TW201202265A - Glucagon analogues - Google Patents

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201202265 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於升糖素類似物及其例如在治療過量食物攝 入、肥胖症及超重中的醫藥用途，而對血糖控制無影響或 僅有極小影響。 【先前技術】 前升糖素原為158個胺基酸前驅體多肽，其在組織中差 異化加工以形成許多結構相關之升糖素原衍生肽，包括升 糖素（Glu)、升糖素樣肽-l(GLP-l)、升糖素樣肽-2(GLP-2) 及調酸素（oxyntomodulin，OXM)。該等分子牵涉於多種生 理功能中，包括葡萄糖穩定、胰島素分泌、胃排空及腸生 長、以及食物攝入調節。 升糖素為對應於前升糖素原之胺基酸53至81的29 -胺基 酸肽，且具有序列出3-86卜〇1!1-017-1'111'邛116-1'11卜86卜八8?-

Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO: 1) » 調酸素 (OXM)為包括具有八肽羧基末端延伸（前升糖素原之胺基 酸 82 至 89 ’ 具有序列 Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala(SEQ ID NO: 2))之升糖素的完整29個胺基酸序列之37 個胺基酸肽且稱作「插入肽1」或IP_ 1 ;人類調酸素之全 序列因此為出3-861*-0111-017-1'111*-?116-1'111>-861>八3卩-丁丫1*-861·-

Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala) (SEQ ID NO: 3)。GLP-1之主要生物活性片段以對應於前 156944.doc 201202265 升糖素原之胺基酸98至127的30-胺基酸C-末端醯胺化肽形 式產生。 升糖素藉由結合至肝細胞上之升糖素受體，使得肝臟經 由肝糖分解釋放葡萄糖（以糖原形式儲存）而有助於維持血 液中之葡萄糖含量。當該等儲存耗盡時，升糖素刺激肝臟 藉由葡糖新生合成其他葡萄糖。該葡萄糖釋放至血流中， 預防發展低血糖症。 OXM響應食物攝取而釋放至血液中且與膳食熱量含量成 正比。已表明OXM抑制食您且抑制人類之食物攝入（Cohen A » Journal of Endocrinology and Metabolism, 88, 4696-4701, 2003 ; WO 2003/0223 04)。除類似於GLP-1之彼等厭 食作用以外，OXM亦必然藉由另一機制影響體重，此係因 為經調酸素處理之大鼠與成對餵養之大鼠相比展示較少之 體重增加（Bloom，Endocrinology 2004, 145, 2687)。用 OXM 處理肥胖齧齒動物亦改善其葡萄糖耐受性（Parlevliet等 人，Am J Physiol Endocrinol Metab，294, E142-7，2008)且 抑制體重增加（WO 2〇03/0223〇4)。 OXM活化升糖素及GLP-1受體兩者，其對於升糖素受體 之效能高出GLP-1受體兩倍，但對於其各別受體之效能不 如天然升糖素及GLP-1。人類升糖素亦能夠活化兩種受 體，但升糖素受體更佳於GLP-1受體。另一方面，GLP-1 不能活化升糖素受體。調酸素之作用機制尚未完全瞭解。 特定而言，不知道激素之某些肝外作用係經由GLP-1及升 糖素受體介導，亦或經由一或多種未識別之受體介導。 156944.doc 201202265 已顯示其他肽結合並活化升糖素及GLP-1受體兩者 (Hjort等人，Journal of Biological Chemistry, 269，30121-30124，1994)且抑制體重增加及減少食物攝入（WO 2006/134340、WO 2007/100535、WO 2008/10101、WO 2008/152403、WO 2009/155257及 WO 2009/155258)。 肥胖症被歸為漸增的全球性健康問題，其與各種疾病相 關，特定而言為心血管疾病（CVD)、2型糖尿病、阻塞性睡 眠呼吸暫停、某些類型之癌症及骨關節炎。因此’已發現 肥胖症縮短預期壽命。根據世界衛生組織（World Health Organization)2005年之預測，全世界範圍有4億成人（年齡 >15)被歸為肥胖。在美國（US)，咸信肥胖症現為繼吸菸之 後可預防性死亡之第二主要原因。 肥胖症的增加使得糖尿病增加’且患有2型糖尿病之人 中約90%可歸為肥胖。全世界範圍内有2億4千6百萬人患 糖尿病，且截至2025年預計將有3億8千萬人患糖尿病。許 多人具有其他心血管風險因素，包括高/異常LDL及三酸甘 油醋症及低HDL。 因此，在醫學中急切需要治療肥胖症。 【發明内容】 本發明提供一種具有式I^-X-Z-R2之化合物，其中： R1為H、C丨.4烷基、乙醯基、曱醯基、苄醯基或三氟乙 醯基； R2 為 OH 或 NH2 ; X為具有式I之狀： 156944.doc 201202265

His-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-X16-X17-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-X27-X28-X29(I)， 其中= X2係選自Ser及Aib ; X16係選自Glu及Y ; X17係選自Arg及Y ; X20係選自Lys及Y ; X27係選自Leu及Y ; X28係選自Ser及Y或不存在； X29為Ala或不存在； 其中X16、X17、X20、X27及X28中之至少一者為Y; 其中每一殘基Υ獨立地選自Lys、Cys及Or η ; 其中X之至少一個胺基酸殘基Υ之側鏈與具有下式之親 脂性取代基結合： (i) Ζ1，其中Ζ1為與X之側鏈直接結合之親脂性部分；或 (ii) Z^2，其中Z1為親脂性部分，Z2為間隔基且Z1經由 Z2與X之側鏈結合； 且Z不存在或為1-20個選自由Ala、Leu、Ser、Thr、 Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr及 Orn組成之群之胺 基酸單元的序列； 或其醫藥學上可接受之鹽。 在一實例中，X可具有序列：

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HSQGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA。 ' 在一些實施例中，該親脂性取代基連接至位置16、17、 20 、 27或28 ° 舉例而言，本發明化合物可具有序列： H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWL-K(十六烷醯基-異 G1u)-SA-NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRA-K(十六烧醯基-異 Glu)-DFIEWLLSA-NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLL-K(十六烧醯 基-異 G1u)_A-NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLD-K(十六烷醯基-異 Glu)-RRAKDFIEWLLSA-NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷醯基-異 Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2 ‘ H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷醯基-異 Glu)- - RAKDFIEWLLSA-NH2。 本發明另外提供一種編碼本發明化合物之核酸（其可為 DNA或RNA)、包含該核酸之表現載體及含有該核酸或表 現載體之宿主細胞。 在另一態樣中，本發明提供一種包含如本文所定義之升 156944.doc 201202265 糖素類似物狀或其鹽或衍生物、編碼該升糖素類似物肽之 核酸、包含該核酸之表現載體或含有該核酸或表現載體之 百主細胞與載劑混合之組合物。在較佳實施例中，組合物 為醫藥學上可#受之組合物且制為冑藥學上可接受之載 劑。升糖素肽類似物可為升糖素類似物之醫藥學上可接受 之酸加成鹽。 在又一態樣中，本發明提供一種用於醫學治療方法中之 組合物》 發現所述化合物可用於預防增重或促使減重。「預防」 意謂在與不存在治療相比時抑制或減少增重，且未必意謂 完全停止增重。肽可使得食物攝入減少及/或能量消耗增 加，得到所觀察的對體重之影響。與本發明化合物對體重 之影響無關，本發明化合物可對循環膽固醇含量具有有利 影響，旎夠降低循環LDL含量並提高HDL/LD]L比率。因 此，本發明化合物可用於由超重引起或以其為特徵之任何 病狀的直接或間接療法，諸如治療及/或預防肥胖症、病 態肥胖症、肥胖症相關之炎症、肥胖症相關之膽囊疾病、 肥胖症誘發之睡眠呼吸暫停4亦可用於㈣代謝症候 群问血壓、致動脈粥樣硬化性血脂異常、動脈粥樣硬 化、動脈硬化、冠心病或中風。本發明化合物在該等病狀 中之作用可為其對體重作用之結果或與此相關聯，或可與 此無關。 在較佳態樣中，發現所述化合物可用於預防增重或促 使減重而對血糖控制無影響或僅有極小影響。本發明中已 156944.doc 201202265 發現，所述化合物在充分確立之動物模財對》咸重具有明 顯作用而對HbAlc含量無影響或僅有極小影響。 如已描述，本發明係關於包含上述核酸序列視情況與指 導其表現之序列組合之表現載體，及含有該等表現載體之 宿主細胞。較佳地，宿主細胞能夠表現及分泌本發明化合 物。在又一態樣中，本發明提供一種產生該化合物之方 法，该方法包含在適合表現該化合物及純化由此產生之化 合物之條件下培養宿主細胞。 本發明另外提供一種本發明之核酸、本發明之表現載體 或能夠表現及分泌本發明化合物之宿主細胞，其係用於醫 學治療方法中。應瞭解，核酸、表現載體及宿主細胞可用 於治療本文所述可由該等化合物本身治療之任何病症。除 非文中另作要求，否則包含本發明化合物之治療組合物、 本發明化合物之投藥或其任何治療用途因此應解釋為涵蓋 本發明之核酸、表現載體或宿主細胞之等效用途。 【實施方式】 在本說明書中’對於天然產生之胺基酸使用習知的一個 字母及三個字母編碼，以及對於其他胺基酸使用通常接受 之三個字母編碼’諸如Aib(a_胺基異丁酸）、〇rn(鳥胺 酸）、Dbu(2,4_二胺基丁酸）及Dpr(2,3-二胺基丙酸）。 術語「天然升糖素」係指具有序列11-出3-86卜0111-017-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-OH(SEQ ID NO: 1)之天然人類升糖素。 156944.doc 201202265 本發明提供如上文所定義之化合物。為避免疑義，在本 文乂供之定義中，X之序列通常意欲僅在表述允許變化之 彼等位置處不同於式Ϊ。序列X中之胺基酸可被視為以習知 之N末端至C末端方向自1至29連續編號。因此，關於X内 之「位置」應解釋為天然人類升糖素及其他分子内所提及 之位置。 本發明化合物可帶有肽序列X内之一或多個分子内橋。 每一該橋形成於一般在X之線性序列中由三個胺基酸分隔 之X的兩個胺基酸殘基之側鏈之間（意即在胺基酸A與胺基 酸A+4之間）。 更特定而言，該橋可形成於殘基對12與16、16與2〇、17 與21、20與24或24與28之側鏈之間。兩個側鏈可經由離子 型相互作用或藉由共價鍵彼此連接。因此，該等殘基對可 包含帶相反電荷之側鍵以藉由離子型相互作用形成鹽橋。 舉例而言，殘基之一者可為Glu或Asp，而另一者可為Lys 或Arg。Lys與GIU及Lys與Asp之配對亦能夠反應以形成内 醯胺環。同樣，Tyr與Glu或Tyr與Asp能夠形成内酯環。 不希望受任何特定理論限制，咸信該等分子内橋使分子 之《螺旋狀結構穩定且因此提高GLpq受體處以及可能的升 糖素受體處之效能及/或選擇性。不希望受任何特定理論 限制，天然升糖素之位置17及18處之精胺酸殘基似乎提供 對於升糖素受體之明顯選擇性。 不希望受任何特定理論限制，天然升糖素之位置27、28 及29處之殘基似乎提供對於升糖素受體之明顯選擇性。關 156944.doc 201202265 於天然升糖素序列，該等位置之一處、兩處或所有三處之 取代可提高對於GLP-丨受體之效能及/或選擇性，可能不會 顯著降低升糖素受體處之效能。特定實例包括位置27處之 Leu、位置2S處之Ser及位置μ處之Aia。 對位置27處天然產生之Met殘基之取代（例如，以或

Lys取代，尤其以Leu取代）亦降低氧化可能性，因此提高 化合物之化學穩定性。 對位置28處天然產生之Asn殘基之取代（例如由3^、Arg 或Ala取代）亦降低酸性溶液中之去醯胺之可能性，因此提 高化合物之化學穩定性。 亦可藉由引入可能形成兩性螺旋狀結構之殘基來提高 GLP-1受體處之效能及/或選擇性，而升糖素受體處之效能 可能無明顯損失。此可藉由在位置16、2〇、24及28之一或 多處引入帶電荷殘基來達成。因此，位置16及2〇處之殘基 均可帶電荷，位置16、20及24處之殘基均可帶電荷，或位 置16、20、24及28處之殘基均可帶電荷。例如，位置16處 之殘基可為Ghi或Lys。位置20處之殘基可為Lys。位置24 處之殘基可為Glu ^位置28處之殘基可為Lys。 對位置20及24處天然產生之Gin殘基之一或兩者之取代 亦降低酸性溶液中去醯胺之可能性，因此提高化合物之化 學穩定性。 以帶電荷胺基酸取代位置16、17、20、27及28處之一或 夕個天然產生之胺基酸使得可與親脂性取代基結合。舉例 而言，位置16、17、20、27及28處之殘基可為Cys、〇„!或 156944.doc 201202265

Lys »更特定而言，位置16、17、20、27及28處之一或多 個殘基可為Cys。此外，位置16、17、20、27及28處之一 或多個殘基可為Lys。 例如，如W099/46283中所述，化合物可包含具有1至20 個胺基酸之C-末端肽序列Z，例如以穩定升糖素類似物肽 之構形及/或二級結構，及/或使得升糖素類似物肽更耐酶 促水解。 當存在時，Z表示具有1至20個胺基酸殘基之肽序列，例 如在1至15個之範圍内’更佳在1至1〇個之範圍内，尤其在 1至7個胺基酸殘基之範圍内，例如1、2、3、4、5、6或7 個胺基酸殘基，諸如6個胺基酸殘基。肽序列z中之每一胺 基酸殘基可獨立地選自Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Cys、 Glu、Lys、Arg、Dbu(2,4-二胺基丁酸）、Dpr(2,3-二胺基丙 酸）及Orn(鳥胺酸p胺基酸殘基較佳選自8^、丁111-丁71·、 Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr及〇rn，更佳可排他地選自 Glu、Lys及Cys。上文提及之胺基酸可具有D_*L構型， 但較佳具有L-構型。尤其較佳之序列z為具有四個、五 個、六個或七個連續離胺酸殘基之序列（意即Lys3、[”4、 Lyss、Lyse或LysJ，且尤其為具有五個或六個連續離胺酸 殘基之序列。Z之其他例示性序列展示於冒〇 〇1/〇4156_ ^ 或者，序列z之c-末端殘基可為Cys殘基。此可有助於化合 物之修飾（例如聚乙二醇化（PEGylati〇n)或與白蛋白結合）。 在該等實施例中，例如’序列z之長度可僅為一個胺基酸 (意即Z=CyS)或長度可為兩個、三個、四個、五個、六個 156944.doc •12- 201202265 或甚至更多個胺基酸。因此，其他胺基酸充當肽X與末端 Cys殘基之間的間隔基。 肽序列Z與人類OXM之IP-1部分之對應序列（其具有序列 Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala)具有不大於25°/。之序列 —致性。 給定肽或多肽序列關於另一多肽序列（例如之「胺 基酸序列一致性百分比（％)」經計算為當將兩種序列彼此 對準時（若必要，則引入間隙以用於最佳對準），給定肽序 列中與另一多肽之對應序列中之對應胺基酸殘基一致的胺 基酸殘基之百分比。一致性％值可由WU-BLAST-2(Altschul 等人，Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))測定。WU-BLAST-2使用若干研究參數，其中大部 分設定為預設值《可調節參數設定為具有以下值：重疊間 隔=1，重疊分率=0.125，字組臨限值（T)=ll。藉由如WU· BLAST-2所測定之匹配一致殘基數目除以參考序列之殘基 總數（由WU-BLAST-2將間隙引入參考序列中以使可忽略之 對準分值最大化）再乘以1〇〇來確定胺基酸序列一致性％值 因此，當Ζ與IP-1之8個胺基酸最優對準時，其具有不大 於兩個與IP-1之對應胺基酸一致之胺基酸。 在一特定實施例中，本發明提供一種其中Z不存在之化 合物。 本發明化合物中之一或多個胺基酸側鏈可與親脂性取代 基結合。親脂性取代基可共價鍵結於胺基酸侧鏈中之原 子’或者可藉由間隔基與胺基酸側鍵結合◊親脂性取代基 156944.doc -13· 201202265 可與作為肽x之一部分及/或肽z之一部分的胺基酸側鏈結 合〇 不希望受理論限制，認為親脂性取代基結合血流中之白 蛋白’由此使本發明化合物免受酶降解，從而可延長化合 物之半衰期。間隔基當存在時用於在化合物與親脂性取代 基之間提供間隔。 親脂性取代基可經由酯、磺醯基酯、硫酯、醯胺或磺醯 胺連接至胺基酸側鏈或連接至間隔基上。因此，應瞭解， 親脂性取代基較佳包括形成酯、磧醯基酯、硫酯、醯胺或 磺醯胺之一部分的醯基、磺醯基、N原子、〇原子或s原 子。親脂性取代基中之醯基較佳與胺基酸側鏈或間隔基形 成醯胺或酯之部分。 親脂性取代基可包括具有4至30個C原子之烴鏈。較佳 地’其具有至少8或12個C原子，且較佳地，其具有24個c 原子或更少’或20個C原子或更少。烴鏈可為直鏈或分支 鍵且可為飽和或不飽和。應瞭解，烴鍵較佳經形成與胺基 酸側鍵或間隔基連接之一部分的部分取代，該部分例如為 醯基、項酿基、N原子、Ο原子或s原子。最佳地，煙鍵經 酿基取代’且因此烴鏈可為烷醯基之一部分，例如軟脂酿 基、己醯基、月桂醯基、肉豆蔻醯基或硬脂醯基。 因此’親脂性取代基可具有以下所示之式： 9 A可為例如醯基、磺醯基、NH、N-烷基、0原子或s原 156944.doc •14· 201202265 子，較佳為醯基。η為3至29之整數，較佳為至少7或至少 η，且較佳為23或23以下，更佳為19或19以下。 烴鏈可進一步經取代。舉例而言，其可進一步經多達三 個選自ΝΗ2、0Η及C00H之取代基取代。若烴鏈進一步2 取代，其較佳僅經一個取代基進一步取代。或者或另外， 煙鏈可包括環烧烴或雜環烧烴，例如如下所示：

環烷烴或雜環烷烴較佳為六員環。其最佳為哌啶。 或者’親脂性取代基可基於環戊菲骨架，其可為部分或 完全不飽和或為飽和的。骨架中之碳原子各自可經 OH取代。例如’親脂性取代基可為膽醯基、去氧膽醯基 或石膽醯基。 如上文所提及’親脂性取代基可藉由間隔基與胺基酸側 鍵結合。間隔基當存在時連接至親脂性取代基及連接至胺 基酸側鏈。間隔基可獨立地藉由酯、磺醯基酯、硫酯、醯 胺或磺醯胺連接至親脂性取代基及連接至胺基酸側鏈。因 此’其可包括兩個獨立地選自醯基、磺醯基、N原子、〇 原子或S原子之部分。間隔基可具有下式：

B^E^D 其中B及D各獨立地選自醯基 '磺醯基、NH、N-烷基、 〇原子或S原子，較佳選自酿基及nh。較佳地，η為1至 156944.doc 201202265 10，較佳1至5之整數。間隔基可進一步經一或多個選自 C!·6烧基、C〇·6烧基胺、CG.6烧基經基及（：〇.6烧基叛基之取 代基取代。 或者，間隔基可具有兩個或兩個以上上式之重複單元。 對於各重複單元，B、D及n各獨立地選擇。相鄰重複單元 可經由其各別Β及D部分彼此共價連接。舉例而言’相鄰 重複單元之Β及D部分可一起形成酯、磺醯基酯、硫酯、 醯胺或磺醢胺。間隔基各端之自由Β及D單元連接至如上 文所述之胺基酸側鏈及親脂性取代基上。 間隔基較佳具有五個或五個以下、四個或四個以下或三 個或三個以下重複單元。間隔基最佳具有兩個重複單元’ 或為單一單元。 舉例而言’間隔基（或若其具有重複單元，則為間隔基 之一或多個重複單元）可為天然或非天然胺基酸。應瞭 解，對於具有官能化側鏈之胺基酸而言，Β及/或1)可為胺 基酸側鏈内之部分。間隔基可為任何天然產生或非天然之 胺基酸。例如，間隔基（或若其具有重複單元，則為間隔 基之一或多個重複單元）可為Gly、Pro、Ala、Va卜Leu、 lie、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gin、 Asn α Glu、γ-Glu、Asp、Ser、Thr、Gaba、Aib、β·

Ala、5-胺基戊醯基、6_胺基己醯基、7_胺基庚醯基、8·胺 基辛醯基、9-胺基壬醯基或1〇_胺基癸醯基。 舉例而σ，間隔基可為選自Y_Giu、Gaba、β-Ala及a-Glu 之單一胺基酸。 156944.doc -16· 201202265 親脂性取代基可與本發明化合物中之任何胺基酸側鍵妹 合。胺基酸側鏈較佳包括羧基、經基、硫醇、醯胺或賤 基’以用於與間隔基或親脂性取代基形成醋、續酿基自旨、 硫酯、醯胺或續醢胺。例如，親脂性取代基可與Asn、

Asp、Glu、Gin、His、Lys、Arg、Ser、Thr、Tyr、Trp、

Cys或Dbu、Dpr或Orn結合。親脂性取代基較佳與Lys結 合。在添加親脂性取代基時，本文所提供之式中展示為 Lys之胺基酸可由Dbu、Dpr或Orn置換。 親脂性取代基及間隔基之實例展示於下式中：

此處’來自本發明化合物之Lys經由醯胺部分共價連接 至Y-Glu(間隔基）。軟脂醯基經由醯胺部分共價連接至丫_ Glu間隔基。 或者或另外，本發明化合物中之一或多個胺基酸側鏈可 與聚合部分結合，例如用以提高溶解性及/或活體内半衰 期（例如在血漿中）及/或生物可用性。已知該修飾亦用以降 低治療性蛋白及肽之清除率（例如腎清除率）。 聚合部分較佳具水溶性（兩親媒性或親水性）、非毒性及 156944.doc 201202265 醫藥學惰性。合適聚合部分包括聚乙二醇（peg)、PEG之 均聚物或共聚物、PEG之經單曱基取代之聚合物（mPEG)或 聚氧乙浠甘油（POG)。例如，參見/«i. J. //emaio/o客少68:1 (1998) ; C/ze/w. 6:150 (1995)及 CWi. TTjera/?· Drwg Carrier 9:249 (1992)。 其他合適聚合部分包括聚胺基酸，諸如聚離胺酸、聚天 冬胺酸及聚麩胺酸（例如，參見Gombotz等人（1995)， Bioconjugate Chem.，第 6 卷：332-351 ; Hudecz 等人 (1992)，Bioconjugate Chem.，第 3 卷，49-57 ; Tsukada 等 人，（1984)，J. Natl. Cancer Inst.，第 73卷：721-729 ;及 Pratesi等人，（1985)，Br. J· Cancer，第 52卷：841-848)。 聚合部分可為直鏈或分支鏈。其可具有500-40,000 Da之 分子量，例如 500-10,000 Da、1000-5000 Da、10,000-20,000 Da或 20,000-40,000 Da ° 化合物可包含兩個或兩個以上該等部分，在該情況下所 有該等部分之總分子量通常將在上文所提供之範圍内。 聚合部分可（藉由共價鍵）與胺基酸側鏈之胺基、羧基或 硫醇基偶合。較佳實例為Cys殘基之硫醇基及Lys殘基之ε 胺基，且亦可使用Asp及Glu殘基之羧基。 熟練閱讀者將明確知曉可用於進行偶合反應之合適技 術。舉例而言，帶有甲氧基之PEG部分可使用購自Nektar Therapeutics AL之試劑藉由馬來酿亞胺基鍵與Cys硫醇基 偶合。亦參見WO 2008/101017及上文關於合適化學品詳情 所引用之參考文獻。 156944.doc -18 - 201202265 在另一態樣中，本發明化人板丨丨 41匕σ物中（例如肽X中）之一或多 個胺基酸側鏈與聚合部分結合。 在另一態樣中’本發明提供_種包含如本文所述化合物 或其鹽或衍生物與載劑混合之組合物。 本發明亦提供本發明化合物在製備用以治療如下所述病 狀之藥物中的用途。 本發明亦提供-種組合物，其中該組合物為醫藥學上可 接受之組合物，且該載劑為醫藥學上可接受之載劑。 肽合成 本發明化合物可藉由標準合成方法、重組表現系統或此 項技術方法之任何其他現有技術來製造。因此，升糖素類 .似物可由多種方式合成，例如包括包含以下之方法： (a) 藉助於固相或液相方法逐步或藉由片段組裝及分離並 純化最終肽產物來合成肽； (b) 在宿主細胞中表現編碼肽之核酸構築體且自宿主細 胞培養物回收表現產物；或 (c) 實現編碼肽之核酸構築體的無細胞活體外表現且回收 表現產物； 或方法（a)、（b)及（c)之任何組合以獲得肽片段，隨後接合 該等片段以獲得肽，及回收該肽。 較佳藉助於固相或液相肽合成來合成本發明之類似物。 在本文中，參考WO 98/11 125且尤其參考Fields，GB等人， 2002， 「Principles and practice of solid-phase peptide synthesis」·· Synthetic Peptides(第 2版）及其中之實例。 156944.doc -19- 201202265 為了重組表現，本發明之核酸片段通常將插入合適載體 中以形成帶有本發明之核酸片段的選殖或表現載體；該等 新穎載體亦成為本發明之一部分。視應用目的及類型而 定，該等載體可呈質體、噬菌體、黏質體、微型染色體或 病毒形式’且僅在某些細胞中瞬間表現之裸DNA亦為重要 載體。本發明之較佳選殖及表現載體（質體載體）能夠自主 複製’藉此使得高複本數用於高水準表現或高水準複製之 目的以供後續選殖。 大體而言’表現載體包含沿5，一3,方向且在可操作鍵中 之以下特徵：用於驅動本發明核酸片段之表現的啟動子、 視情況選用之編碼前導肽之核酸序列以使得可分泌（至細 胞外相或（若適當）至周質中）、編碼本發明之肽之核酸片段 及視情況選用之編碼終止子之核酸序列。其可包含其他特 徵，諸如可選擇之標記及複製起點。當以生產者菌株或細 胞株中之表現載體操作時，該載體較佳能夠整合至宿主細 胞基因體中。熟習此項技術者極為熟悉合適載體且能夠根 據其特定要求設計載體。 本發明之載體用於轉型宿主細胞以產生本發明化合物。 亦為本發明之部分的該等轉型細胞可為用於繁殖本發明之 核酸片段及載體或用於重組產生本發明之肽的培養細胞或 細胞株》 本發明之較佳轉型細胞為微生物，諸如細菌，諸如物種 埃希氏菌（Escherichia)(例如大腸桿菌（E.coli))、桿菌 (Bacillus)(例如枯草桿菌（BaciUus subtiHs))、沙門氏菌 156944.doc -20- 201202265 (Salmonella)或分枝桿菌（Mycobacterium)(較佳為非病原 性，例如牛BCG);酵母（諸如啤酒酵母菌（Sacchar〇myces cerevisiae))及原生動物（pr〇t〇z〇an)。或者，轉型細胞可衍 生自多細胞生物體，意即其可為真菌細胞、昆蟲細胞、植 物細胞或哺乳動物細胞。出於選殖及/或最優化表現之目 的，轉型細胞較佳能夠複製本發明之核酸片段。表現核酸 片段之細胞為本發明之適用實施例；其可用於小規模或大 規模製備本發明之肽。 當藉助於轉型細胞產生本發明之肽時，儘管遠非必需， 但宜將表現產物分泌至培養基中。 功效 相關化合物與GLP-1或升糖素（Glu)受體之結合可用作對 促效劑活性之指示，但一般而言，較佳使用量測藉由化合 物與相關受體結合引起之細胞内信號轉導的生物檢測法。 舉例而言，由升糖素促效劑活化升糖素受體將刺激細胞環 狀AMP(cAMP)形成。同樣，由GLP-1促效劑活化GLP-1受 體將刺激細胞c AMP形成。因此，在表現該兩種受體之一 者的合適細胞中產生cAMP可用於監控相關受體活性。因 此，使用合適細胞類型對（各自表現一種受體而不表現另 一者）可用於測定促效劑對於兩種類型受體之活性。 熟習此項技術者將瞭解合適檢測形式，且下文提供實 例。GLP-1受體及/或升糖素受體可具有如實例中所述受體 之序列。舉例而言，檢測法可利用具有主要寄存編號 GI..4503947之人類升糖素受體（升糖素_R)及/或具有主要寄 156944.doc 201202265 存編號GI: i 66795283之人類升糖素樣肽丨受體（GLp_〖r)。 (其中則驅蛋白之序列可稱作缺少信號序列，當然應除解 檢測法可利用成熟蛋白）。 EC^值可用作促效劑對給定受體之效能的數值量度。 ECw值係對於在特定檢測法中達成化合物最大活性之一半 所需要的化合物濃度之量度。因此，舉例而言，可認為在 特定檢測法中具有低於升糖素之EC5Q[GLp_1]的ECM[GLp_ 1]之化合物具有高於升糖素之GLP1效能。 本說明書中所述之化合物通常為Glu-GLP-Ι雙重促效 劑，意即其能夠刺激升糖素受體與GLpq受體兩者之cAMp 形成。可以獨立檢測，量測各受體之刺激作用且隨後相互 比較。 對於給定化合物而言，藉由比較升糖素受體之EC50值 (EC5q[升糖素-R])與 gLIM 受體之 Ec5。值（EC5〇[GLp_1R])， 可發現彼化合物之相對升糖素選擇性（％): 相對升糖素-R選擇性[化合物]=(1/EC5Q[升糖素-11])><100/(1/£(：50[升糖素_尺]+ 1/£(：5〇[(31^1)_111]) 同樣可發現相對GLP-1R選擇性： 相對 GLP-1R 選擇性[化合物]=(1/EC5〇[GLp iR])x ioo/(i/ec5〇[升糖素 _r]+1/EC5〇[glp_1r]) 化合物之相對選擇性使得其對（}1^_1或升糖素受體之作 用可直接與其對另一受體之作用相比較。舉例而言，化合 物之相對GLP-1選擇性愈高，則彼化合物對GLp]受體與 對升糖素受體相比更有效。 156944.doc •22· 201202265 使用下文所述之檢測法，吾人6發現對於人類升糖素之 相對GLP-1選擇性約為5%。 本發明化合物與人類升糖素相比可具有較高之相對G l p _ 1R選擇性。因此’料料水準之升糖素铺效劑活性而 5，该化合物將展現與升糖素相比較高水準之GLp_促 效劑活性（意即對GLP-丨受體之效能較高）。應瞭解，特定 化合物對升糖素及GLP—丨受體之絕對效能可高於、低於或 大致等於天然人類升糖素之效能，只要達成適當之相對 GLP-1R選擇性即可。 然而，本發明化合物可具有低於人類升糖素之 EC5〇[GUMRp該等化合物可具有低於升糖素之 EC5〇[GLP-l-R]，而維持比人類升糖素2EC5〇[升糖素_R]高 出J於10倍、比人類升糖素之Ες；5〇[升糖素_r]高出小於5倍 或比人類升糖素之ECso[升糖素-R]高出小於2倍之eC5〇[升 糖素-R]。 本發明化合物可具有小於人類升糖素之EC5q[升糖素_R] 之兩倍的ECw[升糖素_R]。該等化合物可具有小於人類升 糖素之ECso[升糖素-R]之兩倍的ECsq[升糖素_R]且具有小 於人類升糖素之EC^tGLP-lR]之一半、小於人類升糖素之 EC5〇[GLP-lR]之五分之一或小於人類升糖素之EC5g[Glp_ 1R]之十分之一的EC5〇[GLP-lR]。 化合物之相對GLP-1選擇性可介於5%與95%之間。例 如，化合物可具有 5-20%、10-30%、20-50%、30-70% 或 50-80%之相對選擇性’或具有3〇·5〇%、4〇·6〇%、5〇_7〇% 156944.doc -23- 201202265 或75-95%之相對選擇性。 本發明化合物亦可對其他B類GPCR受體具有作用，該等 受體諸如（但不限於）抑鈣素基因相關肽1(CGRP1)、促皮質 素-釋放因子1與2(CRF1與CRF2)、胃抑制性多肽（GIP)、升 糖素樣肽1與2(GLP-1與GLP-2)、升糖素（GCGR)、分泌 素、促性腺激素釋放激素（GnRH)、副曱狀腺_激素i與 2(PTH1 與PTH2)、血管活性腸肽（VPAC^vpAC2)。 治療用途 本發明化合物可對肥胖症及代謝疾病提供具吸引力之治 療選擇。 代謝症候群之特徵為人體内之一組代謝風險因素。其包 括腹部肥胖（腹部内部器官周圍脂肪組織過量）、致動脈粥 樣硬化性血脂異常（血液脂肪病症，包括高甘油三酯、低 HDL膽固％及/或尚LDL膽固醇，其促使在動脈壁中的斑塊 聚積）、也壓升高（高血壓）、胰島素抵抗及葡萄糖不耐受、 血栓前狀態（例如血液中之高血纖維蛋白原或血纖維蛋白 溶酶原活化劑抑制劑·丨）及炎症前狀態（例如血液中c反應性 蛋白升高）。 患有代謝症候群之個體患冠心病及與動脈硬化之其他表 現相關之其他疾病（例如中風及周邊血管疾病）的風險增 加。該症候群之主要潛在風險因素似乎為腹部肥胖。 不希望受任何特定理論限制，咸信本發明化合物充當 GluGLP-Ι雙重促效劑。雙重促效劑使升糖素對脂肪代謝之 作用與GLP-1對食物攝入之作用組合。因此，其可能以協 156944.doc •24· 201202265 同方式用於加速過量脂肪沈積之去除且誘發可持續性減 重。 雙重GluGLP-1促效劑之協同作用亦可導致心血管風險因 素（諸如高膽固醇及LDL)降低，此可與其對體重之作用完 全無關。 因此’本發明化合物可用作用於預防增重、促進減重、 降低超重或治療肥胖症（例如藉由控制食慾、链飼、食物 攝入、熱量攝取及/或能量消耗，包括病態肥胖症）以及相 關疾病及健康病狀（包括（但不限於）肥胖症相關之炎症、肥 胖症相關之膽囊疾病及肥胖症誘發之睡眠呼吸暫停）的藥 劑。本發明化合物亦可用於治療代謝症候群、高血壓、致 動脈粥樣硬化性血脂異常、動脈粥樣硬化、動脈硬化、冠 心病及中風。該等疾病均為可與肥胖症有關之病狀。然 而，本發明化合物對該等病狀之作用可完全或部分經由對 體重之作用來調節，或可獨立調節。 特定而言，本發明中所述之化合物可用於預防增重或促 進減重而對葡萄糖耐受性無影響或影響極小。已發現，所 述化合物在合適血糖控制動物模型中對減重具有明顯作用 而對HbAlc含量無影響或影響極小。 因此’本發明提供本發明化合物在有此需要之個體中> 療如上所述病狀中之用途。 本發明亦提供—種本發明化合物，其用於醫學治 中，尤其用於治療如上所述之病狀之方法中。’、 在-較佳態樣中，所述化合物可用於預防增重或促進減 156944.doc -25- 201202265 在一特定實施例中，本發明包含化合物在有此需要之個 體中用於預防增重或促進減重之用途。 在一特定實施例中’本發明包含化合物在有此需要之個 體中治療由超重引起或以其為特徵之病狀的方法中之用 途，例如治療及/或預防肥胖症、病態肥胖症、手術前之 病態肥胖症、肥胖症相關之炎症、肥胖症相關之膽囊疾 病、肥胖症誘發之睡眠呼吸暫停、高血壓、致動脈粥樣硬 化性血脂異常、動脈粥樣硬化、動脈硬化、冠心病、周邊 動脈疾病、中風或微血管疾病。 在另一態樣中，所述化合物可用於降低循環1^1)1^含量及/ 或提尚HDL/LDL比率之方法中。 在-特定實施例中，本發明包含化合物在有此需要之個 體中降低循環LDL含量及/或提高HDL/LDL比率之方法中 的用途。 醫藥组合物 本發明化合物或其鹽可調配成為經製備用於儲存或投奏 之醫藥組合物’其通常在醫藥學上可接受之載劑中包含^ 療有效量之本發明化合物或其鹽。 Ε 本發明化合物之治療有效量將視投藥途經、受 ^動物類型及財慮㈣定哺乳㈣之身體特徵而定。續 所=及:!測!：量之關係為醫學技術中之熟練實踐者 -，、σ ^及投藥方法可經調整以達成最傷a 士 視為熟習醫學技術者所孰知W 最優功效’且可 者所熟知之因素而定，諸如體重、飲 I56944.doc •26· 201202265 途之劑量大小及 且可在適當設計 食、併用藥物及其他因素。最適合人類用 給藥方案可由本發明獲得之結果來指導， 之臨床試驗中證實。 有效劑1及治療方案可藉由習 …… 切定，在實驗室動

物中以低劑量開始，且随描A 且隨後在監控作用之同時增加劑量且 亦系統地改變給藥方幸。告滅宁料认^ 茶曰確疋對給定個體之最優劑量 時’臨床醫師可考慮多種因辛。 u系通寺考慮因素為熟習此項 技術者所知。 術語「醫藥學上可接受之載劑」包括任何標準醫藥載 劑。用於治療用途之醫藥學上可接受之載劑在醫藥技術中 熟知且例如描述於Remingt〇n,s抑咖扣如㈣

Mack Publishing Co.(A_ R. Gennaro編，1985)中。舉例而 言，可使用弱酸性或生理pH值之無菌生理食鹽水及磷酸鹽 緩衝生理食鹽水。pH緩衝劑可為磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸 鹽、參（羥曱基）胺基甲烷（TRIS)、小參（羥甲基）甲基_3胺 基丙烷磺酸（TAPS)、碳酸氫銨、二乙醇胺、組胺酸（其為 較佳緩衝劑）、精胺酸、離胺酸或乙酸鹽或其混合物。該 術語另外涵蓋US Pharmacopeia中列舉之用於動物（包括人 類）之任何試劑。 術語「醫藥學上可接受之鹽」係指化合物之鹽。鹽包括 醫藥學上可接受之鹽，諸如酸加成鹽及鹼性鹽。酸加成鹽 之實例包括鹽酸鹽、檸檬酸鹽及乙酸鹽β驗性鹽之實例包 括其中陽離子選自驗金屬（諸如納及奸）、驗土金屬（諸如 鈣）及銨離子+N(R3)3(R4)(其中R3及R4獨立地表示視情況經 156944.doc -27- 201202265 取代之c〗·6烷基、視情況經取代之C2·6烯基、視情況經取代 之芳基或視情況經取代之雜芳基）之鹽。醫藥學上可接受 之鹽之其他實例描述於「Remington丨s Pharmaceutical Sciences」，第 17版，Ed. Alfonso R. Gennaro(編），Mark

Publishing Company，Easton, PA, U.S.A.，1985及更新版 本，及 Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology 中。 「治療」係一種用於獲得有益或所要臨床結果之方法。 為本發明之目的，無論可偵測或不可伯測，有益或所要臨 床結果包括（但不限於）減輕症狀、降低疾病程度、穩定疾 病狀態（意即不惡化）、延遲或減緩疾病進程、改善或緩和 疾病狀態及緩解（無論部分或總體）。「治 不接受治療之預期存活率相比存活率延長。= 預防發展或改變病症病理為目的所進行之干預。因此， 「治療」係指治療性治療及預防性或防止性措施。彼等需 要治療者為彼等已患病症者以及彼等待預防病㈣。 醫藥組合物可呈單位劑型。以該形式之組合物分為含有 適當量活性組份之單位劑量。單位劑型可為包裝製劑，即 含有個別量之製劑的包裝’例如封包旋劑、膠 :瓶中之散劑。翠位劑型亦可為膠囊、扁囊劑或鍵劑： 身’或其可為適當數量之任何該等包裝形式。其可一 劑量可注射形式提供，例如以筆之形式。組合物 以用於任何合適投藥途徑及方式。醫藥學上— 或稀釋劑包括彼等用於適合經口又之載劑 經頰及舌下）、陰道或非經 '局部（包括 (^括皮下、肌肉内、靜脈 156944.doc •28· 201202265 内、皮内及經皮）投藥之調配物中的載劑或稀釋劑。調配 物宜以單位劑型呈現且可藉由醫藥技術中熟知之任何方法 來製備》 皮下或經皮投藥模式可尤其適於本文所述之化合物。 本發明之組合物可另外例如經共價疏水性及靜電相互作 用化合於或連接於藥物載劑、藥物傳遞系統及高級藥物傳 遞系統以進一步提高化合物之穩定性、增加生物可用性、 增加可溶性、減少不利作用、達成熟習此項技術者熟知之 時相療法（chronotherapy)及提高患者順應性或其任何組 合。載劑、藥物傳遞系統及高級藥物傳遞系統之實例包括 (但不限於）聚合物（例如纖維素及衍生物）、多醣（例如葡聚 糖及衍生物、澱粉及衍生物）、聚（乙烯醇）、丙烯酸酯及甲 基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸及聚乙醇酸及其嵌段共聚物、 聚乙二醇、載劑蛋白（例如白蛋白）、凝膠（例如熱膠凝系 統，例如熟習此項技術者熟知之嵌段共聚系統）、微胞、 脂質體、微球、奈米微粒、液晶及其分散液、熟習脂質_ ，系統中之相行為之技術者熟知之L2相及其分散液、聚合 微胞、多重乳液、自乳化、自微乳化環糊精及其衍生物及 樹枝狀聚合物。 組合療法 本發明化合物可作為與用於治療肥胖症、高血壓、血脂 異常或糖尿病之藥劑的組合療法之—部分投與。 在該等情況下’兩種活性劑可—起或分開給與，且可作 為同-醫藥調配物之-部分或呈單獨調配物形式給與。 156944.doc •29· 201202265 ，此化口物或其鹽可另外與抗肥胖劑組合使用，該抗 肥胖劑包括(但不限於)升糖素樣肽受體1促效劑、肽γγ或 、類似物大麻驗受體丨拮抗劑、脂肪酶抑制劑、黑皮素 受體4促效劑或黑色素集中激素受體1拮抗劑。 類似物化σ物或其鹽可與抗高血壓劑組合使用，該抗高 企壓劑包括(但;^限於)血管收縮素轉化酶抑制齊!、企管收 縮素II受體阻斷劑、利尿劑、p_阻斷劑或釣離子通道阻斷 劑。 類似物化合物或其鹽可與血脂異常藥劑組合使用，該也 脂異常藥劑包括（但不限於）抑制素（statin)、纖維酸酯 (fibrate)、菸鹼及/或膽固醇吸收抑制劑。 此外，本發明化合物（或其鹽）可與抗糖尿病劑組合使 用，該抗糖尿病劑包括（但不限於）二甲雙胍、磺醯脲、格 列不（glinide)、DPP-IV抑制劑、格列酮（giitaz〇ne)或姨島 素。在一較佳實施例中，化合物或其鹽與胰島素' Dpp_iv 抑制劑、磺醯脲或二曱雙胍（尤其為磺酿脲或二曱雙胍）組 合使用，以達成適當之血糖控制。在甚至更佳實施例中， 化合物或其鹽與胰島素或胰島素類似物組合使用，以達成 適當之血糖控制。胰島素類似物之實例包括（但不限於）蘭 德仕（Lantus)、諾和瑞筆型胰島素（Novorapid)、優泌樂 (Humalog)、諾和密斯（Novomix)及 Actraphane HM。 方法 升糖素類似物之通用合成法 在微波辅助合成器上使用標準Fmoc策略，在聚苯乙烯 156944.doc -30· 201202265 樹脂上之NMP(TentaGel S Ram)中進行稱作SPPS之固相肽 •合成法》HATU用作偶合試劑，與作為鹼之DIPEA —起使 用。使用哌啶（20%含於NMP中）脫除保護基。若適當，則 使用偽捕胺酸·· Fmoc-Phe-Thr(.Psi. Me，Me pro)-OH 及 Fmoc-Asp-Ser(.Psi_，Me，Me pro)-OH(可購自 NovaBiochem)。 裂解法： 藉由在室溫（r.t.)下，以 95/2.5/2.5%(v/v)TFA/TIS/水處理 2小時，自樹脂上裂解粗產物肽。針對序列中具有甲硫胺 酸之肽，使用95/5%(v/v)TFA/EDT之混合物。在減壓下移 除大部分TFA，且讓粗產物肽沈澱，以乙醚洗滌，並在周 圍溫度下乾燥至恆定重量。 醯化升糖素類似物之通用合成法 如上文關於升糖素類似物之通用合成法所述來合成肽骨 架，但其中改於肽仍連接於樹脂上時醯化離胺酸殘基之側 鏈，且除了待醯化之離胺酸上之ε-胺以外，其側鏈基團均 受到完全保護。使用Fmoc-Lys(ivDde)-OH或Fmoc-Lys(Dde)-OH併入待醯化之離胺酸。使用含於NMP中之 Boc20，以Boc基團保護肽之N-末端。在肽仍連接於樹脂 上時，使用NMP中之5%水合肼選擇性裂解ivDde保護基。 隨後使未受保護之離胺酸側鏈首先與間隔基胺基酸（如 Fmoc-Glu-OtBu)偶合，使用如上文所述之標準肽偶合方 法，以哌啶脫除保護基，且以脂肪酸醯化。或者，N-末端 之組胺酸可自開始時即以Boc-His(Boc)-OH形式併入。如 上文所述自樹脂裂解並進行純化。 156944.doc •31 · 201202265 產生表現人類升糖素受體及GLP-1受體之細胞株 分別自 cDNA純系 BC104854(MGC:132514/ IMAGE:8143857) 或 BC112126(MGC:138331/IMAGE: 8327594)選殖編碼人類升 糖素受體（升糖素-R)(主要寄存編號P47871)或人類升糖素 樣肽1受體（GLP-1R)(主要寄存編號P43220)之cDNA。藉由 PCR，使用編碼末端限制位點之引子擴增編碼升糖素-R或 GLP-1-R之DNA，以用於次選殖。5，_末端引子額外編碼近 Kozak—致序列，以確保有效轉譯。藉由DNA定序確認編 碼升糖素-R及GLP-MI之DNA的真實度。將編碼升糖素-R 或GLP-1-R之PCR產物次選殖至含有新黴素（G418)抗性標 記之哺乳動物表現載體中。藉由標準磷酸鈣轉染方法，將 編碼升糖素-R或GLP-1-R之哺乳動物表現載體轉染至 HEK293細胞中。轉染後48小時’接種細胞，以用於限制 稀釋選殖，且在培養基中使用1 mg/ml G418進行選拔。三 週後，揀選升糖素-R及GLP-1-R表現細胞之12個存活群 落，使其繁殖，且如下文所述以升糖素-R及GLP-卜R功效 檢測法測試。選擇一種升糖素_R表現純系及一種GLP-1-R 表現純系用於化合物型態。 升糖素受體及GLP-1-受體功效檢測法 以每孔40,000個細胞，將表現人類升糖素-R或人類GLP-1-11之11£〖293細胞接種於塗覆有〇.〇1°/。聚1^離胺酸之96孔 微量滴定盤中，且在100 丨生長培養基中，於培養物中生 長1天。分析當曰，移除生長培養基，且將細胞以200 μΐ Tyrode緩衝液洗蘇一次。在37C下’將細胞在100 μΐ含有 156944.doc •32- 201202265 濃度漸增之測試肽、100 μΜ IBMX及6 mM葡萄糖之Tyrode 緩衝液中培育長達15 min。藉由添加25 μΐ 0.5 M HC1停止 反應且在冰上培育60 min。使用來自Perkin-Elmer之 FlashPlate® cAMP套組評估cAMP含量。藉由電腦輔助曲 線擬合法評估與參考化合物（升糖素及GLP-1)相比之EC5q 及相對功效。

HbAlc測定 可能藉由測定血紅素AlC(HbAlc)含量來評估化合物對 個體之葡萄糖含量的長期作用》HbAlc為糖化形式之血紅 素，其在細胞中之含量反映細胞在其壽命期間已暴露於葡 萄糖的平均含量。在小鼠中，Hb A1 c為在前4週期間用於 平均血糖含量之相關生物標記，這是因為轉化為HbAl c受 約47天之紅血球生命期限之限制（Abbrecht及Littell， 1972; J. Appl. Physiol. 32, 443-445)。HbAlc測定係基於 比濁抑制免疫檢測法（Turbidimetric INhibition ImmunoAssay，TINIA)，其中樣品中之 HbAlc與抗 HbAlc 反應形成可溶性抗原-抗體複合物。添加之多半抗原 (polyhapten)與過量抗-HbAlc抗體反應形成不溶性抗體-多 半抗原複合物，其可用比濁滴定法量測β溶血樣品中釋放 之血色素經轉化為具有特徵性吸收光譜之衍生物，其係在 預培育階段期間用雙色度法（bichromatically)量測。最終結 果表述為總血色素之HbA 1 c百分比（Cob as ©Application標 註 A1C-2) 〇 膽固醇含量測定 156944.doc •33· 201202265 該檢測法為一種酶比色法"在鎮離子存在下，硫酸葡聚 糖選擇性地與對PEG修飾酶具有抗性之LDL、VLDLA及乳 糜微粒形成水溶性複合物。藉由與PEG偶合至胺基之膽固 醇酯酶及膽固醇氧化酶來酶促測定HDL膽固醇。膽固醇酯 定量分解為游離膽固醇及脂肪酸。HDL膽固醇經酶促氧化 為膽留-4-稀-3-嗣及H2O2，且比色量測所形成之 H2〇2(Cobas® ; Application標註HDLC3)。 LDL之直接測定藉由非離子性清潔劑及糖化合物與脂蛋 白（VLDL及乳糜微粒）之相互作用利用LDL之選擇性微胞增 溶作用。糖化合物與清潔劑之組合使得可選擇性地測定血 漿中之LDL。測試原則與膽固醇及HDL之測試原則相同， 但由於糖及清潔劑，僅LDL-膽固醇酯分解為游離膽固醇及 脂肪酸。游離膽固醇隨後經氧化且比色量測所形成之 H2〇2(Application標註LDL_C，Cobas®)。 TESTED GPCR-B iTARGET^ii SKAL TOE SP0RGES??? 受體用於：抑鈣素基因相關肽l(CGRPl)、促皮質素-釋 放因子1與2(CRF1與CRF2)、胃抑制性多肽（GIP)、升糖素 樣肽1與2(GLP-1與GLP-2)、升糖素（GCGR)、分泌素、促 性腺激素釋放激素（GnRH)、副曱狀腺-激素1與2(PTH1與 PTH2)、血管活性腸肽（VPAC1與VPAC2)。 用於其他B類受體之檢測法設計 藉由分析樣品化合物（升糖素類似物）及參考所概述每一 GPCR之Emax對照物獲得促效劑百分比活化湏4定值。藉由 分析樣品化合物及參考所概述每一 GPCR之對照EC80孔獲 156944.doc • 34· 201202265 得拮抗劑百分比抑制測定值。使用用於促效劑及拮抗劑檢 測法運作之「雙重加入（D〇ubie Addition) j檢測方案運作 樣品。方案設計如下： 化合物製備主儲備溶液 除非另外規定，否則將樣品化合物於包括所有稀釋物之 100%無水DMSO中稀釋。若在不同溶劑中提供樣品化合 物，則在指定溶劑中進行所有主儲備稀釋。所有對照孔含 有與樣品化合物孔一致之溶劑最終濃度。 用於檢測法之化合物培養盤 將升糖素類似物自主儲備溶液轉移至用於檢測法之子培 養盤中。將每一樣品化合物以適當濃度稀釋至檢測緩衝液 (lxHBSS，具有 20 mM HEpES 及 2 5 mM 丙磺舒 (Probenecid))中以獲得最終指定濃度。 鈣離子流檢測促效劑檢測形式 將升糖素類似物一式兩份以100 nM塗覆。本文 所述濃度反映化合物在拮抗劑檢測期間之最終濃度。如上 文所提及將參考促效劑充當檢測對照物來處理。如上文關 於Emax所述處理參考促效劑。使用 tetr 歷時90秒讀 取檢測值（該檢測法使所添加之樣品化合物及參# 運作至各別列）。 拮抗劑檢測形式 使用先前測定之£〇8()值，刺激所有經預培育之樣品化人 物及具有參考促效劑之EC8◦的|考结抗劑（若適巧孔° 使用FUPRTETRA歷時⑽秒讀取（此添加為^孔添加參 156944.doc -35- 201202265 考促效劑）-隨後收集螢光量測以計算ic5G-值。

食赞狼（Cynomolgus monkey)中之PK 研究設計 分別在第1天及第8天以單次劑量對食蟹猴（雄性，n=2) 以20 nmol化合物6/kg靜脈内（ζ·.ν·)給藥且以20 nmol化合物 6/kg皮下（i.c.)給藥》在以下時間點提取血漿樣品：給藥 前、靜脈内（厂V.)給藥後5、10、30 min、1、2、4、8、 12、24及36 h及給藥前、皮下O.c.)給藥後1〇、30 min、 1、2、4、8、12、24、36及4811。媒劑由1)117.4之25 mM 磷酸鹽緩衝生理食鹽水（25 mM磷酸鈉，25 mM NaCl)組 成。使用蛋白沈澱、繼而固相萃取及LC-MS/MS分析來分 析血漿樣品。使用WinNonLin 4.1版之非隔室模型分析 (non-compartmental analysis)來計算藥物動力學參數。 6週皮下投與GluGLP-l促效劑化合物6對db/db小鼠體内之 HbAlc的作用 自 Charles River Laboratories，Germany獲得 5 至 6週大之 + 雄性小鼠且使其適應可自由 獲取正常飲食及水之新環境。將動物分為具有類似平均 HbAlc之組且每天兩次以化合物6(1、2.5及5 nmol/kg)或媒 劑經皮下（s.c.)處理六週。整個研究期間，每天記錄體重且 將其用於投與經體重校正劑量之肽。處理之前量測血液樣 品中之HbAlc含量，且隨後在研究期間每週量測一次。在 最終血液取樣之後即刻處死所有動物。 以雙重GluGLP-l促效劑化合物6處理三週對飲食誘發肥胖 156944.doc •36* 201202265 症小鼠（30週高脂肪飲食）之口服葡萄糖耐受性及體重的作用 使ό週大之C57B1/6J雄性小鼠適應其可自由獲取高脂肪 飲食及水之新環境。36週大時，將動物隨機分為具有類似 平均禁食（6小時）血糖（由自尾尖端獲取之血液樣品評估）之 組。每天兩次以化合物6或媒劑皮下（s.c.)處理小鼠三週。 每天記錄體重。在肽處理之後，在使動物禁食6小時後進 行口服葡萄糖耐受性測試（OGTT) »清晨時以肽或媒劑對 動物給藥。約4小時後，獲取初始血液樣品（禁食血糖含 量）。此後，給與口服劑量之葡萄糖且使動物返回其籠内 (t=0)。在 t=l 5 min、t=30 min、t=60 min、t=90 min 及 t=120 min時量測BG。在血液取樣後，即刻藉由C〇2麻醉， 繼而藉由頸部脫位處死所有動物。 藉由以下實例進一步說明本發明。 實例1 :對升糖素及GLP-1受體之功效 化合 SEQ GLP-1R GluR 物編 ID 序 列 EC50 ECso 號 No (nM) (nM) 1 4 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLSA- NH2 0.06 0.06 2 5 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWL-K(十 六烷醯基-異Glu)-SA-NH2 3.09 0.81 3 6 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRA-K(十六烷醯基-異 Glu)-DHEWLLS A-NH2 0.64 0.60 4 7 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLL-K(十六烷醯基-異Glu)-A-NH2 0.31 0.25 5 8 H-HSQGTFTSDYSKYLD-K(十六烷醯基-異 Glu)-RRAKDFIEWLLSA-NH2 0.35 0.19 6 H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷醯基-異 Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2 0.13 0.16 7 10 H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷醯基-異 Glu)-RAKDFIEWLLS A-NH2 0.10 0.16 表1 :如上所述量測EC50值 156944.doc •37· 201202265 實例2·狼之皮下及靜脈内投藥後的藥物動力學研究 對猴給與化合物6以在皮下投藥（其為人類之預期途徑） 後測試藥物動力學及生物可用性。經展示化合物6之生物 可用性為43%±8.1，為8.2 h±2.0及tmax介於4與8 h之間。 在藉由皮下途徑每天一次投與可行劑量後，化合物6之藥 物動力學型態可能預測對人類之升糖素及GLP1受體之高 於ECso之怪定暴露。 實例3. 6週皮下投與GluGLP-l促效劑化合物6對db/db小 鼠體内之HbAlc的作用 對動物皮下庄射1 00 μΐ媒劑（一天一次）持續三天時間以 使動物適應處理及注射。將動物隨機分為具有類似平均 HbAlc之組中。隨後每天兩次以化合物叩、2 $或$ nmol/kg)或媒劑皮下處理小鼠。處理之前且每週一次持續 六週處理，自眼窩後靜脈叢獲取血液樣品。 使用 Cobas Clll 分析器（R〇che Diagn〇stics,

Germany)分析血液樣品之HbAlc。在取樣24小時内分析用 於Hb A1 c分析之樣品。 整個研究期間’每天記錄體重且將其用於投與經體重校 正劑量之肽。在給藥之前即刻製備溶液。 如由db/db小鼠模型所預期，可見财1(；隨時間推移而增 加（圖}在六週處理期間’吾人觀測到媒劑組之嫩^增 加 27%。 化合物6在所有劑量下在任何時間點均不減少在經媒劑 處理動物中可見的HbAlc隨時間推移之增加(圖”。 156944.doc -38- 201202265 在六週處理期間，吾人觀測到媒劑組之體重增加22%。 化合物6(5 nmol/kg)與媒劑相比顯著減少體重增加 (p<0.0001，圖 2)。 研究如由db/db小鼠體内之HbAlc所評估的以雙重 GluGLP-1促效劑化合物6處理六週對血糖控制之作用。 如所預期，db/db小鼠模型展示HbAlc隨時間推移而增 加。在經媒劑處理之db/db小鼠體内，以化合物6處理六週 未顯著減少隨時間推移可見之HbAlc增加。 在經媒劑處理之db/db小鼠體内，以化合物6(5 nmol/kg) 處理六週顯著減少隨時間推移可見之體重增加。 實例4 : 3週皮下投與GluGLP-Ι促效劑化合物6對飲食誘發 之肥胖症C57BL/6J小鼠（6個月高脂肪飲食）之口服葡萄糖 耐受性·及體重的作用 體重 化合物6使體重減少38.7%(p<0.05)(圖3)。有趣的是，由 以化合物6處理三週之高脂肪餵飼動物所獲得之體重穩定 在與由規律飲食之未經處理對照動物所獲得之相同體重 (圖 3)。

OGTT 以化合物6處理三週對葡萄糖耐受性無顯著作用（經量測 為AUC減少）（圖4)。 化合物6使飲食誘發之肥胖症小鼠（30週高脂肪飲食）之 體重顯著減少至如在規律飲食之未經處理對照動物中可見 之水準（圖3)。化合物6之作用顧著降低禁食血糖。化合物6 156944.doc •39· 201202265 不顯著提高口服葡萄糖耐受性。 減重與葡萄糖處理中之該等差異可反映GluGLP-l促效劑 化合物6之效能（表1)及/或於GLP-1受體上之暴露。該差異 亦可與GLP-1及GLP-1類似物與GluGLP-l促效劑在作用機 制方面之差異相關。已知腸促膜島素-4(Exendin-4)及其他 GLP-1類似物經由刺激葡萄糖依賴性胰島素分泌、抑制胃 排空及抑制升糖素分泌來調節血糖。除諸如該等對GLP-1 受體之作用以外，化合物c(c eller 6 her?)亦結合並活化 GluR(參見表1)。 在飲食誘發之肥胖症小鼠中，化合物6顯著減少體重。 化合物6不改良在口服葡萄糖耐受性測試中所量測之葡萄 糖耐受性。 實例5 : 3週皮下投與GluGLP-l促效劑化合物6對30週高脂 肪飲食餵飼小鼠體内之脂質的作用 在歷時3週每天兩次以媒劑（PBS)、10 nmol/kg腸促胰島 素-4或10 nmol/kg化合物6處理（皮下）之前，對已高脂肪飲 食30週之小鼠處理3週對脂質的作用（圖5)。量測對LDL、 HDL及三酸甘油酯（CHO :總膽固醇；HDL :高密度膽固 醇；LDL :低密度膽固醇；TRIG :三酸甘油酯； HDL/LDL: HDL與LDL之比率）之作用。 化合物6顯示（圖5)顯著減少總膽固醇、HDL、 LDL(P<0.001)及三酸甘油醋（P<0.05)，而HDL/LDL比率顯 著增加（ρ<〇·〇〇1)。HDL/LDL比率被視為對心臟病之風險指 示。比率愈高，心臟病發作或其他心血管問題之風險愈 156944.doc •40· 201202265 低。 實例6 :化合物6對CGRP及其他受體之反向篩選 測試化合物6抵抗以下各物之促效劑及拮抗劑活性：抑 鈣素基因相關肽l(CGRPl)、促皮質素釋放因子1與2(CRF1 與CRF2)、胃抑制性多肽（GIP)、升糖素樣肽1與2(GLP-1與 GLP-2)、升糖素（GCGR)、分泌素、促性腺激素釋放激素 (GnRH)、畐ij甲狀腺-激素1與2(PTH1與PTH2)、血管活性腸 肽（VPAC1 與VPAC2)1(1.25)、100(125)及 10,000(12,500)nM。 觀測針對以下受體之促效劑活性： GLP-1受體：化合物6在12.5 μΜ及125 nM下展現促效劑 活性 升糖素受體：化合物6在12.5 μΜ及125 nM下展現促效劑 活性 觀測針對以下受體之拮抗劑活性： CRF2受體：化合物6在10 μΜ下展現拮抗劑活性 GIP受體：化合物6在10 μΜ及100 nM下展現拮抗劑活性 分泌素受體：化合物6在1 0 μΜ下展現拮抗劑活性 實例7 :化合物6及7對高脂肪餵飼C57BL/6J小鼠之體重增 加的作用 使C57BL/6J小鼠歷時4週適應其可自由獲取高脂肪飲食 及水之新環境。隨後將小鼠每天兩次以化合物6及化合物 7(以兩種劑量：0.5及5 nmol/kg)或媒劑皮下（s.c.)處理10 天。在整個研究期間，每天記錄體重且將其用於投與經體 重校正劑量之肽（圖6)。藉由頸部脫位處死小鼠。 156944.doc • 41 · 201202265 在高脂肪餵飼C57BL/6J小鼠中，化合物6及化合物7在兩 種劑量（0.5及5 nmol/kg)下均顯著減少體重增加。 【圖式簡單說明】 圖皮下（s.c.)投與GluGLP-i促致劑化合物6對北/肋小 鼠體内在經6週處理期間之HbAlc變化的作用。資料展示 為平均值+SEM，其中每組n=U。與相同時間點之媒劑相 tt»，*ρ<〇,〇5 , **ρ<〇·〇1 , ***ρ<〇.〇〇ι 〇 圖2 .皮下（s.c.)投與GluGLP-l促欵劑化合物6對北/(113小 鼠體内在經6週處理期間之體重增加的作用。資料給定為 平均值+SEM，其中每組n=ll。與媒劑相比，**p<〇〇1， *"p<0.001。 圖3 ·皮下（s.c.)投與GluGLP-1促致劑化合物6對高脂肪 飯飼C57BL/6J小鼠之體重的作用。資料為平均值士 SEM。 圖4 ·皮下（s.c.)投與GluGLP-l促致劑化合物6對高脂肪 银飼C57BL/6J小鼠在OGTT期間之葡萄糖曲線（AUC)下面 積的作用。資料為平均值+SEM。*p<〇 ()5。 圖5 :在歷時3週每天兩次以媒劑（PBS)、10 nmol/kg腸促 騰島素-4或10 nmol/kg化合物6處理（皮下）之前，對已高脂 肪飲食30週之小鼠處理3週對脂質的作用^ CHO :總膽固 醇；HDL :高密度膽固醇；LDL :低密度膽固醇；TRIG : 甘油三酯；HDL/LDL : HDL與LDL之比率。 圖6 :化合物6及化合物7對高脂肪餵飼C57BL/6J小鼠之 體重增加的作用。 156944.doc -42-

Claims (1)

1. 201202265 七、申請專利範圍： 1. 一種具有下式之化合物， R^X-Z-R2 其中 R1為Η、Cm烷基、乙醯基、甲醯基、苄醯基或三氟乙 醯基； R2 為 OH 或 NH2 ; X為具有式I之肽： His-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-X16-X 17-Arg-Ala-X20-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-X27-X28-X29(I)， 其中 X2係選自Ser及Aib ; 又16係選自0111及丫； 又17係選自入巧及丫； X20係選自Lys及Y ; Χ27係選自Leu及Υ ; Χ28係選自Ser及Υ或不存在； Χ29為Ala或不存在； 其中X16、X17、X20、X27及X28中之至少一者為Y ; 其中每一殘基Y獨立地選自Lys、Cys及Orn ; 其中X之至少一個胺基酸殘基Y之側鏈與具有下式之親 脂性取代基結合： (i) Ζ1，其中Ζ1為與Υ之側鏈直接結合之親脂性部分 156944.doc 201202265 :或 (ii) Z^2，其中Z1為親脂性部分，Z2為間隔基，且Z1經 由Z2與Y之側鏈結合； 且Z不存在或為1至20個選自由Ala、Leu、Ser、Thr、 Tyr、Cys、Glu、Lys、Arg、Dbu、Dpr及 Orn組成之群之 胺基酸單元的序列； 或其醫藥學上可接受之鹽。 2. 如請求項1之化合物，其具有序列： HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLKSA HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLSA HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLLKA HSQGTFTSDYSKYLDKRRAKDFIEWLLSA HSQGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA H-Aib-QGTFTSDYSKYLDEKRAKDFIEWLLSA。 3. 如請求項1或2之化合物，其中該親脂性取代基係連接至 位置 16、17、20、27或 28上。 4. 如前述請求項中任一項之化合物，其中R1為Η。 5. 如前述請求項中任一項之化合物，其中R2為ΝΗ2。 6. 如前述請求項中任一項之化合物，其具有序列： H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWL-K(十六烷醯 基-異 G1u)-SA-NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRA-K(十六烷醯基-異 Glu)-DFIEWLLSA-NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDERRAKDFIEWLL-K(十六烷醯 156944.doc -2- 201202265 基-異 G1u)-A-NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLD-K(十六院醯基-異 Glu)-RRAKDFIEWLLSA-NH2 H-HSQGTFTSDYSKYLDE-K(十六炫醢基-異 Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2 H-H-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷醯基-異 Glu)-RAKDFIEWLLSA-NH2。 7. 如前述請求項中任一項之化合物，其中該化合物（例如肽 X)中之一或多個胺基酸側鏈與聚合部分結合。 8. 一種組合物，其包含與載劑混合之如請求項1至7中任一 項之化合物或其鹽或衍生物。 9. 如請求項8之組合物，其中該組合物為醫藥學上可接受 之組合物，且該載劑為醫藥學上可接受之載劑。 10. 如請求項1至7中任一項之化合物，其係用於醫學治療方 法中。 11. 如請求項1至7中任一項之化合物，其係用於為有此需要 之個體中預防增重或促進減重。 12. 如請求項1至7中任一項之化合物，其係用於為有此需要 之個體中減少循環中LDL含量及/或提高HDL/LDL比率之 方法中。 13. —種如請求項1至7中任一項之化合物之用途，其係用於 為有此需要之個體治療由超重引起或以其為特徵之病狀 的方法中，例如治療i/或預防肥胖症、病態肥胖症、手 術前之病態肥胖症、肥胖症相關之炎症、肥胖症相關之 156944.doc 201202265 膽囊疾病、肥胖症誘發之睡眠呼吸暫停、古 r 巧血厘、致動 脈粥樣硬化性血脂異常、動脈粥樣硬化、動脈硬化、冠 心病、周邊動脈疾病、中風或微血管疾病。 μ.如請求物至13中任一項之化合物、用途或方法，其中 該化合物作為與用於治療肥胖症、血脂異常或高血壓之 藥劑之組合療法之一部分投與。 15. 如明求項14之化合物、用途或方法，其中該用於治療肥 胖症之藥劑為升糖素樣肽受體丨促效劑、肽或其類似 物、大麻驗受體1括抗劑、脂肪酶抑制m素受體4 促效劑或黑色素集中激素受體1拮抗劑。 16. 士 ：求項14之化合物用途或方法，其中該用於治療高 企壓之藥劑為灰管收縮素轉化酶抑制劑、血管收縮素η 又體阻斷劑、利尿劑、β·阻斷劑或鈣離子通道阻斷劑。 17. :¾ π求項14之化合物用途或方法，其中該用於治療血 、吊之藥劑為抑制素（statin)、纖維酸酯（Hbrate)、於 鹼及/或膽固醇吸收抑制劑。 156944.doc