', S032' o HS02" formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23', POS33' o PS„3" formada con un catión), tio fosfato éster (RiO)2PS(ORi), R¡S-, R¡SO, R¡S02, R¡S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032' formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S2042" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk')(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02 Naf) o una mezcla de estos, en donde R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo.
En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico se produce al reaccionar un compuesto citotóxico que contiene imina que porta el grupo tiol con un reactivo de imina reactiva.
En ciertas modalidades, el método puede comprender además purificar el compuesto citotóxico antes de reaccionar con el CBA modificado.
En ciertas modalidades, (1 ) el compuesto citotóxico que contiene imina es representado por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: (3) el compuesto citotóxico y la porción del grupo de enlace del conjugado es representado por una de las siguientes fórmulas: en donde: X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; R° es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono; R, , R2, R3, R„, R,', R2', R3' y R4' son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R\ un sulfonato -S03" M+, un sulfato -OS03"M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R"; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; R' y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)„-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, o halógeno; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7Rg-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-0-(CH2)na- y -(CH2)n-S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y s son ¡guales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2),r; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-, R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son ¡guales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alq'uinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, o cuando está presente, comprende el grupo tiol, o es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-, un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo es opcionalmente sustituido; en donde al menos uno de X', Y', R6, Rc, R, , R2, R3, R4, RT, R2\ R3' , R4' , L (por ejemplo, a través de un grupo opcionalmente sustituido), está unido al grupo de enlace en las fórmulas (Ib') o (l lb').
En ciertas modalidades, el CBA modificado se prepara reaccionando el CBA con el agente de reticulación bifuncional, dicho agente de reticulación bifuncional comprende el grupo tiol reactivo y un grupo reactivo con el CBA, ambos unidos al grupo de enlace.
En ciertas modalidades, el grupo reactivo con el CBA reacciona con un grupo amino del CBA (tal como el grupo amino de una cadena lateral de Lys), o con un grupo tiol del CBA (tal como el grupo tiol de una cadena lateral de Cys).
En ciertas modalidades, el grupo tiol reactivo es seleccionado del grupo que consiste de maleimido, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida, un grupo basado en haloacetilo y un grupo disulfuro.
Alternativamente, el grupo tiol reactivo puede ser maleimido, haloacetamido o - SSRcl, en donde Rd es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono, fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo, 2-nitropiridilo, 4-nitropiridilo, o 3-carboxi-4-nitropiridilo.
En ciertas modalidades, el CBA modificado es: Un esquema de reacción ilustrativo se muestra en la FIG. 8, en el que en la "etapa uno", un reactivo de imina reactiva (mostrado en el esquema de reacción como un nucleófilo (Nuc:)) se añade al fármaco que contiene un tiol y se deja que reaccione y forme un fármaco modificado que porta el grupo tiol. El fármaco modificado se purifica opcionalmente para eliminar el exceso reactivo de imina reactiva. En la "etapa dos", el anticuerpo se modifica con un enlazador que contiene un grupo tiol reactivo X (maleimida, SSPy, vinil sulfona, etc) , y reacciona con el fármaco modificado que porta el grupo tiol a pH 6-9 para generar un enlace disulfuro o tioéter estable entre el fármaco y el anticuerpo. En la "etapa tres", los productos secundarios (tales como el exceso de reactivo de imina reactiva, el fármaco modificado que no reacciona con el anticuerpo, etc.) se eliminan y se formula el conjugado. El número de las moléculas del fármaco conjugadas con el anticuerpo es igual a n, el cual puede ser, por ejemplo, de 1 - 0.
Un ejemplo representativo de un método de conjugación de dos etapas sé describe en la FIG. 1 6, en donde un anticuerpo se modifica primero con un agente de reticulación bifuncional resultando en un anticuerpo que posee un número deseado de enlazadores adecuados para la reacción con un compuesto dímero que tiene una poción tiol libre. En este ejemplo el anticuerpo huMy9-6 se modificó primero con SPDB para dar un anticuerpo con enlazadores que contienen la porción ditiopiridil. El anticuerpo modificado se expuso después a un tiol libre, tal como 2a, generando el conjugado deseado huMy9-6-SPDB-2a. Los enlazadores reactivos tiol adecuados adicionales que pueden usarse en reacciones similares se incluyen en la FIG 16.
El reactivo de ¡mina reactiva puede mezclarse con el fármaco que porta un grupo tiol en solvente orgánico (por ejemplo, dimetilacetamida, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, etanol, metanol, metileno cloruro, cloroformo, dioxano, o una mezcla de estos) o una mezcla de agua [por ejemplo, agua desionizada) y uno o más solventes orgánicos. Cuando solo se usa el solvente orgánico, el reactivo de imina reactiva puede mezclarse con el fármaco a temperatura ambiente durante 30 min o más (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas o hasta que la reacción se completa). Preferentemente, el tiempo de incubación /reacción es aproximadamente 0-4 h, o 1 -3 h. La mezcla resultante puede usarse inmediatamente para reaccionar con el agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo) modificado con un grupo tiol reactivo tamponado a pH aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente aproximadamente 6 a aproximadamente 9. Alternativamente, la mezcla puede congelarse y almacenarse, por ejemplo, a -20°C o -80°C, y usarse después, mientras que mantiene su reactividad con el agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo). Si una mezcla de agua y de solvente(s) orgánico(s) se usa como un sistema co-solvente miscible (por ejemplo, agua y dimetilacetamida), la mezcla de reacción del fármaco y del reactivo de imina reactiva se usa inmediatamente o se mantiene congelada hasta su uso después de mezclar para reaccionar con el agente de unión celular que porta un grupo tiol reactivo. Si una mezcla de agua y de solvente(s) orgánico(s) se usa como un sistema co-solvente no miscible (por ejemplo, agua y cloruro de metileno), el fármaco y el reactivo de ¡mina reactiva se mezclan por 10 min o más (por ejemplo, aproximadamente 30 min, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas o hasta que la reacción se completa), y la capa acuosa se recoge, cuantifica para el fármaco y reactivo tiol (por ejemplo, por espectroscopia de UV y ensayo de Ellman con DTNB (reactivo 5,5 '-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico)) y se añade al agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo) que porta un grupo tiol reactivo tamponado a pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente aproximadamente 6 a aproximadamente 9.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo de enlace, el método que comprende reaccionar el CBA con un compuesto citotóxico que contiene imina, un reactivo de ¡mina reactiva, y un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo de enlace para formar el conjugado.
En ciertas modalidades, el agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo) se pone en contacto con un fármaco (por ejemplo, el compuesto citotóxico que contiene imina) y un reactivo de imina reactiva para formar una primera mezcla; y la primera mezcla se contacta después con un agente de reticulación bifuncional para formar el conjugado agente de unión celular-fármaco. Preferentemente, el agente de reticulación bifucional se contacta con la primera mezcla inmediatamente después de la formación de la primera mezcla. Alternativamente, la primera mezcla se mantuvo durante un intervalo de tiempo (por ejemplo, aproximadamente 1 -10 min, aproximadamente 1 0-30 min, aproximadamente 30 min a 1 h, aproximadamente 1 a 5 h, aproximadamente 5 a 24 h, o aproximadamente 1 a 2 días) antes de que se ponga en contacto con un agente de reticulación bifuncional.
En ciertas modalidades, el método puede comprender además purificar el conjugado.
Un esquema de reacción ilustrativo se muestra en la FIG. 10, en la cual en la "etapa 1 ", un reactivo de ¡mina reactiva (mostrado en el esquema de reacción como un nucleófilq (Nuc:)) se añade al CBA (por ejemplo, un anticuerpo), un fármaco que contiene un tiol, un agente de reticulación bifuncional que contiene tanto un grupo tiol reactivo X (maleimida, SSPy, vinil sulfona, etc) como un grupo éster reactivo, y se deja que proceda la reacción a pH 6-9 para generar un conjugado estable fármaco-anticuerpo. En la "etapa dos", los productos secundarios (tal como exceso de. reactivo de ¡mina reactiva, el fármaco modificado que no reacciona con el anticuerpo, etc.) se eliminan y se formula el conjugado. El número de moléculas del fármaco conjugadas con el anticuerpo es igual a n, el cual puede ser, por ejemplo, de 1 -10 En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo de enlace, el método que comprende: a) reaccionar un compuesto citotóxico con un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo de enlace, un grupo reactivo con el CBA (tales como un grupo tiol, un grupo maleimida, un grupo haloacetamida, o un grupo amina), y un grupo reactivo con el compuesto citotóxico, para formar un compuesto citotóxico modificado unido covalentemente a un residuo del agente de reticulación bifuncional, en donde el residuo comprende el grupo de enlace y el grupo reactivo con el CBA; en donde el compuesto citotóxico es representado por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: en donde: Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03 , S032" o HS02" formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23', POS33' o PS43" formada con un catión), tio fosfato ester (R¡0)2PS(OR¡), R¡S-, R'SO, R'S02, R¡S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (HS20 o una sal de S2CX,2" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk')(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02' o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCH2S02"Na") o una mezcla de estos, en donde R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R1 puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo; X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono; R i , R2, R3, R4, Ri', R2', R3' y ' son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03' M+, un sulfato -OS03 M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R"; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; R' y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, o, halógeno; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)„-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-0-(CH2)na- y -(CH2)„-S-(CH2)na~; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y Ra son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)„-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-, R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-: L está ausente, o cuando está presente, comprende el grupo tiol, o es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-, un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo es opcionalmente sustituido; y, b) reaccionar el compuesto citotóxico modificado con el CBA a través del grupo reactivo con el CBA, a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, para formar el conjugado.
En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico se produce al reaccionar un compuesto citotóxico que contiene imina que porta el grupo tiol de las siguientes fórmulas con un reactivo de imina reactiva en una mezcla de reacción En ciertas modalidades, el método puede comprender además purificar el compuesto citotóxico antes de la Etapa a).
En ciertas modalidades, el método puede comprender además purificar el compuesto citotóxico modificado antes de la Etapa b).
En ciertas modalidades, la mezcla de reacción se almacena congelada antes que se descongele la mezcla congelada y se lleve a cabo la etapa a).
En ciertas modalidades, el método puede comprender además almacenar la mezcla de reacción de la Etapa a) congelada antes de descongelar y antes que se lleve a cabo la etapa b).
En ciertas modalidades, el agente de reticulación bifuncional es bis-maleimidohexano o BMPEO.
Un esquema de reacción ilustrativo se muestra en la FIG. 1 1 , en el cual en la "etapa 1", un reactivo de ¡mina reactiva (mostrado en el esquema de reacción como un nucleófilo (Nuc:)) se añade a un compuesto citotóxico que contiene un tiol. El compuesto citotóxico resultante se purifica opcionalmente, antes que el compuesto citotóxico reaccione en la "etapa dos" con un agente de reticulación bifuncional (tal como un bismaleimidohexano o BMPEO) para producir un segundo fármaco modificado que porta un grupo tiol-reactivo. Después, en la "etapa tres" se añade un CBA que contiene tiol (tal como anticuerpo) y la reacción se deja que proceda (a pH 6-9) para generar un conjugado fármaco-anticuerpo estable. En la "etapa cuatro", los productos secundarios (tales como exceso del reactivo de ¡mina reactiva, el fármaco modificado que no reacciona con el anticuerpo, etc.) se eliminan y se formula el conjugado. El número de moléculas conjugadas del fármaco al anticuerpo es igual a n, el cual puede ser por ejemplo, de 1 -1 0.
El reactivo de ¡mina reactiva puede mezclarse con el fármaco que porta un grupo tiol reactivo en solvente orgánico (por ejemplo, dimetilacetamida, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, etanol, metanol, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano, o una mezcla de estos) o una mezcla de agua (por ejemplo, agua deslonizada) y uno o más solventes orgánico. Cuando sólo se usa solvente orgánico, el reactivo de imina reactiva puede mezclarse con el fármaco a temperatura ambiente por 30 min o más (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas o hasta que se complete la reacción). Preferentemente, el tiempo de incubación / reacción es aproximadamente 0-4 h, o 1 -3 h. La mezcla resultante puede usarse inmediatamente para reaccionar con el agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo) modificado con un grupo tiol reactivo tamponado a pH aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente aproximadamente 6 a aproximadamente 9. Alternativamente, la mezcla puede congelarse y almacenarse, por ejemplo, a -20°C o -80°C, y usarse después mientras mantiene su reactividad con el agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo). Si se usa una mezcla de agua y de solvente(s) orgánico(s) como un sistema co-solvente miscible (por ejemplo, agua y dimetilacetamida), la mezcla de reacción del fármaco y el reactivo de imina reactiva se usa inmediatamente después de mezclar o se mantiene congelada hasta el uso para reaccionar con el agente de unión celular que porta un grupo tiol reactivo. Si se usa una mezcla de agua y de solvente(s) orgánico(s) como un sistema co-solvente no-miscible [por ejemplo, agua y cloruro de metileno), el fármaco y el reactivo de ¡mina reactiva se mezclan por 1 0 min o más (por ejemplo, aproximadamente 30 min, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas o hasta que la reacción se completa), y la capa acuosa se recoge, se cuantifica para el fármaco {por ejemplo, por espectroscopia UV) y se añade al agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo) que porta un grupo tiol tamponado a pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente aproximadamente 6 a aproximadamente 9.
En un cuarto aspecto, la presente invención se dirige a un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo de enlace, el método que comprende reaccionar un compuesto citotóxico modificado con el CBA a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, en donde el compuesto citotóxico modificado comprende: a) un residuo de un agente de reticulación bifuncional unido al compuesto citotóxico, y el residuo comprende el grupo de enlace y un grupo reactivo seleccionado de un éster reactivo y un grupo tiol-reactivo, y, b) un grupo representado por: en donde: Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03", S032" o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052' formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23', POS33' o PS43' formada con un catión), tio fosfato éster (R'OfePSíOR1), R'S-, R¡SO, fíSOz, R'S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S2042" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCH2S02'Na+) o una mezcla de estos, en donde R1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyeme seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyeme para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo.
En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico modificado se produce al reaccionar un reactivo de imina reactiva con un compuesto citotóxico que contiene ¡mina que porta el grupo de enlace y el grupo reactivo.
En ciertas modalidades, el método puede comprender además purificar el compuesto citotóxico modificado antes de reaccionar con el CBA.
En ciertas modalidades, el éster reactivo puede seleccionarse del grupo que consiste de N-hidroxisuccinimida éster, N-hidroxi sulfosuccinimida éster, nitrofenil éster, dinitrofenil éster, tetrafluorofenil éster, sulfo-tetraflurofenil éster, y pentafluorofenil éster.
Preferentemente, el éster reactivo es N-hidroxisuccinimída éster.
En ciertas modalidades, el grupo tiol reactivo puede seleccionarse del grupo que consiste de maleimido, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida, un grupo basado en haloacetilo y un grupo disulfuro.
En ciertas modalidades, el grupo tiol reactivo puede ser maleimido, haloacetamido o -SSRcl, en donde Rd es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono, fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo, 2-nitropiridilo, 4-nitropiridilo, o 3-carboxi-4-nitropiridilo.
Un esquema de reacción ilustrativo se muestra en la FIG. 7, en el cual en la "etapa uno", un reactivo de ¡mina reactiva (mostrado en el esquema de reacción como un nucleofilo (Nuc:)) se añade al fármaco que contiene un éster reactivo (1 c) y se dejan reaccionar para formar un fármaco modificado. El fármaco modificado puede ser opcionalmente purificado para eliminar el exceso de reactivo de ¡mina reactiva. En la "etapa dos", el fármaco modificado con un éster reactivo reacciona con un anticuerpo tamponado a pH 6-9. En la "etapa tres", los productos secundarios (tales como exceso del reactivo de imina reactiva, el fármaco modificado que no reacciona con el anticuerpo, etc.) se eliminan, y se formula el conjugado. El número de moléculas conjugadas al anticuerpo es igual a n, el cual puede ser por ejemplo, de 1 a 10.
Otro esquema de reacción que representa un método ilustrativo de la presente invención se muestra en la FIG. 9. En la "etapa uno", un reactivo de imina reactiva se añade al fármaco que contiene un grupo tiol reactivo (donde R es un grupo maleimida, SSPy, etc.) y se dejan reaccionar y formar un fármaco modificado. El fármaco modificado se purifica opcionalmente para eliminar el exceso de reactivo de imina reactiva. En la "etapa dos", el fármaco modificado reacciona con un anticuerpo que contiene un tiol reactivo para formar un conjugado anticuerpo-fármaco que tiene el anticuerpo covalentemente unido al fármaco a través de un enlace disulfuro o tioéter estable. Los anticuerpos con el grupo tiol reactivo pueden generarse por los métodos descritos en la presente, por ejemplo, al reducir los disulíuros intercadena, codificar genéticamente la cisteína, o modificar el anticuerpo con enlazadores que contienen tioles o tioles químicamente enmascarados. En la "etapa tres", el fármaco que no . reacciona con el anticuerpo se elimina y se formula el conjugado. El número de moléculas conjugadas del fármaco al anticuerpo es igual a n, el cual puede ser por ejemplo, de 1 -10.
El reactivo de imina reactiva puede mezclarse con el fármaco que porta un éster activado (por ejemplo, N-hidroxisuccinimidil éster, pentafluorofenol éster, sulfo N-hidroxisuccinimidil éster) en un solvente orgánico {por ejemplo, dimetil acetamida, etanol, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano, o una mezcla de estos) o una mezcla de agua (por ejemplo, agua desionizada) y uno o más solventes orgánicos. Cuando se usa sólo solvente orgánico, el reactivo de imina reactiva puede mezclarse con el fármaco a una temperatura de 0 a 1 00 °C, preferentemente a una temperatura de 0 a 30 °C, con mayor preferencia a temperatura ambiente por 5 min o más (por ejemplo, aproximadamente 30 min, 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 1 0 horas, aproximadamente 24 horas o hasta que la reacción se completa). Preferentemente, el tiempo de incubación / reacción es aproximadamente 0-4 h, o 1 -3 h. La mezcla de reacción resultante puede usarse inmediatamente para reaccionar con el agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo) tamponado a pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente aproximadamente 6 a aproximadamente 9. Alternativamente, la mezcla de reacción puede congelarse y almacenarse, por ejemplo, a aproximadamente -20°C o -80°C y usarse después mientras mantiene su reactividad con el anticuerpo. Preferentemente, no se requiere la purificación de los productos intermedios. Cuando se usa una mezcla de agua y solvente orgánico como un sistema co-solvente miscible (por ejemplo, agua y dimetilacetamida), la mezcla de reacción del fármaco y la imina se usa inmediatamente después de mezclar o se mantiene congelada hasta el uso para reaccionar con el agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo). Cuando se usa una mezcla de agua y solvente orgánico como un sistema co-solvente no miscible (por ejemplo, agua y cloruro de metileno), el fármaco y el reactivo de ¡mina reactiva se mezclan por 10 min o más, y la capa acuosa se recoge, se cuantifica para el fármaco y se añade al agente de unión celular (por ejemplo, anticuerpo) tamponado a pH aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente aproximadamente 6 a aproximadamente 9.
En cualquiera de los aspectos anteriores, se puede usar una cantidad adecuada del reactivo de imina reactiva. Por ejemplo, se pueden usar aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 equivalentes molares del reactivo de imina reactiva al fármaco. Preferentemente, se pueden usar aproximadamente 1 a aproximadamente 10 equivalentes molares, con mayor preferencia, aproximadamente 1 a aproximadamente 5 equivalentes molares, y aún con mayor preferencia aproximadamente 3 a aproximadamente 5 equivalentes molares del reactivo de imina reactiva.
Usando este procedimiento general, en cualquiera de los aspectos anteriores, puede usarse cualquiera de los siguientes reactivos de imina reactiva: sulfitos (H2S03, H2S02 o una sal de HS03', S032' o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052' formada con un catión), mono, di, tri, y tetra- tiofosfatos (P03SH3, P02S2H3, POS3H3, PS4H3 o una sal de P03S3", P02S23", POS33' o PS43" formada con un catión), ésteres de tio fosfato ((RiO)2PS(ORi), R'SH, R¡SOH, R'SOZH, R¡S03H) , varias aminas (hidroxil amina (por ejemplo, NH2OH), hidrazina (por ejemplo, NH2NH2), NH20-R', R'NH-R1, NH2-R¡), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2, tiosulfato (H2S203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (H2S204 o una sal de S2042" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=0)NHOH o una sal formada con un catión), idrazida (RkCONHNH2), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02H o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCH2S02~Na+), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de estos, en donde R' y R' son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y son sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' y R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; y Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo (preferentemente, Rk es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; con mayor preferencia, Rk es metilo, etilo o propilo). Preferentemente, el catión es un catión monovalente, tal como Na+ o K+.
Preferentemente, el reactivo de imina reactiva es seleccionado de sulfitos (por ejemplo, NaHS03 o KHS03), hidroxilamina, hidrazina y urea. Con mayor preferencia, el reactivo de imina reactiva es NaHS03 o KHS03.
En una modalidad, los fármacos modificados descritos en cualquiera de los aspectos anteriores se purifican antes de reaccionar con un agente de unión celular. Cualquier método adecuado conocido en la técnica puede usarse para purificar el fármaco modificado. Por ejemplo, el fármaco modificado puede purificarse por cromatografía de columna (por ejemplo, cromatografía en gel de sílice) o HPLC.
En otra modalidad, el conjugado agente de unión celular-fármaco preparado de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores se purifica por filtración en flujo tangencial, cromatografía de adsorción, filtración por adsorción, precipitación selectiva, filtración no absorbente o combinación de los mismos. Preferentemente, filtración en flujo tangencial (TFF, además conocida como filtración de flujo cruzado, ultrafiltración y diafiltración) y/o resinas para cromatografía de adsorción se usan para la purificación de los conjugados.
Cualquier sistema TFF adecuado puede usarse, incluyendo un sistema tipo Pellicon (Millipore, Billenca, Mass.), un sistema Sartocon Cassette (Sartorius AG, Edgewood, N.Y.), y un sistema tipo Centrasette (Pall Corp., East Hills, N.Y.).
Puede utilizarse cualquier resina para cromatografía de adsorción adecuada. Las resinas para cromatograf ía de adsorción preferidas incluyen resinas para cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de inducción por carga hidrófoba (HCIC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de intercambio de iones en modo mixto, cromatografía de afinidad por metal inmovilizado (IMAC), cromatografía con pigmentos como ligando, cromatografía de afinidad, cromatografía de fase reversa, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de resinas de hidroxiapatita adecuadas incluyen hidroxiapatita cerámica (CHT Tipo I y Tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif .), hidroxiapatita HA Ultrogel (Pall Corp., East Hills, N.Y.), y fluoroapatita cerámica (CFT Tipo I y Tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Un ejemplo de una resina HCIC adecuada es la resina MEP Hypercel (Pall Corp., East Hills, N.Y.). Los ejemplos de resinas HIC adecuadas incluyen resinas de Butil-Sefarosa, Hexil-Sefarosa, Fenil-Sefarosa, y Octil Sefarosa (todas de GE Healthcare, Piscataway, N.J.), así como Macro-prep Metil y Macro-Prep t-Butil resinas (Biorad Laboratories, Hercules, Calif.). Los ejemplos de resinas de intercambio de iones adecuadas incluyen resinas de SP-Sefarosa, CM-Sefarosa, y Q-Sefarosa (todas de GE Healthcare, Piscataway, N.J.), y la resina Unosphere S (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Los ejemplos de intercambiadores de iones en modo mixto adecuados incluyen la resina Bakerbond ABx (JT Baker, Phillipsburg N.J.). Los ejemplos de resinas IMAC adecuadas incluyen la resina de Sefarosa quelante (GE Healthcare, Piscataway, N.J.) y la resina Profinity IMAC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Los ejemplos de resinas con pigmentos como ligando adecuadas incluyen la resina Sefarosa Azul (GE Healthcare, Piscataway, N.J.) y la resina Affi-gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif .). Los ejemplos de resinas de afinidad adecuadas incluyen resina Proteína A Sefarosa (por ejemplo, MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, N.J.), donde el agente de unión celular es un anticuerpo, y las resinas de afinidad de lectina, por ejemplo la resina Lentil Lectina Sefarosa (GE Healthcare, Piscataway, N.J.), donde el agente de unión celular porta sitios de unión a la lectina adecuados. Alternativamente, puede usarse un anticuerpo específico para el agente de unión celular. Tal anticuerpo puede inmovilizarse a, por ejemplo, la resina Sefarosa 4 Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, N.J.). Los ejemplos de resinas de fase reversa adecuadas incluyen las resinas C4, C8, y C18 (Grace Vydac, Hesperia, Calif.).
Cualquier resina para cromatografía no adsorbente adecuada puede usarse en los métodos de la presente invención. Los ejemplos de resinas para cromatografía adecuadas incluyen, pero sin limitarse a, las resinas SEPHADEX™ G-25, G-50, G-100, SEPHACRYL™ (por ejemplo, S-200 y S-300), resinas SUPERDEX™ (por ejemplo, resinas SUPERDEX™ 75 y SUPERDEX™ 200), BIO-GEL® [por ejemplo, P-6, P-10, P-30, P-60, y P-100), y otras conocidas por las personas de habilidad ordinaria en la industria. Fármacos que portan una porción enlazadora Los fármacos que pueden usarse en los presentes métodos incluyen los compuestos descritos en US2010/0316656, US 2010/003641 , US2010/0203007, los que se incorporan en la presente como referencia.
En algunas modalidades, los compuesto citotóxicos que pueden conjugarse con los agente de unión celular a través de un grupo de enlace no comprenden el grupo de enlace. En su lugar, un reactivo de reticulación bifuncional (que comprende el grupo de enlace) puede ser requerido para conjugar el compuesto citotóxico sin enlazadores con CBA a través del grupo enlazador.
Así en la primera modalidad específica, un fármaco covalentemente conectado a un grupo de enlace con un grupo reactivo unido a él, que puede usarse en los métodos de la presente invención (tal como en el método del reactivo de la etapa 1 como se describe en el cuarto aspecto de la invención anteriormente), o que puede ser un producto intermedio de los métodos de la invención (tal como, el método descrito en el tercer aspecto de la invención), es un compuesto citotóxico que porta un grupo reactivo, tal como un éster reactivo o un grupo tiol reactivo (colectivamente "el grupo reactivo"), que comprende un grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, capaz de enlazar covalentemente el compuesto citotóxico al CBA, en donde el compuesto citotóxico se representa por cualquiera de las siguientes fórmulas: (l ia) o una sal farmacéuticamente aceptable de estos. Después de reaccionar con el reactivo de ¡mina reactiva, los compuestos citotóxicos pueden ser representados por cualquiera de las siguientes fórmulas: en donde: Y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03', S032' o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3> P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3', P02S23", POS33" o PS43" formada con un catión), tio fosfato éster (RiO)2PS(ORi), R¡S-, FVSO, R¡S02, R¡S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032' formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S2042" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02' o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02"Na+) o una mezcla de estos, en donde R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R1 puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene; 1 a 10 átomos de carbono, arilo heterociclilo o heteroarilo; X' es seleccionado de -H, -OH, un grupo protector amina, el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; Ri , F¡2, R3, R<i, R , 2\ 3' y R son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste dé -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -SO3" M+, un sulfato -OS03"M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R", y el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; R' y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, halógeno o el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-0-(CH2)na- y -(CH2)n~S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y R8 son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR5 y -CRR'N(R5)-; R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-, un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo o alquenilo es opcionalmente sustituido con el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; el fenilo o anillo heterocíclico o heteroarilo puede ser opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente puede ser el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este.
Preferentemente, L está ausente, o es seleccionado de un grupo fenilo opcionalmente sustituido y un grupo piridilo opcionalmente sustituido, en donde el grupo fenilo y piridilo porta el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, o L es un grupo amina que porta el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este (es decir, -N(grupo de enlace)-) , o L es un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y que porta el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este.
Varios compuestos representativos de las fórmulas (la') y (Ha') se enumeran más abajo: En ciertas modalidades, X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, y un grupo protector amina. Preferentemente, X' es -H, -OH, -Me o el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este. Con mayor preferencia, X' es -H; Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Preferentemente, Y' es seleccionado de -H o oxo. Con mayor preferencia, Y' es -H; W es C=0; R, , R2, R3, R4, R , R2', R3', y R4' son cada uno independientemente seleccionados de -H, -NR'R", -NR'(C=0)R, -OR, -SR, -N02 y el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este. Preferentemente, uno de R2, R3, R2' , y F es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este y el resto son -H; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o fenilo; R' y R" son ¡guales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o fenilo; R6 es -ORc o -SRC, en donde Rc es -H, un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono. Preferentemente, R6 es -OMe o -SMe. Aún con mayor preferencia, R6 es -OMe; Z y Z' son -CH2-; A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O-, -S-, -NR5 y oxo (C=0). Preferentemente, A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O- y -S-. Con mayor preferencia, A y A' son -O-; D y D' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 24, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, o un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo son opcionaimente sustituidos con uno o más [por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más) sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de halógeno, -OR, -NR'COR", -SR, y -COR'; Preferentemente, D y D' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Con mayor preferencia, D y D' son alquilo lineal o ramificado que porta 1 a 4 átomos de carbono. Aún con mayor preferencia, D y D' son iguales o diferentes, y son seleccionados de un alquilo lineal que tiene 1 a 4 átomos de carbono; L está ausente, o es seleccionado de un grupo fenilo opcionaimente sustituido y un grupo piridilo opcionaimente sustituido, en donde el grupo fenilo y piridilo portan el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, o L es un grupo amina que porta el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este (es decir, -N (grupo de enlace)-), o L es un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y que porta el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este.
En una segunda modalidad específica, para los dímeros citotóxicos (la) o (Ha), las variables son como las descritas más abajo: W es C=0; R, , R2, R,', R2', R„, y R„' son -H; uno de R3 o R3' es opcionaimente el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este y el otro es -H; R6 es -OMe; Z y Z' son -CH2-; X' es -H; ?' es -?; A y A' son -O-; y el resto de las variables son como las descritas en la primera modalidad específica.
En una tercera modalidad específica, los dímeros citotóxicos (unidos al grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este) de la Fórmula (la') y (lia') son representados por las siguientes fórmulas: en donde: X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, un alquilo, alquenilo 0 alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector amina. Preferentemente, X' es -H, -OH o -Me. Con mayor preferencia, X' es -H; Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Preferentemente, Y' es seleccionado de -H o -Me. Con mayor preferencia Y' es -H; L', L", y L'" son iguales o diferentes y son independientemente seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03'M+, un sulfato -OS03+M", una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R" y el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, siempre que solo uno de L', L" y L'" sea el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este. Preferentemente, L' es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este. Alternativamente, uno de L', L", o L'" es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, mientras los otros son -H. Con mayor preferencia, U es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, y L" y L'" son -H; R6 es -ORc o -SRC, en donde Rc es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono. Preferentemente, R6 es -OMe o -SMe. Aún con mayor preferencia, R6 es -OMe; A y A' son seleccionados de -O- y -S-. Preferentemente, A y A' son -O-; R es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o un grupo PEG (CH2CH20)n-Rc; n es un número entero de 1 a 24; y, Rc es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; R' y R" son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H, -OH, -OR, -NRR9 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos seleccionados de O, S, N y P, un grupo PEG -(CH2CH20)n-Rc, en donde n es un número entero de 1 a 24, preferentemente n es 2, 4 o 8; y RQ es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o un grupo PEG (CH2CH2O)n-R0; G es seleccionado de -CH- o -N-; y el resto de las variables son como las descritas en la primera modalidad específica.
En una cuarta modalidad específica, para los dímeros citotóxicos de la Fórmula (MAa'), L' es representado por la Fórmula: -W'-Rx-V-Ry-J, en donde: W y V son iguales o diferentes, y cada uno está independientemente ausente, o es seleccionado de -CReRe -, -O-, -0-C(=0)-, -C(=0)-0-, -S-, -SO-, -S02-, -CH2-S-, -CH20-, -CH2NRe-, -0-(C=0)0-, -0-(C=0)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, -C(=0)-N(Re)-, -N(Re)-C(=0)0-, -N(C(=0)Re)C(=0)-, -N(C(=0)R9)-, -(O-CH2-CH2)n-, -SS-, o -C(=0)-, o un aminoácido, o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos; R y Rv son iguales o diferentes, y cada uno independientemente está ausente o es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un arilo que porta 6 a 10 átomos de carbono o un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros que porta 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N o S; Re y Re son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)„-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario [por ejemplo, -NHR101) o amino terciario (-NR,0, R102) o un nitrógeno de 5 o 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R'01 y R 102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; preferentemente, R101 y R '02 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; n es un entero de 1 a 24; y J comprende el grupo reactivo unido a este, y es seleccionado de una maleimida, un haloacetamido, -SH, -SSRd, -CH2SH, -CH(Me)SH, -C(Me)2SH, y - COE, en donde -COE representa un éster reactivo seleccionado de, pero sin limitarse a, N-hidroxisuccinimda éster, N-hidroxi sulfosuccinimida éster, nitrofenil (por ejemplo, 2 o 4-nitrofenilo) éster, dinitrofenil (por ejemplo, 2,4-dinitrofenilo) éster, sulfo-tetraflurofenil (por ejemplo, 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenilo) éster, y pentafluorofenil éster, y en donde Rc1 es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono, y, Rd es seleccionado de fenilo, nitrofenilo (por ejemplo, 2 o 4-nitrofenilo), dinitrofenilo (por ejemplo, 2 o 4-nitrofenilo), carboxinitrofenilo (por ejemplo, 3- carboxi-4-nitrofenilo), piridilo o nitropiridilo (por ejemplo, 4-nitropiridilo).
Preferentemente, J es -SH, -SSRd, una maleimida, o un N-hidroxisuccinimida éster.
Preferentemente, Re es -H o -Me; Re es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rk; n es un número entero de 2 a 8; preferentemente Rk es -H, -Me o -CH2CH2-NMe2, y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la tercera modalidad específica.
En otra modalidad preferida, V es un aminoácido o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos. Con mayor preferencia, V es vaiina-citrulina, gly-gly-gly o ala-leu-ala-leu.
En otra modalidad preferida, W es -O-, -N(Re)- o -N(Re)-C(=0)-; Re es -H, un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono, o -(CH2-CH2-0)n-Rk; R* es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; V está ausente, -(0-CH2-CH2)„-, -C(=0)-NH-, -S-, -NH-C(=0)-; Ry está ausente o es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; y J es -SH, -SSRd o -COE (preferentemente, N-hidroxisuccinimida éster). El resto de las variables es como se describió en la cuarta modalidad específica.
En otra modalidad preferida, W es -O-, -N(Re)- o -N(Re)-C(=0)-; Re es H, -Me, o -(CH2-CH2-0)n-Me; n es un número entero de 2 a 6; R* es un alquilo lineal o ramificado que porta 1 a 6 átomos de carbono; V y Ry están ausentes; y J es -COE, preferentemente N-hidroxisuccinimida éster.
En una quinta modalidad específica, L' es representado por la siguiente Fórmula: -W'-[CRrR2..]a-V-[Cy]o.,-[CR3"R4"]b-COE, en donde: R, -, R2-, y R3- son cada uno independientemente -H o -Me; R„- es -H, -Me, -S03H, o -S03"M+, en donde M+ es un catión farmacéuticamente aceptable; a es un número entero de 0-2, b es un número entero de 0-3; y, Cy es un anillo heterocíclico de 5 miembros opcionalmente sustituido que porta un N heteroátomo, preferentemente Cy es En ciertas modalidades, tal como en la cuarta o la quinta modalidades específicas, W es -N(Re)-.
En ciertas modalidades, tal como en la cuarta o la quinta modalidades específicas, Re es -(CH2-CH2-0)2-6- R\ en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas modalidades, tal como en la cuarta o la quinta modalidades específicas, V es -S- o -SS-.
En una sexta modalidad específica, L', tal como en la cuarta o la quinta modalidades específicas, es representado por la siguiente fórmula: - NRe-[CR, R ]a-S-[CR3"R4 ]b-COE.
En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico unido al grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, como en la 4ta, 5ta, y 6ta modalidades específicas, es: en donde Y es -S03M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En una séptima modalidad específica, L', tal como en la cuarta, la quinta, o la sexta modalidades específicas, es representado por la siguiente fórmula: - NRe-[CRrR2 ]a-S-Cy-[CR3 R4 ]b-COE.
En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico unido al grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, como en la 4ta, la 5ta, o la 7ma modalidades específicas, es: en donde Y es -S03M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En una octava modalidad específica, los compuestos citotoxicos de la Fórmula (la) y (l ia) son representados por las siguientes fórmulas: en donde: W está ausente, o es seleccionado de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, - N(C(=0)Re)-, -S- o -CH2-S-, -CH2NRe-; R* está ausente o es seleccionado de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un amino secundario (por ejemplo, -NHR '01) o un grupo amino terciario (-NR101 R 102) o un nitrógeno de 5 o 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo. lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono. Preferentemente, R10' y R 102 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Zs es -H, -SRm; Rm es Rd o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono que porta un éster reactivo, seleccionado de N- hidroxisuccinimida ésteres, N-hidroxiftalimida ésteres, N-hidroxi sulfo-succinimida ésteres, para-'nitrofenil ésteres, dinitrofenil ésteres, pentafluorofenil ésteres; Rc< es seleccionado de fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo o nitropiridilo; n es un número entero de 1 a 24; y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la cuarta modalidad específica.
Preferentemente, Rk es -H o -Me y n es un número entero de 2 a 8. Preferentemente, R es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; y el resto de las variables es como se describió anteriormente en la quinta modalidad específica.
En ciertas modalidades, para los compuestos de la fórmula (IBa) y (IIBa) descritos en la octava modalidad específica, las variables son como las descritas más abajo: X' y Y' son ambos -H; A y A' son ambos -; R6 es -OMe; Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; y el resto de las variables es como se describió anteriormente en la octava modalidad específica.
Preferentemente, Rx es -(CH2)P-(CR'R9)-, en donde Rf y R9 son cada uno independientemente seleccionados de H o un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; p es 0, 1 , 2 o 3. Con mayor preferencia, R1 y Rg son iguales o diferentes y son seleccionados de -H y -Me; y p es 1 .
En una novena modalidad específica, el compuesto citotóxico unido al grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: en donde: Y es seleccionado de -S03M, -S02M o -OS03M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable tal como Na+ o K+; X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, un alquilo, alquenilo 0 alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector amina; Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, a alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 1 0 átomos de carbono; A y A' son seleccionados de -O- y -S-; W está ausente, o es seleccionado de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, -N(C(=0)Re)-, -S- o -CH2-S-, -CH2NRe-; R está ausente o es seleccionado de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-R\ en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (por ejemplo, -NHR101) o amino terciario (-NR '0, R'02) O un nitrógeno de 5 o 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; G es seleccionado de -CH- o -N-; Zs es -H, o es seleccionado de cualquiera de las siguientes fórmulas: (al ); en donde: q es un número entero de 1 a 5; preferentemente q es 2; n es un número entero de 2 a 6; preferentemente n es 4; D es -H o -S03M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na* o K+. En ciertas modalidades, Zs es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: En ciertas modalidades, tal como la novena modalidad específica, W es -N(Re)-. En ciertas modalidades, Re es -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas modalidades, Rk es -H o -Me, n es 4, y q es 2.
En ciertas modalidades, Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas modalidades, Rx es -(CH2)P-(CR'R3)-, en donde Rf y R9 son cada uno independientemente seleccionados de -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; y p es 0, 1 , 2 o 3.
En ciertas modalidades, R1 y R9 son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H y -Me; y p es 1 .
En una décima modalidad específica, las variables de la novena modalidad específica son representadas más abajo: Y es -S03M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable [por ejemplo, Na+); X' y Y' son ambos -H; A y A' son ambos -0-; R6 es -OMe; y Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
En cualquiera de las modalidades anteriores, tal como la 1 ra a la 9na modalidades específicas, Y es seleccionado de -S03M, -S02M y un sulfato -OS03M. Preferentemente, Y es -S03M, en donde M es preferentemente -H, Na+ o K+.
En cualquiera de las modalidades anteriores, tal como la 1 ra a la 10ma modalidades específicas, W, cuando está presente, es C=0.
En cualquiera de las modalidades anteriores, tal como la 1 ra a la 10ma modalidades específicas, Z y Z', cuando están presente, son -CH2-.
En cualquiera de las modalidades anteriores, tal como la 1 ra a la 10ma modalidades específicas, X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, y un grupo protector amina. Preferentemente, X' es -H, -OH, -Me o el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este. Con mayor preferencia, X' es -H.
En cualquiera de las modalidades anteriores, tal como la 1 ra a la 10ma modalidades específicas, Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Preferentemente, Y' es -H u oxo. Con mayor preferencia, Y' es -H.
En cualquiera de las modalidades anteriores, tal como la 1 ra a la 10ma modalidades específicas, A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O-, -S-, -NR5-, y oxo -(C=0)-. Preferentemente, A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O- y -S-. Con mayor preferencia, A y A' son -O-.
En cualquiera de las modalidades anteriores, tal como la 1 ra a la 10ma modalidades específicas, D y D', cuando está presente, son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 24, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, or a alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo son opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de halógeno, -OR, -NR'COR", -SR y -COR'. Preferentemente, D y D' son un alquilo lineal o ramificado que porta 1 a 4 átomos de carbono.
En una décimo primera modalidad específica, los varios grupos de los compuestos citotóxicos de la primera, tercera, y novena modalidad específica, son representados más abajo: W es C=0; R, , R2, R,', R2', R4 y R4' son -H; uno de R3, o R3' es opcionalmente el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este y el otro es -H; R6 es -OMe; Z y Z' son -CH2-; X' es -H; Y' es -H; y A y A' son -O-.
En otra modalidad, el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este como en cualquiera de las modalidades específicas anteriores es cualquiera de aquellos enumerados en la Lista 1 .
En otra modalidad, los dímeros citotóxicos sin una porción enlazadora (tal como las porciones enlazadoras descritas anteriormente) unida a estos pueden reaccionar adicionalmente con un reactivo de reticulación bifuncional para formar un fármaco que porta una porción enlazadora con un grupo reactivo unido a este, para ser usado en los métodos de la presente invención (por ejemplo, para reaccionar adicionalmente con un agente de unión celular para formar el conjugado fármaco-CBA). Alternativamente, los dímeros citotóxicos sin una porción enlazadora (tal como las porciones enlazadoras descritas anteriormente) unida a estos pueden reaccionar adicionalmente con un reactivo de reticulación bifuncional y un reactivo d unión celular en una reacción de una etapa para formar directamente el conjugado fármaco-CBA. En cualquier caso, un reactivo de imina-reactiva puede añadirse a la mezcla de reacción para formar un aducto del reactivo de ¡mina reactiva-fármaco (tal como un aducto de bisulfito) antes de la reacción para crear el conjugado fármaco-CBA. Preferentemente, los dímeros citotóxicos sin una porción enlazadora (tal como las porciones enlazadoras descritas anteriormente) unida a estos pueden pre-incubarse primero con el reactivo de imina reactiva para formar el aducto, antes que la mezcla de reacción se use en las reacciones posteriores para formar el conjugado fármaco-CBA.
Así en una décimo segunda modalidad específica, el compuesto citotóxico que contiene ¡mina es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: y, después de reaccionar con el reactivo de ¡mina reactiva, el compuesto citotóxico es representado por la siguiente fórmula, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: en donde: Y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03", S032" o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052' formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23', POS33' o PS43" formada con un catión), tio fosfato éster (?/0)2?8(??0, R¡S-, FTSO, R¡S02, R¡S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032- formada con un catión), ditionita (HS20 o una sal de S20«,2" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02 o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCH2S02"Na4) o una mezcla de estos, en donde R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arüo, heterociclilo o heteroarilo; preferentemente, Y es un aducto de un bisulfito, un hidrosulfito un metabisulfito, o sales de estos (tal como sal sódica); X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, un grupo protector amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono (por ejemplo, fenilo), un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P. Preferentemente, X' es -H, -OH, o -Me. Con mayor preferencia, X' es -H; Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroariio de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos. Preferentemente, Y' es seleccionado de -H o oxo. Con mayor preferencia, Y' es -H; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono; R,, R2, R3, R,|, R,', R2', R3', y R4' son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc. halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2), -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03' M+, un sulfato -OS03"M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', y -OCONR'R". Preferentemente, 1 , 2, 3, o todos los R2, R3, R2' y R3' es -H; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroariio de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; R' y R" son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO, y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, halógeno, -OR° o -SRC; preferentemente, R6 es -OMe o -SMe. Aún con mayor preferencia, R6 es -OMe; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)„a-, -(CH2)n-0-(CH2)na- y -(CH2)n-S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y R8 son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)„-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-.
Preferentemente, A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O- y -S-. Con mayor preferencia, A y A' son -0-; R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, o cuando está presente, comprende el grupo tiol, y es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)„-, un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 1 8 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo es opcionalmente sustituido.
Las estructuras representativas de tales compuestos citotóxicos que contienen imina se muestran en la Tabla 1 5. Ver los compuestos 1 , 3, 4, 5, y 1 d.
En ciertas modalidades, W es C=0; R , , R2, R3, R4, R r, R2-, Ry. y R* son -H; Z y Z' son -CH2-; A y A' son ambos -O-; W es -(C=0)-; G es -CH-; R6 es -H, o C1 -C10 lineal opcionalmente sustituido, C1 -C10 ramificado, o C3-C7 alquilo cíclico, -O-alquilo, o -O-halo-alquilo, tal como -O e; X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, un alquilo, alquenilo 0 alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector amina; y Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono.
Preferentemente, Y es seleccionado de -S03 , -S02M, o -OS03 , y en donde M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable tal como Na+ o K+.
Preferentemente, Y es -S03 ; M es -H o Na+.
En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico que contiene ¡mina es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: en donde: U, L", y L'" son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, - NR'R", -N02, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03M, un sulfato -OS03M, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', - OCONR'R"; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable; y, G es seleccionado de -CH- o -N-.
En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico, cuando está presente, es representado por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: En ciertas modalidades, uno de L', L", o L'" porta el grupo tiol, mientras los otros son -H. Preferentemente, L' porta el grupo tiol, y L" y L'" son -H.
En ciertas modalidades, A y A' son ambos -O-; R6 es -OMe; y G es -CH-.
En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico que contiene imina puede ser representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: en donde: W está ausente, o cuando está presente, es seleccionado de -CReRe -, -O-, ¦0-C(=0)-, -C(=0)-0-, -S-, -SO-, -S02-, -CH2-S-, -CH20-, -CH2NRe-, -0-(C=0)0-, -0-(C=0)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, -C(=0)-N(Re)-, -N(Re)-C(=0)0-, -N(C(=0)Re)C(=0)-, -N(C(=0)Re)-, -(0-CH2-CH2)n-, -SS-, o -C(=0)-, o un aminoácido, o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos; Rx está ausente, o cuando está presente, es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un arilo que porta 6 a 10 átomos de carbono o un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros que porta 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N o S; Re y Re son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario {por ejemplo, -NHR101) o amino terciario (-NR,01 R102) o un nitrógeno de 5 o 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R10' y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; preferentemente, R101 y R,02 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; n es un número entero del 1 al 24.
En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico, cuando está presente, puede ser representado por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: En ciertas modalidades, Y es seleccionado de -S03M, -S02M o -OS03M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable tal como Na+ o K+; X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, un alquilo, alquenilo 0 alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector amina; Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, a alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; A y A' son seleccionados de -O- y -S-; W está ausente, o es seleccionado de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, - N(C(=0)Re)-, -S- o -CH2-S-, -CH2NRe-; R* está ausente o es seleccionado de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2 )n-RK, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (por ejemplo, -NHR'01) o amino terciario (-NR ,01 R 102) o un nitrógeno de 5 o 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R10' y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; G es seleccionado de -CH- o -N-.
En ciertas modalidades, W es -N(Re)-.
En ciertas modalidades, Re es -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas modalidades, Rk es -H o -Me, n es 4, y q es 2.
En ciertas modalidades, R* es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas modalidades, Rx es -(CH2)p-(CR'R9)-, en donde R1 y R9 son cada uno independientemente seleccionados de -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; y p es 0, 1 , 2 o 3.
En ciertas modalidades, R' y Rs son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H y -Me; y p es 1 .
En ciertas modalidades, Y es -SO3M, -S02M, o un sulfato -OS03M; preferentemente -S03M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, Na+); X' y Y' son ambos -H; A y A' son ambos -O-; R6 es -O e; y Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono. En ciertas modalidades, el agente de reticulación bifuncional es: una porción basada en maleimido seleccionada de: N-succinimidil 4-(maleimidometilo)ciclo exanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometilo)-ciclohexano-1 -carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), N-succinimidil éster del ácido f -maleimidoundecanoico (KMUA) , N-succinimidil éster del ácido r i-male¡m¡dobutírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido i "i-maleimidocaproico (EMCS), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), N-(n-maleim¡doacetox¡)-succinimida éster (AMAS), succinimidil-6-(. '-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidofenilo)-butirato (SMPB), N-(p-maleimidofenilo)isocianato (PMPI), /V-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato; o, una porción basada en haloacetilo seleccionada de: N-succinimidil-4-(yodoacetilo)-aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), y N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), bis-maleimidopolietilenoglicol (BMPEO), BM(PEO)2, BM(PEO)3, ?-(?-maleimidopropiloxi)succinimida éster (BMPS), ácido 5-maleimidovalérico NHS, HBVS, ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butirico hidrazida»HCI (MPBH), Succinimidil-(4-vinilsulfonilo)benzoato (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1 ,4-bis-maleimidobutano (BMB), 1 ,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis-maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), sulfosuccinimidil 4-(N-maleimido-metilo)ciclohexano- 1 - carboxilato (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-yodo-acetilo)aminobenzoato (sulfo-SlAB), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), N-(! -maleim¡dobutriloxi)sulfosuccin¡mida éster (sulfo-GMBS), N-( -maleimidocaproiloxi)sulfosucc¡mido éster (sulfo-EMCS), N-(l -maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-KMUS), sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenilo)butirato (sulfo-SMPB), CX1 -1 , sulfo-Mal y PEGn-Mal.
En ciertas modalidades, el agente de reticulación bifuncional es seleccionado del grupo que consiste de SMCC, Sulfo-SMCC, BMPS, GMBS, SIA, SIAB, A/-succ¡nimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, bis-maleimidohexano o BMPEO.
En ciertas modalidades, el CBA modificado, cuando está presente, es: Los agentes de reticulación bifuncionales pueden ser cualquier enlazador bifuncional conocido en la técnica. Por ejemplo, los enlazadores bifuncionales que pueden usarse para preparar los compuestos de unión al fármaco son aquellos que forman enlaces disulfuro, enlaces tioéter, enlaces lábiles de ácido , enlaces fotolábiles, enlaces lábiles de peptidasa y enlaces lábiles de esterasa con los compuestos citotóxicos (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos 5,208,020; 5,475,092; 6,441 ,163; 6,716,821 ; 6,913,748; 7,276,497; 7,276,499; 7,368,565; 7,388,026 y 7,414,073, las que se incorporan en la presente descripción como referencia). Preferentemente, los agentes de reticulación bifuncionales son los que forman enlaces disulfuro, tioéter y enlaces lábiles de peptidasa con los compuestos citotóxicos. Otros agentes de reticulación bifuncionales que pueden usarse en la presente invención incluyen enlazadores no-escindibles, tales como los descritos en la publicación de Estados Unidos número US 2005/0169933, o enlazadores cargados o enlazadores hidrófilos y se describen en US 2009/0274713, US 2010/01293140 y WO 2009/134976, cada uno de que se incorpora expresamente en la presente como referencia. Los agentes de reticulación bifuncionales que pueden usarse para preparar los compuestos de unión al fármaco de la presente invención incluyen además los descritos en Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbopk, la enseñanza completa del mismo se incorpora en la presente como referencia.
En otra modalidad preferida, el fármaco (con o sin grupo enlazador con un grupo reactivo unido a este) que puede usarse en la presente invención es cualquiera de los compuestos mostrados en las Tablas 1 -7. En otra modalidad preferida, el conjugado agente de unión celular-fármaco que puede ser preparado por la presente invención es cualquiera de los conjugados mostrados en la Tabla 8.
Tabla 1 Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención.
Tabla 2. Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención (continuación).
Tabla 3. Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención (continuación).
Tabla 4. Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención (continuación).
Tabla 5 Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención.
Tabla 6 Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención (continuación).
Tabla 7 Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención (continuación).
Tabla 8 Estructuras de los conjugados representativos en la presente invención.
En cualquiera de los compuestos o conjugados descritos anteriormente en las Tablas 1-8, el enlace doble imina puede reaccionar con / haber reaccionado con cualquier reactivo de ¡mina reactiva (tal como los descritos en la presente descripción) de acuerdo con los métodos de la invención para formar aducios, que incluyen aductos de bisulfito. Tales aductos protegidos de imina en los compuestos de las Tablas 1 -7 pueden usarse en reacciones adicionales de acuerdo con los métodos de la invención para producir los conjugados de la invención. Igualmente, los compuestos que comprenden aducios protegidos de imina pueden usarse en los métodos de la invención para producir los conjugados de la Tabla 8.
En otra modalidad, los fármacos que portan opcionalmente una porción enlazadora {por ejemplo, un grupo enlazador con un grupo reactivo unido a este) que puede usarse en los métodos de la presente invención se representan por la fórmula (A1 ) o (A2): en donde: la doble línea— entre N y C representa un enlace sencillo o un enlace doble, siempre que al menos uno de— entre N y C representa un enlace doble, y cuando es un enlace doble, X está ausente y Y es -H, t cuando es un enlace sencillo, X es -H o una porción protectora de amina que convierte el compuesto en un profármaco; preferentemente, cuando este es un enlace doble, X está ausente y Y es -H, y el enlace doble puede reaccionar con el reactivo de imina reactiva de la invención para formar un aducto (tal como un aducto de bisulfito) antes que el aducto se use en los métodos de la invención para producir conjugados fármaco-CBA; Y es seleccionado de -H, -OR, un éster representado por -OCOR', un carbonato representado por -OCOOR', un carbamato representado por -OCONR'R", una amina o una hidroxil amina representada por -NR'R", amida representada por -NRCOR', un péptido representado por -NRCOP, en donde P es un aminoácido o un polipéptido que contiene entre 2 a 20 unidades de aminoácidos, un tioéter representado por -SR', un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, -S02 , -S03M, -OS03M, un halógeno, ciano, un azido, o un tiol; en donde M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (tal como Na+); o, Y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03", S032" o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS„H2 o una sal de P03S3", P02S23", POS33" o PS„3' formada con un catión), tio fosfato éster (RiO)2PS(ORi), R¡S-, R¡SO, R¡S02, R¡S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (HS20 o una sal de S20,,2" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02'Na+) o una mezcla de estos, en donde R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyeme seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -PO3H; R¡ puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene; 1 a 10 átomos de carbono, arilo heterociclilo o heteroarilo; R, R', y R" son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente 1 -200, o 1 -20), un anillo heteroarilo de 5 ó 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un sistema anular fusionado de 5 a 1 8 miembros, en donde al menos uno de los anillos es aromático, que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxigeno, y azufre, arilo que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, anillo heterocíclico de 3 a 1 8 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos seleccionados de O, S, N y P, en donde el sustituyeme es seleccionado de halógeno, -OR7, -NRBRg, -N02, -NRCOR', -SR,0, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, una sulfonamida representada por -S02NRR', ciano, un azido, -COR , , , -OCOR, , o -OCONR, , R ,2; R7, Re, Rg, R ,0, R y R, 2 son cada uno independientemente seleccionados de -H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 1 0 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OC ^Cr-^),,, en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente 1 -200, o 1 -20), un anillo heteroarilo de 5 ó 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un sistema anular fusionado de 5 a 18 miembros, en donde al menos uno de los anillos es aromático, que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, arilo que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, anillo heterocíclico de 3 a 10 miembros que tiene anillo heterocíclico de 3 a 1 8 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos seleccionados de O, S, N y P, y R 10 es opcionalmente SR 13 o COR ,3; R,3 es seleccionado de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 1 0 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 ó 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un sistema anular fusionado de 5 a 18 miembros, en donde al menos uno de los anillos es aromático, que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, arilo que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos seleccionados de O, S, N y P, opcionalmente R, , es OR,4, en donde R14 tiene la misma definición que R, opcionalmente R" es -OH; W es C=0, C=S, CH2, BH, SO o S02; R, , R2, R3, R4, R,', R2', R3', y R4' son cada uno independientemente seleccionados de -H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente 1 -200, o 1 -20), o un sustituyente seleccionado de un halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR7, -NR8R9, -N02, -NRCOR', -SRio, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, una sulfonamida representada por -S02NRR', ciano, un azido, -COR, ,, -OCOR, , o -OCONR, , R,2, en donde R7, R8, R9, R,0, Rn y R,2 son como se definieron anteriormente, opcionalmente, cualquiera de R, , R2, R3, R4, R,', R2', R3', o R„' es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este (si está presente), el cual puede seleccionarse de una unidad de polipirrolo, poli-indolilo, poli-imidazolilo, polipirrolo-imidazolilo, poli-pirrolo-indolilo o poliimidazolo-indolilo que porta opcionalmente el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; Z es seleccionado de -(CH2)„-, en donde n es 1 , 2 o 3, -CR,5R16, -NR17, -O- o -S-, en donde R15, R16 y R,7 son cada uno independientemente seleccionados de -H, alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente 1 -200, o 1 -20); R6 es -OR, -SR o -NRR', en donde R y R' tienen la misma definición dada anteriormente, opcionalmente R6 es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este (si está presente); X' es seleccionado de -CH2, -N R, -CO, -BH, -SO o -S02 en donde R tiene la misma definición dada anteriormente; Y' es -O-, -CH2-, -N R o -S, en donde R tiene la misma definición dada anteriormente; Z' es -CH2 o -(CH2)n, donde n es 2, 3 o 4, siempre que X', Y' y Z' no sean todos CH2 al mismo tiempo; A y A' son iguales o diferentes y son seleccionados de -O-, -CRR'O, S, -CRR'S, -NR 15 o -CRR'NHR ,5, en donde R y R' tienen la misma definición dada anteriormente y en donde R ,5 tiene la misma definición que R; D y D' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente sustituidos con cualquiera de halógeno, -OR7, -N R8R9, -N02, -N RCOR', -SR 10, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, una sulfonamida representada por -S02N RR', ciano, un azido, -COR , , , -OCOR , , o -0C0NR, , R i2> en donde las definiciones de R7, Rs, R9, R ío, Fti 1 y R 12 son como se definieron anteriormente, o una unidad de polietilenglicol (-0CH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente 1 -200, o 1 -20); L es un grupo fenilo opcional o anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroatomos seleccionados de O, S, N y P que es opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este (si está presente), o es seleccionado de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente sustituidos con cualquiera de halógeno, -OR7, -NR8R9, -N02) -NRCOR', -SR,0, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, una sulfonamida representada por -S02NRR', ciano, un azido, -CORn , OCOR, , o OCONRnR,2, en donde R7, R8, R9, R10, Ri i y R)2 tienen las mismas definiciones dadas anteriormente, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente 1 -200, o 1 -20); opcionalmente, el propio L es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; o sus solvatos farmacéuticamente aceptables, sales, hidratos o sales hidratadas, sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros, enantiomeros o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos; siempre que el compuesto no tenga más de un grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este.
En una modalidad preferida, para fármacos de la fórmula (A1 ) o (A2): la doble línea— entre N y C representa un enlace simple o un doble enlace siempre que, cuando sea un doble enlace, X está ausente y Y es -H, y cuando sea un simple enlace, X es -H o un grupo protector amina, que convierte el compuesto en un profármaco; Y es seleccionado de -H, -OR, NR'R", un sulfito -S03M, o un bisulfito -OS03M , en donde M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (tal como Na+); R es seleccionado de -H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a' 2000 (preferentemente 1 -200 o 1 -20), arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, anillo heterocíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono; W es C=0, CH2 o S02; R, , R2, R3, R4, R,'. R2'. R3' y R„' son cada uno independientemente seleccionados de -H, -N02 o el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este (si está presente); R6 es -OR,8, en donde R,8 tiene la misma definición que R; Z es seleccionado de -(CH2)n, en donde n es 1 , 2 o 3, -CR15R16, -NR17, -O- o -S-, en donde R,5, R,6 y R,7 son cada uno independientemente seleccionados de -H, alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente 1 -200 ó 1 -20); X' es seleccionado de -CH2, o C=0; Y' es -O-, -NR, o -S, en donde R es como se definió anteriormente; Z' es -CH2- o -(CH2)2-; A y A' son cada uno -0-; D y D' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; L es un grupo fenilo opcional o un anillo heterociclo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono que es opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este (si está presente), o es seleccionado de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente sustituidos con cualquiera de halógeno, -OR7, -NR8R9, -N02, -NRCOR', -SRio, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, una sulfonamida representada por -S02NRR', ciano, un azido, -COR, , , -OCOR,, o -OCONR, ,R,2, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente 1 -200 o 1 -20); opcionalmente, el propio L es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este; o sus solvatos farmacéuticamente aceptables, sales, hidratos o sales hidratadas, sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros, enantiómeros o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos.
En otra modalidad preferida, el fármaco de la fórmula (A1 ) o (A2) es representado por los compuestos de las fórmulas (A4) o (A5): en donde: la doble línea— entre N y C representa un enlace simple o un doble enlace siempre que, cuando sea un doble enlace, X está ausente y Y -es H, y cuando sea un simple enlace, X es -H o un grupo protector amina, que convierte el compuesto en un profármaco; Y es seleccionado de -H, -OH, un éter representado por -OR, -NR'R", un sulfito -S03 , o un bisulfito -OSO3M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (tal como Na+); R, R', y R" son seleccionados de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; uno de R2, R3, 2' y R3' es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este (si está presente) y los otros son -H, -NRCOR' o -N02; R6 es -OR, en donde R tiene la misma definición dada anteriormente para; Z es -CH2- o -NR, en donde R tiene la misma definición dada anteriormente para; A es -O- o -NR,5; L es -(CH2)„n-, en donde nn es 0 o un número entero entre 1 y 5, o un alquilo o alquenilo sustituido o insustituido que tiene de 2 a 4 átomos de carbono, en donde el sustituyente es seleccionado de halógeno, -OR7, -NR8R9, -N02, -NRCOR', -SRi0, un sultóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, una sulfonamida representada por -S02NRR', ciano, un azido, -COR, ,, -OCOR,, , o -OCONR, ,R,2; R7, R8, R9, R,0, R, , , R,2 y R,5 tienen la misma definición dada anteriormente; opcionalmente, el propio L es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este (si está presente); uno de L', L", o U" es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este (si está presente), mientras los otros son -H; preferentemente L' es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este (si está presente); y G es -CH- o -N-, o sus solvatos farmacéuticamente aceptables, sales, hidratos o sales hidratadas, sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros, enantiómeros o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos.
En aún otra modalidad preferida, el compuesto de la fórmula (A1 ) o (A2) es representado por los compuestos de las fórmulas (A6) o (A7): til) R2' OCH3 H3CO' en donde: la doble línea ~ entre N y C representa un enlace simple o un doble enlace siempre que, cuando sea un doble enlace, X está ausente y Y es -H, y cuando sea un simple enlace, X es -H o un grupo protector amina, que convierte el compuesto en un profármaco; Y es seleccionado de -H, -OH, un éter representado por -OR, un sulfito -S03, o un bisulfito -OS03; R es seleccionado de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; nn es 0 o un número entero de 1 a 5; uno de R2, R3, R2' y R3' es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este (si está presente) y los otros son -H, -NRCOR', o -N02; uno de L', L" o U" es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este (si está presente), siempre que cuando uno de L\ L" o L'" es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este, los otros son -H (por ejemplo, si U es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este, entonces L" y U" son -H); G es -CH- o -N-, o sus solvatos farmacéuticamente aceptables, sales, hidratos o sales hidratadas, sus isómeros ópticos, racematos, diastereomeros, enantiómeros o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos.
En otra modalidad específica, uno de R2, R3, R2' y R3' de la Fórmula (A4) y (A6) es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este(si está presente), y es representado por la fórmula -W'-R'-V-R^J, y el resto son -H; L" y L'" de la fórmula (A5) y (A7) son -H, y L' es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este (si está presente), y es representado por la fórmula -W'-R"-V-Ry-J en donde: W está ausente, -CRcRe-, -O-, -0-C(=0)-, -S-, -CH2-S-, -0-(C=0)0-, -O-(C=0)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, -N(Re)-C(=0)0-, o -C(=0)-; R* está ausente o es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono; V está ausente, -(CH2-CH2-0)n-, -O-, -0-C(=0)-, -S-, -0-(C=0)0-, 0-(C=0)N(RB)-, -N(Re)-, -N(Ra)-C(=0)-, -N(Re)-C(=0)0-, -C(=0)-, un aminoácido, o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos; Ry está ausente o es un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 0 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rc, n es un entero de 1 a 24; y J es como se describió anteriormente en la cuarta modalidad específica.
Preferentemente, Rc es -H o -Me; Re es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rc; n es un número entero de 2 a 8; y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la cuarta modalidad específica.
En otra modalidad preferida, V es un aminoácido o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos. Con mayor preferencia, V es valina-citrulina, gly-gly-gly o ala-leu-ala-leu.
Preferentemente, J es -SH, -SSRd o -COE como se describió anteriormente.
En otra modalidad específica, uno de R2, R3, R2' y 3' de la fórmula (A4) y (A6) es el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este (si está presente), y es representado por la fórmula -W'-Rx-S-Zs; L" y L'" de la fórmula (A5) y (A7) son -H, y L' es representado por -W'-Rx-S-Zs, en donde las variables son como las descritas en la octava y novena modalidades específicas.
En otra modalidad, los compuestos de la fórmula (A1 )-(A7) (con o sin pre-incubación del reactivo de imina reactiva), si el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este no está ya presente, puede reaccionar adicionalmente con un reactivo de reticulación bifuncional descrito anteriormente para formar un fármaco que contiene imina que porta el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este, que puede usarse en los métodos de la presente invención.
En ciertas modalidades, el fármaco que contiene imina que porta el grupo de enlace con un grupo reactivo unido a este que puede usarse en los métodos de la presente invención es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: ( AS) en donde: El "enlazador" es representado por la fórmula (a1 ), (a2), (a3), (a4), (a5), (a6), (a7) o (a8) descritas anteriormente (en la novena modalidad específica); q es un número entero de 1 a 5; n es un número entero de 2 a 6; D es -H o -S03M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+ o K+; y el resto de las variables es como se describió en la octava o novena modalidades específicas.
Preferentemente, q es 2 y n es 4.
En una modalidad preferida, el enlazador es representado por la fórmula (a 1 ), (a4), (a5), (a9) o (a10) descritas anteriormente.
En ciertas modalidades, para los compuestos de la fórmula (A8) inmediatamente antes descritos, las variables son como las descritas más abajo: W es -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, -N(CORe)-, -S- o -CH2-S-; Rx está ausente o es seleccionado de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Re es -H, a alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-R\ en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino primario, secundario o terciario o un nitrógeno de 5 o 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina; n es un número entero de 1 a 24; y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la modalidad inmediatamente anterior.
Preferentemente, Rk es -H o -Me y n es un número entero de 2 a 8. Preferentemente, Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
En otra modalidad preferida, el enlazador es representado por cualquier fórmula seleccionada de las fórmulas (a1 ), (a4), (a5), (a10) y (a1 1 ) mostradas anteriormente; y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la novena modalidad específica.
En ciertas modalidades, para los compuestos de la fórmula (A8) descritos en las modalidades anteriores, las variables son como las descritas más abajo: X' y Y' son ambos -H; A y A' son ambos -O-; R6 es -OMe; Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; y el resto de las variables es como se describió anteriormente.
Preferentemente, R es -(CH2)p-(CR'Rg)-, en donde R1 y R9 son cada uno independientemente seleccionados de -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; p es 0, 1 , 2 o 3. Con mayor preferencia, R* y R9 son iguales o diferentes y son seleccionados de -H y -Me; y p es 1 .
En otra modalidad preferida, el enlazador es representado por cualquier fórmula seleccionada de las fórmulas (a1 ), (a4), (a5), (a10) y (a1 1 ) mostradas anteriormente; y el resto de las variables son como se describió anteriormente.
En otra modalidad preferida, el fármaco de la fórmula (A1 ), (A2) o (A3) es cualquiera de los compuestos mostrados en las Tablas 1 -13 y el conjugado que puede preparase por el método de la presente invención es cualquiera de los conjugados mostrados en la Tabla 14.
Tabla 1 1 Estructuras de fármacos representativos que pueden usarse en los métodos de la presente invención.
Tabla 12 Estructuras de fármacos representativos que pueden usarse en los métodos de la presente invención, (continuación) Tabla 14 Estructuras de conjugados representativos que pueden prepararse por los métodos de la presente invención.
Cualquiera de los compuestos de las Tablas 1 1 -13 y cualquier conjugado de la Tabla 14 puede tener al menos uno de sus enlaces ¡mina reaccionado con un reactivo de ¡mina reactiva, y formar así un aducto, tal como aducto de bisulfito.
En una modalidad, el fármaco que contiene ¡mina que porta una porción enlazadora es el que tiene un grupo éster reactivo, un tiol o un grupo reactivo tiol descrito anteriormente.
Alternativamente, el fármaco descrito anteriormente puede reaccionar además con el agente de reticulación bifuncional para formar un fármaco que porta una porción enlazadora. Cualquiera de los agentes de reticulación bifuncionales descritos puede ser usado.
En otra modalidad preferida, el fármaco que puede usarse en la presente invención es cualquiera de los compuestos mostrados en la Tabla 15.
Tabla 15 Compuestos fármacos representativos que pueden usarse en los presentes métodos.
AGENTE DE UNION CELULAR La eficacia de los conjugados de la invención como agentes terapéuticos depende de la selección cuidadosa de un agente de unión celular adecuado. Los agentes de unión celular pueden ser de cualquier tipo actualmente conocido, o que se conozcan e incluye péptidos y no-péptidos. Generalmente, estos pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales), linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas (tales como folato etc., que pueden unirse a un receptor de superficie celular para ello, por ejemplo, un receptor de folato), moléculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina), o cualquier otra molécula o sustancia de unión celular.
En ciertas modalidades, los agentes de unión celular son proteínas o polipéptidos, o compuestos que comprenden proteínas o polipéptidos. Preferentemente, las proteínas o polipéptidos comprenden uno o más residuos Lys con grupos -NH2 de cadena lateral. Alternativamente o adicionalmente, las proteínas o polipéptidos comprenden uno o más residuos Cys. Los grupos -SH de cadena lateral de los residuos Cys pueden estar intactos, o pueden estar en un enlace disulfuro que puede reducirse. Preferentemente, la reducción del enlace disulfuro (s) no impacta significativamente de forma negativa la función de unión celular de las proteínas o polipéptidos {por ejemplo, en el caso de la porción de unión del anticuerpo o antígeno de estos, la reducción de los enlaces disulfuro no aumenta sustanclalmente la disociación de cadenas ligeras / cadenas pesadas).
Los grupos -NH2 de la cadena lateral de Lys y/o los grupos -SH de la cadena lateral de Cys pueden unirse covalentemente a los enlazadores, que son a su vez enlazados a los compuestos dímeros de la invención, conjugando así . los agentes de unión celular a los compuestos dímeros de la invención. Cada uno de los agentes de unión celular basados en proteína pueden contener múltiples grupos -NH2 de cadena lateral de Lys y/o grupos -SH de cadena lateral de Cys disponibles para enlazar los compuestos de la invención a través de los agentes de reticulación bifuncionales.
Los ejemplos más específicos de agentes de unión celular que pueden usarse incluyen: anticuerpos policlonales; anticuerpos monoclonales; fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', y F(ab')2, Fv, minicuerpos, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos (Parham, J. Immunol. 131 :2895-2902 ( 1983); Spring y ótros. J. Immunol. 1 13:470-478 (1974); Nisonoff y otros. Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 ( 1 960), Kim y otros, Mol, Cáncer Ther., 7 : 2486-2497 (2008), Cárter, Nature Revs. , 6 : 343-357 (2006)); interferones (por ejemplo ' ? , ? l , f !); linfocinas tales como IL-2, I L-3, IL-4, IL-6; hormonas tales como insulina, TRH (hormona liberadora de tirotropina), MSH (hormona estimulante de los melanocitos), hormonas esteroides, tales como andrógenos y estrógenos; factores de crecimiento y factores estimulantes de colonias tales como EGF, TGF-alfa, FGF, VEGF, G-CSF, M-CSF y GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5: 155-158 (1984)); transferrina (O'Keefe y otros. J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985)); vitaminas, tal como folato; Soportes de proteína basados en una secuencia consenso de repeticiones de fibronectina tipo I I I (FN3) (conocido además como Centyrins; Ver la publicación de patente de Estados Unidos 2010/0255056, incorporada en la presente como referencia); Proteínas de Repetición de Ankirina Diseñadas (DARPins; solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 20040132028; 20090082274; 201 101 18146; 201 10224100, incorporadas en la presente como referencia), C. Zahnd y otros. 2010, Cáncer Res., 70; 1595-1605, incorporado en la presente como referencia); y, Proteínas de soporte con dominio de fibronectina (Adnectinas: solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 20070082365; 20080139791 , incorporadas en la presente como referencia).
Las técnicas de los anticuerpos monoclonales permiten la producción de agentes de unión celular extremadamente específicos en la forma de anticuerpos monoclonales específicos. Particularmente son bien conocidos en el estado de la técnica, las técnicas para crear anticuerpos monoclonales producidos mediante inmunización de ratones, ratas, hámsters o cualquier otro mamífero con el antígeno de interés, tal como la célula diana intacta, los antígenos aislados a partir de la célula diana, los virus enteros, los virus enteros atenuados, y las proteínas virales, tales como las proteínas de la cubierta viral. Las células humanas sensibilizadas también se pueden usar. Otro método para crear anticuerpos monoclonales es el uso de genotecas de fagos de scFv (región variable de cadena sencilla), específicamente los scFv humanos [ver, por ejemplo, Griffiths y otros, patente de Estados Unidos núms. 5,885,793 y 5,969,108; cCafferty y otros, WO 92/01047; Liming y otros, WO 99/06587). Adicionalmente, los anticuerpos revestidos descritos en la patente de Estados Unidos núm. 5,639,641 pueden usarse además, como lo pueden los anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. La selección del agente de unión celular adecuado es una cuestión de elección que depende de la población celular particular que se enfoca, pero en general se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos si está disponible uno adecuado.
Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgG murino que se une específicamente al Antígeno CD33 (J.D.Griffin y otros 8 Leukemia Res., 521 (1984)} y puede usarse si las células diana expresan CD33 como en la enfermedad de leucemia mielógena aguda (AML). El agente de unión celular puede ser cualquier compuesto que se puede unir una célula, ya sea de una manera específica o no específica. Generalmente, estos pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos), interferones, linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas, moléculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina), o cualquier otra molécula o sustancia de unión celular.
Cuando el agente de unión-celular es un anticuerpo, este se une a un antígeno que es un polipéptido y puede ser una molécula transmembrana (por ejemplo, un receptor) o un ligando tal como un factor de crecimiento. Los antígenos ilustrativos incluyen moléculas como renina; una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humano y la hormona de crecimiento bovino; factor liberador de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimuladora de las tiroides; lipoproteínas; alfa-1 -antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora de folículos; calcitonina; hormona lutelnizante; glucagon; factores de coagulación tales como factor vmc, factor IX, factor tisular (TF), y factor de von Willebrands; factores anti-coagulantes tales como proteína C; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como la uroquinasa o la orina humana o activador tisular del plasminógeno (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor-alfa y -beta de necrosis tumoral; encefalinasa; RANTES (expresada y secretada por células T normales reguladas tras la activación); proteína humana inflamatoria de macrófagos (???-1 -alfa); una albúmina sérica tal como la albúmina de suero humano; sustancia inhibidora de Müller; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como la beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como el CTLA-4; inhibina; activina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, o -6 (NT-3, NT4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-ß; factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tales como aFGF y bFGF; receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR2); factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta, que incluye TGF-ß? , TGF-M2, TGF-í i ! i3, TGF-l 14, o TGF-n i i5; factor de crecimiento similar a la insulina -I y -II (IGF-I e IGF-II); des(1 -3)-IGF-l (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, EpCAM, GD3, FLT3, PSMA, PSCA, MUC1 , UC16, STEAP, CEA, TENB2, receptores EphA, receptores EphB, receptor de folato, FOLR1 , mesotelina, cripto, alfavbeta6, integrinas, VEGF, VEGFR, EGFR, receptor de transferrina, IRTA1 , IRTA2, IRTA3, IRTA4, IRTA5; proteínas CD tales como CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD1 1 , CD14, CD19, CD20, CD21 , CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81 , CD103, CD105, CD134, CD137, CD138, CD152 o un anticuerpo que se une a uno o más antígenos asociados al tumor o receptores de superficie celular descritos en la publicación de Estados Unidos núm. 20080171040 o la publicación de Estados Unidos núm. 20080305044 y se incorporan en su totalidad como referencia; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética de hueso (BMP); un interferón, tal como interferón-alfa,-beta y-gamma, factores estimulantes de colonias (CSF) por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL- a IL-10; superóxido dismutasa, receptores de células T; proteínas de superficie de membrana; factor de aceleración de decadencia; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del VIH; proteínas de transporte; receptores de alojamiento; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, tales como CD1 1 a, CD1 1 b, CD1 1 c, CD18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; endoglina, c-Met, 1 GF1 R, PSGR, NGEP, PSMA, PSCA, LGR5, B7H4, y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos anteriormente enumerados.
Además, GM-CSF, que se une a células mieloides puede usarse como un agente de unión celular para células enfermas de leucemia mielógena aguda. IL-2 que se une a células T activadas puede usarse para la prevención del rechazo de trasplante del injerto, para la terapia y prevención de la enfermedad de injerto contra huésped, y para el tratamiento de la leucemia aguda de células T. La MSH, que se une a los melanocitos, puede usarse para el tratamiento del melanoma, como pueden dirigirse los anticuerpos hacia los melanomas. El ácido fólico puede usarse para enfocar el receptor de folato expresado en el ovario y otros tumores. El factor de crecimiento epidérmico puede usarse para enfocar los cánceres escamosos tales como de pulmón y de cabeza y cuello. La somatostatina puede usarse para enfocar los neuroblastomas y otros tipos de tumores.
Los cánceres de mama y testículos pueden enfocarse exitosamente con estrógeno (o análogos de estrógeno) o andrógeno (o análogos de andrógeno), respectivamente, como agentes de unión celular.
En una modalidad, el agente de unión celular son los anticuerpos monoclonales humanizados. En otra modalidad, el agente de unión celular es huMy9-6 u otros anticuerpos relacionados, que se describen en las patentes de Estados Unidos núm. 7,342, 1 10 y 7,557, 189 (incorporadas en la presente como referencia). En otra modalidad, el agente de unión celular es un anticuerpo anti-receptor de folato descrito en las solicitudes provisionales de Estados Unidos núms. 61/307,797, 61/346,595, 61/413, 172 y la solicitud de Estados Unidos núm. 13/033,723 (publicada como US 2012-0009181 A1 ). Las enseñanzas de todas estas solicitudes se incorporan en su totalidad como referencia en la presente.
En ciertas modalidades, el agente de unión celular puede ser un anticuerpo monoclonal o porciones de unión al antígeno de estos que comparten secuencias críticas para la unión al antígeno con un anticuerpo descrito en la presente, tales como huMy9-6 o sus anticuerpos relacionados descritos en las patentes de Estados Unidos núms. 7,342, 1 10 y 7,557,189 (incorporadas en la presente como referencia). Estos anticuerpos derivados pueden tener sustancialmente la misma o idéntica (1 ) regiones CDR3 de cadena ligera y/o cadena pesada, (2) regiones CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena ligera y/o cadena pesada, o (3) regiones de cadena ligera y/o cadena pesada, en comparación con un anticuerpo descrito en la presente. Las secuencias dentro de estas regiones puede contener sustituciones conservativas de aminoácidos, que incluyen sustituciones dentro de estas regiones CDR. Preferentemente, no hay más de 1 , 2, 3, 4, o 5 sustituciones conservativas. En ciertas modalidades, los anticuerpos derivados tienen una región de cadena ligera y/o una región de cadena pesada que es al menos aproximadamente 90%, 95%, 99% o 100% idéntica a un anticuerpo descrito en la presente. Estos anticuerpos derivados pueden tener sustancialmente la misma especificidad de unión y/o afinidad al antígeno diana en comparación con un anticuerpo descrito en la presente. Preferentemente, los valores Kd y/o k„n de los anticuerpos derivados están dentro de 10 veces (ya sea superior o inferior), 5 veces (ya sea superior o inferior), 3 veces (ya sea superior o inferior) o 2 veces (ya sea superior o inferior) de un anticuerpo descrito en la presente. Estos anticuerpos derivados pueden ser anticuerpos completamente humanos, o anticuerpos humanizados, o anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos derivados pueden producirse de acuerdo con cualquiera de los métodos reconocidos en la técnica.
En una modalidad, el anticuerpo anti-receptor de folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente a un receptor 1 humano de folato, en donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN (sec. con núm. de ident.: 1 ); una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQXaai FXaa2Xaa3 (sec. con núm. de ident.: 2); y una CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRAMDY (sec. con núm. de ident.: 3); y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSLMH (sec. con núm. de ident.: 4); una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (sec. con núm. de ident.: 5); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (sec. con núm. de ident.: 6); en donde Xaa , es seleccionado de K, Q, H, y R; Xaa2 es seleccionado de Q, H, N, y R; y Xaa3 es seleccionado de G, E, T, S, A, y V. Preferentemente, la secuencia de CDR2 de la cadena pesada comprende RIHPYDGDTFYNQKFQG (sec. con núm. de ident.: 7).
En otra modalidad, el anticuerpo anti-receptor de folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este gue se une específicamente al receptor 1 humano de folato gue comprende la cadena pesada gue tiene la secuencia de aminoácido de QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTF YNQKFQGKATLTVDKSSNTAH ELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD THTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYR VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSV HEALHNHYTQKSLSLSPGK (sec. con núm. de ident.: 8).
En otra modalidad, el anticuerpo anti-folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este codificado por el ADN de plásmido depositado en la ATCC el 7 de abril de 2010 y que tiene núms. de depósito de ATCC PTA-10772 y PTA- 10773 ? 10774.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-receptor de folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente al receptor 1 humano de folato que comprende la cadena ligera que tiene que tiene la secuencia de aminoácido de DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAG VPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (sec. con núm. de ident.: 9); o DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAG VPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (sec. con núm. de ident.: 10).
En otra modalidad el anticuerpo anti-receptor de folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este que se une específicamente al receptor 1 humano de folato que comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 8, y la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 9 o sec. con núm. de ident.: 10. Preferentemente, el anticuerpo comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 8 y la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 10 (hu FOLR1 ).
En otra modalidad, el anticuerpo anti-receptor de folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este codificado por el ADN del plásmido depositado en la ATCC el 7 de abril de 2010 y que tiene núms. de depósito de ATCC PTA-10772 y PTA-10773 o 10774.
En otra modalidad, el anticuerpo anti-receptor de tolato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno de este que comprende un dominio variable de cadena pesada al menos aproximadamente 90%, 95%, 99% o 100% idéntico a QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTF YNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVS S (sec. con núm. de ident.: 1 1 ), y un dominio variable de cadena ligera al menos aproximadamente 90%, 95%, 99% o 100% idéntico a DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAG VPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (sec. con núm. de ident.: 12); o DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAG VPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (sec. con núm. de ident.: 13).
Un agente de unión celular, tal como un anticuerpo, puede modificarse con un agente de reticulación heterobifuncional que porta un grupo amino reactivo, tales como grupo /V-hidroxisuccinimida (grupo NHS), un maleimido tiol reactivo, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida o un grupo basado en haloacetilo, o un grupo tiol.
Los residuos tiol en el anticuerpo pueden introducirse por una serie de métodos conocidos en la técnica, que incluyen: a) modificación del anticuerpo con reactivos que generan tiol tales como 2-iminotiolano u homocisteína tiolactona, o b) a través de la reacción con un agente de reticulación heterobifuncional que contiene disulfuro tal como SPP, SPDP, SPDB, sulfo-SPDB seguido por reducción del enlace disulfuro con DTT o TCEP para generar un tiol libre, c) mutagénesis para incorporar residuos no nativos de cisteína, tales como los anticuerpos modificados con cisteína (US2007/0092940 A1 , US 2010/0003766 A1 , US 7723485 B2), o d) reducción de los enlaces disulfuro nativos (del Rosario. R.B. y otros, Cáncer Res. Suppl. 1990, 50, 804s -808s).
Un grupo tiol reactivo, tal como maleimido, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida o un grupo basado en haloacetilo en el anticuerpo puede introducirse modificando un anticuerpo con un agente de reticulación heterobifuncional que porta un grupo tiol reactivo (que incluye pero sin limitarse a SPDB, A/-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, sulfo-SMCC, SMCC, LC-SMCC, KMUA, B PS, GMBS, sulfo-GMBS, EMCS, sulfo-EMCS, AMAS, SVSB, SPP, NHS-(PEG)n-mal, donde n = 1 a . 24, preferentemente 2, 4, 8, 12, y 24). Los agentes de reticulación que comprenden una porción basada en maleimido incluyen /V-succinimidil 4-(maleimidometilo)ciclohexano-carboxilato (SMCC), /V-succinimidil-4-(N-maleimidometilo)-ciclohexano-1 -carboxi-(6-amidocaproato), el cual es un análogo de "cadena larga" de SMCC (LC-SMCC), N-succinimidil éster del ácido ' -maleimidoundecanoico (KMUA), /V-succinimidil éster del ácido : i-maleimidobutírico (GMBS), A/-hidroxisuccinimida éster del ácido l -maleimidocaproico (EMCS), m-maleimidobenzoil-/V-hidroxisuccinimida éster (MBS), N-(< -maleimidoacetoxi)-succinimida éster (AMAS), succinimidil-6-(i -maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), /V-succinimidil 4-(p-maleimidofenilo)-butirato (SMPB) , y /V-(p-maleimidofenilo)isocianato (PMPI). Se describen los compuestos reactivos de tiol que contienen una vinilpiridina (Friedman M. y otros Int. J. Peptide Protein Res. 1974, 6, 183-1 85; Mak A. y otros, Anal. Biochem. 1978, 84, 432-440). Se describen los compuestos reactivos de tiol que contienen una porción de vinil sulfona (Masri M. S. J. Protein Chem., 1988, 7, 49-54; Morpurgo, M. y otros, Bioconjugate Chem. 1996, 7, 363-368) Los reactivos de reticulación que comprenden una porción basada en haloacetilo incluyen A/-succinimidil-4-(yodoacetilo)-aminobenzoato (SIAB), /V-succinimidil yodoacetato (SIA), /V-succinimidil bromoacetato (SBA), y /V-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP).
El anticuerpo modificado puede purificarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, filtración en gel, TFF o cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de afinidad.
Todas las referencias citadas en la presente y en los ejemplos que siguen se incorporan expresamente como referencia en su totalidad.
CONJUGADOS DE AGENTE DE UNIÓN CELULAR-FÁRMACO La presente invención proporciona métodos mejorados para producir conjugados de agente de unión celular-fármaco, que comprenden un agente de unión celular unido a uno o más compuestos citotóxicos de la presente invención a través de una variedad de enlazadores, que incluyen, pero sin limitarse a, enlazadores disulfuro, enlazadores tioéter, enlazadores unidos amida, enlazadores lábiles con peptidasa, enlazadores lábiles en medio ácido, enlazadores lábiles con esterasa.
Los conjugados representativos que se pueden presentar usando los métodos de la invención incluyen anticuerpos/compuesto citotóxico, fragmento anticuerpo/compuesto citotóxico, factor de crecimiento epidérmico (EGF)/compuesto citotóxico, hormona estimulante de los melanocito (MSH) /compuesto citotóxico, hormona estimulante de la tiroide (TSH)/compuesto citotóxico, somatostatina/compuesto citotóxico, folato/compuesto citotóxico, estrógeno/compuesto citotóxico, análogo de estrógeno/compuesto citotóxico, andrógeno/ compuesto citotóxico, y análogo andrógeno/ compuesto citotóxico. Un conjugado representativo folato/compuesto citotóxico se representa más abajo, con el aducto opcional-S03Na en el enlace imina de uno de los dos monómeros del fármaco. Un esquema de síntesis representativa para este conjugado se muestra en la FIG. 26. conjugado folato/compuesto citotóxico En una modalidad preferida, la presente invención proporciona métodos para producir conjugados que comprenden un compuesto dimero de indolino benzodiazepina (por ejemplo, formulas (Ib'), (I lio') , (lab'), (I lAb'), (IBb'), (I IBb'), (Xlllb'), (Xb"), etc.) y el agente de unión celular enlazado a través de un enlace covalente. El enlazador puede escindirse en el sitio de las células proliferantes no deseadas/ tumorales para suministrar el agente citotóxico a su diana en un número de maneras. El enlazador puede escindirse, por ejemplo, por un pH bajo (hidrazona), ambiente reductor (disulfuro), proteolisis (enlace amida/péptido) , o a través de una reacción enzimática (esterasa/glucosidasa).
En un aspecto preferido, los conjugados citotóxicos representativos que pueden producirse por los métodos de la invención son compuesto dimero anticuerpo/ indolinobenzodiazepina, compuesto dimero fragmento de anticuerpo/indolinobenzodiazepina, compuesto dimero factor de crecimiento epidérmico (EGF) / indolinobenzodiazepina, compuesto dimero hormona estimulante de los melanocitos (MSH)/indolinobenzodiazepina, compuesto dimero hormona estimulante de la tiroides (TSH)/ indolinobenzodiazepina, compuesto dimero somatostatina / indolinobenzodiazepina, compuesto dimero folato/indolinobenzodiazepina, compuesto dimero estrógeno/indolinobenzodiazepina, compuesto dimero análogo de estrógeno / indolinobenzodiazepina, compuesto dimero inhibidor del antígeno. prostético específico de membrana (PSMA) / indolinobenzodiazepina, compuesto dimero inhibidor matriptasa/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero proteínas de repetición de ankirina diseñada (DARPins) / indolinobenzodiazepina, compuesto dímero andrógeno/ indolinobenzodiazepina y compuesto dímero análogo de andrógeno/ indolinobenzodiazepina.
Así, en la decimocuarta modalidad específica, los métodos de la invención producen un conjugado que comprende: un compuesto citotoxico y un agente de unión celular (CBA), en donde el compuesto citotoxico se une covalentemente al CBA a través de un grupo de enlace, y en donde el compuesto citotoxico y la porción del grupo de enlace del conjugado se representa por cualquiera de las siguientes fórmulas: o una sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde: Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03 , S032" o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052' formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3', P02S23", POS33" o PS43" formada con un catión), tio fosfato éster (RO)2PS(OR¡), R'S-, R'SO, R¡S02, 'SOa, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032' formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S2042" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02 Na+) o una mezcla de estos, en donde R1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo; preferentemente, Y es un aducto de un bisulfito, un hidrosulfito, un metabisulfito, o sales de estos (tal como sal sódica); X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, el grupo de enlace, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, el grupo de enlace, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo de enlace; R1 , R2, R3, R4 , Ri ', R2', R3' y 4' son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03"M+, un sulfato -OS03"M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R" y el grupo de enlace; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; R' y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo de enlace; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR -NR'R", -N02, halógeno o el grupo de enlace; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na--, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-0-(CH2)na- y -(CH2)n-S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y Re son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; Rg es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(RS)-, R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; , L está ausente, es el grupo de enlace, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-, un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo o alquenilo es opcionalmente sustituido con el grupo de enlace; el fenilo o anillo heterocíclico o heteroarilo puede ser opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente puede comprender el grupo de enlace.
Un conjugado representativo se presenta más abajo ("Ab" actúa como un CBA, tal como un anticuerpo): En ciertas modalidades, Y es -S02M, -S03M, o -OS03M.
En ciertas modalidades, los conjugados que pueden sintetizarse por los métodos de la invención incluyen los siguientes: CBA es el agente de unión celular, r es un número entero de 1 a 1 0, Y es H, un aducto de un bisulfito, un hídrosulfito, un metabisulfito, o sales de estos, o - SO3M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas modalidades, L está ausente, o es seleccionado de un grupo fenilo opcionalmente sustituido y un grupo piridilo opcionalmente sustituido, en donde el grupo fenilo y piridilo porta el grupo de enlace, o L es un grupo amina que porta el grupo de enlace (es decir, -N(grupo de enlace)-), o L es un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y que porta el grupo de enlace.
En la décimo quinta modalidad específica, el compuesto citotóxico unido al grupo de enlace es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: en donde: L', L", y L'" son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, - NR'R", -NO2, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03M, un sulfato -OS03M, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', - OCONR'R" y el grupo de enlace, siempre que solo uno de L', L", y L'" sea'el grupo de enlace; y G es seleccionado de -CH- o -N-. Los grupos restantes son como se describieron en la décimo cuarta modalidad específica anterior.
En ciertas modalidades, uno de L', L", o L'" es el grupo de enlace, mientras los otros son -H. Preferentemente, L' es el grupo de enlace, y L" y L'" son -H.
En ciertas modalidades, A y A' son ambos -O-, R6 es -OMe, y G es -CH-.
En la décimo sexta modalidad específica, L' es representado por la siguiente fórmula: -W'-Rx-V-Ry-J, en donde: W y V son iguales o diferentes, y cada uno está independientemente ausente, o es seleccionado de -CReRe'-, -O-, -0-C(=0)-, -C(=0)-0-, -S-, -SO-, - S02-, -CH2-S-, -CH20-, -CH2NR\ -0-(C=0)0-, -0-(C=0)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)- C(=0)-, -C(=0)-N(Re)-, -N(Re)-C(=0)0-, -N(C(=0)Re)C(=0)-, -N(C(=0)Re)-, -(O- CH2-CH2)n-, -SS-, o -C(=0)-, o un aminoácido, o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos; Rx y Ry son iguales o diferentes, y cada uno está independientemente ausente, o es un alquilo, alquenilo, o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un arilo que porta 6 a 10 átomos de carbono o un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros que porta 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N o S; Re y Re son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo, o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario {por ejemplo, -NHR101) o amino terciario (-NR10,R102) o un nitrógeno de 5 o 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R,0) y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; preferentemente, R10' y R'02 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; n es un entero de 1 a 24; y J está covalentemente unido a CBA, y es seleccionado de una succinimida, un acetamido, -S-, -SS-, -CH2S-, -CH(Me)S-, -C(Me)2S-, -NRc1-, -CH2NR°1-, - NRC'N-, y -C(=0)-, en donde Rc1 es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono.
En ciertas modalidades, J es -S-, -SS-, una succinimida, o -C(=0)-.
En ciertas modalidades, Re es -H o -Me; Re es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono o -(CH CH2-0)n-Rk; n es un número entero de 2 a 8; y Rk es -H, -Me o -CH2CH2-NMe2, y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la décimo quinta modalidad específica.
En ciertas modalidades, V es un aminoácido o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos.
En ciertas modalidades, V es valina-citrulina, gly-gly-gly, o ala-leu-ala-leu.
En ciertas modalidades, W es -O-, -N(Re)- o -N(Re)-C(=0)-; Re es H, un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono, o -(CH2-CH2-0),rRk; Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; V está ausente, es -(0-CH2-CH2)n-, -C(=0)-NH-, -S-, -NH-C(=0)-; Ry está ausente o es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; y J es -S-, -SS-, o -C(=0)-, y los grupos restantes son como los definidos en la décimo sexta modalidad específica.
En ciertas modalidades, W es -O-, -N(Re)- o -N(Re)-C(=0)-; Re es -H, -Me, o -(CH2-CH2-0)n-Me; n es un número entero de 2 a 6; Rx es un alquilo lineal o ramificado que porta 1 a 6 átomos de carbono; V y Ry están ausentes; y J es -C(=0)-. Los grupos restantes son como los definidos en la décimo sexta modalidad específica.
En una décimo séptima modalidad específica, L' en la décimo sexta modalidad específica es representado por la siguiente Fórmula: -W-[CR1 »R2»]a-V-[Cy]o.i-[CR3»R4"]b-C(=0)-, en donde: R , , R2 , y R3 son cada uno independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado que porta 1 a 4 átomos de carbono, preferentemente -Me; R ' es -H, un alquilo lineal o ramificado que porta 1 a 4 átomos de carbono (preferentemente -Me), -S03H, o -S03"M+, en donde M+ es un catión farmacéuticamente aceptable; a es un número entero de 0-5 (por ejemplo, de 0 a 2, 3, 4, o 5), y b es un número entero de 0-6 (por ejemplo, de 0 a 3, 4, 5, o 6); y, Cy es un anillo heterocíclico de 5 miembros opcionalmente sustituido que porta un N heteroátomo, preferentemente Cy es En ciertas modalidades, tal como en la décimo sexta o la décimo séptima modalidad específica, W es -N(Re)-.
En ciertas modalidades, tal como en la décimo sexta o la décimo séptima modalidad específica, Re es -(CH2-CH2-0)2-6-Rk, en donde Rk es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas modalidades, tal como en la décimo sexta o la décimo séptima modalidad específica, V es -S- o -SS-.
En una décimo octava modalidad específica, L' en la décimo sexta o la décimo séptima modalidad específica es representado por la siguiente fórmula: - NRe-[CR R2..]a-S-[CRxR4. ] "C(=0)-.
En ciertas modalidades, tal como en la décimo sexta a la décimo séptima modalidades específicas, el conjugado es: anticuerpo anticuerpo en donde r es un número entero de 1 a 10, Y es -S03M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas modalidades, tal como en la décimo sexta a la décimo octava modalidades específicas, el anticuerpo es huMy9-6.
En una décimo novena modalidad específica, U en la décimo sexta o la décimo séptima modalidad específica es representado por la siguiente fórmula: - NRe-[CRr R2-]a-S-Cy-[CR3 R4']h-C(=0)-.
En ciertas modalidades, tal como en la décimo sexta, décimo séptima, y la décimo novena modalidades específicas, el conjugado es: en donde r es un número entero de 1 a 1 0, Y es -S03M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas modalidades, tal como en la décimo sexta, décimo séptima, y la décimo novena modalidades específicas, el anticuerpo es huMy9-6.
En la vigésima modalidad específica, el compuesto citotóxico unido al grupo de enlace es representado por la siguiente fórmula: en donde: W está ausente, o es seleccionado de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, - N(C(=0)Re)-, -S-, -CH2-S-, o -CH2NRe-; R* está ausente o es seleccionado de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un amino secundario (por ejemplo, -NHR101) o un grupo amino terciario (-NR ,0 ,R 102) o un nitrógeno de 5 ó 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o rnorfolina, en donde R'01 y R 102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono; Zs está unido al CBA, y es un enlace, o -SRm-; Rm es Rd o un alquilo lineal o ramificado sustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono que porta un éster reactivo, seleccionado de N-hidroxisuccinimida esteres, N-hidroxiftalimida ésteres, N-hidroxi sulfo-succinimida ésteres, para- nitrofenil ésteres, dinitrofenil ésteres, y pentafluorofenil ésteres; Rd es seleccionado de fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo o nitropiridilo; y n es un número entero de 1 a 24; y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la octava o décimo quinta modalidad específica.
En una vigésimo primera modalidad específica, el compuesto citotóxico unido al grupo de enlace es representado por la siguiente fórmula: en donde: W está ausente, o es seleccionado de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, - N(C(=0)Re)-, -S-, -CH2-S-, o -CH2NRe-; Rx está ausente o es seleccionado de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un amino secundario (por ejemplo, -NHR101) o un grupo amino terciario (-NR^' R 102) o un nitrógeno de 5 o 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R 101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; n es un número entero de 2 a 6; Zs está unido al CBA, y es seleccionado de: un enlace; en donde: q es un número entero de 1 a 5; y, M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+ o K+. En ciertas modalidades, Zs es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: En ciertas modalidades, tal como la 21 ra modalidad específica, W es -N(Re)-.
En ciertas modalidades, tal como la 21 ra modalidad específica, Re es -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas modalidades, tal como la 21 ra modalidad específica, Rk es -H o -Me, n es 4, y q es 2.
En ciertas modalidades, tal como la 21 ra modalidad específica, Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas modalidades, tal como la 21 ra modalidad específica, Rx es -(CH2)P-(CR'R9)-, en donde R' y R3 son cada uno independientemente seleccionados de H o un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; y p es 0, 1 , 2 o 3.
En ciertas modalidades, tal como la 21 ra modalidad específica, R' y R3 son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H y -Me; y p es 1.
En una vigésimo segunda modalidad específica, el conjugado de la fórmula (Vlllb') y (Xb') descrito en la vigésimo primera modalidad específica, las variables son como las descritas más abajo: Y es -SO3M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, Na+); X' y Y' son ambos -H; A y A' son ambos -O-; R6 es -OMe; y R es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono. En ciertas modalidades, tal como la 14la a la 21 ra modalidad específica, Y es seleccionado de -S03M, -S02M y un sulfato -OSO3M. Preferentemente, Y es -S03M. Preferentemente, M es -H, Na+ o K+.
En ciertas modalidades, tal como la 14ta a la 22üa modalidad específica, W, cuando está presente, es C=0.
En ciertas modalidades, tal como la 14t a la 22da modalidad específica, Z y Z', cuando están presentes, son -CH2-.
En ciertas modalidades, tal como la 14la a la 22da modalidad específica, X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, el grupo de enlace, y un grupo protector amina. En ciertas modalidades, X' es -H, -OH, -Me o el grupo de enlace. Preferentemente, X' es -H.
En' ciertas modalidades, tal como la 14la a la 22da modalidad específica, Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Preferentemente, Y' es -H u oxo. Con máyor preferencia, -H.
En ciertas modalidades, tal como la 14ta a la 22da modalidad específica, A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O-, -S-, -N(RS)-, y oxo (C=0). Preferentemente, A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O- y -S-. Con mayor preferencia, A y A' son -0-.
En ciertas modalidades, tal como la 14,a a la 22d modalidad específica, D y D', cuando están presentes, son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 24, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, o un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo son opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de halógeno, -OR, -NR'COR", -SR y -COR'. Preferentemente, D y D' son un alquilo lineal o ramificado que porta 1 a 4 átomos de carbono.
En una vigésimo tercera modalidad específica, para los compuestos de la fórmula (Ibb') o (IlBb'), descritos en la vigésima modalidad específica, las variables son como las descritas más abajo: Y es -S03M; M es -H o Na+; X' y Y' son ambos -H; A y A' son ambos -O-; R6 es -OMe; Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
Preferentemente, RK es -(CH2)p-(CR'Ry)-, en donde Rf y R9 son cada uno independientemente seleccionados de -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; p es 0, 1 , 2 o 3. Con mayor preferencia, Rf y R9 son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H y -Me; y p es 1 .
En una vigésimo cuarta modalidad específica, el conjugado de la presente invención como se describió en la décimo cuarta, décimo quinta, o la vigésimo primera modalidad específica es representado por lo siguiente: Y es -SO3M, en donde M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, Na+); W es C=0; R , , R2, R i', R2\ R4 y R,i' son -H; uno de R3, o R3' es opcionalmente el grupo de enlace y el otro es -H; R6 es -OMe; Z y Z son -CH2; X' es -H; Y' es -H; y A y A' son -0-.
En cualquiera de las modalidades específicas para el conjugado de la invención anterior, tal como la 14la a la 24la modalidades específicas, Y es seleccionado de -SO3M, '-S02M y un sulfato -OS03M. Preferentemente, Y es -S03M.
En ciertas modalidades, tal como la 14ta a la 24ta modalidad específica, M es -H, Na+ o K+.
En cualquiera de las modalidades específicas para el conjugado de la invención anterior, tal como la 14la a la 24la modalidades específicas, W, cuando está presente, es C=0.
En cualquiera de las modalidades específicas para el conjugado de la invención anterior, tal como la 14la a la 24ta modalidades específicas, Z y Z', cuando están presentes, son -CH2-.
En cualquiera de las modalidades específicas para el conjugado de la invención anterior, tal como la 14la a la 24la modalidades específicas, X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, el grupo de enlace, y un grupo protector amina. En ciertas modalidades, X' es -H, -OH, -Me o el grupo de enlace. En ciertas modalidades, X' es -H.
En cualquiera de las modalidades específicas para el conjugado de la invención anterior, tal como la 14la a la 24,a modalidades específicas, Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. En ciertas modalidades, Y' es -H u oxo. En ciertas modalidades, Y' es -H.
En cualquiera de las modalidades específicas para el conjugado de la invención anterior, tal como la 14la a la 24la modalidades específicas, A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O-, -S-, -N(R5)-, y oxo (C=0). En ciertas modalidades, A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O- y -S-. En ciertas modalidades, A y A' son -O-.
En cualquiera de las modalidades específicas para el conjugado de la invención anterior, tal como la 14la a la 24la modalidades específicas, D y D', cuando están presentes, son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)„, en donde n es un número entero de 1 a 24, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo son opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes . independientemente seleccionados del grupo que consiste de halógeno, -OR, -NR'COR", -SR y -COR'. En ciertas modalidades, D y D' son un alquilo lineal o ramificado que porta 1 a 4 átomos de carbono.
En ciertas modalidades, el conjugado de cualquiera de las modalidades descritas, tal como la 14la a la 24la modalidades específicas, puede comprender 1 -10 compuesto citotóxicos, 2-9 compuesto citotóxicos, 3-8 compuesto citotóxicos, 4-7 compuesto citotóxicos, o 5-6 compuesto citotóxicos, cada compuesto citotóxico que comprende el grupo de enlace que une el compuesto citotóxico al CBA, y cada compuesto citotóxico en el conjugado es el mismo.
En ciertas modalidades, el conjugado de cualquiera de las modalidades descritas, tal como la 14la a la 24,a modalidades específicas, puede comprender 1 -10 compuesto citotóxicos, 2-9 compuesto citotóxicos, 3-8 compuesto citotóxicos, 4-7 compuesto citotóxicos, o 5-6 compuesto citotóxicos, cada compuesto citotóxico que comprende el grupo de enlace que une el compuesto citotóxico al CBA, y cada compuesto citotóxico en el conjugado es el mismo.
En ciertas modalidades, el conjugado de cualquiera de las modalidades descritas, tal como la 14la a la 24,a modalidades específicas, puede comprender 1 -10 compuestos citotóxicos totales y compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados), 2-9 compuestos citotóxicos totales y compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados), 3-8 compuestos citotóxicos totales y compuestos citotóxicos (no modificados) que contienen imina, 4-7 compuestos citotóxicos totales y compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados), o 5-6 compuestos citotóxicos totales y compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados), cada uno de los compuesto citotóxicos o compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados) que comprende el grupo de enlace que une los compuestos citotóxicos o compuestos citotóxicos que contienen ¡mina (no modificados) al CBA, y cada uno de los compuestos citotóxicos o compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados) en el conjugado es el mismo (excepto para la modificación (bisulfito)).
En cualquiera de las modalidades de conjugados, tales como la 14la a la 24la modalidades específicas, el agente de unión celular puede unirse a las células diana seleccionadas de células tumorales, células infectadas por virus, células infectadas por microorganismos, células infectadas por parásitos, células autoinmunes, células activadas, células mieloides, células T activadas, células B, o melanocitos; células que expresan el CD4, CD6, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37 , CD38, CD40, CD44, CD56, EpCAM, CanAg, CALLA, o antígenos Her-2; antígenos Her-3; o células que expresan el receptor factor de crecimiento insulínico, receptor del factor de crecimiento epidérmico, y receptor de folato.
En cualquiera de las modalidades de conjugados, tal como la 14la a la 24la modalidades específicas, el agente de unión celular puede ser un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla, o un fragmento de anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una célula diana, un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo quimérico que se une específicamente a la célula diana, un dominio de anticuerpo, un fragmento de dominio de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, una linfoquina, una hormona, una vitamina, un factor de crecimiento, un factor estimulante de colonias, o una molécula de transporte de nutrientes.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo revestido, un anticuerpo de cadena sencilla revestida, o un fragmento de anticuerpo revestido.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla, o un fragmento de este anticuerpo monoclonal.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena sencilla' humanizado, o un fragmento de anticuerpo humanizado.
En cualquiera de las modalidades específicas en la presente, tales como las 1 ra -24la modalidades específicas, el reactivo de imina reactivo es seleccionado del grupo que consiste de sulfitos (H2S03, H2S02 o una sal de HS03", S032" o HS02" formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono, di, tri, y tetra- tiofosfatos (P03SH3, P02S2H3, POS3H3, PS4H3 o una sal de P03S3', P02S23", POS33' o PS„3' formada con un catión), tio fosfato ésteres ((?/0)2?8(??/), FVSH, FTSOH, R¡S02H, R'S03H), varias aminas (hidroxil amina {por ejemplo, NH2OH), hidrazina {por ejemplo, NH2NH2), NH20-R¡, R''NH-R', NH2-R'), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2'tiosulfato (H2S203 o una sal de S2032' formada con un catión), ditionita (H2S204 o una sal de S20 " formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=0)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONHNH2), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02H o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02'Na4), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de estos, en donde R' y R' son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y son sustituidos con al menos un sustituyeme seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' y R' pueden ser además opcionalmente sustituidos con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo.
Preferentemente, el reactivo de imina reactivo es seleccionado de sulfitos, hidroxilamina, hidrazina y urea. Con mayor preferencia, el reactivo de imina reactivo es NaHS03 o KHSO3.
En cualquiera de las modalidades específicas en la presente, tal como la 1 ra - 24la modalidades específicas, se usan aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 equivalentes molares del reactivo de imina reactivo al compuesto citotoxico que contiene imina. En ciertas modalidades, se usan aproximadamente 1 a aproximadamente 10 equivalentes molares del reactivo de imina reactivo al compuesto citotoxico que contiene imina. En ciertas modalidades, se usan aproximadamente 3 a aproximadamente 5 equivalentes molares del reactivo de imina reactivo al compuesto citotoxico que contiene imina.
En cualquier modalidad específica en la presente, tal como la 1 ra - 24ta modalidades específicas, el agente de reticulación bifuncional une el agente citotoxico al agente de unión celular a través de un enlace tioéter, y puede tener una porción basada en maleimido- o haloacetilo, en donde el agente de reticulación bifuncional que tiene la porción basada en maleimido es seleccionado de: N-succinimidil 4-(maleimidometilo)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometilo)-ciclohexano-1 -carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), N-succinimidil éster del ácido [ -maleimidoundecanoico (K UA), N-succinimidil éster del ácido n-maleimidobutírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido 1 1-maleimidocaproico (EMCS), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), N-(n-maleimidoacetoxi)-succinimida éster (AMAS), succinimidil-6-( i-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succmimidil 4-(p-maleimidofenilo)-butirato (SMPB), N-(p-maleimidofenilo)isocianato (PMPI), A/-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato; y, en donde el agente de reticulación bifuncional que tiene la porción basada en haloacetilo es seleccionado de: N-succinimidil-4-(yodoacetilo)-aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N- succinimidil bromoacetato (SBA), y N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), ' bis-maleimidopolietilenoglicol (BMPEO), BM(PEO)2, B (PEO)3, N-(l -maleimidopropiloxi)succinimida éster (BMPS), ácido 5-maleimidovalérico NHS, HBVS, ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butírico hidrazida»HCI (MPBH), Succinimidil-(4-vinilsulfonilo)benzoato (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), ,4-bis-maleimidobutano (BMB), 1 ,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis-maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), sulfosuccinimidil 4-(N-maleimido-metilo)ciclohexano-1 -carboxilato (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-iodo-acetilo)aminobenzoato (sulfo-SIAB), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), N-(i -maleimidobutriloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-G BS), N-(¡ -maleimidocaproiloxi)sulfosuccimido éster (sulfo-EMCS), N-(l -maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-KMUS), sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenilo)butirato (sulfo-SMPB), CX 1 -1 , sulfo-Mal y PEGn-Mal.
En ciertas modalidades, el agente de reticulación bifuncional es seleccionado del grupo que consiste de SMCC, Sulfo-SMCC, BMPS, GMBS, SIA, SIAB, A/-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, bis-maleimidohexano o BMPEO.
En cualquiera de las modalidades, tales como la 1 ra - 24la modalidades específicas, el conjugado se purifica por filtración en flujo tangencial, cromatografía de adsorción, filtración por adsorción, precipitación selectiva, filtración no absorbente o combinación de estos. Preferentemente, el conjugado se purifica por filtración en flujo tangencial y/o cromatografía de adsorción.
En ciertas modalidades, tales como la 1 ra - 24ta modalidades específicas, el agente de unión celular (CBA) que porta el grupo tiol reactivo es: Los compuestos o los conjugados preparados por los métodos de la invención específicamente incluyen: en donde r es un número entero de 1 a 10, Y es -H o -S03M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En una 25la modalidad específica, la invención proporciona un método para preparar un conjugado de la siguiente fórmula: anticuerpo ? el método que comprende reaccionar un compuesto citotóxico de la siguiente fórmula, con un CBA modificado de la siguiente fórmula, respectivamente, a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, en donde: r es un entero de 1 a 1 0; Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HSO3, HS02 o una sal de HS03', SO32" o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052' formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (PO3SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3', P02S23", POS33" o PS43" formada con un catión), tio fosfato éster (ROfePSÍOR1), R¡S-, R¡SO, R'S02, R¡S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032' formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S20„2' formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02' o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCH2S02"Na+) o una mezcla de estos, en donde R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo; preferentemente Y es -S03M; y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas modalidades, Y es -S03M; y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas modalidades, el compuesto citotóxico se produce al reaccionar un reactivo de imina reactivo con un compuesto citotóxico que contiene imina de la siguiente fórmula: En ciertas modalidades, el CBA es huMy9-6.
En una 26la modalidad específica, la invención proporciona un método para preparar un conjugado de la siguiente fórmula: el método que comprende reaccionar el CBA con un compuesto citotóxico que contiene ¡mina, un reactivo de ¡mina reactivo, y un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo de enlace para formar ei conjugado, en donde: el compuesto citotóxico que contiene ¡mina es: el agente de reticulación bifuncional es: el reactivo de imina reactivo es seleccionado de: sulfitos (H2S03, H2S02 o una sal de HS03 , S032" o HS02" formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono, di, tri, y tetra- tiofosfatos (P03SH3, P02S2H3, POS3H3, PS4H3 o una sal de P03S3', P02S23', POS33" o PS43" formada con un catión), tio fosfato ásteres ((ROJaPSíOR1), R¡SH, R'SOH, R'SOsH, R¡S03H), varias aminas (hidroxil amina {por ejemplo, NH2OH), hidrazina (por ejemplo, NH2NH2), Nh^O-R1, R'^H-R1, NH2-R'), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2' tiosulfato (H2S203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (H2S204 o una sal de S20„2' formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=0)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONHNH2), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02H o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02'Na+), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de estos, en donde R' y R' son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y son sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' y Rr pueden ser además opcionalmente sustituidos con un sustituyeme para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo.
En ciertas modalidades, Y es -S03 ; y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas modalidades, el CBA es huMy9-6.
CITOTOXICI DAD IN VITRO DE COMPUESTOS Y CONJUGADOS Los compuestos citotóxicos y los conjugados de agente de unión celular-fármaco producidos por los métodos de la invención pueden evaluarse por su capacidad para suprimir la proliferación de diversas líneas celulares de cáncer in vitro. Por ejemplo, las líneas celulares tales como la línea de carcinoma de colon humano COLO 205, la linea celular de rabdomiosarcoma RH-30, y la línea celular de mieloma múltiple MOLP-8 pueden usarse para la evaluación de la citotoxicidad de estos compuestos y conjugados. Las células a evaluarse se pueden exponer a los compuestos o conjugados por 1 -5 días y las fracciones sobrevivientes de células se miden en ensayos directos por métodos conocidos. Los valores de IC50 pueden calcularse después a partir de los resultados de los ensayos. Alternativamente o adicionalmente, un tamizaje de la sensibilidad de la línea celular in vitro tal como uno descrito por el Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos (ver Voskoglou-Nomikos y otros, 2003, Clinical Cáncer Res. 9: 42227-4239, incorporado en la presente como referencia) puede usarse como una de las guías para determinar los tipos de cánceres que pueden ser sensibles al tratamiento con los compuestos o conjugados producidos por los métodos de la invención.
Los ejemplos de potencia y especificidad de la diana in vitro de los conjugados anticuerpo-agente citotóxico producidos por los métodos de la presente invención se muestran en la FIG. 17. Todos los conjugados son extremadamente citotóxicos en las células de cáncer positivas al antígeno con un IC50 en el intervalo picomolar bajo. Las líneas celulares negativas al antígeno permanecieron viables cuando se expusieron a los mismos conjugados. Los dímeros de indolinobenzodiazepina mostraron potencia específica a la diana siendo 1 60 veces menos potentes cuando se bloquearon con el anticuerpo huMy9-6 sin conjugar (anti-CD33) (FIG. 17) y 40 veces menos potentes cuando se bloquearon con el anticuerpo FOLR1 sin conjugar (anticuerpo anti-receptor folato) (resultado no mostrado) . Por ejemplo, el conjugado hu y9-6-SPDB-1 f que porta los aductos de bisulfito mató las células HL60/QC positivas al antígeno con un valor IC50 de 10.5 p , mientras que la adición de un exceso de anticuerpo huMy9-6 sin conjugar redujo este efecto citotóxico (IC5o = 1 .69 nM) , demostrando la especificidad del antígeno (FIG. 17A). Adicionalmente, el conjugado huMy9-6-SPDB-1 f es además altamente potente tanto hacia la línea celular HL60/ATCC con un valor IC50 de 21 p como a la línea celular NB-4 con un valor IC50 de 190 pM (FIGS. 1 7B y 17C ).
El efecto de la conjugación en la unión del anticuerpo se midió comparando la unión del anticuerpo huMy9-6 sin conjugar como el conjugado huMy9-6-SPDB-1 f hacia la l ínea celular HL60/QC (FIG. 18) . El análisis FACS reveló que no existe cambio en la capacidad de unión del conjugado con el anticuerpo desnudo indicando que no existe compromiso en la unión debido a la conjugación del agente citotóxico al anticuerpo.
En un ejemplo, se midió la eficacia in vivo de un conjugado agente de unión celular/agente citotóxico. Ratones desnudos que portan tumores HL60/QC humanos se trataron con el conjugado huMy9-6-SPDB-1 f y se observó una regresión significativa del tumor en dosis múltiples mientras que en los ratones sin tratar los tumores crecieron rápidamente (FIG. 1 9). Se observó actividad a dosis tan bajas como 20 í lg/kg que es al menos 35 veces inferior que la dosis máxima tolerada.
El efecto de la saturación de imina hacia la tolerabilidad se muestra en la Tabla 9. Di-imina huFOLRI -fármaco 1 se probó en dosis múltiples y se encontró que todas son altamente tóxicas quedando solamente supervivientes en el grupo de ensayo más bajo probado a 50 f :g/kg. En contraste, se encontró que los conjugados mono-imina huFOLRI -Fármaco2 parcialmente reducido y huFOLR1 -SPDB-IGN (huFOLR1 -SPDB-1 f) tienen una tolerancia significativamente mejorada con el conjugado huFOLR1 -SPDB-IGN (huFOLRI -SPDB-l f) que muestra 100% de supervivencia animal a las dosis más altas probadas de 560 g/kg.
EJEMPLIFICACIÓN EJEMPLO 1 El anticuerpo My9-6 humanizado a 2 mg/ml se conjugó con 9 equivalentes molares de 2-NHS éster (compuesto 2) por 3 h a 25°C en 85% de PBS, pH 7.4, que contiene 15% de DMA (v/v) y se purificó después en una columna de desalinización G25 con PBS, pH 7.4, para eliminar el fármaco no reactivo o hidrolizado, sin conjugar. El conjugado se dializó en tampón 10 mM de Histidina, 250 mM de Glicina, pH 6.5, que contiene 1 % de sacarosa. La relación fármaco/anticuerpo en el conjugado (DAR) se determinó como 1 .4 DAR basado en la absorbancia UV a 280 y 320 nm y el cálculo usando los coeficientes de extinción del fármaco y anticuerpo a 280 nm y 320 nm.
El conjugado se analizó para el % de monómero por cromatografía de exclusión molecular (SEC) en una columna TSK-Gel G300SWXL (7.8 mm x 300 mm, 5 < lm de tamaño de partícula) usando una fase móvil ¡socrática de 400 mM de perclorato sódico, 150 mM de tampón de fosfato potásico, pH 7.0, a 1 ml/min. Los porcentajes de monómero (% de monómero) y agregado se determinaron monitoreando la absorbancia UV de todas las especies de anticuerpos a 280 nm y midiendo el área bajo la curva (AUC) de cada pico de anticuerpo. Además, los porcentajes (%) del fármaco 2 tanto en el monómero como en el agregado se determinaron monitoreando la absorbancia UV de todas las especies de anticuerpos a 320 nm y 280 nm y midiendo la AUC de cada pico de anticuerpo. El % de monómero del conjugado huMy9-6-2 que contiene 1 .4 DAR fue 91 %. El % de 2 en el monómero fue 80%.
Para el ensayo con el fármaco libre (sin conjugar), el conjugado se extrajo con acetona para eliminar la proteína, se secó, y reconstituyó en la fase móvil y se inyectó en una columna HPLC de fase reversa VYDAC 208TP C8 (4.6 x 250 mm, 7 nm de tamaño de partícula) usando un gradiente lineal de 20% de acetonitrilo y 80% de desionizada hasta 100% de acetonitrilo, todos conteniendo 0.025% de ácido acético, a 1 ml/min por 48 min y se comparó con los estándares de fármacos metil-éster. El porcentaje de fármaco libre, sin conjugar en el conjugado se determinó como <1 % del fármaco conjugado.
El conjugado huMy9-6-2 con 1.4 de relación fármaco/anticuerpo (DAR) se analizó por espectrometría de masas (MS) después de la deglicolisación (FIG. 1 A). La MS del conjugado mostró el anticuerpo sin conjugar (DO) como el pico más alto, con un pico más pequeño D1 (anticuerpo con 1 fármaco enlazado), y picos mucho más pequeños D2 y D3 de 2 y 3 fármacos unidos por anticuerpo. La eficacia de conjugación fue inferior con un conjugado DAR de 1 .4 después de la conjugación con exceso molar de 9 veces del 2-NHS éster sobre el anticuerpo.
EJEMPLO 2 Para la conjugación del 2-NHS éster (compuesto 2) usando bisulfito sódico, el 2-NHS éster (compuesto 2) se pre-incubó con 0.9 equivalentes molares de bisulfito sódico (NaHS03 preparado recientemente en agua desionizada) con 66% de DMA (dimetilacetamida) en agua por 30 min a 25°C. El anticuerpo HuMy9-6 a 2 mg/ml se conjugó con 9 equivalentes molares de 2-NHS éster (con adición de NaHS03) por 3 h a 25°C en 85% de PBS, pH 7.4, 15% de DMA (v/v) y se purificó después en una columna de desalineación G25 con PBS, pH 7.4 para eliminar el fármaco no-reactivo o hidrolizado. El conjugado se dializó en tampón de 10 mM de histidina, 250 mfvl de glicina, 1 % de sacarosa, pH 6.5.
La DAR del conjugado huMy9-6-2 preparado usando bisulfito sódico se midió por espectrofotometría UV a 280 y 320 nm y se calculó que era 3.1 DAR. El % de monómero del conjugado fue 95% y el % 2 en el monómero fue 91 %. La MS del conjugado preparado usando bisulfito sódico a continuación de la deglicosilación mostró el pico más alto de D1 con un fármaco enlazado, y además los picos D2, D3, D4, D5, D6 con 2-6 fármacos enlazados por anticuerpo (FIG. 1 B).
El conjugado huMy9-6-2 preparado con bisulfito sódico mostró una incorporación de fármaco de 3.1 DAR mucho mayor que el conjugado preparado sin bisulfito sódico con 1 .4 DAR. La MS del conjugado de 3.1 DAR preparado con bisulfito sódico mostró picos del conjugado de 1 -6 fármacos enlazados con el pico D1 más alto de 1 fármaco enlazado. A diferencia, la MS del conjugado de 1.4 DAR preparado sin bisulfito sódico mostró el pico más alto de anticuerpo sin conjugar (DO) y picos D1 , D2 y D3 mucho más cortos del conjugado de fármaco enlazado. El % de fármaco en el monómero para el conjugado huMy9-6-2 preparado con bisulfito sódico fue 91 o, lo cual fue superior que el 8'0% de fármaco en el monómero para el conjugado huMy9-6-2 preparado sin bisulfito sódico. La calidad del conjugado global para el conjugado huMy9-6-2 preparado con bisulfito sódico, por lo tanto, fue mucho superior que por el procedimiento tradicional de conjugación sin bisulfito sódico.
Las conjugaciones de los NHS ésteres de fármacos diversos (1 , 2, 3, y 4) con el anticuerpo se realizaron en presencia de bisulfito sódico (NaHS03) y se compararon con el método tradicional de conjugación sin NaHS03. Los resultados se muestran en la Tabla 16. En todos los casos, la adición de bisulfito sódico en la conjugación mostró conjugados con calidad significativamente mejor de DAR superior y % superior de fármaco en el monómero que los conjugados preparados sin la adición de bisulfito sódico.
TABLA 1 6. Comparaciones de las conjugaciones del anticuerpo con diversos NHS ésteres del fármaco sin y con adición de bisulfito sódico (NaHS03) El conjugado huMy9-6-2 preparado con bisulfito sódico mostró una citotoxicidad in vitro similar a la del conjugado preparado sin bisulfito sódico (FIG. 2). Por lo tanto un conjugado de mejor calidad de DAR superior y % superior de fármaco en el monómero se preparó usando bisulfito sódico sin pérdida alguna de la potencia de citotoxicidad. Un conjugado anticuerpo anti-CD22-2 preparado con bisulfito sódico mostró una citotoxicidad in vitro similar a la del conjugado preparado sin bisulfito sódico (FIG. 3).
El conjugado huMy9-6-2 preparado usando bisulfito sódico se analizó mediante SDS-PAGE no-reductor usando un analizador en gel chip. El conjugado mostró sólo la banda del anticuerpo intacta; no se observaron bandas de cadenas pesada y ligera, mostrando una ventaja inesperada de que el bisulfito sódico adicionado no causó ninguna reducción indeseada de los enlaces disulfuros ¡ntercatenarios en el anticuerpo nativo. 2-NHS éster o SPDB-NHS ásteres de 3, 4, 1 , y 5 se pre-incubaron con 0.5 a 3 equivalentes molares de bisulfito sódico (NaHS03 preparado recientemente en agua desionizada) con 66-98% de DMA (dimetilacetamida) en agua de 15 min a 4 h a 25"C. Algunas de estas reacciones se dejaron además toda la noche a 4 'C y usaron para las conjugaciones 20 h después.
El 2-NHS éster en DMA tratado con bisulfito sódico o sin adicionar bisulfito sódico se analizó por HPLC usando una columna de fase reversa VYDAC C8 con un gradiente lineal de 20% de acetonitrilo y 80% de agua desionizada hasta 1007o de acetonitrilo, todo conteniendo 0.025% de ácido acético, a 1 ml/min por 48 min. Como se muestra en la FIG. 4, el 2-NHS éster parental eluyó en -23 min. Después de 30 min de tratamiento con 0.9 equivalentes molares de NaHS03 en 66% de DMA en agua a 25°C, una mayoría del 2-NHS se convirtió en la forma sulfonada, más polar que eluyó en -14 min. De forma inesperada, no se observó ningún pico indeseable del hidrolizado sulfonado 2. Por lo tanto, se observó una reacción sorprendentemente favorable de bisulfito sódico hacia la adición del enlace ¡mina sin reacción con el NHS éster.
Del mismo modo los NHS esteres del fármaco se trataron con los reactivos de imina reactiva distinto al bisulfito sódico antes de la conjugación con el anticuerpo. Un enfoque alternativo de la conjugación es tratar una mezcla del NHS éster del fármaco y anticuerpo con el bisulfito sódico u otro reactivo de imina reactiva.
EJEMPLO 3 El conjugado de anticuerpo con disulfuro enlazado-SPDB-1 se preparó usando el 1 -SPDB-NHS éster sintetizado (compuesto 1 c). El 1 -SPDB-NHS éster se pre-trató con 3 equivalentes molares de bisulfito sódico (usando una solución de NaHS03 recientemente preparada en agua) con 96-98% de DMA en agua por 4-5 h a 25°C. El 1 -SPDB-NHS éster tratado con bisulfito sódico en DMA se analizó usando la columna de HPLC de fase reversa VYDAC C8 con un gradiente lineal de 20% de acetonitrilo y 80% de agua desionizada que contiene 0.025% de ácido acético a 1 ml/min por 48 min. El análisis de HPLC de fase reversa mostró sólo la reacción deseada de adición de bisulfito en el enlace ' de ¡mina, sin la reacción indeseada del bisulfito con el NHS éster.
Para la conjugación, un anticuerpo humanizado a 2 mg/ml reaccionó con 5-7 equivalentes molares de 1 -SPDB-NHS éster (pre-tratado con NaHS03) por 6 h a 25"C en 85% de tampón acuoso PBS, pH 7.4, que contiene 1 5% de A/,A/-dimetilacetamida (DMA) y se purificó después en una columna de filtración en gel G25 con PBS, pH 7.4, para eliminar el fármaco sin reaccionar o hidrolizado. Los conjugados de anticuerpo humanizado-SPDB-1 se dializaron en tampón de 1 0 mM de Histidina, 250 mM de Glicina, 1 % de sacarosa, pH 6.5. Se midieron las relaciones fármaco/anticuerpo (DAR) de los conjugados y eran 2.2-2.9 mediante las mediciones de absorbancia UV a 280 y 320 nm y usando los coeficientes de extinción del fármaco y anticuerpo a 280 nm y 320 nm. El porcentaje de monómero en la preparación de conjugado se determinó por SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) como 90%. Basado en la absorbancia UV del pico de monómero en SEC se demostró además que el pico de monómero del conjugado tuvo moléculas de fármaco enlazadas. El % de fármaco sin conjugar por extracción con acetona y HPLC de fase reversa demostró ser menos de 1 %.
La MS del conjugado de anticuerpo deglicosilado-SPDB-1 preparado con bisulfito sódico adicionado antes de la conjugación mostró un conjugado mucho superior que el obtenido sin la conjugación con bisulfito sódico (FIG. 5). La MS del conjugado preparado sin bisulfito sódico tuvo un promedio de 1 .4 1/Ab y especies de anticuerpos con hasta tres moléculas 1 enlazadas (FIG . 5A). Por el contrario, la MS del conjugado preparado con bisulfito sódico mostró un promedio de 2.5 1/Ab y especies de anticuerpos con hasta siete moléculas 1 enlazadas (FIG. 5B).
El conjugado de anticuerpo con disulfuro enlazado -SPDB-1 preparado usando bisulfito sódico mostró sólo la banda del anticuerpo intacto mediante el análisis en gel chip SDS-PAGE no-reductor. El ensayo en gel chip se realizó usando chip de proteínas Agilent Protein 230 y analizó usando un bioanalizador Agilent 2300. No se observaron bandas de cadenas pesadas ni ligeras, mostrando una ventaja inesperada de que el bisulfito sódico adicionado no causó ninguna reducción indeseada de los enlaces disulfuros intercatenarios en el anticuerpo nativo (FIG. 6). El fármaco enlazado obtenido en el conjugado de anticuerpo-SPDB-1 preparado usando bisulfito sódico demostró sorprendentemente además que el enlazador de disulfuro en el conjugado fue estable con el bisulfito sódico adicionado.
EJEMPLO 4 Para la preparación del conjugado, el 1 f-SPDB-NHS éster (compuesto 1 c, FIG. 7) se pre-incubó con 3 equivalentes molares de bisulfito sódico (NaHS03 preparado recientemente en agua desionizada) con 96% de DMA (dimetilacetamida) en agua por 5 h a 25 C y después se incubó toda la noche a 4 C hasta que fuera necesario para la conjugación. El anticuerpo humanizado a 2-3 mg/ml se derivatizó con 8 equivalentes molares del 1 f-SPDB-NHS éster en ausencia o presencia de bisulfito sódico (-/+ NaHS03) por 4 h a 25°C en tampón acuoso de 95% de 50 mM HEPES, pH 8.5, que contiene 5% de DMA (v/v) y después ambos se purificaron en la columna de desalinización G25s en PBS, pH 7.4, para eliminar el fármaco sin reaccionar, hidrolizado. Los conjugados se dializaron en tampón de 10 mM de histidina, 250 mM de glicina, 1 % de sacarosa, pH 6.5. La DAR del conjugado se midió por espectrofotometría UV a 280 y 320 nm. El % de monómero y % de fármaco en el monómero en el conjugado se determinaron por SEC. El fármaco sin conjugar en el conjugado se determinó mediante HPLC de fase reversa después de la extracción con acetona. Estas conjugaciones se realizaron con diversos anticuerpos humanizados.
EJEMPLO 5 Para conjugar los tioles del fármaco con el enlazador de disulfuro reactivo incorporado en el anticuerpo, el mAb humanizado a 8 mg/ml se derivatiza con 4-6 equivalentes molares del enlazador SPDB hetrobifuncional por 1 .5 h a 25 °C en tampón acuoso de 90% de PBS, pH 7.5, con 5% de DMA (v/v) y se purifica después en una columna de desalinización G25 en el tampón de 35 mM de citrato, 2 mM de EDTA, 150 mM de NaCI, pH 5.5 para eliminar el enlazador no-reactivo, hidrolizado. La LAR (relación enlazador anticuerpo) se mide por absorbancia UV a 280 y 343 nm sin y con 50 mM de ditiotreitol adicionado (para medir el anticuerpo total y SPy liberado). El SPDB-anticuerpo modificado a 2 mg/ml reacciona con 2 equivalentes molares de tiol del fármaco-tratado con bisulfito sódico por enlazador por 2 a 20 h a 25 C con 85-90% de tampón de 50 mM de fosfato potásico, 50 mM de NaCI, pH 7.5 y se purifica después en una columna de desalinización G25 con PBS, pH 7.4, para eliminar el fármaco no-reactivo, hidrolizado. La DAR del conjugado de anticuerpo-SPDB-fármaco se mide por la absorbancia a 280 y 320 nm y el porcentaje de monómero y porcentaje de fármaco en el monómero en la preparación delconjugado se determina por SEC.
EJEMPLO 6 Preparación de huMy9-6-sulfo-SPDB-1 (método de 2-etapas) Una reacción que contiene 6 mg/ml del anticuerpo HuMy9-6 y 9 equivalentes molares del enlazador sulfo-SPDB (20 mM de materia prima en DMA) se incubó por 3 h a 25 °C con tampón 50 mM de EPPS pH 8. El enlazador sin reaccionar se eliminó usando una columna de desalinización NAP (I Ilustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) y se determinó que la relación del enlazador al anticuerpo (LAR) era 3.7 basado en la concentración del anticuerpo y concentración de la tiopiridina liberada del DTT por UV-Vis ( 313 nm= 8,080 cm'1 M"' para 2-tiopiridona).
El huMy9-6 modificado con Sulfo-SPDB se diluyó para 2 mg/ml en 50 mM EPPS pH 8.5, 1 0% v/v de DMA, y reaccionó con 2 equivalentes molares del compuesto 1 d por enlazador (5 mM de materia prima en DMA; 7.4 equivalentes por anticuerpo) por 3 h a 25 °C.
Post-reacción, el conjugado se purificó y el tampón se intercambió en 250 mM de Glicina, 10 mM de Histidina, 1 % de sacarosa, 0.01 % de Tween-20, 50µ? de bisulfito sódico a pH 6.2 usando una columna de desalinización (G-25 Sephadex, calidad fina, GE Healthcare).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 2.9 de moléculas del compuesto 1 enlazadas por anticuerpo (por UV-Vis usando los coeficientes de extinción molar i i330 rm= 1 5,484 crrT' M'1 y i i280 nm= 30, 1 15 cm"1 M"1 para el compuesto 1 , y 280 nm= 207,000 cm"' M' 1 para el anticuerpo My9-6), 97.8% de monómero (por cromatografía de exclusión molecular), < 1 % de compuesto sin conjugar 1 (por extracción con acetona/HPLC de fase reversa), un rendimiento de 60% basado en la cantidad del anticuerpo usado, y un rendimiento global de 18% basado en la cantidad de compuesto "I d usado. El conjugado hecho usando este método se puede concentrar (por celda agitada o dispositivo de filtro centrífugo Amicon) hasta >3 mg/ml sin la precipitación del conjugado.
EJEMPLO 7 Preparación de huMy9-6-SPDB-1 Método 1 (método reactivo de una etapa): Una reacción que contiene 2 mg/ml de anticuerpo HuMy9-6 y 7 equivalentes molares de 1 -SPDB-NHS (pretratados con exceso de 5 veces de bisulfito sódico en 90: 10 D A:agua, v/v por 1 h a 25 °C y toda la noche después a 4 °C) en 50 mM de tampón HEPES (ácido 4-(2-hidroxietilo)-1 -piperazina etanosulfónico) pH 8.5 y 10% v/v del cosolvente DMA (A/,A -Dimetilacetamida) se dejó incubar por 3 h a 25 °C.
Post-reacción, el conjugado se purificó y el tampón se intercambió en el tampón de formulación de 250 mM de Glicina, 10 mM de Histidina, 1 % de sacarosa, 0.01 % de Tween, 50 µ? de bisulfito sódico, usando las columnas de desalinización NAP (lllustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). La diálisis se realizó en el mismo tampón por 4 horas a temperatura ambiente utilizando casetes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 20,000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 4.0 moléculas del compuesto 1 enlazadas por anticuerpo (por UV-Vis usando los coeficientes de extinción molar ' '33Q nm= 15,484 cm''M"1 y ' !2ao nm= 30, 1 15 cm''M'' para el compuesto 1 , y n28o nm= 207,000 cnrT'M'1 para el anticuerpo My9-6), 92% de monómero (por cromatografía de exclusión molecular, TSK3000, TOSOH Biosciences), <1 % de compuesto sin conjugar 1 (por extracción con acetona/HPLC de fase reversa) un rendimiento de 72% basado en la cantidad del anticuerpo usado, un rendimiento global de 40% basado en la cantidad de 1 -SPDB-NHS usado, y una concentración final de proteína de 1 .0 mg/ml.
Método 2 (método de dos-etapas): Una reacción que contiene 4.8 mg/ml de anticuerpo HuMy9-6 y 6 equivalentes molares de enlazador SPDB (18.5 mM de materia prima en etanol) se incubó por 3 h a 25 °C en PBS pH 7.4. El enlazador sin reaccionar se eliminó usando una columna de desalinización NAP (lllustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) y se determinó que la relación del enlazador al anticuerpo (LAR) era 4.0 basado en la concentración del anticuerpo y la concentración de 2-tiopiridona liberada del DTT por UV-Vis (n343 nm= 8,080 crn^M"1 para 2-tiopiridona).
El huMy9-6 modificado con SPDB se diluyó para 2 mg/ml con 50 mM de EPPS pH 8.5, 10% v/v de DMA y reaccionó con 1 .75 equivalentes molares del compuesto 1d por enlazador (5 mM de materia prima en DMA; 7 equivalentes por anticuerpo) por 3 h a 25 °C.
Post-reacción, el conjugado se purificó e intercambió el tampón en 250 mM de Glicina, 10 mM de Histidina, 1 % de sacarosa, 0.01 % de Tween-20, 50µ? de bisulfito sódico a pH 6.2 usando una columna de desalinización (lllustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 3.8 moléculas del compuesto 1 enlazada por anticuerpo (por UV-Vis usando los coeficientes de extinción molar 330 nm= 15,484 cirT'M'1 y ' ½0 nm= 30,1 15 cm' lM"' para el compuesto 1 , y n280 nm= 207,000 cm 'M"' para el anticuerpo My9-6), 91 .6% de monómero (por cromatografía de exclusión molecular, TSK3000, TOSOH Biosciences), <1 % de compuesto sin conjugar 1 (por extracción con acetona/HPLC de fase reversa), un rendimiento de 40% basado en la cantidad del anticuerpo usado, un rendimiento global de 22% basado en la cantidad de compuesto 1 d usado, y una concentración final de proteína de 0.5 mg/ml.
EJEMPLO 8 Preparación de huMy9-6-CX1 -1 -1 huMy9-6-CX1 -1 -1 Método 1 (método reactivo de una etapa in-situ): Una solución de DMA que contiene 1 .9 mM del compuesto 1 d, 1 mM de enlazador CX 1 -1 heterobifuncional con grupos N-hidroxisuccinimida (NHS) y maleimida, y 20 mM de diisopropil etil amina (DIPEA) se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 8 min. Después 3 mM de ácido maleimido propiónico (MPA) se adicionó para extinguir el exceso del compuesto "I d. La mezcla de reacción 1 -CX1 -1 -NHS se almacenó congelada a -80°C, y después de descongelada se adicionó en dos porciones a una solución tamponada de huMy9-6 a 25 °C (2 mg/ml, 100 mM de EPPS, pH 8.0, 10% v/v de DMA); 4.8 equivalentes molares por anticuerpo (basado en la concentración del enlazador) seguido por 4.2 equivalentes 30 min después. Después de 2 h de reacción, el conjugado se purificó e intercambió el tampón en 250 mM de Glicina, 10 mM de Histidina, 1 % de sacarosa, 0.01 % de Tween-20, 50 µ? de bisulfito sódico a pH 6.2 usando una columna de desalinización (Quick-spin protein, resina G-25 fina, Roche), diálisis, y finalmente filtración estéril por 0.22 ¡m.
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 3.3 moléculas del compuesto 1 enlazadas por anticuerpo (por UV-Vis usando los coeficientes de extinción molar ' ' 330 nm = 15,484 cm^ M"1 y : i280 nm = 30,1 15 cm"1M"1 para el compuesto 1 , y f l 280 nm = 207,000 cirf'M'' para el anticuerpo My9-6), 95% de monómero (por cromatografía de exclusión molecular, TSK3000, TOSOH Biosciences), <1 % compuesto sin conjugar 1 (por extracción con acetona/ HPLC de fase reversa), un rendimiento de 45% basado en la cantidad del anticuerpo usado, un rendimiento global de 17% basado en la cantidad de compuesto 1 d usado, y una concentración final de proteína de 0.7 mg/ml.
Método 2 (método de una etapa): A una solución tamponada de anticuerpo HuMy9-6 (2 mg/ml, 50 mM de EPPS, pH 8.5, 8% v/v de DMA) se adicionaron 14 equivalentes molares del compuesto "I d (5 mM de materia prima en DMA) seguido por 7 equivalentes molares del enlazador CX1 -1 (1 5 mM solución de materia prima en etanol) e incubó por 3 h a 25 °C.
Post-reacción, el conjugado se purificó e intercambió el tampón en 250 mM de Glicina, 1 0 mM de Histidina, 1 % de sacarosa, 0.01 % de Tween-20, 50 µ? de bisulfito sódico a pH 6.2 usando una columna de desalinización (lllustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare), seguido por 2 x diálisis a 4 °C en casetes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 20,000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 3.4 moléculas del compuesto 1 enlazadas por anticuerpo (por UV-Vis usando los coeficientes de extinción molar ;330 nm = 15,484 cm'' M'' y ! i 280 nm = 30, 1 15 crrT' M' 1 para el compuesto 1 , y í l28o nm = 207,000 cm" 1 M"' para el anticuerpo My9-6), 90% de monómero (por cromatografía de exclusión molecular, TSK3000, TOSOH Biosciences), <1 % de compuesto sin conjugar 1 (por extracción con acetona/HPLC de fase reversa), un rendimiento de 44% basado en la cantidad del anticuerpo usado, un rendimiento global de 1 1 % basado en la cantidad de compuesto 1 d usado, y una concentración final de proteína de 1 .48 mg/ml.
EJEMPLO 9 Análisis MS del My9-6-SPDB-1f deglicosilado My9-6-SPDB-1 f se preparó conjugando un NHS éster que contiene el compuesto 1 f directamente con las lisinas del anticuerpo (es decir, el método reactivo de una etapa como se describió anteriormente), o conjugando el compuesto 1 d con un anticuerpo modificado con ditiopiridina (es decir, el método de dos etapas como se describió anteriormente). Los análisis por espectrometría de masa (MS) del My9-6-SPDB-1 f deglicosilado se llevaron a cabo después como se describió anteriormente.
El método reactivo de una etapa dio un conjugado con 0-9 modificaciones del compuesto 1 f, una distribución asimétrica del fármaco conjugado, y una cantidad significativa de anticuerpo sin conjugar. Por otra parte, el conjugado hecho con el método de dos etapas tuvo un perfil de MS con 0-6 modificaciones del compuesto 1 f, una distribución simétrica del fármaco conjugado, y muy poco anticuerpo sin conjugar. Ver la FIG. 12. Ambos conjugados tuvieron un promedio similar de la relación compuesto 1 f/anticuerpo de ~4 por análisis de UV-vis.
EJEMPLO 10 Efecto del pH en la síntesis de My9-6-sulfo-SPDB-1 en dos etapas Los datos de la MS para My9-6-sulfo-SPDB-1 f preparado usando un método de dos-etapas bajo diferentes condiciones de pH se mostraron en la FIG. 13. En resumen, el My9-6-sulfoSPDB (3.7 enlazador/anticuerpo) reaccionó con 3 equivalentes del compuesto 1 d por enlazador (o aproximadamente 1 1.1 equivalentes por anticuerpo) por 18 h a pH 6, 7, 8, y 8.5. Los datos de la MS mostraron una disminución en el enlazador sin reaccionar (picos satélites 260 amu) con el aumento del pH de reacción. Así, parece que el pH afecta la reacción de conjugación en la síntesis del conjugado de My9-6-sulfo-SPDB-1 f. Específicamente un pH de > 8 se requiere para que elcompuesto 1 d reaccione completamente con el enlazador sulfo-SPDB en el anticuerpo.
EJEMPLO 11 Efecto de la relación compuesto / enlazador en la síntesis en dos etapas de chKTI-sulfo-SPDB-1 La FIG. 14 muestra los datos de MS de chKTI-sulfo-SPDB-1 hechos usando un método de dos-etapas con diferentes relaciones compuesto 1 d / enlazador. El chKTI- sulfoSPDB (3.7 enlazador/anticuerpo) reaccionó con 1.1 , 1 .3, 1 .5 o 2 equivalentes de compuesto 1 d por enlazador por 3 h, a 25 °C, pH 8.5. La MS mostró una disminución en el enlazador sin reaccionar (picos satélites de 260 amu) con el aumento de equivalentes de compuesto 1 d por enlazador. Parece que bajo esta condición, se requiere una relación del compuesto 1 d / enlazador de >1 .3 para reaccionar completamente con el enlazador sulfo-SPDB en el anticuerpo. El aumento de los equivalentes de compuesto 1 d por encima de 1 .5 por enlazador condujo a aumentar la fragmentación del anticuerpo (14-19%) mientras que 1 .1 -1 .3 de compuesto 1d / enlazador no causó una fragmentación significativa del anticuerpo. - EJEMPLO 12 Preparación del conjugado anticuerpo-SPDB-fármaco El compuesto 1c se pre-trató con 3 equivalentes molares de bisulfito sódico (usando una solución recientemente preparada de NaHS03 en agua) con 96-98% de DMA en agua por 4-5 h a 25 C. Para la conjugación, el anticuerpo humanizado a 2 mg/ml reaccionó con 5-7 equivalentes molares del compuesto 1 c (pre-tratado con NaHS03) por 6 h a 25 "C en 85-90% de PBS, pH 7.4, tampón acuoso, o 50 mM HEPES, pH 8.5, tampón acuoso, que contiene 10-15% de A/,A/-dimetilacetamida (DMA) y se purificó después en una columna de gel filtración G25 en PBS, pH 7.4, para eliminar el compuesto no reactivo o hidrolizado. Los conjugados de anticuerpo humanizado-SPDB-fármaco se dializaron en tampón de 10 mM de Histidina, 250 mM de Glicina, 1 % de sacarosa, pH 6.5. Se midió que la relación fármaco anticuerpo (DAR) de los conjugados era 2.2-2.9 por mediciones de absorbancia UV a 280 y 320 nm y usando los coeficientes de extinción del fármaco y anticuerpo a 280 nm (215,000 M"1cm'') y 320 nm (9137 M'1cm"'). El porcentaje de monómero en los conjugados se determinó como >90% por SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) usando la columna TSK-Gel G300SWXL (7.8 mm x 300 mm, 5 I Im tamaño de partícula). Basado en la absorbancia UV del pico de monómero en SEC se demostró además que los picos del conjugado monómero tuvieron moléculas de fármaco enlazadas. Para el ensayo de fármaco libre (sin conjugar), el conjugado se extrajo con acetona para eliminar la proteína, se secó, y reconstituyó en la fase móvil e inyectó en una columna HPLC de fase reversa VYDAC 208TP C8 (4.6 x 250 mm, 7 nm tamaño de partícula) y comparó con los estándares. El porcentaje del compuesto de fármaco libre en el conjugado se determinó como <0.5% del compuesto fármaco conjugado.
Preparación del conjugado Ab human¡zado-SPDB-2a: El Ab humanizado a 8 mg/ml se derivatizó con 4-6 equivalentes molares del enlazador hetrobifuncional SPDB por 1 .5 h a 25 C en 95% PBS, pH 7.4, que contiene 5% de DMA (v/v), y se purificó después sobre una columna de desalinizacion G25 en tampón citrato (35 mM tampón citrato, pH 5.5, que contiene 2 mM de EDTA, 150 mM de NaCI) para eliminar el enlazador sin reaccionar. Las LAR (relación enlazador anticuerpo) se midieron usando la absorbancia UV a 280 y 343 nm sin y con la adición de 50 mM de ditiotreitol (para medir el anticuerpo total y SPy liberada por ditiotreitol) y se determinó que era 2.7-4.1 LAR. El SPDB-anticuerpo modificado a 2 mg/ml reaccionó con 2 equivalentes molares del compuesto 2a (sal HCI) por SPDB enlazado por 20 h a temperatura ambiente en 85% tampón citrato, 15 % de DMA (v/v) y se purificó después sobre una columna de desalinizacion G25 en PBS, pH 7.4 para eliminar el compuesto fármaco sin conjugar. La DAR del conjugado de Ab humanizado-SPDB-2a final se midió por espectrofotometría UV a 280 y 350 nm y se calculó que era -1 .7-2.1 DAR. El porcentaje de monómero y compuesto fármaco enlazado en el monómero en el conjugado se determinó mediante HPLC usando una columna SEC (cromatografía de exclusión por tamaño). Ver la FIG. 16.
EJEMPLO 13 Uso de reactivos de ¡mina covalentes para mejorar las especificaciones del conjugado Ab-fármaco (% de monómero y carga de fármaco) La formación del aducto se llevó a cabo con 5 equivalentes molares de reactivo imina sobre NHS-BMPS-1 en 90% de DMSO/ 10% de PBS pH 7.4 por 4 h a 25 °C. La mezcla de reacción se adicionó después al anticuerpo HuMy9-6 (4 equivalentes molares de fármaco, 2 mg/ml, 10% v/v de DMSO, 50 mM de tampón HEPES, pH 8.5, 5 h, 25 °C). Los conjugados preparados usando hidrosulfito sódico, bisulfito sódico, o metabisulfito sódico tuvieron relaciones fármaco/Ab similares y % de monómero, mientras que los conjugados preparados con el tratamiento sin aditivo condujeron a muy poca incorporación de fármaco.
EJEMPLO 14 Estudio de tolerabilidad in vivo óe los conjugados huFOLR-1 La ' tolerabilidad in vivo de los conjugados huFOLR- 1 se investigó en ratones hembras CD-1 . Los animales se observaron siete días antes de la iniciación del estudio y se encontró que estaban libres de enfermedades o afecciones. A los ratones se le administró una inyección simple i. v. del conjugado que porta el bisulfito y los animales se monitorearon diariamente para la pérdida de peso corporal, morbilidad o mortalidad. La Tabla 9 muestra que para el huFOLFM -fármacol , el conjugado se toleró sólo a la dosis m ínima probada de 50 ; ¡g/kg. Por el contrario, se encontró que los conjugados mono-imina huFOLR l -fármaco2 como huFOLR1 -SPDB-1f eran mejor tolerados con una dosis máxima tolerada de < 1 98 ' g/kg y >560 rig/kg respectivamente.
Tabla 9 Datos de comparación de tolerabilidad para los conjugados (A) huFOLRI -fármacol , (B) huFOLR 1 -fármaco2, y (C) huFOLR1 -SPDB-1f.
MTD < 100 \iglkq huFOLRl-fármacol MTD > 560 EJEMPLO 15 Efecto del propilenglicol en la formulación y conjugación Este ejemplo demuestra que las presentes reacciones de conjugación llevadas a cabo en presencia de propilenglicol como co-disolvente no muestran precipitación de los conjugados, y que se puede usar tanto como 40% (y posiblemente aún más alto) de propilenglicol sin una disminución en el % de monómero del conjugado resultante (en presencia de 2% de dimetilacetamida - datos no mostrados).
De mayor importancia, la presencia de propilenglicol durante la purificación conduce a un aumento significativo en el rendimiento (Tabla 10).
Aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría en particular, los solicitantes creen que una fuente principal de los problemas durante la conjugación de los presentes conjugados es la hidrofobicidad inherente de los componentes moleculares de los conjugados. Esto puede al menos parcialmente explicar los bajos rendimientos purificados, y a veces los perfiles de distribución de masa aberrantes observados con las presentes conjugaciones.
Es digno mencionar además que la adición de isopropanol durante la cromatografía de exclusión por tamaño de los preesentes conjugados disminuye en gran medida la población aparente agregada. Esta observación sugiere que cosolventes pequeños hidrofóbicos pueden aumentar la solubilidad de la droga y el conjugado de la invención.
Así, en las presentes reacciones de conjugación, las etapas de purificación después de la reacción, y/o la formulación de los conjugados formados se llevan a cabo preferentemente en presencia de cosolventes pequeños hidrofóbicos, tales como propilenglicol (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45%).
El anticuerpo-sulfo-SPDB se preparó de acuerdo con los métodos descritos anteriormente por la adición de la forma de N-hidroxisuccinimidil (NHS) éster de sulfo-SPDB al anticuerpo (huMy9-6) en agua que contiene 3% de DMA, y tamponada a pH 8.5 por 3 horas. El producto intermedio resultante (anticuerpo-sulfo-SPDB) se purificó en Sephadex G25 para eliminar el exceso de enlazador. El anticuerpo y enlazador se cuantificaron mediante espectroscopia de UV-vis midiendo la absorbancia a 280 nm en ausencia del agente reductor, y a 343 nm en presencia de -50 mM DTT para medir la liberación de 2-tiopiridina del enlazador conjugado.
Para conjugar el fármaco, el anticuerpo-sulfo-SPDB preparado anteriormente reaccionó a 2 mg/ml de anticuerpo con un exceso molar de 2-veces del compuesto 1 d en presencia de los co-solventes indicados, y manteniendo el pH a 8.5 con tampón EPPS (concentración final 60 mM). La dimetilacetamida (SAFC) y el propilenglicol (Alfa Aesar) se usaron como se recibieron sin purificación adicional. Todos los tampones se esterilizaron por el paso a través del filtro de 0.22 mieras (Corning) y el agua se purificó por osmosis inversa / desionización. Las reacciones se incubaron a 25 nC por 3 h y se purificaron después usando columnas desechables de Sephadex G25 (Nap 25, GE Healthcare) en un tampón de formulación consistente de 10 mM de histidina, 250 de glicina, 1 % de sacarosa, 0.01 % de polisorbato 20, 50 µ? de bisulfito sódico y tamponado a pH 6.2, así como el porcentaje indicado de propilenglicol (v/v).
Los rendimientos de la reacción y carga del fármaco se determinaron por espectroscopia de absorbancia. Todas las muestras mostraron >96% de monómero por cromatografía analítica de exclusión por tamaño.
La Tabla 10 más abajo muestra el % de rendimiento de la conjugación como una función del propilenglicol en la mezcla de reacción o formulación. El anticuerpo-sulfo-SPDB-1 se preparó por la reacción del compuesto 1 d con el anticuerpo-sulfo-SPDB por 4 horas a pH 8.5 (componentes no-acuosos como se indicó) seguido por la purificación en Sephadex G25.
Tabla 10 * Un precipitado blanco espeso se observó sobre la columna de Sephadex después de la purificación EJEMPLO 16 Preparación de huMy9-6-sulfo-SPDB-1 d usando el enlazador 4- nitroPy-sulfo-SPDB altamente reactivo Una reacción que contiene 6 mg/ml de anticuerpo HuMy9-6 y 5 equivalentes molares del enlazador N-succinimidil-4-(4-n¡tropiridil-2-dit¡o)butanoato altamente reactivo (20 mM de materia prima en etanol) se incubó por 3 h a 25 °C en 50 mM de tampón EPPS a pH 8. El enlazador sin reaccionar se eliminó usando una columna de desalinización NAP (lllustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se determinó que la relación del enlazador al anticuerpo (LAR) era aproximadamente 2.3 basado en la concentración del anticuerpo y concentración de nitropiridina-2-tiona liberada de DTT por UV-Vis (i '3£? „m= 14205 cm"1M"' para el 2-tio-4-nitropiridona).
El huMy9-6 modificado con el enlazador se diluyó hasta 2 mg/ml en 50 mM de tampón HEPES a pH 8.5, 10% v/v de DMA, y reaccionó con 2 equivalentes molares del compuesto "I d por enlazador (5 mM de materia prima en DMA; 4.6 equivalentes por anticuerpo) por 30 min a 25 °C. La terminación de la reacción de intercambio de disulfuro se determinó monitoreando el aumento de absorbancia a 394 nm por UV. Post-reacción, el conjugado se purificó e intercambió el tampón en 250 mM de glicina, 10 mM de histidina, 1 % de sacarosa, 0.01 % de Tween-20, 50 µ? de bisulfito sódico a pH 6.2 usando una columna de desalinización (G-25 Sephadex, calidad fina, GE Healthcare).
Se encontró que el conjugado purificado tiene un promedio de 2.1 moléculas de 1d enlazadas por anticuerpo (por UV-Vis usando los coeficientes de extinción molar I i330nm= 15,484 cm 'M"1 y ' '280 nm= 30, 115 cirr'M'' para 1d, y n28onm= 207,000 cm^M'' para huMy9-6), 98% de monómero (por cromatografía de exclusión molecular), <1% de 1d sin conjugar (por extracción con acetona/HPLC de fase reversa), un rendimiento de 70% de proteína, y un rendimiento global de 32% de 1d. Ver la FIG.28.

Claims (171)

REIVINDICACIONES
1 . Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo de enlace, el método comprende reaccionar un compuesto citotóxico modificado con un CBA modificado a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, caracterizado porque: a) el CBA modificado comprende un residuo de un agente de reticulación bifuncional unido al CBA, y el residuo comprende el grupo de enlace y un grupo tiol-reactivo; y b) el compuesto citotóxico modificado comprende un grupo tiol, y un grupo representado por: en donde: Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03 , S032' o HS02" formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052' formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23', POS33' o PS43' formada con un catión), tio fosfato éster (RO^PSÍOR*), R'S-, R¡SO, R'SOZ, R¡S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (HS2O4 o una sal de S20,i2" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCh^SC-VNa*) o una mezcla de estos, en donde R1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo.
2. El método de la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto citotóxico modificado se produce reaccionando un compuesto citotóxico que contiene ¡mina que contiene el grupo tiol con un reactivo de imina reactiva.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque comprende purificar el compuesto citotóxico modificado antes de reaccionar con el CBA modificado.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, caracterizado además porque: (1 ) el compuesto citotóxico que contiene imina es representado por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: el compuesto citotóxico modificado y la porción del grupo de enlace del conjugado es representado por una de las siguientes fórmulas: donde: X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono; R, , R2, R3, , Ri\ R2' , R3' y R4' son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-R°, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03' M+, un sulfato -OS03'M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R"; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; FT y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, o, halógeno; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)„a-, -(CH2)„-NRe-(CH2)na-, -(CH2)n-0-(CH2)na- y -(CH2)n-S-(CH2)na -; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y Ra son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-, R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son ¡guales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)„-; L está ausente, o cuando está presente, comprende el grupo tiol, o es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n- , un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo es opcionalmente sustituido; en donde al menos uno de X', Y', R6, R°, R, , R2, R3, R4, Ri', R2\ R3 . R-\ L (por ejemplo, a través de un grupo opcionalmente sustituido), está unido al grupo de enlace en las fórmulas (Ib') o (l lb').
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, caracterizado además porque el CBA modificado se prepara reaccionando el CBA con el agente de reticulación bifuncional, dicho agente de reticulación bifuncional comprende el grupo tiol reactivo y un grupo reactivo con el CBA, ambos unidos al grupo de enlace.
6. El método de la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho grupo reactivo con el CBA reacciona con un grupo amino del CBA (tal como el grupo amino de una cadena lateral de Lys), o con un grupo tiol del CBA (tal como el grupo tiol de una cadena lateral de Cys).
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, caracterizado además porque el grupo tiol reactivo es seleccionado del grupo que consiste de maleimido, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida, un grupo basado en haloacetilo y un grupo disulfuro.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, caracterizado además porque el grupo tiol reactivo es maleimido, haloacetamido o -SSRd, en donde Rd es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono, fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo, 2-nitropiridilo, 4-nitropiridilo, o 3-carboxi-4-nitropiridilo.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, caracterizado además porque el CBA modificado es:
10. Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo de enlace, el método caracterizado porque comprende reaccionar el CBA con un compuesto citotóxico que contiene imina, un reactivo de ¡mina reactiva, y un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo de enlace para formar el conjugado.
1 1 . El método de la reivindicación 10, caracterizado además porque el CBA se pone en contacto con el compuesto citotóxico que contiene imina y el reactivo de imina reactiva para formar una primera mezcla; y la primera mezcla se pone en contacto después con el agente de reticulación bifuncional para formar el conjugado.
12. El método de la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el agente de reticulación bifuncional se pone en contacto con la primera mezcla inmediatamente después de la formación de la primera mezcla.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 10-12, caracterizado además porque comprende purificar el conjugado.
14. Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo de enlace, el método caracterizado porque comprende: a) reaccionar un compuesto citotóxico modificado con un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo de enlace, un grupo reactivo con el CBA (tal como un grupo tiol, un grupo maleimida, un grupo haloacetamida, o un grupo amina), y un grupo reactivo con el compuesto citotóxico modificado, para formar un segundo compuesto citotóxico modificado covalentemente unido a un residuo del agente de reticulación bifuncional, en donde el residuo comprende el grupo de enlace y el grupo reactivo con el CBA; en donde el compuesto citotóxico modificado es representado por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03 , S032" o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052' formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (PO3SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3', P02S23", POS33" o PS43" formada con un catión), tio fosfato éster (RiO)2PS(ORi), R¡S-, R¡SO, R'S02, R¡S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032 formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S20 " formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02' o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02"Na+) o una mezcla de estos, en donde R1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -SO3H, y -PO3H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo; X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno ' o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; R° es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono; Ri, R2, R3, R4, R,', R2', R3' y R4' son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03" M+, un sulfato -OS03'M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R"; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; R' y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, o, halógeno; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n>-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2),,-0-(CH2)na.- y -(CH2)n-S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y R8 son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-, R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, o cuando está presente, comprende el grupo tiol, o es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)rl-, un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo es opcionalmente sustituido; y, b) reaccionar el segundo compuesto citotóxico modificado con el CBA a través del grupo reactivo con el CBA, a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, para formar el conjugado.
15. El método de la reivindicación 14, caracterizado además porque el grupo reactivo con el CBA es un grupo tiol, un grupo maleimida, un grupo haloacetamida, o un grupo amina.
16. El método de la reivindicación 14, caracterizado además porque el compuesto citotoxico modificado comprende un grupo tiol, y el grupo reactivo con el compuesto citotoxico modificado es un grupo tiol reactivo.
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, caracterizado además porque el compuesto citotoxico modificado se produce reaccionando un compuesto citotoxico que contiene ¡mina que contiene el grupo tiol de la siguiente fórmula con un reactivo de imina reactiva en una mezcla de reacción
18. El método de la reivindicación 17, caracterizado además porque comprende además purificar el compuesto citotoxico modificado antes de la etapa a).
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14-18, caracterizado además porque comprende además purificar el segundo compuesto citotoxico modificado antes de la etapa b).
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 17-19, caracterizado además porque la mezcla de reacción se almacena congelada antes que la mezcla congelada se descongele y la etapa a) sea llevada a cabo.
21 . El método de cualquiera de las reivindicaciones 17-20, caracterizado además porque comprende además almacenar la mezcla de reacción de la etapa a) congelada antes que se descongele y antes que la etapa b) sea llevada a cabo. .
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14-21 , caracterizado además porque el agente de reticulación bifuncional es bis-maleimidohexano o B PEO.
23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-22, caracterizado además porque el compuesto citotoxico que contiene imina es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este: en donde: X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono; R,, R2, R3, R4, R,', R2\ R3' y R4' son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03" M+, un sulfato -OS03'M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R" y el grupo de enlace; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; FT y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, o halógeno; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n -NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-0-(CH2)na- y -(CH2)n-S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y R8 son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-, R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son ¡guales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, o cuando está presente, comprende el grupo tiol, y es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-, un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo es opcionalmente sustituido.
24. El método de la reivindicación 23, caracterizado además porque el compuesto citotóxico que contiene ¡mina es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: L', L", y L'" son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, - NR'R", -N02, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R\ un sulfonato -S03M, un sulfato -OS03M, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', - OCONR'R"; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable; y, G es seleccionado de -CH- o -N-.
25. El método de la reivindicación 24, el compuesto citotóxico modificado caracterizado además porque cuando está presente, es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este:
26. El método de la reivindicación 23, 24, o 25, caracterizado además porque uno de L', L", o L'" porta el grupo tiol, mientras que los otros son -H.
27. El método de la reivindicación 26, caracterizado además porque L' porta el grupo tiol, y L" y U" son -H.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23-27, caracterizado además porque A y A' son -O-; R6 es -OMe; y G es -CH-.
29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23-28, caracterizado además porque el compuesto citotóxico que contiene imina es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: en donde: W está ausente, o cuando está presente, es seleccionado de -CRsRe -, -O-, -0-C(=0)-, -C(=0)-0-, -S-, -SO-, -S02-, -CH2-S-, -CH20-, -CH2NRe-, -0-(C=0)0-, - 0-(C=0)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, -C(=0)-N(Re)-, -N(Re)-C(=0)0-, - N(C(=0)Re)C(=0)~, -N(C(=0)Re)-, -(0-CH2-CH2)n-, -SS-, o -C(=0)-, o un aminoácido, o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos; Rx está ausente, o cuando está presente, es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono, un arilo que porta 6 a 10 átomos de carbono o un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros que porta 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N o S; R8 y Re son ¡guales o diferentes, y son seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (por ejemplo, -NHR '01) o amino terciario (-NR101 R 102) o un nitrógeno de 5 ó 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R 101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinüo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; preferentemente, R101 y R,02 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; n es un número entero del 1 al 24.
30. El método de la reivindicación 29, caracterizado además porque el compuesto citotóxico modificado, cuando está presente, es representado por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable de este:
31 . El método de la reivindicación 29 o 30, caracterizado además porque: Y es seleccionado de -S03M, -S02M o -OS03 ; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable tal como Na+ o K+; X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, un alquilo, alquenilo 0 alquinüo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector amina; Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, a alquilo, alquenilo o alquinüo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; A y A' son seleccionados de -O- y -S-; W está ausente, o es seleccionado de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, - N (C(=0) RE)-, -S- o -CH2-S-, -CH2NRE-; RX está ausente o es seleccionado de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono; RE es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)N-RK, en donde RK es un -H , un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (por ejemplo, -N HR 10' ) o amino terciario (-NR , 0' R 102) o un nitrógeno de 5 ó 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R 101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono; G es seleccionado de -CH- o -N-.
32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 29-31 , caracterizado además porque W es -N ( RE)-.
33. El método de la reivindicación 32 , caracterizado además porque RE es -(CH2-CH2-0)N-RK, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
34. El método de la reivindicación 33, caracterizado además porque RK es -H o -Me, n es 4, y q es 2.
35. El método de la reivindicación 34 , caracterizado además porque R* es un un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
36. El método de la reivindicación 34, caracterizado además porque RX es -(CH2)P-(CR'Rs)-, en donde R1 y R9 son cada uno independientemente seleccionados de -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; y p es 0, 1 , 2 o 3.
37. El método de la reivindicación 36, caracterizado además porque R1 y RG son ¡guales o diferentes, y son seleccionados de -H y -Me; y p es 1 .
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 29-37, caracterizado además porque: Y es -SO3M, -S02M, o un sulfato -OS03M; preferentemente -S03M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, Na+); X' y Y' son ambos -H; A y A' son ambos -O-; R6 es -OMe; y R* es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 0-16 y 23-38, caracterizado además porque el agente de reticulación bifuncional es: una porción basada en maleimido seleccionada de: N-succinimidil 4- (maleimidometilo)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N- maleimidometilo)-ciclohexano-1 -carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), N- succinimidil éster del ácido ' i-maleimidoundecanoico (KMUA), N-succinimidil éster del ácido ; -maleimidobutírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido i - maleimidocaproico (EMCS) , m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), N-(. !-maleimidoacetoxi)-succinimida éster (AMAS), succinimidil-6-( - maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidofenilo)- butirato (SMPB) , N-(p-maleimidofenilo)isocianato (PMPI), /V-succinimidil-4-(4- nitropiridil-2-ditio)butanoato; o, una porción basada en haloacetilo seleccionada de: N-succinimidil-4-(yodoacetilo)- aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), y N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), bis- maleimidopolietilenoglicol (BMPEO), BM(PEO)2, BM(PEO)3, N-([ - maleimidopropilox¡)succ¡n¡m¡da éster (BMPS), ácido 5-maleimidovalérico NHS, HBVS, ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butirico hidrazida«HCI (MPBH), Succinimidil- (4-vinilsulfonilo)benzoaIo (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1 ,4-bis- maleimidobutano (BMB), 1 ,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis- maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), sulfosuccinimidil 4-(N- maleimido-metilo)ciclohexano-1 -carboxilato (sulfo-SMCC), sulfosuccin¡midil(4- yodo-acetilo)aminobenzoato (sulfo-SIAB), m-maleimidobenzoil-N- hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), N-(í :- maleimidobutriloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-GMBS), N-(í - maleimidocaproilox¡)sulfosuccimido éster (sulfo-EMCS), N-(N- maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-KMUS), sulfosuccinimidil 4- (p-maleimidotenilo)butirato (sulfo-SMPB), CX1 -1. sulfo-Mal y PEGn-Mal.
40. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23-38, caracterizado además porque el agente de reticulación bifuncional es seleccionado del grupo que consiste de SMCC, Sulfo-SMCC, BMPS, GMBS, SIA, SIAB, W-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, bis-maleimidohexano o BMPEO.
41 . El método de cualquiera de las reivindicaciones 23-40, caracterizado además porque el CBA modificado, cuando está presente, es:
42. Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión celular (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo de enlace, el método caracterizado porque comprende reaccionar un segundo compuesto citotóxico modificado con el CBA a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, en donde el segundo compuesto citotóxico modificado comprende: a) un residuo de un agente de reticulación bifuncional unido al compuesto citotóxico, y el residuo comprende el grupo de enlace y un grupo reactivo seleccionado de un éster reactivo y un grupo tiol-reactivo, y, b) un grupo representado por: \ )— NH y en donde: Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03', S032' o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052' formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H , POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3', P02S23', POS33' o PS43' formada con un catión), tio fosfato éster (RiO)2PS(O i), R¡S-, R¡SO, R¡S02, R¡S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032' formada con un catión), ditionita (HS20 o una sal de S20„2" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCH2S02'Na+) o una mezcla de estos, en donde R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyeme seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo.
43. El método de la reivindicación 42, caracterizado además porque el segundo compuesto citotóxico modificado se produce al reaccionar un reactivo de imina reactiva con un compuesto citotóxico que contiene imina que porta el grupo de enlace y el grupo reactivo.
44. El método de la reivindicación 42 o 43, caracterizado además porque comprende además purificar el segundo compuesto citotóxico modificado antes de reaccionar con el CBA.
45. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42-44, caracterizado además porque el éster reactivo es seleccionado del grupo que consiste de N-hidroxisuccinimida éster, N-hidrox¡ sulfosuccinimida éster, nitrofenil éster, dinitrofenil éster, tetrafluorofenil éster, sulfo-tetraflurofenil éster, y pentafluorofenil éster.
46. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42-44, caracterizado además porque el éster reactivo es N-hidroxisuccinimida éster.
47. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42-44, caracterizado además porque el grupo tiol reactivo es seleccionado del grupo que consiste de maleimído, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida, un grupo basado en haloacetilo y un grupo disulfuro.
48. El método de cualquiera de las reivindicaciones 42-44, caracterizado además porque el grupo tiol reactivo es maleimido, haloacetamido o -SSRd, en donde Rd es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono, fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo, 2-nitropiridilo, 4-nitropiridilo, o 3-carboxi-4-nitropiridilo.
49. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14-48, caracterizado además porque el segundo compuesto citotóxico modificado es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: sal farmacéuticamente aceptable de este, en donde: Y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03', S032" o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23', POS33" o PS43' formada con un catión), tio fosfato éster (RiO)2PS(ORi), R¡S-, R'SO, R¡S02, R¡S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S2042" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02 o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02'Na+) o una mezcla de estos, en donde FT es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene; 1 a 10 átomos de carbono, arilo heterociclilo o heteroarilo; X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; R, , R2, R3, R4, R,', R2', R3' y R4' son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03' M+, un sulfato -OS03" +, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R", y el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)„-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; R' y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-R0, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y SO¡>; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, halógeno o el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n -NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-0-(CH2)„a - y -(CH2)„-S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y Rs son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)„-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 1 0 átomos de carbono; R9 es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 1 0 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son ¡guales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-) , -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR5 y -CRR'N(R5)-; R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono; D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-, un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo o alquenilo es opcionalmente sustituido con el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; el fenilo o anillo heterocíclico o heteroarilo puede ser opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente puede ser el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este;
50. El método de la reivindicación 49, caracterizado además porque L está ausente, o es seleccionado de un grupo fenilo opcionalmente sustituido y un grupo piridilo opcionalmente sustituido, en donde el grupo fenilo y piridilo porta el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, o L es un grupo amina que porta el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este (es decir, -N(grupo de enlace)-), o L es un alquilo o alquenilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y que porta el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este.
51 . El método de la reivindicación 49, caracterizado además porque el compuesto citotóxico unido al grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: en donde: L\ L", y L'" son ¡guales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, - NR'R", -N02, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona epresentada por -S02R\ un sulfonato -S03M, un sulfato -OS03M, una sulfonamida epresentada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R" y el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, siempre que solo uno, de L\ L", y L'" sea el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable; y, G es seleccionado de -CH- o -N-.
52. El método de la reivindicación 51 , caracterizado además porque uno de L', L", o L'" es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, mientras los otros son -H.
53. El método de la reivindicación 52, caracterizado además porque L' es el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, y L" y L'" son -H.
54. El método de la reivindicación 52 o 53, caracterizado además porque A y A' son ambos -OR-, 6 es -OMe, y G es -CH-.
55. El método de la reivindicación 52, 53, o 54, caracterizado además porque L' es representado por la siguiente fórmula: -W'-Rx-V-Ry-J, en donde: W y V son iguales o diferentes, y cada uno está independientemente ausente, o es seleccionado de -CReRe -, -O-, -0-C(=0)-, -C(=0)-0-, -S-, -SO-, - S02-, -CH2-S-, -CH20-, -CH2NRe-, -0-(C=0)0-, -0-(C=0)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)- C(=0)-, -C(=0)-N(Re)-, -N(Re)-C(=0)0-, -N(C(=0)Re)C(=0)-, -N(C(=0)Re)-, -(O- CH2-CH2)n-, -SS-, o -C(=0)-, o un aminoácido, o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos; Rx y Ry son ¡guales o diferentes, y cada uno independientemente está ausente o es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un arilo que porta 6 a 10 átomos de carbono o un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros que porta 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N o S; Re y Re son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-R\ en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario {por ejemplo, -NHR101) o amino terciario (-NR10,R102) o un nitrógeno de 5 ó 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; preferentemente, R10' y R102 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; n es un número entero de 1 a 24; J comprende el grupo reactivo unido a este, y es seleccionado de una maleimida, un haloacetamido, -SH, -SSRd, -CH2SH, -CH(Me)SH, -C(Me)2SH, y - COE, en donde -COE representa un éster reactivo seleccionado de, pero sin limitarse a, N-hidroxisuccinimda éster, N-hidroxi sulfosuccinimida éster, nitrofenil (por ejemplo, 2 o 4-nitrofenilo) éster, dinitrofenil (por ejemplo, 2,4-dinitrofenilo) éster, sulfo-tetraflurofenil (por ejemplo, 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenilo) éster, y pentafluorofenil éster, y en donde Rc1 es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono, y, Rd es seleccionado de fenilo, nitrofenilo (por ejemplo, 2 o 4-nitrofenilo), dinitrofenilo (por ejemplo, 2 o 4-nitrofenilo), carboxinitrofenilo (por ejemplo, 3- carboxi-4-nitrofenilo), piridilo o nitropiridilo (por ejemplo, 4-nitropiridilo).
56. El método de la reivindicación 55, caracterizado además porque J es -SH, -SSRd, una maleimida, o un N-hidroxisuccinimida éster.
57. El método de la reivindicación 55 o 56, caracterizado además porque: Re' es -H o -Me; Re es un un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rk; n es un entero de 2 a 8; y Rk es -H, -Me o -CH2CH2-NMe2.
58. El método de cualquiera de las reivindicaciones 55-57, caracterizado además porque V es un aminoácido o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos.
59. El método de la reivindicación 58, caracterizado además porque V es valina-citrulina, gly-gly-gly, o ala-leu-ala-leu.
60. El método de la reivindicación 55, caracterizado además porque: W es -O-, -N(Re)- o -N(Re)-C(=0)-; Re es -H, un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono, o -(CH2-CH O)n-Rk; R* es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; V está ausente, es -(0-CH2-CH2)n-, -C(=0)-NH-, -S-, -NH-C(=0)-; Ry está ausente o es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; y J es -SH, -SSRcl o -COE.
61 . EL método de la reivindicación 55, caracterizado además porque: W es -O-, -N(R o -N(Re)-C(=0)-; Re es -H, -Me, o -(CH2-CH2-0)rl-Me; n es un número entero de 2 a 6; Rx es un alquilo lineal o ramificado que porta 1 a 6 átomos de carbono; V y Ry están ausentes; y J es -COE:
62. El método de la reivindicación 60 o 61 , caracterizado además porque -COE es N-hidroxisuccinimida éster.
63. El método de la reivindicación 55, caracterizado además porque L' es representado por la siguiente fórmula: -W'-[CR, R2-]a-V-[Cy]0-,-[CR3 R4"]b-COE, en donde: R, , R2", y Rr son cada uno independientemente -H o -Me; R4- es -H, -Me, -S03H, o -S03"M+, en donde M+ es un catión farmacéuticamente aceptable; a es un número entero de 0-2, b es un número entero de 0-3; y, Cy es un anillo heterocíclico de 5 miembros opcionalmente sustituido que porta un N heteroátomo, preferentemente Cy es
64. El método de la reivindicación 55 o 63, caracterizado además porque W es -N(Re)-
65. El método de la reivindicación 55, 63, o 64, caracterizado además porque Re es -(CH2-CH2-0)2-6- Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
66. El método de la reivindicación 55, 63, 64, o 65, en donde V es -S- o -SS-.
67. El método de la reivindicación 55, 63, 64, 65, o 66, caracterizado además porque L' es representado por la siguiente fórmula: - NRe-[CRrRHa-S-[CR3"R4.]b-COE.
68. El método de la reivindicación 55, 63, 64, 65, 66, o 67, caracterizado además porque el compuesto citotóxico unido al grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este es: en donde Y es -S03M, y M es H o un catión farmacéuticamente aceptable.
69. El método de la reivindicación 55, 63, 64, 65, o 66, caracterizado además porque L' es representado por la siguiente fórmula: - NRe-[CR, R2 ']a-S-Cy-[CR3 R4»]b-COE.
70. El método de la reivindicación 55, 63, 64, 65, 66, o 68, caracterizado además porque el compuesto citotóxico unido al grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este es: en donde Y es -S03M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
71 . El método de la reivindicación 49, 51 , o 55, caracterizado además porque el compuesto citotóxico unido al grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: e: Y es seleccionado de -S03M, -S02M o -OS03 ; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable tal como Na+ o K+; X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, un alquilo, alquenilo 0 alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector amina; Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, a alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
A y A' son seleccionados de -O- y -S-; W está ausente, o es seleccionado de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, -N(C(=0)Re)-, -S- o -CH2-S-, -CH2NRe-; Rx está ausente o es seleccionado de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (por ejemplo, -NHR101) o amino terciario (-NR,01 R,t)2) o un nitrógeno de 5 ó 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; G es seleccionado de -CH- o -N-; Zs es -H, o es seleccionado de cualquiera de las siguientes fórmulas: en donde: q es un número entero de 1 a 5; preferentemente q es 2; n es un número entero de 2 a 6; preferentemente n es 4; D es -H o -S03M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+ o K+.' 72. El método de la reivindicación 71 , caracterizado además porque Zs representado por cualquiera de las siguientes fórmulas:
73. El método de la reivindicación 71 o 72, caracterizado además porque W es -N(Re)-
74. El método de la reivindicación 73, caracterizado además porque Re es -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
75. El método de la reivindicación 74, caracterizado además porque Rk es -H o -Me, n es 4, y q es 2.
76. El método de la reivindicación 75, caracterizado además porque R es un un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
77. El método de la reivindicación 75, caracterizado además porque Rx es -(CH2)P-(CR'RtJ)-, en donde R1 y RCJ son cada uno independientemente seleccionados de -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; y p es 0, 1 , 2 o 3.
78. El método de la reivindicación 77, caracterizado además porque R1 y Rg son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H y -Me; y p es 1 .
79. El método de cualquiera de las reivindicaciones 71 -78, caracterizado además porque: Y es -S03M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, Na+); X' y Y' son ambos -H; A y A' son ambos -O-; R6 es -OMe; y Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
80. El método de cualquiera de las reivindicaciones 49-78, caracterizado además porque Y se selecciona de -S03M, -S02M y un sulfato -OS03M.
81 . El método de la reivindicación 80, en donde Y es -S03M.
82. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-81 , caracterizado además porque M es -H, Na+ o K+.
83. El método de cualquiera de las reivindicaciones 49-82, caracterizado además porque W, cuando está presente, es C=0.
84. El método de cualquiera de las reivindicaciones 49-83, caracterizado además porque Z y Z', cuando están presentes, son -CH2-.
85. El método de cualquiera de las reivindicaciones 49-84, caracterizado además porque X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este, y un grupo protector amina.
86. El método de la reivindicación 85, caracterizado además porque X' es -H, -OH, -Me o el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este.
87. El método de la reivindicación 86, caracterizado además porque X' es -H.
88. El método de cualquiera de las reivindicaciones 49-87, caracterizado además porque Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, un alquilo alquenilo o alquinilo lineal ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono.
89. El método de la reivindicación 88, caracterizado además porque Y' es -H u oxo.
90. El método de la reivindicación 89, caracterizado además porque Y' es -H.
91 . El método de cualquiera de las reivindicaciones 49-90, caracterizado además porque A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O-, -S-, -NR5-, y oxo -(C=0)-.
92. El método de la reivindicación 91 , caracterizado además porque A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O- y -S-.
93. El método de la reivindicación 92, caracterizado además porque A y A' son -O-.
94. El método de cualquiera de las reivindicaciones 49-93, caracterizado además porque D y D', cuando están presentes, son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 24, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, o un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, en donde el alquilo alquenilo y alquinilo son opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de halógeno, -OR, -NR'COR", -SR y -COR'.
95. El método de la reivindicación 94, caracterizado además porque D y D' son alquil lineal o ramificado que contiene 1 a 4 átomos carbono.
96. El método de la reivindicación 49, 50, 51 , o 71 , caracterizado además porque: W es C=0; R, , R2, R,\ R2', R„ y R4' son -H; uno de R3, o R3' es opcionalmente el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este y el otro es -H; R6 es -OMe; Z y Z' son -CH2-; X' es -H; Y' es -H; y A y A' son -O-.
97. El método de cualquiera de las reivindicaciones 49-96, caracterizado además porque el grupo de enlace con el grupo reactivo unido a este es cualquiera de la Lista 1 .
98. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -97, caracterizado además porque el compuesto citotóxico y la · porción del grupo de enlace del conjugado es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: o una sal farmacéuticamente aceptable de éste, en donde: Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03", S032" o HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (PO3SH3, PO2S2H2, POS3H2> PS4H2 o una sal de P03S3", P02S23", POS33" o PS43' formada con un catión), tío fosfato éster (RO^PSÍOFV), R¡S-, R'SO, R¡S02, R'SOa, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S20 formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCH2S02"Na+) o una mezcla de estos, en donde R1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -PO3H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo; X' es seleccionado de -H, un grupo protector amina, el grupo de enlace, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; Y' es seleccionado de -H, un grupo oxo, el grupo de enlace, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 1 0 átomos de carbono, un arilo de 6 a 1 8 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos; Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo de enlace; Ri , F¡2, R3. R4, R i ', R2', 3' y FV son cada uno independientemente seleccionados del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 1 0 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH¡>], -OR, -NR'R", -N02, -NCO, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03" M+, un sulfato -OS03'M+, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R" y el grupo de enlace; es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+; R, para cada aparición, es independientemente seleccionado del grupo que consiste de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 1 8 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos independientemente seleccionados de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; R' y R" son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2, -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH20)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P; n es un número entero de 1 a 24; W es seleccionado de C=0, C=S, CH2, BH, SO y S02; R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R", -N02, halógeno o el grupo de enlace; Z y Z' son independientemente seleccionados de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n.-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-0-(CH2)na.- y -(CH2)n-S-(CH2)na-; n' y na' son iguales o diferentes, y son seleccionados de 0, 1 , 2 y 3; R7 y Re son iguales o diferentes, y son cada uno independientemente seleccionados de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-, un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; Rg es independientemente seleccionado de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-; A y A' son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -O-, oxo (-C(=0)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-, R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono; D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o seleccionados del grupo que consiste de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, es el grupo de enlace, una unidad de polietilenglicol (- OCH2CH2)n-, un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene 1 a 6 heteroátomos independientemente seleccionados de O, S, N y P, en donde el alquilo o alquenilo es opcionalmente sustituido con el grupo de enlace; el fenilo o anillo heterocíclico o heteroarilo puede ser opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente puede comprender el grupo de enlace.
99. El método de la reivindicación 98, caracterizado además porque Y es -S02M, -S03M, 0 -OSO3M.
100. El método de la reivindicación 98 o 99, caracterizado además porque L está ausente, o es seleccionado de un grupo fenilo opcionalmente sustituido y un grupo piridilo opcionalmente sustituido, en donde el grupo fenilo y piridilo porta el grupo de enlace, o L es un grupo amina que porta el grupo de enlace (es decir, -N(grupo de enlace)-), o L es un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y que porta el grupo de enlace.
101 . El método de la reivindicación 98 o 99, caracterizado además porque el compuesto citotóxico unido al grupo de enlace es representado por cualquiera de las siguientes fórmulas: en donde: L', L", y L'" son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, - NR'R", -N02, -NR'COR", -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -S02R', un sulfonato -S03M, un sulfato -OS03M, una sulfonamida representada por -S02NR'R", ciano, un azido, -COR', -OCOR', - OCONR'R" y el grupo de enlace, siempre que solo uno de L', L", y L'" sea el grupo de enlace; y G es seleccionado de -CH- o -N-.
102. El método de la reivindicación 101 , caracterizado además porque uno de L', L", o U" es el grupo de enlace, mientras que los otros son -H.
103. El método de la reivindicación 102, caracterizado además porque L' es el grupo de enlace, y L" y L'" son -H.
104. El método de la reivindicación 102 o 103, caracterizado además porque A y A' son ambos -O-, R6 es -OMe, y G es -CH-.
105. El método de la reivindicación 102, 103, o 104, caracterizado además porque L' es representado por la siguiente fórmula: -W'-Rx-V-Ry-J, en donde: W y V son iguales o diferentes, y cada uno está independientemente ausente, o es seleccionado de -CReRe -, -O-, -0-C(=0)-, -C(=0)-0-, -S-, -SO-, - S02-, -CH2-S-, -CH20-, -CH2NRe-, -0-(C=0)0-, -0-(C=0)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)- C(=0)-, -C(=0)-N(Re)-, -N(Re)-C(=0)0-, -N(C(=0)Re)C(=0)-, -N(C(=0)Re)-, -(O- CH2-CH2)n-, -SS-, o -C(=0)-, o un aminoácido, o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos; Rx y Ry son iguales o diferentes, y cada uno está independientemente ausente, o es un alquilo, alquenilo, o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene 1 a 10 átomos de carbono, un arilo que porta 6 a 10 átomos de carbono o un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros que porta 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N o S; Re y Re son iguales o diferentes, y son seleccionados de -H, un alquilo, alquenilo, o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)„-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario {por ejemplo, -NHR101) o amino terciario (-NR,01R102) o un nitrógeno de 5 ó 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o morfolina, en donde R'01 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; preferentemente, R101 y R,02 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; n es un entero de 1 a 24; y J está covalentemente unido al CBA, y es seleccionado de una succinimida, un acetamido, -S-, -SS-, -CH2S-, -CH(Me)S-, -C(Me)2S-, -NRc1-, - CH2NRC'-, -NRC,N-, y -C(=0)-, en donde Rc1 es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene 1 a 4 átomos de carbono.
106. El método de la reivindicación 105, caracterizado además porque J es -S-, -SS-, una succinimida, o -C(=0)-.
107. El método de la reivindicación 105 o 106, caracterizado además porque: Re' es -H o -Me; Re es un un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rk; n es un entero de 2 a 8; y Rk es -H, -Me o -CH2CH2-NMe2.
108. El método de cualquiera de las reivindicaciones 105-107, caracterizado además porque V es un aminoácido o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos.
109. El método de la reivindicación 108, caracterizado además porque V es valina-citrulina, gly-gly-gly, o ala-leu-ala-leu.
1 10. El método de la reivindicación 105, caracterizado además porque: W es -O-, -N(Re)- o -N(Re)-C(=0)-; Re es -H, un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono, o -(CH2-CH2-0)n-Rk; R* es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; V está ausente, es -(0-CH2-CH2)n-, -C(=0)-NH-, -S-, -NH-C(=0)-; Ry está ausente o es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; y J es -S-, -SS-, o -C(=0)-.
1 1 1 . El método de la reivindicación 105, caracterizado además porque: W es -O-, -N(R8)- o -N(Re)-C(=0)-; Re es -H, -Me, o -(CH2-CH2-0)n-Me; n es un número entero de 2 a 6; R" es un alquilo lineal o ramificado que porta 1 a 6 átomos de carbono; V y Ry están ausentes; y J es -C(=0)-.
1 12. El método de la reivindicación 105, caracterizado además porque U es representado por la siguiente fórmula: -W'-[CR R2 ]s-V-[Cy]o.,-[CR3 Rr ]b-C(=0)-, en donde: Rr, R2-, y R3- son cada uno independientemente -H o -Me; R„' es -H, -Me, -S03H, o -S03'M+, en donde M+ es un catión farmacéuticamente aceptable; a es un número entero de 0-2, b es un número entero de 0-3; y, Cy es un anillo heterocíclico de 5 miembros opcionalmente sustituido que porta un N heteroátomo, preferentemente Cy es
1 13. El método de la reivindicación 105 o 1 12, caracterizado además porque W es -N(Re)-.
1 14. El método de la reivindicación 105, 1 12, o 1 13, caracterizado además porque Re es -(CH2-CH2-0)2-6-Rk, en donde Rk es un un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
115. El método de la reivindicación 105, 112, 113, o 114, caracterizado además porque V es -S- o -SS-.
116. El método de la reivindicación 105, 112, 113, 114, o 115, caracterizado además porque L' es representado por la siguiente fórmula: - NRe-[CRrR2"]a-S-[CR3 R4"]b-C(=0)-.
117. El método de la reivindicación 105, 112, 113, 114, o 115, caracterizado además porque el conjugado es: en donde r es un número entero de 1 a 10, Y es -S03M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
118. El método de la reivindicación 105, 112, 113, 114, 115, 116, o 117, caracterizado además porque el anticuerpo es huMy9-6.
119. El método de la reivindicación 105, 112, 113, 114, o 115, caracterizado además porque L' es representado por la siguiente fórmula: - NRe-[CRr'R2 ]a-S-Cy-[CR3 Rdb-C(=0)-.
120. El método de la reivindicación 105, 112, 113, 114, 115, o 119, caracterizado además porque el conjugado es: en donde r es un número entero de 1 a 10, Y es -S03 , y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
121. El método de la reivindicación 105, 112, 113, 114, 115, 119, o 120, caracterizado además porque el anticuerpo es huMy9-6.
122. El método de la reivindicación 98, 99, o 101, caracterizado además porque el compuesto citotoxico unidos al grupo de enlace es representado por la siguiente fórmula: donde: W está ausente, o es seleccionado de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=0)-, - N(C(=0)Re)-, -S-, -CH2-S-, o -CH2NRe-; Rx está ausente o es seleccionado de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un amino secundario {por ejemplo, -NHR101) o un grupo amino terciario (-NR,01R 102) o un nitrógeno de 5 ó 6 miembros que contiene heterociclo, tal como piperidina o moríolina, en donde R'01 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono; n es un número entero de 2 a 6; Zs está enlazado al CBA, y es seleccionado de: un enlace; en donde: q es un número entero de 1 a 5; y, M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+ o K+
123. El método de la reivindicación 122, caracterizado además porque Zs es:
124. El método de la reivindicación 122 o 123., en donde W es -N(Re)-.
125. El método de la reivindicación 124, caracterizado además porque Re es -(CH2-CH2-0)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
126. El método de la reivindicación 125, caracterizado además porque Rk es -H o -Me, n es 4, y q es 2.
127. El método de la reivindicación 126, caracterizado además porque Rx es un un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
128. El método de la reivindicación 126, en donde R es -(CH2)p-(CR'R9)-, caracterizado además porque Rf y R9 son cada uno independientemente seleccionados de H o un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 4 átomos de carbono; y p es 0, 1 , 2 o 3.
129. El método de la reivindicación 128, caracterizado además porque R1 y R9 son iguales o diferentes, y son seleccionados de H y Me; y p es 1 .
130. El método de cualquiera de las reivindicaciones 122-129, caracterizado además porque: Y es -S03M: M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable {por ejemplo, Na+); X' y Y' son ambos -H; A y A' son ambos -O-; R6 es -OMe; y R es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono.
131 . El método de cualquiera de las reivindicaciones 98-129, caracterizado además porque Y se selecciona de -S03M, -S02M y un sulfato -OS03M.
132. El método de la reivindicación 131 , caracterizado además porque Y es -S03M.
133. El método de cualquiera de las reivindicaciones 131 -132, caracterizado además porque M es -H, Na+ o K+.
134. El método de cualquiera de las reivindicaciones 98-133, caracterizado además porque W, cuando está presente, es C=0.
135. El método de cualquiera de las reivindicaciones 98-134, caracterizado además porque Z y Z', cuando están presentes, son -CH2-.
136. El método de cualquiera de las reivindicaciones 98-135, caracterizado además porque X' es seleccionado del grupo que consiste de -H, -OH, es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, el grupo de enlace y un grupo protector amina.
137. El método de la reivindicación 136, caracterizado además porque X' es -H, -OH, -Me o el grupo de enlace.
138. El método de la reivindicación 137, caracterizado además porque X' es -H.
139. El método de cualquiera de las reivindicaciones 98-138, caracterizado además porque Y' es seleccionado del grupo que consiste de -H, un grupo oxo, un alquilo alquenilo o alquinilo lineal ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono.
140. El método de la reivindicación 139, caracterizado además porque Y' es -H u oxo.
141 . El método de la reivindicación 140, caracterizado además porque Y' es -H.
142. El método de cualquiera de las reivindicaciones 98-141 , caracterizado además porque A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O-, -S-, -N(R5)-, y oxo (C=0).
143. El método de la reivindicación 142, caracterizado además porque A y A' son iguales o diferentes, y son seleccionados de -O- y -S-.
144. El método de la reivindicación 143, caracterizado además porque A y A' son -O-.
145. El método de cualquiera de las reivindicaciones 98-144, caracterizado además porque D y D', cuando están presentes, son iguales o diferentes, y son independientemente seleccionados de una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 24, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, o un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, en donde el alquilo alquenilo y alquinilo son opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de halógeno, -OR, -NR'COR", -SR y -COR'.
146. El método de la reivindicación 145, caracterizado además porque D y D' son alquilo lineal o ramificado que contiene 1 a 4 átomos carbono.
147. El método de la reivindicación 98, 99, 101 , o 122, caracterizado además porqué: Y es -SO3M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (tal como Na+); W es C=0; R, , R2, R,', R2', R4 y R4' son -H; uno de R3, o R3' es opcionalmente el grupo de enlace y el otro es -H; R6 es -OMe; Z y Z' son -CH2-; X' es -H; Y' es -H; y A y A' son -O-.
148. El método de cualquiera de las reivindicaciones 98-147, caracterizado además porque el conjugado comprende 1 -10 compuestos citotóxicos, cada compuesto citotóxico está unido al CBA a través del grupo de enlace, y cada compuesto citotóxico en el conjugado es el mismo.
149. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9 y 14-22, caracterizado además porque el conjugado comprende 1 -10 compuestos citotóxicos modificados, cada compuesto citotóxico modificado está unido al CBA a través del grupo de enlace, y cada compuesto citotóxico modificado en el conjugado es el mismo.
150. El método de cualquiera de las reivindicaciones 98-149, caracterizado además porque el agente de unión celular se une a las células diana seleccionadas de células tumorales, células infectadas por virus, células infectadas por microorganismos, células infectadas por parásitos, células autoinmunes, células activadas, células mieloides, células T activadas, células B o melanocitos; células que expresan el CD4, CD6, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, EpCAM, CanAg, CALLA, o antígenos Her-2; antígenos Her-3; o células que expresan el receptor factor de crecimiento insulínico, receptor del factor de crecimiento epidérmico, y receptor de folato.
151 . El método de la reivindicación 150, caracterizado además porque el agente de unión celular es un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla, o un fragmento de anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una célula diana, un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo quimérico que se une específicamente a la célula diana, un dominio de anticuerpo, un fragmento de dominio de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, una línfoquina, una hormona, una vitamina, un factor de crecimiento, un factor estimulante de colonias, o una molécula de transporte de nutrientes.
152. El método de la reivindicación 151 , caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo revestido, un anticuerpo de cadena sencilla revestido, o un fragmento de anticuerpo revestido.
153. El método de la reivindicación 151 , caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla, o un fragmento de anticuerpo monoclonal de este.
154. El método de la reivindicación 151 , caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena sencilla humanizado, o un fragmento de anticuerpo humanizado.
1 55. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-1 54, caracterizado además porque el reactivo de imina reactivo es seleccionado del grupo que consiste de sulfitos (H2S03, H2S02 o una sal de HS03", S032' o HS02" formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono, di, tri, y tetra- tiofosfatos (PO3SH3, P02S2H3, POS3H3, PS4H3 o una sal de P03S3", P02S23", POS33" o PS„3" formada con un catión), tio fosfato ásteres ((RiO)2PS(ORi), R¡SH, R¡SOH, R'SOaH, R'SOaH), varias aminas (hidroxil amina (por ejemplo, NH2OH), hidrazina {por ejemplo, NH2NH2), NH20-R', R''NH-R', NH2-R¡), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2 tiosulfato (H2S203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (H2S204 o una sal de S20 2' formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=0)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONHNH2), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02H o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCH2S02"Na+), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de estos, en donde R' y R' son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 1 0 átomos de carbono y son sustituidos con al menos un sustituyeme seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R1 y R' pueden ser además opcionalmente sustituidos con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R¡ es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo.
156. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-1 54, caracterizado además porque el reactivo de imina reactiva se selecciona de sulfitos, hidroxilamina, hidrazina y urea.
157. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-154, caracterizado además porque el reactivo de imina reactiva es NaHS03o KHS03.
158. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-157, caracterizado además porque se usa aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 equivalentes molares del reactivo de imina reactiva al compuesto citotóxico que contiene imina.
159. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-157, caracterizado además porque se usa aproximadamente 1 a aproximadamente 10 equivalentes molares del reactivo de imina reactiva al compuesto citotóxico que contiene imina.
160. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-157, caracterizado además porque se usa aproximadamente 3 a aproximadamente 5 equivalentes molares del reactivo de imina reactiva al compuesto citotóxico que contiene imina.
161 . El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -160, caracterizado además porque el agente de reticulación bifuncional es: una porción basada en maleimido seleccionada de: N-succinimidil 4- (maleimidometilo)ciclohexanocarboxilato (S CC), N-succinimidil-4-(N- maleimidometilo)-ciclohexano-1 -carbox¡-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), N- succinimidil éster del ácido n-maleimidoundecanoico (KMUA), N-succinimidil éster del ácido ' -maleimidobutírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido - maleimidocaproico (EMCS), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), N-(r '-maleimidoacetoxi)-succinimida éster (AMAS), succinimidil-6-(r - maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidofen¡lo)- butirato (SMPB), N-(p-maleimidofenilo)isocianato (PMPI), A -succinimidil-4-(4- nitropiridil-2-ditio)butanoato; o, una porción basada en haloacetilo seleccionada de: N-succinimidil-4-(yodoacetilo)- aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), y N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), bis- maleimidopolietilenoglicol (BMPEO), BM(PEO)2, B (PEO)3, N-(l - maleimidopropiloxi)succinimida éster (BMPS), ácido 5-maleimidovalérico NHS, HBVS, ácido 4-(4-N-maleímidofenil)-butirico hidrazida»HCI (MPBH), Succinimidil- (4-vinilsulfonilo)benzoato (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1 ,4-bis- maleimidobutano (BMB), 1 ,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis- maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), sulfosuccinimidil 4-(N- maleimido-metilo)ciclohexano-1 -carboxilato (sulfo-S CC), sulfosuccinimidil(4- yodo-acetilo)aminobenzoato (sulfo-SIAB), m-maleimidobenzoil-N- hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), N-(i - maleimidobutriloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-GMBS) , N-(f - maleimidocaproiloxi)sulfosuccimido éster (sulfo-EMCS), N-(l - maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-KMUS), sulfosuccinimidil 4- (p-maleimidofenilo)butirato (sulfo-SMPB), CX 1 - 1 , sulfo-Mal y PEGn-Mal.
162. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -161 , caracterizado además porque el agente de reticulación bifuncional es seleccionado del grupo que consiste de SMCC, Sulfo-SMCC, BMPS, GMBS, SIA, SIAB, /V-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, bis-maleimidohexano o BMPEO.
163. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 62, caracterizado además porque el conjugado se purifica por filtración en flujo tangencial, cromatografía de adsorción, filtración por adsorción, precipitación selectiva, filtración no absorbente o combinación de los mismos.
164. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -162, caracterizado además porque el conjugado se purifica por filtración en flujo tangencial y/o cromatografía de adsorción.
165. Un método para preparar un conjugado de la siguiente fórmula: el método comprende reaccionar un compuesto citotóxico modificado de la siguiente fórmula, con un CBA modificado de la siguiente fórmula, respectivamente, a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, caracterizado porque: r es un entero de 1 a 10; Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HS03, HS02 o una sal de HS03', S032' o HS02" formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra- tiofosfato (P03SH3, P02S2H2, POS3H2, PS4H2 o una sal de P03S3', P02S23', POS33" o PS„3' formada con un catión), tio fosfato éster (RiO)2PS(ORi), R'S-, R¡SO, R¡S02, R'S03, tiosulfato (HS203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (HS204 o una sal de S20 2" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk )(S)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk C(=0)NOH o una sal formada con un catión), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02" o una sal de HOCH2S02' formada con un catión, tal como HOCH2S02"Na+) o una mezcla de estos, en donde R1 es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y es sustituido con al menos un sustituyeme seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' puede ser además opcionalmente sustituido con un sustituyeme para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo; preferentemente Y es -S03M; y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
166. El método de la reivindicación 165, caracterizado además porque Y es -S03M; y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
167. El método de la reivindicación 165 o 166, caracterizado además porque el compuesto citotóxico modificado se produce reaccionando un reactivo de ¡mina reactiva con un compuesto citotóxico que contiene ¡mina de la siguiente fórmula:
168. El método de cualquiera de las reivindicaciones 165-167, caracterizado además porque el CBA es huMy9-6.
169. Un método para preparar un conjugado de la siguiente fórmula: el método comprende reaccionar el CBA con un compuesto citotóxico que contiene ¡mina, un reactivo de ¡mina reactivo, y un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo de enlace para formar el conjugado, caracterizado porque: el compuesto citotóxico que contiene imina es: el agente de reticulación bifuncional es: el reactivo de imina reactivo es seleccionado de: sulfitos (H2S03, H2S02 o una sal de HS03", S032' or HS02' formada con un catión), metabisulfito (H2S205 o una sal de S2052" formada con un catión), mono, di, tri, y tetra- tiofosfatos (P03SH3, P02S2H3, POS3H3, PS4H3 o una sal de P03S3', P02S23", POS33" o PS43' formada con un catión), tio fosfato ésteres ((R'OfePSÍOFT), FVSH, R'SOH, RiS02H, R¡S03H), varias aminas (hidroxil amina {por ejemplo, NH2OH), hidrazina (por ejemplo, NH2NH2), NH20-R¡, R'NH-R1, NH^R1), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2 tiosulfato (H2S203 o una sal de S2032" formada con un catión), ditionita (H2S204 o una sal de S2042" formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal de este formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=0)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONHNH2), formaldehído sulfoxilato (HOCH2S02H o una sal de HOCH2S02" formada con un catión, tal como HOCH2S02'Na+), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de estos, en donde R' y R1 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 10 átomos de carbono y son sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de -N(R')2, -C02H, -S03H, y -P03H; R' y R' pueden ser además opcionalmente sustituidos con un sustituyente para un alquilo descrito en la presente; R' es un alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo.
170. El método de la reivindicación 169, caracterizado además porque Y es -S03M; y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
171 . El método de la reivindicación 169 o 170, caracterizado además porque el CBA es huMy9-6.
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