MX2012014774A - Analogos de glucagon. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona materiales y procedimientos para promover la pérdida de peso o evitar la ganancia de peso sin afectar al control glucémico. En particular, la invención proporciona péptidos de análogos al glucagón novedosos eficaces en dichos procedimientos. Los péptidos pueden mediar su efecto mediante un incremento en la selectividad para el receptor de GLP-1 en comparación con el glucagón humano.

Description

ANÁLOGOS DE GLUCAGÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a análogos de glucagón y a su uso médico, por ejemplo, en el tratamiento del exceso de ingesta de alimento, obesidad y exceso de peso, colesterol elevado, y con muy poco o ningún efecto sobre el control glucémico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El preproglucagón es un polipéptido precursor de 158 aminoácidos que se procesa de forma diferencial en los tejidos para formar un número péptidos derivados de proglucagón estructuralmente relacionados, incluyendo glucagón (Glu), péptido de tipo glucagón 1 (GLP-1), péptido de tipo glucagón 2 (GLP-2) y oxintomodulina (OXM). Estas moléculas están implicadas en una amplia variedad de funciones fisiológicas, incluyendo homeostasis de la glucosa, secreción de insulina, vaciado gástrico y crecimiento intestinal, así como regulación de la ingesta de alimento.

El glucagón es un péptido de 29 aminoácidos que se corresponde con los aminoácidos de 53 a 81 del pre-proglucagón y tiene la secuencia His-Ser-GIn-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID NO: 1). La oxintomodulina (OXM) es un péptido de 37 aminoácidos que incluye la secuencia de 29 aminoácidos completa de glucagón con una extensión carboxiterminal octapeptídica (aminoácidos de 82 a 89 de pre-proglucagón, que tiene la secuencia Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-lle-Ala (SEQ ID NO: 2) y se denomina "péptido de intervención 1" o IP-1 ; la secuencia completa de la oxintomodulina humana es, por tanto, His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr- Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-lle-Ala) (SEQ ID NO: 3). El fragmento biológicamente activo principal de GLP-1 se produce como un péptido amidado de forma C terminal, de 30 aminoácidos que se corresponde con los aminoácidos de 98 a 127 de pre-proglucagón.

El glucagón ayuda a mantener el nivel de glucosa en la sangre uniendo los receptores de glucagón en hepatocitos, lo que provoca que el hígado libere glucosa (almacenada en forma de glucógeno) a través de glucogenolisis. A medida que estas reservas disminuyen, el glucagón estimula el hígado para sintetizar glucosa adicional por gluconeogénesis. Esta glucosa se libera en el torrente circulatorio, evitando el desarrollo de hipoglucemia.

La OXM se libera en la sangre en respuesta a la ingestión de alimento y en proporción al contenido calórico de la comida. La OXM ha mostrado que suprime el apetito e inhibe la ingesta de alimento en seres humanos (Cohén et al, Journal of Endocrinology and Metabolism, 88, 4696-4701 , 2003; WO 2003/022304). Además de estos efectos anorécticos, que son similares a los del GLP-1 , la OXM también debe afectar al peso corporal por otro mecanismo, puesto que las ratas tratadas con oxintomodulina muestras menor ganancia de peso corporal que las ratas alimentadas en paralelo (Bloom, Endocrinology 2004, 145, 2687). El tratamiento de roedores obesos con OXM también mejora su tolerancia a la glucosa (Parlevliet et al, Am J Physiol Endocrinol Metab, 294, E142-7, 2008) y suprime la ganancia de peso corporal (documento WO 2003/022304).

La OXM activa los receptores tanto de glucagón como de GLP-1 con una potencia dos veces mayor para el receptor de glucagón sobre el receptor de GLP-1 , pero es menos potente que el glucagón nativo y el GLP-1 sobre sus respectivos receptores. El glucagón también puede activar ambos receptores, aunque con una preferencia fuerte por el receptor de glucagón sobre el receptor de GLP-1., El GLP-1 , por otra parte, no puede activar los receptores de glucagón. El mecanismo de acción de oxintomodulina no se entiende bien. En particular, no se sabe si algunos de los efectos extrahepáticos de la hormona están mediados a través de los receptores de GLP-1 y glucagón, o a través de uno o más receptores no identificados.

Otros péptidos han mostrado que se unen y activan tanto el receptor de glucagón como de GLP-1 (Hjort et al, Journal of Biological Chemistry, 269, 30121-30124, 1994) y suprimen la ganancia de peso corporal y reducen la ingesta de alimento (documentos WO 2006/134340, WO 2007/100535, WO 2008/10101 , WO 2008/152403, WO 2009/155257 y WO 2009/155258).

La obesidad es un problema de salud creciente a nivel global que está asociado a varias enfermedades, en particular enfermedad cardiovascular (CVD), diabetes de tipo 2, apnea de sueño obstructiva, determinados tipos de cáncer y artrosis. Como resultado, se ha encontrado que la obesidad reduce la esperanza de vida. De acuerdo con los pronósticos de 2005 de la Organización Mundial de la Salud, hay 400 millones de adultos (edad > 15) clasificados como obesos en todo el mundo. En los EE. UU., ahora se cree que la obesidad es la segunda causa principal de muerte evitable después del tabaquismo.

El aumento en la obesidad conduce a un incremento en la diabetes, y aproximadamente un 90% de las personas con diabetes de tipo 2 se puede clasificar como obesa. Hay 246 millones de personas en todo el mundo con diabetes, y se estima que en 2025 habrá 380 millones de diabéticos. Muchas tienen factores de riesgo cardiovasculares adicionales, incluyendo LDL y triglicéridos altos/aberrantes y baja HDL.

En consecuencia, existe una gran necesidad médica de tratar la obesidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un compuesto que tiene la fórmula R1-X-Z-R2 en la que R1 es H, alquilo Ci-4, acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; R2 es OH o NH2; X es un péptido que tiene la fórmula I: His-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Arg-Ala- X20-Asp-Phe-lle-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29 (I) en la que X2 está seleccionado de Ser y Aib; X16 está seleccionado de Glu e Y; X17 está seleccionado de Arg e Y; X20 está seleccionado de Lys e Y; X24 está seleccionado de Glu e Y; X27 está seleccionado de Leu e Y; X28 está seleccionado de Ser e Y o está ausente; X29 es Ala o está ausente; en la que al menos uno de X16, X17, X20, X24, X27 y X28 es Y; en la que cada residuo Y está seleccionado independientemente de entre Lys, Cys y Orn; en la que la cadena lateral de al menos un residuo aminoacídico Y de X está conjugada con un sustituyente lipófilo que tiene la fórmula: (i) Z1 , en la que Z1 es un resto lipófilo conjugado directamente a la cadena lateral de X; o (ii) Z1Z2, en la que Z1 es un resto lipófilo, Z2 es un espaciador, y Z1 está conjugado a la cadena lateral de X por medio de Z2; y Z está ausente o es una secuencia de 1-20 unidades de aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr y Orn; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En un ejemplo, X puede tener la secuencia: HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLKSA HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLSA HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLKA HSQGTFTSDYSKYLDKRRAKDFIEWLLSA HSQGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA o H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA En algunas realizaciones, el sustituyente lipófilo se une al residuo aminoacídico en la posición 16, 17, 20, 27 ó 28.

Por ejemplo, el compuesto de la invención puede tener la secuencia: H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWL-K(Hexadecanoil-isoGlu)-SA -NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRA-K(Hexadecanoil-isoGlu)-DFIEWLLSA -NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLL-K(Hexadecanoil-isoGlu)-A -NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLD-K(Hexadecanoil-isoGlu)-RRAKDFIEWLLSA -NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(Hexadecanoil-isoGlu)-RAKDFIEWLLSA -NH o H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(Hexadecanoil-isoGlu)-RAKDFIEWLLSA-NH2 La invención también proporciona un ácido nucleico (que puede ser un ADN o ARN) que codifica un compuesto de la invención, un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico, y una célula huésped que contiene dicho ácido nucleico o vector de expresión.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un péptido análogo de glucagón como se define en el presente documento, o una sal o derivado del mismo, un ácido nucleico que codifica dicho péptido análogo de glucagón, un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico, o una célula huésped que contiene dicho ácido nucleico o vector de expresión, en mezcla con un vehículo. En realizaciones preferidas, la composición es una composición farmacéuticamente aceptable y el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. El análogo del péptido de glucagón puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable del análogo de glucagón.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición para su uso en un procedimiento de tratamiento médico.

Los compuestos descritos encuentran su uso, inter alia, en la prevención de la ganancia de peso o en la promoción de la pérdida de peso. Por "prevención" se quiere decir inhibición o reducción cuando se compara con la ausencia de tratamiento, y no tiene que implicar necesariamente un cese completo de la ganancia de peso. Los péptidos pueden provocar una disminución en la ingesta y/o un incremento en el gasto energético, lo que da como resultado el efecto observado sobre el peso corporal. Independientemente de su efecto sobre el peso corporal, los compuestos de la invención pueden tener un efecto beneficioso sobre los niveles de colesterol en circulación, lo que puede disminuir los niveles de LDL en circulación e incrementar la proporción de HDL/LDL. Por tanto, los compuestos de la invención se pueden usar para tratamiento directo o indirecto de cualquier afección provocada o caracterizada por un exceso en el peso corporal, tal como el tratamiento y/o la prevención de obesidad, obesidad mórbida, inflamación ligada a obesidad, colecistopatía ligada a obesidad, apnea del sueño inducida por obesidad. También se pueden usar para la prevención de síndrome metabólico, hipertensión, dislipidemia aterogénica, ateroesclerosis, arterioesclerosis, cardiopatía coronaria o apoplejía. Sus efectos en estas condiciones pueden ser como resultado de o se pueden asociar con su efecto sobre el peso corporal, o pueden ser independientes del mismo.

En determinadas realizaciones, los compuestos descritos pueden encontrar uso en la prevención de la ganancia de peso o en la promoción de la pérdida de peso con muy poco o ningún efecto sobre el control glucémico. Se ha encontrado en la presente invención que determinados de los compuestos descritos tienen un efecto marcado sobre la pérdida de peso con muy poco efecto o ninguno sobre el nivel de HbA1c en un modelo animal bien establecido.

Como ya se ha descrito, la invención se extiende a los vectores de expresión que comprenden la secuencia de ácidos nucleicos descrita anteriormente, opcionalmente en combinación con secuencias para dirigir su expresión, y células huésped que contienen los vectores de expresión. Preferentemente, las células huésped pueden expresar y secretar el compuesto de la invención. En otro aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento de producción del compuesto, comprendiendo el procedimiento cultivar las células huésped bajo condiciones adecuadas para expresar el compuesto y purificar el compuesto así producido.

La invención proporciona además un ácido nucleico de la invención, un vector de expresión de la invención, o una célula huésped que puede expresar y secretar un compuesto de la invención, para su uso en un procedimiento de tratamiento médico. Se entenderá que el ácido nucleico, el vector de expresión y las células huésped se pueden usar para el tratamiento de cualquiera de los trastornos descritos en el presente documento que se pueden tratar con los propios compuestos de la invención. Por lo tanto, las referencias a una composición terapéutica que comprende un compuesto de la invención, administración de un compuesto de la invención, o cualquier uso terapéutico del mismo, se deben interpretar para abarcar el uso equivalente de un ácido nucleico, vector de expresión o célula huésped de la invención, excepto cuando el contexto lo demande de otro modo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 : muestra el efecto de la administración s.c. del compuesto 6 agonista dual Glu-GLP-1 sobre el cambio en HbA1c durante el periodo de tratamiento de 6 semanas en ratones db/db. Los datos se muestran como media+EEM con n=1 1/grupo. * p<0,05, **p<0,01 , *** p<0,001 en comparación con el vehículo en el mismo punto temporal.

Figura 2: muestra el efecto de la administración s.c. del compuesto 6 agonista Glu-GLP-1 sobre la ganancia de peso corporal durante el periodo de tratamiento de 6 semanas en ratones db/db. Los datos se dan como media+EEM con n = 1 1/grupo.** p<0,01 , ***p<0,001 en comparación con el vehículo.

Figura 3: Muestra el efecto de la administración s.c. del compuesto 6 agonista Glu-GLP-1 sobre el peso corporal en ratones C57BL/6J alimentados con alto contenido en grasas. Los datos son la media+EEM.

Figura 4: Muestra el efecto de la administración s.c. del compuesto 6 agonista Glu-GLP-1 sobre el área bajo la curva de glucosa (ABC) durante OGTT en ratones C57BL/6J alimentados con alto contenido en grasas. Los datos son la media±EEM. * p<0,05.

Figura 5: Muestra el efecto del tratamiento de 3 semanas de ratones que han estado con una dieta de alto contenido en grasas de 30 semanas durante 30 semanas antes del tratamiento (s.c.) con vehículo (PBS), 10 nmol/kg de exendina-4 o 10 nmol/kg de compuesto 6 dos veces diariamente durante 3 semanas en lípidos. CHO: Colesterol total; HDL: Colesterol de alta densidad; LDL: Colesterol de baja densidad; TRIG: Triglicéridos; HDL/LDL: Proporción entre HDL y LDL.

Figura 6: Muestra el efecto del compuesto 6 y del compuesto 7 sobre la ganancia de peso corporal en ratones C57BL/6J alimentados con alto contenido en grasas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la memoria descriptiva presente, se usan los códigos de una letra y tres letras convencionales para los aminoácidos naturales, así como los códigos de tres letras generalmente aceptados para otros aminoácidos, tales como Aib (ácido a-aminoisobutírico), Orn (ornitina), Dbu (ácido 2,4 diaminobutírico) y Dpr (ácido 2,3-diaminopropanoico).

El término "glucagón nativo" se refiere a glucagón humano nativo que tiene la secuencia H-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-GIn-Asp-Phe-Val-GIn-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH (SEQ ID NO: 1).

La invención proporciona compuestos como se definen anteriormente. Para evitar dudas, en las definiciones proporcionadas en el presente documento, en general se pretende que la secuencia de X sólo difiera de la fórmula I en las posiciones que están establecidas para permitir una variación. Se puede considerar que los aminoácidos dentro de la secuencia X están numerados consecutivamente de 1 a 29 en el sentido del extremo N terminal al C terminal convencional. La referencia a una "posición" dentro de X se debe interpretar en consecuencia, ya que debe hacer referencia a posiciones dentro del glucagón humano nativo y a otras moléculas.

Los compuestos de la invención pueden llevar uno o más puentes intramoleculares dentro de la secuencia peptídica de X. Cada uno de dichos puentes se forma entre las cadenas laterales de dos residuos aminoacídicos de X que se separan normalmente por tres aminoácidos en la secuencia lineal de X (es decir, entre el aminoácido A y el aminoácido A+4).

Más en particular, el puente puede estar formado entre las cadenas laterales de los pares de residuos 12 y 16, 16 y 20, 17 y 21 , 20 y 24, o 24 y 28. Las dos cadenas laterales se pueden enlazar entre sí a través de interacciones iónicas o por enlaces covalentes. Por tanto, estos pares de residuos pueden comprender cadenas laterales opuestamente cargadas para formar un puente salino por interacciones iónicas. Por ejemplo, uno de los residuos puede ser Glu o Asp, mientras que el otro puede ser Lys o Arg. Los pares Lys y Glu y Lys y Asp, respectivamente, también pueden reaccionar para formar un anillo de lactama. Asimismo, una Tyr y una Glu o una Tyr y una Asp pueden formar un anillo de lactona.

Sin pretender quedar vinculado a teoría particular alguna, se cree que dichos puentes intramoleculares estabilizan la estructura alfa helicoidal de la molécula y de este modo se incrementa la potencia y/o la selectividad en el receptor de GLP-1 y posiblemente también en el receptor de glucagón.

Sin pretender quedar vinculado a teoría particular alguna, parece que los residuos de arginina en las posiciones 17 y 18 del glucagón nativo proporcionan una selectividad significativa para el receptor de glucagón Sin pretender quedar vinculado a teoría particular alguna, parece que los residuos en las posiciones 27, 28 y 29 del glucagón nativo proporcionan una selectividad significativa del péptido para el receptor de glucagón. Las sustituciones en una, dos o las tres de estas posiciones con respecto a la secuencia de glucagón nativo pueden incrementar la potencia en y/o la selectividad para el receptor de GLP-1 , potencialmente sin una reducción significativa de la potencia en el receptor de glucagón. Los ejemplos particulares incluyen Leu en la posición 27, Ser en la posición 28 y Ala en la posición 29.

La sustitución del residuo Met natural en la posición 27 (por ejemplo, con Leu o Lys, en especial con Leu) también reduce el potencial para la oxidación, incrementando de este modo la estabilidad química de los compuestos.

La sustitución del residuo Asn natural en la posición 28 (por ejemplo, por Ser, Arg o Ala) también reduce el potencial para la desaminación en solución acida, incrementando así la estabilidad química de los compuestos.

: La potencia y/o la selectividad en el receptor de GLP-1 también se puede incrementar introduciendo residuos que es probable que formen una estructura helicoidal amf ¡pática, sin un pérdida potencialmente significativa de la potencia en el receptor de glucagón. Esto se puede lograr por la introducción de residuos cargados en una o más de las posiciones 16, 20, 24 y 28. Por tanto, los residuos en las posiciones 16 y 20 pueden ambos estar cargados, los residuos en las posiciones 16 y 24 pueden ambos estar cargados, los residuos en las posiciones 20 y 24 pueden ambos estar cargados, los residuos en las posiciones 16, 20 y 24 pueden todos estar cargados, o los residuos en las posiciones 16, 20, 24 y 28 pueden todos estar cargados. Por ejemplo, el residuo en la posición 16 puede ser Glu o Lys. El residuo en la posición 20 puede ser Lys. El residuo en la posición 24 puede ser Glu. El residuo en la posición 28 puede ser Lys.

La sustitución de uno o ambos de los residuos Gln naturales en las posiciones 20 y 24 también reduce el potencial para la desamidación en solución ácida, incrementando de este modo la estabilidad química de los compuestos.

La sustitución de uno o más de los aminoácidos naturales en las posiciones 16, 17, 20, 27 y 28 con un aminoácido cargado permite la conjugación con un sustituyente lipófilo. Por ejemplo, los residuos en las posiciones 16, 17, 20, 27 o 28 pueden ser Cys, Orn o Lys. Más en particular, uno o más de los residuos en las posiciones 16, 17, 20, 27 y 28 pueden ser Cys. Además, uno o más de los residuos en las posiciones 16, 17, 20, 27 y 28 pueden ser Lys.

Como ya se divulgó, un compuesto de la invención puede comprender una secuencia peptídica C terminal Z de 1-20 aminoácidos, por ejemplo, para estabilizar la conformación y/o la estructura secundaria del péptido análogo de glucagón, y/o para hacer que el péptido análogo de glucagón sea más resistente a la hidrólisis enzimática, por ejemplo, como se describe en el documento WO 99/46283.

Cuando está presente, Z representa una secuencia peptídica de 1-20 residuos aminoacídicos, por ejemplo, en el intervalo de 1-15, más preferentemente en el intervalo de 1-10, en particular en el intervalo de 1-7 residuos aminoacídicos, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 residuos aminoacídicos, tales como 6 residuos aminoacídicos. Cada uno de los residuos aminoacídicos en la secuencia peptídica Z se puede seleccionar independientemente de entre Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu (ácido 2,4 diaminobutírico), Dpr (ácido 2,3-diaminopropanoico) y Orn (ornitina). Preferentemente, los residuos aminoacídicos están seleccionados de entre Ser, Thr, Tyr, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr y Orn, más preferentemente están seleccionados exclusivamente de entre Glu, Lys y Cys. Los aminoácidos mencionados anteriormente pueden tener configuración D o bien L, pero preferentemente tienen una configuración L. Las secuencias Z particularmente preferidas son secuencias de cuatro, cinco, seis o siete residuos lisina consecutivos (es decir, Lys3, Lys4, Lys5, Lys6 o Lys7), y en particular cinco o seis residuos de lisina consecutivos. Otras secuencias ejemplares de Z se muestran en el documento WO 01/04156. De forma alternativa, el residuo C terminal de la secuencia Z puede ser un residuo Cys. Esto puede ayudar en la modificación (por ejemplo, PEGilación, o conjugación con albúmina) del compuesto. En dichas realizaciones, la secuencia Z, por ejemplo, puede ser sólo de un aminoácido de longitud (es decir, Z = Cys) o puede ser de dos, tres, cuatro, cinco, seis o incluso más aminoácidos de longitud. Por lo tanto, los otros aminoácidos sirven como espaciador entre el péptido X y el residuo Cys terminal.

La secuencia peptídica Z tiene una identidad de secuencia de no más de un 25% con la secuencia correspondiente de la porción IP-1 de la OXM humana (que tiene la secuencia Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-lle-Ala).

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" de una secuencia peptídica o polipeptídica dada con respecto a otra secuencia polipeptídica (por ejemplo, IP-1) se calcula como el porcentaje de residuos aminoacídicos en la secuencia peptídica dada que son idénticos con los residuos aminoacídicos correspondientemente situados en la secuencia correspondiente de ese otro polipéptido cuando los dos están alineados entre sí, introduciendo huecos para la alineación óptima si es necesario. Los valores del % de identidad se pueden determinar usando WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)). WU-BLAST-2 usa varios parámetros de búsqueda, de los que la mayoría se establecen como los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se establecen con los siguientes valores: intervalo de solapamiento = 1 , fracción de de solapamiento = 0,125, valor umbral de palabra (T) = 11. Un % de identidad de secuencia de aminoácidos se determina por el número de residuos idénticos emparejados determinado por WU-BLAST-2, dividido entre el número total de residuos de la secuencia de referencia (huecos introducidos por WU-BLAST-2 en la secuencia de referencia para maximizar la puntuación de alineación que se ignora), multiplicado por 100.

Por tanto, cuando Z se alinea óptimamente con los 8 aminoácidos de IP-1 , no tiene más de dos aminoácidos que sea idénticos con los aminoácidos correspondientes de IP-1.

En una realización específica, la presente invención proporciona un compuesto en el que Z está ausente.

Se puede conjugar una o más de las cadenas laterales de aminoácidos en el compuesto de la invención con un sustituyente lipófilo. El sustituyente lipófilo se puede unir covalentemente a un átomo en la cadena lateral de aminoácidos, o de forma alternativa, se puede conjugar con la cadena lateral de aminoácidos por un espaciador. Se puede conjugar un sustituyente lipófilo con una cadena lateral de un aminoácido que es parte del péptido X, y/o parte del péptido Z.

Sin pretender quedar vinculado a teoría alguna en particular, se cree que el sustituyente lipófilo se une a albúmina en el torrente circulatorio, protegiendo de este modo los compuestos de la invención de la degradación enzimática y potenciando de este modo la semivida de los compuestos. El espaciador, cuando está présente, se usa para proporcionar espacio entre el compuesto y el sustituyente lipófilo.

El sustituyente lipófilo se puede unir a la cadena lateral de aminoácidos o al espaciador por medio de un éster, un éster de sulfonilo, un tioéster, una amida o una sulfonamida. En consecuencia, se entenderá que, preferentemente, el sustituyente lipófilo incluye un grupo acilo, un grupo sulfonilo, un átomo de N, un átomo de O o un átomo de S que forma parte del éster, sulfonil éster, tioéster, amida o sulfonamida. Preferentemente, un grupo acilo en el sustituyente lipófilo forma parte de una amida o éster con la cadena lateral de aminoácidos o el espaciador.

El sustituyente lipófilo puede incluir una cadena de hidrocarburos que tiene de 4 a 30 átomos de C. Preferentemente, tiene al menos 8 ó 12 átomos de C, y preferentemente tiene 24 átomos de C o menos, o 20 átomos de C o menos. La cadena de hidrocarburos puede ser lineal o ramificada y puede ser saturada o insaturada. Se entenderá que la cadena de hidrocarburos está sustituida preferentemente por un resto que forma parte de la unión con la cadena lateral de aminoácidos o el espaciador, por ejemplo, un grupo acilo, un grupo sulfonilo, un átomo de N, un átomo de O o un átomo de S. Lo más preferentemente, la cadena de hidrocarburos se sustituye con acilo, y en consecuencia, la cadena de hidrocarburos puede ser parte de un grupo alcanoílo, por ejemplo, palmitoílo, caproílo, lauroílo, miristoílo o estearoílo.

En consecuencia, el sustituyente lipófilo puede tener la fórmula mostrada a continuación: A puede ser, por ejemplo, un grupo acilo, un grupo sulfonilo, NH, N-alquilo, un átomo de O o un átomo de S, preferentemente acilo. n es un número entero de 3 a 29, preferentemente al menos 7 o al menos 11 , y preferentemente 23 o menor, más preferentemente 19 o menor.

La cadena de hidrocarburos puede estar adicionalmente sustituida. Por ejemplo, puede estar adicionalmente sustituida con hasta tres sustituyentes seleccionados de NH2, OH y COOH. Si la cadena de hidrocarburos está adicionalmente sustituida, preferentemente está adicionalmente sustituida sólo con un sustituyente. De forma alternativa o adicional, la cadena de hidrocarburos puede incluir un cicloalcano o heterocicloalcano, por ejemplo como se muestra a continuación: Preferentemente, el cicloalcano o heterocicloalcano es un anillo de seis miembros. Lo más preferentemente, es piperidina.

De forma alternativa, el sustituyente lipófilo puede estar basado en un esqueleto de ciclopentanofenantreno, que puede estar parcial o totalmente insaturado o saturado. Los átomos de carbono en el esqueleto pueden estar sustituidos cada uno con Me u OH. Por ejemplo, el sustituyente lipófilo puede ser colilo, desoxicolilo o litocolilo.

Como se ha mencionado anteriormente, el sustituyente lipófilo puede estar conjugado con la cadena lateral de aminoácidos por un espaciador. Cuando está presente, el espaciador está unido al sustituyente lipófilo y a la cadena lateral de aminoácidos. El espaciador puede estar unido al sustituyente lipófilo y a la cadena lateral de aminoácidos independientemente por un éster, un sulfonil éster, un tioéster, una amida o una sulfonamida. En consecuencia, puede incluir dos restos seleccionados independientemente de entre acilo, sulfonilo, un átomo de N, un átomo de O o un átomo de S. El espaciador puede tener la fórmula: en la que B y D está seleccionado cada uno independientemente de entre acilo, sulfonilo, NH, N-alquilo, un átomo de O y un átomo de S, preferentemente de entre acilo y NH. Preferentemente, n es un número entero de 1 a 10, preferentemente de 1 a 5. El espaciador puede estar adicionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de entre alquilo Co-6, alquilamina Co-6, alquilhidroxi Co-6 y alquilcarboxi C0-6- De forma alternativa, el espaciador puede tener dos o más unidades de repetición de la fórmula anterior. B, D y n están seleccionados cada uno independientemente para cada unidad de repetición. Las unidades de repetición adyacentes pueden estar unidas covalentemente ente sí por medio de sus respectivos restos B y D. Por ejemplo, los restos B y D de las unidades de repetición adyacentes pueden formar juntos un éster, un sulfonil éster, a tioéster, una amida o una sulfonamida. Las unidades B y D libres en cada extremo del espaciador están unidas a la cadena lateral de aminoácidos y al sustituyente lipófilo como se describe anteriormente.

Preferentemente, el espaciador tiene cinco o menos, cuatro o menos o tres o menos unidades de repetición. Lo más preferentemente, el espaciador tiene dos unidades de repetición o es una unidad individual.

El espaciador (o una o más de las unidades de repetición del espaciador, si tiene unidades de repetición) puede ser, por ejemplo, un aminoácido natural o no natural. Se entenderá que para aminoácidos que tienen cadenas laterales funcionalizadas, B y/o D puede ser un resto dentro de la cadena lateral del aminoácido. El espaciador puede ser un aminoácido natural o no natural. Por ejemplo, el espaciador (o una o más unidades de repetición del espaciador, si tiene unidades de repetición) puede ser Gly, Pro, Ala, Val, Leu, lie, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Gln, Asn, a-Glu, ?-Glu, Asp, Ser Thr, Gaba, Aib, ß-Ala, 5-aminopentanoílo, 6-aminohexanoílo, 7-aminoheptanoílo, 8-aminooctanoílo, 9-aminononanoílo o 10-aminodecanoílo.

Por ejemplo, el espaciador puede ser un aminoácido seleccionado de entre ?-Glu, Gaba, ß-Ala y a-Glu.

Se puede conjugar un sustituyente lipófilo con una cadena lateral de aminoácidos en un compuesto de la invención. Preferentemente, la cadena lateral de aminoácidos incluye un grupo carboxi, hidroxilo, tiol, amida o amina, para formar un éster, un sulfonil éster, un tioéster, una amida o una sulfonamida con el espaciador o el sustituyente lipófilo. Por ejemplo, el sustituyente lipófilo se puede conjugar con Asn, Asp, Glu, Gln, His, Lys, Arg, Ser, Thr, Tyr, Trp, Cys o Dbu, Dpr u Orn. Preferentemente, el sustituyente lipófilo se conjuga con Lys. Se puede reemplazar un aminoácido mostrado como Lys en las fórmulas proporcionadas en el presente documento, por ejemplo, por Dbu, Dpr u Orn donde se añade un sustituyente lipófilo.

Un ejemplo de un sustituyente lipófilo y un espaciador se muestra en la fórmula a continuación: Aquí, un residuo Lys en el compuesto de la presente invención se une covalentemente a ?-Glu (el espaciador) por medio de un resto amida. El palmitoilo se une covalentemente al espaciador ?-Glu por medio de un resto amida.

De forma alternativa o adicional, se pueden conjugar una o más cadenas laterales de aminoácidos en el compuesto de la invención con un resto polimérico, por ejemplo, para incrementar la solubilidad y/o la semivida in vivo (por ejemplo, in plasma) y/o la biodisponibilidad. También se sabe que dicha modificación reduce la depuración (por ejemplo, depuración renal) de proteínas y péptidos terapéuticos.

El resto polimérico es preferentemente soluble en agua (anfifílico o hidrófilo), no tóxico, farmacéuticamente inerte. Los resto poliméricos adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), homo- o copolímeros de PEG, un polímero monometil-sustituido de PEG (mPEG), y polioxietilenglicerol (POG). Véase, por ejemplo, Int. J. Hematology 68:1 (1998); Bioconjugate Chem. 6:150 (1995); y Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Sys. 9:249 (1992).

Otros resto poliméricos adecuados incluyen poliaminoácidos tales como poli-lisinas, ácido poli-aspártico y ácido poli-glutámico (véase, por ejemplo, Gombotz, et al. (1995) , Bioconjugate Chem. , vol. 6 : 332-351 ; Hudecz, et al. (1992) , Bioconjugate Chem. , vol. 3, 49-57; Tsukada, et al. (1984) , J. Nati. Cáncer Inst. , vol. 73, : 721-729; y Pratesi, et al. (1985), Br. J. Cáncer, vol. 52: 841-848).

El resto polimérico puede ser de cadena lineal o ramificada. Puede tener un peso molecular de 500-40,000 Da, por ejemplo 500-10.000 Da, 1.000-5.000 Da, 10.000-20.000 Da o 20.000-40.000 Da.

Un compuesto de la invención puede comprender dos o más de dichos restos, en cuyo caso el peso molecular total de todos los dichos restos, en general, caerá dentro de los intervalos proporcionados anteriormente.

El resto polimérico se puede acoplar (por enlace covalente) a un grupo amino, carboxilo o tiol de una cadena lateral de aminoácidos, ejemplos preferentes son el grupo tiol de residuos Cys y el grupo épsilon amino de residuos Lys. También se pueden usar los grupos carboxilo de los residuos Asp y Glu.

El lector experto será muy consciente de las técnicas adecuadas que se pueden usar para realizar la reacción de acoplamiento. Por ejemplo, un resto PEG que lleva un grupo metoxi se puede acoplar a un grupo tiol por un enlace maleimido usando reactivos disponibles comercialmente de Nektar Therapeutics AL. Véase también el documento WO 2008/101017 y las referencias citadas anteriormente para detalles de química adecuada.

En otro aspecto, se conjugan uno o más de las cadenas laterales de aminoácidos en un compuesto en la presente invención, por ejemplo, en el péptido X, con un resto polimérico.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un compuesto de la invención como se describe en el presente documento, o una sal o derivado del mismo, en mezcla con un vehículo.

El término "derivado del mismo" se refiere a un derivado de uno cualquiera de los compuestos. Los derivados incluyen todas las modificaciones químicas, todas las variantes conservadoras, todos los profármacos y todos los metabolitos de los compuestos.

La invención también proporciona el uso de un compuesto de la presente invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una afección como se describe a continuación.

La invención también proporciona una composición en la que la composición es una composición farmacéuticamente aceptable, y el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Síntesis de péptidos Los compuestos de la presente invención se pueden preparar por procedimientos sintéticos estándar, sistemas de expresión recombinantes o bien cualquier otro procedimiento del estado de la técnica. Por tanto, los análogos de glucagón se pueden sintetizar de varia maneras, incluyendo, por ejemplo, un procedimiento que comprende: (a) sintetizar el péptido por medio de metodología en fase sólida o en fase líquida, por etapas o bien por montaje de fragmentos, y aislar y purificar el producto peptídico final; o (b) expresar una construcción de ácido nucleico que codifica el péptido en una célula huésped, y recuperar el producto de expresión del cultivo de célula huésped; o (c) efectuar la expresión in vitro libre de células de una construcción de ácido nucleico que codifica el péptido, y recuperar el producto de expresión; o cualquier combinación de procedimientos de (a), (b) y (c) para obtener fragmentos del péptido, uniendo posteriormente los fragmentos para obtener el péptido, y recuperar el péptido.

Se prefiere sintetizar los análogos de la invención por medio de síntesis de péptidos en fase sólida o en fase líquida. En este contexto, se hace referencia al documento WO 98/11125 y, entre muchos otros, Fields, GB et al., 2002, "Principies and practice of solid-phase peptide synthesis". En: Synthetic Peptides (2a edición), y los ejemplos en el presente documento.

Para la expresión recombinante, los fragmentos de ácido nucleico de la invención se insertarán normalmente en vectores adecuados para formar vectores de clonación o de expresión que llevan los fragmentos de ácido nucleico de la invención; dichos vectores novedosos también son parte de la invención. Los vectores, dependiendo del propósito y del tipo de aplicación, pueden estar en forma de plásmidos, fagos, cósmidos, mini-cromosomas, o virus, pero también el ADN desnudo que sólo se expresa de forma transitoria en determinadas células es un vector importante. Los vectores de clonación y de expresión preferentes (vectores plasmídicos) de la invención pueden realizar la replicacíón autónoma, permitiendo de este modo números de copias altos para los propósitos de expresión de nivel alto o replicación de nivel alto para la clonación posterior.

En líneas generales, un vector de expresión comprende las siguientes características en la dirección 5'?3' y en el enlace funcional: un promotor para conducir la expresión del fragmento de ácido nucleico de la invención, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido líder que permite la secreción (a la fase extracelular o, si es aplicable, en el periplasma), el fragmento de ácido nucleico que codifica el péptido de la invención, y opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un terminador. Pueden comprender características adicionales tales como marcadores seleccionabas y orígenes de replicación. Cuando funcionan con vectores de expresión en cepas productoras o líneas celulares puede ser preferente que el vector pueda integrarse en el genoma de la célula huésped. El experto está muy familiarizado con los vectores adecuados y puede diseñar uno de acuerdo con sus requisitos específicos.

Los vectores de la invención se usan para transformar células huésped para producir el compuesto de la invención. Dichas células transformadas, que también son parte de la invención, pueden ser células o líneas celulares cultivadas para la propagación de los fragmentos de ácido nucleico y vectores de la invención, o se pueden usar para la producción recombinante de los péptidos de la invención.

Las células transformadas preferentes de la invención son microorganismos tales como bacterias tale como las especies Escherichia (por ejemplo, E. coli), Bacillus (por ejemplo, Bacillus subtilis), Salmonella, o Mycobacterium (preferentemente no patógenas, por ejemplo, M. bovis BCG), levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris), y protozoos. De forma alternativa, las células transformadas se pueden derivar de un organismo multicelular, es decir, puede ser una célula fúngica, una célula de insecto, una célula de alga, una célula vegetal o una célula animal tal como una célula de mamífero. Para los propósitos de clonación y/o expresión optimizada, es preferente que la célula transformada pueda replicar el fragmento de ácido nucleico de la invención. Las células que expresan el fragmento nucleico son realizaciones útiles de la invención, se pueden usar para preparación a pequeña escala o a gran escala de los péptidos de la invención.

Cuando se produce el péptido de la invención por medio de células transformadas, es conveniente, aunque dista de ser esencial, que el producto de expresión se secrete dentro del medio de cultivo.

Eficacia Se puede usar la unión de los compuestos relevantes para los receptores de GLP-1 o glucagón (Glu) como una indicación de la actividad agonista, pero en general se prefiere el uso de un ensayo biológico que mida la señalización intracelular provocada por la unión del compuesto al receptor relevante. Por ejemplo, la activación del receptor de glucagón por un agonista de glucagón estimulará la formación del AMP cíclico (cAMP) celular. De forma similar, la activación del receptor de GLP-1 por un agonista de GLP-1 estimulará la formación del cAMP celular. Por tanto, la producción de cAMP en células adecuadas que expresan uno de estos dos receptores se puede usar para controlar la actividad de receptor relevante. Por tanto, el uso de un par adecuado de tipos celulares, que exprese cada uno un receptor pero no el otro, se puede usar para determinar la actividad del agonista frente a ambos tipos de receptor.

El experto en la técnica será consciente de los formatos de ensayo adecuados, y los ejemplos se proporcionan a continuación. El receptor de GLP-1 y/o el receptor de glucagón pueden tener la secuencia de los receptores que se describe en los ejemplos. Por ejemplo, los ensayos pueden emplear el receptor de glucagón humano (glucagón-R) que tiene el número de acceso principal Gl:4503947 y/o el receptor de péptido de tipo glucagón humano 1 (GLP-1 R) que tiene el número de acceso principal Gl:166795283. (porque, cuando se refiere a secuencias de las proteínas precursoras, se debe entender, por supuesto, que los ensayos pueden hacer uso de la proteína madura, que carece de la secuencia señal).

Se pueden usar los valores de CE50 como medida numérica de la potencia agonista para un receptor dado. Un valor de CE50 es una medida de la concentración de un compuesto requerida para lograr la mitad de la actividad máxima de ese compuesto en un ensayo particular. Por tanto, por ejemplo, un compuesto que tiene una CE50[GLP-1] menor que la CE50[GLP-1] de glucagon en un ensayo particular se puede considerar que tiene una potencia del agonista del receptor de GLP-1 mayor que el glucagon.

Los compuestos descritos en esta memoria descriptiva son, normalmente, agonistas duales Glu-GLP-1 , como se determina por la observación de que pueden estimular la formación de cAMP tanto en el receptor de glucagon como en el receptor de GLP-1. La estimulación de cada receptor se puede medir en ensayos independientes y comparar después entre sí.

Comparando el valor de CE50 para el receptor de glucagon (CE50 [glucagón-R]) con el valor de CE50 para el receptor de GLP-1 , (CE50 [GLP-1 R]) para un compuesto dado, la selectividad de glucagón relativa (%) de ese compuesto se puede hallar como sigue: Selectividad de glucagón-R relativa [compuesto] = (1/CE50 [glucagón-R])x100 / (I/CE50 [glucagón-R] + 1/CE50 [GLP-1 R]) Asimismo, la selectividad de GLP-1 R relativa se puede hallar: Selectividad de GLP-1 R relativa [compuesto] = (1/CE50 [GLP-1 R])x100 / (1/CE50 [glucagón-R] + I/CE50 [GLP-1 R]) Una selectividad relativa de un compuesto permite que su efecto sobre el receptor de GLP-1 o glucagón se compare directamente con su efecto sobre el otro receptor. Por ejemplo, cuanto mayor sea la selectividad de GLP-1 relativa de un compuesto, más eficaz es ese compuesto sobre el receptor de GLP-1 en comparación con el receptor de glucagón.

Usando los ensayos descritos a continuación, se ha encontrado que la selectividad de GLP-1 relativa para el glucagón humanos es aproximadamente de un 5%.

Los compuestos de la invención tiene una selectividad de GLP-1 R relativa mas alta que el glucagón humano porque, para un nivel particular de actividad agonista de glucagón-R, el compuesto presentará un nivel más alto de actividad agonista de GLP-1 R (es decir, mayor potencia en el receptor de GLP-1) que glucagón. Se entenderá que la potencia absoluta de un compuesto particular en los receptores de glucagón y GLP-1 pueden ser más alta, más baja o aproximadamente igual q la del glucagón humano nativo, siempre que se logre la selectividad de GLP- 1 R relativa apropiada.

No obstante, los compuestos de la presente invención pueden tener una CE50 menor [GLP-1 R] que el glucagón humano. Los compuestos pueden tener una CE50[GLP-1-R] menor que glucagón mientras mantienen una CE50 [glucagón-R] que es menos de 10 veces mayor que la de glucagón humano, menos de 5 veces mayor que la de glucagón humano, o menos de 2 veces mayor que la de glucagón humano.

Los compuestos de la invención pueden tener una CE50 [glucagón-R] que sea menor de dos veces la de glucagón humano. Los compuestos pueden tener una CE50 [glucagón-R] que sea menos de dos veces la del glucagón humano y tener una CE50 [GLP-1 R] que sea menos de la mitad de la de glucagón humano, menos de un : quinto de la de glucagón humano, o menos de un décimo de la de glucagón humano.

La selectividad de GLP-1 R relativa de los compuestos puede ser de ente un 5% y un 95%. Por ejemplo, los compuestos pueden tener una selectividad relativa de 5-20%, 10-30%, 20-50%, 30-70%, o 50-80%; o de 30-50%, 40-60,%, 50-70% o 75- 95%.

Los compuestos de la invención también pueden tener efecto sobre otros receptores GPCR de clase B, tales como, pero sin limitarse a, péptido relacionado con el gen de la calcitonina de tipo 1 (CGRP1), factor de liberación de corticotropina de tipo 1 y 2 (CRF1 y CRF2), polipéptido inhibidor gástrico (GIP), péptido de tipo glucagón 1 y 2 (GLP-1 y GLP-2, glucagón (GCGR), secretina, hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), hormona paratiroidea de tipo 1 y 2 (PTH1 y PTH2), péptido intestinal vasoactivo (VPAC1 y VPAC2).

Usos terapéuticos Los compuestos de la invención pueden proporcionar una opción de tratamiento atractiva para, inter alia, obesidad y enfermedades metabólicas.

El síndrome metabólico se caracteriza por un grupo de factores de riesgo metabólico en una persona. Incluyen obesidad abdominal (tejido graso excesivo alrededor de los órganos internos abdominales), dislipidemia aterogénica (trastornos de lípidos en sangre incluyendo triglicéridos altos, colesterol HDL alto y/o colesterol LDL alto, lo que acumula plaquetas temporales en las paredes arteriales), tensión arterial elevada (hipertensión), resistencia a insulina e intolerancia a la glucosa, estado protrombótico (por ejemplo, inhibidor del activador de plasminógeno o fibrinógeno alto -1 en la sangre), y estado proinflamatorio (por ejemplo proteína C-reactiva elevada en la sangre).

Los individuos con el síndrome metabólico tienen un riesgo incrementado de padecer cardiopatía coronaria y otras enfermedades relacionadas con otras manifestaciones de arterieesclerosis (por ejemplo apoplejía y enfermedad vascular periférica). Parece que los factores de riesgo subyacentes dominantes para este síndrome son la obesidad abdominal.

Sin desear quedar vinculado a teoría alguna particular, se cree que los compuestos de la invención actúan como agonistas duales GluGLP-1. El agonista dual combina el efecto de glucagón sobre el metabolismo de las grasas con los efectos de GLP-1 sobre la ingesta de alimento. Por lo tanto, podrían actuar de un modo sinérgico para acelerar la eliminación de un depósito de grasa excesivo e inducir una pérdida de peso sostenible.

El efecto sinérgico de los agonistas GluGLP-1 duales también puede dar como resultado la reducción de los factores de riesgo cardiovasculares tales como el colesterol y LDL altos, lo que puede ser completamente independiente de su efecto sobre el peso corporal.

Por lo tanto, los compuestos de la presente invención se pueden usar como agentes farmacéuticos para evitar la ganancia de peso, promover la pérdida de peso, reducir el exceso de peso corporal o tratar la obesidad (por ejemplo, por el control del apetito, la alimentación, ingesta de alimento, ingesta calórica y/o gasto energético), incluyendo obesidad mórbida, así como enfermedades asociadas y afecciones de salud incluyendo, pero sin limitarse a inflamación ligada a obesidad, colecistopatía ligada a obesidad y apnea del sueño inducida por obesidad. Los compuestos de la invención también se pueden usar para el tratamiento de síndrome metabólico, hipertensión, dislipidemia aterogénica, ateroesclerosis, arterioesclerosis, cardiopatía coronaria y apoplejía. Todas son afecciones que pueden estar asociadas con la obesidad. Sin embargo, los efectos de los compuestos de la invención sobre estas afecciones se pueden mediar en todo o en parte por medio de un efecto sobre el peso corporal, o puede ser independiente del mismo.

En particular, los compuestos descritos en la presente invención pueden encontrar uso en la prevención de la ganancia de peso o en la promoción de la pérdida de peso con muy poco o ningún efecto sobre la tolerancia a la glucosa. Se ha encontrado que los compuestos descritos tienen un efecto marcado sobre la pérdida de peso con muy poco o ningún efecto sobre el nivel de HbA1c en un modelo animal de control glucémico adecuado.

Por tanto, la invención proporciona el uso de un compuesto de la invención en el tratamiento de una afección como se describe anteriormente, en un individuo que lo necesita.

La invención también proporciona un compuesto de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento médico, en particular para su uso en un proporciona de tratamiento de una afección como se describe anteriormente.

En un aspecto preferente, los compuestos descritos se pueden usar en la prevención de la ganancia de peso o en la promoción de la pérdida de peso.

En una realización específica, la presente invención comprende el uso de un compuesto para evitar la ganancia de peso o promover la pérdida de peso en un individuo que lo necesita.

En una realización específica, la presente invención comprende el uso de un compuesto en un procedimiento de tratamiento de una afección provocada o caracterizada por un exceso de peso corporal, por ejemplo, el tratamiento y/o la prevención de obesidad, obesidad mórbida, obesidad mórbida antes de cirugía, inflamación ligada a obesidad, colecistopatía ligada a obesidad, apnea del sueño inducida por obesidad, hipertensión, dislipidemia aterogénica, ateroesclerosis, arterioesclerosis, cardiopatía coronaria; enfermedad arterial periférica, apoplejía o enfermedad microvascular en un individuo que lo necesita.

En otro aspecto, los compuestos descritos se pueden usar en un procedimiento de disminución de los niveles de LDL en circulación, y/o de incremento de la proporción de HDL/LDL.

En una realización específica, la presente invención comprende el uso de un compuesto en un procedimiento de disminución de los niveles de LDL en circulación, y/o de incremento de la proporción de HDL/LDL en un individuo que lo necesita.

Composiciones farmacéuticas Los compuestos de la presente intención, o las sales de los mismos, se pueden formular como composiciones farmacéuticas preparadas para su almacenamiento o administración, lo que comprende normalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención, o una sal del mismo, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención dependerá de la vía de administración, del tipo de mamífero que se trata y de las características físicas del mamífero específico en consideración. Estos factores y su relación para determinar esta cantidad son muy conocidos para los médicos expertos en las técnicas médicas. Esta cantidad y el procedimiento de administración se pueden adaptar para lograr una eficacia óptima, y puede depender de factores tales como el peso, la dieta, la medicación simultánea y otros factores, bien conocidos por los expertos en las técnicas médicas. Los tamaños de dosificación y el régimen de dosificación más apropiados para un uso en seres humanos pueden estar guiados por los resultados obtenidos por la presente invención, y se pueden confirmar en ensayos clínicos apropiadamente diseñados.

Una dosificación y un protocolo de tratamiento: eficaces se pueden determinar por medios convencionales, comenzando con una dosis baja en animales de laboratorio y a continuación incrementando la dosificación mientras se evalúan los efectos, y también variando sistemáticamente el régimen de dosificación. Se pueden tomar en consideración numerosos factores por un médico cuando se detérmina una dosificación óptima para un sujeto dado. Dichas consideraciones son conocidas por el experto.

El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para un uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). Por ejemplo, se pueden usar solución salina estéril y solución salina tamponada con fosfato a un pH ligeramente ácido o fisiológico. Los agentes de tamponación del pH pueden ser fosfato, citrato, acetato, tr¡s/hidroximetil)am¡nometano (TRIS), ácido N-Tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), bicarbonato de amonio, dietanolamina, histidina, que es un tampón preferente, arginina, lisina, o acetato o mezclas de los mismos. El término abarca adicionalmente cualquier agente enumerado en la Farmacopea de los EE. UU. para su uso en animales, incluyendo seres humanos.

El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal de uno cualquiera de los compuestos. Las sales incluyen sales farmacéuticamente aceptables tales como sales de adición de ácido y sales básicas. Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen sales clorhídricas, sales de citrato y sales de acetato. Ejemplos de sales básicas incluyen sales en las que el catión se selecciona de metales alcalinos, tales como sodio y potasio, metales alcalinotérreos, tales como calcio, e iones amonio +N (R3) 3(R4), en los que R3 y R4 designa independientemente alquilo Ci-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarílo opcionalmente sustituido. Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" ,17a edición. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, EE. UU., 1985 y ediciones más recientes, y en ; Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology.

"Tratamiento" es un enfoque para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio de los síntomas, disminución del alcance de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, que no empeora) de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión (sea parcial o total), sean detectables o indetectables. "Tratamiento" también puede significar la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. "Tratamiento" es una intervención realizada con la intención de evitar el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. En consecuencia, "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico y profiláctico como a medidas preventivas. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya tienen en trastorno así como en los que se va a evitar el trastorno.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en una forma de dosificación unitaria. En dicha forma, la composición se divide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades discretas de las preparaciones, por ejemplo, comprimidos, cápsulas y polvos envasados en viales o ampollas. La forma de dosificación unitaria también puede ser una cápsula, sello o propiamente un comprimido, o puede ser el número apropiado de cualquiera de estas formas envasadas. Se puede proporcionar en una forma inyectable de dosis individual, por ejemplo, en forma de pluma. En determinadas realizaciones, las formas envasadas incluyen una etiqueta o encarte con instrucciones para su uso. Las composiciones se pueden formular para cualquier ruta y medio de administración adecuados. Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen los usados en formulaciones adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica y transdérmica). Las formulaciones se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de farmacia.

Los modos de administración subcutáneo y transdérmico pueden ser particularmente adecuados para los compuestos descritos en el presente documento.

Las composiciones de la invención pueden estar compuestas adicionalmente en, o unidas a, por ejemplo, a través de interacciones covalentes, hidrófobas y electrostáticas, un vehículo de fármaco, un sistema de administración de fármaco y un sistema de administración de fármaco avanzado para potenciar adicionalmente la estabilidad del compuesto, incrementar la biodisponibilidad, incrementar la solubilidad, disminuir los efectos adversos, lograr la cronoterapia bien conocida por los expertos en la técnica, e incrementar el cumplimiento por parte del paciente o cualquier combinación de los mismos. Ejemplos de vehículos, sistemas de administración de fármaco y sistemas de administración de fármaco avanzados, incluyen, pero no se limitan a, polímeros, por ejemplo, celulosa y derivados, polisacáridos, por ejemplo, dextrano y derivados, almidón y derivados, alcohol poli(alcohol vinílico), polímeros de acrilato metacrilato, copolímeros de bloque de ácido poliláctico y poliglicólico de los mismos, polietilenglicoles, proteínas de vehículo, por ejemplo, albúmina, geles, por ejemplo, sistemas termogelificantes, por ejemplo, sistemas copoliméricos de bloque bien conocidos por los expertos en la técnica, micelas, liposomas, microesferas, nanopartículas, cristales líquidos y dispersiones de los mismos, fase L2 y dispersiones de la misma, bien conocidos por los expertos en la técnica de comportamiento de fase en sistemas de lípidos-agua, micelas poliméricas, emulsiones múltiples, auto-emulsionantes, auto-microemulsionantes, ciclodextrinas y derivados de las mismas, y dendrímeros.

Terapia de combinación Como se señala anteriormente, se entenderá que la referencia en lo siguiente a un compuesto de la invención también se extiende a una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo así como a una composición que comprende más de un compuesto diferente de la invención.

Un compuesto de la invención se puede administrar como parte de una politerapia con un agente para el tratamiento de obesidad, hipertensión, dislipidemia o diabetes.

En dichos casos, los dos agentes activos se pueden dar juntos o por separado, como parte de la misma formulación farmacéutica o como formulaciones por separado.

Por tanto, un compuesto o sal del mismo se puede usar adicionalmente en combinación con un agente contra la obesidad, incluyendo, pero sin limitarse a agonista del receptor de péptido de tipo glucagón de tipo 1 , péptido YY o análogo del mismo, antagonista del receptor cannabinoide de tipo 1 , inhibidor de lipasa, agonista del receptor de melanocortina de tipo 4, o antagonista del receptor de la hormona concentradora de melanina de tipo 1.

Se puede usar un compuesto de la invención o sal del mismo en combinación con una agente anti-hipertensión, incluyendo, pero sin limitación a un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, bloqueante del receptor de angiotensina II, diuréticos, beta-bloqueante, o bloqueante del canal de calcio.

Se puede usar un compuesto de la invención o sal del mismo en combinación con un agente de dislipidemia, incluyendo pero sin limitarse a una estatina, un fibrato, un niacina y/o un inhibidor de absorción de colesterol.

Además, se puede usar un compuesto de la invención o sal del mismo en combinación con un agente antidiabético, incluyendo pero sin limitarse a, una metformina, una sulfonilurea, una glinida, un inhibidor de DPP-IV, una glitazona, un agonista de GLP-1 diferente o una insulina. En una realización preferente, el compuesto o sal del mismo se usa en combinación con insulina, inhibidor de DPP-IV, sulfonilurea o metformina, en particular sulfonilurea o metformina, para lograr un control glucémico adecuado. En una realización aún más preferente, el compuesto o sal del mismo se usa en combinación con una insulina o un análogo de insulina para lograr un control glucémico adecuado. Ejemplos de análogos de insulina incluyen pero no se limitan a Lantus, Novorapid, Humalog, Novomix y Actraphane HM.

PROCEDIMIENTOS Síntesis general de análogos de glucagón Se realizó la síntesis peptídica en fase sólida (SPPS) en un sintetizador asistido por microondas usando estrategia de Fmoc estándar en NMP en una resina de poliestireno (TentaGel S Ram). Se usó HATU como reactivo de acoplamiento junto con DIPEA como base. Se usó piperidina (20% en NMP) para la desprotección.

Pseudoprolinas: Fmoc-Phe-Thr(.Ps¡. Me, Me pro)-OH y Fmoc-Asp-Ser(.Psi., Me, Me pro)-OH (adquirida de NovaBiochem) se usaron cuando fue aplicable.

Las abreviaturas empleadas son las siguientes: ivDde: 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexiliden)3-metil-butilo Dde: 1 -(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexil¡den)-etilo DCM: diclorometano DMF: ?/,/V-dimetilformamida DIPEA: diisopropiletilamina EtOH: etanol Et20: dietil éter HATU: /V-óxido de N-[(d¡met¡lam¡no)-1/-/-1 ,2,3-tr¡azol[4,5-¿)]pir¡din-1-¡lmet¡len]- A/-metilmetanaminio hexafluorofosfato MeCN: acetonitrilo NMP: /V-metilpirrolidona TFA: ácido trifluoroacético TIS: triisopropilsilano Escisión: El péptido en bruto se escindió de la resina por tratamiento con TFA/TIS/ agua al 95/2,5/2,5 % (v/v) a t.a. durante 2 h. Para péptidos con una metionina en la secuencia, se usó una mezcla de TFA EDT al 95/5 % (v/v). Se retiró la mayoría del TFA a presión reducida y se precipitó el péptido en bruto y se lavó con dietiléter y se dejó que secara a peso constante a temperatura ambiente.

Síntesis general de análogos de qlucagón acilados Se sintetizó el esqueleto peptídico como se describe anteriormente para la síntesis general de análogos de glucagón, con la excepción de que se aciló en la cadena lateral de un residuo de lisina con el péptido aún unido a la resina y totalmente protegido en los grupos de cadena lateral, excepto la épsilon-amina en la lisina que se va a acilar. Se incorporó la lisina que se va a acilar con el uso de Fmoc-Lys(ivDde)-OH o Fmoc-Lys(Dde)-OH. Se protegió el extremo N terminal del péptido con un grupo Boc usando Boc20 en NMP. Mientras el péptido aún estaba unido a la resina, se escindió selectivamente el grupo desprotector ivDde usando hidrato de hidrazina al 5 % en NMP. A continuación, se acopló en primer lugar la cadena lateral de lisina desprotegida con un aminoácido espaciador de tipo Fmoc-Glu-OtBu, que se desprotegió con piperidina y se aciló con un ácido graso usando metodología de acoplamiento peptídico estándar como se describe anteriormente. De forma alternativa, se puede incorporar la histidina en el extremo N terminal desde el comienzo como Boc-His(Boc)-OH. Se realizó la escisión de la resina y la purificación como se describe anteriormente.

Generación de líneas celulares que expresan receptores de glucagón y GLP-1 humanos Se clonaron el ADNc que codifica el receptor de glucagón humano (glucagón-R) (número de acceso principal P47871) o el receptor del péptido de tipo glucagón 1 humano (GLP-1 R) (número de acceso principal P43220) a partir de los clones de ADNc BC104854 (MGC:132514/IMAGE:8143857) o BC112126 (MGC:138331/IMAGE:8327594), respectivamente. Se amplificó el ADN que codifica el glucagón-R o el GLP-1 -R por PCR usando cebadores que codifican los sitios de restricción terminales para la subclonación. Los cebadores del extremo 5' codificaron adicionalmente una secuencia consenso Kozak próxima para garantizar una traducción eficaz. Se confirmó la fidelidad del ADN que codifica el glucagón-R y el GLP-1-R por secuenciación de ADN. Se subclonaron los productos de¦ PCR que codifican el glucagón-R o el GLP-1-R en un vector de expresión de mamífero que contiene un marcador de resistencia a neomicina (G418).

Se transfectaron vectores de expresión de mamífero que codifican el glucagón-R o el GLP-1 -R en células HEK293 por un procedimiento de transfección de fosfato de calcio estándar. 48 h después de: la transfección, se sembraron las células para la clonación con dilución limitada y se seleccionaron con 1 mg/ml de G418 en el medio de cultivo. Tres semanas después, se escogieron 12 colonias supervivientes de células que expresaban glucagón-R y GLP-1 -R, se propagaron y se sometieron a prueba en los ensayos de eficacia de glucagón-R y GLP:1-R como se describe a continuación. Se eligió un clon de expresión de glucagón-R y un clon de expresión de GLP-1-R para el realizar el perfil del compuesto.

Ensayos de eficacia del receptor de glucaqón y del receptor de GLP-1 Se sembraron células HEK293 que expresan el glucagón-R humano, o el GLP-1 -R humano a 40.000 células por pocilio en placas de microvaloración de 96 pocilios recubiertas con poli-L-lisina al 0,01 % y se hicieron crecer durante 1 día en cultivo en 100 µ? de medio de crecimiento. El día del análisis, se retiró el medio de crecimiento y las células se lavaron una vez con 200 µ? de tampón de Tyrode. Se incubaron las células en 100 µ? de tampón de Tyrode que contenía concentraciones crecientes de los péptidos de prueba, IBMX 100 µ?, y glucosa 6 mM durante hasta 15 min a 37° C. Se detuvo la reacción por la adición de 25 µ? de HCI 0,5 M y se incubó en hielo durante 60 min. Se estimó el contenido en cAMP usando el kit de cAMP FlashPlate® de Perkin-Elmer de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se estimaron las CE50 y eficacias relativas en comparación con los compuestos de referencia (glucagón y GLP-1) por ajuste de curva asistido por ordenador.

Determinación de HbAlc Es posible evaluar el efecto a largo plazo de un compuesto sobre él nivel de glucosa de un sujeto determinando el nivel de hemoglobina A1C (HbAlc). La HbAlc es una forma glucosilada de hemoglobina con un nivel en una célula que refleja el nivel promedio de glucosa al que se ha expuesto la célula durante su tiempo de vida. En ratones, la HbAlc es un biomarcador relevante para el nivel de glucosa en sangre promedio durante las 4 semanas precedentes, debido a que la conversión a HbAlc está limitada por la duración de los eritrocitos, de aproximadamente 47 días (Abbrecht y Littell, 1972; J. Appl. Physiol. 32, 443-445).

La determinación de HbAlc se basa en el inmunoensayo de inhibición turbidimétrico (TINIA) en el que la HbAlc en la muestra reacciona con anti-HbA1c para formar complejos antígeno-anticuerpo solubles. Las adiciones de polihaptenos reaccionan con los anticuerpos anti-HbA1c en exceso para formar un complejo anticuerpo-polihapteno insoluble, que se puede medir turbidimétricamente. La hemoglobina liberada en la muestra hemolizada se convierte en un derivado que tiene un espectro de absorción característico, que se mide bicromáticamente durante las fases de preincubación. El resultado final se expresa como un porcentaje de HbA1c de la hemoglobina total (nota de aplicación A1C-2 de Cobas®).

Determinación del nivel de colesterol El ensayo es un procedimiento colorimétrico enzimático. En presencia de iones de magnesio, el sulfato de dextrano forma selectivamente complejos solubles en agua con LDL, VLDLA y quilomicrones, que son resistentes a enzimas modificadas por PEG. El colesterol HDL se determina enzimáticamente por colesterol esterasa colesterol oxidasa acopladas con PEG a los grupos amino. Los ésteres de colesterol se dividen cuantitativamente en colesterol libre y ácidos grasos. El colesterol HDL se oxida enzimáticamente a coles-4-en-3-ona y H2O2, y el H2O2 formado se mide colorimétricamente (Cobas®; nota de aplicación HDLC3).

La determinación directa de LDL aprovecha la solubilización micelar selectiva de LDL por un detergente no iónico y la interacción de un compuesto de azúcar y lipoproteínas (VLDL y quilomicrones). La combinación de un compuesto de azúcar con detergente permite la determinación selectiva de LDL en plasma. El principio de prueba es el mismo que el del colesterol y HDL, pero debido al azúcar y al detergente sólo los ésteres de LDL-colesterol se dividen en colesterol libre y ácidos grasos. A continuación, el colesterol libre se oxida y el H202 formado se mide colorimétricamente (nota de aplicación LDL_C, Cobas®).

Dianas de GPCR-B sometidas a prueba Receptores para: Péptido relacionado con el gen de la calcitonina tipo 1 (CGRP1), factor de liberación de corticotropina de tipo 1 y 2 (CRF1 y CRF2), polipéptido inhibidor gástrico (GIP), péptido de tipo glucagón 1 y 2 (GLP-1 y GLP-2, glucagón (GCGR), secretina, hormona de liberación de gonadotropina (GnRH), hormona paratiroidea de tipo 1 y 2 (PTH1 y PTH2), péptido intestinal vasoactivo (VPAC1 y VPAC2).

Diseño de ensayo para otros receptores de clase B Se obtuvieron determinaciones de la activación en porcentaje de agonista evaluando los compuestos de muestra (análogos de glucagón) y referenciando el control de Emáx para cada perfil de GPCR. Se obtuvieron las determinaciones de inhibición en porcentaje de antagonista evaluando los compuestos de muestra y referenciando los pocilios de CE80 de control para cada perfil de GPCR. Se realizaron las muestras usando un protocolo de ensayo de "adición doble" para la serie de ensayos de agonista y antagonista. El diseño de protocolo es el siguiente: SOLUCIÓN MADRE MAESTRA PARA LA PREPARACIÓN DEL COMPUESTO A menos que se especifique de otro modo, se diluyeron los compuestos de muestra en DMSO anhidro al 100% incluyendo todas las diluciones. Si se proporciona el compuesto de muestra en un disolvente diferente, se realizan dotas las diluciones madre maestras en el disolvente específico. Todos los pocilios de control contenían concentraciones finales de disolvente idénticas que los pocilios del compuesto de pruebas.

PLACA DE COMPUESTO PARA EL ENSAYO Se transfirieron los análogos de glucagón desde una solución madre maestra a una placa hija que se usó en el ensayo. Se diluyó cada compuesto de muestra en tampón de ensayo (1x HBSS con HEPES 20mM y Probenecid 2,5 mM) a una concentración apropiada para obtener las concentraciones especificadas finales. FORMATO DE ENSAYO DEL AGONISTA DEL ENSAYO DE FLUJO DE CALCIO Se plaquearon los análogos de glucagón en duplicado a 100 nM y 1 nM. Las concentraciones descritas aquí reflejan las concentraciones finales de los compuestos durante el ensayo de antagonista. Los agonistas de referencia se manipularon como se menciona anteriormente sirviendo como control de ensayo. Los agonistas de referencia se manipularon como se describe anteriormente para Emáx. Se leyó el ensayo durante 90 segundos usando FLIPRTETRA FORMATO DE ENSAYO DE ANTAGONISTA Usando los valores de CE80 determinados previamente, se estimularon todos los pocilios de antagonista (si era aplicable) de referencia y de compuesto de muestra preincubados con CEso de agonista de referencia.

Se leyó durante 180 segundos usando FLIPRTETRA (esta adición añadió agonista de referencia a los respectivos pocilios), después se recogieron las medidas de fluorescencia para calcular los valores de C o.

PK en macacos de Java Se dosificaron macacos de Java (macho, N=2) con 20 nmol de compuesto 6/kg i.v. y 20 nmol de compuesto 6/kg s.c. como dosis individual el día 1 y el 8, respectivamente. Se retiraron muestras de plasma en los siguientes puntos temporales; predosis, 5, 10, 30 min, 1 , 2, 4, 8, 12, 24 y 36 h de dosificación post i.v. y predosis,10, 30 min, 1 , 2, 4, 8, 12, 24, 36 y 48 h de dosificación post s.c. El vehículo consistió en solución salina tamponada con fosfato 25 mM a pH 7.4 (fosfato de sodio 25 mM, NaCI 25 mM). Se analizaron las muestras de plasma usando precipitación de proteínas seguido de extracción de fase sólida y análisis CL-EM/EM. Se calcularon los parámetros farmacocinéticos usando análisis no compartimental en WinNonLin versión 4.1.

Efecto de la administración subcutánea a las 6 semanas del compuesto 6 de agonista de Glu-GLP-1 sobre HbA1c en ratones db/db Se obtuvieron ratones macho db/db (BKS.Cg-m +/+ Lep^tt), de 5-6 semanas de edad, de Charles River Laboratories, Alemania, y se aclimataron en su nuevo entorno con libre acceso a pienso normal y agua. Se estratificaron los animales en grupos con HbA1c promedio similar y se trataron dos veces al día s.c. con el compuesto 6 (1 , 2,5 y 5 nmol/kg) o vehículo durante seis semanas. En todo el estudio, se registraron los pesos corporales diariamente y se usaron para administrar las dosis corregidas con el peso corporal del péptido. Se midieron los niveles de HbA1c en muestras de sangre antes del tratamiento, y una vez a la semana durante el estudio. Inmediatamente después de la obtención de la muestra de sangre final, se sacrificaron todos los animales.

Efecto del tratamiento de tres semanas con el compuesto 6 de agonista Glu-GLP-1 dual sobre la tolerancia a la glucosa v el peso corporal en ratones con obesidad inducida por dieta (dieta de alto contenido en grasas de 30 semanas).

Se aclimataron ratones macho C57BI/6J, de 6 semanas de edad, en su nuevo entorno con libre acceso a dieta de alto contenido en grasas y agua. Se aleatorizaron los animales, de 36 semanas de edad en grupos con glucosa en sangre de ayuno promedio (6 horas) similar (evaluada a partir de muestras de sangre tomadas en la punta de la cola). Los ratones se trataron dos veces al día s.c. durante tres semanas con el compuesto 6 o el vehículo. El peso corporal se registró diariamente. Después del tratamiento peptídico, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) después ¡de someter a los animales a un ayuno de 6 horas. Se dosificaron los animales con péptido o vehículo por la mañana. Aproximadamente cuatro horas más tarde, se tomó una muestra de sangre inicial (nivel de glucosa en sangre en ayuno). A continuación, se dio una dosis oral de glucosa y se devolvieron los animales a sus jaulas de origen (t = 0). Se midió la BG a t=15 min, t=30 min, t=60 min, t=90 min y t=120 min. Se sacrificaron todos los animales de inmediato después de la obtención de la muestra de sangre por anestesia con CO2 seguido de dislocación cervical.

La invención se ilustra además con los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 : Eficacia sobre los receptores de glucagón y GLP-1 N.° de SEC ID GLP-1 R GluR ComN.°: CE50 CE50 puesto Secuencia (nM) (nM) 1 4 H- 0,06 0,06 HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLSA- NH2 2 5 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWL- 3,09 0,81 K(Hexadecanoil-isoGlu)-SA-NH2 3 6 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRA- 0,64 0,60 K(Hexadecanoil-isoGlu)-DFIEWLLSA-NH2 4 7 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLL- 0,31 0,25 K(Hexadecanoil-isoGlu)-A-NH2 5 8 H-HSQGTFTSDYSKYLD-K(Hexadecanoil- 0,35 0,19 isoGlu)-RRAKDFIEWLLSA-NH2 6 H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(Hexadecanoil- 0,13 0,16 9 isoGlu)-RAKDFIEWLLSA-NH2 7 10 H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE- 0,10 0,16 K(Hexadecanoil-isoGlu)-RAKDFIEWLLSA- NH2 Tabla 1 : Los valores de CE50 se midieron como se describe anteriormente Ejemplo 2. Estudio farmacocinético después de la administración subcutánea e intravenosa en el mono Se dosificó el compuesto 6 a monos para someter a prueba la farmacocinética y la biodisponibilidad después de la administración subcutánea, que es la vía destinada en seres humanos. El compuesto 6 mostró una biodisponibilidad de un 43% ± 8,1 , t½ de 8,2 h + 2,0 y tmáx entre 4 y 8 h. Probablemente el perfil farmacocinético del compuesto 6 predice la exposición constante sobre CE50 en ambos receptores de glucagón y GLP-1 en seres humanos después de una administración al día de una dosis factible por la vía subcutánea.

Ejemplo 3: Efecto de la administración subcutánea a las 6 semanas del compuesto 6 de agonista de Glu-GLP-1 sobre HbA1c en ratones db/db Se inyectaron los animales s.c. con 100 µ? de vehículo (una vez al día) durante un periodo de tres días para aclimatar los animales a la manipulación y a las inyecciones. Se aleatorizaron los animales en grupos con HbA1c promedio similar. A continuación, se trataron los ratones dos veces al día s.c. con el compuesto 6 (1 , 2,5 ó 5 nmol/kg) o el vehículo. Antes del tratamiento y una vez a la semana durante seis semanas de tratamiento, se tomaron muestras de sangre del plexo venoso retroorbital.

Se analizaron las muestras de sangre para HbA1c usando el analizador c111 de Cobas (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Se analizaron las muestras para el análisis de HbA1c dentro de las 24 horas del muestreo.

En todo el estudio, se registraron los pesos corporales diariamente y se usaron para administrar las dosis corregidas con el peso corporal del péptido. Se prepararon soluciones de inmediato antes de la dosificación.

Como se esperaba a partir del modelo de ratón db/db, se observó un incremento de HbA1c con el tiempo (Fig1). Durante las seis semanas de tratamiento, se observó un incremento de un 27 % de HbA1c en el grupo de vehículo.

El compuesto 6, en todas las dosis, no redujo, en ningún punto temporal, el incremento de HbA1c visto con el tiempo en animales trataros con el vehículo (Fig.1 ).

Durante el tratamiento de seis semanas, se observó un incremento de un 22% en el peso corporal en el grupo de vehículo. El compuesto 6 (5 nmol/kg) disminuyó significativamente la ganancia de peso corporal en comparación con el vehículo (p<0,0001 , Fig.2).

Se investigó el efecto del tratamiento de seis semanas con el compuesto 6 de agonista de Glu-GLP-1 dual sobre el control glucémico evaluado por HbA1c en ratones db/db.

El modelo de ratón db/db, como se esperaba, mostró un incremento de HbA1c con el tiempo. El tratamiento con el compuesto 6 durante seis semanas no redujo significativamente el incremento de HbA1c visto con el tiempo en ratones db/db tratados con vehículo.

El tratamiento con el compuesto 6 (5 nmol/kg) durante seis semanas redujo significativamente el incremento en el peso corporal visto con el tiempo en ratones db/db tratados con vehículo.

Ejemplo 4: Efecto de la administración subcutánea de 3 semanas del compuesto 6 de agonista Glu-GLP-1 dual sobre la tolerancia a la glucosa oral y el peso corporal en ratones C57BL/6J con obesidad inducida por dieta (dieta de alto contenido en grasas de 6 meses) Peso corporal El compuesto 6 disminuyó un 38,7 % el peso corporal (p<0,05) (Fig.3). De forma interesante, el peso corporal obtenido por los animales alimentados con alto contenido en grasas tratados con el compuesto 6 durante tres semanas se estabilizó al mismo peso corporal obtenido por los animales de control no tratados en una dieta de pienso regular (Fig.3).

OGTT (prueba de tolerancia a la glucosa oral) El tratamiento con el compuesto 6 durante tres semana no tuvo un efecto significativo sobre la tolerancia a la glucosa (medido como disminución en ABC) (Fig. 4).

El compuesto 6 disminuyó significativamente el peso corporal en ratones con obesidad inducida por dieta (dieta de alto contenido en grasas de 30 semanas) hasta un nivel al visto en los animales de control no tratados en una dieta de pienso regular (Fig. 3). El efecto del compuesto 6 disminuyó significativamente la glucosa en sangre en ayuno. El compuesto 6 no incrementó significativamente la tolerancia a la glucosa oral.

Estas diferencias en la pérdida de peso y el tratamiento de la glucosa podrían reflejar la potencia (tabla 1) y/o la exposición en el receptor de GLP-1 del compuesto 6 de agonista Glu-GLP-1. La diferencia también podría estar relacionada con diferencias entre GLP-1 y los análogos de GLP-1 y los agonistas de Glu-GLP-1 en el mecanismo de acción. Se sabe que exendina-4 y otros análogos de GLP-1 regulan la glucosa en sangre por medio de la estimulación de la secreción de insulina dependiente de glucosa, inhibición de vaciado gástrico, e inhibición de secreción de glucagón. Además de los efectos tales como los del receptor de GLP-1 , el compuesto 6 también se une y activa el GluR (véase la tabla 1).

En ratones con obesidad inducida por dieta, el compuesto 6. disminuye significativamente el peso corporal. El compuesto 6 no mejoró la tolerancia a la glucosa medida durante una prueba de tolerancia a la glucosa oral.

Ejemplo 5: Efecto de la administración subcutánea de 3 semanas del compuesto 6 de agonista Glu-GLP-1 sobre lípidos en ratones alimentados con una dieta con alto contenido en grasas de 30 semanas.

Efecto del tratamiento de 3 semanas de ratones que han estado con una dieta de alto contenido en grasas durante 30 semanas antes del tratamiento (s.c.) con vehículo (PBS), 10 nmol/kg de exendina-4 o 10 nmol/kg de compuesto 6 dos veces al día durante 3 semanas sobre lípidos (figura 5). Se midió el efecto sobre LDL, HDL y triglicéridos (CHO: Colesterol total; HDL: Colesterol de alta densidad; LDL: Colesterol de baja densidad; TRIG: Triglicéridos; HDL/LDL: Proporción entre HDL y LDL).

El compuesto 6 demostró que disminuyó significativamente el colesterol total, HDL, LDL (P < 0,001) y los triglicéridos (P < 0,05), mientras que la proporción de HDL/LDL se incrementó significativamente (p < 0,001) (Fig. 5). Se considera que la proporción de HDL/LDL es un indicador de riesgo para la cardiopatía. Cuanto mayor sea la proporción, menor es el riesgo de infarto de miocardio u otros problemas cardiovasculares.

Ejemplo 6: Selección inversa del compuesto 6 contra receptores de CGRP y otros receptores Se sometió a prueba el compuesto 6 para determinar su actividad agonista y antagonista contra el péptido relacionado con el gen de la calcitonina de tipo 1 (CGRP1), el factor de liberación de corticotropina de tipo 1 y 2 (CRF1 y CRF2), polipéptido inhibidor gástrico (GIP), péptido de tipo glucagón 1 y 2 (GLP-1 y GLP-2, glucagón (GCGR), secretina, hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), hormona paratiroidea de tipo 1 y 2 (PTH1 y PTH2), péptido intestinal vasoactivo (VPAC1 y VPAC2) a 1 (1 ,25), 100 (125) y 10.000 (12.500) nM.

Se observó la actividad agonista contra los siguientes receptores: Receptor de GLP-1 : el compuesto 6 mostró actividades agonistas a 12,5 µ? y 125 nM Receptor de glucagón: el compuesto 6 mostró actividades agonistas a 12,5 µ? y 125 nM Se observó actividad antagonista contra los siguientes receptores: Receptor de CRF2: El compuesto 6 mostró actividad antagonista a 10 µ? Receptor de GIP: El compuesto 6 mostró actividad antagonista a 10 µ? y 100 nM Receptor de secretina: El compuesto 6 mostró actividad antagonista a 10 µ?.

Ejemplo 7: El efecto de los compuestos 6 y 7 sobre la ganancia de peso corporal en ratones C57BL/6J alimentados con alto contenido en grasas.

Se aclimataron ratones C57BL/6J en su nuevo entorno con acceso libre a dieta de alto contenido en grasas y agua. A continuación, se trataron los ratones dos veces al día s.c. con el compuesto 6 y el compuesto 7 (a las dos dosis: 0,5 y 5 nmol/kg) o con el vehículo durante 10 días. En todo el estudio, se registraron los pesos corporales diariamente y se usaron para administrar las dosis corregidas con el peso corporal del péptido (fig. 6). Se sacrificaron los ratones por dislocación cervical.

El compuesto 6 y el compuesto 7 disminuyeron significativamente la ganancia de peso corporal en ambas dosis (0,5 y 5 nmol/kg) en ratones C57BL/6J alimentados con alto contenido en grasas.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene la fórmula R1-X-Z-R2 caracterizado porque R1 es H, alquilo C^, acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; R2 es OH o NH2; X es un péptido que tiene la fórmula I: His-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-X27-X28-X29 (I) en la que X2 está seleccionado de Ser y Aib; X16 está seleccionado de Glu e Y; X17 está seleccionado de Arg e Y; X20 está seleccionado de Lys e Y; X27 está seleccionado de Leu e Y; X28 está seleccionado de Ser e Y o está ausente; X29 es Ala o está ausente; en la que al menos uno de X16, X17, X20, X27 and X28 es Y; en la que cada residuo Y está seleccionado independientemente de entre Lys, Cys y Orn; en la que la cadena lateral de al menos un residuo aminoacídico Y de X está conjugada con un sustituyente lipófilo que tiene la fórmula: (i) Z en la que Z1 es un resto lipófilo conjugado directamente con la cadena lateral de Y; o (ii) Z1Z2, en la que Z es un resto lipófilo, Z2 es un espaciador, y Z1 está conjugado con la cadena lateral de Y por medio de Z2¡ y Z está ausente o es una secuencia de 1-20 unidades de aminoácidos seleccionados independientemente del grupo que consiste en Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Cys, Glu, Lys, Arg, Dbu, Dpr y Orn; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado poque tiene la secuencia HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLKSA HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLSA HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLKA HSQGTFTSDYSKYLDKRRAKDFIEWLLSA HSQGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA o H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA.

3. El compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque dicho sustituyente lipófilo está unido a residuos aminoacídico en la posición 16, 17, 20, 27 ó 28.

4 El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque R1 es H.

5. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque R2 es NH2.

6. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque tiene la secuencia H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWL-K(Hexadecanoil-isoGlu)-SA -NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRA-K(Hexadecanoil-isoGlu)-DFIEWLLSA -NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLL-K(Hexadecanoil-isoGlu)-A -NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLD-K(Hexadecanoil-isoGlu)-RRAKDFIEWLLSA -NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(Hexadecanoil-isoGlu)-RAKDFIEWLLSA -NH2 o H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(Hexadecanoil-isoGlu)-RAKDFIEWLLSA-NH2.

7. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque una o más de las cadenas laterales de aminoácidos en el compuesto está conjugada con un resto polimérico.

8. El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterzado porque una o más de las cadenas laterales de aminoácidos en el péptido X está conjugada con un resto polimérico.

9. Una composición, caracterizada porque comprende un compuesto de como el que se reclama en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal o derivado del mismo; en mezcla con un vehículo.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la composición es una composición farmacéuticamente aceptable, y el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en un procedimiento de tratamiento médico.

12. El compuesto de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en un procedimiento de prevención de ganancia de peso o promoción de la pérdida de peso en un individuo que lo necesita.

13. El compuesto de conformidad con cualquier de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en un procedimiento de disminución de los niveles de LDL en circulación, y/o de incremento de la proporción de HDL/LDL en un individuo que lo necesita.

14. El uso de un compuesto como el que se reclama en cualquiera de las reivindicacionesl a 8, en un procedimiento de tratamiento de una afección provocada o caracterizada por un exceso de peso corporal.

15. El uso de un compuesto como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en un procedimiento de tratamiento y/o prevención de obesidad, obesidad mórbida, obesidad mórbida antes de cirugía, inflamación ligada a obesidad, colecistopatía ligada a obesidad, apnea del sueño inducida por obesidad, hipertensión, dislipidemia aterogénica, ateroesclerosis, arterieesclerosis, cardiopatía coronaria, enfermedad arterial periférica, apoplejía o enfermedad microvascular en un individuo que lo necesita.

16. El compuesto, uso o procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque el compuesto es administrado como parte de un tratamiento de combinación junto con un agente para el tratamiento de obesidad, dislipidemia o hipertensión.

17. El compuesto, uso o procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el agente para el tratamiento de la obesidad es el agonista del receptor del péptido de tipo glucagón 1 , agonista del receptor del péptido YY o análogo del mismo, antagonista del receptor cannabinoide de tipo 1 , inhibidor de lipasa, agonista del receptor de melanocortina de tipo 4, o antagonista del receptor de la hormona concentradora de melanina de tipo 1.

18. El compuesto, uso o procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el agente para el tratamiento de hipertensión es un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, bloqueante del receptor de angiotensina II, diurético, beta-bloqueante o bloqueante del canal de calcio.

19. Un compuesto, uso o procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el agente para el tratamiento de dislipidemia es una estatina, un fibrato, una niacina y/o un inhibidor de la absorción del colesterol.