BRPI1008532B1 - Arcabouço de proteína isolada, método para construção de uma biblioteca de arcabouço de proteína isolada, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de ácido nucleico isolado, célula hospedeira de bactéria ou fungo, composição, dispositivo médico e artigo de manufatura para uso farmacêutico ou de diagnóstico em seres humanos - Google Patents

Abstract

composições, métodos e usos para arcabouço com base no domínio de fibronectina tipo iii. a presente invenção refere-se a um arcabouço de proteína com base em uma sequência consenso de uma décima repetição da fibronectina tipo iii (fn3) obtida de fibronectina humana, incluindo ácidos nucleicos isolados que codificam um arcabouço de proteína, vetores, células hospedeiras, e métodos de preparo e uso dos mesmos tendo aplicações em dispositivos, métodos e composições terapêuticas ou de diagnóstico. em particular, moléculas de arcabouço de proteína ligadas para igg com base na sequência consenso foram identificadas como úteis para aplicações terapêuticas ou de diagnóstico.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a arcabouço de proteína compropriedades inovadoras, inclusive a capacidade de ligar-se a alvos celulares. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um arcabouço de proteína com base em uma sequência consenso de uma repetição da fibronectina tipo III (FN3).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Os anticorpos monoclonais são a classe mais amplamenteusada de proteínas terapêuticas quando são desejadas alta afinidade e especificidade para uma molécula-alvo. Entretanto, proteínas não anticorpo que possam ser manipuladas para ligar-se a esses alvos também são de alto interesse na indústria biofarmacêutica. Essas proteínas de "arcabouço alternativo" podem apresentar vantagens sobre anticorpos tradicionais, devido a seu pequeno tamanho, falta de ligações dissulfeto, alta estabilidade e capacidade de serem expressas em hospedeiros procarióticos. Novos métodos de purificação são facilmente aplicados; eles são facilmente conjugados a fármacos/to- xinas, penetram de modo eficaz em tecidos e são prontamente formatados em ligantes multiespecíficos (Skerra 2000; Binz e Pluckthun 2005).

[0003] Um desses arcabouços alternativos é a dobra deimunoglobulina (Ig). Essa dobra é encontrada nas regiões variáveis dos anticorpos, bem como milhares de proteínas não anticorpo. Demonstrou-se que uma proteína Ig desse tipo, a décima repetição de fibronectina tipo III (FN3) obtida de fibronectina humana, pode tolerar inúmeras mutações em laços expostos na superfície, ao mesmo tempo em que retém a estrutura geral da dobra de Ig. Desta forma, bibliotecas de variantes de aminoácido foram construídas nestes laços e ligantes específicos foram selecionados para inúmeros alvos diferentes (Koide et al. 1998; Karatan et al. 2004). Observou-se que tais domínios FN3 manipulados se ligam a alvos com alta afinidade, embora retenham propriedades biofísicas importantes (Parker et al. 2005).

[0004] As propriedades físicas desejáveis de potenciais moléculasde arcabouço alternativo incluem alta estabilidade térmica e reversibilidade de dobragem e desdobragem térmica. Vários métodos foram aplicados para aumentar a estabilidade térmica aparente de proteínas e enzimas, incluindo design racional com base em comparação a sequências termoestáveis altamente similares, design de pontes de dissulfeto estabilizantes, mutações para aumentar a propensão da a-hélice, manipulação de pontes salinas, alteração da carga superficial da proteína, evolução dirigida, e composição de sequências consenso (Lehmann e Wyss 2001). A alta estabilidade térmica é uma propriedade desejada desses arcabouços, já que pode aumentar o rendimento da proteína recombinante obtida, otimizar a solubilidade da molécula purificada, otimizar a atividade dos arcabouços intracelulares, diminuir a imunogenicidade, e minimizar a necessidade por uma cadeia fria na fabricação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A presente invenção apresenta um arcabouço de proteínabaseado em uma proteína de repetição da fibronectina tipo III (FN3), ácidos nucleicos codificantes ou complementares, vetores, células hospedeiras, composições, combinações, formulações, dispositivos e métodos para fabricação e uso do mesmo. Em uma modalidade preferencial, o arcabouço de proteína é composto por uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 de fibronectina humana. Em uma outra modalidade preferencial, o arcabouço de proteína da presente invenção é uma sequência consenso de 7 domínios FN3. Os arcabouços de proteína da invenção podem ser projetados para ligar várias moléculas, por exemplo uma proteína-alvo celular.

[0006] Os arcabouços de proteína da invenção podem incluirmoléculas ou porções adicionais, por exemplo, a região Fc de um anticorpo, um domínio de ligação a albumina, ou outra porção que influencie a meia-vida. Em modalidades adicionais, os arcabouços de proteína da invenção podem ser ligados a uma molécula de ácido nucleico que possa codificar o arcabouço de proteína.

[0007] A presente invenção apresenta, também, pelo menos ummétodo para expressão de pelo menos um arcabouço de proteína baseado em uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3, em uma célula hospedeira, compreendendo cultivar a célula hospedeira conforme descrito na presente invenção, sob condições nas quais pelo menos um arcabouço de proteína seja expresso em quantidades detectáveis e/ou recuperáveis.

[0008] A presente invenção apresenta, também, pelo menos umacomposição compreendendo: (a) um arcabouço de proteína baseado em uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 e/ou ácido nucleico codificante conforme descrito na presente invenção, e (b) um veículo ou diluente adequado e/ou farmaceuticamente aceitável.

[0009] A presente invenção compreende, adicionalmente, ummétodo de gerar bibliotecas de um arcabouço de proteína com base em uma proteína de repetição da fibronectina tipo III (FN3), de preferência, uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 e, com mais preferência, uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 de fibronectina humana. A biblioteca é formada mediante a produção de sucessivas gerações de arcabouços, alterando-se (por mutação) os aminoácidos ou o número de aminoácidos nas moléculas, em posições específicas nas porções do arcabouço, por exemplo nas regiões de laço. As bibliotecas podem ser geradas pela alteração da composição de aminoácido de um único laço ou a alteração simultânea de múltiplos laços. Os laços que são alterados podem ser alongados ou encurtados de acordo com a necessidade. Essas bibliotecas podem ser geradas para incluir, em cada posição, todos os aminoácidos possíveis ou um determinado subconjunto de aminoáci- dos. Os elementos da biblioteca podem ser usados para triagem por apresentação, como apresentação in vitro (DNA, RNA, apresentação em ribossomo) e apresentação em fago.

[00010] Os arcabouços de proteína da presente invenção oferecem propriedades biofísicas otimizadas, como estabilidade sob condições redutoras e solubilidade em altas concentrações, podendo ser expressos e dobrados em sistemas procarióticos como E. coli, em sistemas eucarióticos como levedura, e em sistemas de transcrição/translação in vitro como o sistema de lisado de reticulócitos de coelho.

[00011] Em um aspecto adicional, a presente invenção apresenta um método para geração de uma molécula de arcabouço que se liga a um alvo particular percorrendo a biblioteca de arcabouços da invenção com os ligantes de alvo e detecção. Em outros aspectos relacionados, a invenção compreende métodos de triagem que podem ser usados para gerar ou amadurecer por afinidade os arcabouços de proteína com a atividade desejada, por exemplo capazes de ligação a proteínas-alvo com uma certa afinidade. A maturação por afinidade pode ser obtida mediante ciclos iterativos de mutagênese e seleção, usando sistemas como exibição de fago ou exibição in vitro. A mutagênese durante esse processo pode ser o resultado de mutagênese direcionada pelo sítio a resíduos de arcabouço específicos, mutagênese aleatória devida a PCR propenso a erro, embaralhamento de DNA e/ou uma combinações dessas técnicas. A presente invenção apresenta, adicionalmente, qualquer invenção aqui descrita.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00012] Figura 1. Estrutura do domínio FN3. Estrutura cristalina do 10° domínio FN3 de fibronectina humana (PDB 1TTF) (Main, et al., Cell 71: 671-8, 1992). Os laços B:C, D:E, e F:G que foram submetidos a diversificação estão identificados.

[00013] Figuras 2A-N. Perfis de fusão dos domínios FN3 purificados (com exceção do 7° domínio) de fibronectina humana como determinado por DSC em PBS pH 7,4.

[00014] Figura 3. Alinhamento de múltiplas sequências dos 15 domínios FN3 de fibronectina humana. O alinhamento foi produzido usando o programa VectorNTI.

[00015] Figura 4. Alinhamento de múltiplas sequências dosdomínios FN3 1, 5, 8, 10, 12, 14, e 15 de fibronectina humana. O alinhamento foi produzido usando o programa VectorNTI.

[00016] Figuras 5A e B. Expressão e purificação de fibcon. A) Uma análise de SDS-PAGE a 4-12% mostrando o lisado celular total, a fração solúvel, fluxo em Ni-NTA, e frações eluídas da coluna de Ni- NTA. B) Purificação em Superdex 75 de fibcon em PBS. As setas mostram o volume de eluição e a massa dos padrões de peso molecular.

[00017] Figura 6. Calorimetria de varredura diferencial de fibcon em PBS pH 7,4.

[00018] Figura 7. Desdobramento induzido por Gu-HCl de fibcon monitorado por fluorescência de triptofano intrínseca. A excitação foi a um comprimento de onda de 280 nm e emissão a 365 nm.

[00019] Figura 8. A sequência de aminoácidos de fibcon mostrando a localização dos laços A-B, B-C, C-D, D-E, E-F, F-G.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[00020] A presente invenção apresenta um arcabouço de proteína isolado, recombinante e/ou sintético baseado em uma proteína de repetição de fibronectina tipo III (FN3) incluindo, sem limitação, arcabouço derivado de mamífero, bem como composições e moléculas de ácido nucleico codificantes compreendendo pelo menos um polinucleotídeo que codifica um arcabouço de proteína baseado no décimo domínio FN3. A presente invenção inclui adicionalmente, mas não se limita a, métodos para fabricação e uso desses ácidos nucleicos e arcabouços de proteína, inclusive composições, métodos e dispositivos diagnósticos e terapêuticos.

[00021] Os arcabouços de proteína da presente invenção oferecem vantagens sobre a terapêutica convencional, como a capacidade de administração local, oral ou através da barreira sangue-cérebro, a capacidade de expressão em E. Coli, que permite um aumento na expressão de proteína como uma função dos recursos versus expressão das células de mamífero, a capacidade de ser manipulada em moléculas biespecíficas que se ligam a múltiplos alvos ou múltiplos epítopos do mesmo alvo, a capacidade para conjugação a fármacos, polímeros e sondas, a capacidade de ser formulado em altas concentrações, e a capacidade dessas moléculas para penetrar de maneira eficaz os tecidos doentes e os tumores.

[00022] Além do mais, os arcabouços de proteína apresentam muitas das propriedades dos anticorpos em relação a sua dobragem, que imita a região variável de um anticorpo. Essa orientação permite que os laços de FN3 sejam expostos de modo similar ao das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo. Os mesmos precisam ser capazes de ligar-se a alvos celulares, e os laços podem ser alterados, por exemplo maturados por afinidade, para otimizar certas propriedades de ligação ou propriedades relacionadas.

[00023] Três dos seis laços do arcabouço de proteínas da invenção correspondem topologicamente às regiões determinantes de complementaridade (CDRs de 1 a 3), isto é, as regiões de ligação a antígeno de um anticorpo, enquanto os três laços restantes são expostos na superfície de maneira similar às CDRs de anticorpos. Esses laços abrangem os resíduos 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 e 75-81 da SEQ. ID N° 16, conforme mostrado na Tabela 3, abaixo, e na figura 8. De preferência, as regiões de laço nos resíduos 22-28, 51-54 e 75-81 são alteradas para especificidade e afinidade de ligação. Estas regiões de laço são randomizadas para popular uma biblioteca e ligantes potentes podem ser selecionados a partir da biblioteca que tem alta afinidade para um alvo de proteína particular. Uma ou mais das regiões de laço podem interagir com uma proteína-alvo, de modo similar a uma interação de CDR de anticorpo com a proteína.

[00024] Os arcabouços da presente invenção podem incorporar outras subunidades, por exemplo via interação covalente. O todo ou uma porção de uma região constante de um anticorpo pode ser ligado ao arcabouço para conferir ao mesmo propriedades similares às de um anticorpo, por exemplo atividade de complemento (ADCC), meia- vida, etc. Por exemplo, a função efetora pode ser oferecida e/ou controlada, por exemplo, modificando-se a ligação C1q e/ou a ligação FCYR e, desse modo, alterando-se a atividade de CDC e/ou de ADCC. As "funções efetoras" são responsáveis pela ativação ou diminuição de uma atividade biológica (por exemplo, em um indivíduo). Os exemplos de funções efetoras incluem, mas não se limitam a: ligação C1q, citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação ao receptor Fc, citotoxicidade mediada por células e dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, regulação para baixo de receptores na superfície celular (por exemplo, receptor para célula B, BCR), etc. Essas funções efetoras podem requerer que a região Fc seja combinada a um domínio de ligação (por exemplo, laços do arcabouço de proteína) e podem ser avaliadas com o uso de vários testes (por exemplo, testes de ligação de Fc, testes de ADCC, testes de CDC, etc.).

[00025] Adicionalmente, moléculas de um conjugado de toxinas, de albumina, de ligantes de albumina ou de polietileno glicol (PEG) podem ser ligadas à molécula de arcabouço para obtenção de propriedades desejadas. Qualquer dessas fusões pode ser gerada por meio de técnicas-padrão, por exemplo, mediante expressão da proteína de fusão a partir de um gene de fusão recombinante construído com o uso de sequências gênicas publicamente disponíveis.

[00026] Os arcabouços da presente invenção podem ser usados como monoespecíficos sob forma monomérica, ou como bi ou multiespecíficos (para diferentes proteínas-alvo ou diferentes epítopos na mesma proteína-alvo) sob forma multimérica. As ligações podem ser covalentes ou não covalentes. Por exemplo, um arcabouço biespecífico dimérico tem uma subunidade com especificidade para uma primeira proteína-alvo ou epítopo e uma segunda subunidade com especificidade para uma segunda proteína-alvo ou epítopo. As subunidades do arcabouço podem estar unidas em uma variedade de conformações que podem aumentar a valência e, portanto, a avidez da ligação ao antígeno.

[00027] Para uso na presente invenção, um “anticorpo" inclui qualquer molécula contendo proteína ou peptídeo que compreenda pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina incluindo, mas não se limitando a, pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve, ou um porção de ligação do ligante da mesma, uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região de estrutura, ou qualquer porção das mesmas. Esse anticorpo opcionalmente afeta, ainda, um ligante específico incluindo, mas não se limitando a, os casos em que o anticorpo modula, diminui, aumenta, antagoniza, agoniza, mitiga, alivia, bloqueia, inibe, anula e/ou interfere com pelo menos uma atividade ou ligação, ou com a atividade ou ligação do receptor, in vitro, in situ e/ou in vivo.

[00028] O termo "anticorpo" se destina, adicionalmente, a abranger anticorpos, fragmentos de digestão, porções especificadas e suas variantes, incluindo, sem limitação, mimetismo de anticorpo ou compreendendo porções de anticorpos que imitam a estrutura e/ou a função de um anticorpo ou fragmento especificado ou porção do mesmo, incluindo, sem limitação, anticorpos de cadeia única, anticor-pos de domínio único e fragmentos dos mesmos. Os fragmentos funcionais incluem fragmentos de ligação a antígeno que se ligam a um alvo específico. Por exemplo, fragmentos de anticorpo capazes de ligação a um alvo específico ou porções do mesmo, incluindo, mas não se limitando a, fragmentos Fab (por exemplo, mediante digestão por papaína), Fab' (por exemplo, mediante digestão por pepsina e redução parcial) e F(ab’)2 (por exemplo, mediante digestão por pepsina), facb (por exemplo, mediante digestão por plasmina), pFc’ (por exemplo, mediante digestão por pepsina ou por plasmina), Fd (por exemplo, mediante digestão por pepsina, redução parcial e reagregação), Fv ou scFv (por exemplo, mediante técnicas de biologia molecular), estão abrangidos pela invenção (vide, por exemplo, Colligan, Immunology, supracitado).

[00029] Tais fragmentos podem ser produzidos por clivagem enzimática, técnicas sintéticas ou recombinantes, conforme conhecido na técnica e/ou conforme descrito na presente invenção. Os anticorpos podem também ser produzidos em uma variedade de formas truncadas com o uso de genes de anticorpo nos quais um ou mais códons de parada foram introduzidos a montante do sítio de parada natural. Por exemplo, um gene de combinação que codifica uma porção de cadeia pesada F(ab')2 pode ser projetado para incluir sequências de DNA que codificam o domínio CH1 e/ou a região de articulação da cadeia pesada. As várias porções de anticorpos podem ser unidas quimicamente por técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua com o uso de técnicas de engenharia genética.

[00030] Uma proteína de arcabouço da presente invenção pode ser usada para medir ou obter um efeito em uma célula, tecido, órgão ou animal (inclusive mamíferos e seres humanos), para diagnosticar, monitorar, modular, tratar, aliviar, ajudar a prevenir a incidência de, ou reduzir os sintomas de, pelo menos uma doença ou condição selecionada de, mas não se limitando a, pelo menos uma dentre transtorno ou doença imunológico, transtorno ou doença cardiovascular, transtorno ou doença infeccioso, maligno e/ou neurológico, ou outra condição relacionada conhecida ou especificada.

[00031] Esse tipo de método pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma proteína de arcabouço a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente precisando de tal modulação, tratamento, alívio, prevenção ou redução nos sintomas, efeitos ou mecanismos. A quantidade eficaz pode compreender de cerca de 0,001 a 500 mg/kg por administração única (por exemplo, bólus), múltipla ou contínua, ou o suficiente para atingir uma concentração sérica de 0,01 a 5.000 μg/ml por administração única, múltipla ou contínua, ou qualquer faixa ou valor eficaz nesse intervalo, conforme realizado e determinado mediante o uso de métodos conhecidos, conforme descrito na presente invenção ou conhecido nas técnicas relevantes.

Proteína de Arcabouço da Presente Invenção - Produção e Geração

[00032] A pelo menos uma proteína de arcabouço da presente invenção pode ser opcionalmente produzida por uma linhagem de células, uma linhagem mista de células, uma célula imortalizada ou uma população clonal de células imortalizadas, conforme é bem- conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Ausubel, et al., editores, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY, E.U.A. (1987-2001), Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989), Harlow e Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989), Colligan, et al., editores, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY, EUA (1994-2001), Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, E.U.A., (1997-2001).

[00033] Os aminoácidos obtidos de uma proteína de arcabouço podem ser alterados, adicionados e/ou deletados para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, acentuar ou modificar a ligação, a afinidade, velocidade de associação, velocidade de dissociação, avidez, especificidade, meia-vida, estabilidade, solubilidade ou qualquer outra característica adequada, conforme é conhecido na técnica.

[00034] Opcionalmente, as proteínas de arcabouço podem ser manipuladas com retenção de alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar esse objetivo, as proteínas de arcabouço podem ser opcionalmente preparadas por meio de um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos manipulados conceituais usando-se modelos tridimensionais das sequências parentais e manipuladas. Os modelos tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para os versados na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de sequências candidatas selecionadas, e podem medir a possível imunogenicidade (por exemplo, o programa Immunofilter da Xencor, Inc., de Monrovia, CA, EUA). A inspeção dessas exibições permite a análise do provável papel desempenhado pelos resíduos no funcionamento da sequência candidata, isto é, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da proteína de arcabouço candidata para ligar-se a seu antígeno. Desse modo, os resíduos podem ser selecionados e combinados a partir das sequências parental e de referência, de modo que seja obtida a característica desejada, como afinidade por um ou mais antígenos-alvo. Alternativamente, ou adicionalmente aos procedimentos acima citados, podem ser usados outros métodos de engenharia adequados.

Triagem

[00035] A triagem de arcabouços de proteína para ligação específica a proteínas similares ou fragmentos pode ser convenientemente obtida com o uso de bibliotecas de exibição de nucleotídeo (exibição de DNA ou RNA) ou peptídeo, por exemplo exibição in vitro. Esse método envolve a triagem de amplas coleções de peptídeos quanto a membros individuais com a função ou a estrutura desejada. As sequências de nucleotídeo ou peptídeo exibidas podem ter um comprimento de 3 a 5.000 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, frequentemente de 5 a 100 aminoácidos e, frequentemente, de cerca de 8 a 25 aminoácidos. Além dos métodos de síntese química direta para geração de bibliotecas de peptídeos, foram descritos vários métodos com DNA recombinante. Um tipo envolve a exibição de uma sequência de peptídeo na superfície de um bacteriófago ou célula. Cada bacteriófago ou célula contém a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de peptídeo específica exibida. Esses métodos são descritos nas publicações de patente PCT n° 91/17271, 91/18980, 91/19818 e 93/08278.

[00036] Outros sistemas para geração de bibliotecas de peptídeos têm aspectos tanto da síntese química in vitro como dos métodos recombinantes. Vide as publicações de patente PCT n° 92/05258, 92/14843 e 96/19256. Vide, também, as patentes U.S. n° 5.658.754 e 5.643.768. As bibliotecas de exibição de peptídeos, o vetor e os kits para triagem estão disponíveis comercialmente junto a fornecedores como Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA), e Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido). Vide, por exemplo, as patentes U.S. n° 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260 e 5856456 atribuídas a Enzon, 5223409, 5403484, 5571698 e 5837500 atribuídas a Dyax, 5427908 e 5580717 atribuídas a Affymax, 5885793 atribuída a Cambridge Antibody Technologies, 5750373 atribuída a Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493 e 5698417 atribuídas a Xoma, Colligan, supracitado, Ausubel, supracitado, ou Sambrook, supracitado.

[00037] Os arcabouços de proteína da invenção podem ligar-se a proteínas humanas ou de outros mamíferos, com uma ampla gama de afinidades (KD). Em uma modalidade preferencial, pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção pode, opcionalmente, ligar-se a uma proteína-alvo com um grau muito alto de afinidade, por exemplo com uma KD igual a ou menor que cerca de 10-7 M, incluindo, mas não se limitando a, de 0,1 a 9,9 (ou qualquer faixa ou valor nesse intervalo) X 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 ou qualquer faixa ou valor nesse intervalo, conforme determinado por ressonância de plásmon de superfície ou pelo método KinExA, conforme praticado pelos versados na técnica.

[00038] A afinidade ou avidez de um arcabouço de proteína a um antígeno pode ser determinada de modo experimental com o uso de qualquer método adequado. (Vide, por exemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY, EUA (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman e Company: New York, NY, EUA (1992); e métodos aqui descritos). A afinidade medida de uma interação específica entre arcabouço de proteínae antígeno pode variar se for medida sob diferentes condições (por exemplo, concentração de sal, pH). Portanto, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação a antígeno (por exemplo, KD, Kon, Koff) são, de preferência, feitas com soluções padronizadas de arcabouço de proteína e antígeno, e com um tampão padronizado, como o tampão aqui descrito.

[00039] Ensaios competitivos podem ser realizados com o arcabouço de proteína da presente invenção, de modo a determinar quais proteínas, anticorpos e outros antagonistas competem pela ligação a uma proteína-alvo com o arcabouço de proteína da presente invenção, e/ou compartilham a região de epítopo. Esses ensaios, conforme é prontamente conhecido pelos versados na técnica, avaliam a competição entre antagonistas ou ligantes por um número limitado de sítios de ligação em uma proteína. Imobiliza-se ou torna-se insolúvel a proteína e/ou o anticorpo, antes ou depois da competição, e a amostra ligada à proteína-alvo é separada da amostra não ligada, por exemplo mediante decantação (nos casos em que se tenha previamente tornado insolúvel a proteína ou o anticorpo) ou mediante centrifugação (nos casos em que se tenha precipitado a proteína ou o anticorpo após a reação competitiva). Além disso, a ligação competitiva pode ser determinada pelo fato da função ter sido alterada pela ligação ou pela ausência de ligação do arcabouço de proteína à proteína-alvo, por exemplo, se a molécula do arcabouço de proteína inibe ou potencializa a atividade enzimática de, por exemplo, um marcador. ELISA e outros testes funcionais podem ser usados, conforme é bem-conhecido na técnica.

Moléculas de Ácido Nucleico

[00040] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção codificando arcabouços de proteína podem estar sob a forma de RNA, como mRNA, hnRNA, tRNA ou qualquer outra forma, ou sob a forma de DNA incluindo, mas não se limitando a, cDNA e DNA genômico obtido por clonagem ou produzido sinteticamente, ou qualquer combinação dos mesmos. O DNA pode ser de filamento triplo, duplo ou único, ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer porção de pelo menos um filamento do DNA ou RNA pode ser um filamento codificante, também conhecido como filamento senso, ou pode ser o filamento não codificante, também conhecido como filamento antissenso.

[00041] As moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção podem incluir moléculas de ácido nucleico compreendendo uma fase de leitura aberta (ORF), opcionalmente com um ou mais íntrons, por exemplo, mas não se limitando a, pelo menos uma porção especificada de ao menos um arcabouço de proteína, moléculas de ácido nucleico compreendendo a sequência de codificação para um arcabouço de proteína ou região de laço que se liga à proteína-alvo, e moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência de nucleotídeo substancialmente diferente daquelas acima descritas mas que, devido à degenerescência do código genético, ainda codificam o arcabouço de proteína conforme descrito na presente invenção e/ou conforme é conhecido na técnica. Evidentemente, o código genético é bem-conhecido na técnica. Portanto, seria rotineiro para o versado na técnica gerar tais variantes degeneradas de ácido nucleico que codificam os arcabouços de proteína da presente invenção. Vide, por exemplo, Ausubel, et al., supra, e tais variantes de ácido nucleico estão incluídos na presente invenção.

[00042] Conforme aqui indicado, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção que compreendem um ácido nucleico codificando um arcabouço de proteína podem incluir, mas não se limitam a, aquelas codificando a sequência de aminoácidos de um fragmento de arcabouço de proteína por si só, a sequência de codificação para o arcabouço de proteína inteiro ou para uma porção do mesmo, a sequência de codificação para um arcabouço de proteína, um fragmento ou uma porção, bem como sequências adicionais, como a sequência de codificação de ao menos um líder de sinalização ou peptídeo de fusão, com ou sem as supracitadas sequências de codificação adicionais, como pelo menos um íntron, juntamente com sequências adicionais não codificantes, incluindo, mas não se limitando a, sequências não codificantes 5’ e 3’, como as sequências transcritas e não transladadas que desempenham uma função na transcrição, no processamento de mRNA, inclusive nos sinais de união e poliadenilação (por exemplo, ligação de ribossoma e estabilidade do mRNA), uma sequência de codificação adicional que codifica aminoácidos adicionais, como aqueles que proporcionam funcionalidades adicionais. Portanto, a sequência que codifica um arcabouço de proteína pode ser fundida a uma sequência de marcador, como uma sequência que codifica um peptídeo que facilita a purificação do arcabouço de proteína fundido que compreende um fragmento ou porção de arcabouço de proteína.

Polinucleotídeos Hibridizando-se Seletivamente para um Polinucleo- tídeo Conforme Descrito na Presente Invenção

[00043] A presente invenção apresenta ácidos nucleicos isolados que se hibridizam sob condições de hibridização seletiva em um polinucleotídeo descrito aqui. Portanto, os polinucleotídeos dessa modalidade podem ser usados para isolar, detectar e/ou quantificar ácidos nucleicos que compreendem tais polinucleotídeos. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para identificar, isolar ou amplificar clones parciais ou de tamanho integral em uma biblioteca depositada. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são sequências genômicas ou de cDNA isoladas, ou, de outro modo, complementares a um cDNA obtido de uma biblioteca de ácido nucleico humano ou de mamífero.

[00044] De preferência, a biblioteca de cDNA compreende pelo menos 80% de sequências com comprimento total, de preferência pelo menos 85% ou 90% de sequências com comprimento total e, com mais preferência, pelo menos 95% de sequências com comprimento total. As bibliotecas de cDNA podem ser normalizadas para aumentar a representação de sequências raras. As condições de hibridização de estringência baixa ou moderada são, tipicamente mas não exclusivamente, empregadas com sequências que têm uma identidade de sequência reduzida em relação a sequências complementares. As condições de estringência moderada e alta podem, opcionalmente, ser empregadas para sequências com maior identidade. As condições de baixa estringência permitem a hibridização seletiva de sequências que tem cerca de 70% de identidade de sequência e podem ser empregadas para identificar sequências ortólogas ou parálogas.

[00045] Opcionalmente, os polinucleotídeos da presente invenção codificarão pelo menos uma porção de um arcabouço de proteína codificado pelos polinucleotídeos aqui descritos. Os polinucleotídeos da presente invenção abrangem sequências de ácido nucleico que podem ser usadas para hibridização seletiva com um polinucleotídeo que codifica um arcabouço de proteína da presente invenção. Vide, por exemplo, Ausubel, supra, e Colligan, supra, cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.

Construção de ácidos nucleicos

[00046] Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser produzidos usando-se (a) métodos recombinantes, (b) técnicas de síntese, (c) técnicas de purificação, e/ou (d) combinações das mesmas, conforme é bem-conhecido na técnica.

[00047] Os ácidos nucleicos podem compreender, de modo conveniente, sequências além de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, um sítio de multiclonagem que compreende um ou mais sítios de restrição de endonuclease pode ser inserido no ácido nucleico para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo. Ademais, as sequências transladáveis podem ser inseridas para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo transladado da presente invenção. Por exemplo, uma sequência marcadora de hexa-histidina fornece um meio conveniente para purificar as proteínas da presente invenção. O ácido nucleico da presente invenção, excluindo-se a sequência de codificação, é opcionalmente um vetor, adaptador ou ligante para clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo da presente invenção.

[00048] As sequências adicionais podem ser adicionadas a tais sequências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função em clonagem e/ou expressão para auxiliar no isolamento do polinucleo- tídeo, ou para otimizar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. O uso de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores, e ligantes é bem-conhecido na técnica. (Vide, por exemplo, Ausubel, supra, ou Sambrook, supra).

Métodos Recombinantes para a Construção de Ácidos Nucleicos

[00049] As composições de ácido nucleico isoladas desta invenção, como RNA, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser obtidas a partir de fontes biológicas com o uso de inúmeras metodologias de clonagem conhecidas por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, as sondas de oligonucleotídeo que se hibridizam seletivamente, sob condições estringentes, com os polinucleotídeos da presente invenção são usadas para identificar a sequência desejada em uma biblioteca de cDNA ou DNA genômico. O isolamento de RNA e a construção de bibliotecas genômicas e de cDNA são bem-conhecidos pelos versados na técnica. (Vide, por exemplo, Ausubel, supra, ou Sambrook, supra).

Triagem de Ácido Nucleico e Métodos de Isolamento

[00050] Uma biblioteca genômica e de cDNA pode ser triada com o uso de uma sonda baseada na sequência de um polinucleotídeo da presente invenção, como aqueles aqui apresentados. As sondas podem ser usadas para hibridizar em sequências de DNA genômico ou de cDNA para isolar genes homólogos no mesmo organismo ou em diferentes organismos. Os versados na técnica compreenderão que vários graus de estringência de hibridização podem ser empregados no teste, sendo que ou a hibridização ou o meio de lavagem podem ser estringentes. À medida que as condições para a hibridização se tornam mais severas, deve haver uma grau maior de complementaridade entre a sonda e o alvo para que a formação bidirecional ocorra. O grau de estringência pode ser controlado por um ou mais dentre temperatura, resistência iônica, pH e a presença de um solvente parcialmente desnaturante, como formamida. Por exemplo, a severidade de hibridização é convenientemente variada através da alteração da polaridade da solução reagente através de, por exemplo, manipulação da concentração de formamida dentro da faixa de 0% a 50%. O grau de complementaridade (identidade de sequência) necessário para a ligação detectável irá variar de acordo com a severidade do meio de hibridização e/ou do meio de lavagem. O grau de complementaridade será, otimamente, de 100%, ou de 70 a 100%, ou qualquer faixa ou valor nesse intervalo. Entretanto, deve-se compreender que variações de sequência mínimas nas sondas e nos iniciadores podem ser compensadas mediante a redução da estringência da hibridização e/ou do meio de lavagem.

[00051] Os métodos de amplificação de RNA ou DNA são bem- conhecidos na técnica e podem ser usados de acordo com a presente invenção sem experimentação indevida, com base nas orientações e nos ensinamentos aqui apresentados.

[00052] Os métodos conhecidos de amplificação de DNA ou RNA incluem, mas não se limitam a, reação em cadeia da polimerase (PCR) e processos de amplificação relacionados (vide, por exemplo, as patentes U.S. n° 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, atribuída a Mullis, et al., 4.795.699 e 4.921.794 atribuída a Tabor, et al.; 5.142.033 atribuída a Innis, 5.122.464 atribuída a Wilson, et al., 5.091.310 atribuída a Innis, 5.066.584 atribuída a Gyllensten, et al, 4.889.818 atribuída a Gelfand, et al, 4.994.370 atribuída a Silver, et al, 4.766.067 atribuída a Biswas, 4.656.134 atribuída a Ringold) e amplificação mediada por RNA que usa RNA antissenso para a sequência-alvo como um molde para a síntese de DNA de filamento duplo (patente U.S. 5.130.238 atribuída a Malek, et al, sob o nome comercial NASBA), cujo conteúdo está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade. (Vide, por exemplo, Ausubel, supra, ou Sambrook, supra.).

[00053] Por exemplo, a tecnologia de reação em cadeia de polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar as sequências de polinucleotídeos da presente invenção e genes relacionados diretamente das bibliotecas de cDNA ou DNA genômico. A PCR e outros métodos de amplificação in vitro podem também ser úteis, por exemplo, para clonar as sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas a serem expressas, para produzir ácidos nucleicos, com o objetivo de usá-los como sondas para detectar a presença de mRNA desejado em amostras, para sequenciamento de ácido nucleico, ou para outros propósitos. Os exemplos de técnicas suficientes para direcionar as pessoas versadas através dos métodos de amplificação in vitrosão encontrados em Berger, supra, Sambrook, supra, e Ausubel, supra, bem como Mullis, et al., patente U.S. n° 4.683.202 (1987), e Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Os kits comercialmente disponíveis para amplificação de PCR genômica são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Adicionalmente, por exemplo, a proteína 32 do gene T4 (Boehringer Mannheim) pode ser usada para otimizar o rendimento de produtos de PCR longos.

Métodos Sintéticos para Construir Ácidos Nucleicos

[00054] Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção também podem ser preparados pela síntese química direta por meio de métodos (vide, por exemplo, Ausubel, et al., acima). A síntese química, em geral, produz um oligonucleotídeo de filamento único, o qual pode ser convertido em DNA de filamento duplo através de hibridização com uma sequência de complementaridade, ou através de polimerização com uma polimerase de DNA com o uso de filamento único como um molde. O elemento versado na técnica irá reconhecer que, embora a síntese de DNA possa ser limitada a sequências de cerca de 100 ou mais bases, as sequências mais longas podem ser obtidas pela ligação de sequências mais curtas.

Cassetes de Expressão Recombinantes

[00055] A presente invenção adicionalmente fornece cassetes de expressão recombinantes que compreendem um ácido nucleico da presente invenção. Uma sequência de ácido nucleico da presente invenção, por exemplo uma sequência genômica ou de cDNA que codifica um arcabouço de proteína da presente invenção, pode ser usada para construir um cassete de expressão recombinante que pode ser introduzido em pelo menos uma célula hospedeira desejada. Um cassete de expressão recombinante irá compreender, tipicamente, um polinucleotídeo da presente invenção ligado, de modo operável, a sequências reguladora de iniciação transcricional que irá direcionar a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira pretendida. Os promotores heterólogos e não heterólogos (isto é, endógeno) podem ser empregados para direcionar a expressão dos ácidos nucleicos da presente invenção.

[00056] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos isolados que funcionam como promotor, intensificador ou outros elementos podem ser introduzidos na posição adequada (a montante, a jusante ou no íntron) de uma forma não heteróloga de um polinucleotídeo da presente invenção, de modo a regular para cima ou para baixo a expressão de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo ou in vitro através de mutação, eliminação e/ou substituição.

Vetores e Células Hospedeiras

[00057] A presente invenção também se refere a vetores que incluem as moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção, células hospedeiras que são geneticamente elaboradas com os vetores recombinantes, e a produção de pelo menos um arcabouço de proteína por meio de técnicas recombinantes, conforme é bem- conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook, et al., supra, Ausubel, et al., supra, cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.

[00058] Os polinucleotídeos podem ser opcionalmente unidos a um vetor que contém um marcador selecionável para propagação em um hospedeiro. Em geral, um vetor plasmídio é introduzido em um precipitado, como um precipitado de fosfato de cálcio, ou em um complexo com um lipídio carregado. Se o vetor é um vírus, o mesmo pode ser armazenado in vitro com o uso de uma linhagem de células de armazenamento adequada e, então, convertido em células hospedeiras.

[00059] O elemento de inserção de DNA deve ser operacionalmente ligado a um promotor adequado. As construções de expressão irão conter, ainda, sítios para iniciação de transcrição, terminação e, na região transcrita, um sítio de ligação ribossomal para transladação. A porção de codificação das transcrições maduras expressa através de construções irão incluir, preferencialmente, uma iniciação de transladação no início e um códon de terminação (por exemplo, UAA, UGA ou UAG) adequadamente posicionado no fim do mRNA a ser transladado, sendo que UAA e UAG são preferenciais para a expressão de célula eucariótica ou de mamífero.

[00060] Os vetores de expressão irão incluir, preferencialmente, porém de opcional, pelo menos um marcador selecionável. Tais marcadores incluem, por exemplo, mas não se limitam a, metotrexato (MTX), di-hidrofolato redutase (DHFR, Pat. U.S. 4.399.216; 4.634.665; 4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; 5.179.017, resistência à ampicilina, neomicina (G418), ácido micofenólico, ou glutamina sintetase (GS, Pat. U.S. 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739) para cultura de célulaeucariótica, e genes de resistência à tetraciclina ou ampicilina para cultivar em E. coli e outras bactérias ou procariotos (as patentes acima estão completamente incorporadas aqui por referência). Os meios e condições de cultura adequados para as células hospedeiras supracitadassão conhecidos na técnica. Os vetores adequados serão prontamente aparentes ao versado na técnica. A introdução de uma construção de vetor em uma célula hospedeira pode ser afetada através de transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE- dextrano, transfecção mediada por lipídio catiônico, eletroporação, transdução, infecção ou outros métodos conhecidos. Tais métodos são descritos na técnica, como Sambrook, supra, capítulos 1 a 4 e 16 a 18, Ausubel, supra, capítulos 1, 9, 13, 15, 16.

[00061] O pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção pode ser expresso em uma forma modificada, como uma proteína de fusão, e pode incluir não só sinais de secreção, como também regiões funcionais heterólogas adicionais. Por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, pode ser adicionada ao amino-terminal de um arcabouço de proteína para otimizar a estabilidade e a persistência na célula hospedeira, durante a purificação ou durante os subsequentes manuseio e armazenamento. Além disso, porções de peptídeo podem ser adicionadas a um arcabouço de proteína da presente invenção, para facilitar a purificação. Essas regiões podem ser removidas antes da preparação final de um arcabouço de proteína, ou pelo menos de um fragmento do mesmo. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório convencionais, como Sambrook, supra, capítulos 17.29 a 17.42 e 18.1 a 18.74, e Ausubel, supra, capítulos 16, 17 e 18.

[00062] Os elementos versados na técnica são instruídos a respeito dos diversos sistemas de expressão disponíveis para expressar um ácido nucleico que codifica uma proteína da presente invenção. Alternativamente, os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser expressos em uma célula hospedeira mediante o acionamento (por manipulação) de um arcabouço de proteína da presente invenção em uma célula hospedeira que contém codificação de DNA endógena. Esses métodos são bem-conhecidos na técnica, por exemplo conforme descrito nas patentes U.S. n° 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746 e 5.733.761, aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade.

[00063] Ilustrativo das culturas celulares úteis para a produção dos arcabouços de proteína, porções especificadas ou variantes das mesmas, são células bacterianas, de levedura e de mamíferos, conformeé conhecido na técnica. Os sistemas de células de mamífero estarão, com frequência, sob a forma de camadas únicas de células, embora as suspensões ou os biorreatores de células de mamífero também possam ser usados. Inúmeras linhagens de células hospedeiras adequadas, capazes de expressar proteínas glicosiladas intactas, foram desenvolvidas na técnica, e incluem as linhagens de células COS-1 (por exemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por exemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por exemplo, ATCC CRL-10), CHO (por exemplo, ATCC CRL 1610) e BSC-1 (por exemplo, ATCC CRL-26), células Cos-7, células CHO, células hep G2, P3X63Ag8.653, células SP2/0-Ag14, 293, células HeLa e similares, as quais estão prontamentedisponíveis, por exemplo, junto à American Type Culture Collection, de Manassas, VA, EUA (www.atcc.org). As células hospedeiras preferenciais incluem células de origem linfoide, como células de mieloma e linfoma. As células hospedeiras particularmente preferenciaissão células P3X63Ag8.653 (número de acesso ATCC CRL- 1580) e células SP2/0-Ag14 (número de acesso ATCC CRL-1851). Em uma modalidade particularmente preferencial, a célula recombinante é uma célula P3X63Ab8.653 ou uma célula SP2/0-Ag14.

[00064] Vetores de expressão para estas células podem incluir uma ou mais das seguintes sequências de controle de expressão, como, por exemplo, mas não se limitando a uma origem de replicação; um promotor (por exemplo, promotores tardios ou precoces de SV40, o promotor de CMV (Pat. U.S. 5.168.062; 5.385.839), promotor tk de HSV, um promotor de pgk (fosfoglicerato quinase), um promotor de alfa EF-1 (Pat. U.S. 5.266.491), pelo menos um promotor humano; um intensificador, e/ou sítios de informação de processamento, como sítios de ligação de ribossoma, sítios de união de RNA, sítios de poliadenilação (por exemplo, um sítio de adição de poli A de antígeno T de SV40 large), e sequências terminadoras de transcrição. Vide, por exemplo, Ausubel et al., supra, Sambrook, et al., supra. Outras células úteis para a produção de ácidos nucleicos ou de proteínas da presente invenção são conhecidas e/ou disponíveis, por exemplo, a partir do American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) ou outros conhecidos ou fontes comerciais.

[00065] Quando células hospedeiras eucarióticas são empregadas, as sequências terminadoras de poliadenilação ou de transcrição são tipicamente incorporadas ao vetor. Um exemplo de uma sequência terminadora é a sequência de poliadenilação proveniente do gene do hormônio de crescimento bovino. As sequências para a emenda adequada da transcrição também podem ser incluídas. Um exemplo de uma sequência de emenda é um íntron VP1 proveniente de SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). Adicionalmente, assequências de gene que controlam a replicação na célula hospedeira podem ser incorporadas ao vetor, conforme conhecido na técnica.

Purificação de um Arcabouço de Proteína

[00066] Um arcabouço de proteína pode ser recuperado e purificado a partir de culturas de células recombinantes por meio de métodos bem- conhecidos incluindo, mas não se limitando a, purificação por proteína A, precipitação por sulfato de amônio ou etanol, extração por ácido, croma- tografia por troca de ânions ou cátions, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidróxi apatita e cromatografia de lectina. A cromato- grafia líquida de alta eficiência ("HPLC") também pode ser empregada para purificação. Vide, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, ou Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, E.U.A., (1997-2001), por exemplo, Capítulos 1, 4, 6, 8, 9 e 10, cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.

[00067] Os arcabouços de proteína da presente invenção incluem produtos naturalmente purificados, produtos de procedimentos de sintetização química e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariótico ou eucariótico incluindo, por exemplo, células de E. Coli, de levedura, de plantas superiores, de insetos e de mamíferos. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, o arcabouço de proteína da presente invenção pode ser glicosilado ou não glicosilado. Esses métodos são descritos em muitos manuais de laboratório convencionais, como Sambrook, supra, seções 17.37 a 17.42, Ausubel, supra, capítulos 10, 12, 13, 16, 18 e 20, e Colligan, Protein Science, supra, capítulos 12 a 14, estando todos aqui incorporados a título de referência, em sua totalidade.

Códigos de Aminoácido

[00068] Os aminoácidos que formam os arcabouços de proteína da presente invenção são frequentemente abreviados. As designações de aminoácido podem ser indicadas designando-se o aminoácido por seu código de letra única, seu código de três letras, seu nome, ou um ou mais códons de três nucleotídeos conforme é bem-conhecido na técnica (vide Alberts, B. et al., Molecular Biology of The Cell, Terceira Edição, Garland Publishing, Inc., New York, EUA, 1994). Um arcabouço de proteína da presente invenção pode incluir uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácido, sejam estas oriundas de mutações naturais ou de manipulação humana, conforme especificado na presente invenção. Os aminoácidos em um arcabouço de proteína da presente invenção que são essenciais para sua função podem ser identificados com o uso de métodos conhecidos na técnica, como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese por varredura de alanina (por exemplo, Ausubel, supra, Capítulos 8 e 15, Cunningham e Wells, Science 244:1081 a 1085 (1989)). O último procedimento citado introduz mutações únicas de alanina em cada um dos resíduos na molécula. As moléculas mutantes resultantes são então testadas quanto à atividade biológica como, mas não se limitando a, pelo menos uma atividade neutralizante. Sítios que são críticos para ligação do arcabouço de proteína podem também ser identificados através de análise estrutural como cristalização, ressonância magnética nuclear ou marcação de fotoafinidade (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899 a 904 (1992) e de Vos, et al., Science 255:306 a 312 (1992)).

[00069] Conforme será compreendido pelos versados na técnica, a presente invenção inclui pelo menos um arcabouço de proteína biologicamente ativo da presente invenção. Os arcabouços de proteína biologicamente ativos têm uma atividade específica de pelo menos 20%, 30% ou 40%, de preferência pelo menos 50%, 60% ou 70% e, com a máxima preferência, pelo menos 80%, 90% ou de 95% a 1000% ou mais em comparação ao arcabouço de proteína nativo (não sintético), endógeno ou relacionado e conhecido. Os métodos para testar e quantificar as medidas de atividade enzimática e de especificidade de substrato são bem-conhecidos pelos versados na técnica.

[00070] Em outro aspecto, a invenção refere-se a arcabouços de proteína e fragmentos, conforme descritos na presente invenção, que são modificados pela ligação covalente de uma porção orgânica. Esse tipo de modificação pode produzir um fragmento de arcabouço de proteína com propriedades farmacocinéticas otimizadas (por exemplo, meia-vida em soro in vivo aumentada). A porção orgânica pode ser um grupo polimérico hidrofílico linear ou ramificado, um grupo de ácido graxo, ou um grupo de éster de ácido graxo. Em modalidades particulares, o grupo polimérico hidrofílico pode ter um peso molecular de cerca de 800 a cerca de 120.000 Daltons e pode ser um polialcano glicol (por exemplo, polietileno glicol (PEG)), polipropileno glicol (PPG)), polímero de carboidrato, polímero de aminoácido ou polivinila pirrolidona, e o ácido graxo ou o grupo de éster de ácido graxo pode compreender de cerca de oito a cerca de quarenta átomos de carbono.

[00071] Os arcabouços e fragmentos de proteína modificados da invenção podem compreender uma ou mais porções orgânicas que estão ligadas de modo covalente, direta ou indiretamente, ao anticorpo. Cada porção orgânica que está ligada a um arcabouço ou fragmento de proteína da invenção pode, independentemente, ser um grupo polimérico hidrofílico, um grupo de ácido graxo ou um grupo de éster de ácido graxo. Para uso na presente invenção, o termo "ácido graxo" abrange ácidos monocarboxílicos e ácidos dicarboxílicos. Para uso na presente invenção, o termo "grupo polimérico hidrofílico"refere- se a um polímero orgânico que é mais solúvel em água do que em octano. Por exemplo, a polilisina é mais solúvel em água que em octano. Dessa forma, um arcabouço de proteína modificado pela ligação covalente de polilisina é abrangido pela invenção. Polímeros hidrofílicos adequados para modificar os arcabouços de proteína da invenção podem ser lineares ou ramificados e incluem, por exemplo, polialcano glicóis (por exemplo, PEG, monometóxi-polietileno glicol (mPEG), PPG e similares), carboidratos (por exemplo, dextrano, celulose, oligossacarídeos, polissacarídeos e similares), polímeros de aminoácidos hidrofílicos (por exemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato e similares), óxido de polialcano (por exemplo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno e similares) e polivinil pirrolidona. De preferência, o polímero hidrofílico que modifica o arcabouço de proteína da invenção tem um peso molecular de cerca de 800 a cerca de 150.000 Daltons, como uma entidade molecular separada. Podem ser usados, por exemplo, PEG5000 e PEG20.000, em que o subscrito é o peso molecular médio do polímero em Daltons. O grupo polimérico hidrofílico pode ser substituído por um a cerca de seis grupos de alquila, ácido graxo ou éster de ácido graxo. Os polímeros hidrofílicos que são substituídos por um ácido graxo ou um grupo de éster de ácido graxo pode ser preparado ao empregar métodos adequados. Por exemplo, um polímero que compreende um grupo de amina pode ser acoplado a um carboxilato do ácido graxo ou éster de ácido graxo, e um carboxilato ativado (por exemplo, ativado com N, N-carbonila di- imidazol) em um ácido graxo ou éster de ácido graxo pode ser acoplado a um grupo hidroxila em um polímero.

[00072] Os ácidos graxos e ésteres de ácido graxo adequados para modificar os arcabouços de proteína da invenção podem ser saturados ou podem conter uma ou mais unidades de insaturação. Os ácidos graxos que são adequados para modificação de arcabouços de proteína da invenção incluem, por exemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, miristato), n-octadecanoato (C18, estearato), n-eicosanoato (C20, araquidato), n-docosanoato (C22, beenato), n-triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40), cis-Δ9- octadecanoato (C18, oleato), todos os cis-Δ5,8,11,14-eicosatetraenoato (C20, araquidonato), ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico, e similares. Os ésteres de ácido graxo adequados incluem monoésteres de ácidos dicarboxílicos que compreendem um grupo alquila inferior linear ou ramificado. O grupo alquila inferior pode compreender de um a cerca de doze, preferencialmente de um a cerca de seis, átomos de carbono.

[00073] Os arcabouços e fragmentos de proteína modificados podem ser preparados com o uso de métodos adequados, como pela reação com um ou mais agentes modificadores. Um "agente modificador" como o termo é usado na presente invenção, refere-se a um grupo orgânico adequado (por exemplo, um polímero hidrofílico, um ácido graxo, um éster de ácido graxo) que compreende um grupo ativador. Um "grupo ativador"é uma porção química ou um grupo funcional que pode, sob condições apropriadas, reagir com um segundo grupo químico formando assim uma ligação covalente entre o agente modificador e o segundo grupo químico. Por exemplo, os grupos ativadores aminarreativos incluem grupos eletrofílicos, como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, fluoro, iodo), ésteres N- hidroxissuccinimidila (NHS) e similares. Grupos ativadores que podem reagir com tióis incluem, por exemplo, maleimida, iodo-acetila, acriloila, dissulfetos de piridila, 5-tiol-2-ácido nitrobenzoico tiol (TNB-tiol), e similares. Um grupo funcional de aldeído pode ser acoplado a moléculas que contêm amina- ou hidrazida-, e um grupo azida pode reagir com um grupo fosforoso trivalente para formar ligações fosforamidato ou fosforamida. Métodos adequados para introduzir grupos ativadores em moléculas são conhecidos na técnica (vide por exemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Um grupo de ativação pode ser ligado diretamente ao grupo orgânico (por exemplo, polímero hidrofílico, ácido graxo, éster de ácido graxo), ou por meio de uma porção ligante, por exemplo um grupo divalente C1-C12 em que uma ou mais átomos de carbono podem ser substituídos por um heteroátomo, como oxigênio, nitrogênio ou enxofre. Porções de ligação adequadas incluem, por exemplo, tetraetileno glicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, - (CH2)2-NH- e -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-. Agentes modificadores que compreendem uma porção de ligação podem ser produzidos, por exemplo, ao reagir um mono-Boc-alquildiamina (por exemplo, mono-Boc-etilenodiamina, mono-Boc-diamino-hexano) com um ácido graxo na presença de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropila) carbodi-imida (EDC) para formar uma ligação amida entre a amina livre e o carboxilato ácido graxo. O grupo protetor Boc pode ser removido do produto mediante tratamento com ácido trifluoroacético (TFA), para expor uma amina primária que pode ser acoplada a outro carboxilato, conforme descrito, ou pode ser reagida com anidrido maleico, sendo o produto resultante ciclizado para produzir um derivado de maleimido ativado do ácido graxo. (Vide, por exemplo, Thompson, et al., WO 92/16221, cujos ensinamentos estão aqui incorporados a título de referência, em sua totalidade.)

[00074] Os arcabouços de proteína modificados da invenção podem ser produzidos mediante a reação do arcabouço ou fragmento de proteína com um agente modificador. Por exemplo, as porções orgânicas podem ser ligadas a um arcabouço de proteína de forma não específica para sítio, mediante o uso de um agente modificador amina-reativo, por exemplo um éster NHS de PEG. Arcabouços de proteína modificados e fragmentos que compreendem uma porção orgânica que é ligada a locais específicos de um arcabouço de proteína da presente invenção podem ser preparados com o uso de métodos adequados, como proteólise reversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147 a 153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411 a 417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233- 2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59 a 68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456 a 463 (1997)), e os métodos descritos em Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).

Composições de Arcabouço de Proteína Compreendendo Ingredientes Terapeuticamente Ativos Adicionais

[00075] As composições de arcabouço de proteína da invenção podem opcionalmente compreender adicionalmente uma quantidade eficaz de pelo menos um composto ou proteína (molécula pequena ou grande) selecionado a partir de pelo menos um dentre um fármaco anti- infectivo, um fármaco para o sistema cardiovascular (CV), um fármaco para o sistema nervoso central (SNC), um fármaco para o sistema nervoso autônomo (SNA), um fármaco para o trato respiratório, um fármaco para o trato gastrointestinal (GI), um fármaco hormonal, um fármaco para equilíbrio de fluidos ou eletrólitos, um fármaco hematológico, um antineoplásico, um fármaco para imunomodulação, um fármaco para uso oftálmico, ótico ou nasal, um fármaco para uso tópico, um fármaco nutricional ou similares. Esses fármacos são bem- conhecidos na técnica, incluindo formulações, indicações, dosagem e administração para cada um daqueles apresentados na presente invenção (vide, por exemplo, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21a Edição, Springhouse Corp., Springhouse, PA, EUA, 2001, Health Professional’s Drug Guide 2001, Editores, Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ, EUA, Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., Editores, Appleton & Lange, Stamford, CT, EUA, cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade).

[00076] O fármaco anti-infectivo pode ser pelo menos um selecionado a partir de amebicidas, ou pelo menos um dentre antiprotozoários, anti- helmínticos, antifúngicos, antimaláricos, antituberculínicos ou pelo menos um dentre antilepróticos, aminoglicosídeos, penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, sulfonamidas, fluoroquinolonas, antivirais, anti-infectivos à base de macrolídeo e anti-infectivos variados. O fármaco CV pode ser pelo menos um selecionado a partir de inotrópicos, antiarrítmicos, antianginosos, anti-hipertensivos, antilipêmicos e fármacos cardiovasculares variados. O fármaco para SNC pode ser pelo menos um selecionado a partir de analgésicos não narcóticos, ou ao menos um selecionado a partir de antipiréticos, drogas anti-inflamatórias não esteroidais, analgésicos narcóticos ou ao menos um analgésico opioide, hipnóticos sedativos, anticonvulsivos, antidepressivos, fármacos antiansiedade, antipsicóticos, estimulantes do sistema nervoso central, antiparkinsonianos e fármacos para o sistema nervoso central variados. O fármaco para SNA pode ser pelo menos um selecionado a partir de colinérgicos (parassimpatomiméticos), anticolinérgicos, adrenérgicos (simpatomiméticos), bloqueadores adrenérgicos (simpatolíticos), relaxantes de músculos esqueléticos, e bloqueadores neuromusculares. O fármaco para o trato respiratório pode ser pelo menos um selecionado a partir de anti-histamínicos, broncodilatadores, expectorantes ou ao menos um antitussivo, e fármacos para o trato respiratório variados. O fármaco para o trato GI pode ser pelo menos um selecionado a partir de antiácidos, ou pelo menos um adsorvente, ou pelo menos um antiflatulento, uma enzima digestiva, ou pelo menos um solubilizante de cálculo biliar, antidiarreicos, laxativos, antieméticos e fármacos antiúlcera. O fármaco hormonal pode ser pelo menos um selecionado dentre corticosteroides, androgênios ou pelo menos um esteroide anabólico, estrogênio ou pelo menos uma progestina, uma gonadotropina, um fármaco antidiabético ou pelo menos um glucagon, hormônio da tiroide, antagonista de hormônio da tiroide, hormônio da hipófise e fármaco similar a paratiroide. O fármaco para equilíbrio de fluidos e eletrólitos pode ser pelo menos um selecionado dentre diuréticos, eletrólitos ou pelo menos uma solução de reposição, um acidificante ou pelo menos um alcalinizante. O fármaco hematológico pode ser pelo menos um selecionado dentre hematínicos, anticoagulantes, derivados de sangue e enzimas trombolíticas. Os antineoplásicos podem ser pelo menos um selecionado dentre fármacos alquilantes, antimetabólitos, antineoplásicos antibióticos, antineoplásicos que alteram o equilíbrio hormonal e antineoplásicos variados. O fármaco imunomodulador pode ser pelo menos um selecionado dentre imunossupressores, vacinas, ou pelo menos um toxoide, uma antitoxina, ou pelo menos um antiveneno, um soro imune e um modificador de resposta biológica. Os fármacos oftálmicos, óticos e nasais podem ser pelo menos um selecionado dentre anti-infecciosos oftálmicos, anti-inflamatórios oftálmicos, mióticos, midriáticos, vasoconstritores oftálmicos, e fármacos oftálmicos, óticos e nasais variados. O fármaco de uso tópico podem ser pelo menos um selecionado dentre anti-infectivos locais, escabicidas ou pelo menos um pediculicida ou corticosteroide tópico. O fármaco nutricional pode ser pelo menos um selecionado dentre vitaminas, minerais, ou calóricos. Vide, por exemplo, o conteúdo de Nursing 2001 Drug Handbook, acima.

[00077] O pelo menos um amebicida ou antiprotozoário pode ser pelo menos um selecionado dentre atovaquona, cloridrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, metronidazol, cloridrato de metronidazol e isetionato de pentamidina. O pelo menos um anti- helmíntico pode ser pelo menos um selecionado dentre mebendazol, pamoato de pirantel e tiabendazol. O pelo menos um antifúngico pode ser pelo menos um selecionado dentre anfotericina B, complexo de anfotericina B e sulfato de colesterila, complexo lipídico de anfotericina B, anfotericina B lipossomal, fluconazol, flucitosina, griseofulvina micronizada, griseofulvina ultramicronizada, itraconazol, cetoconazol, nistatina e cloridrato de terbinafina. O pelo menos um antimalárico pode ser pelo menos um selecionado dentre cloridrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidróxi cloroquina, cloridrato de mefloquina, fosfato de primaquina, pirimetamina e pirimetamina com sulfadoxina. O pelo menos um antituberculínico ou antileprótico pode ser pelo menos um selecionado dentre clofazimina, ciclosserina, dapsona, cloridrato de etambutol, isoniazida, pirazinamida, rifabutina, rifampin, rifapentina e sulfato de estreptomicina. O pelo menos um aminoglicosídeo pode ser pelo menos um selecionado dentre sulfato de amicacina, sulfato de gentamicina, sulfato de neomicina, sulfato de estreptomicina e sulfato de tobramicina. A pelo menos uma penicilina pode ser pelo menos uma selecionada dentre amoxicilina/clavulanato de potássio, tri-hidrato de amoxicilina, ampicilina, ampicilina sódica, tri-hidrato de ampicilina, ampicilina sódica/sulbactama sódica, cloxacilina sódica, dicloxacilina sódica, mezlocilina sódica, nafcilina sódica, oxacilina sódica, penicilina G benzatina, penicilina G potássica, penicilina G procaína, penicilina G sódica, penicilina V potássica, piperacilina sódica, piperacilina sódica/tazobactama sódica, ticarcilina dissódica e ticarcilina dissódica/clavulanato de potássio. A pelo menos uma cefalosporina pode ser pelo menos uma selecionada dentre cefaclor, cefadroxila, cefazolina sódica, cefdinir, cloridrato de cefepima, cefixima, cefmetazol sódico, cefonicida sódica, cefoperazona sódica, cefotaxima sódica, cefotetam dissódico, cefoxitina sódica, cefpodoxima proxetil, cefprozil, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima sódica, ceftriaxona sódica, cefuroxima axetil, cefuroxima sódica, cloridrato de cefalexina, monoidrato de cefalexina, cefradina e loracarbefe. A pelo menos uma tetraciclina pode ser pelo menos uma selecionada a partir de cloridrato de demeclociclina, doxiciclina cálcica, hiclato de doxiciclina, cloridrato de doxiciclina, mono-hidrato de doxiciclina, cloridrato de minociclina e cloridrato de tetraciclina. A pelo menos uma sulfonamida pode ser pelo menos uma selecionada dentre co-trimoxazol, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfissoxazol e acetil sulfissoxazol. A pelo menos uma fluoroquinolona pode ser pelo menos uma selecionada dentre mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, cloridrato de lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina e mesilato de trovafloxacina. A pelo menos uma fluoroquinolona pode ser pelo menos uma selecionada dentre mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, cloridrato de lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina e mesilato de trovafloxacina. O pelo menos um antiviral pode ser pelo menos um selecionado dentre sulfato de abacavir, aciclovir sódico, cloridrato de amantadina, amprenavir, cidofovir, mesilato de delavirdina, didanosina, efavirenz, famciclovir, fomivirsen sódico, foscarnet sódico, ganciclovir, sulfato de indinavir, lamivudina, lamivudina/zidovudina, mesilato de nelfinavir, nevirapina, fosfato de oseltamivir, ribavirina, cloridrato de rimantadina, ritonavir, saquinavir, mesilato de saquinavir, estavudina, cloridrato de valaciclovir, zalcitabina, zanamivir e zidovudina. O pelo menos um macrolídeo anti- infectivo pode ser pelo menos um selecionado dentre azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina base, estolato de eritromicina, etil succinato de eritromicina, lactobionato de eritromicina e estearato de eritromicina. O pelo menos um anti-infectivo variado pode ser pelo menos um selecionado dentre aztreonama, bacitracina, succinato sódico de cloranfenicol, cloridrato de clindamicina, cloridrato palmitato de clindamicina, fosfato de clindamicina, imipenema e cilastatina sódica, meropenema, macrocristais de nitrofurantoína, microcristais de nitrofurantoína, quinupristina/dalfopristina, cloridrato de espectino- micina, trimetoprima e cloridrato de vancomicina (vide, por exemplo, páginas 24 a 214 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00078] O pelo menos um inotrópico pode ser pelo menos umselecionado dentre lactato de amrinona, digoxina e lactato de milrinona. O pelo menos um antiarrítmico pode ser pelo menos um selecionado dentre adenosina, cloridrato de amiodarona, sulfato de atropina, tosilato de bretílio, cloridrato de diltiazem, disopiramida, fosfato de disopiramida, cloridrato de esmolol, acetato de flecainida, fumarato de ibutilida, cloridrato de lidocaina, cloridrato de mexiletina, cloridrato de moricizina, fenitoína, fenitoína sódica, cloridrato de procainamida, cloridrato de propafenona, cloridrato de propranolol, bissulfato de quinidina, gluconato de quinidina, poligalacturonato de quinidina, sulfato de quinidina, sotalol, cloridrato de tocainida e cloridrato de verapamil. O pelo menos um antianginoso pode ser pelo menos um selecionado dentre besilato de anlodipidina, nitrito de amila, cloridrato de bepridila, cloridrato de diltiazem, dinitrato de isossorbida, mononitrato de isossorbida, nadolol, cloridrato de nicardipino, nifedipina, nitroglicerina, cloridrato de propranolol, verapamila ecloridrato de verapamila. O pelo menos um anti-hipertensivo pode ser pelo menos um selecionado dentre cloridrato de acebutolol, besilato de anlodipina, atenolol, cloridrato de benazeprila, cloridrato de betaxolol, fumarato de bisoprolol, candesartano cil-hexetila, captoprila, cloridrato de carteolol, carvedilol, clonidina, cloridrato de clonidina, diazóxido, cloridrato de diltiazem, mesilato de doxazosina, enalaprilate, maleato de enalapril, mesilato de eprosartano, felodipina, mesilato de fenoldopam, fosinopril sódico, acetato de guanabenz, sulfato de guanadrel, cloridrato de guanfacina, cloridrato de hidralazina, irbesartano, isradipina, cloridrato de labetalol, lisinopril, losartano potássico, metildopa, cloridrato de metildopato, succinato de metoprolol, tartarato de metoprolol, minoxidil, cloridrato de moexiprila, nadolol, cloridrato de nicardipina, nifedipina, nisoldipina, nitroprussiato sódico, sulfato de penbutolol, perindoprila erbumina, mesilato de fentolamina, pindolol, cloridrato de prazosina, cloridrato de propranolol, cloridrato de quinaprila, ramiprila, telmisartano, cloridrato de terazosina, maleato de timolol, trandolaprila, valsartano e cloridrato de verapamila. O pelo menos um antilipêmico pode ser pelo menos um selecionado dentre atorvastatina cálcica, cerivastatina sódica, colestiramina, cloridrato de colestipol, fenofibrato (micronizado), fluvastatina sódica, genfibrozila, lovastatina, niacina, pravastatina sódica e sinvastatina. O pelo menos um fármaco CV variado pode ser pelo menos um selecionado a partir de abciximab, alprostadil, cloridrato de arbutamina, cilostazol, bissulfato de clopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, cloridrato de midodrina, pentoxifilina, cloridrato de ticlopidina, cloridrato de tirofiban. (vide, por exemplo, páginas 215 a 336 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00079] O pelo menos um analgésico ou antipirético não narcótico pode ser pelo menos um selecionado dentre acetaminofeno, aspirina, trissalicilato de magnésio colina, diflunisal e salicilato de magnésio. O pelo menos um medicamento anti-inflamatório não esteroidal pode ser pelo menos um selecionado dentre celecoxibe, diclofenaco potássico, diclofenaco sódico, etodolaco, fenoprofeno cálcico, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, tri-hidrato de sódio indometacina, cetoprofeno, cetorolaco trometamina, nabumetona, naproxeno, naproxeno sódico, oxaprozina, piroxicame, rofecoxibe e sulindaco. O pelo menos um analgésico narcótico ou opioide pode ser pelo menos um selecionado dentre cloridrato de alfentanila, cloridrato de buprenorfina, tartarato de butofanol, fosfato de codeína, sulfato de codeína, citrato de fentanila, sistema transdérmico de fentanila, sistema transmucoso de fentanila, cloridrato de hidromorfona,cloridrato de meperidina, cloridrato de metadona, cloridrato de morfina, sulfato de morfina, tartarato de morfina, cloridrato de nalbufina,cloridrato de oxicodona, pectinato de oxicodona, cloridrato deoximorfona, cloridrato de pentazocina, cloridrato de pentazocina e cloridrato de naloxona, lactato de pentazocina, cloridrato depropoxifeno, napsilato de propoxifeno, cloridrato de remifentanila, citrato de sufentanila e cloridrato de tramadol. O pelo menos um sedativo-hipnótico pode ser pelo menos um selecionado dentre hidrato de cloral, estazolam, cloridrato de flurazepam, pentobarbital, pentobarbital sódico, fenobarbital sódico, secobarbital sódico, temazepam, triazolam, zaleplom e tartarato de zolpidem. O pelo menos um anticonvulsivo pode ser pelo menos um selecionado dentre acetazolamida sódico, carbamazepina, clonazepam, clorazepato dipotássico, diazepam, divalproex sódico, etossuximida, fosfenitoína sódico, gabapentina, lamotrigina, sulfato de magnésio, fenobarbital, fenobarbital sódico, fenitoína, fenitoína sódica, fenitoína sódica (estendida), primidona, cloridrato de tiagabina, topiramato, valproato sódico e ácido valproico. O pelo menos um antidepressivo pode ser pelo menos um selecionado dentre cloridrato de amitriptilina, pamoato de amitriptilina, amoxapina, cloridrato de bupropiona, bromidrato citalopram, cloridrato de clomipramina, cloridrato de desipramina, cloridrato de doxepina, cloridrato de fluoxetina, cloridrato de imipramina, pamoato de imipramina, mirtazapina, cloridrato de nefazodona, cloridrato de nortriptilina, cloridrato de paroxetina, sulfato de fenelzina, cloridrato de sertralina, sulfato de tranilcipromina, maleato de trimipramina e cloridrato de venlafaxina. O pelo menos um fármaco antiansiedade pode ser pelo menos um selecionado dentre alprazolam, cloridrato de buspirona, clordiazepóxido, cloridrato de clordiazepóxido, clorazepato dipotássico, diazepam, cloridrato de doxepina, embonato de hidroxizina, cloridrato de hidroxizina, pamoato de hidroxizina, lorazepam, meprobamato, cloridrato de midazolam e oxazepam. O pelo menos um fármaco anti-psicótico pode ser pelo menos um selecionado dentre cloridrato de cloropromazina, clozapina, decanoato de flufenazina, enantato de flufenazina, cloridrato de flufenazina, haloperidol, decanoato de haloperidol, lactato de haloperidol, cloridrato de loxapina, succinato de loxapina, besilato de mesoridazina, cloridrato de molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, proclorperazina, fumatato de quetiapina, risperidona, cloridrato de tioridazina, tiotixeno, cloridrato de tiotixeno e cloridrato de trifluoroperazina. O pelo menos um estimulante do sistema nervoso central pode ser pelo menos um selecionado dentre sulfato de anfetamina, cafeína, sulfato de dextroanfetamina, cloridrato de doxapram, cloridrato de metanfetamina, cloridrato de metilfenidato, modafinil, pemolina e cloridrato de fentermina. O pelo menos um antiparkinsoniano pode ser pelo menos um selecionado dentre cloridrato de amantadina, mesilato de benztropina, cloridrato de biperideno, lactato de biperideno, mesilato de bromocriptina, carbidopa-levodopa, entacapona, levodopa, mesilato de pergolida, dicloridrato de pramipexol, cloridrato de ropinirol, cloridrato de selegilina, tolcapona e cloridrato de tri-hexilfenidila. O pelo menos um fármaco variado para o sistema nervoso central pode ser pelo menos um selecionado dentre cloridrato de bupropiona, cloridrato de donepezila, droperidol, maleato de fluvoxamina, carbonato de lítio, citrato de lítio, cloridrato de naratriptano, nicotina polacrilex, sistema transdérmico de nicotina, propofol, benzoato de rizatriptano, cloridrato monoidrato de sibutramina, succinato de sumatriptano, cloridrato de tacrina e zolmitriptano. (vide, por exemplo, páginas 337 a 530 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00080] O pelo menos um colinérgico (por exemplo, parassimpatomimético) pode ser pelo menos um selecionado dentre cloreto de betanecol, cloreto de edrofônio, brometo de neostigmina, metilsulfato de neostigmina, salicilato de fisostigmina e brometo de piridostigmina. O pelo menos um anticolinérgico pode ser pelo menos um selecionado dentre sulfato de atropina, cloridrato de diciclomina, glicopirrolato, hiosciamina, sufato de hiosciamina, brometo depropantelina, escopolamina, butil brometo de escopolamina ebromidrato de escopolamina. O pelo menos um adrenérgico(simpatomimético) pode ser pelo menos um selecionado dentre cloridrato de dobutamina, cloridrato de dopamina, bitartarato de metaraminol, bitartarato de norepinefrina, cloridrato de fenilefrina, cloridrato de pseudoefedrina e sulfato de pseudoefedrina. O pelo menos um bloqueador adrenérgico (simpatolítico) pode ser pelo menos um selecionado dentre mesilato de di-hidroergotamina, tartarato de ergotamina, maleato de metisergida e cloridrato de propranolol. O pelo menos um músculo esquelético relaxante pode ser pelo menos um selecionado dentre baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, cloridrato de ciclobenzaprina, dantroleno sódico, metocarbamol e cloridrato de tizanidina. O pelo menos um bloqueador neuromuscular pode ser pelo menos um selecionado dentre besilato de atracúrio, besilato de cisatracúrio, cloreto de doxacúrio, cloreto de mivacúrio, brometo de pancurônio, brometo de pipecurônio, brometo de rapacurônio, brometo de rocurônio, cloreto de succinil colina, cloreto de tubocurarina e brometo de vecurônio. (vide, por exemplo, páginas 531 a 84 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00081] O pelo menos um anti-histaminico pode ser pelo menos um selecionado dentre maleato de bromfeniramina, cloridrato de cetirizina, maleato de clorfeniramina, fumarato de clemastina, cloridrato de cipro- heptadina, cloridrato de difenidramina, cloridrato de fexofenadina,loratadina, cloridrato de prometazina, teoclato de prometazina,cloridrato de triprolidina. O pelo menos um broncodilatador pode ser pelo menos um selecionado dentre albuterol, sulfato de albuterol, aminofilina, sulfato de atropina, sulfato de efedrina, epinefrina, bitartarato de epinefrina, cloridrato de epinefrina, brometo de ipratrópio, isoproterenol, cloridrato de isoproterenol, sulfato de isoproterenol, cloridrato de levalbuterol, sulfato de metaproterenol, oxtrifilina, acetato de pirbuterol, xinafoato de salmeterol, sulfato de terbutalina e teofilina. O pelo menos um expectorante ou antitussivo pode ser pelo menos um selecionado dentre benzonatato, fosfato de codeína, sulfato de codeína, bromidrato de dextrametorfano, cloridrato de difenidramina, guaifenesina e cloridrato de hidromorfona. O pelo menos um fármaco respiratório variado pode ser pelo menos um selecionado dentre acetilcisteína, dipropionato de beclometazona, beractanto, budesonida, calfactanto, cromolina sódica, dornase alfa, epoprostenol sódico, flunisolida, propionato de fluticasona, montelucaste sódico, nedocromila sódica, palivizumabe, triancinolona acetonido, zafirlucaste e zileutona. (vide, por exemplo, páginas 585 a 642 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00082] O pelo menos um antiácido, adsorvent ou antiflatulento pode ser pelo menos um selecionado dentre carbonato de alumínio, hidróxido de alumínio, carbonato de cálcio, magaldrato, hidróxido de magnésio, óxido de magnésio, simeticona e bicarbonato de sódio. A pelo menos uma enzima digestiva ou solubilizante de cálculo biliar pode ser pelo menos um selecionado dentre pancreatina, pancrelipase e ursodiol. O pelo menos um antidiarreico pode ser pelo menos um selecionado dentre atapulgita, subsalicilato de bismuto, cálciopolicarbófilo, cloridrato de difenoxilato e sulfato de atropina, loperamida, acetato de octreotida, tintura de ópio e tintura de ópio (canforada). O pelo menos um laxativo pode ser pelo menos umselecionado dentre bisocodil, cálcio policarbófilo, cáscara sagrada, extrato fluido aromático de cáscara sagrada, extrato fluido de cáscara sagrada, óleo de mamona, docusato cálcico, docusato sódico, glicerina, lactulose, citrato de magnésio, hidróxido de magnésio, sulfato de magnésio, metil celulose, óleo mineral, polietileno glicol ou solução eletrolítica, plantago, sene e fosfatos de sódio. O pelo menos um antiemético pode ser pelo menos um selecionado dentre cloridrato de cloropromazina, dimenidrinato, mesilato de dolasetrona, dronabinol, cloridrato de granisetrona, cloridrato de meclizina, cloridrato de metocloproamida, cloridrato de ondansetrona, perfenazina, proclorpe- razina, edisilato de proclorperazina, maleato proclorperazino, cloridrato de prometazina, escopolamina, maleato tietilperazina e cloridrato de trimetobenzamida. O pelo menos um fármaco antiúlcera pode ser pelo menos um selecionado dentre cimetidina, cloridrato de cimetidina, famotidina, lansoprazol, misoprostol, nizatidina, omeprazol, rabeprazol sódico, ranitidina citrato de bismuto, cloridrato de ranitidina e sucralfato (vide, por exemplo, páginas 643 a 95 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00083] O pelo menos um corticosteroide pode ser pelo menos um selecionado dentre betametasona, acetato de betametasona ou fosfato sódico de betametasona, acetato de cortisona, dexametasona, acetato de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, acetato de fludrocortisona, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona, succinato sódico de hidrocortisona, metil prednisolona, acetato de metil prednisolona, succinato sódico de metil prednisolona, prednisolona, acetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, tebutato de prednisolona, prednisona, triancinolona, acetonido de triancinolona e diacetato de triancinolona. O pelo menos um androgênio ou esteroide anabolizante pode ser pelo menos um selecionado dentre danazol, fluoximesterona, metiltestosterona, decanoato de nandrolona, fenpropionato de nandrolona, testosterona, cipionato de testosterona, enantato de testosterona, propionato de testosterona e sistema transdérmico de testosterona. O pelo menos um estrogênio ou uma progestina pode ser pelo menos um selecionado dentre estrogênios esterificados, estradiol, cipionato de estradiol, sistema transdérmico de estradiol/acetato de noretindrona, valerato de estradiol, estrogênios (conjugados), estropipato, etinil estradiol, etinil estradiol e desogestrel, etinil estradiol e diacetato de etinodiol, etinil estradiol e desogestrel, etinil estradiol e diacetato de etinodiol, etinil estradiol e levonorgestrel, etinil estradiol e noretindrona, etinil estradiol e acetato de noretindrona, etinil estradiol e norgestimato, etinil estradiol e norgestrel, etinil estradiol e noretindrona e acetato e fumarato ferroso, levonorgestrel, acetato de medróxi progesterona, mestranol e noretindrona, noretindrona, acetato de noretindrona, norgestrel e progesterona. A pelo menos uma gonadrotropina pode ser pelo menos uma selecionada dentre acetato de ganirelix, acetato de gonadorrelina, acetato de histrelina e menotropinas. O pelo menos um antidiabético ou glucagon pode ser pelo menos um selecionado dentre acarbose, clorpropamida, glimepirida, glipizida, glucagon, gliburida, insulinas, cloridrato de metformina, miglitol, cloridrato de pioglitazona, repaglinida, maleato de rosiglitazona e troglitazona. O pelo menos um hormônio da tiroide pode ser pelo menos um selecionado dentre levotiroxina sódica, liotironina sódica, liotrix e tiroide. O pelo menos um antagonista de hormônio da tiroide pode ser pelo menos um selecionado dentre metimazol, iodeto de potássio, iodeto de potássio (solução saturada), propiltiouracil, iodo radioativo (iodeto de sódio 131I) e solução forte de iodo. O pelo menos um hormônio da hipófise pode ser pelo menos um selecionado dentre corticotropina, cosintropina, acetato de desmopressina, acetato de leuprolida, corticotropina de repositório, somatrem, somatropina e vasopressina. O pelo menos um fármaco similar a paratiroide pode ser pelo menos um selecionado dentre calcifediol, calcitonina (humana), calcitonina (de salmão), calcitriol, diidrotaquisterol e etidronato dissódico. (vide, por exemplo, páginas 696 a 796 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00084] O pelo menos um diurético pode ser pelo menos um selecionado dentre acetazolamida, acetazolamida sódica, cloridrato de amilorida, bumetanida, clortalidona, etacrinato sódico, ácido etacrínico, furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, manitol, metolazona, espirono lactona, torsemida, triantereno e ureia. O pelo menos um eletrólito ou solução de reposição pode ser pelo menos um selecionado dentre acetato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, glubionato de cálcio, gluceptato de cálcio, gluconato de cálcio, lactato de cálcio, fosfato de cálcio (dibásico), fosfato de cálcio (tribásico), dextrano (alto peso molecular), dextrano (baixo peso molecular), hetamido, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de potássio, bicarbonato de potássio, cloreto de potássio, gluconato de potássio, injeção de Ringer, injeção de Ringer (lactato) e cloreto de sódio. O pelo menos um acidificante ou alcalinizante pode ser pelo menos um selecionado de bicarbonato de sódio, lactato de sódio e trometamina. (vide, por exemplo, páginas 797 a 833 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00085] O pelo menos um hematínico pode ser pelo menos um selecionado dentre fumarato ferroso, gluconato ferroso, sulfato ferroso, sulfato ferroso (seco), ferro dextrano, ferro sorbitol, complexo de polissacarídeo-ferro e complexo de sódio e gluconato férrico. O pelo menos um anticoagulante pode ser pelo menos um selecionado dentre ardeparina sódica, dalteparina sódica, danaparoide sódico, enoxaparina sódica, heparina cálcica, heparina sódica e varfarina sódica. O pelo menos um derivado de sangue pode ser pelo menos um selecionado dentre albumina a 5%, albumina a 25%, fator anti- hemofílico, complexo coagulante anti-inibidor, antitrombina III (humana), fator IX (humano), complexo de fator IX, e frações de proteína plasmática. A pelo menos uma enzima trombolítica pode ser pelo menos uma selecionada dentre alteplase, anistreplase, reteplase (recombinante), estreptoquinase e uroquinase. (vide, por exemplo, páginas 834 a 66 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00086] O pelo menos um fármaco alquilante pode ser pelo menos um selecionado dentre bussulfano, carboplatina, carmustina, cloram- bucila, cisplatina, ciclofosfamida, ifosfamida, lomustina, cloridrato de mecloretamina, melfalana, cloridrato de melfalana, estreptozocina, temozolomida e tiotepa. O pelo menos um antimetabólito pode ser pelo menos um selecionado dentre capecitabina, cladribina, citarabina, floxuridina, fosfato de fludarabina, fluorouracila, hidroxiureia, mercapto- purina, metotrexato, metotrexato sódico e tioguanina. O pelo menos um antibiótico antineoplásico pode ser pelo menos um selecionado dentre sulfato de bleomicina, dactinomicina, citrato de daunorrubicina lipossomal, cloridrato de daunorrubicina, cloridrato de doxorrubicina, cloridrato de doxorrubicina liposomal, cloridrato de epirrubicina, cloridrato de idarrubicina, mitomicina, pentostatina, plicamicina e valrubicina. O pelo menos um antineoplásico que altera o equilíbrio hormonal pode ser pelo menos um selecionado dentre anastrozol, bicalutamida, fosfato sódico de estramustina, exemestano, flutamida, acetato de goserelina, letrozol, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, nilutamida, citrato de tamoxifeno, testolactona e citrato de toremifeno. O pelo menos um antineoplásico variado pode ser pelo menos um selecionado a partir de asparaginase, bacilo Calmette- Guerin (BCG) (intravesical vivo), dacarbazina, docetaxel, etoposida, fosfato de etoposida, cloridrato de gemcitabina, cloridrato de irinotecano, mitotano, cloridrato de mitoxantrona, paclitaxel, pegaspa- rgaso, porfímero sódico, cloridrato de procarbazina, rituximab, teniposide, cloridrato de topotecano, trastuzumab, tretinoína, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, tartarato de vinorelbina. (vide, por exemplo, páginas 867 a 963 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00087] O pelo menos um imunossupressor pode ser pelo menos um selecionado dentre azatioprina, basiliximabe, ciclosporina, daclizumabe, imunoglobulina linfocitária, muromonabe-CD3, micofeno- lato de mofetila, cloridrato de micofenolato de mofetila, sirolimo e tacrolimo. A pelo menos uma vacina ou um toxoide pode ser pelo menos um selecionado dentre vacina BCG, vacina para cólera, toxoides de difteria e tétano (adsorvido), toxoides de difteria e tétano e vacina acelular adsorvida para coqueluche, toxoides de difteria e tétano e vacina com célula inteira para coqueluche, vacinas conjugadas para Haemophillus b, vacina para hepatite A (inativada), vacina para hepatite B (recombinante), vacina para vírus da gripe 1999 a 2000 tipos trivalentes A & B (antígeno de superfície purificado), vacina para vírus da gripe 1999 a 2000 tipos trivalentes A & B (subvírion ou subvírion purificado), vacina para vírus da gripe 1999 a 2000 tipos trivalentes A & B (vírion inteiro), vacina para vírus de encefalite japonesa (inativado), vacina para doença de Lyme (OspA recombinante), vacina para vírus de rubéola, sarampo e caxumba (viva), vacina para vírus de rubéola, sarampo e caxumba (viva atenuada), vacina para vírus do sarampo (viva atenuada), vacina antimeningocócica à base de polissacarídeo, vacina para vírus de caxumba (viva), vacina para peste bubônica, vacina pneumocócica (polivalente), vacina para poliovírus (inativado), vacina para poliovírus (viva, oral, trivalente), vacina para raiva (adsorvida), vacina para raiva (célula diploide humana), vacina para vírus de rubéola e caxumba (viva), vacina para vírus de rubéola (viva, atenuada), toxoide de tétano (adsorvido), toxoide de tétano (fluido), vacina para febre tifoide (oral), vacina para febre tifoide (parenteral), vacina para febre tifoide polissacarídica VI, vacina para vírus de varicela e vacina para febre amarela. A pelo menos uma antitoxina ou um antiveneno pode ser pelo menos um selecionado dentre antiveneno de aranha viúva-negra, antiveneno para Crotalidae (polivalente), antitoxina para difteria (equina) e antiveneno para Micrurus fulvius. O pelo menos um soro imune pode ser pelo menos um selecionado dentre imunoglobulina contra citomegalovírus (intravenoso), imunoglobulina contra hepatite B (humana), imunoglobulina intramuscular, imunoglobulina intravenoso, imunoglobulina contra raiva (humana), imunoglobulina contra vírus sincicial respiratório intravenosa (humana), imunoglobulina contra Rh0(D) (humana), imunoglobulina contra Rh0(D) intravenosa (humana), imunoglobulina contra tétano (humana) e imunoglobulina contra varicela-zóster. O pelo menos um modificador de resposta biológica pode ser pelo menos um selecionado dentre aldesleucina, epoetina alfa, filgrastim, acetato de glatirâmero para injeção, interferon alfacon- 1, interferon alfa-2a (recombinante), interferon alfa-2b (recombinante), interferon beta-1a, interferon beta-1b (recombinante), interferon gama- 1b, cloridrato de levamisol, oprelvecina e sargramostim. (Vide, por exemplo, páginas 964 a 1040 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00088] O pelo menos um anti-infectivo de uso oftálmico pode ser selecionado dentre bacitracina, cloranfenicol, cloridrato de ciprofloxacina, eritromicina, sulfato de gentamicina, ofloxacina a 0,3%, sulfato de polimixina B, sulfacetamida sódica a 10%, sulfacetamida sódica a 15%, sulfacetamida sódica a 30%, tobramicina e vidarabina. O pelo menos um anti-inflamatório de uso oftálmico pode ser pelo menos um selecionado dentre dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, diclofenaco sódico a 0,1%, fluorometolona, flurbiprofeno sódico, cetorolaco trome- tamina, acetato de prednisolona (suspensão) e fosfato sódico de prednisolona (solução). O pelo menos um miótico pode ser pelo menos um selecionado dentre cloreto de acetilcolina, carbacol (intraocular), carbacol (tópico), iodeto de ecotiofato, pilocarpina, cloridrato de pilocarpina e nitrato de pilocarpina. O pelo menos um midriático pode ser pelo menos um selecionado dentre sulfato de atropina, cloridrato de ciclopentolato, cloridrato de epinefrina, borato de epinefrila, bromidrato de homatropina, cloridrato de fenilefrina, bromidrato de escopolamina e tropicamida. O pelo menos um vasoconstritor oftálmico pode ser pelo menos um selecionado dentre cloridrato de nafazolina, cloridrato de oximetazolina e cloridrato de tetraidrozolina. O pelo menos um oftálmico variado pode ser pelo menos um selecionado dentre cloridrato de apraclonidina, cloridrato de betaxolol, tartarato de brimonidina, cloridrato de carteolol, cloridrato de dipivefrina, cloridrato de dorzolamida, difumarato de emedastina, fluoresceína sódica, fumarato de cetotifeno, latanoprosta, cloridrato de levobunolol, cloridrato de metipranolol, cloreto de sódio (hipertônico) e maleato de timolol. O pelo menos um ótico pode ser pelo menos um selecionado dentre ácido bórico, peróxido de carbamida e cloranfenicol, oleato-condensado de trietanolamina polipeptídica. O pelo menos um fármaco nasal pode ser pelo menos um selecionado dentre dipropionato de beclometazona, budesonida, sulfato de efedrina, cloridrato de epinefrina, flunisolida, proprionato de fluticasona, cloridrato de nafazolina, cloridrato de oximetazolina, cloridrato de fenilefrina, cloridrato de tetra-hidrozolina, acetonido de triancinolona, cloridrato de xilometazolina. (vide, por exemplo, páginas 1041 a 97 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00089] O pelo menos um anti-infectivo local pode ser pelo menos um selecionado dentre aciclovir, anfotericina B, creme de ácido azelaico, bacitracina, nitrato de butoconazol, fosfato de clindamicina, clotrimazol, nitrato de econazol, eritromicina, sulfato de gentamicina, cetoconazol, acetato de mafenida, metronidazol (tópico), nitrato de miconazol, mupirocina, cloridrato de naftifina, sulfato de neomicina, nitrofurazona, nistatina, sulfadiazina de prata, cloridrato de terbinafina, terconazol, cloridrato de tetraciclina, tioconazol e tolnaftato. A pelo menos um escabicida ou pediculicida pode ser pelo menos um selecionado dentre crotamitona, lindano, permetrina e piretrinas. O pelo menos um corticosteroide de uso tópico pode ser pelo menos um selecionado dentre dipropionato de beta-metasona, valerato de beta- metasona, propionato de clobetasol, desonida, desoximetasona, dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, diacetato de diflorasona, acetonido de fluocinolona, fluocinonida, flurandrenolida, propionato de fluticasona, halcionida, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona, furoato de mometasona e acetonido de triancinolona. (Vide, por exemplo, páginas 1098 a 1136 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00090] A pelo menos uma vitamina ou um mineral pode ser pelo menos um selecionado dentre vitamina A, complexo de vitamina B, cianocobalamina, ácido fólico, hidroxicobalamina, leucovorina cálcica, niacina, niacinamida, cloridrato de piridoxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina C, vitamina D, colecalciferol, ergocalciferol, análogo de vitamina D, doxercalciferol, paricalcitol, vitamina E, análogo de vitamina K, fitonadiona, fluoreto de sódio, fluoreto de sódio (tópico), elementos-traço, cromo, cobre, iodo, manganês, selênio e zinco. O pelo menos um calórico pode ser pelo menos um selecionado dentre infusões de aminoácido (cristalino), infusões de aminoácido em dextrose, infusões de aminoácido com eletrólitos, infusões de aminoácido com eletrólitos em dextrose, infusões de aminoácido para insuficiência hepática, infusões de aminoácido para alto estresse metabólico, infusões de aminoácido para insuficiência renal, dextrose, emulsões de gordura e triglicerídeos de cadeia média. (vide, por exemplo, páginas 1137 a 63 do documento Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00091] As composições de arcabouço de proteína da presenteinvenção podem compreender adicionalmente ao menos um dentre quaisquer quantidade adequada e eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo um arcabouço de proteína colocado em contato com, ou administrado a, uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente precisando de tal modulação, tratamento ou terapia, opcionalmente compreendendo, adicionalmente, pelo menos um selecionado dentre pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, mas não se limitando a, um antagonista químico ou proteico de TNF, um anticorpo monoclonal ou policlonal de TNF ou fragmento do mesmo, um receptor de TNF solúvel (por exemplo p55, p70 ou p85) ou fragmento do mesmo, polipeptídeos de fusão do mesmo, ou um antagonista de TNF de molécula pequena, por exemplo, uma proteína de ligação I ou II a TNF (TBP-1 ou TBP-II), nerelimomabe, infliximabe, etanercepte, CDP-571, CDP-870, afelimo- mabe, lenercepte, e similares), um antirreumático (por exemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglicose, azatioprina, etanercept, tiomalato sódico de ouro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfassalazina), um relaxante muscular, um narcótico, um medicamentoanti-inflamatório não esteroidal (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um microbicida (por exemplo, um aminoglicosídeo, um fungicida, um antiparasítico, um antiviral, um carbapenema, uma cefalosporina, uma fluoroquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outro microbicida), um antipso- ríase, um corticoesteroide, um esteroide anabolizante, um agente relacionado a diabetes, um mineral, um nutricional, um agente para tiroide, uma vitamina, um hormônio relacionado a cálcio, um antidiarreico, um antitussivo, um antiemético, um antiúlcera, um laxativo, um anticoagulante, uma eritropoietina (por exemplo, epoetina alfa), um filgrastim (por exemplo, G-CSF, Neupogen), um sargramostim (GM-CSF, Leukine), uma imunização, uma imunoglobu- lina, um imunossuppressivo (por exemplo, basiliximabe, ciclosporina, daclizumabe), um hormônio do crescimento, um fármaco de reposição hormonal, um modulador do receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente alquilante, um antimetabólito, um inibidor mitótico, um radiofarmacêutico, um antidepressivo, um agente antimaníaco, um antipsicótico, um ansiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, um medicamento para asma, um beta agonista, um esteroide inalável, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo da mesma, dornase alfa (Pulmozyme), uma citoquina ou um antagonista de citoquina. Alguns exemplos não limitadores dessas citoquinas incluem, mas não se limitam a, qualquer dentre IL-1 a IL-32 (por exemplo, IL-1, IL-2, etc.). Dosagens adequadas são bem-conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Wells et al., editores, Pharmacotherapy Handbook, 2a Edição, Appleton and Lange, Stamford, CT, EUA (2000), PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Edição de luxo, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA, EUA (2000), cada uma das quais está aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade.

[00092] Essas substâncias anticâncer ou anti-infectivas podem, também, incluir moléculas de toxina que são associadas, ligadas, coformuladas ou coadministradas com pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção. A toxina pode, opcionalmente, agir para matar células ou tecidos patológicos, de modo seletivo. A célula patológica pode ser uma célula de câncer ou outra célula. Tais toxinas podem ser, mas não são limitadas a, toxina purificada ou recombinante ou fragmento de toxina que compreende pelo menos um domínio citotóxico funcional de toxina, por exemplo, selecionado a partir de pelo menos um de ricina, toxina de difteria, uma toxina venenosa, ou uma toxina bacteriana. O termo toxina inclui, também tanto endotoxinas quanto exotoxinas produzidas por qualquer bactéria ou vírus de ocorrência natural, mutante ou recombinante que possam causar qualquer condição patológica em seres humanos e outros mamíferos, incluindo choque de toxina, que pode resultar em morte. Tais toxinas podem incluir, mas não se limitam a, enterotoxina lábil ao aquecimento enterotoxigênico de E. coli (LT), enterotoxina estável em aquecimento (ST), citotoxina shiguela, enterotoxinas Aeromonas, toxina-1 da síndrome do choque tóxico (TSST-1), enterotoxina Staphylococcal A (SEA), B (SEB), ou C (SEC), enterotoxinas Streptococcal e similares. Tais bactérias incluem, mas não se limitam a, cepas de uma espécie de enterotoxigênico de E. coli (ETEC), entero-hemorrágico de E. coli (por exemplo, cepas de serotipo 0157:H7), espécie estafilococo (por exemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), espécie Shigella (por exemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, e Shigella sonnei), espécie Salmonella (por exemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), espécie Clostridium (por exemplo, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), espécie Camphlobacter (por exemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), espécie Heliobacter, (por exemplo, Heliobacter pylori), espécie Aeromonas (por exemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, espécie Vibrios (por exemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), espécie Klebsiella, Pseudomonasaeruginosa e Streptococci. Vide, por exemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3a ed, páginas 1 a 13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2a Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York, E.U.A. (1991); Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3a Ed., Churchill Livingstone, New York, E.U.A. (1990); Berkow et al, eds., The Merck Manual, 16a edição, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990), cujos conteúdos estão aqui incorporados, em sua totalidade, a título de referência.

[00093] Os compostos, composições ou combinações de arcabouço de proteína da presente invenção podem compreender adicionalmente ao menos um dentre qualquer auxiliar adequado, incluindo, mas não se limitando a, diluente, ligante, estabilizante, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservante, adjuvante ou similares. São preferenciais os auxiliares farmaceuticamente aceitáveis. Alguns exemplos não limitadores dessas soluções estéreis, e métodos para preparo das mesmas, são bem-conhecidos na técnica incluindo, mas limitando-se a, Gennaro, Editores, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18aEdição, Mack Publishing Co. (Easton, PA, EUA) 1990. Podem ser rotineiramente selecionados veículos farmaceuticamente aceitáveis que sejam adequados para o modo de administração, a solubilidade e/ou a estabilidade da composição de arcabouço de proteína, seu fragmento ou variante, conforme é bem-conhecido na técnica ou conforme descrito na presente invenção.

[00094] Os excipientes e aditivos farmacêuticos úteis na presente composição incluem, mas não se limitam a, proteínas, peptídeos, aminoácidos, lipídios e carboidratos (por exemplo, açúcares, inclusive monossacarídeos, di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos, açúcares derivati- zados como alditóis, ácidos aldônicos, açúcares esterificados e similares, e polissacarídeos ou polímeros de açúcar), que podem estar presentes por si sós ou em combinação, e que compreendem, por si sós ou em combinação, de 1 a 99,99%, em peso ou volume. Exemplos de excipientes à base de proteína incluem albumina sérica, como albumina sérica humana (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e similares. Componentes de aminoácido/pro- teína representativos, que podem também funcionar como tampão, incluem alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame e similares. Um aminoácido preferencial é a glicina.

[00095] Os excipientes à base de carboidrato adequados ao uso na invenção incluem, por exemplo, monossacarídeos como frutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose e similares, dissacarí- deos como lactose, sacarose, trealose, celobiose e similares, polissacarídeos como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e similares, e alditóis, como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol e similares. Excipientes de carboidrato preferenciais para uso na presente invenção são manitol, trealose, e rafinose.

[00096] As composições de arcabouço de proteína podem, também, incluir um tampão ou um agente de ajuste de pH, sendo que tipicamente o tampão é um sal preparado a partir de ácido ou base orgânicos. Os tampões representativos incluem sais de ácido orgânico, como sais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico; Tris, cloridrato de trometamina ou tampões de fosfato. Os tampões preferenciais para uso nas presentes composições são sais de ácido orgânico, como citrato.

[00097] Adicionalmente, as composições de arcabouço de proteína da invenção podem incluir excipientes/aditivos poliméricos, como polivinilpirrolidonas, Ficoll (um açúcar polimérico), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas como 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina), polietile- no glicóis, agentes flavorizantes, agentes microbicidas, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestática, tensoativos (por exemplo, polissorbatos, como "TWEEN 20" e "TWEEN 80"), lipídios (por exemplo, fosfolipídeos, ácidos graxos), esteroides (por exemplo, colesterol) e agentes quelantes (por exemplo, EDTA).

[00098] Estes e outros excipientes farmacêuticos conhecidos e/ou aditivos adequados para uso nas composições de arcabouço de proteína, suas porções ou variantes, de acordo com a presente invenção, são conhecidos na técnica, por exemplo conforme mencionados em "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a Edição, Williams & Williams, (1995), e em "Physician’s Desk Reference", 52a Edição, Medical Economics, Montvale, NJ, EUA (1998), cujas descrições estão aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade. Os materiais de veículo ou excipiente preferenciais são os carboidratos (por exemplo, sacarídeos e alditóis) e tampões (por exemplo, citrato) ou agentes poliméricos. Uma molécula veículo exemplificadora consiste em um mucopolissacarídeo, ácido hialurô- nico, o qual pode ser útil para aplicação intra-articular.

Formulações

[00099] Conforme observado acima, a invenção apresenta formulações estáveis, as quais compreendem, de preferência, um tampão de fosfato com solução salina ou um sal escolhido, bem como soluções e formulações conservadas contendo um conservante, bem como formulações preservadas multiuso adequadas para uso farmacêutico ou veterinário, compreendendo pelo menos um arcabouço de proteína em uma formulação farmaceuticamente aceitável. As formulações conservadas contêm pelo menos um conservante conhecido ou, opcionalmente, selecionado do grupo consistindo em pelo menos um fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldeído, clorobutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexa- hidrato), alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, polímeros, ou misturas dos mesmos em um diluente aquoso. Pode-se usar qualquer concentração ou mistura adequada, conforme é conhecido na técnica, como cerca de 0,0015%, ou qualquer faixa, valor ou fração das mesmas. Alguns exemplos não limitadores incluem, nenhum conservante, cerca de 0,1 a 2% de m- cresol (por exemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), cerca de 0,1 a 3% de álcool benzílico (e,g, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), cerca de 0,001 a 0,5% de timerosal (e.g., 0,005, 0,01), cerca de 0,001 a 2,0% de fenol (por exemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005 a 1,0% de alquilparabeno(s) (por exemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%), e similares.

[000100] Conforme observado acima, a invenção apresenta um artigo de fabricação compreendendo material de embalagem e pelo menos um frasco compreendendo uma solução de ao menos um arcabouço de proteína com os tampões e/ou conservantes prescritos, opcionalmente em um diluente aquoso, sendo que o dito material de embalagem compreende um rótulo que indica que essa solução pode ser mantida ao longo de um período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66 ou 72 horas, ou mais. A invenção compreende, adicionalmente, um artigo de fabricação compreendendo material de embalagem, um primeiro frasco compreendendo pelo menos um arcabouço de proteína liofilizado, e um segundo frasco compreendendo um diluente aquoso com o tampão ou conservante prescrito, sendo que o dito material de embalagem compreende um rótulo que instrui um paciente a reconstituir o pelo menos um arcabouço de proteína no diluente aquoso para formar uma solução que pode ser mantida ao longo de um período de vinte e quatro horas ou mais.

[000101] O pelo menos um arcabouço de proteína usado de acordo com a presente invenção pode ser produzido por meios recombinan- tes, inclusive a partir de células de mamífero ou preparações transgê- nicas, ou pode ser purificado a partir de outras fontes biológicas, conforme descrito na presente invenção ou conforme é conhecido na técnica.

[000102] A faixa de teores do ao menos um arcabouço de proteína no produto da presente invenção inclui quantidades que resultem, após a reconstituição no caso de um sistema molhado/seco, em concentrações de cerca de 1,0 μg/ml a cerca de 1.000 mg/ml, embora concentrações mais baixas ou mais altas sejam funcionais e dependam do veículo de aplicação a que se destina o produto, por exemplo formulações de solução serão diferentes daquelas para emplastros transdérmicos, ou métodos de aplicação pulmonar, transmucosal, osmótico ou por microbomba.

[000103] De preferência, o diluente aquoso, opcionalmente, compreende adicionalmente um conservante farmaceuticamente aceitável. Conservantes preferenciais incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidrocetato de sódio e timerosal, ou misturas dos mesmos. A concentração de conservante usada na formulação é uma concentração suficiente para resultar em um efeito microbicida. Tais concentrações são dependentes do conservante selecionado e são prontamente determinadas pelo versado na técnica.

[000104] Outros excipientes, por exemplo agentes de isotonicidade, tampões, antioxidantes e conservantes intensificadores, podem ser opcionalmente, e de preferência, adicionados ao diluente. Um agente de isotonicidade, como a glicerina, é comumente usado em concentrações conhecidas. Um tampão fisiologicamente tolerado é, de preferência, adicionado para fornecer um controle de pH aprimorado. As formulações podem abranger uma ampla gama de pHs, como de cerca de pH 4 a cerca de pH 10, faixas preferenciais de cerca de pH 5 a cerca de pH 9, e uma faixa da máxima preferência de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. De preferência, as formulações da presente invenção têm um pH entre cerca de 6,8 e cerca de 7,8. Os tampões preferenciais incluem tampões de fosfato e, com a máxima preferência, fosfato sódico, particularmente solução salina tamponada com fosfato (PBS).

[000105] Outros aditivos, como solubilizantes farmaceuticamente aceitáveis como Tween 20 (polioxietileno (20) monolaurato de sorbitano), Tween 40 (polioxietileno (20) monopalmitato de sorbitano), Tween 80 (polioxietileno (20) mono-oleato de sorbitano), Pluronic F68 (copolímeros de bloco de polioxietileno e polioxipropileno) e PEG (polietileno glicol), ou tensoativos não iônicos como polissorbato 20 ou 80, ou poloxâmero 184 ou 188, polióis Pluronic®, outros copolímeros de bloco, e quelantes como EDTA e EGTA, podem ser opcionalmente adicionados às formulações ou composições para reduzir a agregação. Esses aditivos são particularmente úteis se uma bomba ou recipiente plástico for usado para administrar a formulação. A presença de tensoativo farmaceuticamente aceitável atenua a propensão de a proteína se agregar.

[000106] As formulações da presente invenção podem ser preparadas por meio de um processo que compreende misturar pelo menos um arcabouço de proteína e um conservante selecionado do grupo consistindo em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno, (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas dos mesmos, em um diluente aquoso. A mistura do pelo menos um arcabouço de proteína e um conservante em um diluente aquoso é feita com o uso de procedimentos convencionais de dissolução e mistura. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um arcabouço de proteína em solução tamponada é combinada ao conservante desejado em uma solução tamponada em quantidades suficientes para fornecer a proteína e o conservante nas concentrações desejadas. Variações desse processo serão reconhecidas pelo versado na técnica. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adicionados, o uso de aditivos adicionais, e a temperatura e o pH no qual a formulação é preparada são fatores que podem ser otimizados para a concentração e os meios de administração usados.

[000107] As formulações reivindicadas podem ser fornecidas aos pacientes sob a forma de soluções límpidas ou sob a forma de frascos duplos compreendendo um frasco contendo pelo menos um arcabouço de proteína liofilizado, que é reconstituído com um segundo frasco contendo água, um conservante e/ou excipientes, de preferência um tampão de fosfato e/ou solução salina e um sal escolhido, em um diluente aquoso. Tanto um único frasco de solução, ou um frasco duplo que requer reconstituição, pode ser reutilizado diversas vezes e pode ser suficiente para um ciclo único ou ciclos múltiplos do tratamento do paciente e, dessa forma, pode fornecer um regime de tratamento mais conveniente do que o atualmente disponível.

[000108] Os presentes artigos de fabricação reivindicados são úteis para administração de um período que está na faixa de imediato a vinte e quatro horas ou mais. Em conformidade, os artigos de fabricação presentemente reivindicados oferecem vantagens significativas para o paciente. As formulações da invenção podem, opcionalmente, ser armazenadas com segurança a temperaturas de cerca de 2°C a cerca de 40°C, e reter a atividade biológica da proteína durante extensos períodos de tempo, permitindo assim o uso de um rótulo na embalagem indicando que a solução pode ser mantida e/ou usada ao longo de um período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 ou 96 horas, ou mais. Se for usado um diluente conservante, esse rótulo pode incluir o uso de 1 a 12 meses, meio ano, um ano e meio e/ou dois anos.

[000109] As soluções de pelo menos um arcabouço de proteína da invenção podem ser preparadas por meio de um processo que compreende misturar pelo menos um arcabouço de proteína em um diluente aquoso. A misturação é realizada com o uso deprocedimentos convencionais de dissolução e misturação. Para preparar um diluente adequado, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um arcabouço de proteína em água ou tampão é combinada em quantidade suficiente para fornecer a proteína e, opcionalmente, um conservante ou tampão, nas concentrações desejadas. Variações desse processo serão reconhecidas pelo versado na técnica. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adicionados, o uso de aditivos adicionais, e a temperatura e o pH no qual a formulação é preparada são fatores que podem ser otimizados para a concentração e os meios de administração usados.

[000110] Os produtos reivindicados podem ser fornecidos a pacientes sob a forma de soluções límpidas ou sob a forma de frascos duplos compreendendo um frasco contendo pelo menos um arcabouço de proteína liofilizado que éreconstituído com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. Tanto um único frasco de solução, ou um frasco duplo que requer reconstituição, pode ser reutilizado diversas vezes e pode ser suficiente para um ciclo único ou ciclos múltiplos do tratamento do paciente e, dessa forma, fornece um regime de tratamento mais conveniente do que o atualmente disponível.

[000111] Os produtos reivindicados podem ser fornecidos indiretamente para os pacientes, mediante o fornecimento a farmácias, clínicas ou outras instituições e instalações, de soluções límpidas ou frascos duplos compreendendo um frasco de pelo menos um arcabouço de proteína liofilizado, que é reconstituído com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. A solução límpida, nesse caso, pode ser de até um litro ou mesmo de um tamanho maior, oferecendo um reservatório grande de onde porções menores da solução de pelo menos um arcabouço de proteína podem ser retiradas uma ou diversas vezes e transferidas para frascos menores a serem fornecidos pelas farmácias ou clínicas a seus clientes e/ou pacientes.

[000112] Os dispositivos reconhecidos compreendendo sistemas de frasco único incluem dispositivos injetores do tipo caneta para aplicação de uma solução, como BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®, e OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por exemplo, como aqueles desenvolvidos pela Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, EUA, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Suíça, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon, EUA (www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, Reino Unido, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediject.com), e dispositivos adequados similares. Dispositivos reconhecidos que compreendem um sistema de frasco duplo incluem os sistemas injetores do tipo caneta para reconstituir um fármaco liofilizado em um cartucho para aplicação da solução reconstituída, como HumatroPen®. Exemplos de outros dispositivos adequados incluem seringas preenchidas, autoinjetores, injetores sem agulha e conjuntos para infusão IV sem agulha.

[000113] Os produtos presentemente reivindicados incluem material de embalagem. O material de embalagem apresenta, em adição às informações requeridas pelos órgãos fiscalizadores, as condições sob as quais o produto pode ser usado. O material de embalagem da presente invenção apresenta instruções ao paciente para reconstituir pelo menos um arcabouço de proteína no diluente aquoso de modo a formar uma solução, e para usar a dita solução ao longo de um período de 2 a 24 horas ou mais para o produto com dois frascos de conteúdo molhado/seco. Para o produto com um único frasco contendo uma solução, o rótulo indica que essa solução pode ser usada ao longo de um período de 2 a 24 horas ou mais. Os produtos presentemente reivindicados são úteis para uso em produtos farmacêuticos destinados a seres humanos.

[000114] As formulações da presente invenção podem ser preparadas por um processo que compreende misturar pelo menos um arcabouço de proteína e um tampão selecionado, de preferência um tampão de fosfato contendo solução salina ou um sal escolhido. A mistura de pelo menos um arcabouço de proteína e tampão em um diluente aquoso é realizada usando-se procedimentos convencionais de dissolução e misturação. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um arcabouço de proteína em água ou tampão é combinada com o agente tampão desejado em água, em quantidades suficientes para fornecer a proteína e o tampão nas concentrações desejadas. Variações desse processo serão reconhecidas pelo versado na técnica. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adicionados, o uso de aditivos adicionais, e a temperatura e o pH no qual a formulação é preparada são fatores que podem ser otimizados para a concentração e os meios de administração usados.

[000115] As formulações estáveis ou conservadas reivindicadas podem ser fornecidas aos pacientes sob a forma de soluções límpidas ou sob a forma de frascos duplos compreendendo um frasco de arcabouço de proteína liofilizado que é reconstituído com um segundo frasco contendo um conservante ou tampão e excipientes em um diluente aquoso. Tanto um único frasco de solução, ou um frasco duplo que requer reconstituição, pode ser reutilizado diversas vezes e pode ser suficiente para um ciclo único ou ciclos múltiplos do tratamento do paciente e, dessa forma, fornece um regime de tratamento mais conveniente do que o atualmente disponível.

[000116] Outras formulações ou outros métodos para estabilização do arcabouço de proteína podem resultar em uma solução não necessariamente límpida de pó liofilizado compreendendo o arcabouço de proteína. Entre as soluções não límpidas estão formulações que compreendem suspensões de particulado, sendo que os ditos particulados consistem em uma composição contendo o arcabouço de proteína em uma estrutura de dimensão variável e conhecida, entre outros, como microesfera, micropartícula, nanopartícula, nanoesfera ou lipossoma. Essas formulações relativamente homogêneas de particulado essencialmente esférico contendo um agente ativo podem ser formadas colocando-se uma fase aquosa contendo o agente ativo e um polímero em contato com uma fase não aquosa, seguido de evaporação da fase não aquosa para causar a coalescência de partículas da fase aquosa, conforme apresentado em U.S. n° 4.589.330. As micropartículas porosas podem ser preparadas com o uso de uma primeira fase contendo agente ativo e um polímero disperso em um solvente contínuo, e removendo-se o dito solvente da suspensão por meio de secagem por congelamento ou diluição- extração-precipitação, conforme apresentado em U.S. n° 4.818.542. Os polímeros preferenciais para essas preparações são copolímeros ou polímeros naturais ou sintéticos, selecionados do grupo consistindo em gelatina, ágar, amido, arabinogalactano, albumina, colágeno, ácido poliglicólico, ácido polilático, glicolídeo-L(-) lactídeo poli(epsílon- caprolactona, poli(ácido epsílon-caprolactona-CO-lático), poli(ácido epsílon-caprolactona-CO-glicólico), poli(ácido β-hidr0xi butírico), óxido de polietileno, polietileno, poli(alquil-2-cianoacrilato), poli(metacrilato de hidroxietila), poliamidas, poli(aminoácidos), poli(2-hidróxi etil DL- aspartamida), poli(éster ureia), poli(L-fenilalanina/etileno glicol/1,6-di- isocianato hexano) e poli(metacrilato de metila). Os polímeros particularmente preferenciais são poliésteres, como ácido poliglicólico, ácido polilático, glicolídeo-L(-) lactídeo poli(epsílon-caprolactona, poli(ácido epsílon-caprolactona-CO-lático) e poli(ácido epsílon- caprolactona-CO-glicólico. Os solventes úteis para dissolver o polímero e/ou o ativo incluem: água, hexafluoroisopropanol, cloreto de metileno, tetra-hidrofurano, hexano, benzeno, ou hexafluoroacetona sesqui-hidrato. O processo de dispersar o ativo que contém fase com uma segunda fase pode incluir pressão a fim de forçar a dita primeira fase através de um orifício em um bocal para afetar a formação de gotícula.

[000117] As formulações de pó seco podem resultar de processos além da liofilização, como secagem por atomização ou extração de solvente por evaporação ou precipitação de uma composição cristalina, seguida de uma ou mais etapas para remover o solvente aquoso ou não aquoso. A preparação de uma composição de arcabouço de proteína seco por atomização é apresentada em U.S. n° 6.019.968. As composições de arcabouço de proteína sob a forma de pó seco podem ser produzidas mediante a secagem por atomização de soluções ou pastas fluidas do arcabouço de proteína e, opcionalmente, excipientes, em um solvente sob condições para se obter um pó seco respirável. Os solventes podem incluir compostos polares, como água e etanol, que podem ser prontamente secos. A estabilidade do arcabouço de proteína pode ser otimizada mediante a execução dos procedimentos de secagem por atomização na ausência de oxigênio, como sob um lençol de nitrogênio, ou mediante o uso do nitrogênio como gás secante. Uma outra formulação relativamente seca é uma dispersão de uma pluralidade de microestruturas perfuradas dispersas em um meio de suspensão que compreende, tipicamente, um propelente hidrofluoroalcano conforme apresentado em WO 9916419. As dispersões estabilizadas podem ser administradas aos pulmões de um paciente com o uso de um inalador de dosagem medida. Os equipamentos úteis na fabricação comercial dos medicamentos de secagem por atomização são produzidos pela Buchi Ltd. ou pela Niro Corp.

[000118] O pelo menos um arcabouço de proteína, seja nas formulações estáveis ou conservadas, ou nas soluções aqui descritas, pode ser administrado a um paciente de acordo com a presente invenção, por meio de uma variedade de métodos de aplicação, inclusive injeção subcutânea ou intramuscular, transdérmico, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba ou outros meios conhecidos pelo versado na técnica, conforme é bem- conhecido na técnica.

Aplicações Terapêuticas

[000119] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de uma doença, em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente, conforme é conhecido na técnica ou conforme descrito na presente invenção, usando-se pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção, por exemplo administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz do arcabouço de proteína a, ou colocando-se a mesma em contato com, a célula, o tecido, o órgão, o animal ou o paciente. A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de uma doença, em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente incluindo, mas não se limitando a, pelo menos uma dentre obesidade, uma doença imunológica, uma doença cardiovascular, uma doença infecciosa, uma doença maligna ou uma doença neurológica.

[000120] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma doença imunológica em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente incluindo, mas não se limitando a, pelo menos uma dentre artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide juvenil de início sistêmico, artrite psoriática, espondilite anquilosante, úlcera gástrica, artropatias soronegativas, osteoartrite, osteólise, afrouxamento asséptico de implantes ortopédicos, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, Lupus erythematosussistêmico, síndrome antifosfolipídio, iridociclite/uveíte/neurite óptica, fibrose pulmonar idiopática, vasculite sistêmica/granulomatose de Wegener, sarcoidose, orquite/procedi- mentos para reversão de vasectomia, doenças alérgicas/ atópicas, asma, rinite alérgica, eczema, dermatite de contato alérgica, conjuntivite alérgica, pneumonite de hipersensibilidade, transplantes, rejeição a transplante de órgão, doença de enxerto-versus-hospedeiro, síndrome de resposta inflamatória sistêmica, síndrome de sepse, sepse gram-positiva, sepse gram-negativa, sepse negativa para culturas, sepse fúngica, febre neutropênica, urossepse, meningococ- cemia, trauma/ hemorragia, queimaduras, exposição a radiação ionizante, pancreatite aguda, síndrome do desconforto respiratório em adultos, artrite reumatoide, hepatite induzida por álcool, patologias inflamatórias crônicas, sarcoidose, patologia de Crohn, anemia falciforme, diabetes, nefrose, doenças atópicas, reações de hipersensibilidade, rinite alérgica, febre do feno, rinite perene, conjuntivite, endometriose, asma, urticária, anafilaxia sistêmica, dermatite, anemia perniciosa, doença hemolítica, trombocitopenia, rejeição de enxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição a transplante de rim, rejeição a transplante de coração, rejeição a transplante de fígado, rejeição a transplante de pâncreas, rejeição a transplante de pulmão, rejeição a transplante de medula óssea (TMO), rejeição a aloenxerto de pele, rejeição a transplante de cartilagem, rejeição a enxerto ósseo, rejeição a transplante de intestino delgado, rejeição a implante de timo fetal, rejeição a transplante de paratiroide, rejeição a xenoenxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição a aloenxerto, reações de hipersensibilidade antirreceptor, doença de Graves, doença de Raynaud, diabetes tipo B resistente a insulina, asma, miastenia grave, citotoxicidade mediada por anticorpos, reações de hipersensibilidade tipo III, síndrome de POEMS (síndrome de polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal e alterações de pele), síndrome de polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal, alterações de pele, síndrome antifosfolipídio, pênfigo, escleroderma, doença mista do tecido conjuntivo, doença de Addison idiopática, diabetes melito, hepatite ativa crônica, cirrose biliar primária, vitiligo, vasculite, síndrome de cardiotomia pós-MI, hipersensibilidade tipo IV, dermatite de contato, pneumonite por hipersensibilidade, rejeição a aloenxerto, granulomas devidos a organismos intracelulares, sensibilidade a fármacos, doença de Wilson metabólica/idiopática, hemocromatose, deficiência de alfa-1- antitripsina, retinopatia diabética, tiroidite de Hashimoto, osteoporose, avaliação do eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal, cirrose biliar primária, tiroidite, encefalomielite, caquexia, fibrose cística, doença pulmonar crônica neonatal, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), linfoistiocitose hematofagocítica familiar, problemas dermatológicos, psoríase, alopécia, síndrome nefrótica, nefrite, nefrite glomerular, insuficiência renal aguda, hemodiálise, uremia, toxicidade pré-eclâmpsia, terapia com okt3, terapia anti-cd3, terapia com citoquinas, quimioterapia, radioterapia (por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, astenia, anemia, caquexia e similares), intoxicação crônica por salicilato, e similares. Vide, por exemplo, the Merck Manual, 12a a17a Editions, Merck & Company, Rahway, NJ, EUA (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), e Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., Editores, Segunda Edição, Appleton e Lange, Stamford, CT, EUA (1998, 2000), cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.

[000121] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma doença cardiovascular em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um dentre síndrome de atordoamento cardíaco, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, acidente vascular cerebral, acidente vascular cerebral isquêmico, hemorragia, síndrome coronária aguda, arterioesclerose, ateroesclerose, reestenose, doença arterioesclerótica diabética, hipertensão, hipertensão arterial, hipertensão renovascular, síncope, choque, sífilis do sistema cardiovascular, insuficiência cardíaca, cor pulmonale, hipertensão pulmonar primária, arritmias cardíacas, batidas ectópicas atriais, flutter atrial, fibrilação atrial (prolongado ou paroxístico), síndrome de pós-perfusão, resposta inflamatória à revascularização cardiopulmonar, taquicardia atrial caótica ou multifocal, taquicardia com QRS estreita regular, arritmias específicas, fibrilação ventricular, arritmias do feixe His, bloqueio atrioventricular, bloqueio da ramificação do feixe, transtornos isquêmicos do miocárdio, doença das artérias coronárias, angina pectoris, infarto do miocárdio, cardiomiopatia, cardiomiopatia congestiva dilatada, cardiomiopatia restritiva, doenças cardíacas valvulares, endocardite, doença do pericárdio, tumores cardíacos, aneurismas aórticos e periféricos, dissecção aórtica, inflamação da aorta, oclusão da aorta abdominal e suas ramificações, transtornos vasculares periféricos, transtornos arteriais oclusivos, doença aterosclerótica periférica, tromboangeíte obliterante, transtornos arteriais periféricos funcionais, fenômeno e doença de Raynaud, acrocianose, eritromelalgia, doenças venosas, trombose venosa, veias varicosas, fístula arteriovenosa, linfedema, lipedema, angina instável, lesão por reperfusão, síndrome pós- bombeamento, lesão por isquemia-reperfusão, e similares. Esse método pode, opcionalmente, compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um arcabouço de proteína, a uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente precisando de tal modulação, tratamento ou terapia.

[000122] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma doença infecciosa em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um dentre: infecção bacteriana aguda ou crônica, processos parasíticos ou infecciosos agudos ou crônicos, inclusive infecções bacterianas, virais e fúngicas, infecção por HIV/neuropatia por HIV, meningite, hepatite (por exemplo, A, B ou C, ou similares), artrite séptica, peritonite, pneumonia, epiglotite, E. coli 0157:h7, síndrome hemolítica urêmica/púrpura trombocitopênica trombolítica, malária, dengue hemorrágica, leishmaniose, hanseníase, síndrome do choque tóxico, miosite estreptocócica, gangrena gasosa, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, pneumonia por Pneumocystis carinii, doença inflamatória pélvica, orquite/epididimite, legionela, doença de Lyme, gripe A, vírus Epstein- Barr, síndrome hemofagocítica associada a vírus, encefalite viral/meningite asséptica, e similares.

[000123] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma doença maligna em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um dentre: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica aguda, células B, células T ou FAB ALL, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mielógena aguda, leucemia mielocítica crônica (LMC), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásica (SMD), linfoma, doença de Hodgkin, linfoma maligno, linfoma não-hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorretal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitose maligna, síndrome paraneoplá- sica/hipercalcemia por malignidade, tumores sólidos, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de cabeça, câncer de pescoço, câncer hereditário não-polipoide, linfoma de Hodgkin, câncer de fígado, câncer pulmonar, câncer pulmonar de células não-pequenas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma de células renais, câncer testicular, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, doença metastática, reabsorção óssea relacionada a câncer, dor óssea relacionada a câncer, e similares.

[000124] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma doença neurológica em uma cell, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um dentre: doenças neurodegenerativas, esclerose múltipla, dor de cabeça por enxaqueca, complexo de demência da AIDS, doenças de desmielinização como esclerose múltipla e mielite transversal aguda, transtornos extrapiramidais e cerebelares como lesões do sistema corticoespinhal, transtornos dos gânglios basais, transtornos de movimento hipercinéticos como coreia de Huntington e coreia senil, transtornos de movimento induzidos por medicamento, como aqueles induzidos por fármacos que bloqueiam os receptores de dopamina do SNC, transtornos de movimento hipocinéticos, como doença de Parkinson, paralisia supranuclear progressiva, lesões estruturais do cerebelo, degenerações espinocerebelares, como ataxia espinhal, ataxia de Friedreich, degenerações corticais cerebelares, degenerações de múltiplos sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager e Machado- Joseph), transtornos sistêmicos (doença de Refsum, abetalipoprotei- nemia, ataxia, telangiectasia e transtorno mitocondrial multi-sistemas), transtornos de desmielinização do núcleo, como esclerose múltipla, mielite transversal aguda, e transtornos da unidade motora, como atrofias musculares neurogênicas (corneta degeneração da célula anterior, como esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal infantil e atrofia muscular espinhal juvenil), doença de Alzheimer, síndrome de Down na meia-idade, doença difusa dos corpos de Lewy, demência senil do tipo relacionado a corpos de Lewy, síndrome de Wernicke-Korsakoff, alcoolismo crônico, doença de Creutzfeldt-Jakob, panencefalite esclerosante subaguda, doença de Hallerrorden-Spatz, demência pugilística, lesão neurotraumática (por exemplo, lesão da medula espinhal, lesão cerebral, concussão, concussão repetitiva), dor, dor de origem inflamatória, autismo, depressão, acidente vascular cerebral, transtornos cognitivos, epilepsia e similares. Tal método pode opcionalmente compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo TNF variante ou porção especificada de uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente precisando de tal modulação, tratamento ou terapia. Consulte, por exemplo, o Merck Manual, 16a Edição, Merck & Company, Rahway, NJ, EUA (1992).

[000125] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma ferida, um trauma ou uma lesão tecidual ou problema crônico relacionado, em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um dentre: lesão física ou trauma associado a cirurgia bucal, inclusive cirurgia periodontal, extração de dentes, tratamento endodôntico, inserção de implantes dentários, aplicação e uso de próteses dentárias, ou em que a ferida é selecionada do grupo consistindo em feridas assépticas, feridas por contusão, feridas por incisão, feridas por laceração, feridas não-penetrantes, feridas abertas, feridas penetrantes, feridas por perfuração, feridas por punção, feridas sépticas, infartos e feridas subcutâneas, ou em que a ferida é selecionada do grupo consistindo em úlceras isquêmicas, úlceras por pressão, fístulas, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas de sítio doador, ou em que a ferida é uma lesão aftosa, uma ferida traumática ou uma lesão associada a herpes.

[000126] As feridas e/ou úlceras são normalmente encontradas projetando-se a partir da pele ou sobre uma superfície mucosa, ou como resultado de um infarto em um órgão ("acidente vascular"). Uma ferida pode ser o resultado de um defeito nos tecidos moles, de uma lesão ou de uma condição subjacente. No presente contexto, o termo "pele" refere-se a superfície mais externa do corpo de um animal, inclusive de um ser humano, e abrange a pele intacta ou quase intacta bem como uma superfície de pele que esteja ferida. O termo "mucosa" refere-se à mucosa intacta ou danificada de um animal, como um ser humano, e pode ser a mucosa oral, bucal, aural, nasal, pulmonar, ocular, gastrointestinal, vaginal ou retal.

[000127] No presente contexto, o termo "ferida" denota uma lesão corporal com perturbação da integridade normal das estruturas teciduais. O termo também se destina a abranger os termos "chaga", "lesão", "necrose" e "úlcera". Normalmente, o termo "ferida"é um termo popular para quase qualquer lesão da pele ou das membranas mucosas, enquanto o termo "úlcera" é um defeito local, ou uma escavação, da superfície de um órgão ou tecido, a qual é produzida pela eliminação de tecido necrótico. O termo "lesão"refere-se de modo geral a qualquer defeito tecidual. A necrose está relacionada a tecidos mortos resultantes de infecção, lesão, inflamação ou infartos.

[000128] O termo "ferida", usado no presente contexto, denota qualquer ferida (consulte abaixo para uma classificação de feridas) e em qualquer estágio específico no processo de cicatrização, inclusive o estágio antes que qualquer cicatrização tenha se iniciado, ou mesmo antes de uma ferida específica, como uma incisão cirúrgica, ter sido feita (tratamento profilático). Exemplos de feridas que podem ser prevenidas e/ou tratadas de acordo com a presente invenção são, por exemplo, feridas assépticas, feridas por contusão, feridas por incisão, feridas por laceração, feridas não-penetrante (isto é, feridas em que não há perturbação da pele, porém há lesão a estruturas subjacentes), feridas abertas, feridas penetrantes, feridas perfurantes, feridas por punção, feridas sépticas, feridas subcutâneas, etc. Os exemplos de úlceras de decúbito, úlceras bucais, úlceras por cromo, aftas, úlceras de pressão, etc. Os exemplos de úlceras são, por exemplo, úlcera péptica, úlcera duodenal, úlcera gástrica, úlcera gotosa, úlcera diabética, úlcera isquêmica de hipertensão, úlcera de estase, ulcus cruris(úlcera venosa), úlcera sublingual, úlcera submucosa, úlcera sintomática, úlcera trófica, úlcera tropical e úlcera venérea, por exemplo, causada por gonorreia (inclusive uretrite, endocervicite e proctite). As condições relacionadas a ferimentos ou úlceras que podem ser corretamente tratadas de acordo com a presente invenção são queimaduras, antraz, tétano, gangrena gasosa, escarlatina, erisipela, sicose da barba, foliculite, impetigo contagioso ou impetigo bolhoso, etc. Frequentemente há uma certa sobreposição entre o uso dos termos "ferida" e "úlcera", e dos termos "ferida" e "lesão"sendo que, além disso, os termos são frequentemente usados de maneira aleatória. Consequentemente, conforme mencionado acima, no presente contexto o termo "ferida" abrange os termos "úlcera", "lesão", "chaga" e "infarto", sendo esses termos indiscriminadamente usados, exceto onde indicado em contrário.

[000129] Os tipos de feridas que a serem tratados de acordo com a invenção incluem também (i) feridas em geral, como feridas cirúrgicas, traumáticas, infecciosas, isquêmicas, térmicas, químicas e bolhosas, (ii) feridas específica da cavidade bucal, como feridas pós-extração, feridas endodônticas especialmente em conexão com tratamento de cistos e abscessos, úlceras e lesões de origem bacteriana, viral ou autoimune, feridas mecânicas, químicas, térmicas, infecciosas e liquenoides, sendo que úlceras herpéticas, estomatite aftosa, gengivite ulcerativa necrosante aguda e síndrome da boca ardente são exemplos específicos, e (iii) feridas sobre a pele, como neoplasma, queimaduras (por exemplo química ou térmica), lesões (bacteriana, viral, autoimune), mordidas e incisões cirúrgicas. Um outro modo para classiicação de feridas é: (i) pequena perda de tecido devido a incisões cirúrgicas, abrasões mínimas e mordidas menores, ou (ii) perda significativa de tecido. Esse último grupo inclui úlceras isquêmicas, úlceras por pressão, fístulas, lacerações, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas de sítio doador (em tecidos moles e duros), bem como infartos.

[000130] Outras feridas que têm importância em conexão com a presente invenção são feridas como úlceras isquêmicas, úlceras por pressão, fístulas, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas de sítio doador. As úlceras isquêmicas e as úlceras por pressão são feridas que normalmente só se curam muito lentamente e, especialmente nesses casos, um processo de cicatrização aprimorado e mais rápido é claramente de grande importância para o paciente. Além disso, os custos envolvidos no tratamento de pacientes sofrendo dessas feridas são marcadamente reduzidos quando a cicatrização é otimizada e ocorre mais rapidamente.

[000131] As feridas de sítio doador são aquelas que, por exemplo, ocorrem em conexão com a remoção de tecidos duros de uma parte do corpo para outra, por exemplo em conexão com transplantes. As feridas resultantes dessas operações são muito dolorosas e uma cicatrização otimizada é, portanto, extremamente valiosa. O termo "pele"é usado em um sentido muito amplo, abrangendo a camada epidérmica da pele e — nos casos em que a superfície da pele está mais ou menos ferida — também a camada dérmica da pele. Além da estrato córneo, a camada epidérmica da pele é a camada externa (epitelial), e a camada do tecido conjuntivo da pele é denominada derme.

[000132] Qualquer método da presente invenção pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um arcabouço de proteína a uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente precisando de tal modulação, tratamento ou terapia. Esse método pode, opcionalmente, compreender ainda a co-administração ou a terapia de combinação para tratamento dessas doenças ou desses transtornos, sendo que a administração do dito pelo menos um arcabouço de proteína, ou da porção ou variante específica do mesmo, compreende adicionalmente a administração, anterior, simultânea e/ou posterior de pelo menos um selecionado dentre pelo menos one antagonista de TNF (por exemplo, mas não se limitando a, um antagonista químico ou proteico de TNF, um anticorpo monoclonal ou policlonal para TNF ou um fragmento do mesmo, um receptor para TNF solúvel (por exemplo, p55, p70 ou p85) ou um fragmento do mesmo, polipeptídeos de fusão do mesmo, ou um antagonista de TNF de molécula pequena, por exemplo uma proteína I ou II de ligação a TNF (TBP-1 ou TBP-II), nerelimomab, infliximab, etanercepte (Enbrel™), adalimumabe (Humira™), CDP-571, CDP-870, afelimomab, lenercepte e similares), um antirreumático (por exemplo, metotrexato, auranofino, aurotioglicose, azatioprina, tiomalato sódico de ouro, sulfato de hidróxi cloroquina, leflunomida, sulfassalazina), um relaxante muscular, um narcótico, um medicamento anti-inflamatório não-esteroidal (AINE), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um microbicida (por exemplo, um aminoglicosídeo, um antifúngico, um antiparasítico, um antiviral, uma carbapenema, uma cefalosporina, uma fluoroquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, ou outro microbicida), um antipsoriático, um corticosteroide, um esteroide anabólico, um agente relacionado a diabetes, um mineral, um nutricional, um agente de tiroide, uma vitamina, um hormônio relacionado a cálcio, um antidiarreico, um antitussivo, um antiemético, um antiúlcera, um laxativo, um anticoagulante, uma eritropoietina (por exemplo, epoetina alfa), um filgrastim (por exemplo, G-CSF, Neupogen), um sargramostim (GM-CSF, Leukine), uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor (por exemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumabe), um hormônio do crescimento, um fármaco para reposição hormonal, um modulador do receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente alquilante, um antimetabólito, um inibidor mitótico, um radiofarmacêutico, um antidepressivo, um agente antimaníaco, um antipsicótico, um ansiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, um fármaco para asma, um beta agonista, um esteroide inalável, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo da mesma, uma dornase alfa (Pulmozyme), uma citoquina ou um antagonista de citoquina. Dosagens adequadas são bem conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Wells et al., Editores, Pharmacotherapy Handbook, 2a Edição, Appleton and Lange, Stamford, CT, EUA (2000), PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Edição de luxo, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA, EUA (2000), Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21a Edição, Springhouse Corp., Springhouse, PA, EUA, 2001, Health Professional’s Drug Guide 2001, Editor, Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ, EUA, cada uma das quais está aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade.

[000133] As citoquinas incluem qualquer citoquina conhecida. Consulte, por exemplo, CopewithCytokines.com. Os antagonistas de citoquina incluem, mas não se limitam a, qualquer anticorpo, fragmento ou mimético do arcabouço de proteína, qualquer receptor solúvel, fragmento ou mimético, qualquer antagonista de molécula pequena, ou qualquer combinação dos mesmos.

[000134] Tipicamente, o tratamento de condições patológicas é realizado mediante a administração de uma quantidade ou dosagem eficaz de pelo menos uma composição de arcabouço de proteína que resulte em um total, em média, na faixa de ao menos cerca de 0,01 a 500 miligramas de ao menos um arcabouço de proteína por quilograma de paciente por dose e, de preferência, de pelo menos cerca de 0,1 a 100 miligramas de arcabouço de proteína/quilograma de paciente para administração simples ou múltipla, dependendo da atividade específica do agente ativo contido na composição. Alternativamente, a concentração sérica pode compreender de 0,1 a 5.000 μg/ml de concentração sérica por administração simples ou múltipla. As dosagens adequadas são conhecidas por profissionais da área médica e irão, certamente, depender do estado particular da doença, atividade específica da composição administrada e do paciente particular sendo submetido ao tratamento. Em alguns casos, para alcançar a quantidade terapêutica desejada, pode ser necessário fornecer administrações repetidas, isto é, administrações individuais repetidas de uma dosagem particular medida ou monitorada, onde as administrações individuais são repetidas até que a dose diária desejada ou efeito seja alcançado.

[000135] As doses preferenciais podem, opcionalmente, incluir de cerca de 0,1 a 99 e/ou de 100 a 500 mg/kg/administração, ou qualquer faixa, valor ou fração das mesmas, ou até se obter uma concentração sérica de cerca de 0,1 a 5.000 μg/ml por administração única ou múltipla, ou qualquer faixa, valor ou fração da mesma. Uma faixa de dosagem preferencial para o arcabouço de proteína da presente invenção é de cerca de 1 mg/kg, até cerca de 3, cerca de 6 ou cerca de 12 mg/kg de peso corporal do paciente.

[000136] Alternativamente, a dosagem administrada pode variar dependendo de fatores conhecidos, como as características farmaco- dinâmicas do agente específico, e do modo e via de administração do mesmo, idade, saúde e peso do recipiente, natureza e extensão dos sintomas, tipo de tratamento concomitante, frequência do tratamento e efeito desejado. Normalmente, uma dosagem do ingrediente ativo pode ser de cerca de 0,1 a 100 miligramas por quilograma de peso corporal. Usualmente, 0,1 a 50 e, de preferência, 0,1 a 10 miligramas por quilograma por administração ou em forma de liberação sustentada é eficaz para obter os resultados desejados.

[000137] Como um exemplo não-limitador, o tratamento de seres humanos ou animais pode ser oferecido como uma dosagem única ou periódica de pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção, de cerca de 0,1 a 100 mg/kg ou qualquer faixa, valor ou fração dos mesmos por dia, em pelo menos um dentre os dias de 1 a 40 ou, alternativa ou adicionalmente, pelo menos uma dentre uma semana de 1 a 52 ou, alternativa ou adicionalmente, pelo menos um dentre 1 a 20 anos, ou qualquer combinação dos mesmos, com o uso de doses únicas, por infusão ou repetidas.

[000138] As formas de dosagem (composição) adequadas para administração interna, em geral, contêm de cerca de 0,001 miligrama a cerca de 500 miligramas de ingrediente ativo por unidade ou recipiente. Nessas composições farmacêuticas, o ingrediente ativo estará usualmente presente em uma quantidade de cerca de 0,5 a 99,999%, em peso, com base no peso total da composição.

[000139] Para a administração parenteral, o arcabouço de proteína pode ser formulado como uma solução, uma suspensão, uma emulsão, uma partícula, um pó ou um pó liofilizado em associação, ou fornecido separadamente, com um veículo parenteral farmaceutica- mente aceitável. Os exemplos desses veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e de 1 a 10% de albumina de soro humano. Os lipossomas e veículos não-aquosos, como óleos fixos, também podem ser usados. O veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantém a isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conservantes). A formulação é esterilizada através de técnicas conhecidas ou adequadas.

[000140] Veículos farmacêuticos adequados são descritos na edição mais recente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto de referência padrão nesse campo.

Administração Alternativa

[000141] Muitos modos desenvolvidos e conhecidos podem ser usados de acordo com a presente invenção para administrar quantidades farmaceuticamente eficazes de pelo menos um arcabouço de proteína de acordo com a presente invenção. Enquanto a administração pulmonar é usada na descrição seguinte, outros modos de administração podem ser usados de acordo com a presente invenção, com resultados adequados. Os arcabouços de proteína da presente invenção podem ser aplicados em um carreador, sob a forma de uma solução, uma emulsão, um coloide ou uma suspensão, ou sob a forma de um pó seco, com o uso de qualquer dentre uma variedade de dispositivos e métodos adequados para a administração por inalação ou outros modos descritos neste documento ou conhecidos na técnica.

Administração e Formulações Parenterais

[000142] As formulações para a administração parenteral podem conter como excipientes comuns água estéril ou solução salina, glicóis polialquilenos como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e similares. As suspensões aquosas ou oleosas para injeção podem ser preparadas pelo uso de um umidificador ou emulsificante adequados e de um agente de suspensão, de acordo com métodos conhecidos. Os agentes para injeção podem ser um agente diluente não-tóxico e não-administrável por via oral, como uma solução aquosa, uma solução injetável estéril ou uma suspensão em um solvente. Como veículo ou solvente útil, são permitidos água, solução de Ringer e solução salina isotônica, entre outros, e como solvente comum ou solvente para suspensão, pode ser usado um óleo estéril não-volátil. Para esses propósitos, qualquer tipo de óleo não-volátil e ácido graxo podem ser usados, incluindo ácidos graxos ou óleos graxos naturais, sintéticos ou semissintéticos, tri, di ou monoglicerídeo natural, sintético ou semissintético. A administração parenteral é conhecida na técnica e inclui, mas não se limita a, meios convencionais de injeção, um dispositivo de injeção a gás pressurizado e sem agulha conforme descrito na patente U.S. n° 5.851.198, e um dispositivo perfurador a laser conforme descrito na patente U.S. n° 5.839.446, aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade.

Aplicação Alternativa

[000143] A invenção refere-se, adicionalmente, à administração de pelo menos um arcabouço de proteína por meio parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitário, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra- hepático, intramiocárdico, intra-ósseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratoráxico, intraute- rino, intravesical, intralesional, bólus, vaginal, retal, bucal, subligual, intranasal ou transdérmico. A pelo menos uma composição de arcabouço de proteína pode ser preparada para uso parenteral (subcutâneo, intramuscular ou intravenoso) ou qualquer outra administração, particularmente sob a forma de soluções líquidas ou suspensões; para o uso vaginal ou retal, a administração é particularmente em formas semisólidas, por exemplo, mas não se limitando a, cremes e supositórios; para a administração bucal ou sublingual é, por exemplo, mas não se limitando a, em forma de comprimidos ou cápsulas; a forma intranasal é, por exemplo, mas não se limitando a, em forma de pó, gotas nasais, aerossóis ou certos agentes; a forma transdérmica é, mas não se limitando a, um gel, pomada, loção, suspensão ou sistema de aplicação por adesivo com intensificadores químicos como sulfóxido de dimetila, tanto para modificar a estrutura da pele quanto para aumentar a concentração do fármaco no adesivo transdérmico (Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S., Eds., p. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York, E.U.A, 1994, inteiramente incorporado aqui, a título de referência), ou com agentes oxidantes que permitem o pedido de formulações que contenham proteínas e peptídeos sobre a pele (WO 98/53847), ou aplicação de campos elétricos para a criação de vias de transporte temporárias, como eletroporação, ou para aumentar a mobilidade de fármacos carregados através da pele, como iontoforese ou aplicação de ultrassom, como sonoforese (Patentes U.S. 4.309.989 e 4.767.402) (as publicações e patentes acima sendo inteiramente incorporadas aqui, a título de referência).

Administração Pulmonar/Nasal

[000144] Para a administração pulmonar, de preferência, pelo menos uma composição de arcabouço de proteína é aplicada em um tamanho de partícula eficaz para atingir as vias aéreas inferiores dos pulmões ou os sinus. De acordo com a presente invenção, pelo menos um arcabouço de proteína pode ser aplicado por meio de qualquer dentre uma variedade dispositivos de inalação ou nasais conhecidos na técnica para a administração de um agente terapêutico por inalação. Esses dispositivos capazes de depositar formulações aerossolizadas na cavidade dos seios paranasais ou alvéolos de um paciente incluem dosagem medida de inaladores, nebulizadores, pó seco geradores, aspersores e similares. Também são conhecidos na técnica outros dispositivos adequados para dirigir a administração pulmonar ou nasal de arcabouços de proteína. Todos esses dispositivos podem usar formulações adequadas à administração e liberação de arcabouço de proteína em um aerossol. Tais aerossóis podem consistir em qualquer uma das soluções (aquosa e não-aquosa) ou partículas sólidas.

[000145] Os inaladores de dosagem medida, como o Ventolin®, tipicamente usam um gás propelente e requerem acionamento durante a inspiração (Consulte, por exemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Os inaladores de pó seco, como Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), o inalador Spiros™ (Dura), os dispositivos comercializados pela Inhale Therapeutics, e o inalador de pó Spinhaler® (Fisons), usam acionamento pela respiração de um pó misturado (U.S. 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086Glaxo, WO 94/08552 Dura, U.S. 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade). Os nebulizadores como AERx™ (Aradigm), Ultravent® (Mallinckrodt), e Acorn II® (Marquest Medical Products) (U.S. 5404871 Aradigm, WO 97/22376, estando as referências acima aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade), produzem aerossóis a partir de soluções, enquanto os inaladores de dosagem medida e os inaladores de pó seco, entre outros, geram pequenos aerossóis de partículas. Esses exemplos específicos de dispositivos de inalação comercialmentedisponíveis se destinam a representar os dispositivos específicos adequados à prática desta invenção, e não a limitar o escopo da mesma.

[000146] De preferência, uma composição compreendendo pelo menos um arcabouço de proteína é liberada por um inalador de pó seco ou um aspersor. Há várias caracteristicas desejáveis em um dispositivo de inalação para administração de pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção. Por exemplo, a liberação por um dispositivo de inalação é vantajosamente confiável, reprodu-zívele precisa. O dispositivo para inalação pode, opcionalmente, fornecer pequenas partículas secas, por exemplo, menor que cerca de 10 μm, de preferência cerca de 1 a 5 μm, para oferecer uma boa respirabilidade.

Administração de composições de arcabouço de proteína sob a forma de aspersão

[000147] Uma aspersão que inclui a composição de arcabouço de proteína pode ser produzida forçando-se uma suspensão ou solução 'contendo pelo menos um arcabouço de proteína a passar através de um bocal, sob pressão. O tamanho e a configuração do bocal, a pressão aplicada e a taxa de alimentação do líquido podem ser escolhidos de modo que se obtenha a saída e o tamanho de partícula desejados. Uma aspersão elétrica pode ser produzida, por exemplo, por um campo elétrico em conexão com um dispositivo para alimentação de um capilar ou bocal. Vantajosamente, as partículas de pelo menos uma composição de arcabouço de proteína liberadas por um aspersor têm um tamanho menor que cerca de 10 μm, de preferência na faixa de cerca de 1 μm a cerca de 5 μm e, com a máxima preferência, de cerca de 2 μm a cerca de 3 μm.

[000148] As formulações de pelo menos uma composição de arcabouço de proteína, adequada ao uso com um aspersor, tipicamente incluem a composição de arcabouço de proteína em uma solução aquosa a uma concentração de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg da pelo menos uma composição de arcabouço de proteína por ml de solução, ou mg/g, ou qualquer faixa, valor ou fração da mesma. A formulação pode incluir agentes, como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo e, de preferência, zinco. A formulação pode, também, incluir um excipiente ou agente para estabilização da composição de arcabouço de proteína, como um tampão, um agente redutor, uma proteína bruta, ou um carboidrato. As proteínas brutas úteis na formulação de composições de arcabouço de proteína incluem albumina, protamina ou similares. Os carboidratos típicos úteis para a formulação de composições de arcabouço de proteína incluem sacarose, manitol, lactose, trealose, glicose ou similares. A formulação da composição de arcabouço de proteína pode, também, incluir um tensoativo que pode reduzir ou impedir a agregação, induzida pela superfície, da composição de arcabouço de proteína causada pela atomização da solução na formação de um aerossol. Podem ser usados vários tensoativos convencionais, como ésteres de ácido graxo e alcoóis de polióxi etileno, e ésteres de ácido graxo de polióxi etileno sorbitol. As quantidades estarão, geralmente, na faixa entre 0,001 e 14%, em peso da formulação. Os tensoativos especialmente preferenciais para os propósitos desta invenção são o monooleato de polióxi etileno sorbitano, o polissorbato 80, o polissorbato 20 ou similares. Os agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína, como arcabouços de proteína, ou porções ou variantes específicas dos mesmos, também podem estar incluídos na formulação.

Administração de composições de arcabouço de proteína por meio de nebulizador

[000149] As composições de arcabouço de proteína da presente invenção podem ser administradas por um nebulizador, como nebulizador de jato ou um nebulizador ultra-sônico. Tipicamente, em um nebulizador de jato, uma fonte de ar comprimido é usada para criar um jato de ar em alta velocidade através de um orifício. Conforme o gás se expande para além do bocal, é criada uma região de baixa pressão que arrasta uma solução de composição de arcabouço de proteína através um tubo capilar conectado a um reservatório de líquido. A corrente de líquido proveniente do tubo capilar é dividida em gotículas e filamentos instáveis conforme sai do tubo, criando um aerossol. Uma variedade de configurações, taxas de fluxo e tipos de defletor pode ser usada para se obter, de um determinado nebulizador de jato, as características de desempenho desejadas. Em um nebulizador ultrassônico, energia elétrica em alta frequência é usada para criar energia mecânica vibracional, tipicamente empregando um transdutor piezelétrico. Essa energia é transmitida à formulação da composição de arcabouço de proteína, seja diretamente ou por meio de um fluido de acoplamento, criando um aerossol que inclui a composição de arcabouço de proteína. Vantajosamente, as partículas da composição de arcabouço de proteína liberadas por um nebulizador têm um tamanho menor que cerca de 10 μm, de preferência na faixa de cerca de 1 μm a cerca de 5 μm e, com a máxima preferência, de cerca de 2 μm a cerca de 3 μm.

[000150] As formulações de pelo menos um arcabouço de proteína adequadas ao uso com um nebulizador, seja este de jato ou ultra- sônico, tipicamente incluem uma concentração de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg de pelo menos um arcabouço de proteína por ml de solução. A formulação pode incluir agentes, como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo e, de preferência, zinco. A formulação pode, também, incluir um excipiente ou agente para estabilização da pelo menos uma composição de arcabouço de proteína, como um tampão, um agente redutor, uma proteína bruta ou um carboidrato. As proteínas brutas úteis na pelo menos uma formulação de composições de arcabouço de proteína incluem albumina, protamina ou similares. Os carboidratos típicos úteis para a formulação de pelo menos um arcabouço de proteína incluem sacarose, manitol, lactose, trealose, glicose ou similares. A formulação de pelo menos um arcabouço de proteína pode, também, incluir um tensoativo que pode reduzir ou impedir a agregação, induzida pela superfície, do pelo menos um arcabouço de proteína causada pela atomização da solução na formação de um aerossol. Podem ser usados vários tensoativos convencionais, como ésteres de ácido graxo e alcoóis de polióxi etileno, e ésteres de ácido graxo de polióxi etileno sorbital. As quantidades estarão, geralmente, na faixa entre cerca de 0,001 e 4%, em peso da formulação. Os tensoativos especialmente preferenciais para os propósitos desta invenção são o monooleato de polióxi etileno sorbitano, o polissorbato 80, o polissorbato 20 ou similares. Os agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína, como um arcabouço de proteína, podem também estar incluídos na formulação.

Administração de composições de arcabouço de proteínapor meio de um inalador de dosagem medida

[000151] Em um inalador de dosagem medida (IDM), um propelente, pelo menos um arcabouço de proteína, e quaisquer excipientes ou outros aditivos estão contidos em um tubo sob a forma de uma mistura que inclui um gás comprimido liquefeito. O acionamento da válvula de medição libera a mistura sob a forma de um aerossol, de preferência contendo partículas em uma faixa de tamanho menor que cerca de 10 μm, de preferência de cerca de 1 μm a cerca de 5 μm e, com a máxima preferência, de cerca de 2 μm a cerca de 3 μm. O tamanho de partícula de aerossol desejável pode ser obtido mediante o uso de uma formulação da composição de arcabouço de proteína produzida por vários métodos conhecidos pelos versados na técnica, incluindo moagem por jato, secagem por atomização, condensação no ponto crítico ou similares. Os Inaladores de dosagem medida preferenciais incluem aqueles produzidos pela 3M ou Glaxo e que empregam um propelente de hidrofluorocarbono. As formulações de pelo menos um arcabouço de proteína para uso com um dispositivo inalador de dosagem medida incluirão, de modo geral, um pó finamente dividido contendo pelo menos um arcabouço de proteína sob a forma de uma suspensão em um meio não-aquoso, por exemplo, suspenso em um propelente com o auxílio de um tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional empregado para este propósito, como clorofluorocarbono, um hidroclorofluorocarbono, um hidrofluorocarbono ou um hidrocarboneto, que inclui triclorofluorometano, diclorodifluoro- metano, diclorotetrafluoroetanol e 1,1,1,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluoroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluoroalcano-227) ou similares. De preferência, o propelente é um hidrofluorocarboneto. O tensoativo pode ser escolhido para estabilizar pelo menos um arcabouço de proteína sob a forma de uma suspensão no propelente, para proteger o agente ativo contra degradação química e similares. Os tensoativos adequados incluem trioleato de sorbitano, lecitina de soja, ácido oleico ou similares. Em alguns casos, os aerossóis de solução que usam solventes como o etanol são preferenciais. Os agentes adicionais conhecidos na técnica para a formulação de uma proteína também podem estar incluídos na formulação. O versado na técnica reconhecerá que os métodos da presente invenção podem ser realizados mediante a administração pulmonar de pelo menos uma composição de arcabouço de proteína por meio de dispositivos que não estão aqui descritos.

Administração e Formulações para Uso Oral

[000152] As formulações para administração oral dependem da co- administração de adjuvantes (por exemplo, resorcinóis e tensoativos não-iônicos, como éter oleílico de polióxi etileno e éter n-hexadecil polietileno) para aumentar artificialmente a permeabilidade das paredes intestinais, bem como da co-administração de inibidores enzimáticos (por exemplo, inibidores de tripsina pancreática, fluorofos- fato de diisopropila (DFF) e trasilol) para inibir a degradação enzimática. As formulações para aplicação de agentes hidrofílicos que incluem proteínas e arcabouços de proteína, bem como uma combinação de pelo menos dois tensoativos destinados à administração oral, bucal, mucosal, nasal, pulmonar, vaginal, transmembrana ou retal, são apresentadas em U.S. n° 6.309.663. O composto constituinte ativo da forma de dosagem do tipo sólido, para administração oral, podem ser misturada com pelo menos um aditivo, inclusive sacarose, lactose, celulose, manitol, trealose, rafinose, maltitol, dextrano, amidos, ágar, arginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma tragacanta, goma arábica, gelatina, colágeno, caseína, albumina, polímero sintético ou semissintético, e glicerídeo. Essas formas de dosagem podem, também, conter outros tipo de aditivos, por exemplo, agente de diluição inativo, lubrificantes como estearato de magnésio, parabeno, agente conservante como ácido sórbico, ácido ascórbico,.alfa.-tocoferol, antioxidantes como cisteína, desintegrador, ligante, espessante, agente tampão, agente adoçante, agente flavorizante, agente perfumante, etc.

[000153] Comprimidos e pílulas podem ser adicionalmente processados em preparações com revestimento entérico. As preparações líquidas para administração oral incluem emulsão, xarope, elixir, suspensão e preparações de soluções permitidas para o uso médico. Essas preparações podem conter agentes diluentes inativos usados usualmente no dito campo, por exemplo, água. Os lipossomas também foram descritos como sistemas de aplicação de medicamentos para insulina e heparina (patente U.S. n° 4.239.754). Mais recentemente, as microesferas de polímeros artificiais de aminoácidos misturados (proteinoides) foram usadas para liberar fármacos (patente U.S. n°. 4.925.673). Adicionalmente, os compostos de veículo descritos na patente U.S. n° 5.879.681 e na patente U.S. n° 5.871.753, e usados para aplicação via oral de agentes biologicamente ativos, são conhecidos na técnica.

Administração e Formulações Mucosais

[000154] Uma formulação para administração oral de um agente bioativo encapsulado em um ou mais excipientes à base de polímeros ou copolímeros biocompatíveis, de preferência um polímero ou copolímero biodegradável, forma microcápsulas que, devido ao tamanho adequado das mesmas, resultam no fato de o agente alcançar os nódulos linfáticos agregados, também conhecidos como "placa de Peyer" ou "GALT" do animal, e ser absorvido pelos mesmos, sem perda de eficácia devida à passagem do agente através do trato gastrointestinal. Nódulos linfáticos agregados similares podem ser encontrados nos tubos bronquiais (BALT) e no intestino grosso. Os tecidos descritos acima são, em geral, chamados de tecidos linforreticulares associados a mucosa (MALT). Para absorção através de superfícies mucosas, as composições e os métodos deadministração de pelo menos um arcabouço de proteína incluem uma emulsão compreendendo uma pluralidade de partículas, umamacromolécula mucoadesiva, um peptídeo bioativo e uma fase aquosa contínua que promove a absorção através das superfícies mucosas ao obter a mucoadesão das partículas da emulsão (patente U.S. n° 5.514.670). As superfícies mucosas adequadas para a aplicação das emulsões da presente invenção podem incluir vias de administração corneana, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal e retal. As formulações para a administração vaginal ou retal, por exemplo em supositórios, podem conter excipientes, por exemplo polialquileno glicóis, vaselina, manteiga de cacau e similares. As formulações para a administração intranasal podem ser sólidas e conter como excipientes, por exemplo, lactose, ou pode ser uma solução aquosa ou oleosa de gotas nasais. Para a administração bucal, os excipientes incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pré-gelatinizado e similares (Patente U.S. n° 5.849.695).

Administração e Formulações Transdérmicas

[000155] Para administração transdérmica, o pelo menos um arcabouço de proteína é encapsulado em um dispositivo de aplicação, como um lipossoma ou nanopartículas, micropartículas, microcápsulas ou microesferas poliméricas (aqui chamadas, coletivamente, de micropartículas, exceto onde especificado em contrário). Inúmeros dispositivos adequados são conhecidos, incluindo micropartículas produzidas a partir de polímeros sintéticos como poli-hidróxi, ácidos como ácido polilático, ácido poliglicólico e copolímeros do mesmo, poliortoésteres, polianidridos e polifosfazeno, e polímeros naturais como colágeno, ácidos poliaminos, albumina e outras proteínas, alginato e outros polissacarídeos e combinações dos mesmos (Patente U.S. n° 5.814.599).

Formulações e Administração Prolongada

[000156] Pode ser desejável a liberação dos compostos da presente invenção ao indivíduo ao longo de períodos de tempo prolongados, por exemplo durante períodos de uma semana a um ano, a partir de uma única administração. Várias formas de dosagem de liberação lenta, depósito ou implante podem ser utilizadas. Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal não-tóxico farmaceuticamente aceitável dos compostos, com um baixo grau de solubilidade em fluidos corpóreos, por exemplo (a) um sal de adição de ácido com um ácido polibásico, como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tânico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglu- tâmico, ácidos naftaleno mono ou dissulfônicos, ácido poligalacturôni- co e similares, (b) um sal com um cátion de metal polivalente, como zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio e similares, ou com um cátion orgânico formado a partir de, por exemplo, N,N'-dibenzil-etileno diamina ou etileno diamina, ou (c) combinações de (a) e (b), por exemplo um sal de tanato de zinco. Adicionalmente, os compostos da presente invenção ou, de preferência, um sal relativamente insolúvel como aqueles descritos acima, podem ser formulados em um gel, por exemplo um gel de monoestearato de alumínio com, por exemplo, óleo de gergelim, adequado para injeção. Os sais particularmente preferenciais são os sais de zinco, sais de tanato de zinco, sais de pamoato e similares. Um outro tipo de formulação de depósito com liberação lenta para injeção poderia conter o composto ou sal disperso para encapsulação em um polímero não-antigênico e não-tóxico de degradação lenta, como um polímero de ácido polilático/ácido poliglicólico, por exemplo conforme descrito na patente U.S. n° 3.773.919. Os compostos ou, de preferência, os sais relativamente insolúveis, como aqueles descritos acima, também podem ser formulados em péletes silasticos de matriz de colesterol, particularmente para uso em animais. As formulações de implante ou depósito de liberação lenta adicionais, por exemplo, lipossomas gás ou líquido, são conhecidas na literatura (Patente U.S. n° 5.770.222 e "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., EUA, 1978).

[000157] Tendo descrito a invenção em geral, a mesma será entendida mais prontamente por referência aos exemplos a seguir, que são fornecidos por meio de ilustração e não são propositados como limitadores.

Exemplos Exemplo 1 - Design do Fibcon

[000158] O 10° domínio FN3 da fibronectina humana (SEQ ID n°: 10) foi explorado como um arcabouço alternativo capaz de ser manipulado para se ligar a moléculas-alvo específicas através de laços expostos na superfície estruturalmente análogos a regiões determinantes de complementaridade do anticorpo (CDR), chamadas de laços B:C, D:E, e F:G (figura 1) (Koide, et al., J Mol Biol 284: 1141-51, 1998). Aproteína fibronectina contém 14 outros domínios FN3 dobrados independentemente, e prevê-se que todos estes adotem uma dobra similar ao 10a domínio FN3 com base na similaridade de sequência (SEQ ID n°: 1 a 9, 11 a 15). De fato, a conservação estrutural para vários destes domínios é confirmada por estruturas de alta resolução de domínios FN3 de fibronectina 1, 7, 8, 9, 10, 12, 13 e 14 (Vakonakis, et al., Embo J 26: 2575 a 2583, 2007; Leahy, et al., Cell 84: 155 a 164, 1996; Sharma, et al., Embo J 18: 1468-79, 1999). De modo a confirmar que todos os 15 domínios podem formar unidades dobradas independentemente, as sequências gênicas que codificam cada domínio foram obtidas por amplificação por PCR a partir de uma fonte de cDNA humano universal (Biochain Institute Inc. (Hayward, CA, EUA)) com o uso de métodos de PCR padrão, subclonadas em um vetor pET15 modificado (Novagen), transformadas em E. coli BL21Star(DE3) (Invitrogen) e plaqueadas sobre placas de ágar LB contendo 75 μg/ml de carbenicilina. Nucleotídeos que codificam uma etiqueta de poli-histidina 6X foram adicionados à extremidade C- terminal de cada gene durante a etapa da PCR. O domínio FN3 7 não pode ser clonado corretamente a partir desta fonte e, portanto, não foi incluído na análise apresentada aqui. Para cada construto, uma única colônia foi selecionada e cultivada de um dia para o outro a 37°C em 50 ml de meio TB contendo 2% de glicose e 100 μg/ml de carbenicilina. Essa cultura foi usada para semear 500 mL de meio de auto-indução (meio Overnight Express Instant TB, Novagen) em um frasco de 2,5 L Ultra Yield (Thomson Instrument Company). A proliferação e a expressão foram feitas usando-se um programa duplo (3 horas a 37°C, 300 rpm, seguido de 16 horas a 30°C, 250 rpm) em uma incubadora de agitação ATR Multitron.

[000159] A cultura foi coletada e centrifugada a 7.000 rpm durante 15 minutos em um rotor JL8,1 para formar péletes com as células. As células foram ressuspensas em 30 ml de tampão contendo 20 mM de fosfato sódico, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol, 20 mM de imidazol, 0,37 mg/mL de lisozima, 1X de inibidor Complete Protease (isento de EDTA, Roche) e Benzonase (Sigma-Aldrich, 0,25 μl/ml final), e lisadas com um sonicador Misonix XL2020 durante 5 minutos sobre gelo, em modo pulso (5 segundos ligado, 30 segundos desligado). O material insolúvel foi removido por centrifugação a 17.000 rpm durante 30 minutos em um rotor JA-17.

[000160] As proteínas FN3 foram purificadas a partir do lisado solúvel em um processo cromatográfico de 2 etapas. Primeiro, a proteína foi capturada por cromatografia de afinidade em metal imobilizado, adicionando 2 mL de microesferas de agarose Ni-NTA (Qiagen) ao lisado e colocando o mesmo em uma plataforma de agitação por 1 hora a 4°C. A resina foi, então, empacotada em uma coluna Poly-Prep (Bio-Rad) e lavada com 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol e 20 mM de imidazol para remover o material não ligado. As proteínas foram eluídas da resina com 20 mM de fosfato sódico, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol e 500 mM de imidazol. As frações foram analisadas por SDS- PAGE, tanto com coloração Coomassie como com Western blot, usando-se anticorpo HRP-conjugado anti-His (Immunology Consultants Laboratory). As frações desejadas foram agrupadas e dialisadas em PBS com pH 7,4. Como uma segunda etapa de purificação, a proteína foi carregada em uma coluna Superdex-75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare), equilibrada em PBS. As frações foram analisadas por SDS-PAGE, e aquelas contendo a proteína FN3 foram agrupadas e concentradas com o uso de um concentrador Centriprep UltraCel YM-3 (Amicon).

[000161] A concentração de proteína foi determinada usando-se um leitor de placas BioTek, para medir a absorbância da amostra a 280 nm. A preparação final foi analisada por coloração Coomassie, Western blot com anticorpo anti-His, e por HPLC-SEC usando-se uma coluna G3000SW-XL (TOSOH Biosciences) equilibrada em PBS. A análise de SDS-PAGE mostra que os domínios FN3 migram entre 6 e 14 kDa, de acordo com as massas previstas para as proteínas monoméricas.

[000162] O dobramento e estabilidade térmica de cada domínio FN3 foi caracterizado por calorimetria de varredura diferencial. Os dados de calorimetria de varredura diferencial foram obtidos mediante aquecimento de soluções a 1,0 mg/mL de cada domínio FN3 em PBS de 35°C a 95°C a uma velocidade de 1°C/minuto em um calorímetro N-DSCII (Applied Thermodynamics). Uma curva exclusiva do tampão foi subtraída para produzir os perfis mostrados nas figuras 2A-N. A partis destes dados, as temperaturas de fusão foram calculadas para cada domínio com o uso do programa CpCalc (Microcal), conforme mostrado na tabela 1. Estes dados demonstram que cada domínio é independentemente dobrado e que estes domínios exibem uma ampla gama de estabilidades térmicas.

[000163] Um alinhamento de múltiplas sequências de todos os 15 domínios FN3 de fibronectina foi produzido de modo a desenhar uma sequência de proteína consenso. A análise do alinhamento de múltiplas sequências na figura 3 mostra que embora estes 15 domínios se dobrem em estruturas similares, eles possuem identidades de sequência apenas modestas, na faixa de 27 a 48%. Uma primeira sequência consenso foi desenhada pela incorporação do aminoácido mais conservado em cada posição do alinhamento mostrado na figura 3. A primeira sequência consenso tem sequência 42 a 62% idêntica aos 15 domínios FN3 da fibronectina com uma identidade média de 45%. A sequência de aminoácido da primeira sequência consenso foi traduzida de volta e uma sequência de gene sintético que codifica esta proteína foi sintetizada pela técnica de "overlapping PCR" e subclonada em um vetor pET15 modificado para expressão. Para expressão, este vetor foi transformado em células hospedeiras de E. coli BL21-Gold(DE3) (Stratagene) e uma única colônia foi selecionada e colocada em 0,5 mL de meio 2YT contendo ampicilina. A expressão foi induzida pela adição de IPTG a uma concentração final de 1 mM quando a cultura atingiu uma O.D.600 de ~0,6. A expressão foi monitorada por SDS-PAGE após 5 horas de expressão a 30°C após a indução. A análise de SDS-PAGE não mostrou evidências de expressão desta proteína em E. coli.

[000164] Uma vez que o alinhamento de sequência apresentado na figura 3 mostra que há várias posições para as quais não é possível definir uma sequência consenso verdadeira, uma sequência consenso alternativa foi desenhada em uma tentativa de produzir uma proteína que pudesse ser expressa em E. coli. A segunda sequência consenso era idêntica à primeira em 79 de 89 posições, resultando em identidades de sequência na faixa de 37 a 63% (identidade média de 51%) aos 15 domínios FN3 da fibronectina. A sequência de aminoácido da segunda sequência consenso foi traduzida de volta e esta sequência gênica foi usada para produzir um vetor de expressão, conforme descrito para a primeira sequência consenso. Tal como com a primeira, a segunda sequência consenso não foi expressa a níveis detectáveis em E. coli.

[000165] Já que as duas primeiras sequências consenso desenhadas não foram expressas em E. coli, uma terceira abordagem foi seguida. Nesta abordagem, um alinhamento de sequência apenas dos domínios FN3 mais estáveis foi produzido de modo a maximizar o potencial de produzir uma proteína consenso estável. A tabela 1 mostra que os domínios 1, 2, 5, 8, 10, 12, 14, e 15 possuem temperaturas de fusão maiores que 70°C. Um alinhamento de múltiplas sequências dos domínios 1, 5, 8, 10, 12, 14, e 15 foi gerado de modo a desenhar uma sequência consenso (figura 4). O domínio 2 foi excluído deste alinhamento já que a análise estrutural mostrou que a fita N-terminal "A"é desordenada neste domínio (Vakonakis, et al., Embo J 26: 2575-83, 2007). O Fibcon (SEQ ID n°: 16) foi gerado mediante seleção do resíduo mais frequentemente usado em cada posição do alinhamento mostrado na figura 4. O Fibcon é 40 a 64% idêntico aos domínios individuais alinhados na figura 4.

[000166] A sequência de aminoácido do Fibcon foi traduzida de volta para produzir a sequência do gene mostrada na SEQ ID n°: 17 e subclonada em um vetor pET27 modificado (Novagen) por métodos de clonagem independentes de ligase. Este vetor foi transformado em células BL21-GOLD (DE3), que foram plaqueadas sobre placas de ágar LB suplementadas com 50 μg/mL de canamicina. Uma cultura de 10 mL de 2YT/Kan foi inoculada com 1 colônia desta placa e cultivada de um dia para o outro a 37°C. Esta cultura de um dia para o outro foi usada para semear uma cultura de 500 mL de 2YT suplementada com 50 μg/mL de canamicina, que foi cultivada a 37°C até alcançar uma O.D.600 ~ 0,6, e neste ponto IPTG foi adicionado a 1 mM e a temperatura foi reduzida para 30°C. As células foram coletadas por centrifugação a 4000 x g, 5 horas após a indução. O pélete de células resultante foi lisado pela adição de 5 mL de BugBuster (Novagen) e 1 μL de Benzonase (Novagen) por grama de pélete úmido, agitado à temperatura ambiente durante 30 minutos, e neste ponto o lisado foi clareado por centrifugação a 15.000 x g durante 30 minutos. O lisado clareado foi aplicado a uma coluna de 1 mL de Hitrap HP Ni-NTA (GE Healthcare), e lavado com 10 volumes de coluna de PBS pH 7,4, imidazol a 12,5 mM. O Fibcon foi eluído da coluna mediante a aplicação de um gradiente de imidazol de 12,5 mM a 250 mM durante 20 volumes de coluna. As frações foram analisadas por SDS-PAGE (figuras 5A e 5B), agrupadas, e concentradas antes de serem injetadas em uma coluna de filtração em gel superdex 75 16/60 (GE Healthcare) em PBS. A partir das figuras 5A e 5B, mostrou-se que o Fibcon é expresso completamente na fração solúvel de E. coli, é eficientemente purificado e está presente como uma única espécie monomérica.

[000167] O dobramento e a estabilidade térmica do fibcon foram avaliados por calorimetria de varredura diferencial e fluorescência de triptofano intrínseca. Os dados de calorimetria de varredura diferencial foram obtidos mediante aquecimento de uma solução a 1,0 mg/mL de fibcon em PBS de 30°C a 115°C a uma velocidade de 1°C/minuto em um calorímetro N-DSCII (Applied Thermodynamics). Uma curva exclusiva do tampão foi subtraída para produzir o perfil mostrado na figura 6. O perfil de fusão está em consonância com o domínio dobrado e mostra que o fibcon é uma proteína altamente estável com transições térmicas a 82°C e 105°C. A transição a 105°C é mais provavelmente causada pela agregação de fibcon a altas temperaturas já que esta transição é dependente da concentração.

[000168] O Fibcon contém apenas um resíduo de triptofano único previsto estar enterrado no núcleo hidrofóbico da proteína por análise estrutural dos outros domínios FN3. A fluorescência deste resíduo de triptofano foi usada para monitorar o dobramento de fibcon mediante o equilíbrio de uma solução de fibcon (10 μM) em soluções tamponadas de fosfato de sódio a 50 mM pH 7,0, NaCl a 150 mM e cloridrato de guanidina (Gu-HCl) em uma placa de 96 poços. A concentração de Gu-HCl foi alterada para cada poço da placa a partir de concentrações de 0 a 6,5 M em aumentos de 0,25 M. A fluorescência do triptofano foi monitorada por excitação a 280 nm e emissão a 360 nm com o uso de um leitor de placa SpectraMax M5 equipado com um monocromador (Molecular Devices). A figura 7 mostra que o fibcon está dobrada em concentrações de Gu-HCl abaixo de 4 M. A fluorescência deste resíduo de triptofano mediante titulação de guanidina confirma o dobramento e a estrutura do fibcon.

Vantagens

[000169] A proteína fibcon tem uma alta estabilidade térmica de 82°C. Com base nesta alta estabilidade, esta molécula de arcabouço é provavelmente suscetível a substituição de aminoácidos nos laços ou filamentos e é fácil de ser fabricada, o que a torna uma valiosa molécula de arcabouço alternativa. As mutações que diminuem a estabilidade da proteína tendem a ser melhor toleradas no contexto de um arcabouço mais estável e, portanto, um arcabouço com estabilidade otimizada está propenso a produzir ligantes mais funcionais e bem dobrados a partir de uma biblioteca de variantes de arcabouço. Como esta nova proteína não é uma proteína codificada pelo genoma humano, ela pode proporcionar também menos riscos relacionados à geração de uma resposta imunológica contra domínios de fibronectina humana nativos quando administrada a seres humanos para uso como uma molécula terapêutica ou ferramenta de diagnóstico em comparação a moléculas de arcabouço baseadas na sequência de domínios de fibronectina nativos, como o 10a domínio FN3.

Exemplo 2 - Geração de bibliotecas de Fibcon

[000170] As bibliotecas de variantes de Fibcon podem ser feitas com o uso de muitos métodos diferentes, dependendo da complexidade desejada e da localização relativa das mutações na molécula. Os métodos de síntese de DNA são preferenciais para criar as mutações espalhadas por todo o gene Fibcon. A clonagem da enzima de restrição também pode ser usada para recombinar os fragmentos de DNA contendo mutações em regiões diferentes do gene. Mutagênese por saturação uma pequena região definida, como um único laço de Fibcon, pode ser introduzida mediante o uso de um oligonucleotídeo degenerado e de uma mutagênese oligonucleotídeo-dirigida (Kunkel et al., 1987).

[000171] Foi construída uma biblioteca de fibcon projetada para substituir o laço FG por 7 a 12 aminoácidos aleatórios com o uso de mutagênese oligonucleotídeo-dirigida. Um oligonucleotídeo é sintetizado para incorporar o nucleotídeo degenerado NNS nas posições que codificam o laço FG e duas sequências de nucleotídeo flanqueadoras de 20 a 27 bp de complementaridade à sequência do gene fibcon. Nesse design, todos os vinte aminoácidos são capazes de representação no laço FG.

[000172] O molde para mutagênese dirigida por oligonucleotídeo é construído mediante a substituição da sequência codificante do laço F:G a por uma sequência haste-laço contendo um sítio de restrição de AscI. Esse sistema permite a eliminação do DNA de molde inicial após a mutagênese, mediante digestão do DNA resultante com AscI antes da transformação. Para purificar um molde de DNA de filamento único para a mutagênese, uma única colônia de E. coli CJ236 carregando o vetor, é selecionada e adicionada a 5 mL de meio de crescimento 2YT com carbenicilina (50 ug/ml de concentração final) e cloranfenicol (10 ug/ml). Após 6 horas, o fago auxiliar VCSM13 é adicionado até uma concentração final de 1010 UFP/ml, e incubado sem agitação durante 10 minutos, antes de ser transferido para 150 mL de 2YT com carbenicilina (10 ug/ml) e uridina (0,25 ug/ml) e incubado a 37°C sob agitação a 200 rpm, de um dia para o outro. As células são peletizadas por centrifugação, o sobrenadante foi coletado e o fago foi agrupado em peletes com PEG NaCl. O DNA de filamento único é purificado a partir desse pélete, usando-se um kit QIAprep Spin M13 (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

[000173] Para a anelar o oligonucleotídeo degenerado ao molde, 5 μg do DNA de molde foram combinados com oligo a uma razão molar de 10:1 em Tris-HCl (50 mM, pH 7,5) e MgCl2 (10 mM) com incubação a 90°C durante 2 minutos, 60°C durante 3 minutos, e 20°C durante 5 minutos. Após a reação de anelamento, ATP (10 mM), dNTPs (25 mM cada), DTT (100 mM), T4 ligase (7 unidades) e T7 DNA polimerase (10 unidades) são adicionados à mistura de reação, com incubação a 14°C durante 6 horas, seguida de 20°C durante 12 horas. O DNA resultante é purificado com o uso de um kit de purificação por PCR (Qiagen), e recuperado em 100 μL de água. O DNA da biblioteca é digerido com 10 unidades de AscI durante 4 horas e, então, purificado novamente com o kit de purificação de PCR da Qiagen. O DNA final da biblioteca é recuperado em 50 μL de água. O produto de DNA de filamento duplo resultante é, então, transformado em E. coli MC1061F’ por eletroporação.

[000174] Os transformantes são coletados em 20 mL de meio SOC, e deixados recuperar durante 1 hora a 37°C. Ao final da recuperação, uma alíquota da transformação é submetida a diluição serial e aplicada sobre placas com carbenicilina (100 ug/ml) contendo 1% de glicose para avaliar o número total de transformantes. O restante da cultura SOC é, então, usado para inocular 1 L de meio 2xYT com carbenicilina e 1% de glicose, sendo cultivado até que OD600 atingisse 0,6. 100 mL dessa cultura é inoculada com fago auxiliar M13 a 1010/mL, incubando- se a 37°C antes da centrifugação. O pélete de células resultante é ressuspenso em 500 mL de meio 2xYT sem uso prévio contendo carbenicilina (100 ug/mL) e canamicina (35 ug/mL) e cultivado a 30°C de um dia para o outro, antes da centrifugação. As partículas de fago são precipitadas mediante a adição de PEG/NaCl e armazenadas a - 80°C.

[000175] Uma segunda biblioteca é projetada para introduzir simultaneamente diversidade nos laços B:C e F:G de fibcon. Para isto, dois oligonucleotídeos são sintetizados. O oligo direto é fosforilado e contém o códon degenerado NNS em cada posição que codifica o laço B:C, enquanto o oligo reverso é biotinilado na extremidade 5’ e contém 21 bases de códon NNS em cada posição que codifica o laço F:G. Ambos os oligonucleotídeos são flanqueados por duas sequências de nucleotídeo de 18 pb idênticas à região precedente e seguinte à região a ser mutagenizada.

[000176] Para construir a biblioteca, dezesseis reações de PCR de 100 μL foram realizadas usando os oligos t para amplificar o molde de DNA de fibcon, introduzindo códons NNS nos laços B:C e F:G simultaneamente no processo. O produto de PCR com filamentos duplos é misturado a microesferas magnéticas de estreptavidina (Dynal) em tampão B&W (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM de EDTA, 2 M de NaCl, 0,1% de Tween-20) e incubado durante 20 minutos, puxado para baixo com um magneto e lavado duas vezes com tampão B&W. O filamento direto é eluído das microesferas com 300 μL de 150 mM NaOH. Esse "megainiciador", uma mistura de iniciadores longos com mais de 8 x 1016 em diversidade teórica, é usado para anelamento a um molde da biblioteca de filamento único. A construção da biblioteca é realizada conforme descrito acima para a primeira biblioteca.

Exemplo 3 - Seleção de ligantes à proteína-alvo

[000177] De modo a fazer seleções de elementos da biblioteca de fibcon que se ligam à proteína-alvo, a proteína-alvo é biotinilada com o uso de sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce) antes da diálise em PBS. Para as seleções, 200 μL de fagos apresentando as bibliotecas são bloqueados com 200 μL de bloqueador químico antes da adição da proteína-alvo biotinilada a concentrações de 500 nM (ciclo 1) ou 100 nM (ciclos 2 e 3). Os fagos ligados são recuperados por microesferas magnéticas com neutravidina (Seradyne) no ciclo 1, ou com microes- feras magnéticas com estreptavidina (Promega) nos ciclos 2 e 3. Os fagos não-ligados são lavados das microesferas com o uso de 5 a 10 lavagens com 1 mL de solução salina Tris tamponada com Tween (TBST), seguido de duas lavagens de 1 mL com solução salina Tris tamponada (TBS). Os fagos ligados são eluídos das microesferas mediante a adição de E. coli MC1061F’ em fase mid-log. As células infectadas são colocadas placas de ágar LB suplementadas com carbenicilina e glicose. No dia seguinte, as células são raspadas da placa e cultivadas até a fase mid-log, antes de recuperação com fago auxiliar VCSM13 e cultivo de um dia para o outro. As partículas de fago isoladas por precipitação em PEG/NaCl são usadas para o ciclo de seleções seguinte.

[000178] Após 3 ou mais ciclos de panning contra a proteína-alvo, o resultado é subclonado em um vetor pET27 modificado para incluir um sítio de clonagem independente de ligase mediante amplificação do gene de fibcon por PCR. Esse produto de PCR é anelado ao vetor e transformado em células BL21-GOLD(DE3) (Stratagene). As colônias individuais são coletadas em culturas de 1 mL em placas com 96 cavidades profundas (Corning) e cultivadas até a saturação de um dia para o outro, a 37°C. No dia seguinte, 50 μL da cultura feita de um dia para o outro são usados para inocular uma cultura de 1 mL sem uso prévio. As culturas são cultivadas a 37°C durante 2 horas antes da adição de IPTG a 1 mM e da redução da temperatura para 30°C. As células são coletadas por centrifugação 16 horas após a indução, e lisadas com 100 μL de BugBuster (Novagen). Os lisados resultantes são clarificados por centrifugação e usados para testar quanto à ligação a IgG por meio de ELISA.

[000179] Placas Maxisorp (Nunc) são revestidas com 0,1 μg de anticorpos anti-HIS (Qiagen), deixadas de um dia para o outro, lavadas com TBST e bloqueadas com Starting Block T20 (Thermo Scientific). Os lisados clarificados diluídos a 1:4 em Starting Block são adicionados às placas e deixados ligar durante 1 hora antes da lavagem com TBST. Adiciona-se IgG biotinilada ou HSA biotinilado a uma concentração de 1 μg/ml, lavando-se com TBST após 1 hora de incubação. A detecção de IgG ou HSA ligado é obtida pela adição de estreptavidina-HRP (Jackson Immunoresearch), seguida de detecção com substrato POD para quimioluminescência.

[000180] Para os propósitos da presente invenção, de 70 a 100% de identidade da sequência de aminoácido ou de nucleotídeo (isto é, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer faixa ou valor nesse intervalo) é determinado usando-se um algoritmo de computador adequado, conforme é conhecido na técnica.

[000181] Ficará claro que a invenção pode ser posta em prática de outro modo do que aquele particularmente descrito na descrição e exemplos acima mencionados. Modificações numerosas e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicaçãoes em anexo. Tabela 1 Temperaturas de fusão dos domínios FN3, como determinado por calorimetria de varredura diferencial.

Tabela 2 - Sequências: SEQ ID n°: 1: MSGPVEVFITETPSQPNSHPIQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRW KEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTS GGHHHHHH SEQ ID n°: 2: MSGPVEVFITETPSQPNSHPIQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRW KEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTS GGHHHHHH SEQ ID n°: 3: MGAPDAPPDPTVDQVDDTSIVVRWSRPQAPITGYRIVYSPSVEGSST ELNLPETANSVTLSDLQPGVQYNITIYAVEENQESTPVVIQQETTGGH HHHHH SEQ ID n°: 4: MTVPSPRDLQFVEVTDVKVTIMWTPPESAVTGYRVDVIPVNLPGEHG QRLPISRNTFAEVTGLSPGVTYYFKVFAVSHGRESKPLTAQQTTGGH HHHHH SEQ ID n°: 5: MKLDAPTNLQFVNETDSTVLVRWTPPRAQITGYRLTVGLTRRGQPR QYNVGPSVSKYPLRNLQPASEYTVSLVAIKGNQESPKATGVFTTLGG HHHHHH SEQ ID n°: 6: MQPGSSIPPYNTEVTETTIVITWTPAPRIGFKLGVRPSQGGEAPREVT SDSGSIVVSGLTPGVEYVYTIQVLRDGQERDAPIVNKVVTGGHHHHH H SEQ ID n°: 7: MGLSPPTNLHLEANPDTGVLTVSWERSTTPDITGYRITTTPTNGQQG NSLEEVVHADQSSCTFDNLSPGLEYNVSVYTVKDDKESVPISDTIIPA GGHHHHHH SEQ ID n°: 8: MGVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDV AELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGG HHHHHH SEQ ID n°: 9: MLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPRED RVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTGGHHHH HH SEQ ID n°: 10: MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPV QEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT GGHHHHHH SEQ ID n°: 11: MGEIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGP TKTKTAGPDQTEMTIEGLQPTVEYVVSVYAQNPSGESQPLVQTAVTG GHHHHHH SEQ ID n°: 12: MTIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMK EINLAPDSSSVVVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLGG HHHHHH SEQ ID n°: 13: MENVSPPRRARVTDATETTITISWRTKTETITGFQVDAVPANGQTPIQ RTIKPDVRSYTITGLQPGTDYKIYLYTLNDNARSSPVVIDASTGGHHH HHH SEQ ID n°: 14: MAIDAPSNLRFLATTPNSLLVSWQPPRARITGYIIKYEKPGSPPREVVP RPRPGVTEATITGLEPGTEYTIYVIALKNNQKSEPLIGRKKTGGHHHH HH SEQ ID n°: 15: MGHRPRPYPPNVGQEALSQTTISWAPFQDTSEYIISCHPVGTDEEPL QFRVPGTSTSATLTGLTRGATYNIIVEALKDQQRHKVREEVVTVGNS GGHHHHHH SEQ ID n°: 16: MPAPTDLRFTNETPSSLLISWTPPRVQITGYIIRYGPVGSDGRVKEFT VPPSVSSATITGLKPGTEYTISVIALKDNQESEPLRGRVTTGGHHHHH H SEQ ID n°: 17: atgccggcgccgaccgatctgcgctttaccaacgaaaccccgagcagcctgctgattagctgga ccccgccgcgcgtgcagattaccggctatattattcgctatggcccggtgggcagcgatggccgc gtgaaagaatttaccgtgccgccgagcgtgagcagcgcgaccattaccggcctgaaaccgggc accgaatataccattagcgtgattgcgctgaaagataaccaggaaaTabela 3 - Laços de fibcon

Claims (9)

1. Arcabouço de proteína isolada, caracterizado por compreender um domínio de fibronectina tipo III (FN3), o qual compreende 7 fitas e 6 laços entre as fitas e é definido pela sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.

2. Arcabouço de proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os laços formam sítios para ligar os alvos.

3. Método para construção de uma biblioteca de um arcabouço de proteína como definido na reivindicação 1 ou 2, o dito método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:obter um polipeptídeo que tenha a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO: 16, e introduzir diversidade nas cópias do polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, para formar a biblioteca de arcabouço de proteína, opcionalmente em que a introdução da etapa de diversidade compreende a mutação de pelo menos uma região de laço selecionada do grupo consistindo em resíduos 13 a 16, 22 a 28, 38 a 43, 51 a 54, 60 a 64, e 75 a 81 da SEQ ID NO:16

4. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada por compreender a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 17.

5. Vetor de ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico isolada como definida na reivindicação 4.

6. Célula hospedeira de bactéria ou fungo, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico isolada, como definida na reivindicação 4, em que a dita célula hospedeira é pelo menos uma selecionada a partir de E. coli BL21Star(DE3), outra célula de E. coli e levedura.

7. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um arcabouço de proteína como definido na reivindicação 1 ou 2, e pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, opcionalmente compreendendo ainda, pelo menos um composto ou polipeptídeo selecionado a partir de um relator ou uma etiqueta detectável, um antagonista de TNF, um fármaco anti-infectivo, um fármaco para o sistema cardiovascular (CV), um fármaco para o sistema nervoso central (SNC), um fármaco para o sistema nervoso autônomo (ANS), um fármaco para o trato respiratório, um fármaco para o trato gastrointestinal (GI), um fármaco hormonal, um fármaco para equilíbrio de fluidos ou eletrólitos, um fármaco hematológico, um antineoplástico, um fármaco para imunomodulação, um fármaco oftálmico, ótico ou nasal, um fármaco de uso tópico, um fármaco nutricional, uma citoquina e um antagonista de citoquina.

8. Dispositivo médico, caracterizado pelo fato de que compreende um arcabouço de proteína como definido na reivindicação 1 ou 2, em que o dito dispositivo é adequado para contatar ou administrar o dito arcabouço de proteína por pelo menos um modo selecionado a partir de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articulatório, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitário, intracelíaco, intracere- belar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocardíaco, intra-ósseo, intrapélvico, intraperi- cardíaco, intra-peritoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intra-uterino, intravesicular, intralesional, bólus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal e transdérmico.

9. Artigo de manufatura para uso farmacêutico ou de diagnóstico em seres humanos, caracterizado por compreender material para embalagem e um recipiente que compreende uma solução ou uma forma liofilizada de um arcabouço de proteína como definido na reivindicação 1 ou 2, em que o dito recipiente é um componente de um dispositivo ou sistema de aplicação parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articulatório, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso,intracavitário, intracelíaco, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocardíaco, intra-ósseo, intrapélvico, intrapericardíaco, intra-peritoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intra-uterino, intravesicular, intralesional, bólus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, ou transdérmico.

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