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MX2012013187A - Proteinas de union de il-1. - Google Patents

Proteinas de union de il-1.

Info

Publication number
MX2012013187A
MX2012013187A MX2012013187A MX2012013187A MX2012013187A MX 2012013187 A MX2012013187 A MX 2012013187A MX 2012013187 A MX2012013187 A MX 2012013187A MX 2012013187 A MX2012013187 A MX 2012013187A MX 2012013187 A MX2012013187 A MX 2012013187A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
binding protein
disease
syndrome
seq
antibody
Prior art date
Application number
MX2012013187A
Other languages
English (en)
Inventor
Chengbin Wu
Tariq Ghayur
Chung-Ming Hsieh
Dominic J Ambrosi
Original Assignee
Abbvie Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44911961&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2012013187(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Abbvie Inc filed Critical Abbvie Inc
Publication of MX2012013187A publication Critical patent/MX2012013187A/es

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/245—IL-1
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Abstract

Se describen proteínas que unen IL-la e lL-1ß junto con su uso en composiciones y métodos para tratar, prevenir y diagnosticar desórdenes relacionados con IL-1 y para detectar IL-1a e IL-1ß en células, tejidos, muestras y composiciones.

Description

PROTEÍNAS DE UNIÓN A IL-1 REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud provisional estadounidense N° 61/334917, presentada el 14 de Mayo de 2010, y de la Solicitud provisional estadounidense N° 61/425701, presentada el 21 de Diciembre de 2010, cuyos contenidos se incorporan en su totalidad en la presente a modo de referencia.
Campo de la invención La presente invención se relaciona con proteínas de unión a la IL-1, y específicamente con su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades inmunológicas agudas y crónicas, tales como la artritis reumática, la osteoartritis, la psoriasis, la esclerosis múltiple y otras enfermedades autoinmunes.
Antecedentes de la invención Las citocinas, tales como la interleuquina-1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral (TNF), son moléculas que se producen en una variedad de células, tales como los monocitos y los macrofagos, que sirven como mediadores de los procesos inflamatorios. La interleuquina-1 es una citocina que presenta un amplio rango de efectos biológicos y fisiológicos, que incluyen la fiebre, la síntesis de prostaglandinas (por ejemplo, en los fibroblastos, en las células musculares y en las células endoteliales), la activación de los linfocitos T y la producción de interleuquina-2.
Los miembros originales de la superfamilia de la IL-1 son la I L- 1 a , la t L- 1 ß y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1Ra, IL-1RA, I L-1 ra, IL-1Ra). La IL-1 a y la I L- 1 ß son citocinas proinflamatorias que están relacionadas con la defensa inmune contra las infecciones. El IL-1Ra es una molécula que compite por la unión al receptor con la I L- 1 a y la IL-1ß, de manera tal de bloquear su participación en la activación inmune. Durante los últimos, se han incorporado otras moléculas a la superfamilia. de la IL-1, que incluyen la IL-18 (véase Dinarello (1994) FASEB J. 8(15): 1314-3225; Huising et al., (2004) Dev. Comp. Immunol. 28(5): 395-413) y otros seis genes que presentan homología estructural con la I L-1 a, la I L- ß o el IL-1RA. Estos últimos seis miembros se denominan IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9 e IL1F10. Por consiguiente, la I L- a , la IL-?ß y el IL-1RA se renombraron como IL-1 F 1 , IL-1F2 e IL-1F3, respectivamente (véase Sims et al., (2001) Trends Immunol., 22(10): 536-537; Dunn et al., (2001) Trends Immunol., 22(10): 533-536). Se ha descrito un miembro putativo de la familia de la IL-1 denominado IL-33 o IL-1F11, aunque este nombre no está aceptado oficialmente en la base de datos de nomenclatura de la familia de genes HGNC.
Tanto la I L- a como la I L- 1 ß son producidas por los macrófagos, los monocitos y las células dendríticas. Constituyen una parte importante de la respuesta inflamatoria del cuerpo contra una infección. Estas citocinas incrementan la expresión de los factores de adhesión sobre las células endoteliales para permitir la transmigración hacia los sitios de infección de leucocitos, que son las células que luchan contra los patógenos, y permiten definir el centro termorregulador del hipotálamo, lo que da como resultado una mayor temperatura corporal, que se manifiesta en forma de fiebre. Por ello, la IL-1 se conoce como un pirógeno endógeno. El incremento de la temperatura corporal le ayuda al sistema inmune del cuerpo a luchar contra la infección. La IL-1 también es importante en la regulación de la hematopoyesis. La producción de IL-?ß en los tejidos periféricos también se ha asociado a la hiperalgesia (una mayor sensibilidad al dolor) asociada a la fiebre (Morgan et al., (2004) Brain Res., 1022(1-2): 96-100). Por lo general, estas dos formas de la IL-1 se unen al mismo receptor celular. Este receptor está compuesto por dos subunidades relacionadas, pero no idénticas, que transmiten señales intracelulares a través de una vía que es compartida notablemente con otros receptores determinados. Estos incluyen los receptores inmunes innatos de la familia Toll y el receptor de IL-18. La IL-1 a y la I L- 1 ß también poseen propiedades biológicas similares, que incluyen la inducción de fiebre, el sueño de ondas lentas y la neutrofilia, la activación de los linfocitos T y B, la proliferación de los fibroblastos, la citotoxicidad para determinadas células, la inducción de las colagenasas, la síntesis de las proteínas hepáticas de fase aguda y la producción incrementada del factor estimulador de colonias y del colágeno.
Se han aislado y expresado los cDNA que codifican las dos formas distintas de la IL-1. Estos cDNA representan dos productos genéticos diferentes, que se conocen como la I L - ß (Auron et al., (1984) Proc.
Nati. Acad. Sci. USA 81: 7909) y la IL-1a (Lomedico et al., (1984) ?/afure 312: 458). La I L- 1 ß es la forma predominante que es producida por los monocitos humanos, tanto a nivel del mRNA y como a nivel de las proteínas. Las dos formas de la IL-1 humana solamente comparten 26% de homología a nivel de los aminoácidos. A pesar de que las secuencias de los polipéptidos son diferentes, las dos formas de la IL-1 presentan similitudes estructurales (Auron et al., (1985) J. Mol. Cell Immunol., 2: 169), por lo que la homología a nivel de los aminoácidos está confinada a regiones discretas de la molécula de IL-1.
La I L- 1 a y la I L- 1 ß se producen como péptidos precursores. En otras palabras, son elaboradas como una proteína larga que luego es procesada para liberar una molécula activa, más corta, que se conoce como la proteína madura. La IL-?ß madura, por ejemplo, es liberada de la pro-I L-1 p después de la escisión por un miembro determinado de la familia de proteínas caspasas, que se conoce como la caspasa-1, o por la enzima convertidora de interleuquina- (ICE). La estructura tridimensional de las formas maduras de cada miembro de la superfamilia de la IL-1 humana está compuesta por 12-14 filamentos ß que producen una proteína con forma de barril.
Aunque se han descrito diversos anticuerpos para la IL-1 durante las dos décadas de trabajo que sucedieron al descubrimiento de esta citocina proinflamatoria crítica, subsiste la necesidad de anticuerpos mejorados que puedan neutralizar la actividad de la IL-1 en la respuesta inflamatoria y en los trastornos autoinmunes, o que puedan neutralizarla de manera efectiva, y que también puedan usarse para detectar la IL-?ß en muestras y tejidos.
Breve descripción de la invención Esta invención se relaciona con proteínas que se unen a la I L- 1 a y la I L- 1 ß humanas. Las proteínas de unión de la invención incluyen, pero no están limitadas a, los anticuerpos, las porciones de unión al antígeno de éstos y las proteínas de unión multivalentes o multiespecíficas, tales como las proteínas de unión DVD-lg™, que pueden unirse a la I L- 1 a y la IL-?ß humanas. En la invención también se proveen métodos para preparar y usar las proteínas de unión a la I L- 1 a y la t L- 1 ß que se describen en la presente, así como diversas composiciones que pueden usarse en métodos para detectar la I L- 1 a y la l L - 1 ß en una muestra, o bien en métodos para tratar o prevenir un trastorno asociado a la actividad de la IL-1, o del que se sospeche que esté asociado a dicha actividad en un individuo.
En una modalidad, la invención provee una proteína de unión que comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica, donde dicha cadena polipeptídica comprende VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un conector con la condición de que no sea CH1.
X2 es una región Fe; y n es independientemente 0 ó 1; y donde dicha segunda cadena polipeptídica comprende un segundo VD1- (X1)n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un conector con la condición de que no sea CH1.
X2 no comprende una región Fe; y n es independientemente 0 ó 1; donde, en dicha primera cadena polipeptídica, VD1 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 60-148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 y 210, y VD2 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 213 y 227; donde, en dicha segunda cadena polipeptídica, VD1 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 149-189, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209 y 211, y VD2 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 216 y 229; y donde la proteína de unión se une a la IL-?ß humana y a la IL-1a humana.
En una modalidad, una proteína de unión como la que se describió con anterioridad comprende una primera cadena polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 212, 217, 226, 230, 232, 234 y 236.
En otra modalidad, una proteína de unión como la que se describió con anterioridad comprende una segunda cadena polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 215, 218, 228, 231, 233, 235 y 237.
En otro aspecto de la invención, se provee una proteína de unión que comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica, donde dicha cadena polipeptídica comprende VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un conector con la condición de que no sea CH1.
X2 es una región Fe; y n es independientemente 0 ó 1; y donde dicha segunda cadena polipeptídica comprende un segundo VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un conector con la condición de que no sea CH1.
X2 no comprende una región Fe; y n es independientemente 0 ó 1; donde, en dicha primera cadena polipeptídica, VD1 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 213 y 227, y VD2 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 60-148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 y 210; donde, en dicha segunda cadena polipeptídica, VD1 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 216 y 229, y VD2 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 149-189, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209 y 211; y donde la proteína de unión se une a la I L- 1 ß humana y a la IL-1a humana.
En otra modalidad, una proteína de unión como la que se describió con anterioridad comprende una primera cadena polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 219 y 221.
En otra modalidad, una proteína de unión como la que se describió con anterioridad comprende una segunda cadena polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 220 y 222.
En otro aspecto, en la invención se provee una proteína de unión como la que se describió con anterioridad, donde cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 212, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 215, 228, 231, 233 y 235; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 217, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 218 y 237; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 219, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 220; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 221, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 222; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 226, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 228, 215, 231, 233 y 235; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 230, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 231, 215, 228, 233 y 235; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 232, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 233, 215, 228, 231 y 235; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 234, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 235, 215, 228, 231, y 233; y cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 236, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 237.
En otro aspecto, en la invención se provee una proteína como la que se describió con anterioridad, donde dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 212 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 215; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 217 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 218; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 219 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 220; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 221 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 222; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 226 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 228; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 230 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 231, o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 232 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 233; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 234 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 235; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 236 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 237.
En una modalidad, una proteína de unión de la invención, tal como la que se describió con anterioridad, comprende dos primeras cadenas polipeptidicas y dos segundas cadenas polipeptidicas.
En otro aspecto, en una proteína de unión como la que se describió con anterioridad, X1 o X2 son una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 26-57, 233, 224 y 225.
En otra modalidad, en la invención se provee una proteína de unión como la que se describió con anterioridad, donde la región Fe se selecciona del grupo que consiste en una región Fe con una secuencia nativa y una región Fe con una secuencia que es una variante. En aún otra modalidad, la región Fe se selecciona del grupo que consiste en una región Fe de una IgG 1 , una lgG2, una lgG3, una lgG4, una IgA, una IgM, una IgE o una IgD.
En otra modalidad, en la invención se provee un conjugado con una proteína de unión, que comprende una proteína de unión como la que se describió con anterioridad y que también comprende un agente. El agente puede incluir, sin limitaciones, una molécula de inmunoadhesión, un agente para el diagnóstico por imágenes, un agente terapéutico y un agente citotóxico. Los agentes preferidos para el diagnóstico por imágenes incluyen, sin limitaciones, una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética y la biotina. Las radiomarcas preferidas incluyen, sin limitaciones, 3H. 1 C, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 31l, 177Lu, 166Ho y 153Sm. Los agente terapéuticos o citotóxicos preferidos incluyen, sin limitaciones, un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, una toxina y un agente apoptótico.
En la invención también se provee una proteína de unión que comprende un dominio de unión al antígeno, donde la proteína de unión puede unirse a la IL-?ß humana y el dominio de unión al antígeno comprende seis CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, que son como se las define a continuación: CDR-H1: ?,-?-D-M-S (SEQ ID N° 190), donde XT es S, K O R; CDR-H2: Y-X2-S-X4-G-G-X7-G-T-Y-Y-P-D-X14-X15-K-G (SEQ ID N° 191), donde X2 es I o V; X4 es S o H; X7 es G o A; X14 es T o S; y X15 es V o A; CDR-H3: G-G-V-X4-K-G-X7-F-D-X10 (SEQ ID N° 192), donde X4 es T o Y; X7 es Y o C; y X10 es V, E, L, M, Q o Y; CDR-L1: R-A-S-G-N-I-X7-X8-X9-L-X11 (SEQ ID N° 193), donde X7 es H, Y o W; X8 es N, G, T, Q, E, H, D o K; X9 es Y o W; y X es T, A o N; CDR-L2: X1-A-K-X4-L-X6-X7 (SEQ ID N° 194), donde X! es N, Q o D; X4 es T, N, I, E o S; X6 es A, M o E; y X7 es D, E, S o A; y CDR-L3: Q-X2-F-W-X5-X6-P-X8-X9 (SEQ ID N° 195), donde X2 es H o Q; X5 es S, N, T, K, R o M; X6 es I o L; X8 es Y o A; y X9 es T, I o N; excepto que, cuando CDR-H1 es S-Y-D-M-S (SEQ ID N° 17), luego CDR-H2 no puede ser Y-l-S-S-G-G-G-G-T-Y-Y-P-D-T-V-K-G (SEQ ID N° 18); CDR-H3 no puede ser G-G-V-T-K-G-Y-F-D-V (SEQ ID N° 19); CDR-L1 no puede ser R-A-S-G-N-l-H-N-Y-L-T (SEQ ID N° 20); CDR-L2 no puede ser N-A-K-T-L-A-D (SEQ ID N° 21); y CDR-L3 no puede ser Q-H-F-W-S-l-P-Y-T (SEQ ID N° 22).
En una modalidad, una proteína de unión aislada como la que se describió con anterioridad comprende al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del siguiente grupo de secuencias CDR que consisten de: En otra modalidad, una proteína de unión como la que se describió con anterioridad comprende al menos tres CDR, donde las tres CDR provienen de un conjunto de CDR que se selecciona del siguiente grupo de conjuntos de CDR: En una modalidad, una proteina de unión como la que se describió con anterioridad comprende CDR de dos conjuntos de CDR que se seleccionan del grupo de conjuntos de CDR que se describió con anterioridad.
En otra modalidad, en la invención se provee una proteína de unión que comprende CDR de dos conjuntos de CDR del grupo anterior, donde los dos conjuntos de CDR se seleccionan del siguiente grupo: En otra modalidad, la proteína de unión que se describió con anterioridad también comprende un marco de trabajo aceptor humano. Preferiblemente, el marco de trabajo humano comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 7-10, 13-16, 25, 240-316 y 317-381. En una modalidad, una proteína de unión de la invención comprende una secuencia del marco de trabajo humano que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 7-10 y 13-16.
Proteínas de unión de la invención incluyen aquéllas que coprenden un marco de trabajo de aceptor humano comprendiendo al menos una substitución de aminoácido de región de marco, en donde la secuencia de aminoácido del marco de trabajo es al menos 65% idéntico a la secuencia de dicho marco de trabajo aceptor humano y coprende al menos 70 residuos de aminoácido idéntico a dicho marco de trabajo aceptor humano.
En otra modalidad, una proteína de unión de la invención comprende un marco de trabajo aceptor humano, donde dicho marco de trabajo aceptor comprende al menos una sustitución de aminoácido en un residuo clave en la región del marco de trabajo, donde el residuo clave se selecciona del grupo que consiste en un residuo adyacente a una CDR, un residuo de un sitio de glicosilación, un residuo raro, un residuo capaz de ¡nteractuar con la l L- 1 ß humana, un residuo capaz de interactuar con una CDR, un residuo canónico, un residuo de contacto entre una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, un residuo en una zona de Vernier y un residuo en una región de superposición entre la CDR1 de una cadena pesada variable, de acuerdo con la definición de Chotia, y el primer marco de una cadena pesada, de acuerdo con la definición de Kabat. En un ejemplo de una modalidad, una proteína de unión de la invención comprende un residuo clave, donde dicho residuo clave se selecciona del grupo que consiste en 2H, 4H, 24H, 26H, 27H, 29H, 34H, 35H, 37H, 39H, 44H, 45H, 47H, 48H, 49H, 50H, 51H, 58H, 59H, 60H, 63H, 67H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H, 91H, 93H, 94H, 2L, 4L, 25L, 29L, 27bL, 33L, 34L, 36L, 38L, 43L, 44L, 46L, 47L, 48L, 49L, 55L, 58L, 62L, 64L, 71L, 87L, 89L, 90L, 91L, 94L y 95L (todos de acuerdo con la numeración de Kabat). Un ejemplo de un subconjunto de estos residuos para la humanización de una proteína de unión de la invención consiste en 27H, 48H, 67H, 69H, 93H, 36L, 43L, 46L, 47L, 49L, 58L, 71L y 87L.
En otra modalidad, una proteína de unión de la invención comprende un dominio variable humano de consenso.
En una modalidad, una proteína de unión a la ??_-1ß de la invención comprende al menos un dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 60-189.
En otra modalidad, una proteína de unión de la invención comprende al menos una región (o un dominio) variable de la cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 60-148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 y 210, En otra modalidad, una proteína de unión de acuerdo con la invención comprende al menos una región (o un dominio) variable de la cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 149-189.
En aún otra modalidad, una proteína de unión de acuerdo con la invención comprende al menos una región VH que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 60-148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 y 210 y al menos una región VL que comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 149-189, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209 y 211.
En una modalidad, una proteína de unión de acuerdo con la invención comprende dos dominios variables, donde los dos dominios variables comprenden secuencias de aminoácidos que se seleccionan del siguiente grupo: En otra modalidad, una proteína de unión a la I L - 1 ß como las que se describen en la presente se selecciona del grupo que consiste en una molécula de inmunoglobulina, un fragmento scFv, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv y un fragmento Fv unido por enlaces disulfuro.
En un aspecto de la invención, una proteina de unión como las que se describen en la presente puede modular una función biológica de la IL-1. En otro aspecto, una proteína de unión como las que se describen en la presente puede neutralizar la IL-1.
En una modalidad, una proteina de unión como las que se describen en la presente tiene una constante de activación (Kon) con relación a la I L- ß que se selecciona del grupo que consiste en al menos aproximadamente 102M"V1, al menos aproximadamente 103M"1s"1, al menos aproximadamente 104M"1s'1, al menos aproximadamente 105M"1s"1 y al menos aproximadamente 106M"V1, medida por resonancia de plasmón superficial.
En otra modalidad, una proteína de unión como las que se describen en la presente tiene una constante de desactivación (Koff) con relación a la I L- ß que se selecciona del grupo que consiste en a lo sumo aproximadamente 10"3s"1, a lo sumo aproximadamente 10" s'1, a lo sumo aproximadamente 10"5s"1 y a lo sumo aproximadamente 10"6s'1, medida por resonancia de plasmón superficial.
En otra modalidad, una proteína de unión como las que se describen en la presente tiene una constante de disociación (KD) con relación a la IL-?ß que se selecciona del grupo que consiste en a lo sumo aproximadamente 10"7 M, a lo sumo aproximadamente 10"8 M, a lo sumo aproximadamente 10"9 , a lo sumo aproximadamente 10"10 M, a lo sumo aproximadamente 10"11 M, a lo sumo aproximadamente 10'12 M y a lo sumo aproximadamente 10"13 M.
En un aspecto, en la invención se provee una construcción con una proteína de unión, que comprende una proteína de unión como las que se describen en la presente y que también comprende un conector o un dominio constante de inmunoglobulina. En una modalidad, la construcción con una proteína de unión comprende una proteína de unión, donde la proteína de unión se selecciona del grupo que consiste en una molécula de inmunoglobulina, un fragmento Fv unido por enlaces disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un fragmento scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con una CDR injertada, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un fragmento Fab, un anticuerpo con especificidad doble, un fragmento Fab', un anticuerpo biespecífico, un fragmento F(ab')2, una DVD-lg™ y un fragmento Fv.
En una modalidad preferida, la construcción con el anticuerpo comprende un dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina que se selecciona del grupo que consiste en un dominio constante de la IgM humana, un dominio constante de la IgG 1 humana, un dominio constante de la lgG2 humana, un dominio constante de la lgG3 humana, un dominio constante de la lgG4 humana, un dominio constante de la IgE humana y un dominio constante de la IgA humana.
En otra modalidad, una construcción con una proteína de unión comprende un dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 y SEQ ID N° 6.
En la invención también se provee un conjugado con una proteína de unión que comprende una construcción con una proteína de unión como las que se describen en la presente y que también comprende un agente que se selecciona del grupo que consiste una molécula de inmunoadhesión, un agente para el diagnóstico por imágenes, un agente terapéutico y un agente citotóxico. Los agentes para el diagnóstico por imágenes que son útiles como unidades de agentes en los conjugados con proteínas de unión que se describen en la presente incluyen, sin limitaciones, una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética y la biotina. En una modalidad, la radiomarca se selecciona del grupo que consiste en 3H. 1 C.35S, 90Y, "Te, 11ln, 125l, 131l, 177Lu, 66Ho y 153Sm.
En otra modalidad, un conjugado con una proteína de unión comprende un agente que es un agente terapéutico o citotóxico que se selecciona del grupo que consiste en un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, una toxina y un agente apoptótico.
En una modalidad, una proteína de unión, una construcción con una proteína de unión o un conjugado con una proteína de unión como los que se describen en la presente presentan un patrón de glicosilación humano.
Las proteínas de unión, las proteínas de unión en las construcciones con proteínas de unión y las proteínas de unión en los conjugados con proteínas de unión que se describen en la presente pueden existir como proteínas solubles o como cristales. En una modalidad, estos cristales son cristales farmacéuticos de liberación controlada que están libres de vehículos. En otra modalidad, una forma cristalina de una proteína de unión, de una construcción con una proteína de unión o de un conjugado con una proteína de unión como los que se describen en la presente presenta una vida media in vivo más prolongada que la de su contraparte soluble. En otra modalidad, un cristal de una proteína de unión, de una construcción con una proteína de unión o de un conjugado con una proteína de unión como los que se describen en la presente conserva su actividad biológica, en contraste con su contraparte soluble.
Las composiciones de la invención incluyen una composición para la liberación de una proteína de unión cristalizada, de una construcción con una proteína de unión o de un conjugado con una proteína de unión como los que se describen en la presente, que comprende (a) una formulación, donde dicha formulación comprende una proteína de unión cristalizada, una construcción con una proteína de unión o un conjugado con una proteína de unión como los que se describen en la presente, así como un ingrediente; y (b) al menos un vehículo polimérico.
Los vehículos poliméricos útiles en las composiciones de la invención incluyen, sin limitaciones, uno o más que pueden seleccionarse del grupo que consiste en el ácido poli(acrílico), los poli(cianoacrilatos), los poli(aminoácidos), los poli(anhídridos), los poli(depsipéptidos), los poli(ésteres), el ácido poli(láctico), el ácido poli(láctico-co-glicólico) o PLGA, el poli(b-hidroxibutirato), la poli(caprolactona), la poli(dioxanona), el poli(etilenglicol), la poli((hidroxipropil)metacrilamida, el poli[(organo)fosfaceno], los poli(ortoésteres), el alcohol poli(vinílico), la poli(vinilpirrolidona), los copolímeros de anhídrido maleico-éter alquilvinílico, los polioles plurónícos, la albúmina, el alginato, la celulosa y los derivados de celulosa, el colágeno, la fibrina, la gelatina, el ácido hialurónico, los oligosacáridos, los glucaminoglucanos y los polisacáridos sulfatados, así como las mezclas o los copolímeros de éstos.
En otro aspecto, un ingrediente de una composición de la invención se selecciona del grupo que consiste en la albúmina, la sacarosa, la trehalosa, el lactítol, la gelatina, la hidroxipropíl-ß-ciclodextrina, el metoxipolietilenglicol y el políetilenglicol.
En la invención también se proveen composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión, una construcción con una proteína de unión o un conjugado con una proteína de unión como los que se describen en la presente, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden comprender al menos un agente adicional que puede ser un agente terapéutico, un agente para el diagnóstico por imágenes, un agente citotóxico, un inhibidor de la angiogénesis, un inhibidor de cinasas, un bloqueador de las moléculas de coestimulación, un bloqueador de las moléculas de adhesión, un anticuerpo anti-citocina o un fragmento funcional de éste, el metotrexato, la ciclosporina, la rapamicina, FK506, una marca o un indicador detectable, un antagonista del TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, una droga antiinflamatoria no esteroidal (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteriode, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, una droga de reemplazo hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, una medicación para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un esteroide oral, una epinefrina o un análogo de ésta, una citocina y un antagonista de citocina.
En una modalidad, una composición farmacéutica de la invención comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, donde el vehículo también sirve como coadyuvante para incrementar la absorción o la dispersión de la proteína de unión, de la construcción con una proteína de unión o del conjugado con una proteína de unión en la composición. Un ejemplo de un coadyuvante es la hialuronidasa.
En otra modalidad, la composición farmacéutica también comprende al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en el cual la actividad de la ??_-1ß es perjudicial.
En una modalidad, en la invención se proveen ácidos nucleicos aislados que codifican una o más secuencias de aminoácidos de una proteína de unión como las que se describen en la presente. Estos ácidos nucleicos pueden insertarse en un vector para llevar a cabo diversos análisis genéticos o para expresar, caracterizar o mejorar una o más propiedades de una proteína de unión como las que se describen en la presente. Un vector puede comprender una o más moléculas de ácidos nucleicos que codifican una o más secuencias de aminoácidos de una proteína de unión como las que se describen en la presente, donde las una o más moléculas de ácidos nucleicos están unidas operativamente a secuencias reguladoras de la transcripción y/o la traducción apropiadas, que permiten expresar la proteína de unión en una célula huésped particular que contiene el vector. Los ejemplos de vectores para clonar o expresar los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos de las proteínas de unión que se describen en la presente incluyen, sin limitaciones, pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV y pBJ.
En la invención también se provee una célula huésped que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una o más secuencias de aminoácidos de una proteína de unión como las que se describen en la presente. Las células huésped útiles en la invención pueden ser procariotas o eucariotas. Un ejemplo de una célula huésped procariota es Escherichia coli. Las células eucariotas útiles como células huésped en la invención incluyen una célula protista, una célula animal, una célula vegetal o una célula fúngica. Un ejemplo de una célula fúngica es una célula de levadura, lo que abarca Saccharomyces cerevisiae Un ejemplo de una célula animal útil como célula huésped de acuerdo con la invención incluye, sin limitaciones, una célula de mamífero, una célula de ave o una célula de insecto. Las células de mamífero preferidas incluyen las células CHO y COS. Una célula de insecto útil como célula huésped de acuerdo con la invención es una célula de insecto Sf9.
En otro aspecto, en la invención se provee un método para producir una proteína de unión como las que se describen en la presente, que comprende cultivar una célula huésped que comprende un vector que codifica la proteína de unión en un medio de cultivo, bajo condiciones apropiadas para producir la proteína de unión que puede unirse a la I L- 1 a y/o la I L- 1 ß . La proteína producida de esta manera puede aislarse y usarse en diversas composiciones y métodos como los que se describen en la presente.
En otra modalidad, en la invención se provee un método para reducir la actividad de la IL-1 humana, que comprende poner en contacto la IL-1 humana con una proteína de unión como las que se describen en la presente, de manera tal de reducir la actividad de la IL-1 humana.
En otra modalidad de la invención, se provee un método para tratar un sujeto que padece un trastorno, que comprende administrarle al sujeto una proteína de unión como las que se describen en la presente, de manera tal de efectuar el tratamiento.
En otra modalidad, una proteína de unión como las que se describen en la presente es útil para tratar un trastorno del siguiente grupo: diabetes, uveitis, dolor neuropátíco, dolor osteoartítico, dolor inflamatorio, artritis reumática, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes autoinmune, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, escleroderma, enfermedad de injerto versus huésped, rechazo de transplante de órganos, enfermedad inmune aguda o crónica asociada al transplante de órganos, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada (DIC), enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitís microscópica de los ríñones, hepatitis crónica activa, uveítis autoinmune, shock séptico, síndrome de shock tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, malignidades, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, esporádica, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II (síndrome de Schmidt), síndrome agudo de dificultad respiratoria de adultos (ARDS), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerosa, sinovitis enteropática, artropatía asociada a Chlamydia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliácea, penfigoide, enfermedad por I g A lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica Coombs positiva, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes (GCA), hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (AIDS), enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia común variada (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, esterilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a enfermedades del tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a enfermedades del tejido conectivo mixtas, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémicas, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la artritis reumática, enfermedad pulmonar asociada al lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada a la dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada a la espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculitica, enfermedad pulmonar asociada a la hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por drogas, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterans, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar linfocítica infiltrante, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo- 1 (hepatitis autoinmune o lupoide clásica), hepatitis autoinmune tipo-2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, esterilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad al esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos, incluyendo la esclerosis múltiple primaria progresiva, la esclerosis múltiple secundaria progresiva y la esclerosis múltiple recurrente remitente), oftalmía simpática, hipertensión pulmonar secundaria a una enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumática, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjorgren, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenía autoinmune (AITP), trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroide autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primaria, uveítis facogénica, vasculitis primaria, vitíligo, enfermedad hepática aguda, enfermedad hepática crónica, cirrosis alcohólica, daño hepático inducido por alcohol, colestasis, enfermedad hepática idiosincrática, hepatitis inducida por drogas, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por tipo Th2 y tipo Th1, dolor agudo y crónico (distintas formas de dolor), cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga, de colon, de páncreas, de ovario, de próstata o rectal), malignidades hematopoyéticas, leucemia, linfoma, abetalipoproteinemia, acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos o crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL de las células T, ALL FAB, leucemia mieloide aguda (AML), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia del AIDS, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo a aloinjertos, déficit de alfa-1-antitripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina pectoris, degeneración de células del asta anterior, terapia anti-CD3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arterioesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación auricular (sostenida o paroxística), taquicardia auricular, bloqueo aurículoventricular, linfoma de células B, rechazo de injerto óseo, rechazo de transplante de médula ósea (BMT), bloqueo de ramas de haz de His, linfoma de Burkitt, acidez estomacal, arritmias cardiacas, síndrome de atontamiento cardiaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación a una derivación, rechazo al transplante de cartílago, degeneraciones de la corteza del cerebelo, trastornos del cerebelo, taquicardia auricular caótica o multifocal, trastornos asociados a la quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (C L), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), intoxicación crónica por salicilato, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis con cultivo negativo, fibrosis quística, trastornos asociados a una terapia con citocinas, demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica del dengue, dermatitis, afecciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad ateriosclerótica diabética, enfermedad de cuerpos difusos de Lewy, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos del ganglio basal, síndrome de Down en la edad madura, trastornos del movimiento inducidos por drogas que bloquean los receptores de dopamina del CNS, sensibilidad a drogas, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por el virus Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfo istiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo al implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos funcionales de las arterias periféricas, sepsis fúngicas, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo a injertos de cualquier órgano o tejido, sepsis Gram-negativa, sepsis Gram-positiva, granulomas debidos a organismos intracelulares, leucemia de células pilosas, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo al transplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, hemorragia, hepatitis A, arritmias del haz de His, infección por HlV/neuropatía por HIV, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimientos hiperquinéticos, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos de movimientos hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática (IPF), citotoxicidad mediada por anticuerpos, astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, lesiones por reperfusión isquémica, accidente cerebrovascular isquémico, artritis reumática juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo al transplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo al transplante de hígado, linfedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, metabólica/idiopática, migraña cefalea, trastorno mitocondrial multisistémico, enfermedad del tejido conectivo mixto, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de múltiples sistemas (Menzel Dejerine-Thomas Shy-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobacterium avium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodiplástico, infarto de miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar neonatal crónica, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica, linfoma no Hodgkins, oclusión de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos arteriales oclusivos, terapia con OKT3®, orquitis/epididimitis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo al transplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia maligna, rechazo al transplante de paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad del pericardio, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía neumocistitis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal y síndrome de cambios de piel), síndrome de post-perfusión, síndrome postbomba, síndrome de cardiotomía post-MI, preeclampsia, parálisis supranuclear progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsums, taquicardia por QRS estrecho regular, hipertensión renovascular, lesión por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, shock, anemia de células falsiformes, rechazo de aloinjertos de piel, síndrome de cambios de piel, rechazo al transplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelosas, miositis estreptococcica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxia sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumática juvenil de comienzo sistémico, telangiectasia, tromboangitis obliterans, trombocitopenia, toxicidad, transplantes, traumatismo/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades de las válvulas cardiacas, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado a virus, síndrome Wernicke-Korsakoff , síndrome Wilson, rechazo a xenoinjertos de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, polirradiculopatía inflamatoria desmielinizante aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, Alopecia areata, anafilaxis, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, anemia aplásica, aterosclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado a una infección de estreptococos, enteropatía autoinmune, pérdida de la audición autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), miocarditis autoinmune, falla ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquiectasias, penfigoide bulloso, enfermedad cardiovascular, síndrome antifosfolípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatrizal, síndrome clínicamente aislado (CIS) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico de la niñez, dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, diabetes mellitus, hernia de disco, prolapso de disco, anemia hemolítica inmune inducida por drogas, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barre (GBS), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad inflamatoria infecciosa ocular, enfermedad inflamatoria desmielinizante, enfermedad inflamatoria del corazón, enfermedad inflamatoria del riñon, iritis, queratitis, queratoconjuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de las células de Langerhans, Lívido reticularis, degeneración macular, poliangitis microscópica, morbus Bechterev, trastornos neuronales motores, penfigoide de la membrana mucosa, insuficiencia multiorgánica, miastenia gravis, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de las raíces nerviosas, neuropatía, hepatitis no-A no-B, neuritis óptica, osteolisis, JRA pauciarticular, enfermedad oclusiva arterial periférica (PAOD), enfermedad vascular periférica (PVD), enfermedad arterial periférica (PAD), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, JRA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendócrina, polimiositís, polimialgia reumática (PMR), síndrome de post-bomba, parkinsonismo primario, prostatitis, aplasia de glóbulos rojos pura, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, restenosis, enfermedad del corazón reumático, SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, pulmón de shock, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad del tejido conectivo asociada a siliconas, dermatosis de Sneddon-Wiikinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis temporal, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversa, TRAPS (síndrome periódico asociados al receptor del factor de necrosis tumoral de tipo 1 (TNFR), resistencia a insulina tipo B con Acanthosis nigricans), reacción alérgica de Tipo 1, diabetes de Tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP), vasculitis, conjuntivitis vernal, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome VKH), degeneración macular húmeda, cicatrización de heridas y artropatía asociada a Yersinia y Salmonella.
En una modalidad adicional del método precedente, la administración al sujeto comprende al menos un modo seleccionado entre las vías parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intraventricular, ¡ntracerebelosa, intracerebroventricular, intracolónica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraósea, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, ¡ntrapleural, intraprostática, intrapulmonar, ¡ntrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmica.
Otro aspecto de la invención es un método para tratar un paciente que padece un trastorno en el que la IL-1 es perjudicial, que comprende el paso de administrar una proteína de unión, una construcción con una proteína de unión o un conjugado con una proteína de unión como los que se describen en la presente, antes de la administración de un segundo agente, de manera concurrente con él o después de él, donde el segundo agente se selecciona del grupo que consiste en los esteroides inhalados, los agonistas beta, los agonistas beta de acción breve o prolongada, los antagonistas del leucotrieno o de los receptores de leucotrieno, ADVAIR, los inhibidores de la I g E , los anticuerpo anti- IgE, XOLAI , los inhibidores de la fosfodiesterasa, los inhibidores de la PDE4, las xantinas, las drogas anticolinérgicas, los agentes estabilizadores de los mastocitos, la cromolina, los inhibidores de la IL-4, los inhibidores de la IL-5, los inhibidores de la eotaxina/CCR3, los antagonistas de la histamina, los antagonistas de los receptores de histamina, los antagonistas de la prostaglandina D o de sus receptores, DP1 y CRTH2, los antagonistas del TNF, un fragmento soluble de un receptor del TNF, ENBREL, los antagonistas enzimáticos del TNF, los inhibidores de la enzima convertidora del TNF (TACE), los antagonistas de los receptores muscarínicos, los antagonistas del TGF-beta, el interferón gamma, la perfenidona, los agentes quimioterapéuticos, el metotrexato, la leflunomida, el sirolimus (la rapamicina) o un análogo de éste, CCI-779. los inhibidores de COX2 o de cPLA2, las NSAID, los ¡nmunomoduladores, los inhibidores de p38, los inhibidores de TPL-2, los inhibidores de MK-2, los inhibidores de NF B, la budenosida, el factor de crecimiento epidérmico, los corticosteroides, la ciclosporina, la sulfasalazina, los aminosalicilatos, la 6-mercaptopurina, la azatioprina, el metronidazol, los inhibidores de la lipoxigenasa, la mesalamina, la olsalazina, la balsalazida, los antioxidantes, los inhibidores del tromboxano, los antagonistas del receptor de IL-1, los anticuerpos anti-IL-?ß, los anticuerpos anti-IL-6, los factores de crecimiento, los inhibidores de la elastasa, los compuestos de piridinil-imidazol, los anticuerpos contra el TNF, la LT, la IL-2, la IL-3, la IL-4, la IL-5, la IL-6, la IL-7, la IL-8, la IL-9, la IL-10, la IL-11, la IL-12, la IL-14, la IL-15, la IL-16, la IL-17, la IL-18, la IL-19, la IL-20, la IL-21, la IL-22, la IL-23, la IL-24, la IL-25, la IL-26, la IL-27, la IL-28, la IL-29, la IL-30, la IL-31, la IL-32, la IL-33, EMAP-II, el GM-CSF, el FGF o el PDGF, o sus agonistas, los anticuerpos contra CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69 o CD90, o sus ligandos, FK506, la rapamicina, el mofetil micofenolato, el ¡buprofeno, la prednisolona, los inhibidores de la fosfodiesterasa, los agonistas de la adenosina, los agentes antitrombóticos, los inhibidores del complemento, los agentes adrenérgicos, los inhibidores de las cinasas IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP, los inhibidores de la enzima convertidora de la I L- 1 , los inhibidores de la enzima convertidora del TNFa, los inhibidores de la señalización de las células T, los inhibidores de metaloproteinasas, las 6-mercaptopurinas, los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, los receptores de citocinas solubles, los receptores del TNF p55 solubles, los receptores del TNF p75 solubles, si L-1 Rl , sIL-1RII, slL-6R, las citocinas antiinflamatorias, la IL-4, la IL-10, la IL-11 y el TGF-ß.
En otro aspecto de la invención, se provee al menos un anticuerpo anti-idiotipo IL-1 contra al menos una proteína de unión a la IL-1 como las que se describen en la presente. El anticuerpo anti-idiotipo incluye cualquier molécula que contiene una proteína o un péptido que comprende al menos una porción de una molécula de ¡nmunoglobulina, tal como, sin limitaciones, al menos una región de determinación de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una porción de unión al ligando de ésta, una región variable de la cadena pesada o de la cadena ligera, una región constante de la cadena pesada o ligera, una región de marco de trabajo o cualquier porción de ésta, que pueda incorporarse en una proteína de unión de la presente invención.
Descripción detallada de la invención Esta invención se relaciona con proteínas de unión a la t L- 1 ß , lo que abarca, sin limitaciones, anticuerpos anti-IL-?ß, o porciones de unión al antígeno de éstos que se unen a la I L- 1 ß , y proteínas de unión multivalentes o multiespecíficas, tales como DVD-lg™, que se unen a la I L- ß y a otro objetivo. Diversos aspectos de la invención se relacionan con anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, con proteínas de unión DVD-lg y con composiciones farmacéuticas que los comprenden, así como con ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células huésped para elaborar dichas proteínas de unión a la I L- 1 ß , lo que abarca los anticuerpos, las proteínas de unión DVD-lg y los fragmentos de éstos. Dentro del alcance de la invención también se incluyen métodos para usar las proteínas de unión a la l L- 1 ß de la invención en la detección de la I L- 1 , en la inhibición de la I L-1 ß humana, tanto in vitro como in vivo; y en la regulación de la expresión genética.
La invención también abarca cualquier proteína de unión o anticuerpo capaz de competir con una proteína de unión a la I L- ß como las que se describen en la presente.
A menos que se los defina de otro modo en la presente, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la presente invención tienen los significados que comúnmente les dan aquellos versados en la técnica. El significado y el alcance de los términos debería estar claro; sin embargo, en el caso en que haya una ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en la presente tendrán prioridad sobre cualquier definición de diccionario o extrínseca. Además, a menos que lo requiera de otro modo el contexto, los términos singulares incluirán las formas plurales y los términos plurales incluirán las formas singulares. En esta solicitud, el uso de "o" denota "y/o", a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluir", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitativo. También, los términos tales como "elemento" o "componente" abarcan los elementos y los componentes que constituyen una unidad, y los elementos y los componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
En general, las nomenclaturas usadas en conexión con el cultivo de células y tejidos, la biología molecular, la inmunología, la microbiología, la genética y la química y la hibridización de proteínas y ácidos nucleicos descritas en la presente, y los procedimientos correspondientes, son aquellos bien conocidos y de uso común en la técnica. Los métodos y los procedimientos de la presente invención generalmente se llevan a cabo de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se describen en esta especificación, a menos que se indique lo contrario. Las reacciones enzimáticas y los procedimientos de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como comúnmente se los lleva a cabo en la técnica o como se describe en la presente. Las nomenclaturas usadas en conexión con los procedimientos de laboratorio y los procesos de química analítica, la química de síntesis orgánica y la química farmacéutica descritas en la presente, y los procedimientos correspondientes, son aquellos bien conocidos y de uso común en la técnica. Se usan técnicas convencionales para la síntesis química, los análisis químicos, las preparaciones farmacéuticas, la formulación, la administración y el tratamiento de los pacientes.
Para que la presente invención se comprenda con mayor facilidad, a continuación se definen determinados términos selectos.
El término "polipéptido" hace referencia a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términos "péptido" y "proteína" se usan indistintamente con el término polipéptido, y también hacen referencia a una cadena polimérica de aminoácidos. El término "polipéptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteínas y análogos de polipéptidos de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. El término "polipéptido" abarca los fragmentos y las variantes (que incluyen los fragmentos de variantes) correspondientes, a menos que del contexto surja lo contrario. Para un polipéptido antigénico, un fragmento de polipéptido opcionalmente contiene al menos un epitope contiguo o no lineal. Los límites precisos del al menos un fragmento de epitope pueden confirmarse usando el conocimiento técnico usual. El fragmento comprende al menos aproximadamente 5 aminoácidos contiguos, tal como al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, o al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos. Una variante del polipéptido es como se describe en la presente.
El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" hace referencia a una proteína o un polipéptido que, en virtud de su origen o la fuente de la que deriva, no está asociado a los componentes con los que se asocia y que lo acompañan en su estado nativo; se halla sustancialmente libre de otras proteínas de la misma especie; es expresado por una célula de una especie diferente; o no aparece en la naturaleza. Por consiguiente, un polipéptido que es sintetizado por medios químicos o es sintetizado en un sistema celular diferente de la célula en la que se origina naturalmente estará "aislado" de los componentes con los que se halla asociado en la naturaleza. Una proteína también puede liberarse sustancialmente de los componentes con los que se halla asociada en la naturaleza si se la aisla usando procedimientos de purificación de proteínas bien conocidos en la técnica.
El término "recuperación" como se lo usa en la presente, hace referencia al proceso de liberar sustancialmente una especie química, tal como un polipéptido, de los componentes con los que está asociada en la naturaleza, lo que suele implicar su aislamiento, por ejemplo, con procedimientos de purificación de proteínas bien conocidos en la técnica.
El término "IL-1a humana" (que se abrevia en la presente hlL-1a o I L- 1 a) incluye una citocina pleiotrópica que participa en diversas respuestas inmunes, en los procesos inflamatorios y en la hematopoyesis. Por ejemplo, la I L- 1 a incluye la citocina humana que es producida por los macrófagos activados. Estimula la proliferación de los timocitos al inducir la liberación de IL-2, la maduración y la proliferación de las células B y la actividad del factor de crecimiento de los fibroblastos. El término I L- 1 a humana incluye la I L- a humana recombinante (rhlL-1 a), que puede prepararse con métodos de expresión recombinante convencionales.
El término " I L- 1 ß humana" (que se abrevia en la presente hlL-?ß o I L- 1 P) incluye una citocina pleiotrópica que participa en diversas respuestas inmunes, en los procesos inflamatorios y en la hematopoyesis. El término I L- 1 ß humana incluye la I L- 1 ß humana recombinante (rh I L- 1 ß ) , que puede prepararse con métodos de expresión recombinante convencionales.
En la tabla 1 se proveen las secuencias de aminoácidos de la IL- 1a y la I L- 1 ß humanas.
Tabla 1. Secuencias de la I L- 1 a humana y la I L- 1 ß humana Proteína Identificador de Secuencia secuencia 123456789012345678901234567890 IL-1a humana SEQ ID N° 1 SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFILNDAL madura NQ SIIRANDQYLTAAALHNLDEAVKFDMG AYK SSKDDAKITVILRISKTQLYVTAQDEDQ PV LLKEMPEIPKTITGSETNLLFFWETHGT KN YFTSVAHPNLFIATKQDYWVCLAGGPP SIT DFQILENQA término "actividad biológica" hace referencia a todas propiedades biológicas inherentes de la citocina IL-1, por ejemplo, I L-1 a y/o IL-?ß. Las propiedades biológicas de la IL-1a y la l L- 1 ß incluyen, sin limitaciones, la unión a los receptores de IL-1.
Los términos "unión específica" o "se une específicamente", como se lo usa en la presente, con referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido con una segunda especie química, significan que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epitope) sobre la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura proteica especifica en lugar de proteínas en general. Si un anticuerpo es específico para el epitope "A", la presencia de una molécula que contiene el epitope A (o A libre, sin marcar) en una reacción que contenga "A" marcado y el anticuerpo reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.
El término "anticuerpo", tal como se lo usa en la presente, hace referencia en términos generales a cualquier molécula inmunoglobulina (Ig) compuesta por cuatro cadenas de polipéptidos, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento funcional, mutante, variante o derivación de éstas, que retienen las características esenciales de unión al epitope de una molécula Ig. Estos formatos de anticuerpos mutantes, variantes o derivados son conocidos en la técnica. A continuación se describirán modalidades no limitativas de dichos formatos.
En un anticuerpo completo, cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (abreviada HCVR o VH en la presente) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (abreviada LCVR o VL en la presente) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera consiste en un dominio CL. Las regiones VH y VL pueden dividirse adicionalmente en regiones hipervariables, conocidas como regiones de determinación de la complementariedad (CDR), que están separadas por regiones conservadas, conocidas como regiones de marco (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas, desde el extremo aminoterminal hacia el extremo carboxiterminal, en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de ¡nmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG 1, lgG2, IgG 3, lgG4, lgA1 e lgA2) o subclase.
El término "región Fe" se usa para definir la región C-terminal de una cadena pesada de ¡nmunoglobulina, la cual puede generarse mediante la digestión con papaína de un anticuerpo intacto. La región Fe puede ser la secuencia de una región Fe nativa o de una variante de una región Fe. La región Fe de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. Los reemplazos de residuos de aminoácidos en la porción Fe para alterar la función efectora del anticuerpo son conocidos en la técnica (Winter, et al. Solicitudes de Patente de los Estados Unidos N° 5648260 y 5624821). La porción Fe de un anticuerpo es mediadora de diferentes funciones efectoras importantes, por ejemplo, la inducción de citocinas, la ADCC, la fagocitosis, la citotoxicidad mediada por complemento (CDC), y la velocidad de eliminación/vida media de los anticuerpos y los complejos antígeno-anticuerpo. En algunos casos, estas funciones efectoras son deseables para anticuerpos terapéuticos, pero en otros casos, puede ser innecesario o incluso perjudicial, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Determinados isotipos de la IgG humana, en particular IgG 1 e lgG3, son mediadores de la ADCC y la CDC a través de la unión a FcyRs y al complemento C1q, respectivamente. Los receptores Fe neonatales (FcRn) son componentes críticos en la determinación de la vida media en circulación de los anticuerpos. En aún otra modalidad, al menos un residuo de aminoácido es reemplazado en la región constante del anticuerpo, por ejemplo, la región Fe del anticuerpo, de manera que estas funciones efectoras del anticuerpo resultan alteradas. La dimerización de dos cadenas pesadas idénticas de una inmunoglobulina es mediada por la dimerización de los dominios CH3 y es estabilizada por los enlaces disulfuro dentro de la región bisagra (Huber et al. 415- 420 (1976); Thies et al., J. Mol. Biol., 293: 67-79 (1999)). La mutación de los residuos de cisteína dentro de las regiones bisagra para evitar los enlaces disulfuro entre la cadena pesada y la cadena pesada desestabiliza la dimerización de los dominios CH3. Se han identificado los residuos responsables de la dimerización CH3 (Dall'Acqua (1998) Biochem. 9266-9273 (1998)). Entonces, es posible generar una media Ig monovalente. Vale destacar que estas moléculas de medias Ig monovalentes han sido halladas en la naturaleza para las subclases IgG e IgA (Seligman 1978 Ann Immunol 129 C: 855-870 (1978); Biewenga et al., Clin. Exp. Immunol., 51: 395-400 (1983)). La estequiometría de la región FcRn: Ig Fe ha sido determinada como 2:1 (West et al., 2000 Biochemistry 39: 9698-9708), y media Fe es suficiente para mediar en la unión a FcRn (Kim et al 1994 Eur J Immunol; 24: 542-548 (1994)). Las mutaciones para alterar la dimerización del dominio CH3 pueden no tener efectos adversos mayores sobre su unión a FcRn, ya que los residuos importantes para la dimerización de CH3 están localizados en la interfase interior de la estructura de lámina b de CH3, mientras que la región responsable de la unión a FcRn está localizada en la interfase externa de los dominios de CH2-CH3. De todos modos, la molécula de media Ig puede tener determinadas ventajas en la penetración en los tejidos, debido a que tiene un tamaño menor que el de un anticuerpo regular. En una modalidad, se reemplaza al menos un residuo de aminoácido en la región constante de la proteína de unión de la invención, por ejemplo, la región Fe, con el fin de interrumpir la dimerización de las cadenas pesadas, lo que resulta en moléculas de media DVD-lg. La actividad antiinflamatoria de la IgG es completamente dependiente de la sililación del glicano unido a N del fragmento Fe de IgG. Se han determinado los requerimientos de glicano precisos para la actividad antiinflamatoria para crear un fragmento Fe de lgG1 apropiado y generar un Fe de I g G 1 completamente recombinante y sialilado con una potencia muy mejorada (Anthony et al., Science, 320:373-376 (2008)).
El término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo hace referencia a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, la hlL-13)· Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede ser llevada a cabo por fragmentos de un anticuerpo completo. Estas modalidades de los anticuerpos también abarcan los formatos biespecificos, con especificidad doble o multiespecíficos, que pueden unirse específicamente a dos o más antígenos diferentes (por ejemplo, la hlL-?ß y una molécula antigénica diferente, tal como la hlL-1ß y la hlL-1a). Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados por el término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos entre sí en la región bisagra a través de un enlace disulfuro; (iii) un fragmento Fd, que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv, que consiste en los dominios FL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región de determinación de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, a saber, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden conectarse uno con otro usando un conector sintético que les permita prepararlos como una sola cadena de proteína, donde las regiones VL y VH se apareen para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv); véanse, por ejemplo, Bird ef al. 423-426 (1988); y Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)). Dichos anticuerpos de cadena simple también se consideran dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. También se incluyen otras formas de anticuerpos, tales como los diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes y biespecíficos donde los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena de polipéptido, pero usando un conector que es demasiado corto para que los dos dominios se combinen en la misma cadena, con lo que se fuerza el apareamiento de dichos dominios con dominios complementarios de una cadena diferente y la formación de dos sitios de unión al antigeno (véanse, por ejemplo, Holliger, P., et al. 6444-6448 (1993); Poljak, R.J., Structure, 2: 1121-1123 (1994)). Estas porciones de unión de los anticuerpos son conocidas en la técnica (Kontermann y Dübel, editores, Antibody Engineering (Springer-Verlag, Nueva York, 2001), p. 790 (ISBN 3-540-41354-5)). Además, los anticuerpos de cadena simple también incluyen los "anticuerpos lineales", que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1), que junto con los polipéptidos complementarios de la cadena ligera, forman un par de regiones de unión al antígeno (Zapata et al 1057-1062 (1995), y Patente estadounidense N° 5641870).
Un dominio constante (C) de inmunoglobulina hace referencia a un dominio constante de una cadena pesada (CH) o ligera (CL). Las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de la cadena pesada y la cadena ligera de la IgG humana o murina son conocidas en la técnica.
El término "construcción con una proteína de unión a la IL-?ß" (o "construcción con una proteína de unión") hace referencia a un polipéptido que comprende una o más porciones de unión al antígeno de la invención unidas a un conector o a un dominio constante de inmunoglobulina. Los polipéptidos conectores comprenden dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, y se usan para unir una o más porciones de unión al antígeno. Los polipéptidos conectores son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Holliger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993); Poljak, R.J., Structure, 2: 1121-1123 (1994)). Un dominio constante de inmunoglobulina hace referencia a un dominio constante de una cadena pesada o ligera. Las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de la cadena pesada y la cadena ligera de la IgG humana son conocidas en la técnica y se representan en la tabla 2.
Tabla 2. Secuencias de dominios constantes de la cadena pesada y dominios constantes de la cadena ligera de la IgG humana Adicionalmente, una proteína de unión a la IL-?ß, tal como un anticuerpo o una porción de unión al antígeno de éste, puede ser parte de una molécula de ¡nmunoadhesión más grande, formadas medíante la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o la porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos. Los ejemplos de estas moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región central de la estreptavidina para preparar una molécula de scFv tetramérica ( ipriyanov, ef al. Hybridomas, 6: 93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptído marcador y una marca de polihistidina C-termínal para preparar moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S.M., eí al. Immunol.,. 31: 1047-1058 (1994)). Las porciones de los anticuerpos, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, pueden prepararse a partir de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tales como la digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Más aún, los anticuerpos, las porciones de anticuerpos y las moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse usando técnicas de DNA recombinante.
Un "anticuerpo aislado", como se lo usa en la presente, hace referencia a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos con especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a la h I L- 1 ß está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de la hlL- ß). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a la hlL-?ß puede presentar reactividad cruzada con otros antígenos, tal como moléculas de I L- 1 ß de otras especies. Más aún, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas.
El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" como se lo usa en la presente hace referencia un anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos; vale decir, los anticuerpos individuales que conforman la población son idénticos, excepto por las posibles mutaciones de ocurrencia natural que pudiera haber presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que están dirigidos contra un solo antígeno. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra determinantes (epitopes) diferentes, cada mAb está dirigido contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" no ha de denotar que la producción del anticuerpo tenga lugar de acuerdo con un método particular.
El término "anticuerpo humano" incluye aquellos anticuerpos que comprenden regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones que hayan sido introducidas por mutagénesis al azar o con especificidad de sitio in vitro, o por mutaciones somáticas in vivo), por ejemplo, en las CDR, y en particular, en CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se lo usa en la presente, no incluye anticuerpos donde se hayan injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como el ratón, en secuencias de regiones de marco humanas.
El término "anticuerpo humano recombinante", como se lo usa en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aislan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos que se expresan usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped (lo que se describirá más adelante en la Sección II C), los anticuerpos aislados de una biblioteca de combinación de anticuerpos humanos recombinantes (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 62-70 (1997); Azzazy y Highsmith, Clin. Biochem., 35: 425-445 (2002); Gavilondo y Larrick, BioTechniques, 29: 128-145 (2000); Hoogenboom y Chames, Immunol. Today, 21: 371-378 (2000)), los anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de ¡nmunoglobulinas humanas (véanse, por ejemplo, Taylor et al., Nucí. Acids Res., 20: 6287-6295 (1992); Kellermann y Green, Curr. Opin. Biotechnol., 13: 593-597 (2002); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370) o los anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados de acuerdo con cualquier otro medio que comprenda la separación de secuencias de genes de ¡nmunoglobulinas humanas para obtener otras secuencias de DNA. Estos anticuerpos humanos recombinantes tendrán regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana. Sin embargo, en determinadas modalidades, estos anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a una mutagénesis in iü' ro (o cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo), por lo que las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien derivan y están relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal, pueden no existir en el repertorio de anticuerpos de la línea germinal humana in vivo bajo condiciones naturales.
El término "anticuerpo quimérico" hace referencia a anticuerpos que comprenden secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera de una especie y secuencias de la región constante de otra especie, tal como anticuerpos donde las regiones variables de la cadena pesada y ligera murinas están ligadas a regiones constantes humanas.
El término "anticuerpo con una CDR injertada" hace referencia a anticuerpos que comprenden secuencias de regiones variables de las cadenas pesada y ligera de una especie, pero cuyas secuencias de una o más regiones CDR de VH y/o VL han sido reemplazadas por secuencias CDR de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de las cadenas pesada y ligera murinas, donde una o más de las CDR murinas (por ejemplo, CDR3) han sido reemplazadas por secuencias CDR humanas.
El término "CDR" hace referencia a la región de determinación de la complementariedad dentro de la secuencia variable de un anticuerpo. Para cada una de las regiones variables, hay tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera, que se denominan CDR1, CDR2 y CDR3 El término "conjunto de CDR" como se lo usa en la presente hace referencia al grupo de tres CDR que aparecen en una sola región variable capaz de unirse al antígeno. Los límites exactos de estas CDR han sido definidos en distintos términos de acuerdo con distintos sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Secuencias of Proteins of Immunological Interest (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, d. (1987) y (1991)) no solamente provee un sistema de numeración no ambiguo de los residuos que puede aplicarse a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también provee límites precisos para los residuos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden denominarse CDR Kabat. Chotia y colaboradores (Chotia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); y Chotia et al., Nature, 342: 877-883 (1989)) descubrieron que determinadas sub-porciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones casi idénticas en sus esqueletos peptidicos, a pesar de que hay una gran diversidad a nivel de las secuencias de aminoácidos. Estas sub-porciones se denominaron L 1 , L2 y L3 o H1, H2 y H3, donde "L" y "H" hacen referencia a las regiones de la cadena ligera y la cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden denominarse CDR Chotia, y tienen límites que se superponen con las CDR Kabat. Otros límites que definen CDR superpuestas con las CDR de Kabat fueron descritos por Padlan et al. (FASEB J. , 9: 133-139 (1995)) y MacCallum et al. (J. Mol. Biol., 262(5): 732-745 (1996)). Otras definiciones de los límites de las CDR pueden no ser estrictamente acordes con los sistemas anteriores, pero aún así pueden superponerse con las CDR de Kabat, aunque pueden estar acortadas o alargadas a la luz de las predicciones o los descubrimientos experimentales de que hay residuos o grupos de residuos particulares, o incluso CDR completas, que no afectan significativamente la unión al antígeno. En los métodos usados en la presente pueden emplearse CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque en modalidades preferidas se usan CDR definidas de acuerdo con Kabat o Chotia.
Los términos "numeración de Kabat", "definiciones de Kabat" y "nomenclatura de Kabat" se usan indistintamente en la presente. Estos términos, que son reconocidos en la técnica, hacen referencia a un sistema para numerar los residuos de aminoácidos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácidos en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo o en una porción de unión al antígeno de éste (Kabat ef al. NY Acad. Sci., 190: 382-391 (1971); y Kabat et al., Secuencias of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación del INS N° 91-3242 (1991)). Para la región variable de la cadena pesada, la región hipervariable se extiende entre las posiciones de los aminoácidos 31 y 35 para CDR1, entre las posiciones de los aminoácidos 50 y 65 para CDR2 y entre las posiciones de los aminoácidos 95 y 102 para CDR3. Para la región variable de la cadena ligera, la región hipervariable se extiende entre las posiciones de los aminoácidos 24 y 34 para CDR1, entre las posiciones de los aminoácidos 50 y 56 para CDR2 y entre las posiciones de los aminoácidos 89 y 97 para CDR3.
El crecimiento y el análisis de grandes bases de datos públicas de secuencias de aminoácidos de las regiones variables pesada y ligera durante los últimos veinte años han permitido comprender los límites típicos entre las regiones del marco de trabajo (FR) y las secuencias de las CDR dentro de las secuencias de la región variable, lo que les posibilitó a aquellos versados en la técnica determinar con precisión las CDR de acuerdo con la numeración de Kabat, la numeración de Chotia u otros sistemas. Véase, por ejemplo, Martin, "Proteína Secuencia and Structure Analysis of Antibody Variable Domains", capítulo 31 de Antibody Engineering (Kontermann y Dübel, editores) (Springer-Verlag, Berlín, 2001), especialmente las páginas 432-433. A continuación se provee un método útil para determinar las secuencias de aminoácidos de las CDR de Kabat dentro de las secuencias de aminoácidos de las regiones variable pesada (VH) y variable ligera (VL).
Parámetros para identificar la secuencia de aminoácidos de CDR-L1: • Comienza a aproximadamente 24 residuos de aminoácidos del extremo amino terminal de la región VL.
• El residuo anterior a la secuencia de CDR-L1 siempre es de cisteína (C).
· El residuo posterior a la secuencia de CDR-L1 siempre es un residuo de triptofano (W), típicamente Trp-Tyr-GIn (W-Y-Q), pero también Trp-Leu-GIn (W-L-Q), Trp-Phe-GIn (W-F-Q) y Trp-Tyr-Leu (W-Y-L).
• La longitud típicamente es de entre 10 y 17 residuos de aminoácidos.
Parámetros para identificar la secuencia de aminoácidos de CDR- L2: • Siempre comienza 16 residuos después del final de CDR-L1.
• Los residuos anteriores a la secuencia de CDR-L2 generalmente son lle-Tyr (l-Y), pero también Val-Tyr (V-Y), lle-Lys (l-K) y lle-Phe (l-F). • La longitud siempre es de 7 residuos de aminoácidos.
Parámetros para identificar la secuencia de aminoácidos de CDR- L3.
• Siempre comienza 33 aminoácidos después del final de CDR-L2. · El residuo anterior a la secuencia de aminoácidos de CDR-L3 siempre es de cisteína (C).
• Los residuos posteriores a la secuencia de CDR-L3 siempre son Phe-Gly-X-Gly (F-G-X-G) (SEQ ID N° 11), donde X es cualquier aminoácido.
· La longitud típicamente es de entre 7 y 11 residuos de aminoácidos.
Parámetros para identificar la secuencia de aminoácidos de CDR- H1: • Comienza a aproximadamente 31 residuos de aminoácidos del extremo amino de la región VH, y siempre 9 residuos después de una cisteína (C).
• Los residuos anteriores a la secuencia de CDR-H1 siempre son Cys-X-X-X-X-X-X-X-X (SEQ ID N° 12), donde X es cualquier aminoácido.
• El residuo posterior a la secuencia de CDR-H1 siempre es de Trp (W), típicamente Trp-Val (W-V), pero también Trp-lle (W-l) y Trp-Ala (W- A).
• La longitud típicamente es de entre 5 y 7 residuos de aminoácidos.
Parámetros para identificar la secuencia de aminoácidos de CDR-H2: • Siempre comienza 15 residuos de aminoácidos después del final de CDR-H1.
• Los residuos anteriores a la secuencia de CDR-H2 típicamente son Leu-Glu-Trp-lle-Gly (L-E-W-l-G) (SEQ ID N° 23), pero también son posibles variaciones de éstos.
• Los residuos después de la secuencia CDR-H2 son Lys/Arg-Leu/lle/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/l le/Ala (K/R-L/l/V/F/T/A-T/S/l/A).
• La longitud típicamente es de entre 16 y 19 residuos de aminoácidos.
Parámetros para identificar la secuencia de aminoácidos de CDR- H3: • Siempre comienza 33 residuos de aminoácidos después del final de CDR-H2, y siempre 3 residuos después de una cisteína (C)' • Los residuos anteriores a la secuencia de CDR-H3 siempre son Cys-X-X (C-X-X), donde X es cualquier aminoácido, típicamente Cys- Ala-Arg (C-A-R).
• Los residuos posteriores a la secuencia de CDR-H3 siempre son Trp-Gly-X-Gly (W-G-X-G) (SEQ ID N° 24), donde X es cualquier aminoácido.
· La longitud típicamente es de entre 3 y 25 residuos de aminoácidos.
Como se lo usa en la presente, el término residuo "canónico" hace referencia a un residuo en una CDR o un marco que define una estructura canónica de CDR particular, como lo definen Chotia et al. (J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)); y Chotia et al. (J. Mol. Biol., 227: 799- 817 (1992)), ambos incorporados en la presente a modo de referencia). De acuerdo con Chotia et al., las porciones críticas de las CDR de muchos anticuerpos tienen conformaciones del esqueleto peptídico casi idénticas, a pesar de su gran diversidad a nivel de la secuencia de aminoácidos. Cada estructura canónica especifica principalmente un conjunto de ángulos de torsión del esqueleto peptídico para un segmento contiguo de residuos de aminoácidos que forman un rizo.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" es un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más de sus CDR, alteraciones que pueden resultar en una mejora en la afinidad del anticuerpo por un antígeno objetivo, en comparación con la afinidad del anticuerpo progenitor, que no posee dichas alteraciones. Los ejemplos de anticuerpos madurados por afinidad tendrán afinidades por el antígeno objetivo en el orden nanomolar o aún picomolar. En la técnica se conocen diversos procedimientos para producir anticuerpos madurados por afinidad. Por ejemplo, en Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992), se describe la maduración por afinidad mediante el barajado de dominios VH y VL. La mutagénesis al azar de residuos de la CDR y/o del marco de trabajo se describe en Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147- 155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992). La mutación selectiva en posiciones de mutagénesis determinadas y en posiciones de contacto o de hipermutación por residuos de aminoácidos que potencian la actividad se describe en la Patente estadounidense N° 6914128 B1.
El término "proteína de unión multivalente" hace referencia a una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión al antígeno. La proteína de unión multivalente preferiblemente se diseña para que tenga tres o más sitios de unión al antígeno, y generalmente no es un anticuerpo de origen natural. El término "proteína de unión multiespecífica" hace referencia a una proteína de unión con la capacidad de unir dos o más objetivos relacionados o no relacionados. Las proteínas de unión con "dominios variables duales" (DVD-lg™) de la invención comprenden dos o más sitios de unión al antígeno y son proteínas de unión tetravalentes o multivalentes. Las DVD pueden ser monoespecíficas, es decir, capaces de unirse a un antígeno, o multiespecíficas, es decir, capaces de unirse a dos o más antígenos. Una proteína de unión DVD que comprende dos polipéptídos DVD de cadena pesada y dos polipéptídos DVD de cadena ligera se conoce como una "inmunoglobulina DVD" o "DVD-lg". Cada mitad de una Ig DVD comprende un polipéptido DVD de cadena pesada, y un polípéptido DVD de cadena ligera, y dos o más sitios de unión al antígeno. Cada sitio de unión comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, con la participación de un total de 6 CDR en la unión al antígeno por sitio de unión al antígeno.
Se provee una descripción del diseño, la expresión y la caracterización de las moléculas de DVD-lg en la Publicación PCT N° WO 2007/024715, en la Patente estadounidense N° 7612181 y en Wu et al., Nature Biotechnol. , 25: 1290-1297 (2007). Un ejemplo preferido de una de estas moléculas de DVD-lg comprende una cadena pesada que presenta la fórmula estructural VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, C es un dominio constante de la cadena pesada, X1 es un conector, con la condición de que no sea CH1, X2 es una región Fe y n es 0 ó 1, pero preferiblemente es 1, y una cadena ligera que presenta la fórmula estructural VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un conector, con la condición de que no sea CH1, X2 no comprende una región Fe y n es 0 ó 1, pero preferiblemente es 1. Esta DVD-lg puede comprender dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, donde cada cadena comprende dominios variables unidos en tándem, sin una región constante entre las regiones variables, donde una cadena pesada y una cadena ligera se asocian para formar sitios en tándem funcionales de unión al antígeno, y un par de cadenas pesadas y ligeras pueden asociarse a otro par de cadenas pesadas y ligeras para formar una proteína de unión tetramérica, con cuatro sitios funcionales de unión al antígeno. En otro ejemplo, una molécula de DVD-lg puede comprender cadenas pesadas y ligeras que comprenden tres dominios variables cada una (VD1, VD2, VD3), unidos en tándem, sin una región constante entre los dominios variables, donde un par de cadenas pesadas y ligeras pueden asociarse para formar tres sitios de unión al antígeno, y donde un par de cadenas pesadas y ligeras pueden asociarse a otro par de cadenas pesadas y ligeras para formar una proteína de unión tetramérica con seis sitios de unión al antígeno.
Una proteína de unión DVD-lg puede unirse a uno o más epitopes de la ??_-1ß. Una proteína de unión DVD-lg también puede unirse a un epitope de la I L- 1 ß y a un epitope de un segundo antígeno objetivo diferente de un polipéptido de ??_-1ß.
El término "anticuerpo biespecífico", como se lo usa en la presente, hace referencia a anticuerpos completos que son generados por medio de tecnología de quadroma (véase Milstein, C. y A.C. Cuello, Nature, 305. 305(5934): 537-540 (1983)), mediante la conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes (véase Staerz et al., Nature, 314: 628-631 (1985)) o a través de abordajes de prolongación-en-orificio, con los que se introducen mutaciones en la región Fe (véase Holliger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90(14): p. 6444-6448), lo que resulta en varias especies de inmunoglobulinas diferentes, una sola de las cuales es el anticuerpo biespecífico funcional. La fusión de las moléculas permite que un anticuerpo biespecífico se una a un antígeno (o a un epitope) en uno de sus brazos de unión (un par de HC/LC) y se una a un antígeno (o un epitope) diferente en su segundo brazo (un par diferente de HC/LC). De acuerdo con esta definición, un anticuerpo biespecífico tiene dos brazos de unión al antígeno diferentes (tanto en su especificidad como en las secuencias de sus CDR) y es monovalente para cada antígeno al que se une.
El término "anticuerpo con especificidad dual", como se lo usa en la presente, hace referencia a un anticuerpo completo que puede unirse a dos antígenos (o epitopes) diferentes en cada uno de sus brazos de unión (un par de HC/LC) (véase la Publicación PCT N° WO 02/02773). Por consiguiente, una proteína de unión con especificidad dual tiene dos brazos de unión al antígeno idénticos, con una especificidad idéntica y con secuencias CDR idénticas, y es bivalente para cada antígeno al que se une.
Un "sitio de unión al antígeno funcional" de una proteína de unión es uno que es capaz de unirse al antígeno objetivo. La afinidad de unión al antígeno del sitio de unión al antígeno no es necesariamente tan elevada como la del anticuerpo progenitor del que deriva el sitio de unión al antígeno, pero la capacidad de unirse al antígeno debe poder medirse usando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar la unión de un anticuerpo a un antígeno. Más aún, no es necesario que la afinidad de unión al antígeno de cada uno de los sitios de unión al antígeno de un anticuerpo multivalente de la presente sea cuantitativamente igual.
El término "citocina" es un término genérico para designar las proteínas liberadas por una población de células que actúan sobre otra población de células como mediadores intercelulares. Los ejemplos de citocinas incluyen las linfoquinas, las monoquinas y las hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen las hormonas de crecimiento, tales como la hormona de crecimiento humana, la N-metionil hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; la hormona paratiroidea; la tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la prorrelaxina; las hormonas glicoproteicas, tales como la hormona estimuladora de los folículos (FSH), la hormona estimuladora de la tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento de los fibroblastos; la prolactina; el lactógeno placentario; los factores de necrosis tumoral alfa (TNF-a) y beta (TNF-ß); la sustancia inhibidora mulleriana; el péptido asociado a la gonadotrofina de ratón; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento del endotelio vascular; la integrina; la trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento de los nervios, tales como NGF-alfa (NGF-a); el factor de crecimiento de las plaquetas; el factor de crecimiento de la placenta, los factores de crecimiento transformantes (TGF), tales como TGF-alfa (TGF-a) y TGF-beta (TGF-ß); los factores de crecimiento similares a la insulina 1 y 11; la eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductivos; interferones, tales como los interferones alfa (IFN-a), beta (IFN-ß) y gamma (IFN-?); los factores estimuladores de colonias (CSF), tales como el CSF de macrófagos (M-CSF), el CSF de granulocitos macrófagos (GM-CSF) y el CSF de granulocitos (G-CSF); las interleuquinas (IL), tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-22, IL-23, IL-33; un factor de necrosis tumoral, tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptidicos, incluyendo LIF y el ligando kit (KL). Como se lo usa en la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o cultivos de células recombinantes, y equivalentes con actividad biológica de las secuencias de citocinas nativas.
Como se los usa en la presente, los términos "donante" y "anticuerpo donante" hacen referencia a un anticuerpo que proporciona una o más CDR. En una modalidad preferida, el anticuerpo donante es un anticuerpo de una especie diferente del anticuerpo del que se obtienen o derivan las regiones de marco. En el contexto de un anticuerpo humanizado, el término "anticuerpo donante" hace referencia a un anticuerpo no humano que proporciona una o más CDR.
Como se lo usa en la presente, el término "marco" o "secuencia de marco" hace referencia a las secuencias restantes de una región variable menos las CDR. Como la definición exacta de una secuencia CDR puede determinarse usando distintos sistemas, el significado de una secuencia de marco está sujeto a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDR (CDR-L1, L2 y L3 de la cadena ligera y CDR-H1, H2 y H3 de la cadena pesada) también dividen las regiones de marco en la cadena ligera y en la cadena pesada en cuatro sub-regiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, donde CDR1 está localizada entre FR1 y FR2, CDR2 está localizada entre FR2 y FR3 y CDR3 está localizada entre FR3 y FR4. Sin especificar las sub-regiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región de marco, tal como la han definido otros, representa las FR combinadas en la región variable de una sola cadena de inmunoglobulina de ocurrencia natural. Como se la usa en la presente, una FR representa una de las cuatro sub-regiones, y las FR representan dos o más de las cuatro sub-regiones que constituyen una región de marco.
Como se los usa en la presente, los términos "aceptor" y "anticuerpo aceptor" hacen referencia al anticuerpo o la secuencia de ácido nucleico que proporciona o codifica al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 100% de las secuencias de aminoácidos de una o más de las regiones de marco. En algunas modalidades, el término "aceptor" hace referencia a la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos del anticuerpo que proporciona o codifica las regiones constantes. En aún otra modalidad, el término "aceptor" hace referencia a la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos del anticuerpo que proporciona o codifica una o más de las regiones de marco y las regiones constantes. En una modalidad específica, el término "aceptor" hace referencia a una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de un anticuerpo que proporciona o codifica al menos 80%, preferiblemente, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 100% de las secuencias de aminoácidos de una o más de las regiones de marco. De acuerdo con esta modalidad, un aceptor puede contener al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 10 residuos de aminoácidos que no aparecen en una o más posiciones específicas de un anticuerpo humano. Una región de marco aceptora y/o una región constante aceptora, por ejemplo, puede derivar o puede obtenerse a partir de un anticuerpo de la línea germinal, un gene de un anticuerpo maduro, un anticuerpo funcional (por ejemplo, anticuerpos bien conocidos en la técnica, anticuerpos en desarrollo, o anticuerpos disponibles comercialmente).
Las secuencias aceptoras de cadena pesada y ligera humanas son conocidas en la técnica. En una modalidad de la invención, la secuencias aceptoras de cadena pesada y cadena ligera humanas de la invención se seleccionan entre las secuencias enumeradas por V-base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) o por IMGT®, el sistema de información internacional ImMunoGeneTics®. (http://imgt.cines.fr/textes/IMGTrepertoire/LocusGenes/). En otra modalidad de la invención las secuencias aceptoras de cadena pesada y cadena ligera humanas de la invención se seleccionan entre las secuencias descritas en la tabla 3 y en la tabla 4.
Tabla 3. Secuencias aceptoras de la cadena pesada Tabla 4. Secuencias aceptoras de la cadena ligera Como se lo usa en la presente, el término "gene de anticuerpo de la línea germinal" o "fragmento de gene" hace referencia a una secuencia de inmunoglobulina codificada por células no linfoides que no han sufrido el proceso de maduración que conduce a un reordenamiento genético y mutación para la expresión de una inmunoglobulina particular (véanse, por ejemplo, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 13-30 (2001)). Una de las ventajas proporcionadas por las diversas modalidades de la presente invención deriva del descubrimiento de que los genes de anticuerpos de la línea germinal tienen mayores probabilidades que los genes de genes maduros de conservar estructuras esenciales en su secuencia de aminoácidos que son propias de los individuos de la especie, por lo que es menos probable que sean reconocidos como extraños cuando se los use con fines terapéuticos en dicha especie.
Como se lo usa en la presente, el término residuos "clave" hace referencia a determinados residuos dentro de la región variable que tienen un impacto mayor sobre la especificidad y/o la afinidad de unión de un anticuerpo, en particular, un anticuerpo humanizado. Un residuo clave incluye, sin que esto constituya limitación alguna, uno o más de los siguientes: un residuo que se halla adyacente a una CDR, un sitio de glicosilación potencial (puede ser un sitio de N u O-glicosilación), un residuo raro, un residuo capaz de interactuar con el antígeno, un residuo capaz de interactuar con una CDR, un residuo canónico, un residuo de contacto entre la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera, un residuo en la zona de Vernier, y un residuo en una región donde se superpone una CDR1 de cadena pesada definida por Chotia y un marco de la primera cadena pesada definida por Kabat.
El término "anticuerpo humanizado" hace referencia a anticuerpos que contienen secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, ratón, rata, conejo, pollo, camélidos, ovejas o cabras), pero donde al menos una parte de la secuencia VH y/o VL ha sido alterada para que sean más "similares a humanos", es decir, para que sean más similares a las secuencias variables de la línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo con una CDR injertada donde las secuencias CDR humanas han sido insertadas en secuencias VH y VL no humanas para reemplazar las secuencias CDR no humanas correspondientes. Además, el término "anticuerpo humanizado" hace referencia específicamente a un anticuerpo, o una variante, un derivado, un análogo o un fragmento de éste, que se une de forma inmunoespecíf ica a un antígeno de interés, y que comprende una región de marco (FR) que sustancialmente tiene la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región de determinación de la complementariedad (CDR) que sustancialmente tiene la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. Como se lo usa en la presente, el término "sustancialmente", en el contexto de una CDR, hace referencia a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la CDR de un anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado sustancialmente comprende la totalidad de al menos uno, y típicamente dos dominios variables (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv), donde la totalidad o sustancialmente todas las regiones de CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, el anticuerpo donante), y la totalidad o sustancialmente todas las regiones de marco son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina human. En una modalidad, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una ¡nmunoglobulina humana. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado contiene la cadena ligera y al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado solamente contiene una cadena ligera humanizada. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado solamente contiene una cadena pesada humanizada. En modalidades especificas, un anticuerpo humanizado solamente contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o una cadena pesada humanizada.
Un anticuerpo humanizado puede seleccionarse entre cualquier clase de ¡nmunoglobulina, incluyendo Ig , IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo, sin limitaciones, IgG 1 , lgG2, lgG3 e lgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y los dominios constantes particulares pueden seleccionarse con el fin de optimizar las funciones efectoras deseadas usando procedimientos bien conocidos en la técnica.
No es necesario que las regiones de marco y CDR de un anticuerpo humanizado correspondan con precisión a las secuencias progenitoras; por ejemplo, la CDR del anticuerpo donante o el marco consenso puede haber sido mutada mediante la sustitución, la inserción y/o la supresión de al menos un residuo de aminoácido, de modo que el residuo de la CDR o el marco en dicho sitio no corresponde al anticuerpo donante o al marco consenso. Sin embargo, en una modalidad preferida, estas mutaciones no son extensas. Comúnmente, al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80%, preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente, al menos 90%, y más preferiblemente, al menos 95% de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a los de las secuencias de las FR y CDR progenitoras. Como se lo usa en la presente, el término "marco consenso" hace referencia a la región del marco en la secuencia de la inmunoglobulina consenso. Como se lo usa en la presente, el término "secuencia de inmunoglobulina consenso" hace referencia a la secuencia formada con los aminoácidos de ocurrencia más frecuente (o nucleótidos) en una familia de secuencias de inmunoglobulina relacionadas (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clons (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1987)). En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que aparece con mayor frecuencia en dicha posición en la familia. Cuando dos aminoácidos aparecen con igual frecuencia, cualquiera de ellos puede incluirse en la secuencia consenso.
Con relación a la construcción de una DVD-lg o de otras moléculas que pueden servir como proteínas de unión, se usa un "conector" para hacer referencia a un solo aminoácido o a un polipéptido ("un conector polipeptídico") que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, que se usa para unir una o más porciones de unión al antígeno. Los conectores polipeptídicos son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Holliger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993); Poljak, R.J., Structure, 2: 1121-1123 (1994)). Los ejemplos de conectores incluyen, sin limitaciones, GGGGSG (SEQ ID N° 26), GGSGG (SEQ ID N° 27), GGGGSGGGGS (SEQ ID N° 28), GGSGGGGSG (SEQ ID N° 223), GGSGGGGSGS (SEQ ID N° 29), GGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N° 30), GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID N° 31), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N° 32), ASTKGP (SEQ ID N° 33), ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID N° 34), TVAAP (SEQ ID N° 35), RTVAAP (SEQ ID N° 224), TVAAPSVFIFPP (SEQ ID N° 36), RTVAAPSVFI FPP (SEQ ID N° 225), AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID N° 37), AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID N° 38), AKTTPKLGG (SEQ ID N° 39), SAKTTPKLGG (SEQ ID N° 40), SAKTTP (SEQ ID N° 41), RADAAP (SEQ ID N° 42), RADAAPTVS (SEQ ID N° 43), RADAAAAGGPGS (SEQ ID N° 44), RADAAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N° 45), SAKTTP K LE EGEFSEARV (SEQ ID N° 46), ADAAP (SEQ ID N° 47), ADAAPTVSIFPP (SEQ ID N° 48), QPKAAP (SEQ ID N° 49), QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID N° 50), AKTTPP (SEQ ID N° 51), AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID N° 52), AKTTAP (SEQ ID N° 53), AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID N° 54), GENKVEYAPALMALS (SEQ ID N° 55), GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID N° 56) y GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID N° 57).
Como se la usa en la presente, la zona "Vernier" hace referencia a un subconjunto de residuos del marco que pueden ajustar la estructura de la CDR y ajustaría con precisión para que se una al antígeno como, lo describen Foote y Winter (1992, J. Mol. Biol. 224: 487-499, que se incorpora en la presente a modo de referencia). Los residuos de la zona Vernier forman una capa que queda debajo de las CDR, y pueden afectar la estructura de las CDR y la afinidad del anticuerpo.
Como se lo usa en la presente, el término "neutralizador" hace referencia a la neutralización de la actividad biológica de un antígeno (por ejemplo, la citocina I L- 1 ß ) cuando una proteína de unión se une específicamente al antígeno. Preferiblemente, una proteína de unión neutralizadora como las que se describen en la presente se une a la hlL-1ß para provocar la inhibición de una actividad biológica de la h I L- 1 ß . Preferiblemente, la proteína de unión neutralizadora se une a la h I L- ß y reduce una actividad biológica de la h I L- 1 ß al menos aproximadamente 20%, 40%, 60%, 80% u 85%, o más. La inhibición de una actividad biológica de la h I L- 1 ß por una proteína de unión neutralizadora puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de la h I L- 1 ß bien conocidos en la técnica, por ejemplo, la inhibición de la secreción de la IL-6 humana mediante la inducción de células HS27 con IL-1 ß.
El término "actividad" incluye actividades como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo por un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-hlL- ß que se une a un antígeno de la IL-?ß, y/o a la potencia de neutralización de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-l L-1 ß, cuya unión a la h I L- 1 ß inhibe la actividad biológica de la hlL-?ß, lo que puede determinarse, por ejemplo, mediante la inhibición de la secreción de la IL-6 humana a través de la inducción de células HS27 con IL-1 ß.
El término "epitope" incluye cualquier determinante polipeptídico capaz de unirse específicamente a un receptor de célula T o inmunoglobulina. En determinadas modalidades, los epitopes determinantes incluyen agrupaciones superficiales de moléculas con actividad química, tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, fosforilos o sulfonilos, y en determinadas modalidades, pueden tener características específicas en su estructura tridimensional y/o características de carga específicas. Un epítope es una región de un antígeno donde se une un anticuerpo. En determinadas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce de forma preferencial su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Se dice que los anticuerpos se "unen al mismo epitope" si los anticuerpos compiten (uno evita la unión o modula el efecto del otro). Además, las definiciones estructurales de los epitopes (superpuestos, similares, idénticos) son informativas, pero las definiciones funcionales comúnmente son más relevantes, ya que incluyen parámetros estructurales (de unión) y funcionales (modulación, competencia).
El término "resonancia de plasmón superficial", como se lo usa en la presente, hace referencia a un fenómeno óptico que permite analizar las interacciones bioespecificas a tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas en una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia, y Piscataway, NJ). Para hallar otras descripciones, véanse Jónsson et al., Ann. Biol. Clin., 51: 19-26 (1993); Jónsson et al., BioTechniques, 11: 620-627 (1991); Johnsson et al., J. Mol. Recognit., 8: 125-131 (1995); y Johnsson et al., Anal. Biochem., 198: 268-277 (1991).
El término "Kon" (también "Kon", "kon"), como se lo usa en la presente, hace referencia a la constante de activación para la asociación de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) con el antígeno para formar un complejo de asociación, por ejemplo, anticuerpo/antigeno, como es conocido en la técnica. La "Kon" también se conoce como "constante de activación", o "ka", términos que se usan indistintamente en la presente. Este valor indica la velocidad de unión de un anticuerpo con su antígeno objetivo, o la velocidad de formación de un complejo entre un anticuerpo y el antígeno puede obtenerse de acuerdo con la siguiente ecuación: Anticuerpo ("Ab") + Antígeno ("Ag")?Ab-Ag.
El término "Koff" (también "Koff", "koff"), como se lo usa en la presente, hace referencia a la constante de desactivación para la disociación, o la "constante de desactivación", de una proteina de unión (por ejemplo, un anticuerpo), de un complejo de asociación (por ejemplo, del complejo de anticuerpo/antígeno), como es conocido en la técnica. Este valor representa la constante de desactivación de un anticuerpo de su antígeno objetivo, o la separación del complejo Ab-Ag en el transcurso del tiempo, lo que resulta en el anticuerpo y el antígeno libres, como se ilustra en la siguiente ecuación: Ab + Ag<-Ab-Ag.
El término "KD" como se lo usa en la presente, hace referencia a la "constante de disociación en equilibrio", y hace referencia al valor que se obtiene en una medición de la titulación en equilibrio, o al valor que se obtiene obtenido dividiendo la constante de desactivación ( k0ff) por la constante de activación (kon). La constante de activación (Kon), la constante de desactivación (Koff) y la constante de disociación en equilibrio se usan para representar la afinidad de unión de un anticuerpo por un antigeno. Los métodos para determinar las constantes de activación y desactivación son bien conocidos en la técnica. El uso de técnicas basadas en fluorescencia ofrece una sensibilidad elevada y la capacidad de examinar muestras en amortiguadores fisiológicos en equilibrio. Pueden usarse otros abordajes e instrumentos experimentales, tales como el ensayo BIAcore® (análisis de interacción biomolecular), por ejemplo, los instrumentos disponibles en BIAcore International AB, una compañía de GE Healthcare, Uppsala, Suecia. Adicionalmente, también puede usarse un ensayo KinExA® (ensayo de exclusión cinética), disponible en Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).
Los términos "marca" y "marca detectable" hacen referencia a una unidad que está unida a un miembro de unión específico, tal como un anticuerpo o un analito, por ejemplo, para poder detectar la reacción entre los miembros de un par de unión específico, tales como un anticuerpo y un analito. El miembro de unión específico marcado, por ejemplo, el anticuerpo o el analito, se conoce como un miembro de unión "marcado de manera detectable". De este modo, el término "proteína de unión marcada", como se lo usa en la presente, hace referencia a una proteína con una marca incorporada que permite identificar la proteína de unión. En una modalidad, la marca es un marcador detectable que puede producir una señal que sea detectable mediante medios visuales o instrumentales, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido marcado radioactivamente o unión a un polipéptido de porciones de biotinilo que puede ser detectado con avidina marcada o estreptavidina (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada mediante métodos ópticos o colorimétricos). Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, sin limitaciones, los que se indicarán a continuación: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H 1 C 35S, 90Y, "Te, 1 ln, 125l, 131l. 177Lu, 6SHo o 153Sm); cromógenos, marca fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantánido-fósforos), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, luciferasa, fosfatasa alcalina); marcadores quimioluminiscentes; grupos de biotinilo; epitopes de polipéptidos predeterminados que son reconocidos por un informante secundario (por ejemplo, secuencias de cierre [zipper] de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcas de epitope); y agentes magnéticos, (tales como quelatos de gadolinio). Los ejemplos representativos de las marcas que se emplean habitualmente en los inmunoensayos incluyen las unidades que producen luz, por ejemplo, los compuestos de acridinio, y las unidades que producen fluorescencia, por ejemplo, la fluoresceína. Se describen otras marcas en la presente. Con relación a esto, la porción propiamente dicha puede no estar marcada para la detección, pero puede tornarse detectable al reaccionar con otra porción adicional. El uso del término "marcas para la detección" abarca este último tipo de marcas detectables.
El término "conjugado con una proteína de unión a la IL-?ß" hace referencia a una proteína de unión a la IL-?ß, como las que se describen en la presente, que está unida químicamente a una segunda unidad química, tal como un agente terapéutico o citotóxico. El término "agente" se usa en la presente para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto obtenido a partir de materiales biológicos. Preferiblemente, los agentes terapéuticos o citotóxicos incluyen, sin limitaciones, toxinas pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicína, actinomicina D, 1 -dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de éstos. Cuando se lo emplea en el contexto de un inmunoensayo, un anticuerpo conjugado puede ser un anticuerpo marcado para la detección, usado como anticuerpo de detección.
Los términos "cristal" y "cristalizada", tal como se los usa en la presente, hacen referencia a una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo), o una porción de unión al antígeno de éste, que existe en forma de un cristal. Los cristales son una forma de materia en estado sólido que es diferente de otras formas, tales como el estado sólido amorfo o el estado líquido cristalino. Los cristales están compuestos por disposiciones de átomos, iones o moléculas tridimensionales, repetitivas y regulares (por ejemplo, proteínas, tales como anticuerpos), o ensamblajes moleculares (por ejemplo, complejos de antígenos/anticuerpos). Estas disposiciones tridimensionales siguen relaciones matemáticas bien comprendidas en el campo. La unidad fundamental, o bloque de construcción, que se repite en un cristal, se denomina unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en una disposición que satisface una simetría cristalográfica dada y bien definida provee la "célula individual" del cristal. La repetición de la célula individual por repeticiones regulares en las tres dimensiones provee el cristal. Véase Giegé et al., capítulo 1 de Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2a edición (Ducruix y Giegé, editores) (Oxford University Press, Nueva York, 1999) pp. 1-16.
El término "polinucleótido" hace referencia a una forma polimérica de dos o más nucleótidos, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos, o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de cadena simple y doble de DNA.
El término "polinucleótido aislado" hace referencia a un polinucleótido (por ejemplo, genómico, de cDNA o de origen sintético, o alguna combinación de éstos) que, en virtud de su origen, no está asociado a la totalidad o una porción de un polinucleótido con el que normalmente se halla asociado en la naturaleza; que está unido operativamente a un polinucleótido con el que normalmente no se halla unido en la naturaleza; o que no aparece en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.
El término "vector", como se lo usa en la presente, hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que está unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que designa un rizo de DNA circular de cadena doble con el que pueden unirse segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, que permite unir segmentos de DNA adicionales al genoma viral. Determinados vectores son capaces de replicarse en forma autónoma en la célula huésped en la que han sido introducidos (por ejemplo, los vectores bacterianos con un origen de replicación en bacterias y los vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamíferos) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped al introducirse en ella, por lo que se replican junto con el genoma del huésped. Más aún, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes con los que están unidos operativamente. Estos vectores se conocen en la presente como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión útiles para los procedimientos de DNA recombinante comúnmente toman la forma de plásmidos. En esta solicitud, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector de uso más común. Sin embargo, la invención pretende incluir estas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados), que tienen funciones equivalentes.
El término "unido operativamente" hace referencia a una yuxtaposición donde los componentes descritos se hallan en una relación que les permite funcionar de la manera deseada. Una secuencia control "unida operativamente" a una secuencia codificante está ligada de modo tal que la expresión de la secuencia codificante se obtiene bajo condiciones compatibles con las secuencias control. Las secuencias "unidas operativamente" incluyen secuencias de control de la expresión que se hallan contiguas al gene de interés y secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gene de interés. El término "secuencia de control de la expresión", como se lo usa en la presente, hace referencia a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para obtener la expresión y el procesamiento de las secuencias codificantes a las que están unidas. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias apropiadas para el inicio de la transcripción, la terminación, secuencias promotoras y potenciadoras; señales eficaces para el procesamiento del RNA, tales como secuencias de separación y poliadenilación; secuencias que estabilizan el mRNA citoplasmático; secuencias que mejoran la eficiencia de la traducción (es decir, la secuencia consenso Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas; y cuando se lo desea, secuencias que mejoran la secreción de las proteínas. La naturaleza de estas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. En procariotas, estas secuencias de control generalmente incluyen promotores, sitios de unión a ribosomas y secuencias de terminación de la transcripción. En eucariotas, en general, estas secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" incluye componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias directrices y secuencias que son asociados de fusión.
La "transformación", como se la define en la presente, hace referencia a cualquier proceso con el cual el DNA exógeno ingresa en una célula huésped. La transformación puede ocurrir bajo condiciones naturales o artificiales, usando diversos métodos bien conocidos en la técnica. La transformación puede basarse en cualquier método conocido para insertar secuencias de ácidos nucleicos extrañas en células huésped procariotas o ecuariotas. El método se selecciona sobre la base de la célula huésped a transformar, y puede incluir, sin limitaciones, la infección viral, la electroporación, la lipofección y el bombardeo de partículas. Estas células "transformadas" incluyen células transformadas de forma estable, donde el DNA insertado puede replicarse como un plásmido de replicación autónoma o como parte del cromosoma del huésped. También incluyen células que expresan de forma transitoria el DNA o el RNA insertado por períodos de tiempo limitados.
El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped") hace referencia a la célula en la que se introduce DNA exógeno. En una modalidad, la célula huésped comprende dos o más (por ej. múltiples) secuencias de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos tales como las células huésped que se describen en la Patente de los Estados Unidos N° 7262028, por ejemplo. Estos términos hacen referencia no solamente a la célula específica en cuestión, sino también a la progenie de dicha célula. Como es posible que ocurran modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, de hecho, esta progenie puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero aún se incluye dentro del término "célula huésped", tal como se lo usa en la presente. En una modalidad, las células huésped incluyen células procariotas y eucariotas seleccionadas entre cualquiera de los reinos de la vida. En otra modalidad, las células eucariotas incluyen células protistas, fúngicas, vegetales y animales. En otra modalidad, las células huésped incluyen, sin limitaciones, la línea de células procariotas de Escherichia coli; las líneas de células de mamífero CHO, HEK 293, COS, NSO, SP2 y PER.C6; la línea de células de insecto Sf9; y las células fúngicas de Saccharomyces cerevisiae.
Pueden emplearse técnicas convencionales para la síntesis de DNA recombinante y oligonucleótidos, y para cultivo y la transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y los procedimientos de purificación pueden llevarse a cabo de acuerdo con las especificaciones de los fabricantes, de maneras conocidas en la técnica o como se describe en la presente. Las técnicas y los procedimientos mencionados generalmente pueden ponerse en práctica de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica, y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se describen en toda la especificación. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).
Un "organismo transgénico", como es conocido en la técnica, hace referencia a un organismo que tiene células que contienen un transgene, donde el transgene introducido en el organismo (o cualquier ancestro del organismo) expresa un polipéptido que no se expresa naturalmente en el organismo. Un "transgene" es una construcción de DNA, que se ha integrado de forma estable y operativa en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrollará un organismo transgénico, que dirige la expresión de un producto genético codificado en uno o más tipos celulares o tejidos del organismo transgénico.
Los términos "regular" y "modular" se usan indistintamente, y como se los emplea en la presente, hacen referencia a un cambio o una alteración en la actividad de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de h 1 L- 1 ß ) . La modulación puede ser un incremento o una disminución en la magnitud de una actividad o una función determinada de la molécula de interés. Los ejemplos de actividades y funciones de una molécula incluyen, sin limitaciones, características de unión, actividad enzimática, activación de receptores celulares y transducción de señales.
Correspondientemente, el término "modulador", como se lo usa en la presente, es un compuesto capaz de cambiar o alterar una actividad o función de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de h I L- 1 ß ) . Por ejemplo, un modulador puede provocar un incremento o una disminución en la magnitud de una actividad o una función determinada de una molécula, en comparación con la magnitud de la actividad o la función observada en ausencia del modulador. En determinadas modalidades, un modulador es un inhibidor que reduce la magnitud de al menos una actividad o una función de una molécula. Los ejemplos de inhibidores incluyen, sin limitaciones, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, hidratos de carbono o pequeñas moléculas orgánicas. Los pepticuerpos se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud Internacional N° WO 01/83525.
El término "agonista", como se lo usa en la presente, hace referencia a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés, provoca un incremento en la magnitud de una actividad o una función determinada, en comparación con la magnitud de la actividad o la función observada en ausencia del agonista. Los agonistas particulares de interés pueden incluir, sin limitaciones, polipéptidos de IL-?ß, ácidos nucleicos, hidratos de carbono o cualquier otra molécula que se una a la h I L- 1 .
Los términos "antagonista" o "inhibidor", como se los usa en la presente, hacen referencia a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés, provoca una disminución en la magnitud de una actividad o una función determinada, en comparación con la magnitud de la actividad o la función observada en ausencia del antagonista. Los antagonistas particulares de interés incluyen aquellos que bloquean o modulan la actividad biológica o inmunologica de I L- 1 ß humano. Los antagonistas y los inhibidores de IL- ß pueden incluir, sin limitaciones, proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, o cualquier otra molécula capaz de unirse a I L- .
Como se lo usa en la presente, el término "cantidad eficaz" hace referencia a la cantidad de una terapia que es suficiente para reducir o mejorar la severidad y/o la duración de un trastorno o uno o más de sus síntomas, prevenir el avance de un trastorno, provocar la regresión de un trastorno, prevenir la recurrencia, el desarrollo, el inicio o la progresión de uno o más síntomas asociados a un trastorno, detectar un trastorno, o potenciar o mejorar el o los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico).
Los términos "paciente" y "sujeto" pueden usarse indistintamente en la presente para hacer referencia a un animal, tal como un mamífero, incluyendo un primate (por ejemplo, un ser humano, un mono y un chimpancé), un animal no primate (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, un cobayo, un gato, un perro, una rata, un ratón, una ballena), un ave (por ejemplo, un pato o un ganso) y un tiburón. Preferiblemente, un paciente o sujeto es un ser humano, tal como un ser humano que está siendo tratado o analizado para determinar la presencia de una enfermedad, un trastorno o una afección, un ser humano que se halla en riesgo de contraer una enfermedad, un trastorno o una afección, un ser humano que tiene una enfermedad, un trastorno o una afección, y/o un ser humano que está recibiendo tratamiento para una enfermedad, un trastorno o una afección.
El término "muestra", como se lo usa en la presente, se usa en su sentido más amplio. Una "muestra biológica", como se lo usa en la presente, incluye, sin limitaciones, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o proveniente de ser vivo. Estos organismos vivos incluyen, sin limitaciones, seres humanos, primates no humanos, ratones, ratas, monos, perros, conejos y otros animales. Estas sustancias incluyen, sin limitaciones, la sangre (por ejemplo, la sangre completa), el plasma, el suero, la orina, el fluido amniótico, el fluido sinovial, las células endoteliales, los leucocitos, los monocitos, otras células, los órganos, los tejidos, la médula ósea, los nodulos linfáticos y el bazo.
Un "componente", varios "componentes" y "al menos un componente" generalmente hacen referencia a un anticuerpo de captura, un anticuerpo de detección o conjugado, un control, un calibrador, una serie de calibradores, un panel de sensibilidad, un recipiente, un amortiguador, un diluyente, una sal, una enzima, un cofactor para una enzima, un reactivo de detección, un reactivo/una solución de pretratamiento, un sustrato (por ejemplo, una solución), una solución de detención, y elementos semejantes que pueden incluirse en un conjunto de elementos para evaluar una muestra de prueba, tal como una muestra de orina, suero o plasma de un paciente, de acuerdo con los métodos que se describen en la presente y otos métodos conocidos en la técnica. Por ende, en el contexto de esta descripción, "al menos un componente", un "componente" y varios "componentes" pueden incluir un polipéptido u otro analito, como se describió con anterioridad, tal como una composición que comprende un analito, tal como un polipéptido, que opcionalmente se halla inmovilizado en un soporte sólido, tal como mediante la unión a un anticuerpo anti-analito (por ejemplo, anti-polipéptido). Algunos componentes pueden hallarse en solución o liofilizados, y han de ser reconstituidos para usarlos en el ensayo.
Un "control" hace referencia a una composición de la que se sabe que no contiene el analito ("control negativo") o que sí contiene el analito ("control positivo"). Un control positivo puede comprender una concentración conocida del analito. Los términos "control", "control positivo" y "calibrador" pueden usarse indistintamente en la presente para hacer referencia a una composición que comprende una concentración conocida del analito. Un "control positivo" puede usarse para establecer las características de desempeño del ensayo, y se trata de un indicador útil de la integridad de los reactivos (por ejemplo, los analitos).
Un "corte predeterminado" y un "nivel predeterminado" generalmente hacen referencia al valor de corte de un ensayo que se usa para evaluar la eficacia de diagnóstico/pronóstico/terapéutica, mediante la comparación de los resultados del ensayo con el corte/nivel predeterminado, donde el corte/nivel predeterminado ya ha sido ligado o asociado a diversos parámetros clínicos (por ejemplo, la severidad de una enfermedad, el progreso/la falta de progreso/la mejora, etcétera). Si bien en esta descripción pueden proveerse ejemplos de niveles predeterminados, es bien conocido que los valores de corte pueden variar dependiendo de la naturaleza del inmunoensayo (por ejemplo, los anticuerpos empleados y otos factores). Además, aquellos versados en la técnica han de poder adaptar la descripción provista en la presente a otros inmunoensayos, para obtener valores de corte específicos para dichos inmunoensayos sobre la base de la descripción. Si bien el valor preciso de un corte/nivel predeterminado puede variar entre los ensayos, las correlaciones que se describen en la presente (de haberlas) deberían ser generalmente aplicables.
Un "reactivo de pretratamiento", por ejemplo, un reactivo de lisis, precipitación y/o solubilización, como se lo usa en un ensayo de diagnóstico como se describe en la presente, es uno que lisa las células y/o solubiliza un analito que está presente en una muestra de prueba. El pretratamiento no es necesario para todas las muestras, como se describe con mayor detalle en la presente. Entre otros acontecimientos, la solubilización del analito (por ejemplo, el polipéptido de interés) puede comprender la liberación del analito de cualquier proteína de unión endógena que pueda estar presente en la muestra. Un reactivo de pretratamiento puede ser homogéneo (puede no ser necesario un paso para separarlo) o heterogéneo (puede ser necesario un paso para separarlo). Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo, es necesario eliminar las proteínas de unión al analito que hayan precipitado de la muestra de prueba antes de proceder con el siguiente paso del ensayo.
Los "reactivos de control de calidad", en el contexto de los inmunoensayos y los conjuntos de elementos que se describen en la presente, incluyen, sin limitaciones, calibradores, controles y paneles de sensibilidad. Un "calibrador" o "referencia" típicamente se usa (por ejemplo, uno o más, tal como varios) para establecer curvas de calibración (referencia) para interpolar la concentración de un analito, tal como un anticuerpo o un analito. Como alternativa, puede usarse un solo calibrador que sea cercano a un corte positivo/negativo predeterminado. Pueden usarse varios calibradores combinados (es decir, más de un calibrador, o una cantidad variable de calibradores) para conformar un "panel de sensibilidad".
El "riesgo" hace referencia a la posibilidad o la probabilidad de que ocurra un acontecimiento particular, ya sea en la actualidad o en algún punto en el futuro. La "estratificación del riesgo" hace referencia a una serie de factores de riesgo clínicos que les permiten a los médicos clasificar a los pacientes como poseedores de un riesgo bajo, moderado, alto o máximo de desarrollar una enfermedad, un trastorno o una afección particulares.
"Específico" y "especificidad", en el contexto de una interacción entre miembros de un par de unión específico (por ejemplo, un antígeno (o un fragmento de éste) y un anticuerpo (o un fragmento de éste con reactividad antigénica)), hacen referencia a la reactividad selectiva de la interacción. La frase "se une específicamente" y frases análogas hacen referencia a la capacidad de los anticuerpos (o fragmentos de éstos con reactividad antigénica) de unirse específicamente a un analito (o un fragmento de éste) y no unirse específicamente a otras entidades.
Un "miembro de unión específico" es un miembro de un par de unión específico. Un par de unión específico comprende dos moléculas diferentes, cada una de las cuales se une específicamente a través de medios químicos o físicos. Entonces, además de los antígenos y los anticuerpos de los pares de unión específicos de los ¡nmunoensayos comunes, otros pares de unión específicos pueden incluir biotina y avidina (o estreptavidina), hidratos de carbono y lectinas, secuencias de nucleótidos complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y enzimas, inhibidores de enzimas y enzimas, y semejantes. Además, los pares de unión específicos pueden incluir miembros que son análogos de los miembros de unión específicos originales, por ejemplo, un análogo de un analito. Los miembros de unión inmunorreactivos específicos incluyen antígenos, fragmentos de antígenos y anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y policlonales, así como complejos, fragmentos y variantes (incluyendo fragmentos de variantes) de éstos, ya sea aislados o producidos por medios recombinantes.
Una "variante", como se la usa en la presente, hace referencia a un polipéptido que difiere de un polipéptido dado (por ejemplo, un polipéptido de I L- 1 , BNP, NGAL o el HIV, o un anticuerpo contra el polipéptido) en una secuencia de aminoácidos, debido a la adición (por ejemplo, la inserción), la supresión o la sustitución conservativa de aminoácidos, pero que retiene la actividad biológica de dicho polipéptido (por ejemplo, una variante de la I L- 1 ß puede competir con un anticuerpo anti-IL-1(3 por la unión a la IL-1(3). En la técnica, se reconoce que una sustitución conservativa de un aminoácido, es decir, el reemplazo de un aminoácido por un aminoácido diferente con propiedades similares (por ejemplo, hidrofilicidad y grado y distribución de las regiones cargadas) típicamente comprende un cambio menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, como es conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)). El índice hidropático de un aminoácido se basa en la consideración de su hidrofobicidad y su carga. En la técnica, se sabe que es posible realizar sustituciones por aminoácidos con índices hidropáticos similares y aún retener una función apropiada. En un aspecto, se realizan sustituciones por aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ± 2. La hidrofilicidad de los aminoácidos también puede usarse para determinar las sustituciones que han de resultar en proteínas que retendrán la función biológica. En el contexto de un péptido, la consideración de la hidrofilicidad de los aminoácidos permite calcular la máxima hidrofilicidad local promedio de dicho péptido, una medida útil de la que se ha informado que está bien correlacionada con la antigenicidad y la inmunogenicidad (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense N° 4554101). La sustitución por aminoácidos con valores de hidrofilicidad similares puede resultar en péptidos que retengan la actividad biológica, por ejemplo, la inmunogenicidad, como es conocido en la técnica. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos están influidos por la cadena lateral particular de dicho aminoácido. De manera consistente con esta observación, ha de comprenderse que las sustituciones de aminoácidos que sean compatibles con la función biológica dependerán de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente las cadenas laterales de dichos aminoácidos, determinada a partir de la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, la carga, el tamaño y otras propiedades. Una "variante" también puede usarse para describir un polipéptido, o un fragmento de éste, que ha sido sometido a un procesamiento diferencial, por ejemplo, por proteólisis, por fosforilación o a través de otra modificación posterior a la traducción, pero que aún retiene su actividad biológica o su reactividad con el antígeno, por ejemplo, la capacidad de unirse a la I L- 1 ß . El uso del término "variante" en la presente ha de abarcar los fragmentos de las variantes, a menos que del contexto surja lo contrario.
I. Anticuerpos que se unen a la I L- 1 ß humana En un aspecto de la presente invención, se proveen anticuerpos monoclonales murinos aislados, o porciones de unión al antígeno de éstos, que se unen a la I L- 1 ß con gran afinidad, que presentan una disociación lenta y una gran capacidad de neutralización. En un segundo aspecto de la invención, se proveen anticuerpos quiméricos que se unen a la I L- ß . En un tercer aspecto de la invención, se proveen anticuerpos con injertos de CDR, o porciones de unión al antígeno de éstos, que se unen a la ( L- 1 ß . En un cuarto aspecto de la invención, se proveen anticuerpos humanizados, o porciones de unión al antígeno de éstos, que se unen a la I L- 1 ß . En un quinto aspecto de la invención, se proveen moléculas de inmunoglobulinas con dominios variables duales (DVD-lg™) que se unen a la I L - 1 ß y a otro objetivo. Preferiblemente, los anticuerpos, o las porciones de éstos, son anticuerpos aislados. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención son anticuerpos neutralizadores anti-l L-1 ß humana A. Método para producir los anticuerpos anti I L- 1 ß Los anticuerpos anti I L- 1 ß de la presente invención pueden producirse con cualquiera de los numerosos procedimientos que se conocen en la técnica. 1. Anticuerpos monoclonales anti-l L- 1 ß usando tecnología de hibridomas Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando una amplia variedad de procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de presentación en fagos, o una combinación de éstas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando procedimientos con hibridomas, incluyen los que son conocidas en la técnica y los que se detallan, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2a edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hammerling et al., editores, "Monoclonal Antibodies y T-Cell Hybridomas", en Research Monographs in Immunology, vol. 3 (J.L. Turk, editor general) (Elsevier, Nueva York, 1981) pp. 563-587 (estas publicaciones se incorporan a modo de referencia en su totalidad). El término "anticuerpo monoclonal", como se lo usa en la presente, no se limita a los anticuerpos producidos con tecnología de hibridomas. El término "anticuerpo monoclonal" hace referencia a un anticuerpo que deriva de un clon individual, que incluye cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no el método con el que se lo produce.
Los métodos para producir y buscar anticuerpos a nti- 1 L- 1 ß específicos usando tecnología de hibridomas son de uso común y bien conocidos en la técnica. En una modalidad, en la presente invención se proveen métodos para generar anticuerpos monoclonales, y también anticuerpos producidos con el método que comprende cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la invención, donde preferiblemente, el hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un antígeno de la invención con células de mieloma, y luego analizando los hibridomas que resultan de la fusión para hallar los clones de hibridomas que secretan un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de la invención. En resumen, los ratones pueden inmunizarse con un antígeno de la I L- 1 ß . En una modalidad preferida, el antígeno de la ??_-1ß se administra con un coadyuvante para estimular la respuesta inmune. Estos coadyuvantes incluyen el coadyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (muramil dipéptidos) o ISCOM (complejos de inmunocoloración). Estos coadyuvantes pueden proteger el polipéptido de una dispersión rápida secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al huésped para que secrete factores quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Preferiblemente, si se administra un polipéptido, el cronograma de inmunización comprenderá dos o más administraciones del polipéptido, distribuidas en un período de varias semanas.
Después de la inmunización de un animal con el antígeno de la IL-1ß, pueden obtenerse anticuerpos y/o células productoras de anticuerpos del animal. El suero que contiene el anticuerpo anti-l L-1 ß se obtiene mediante la exsanginación o el sacrificio del animal. El suero puede usarse tal como se lo obtiene del animal, puede obtenerse una fracción de inmunoglobulina del suero o pueden purificarse anticuerpos a nti- 1 L- 1 ß a partir del suero. El suero o las inmunoglobulinas obtenidas de este modo son policlonales, por lo que tienen una serie heterogénea de propiedades.
Una vez detectada una respuesta inmune en el suero del ratón, por ejemplo, de anticuerpos con especificidad por antígenos de la I L- 1 ß , se cosecha el bazo del ratón y se aislan los esplenocitos. Posteriormente, los esplenocitos se fusionan a cualquier célula de mieloma apropiada, por ejemplo, células de la línea celular SP20, disponible en la Colección Americana de Tipos de Cultivo (ATTC, Manassas, Virginia, EEUU), de acuerdo con procedimientos bien conocidos. Los hibridomas se seleccionan y se clonan por dilución limitada. Los clones de hibridomas se evalúan de acuerdo con métodos conocidos en la técnica para determinar la presencia de células capaces de secretar anticuerpos con la capacidad de unirse a l L- 1 ß . El fluido de ascites, que generalmente contiene niveles elevados de anticuerpos, puede generarse inmunizando ratones con clones de hibridomas positivos.
En otra modalidad, los hibridomas inmortalizados productores de anticuerpos pueden prepararse a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal se sacrifica y las células B de bazo se fusionan a células de mieloma inmortalizadas, como es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra. En una modalidad preferida, las células de mieloma no secretan polipéptidos de ¡nmunoglobulina (una línea de células no secretoras). Después de la fusión y selección de antibiótico, los hibridomas se analizan usando IL-1ß, o una porción de éste, o una célula que expresa IL-?ß. En una modalidad particular, el análisis inicial se realiza usando un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), preferiblemente un ELISA. Se proporciona un ejemplo de análisis ELISA en la Publicación de Solicitud Internacional N° WO 00/37504, incorporada en la presente a modo de referencia.
Los hibridomas productores de anticuerpos anti-l L-1 ß se seleccionan, se clonan y se someten a un análisis adicional para determinar la presencia características deseables, incluyendo un crecimiento robusto del hibridoma, una producción elevada de anticuerpos, y la presencia de características deseables en dichos anticuerpos, como se describirá con mayor detalle más adelante. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos, o en un cultivo celular in vitro. Los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas son bien conocidos por aquellos versados en la técnica.
En una modalidad preferida, los hibridomas son hibridomas de ratón, como se describió con anterioridad. En otra modalidad preferida, los hibridomas se producen en un animal no humano, en una especie distinta del ratón, tal como la rata, la oveja, el cerdo, el ganado bovino o el caballo. En otra modalidad, los hibridomas son hibridomas humanos, donde se fusiona un mieloma no secretor humano con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-l L-1 ß.
Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epitopes específicos pueden generarse de acuerdo con técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 de la invención pueden producirse mediante el corte proteolítico de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CHI de la cadena pesada. 2. Anticuerpos monoclonales anti-IL-1 ß usando SLAM En otro aspecto de la invención, se generan anticuerpos recombinantes a partir de linfocitos individuales aislados usando un procedimiento conocido en la técnica como el método de anticuerpos con linfocitos seleccionados (SLAM), como se describe en la Patente estadounidense N° 5627052, la Publicación PCT WO 92/02551, y Babcock, J.S. ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 7843-7848 (1996). En este método, se analizan células individuales que secretan anticuerpos de interés, por ejemplo, linfocitos derivados de cualquiera de los animales inmunizados descritos en la Sección 1, usando un ensayo en placa hemolítica específico para el antígeno, donde el antígeno de IL-?ß, una subunidad de IL-?ß, o un fragmento de éste, se une a eritrocitos de oveja usando un conector, tal como biotina, y se lo usa para identificar células individuales que secretan anticuerpos con especificidad por I L- ß . Una vez identificadas las células secretoras de anticuerpos de interés, se rescatan los cDNA de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de las células por PCR con transcriptasa inversa, y estas regiones variables pueden expresarse posteriormente en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina apropiadas (por ejemplo, regiones constantes humanas), en células huésped de mamífero, tales como células COS o CHO. Después, las células huésped transfectadas con las secuencias de inmunoglobulinas amplificadas, derivadas de linfocitos seleccionados in vivo, pueden someterse a otros procedimientos de análisis y selección in vitro, por ejemplo, analizando las células transfectadas para aislar aquellas células que expresan anticuerpos contra IL-?ß. Las secuencias de inmunoglobulinas amplificadas pueden someterse a manipulaciones adicionales in vitro, por ejemplo, con métodos de maduración por afinidad in vitro como los que se describen en la Publicación PCT WO 97/29131 y la Publicación PCT WO 00/56772. 3. Anticuerpos monoclonales a nti-l L- 1 ß usando animales transgénicos En otra modalidad de la presente invención, los anticuerpos se producen inmunizando un animal no humano que comprende algunos o todos los loci de la inmunoglobulina humana con un antígeno de I L- 1 ß . En una modalidad, el animal no humano es un ratón transgénico XENOMOUSE, una cepa de ratón modificada que comprende fragmentos grandes de loci de inmunoglobulina humana y presenta una producción de anticuerpos diferentes. Véanse, por ejemplo, Green et al., Nature Genetics, 7: 13-21 (1994), y las Patentes estadounidenses N° 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598 y 6130364. Véanse también las Publicaciones PCT N° WO 91/10741, publicada el 25 de Julio de 1991, WO 94/02602, publicada el 3 de Febrero de 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, ambas publicadas el 31 de Octubre de 1996, WO 98/16654, publicada el 23 de Abril de 1998, WO 98/24893, publicada el 11 de Junio de 1998, WO 98/50433, publicada el 12 de Noviembre de 1998, WO 99/45031, publicada el 10 de Septiembre de 1999, WO 99/53049, publicada el 21 de Octubre de 1999, WO 00/09560, publicada el 24 de Febrero de 2000, y WO 00/037504, publicada el 29 de Junio de 2000. El ratón transgénico XENOMOUSE produce un repertorio de anticuerpos completamente humanos similar al de un ser humano adulto y genera mAb humanos con especificidad por el antígeno. El ratón transgénico XENOMOUSE contiene aproximadamente 80% del repertorio humano merced a la introducción de fragmentos YAC con la configuración de la línea germinal humana, con un tamaño en el orden de las megabases, que contienen loci de la cadena pesada humana y loci de la cadena ligera humana. Véase, Méndez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). 483 y -495, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. 4. Anticuerpos monoclonales a nti-l L- 1 ß usando bibliotecas de anticuerpos recombinantes También pueden usarse métodos in vitro para preparar los anticuerpos de la invención, donde se analiza una biblioteca de anticuerpos para identificar un anticuerpo que tiene la especificidad de unión deseada. Los métodos para llevar a cabo este análisis de bibliotecas de anticuerpos recombinantes son bien conocidos en la técnica e incluyen los métodos descritos, por ejemplo, en Ladner ef al., la Patente estadounidense N° 5223409; Kang et al., la Publicación de Solicitud Internacional N° WO 92/18619; Dower et al., la Publicación de Solicitud Internacional N° WO 91/17271; Winter et al., la Publicación de Solicitud Internacional N° WO 92/20791; Markland ef al., la Publicación de Solicitud Internacional N° WO 92/15679; Breitling ef al., la Publicación de Solicitud Internacional N° WO 93/01288; McCafferty et al., la Publicación PCT N° WO 92/01047; Garrard ef al., Publicación PCT N° WO 92/09690; Fuchs ef al., Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990) ; Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) ; Gram et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucí. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991); y Barbas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991); Publicación estadounidense N° 2003/0186374; y Publicación PCT N° WO 97/29131, cuyos contenidos respectivos se incorporan en la presente a modo de referencia.
La biblioteca de anticuerpos recombinantes puede provenir de un sujeto que haya sido inmunizado con I L - 1 ß o con una porción de la IL- 1ß. Como alternativa, la biblioteca de anticuerpos recombinantes puede ser de un sujeto na'íve, es decir, uno que no ha sido inmunizado con IL-1ß, como una biblioteca de anticuerpos humanos de un sujeto humano que no ha sido inmunizado con I L- 1 ß humano. Los anticuerpos de la invención se seleccionan examinando la biblioteca de anticuerpos recombinantes con el péptido que comprende la I L- 1 ß humana para así seleccionar a los anticuerpos que reconocen IL-?ß. Los métodos para realizar este procedimiento de análisis y selección son bien conocidos en la técnica, tal como se describe en las referencias en el párrafo precedente. Para seleccionar los anticuerpos de la invención que presentan afinidades de unión particulares por hlL-?ß, tales como los que se disocian de la I L- 1 ß humana con una constante de desactivación koff particular, puede usarse el método conocido en la técnica de resonancia de plasmón superficial para seleccionar los anticuerpos que presentan la constante de desactivación k0ff deseada. Para seleccionar los anticuerpos de la invención que tienen una actividad de neutralización de I L- 1 ß particular, tales como aquellos que presentan una IC50 particular, pueden usarse métodos convencionales conocidos en la técnica para determinar la inhibición de la actividad de I L- 1 .
En un aspecto, la invención hace referencia a un anticuerpo aislado, o una porción de unión al antígeno de éste, que se une a I L- 1 ß humano. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizador. En diversas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal.
Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse usando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fagos, se presentan dominios de anticuerpos funcionales en la superficie de partículas de fagos que contienen las secuencias de polinucleótidos que los codifican. En particular, estos fagos pueden emplearse para presentar dominios de unión al antígeno expresados a partir de un repertorio o una biblioteca de combinación de anticuerpos (por ejemplo, humanos o murinos). Los fagos que expresan un dominio de unión al antígeno que se une al antígeno de interés pueden seleccionarse o identificarse con un antígeno, por ejemplo, usando un antígeno marcado o un antígeno unido o capturado en una superficie sólida o una esfera. Los fagos usados en estos métodos típicamente son fagos filamentosos, e incluyen los dominios de unión fd y M13, expresados a partir de fagos con Fab, Fv o dominios de anticuerpos Fv estabilizados por enlaces disulfuro fusionados en forma recombinante al gene III o al gene VIII de proteínas del fago. Los ejemplos de métodos de presentación en fagos que pueden usarse para preparar los anticuerpos de la presente invención incluyen los que se describen en Brinkmann et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods, 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene, 187: 9-18 (1997); Burton et al., Adv. Immunol., 57: 191-280 (1994); las Publicaciones PCT N° WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047 (PCT/GB91 /01134); WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las Patentes estadounidenses N° 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 y 5969108, cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad en la presente a modo de referencia.
Como se describe en las referencias anteriores, una vez seleccionados los fagos, las regiones codificantes del anticuerpo obtenidas de los fagos pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión al antígeno deseado, y pueden expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describirá con mayor detalle más adelante. Por ejemplo, también podrán emplearse procedimientos para producir fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 de manera recombinante que sean bien conocidos en la técnica, tales como los que se describen en la Publicación PCT N° WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): 864-869 (1992); y Sawai et al., Am. J. Reprod. Immunol., 34: 26-34 (1995); y Better et al., Science, 240: 1041-1043 (1988) (estas referencias se incorporan a modo de referencia en su totalidad). Los ejemplos de procedimientos que pueden usarse para producir fragmentos Fv y anticuerpos de cadena simple incluyen los que se describen en las Patentes estadounidenses N° 4946778 y 5258498; Huston et al., Methods Enzymol., 203: 46-88 (1991); Shu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science, 240: 1038-1041 (1988).
Como alternativa al análisis de bibliotecas de anticuerpos recombinantes mediante la presentación en fagos, pueden aplicarse otras metodologías conocidas en la técnica para analizar grandes bibliotecas de combinación con el fin de identificar anticuerpos de especificidad doble de acuerdo con la invención. Un tipo de sistema de expresión alternativo es uno donde la biblioteca de anticuerpos recombinantes se expresa como fusiones de RNA y proteínas, como se describe en la Publicación PCT N° WO 98/31700, de Szostak y Roberts; y en Roberts y Szostak, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94: 12297-12302 (1997). En este sistema, se crea una fusión covalente entre un mRNA y el péptido o la proteína que codifica, por medio de la traducción in vitro de mRNA sintético que contiene puromicina en su extremo 3', un antibiótico aceptor de peptidilo. Por consiguiente, un mRNA específico puede enriquecerse a partir de una mezcla compleja de mRNA (por ejemplo, una biblioteca de combinación) sobre la base de las propiedades del péptido o la proteína codificada, por ejemplo, el anticuerpo o la porción de éste, tales como la unión del anticuerpo o la porción de éste al antígeno de especificidad doble. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o porciones de éstos, recuperadas del análisis de dichas bibliotecas, pueden expresarse por medios recombinantes como se describió con anterioridad (por ejemplo, en células huésped de mamífero), y más aún, pueden someterse a una maduración de afinidad adicional con procedimientos adicionales de análisis de fusiones de mRNA-péptidos en cuyas secuencias originales se han introducido mutaciones, o con otros métodos de maduración por afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, como se describió con anterioridad.
En otro abordaje, los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse usando métodos de presentación en levaduras conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en levaduras, se usan métodos genéticos para unir dominios de anticuerpos a la pared celular de la levadura, de modo que sean presentados en la superficie de la levadura. En particular, estas levaduras pueden emplearse para presentar dominios de unión al antígeno expresados a partir de un repertorio o una biblioteca de combinación de anticuerpos (por ejemplo, humanos o murinos). Los ejemplos de métodos de presentación en levaduras que pueden usarse para preparar los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en Wittrup, et al., Patente estadounidense N° 6699658 incorporada en la presente a modo de referencia.
B. Producción de anticuerpos contra la IL- ß recombinantes Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse con cualquiera de una cantidad de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la expresión puede efectuarse a partir de células huésped en las cuales se han transfectado uno o más vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera de acuerdo con procedimientos convencionales. Las diversas formas del término "transfección" abarcan una amplia variedad de procedimientos de uso común para la introducción de DNA exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano, y semejantes.
Aunque es posible expresar los anticuerpos de la invención en células huésped procariotas o eucariotas, es preferible la expresión de los anticuerpos en células eucariotas, y es más preferible en células huésped de mamíferos, ya que la probabilidad de que se ensamble y se secrete un anticuerpo plegado correctamente y con actividad inmunológica es mayor en dichas células eucariotas (y en particular, en células de mamíferos) que en las células eucariotas.
Las células huésped de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombínantes de la invención incluyen las células de ovario de hámster chino (las células CHO) (que incluyen las células dhfr- CHO, que se describen en Urlaub y Chasin, Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980); se las usa con un marcador de selección de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)), las células de mieloma NSO, las células COS y las células SP2. Cuando los vectores de expresión recombínantes que contienen genes que codifican el anticuerpo se introducen en células huésped de mamíferos, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped hasta que el anticuerpo se expresa en dichas células huésped, o preferiblemente, el anticuerpo se secreta en el medio de cultivo en el que se cultivan las células huésped. Después, los anticuerpos pueden aislarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales.
Es posible usar células huésped para producir porciones de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Ha de comprenderse que las variaciones del procedimiento anterior se hallan dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula huésped con DNA que codifica fragmentos funcionales de la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo de esta invención. La tecnología de DNA recombinante también puede usarse para retirar una parte o la totalidad del DNA que codifica las cadena ligera y/o la cadena pesada que no es necesario para la unión con los antígenos de interés. Las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas de DNA truncadas también quedan incluidas dentro de los anticuerpos de la invención. Además, es posible producir anticuerpos bifuncionales, donde una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo de la invención, y la otra cadena pesada y la otra cadena ligera tienen especificidad por un antígeno diferente del antígeno de interés, por medio del cruzamiento de un anticuerpo de la invención con un segundo anticuerpo, de acuerdo con métodos de cruzamiento químico convencionales.
En un sistema que sirve como ejemplo para la expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, o una porción de unión al antígeno de éste, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica la cadena pesada del anticuerpo y la cadena ligera del anticuerpo en células CHO dhfr- a través de una transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo están unidos operativamente en cada caso a elementos reguladores, que consisten en el potenciador de CMV y el promotor AdMLP, con el fin de obtener niveles de transcripción elevados de los genes. El vector de expresión recombinante también contiene un gene DHFR, que permite seleccionar las células CHO dhfr" transfectadas con el vector usando una selección/amplificación con metotrexato. Las células huésped transformadas seleccionadas se cultivan de modo que se expresen las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, y el anticuerpo intacto se aisla del medio de cultivo. Se usan técnicas convencionales de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar las transformantes, cultivar dichas células huésped y obtener el anticuerpo del medio de cultivo. Adicionalmente, en la invención se provee un método para sintetizar un anticuerpo recombinante de la invención, que comprende cultivar una célula huésped de la invención en un medio de cultivo apropiado hasta que se ha sintetizado un anticuerpo recombinante de la invención. Además, el método puede comprender aislar dicho anticuerpo recombinante del medio de cultivo. 1. Anticuerpos anti-IL-1 ß humana quiméricos Un anticuerpo quimérico es una molécula donde las distintas porciones del anticuerpo derivan de animales de distintas especies, tales como los anticuerpos que tienen una región variable que deriva de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica y se describen en detalle en la sección de los ejemplos. Véanse, por ejemplo, Morrison, S.L., Science, 229: 1202-1207 (1985); Oi et al., BioTechniques, 4: 214-221 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125: 191-202 (1989); las Patentes estadounidenses N° 5807715, 4816567 y 4816397, que se incorporan en su totalidad en la presente a modo de referencia. Además, podrán usarse técnicas desarrolladas para producir "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984); Takeda et al., Nature, 314: 452-454 (1985), que se incorporan en su totalidad en la presente a modo de referencia) que comprendan separar los genes de una molécula de anticuerpo de ratón con una especificidad antigénica apropiada y combinarlos con genes de una molécula de anticuerpo humano que presente una actividad biológica apropiada.
En una modalidad, los anticuerpos quiméricos de la invención se producen reemplazando la región constante de la cadena pesada de los anticuerpos monoclonales anti- IL-?ß humanas de murinos que se describen en sección 1 con una región constante de la lgG1 humana. 2. Anticuerpos anti-IL- ß con injertos de CDR Los anticuerpos con injertos de CDR de la invención comprenden secuencias de la región variable de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo humano donde una o más de las regiones CDR de VH y/o VL se reemplazan con secuencias CDR de los anticuerpos murinos de la invención. Una secuencia de la región del marco de cualquier anticuerpo humano puede servir como molde para el injerto de CDR. Sin embargo, el reemplazo directo de cadenas en una de estas regiones de marco comúnmente resulta en una cierta pérdida de afinidad de unión al antígeno. Cuanto más homólogo es un anticuerpo humano al anticuerpo murino original, menor es la probabilidad de que la combinación de las CDR murinas con la región del marco humana introduzca distorsiones en las CDR que puedan reducir la afinidad. Entonces, es preferible que la región variable del marco humano seleccionada para reemplazar la región variable del marco murino, aparte de las CDR, tenga al menos a 65% de identidad de secuencia con la región variable del marco del anticuerpo murino. Es más preferible que las regiones variables humanas y murinas, aparte, de las CDR, tengan al menos 70% de identidad de secuencia. Es aún más preferible que las regiones variables humanas y murinas aparte de las CDR tengan al menos 75% de identidad de secuencia. Es más preferible que las regiones variables humanas y murinas, aparte de las CDR, tengan al menos 80% identidad de secuencia. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, la Patente Europea N° EP 0 239 400, la Publicación PCT N° WO 91/09967 y las Patentes estadounidenses N° 5225539, 5530101 y 5585089. Para hallar información sobre los métodos para modificar los residuos de los anticuerpos o alterar su superficie, véanse, por ejemplo, las Patentes Europeas N° EP 0 592 106 y EP 0 519 596; Padlan, Mol. Immunol., 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Proteína Eng., 7(6): 805-814 (1994); y Roguska et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91: 969-973 (1994)). Con relación al barajado de las cadenas de los anticuerpos, véase, por ejemplo, la Patente estadounidense N° 5565352. 3. Anticuerpos anti-IL-?ß humana humanizados Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos de especies no humanas que se unen al antígeno deseado y tienen una o más regiones de determinación de la complementariedad (CDR) de la especie no humana, y regiones de marco de una molécula de inmunoglobulina humana. Las secuencias de Ig humanas conocidas se describen, por ejemplo, en los siguientes sitios de Internet: www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools. html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/inmunology/CH- 05/ku by05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/lnmune/An ti body.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/ vi a b/; ww w. pa t h. cam. ac.uk/. a bout.mrc7/m ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/lnmunology.html.www.inmunologylink.com/; pathbox. wustl.edu/. about.hcenter/i ndex.html; www.biotech.ufl.edu/.a out.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www. m.ehimeu.acjp/.about.yasu hito/E lisa, html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www. biotech.ufl.edu/. a bout.fccl/protocol. html; www.isacnet.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni- marburg.de/.about.rek/AEPStart.html; baserv. uc¡. kun.nl/. a bout.jraats/l i nksl.html; www.recab.uni-hd.de/inmuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www. biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index. html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/ about.honegger/AHOseminar/Slide01.html; www. cry st.bbk.ac.uk/. a bout.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www. path.cam.ac. uk/.about. mrc7/h urna ni sation/TAHHP. html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www. cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Webpages/Pept/spottech. html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html; Kabat et al., Secuencias of Proteins of Inmunological Interest, U.S. Health Departament (1983). Estas secuencias importadas pueden usarse para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la afinidad de unión, la velocidad de activación, la velocidad de desactivación, la avidez, la especificidad, la vida media o cualquier otra característica apropiada, como es conocido en la técnica.
Los residuos de la región del marco (FR) en las regiones del marco humano pueden reemplazarse por los residuos correspondientes de la CDR del anticuerpo donante para alterar, preferiblemente mejorar la unión al antígeno. Estas sustituciones del marco de trabajo se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por modelación de las interacciones de los residuos de la CDR y del marco de trabajo para identificar los residuos del marco de trabajo que son importantes para la unión al antígeno y por comparación de secuencias para identificar residuos poco comunes del marco de trabajo en posiciones particulares (véanse, por ejemplo, Queen et al., Patente estadounidense N° 5585089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), que se incorporan en su totalidad en la presente a modo de referencia). Los modelos tridimensionales de la inmunoglobulina se hallan disponibles y son conocidos por aquellos versados en la técnica. Hay programas informáticos disponibles que permiten ¡lustrar y presentar estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas representaciones permite analizar la participación de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de unión de la inmunoglobulina candidata a su antígeno. De este modo, pueden aislarse y combinarse residuos FR de secuencias consenso e importadas con el fin de obtener una característica deseada en el anticuerpo, tal como la afinidad de unión por uno o más antígenos objetivo. En general, los residuos de las CDR tienen una influencia directa y más sustancial sobre la unión al antígeno. Los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, tales como, sin limitaciones, los que se describen en Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), Sims et al., J. Immunol., 151: 2296-2308 (1993); Chotia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987), Cárter et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623-2632 (1993); Padlan, Mol. Immunol., 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Proteína Eng., 7(6): 805-814 (1994); Roguska et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91: 969-973 (1994); las Publicaciones PCT N° WO 91/09967, WO 90/14443, WO 90/14424, WO 90/14430, WO 99/06834 (PCT/US98/16280), WO 97/20032 (PCT/US96/18978), WO 92/11272 (PCT/US91/09630), WO 92/03461 (PCT/US91 /05939), WO 94/18219 (PCT/US94/01234), WO 92/01047 (PCT/GB91/01134) y WO 93/06213 (PCT/GB92/01755); las Patentes Europeas N° EP O 592 106, EP 0 519 596 y EP 0 239 400; y las Patentes estadounidenses N° 5565332, 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539 y 4816567, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en la presente a modo de referencia, incluyendo las referencias citadas en ellas. 4. Proteínas de unión a la I L- 1 ß DVD-lg™ También se proveen proteínas de unión que son inmunoglobulinas con dominios variables duales (DVD-lg), que se unen a uno o más epitopes de la IL-?ß. Una proteína de unión DVD-lg también pude unirse a un epitope de la I L- 1 ß y a un epitope de un segundo antigeno objetivo distinto del polipéptido de la ??_-1ß. Un ejemplo de una modalidad de estas moléculas de DVD-lg comprende una cadena pesada que presenta la fórmula estructural VD1-(X1 )n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada, C es un dominio constante de la cadena pesada, X1 es un conector, con la condición de que no sea CH1, X2 es una región Fe y n es 0 ó 1, y preferiblemente es 1, y una cadena ligera que presenta la fórmula estructural VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera, VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera, C es un dominio constante de la cadena ligera, X1 es un conector, con la condición de que no sea CH1, X2 no comprende una región Fe, y n es 0 ó 1 , y preferiblemente es 1. Esta DVD-lg puede comprender dos de estas cadenas pesadas y dos de estas cadenas ligeras, donde cada cadena comprende dominios variables unidos en tándem, sin una región constante entre las regiones variables, donde una cadena pesada y una cadena ligera se asocian para formar sitios en tándem funcionales de unión al antigeno, y un par de cadenas pesadas y ligeras pueden asociarse a otro par de cadenas pesadas y ligeras para formar una proteína de unión tetramérica, con cuatro sitios funcionales de unión al antígeno. En otra modalidad, una molécula de DVD-lg puede comprender cadenas pesadas y ligeras que comprenden tres dominios variables cada una, por ejemplo, VD1, VD2, VD3, unidos en tándem, sin una región constante entre los dominios variables, donde un par de cadenas pesadas y ligeras pueden asociarse para formar tres sitios de unión al antígeno, y donde un par de cadenas pesadas y ligeras pueden asociarse a otro par de cadenas pesadas y ligeras para formar una proteína de unión tetramérica con seis sitios de unión al antígeno.
Cada dominio variable (VD) en una DVD-lg podrá provenir de uno o más anticuerpos monoclonales "progenitores", que puedan unirse a uno o más antígenos o epitopes deseados, tales como antígenos o epitopes de la I L- 1 ß o de la I L-1 a.
A. Generación de los anticuerpos monoclonales progenitores Los dominios variables de la proteína de unión con DVD pueden obtenerse a partir de anticuerpos progenitores, incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales capaces de unirse a antigenos de interés. Estos anticuerpos pueden ser de ocurrencia natural o pueden generarse con tecnología de recombinación. Ha de comprenderse que, si un anticuerpo que se une a un antígeno o un epitope objetivo deseado es policlonal, entonces todavía es necesario obtener los dominios variables de un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo individual de la población policlonal, es decir, de un solo miembro monoclonal de la población policlonal, para usarlo en la generación de una DVD-lg. Los anticuerpos monoclonales pueden generarse con cualquiera de los diversos métodos que se conocen en la técnica, que incluyen los que se describen en la presente (véanse las secciones A.1-A.4 anteriores).
B. Criterios para la selección de los anticuerpos monoclonales progenitores Una modalidad de la invención se relaciona con la selección de anticuerpos progenitores con al menos una o más propiedades deseadas en la molécula de DVD-lg. En una modalidad, la propiedad deseada se selecciona de uno o más parámetros del anticuerpo. En otra modalidad, los parámetros del anticuerpos se seleccionan del grupo que consiste en especificidad por el antígeno, afinidad por el antígeno, potencia, función biológica, reconocimiento de epitope, estabilidad, solubilidad, eficacia de producción, inmunogenicidad, farmacocinética, biodisponibilidad, reactividad cruzada de tejido, y unión al antígeno ortólogo.
B.1. Afinidad por el antígeno La afinidad deseada de un mAb terapéutico puede depender de la naturaleza del antígeno, y del objetivo terapéutica deseada. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales tienen afinidades más altas (Kd = entre 0,01 y 0,50 pM) cuando bloquean la interacción receptor de citocina-citocina ya que dichas interacciones son generalmente interacciones de alta afinidad (por ejemplo, rangos <pM - <n ). En tales casos, la afinidad del mAb por su objetivo debería ser igual o mejor que la afinidad de la citocina (ligando) por su receptor. Por otro lado, los mAb con menores afinidades (en un rango inferior al nM) podrían ser eficaces para las aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, para eliminar las proteínas potencialmente patogénicas en la circulación, por ejemplo, como anticuerpos monoclonales que se unieran a las especies de antígenos objetivo, tales como los péptidos ?-ß amiloides, los capturaran y los retiraran de la circulación. En otros casos, la reducción de la afinidad de un mAb con alta afinidad existente por mutagénesis sitio dirigida o usando un mAb con menor afinidad por su objetivo, se podría usar para evitar los potenciales efectos secundarios como por ejemplo, un mAb con alta afinidad puede secuestrar/neutralizar todos sus objetivos pretendidos, de este modo reduciendo/eliminando completamente la o las funciones de la proteína objetivo. En este marco, a mAb con baja afinidad puede secuestrar/neutralizar una fracción del objetivo que puede ser la responsable de los síntomas de la enfermedad (los niveles patológicos o sobreproducidos), permitiendo de este modo que una fracción del objetivo continúe cumpliendo su función o funciones fisiológicas normales. Por lo tanto, puede ser posible reducer la kd para ajustar la dosis y/o reducir los efectos secundarios. La afinidad del mAb progenitor puede cumplir un papel en el direccionamiento apropiado a moléculas de la superficie celular para alcanzar un resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, si un objetivo se expresa en células cancerígenas con alta densidad y en células normales con baja densidad, un mAb con baja afinidad se unirá a un mayor número de objetivos en las células tumorales que en las células normales, dando como resultado la eliminación de la célula tumoral a través de ADCC ó CDC, y por lo tanto podría tener efectos terapéuticos deseados. De este modo, la selección de un mAb con afinidad deseada puede ser de interés tanto para objetivos solubles como para los de superficie.
La señalización de un receptor cuando se produce la interacción con su ligando puede depender de la afinidad de la interacción receptor-ligando. De modo similar, es concebible que la afinidad de un mAb por un receptor de superficie podría determinar la naturaleza de la señalización intracelular y si el mAb puede transmitir una señal agonista o antagonista. La naturaleza basada en la afinidad de la señalización mediada por mAb puede tener un impacto en su perfil de efectos secundarios. Por lo tanto, se necesita determinar con cuidado la afinidad deseada y las funciones deseadas de los anticuerpos monoclonales terapéuticos por medio de experimentación in vitro e in vivo.
La Kd deseada de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) puede determinarse experimentalmente dependiendo del resultado terapéutico deseado. En una modalidad se seleccionan los anticuerpos progenitores con afinidad (Kd) por un antígeno particular igual a, o mejor que, la afinidad deseada de una DVD-lg por el mismo antígeno. La afinidad y cinética de unión al antígeno se evalúan por Biacore u otra técnica similar. En una modalidad, cada anticuerpo progenitor tiene una constante de disociación (Kd) de su antígeno que se selecciona del grupo que consiste en como máximo aproximadamente 10"7 M; como máximo aproximadamente 10"8 M; como máximo aproximadamente 10'9 M; como máximo aproximadamente 10"10 M; como máximo aproximadamente 10"11 M; como máximo aproximadamente 10"12 M; y como máximo 10"13 M. El primer anticuerpo progenitor del cual VD1 se obtiene y el segundo anticuerpo progenitor del cual se obtiene VD2 tienen una afinidad similar o diferente. (KD) con el antígeno respectivo. Cada anticuerpo progenitor tiene una constante de activación (Kon) al antígeno que se selecciona del grupo que consiste en al menos aproximadamente 102M"1s"1 ; al menos aproximadamente 103M"1s'1; al menos aproximadamente 104M'V1; al menos aproximadamente 105M"V 1; y al menos aproximadamente 106M"1s'1, medida por resonancia de plasmón superficial. El primer anticuerpo progenitor del cual se obtiene VD1 y el segundo anticuerpo progenitor del cual se obtiene VD2, pueden tener una constante de activación ( on) similar o diferente por el respectivo antígeno. En una modalidad, cada anticuerpo progenitor tiene una constante de desactivación (Koff) del antígeno que se selecciona del grupo que consiste en a lo sumo aproximadamente 10 V1, a lo sumo aproximadamente 10'4 s"1, a lo sumo aproximadamente 10"5 s"1 y a lo sumo aproximadamente 10"6 s"1, medida por resonancia de plasmón superficial. El primer anticuerpo progenitor del cual se obtiene VD1 y el segundo anticuerpo progenitor del cual se obtiene VD2, pueden tener una constante de desactivación (Koff) similar o diferente por el respectivo antígeno.
B.2. Potencia La afinidad/potencia de anticuerpos monoclonales progenitores dependerá del resultado terapéutico deseado. Por ejemplo, para interacciones receptor-ligando (R-L) la afinidad (kd) es igual o mejor que la kd R-L (rango pM). Para la simple depuración de una proteína circulante patológica, la kd podría estar en el rango nM, por ejemplo, depuración de diferentes especies de péptido ?-ß circulante. Adicionalmente, la kd también dependerá de si el objetivo expresa copias múltiples del mismo epitope, por ejemplo, un epitope conformacional de direccionamiento del mAb en oligómeros ?ß.
Cuando VD1 y VD2 se unen al mismo antígeno, pero a diferentes epitopes, la DVD-lg contendrá 4 sitios de unión para el mismo antígeno, aumentando de esta manera la avidez y así la kd aparente de I DVD-lg. En una modalidad, se seleccionan los anticuerpos progenitores con igual o menor kd que el deseado en la DVD-lg. Las consideraciones de afinidad de un mAb progenitor también pueden depender de si la DVD-lg contiene cuatro o más sitios de unión a idénticos (es decir; una DVD-lg de un único mAb). En este caso, la kd aparente podría ser mayor que el mAb debido a su avidez. Dicha DVD-lg puede emplearse para entrecruzar receptores de superficie, aumentar la potencia de neutralización, potenciar la depuración de proteínas patológicas, etc.
En una modalidad se seleccionan los anticuerpos progenitores con potencia de neutralización por un antígeno específico igual o mejor que el potencial de neutralización de la DVD-lg por el mismo antígeno. La potencia de neutralización puede evaluarse por medio de un bioensayo dependiente de objetivo donde las células de un tipo apropiado producen una señal que puede medirse (es decir, proliferación o producción de citocina) en respuesta a una estimulación del objetivo, y la neutralización del objetivo por el mAb puede reducir la señal en un modo dependiente de la dosis.
B.3. Funciones biológicas Los anticuerpos monoclonales pueden desempeñar potencialmente muchas funciones. Algunas de estas funciones se enumeran en la tabla 5. Estas funciones pueden evaluarse tanto por ensayos in vitro (por ejemplo, ensayos en base a células y bioquímicos) así como con modelos animales in vivo.
Tabla 5. Algunas aplicaciones potenciales para los anticuerpos terapéuticos Pueden seleccionarse mAb con diferentes funciones a las descritas en los ejemplos en la presente en la tabla 5 para obtener un resultado terapéutico deseado. Pueden usarse dos o más anticuerpos monoclonales progenitores seleccionados con formato DVD-lg para lograr dos funciones distintas en una única molécula de DVD-lg. Por ejemplo, puede generarse una DVD-lg por selección de un mAb progenitor que neutralice la función de una citocina específica, y seleccionar una mAb progenitor que potencie la depuración de una proteína patológica. Similarmente, los inventores pueden seleccionar dos anticuerpos monoclonales progenitores que reconozcan dos receptores de superficie celular diferentes, un mAb con una función agonista sobre un receptor y el otro mAb con una función antagonista sobre un receptor diferente. Estos dos anticuerpos monoclonales seleccionados, cada uno con una función distinta, pueden usarse para construir una única molécula de DVD-lg que tendrá dos funciones diferentes (agonista y antagonista) de los anticuerpos monoclonales en una única molécula. Similarmente, pueden usarse dos anticuerpos monoclonales antagonistas a receptores de superficie celular, cada uno bloqueando la unión de los respectivos ligandos de receptor (por ejemplo, EGF e IGF) con un formato DVD-lg. Por el contrario, puede seleccionarse un mAb anti-receptor antagonista (por ejemplo, anti-EGFR) y un mAb anti-mediador soluble neutralizador (por ejemplo, anti-IGF1/2) para hacer un DVD-lg.
B.4. Reconocimiento de epitope: Regiones diferentes de proteínas pueden cumplir diferentes funciones. Por ejemplo, hay regiones específicas en la citocina que interactúan con el receptor de citocina para dar lugar a la activación del receptor, al tiempo que otras regiones de la proteína pueden participar en la estabilización de la citocina. En este caso uno puede seleccionar un mAb que se une específicamente a la región o regiones de interacción con el receptor en la citocina y de este modo bloquear la interacción citocina-receptor. En algunos casos, por ejemplo, determinados receptores de quimoquinas que unen ligandos múltiples, puede seleccionarse un mAb que se une al epitope (región en el receptor de quimoquina) que interactúa con un solo ligando. En otros casos, los anticuerpos monoclonales pueden unirse a epitopes en un objetivo que no son directamente responsables de las funciones fisiológicas de la proteína, pero la unión de mAb a estas regiones podría interferir con las funciones fisiológicas (impedimento estérico) o alterar la conformación de la proteína de modo tal que la proteína no puede funcionar (mAb a receptores con ligandos múltiples que alteran la conformación del receptor de forma que ninguno de los ligandos puede unirse). También se han identificado anticuerpos monoclonales anti-citocina que no bloquean la unión de la citocina a su receptor, pero bloquean la transducción de señales (por ejemplo, 125-2H, un mAb anti-IL-18).
Los ejemplos de epitopes y funciones de mAb incluyen, a modo de ejemplo ilustrativo, bloqueo de la interacción Receptor-Ligando (R-L) (mAb neutralizador que se une al sitio de interacción con R); impedimento estérico que da como resultado una unión a R disminuida o nula. Un Ab puede unirse al objetivo en un sitio diferente del sitio de unión al receptor, pero todavía interferir con la unión al receptor y funciones del objetivo por inducción de cambios conformacionales y eliminar la función (por ejemplo, XOLAIR® omalizumab, Genetech/Novartis), unirse a R pero bloquear la señalización (mAb 125-2H).
En una modalidad, el mAb progenitor necesita estar dirigido al epitope apropiado para una eficacia máxima. Dicho epitope debe ser conservado en la DVD Ig. El epitope de unión a un mAb puede determinarse con diversos procedimientos, que incluyen la cristalografía concurrente, la proteólisis limitada de los complejos mAb-antígenos en combinación con el mapeo de péptidos por espectrometría de masa (Legros V. et al 2000 Proteína Sci. 1002-1010 (2000)), las bibliotecas de presentación en fagos (O'Connor et al., J. Immunol. Met ods. , 299: 21-35 (2005)) y la mutagénesis (Wu C. et al., J. Immunol., 170: 5571-5577 (2003)).
B.5. Propiedades fisicoquímicas y farmacéuticas El tratamiento terapéutico con anticuerpos con frecuencia requiere la administración de altas dosis, con frecuencia varios mg/kg (debido a la baja potencia en términos de cómo consecuencia de un generalmente gran peso molecular). Con el objetivo de adecuarse a la conformidad del paciente y de abordar adecuadamente las terapias de enfermedades crónicas y el tratamiento ambulatorio, se desea la administración subcutánea (s.c.) o intramuscular (i.m.) de mAb terapéuticos. Por ejemplo, el volumen máximo deseado para una administración s.c. es aproximadamente 1,0 mi, y por lo tanto, son deseables concentraciones >100 mg/ml para limitar el número de inyecciones por dosis. En una modalidad, el anticuerpo terapéutico se administra en una dosis. El desarrollo de dichas formulaciones está limitado, sin embargo, por interacciones proteína-proteína (por ejemplo, agregación, que potencialmente aumenta los riesgos de inmunogenicidad) y por limitaciones durante el procesamiento y administración (por ejemplo, viscosidad). Consecuentemente, las grandes cantidades requeridas para la eficacia clínica y las limitaciones en el desarrollo asociadas limitan el completo aprovechamiento del potencial de la formulación del anticuerpo y la administración s.c. en regímenes de altas dosis. Es evidente que las propiedades fisicoquímicas y farmacéuticas de una molécula proteína y la solución de proteína son de extrema importancia, por ejemplo, características de estabilidad, solubilidad y viscosidad.
B.5.1. Estabilidad Una formulación de anticuerpo "estable" es una en la cual el anticuerpo en la misma esencialmente conserva sus su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica con el almacenamiento. La estabilidad puede medirse a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo seleccionado. En una modalidad, el anticuerpo en la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30°C) o a 40°C durante al menos 1 mes y/o estable a aproximadamente entre 2 y 8°C durante al menos 1 año durante al menos 2 años. Además, en una modalidad, la formulación es estable después de la congelación (por ejemplo, a -70°C) y la descongelación, lo que se conocerá de aquí en adelante como un "ciclo de congelación/descongelación". En otro ejemplo, una formulación "estable" podrá ser una donde entre menos de aproximadamente 10% y menos de aproximadamente 5% de la proteína esté presente como un agregado en la formulación.
Se desea una DVD-lg estable in vitro a diferentes temperaturas durante un período de tiempo extenso. Esto puede efectuarse por medio de un análisis rápido de los mAb progenitores estables in vitro a temperaturas elevadas, por ejemplo, a 40°C, durante un período de entre 2 y 4 semanas, a lo que sigue la evaluación de la estabilidad. Durante el almacenamiento a entre 2 y 8°C, la proteína muestra estabilidad durante al menos 12 meses, por ejemplo, al menos 24 meses. La estabilidad (% de molécula intacta, monomérica) puede evaluarse usando distintas técnicas, tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de exclusión molecular, la SDS-PAGE y las evaluaciones de la bioactividad. Para hallar una lista más exhaustiva de las técnicas de análisis que pueden emplearse para evaluar las modificaciones covalentes y conformacionales, véanse, Jones, A.J.S., "Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems", capítulo 2 de Formulation and delivery of peptides and proteins, 1a edición (Cleland y Langer, editores) (Sociedad Americana de Química, Washington, D.C., 1994) pp. 22-45; y Pearlman y Nguyen, "Analysis of protein drugs", capítulo 6 de Peptide and protein drug delivery, 1a edición [en Advances ¡n Parenteral Sciences, vol. 4] (Lee, V.H., editor) (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1991) pp. 247-301.
Heterogeneidad y formación de agregados. La estabilidad del anticuerpo puede ser tal que la formulación puede mostrar menos de aproximadamente 10%, y, en una modalidad, menos de aproximadamente 5%, En otra modalidad, menos de aproximadamente 2%, o, en una modalidad, en el rango entre 0,5% y 1,5% o menos en el material anti-GMP que está presente como agregado. La cromatografía de exclusión molecular es un método que es sensible, reproducible, y muy robusto en la detección de agregados de proteína.
Adicionalmente a niveles bajos de agregados, el anticuerpo debe, en una modalidad, ser químicamente estable. La estabilidad química puede ser determinada por cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico o amónico), cromatografía de interacción hidrofóbica, u otros métodos tales como isoelectroenfoque o electroforesis capilar. Por ejemplo, la estabilidad química del un anticuerpo puede ser tal que, después de almacenarlo durante al menos 12 meses a una temperatura de entre 2 y 8°C, el pico que representa el anticuerpo no modificado en una cromatografía de intercambio catiónico puede aumentar no más de 20%, en una modalidad, no más de 10%, o, en otra modalidad, no más de 5% en comparación con la solución de anticuerpo antes del ensayo de almacenamiento.
En una modalidad, los anticuerpos progenitores muestran integridad estructural; correcta formación de puentes disulfuro, y correcto plegamiento: la inestabilidad química debida a cambios en la estructura secundaria o terciaria de un anticuerpo puede impactar en la actividad del anticuerpo. Por ejemplo, la estabilidad indicada por la actividad del anticuerpo puede ser tal que, después de almacenarlo durante al menos 12 meses a una temperatura de entre 2 y 8°C, la actividad del anticuerpo pueda disminuir no más de 50%, en una modalidad no más de 30%, o incluso no más de 10%, o en una modalidad no más de 5% o 1% en comparación con la solución de anticuerpo antes del ensayo de almacenamiento. Pueden emplearse ensayos de unión al antígeno para determinar la actividad del anticuerpo.
B.5.2. Solubilidad La "solubilidad" de un mAb se correlaciona con la producción de una IgG monomérica correctamente plegada. La solubilidad de la IgG por lo tanto puede ser evaluada por HPLC. Por ejemplo, la IgG soluble (monomérica) dará lugar a un pico único en el cromatograma de HPLC, mientras que la insoluble (por ejemplo, multimérica y agregada) dará lugar a varios picos. Una persona versada en la técnica tendrá por lo tanto la capacidad de detectar un aumento o disminución en la solubilidad de una IgG usando técnicas de HPLC de rutina. Para hallar una lista más exhaustiva de las técnicas de análisis que pueden emplearse para evaluar la solubilidad, véanse, Jones, A.G., Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. del Col. de Londres, "Particle formation and separation in suspensión crystallization processes", capítulo 4 de Process. Solid-Liquid Suspensions, (P. Ayazi Shamlou, editor) (Butterworth-Heinemann, Oxford, Reino Unido, 1993) pp. 93-117; y Pearlman y Nguyen, "Analysis of protein drugs", capitulo 6 en Peptide and protein drug delivery, 1a edición [en Advances in Parenteral Sciences, vol. 4] (Lee, V.H., editor) (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1991) pp. 247-301). La solubilidad de un mAb terapéutico es crítica para la formulación a altas concentraciones requeridas con frecuencia para la adecuada dosificación. Tal como se describe en la presente, solubilidades > 100 mg/ml pueden ser requeridas para permitir la dosificación eficaz del anticuerpo. Por ejemplo, la solubilidad del anticuerpo no puede ser menos de aproximadamente 5 mg/ml en la fase de investigación temprana, en una modalidad no menos de aproximadamente 25 mg/ml en estadios de procesos avanzados de la ciencia, o en una modalidad no menos de aproximadamente 100 mg/ml, o en una modalidad no menos de aproximadamente 150 mg/ml. Las propiedades intrínsecas de una molécula proteica son importantes para las propiedades fisicoquímicas de la proteína en una solución, por ejemplo, su estabilidad, su solubilidad o su viscosidad. Sin embargo, una persona versada en la técnica apreciará que existe una gran variedad de excipientes que pueden usarse como aditivos para afectar beneficiosamente las características de la formulación de proteína final. Estos excipientes pueden incluir: (i) solventes líquidos, cosolventes (por ejemplo, alcoholes tales como etanol); (ii) agentes amortiguadores (por ejemplo, fosfato, acetato, citrato, aminoácidos amortiguadores); (iii) azúcares o alcoholes azúcares (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, fructosa, rafinosa, manitol, sorbitol, dextranos); (iv) tensioactivos (por ejemplo, polisorbato 20, 40, 60, 80, poloxámeros); (v) modificadores de isotonicidad (por ejemplo, sales tales como NaCI, azúcares, alcoholes azúcares); y (vi) otros (por ejemplo, preservantes, agentes quelantes, antioxidantes, sustancias quelantes (por ejemplo, EDTA), polímeros biodegradables, moléculas vehículo (por ejemplo, HSA, PEGs).
La viscosidad es un parámetro de gran importancia con relación a la fabricación del anticuerpo y el procesamiento del anticuerpo (por ejemplo, diafiltración/ultrafiltración), procesos de llenado y terminado (aspectos de bombeo, aspectos de filtración) y aspectos de administración (jeringabilidad, administración con dispositivo sofisticado). Las bajas viscosidades permiten que la solución líquida del anticuerpo tenga altas concentraciones. Esto permite que la misma dosis sea administrada en pequeños volúmenes. Pequeños volúmenes de inyección forman parte de la ventaja de menor dolor en la sensación de la inyección, y las soluciones no tienen que ser necesariamente isotónicas para reducir el dolor en las inyecciones en el paciente. La viscosidad de la solución de anticuerpo puede ser tal que a velocidades de cizalla de 100 (1/s) la viscosidad de la solución de anticuerpo es menor que 200 mPa s, en una modalidad menor a 125 mPa s, en otra modalidad menor a 70 mPa s, y en aún otra modalidad menor a 25 mPa s o incluso menor a 10 mPa s.
B.5.3. Eficiencia de la producción La generación de una DVD-lg que se expresa eficazmente en células mamíferas, tales como células de ovarios de hámster chino (CHO), requerirá en una modalidad dos anticuerpos monoclonales progenitores que se expresan eficazmente en células mamíferas. El rendimiento de producción de una línea mamífera estable (es decir, CHO) debe ser superior a aproximadamente 0,5 g/l, en una modalidad superior a aproximadamente 1g/l, y en otra modalidad en el rango de aproximadamente entre 2 y 5 g/l o más (Kipriyanov SM, Little M. 1999 Mol Biotechnol. Biotechnol., 12:173-201 (1999); Carroll et al., Expert Opin Biol Ther., 4:1821-1829 (2004)).
La producción de anticuerpos y proteínas de fusión Ig en células mamíferas está influenciada por varios factores. El diseño del vector de expresión por medio de la incorporación de promotores fuertes, potenciadores y marcadores de selección puede maximizar la transcripción del gene de interés a partir de una copia del vector integrado. La identificación de los sitios de integración de un vector que permiten obtener una transcripción de los genes en niveles elevados permiten incrementar la expresión de las proteínas a partir de dicho vector (Wurm, F.M., Nature Biotechnol., 22(11): 1393-1398 (2004)). Además, los niveles de producción son afectados por la proporción entre las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo y por los diversps pasos en el proceso de ensamblaje y secreción de la proteína (Jiang et al. Prog., 22(1): 313-318 (2006)).
B.6. Inmunogenicidad La administración de un mAb terapéutico puede dar como resultado con cierta incidencia una respuesta inmune (es decir, la formación de anticuerpos endógenos dirigidos contra el mAb terapéutico). Los potenciales elementos que pueden inducir inmunogenicidad deben ser analizados durante la selección de los anticuerpos monoclonales progenitores, y se deben realizar pasos para reducir dichos riesgos para optimizar los anticuerpos monoclonales progenitores antes de la construcción de DVD-lg. Se ha encontrado que los anticuerpos derivados de ratón son altamente inmunogénicos en pacientes. La generación de anticuerpos quiméricos compuestos por regiones variables de ratón y regiones humanas representa el siguiente paso lógico en el esfuerzo por reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos terapéuticos (Morrison y Schlom, "Recombinant Chimeric Monoclonal Antibodies", capítulo 1 de Important Advances in Oncology 1990 (J.B. Lippincott Company, Filadelfia, 1990) pp. 3-18). Como alternativa, la inmunogenicidad puede reducirse transfiriendo secuencias de CDR murinas a un marco de trabajo humano (reforma/injerto de CDR/humanización), como se describe para un anticuerpo terapéutico en Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988). Otro método se conoce como la "modificación superficial", y comienza con dominios variables livianos y pesados de roedores en los que se cambian solamente los aminoácidos del marco de trabajo a los que puede accederse desde la superficie por aminoácidos humanos, al tiempo que se conservan los aminoácidos de las CDR y los aminoácidos ocultos del anticuerpo progenitor de roedor (Roguska et al., Protelna Eng., 9(10): 895-904 (1996)). En otro tipo de humanización, en lugar de injertar las CDR completas, en un método se injertan tan solo las "regiones de determinación de la especificidad" (SDR), que se definen como el subconjunto de residuos de las CDR que participan en la unión entre el anticuerpo y su objetivo (Kashmiri et al., 36(1). 25-34 (2005)). Para esto, es necesario identificar las SDR por medio del análisis de las estructuras tridimensionales disponibles de los complejos de anticuerpos y objetivos, o mediante el análisis por mutación de los residuos de las CDR del anticuerpo, con el propósito de determinar cuáles interactúan con el objetivo. Como alternativa, los anticuerpos completamente humanos pueden tener una inmunogenicidad reducida en comparación con los anticuerpos murinos, quiméricos o humanizados.
Otra estrategia para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos es la eliminación de ciertas secuencias específicas que se predice como inmunogénicas. En una estrategia, si después de una primera generación se evaluó la biología en seres humanos y se determinó una imunogenicidad inaceptable, es posible mapear los epitopes de las células B y alterarlos para evitar la detección inmune. En otro abordaje, se usan métodos para predecir y eliminar distintos epitopes potenciales de células T. Se han desarrollado métodos computacionales para estudiar e identificar las secuencias de péptidos de terapéuticos biológicos con el potencial de unirse a proteínas MHC (Desmet et al., 58: 53-69 (2005)). Como alternativa puede usarse un método basado en células dendríticas para identificar los epitopes para las células T CD4+ en los alérgenos proteicos potenciales (Stickier et al., J. Immunother., 23: 654-660 (2000); Morrison y Schlom, Important Adv. Oncol. (1990) pp. 3-18; Riechmann et al. " Reshaping human antibodies for therapy", Nature. 332: 323-327 (1988); Roguska et al., "A comparison of two murine mAb humanized by CDR-grafting and variable domain resurfacing", Proteína Eng., 9: 895-904 (1996); Kashmiri et al., "SDR grafting - a new approach to antibody humanization", Methods, 36(1): 25-34 (2005); Desmet et al., "Anchor profiles of HLA-specific peptides: analysis by a novel affinity scoring method and experimental validatíon. 53-69 (2005); Stickier et al., "CD4+ T-cell epitope determination using unexposed human donor peripheral blood mononuclear cells", J. Immunother., 23: 654-660 (2000)).
B.7. Eficacia in vivo Para generar una molécula de DVD-lg con una eficacia in vivo deseada, es importante generar y seleccionar mAb con eficacia in vivo deseada similar cuando se da en combinación. Sin embargo, en algunos casos la DVD-lg puede exhibir una eficacia in vivo que no puede ser lograda con la combinación de dos mAb separados. Por ejemplo, una DVD-lg puede acercar dos objetivos induciendo una actividad que no puede alcanzarse con la combinación de dos mAb separados. Se describen otras funciones biológicas deseables en la sección B.3 de la presente. Los anticuerpos progenitores que puedan aportarle características deseables a la molécula de DVD-lg podrán seleccionarse sobre la base de factores como su vida media farmacocinética (t½), su distribución en los tejidos, su carácter soluble o anclado en la superficie celular y su concentración o su densidad en el objetivo.
B.8. Distribución en los tejidos in vivo Para generar una molécula de DVD-lg con una distribución tisular in vivo deseada, en una modalidad se deben seleccionar mAb progenitores con similar perfil de distribución tisular in vivo deseada. Como alternativa, en base a los mecanismos de la estrategia de direccionamiento específico dual, puede en otros casos no ser necesaria la selección de mAb progenitores con la similitud en la distribución tisular in vivo deseada cuando se da en combinación. Por ejemplo, en el caso de una DVD-lg donde un componente de unión dirige la DVD-lg a un sitio específico llevando de esta manera al segundo componente de unión al mismo sitio objetivo. Por ejemplo, una especificidad de unión de una DVD-lg podría estar dirigida a páncreas (células del islote) y la otra especificidad podría llevar GLP1 al páncreas para inducir insulina.
B.9. Isotipo Para generar una molécula de DVD-lg con las propiedades deseadas, que incluyen, sin limitaciones, el isotipo, las funciones efectoras y la vida media en la circulación, se seleccionan mAb progenitores que poseen funciones efectoras de Fe apropiadas, en función de la utilidad terapéutica y el objetivo terapéutico buscado. Hay cinco clases o ¡sotipos de cadena pesada principales, algunos de los cuales tienen varios subtipos y estos determinan las funciones efectoras de una molécula de anticuerpo. Estas funciones efectoras residen en la región bisagra, dominios CH2 y CH3 de la molécula de anticuerpo. Sin embargo, los residuos en otras partes de una molécula de anticuerpo pueden tener igualmente efectos en las funciones efectoras. La región bisagra de las funciones efectoras Fe incluye: (i) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, (ii) unión a complemento (C1q), activación y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), (iii) fagocitosis/depuración de complejos antígeno-anticuerpo, y (iv) liberación de citocina en algunos casos. Estas funciones efectoras Fe de una molécula de anticuerpo están mediadas por medio de la interacción de la región Fe con un conjunto de receptores de superficie celular específicos de clase. Los anticuerpos del isotipo lgG1 son más activos mientras que lgG2 e lgG4 tienen mínimas o ninguna función efectora.
Las funciones efectoras de los anticuerpos IgG están mediadas por interacciones con tres tipos de receptores de Fe celular estructuralmente homólogos (y subtipos) (FcgR1, FcgRIl y FcgRIII). Estas funciones efectoras de una I gG 1 pueden eliminarse por mutación de residuos aminoácidos específicos en la región bisagra inferior (por ejemplo, L234A, L235A) que son requeridos para la unión FcgR y C1q. Los residuos de aminoácidos en la región Fe, en particular los dominios CH2-CH3, también determinan la vida media de circulación de la molécula de anticuerpo. Esta función de Fe está mediada por la unión de la región Fe al receptor Fe neonatal (FcRn) que es responsable para la recirculación de las moléculas de anticuerpo desde los lisosomas ácidos nuevamente a la circulación general.
Si un mAb debe tener un isotipo activo o uno inactivo, dependerá del objetivo terapéutico deseado para un anticuerpo. Más adelante se enumeran algunos ejemplos de uso de isotipos y resultado terapéutico deseado: 1. Si el objetivo deseado es la neutralización funcional de una citocina soluble, entonces puede usarse un isotipo inactivo; 2. Si el objetivo deseado es la depuración de una proteína patológica, puede usarse un isotipo activo; 3. Si el resultado deseado es la depuración de agregados de proteína, puede usarse un isotipo activo; 4. Si el resultado deseado es antagonizar un receptor de superficie, puede usarse un isotipo inactivo (Tysabri, lgG4; OKT3, I g G 1 mutada); 5. Si el resultado deseado es eliminar las células objetivo, puede usarse un isotipo activo (Herceptina, lgG1 (y con funciones efectoras potenciadas); y 6. Si el resultado deseado es quitar proteínas de la circulación sin entrar al SNC, puede usarse un isotipo IgM (por ejemplo, depuración de especies de péptidos Ab circulantes).
Las funciones efectoras Fe de un mAb progenitor puede determinarse por diferentes métodos in vitro conocidos en la técnica.
Tal como se discutió, la selección del isotipo, y de esta manera las funciones efectoras dependerán del objetivo terapéutico deseado. En los casos donde se desee la simple neutralización de un objetivo circulante, por ejemplo, el bloqueo de las interacciones receptor-ligando, las funciones efectoras podrán ser no necesarias. En estos casos, se desearán los isotipos o mutaciones en la región Fe de un anticuerpo que eliminen las funciones efectoras. En otros casos donde la eliminación de las células objetivo sea el objetivo terapéutico, por ejemplo, la eliminación de las células tumorales, resultarán deseables los isotipos o las mutaciones o la eliminación de las fucosas en la región Fe que potencien las funciones efectoras (Presta GL, Adv. Drug Del. Rev., 58: 640-656 (2006); Satoh et al., Expert Opin. Biol. Ther., 6: 1161-1173 (2006). De manera similar, dependiendo de la utilidad terapéutica, la vida media de una molécula de anticuerpo podrá reducirse/prolongarse modulando las interacciones anticuerpo/FcRn, a través de la introducción de mutaciones específicas en la región Fe (Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem., 281: 23514-23524 (2006); Petkova et al., Int.
Immunol., 18: 1759-1769 (2006); Vaccaro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 18709-18714 (2006)).
Puede ser necesario confirmar para las DVD-lg la información publicada sobre los distintos residuos que influyen en las diversas funciones efectoras de un mAb terapéutico normal. Puede ser posible que, en un formato DVD-lg adicional (diferente), sean importantes residuos de la región Fe que sean diferentes de los que se hayan identificado para la modulación de las funciones efectoras del anticuerpo monoclonal.
En conjunto, la decisión de cuales funciones efectoras Fe (isotipo) serán críticas en el formato DVD-lg final dependerá de la indicación de la enfermedad, objetivo terapéutico, objetivo terapéutico deseado y consideraciones de seguridad. Más adelante se enumeran regiones constantes apropiadas de cadena pesada y cadena ligera que incluyen, a modo de ejemplo ilustrativo: IgG 1 - alotipo: G1mz; I g G 1 mutante -A234, A235; lgG2 - alotipo: G2m(n-); Kappa - Km3; y Lambda.
Estudios de receptor de Fe y C1q: La posibilidad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC) y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) no deseadas por formación de complejos de anticuerpo a cualquier objetivo sobreexpresado en las membranas celulares, puede ser abolida por las mutaciones en la región bisagra (por ejemplo, L234A, L235A). Estos aminoácidos sustituidos, presentes en la región bisagra de I g G 1 del mAb, se espera que den como resultado una unión disminuida de mAb a los receptores de Fe humano (pero no FcRn), ya que la unión de FcgR se cree que ocurre en sitios superpuestos en la región bisagra de IgG 1. Esta característica de mAb puede llevar a un perfil de seguridad mejorado sobre anticuerpos que contienen una IgG de tipo salvaje. La unión de mAb a los receptores de Fe humanos pueden determinarse por experimentos de citometría de flujo usando líneas celulares (por ejemplo, THP-1 , K562) y una línea celular CHO diseñada que exprese FcgRIIb (u otros FcgR). En comparación con anticuerpos monoclonales IgG 1 control, mAb presenta unión reducida a FcgRI y FcgRIIa mientras que la unión a FcgRIIb no está afectada. La unión y activación de C1q por complejos inmunes antígeno/lgG dispara la cascada clásica del complemento con las consecuentes respuestas inflamatoria y/o inmunoregulatoria. El sitio de unión a C1q en las IgGs ha sido localizado en residuos de la región bisagra de IgG. La unión de C1q para aumentar las concentraciones de mAb se evaluó por ELISA de C1q. Los resultados demostraron que mAb no es capaz de unirse a C1q, tal como se esperaba cuando se comparó con la unión de una lgG1 de tipo salvaje control. En conjunto, las mutaciones L234A, L235A en la región bisagra desactiva la unión de mAb a FcgRI, FcgRIIa y C1q pero no afecta la interacción de mAb con FcgRIIb. Estos datos sugieren que in vivo, el mAb con Fe mutante ¡nteractuará normalmente con el FcgRIIb inhibitorio pero probablemente fracasará en interactuar con los receptores activadores FcgRI y FcgRIIa o C1q.
Unión a FcRn humano: El receptor neonatal (FcRn) es responsable del transporte de IgG a través de la placenta y para el control de la vida media catabólica de las moléculas de IgG. Puede ser deseable aumentar la vida media terminal de un anticuerpo para mejorar la eficacia, para reducir la dosis o frecuencia de la administración, o para mejorar la localización al objetivo. Como alternativa, puede ser ventajoso realizar lo opuesto, es decir, disminuir la vida media terminal de un anticuerpo para reducir la exposición al cuerpo entero o para mejorar la relación de unión objetivo a no objetivo. El ajuste de la interacción entre IgG y su receptor salvaje, FcRn, ofrece una manera de aumentar o disminuir la vida media terminal de IgG. Las proteínas en la circulación, incluyendo IgG, son incorporadas en la fase fluido por medio de micropinocitosis por ciertas células, tales como aquellas del endotelio vascular. IgG puede unirse a FcRn en endosomas bajo condiciones levemente ácidas (pH entre 6,0 y 6,5) y puede reciclarlo a la superficie celular, donde se libera bajo condiciones casi neutras (pH entre 7,0 y 7,4). El mapeo del sitio de unión de la región Fe en FcRn80, 16, 17 mostró que dos residuos histidina que son conservados en las especies, His310 y His435, son los responsables de la dependencia con el pH de esta interacción. Usando tecnología de expresión en fagos, se identificó una mutación en la región Fe de ratón que aumenta la unión a FcRn y extiende la vida media de la IgG de ratón (véase Víctor, G. et al.; Nature Biotechnology (1997), 15(7), 637-640). 637-640 (1997)). Las mutaciones en la región Fe que aumentan la afinidad de unión de IgG humana por FcRn a pH 6,0, pero no a pH 7,4, también han sido identificadas (véase Dall'Acqua William F, et al., Journal of Immunology (2002), 169(9), 5171-80). 5171-5180 (2002)). Adicionalmente, en un caso, también se observó un aumento similar dependiente del pH en la unión (hasta 27 veces) para FcRn de Rhesus, y esto dio como resultado un aumento de dos veces en la vida media sérica en monos Rhesus en comparación con la IgG progenitor (véase Hinton, Paul R. et al., Journal of Biological Chemistry (2004), 279(8), 6213-6216). 6213-6216 (2004)). Estos hallazgos indican que es posible extender la vida media en plasma de la terapéutica del anticuerpo por ajuste de la interacción de la región Fe con FcRn. Por el contrario, las mutaciones en la región Fe que atenúan la interacción con FcRn pueden reducir la vida media del anticuerpo.
B.10. Farmacocinética (PK) Para generar una molécula de DVD-lg con perfil farmacocinético deseado, en una modalidad se seleccionan mAb progenitores con perfil farmacocinético similarmente deseado. Una consideración es que la respuesta inmune a anticuerpos monoclonales (es decir, HAHA, respuesta humana anti-anticuerpo humano; HACA, respuesta humana anti-anticuerpo quimérico) además complica la farmacocinética de estos agentes terapéuticos. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales con mínima o sin inmunogenicidad se usan para la construcción de moléculas de DVD-lg de modo que las DVD-lg resultantes también tendrán mínima o ninguna inmunogenicidad. Algunos de los factores que determinan la PK de un mAb incluyen, a modo de ejemplo ilustrativo, propiedades intrínsecas del mAb (secuencia de aminoácidos de VH); inmunogenicidad; unión a FcRn y funciones de Fe.
El perfil PK de los anticuerpos monoclonales progenitores seleccionados puede ser determinado fácilmente en roedores ya que el perfil PK en roedores se correlaciona bien con (o predice con detalle) el perfil PK de anticuerpos monoclonales en monos Cynomolgus y humanos.
Luego que se seleccionan los anticuerpos monoclonales progenitores con características de PK deseadas (y otras propiedades funcionales deseadas tal como se describe en la presente), se construye la QVD-lg. Dado que las moléculas de DVD-lg contienen dos dominios de unión al antígeno de dos anticuerpos monoclonales progenitores, las propiedades PK de la DVD-lg también se evalúan. Por lo tanto, mientras se determinan las propiedades PK de la DVD-lg, pueden emplearse ensayos PK para determinar el perfil PK en base a la funcionalidad de ambos dominios de unión al antígeno derivados de los 2 anticuerpos monoclonal progenitores. Es posible determinar el perfil PK de una DVD-lg. Otros factores que pueden afectar el perfil PK de una DVD-lg incluyen la orientación del dominio de unión al antígeno (CDR), el tamaño del conector y las interacciones Fc/FcRn. Las características PK de los anticuerpos progenitores pueden evaluarse por análisis de los siguientes parámetros: absorción, distribución, metabolismo y excreción.
Absorción: Hasta este momento, la administración de anticuerpos monoclonales terapéuticos es por medio de rutas parenterales (por ejemplo, intravenosa [IV], subcutánea [SC], o intramuscular [IM]). La absorción de un mAb en la circulación sistémica seguido de la administración SC ó IM del espacio intersticial es principalmente a través de la vía linfática. La degradación proteolítica, saturable, presistémica puede dar como resultado una biodisponibilidad absoluta variable después de la administración extravascular. Generalmente, puede observarse un aumento en la biodisponibilidad absoluta con el aumento de las dosis de anticuerpos monoclonales debido a la saturación de la capacidad proteolítica a altas dosis. El proceso de absorción para un mAb usualmente es bastante lento, ya que el fluido se drena lentamente hasta el sistema vascular, y la duración de la absorción puede variar entre varias horas y varios días. La biodisponibilidad absoluta de los anticuerpos monoclonales después de una administración SC generalmente varía entre 50% y 100%. En el caso de una estructura mediadora de transporte en la barrera hematoencefálica objetivo de la construcción DVD, los tiempos de circulación en plasma pueden ser reducidos debido al transporte transcelular potenciado (o mejorado, o aumentado) en la barrera HE hacia el compartimiento del SNC, donde se libera la DVD-lg para permitir su interacción a través de su segundo sitio de reconocimiento del antígeno Distribución: Después de la administración IV, los anticuerpos monoclonales generalmente siguen un perfil bifásico de concentración-tiempo en suero (o plasma), comenzando con una fase rápida de distribución, seguido de una fase de eliminación lenta. En general, un modelo farmacocinético biexponencial es el que mejor describe este tipo de perfil farmacocinético. El volumen de distribución en el compartimiento central (Ve) para un mAb es generalmente igual a o levemente mayor que el volumen del plasma (entre 2 y 3 litros). Un patrón bifásico marcado en el perfil sérico (plasma) de concentración versus tiempo puede no ser evidente para otras vías parenterales de administración, tales como IM ó SC, debido a que la fase de distribución de la curva de concentración sérica(plasma)-tiempo está enmascarada por la porción larga de absorción. Muchos factores, incluyendo las propiedades fisicoquímicas, la incorporación específica mediada por receptor específica de sitio y orientada por objetivo, la capacidad de unión del tejido, y la dosis de mAb pueden influir en la biodistribución de un mAb. Algunos de estos factores pueden contribuir a la no linealidad en la biodistribución para un mAb.
Metabolismo y excreción: Debido al tamaño molecular, los anticuerpos monoclonales intactos no son excretados en la orina por medio del riñon. Son principalmente inactivados por el metabolismo (por ejemplo, catabolismo). Para anticuerpos monoclonales terapéuticos en base a IgG, las vidas medias generalmente varían en un rango entre horas o entre 1y 2 días hasta más de 20 días. La eliminación de un mAb puede ser afectada por muchos factores, incluyendo, a modo de ejemplo ilustrativo, afinidad por el receptor de FcRn, inmunogenicidad del mAb, el grado de glicosilación del mAb, la susceptibilidad del mAb a la proteólisis, y eliminación mediada por receptor.
B.11. Patrón de reactividad cruzada tisular en seres humanos y en especies tox Los patrones de tinción idénticos sugieren que la potencial toxicidad humana puede ser evaluada en especies tox. Las especies tox son aquellos animales en los cuales se estudia la toxicidad no relacionada.
Los anticuerpos individuales se seleccionan de manera que cumplan con dos criterios. (1) una coloración del tejido apropiada para la expresión del objetivo conocido del anticuerpo y (2) un patrón de coloración similar entre el ser humano y los tejidos del mismo órgano de especies tox.
Criterio 1: Inmunizaciones y/o selecciones de anticuerpo generalmente emplean antígenos recombinantes o sintetizados (proteínas, hidratos de carbono u otras moléculas). La unión a su contraparte natural y contraselección contra antígenos no relacionados son frecuentemente parte del embudo del tamizaje para anticuerpos terapéuticos. Sin embargo, la selección contra una multitud de antígenos es generalmente poco práctica. Por lo tanto los estudios de reactividad cruzada de tejido con tejidos humanos de todos los órganos mayores sirven para descartar la unión no deseada del anticuerpo a cualquier antígeno no relacionado.
Criterio 2: Estudios de reactividad cruzada de tejido comparativos con tejidos humanos y de especies tox (mono Cynomolgus, perro, posiblemente roedores y otros, los mismos 36 ó 37 tejidos son ensayados como en el estudio humanos) ayudan para validar la selección de una especie tox. En los estudios típicos de reactividad cruzada de tejido en secciones de tejidos congelados los anticuerpos terapéuticos pueden demostrar la unión esperada al antígeno conocido y/o con un menor grado la unión a tejidos en base a interacciones de nivel bajo (unión inespecíf ica, unión con bajo nivel a antígenos similares, interacciones basadas en cargas de bajo nivel, etc.)- En cualquier caso la especie toxicológica animal más relevante es la que tiene el mayor grado de coincidencia de unión a tejido humano y animal.
Los estudios de reactividad cruzada de tejido siguen las normas regulatorias apropiadas incluyendo la norma 111/5271/94 EC CPMP "Producción y control de calidad de mAb" y la 1997 US FDA/CBER "Puntos para considerar en la fabricación y ensayo de productos de anticuerpos monoclonales para el uso humano". Se fijaron criosecciones (5 µ?t?) de tejidos humanos obtenidos por autopsia o biopsia y se secaron sobre portaobjetos. Se realizó la tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, usando el sistema avidina-biotina. Normas de FDA "Puntos para considerar en la fabricación y ensayo de productos de anticuerpos monoclonales para el uso humano". Las referencias relevantes incluyen Clarke, J. (2004), Boon, L. (2002a), Boon, L. (2002b), Ryan, A. (1999).
Los estudios de reactividad cruzada de tejido son generalmente realizados en dos etapas, donde la primera etapa incluye criosecciones de 32 tejidos (generalmente: glándula adrenal, tracto gastrointestinal, próstata, vejiga, corazón, músculo esquelético, células sanguíneas, riñon, piel, médula ósea, hígado, médula espinal, mama, pulmón, bazo, cerebelo, ganglio linfático, testículos, corteza cerebral, ovario, timo, colon, páncreas, tiroides, endotelio, paratiroides, uréter, ojo, pituitaria, útero, trompas de Falopio y placenta) de un donante humano. En la segunda fase se realizó un estudio de reactividad cruzada completo con hasta 38 tejidos (incluyendo adrenales, sangre, vasos sanguíneos, médula ósea, cerebelo, cerebro, cérvix, esófago, ojo, corazón, riñon, intestino delgado, hígado, pulmón, ganglio linfático, glándula mamaria, ovario, oviducto, páncreas, paratiroides, nervio periférico, pituitaria, placenta, próstata, glándula salivar, piel, intestino grueso, médula espinal, bazo, estómago, músculo estriado, testículos, timo, tiroides, amígdala, uréter, vejiga urinaria, y útero) de 3 adultos no relacionados. Los estudios se hacen generalmente con dos niveles de dosis como mínimo.
El anticuerpo terapéutico (es decir, el artículo en ensayo) y un anticuerpo control con igual isotipo puede ser biotínilado para la detección del complejo avidina-biotina (ABC); otros métodos de detección pueden incluir la detección de un tercer anticuerpo para un artículo de ensayo marcado para FITC (o similar), o complejación previa con un anti-lgG humana marcado para un artículo de ensayo n o marcado.
Brevemente, las criosecciones (aproximadamente 5 pm) de tejidos humanos obtenidos por autopsia o biopsia se fijaron y se secaron sobre portaobjetos. Se realizó la tinción con peroxidasa de las secciones de tejido, usando el sistema avidina-biotina. Primero (en caso de un sistema de detección de complejación previa), el artículo ensayo se incuba con el anti-lgG humana secundario biotinilado y se convierte en un complejo inmune. Se agrega el complejo inmune con concentraciones finales de entre 2 y 10 pg/ml del artículo ensayo sobre secciones de tejido sobre un portaobjeto y luego se hacen reaccionar las secciones de tejido durante 30 minutos con un conjunto de elementos de avidina-biotina-peroxidasa. Posteriormente, se aplica DAB (3,3'-diaminobencidina), un sustrato para la reacción de la peroxidasa, durante 4 minutos para la tinción del tejido. Se usan esferas de antígeno-Sefarosa como control positivo de secciones de tejido.
Toda tinción específica es considerada reactividad esperada (por ejemplo, coherente con la expresión del antígeno) o no esperada basado en la expresión conocida del antígeno objetivo en cuestión. Cualquier tinción juzgada como específica se califica de acuerdo a la intensidad y frecuencia. Los estudios de competición de antígeno o suero o de bloqueo pueden ayudar adicionalmente en la determinación de si la tinción observada es específica o inespecífica.
Si se encuentra que dos anticuerpos seleccionados cumplen con los criterios de selección -tinción apropiada de tejido, coincidencia de tinción entre tejido específico humano y animal toxicológico-, pueden ser seleccionados para la generación de DVD-lg.
El estudio de reactividad cruzada de tejido tiene que ser repetido con la construcción de DVD-lg final, pero mientras estos estudios siguen el mismo protocolo tal como se describe en la presente, son más complejos de evaluar debido a que cualquier unión puede provenir de cualquier anticuerpo progenitor, y cualquier unión no explicada necesita ser confirmada por estudios complejos de competición de antígeno.
Ha de ser evidente que la tarea compleja de realizar estudios de reactividad cruzada con una molécula multiespecífica como una DVD-lg se simplifica en gran medida si los dos anticuerpos progenitores se seleccionan en función de (1) la ausencia de descubrimientos de reactividad cruzada inesperada en el tejido y (2) la correlación entre los datos de la reactividad cruzada en el tejido humano y los datos de la toxicología en tejidos de animales de otras especies.
B.12. Especificidad y selectividad Para generar una molécula de DVD-lg con la especificidad y selectividad deseadas, uno necesita generar y seleccionar mAb progenitores con el perfil de especificidad y selectividad similarmente deseado.
Los estudios de unión para la especificidad y selectividad con una DVD-lg pueden ser complejos debido a los cuatro o más sitios de unión, dos para cada antígeno. KinExA u otro estudio de interacción con una DVD-lg necesita monitorear la unión de uno, dos o más antígenos a la molécula de DVD-lg. Mientras que la tecnología BIAcore puede resolver la unión independiente, consecutiva, de múltiples antígenos, los métodos más tradicionales que incluyen ELISA o técnicas más modernas como KinExA, no pueden. Por lo tanto la caracterización cuidadosa de cada anticuerpo progenitor es crítica. Una vez que se ha caracterizado la especificidad de cada anticuerpo individual, la confirmación de la retención de la especificidad en los sitios de unión individuales en la molécula de DVD-lg se simplifica en gran medida.
Resulta fácilmente evidente que la compleja tarea de determinar la especificidad de una DVD-lg se simplifica en gran medida si los dos anticuerpos progenitores se seleccionan según la especificidad antes de ser combinados en una DVD-lg.
Los estudios de interacción antígeno-anticuerpo pueden tomar muchas formas, incluyendo muchos estudios de interacción clásicos proteína-proteína, incluyendo ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima), espectroscopia de masa, entrecruzamiento químico, SEC con dispersión de luz, diálisis en equilibrio, permeación en gel, ultrafiltracíón, cromatografía en gel, SEC analítico en zona amplia, ultracentrifugación micropreparativa (equilibrio de sedimentación), métodos espectroscópicos, microcalorimetría de titulación, equilibrio de sedimentación (en ultracentrífuga analítica), velocidad de sedimentación (en centrífuga analítica), resonancia de plasmón superficial (incluyendo BIAcore). Las referencias relevantes incluyen Current Protocols in Proteína Science, volumen 3, capítulos 19 y 20 (Coligan et al., editores) (John Wiley & Sons Inc.) y las referencias incluidas en dicha publicación; y Current Protocols in Immunology (Coligan et al., editores) (John Wiley & Sons Inc.) y las referencias icluidas en dicha publicación.
Liberación de citocinas en sangre completa. La interacción entre el mAb y los eritrocitos humanos puede investigarse con un ensayo de liberación de citocinas (Wing et al., Therapeutic Immunol., 2(4): 183-190 (1995); Current Protocols in Pharmacology (Enna et al., editores) (John Wiley & Sons Inc.); Madhusudan et al., Clin. Cáncer Res., 10(19): 6528-6534 (2004); Cox et. al., Métodos, 38(4): 274-282 (2006); Choi et al., Eur. J. Immunol., 31(1): 94-106 (2001)). Brevemente, se incuban diferentes concentraciones de mAb con sangre completa durante 24 horas. La concentración ensayada debe cubrir un gran rango incluyendo las concentraciones finales que simulan los niveles típicos en sangre en pacientes (incluyendo a modo de ejemplo ilustrativo, entre 100 ng/ml y 100 g/ml). Después de la incubación, se analizaron los sobrenadantes y lisados celulares para estudiar la presencia de IL-1Ra, TNF-ct, IL-1b, IL-6 e IL8. Los perfiles de concentración de citocina generados por mAb se compararon con los perfiles producidos por una IgG humana control negativo y un LPS o PHA control positivo. El perfil de citocina mostrado por mAb tanto en los sobrenadantes como en los lisados celulares fue comparable con la IgG humana control. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal no interactúa con las células sanguíneas humanas para liberar espontáneamente citocinas inflamatorias.
Los estudios de liberación de citocina para una DVD-lg son complejos debido a los cuatro o más sitios de unión, dos de cada uno para cada antígeno. Brevemente, los estudios de liberación de citocinas descritos en la presente miden el efecto de la molécula de DVD-lg completa sobre la sangre completa u otros sistemas celulares, pero pueden resolver cual porción de la molécula provoca la liberación de citocinas. Una vez que se ha detectado la liberación de citocinas, la pureza de la preparación de DVD-lg tiene que ser determinada, dado que algunos componentes celulares que copurifican pueden causar la liberación de citocinas por sí solas. Si la pureza no es una cuestión, puede ser necesario emplear de la fragmentación de DVD-lg (incluyendo a modo de ejemplo ilustrativo la eliminación de la porción Fe, separación de los sitios de unión, etc.), mutagénesis del sitio de unión u otros métodos para descifrar cualquier observación. Resulta fácilmente evidente que esta compleja tarea se simplifica en gran medida si los dos anticuerpos progenitores se seleccionan para que carezcan de liberación de citocina antes de ser combinados en una DVD-lg.
B.13. Reactividad cruzada con otras especies para estudios toxicológicos En una modalidad, los anticuerpos individuales se seleccionaron con suficiente reactividad cruzada por especies tox apropiadas, por ejemplo, mono Cynomolgus. Los anticuerpos progenitores necesitan unirse a objetivos de especies ortólogas (es decir, mono Cynomolgus) y mostrar una respuesta apropiada (modulación, neutralización, activación). En una modalidad, la reactividad cruzada (afinidad/potencia) por objetivos de especies ortólogas deben ser 10 veces la del objetivo humano. En la práctica, los anticuerpos progenitores se evalúan para múltiples especies, incluyendo ratón, rata, perro, mono (y otros primates no humanos), así como especies modelo de enfermedades (es decir, oveja para modelo de asma). La reactividad cruzada aceptable para especies tox de los anticuerpos monoclonales progenitores permite estudios toxicológicos futuros de DVD-lg-lg en las mismas especies. Por esa razón, los dos anticuerpos monoclonales progenitores deben tener reactividad cruzada aceptable para especies tox comunes permitiendo por lo tanto los estudios toxicológicos de DVD-lg en las mismas especies.
El mAb progenitor puede seleccionarse entre diversos mAb capaces de unirse a objetivos específicos que son bien conocidos en la técnica. Éstos incluyen, sin limitaciones, la I L- 1 ß , un anticuerpo anti-TNF (Patente estadounidense N° 6258562), un anticuerpo anti-IL-12 y/o anti-IL-12p40 (Patente estadounidense N° 6914128), un anticuerpo anti-IL-18 (Publicación estadounidense N° 2005/0147610 A1), un anticuerpo anti-C5, anti-CBL, anti-CD147, anti-gp120, anti-VLA-4, anti-CD11a, anti-CD18, anti-VEGF, anti-CD40L, anti CD-40 (por ejemplo, véase la Publicación PCT N° WO 2007/124299), anti-ld, anti-ICAM-1, anti-CXCL13, anti-CD2, anti-EGFR, anti-TGF-beta 2, anti-HGF, anti-cMet, anti DLL-4, anti-NPR1, anti-PLGF, anti-ErbB3, anti-E-selectina, anti-factor Vil, anti-Her2/neu, anti-F gp, anti-CD11/18, anti-CD14, anti-ICAM-3, anti-RON, anti CD-19, anti-CD80 (por ejemplo, véase la Publicación PCT N° WO 2003/039486), anti-CD4, anti-CD3, anti-CD23, anti-beta2-integrina, anti-alfa4beta7, anti-CD52, anti-HLA DR, anti-CD22 (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense N° 5789554), anti-CD20, anti-MIF, anti-CD64 (FcR), anti-TCR alfa beta, anti-CD2, anti-Hep B, anti-CA 125, anti-EpCAM, anti-gp120, anti-CMV, anti-gpllbllla, anti-lgE, anti-CD25, anti-CD33, anti-HLA, anti-IGF1,2, anti-IGFR, anti-VNRintegrina, anti-IL-1 alfa, anti-IL-1 beta, anti-receptor de IL-1, anti-receptor de IL-2, anti-IL-4, anti-receptor de IL-4, anti-l L5, anti-receptor de IL-5, anti-IL-6, anti-IL-6R, RANKL, NGF, DKK, alfaVbeta3, anti-IL-8, anti-IL-9, anti-IL-13, anti-receptor de IL-13 o anti-IL-23, o bien la I L-23p19 (véase Presta, L.G., "Selection, design, and engineering of therapeutic antibodies", J. Allergy Clin. Immunol., 116: 731 :-7362005, y http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/antibodies.html).
Los mAb progenitores también pueden seleccionarse entre diferentes anticuerpos terapéuticos aprobados para el uso, en ensayos clínicos, o en desarrollo para el uso clínico. Dichos anticuerpos terapéuticos incluyen, a modo de ejemplo ilustrativo, rituximab (Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche) (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense N° 5736137), un anticuerpo anti-CD20 quimérico aprobado para tratar linfoma no hodgkiniano; HuMax-CD20, un anti-CD20 actualmente en desarrollo por Genmab, un anticuerpo anti-CD20 descrito en la Patente estadounidense N° 5500362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), y PRO70769 (PCT/US2003/040426, titulado "Variantes de inmunoglobulinas y sus usos"), trastuzumab (HerceptinR, Genentech) (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense N° 5677171), un anticuerpo antí-Her2/neu humanizado aprobado para tratar cáncer de mamas; pertuzumab (rhuMab-2C4, OmnitargR), actualmente en desarrollo por Genentech; un anticuerpo anti-Her2 descrito en la Patente estadounidense N° 4753894; cetuximab (ErbituxR, Imclone) (Patente estadounidense N° 4943533; PCT WO 96/40210), un anticuerpo anti-EGFR quimérico en ensayos clínico para una variedad de canceres; ABX-EGF (Patente estadounidense N° 6235883), actualmente en desarrollo por Abgenix-lmmunex-Amgen; HuMax- EGFr (Solicitud estadounidense N° de Acta 10/172317), actualmente en desarrollo por Genmab; 425, EMD55900, EMD62000, y EMD72000 (Merck KGaA) (Patente estadounidense N° 5558864; Murthy et al. 773-783 (1991)); ICR62 (Instituto de Investigación del Cáncer) Publicación PCT N° WO 95/20045; 549-560 (1987); Rodeck et al., J. Cell Biochem., 35(4):315- 320 (1987); Kettleborough et al., Proteína Eng., 4(7); Modjtahedi et al., J. Cell Biophys., 22.( -3): 129-146 (1993); Modjtahedi et al., Br. J. Cáncer, 67(2):247-253 (1993); Modjtahedi et al., Br. J. Cáncer, 73(2):228-235 (1996); Modjtahedi et al., Int. J. Cáncer, 105(2):273-280 (2003)); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canadá, y Centro de Immunologia Molecular, Cuba (Patente estadounidense N° 5891996; Patente estadounidense N° 6506883; Mateo et al., Immunotechnology, 3(1 ):71 -81 (1997)); mAb-806 (Ludwig Institute for Cáncer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 100(2): 639(-644):2003-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, Instituto Nacional del Cáncer) (PCT WO 0162931A2); y SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138); alemtuzumab (Campath®, Millenium), un mAb humanizado actualmente aprobado para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica de células B; muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), un anticuerpo anti-CD3 desarrollado por Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), un anticuerpo anti-CD20 desarrollado por IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®), un anticuerpo anti-CD33 (proteína p67) desarrollado por Celltech/Wyeth, alefacept (Amevive®), una fusión de Fe con anti-LFA-3 desarrollado por Biogen, abciximab (ReoPro®), desarrollado por Centocor/Lilly, basiliximab (Simulect®), desarrollado por Novartis, palivizumab (Synagis®), desarrollado por Medimmune, infliximab (Remicade®), un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Centocor, adalimumab (Humira®), un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Abbott, Humicade®, un anticuerpo anti-TNFalfa desarrollado por Celltech, golimumab (CNTO-148), un anticuerpo contra TBF completamente humano desarrollado por Centocor, etanercept (Enbrel®), una fusión de Fe con el receptor de TNF p75 desarrollado por Immunex/Amgen, lenercept, una fusión de Fe con el receptor de TNF p55 previamente desarrollado por Roche, ABX-CBL, un anticuerpo anti-CD147 en desarrollo por Abgenix, ABX-IL8, un anticuerpo anti-IL8 en desarrollo por Abgenix, ABX-MA1, un anticuerpo anti-MUC18 en desarrollo por Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1 ), un anti-MUC1 en desarrollo por Antisoma, Therex (R1550), un anticuerpo anti-MUC1 en desarrollo por Antisoma, AngioMab (AS1405), en desarrollo por Antisoma, HuBC-1, en desarrollo por Antisoma, Tioplatin (AS1407) en desarrollo por Antisoma, Antegren® (natalizumab), un anticuerpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) y alfa-4-beta-7 en desarrollo por Biogen, VLA-1 mAb, un anticuerpo anti-integrina VLA-1 en desarrollo por Biogen, LTBR mAb, un anticuerpo anti-receptor beta de linfotoxina (LTBR) en desarrollo por Biogen, CAT-152, un anticuerpo anti-TGF-á2 en desarrollo por Cambridge Antibody Technology, ABT 874 (J695), un anticuerpo anti-IL-?ß en desarrollo por Abbott, CAT-192, un anticuerpo anti-TGF 1 en desarrollo por Cambridge Antibody Technology y Genzima, CAT-213, un anticuerpo anti-Eotaxinl en desarrollo por Cambridge Antibody Technology, LymphoStat-B® un anticuerpo anti-Blys en desarrollo por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1mAb, un anticuerpo anti-TRAIL-R1 en desarrollo por Cambridge Antibody Technology y Human Genome Sciences, Inc., Avastin® bevacizumab, rhuMAb-VEGF), un anticuerpo anti-VEGF en desarrollo por Genentech, un anticuerpo anti-familia de receptor de HER en desarrollo por Genentech, anti-factor tisular (ATF), un anticuerpo anti-factor tisular en desarrollo por Genentech, Xolair® (Omalizumab), un anticuerpo anti-IgE en desarrollo por Genentech, Raptiva® (Efalizumab), un anticuerpo ant¡-CD11a en desarrollo por Genentech y Xoma, anticuerpo MLN-02 (antiguamente LDP-02), en desarrollo por Genentech y Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, un anticuerpo anti-CD4 en desarrollo por Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo anti-IL15 en desarrollo por Genmab y Amgen, HuMax-Inflam, en desarrollo por Genmab y Medarex, HuMax-Cáncer, un anticuerpo anti-Heparanasa I en desarrollo por Genmab y Medarex y Oxford GcoSciences, HuMax-Lymphoma, en desarrollo por Genmab y Amgen, HuMax-TAC, en desarrollo por Genmab, IDEC-131, y anticuerpo anti-CD40L en desarrollo por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab), un anticuerpo anti-CD4 en desarrollo por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, un anticuerpo anti-CD80 en desarrollo por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, un anti-CD23 en desarrollo por IDEC Pharmaceuticals, anticuerpos anti-factor de migración de macrófagos (MIF) en desarrollo por IDEC Pharmaceuticals, BEC2, un anticuerpo anti-idiotipo en desarrollo por Imclone, IMC-1C11, un anticuerpo anti-KDR en desarrollo por Imclone, DC101, un anticuerpo anti-flk-1 en desarrollo por Imclone, anticuerpos anti-VE caderina en desarrollo por Imclone, CEA-Cide® (labetuzumab), un anticuerpo anti-antigeno carcinoembriónico (CEA) en desarrollo por Immunomedics, LymphoCide® (Epratuzumab), un anticuerpo anti-CD22 en desarrollo por Immunomedics, AFP-Cide, en desarrollo por Immunomedics, MyelomaCide, en desarrollo por Immunomedics, LkoCide, en desarrollo por Immunomedics, ProstaCide, en desarrollo por Immunomedics, MDX-010, un anticuerpo anti-CTLA4 en desarrollo por Medarex, MDX-060, un anticuerpo anti-CD30 en desarrollo por Medarex, MDX-070 en desarrollo por Medarex, MDX-018 en desarrollo por Medarex, Osidem® (IDM-1), y anticuerpo anti-Her2 en desarrollo por Medarex y Immuno-Designed Molecules, HuMax®-CD4, un anticuerpo anti-CD4 en desarrollo por Medarex y Genmab, HuMax-IL15, un anticuerpo a nti-l L 15 en desarrollo por Medarex y Genmab, CNTO 148, un anticuerpo anti-TNFá en desarrollo por Medarex y Centocor/J&J, CNTO 1275, un anticuerpo anti-citocina en desarrollo por Centocor/J&J, MOR101 y MOR102, anticuerpos anti-molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) (CD54) en desarrollo por MorphoSys, MOR201, un anticuerpo anti-receptor del factor de crecimiento fibroblástico 3 (FGFR-3) en desarrollo por MorphoSys, Nuvion® (visilizumab), un anticuerpo anti-CD3 en desarrollo por Proteína Design Labs, HuZAF®, un anticuerpo anti-interferón gamma en desarrollo por Proteína Design Labs, Anti-integrina á 5á1, en desarrollo por Proteína Design Labs, anti-IL-12, en desarrollo por Proteína Design Labs, ING-1, un anticuerpo anti-Ep-CAM en desarrollo por Xoma, Xolair® (Omalizumab) un anticuerpo humanizado anti-lgE desarrollado por Genentech y Novartis, y MLN01, un anticuerpo anti-integrina Beta2 en desarrollo por Xoma, todas las referencias citadas en la presente en este párrafo se incorporan expresamente en la presente a modo de referencia. En otra modalidad, los terapéuticos incluyen KRN330 (Kirin); anticuerpo huA33 (A33, Ludwig Institute for Cáncer Research); CNTO 95 (¡ntegrinas alfa V, Centocor); MEDI-522 (¡ntegrina alfa Vá3, Medimmune); volociximab (integrina alfa Vá1, Biogen/PDL); mAb 216 humano (epitope glicosilado de células B, NCI); BiTE MT103 (biespecífico CD19 x CD3, Medimmune); 4G7xH22 (biespecífico célula BxFcgammaRI, Medarex/Merck KGa); rM28 (biespecífico CD28 x MAPG, Patente estadounidense N° EP1444268); MDX447 (EMD 82633) (biespecífico CD64 x EGFR, Medarex); Catumaxomab (removab) (biespecífico EpCAM x anti-CD3, Trion/Fres); Ertumaxomab (biespecífico HER2/CD3, Fresenius Biotech); oregovomab (OvaRex) (CA-125, VíRexx); Rencarex® (WX G250) (anhidrasa carbónica IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 (endoglina), Tracon); BMS-663513 (agonista CD137, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); Siplizumab (MEDI-507) (CD2, Medimmune); Ofatumumab (Humax-CD20) (CD20, Genmab); Rituximab (Rituxan) (CD20, Genentech); veltuzumab (hA20) (CD20, Immunomedics); Epratuzumab (CD22, Amgen); lumíliximab (IDEC 152) (CD23, Biogen); muromonab-CD3 (CD3, Ortho); HuM291 (receptor de fe CD3, PDL Biopharma); HeFi-1. CD30, NCI); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Medarex); SGN-30 (CD30, Seattle Genentics); SGN-33 (Lintuzumab) (CD33, Seattle Genentics); Zanolimumab (HuMax-CD4) (CD4, Genmab); HCD122 (CD40, Novartis); SGN-40 (CD40, Seattle Genentics); Campathlh (Alemtuzumab) (CD52, Genzima); MDX-1411 (CD70, Medarex); hLL1 (EPB-1) (CD74.38, Immunomedics); Galiximab (IDEC-144) (CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) (colágeno escindido, Tracon); HuLuc63 (CS1, PDL Pharma); ipilimumab (MDX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb); Tremelimumab (Ticilimumab, CP-675,2) (CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 (Mapatumumab) (agonista DR4 TRAIL-R1, Human Genome Science/Glaxo Smith Kline); A G-655 (DR5, Amgen); Apomab (DR5, Genentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); HGS-ETR2 (lexatumumab) (agonista DR5 TRAIL-R2, HGS); Cetuximab (Erbitux) (EGFR, Imclone); IMC-11F8, (EGFR, Imclone); Nimotuzumab (EGFR, YM Bio); Panitumumab (Vectabix) (EGFR, Amgen); Zalutumumab (HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab); CDX-110 (EGFRvIll, AVANT Immunotherapeutics); adecatumumab (MT201) (Epcam, Merck); edrecolomab (Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (receptor a de folato, Morphotech); KW-2871 (gangliósido GD3, Kyowa); MORAb-009 (GP-9, Morphotech); CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, Celldex); Trastuzumab (Herceptin) (HER2, Celldex); Pertuzumab (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech); apolizumab (cadena beta HLA-DR, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-1R, Amgen); anti-IGF-1R R1507 (IGF1-R, Roche); CP 751871 (IGF1-R, Pfizer); IMC-A12 (IGF1-R, Imclone), BIIB022 (IGF-1R, Biogen); Mik-beta-1 (IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (IL6, Centocor); Anti-KIR (1-7F9) (Receptor similar a Ig de célula asesina (KIR), Novo); Hu3S193 (Lewis (y), Wyeth, Ludwig Institute de Cáncer Research); hCBE-11 (LT R, Biogen); HuHMFGI (MUC1, Antisoma/NCI); RAV12 (epitope carbohidrato unido a N, Raven); CAL (proteína relacionada con la hormona paratiroides (PTH-rP), University de California); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono-4538) (PD1, Medarex/Ono); MAb CT-011 (PD1, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone); bavituximab (fosfatidilserina, Peregrine); huJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); muJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); GC1008 ((pan) inhibidor TGFb (lgG4), Genzima); Infliximab (Remicade) (TNFa, Centocor); A27.15 (receptor de transferrina, Salk Institute, INSERN WO 2005/111082); E2.3 (receptor de transferrina, Salk Institute); Bevacizumab (Avastin) (VEGF, Genentech); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab-WO/2000/034337, University de Texas); IMC-18F1 (VEGFR1, Imclone); I C-1121 (VEGFR2, Imclone).
C. Construcción de las proteínas de unión DVD-lg™ Una proteína de unión que es una inmunoglobulina con dominio variable dual (DVD-lg) multivalente muitiespecífica se diseña asociando en tándem dos dominios variables de la cadena ligera (VL) diferentes, provenientes de dos anticuerpos monoclonales progenitores diferentes, de manera directa o a través de un conector corto, con métodos de DNA recombinante, seguidos por el dominio constante de cadena ligera. De manera similar, la cadena pesada comprende dos dominios variables de la cadena pesada (VH) diferentes asociados en tándem, seguidos por el domino constante CH1 y la región Fe.
Los dominios variables pueden obtenerse usando técnicas de DNA recombinante a partir de un anticuerpo progenitor que se genera por alguno de los métodos que se describen en la presente. En una modalidad, el domino variable es un domino variable murino de la cadena pesada o ligera. En otra modalidad, el domino variable es un dominio variable de la cadena pesada o ligera con CDR injertada o humanizado. En una modalidad, el domino variable es un domino variable humano de la cadena pesada o ligera.
En una modalidad el primero y segundo dominios variables se asocian directamente entre ellos usando técnicas de DNA recombinante. En otra modalidad, los dominios variables se asocian a través de una secuencia conectora. En una modalidad, se asocian dos dominios variables. También pueden asociarse tres o más dominios variables en forma directa o a través de una secuencia conectora. Los dominios variables pueden unir al mismo antígeno o pueden unir antígenos diferentes. Las moléculas de DVD-lg de la invención pueden incluir un domino variable de inmunoglobulina y un domino variable de no inmunoglobulina tal como un dominio de unión a ligando de un receptor, el dominio activo de una enzima. Las moléculas DVD también pueden comprender 2 o más dominios no Ig.
La secuencia conectora puede ser un solo aminoácido o un péptido conector que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. En una modalidad, la secuencia conectora se selecciona del grupo que consiste en GGGGSG (SEQ ID N° 26), GGSGG (SEQ ID N° 27), GGGGSGGGGS (SEQ ID N° 28), GGSGGGGSG (SEQ ID N° 223), GGSGGGGSGS (SEQ ID N° 29), GGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N° 30), GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID N° 31), GGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID N° 32), ASTKGP (SEQ ID N° 33), ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID N° 34), TVAAP (SEQ ID N° 35), RTVAAP (SEQ ID N° 224), TVAAPSVFIFPP (SEQ ID N° 36), RTVAAPSVFI FPP (SEQ ID N° 225), AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID N° 37), AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID N° 38), AKTTPKLGG (SEQ ID N° 39), SAKTTPKLGG (SEQ ID N° 40), SAKTTP (SEQ ID N° 41), RADAAP (SEQ ID N° 42), RADAAPTVS (SEQ ID N° 43), RADAAAAGGPGS (SEQ ID N° 44), RADAAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N° 45), SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID N° 46), ADAAP (SEQ ID N° 47), ADAAPTVSIFPP (SEQ ID N° 48), QPKAAP (SEQ ID N° 49), QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID N° 50), AKTTPP (SEQ ID N° 51), AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID N° 52), AKTTAP (SEQ ID N° 53), AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID N° 54), GENKVEYAPAL ALS (SEQ ID N° 55), GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID N° 56) y GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID N° 57). La elección de las secuencias conectoras se basa en el análisis de la estructura cristalina de varias moléculas Fab. Existe un acoplamiento flexible natural entre el domino variable y el dominio constante CH1/CL en Fab o en la estructura molecular del anticuerpo. Este acoplamiento natural comprende aproximadamente entre 10 y 12 residuos de aminoácidos, contribuidos por entre 4 y 6 residuos del extremo C terminal del dominio V y entre 4 y 6 residuos del extremo N terminal del domino CL/CH1. Las DVD-lg descritos en la presente pueden generarse usando entre 5 y 6 residuos de aminoácidos N terminales, o entre 11 y 12 residuos de aminoácidos, de CL o CH1, como conector en la cadena ligera y cadena pesada de las DVD-lg, respectivamente. Los residuos N terminales de los dominios CL o CH1, en particular los primeros 5 a 6 residuos de aminoácidos, adoptan una conformación en bucle sin estructuras secundarias fuertes, y por lo tanto pueden actuar como conectores flexibles entre los dos dominios variables. Los residuos N terminales de los dominios CL ó CH1 son una extensión natural de los dominios variables, ya que son parte de las secuencias de Ig, y por lo tanto minimizan en gran medida cualquier inmunogenicidad potencial que pueda surgir de los conectores y los empalmes.
Otras secuencias conectoras podrán incluir cualquier secuencia de cualquier longitud de los dominios CL/CH1, pero no la totalidad de los residuos de los dominios CL/CH1; por ejemplo, los primeros 5-12 residuos de aminoácidos de los dominios CL/CH1. Los conectores de la cadena ligera pueden provenir de CK O de CX. Los conectores de la cadena pesada pueden derivar de CH1 de cualquier isotipo, incluyendo Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, Cal, Ca2, C5, Ce o Cp. Las secuencias conectoras también pueden derivar de otras proteínas, tales como proteínas similares a Ig (por ejemplo, TCR, FcR, KIR), pueden ser secuencias basadas en G/S, secuencias derivadas de la región de la bisagra o secuencias de otras proteínas naturales.
En una modalidad se asocia un dominio constante a los dos dominios variables asociados usando técnicas de DNA recombinante. En una modalidad, la secuencia que comprende dominios variables de la cadena pesada asociados en tándem de la cadena pesada se asocia a un dominio constante de la cadena pesada y la secuencia que comprende dominios variables de cadena ligera asociados en tándem se asocia a un dominio constante de cadena ligera. En una modalidad, los dominios constantes son dominio constante de la cadena pesada humana y dominio constante de cadena ligera humana, respectivamente. En una modalidad, la cadena pesada DVD se asocia además a una región Fe. La región Fe puede ser la secuencia de una región Fe nativa o de una variante de una región Fe. En otra modalidad, la región Fe es una región Fe humana. En otra modalidad la región Fe incluye una región Fe de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE, o IgD.
En una modalidad de máxima preferencia se combinan dos polipéptidos DVD de la cadena pesada y dos polipéptidos DVD de cadena ligera para formar una molécula de DVD-lg. La descripción detallada de las moléculas de DVD-lg específicas capaces de unirse a objetivos de unión específicos, y los métodos para prepararlas, se proveerá en la sección de ejemplos más adelante.
D. Producción de las proteínas de unión DVD-lg Las proteínas de unión DVD-lg de la presente invención pueden producirse con cualquiera de una cantidad de procedimientos bien conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, la expresión a partir de células huésped en las cuales se han transfectado uno o más vectores de expresión que codifican las cadenas DVD-lg pesada y ligera en una célula huésped de acuerdo con procedimientos convencionales. Las diversas formas del término "transfección" abarcan una amplia variedad de procedimientos de uso común para la introducción de DNA exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano, y semejantes. Aunque es posible expresar las proteínas DVD-lg de la invención en células huésped procariotas o eucariotas, las proteínas DVD-lg se expresan en células eucariotas, por ejemplo, en células huésped de mamíferos, ya que la probabilidad de que se ensamble y se secrete una proteína DVD-lg plegada correctamente y con actividad inmunológica es mayor en dichas células eucariotas (y en particular, en células de mamíferos) que en las células eucariotas.
Los ejemplos de células huésped de mamíferos para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen las células de ovario de hámster chino (las células CHO) (que incluyen las células dhfr- CHO, que se describen en Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980); se las usa con un marcador de selección de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)), las células de mieloma NS0, las células COS, las células SP2 y las células PER.C6. Cuando los vectores de expresión recombinantes que contienen genes que codifican el proteínas DVD-lg se introducen en células huésped de mamíferos, las proteínas DVD-lg sé producen cultivando las células huésped hasta que las proteínas DVD-lg se expresan en dichas células huésped o hasta que las proteínas DVD se secretan en el medio de cultivo en el que se cultivan las células huésped. Las proteínas DVD-lg pueden aislarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales.
En un sistema ejemplar para la expresión recombinante de proteínas DVD-lg de la invención, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica la cadena pesada de las proteínas DVD-lg y la cadena ligera de las proteínas DVD-lg en células CHO dhf a través de una transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de las cadenas pesada y ligera de DVD-lg están unidos operativamente en cada caso a elementos reguladores, que consisten en el potenciador de CMV y el promotor AdMLP, con el fin de obtener niveles de transcripción elevados de los genes. El vector de expresión recombinante también contiene un gene DHFR, que permite seleccionar las células CHO dhfr transfectadas con el vector usando una selección/amplificación con metotrexato. Las células huésped transformadas seleccionadas se cultivan de modo que se expresen las cadenas pesada y ligera de DVD-lg, y la proteina DVD-lg intacta se aisla del medio de cultivo. Se usan técnicas convencionales de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huésped, seleccionar las transformantes, cultivar dichas células huésped y obtener la proteína DVD-lg del medio de cultivo. Adicionalmente, en la invención se provee un método para sintetizar una proteína DVD-lg de la invención, que comprende cultivar una célula huésped de la invención en un medio de cultivo apropiado hasta que se ha sintetizado una proteína DVD-lg de la invención. Además, el método puede comprender aislar dicha proteína DVD-lg del medio de cultivo.
Una característica importante de la DVD-lg es que puede ser producida y purificada de una manera similar que un anticuerpo convencional. La producción de la DVD-lg resulta en un solo producto de importancia homogéneo con la actividad con especificidad dual deseada, sin modificaciones de secuencia en la región constante o modificaciones químicas de ningún tipo. Otros métodos descritos con anterioridad para generar proteínas de unión completas "biespecíficas", "multiespecíficas" y "multiespecíficas multivalentes" no resultan en un solo producto primario, sino que resultan en la producción intracelular o por secreción de una mezcla de proteínas de unión monoespecíficas, multiespecíficas o multivalentes completas, y proteínas de unión multivalentes completas con combinaciones de distintos sitios de unión. A modo de ejemplo, sobre la base del diseño descrito por Miller y Presta (Publicación PCT WO2001/077342(A1 ), hay 16 combinaciones posibles de cadenas pesadas y ligeras. Por lo tanto, solamente 6,25% de las proteínas han de presentar la forma activa deseada, y no ha de haber un solo producto de importancia o un solo producto primario, en comparación con las otras 15 combinaciones posibles. Aún no se ha demostrado la separación de las formas completamente activas deseadas de la proteína de las formas inactivas y parcialmente activas usando las técnicas de cromatografía convencionales que típicamente se emplean en la fabricación a gran escala.
Sorprendentemente, el diseño de las "proteínas de unión multivalentes completas con especificidad dual" de la presente invención resulta en una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual que se ensamblan primariamente para obtener las "proteínas de unión completas multivalentes con especificidad dual" deseadas.
Al menos 50%, al menos 75% y al menos 90% de las moléculas de DVD-lg ensambladas y expresadas son la proteína tetravalente con especificidad dual deseada. En particular, este aspecto de la invención permite mejorar la utilidad comercial de la invención. Entonces, en la presente invención se incluye un método para expresar una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual en una sola célula, lo que resulta en un producto primario de una "proteína de unión tetravalente completa con especificidad dual".
En la presente invención se provee un método para expresar una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual en una sola célula, lo que resulta en un "producto primario" de una "proteína de unión tetravalente completa con especificidad dual", donde el "producto primario" constituye más de 50% de la totalidad de la proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual.
En la presente invención se provee un método para expresar una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual en una sola célula, lo que resulta en un único "producto primario" de una "proteína de unión tetravalente completa con especificidad dual", donde el "producto primario" constituye más de 75% de la totalidad de la proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual.
En la presente invención se provee un método para expresar una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual en una sola célula, lo que resulta en un único "producto primario" de una "proteína de unión tetravalente completa con especificidad dual", donde el "producto primario" constituye más de 90% de la totalidad de la proteína ensamblada, que comprende una cadena ligera con dominio variable dual y una cadena pesada con dominio variable dual. 6. Producción de las proteínas de unión a la I L- 1 ß y de líneas celulares capaces de producir las proteínas de unión Preferiblemente, las proteínas de unión a la I L- 1 ß de la presente invención, incluyendo los anticuerpos a ntt-l L- 1 ß , presentan una capacidad notable de reducir o neutralizar la actividad de la I L- 1 ß , lo cual puede determinarse, por ejemplo, con cualquiera de los diversos ensayos in vitro e in vivo que se conocen en la técnica. Preferiblemente, las proteínas de unión a la I L- 1 ß de la presente invención también presentan una capacidad notable de reducir o neutralizar la actividad de la IL-?ß.
En modalidades preferidas, una proteína de unión, o porción de unión al antígeno de éste, se une a la IL-?ß humana, donde la proteína de unión, o una porción de unión al antígeno de éste, se disocia de la ??_-1ß humana con una constante de desactivación koff de aproximadamente 0,1s'1 o menos, según se determina por resonancia de plasmón superficial, o inhibe la actividad de la I L- 1 ß humana y/o la I L- 1 ß humana con una IC50 de aproximadamente 1x10"6 M o menos. Como alternativa, la proteína de unión, o una porción de unión al antígeno de éste, puede disociarse de la ??_-1ß humana con una constante de desactivación koff de aproximadamente 1x10'2s o menos, según se determina por resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de la I L- 1 ß humana y/o de la I L- ß humana con una IC50 de aproximadamente 1x10"7 M o menos. Como alternativa, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno de éste, puede disociarse de la I L- 1 ß humana con una constante de desactivación k0ff de aproximadamente 1x10'3s"1 o menos, según se determina por resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de la I L- 1 ß humana con una IC50 de aproximadamente 1x10"8 M o menos. Como alternativa, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno de éste, puede disociarse de la I L- 1 ß humana con una constante de desactivación koff de aproximadamente 1x10'V o menos, según se determina por resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de la ??_-1ß humana con una IC50 de aproximadamente 1x10"9 M o menos. Como alternativa, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno de éste, puede disociarse de la I L- 1 ß humana con una constante de desactivac ión k0ff de aproximadamente 1x10'5s"1 o menos, según se determina por resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de la I L - 1 ß humana con una IC50 de aproximadamente 1x10"10 M o menos. Como alternativa, el anticuerpo, o una porción de unión al antígeno de éste, puede disociarse de la l L- 1 ß humana con una constante de desactivación koff de aproximadamente 1x10"5s"1 o menos, según se determina por resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de la I L - 1 ß humana con una IC50 de aproximadamente 1 x 10" 1 M o menos.
En determinadas modalidades, la proteína de unión comprende una región constante de la cadena pesada, tal como una región constante de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD.
Preferiblemente, la región constante de la cadena pesada es una región constante de la cadena pesada de I g G 1 o una región constante de cadena pesada de lgG4.. ás aún, el anticuerpo puede comprender una región constante de la cadena ligera, una región constante de la cadena ligera kappa o una región constante de la cadena ligera lambda. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una región constante de la cadena ligera kappa. Como alternativa, la porción de anticuerpo puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento Fv de cadena simple.
Los reemplazos de residuos de aminoácidos en la porción Fe para alterar la función efectora del anticuerpo son conocidos en la técnica (Winter, et al. Solicitudes de Patente de los Estados Unidos N° 5648260 y 5624821). La porción Fe de un anticuerpo es mediadora de diferentes funciones efectoras importantes, por ejemplo, la inducción de citocinas, la ADCC, la fagocitosis, la citotoxicidad mediada por complemento (CDC), y la velocidad de eliminación/vida media de los anticuerpos y los complejos antígeno-anticuerpo. En algunos casos, estas funciones efectoras son deseables para anticuerpos terapéuticos, pero en otros casos, puede ser innecesario o incluso perjudicial, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Determinados isotipos de la IgG humana, en particular I g G 1 y lgG3, son mediadores de la ADCC y la CDC a través de la unión a FcyRs y al complemento C1q, respectivamente. Los receptores Fe neonatales (FcRn) son componentes críticos en la determinación de la vida media en circulación de los anticuerpos. En aún otra modalidad, al menos un residuo de aminoácido es reemplazado en la región constante del anticuerpo, por ejemplo, la región Fe del anticuerpo, de manera que estas funciones efectoras del anticuerpo resultan alteradas.
En una modalidad, se provee una proteína de unión marcada donde el anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención ha sido derivado o unido a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de unión marcada de la invención puede obtenerse por derivación mediante la unión funcional de un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una u otra más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo, un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o un péptido que puede ser mediador de la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una marca de polihistidina).
Entre los agentes detectables útiles con los cuales puede derivarse una proteína de unión, tal como un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención, se incluyen los compuestos fluorescentes. Entre los ejemplos de agentes fluorescentes detectables se incluyen la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, el cloruro de 5-dimetilamina-1 -napfalensulfonilo, la ficoeritrina, y semejantes. Un anticuerpo también puede derivarse con enzimas detectables, tales como la fosfatasa alcalina, la peroxidasa de rábano picante, la glucosa oxidasa, y semejantes. Cuando el anticuerpo se deriva con una enzima detectable, se lo detecta agregando reactivos adicionales que son usados por la enzima para generar un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando se encuentra presente la peroxidasa de rábano picante como agente detectable, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina genera un producto de reacción con color, el cual es detectable. Un anticuerpo también puede derivarse con biotina y detectarse a través de una medida indirecta de la unión de avidina o estreptavidina.
En otra modalidad de la invención, se provee una proteína de unión cristalizada. Preferiblemente, la invención se relaciona con cristales de anticuerpos completos anti-l L-1 ß, y fragmentos de éstos, según se describe en la presente, y con formulaciones y composiciones que comprenden dichos cristales. En una modalidad, las proteínas de unión cristalizadas tienen una vida media in vivo más larga que la contraparte soluble de la proteína de unión. En otra modalidad, la proteína de unión conserva su actividad biológica después de la cristalización.
La proteína de unión cristalizada de la invención puede producirse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, y tal como se describe en la Publicación PCT N° WO 02072636, que se incorpora en la presente a modo de referencia.
En una modalidad de la invención, se provee una proteína de unión glicosilada, donde el anticuerpo o la porción de unión al antígeno de éste comprenden uno o más residuos de hidrato de carbono. La producción nativa de proteínas in vivo puede incluir un procesamiento adicional, conocido como modificación postraduccional. En particular, pueden agregarse residuos de azúcares (glicosilo) en forma enzimática, un proceso conocido como glicosilación. Las proteínas resultantes, que contienen cadenas laterales de oligosacáridos unidas en forma covalente, son conocidas como proteínas glicosiladas o glicoproteínas.
Los anticuerpos de ocurrencia natural son glicoproteínas con uno o más residuos de hidrato de carbono en el dominio Fe, así como en el dominio variable. Los residuos de hidrato de carbono en el dominio Fe tienen un efecto importante en la función efectora del dominio Fe, con un efecto menor en la unión al antígeno o la vida media del anticuerpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21: Prog., 21: 11-16 (2005)). Por el contrario, la glicosilación del dominio variable puede tener efecto sobre la actividad de unión al antígeno del anticuerpo. La glicosilación del dominio variable puede tener un efecto negativo sobre la afinidad de unión del anticuerpo, probablemente debido a los impedimentos estéricos (Co et al., Mol. Immunol., 30: 1361- 1367 (1993)) o como resultado de una afinidad incrementada por el antígeno (Wallick et al., J. Exp. Meó., 168:1099-1109 (1988); Wright et al., EMBO J. , 10: 2717-2723 (1991)).
Un aspecto de la presente invención se relaciona con la generación de mutantes de sitios de glicosilación en las cuales se ha mutado el sitio de glicosilación unido a O o N de la proteína de unión. Aquél versado en la técnica puede generar dichos mutantes con el uso de tecnologías convencionales bien conocidas. Los mutantes de sitios de glicosilación que retienen la actividad biológica, pero presentan una actividad de unión incrementada o disminuida, son otro objeto de la presente invención.
En aún otra modalidad, se modifica la glicosilación del anticuerpo o porción de unión al antígeno de la invención. Por ejemplo, es posible generar un anticuerpo no glicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación puede alterarse, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones del hidrato de carbono pueden obtenerse, por ejemplo, mediante la alteración de uno o más sitios de glicosilación en la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, pueden realizarse una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación en la región variable, para eliminar de este modo la glicosilación en ese sitio. Dicha aglicosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Este abordaje se describe con mayor detalle en la Publicación PCT N° WO 2003/016466 y en las Patentes estadounidenses N° 5714350 y 6350861.
Adícionalmente o como alternativa, podrá prepararse una proteína de unión modificada de la invención que presente un tipo de glicosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado que presente cantidades reducidas de residuos de fucosilo (véase Kanda et al., J. Biotechnol., 130(3): 300-310 (2007)) o un anticuerpo que presente estructuras de GIcNAc cruzadas. Se ha demostrado que dichos patrones de glicosilación alterados incrementan la capacidad de los anticuerpos de producir ADCC. Dichas modificaciones de los hidratos de carbono pueden efectuarse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con la maquinaria de glicosilación alterada. En la técnica se han descrito células con la maquinaria de glicosilacion alterada, que pueden ser usadas como células huésped para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención, y de este modo, producir un anticuerpo con glicosilacion alterada. Véanse, por ejemplo, Shields et al., J. Biol. Chem., 277: 26733-26740 (2002); Umana et al., "Engineered glycoforms of an antineuroblastoma IgG 1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxic activity", Nat. Biotechnol., 17: 176-180 (1999), así como la Publicación Europea N° EP 1 176 195 y las Publicaciones PCT N° WO 03/035835 y WO 99/54342.
La glicosilacion de las proteínas depende de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés, así como de la célula huésped en la cual se expresa la proteína. Distintos organismos pueden producir enzimas de glicosilacion diferentes (por ejemplo, glicosíltransferasas y glicosidasas), y pueden tener diferentes sustratos (azúcares nucleotídicos) disponibles. Debido a dichos factores, el patrón de glicosilacion, y la composición de residuos glicosídicos, pueden diferir dependiendo del sistema huésped en el cual se expresa la proteína en particular. Entre los residuos glicosídicos útiles en la invención pueden incluirse, sin limitaciones, glucosa, galactosa, mañosa, fucosa, n-acetilglucosamina y ácido siálico. Preferiblemente, la proteína de unión glicosilada comprende residuos glicosídicos que permiten obtener un patrón de glicosilacion humano.
Aquellos versados en la técnica saben que el cambio en las glicosilaciones de proteínas puede dar como resultado diferentes características en la proteína. Por ejemplo, la eficacia de una proteína terapéutica producida por un microorganismo huésped, tal como una levadura, y glicosilada usando la vía endógena de la levadura, puede ser reducida en comparación con la de la misma proteína expresada en una célula de mamífero, tal como una línea celular CHO. Dichas glicoproteínas también pueden ser inmunogénicas en seres humanos y presentar una vida media reducida in vivo después de la administración. Receptores específicos en humanos y otros animales pueden reconocer residuos glicosídicos específicos y promover la rápida eliminación de la proteína del torrente sanguíneo. Entre otros efectos adversos pueden incluirse cambios en el plegamiento de las proteínas, su solubilidad, su susceptibilidad a proteasas, su circulación, su transporte, su compartimentalización, su secreción, el reconocimiento por otras proteínas o factores, su antigenicidad, o su alergenicidad. En consecuencia, un profesional puede preferir una proteína terapéutica con una composición y un patrón de glicosilación específicos, por ejemplo, una composición de glicosilación y un patrón idénticos, o al menos similares, a los producidos en las células humanas o las células con especificidad de especie del animal sujeto previsto.
La expresión de proteínas glicosiladas diferentes de las de una célula huésped puede llevarse a cabo mediante la modificación genética de la célula huésped para expresar enzimas de glicosilación heterólogas. Usando procedimientos conocidos en la técnica, un profesional puede generar anticuerpos o porciones de unión al antígenos de éstos que presenten la glicosilación de las proteínas humanas. Por ejemplo, se han modificado cepas de levadura para expresar enzimas de glicosilación de origen no natural, tales como las proteínas glicosiladas (glicoproteínas) producidas en estas cepas de levaduras que presentan una glicosilación proteica idéntica a aquella de las células animales, especialmente las células humanas (Solicitudes de Patentes estadounidenses N° 2004/0018590 y 2002/0137134).
Además de las proteínas de unión, la presente invención también está relacionada con anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) específicos para las proteínas de unión de la invención. Un anticuerpo anti-ld es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados a la región de unión al antígeno de otro anticuerpo. El anti-ld puede prepararse mediante la inmunización de un animal con la proteína de unión o con una región que contenga su CDR. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante, y producirá un anticuerpo anti-ld. Ha de ser evidente que puede ser más fácil generar anticuerpos anti-idiotípicos contra dos o más anticuerpos progenitores diferentes incorporados en una molécula de DVD-lg y confirmarlos mediante estudios de unión, de acuerdo con métodos reconocidos en la técnica (por ejemplo, BIAcore, ELISA), para verificar que los anticuerpos anti-idiotípicos específicos para el idiotipo de cada anticuerpo progenitor también reconozcan el idiotipo (por ejemplo, el sitio de unión al antígeno) en el contexto de la DVD-lg. Los anticuerpos anti-idiotípicos específicos para cada uno de los dos o más sitios de unión al antígeno de una DVD-lg constituyen reactivos ideales para medir las concentraciones de las DVD-lg humanas en el suero de un paciente. Por ejemplo, las evaluaciones de la concentración de las DVD-lg pueden realizarse con un "formato de ELISA en sándwich", con un anticuerpo contra una primera región de unión al antígeno aplicado como recubrimiento sobre una fase sólida (por ejemplo, un chip BIAcore, una placa de ELISA, etcétera), la cual se lava con un amortiguador de lavado, se incuba con una muestra de suero, se lava nuevamente y finalmente se incuba con otro anticuerpo anti-idiotípico contra el otro sitio de unión al antígeno (este último está marcado con una enzima que permite cuantificar la reacción de unión). En una modalidad, para una DVD-lg con más de dos sitios de unión diferentes, los anticuerpos anti-idiotípicos contra los dos sitios de unión externos (más distales y proximales respecto de la región constante) no solamente ayudarán a determinar la concentración de DVD-lg en suero humano, sino que también permitirán documentar la integridad de la molécula in vivo. Cada anticuerpo anti-ld también puede ser usado como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en aún otro animal, con lo que se produce lo que se conoce como anticuerpo anti-anti-ld.
Además, aquél versado en la técnica ha de apreciar que es posible expresar una proteína de interés usando una biblioteca de células huésped diseñadas genéticamente para expresar distintas enzimas de glicosilación, de modo que los miembros de dicha biblioteca de células huésped produzcan la proteína de interés con patrones de glicosilación variantes. Por lo tanto, un profesional puede seleccionar y aislar una proteína de interés con nuevos patrones de glicosilación particulares. Preferiblemente, la proteína que tiene un nuevo patrón de glicosilación particularmente seleccionado presenta propiedades biológicas mejoradas o alteradas. 7. Usos de las proteínas de unión a la I L- 1 ß Dada su capacidad para unirse a la l L- 1 ß humana, las proteínas de unión a la I L- 1 ß de la invención, o las porciones de unión al antígeno de éstas, pueden usarse para detectar I L- 1 ß (por ejemplo, en una muestra biológica, tal como suero o plasma), usando un inmunoensayo convencional, tal como un ensayo de inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica de tejidos. En la invención se provee un método para detectar la ??_-1ß en una muestra biológica, que comprende poner en contacto la muestra biológica con una proteína de unión de la invención, o con una porción de unión al antígeno de ésta, y detectar la proteína de unión (o la porción de unión al antígeno) unida a la I L- 1 ß , o bien la proteína de unión (o la porción de unión) no unida, con lo que puede detectarse la I L- 1 ß en la muestra biológica. La proteína de unión se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Entre las sustancias detectables apropiadas se incluyen distintas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radioactivos. Entre los ejemplos apropiados de enzimas, se incluye la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la ß-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; entre los ejemplos de grupos prostéticos complejos apropiados, se incluye la estreptavidina/biotina y la avidina/biotina; entre los ejemplos de materiales fluorescentes apropiados, se incluye la umbeliferona, la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la diclorotriazinilamino fluoresceína, el cloruro de dansilo o la ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y entre los ejemplos de materiales radioactivos apropiados, se incluyen 3Hi 4C, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho o 153Sm.
Como una alternativa de marcar la proteína, la IL-?ß humana puede ser evaluada en fluidos biológicos con un inmunoensayo de competencia usando referencias de rhlL-?ß marcadas con una sustancia detectable y una proteína I L- 1 ß humana no marcada. En este ensayo, se combina la muestra biológica, las referencias de rhlL-1 ß marcadas y la proteína de unión a la IL-?ß humana y se determina la cantidad de la referencia de rhlL-?ß marcada unida al anticuerpo no marcado. La cantidad de ??_-1ß humana en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de rh I L-1 ß marcada de referencia que está unida a la proteína de unión a la IL-?ß. De manera similar, la ??_-1ß humana también puede ser evaluada en fluidos biológicos con un inmunoensayo de competencia usando referencias de rh I L- 1 ß marcadas con una sustancia detectable y una proteína de unión a la I L- 1 ß humana no marcada.
Las proteínas de unión a la IL-?ß de la invención y las porciones de éstas pueden neutralizar la actividad de la IL-?ß humana tanto in vitro como in vivo. Por ende, las proteínas de unión a la I L- 1 ß de la invención y las porciones de éstas podrán usarse para inhibir la actividad de la I L- 1 ß humana, por ejemplo, en un cultivo celular que contenga f L- 1 ß humana, en sujetos humanos o en otros sujetos mamíferos en los que haya una I L- 1 ß con la cual pueda reaccionar un anticuerpo de la invención. En una modalidad, en la invención se provee un método para inhibir la actividad de la I L- 1 ß humana, que comprende poner en contacto la I L- 1 ß humana con una proteína de unión a la I L- ß de la invención, o con una porción de ésta, de manera tal de inhibir la actividad de la I L- 1 ß humana. Por ejemplo, en el contexto de un cultivo celular que contenga I L- 1 ß humana, o del que se sospeche que contiene I L- 1 ß humana, será posible agregar una proteína de unión a la IL-?ß de la invención al medio de cultivo, o una porción de ésta, para inhibir la actividad de la l L- 1 ß humana.
En otra modalidad, en la invención se provee un método para reducir la actividad de la IL-?ß humana en un sujeto, ventajosamente en un sujeto que sufre una enfermedad o un trastorno en el cual la actividad de la I L- 1 ß es perjudicial. En la invención se proveen métodos para reducir la actividad de la I L- 1 ß en un sujeto que sufre una enfermedad o un trastorno como los mencionados, donde los métodos comprenden administrarle al sujeto un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención, de manera tal de reducir la actividad de la I L- 1 ß en el sujeto. Preferiblemente, la I L- 1 ß es la I L- 1 ß humana y el sujeto es un sujeto humano. Como alternativa, el sujeto podrá ser un mamífero donde se exprese una ) L- 1 ß con la cual pueda unirse el anticuerpo de la invención. Adicionalmente, el sujeto podrá ser un mamífero en el que se haya introducido la IL-?ß (por ejemplo, mediante la administración de la f L- 1 ß o por medio de la sobreexpresion de un transgene de I L- 1 ) . La proteína de unión a la I L- ß de la invención puede ser administrada a un sujeto humano con fines terapéuticos. Más aún, la proteína de unión de la invención puede ser administrada a un mamífero no humano que expresa una l L- 1 ß con la cual el anticuerpo tiene capacidad de unirse con fines veterinarios o como un modelo de animales de la enfermedad humana. Con relación a esto último, dichos modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, evaluando las dosificaciones y la progresión de la administración en el tiempo).
Como se lo usa en la presente, el término "un trastorno donde la actividad del antígeno es perjudicial" incluye enfermedades y otros trastornos donde se ha demostrado que la presencia del antígeno en un sujeto que sufre el trastorno es responsable de la patofisiología del trastorno o es un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Por ende, un trastorno donde la actividad del antígeno es perjudicial es uno donde se espera que la reducción de la actividad del antígeno alivie los síntomas y/o el progreso del trastorno. Dichos trastornos pueden evidenciarse, por ejemplo, por un aumento en la concentración de I L-1 ß en un fluido biológico de un sujeto que sufre del trastorno (por ejemplo, un aumento en la concentración de l L- 1 ß en suero, plasma, fluido sinovial, etc. del sujeto) que puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo anti- I L- 1 ß como se ha descrito. Entre los ejemplos no limitativos de trastornos que pueden tratarse con los anticuerpos de la invención, se incluyen aquellos trastornos indicados en la sección anterior, relacionada con composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la invención.
Las DVD-lg de la invención pueden unirse a la I L- 1 ß sola o a múltiples antígenos (por ejemplo, la IL-?ß humana y otro antígeno distinto de la I L- 1 ß ) . Por consiguiente, una DVD-lg puede bloquear o reducir la actividad de la h I L- 1 ß y la actividad de otro antígeno objetivo. Estos antígenos objetivo pueden incluir objetivos solubles (por ejemplo, la I L-1 a) y objetivos que son receptores en la superficie de las células (por ejemplo, el VEGFR o el EGFR).
Estos otros antígenos incluyen, sin limitaciones, los objetivos que se detallan en las bases de datos de acceso público, incluyendo los objetivos que están disponibles en Internet, que se incorporan en la presente a modo de referencia. A continuación se mencionan estas bases de datos de objetivos.
• Objetivos terapéuticos (http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp).
· Citocinas y receptores de citocina (http://www.cytokinewebfacts.com/, http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi y http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kum amoto-u.ac.jp/CFC/i ndexR.html).
· Quimioquinas (http://cytokine. medie, kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html).
• Receptores de quimioquinas y GPCR (http://csp. medie. kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/).
• Receptores olfativos (http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp).
• Receptores (http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm).
• Objetivos relacionados con el cáncer (http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi).
• Proteínas secretadas, tales como objetivos potenciales de anticuerpos (http://spd.cbi.pku.edu.cn/).
• Proteina cinasas (http://spd.cbi.pku.edu.cn/).
• Marcadores CD humanos (http://content.labvelocity.eom/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf y Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules", Blood, 106: 3123-3126 (2005)).
Las DVD-lg son útiles como agentes terapéuticos para bloquear dos o más objetivos diferentes, es decir, la l L- 1 ß humana y uno o más antígenos objetivo distintos de la IL-?ß, con el fin de mejorar su eficacia/seguridad y/o para incrementar la protección del paciente. Tales objetivos pueden incluir objetivos solubles (TNF) y objetivos de receptor de la superficie celular (VEGFR y EGFR).
Adicionalmente, las DVD-lg de la invención pueden emplearse para la administración con especificidad tisular (direccionamiento hacia un marcador tisular y un mediador de enfermedades para obtener una PK local mejorada, lo que resulta en una mayor eficacia y/o una menor toxicidad), incluyendo una administración ¡ntracelular (direccionamiento hacia un receptor de internalización y una molécula ¡ntracelular), una administración en el interior del cerebro (direccionamiento hacia un receptor de transferrina y un mediador de enfermedades del CNS, para atravesar la barrera hematoencefálica). La DVD-lg también puede servir como proteína de transporte para administrar un antígeno en una localización específica, por medio de la unión a un epitope no neutralizador de dicho antígeno, y también para incrementar la vida media del antígeno. Además, las DVD-lg pueden diseñarse de manera que estén unidas físicamente a los dispositivos médicos que se implanten en los pacientes o para que se dirijan a estos dispositivos médicos (véanse Burke et al., "Zotarolimus eluting stents", Adv. Drug Deliv. Rev., 58(3): 437-446 (2006); Hildebrand et al., "Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices", Surface and Coatings Technology, 200(22-23): 6318-6324 (2006); Wu et al., "Drug/device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis", Biomaterials, 27: 2450-2467 (2006); Marques et al., "Mediation of the Cytokine Network ¡n the Implantation of Orthopedic Devices", capítulo de Biodegradable Systems in Tissue Engineering and Regenerative Medicine (Reis et al., editores) (CRC Press LLC, Boca Ratón, 2005) pp. 377-397). En resumen, el direccionamiento de tipos apropiados de células al sitio del implante médico puede promover la cicatrización y la restauración de la función normal del tejido. Como alternativa, también se provee la inhibición de los mediadores (incluyendo, sin limitaciones, citocinas) liberados al implantarse el dispositivo por una DVD-lg unida o dirigida a un dispositivo. Por ejemplo, durante años se han usado stents en la cardiología de intervención para liberar las arterias bloqueadas y mejorar el flujo de sangre hacia el músculo cardiaco. Sin embargo, se ha comprobado que los stents tradicionales, de metal desnudo, provocan restenosis (nuevo angostamiento de la arteria en un área tratada) en algunos pacientes y puede resultar en coágulos de sangre. Recientemente, se ha descrito un stent recubierto con un anticuerpo anti-CD34 que permite reducir la restenosis y previene la aparición de coágulos de sangre en las células progenitoras endoteliales (EPC) que circulan en sangre. Las células endoteliales son las células que recubren los vasos sanguíneos y permiten que la sangre tenga un flujo suave. Las EPC se adhieren a la superficie dura del stent para formar una capa suave, la cual no solamente promueve la cicatrización, sino que también previene la restenosis y los coágulos de sangre, complicaciones asociadas previamente con el uso de stents (Aoji et al. 1574-1579 (2005)). Además de mejorar los resultados en los pacientes para los que se requiere el uso de stents, también hay implicaciones para los pacientes para los que se requiere cirugía de derivación cardiovascular. Por ejemplo, un conducto vascular prostético (arteria artificial) recubierto con anticuerpos anti-EPC permitiría eliminar la necesidad de usar arterias de las piernas o los brazos de los pacientes para los injertos en la cirugía de derivación. Esto reduciría la duración de la cirugía y la anestesia, lo que a su vez, reduciría las muertes relacionadas con la cirugía coronaria. Las DVD-lg están producidas por ingeniería genética de manera tal que se unan a un marcador en la superficie de las células (tal como CD34), y también a una proteína (o un epitope de cualquier tipo, incluyendo, sin limitaciones, proteínas, lípidos y polisacáridos) que haya sido aplicada como recubrimiento sobre el dispositivo implantado para facilitar el reclutamiento de células. Estos abordajes también pueden aplicarse a los implantes médicos en general. Como alternativa, las DVD-lg pueden aplicarse como recubrimientos en dispositivos médicos, y al realizarse la implantación y la liberación de todas las DVD-lg del dispositivo (o cualquier otra aplicación para la que fuera necesaria una DVD-lg fresca adicional, incluyendo el envejecimiento y la desnaturalización de las DVD-lg ya cargadas), el dispositivo podría ser recargado mediante la administración sistémica de una DVD-lg fresca al paciente, donde la DVD-lg estaría diseñada de manera que se uniera a un objetivo de interés (una citocina, un marcador de la superficie de la célula (tal como CD34), etcétera), con un conjunto de sitios de unión y un objetivo aplicados como recubrimiento en el dispositivo (incluyendo una proteína, un epitope de cualquier tipo, incluyendo, sin limitaciones, lípidos, polisacáridos y polímeros). Esta tecnología tiene la ventaja de extender la utilidad de los implantes recubiertos.
A. Uso de las DVD-lg en diversas enfermedades Las moléculas de DVD-lg de la invención también son útiles como moléculas terapéuticas para tratar diversas enfermedades. Estas moléculas de DVD-lg pueden unirse a uno o más objetivos que participen en una enfermedad específica. A continuación se describirán ejemplos de estos objetivos en diversas enfermedades.
Respuesta autoinmune e inflamatoria humana En un aspecto, una proteína de unión DVD-lg de la invención es capaz de unirse a la l L- 1 ß humana y uno o más antígenos que han sido relacionados con las respuestas autoinmunes e inflamatorias generales, incluyendo C5, CCL1 (I-309), CCL11 (eotaxina), CCL13 (mcp-4), CCL15 (MIP-1d), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19, CCL2 (mcp-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26, CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (mcp-3), CCL8 (mcp-2), CXCL1 , CXCL10 (IP-10), CXCL11 (l-TAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL2, CXCL3, CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9, IL13, IL8, CCL13 (mcp-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CR1, IL8RA, XCR1 (CCXCR1), IFNA2, IL10, IL13, IL17C, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, IL1F9, IL22, IL5, IL8, IL9, LTA, LTB, MIF, SCYE1 (citocina activadora de los monocitos endoteliales), SPP1, TNF, TNFSF5, IFNA2, IL10RA, IL10RB, IL13, IL13RA1, IL5RA, IL9, IL9R, ABCF1, BCL6, C3, C4A, CEBPB, CRP, ICEBERG, IL1R1, IL1RN, IL8RB, LTB4R, TOLLIP, FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6, ACVR1 , ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD28, CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, OPRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1 , XCL2, XCR1, ???, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orf10 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451 J0118, FGF2, GFI1, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL9, IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, ITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, PPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI , TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11 A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFP 2 y RNF110 (ZNF144).
Asma El asma alérgico se caracteriza por la presencia de eosinofilia, metaplasia de las células caliciformes, alteraciones en las células epiteliales, hiperreactividad de las vías aéreas (AHR), y expresión de las citocinas Th2 y Th1, así como niveles elevados de IgE en suero. En la actualidad, existe el consenso de que la inflamación de las vías aéreas es el factor clave subyacente de la patogénesis del asma, y comprende una interacción compleja entre las células inflamatorias, tales como células T, célula B, eosinófilos, mastocios y macrófagos, y los mediadores que secretan, incluyendo citocinas y quimioquinas. Los corticosteroides constituyen el tratamiento antiinflamatorio más importante para el asma en la actualidad, pero su mecanismo de acción no es específico e implica riesgos de seguridad, especialmente en la población de pacientes juveniles. Por lo tanto, se necesita el desarrollo de terapias más específicas y dirigidas.
Los modelos animales, tales como el modelo de asma inducido por OVA en ratones, donde puede evaluarse la inflamación y la AHR, son conocidos en la técnica y pueden usarse para determinar la capacidad de diversas moléculas de DVD-lg de tratar el asma. Se describen modelos en animales para estudiar el asma en Coffman et al., J. Exp. Med., 201(12): 1875-1879 (2005); Lloyd et al., Adv. Immunol., 77: 263-295 (2001); Boyce et al., J. Exp. Med., 201(12): 1869-1873 (2005); y Snibson et al., Clin. Exp. Allergy, 35(2): 146-152 (2005). Además de las evaluaciones de seguridad de rutina con estos pares de objetivos, podrán diseñarse pruebas específicas para determinar el grado de inmunosupresion que sean útiles para seleccionar los mejores pares de objetivos (véanse Luster et al., Toxicology, 92(1-3): 229-243 (1994); Descotes, J., Develop. Biol. Standard., 77: 99-102 (1992); Hart et al., J. Allergy Clin. Immunol., 108(2): 250-257 (2001)).
Un aspecto de la invención se relaciona con moléculas de DVD-lg que pueden unirse a la I L- 1 ß y a uno o más objetivos adicionales, por ejemplo, dos objetivos, seleccionados del grupo que consiste en la IL-4, la IL-5, la IL-8, la IL-9, la IL-13, la IL-18, la IL-5R(a), el TNFSF4, la IL-4R(a), el ¡nterferón a, la eotaxina, la TSLP, PAR-2, PGD2 y la IgE. En una modalidad, se incluye una DVD-lg con especificidad dual anti-IL-1 ß/ I L- 1 a como agente terapéutico beneficioso para el tratamiento de la MS.
Artritis reumática (RA) La artritis reumática (RA), una enfermedad sistémica, se caracteriza por una reacción inflamatoria crónica en el sinovio de las articulaciones, y está asociada a la degeneración del cartílago y la erosión del hueso yuxtaarticular. Muchas citocinas proinflamatorias, incluyendo el TNF, las quimioquinas y los factores de crecimiento, se expresan en las articulaciones enfermas. Se ha demostrado que la administración sistémica de un anticuerpo anti-TNF o una proteína de fusión sTNFR en modelos de RA en ratones tiene efectos antiinflamatorios y de protección de las articulaciones. Se ha postulado que diversas citocinas, incluyendo la I L- 1 ß , participan en la RA. En investigaciones clínicas donde se bloqueó la actividad del TNF en pacientes con RA por medio de la aplicación intravenosa de infliximab (Harriman et al., "Summary of clinical triáis in rheumatoid arthritis using infliximab, an anti-TNFalpha treatment", Ann. Rheum. Dis., 58 (Supl. 1): 1:161-164 (1999)), se obtuvieron evidencias de que TNF regula la producción de IL-6, IL-8, MCP-1 y VEGF, el reclutamiento de células inmunes e inflamatorias hacia las articulaciones, la angiogénesis, y la reducción de las metaloproteinasas de matriz 1 y 3 en los vasos sanguíneos. Una mejor comprensión de la vía inflamatoria en la artritis reumática ha permitido identificar otros objetivos terapéuticos en la artritis reumática. Durante los últimos años, se han evaluado tratamientos prometedores como los antagonistas de la interleuquina-6 (el anticuerpo contra el receptor de IL-6 MRA, desarrollado por Chugai, Roche (véase Nishimoto et al., Arthritis Rheum., 50(6): 1761-1769 (2004)), CTLA4lg (abatacept, Genovese et al., "Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition", N. Engl. J. Med., 353: 1114-1123 (2005)) y la terapia contra las células B (rituximab, Okamoto et al., "Rituximab for rheumatoid arthritis", N. Engl. J. Med., 351: 1909 (2004)) en pruebas controladas al azar. Se ha identificado la I L- 1 ß y otras citocinas, tales como la IL-15 y la IL-18, como participantes en la RA en modelos en animales (el anticuerpo terapéutico HuMax-IL_15, AMG 714, véase Baslund et al., Arthritis Rheum., 52(9): 2686-2692 (2005)). La terapia con anticuerpos con especificidad dual, donde se combina anti-TNF y otro mediador, tal como I L- 1 ß , tiene un gran potencial para mejorar la eficacia clínica y/o la cobertura del paciente. Por ejemplo, el bloqueo de TNF y VEGF potencialmente puede erradicar la inflamación y la angiogénesis, procesos relacionados con la patofisiología de la RA. Se contempla una proteína de unión DVD-lg capaz de bloquear la IL-1a y la I L- 1 ß . Además de las evaluaciones de seguridad de rutina con estos pares de objetivos, podrán diseñarse pruebas específicas para determinar el grado de inmunosupresion que sean útiles para seleccionar los mejores pares de objetivos (véanse Luster et al., Toxicology, 92(1-3): 229-243 (1994); Descotes et al., Develop. Biol. Standard., 77: 99-102 (1992); Hart et al., J. Allergy Clin. Immunol., 108(2): 250-257 (2001)). Puede establecerse si una molécula de DVD-lg será útil para el tratamiento de la artritis reumática usando modelos animales de RA pre-clínica, tales como el modelo de artritis inducida por colágeno en ratón. Otros modelos útiles también son bien conocidos en la técnica (véase Brand DD., Comp.
Med.t 55:114-122 (2005)). Sobre la base de la reactividad cruzada de los anticuerpos progenitores por los ortólogos humanos y de ratón (por ejemplo, la reactividad por el TNF humano y de ratón, por la IL-15 humana y de ratón, etcétera), pueden realizarse estudios de convalidación con el modelo de CIA en ratón usando moléculas de DVD-Ig derivadas de "anticuerpos de reemplazo coincidentes". En resumen, una DVD-lg basada en dos (o más) anticuerpos específicos para objetivos de ratón puede modificarse en la medida de lo posible para que presente características similares a las de los anticuerpos progenitores humanos o humanizados que se usaron para construir la DVD-lg humana (es decir, para que presente una afinidad, una potencia de neutralización o una vida media similar, etcétera).
En una modalidad, una DVD-lg de la invención que se une a la IL-1ß humana y a otro objetivo distinto de la 1 L- 1 ß también podrá usarse para tratar otras enfermedades en las que participe la IL-?ß. Estas enfermedades incluyen, sin limitaciones, el SLE; la esclerosis múltiple (MS), la sepsis, diversas enfermedades neurológicas y el cáncer (incluyendo el cáncer cervical, de mama o gástrico). Mas adelante se provee una lista más exhaustiva de las enfermedades y los trastornos donde participa la ??_-1ß.
Una modalidad de la invención se relaciona con moléculas de DVD-lg capaces de unir a hlL-?ß humana y uno o más objetivos seleccionados del grupo que consiste en TNFa, IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF , CD45RB, CD200, IFNgamma, GM-CSF, FGF, C5, CD52, esclerostina y CCR2.
Lupus eritematoso sistémico (SLE) La característica distintiva inmunopatogénica del SLE es la activación de las células B policlonales, lo que resulta en hiperglobulinemia, producción de autoanticuerpos y formación de complejos inmunes. La anormalidad fundamental parece ser la incapacidad de las células T de suprimir los clones prohibidos de células B debido a la desregulación generalizada de las células T. Además, la interacción entre las células B y T se ve facilitada por varias citocinas, tales como IL-10, y también por moléculas co-estimulatorias, tales como CD40 y CD40L, B7 y CD28 y CTLA-4, que inician la segunda señal. Estas interacciones, junto con la eliminación por fagocitosis reducida de los complejos inmunes y el material apoptótico, perpetúan la respuesta inmune, lo que resulta en lesiones en los tejidos.
En un aspecto, una proteína de unión DVD-lg de la invención puede unirse a la l L- 1 ß humana y a uno o más de los siguientes antígenos relacionados con el SLE: terapias dirigidas a las células B: CD-20, CD-22, CD-19, CD28, CD4, CD80, HLA-DRA, IL10, IL2, IL4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFSF5, TNFSF6, BLR1, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, ICOSL, IGBP1, MS4A1, RGS1, SLA2, CD81, IFNB1, IL10, TNFRSF5, TNFRSF7, TNFSF5, AICDA, BLNK, GALNAC4S-6ST, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, IL10, IL11, IL4, INHA, INHBA, KLF6, TNFRSF7, CD28, CD38, CD69, CD80, CD83, CD86, DPP4, FCER2, IL2RA, TNFRSF8, TNFSF7, CD24, CD37, CD40, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CR2, IL1R2, ITGA2, ITGA3, MS4A1, ST6GAL1, CD1C, CHST10, HLA-A, HLA-DRA y NT5E; señales de co-estimulación: CTLA4 o B7.1/B7.2; inhibición de la supervivencia de las células B: BlyS, BAFF; activación del complemento: C5; modulación de las citocinas: el principio clave es que la respuesta biológica neta en cualquier tejido es el resultado del equilibrio entre los niveles locales de citocinas proinflamatorias o antiinflamatorias (véase Sfikakis PP et al 2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-557). Se considera que el SLE es una enfermedad dirigida por Th-2, con elevaciones documentadas de IL-4, IL-6 e IL-10 en suero. También se contemplan las DVD Ig capaces de unirse a uno o más objetivos seleccionados del grupo que consiste en o IL-4, IL-6, IL-10, IFN-a, y TNF-a La combinación de los objetivos que se describen en la presente permitirá mejorar la eficacia de las terapias para el SLE, lo que podrá ser evaluado en una cantidad de modelos de lupus preclínico (véase Peng SL (2004) Methods Mol Med. ; 102:227-72). Mee/., 102: 227-272 (2004)). Sobre la base de la reactividad de los anticuerpos progenitores con ortólogos humanos y de ratón (por ejemplo, la reactividad con CD20 humano y de ratón, interferón alfa humano y de ratón, etcétera), pueden realizarse estudios de convalidación en un modelo de lupus en ratón con moléculas de DVD-lg derivadas de un "anticuerpo de reemplazo coincidente". En resumen, puede hacerse coincidir una DVD-lg basada en dos (o más) anticuerpos objetivo específicos de ratón, en la mayor medida posible, con las características de los anticuerpos progenitores humanos o humanizados usados para la construcción de DVD-lg humanas (afinidad similar, potencia de neutralización similar, vida media similar, etcétera).
Esclerosis múltiple (MS) La esclerosis múltiple (MS) es una enfermedad humana compleja de tipo autoinmune que posee una etiología predominantemente desconocida. La destrucción inmunológica de la proteína básica de la mielina (MBP) en el sistema nervioso es la patología más saliente de la esclerosis múltiple. La MS es una enfermedad con patologías complejas, que comprende la infiltración por células T CD4 + , CD8+ y de respuesta dentro del sistema nervioso central. En la MS se ha descrito la expresión de citocinas en el SNC, las especies de nitrógeno reactivas y las moléculas coestimulatorias. Son de mayor consideración los mecanismos inmunológicos que contribuyen al desarrollo de autoínmunidad. En particular, la expresión de antígenos, las interacciones entre las citocinas y los leucocitos, y las células T reguladoras, que ayudan a balancear/modular otras células T, tales como células Th1 y Th2, son áreas importantes para la identificación de objetivos para la terapia.
La IL-12 es una citocina proinflamatoria que es producida por el APC y promueve la diferenciación de las células efectoras Th1. La IL-12 es producida en las lesiones en desarrollo de pacientes con MS, y también en los anímales afectados por EAE. Con anterioridad, se demostró que la interferencia en las vías de IL-12 permitía prevenir de manera efectiva la EAE, y que la neutralización in vivo de I L- 12p40 con un anticuerpo monoclonal antí-IL- 2 tenía efectos beneficiosos en el modelo de EAE inducida por mielina en monos tití.
TWEAK es un miembro de la familia de los TNF que es expresado de manera constitutiva en el sistema nervioso central (CNS), cuyos efectos proinflamatorios, proliferativos o apoptóticos dependen de los tipos celulares. Su receptor, Fn14, es expresado en el CNS por las células endoteliales, los astrocitos reactivos y las neuronas. La expresión de mRNA de TWEAK y Fn14 se halla incrementada en la médula espinal durante la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). El tratamiento con anticuerpos anti-TWEAK en la EAE inducida por la glicoproteína de los oligodendrocitos de la mielina (MOG) en ratones C57BL/6 resultó en una reducción de la severidad de la enfermedad y la infiltración de leucocitos cuando se trataron los ratones después de la fase de cebado.
Un aspecto de la invención se relaciona con moléculas de DVD-lg capaces de unirse a uno o más, por ejemplo, dos objetivos seleccionados del grupo que consiste en IL-12, TWEAK, IL-23, CXCL13, CD40, CD40L, IL-18, VEGF, VLA-4, TNF, CD45RB, CD200, IFNgamma, GM-CSF, FGF, C5, CD52 y CCR2. En una modalidad, se incluye una DVD-lg con especificidad dual anti-IL-1 ß/TWEAK como agente terapéutico beneficioso para el tratamiento de la MS.
En la técnica se conocen varios modelos animales para evaluar la utilidad de las moléculas de DVD-lg para tratar la MS (véanse Steinman L, et al., (2005) Trends Immunol. 565-571 (2005); Lublin et al., Springer Semin Immunopathol. , 8(3): 197-208 (1985), Genain et al., J. Mol. Med., 75(3): 187-197 (1997); Tuohy et al., J. Exp. Med., 189(7): 1033-1042 (1999); Owens et al., Neurol. Clin., 13(1): 51-73 (1995); y 't Hart et al., J. Immunol., 175(7): 4761-4768 (2005)). Sobre la base de la reactividad de los anticuerpos progenitores con ortólogos humanos y de animales (por ejemplo, la reactividad con I L- 1 ß humano y de ratón, TWEAK humana y de ratón, etcétera), pueden realizarse estudios de convalidación en el modelo de EAE en ratón con moléculas de DVD-lg derivadas de un "anticuerpo de reemplazo coincidente"; en resumen, puede hacerse coincidir una DVD-lg basada en dos (o más) anticuerpos objetivo específicos de ratón, en la mayor medida posible, con las características de los anticuerpos progenitores humanos o humanizados usados para la construcción de DVD-lg humanas (afinidad similar, potencia de neutralización similar,, vida media similar, etcétera). El mismo concepto se aplica a modelos animales en otras especies distintas de roedores, donde se seleccionaría una DVD-lg derivada de un "anticuerpo de reemplazo coincidente" para los estudios anticipados de farmacología, y posiblemente seguridad. Además de las evaluaciones de seguridad de rutina con estos pares de objetivos, podrán diseñarse pruebas específicas para determinar el grado de inmunosupresión que sean útiles para seleccionar los mejores pares de objetivos (véanse Luster et al., Toxicology, 92(1-3): 229-243 (1994); Descotes et al., Develop. Biol. Standard., 77: 99-102 (1992); Jones, R., "Rovelizumab-ICOS Corp", IDrugs, 3(4):442-446 (2000)).
Sepsis La patofisiología de la sepsis es iniciada por los componentes de la membrana externa de los organismos gram-negativos (lipopolisacárido [LPS], lípido A, endotoxina) y los organismos gram-positivos (ácido lipoteicoico, peptidoglicano). Estos componentes de la membrana externa pueden unirse al receptor de CD14 en la superficie de los monocitos. Los receptores activables descritos con anterioridad permiten que posteriormente se transmita una señal hacia la célula, lo que resultará en la producción eventual de las citocinas proinflamatorias factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) e interleuquina-1 (IL-1). Las respuestas inflamatorias e inmunes avasalladoras son características esenciales del choque séptico, y tienen una participación clave en la patogénesis del daño en los tejidos, el fallo de múltiples órganos y la muerte inducida por sepsis. Se ha demostrado que las citocinas, especialmente el factor de necrosis tumoral (TNF) y la interleuquina (IL-1), son mediadores críticos del choque séptico. Estas citocinas tienen un efecto tóxico directo sobre los tejidos; también activan la fosfolipasa A2. Estos y otros efectos resultan en concentraciones incrementadas del factor activador de las plaquetas, la promoción de la actividad de la óxido nítrico sintetasa, la promoción de la infiltración de los tejidos por neutrófilos, y la promoción de la actividad de los neutrófilos.
El tratamiento de la sepsis y el choque séptico sigue siendo un problema desde el punto de vista clínico, y las pruebas prospectivas recientes con modificadores de la respuesta biológica (es decir, anti-TNF, ' anti-MIF) dirigidos a la respuesta inflamatoria solamente han presentado beneficios clínicos modestos. Recientemente, el interés se ha desviado hacia las terapias dirigidas a la reversión de los períodos de supresión inmune adjuntos. Con estudios en animales experimentales y pacientes críticamente enfermos, se ha demostrado que la apoptosis incrementada de órganos linfoides y algunos tejidos parenquimáticos contribuyen a la supresión inmune, la anergia y la disfunción de los sistemas de órganos. Durante los síndromes de sepsis, la apoptosis de los linfocitos puede ser desencadenada por la ausencia de IL-2 o la liberación de glucocorticoides, granzimas, o las denominadas citocinas "de muerte": el factor de necrosis tumoral alfa o el ligando Fas. La apoptosis procede a través de la auto-activación de las caspasas del citosol y/o las mitocondrias, lo que puede estar influido por los miembros pro y antiapoptóticos de la familia de Bcl-2. En animales experimentales, el tratamiento con inhibidores de la apoptosis no solamente puede prevenir la apoptosis de las células linfoides; sino que también puede mejorar el resultado. Aunque las pruebas clínicas con agentes antiapoptóticos permanecen distantes debido en gran parte a las dificultades técnicas asociadas a su administración y su direccionamiento a los tejidos, la inhibición de la apoptosis de los linfocitos sigue siendo un objetivo terapéutico atractivo para el paciente con sepsis. De manera similar, un agente con especificidad dual, dirigido a un mediador inflamatorio y un mediator apoptótico, puede resultar en un beneficio adicional. Un aspecto de la invención se relaciona con DVD-lg capaces de unirse a la I L - 1 ß y/o I L- 1 ß F y uno o más objetivos que participan en la sepsis seleccionados del grupo que consiste en TNF, IL-1, MIF, IL-6, IL-8, IL-18, IL-12, IL-23, FasL, LPS, los receptores activables, TLR-4, el factor tisular, MIP-2, ADORA2A, CASP1, CASP4, IL-10, IL-1B, NFKB1, PROC, TNFRSF1 A, CSF3, CCR3, IL1RN, MIF, NFKB1, PTAFR, TLR2, TLR4, GPR44, HMOX1, H G-B1, la midquina, IRAK1, NFKB2, SERPINA1, SERPINE1 y TREM1. La eficacia de estas DVD-lg para la sepsis puede evaluarse en modelos animales preclínicos conocidos en la técnica (véanse Buras JA, et al. ,(2005) Nat Rev Drug Discov. 4(10): 854-865 (2005); y Calandra et al., Nature Med., 6(2):164-170 (2000)).
Trastornos neurológicos y enfermedades neurodegenerativas Las enfermedades neurodegenerativas usualmente son enfermedades dependientes de la edad o agudas (por ejemplo, accidentes cardiovasculares, lesiones traumáticas cerebrales, lesiones en la médula espinal, etc). Se caracterizan por la pérdida progresiva de funciones neuronales (muerte de células neuronales, desmielinización), pérdida de movilidad y pérdida de memoria. Al incrementarse el conocimiento de los mecanismos subyacentes de las enfermedades neurodegenerativas crónicas (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, AD), se observa una etiología compleja, y se ha reconocido una variedad de factores que contribuyen a su desarrollo y progreso, por ejemplo, la edad, el estado de glucemia, la producción y la multimerización de amiloides, la acumulación de productos de glucación terminal avanzados (AGE) que se unen a su receptor RAGE (receptor para AGE), el estrés oxidativo incrementado en el cerebro, el flujo de sangre disminuido en el cerebro, la neuroinflamación, incluyendo la liberación de citocinas y quimioquinas inflamatorias, la disfunción neuronal, y la activación de la microglía. Por ende, estas enfermedades neurodegenerativas crónicas representan una interacción compleja entre múltiples tipos celulares y mediadores. Las estrategias de tratamiento para estas enfermedades son limitadas, y la mayoría comprende el bloqueo de los procesos inflamatorios con agentes antiinflamatorios no específicos (por ejemplo, corticosteroides, inhibidores de la COX) o agentes para prevenir la pérdida de neuronas y/o funciones sinápticas. Con estos tratamientos, no es posible detener el progreso de la enfermedad. A partir de estudios recientes, ha sido posible concluir que las terapias más dirigidas, tales como los anticuerpos contra el péptido A-b soluble (incluyendo las formas oligoméricas A-b) no solamente pueden ayudar a detener el progreso de la enfermedad, sino que también pueden ayudar a mantener la memoria. Estas observaciones preliminares permiten inferir que, con terapias específicas dirigidas a más de un mediador de las enfermedades (por ejemplo, ?ß y una citocina proinflamatoria, tal como el TNF), sería posible obtener una eficacia terapéutica para las enfermedades neurodegenerativas aún mayor que la observada con el direccionamiento hacia un solo mecanismo de la enfermedad (por ejemplo, ?ß soluble sola) (véanse CE. Shepherd, et al, Neurobiol Aging. 503-511(2005); Nelson, R.B., Curr. Pharm. Des., 11: 3335-3352 (2005); Klein, W.L., Neurochem. Int., 41: 345-352 (2002); Janelsins et al., "Early correlation of microglial activation with enhanced tumor necrosis factor-alpha and monocyte chemoattractant protein-l expression especifically within the entorhinal cortex of triple transgenic Alzheimer's disease mice", J. Neuroinflammation, 2(23): 1-12 (2005); Soloman, B., Curr. Alzheimer. Res., 1: 149-163 (2004); Klyubin et al., Nature Med., 11:556-561 (2005); Arancio et al., EMBO J., 23: 4096-4105 (2004); Bornemann et al., Am. J. Pathol., 158: 63-73 (2001); Deane et al. , Nature Med., 9: 907-913 (2003); y Masliah et al., Neuron, 46: 857-868 (2005)).
Las moléculas de DVD-lg de la invención pueden unirse a la I L- 1 ß y a uno o más objetivos relacionados con enfermedades neurodegenerativas crónicas como la enfermedad de Alzheimer. Estos objetivos incluyen, sin limitaciones, cualquier mediador, soluble o de la superficie celular, relacionado con la patogénesis de la AD, por ejemplo, AGE (S100 A, anfotericina), las citocinas proinflamatorias (por ejemplo, la IL-1), las quimioquinas (por ejemplo, MCP 1), las moléculas que inhiben la regeneración de los nervios (por ejemplo, Nogo, RGM A), las moléculas que potencian el crecimiento de las neuritas (neurotrofinas) y las moléculas que pueden mediar en el transporte a través de la barrera hematoencefálica (por ejemplo, el receptor de transferrina, el receptor de insulina o RAGE). La eficacia de las moléculas de DVD-lg puede convalidarse en modelos animales preclínicos, tales como los ratones transgénicos donde se sobreexpresa la proteina precursora amiloide o RAGE, en los cuales se desarrollan síntomas similares a los de la enfermedad de Alzheimer. Además, pueden construirse moléculas de DVD-lg para evaluar su eficacia en los modelos animales, y las mejores DVD-lg para aplicaciones terapéuticas pueden seleccionarse para evaluaciones en pacientes humanos. Las moléculas de DVD-lg también pueden emplearse para el tratamiento de otras enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Parkinson. La alfa-sinucleína participa en la patología de la enfermedad.de Parkinson. Una DVD-lg capaz de dirigirse a la ??_-1ß y LINGO-1, alfa-sinucleína y mediadores inflamatorios como TNF, IL-17 y MCP- podría ser efectiva para la terapia de la enfermedad de Parkinson, y está contemplada en la invención.
Regeneración neuronal y lesiones en la médula espinal A pesar de un incremento en el conocimiento de los mecanismos patológicos, las lesiones en la médula espinal (SCI) aún son una afección devastadora y representan una indicación médica caracterizada por una elevada necesidad médica. La mayoría de las lesiones en la médula espinal son lesiones por contusión o compresión, y la lesión primaria comúnmente es seguida por mecanismos de lesión secundarios (mediadores inflamatorios, por ejemplo, citocinas y quimioquinas) que empeoran la lesión inicial y resultan en un agrandamiento significativo del área de la lesión, algunas veces hasta 10 veces. Estos mecanismos primarios y secundarios en las SCI son muy similares a los que presentan las lesiones cerebrales causadas por otros medios, por ejemplo, accidente cerebrovascular. No hay un tratamiento satisfactorio, y la inyección de dosis elevadas en bolo de metilprednisolona (MP) es la única terapia usada en un período de tiempo escaso de 8 horas después de la lesión. Sin embargo, este tratamiento solamente tiene por objeto prevenir la lesión secundaria, sin provocar una recuperación funcional significativa. Ha recibido numerosas críticas debido a que carece eficacia inequívoca y presenta efectos adversos severos, por ejemplo, inmunosupresión, con infecciones subsiguientes y alteraciones histopatológicas severas en los músculos. No se han aprobado otras drogas, agentes biológicos o moléculas pequeñas que estimulen el potencial regenerativo endógeno, pero en los años recientes, se han descubierto principios de tratamiento y drogas candidatas prometedores que presentan eficacia en modelos animales de SCI y recientemente se han presentado los primeros datos clínicos prometedores. En gran medida, la falta de recuperación funcional en las SCI humanas es causada por factores que inhiben el crecimiento de las neuritas en los sitios de las lesiones, el tejido de las cicatrices, la mielina y las células asociadas a la lesión. Estos factores son las proteínas asociadas a la mielina NogoA, OMgp y MAG, RGM A, los CSPG (proteoglicanos de condroitín sulfato) asociados a las cicatrices y los factores inhibidores en los astrocitos reactivos (algunas semaforinas y efrinas). Sin embargo, en el sitio de la lesión no solamente se hallan moléculas inhibidoras, sino también factores que estimulan el crecimiento de las neuritas, tales como neurotrofinas, laminina, L1, y otros. Este conjunto de moléculas inhibidoras y promotoras del crecimiento de las neuritas puede explicar que los factores bloqueadores individuales, tales como NogoA o RGM A, resultaran en una recuperación funcional significativa en modelos de SCI en roedores, debido a que una reducción de las influencias de inhibición podría desviar el equilibrio desde la inhibición del crecimiento hacia la promoción del crecimiento. Sin embargo, las recuperaciones observadas con el bloqueo de una sola molécula inhibidora del desarrollo de las neuritas no fueron completas. Para obtener recuperaciones más veloces y más pronunciadas, se desearían dos moléculas bloqueadoras del desarrollo de las neuritas, por ejemplo, Nogo y RGM A, o una molécula bloqueadora del desarrollo de las neuritas y una molécula potenciadora de las funciones de las moléculas bloqueadoras del desarrollo de las neuritas, por ejemplo, Nogo y las neurotrofinas, o una molécula bloqueadora del desarrollo de las neuritas por ejemplo, Nogo, y una molécula proinflamatoria, por ejemplo, TNF (véanse McGee AW, et al. 193-198 (2003); Domeniconi et al., J. Neurol. Sci., 233: 43-47 (2005); Makwana et al., FEBS J. , 272: 2628-2638 (2005); Dickson, B.J., Science, 298: 1959-1964 (2002); Teng et al., J. Neurosci. Res., 79: 273-278 (2005); Karnezis et al., Nature Neurosa'., 7: 736 (2004); Xu et al., J. Neurochem., 91: 1018-1023 (2004)).
En un aspecto, se provee un DVD-lg que se une a hlL-?ß puede unirse a uno o ambos de pares de objetivos, tales como NgR y RGM A; NogoA y RGM A; MAG y RGM A; OMGp y RGM A; RGM A y RGM B; CSPGs y RGM A; agrecán, midquina, neurocán, versicán, fosfacán, Te38 y TNF-a; anticuerpos específicos para globulomeros ?ß combinados con anticuerpos promotores de la brotación de dendritas y axones. La patología de las dendritas es una señal muy temprana de la AD y se sabe que NOGO A restringe el crecimiento de las dendritas. Es posible combinar este tipo de anticuerpos con cualquiera de los anticuerpos candidatos para las SCI (proteínas de la mielina). Otras DVD-lg objetivo pueden incluir cualquier combinación de NgR-p75, NgR-Troy, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR-Lingo, Lingo-Troy, Lingo-p75, MAG u Omgp. Adicionalmente, los objetivos también pueden incluir cualquier mediador, soluble o de la superficie celular, que participe en la inhibición de las neuritas, por ejemplo, Nogo, Ompg, MAG, RGM A, semaforinas, efrinas, A-b soluble, citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-1), quimioquinas (por ejemplo, MIP 1a), moléculas que inhiben la regeneración de los nervios. La eficacia de moléculas anti-nogo/anti-RGM A o moléculas de DVD-lg similares puede convalidarse en modelos animales preclínicos de lesiones en la médula espinal. Además, pueden construirse moléculas de DVD-lg para evaluar su eficacia en los modelos animales, y las mejores DVD-lg para aplicaciones terapéuticas pueden seleccionarse para evaluaciones en pacientes humanos. Además, pueden construirse moléculas de DVD-lg dirigidas a dos sitios de unión a ligandos diferentes en un mismo receptor, por ejemplo, el receptor Nogo, que se une a tres ligandos Nogo, OMGp y MAG, y RAGE, que se une a ?ß y S100 A. Además, los inhibidores del desarrollo de las neuritas, por ejemplo, nogo y el receptor de nogo, también pueden participar en la prevención de la regeneración de los nervios en enfermedades inmunológicas como la esclerosis múltiple. Se ha demostrado que la inhibición de la interacción entre nogo y el receptor de nogo mejora la recuperación en modelos animales de esclerosis múltiple. Entonces, las moléculas de DVD-lg que puedan bloquear la función de un mediador inmune, por ejemplo, una citocina como IL-12, y una molécula inhibidora del desarrollo de las neuritas, por ejemplo, nogo o RGM, podrán ofrecer mayor velocidad y eficacia que el bloqueo separado inmune o de una molécula inhibidora del desarrollo de las neuritas.
En general, los anticuerpos no cruzan la barrera hematoencefálica (BBB) en forma eficiente y relevante. Sin embargo, en algunas enfermedades neurológicas, por ejemplo, los accidentes cerebrovasculares, las lesiones traumáticas cerebrales, la esclerosis múltiple, etc, la BBB puede estar comprometida y esto permite una mayor penetración de las DVD-lg y los anticuerpos en el cerebro. En otros trastornos neurológicos, en los que no se producen fugas en la BBB, puede emplearse el direccionamiento de sistemas de transporte endógeno, que incluyen transportadores mediados por un vehículo, tal como un vehículo de glucosa o aminoácido y receptores/estructuras celulares que intervienen en la transcitosis mediada por receptores a nivel del endotelio vascular de la BBB, permitiendo de esa manera el transporte trans-BBB de la DVD-lg. Las estructuras en la BBB que permiten dicho transporte incluyen, pero en un sentido no limitante, el receptor de insulina, el receptor de transferrina, LRP y RAGE. Además, las estrategias también permiten el uso de las DVD-lg como lanzaderas para transportar drogas potenciales dentro del CNS incluyendo drogas de bajo peso molecular, nanopartículas y ácidos nucleicos (Coloma MJ, et al. Res., 17(3):266-274 (2000); Boado et al., Bioconjug. Chem., 18(2):447-455 (2007)).
Trastornos oncológicos La terapia con anticuerpos monoclonales ha emergido como una modalidad terapéutica importante para el cáncer (von Mehren M, et al Annu Rev Med.;54: 343-369 (2003)). Los anticuerpos pueden presentar efectos antitumorales mediados por la inducción de la apoptosis, la redirección de la citotoxicidad, la interferencia con interacciones entre ligandos y receptores, o la prevención de la expresión de proteínas críticas para el fenotipo neoplástico. Además, los anticuerpos pueden atacar componentes del microambiente tumoral, lo que resulta en la alteración de estructuras vitales, por ejemplo, la formación de vasculatura asociada a los tumores. Los anticuerpos también pueden atacar receptores cuyos ligandos son factores de crecimiento, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico. De esta manera, el anticuerpo inhibe el direccionamiento de los ligandos naturales que estimulan el crecimiento celular hacia las células tumorales. Como alternativa, los anticuerpos pueden inducir una red anti-idiotípica, la citotoxicidad mediada por el complemento o la citotoxcidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). El uso de anticuerpos con especificidad dual dirigidos a dos mediadores tumorales separados probablemente tenga beneficios adicionales, en comparación con una terapia monoespecífica.
En otra modalidad, una DVD-lg de la invención, capaz de unirse a la I L- ß humana, también puede ser capaz de unirse a otro objetivo relacionado con las enfermedades oncológicas, que incluyen, sin limitaciones IGFR, IGF, VGFR1, PDGFRb, PDGFRa, IGF1.2, ERB3, CDCP, 1BSG2, ErbB3, CD52, CD20, CD19, CD3, CD4, CD8, BMP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24, INHA, TNF, TNFSF10, BMP6, EGF, FGF1, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, GRP, IGF1, IGF2, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, INHA, TGFA TGFB1, TGFB2, TGFB3, VEGF, CDK2, FGF10, FGF18, FGF2, FGF4 FGF7, IGF1R, IL2, BCL2, CD164, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, GNRH1, IGFBP6, IL1A, IL1B 0DZ1, PAWR, PLG, TGFB1I1, AR, BRCA1, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6 CDK7, CDK9, E2F1, EGFR, EN01, ERBB2, ESR1, ESR2, IGFBP3 IGFBP6, IL2, INSL4, MYC, N0X5, NR6A1, PAP, PCNA, PRKCQ, PRKD1 PRL, TP53, FGF22, FGF23, FGF9, IGFBP3, IL2, INHA, KLK6, TP53 CHGB, GNRH1, IGF1, IGF2, INHA, INSL3, INSL4, PRL, KLK6, SHBG NR1D1, NR1H3, NR1I3, NR2F6, NR4A3, ESR1, ESR2, NR0B1, NR0B2 NR1D2, NR1H2, NR1H4, NR1I2, NR2C1, NR2C2, NR2E1 , NR2E3 NR2F1, NR2F2, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR5A1, NR5A2 NR6A1, PGR, RARB, FGF1, FGF2, FGF6, KLK3, KRT1, APOC1, BRCA1 CHGA, CHGB, CLU, COL1A1, COL6A1, EGF, ERBB2, ERK8, FGF1 FGF10, FGF11, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF2, FGF20 FGF21, FGF22, FGF23, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9 GNRH1, IGF1, IGF2, IGFBP3, IGFBP6, IL12A, IL1A, IL1B, IL2, IL24 INHA, INSL3, INSL4, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3 KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, MMP2, MMP9, MSMB, NTN4, ODZ1, PAP PLAU, PRL, PSAP, SERPINA3, SHBG, TGFA, TIMP3, CD44, CDH1 CDH10, CDH19, CDH20, CDH7, CDH9, CDH1, CDH10, CDH13, CDH18 CDH19, CDH20, CDH7, CDH8, CDH9, ROB02, CD44, ILK, ITGA1, APC CD164, COL6A1, MTSS1, PAP, TGFB1I1, AGR2, AIG1, AKAP1, AKAP2 CANT1, CAV1, CDH12, CLDN3, CLN3, CYB5, CYC1, DAB2IP, DES DNCL1, ELAC2, EN02, EN03, FASN, FLJ12584, FLJ25530, GAGEB1 GAGEC1, GGT1, GSTP1, HIP1, HUMCYT2A, IL29, K6HF, KAI1, KRT2A, MIB1, PART1, PATE, PCA3, PIAS2, PIK3CG, PPID, PR1, PSCA, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, STEAP, STEAP2, TPM1, TPM2, TRPC6, ANGPT1, ANGPT2, ANPEP, ECGF1, EREG, FGF1, FGF2, FIGF, FLT1, JAG1 , KDR, LAMA5, NRP1, NRP2, PGF, PLXDC1 , STAB1, VEGF, VEGFC, ANGPTL3, BAI1, COL4A3, IL8, LAMA5, NRP1, NRP2, STAB1, ANGPTL4, PECA 1, PF4, PROK2, SERPINF1, TNFAIP2, CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL10, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL9, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL1B, IL6, MDK, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EPHB4, FGFR3, HGF, IGF1, ITGB3, PDGFA, TEK, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBR1, CCL2, CDH5, COL18A1, EDG1, ENG, ITGAV, ITGB3, THBS1, THBS2, BAD, BAG1, BCL2, CCNA1 , CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CDH1 (E-caderina), CDKN1B (p27Kip1), CDKN2A (p16INK4a), COL6A1, CTNNB1 (b-caten¡na), CTSB (catepsina B), ERBB2 (Her-2), ESR1, ESR2, F3 (TF), FOSL1 (FRA-1), GATA3, GSN (gelsolina), IGFBP2, IL2RA, IL6, IL6R, IL6ST (glicoproteina 130), ITGA6 (integrina a6), JUN, KLK5, KRT19, MAP2K7 (c-Jun), M I67 ( i-67), NGFB (NGF), NGFR, NME1 (NM23A), PGR, PLAU (uPA), PTEN, SERPINB5 (maspina), SERPINE1 (PAI-1), TGFA, THBS1 (trombospondina-1 ), TIE (Tie-1), TNFRSF6 (Fas), TNFSF6 (FasL), TOP2A (topoisomerasa lia), TP53, AZGP1 (cinc-a-glicoproteína), BPAG1 (plectina), CDKN1A (p21Wap1/Cip1 ), CLDN7 (claudina-7), CLU (clusterina), ERBB2 (Her-2), FGF1, FLRT1 (fibronectina), GABRP (GABAa), GNAS1, ID2, ITGA6 (integrina a6), ITGB4 (integrina b 4), KLF5 (GC Box BP), KRT19 (queratina 19), KRTHB6 (queratina especifica para el cabello tipo II), MACMARCKS, MT3 (metalotionectina-lll), MUC1 (mucina), PTGS2 (COX-2), RAC2 (p21Rac2), S100A2, SCGB1D2 (lipofilina B), SCGB2A1 (mamaglobina 2), SCGB2A2 (mamaglobina 1), SPRR1B (Spr1), THBS1, THBS2, THBS4, y TNFAIP2 (B94), RON, c-Met, CD64, DLL4, PLGF, CTLA4, fosfatidMserina, ROB04, CD80, CD22, CD40, CD23, CD28, CD80, CD55, CD38, CD70, CD74, CD30, CD138, CD56, CD33, CD2, CD137, DR4, DR5, RANKL, VEGFR2, PDGFR, VEGFR1 , TSP1, MSP, EPHB2, EPHA1, EPHA2, EpCAM, PGE2, NKG2D, LPA, SIP, APRIL, BCMA, MAPG, FLT3, PDGFR alfa, PDGFR beta, ROR1, PSMA, PSCA, SCD1 y CD59.
D. Composición farmacéutica En la invención también se proveen composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo (incluida una DVD-lg descrita en la presente), o una porción de unión de éste al antígeno de la invención, y un vehículo aceptable para el uso farmacéutico. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de la invención son para usar, sin limitaciones, en el diagnóstico, la detección o el monitoreo de un trastorno, en la prevención, el tratamiento, el manejo o el alivio de un trastorno, o uno o más de sus síntomas, y/o en la investigación. En una modalidad específica, una composición comprende uno o más anticuerpos de la invención de la invención. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende uno o más anticuerpos de la invención, y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos de los anticuerpos de la invención, para tratar un trastorno donde la actividad de I L- ß es perjudicial. En una modalidad, los agentes profilácticos o terapéuticos son conocidos por ser de utilidad o se han usado o actualmente se usan en la prevención, el tratamiento, manejo o alivio de un trastorno o uno o más de sus síntomas. De acuerdo con estas modalidades, la composición puede comprender además un vehículo, diluyente o excipiente.
Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención y un vehículo aceptable para el uso farmacéutico. Tal como lo se usa en la presente, un "vehículo aceptable para el uso farmacéutico" incluye cualquiera de los solventes, los medios de dispersión, los recubrimientos, los agentes antibacterianos y antifúngicos, los agentes isotónicos y los agentes que demoran de absorción, y semejantes, que sean compatibles con el uso fisiológico. Los ejemplos de vehículos aceptables para el uso farmacéutico incluyen uno o más entre agua, salina, salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y semejantes, así como combinaciones de éstos. En muchos casos, en la composición será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, políalcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. Los vehículos aceptables para el uso farmacéutico pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservadores o soluciones amortiguadoras, que mejoran la vida útil o eficacia del anticuerpo o una porción de anticuerpo.
Se conocen diversos sistemas de administración que pueden usarse para administrar uno o más anticuerpos de la invención o la combinación de uno o más anticuerpos de la invención y un agente profiláctico o agente terapéutico de utilidad para prevenir, manejar, tratar o aliviar un trastorno o uno o más síntomas de éste, por ejemplo, encapsulamiento en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por un receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etcétera. Los métodos para administrar un agente profiláctico o terapéutico de la invención incluyen, sin limitaciones, la administración parenteral (por ejemplo, ¡ntradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea), la administración epidural, la administración intratumoral y la administración a través de las mucosas (por ejemplo, las vías intranasal u oral). Además, puede emplearse la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o un nebulizador, y la formulación con un agente para una aplicación en aerosol. Véase, por ejemplo, las Patentes estadounidenses N° 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913 y 5290540 y las Publicaciones PCT N° WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora por completo en la presente a modo de referencia. En una modalidad, se administra un anticuerpo o una porción de un anticuerpo de la invención, una terapia combinada o una composición de la invención usando la tecnología de liberación pulmonar de drogas Alquermes AIR® (Alquermes, Inc., Cambridge, Masachusetts, EEUU). En una modalidad específica, los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención se administran por vía intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden administrarse por cualquier ruta apropiada, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través del revestimiento epitelial o mucocutáneo (por ejemplo, mucosa oral, rectal y mucosa intestinal, etc.), y pueden administrarse en combinación con otros agentes con actividad biológica. La administración puede ser sistémica o local.
En una modalidad, puede usarse la unión específica de nanotubos de carbono unidos a anticuerpos (CNT) a células tumorales in vitro, seguida por su ablación altamente específica con luz infrarroja cercana (NIR), para realizar el direccionamiento hacia las células tumorales. Por ejemplo, pueden usarse lípidos polares biotinílados para preparar dispersiones estables, biocompatibles y no citotóxicas de CNT, las cuales posteriormente son unidas a uno o dos DVD-lg neutralizadoras derivadas con avidina, dirigidas contra uno o más antígenos tumorales (por ejemplo, CD22) (Chakravarty, P. et al. USA, 105: 8697-8702 (2008)).
En una modalidad específica, puede ser deseable administrar los agentes profilácticos o terapéuticos de la invención localmente en el área que necesita del tratamiento; esto puede efectuarse, por ejemplo, sin limitaciones, mediante infusión local, inyección o por medio de un implante, donde dicho implante es de un material poroso o no poroso, incluyendo membranas y matrices, tales como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®) o matrices de colágeno. En una modalidad, se administra una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la invención antagonistas localmente en el área afectada a un sujeto para prevenir, tratar, manejar y/o aliviar un trastorno o un síntoma de éste. En otra modalidad, se administra una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la invención en forma local en el área afectada, en combinación con una cantidad eficaz de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) diferentes de un anticuerpo de la invención a un sujeto, para prevenir, tratar, manejar y/o aliviar un trastorno o uno o más de sus síntomas.
En otra modalidad, el agente profiláctico o terapéutico puede liberarse en un sistema de liberación controlada o liberación sostenida. En una modalidad, puede usarse una bomba para efectuar una liberación controlada o sostenida (véanse Langer, supra; Sefton, M.V., CRC Crit. Rev. Biomed. Eng., 14: 201-240 (1987); Buchwald et al., Surgery, 88: 507-516 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321: 574-579 (1989)). En otra modalidad, pueden usarse materiales poliméricos para efectuar la liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (véanse, por ejemplo, Goodson, J.M., capítulo 6 de Medical Applications of Controlled Reléase, Vol. II, Applications y Evaluation, (Langer y Wise, editores) (CRC Press, Inc., Boca Ratón, 1984) pp. 115-138; Langer y Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. Phys., C23(1): 61-126 (1983)). Véanse también Levy et al., Science, 228:190-192 (1985); During et al., Ann. NeuroL, 25:351-356 (1989); Howard et al., J. Neurosurg., 71:105-112 (1989), la Patente estadounidense N° 5679377, la Patente estadounidense N° 5916597, la Patente estadounidense N° 5912015, la Patente estadounidense N° 5989463, la Patente estadounidense N° 5128326; Publicación PCT N° WO 99/15154 y la Publicación PCT N° WO 99/20253. Los ejemplos de polímeros que pueden usarse en las formulaciones de liberación sostenida incluyen, sin limitaciones, el poli(2-hidroxi metacrilato de etilo), el poli(metacrilato de metilo), el poli(ácido acriílico), el poli(el acetato de etileno-co-vinilo), el poli(ácido metacrílico), los poliglicólidos (PLG), los polianhídridos, la pol i(N-vi n i I pirrolidona), el poli(alcohol vinílico), la poliacrilamida, el poli(etilenglicol), los poliláctidos (PLA), los poli(láctidos-co-glicólidos) (PLGA) y los poliortoésteres. En una modalidad, el polímero usado en la formulación de liberación sostenida es inerte, está libre de impurezas lixiviables, el estable al almacenamiento, estéril y biodegradable. En aún otra modalidad, puede colocarse un sistema de liberación controlada o sostenida en la proximidad de un objetivo profiláctico o terapéutico, de modo que se requiera solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Reléase, mencionado con anterioridad, volumen 2, páginas 115-138 (1984)).
Los sistemas de liberación controlada se describen en la revisión de Langer (1990, Science 249:1527-1533). Puede usarse cualquier técnica conocida por aquellos versados en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la invención. Véanse, por ejemplo, la Patente estadounidense N° 4526938, la Publicación PCT N° WO 91/05548, la Publicación PCT N° WO 96/20698; Ning et al., "Intratumoral radioimmunot erapy of a human colon cáncer xenograft using a sustained-release gel", Radiotherapy Oncol., 39: 179-189 (1996); Song et al., "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions", PDA J. Pharm. Sci.Technol. , 50: 372-377 (1996); Cleek et al., "Biodegradable Polimeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application", Proceed. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759- -760. 853-854 (1997); y Lam et al., "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery", Proceed. Int'l. Symp. Control Reí. Bioact. Mater. 24:759-760 (1997), cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad en la presente a modo de referencia.
En una modalidad específica, cuando la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica un agente profiláctico o terapéutico, el ácido nucleico puede administrarse in vivo para promover la expresión del agente profiláctico o terapéutico que codifica si se lo construye como parte de un vector de expresión de ácidos nucleicos apropiado y se lo administra de modo de que se torne ¡ntracelular, por ejemplo, con el uso de un vector retroviral (véase la Patente estadounidense N° 4980286), por inyección directa, usando un bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont) o un recubrimiento con lípidos o receptores superficiales celulares o agentes de transfeccion, o administrándolo en combinación con un péptido semejante a homeobox del que se sepa que ingresa al núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868 (1991)). Como alternativa, el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente y puede incorporarse en el DNA de la célula huésped para su expresión mediante recombinación de homólogos.
La composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su ruta de administración pretendida. Entre los ejemplos de rutas de administración, se incluyen, no de manera limitante, la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, por inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica), transmucosal, y rectal. En una modalidad específica, la composición se formula de acuerdo con los procedimientos de rutina, como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal o tópica a sujetos humanos. Típicamente, las composiciones para una administración intravenosa son soluciones en solución amortiguadora acuosa isotónica estéril. Cuando fuera necesario, la composición también puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local, tal como lignocamina, para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.
Si las composiciones de la invención serán administradas tópicamente, las composiciones pueden formularse en forma de un ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, spray, aerosol, solución, emulsión u otra forma bien conocida por aquellos versados en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences y Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para las formas de dosificación tópica no atomizables, generalmente se emplean formas entre viscosas y semisólidas o sólidas, que comprenden un vehículo o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica, y que tienen una viscosidad dinámica preferiblemente mayor que el agua. Entre las formulaciones apropiadas se incluyen, no de manera limitante, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, polvos, linimentos, bálsamo, y semejantes, que son, se desea, esterilizados o mezclados con agentes auxiliares por ejemplo, preservantes, estabilizadores, agentes de humectación, amortiguadores o sales) para afectar distintas propiedades, tales como, por ejemplo, la presión osmótica. Otras formas de dosificación tópica adecuadas incluyen preparaciones en aerosol rociables, donde el ingrediente activo, preferiblemente en combinación con un vehículo sólido o líquido inerte, es envasado en una mezcla con un compuesto volátil presurizado (por ejemplo, un propelente gaseoso, tal como freón) o en una botella lavadora o de compresión. Si se lo desea, también pueden agregarse hidratantes o humectantes a las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación. Los ejemplos de dichos ingredientes adicionales son bien conocidos en la técnica.
Si el método de la invención comprende una administración intranasal de una composición, la composición pueden formularse en forma de un aerosol, rocío, niebla o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para su uso de acuerdo con la presente invención pueden administrarse convenientemente bajo la forma de una presentación como rocío en aerosol, a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente apropiado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas apropiado). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede ser determinada con una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos (compuestos, por ejemplo, por gelatina) pueden formularse para usar en un inhalador o un insuflador que contenga una mezcla del polvo del compuesto con una base de polvo apropiada, tal como lactosa o almidón.
Si el método de la invención comprende la administración oral, las composiciones pueden formularse por vía oral en forma de tabletas, cápsulas, sellos, cápsulas de gelatina, soluciones, suspensiones, y semejantes. Las tabletas o las cápsulas pueden prepararse por medios convencionales, con agentes excipientes aceptables para el uso farmacéutico, tales como agentes unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); rellenos (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato ácido de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ejemplo, almidón de papa o glicolato sódico de almidón); o agentes de humectación (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Las tabletas pueden recubrirse de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tomar la forma de soluciones, jarabes o suspensiones, no de manera limitante, o pueden presentarse como un producto seco para la reconstitución con agua u otro vehículo apropiado antes de usarlas. Dichas preparaciones líquidas pueden prepararse usando medios convencionales con aditivos aceptables para el uso farmacéutico, tal como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsificantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservadores (por ejemplo, metil o propíl-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales amortiguadoras, agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes, según sea apropiado. Las preparaciones para una administración oral pueden formularse convenientemente para una liberación lenta, liberación controlada o liberación sostenida de uno o más agentes profilácticos o terapéuticos.
El método de la invención puede comprender la administración pulmonar, por ejemplo, con el uso de un inhalador o un nebulizador, de una composición formulada con un agente para la aplicación en aerosol. Véanse, por ejemplo, las Patentes estadounidenses N° 6773900, 6740506, 6713282, 6635449, 6605449, 6537776, 6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 y 4880078 y las Publicaciones PCT N° WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en la presente a modo de referencia. En una modalidad específica, se administra un anticuerpo de la invención, una terapia combinada y/o una composición de la invención usando la tecnología de liberación de drogas pulmonar Alquermes AIR® (Alquermes, Inc., Cambridge, Mass.).
El método de la invención puede comprender la administración de una composición formulada para la administración parenteral por inyección (por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua). Las formulaciones para inyección pueden presentarse en una forma de dosificación unitaria (por ejemplo, en ampolletas o recipientes con dosificaciones múltiples) con adición de un conservador. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de la formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el principio activo puede tomar la forma de un polvo para reconstituir con un vehículo apropiado (por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos) antes de usarlo.
Además, los métodos de la invención pueden comprender la administración de composiciones formuladas como preparaciones de depósito. Dichas formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación (por ejemplo, en forma subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. De este modo, por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrofóbicos apropiados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles (por ejemplo, como una sal moderadamente soluble).
Los métodos de la invención abarcan la administración de composiciones formuladas como formas neutras o salinas. Entre las sales aceptables para el uso farmacéutico se incluyen aquellas formadas con aniones, tales como aquellos derivados de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etcétera, y aquellos formados con cationes, tales como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etcétera.
Por lo general, los ingredientes de las composiciones se proveen en forma separada o mezclados en una unidad de forma de dosificación, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente, tal como una ampolleta o un saquito donde se indica la cantidad de agente activo. En los casos en que el modo de administración sea la infusión, la composición podrá administrarse con una botella de infusión que contenga agua o solución salina estéril de grado farmacéutico. Cuando el modo de administración es por inyección, puede proveerse una ampolleta de agua para inyección o salina estéril para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
En particular, en la invención también se provee uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas de la invención envasadas en un recipiente sellado herméticamente, tal como una ampolleta o saquito donde se indica la cantidad del agente.
En una modalidad, dichos uno o más agentes profilácticos o terapéuticos, o composiciones farmacéuticas, de la invención, son suministrados como un polvo liofilizado seco esterilizado o un concentrado sin agua en un recipiente herméticamente sellado y puede reconstituirse (por ejemplo, con agua o salina) a la concentración apropiada para su administración a un sujeto. Preferiblemente, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas de la invención, se proveen como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente sellado herméticamente, con una dosificación individual de al menos 5 mg, más preferiblemente al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg, o al menos 100 mg. Los agentes profilácticos o terapéuticos liofilizados o las composiciones farmacéuticas de la invención deben almacenarse a una temperatura de entre 2°C y 8°C en su recipiente original, y los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas de la invención deben administrarse una semana, preferiblemente 5 días, 72 horas, 48 horas, 24 horas, 12 horas, 6 horas, 5 horas, 3 horas o una hora después de reconstituirse. En una modalidad alternativa, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas de la invención, se proveen en forma líquida en un recipiente sellado herméticamente en el que se indica la cantidad y la concentración del agente. Preferiblemente, la forma líquida de la composición administrada se suministra en un recipiente herméticamente sellado a por lo menos 0,25 mg/ml, más preferiblemente al menos 0,5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/kg, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml. La forma líquida debe almacenarse a una temperatura de entre 2°C y 8°C en su recipiente original.
Los anticuerpos y las porciones de anticuerpos de la invención pueden incorporarse en de una composición farmacéutica apropiada para la administración parenteral. Preferiblemente, el anticuerpo o las porciones del anticuerpo se prepararán como una solución inyectable que contiene 0,1-250 mg/ml del anticuerpo. La solución inyectable puede estar compuesta por una forma de dosificación líquida o liofilizada en un recipiente, una ampolleta o una jeringa de color sílex o ámbar rellena con antelación. La solución amortiguadora puede ser L-histidina (entre 1 y 50 mM), óptimamente entre 5 y 10 mM, a pH entre 5,0 y 7,0 (óptimamente a pH 6,0). Otras soluciones amortiguadoras adecuadas incluyen, sin limitaciones, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Puede usarse cloruro de sodio para modificar la toxicidad de la solución, en una concentración de entre 0 y 300 mM (óptimamente 150 mM para una forma de dosificación líquida). Pueden incluirse crioprotectores para una forma de dosificación liofilizada, principalmente sacarosa en una proporción de entre 0 y 10% (óptimamente entre 0,5 y 1,0%). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Pueden incluirse agentes de relleno para una forma de dosificación liofilizada, principalmente manitol 1-10% (preferiblemente 2-4%). Pueden usarse estabilizadores en formas de dosificación líquidas y liofilizadas, principalmente L-metionina 1-50 mM (preferiblemente 5-10 mM). Otros agentes de relleno adecuados incluyen glicina, arginina, que pueden incluirse como polisorbato-80 0-0,05% (preferiblemente 0,005-0,01%). Entre los agentes tensioactivos adicionales, se incluyen, no de manera limitante, el polisorbato 20 y los agentes tensioactivos BRIJ. La composición farmacéutica que comprende los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención preparados como una solución inyectable para una administración parenteral, pueden comprender además un agente de utilidad como un adyuvante, tal como los que se usan para incrementar la absorción, o dispersión de una proteína terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo). En particular, un adyuvante útil es la hialuronidasa, tal como Hylenex® (hialuronidasa recombinante humana). La adición de hialuronidasa a la solución inyectable mejora la biodisponibilidad para los humanos después de la administración parenteral, particularmente la administración subcutánea. También permite volúmenes mayores en el sitio de inyección (es decir, más de 1 mi) con menos dolor e incomodidad, y una incidencia mínima de reacciones en el sitio de la inyección, (véase W02004078140 y Publicación de la Solicitud de Patente estadounidense 2006/104968).
Las composiciones de esta invención pueden tomar diversas formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables y para infusión), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica que se deseen. Las composiciones preferidas típicas toman la forma de soluciones inyectables o para infusión, tales como composiciones similares a las que se usan para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es el parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una modalidad, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea.
Típicamente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración elevada de droga. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación del compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes de los que se enumeraron previamente, según se lo requiera, a lo que sigue una esterilización por filtración. Por lo general, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes que necesarios enumerados con anterioridad. En el caso de los polvos estériles y los liofilizados para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado por vacio y el secado por rociado, que proporciona un polvo del ingrediente activo, más cualquier ingrediente adicional que se desee, a partir de una solución de éste previamente esterilizada por filtración. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante el uso de agentes tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede efectuarse incluyendo en la composición un agente que demora la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las proteínas de unión de la presente invención pueden administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, en una modalidad, la ruta/el modo de administración es la inyección subcutánea, la inyección intravenosa o la infusión. Como podrán apreciar aquellos versados en la técnica, la ruta y/o modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo puede prepararse con un vehículo que protegerá el compuesto de la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tal como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o generalmente son conocidos por aquellos versados en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, editor, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
En determinadas modalidades, el anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también pueden incluirse en cápsulas de gelatina dura o blanda, presionar en comprimidos o incorporar directamente a la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usar en forma de tabletas masticables, tabletas para disolución bucal, comprimidos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y semejantes. Para administrar un compuesto de la invención por otra vía que no sea la parenteral puede ser necesario recubrir el compuesto o coadministrar el compuesto con un material que impida su inactivación.
También pueden incorporarse en las composiciones compuestos activos adicionales. En determinadas modalidades, un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención está co-formulado con y/o se coadministra con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son de utilidad para el tratamiento de trastornos en los cuales la actividad de la I L- 1 ß es perjudicial. Por ejemplo, un anticuerpo anti-hlL-1 ß o una porción de anticuerpo de la invención pueden coformularse y/o coadministrarse con uno o más anticuerpos adicionales que se unen a otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citocinas o que se unen a moléculas de la superficie celular). Más aún, puede usarse uno o más anticuerpos de la invención en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos precedentes. Dichas terapias combinadas pueden emplear ventajosamente dosificaciones menores de los agentes terapéuticos administrados, evitando de esa manera posibles toxicidades o complicaciones asociadas a las diversas monoterapias.
En determinadas modalidades, un anticuerpo contra la I L - 1 ß , o un fragmento de éste, se une a un vehículo que prolonga la vida media conocido en la técnica. Dichos vehículos incluyen, sin limitaciones, el dominio Fe, polietilenglicol y dextrano. Estos vehículos se describen, por ejemplo, en la Solicitud estadounidense con el N° de Acta 09/428082 (que actualmente es la Patente estadounidense N° 6660843), que se incorpora en la presente a modo de referencia para cualquier propósito.
En una modalidad específica, se administran secuencias de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención u otro agente profiláctico o terapéutico de la invención, para tratar, prevenir, manejar o mejorar un trastorno o uno o más de sus síntomas mediante terapia génica. La terapia de genes hace referencia a una terapia que comprende la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o que puede expresarse. En esta modalidad de la invención, los ácidos nucleicos producen el anticuerpo o el agente profiláctico o terapéutico de la invención codificado, que produce un efecto profiláctico o terapéutico.
Pueden usarse cualquiera de los métodos de terapia de genes disponibles en la técnica de acuerdo con la presente invención. Para hallar revisiones generales de los métodos de terapia génica, véanse Goldspiel et al., Clinical Pharm., 12: 488-505 (1993); Wu et al., "Delivery systems for gene therapy", Biotherapy, 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, P., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 573-596 (1993); Mulligan, R.C., Science, 260: 926- 932 (1993); y Morgan y Anderson, "Human Gene Therapy", Ann. Rev. Biochem., 62:191-217 (1993); Robinson, C, Trends Biotechnol., 11:155 (1993). Los métodos de uso común en el contexto de la tecnología del DNA recombinante se describen en Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York (1990). Se presenta una descripción detallada de los distintos métodos de terapia génica en la Publicación de Solicitud de Patente estadounidense N° US20050042664 A1, que se incorpora en la presente a modo de referencia.
Los miembros de la familia de la IL-1 (la IL-?ß y la I L- 1 a) tienen una participación critica en la patología asociada a una variedad de trastornos que comprenden elementos inmunes e inflamatorios. Es posible administrarle una proteina de unión a la IL-1 como las que se describen en la presente a un individuo para tratar dichos trastornos. En una modalidad, un trastorno que puede tratarse con un método de la invención, que comprende administrarle a un sujeto una proteína de unión a la IL-1 como las que se describen en la presente, incluye, sin limitaciones, uno del siguiente grupo: diabetes, uveitis, dolor neuropático, dolor osteoartítico, dolor inflamatorio, artritis reumática, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes autoinmune, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, escleroderma, enfermedad de injerto versus huésped, rechazo de transplante de órganos, enfermedad inmune aguda o crónica asociada al transplante de órganos, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada (DIC), enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis crónica activa, uveítís autoinmune, shock séptico, síndrome de shock tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, malignidades, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, esporádica, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II (síndrome de Schmidt), síndrome agudo de dificultad respiratoria de adultos (ARDS), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerosa, sinovitis enteropática, artropatía asociada a C lamydia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliácea, penfigoide, enfermedad por I g A lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica Coombs positiva, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes (GCA), hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (AIDS), enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia común variada (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatia dilatada, esterilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a enfermedades del tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a enfermedades del tejido conectivo mixtas, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémicas, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la artritis reumática, enfermedad pulmonar asociada al lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada a la dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada a la espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada a la hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por drogas, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterans, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar linfocítica infiltrante, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo-1 (hepatitis autoinmune o lupoide clásica), hepatitis autoinmune tipo-2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, esterilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad al esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos, incluyendo la esclerosis múltiple primaria progresiva, la esclerosis múltiple secundaria progresiva y la esclerosis múltiple recurrente remitente), oftalmía simpática, hipertensión pulmonar secundaria a una enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumática, enfermedad de Still, esclerosis sístémica, síndrome de Sjorgren, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenia autoinmune (AITP), trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroide autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primaria, uveítis facogénica, vasculitis primaria, vitíligo, enfermedad hepática aguda, enfermedad hepática crónica, cirrosis alcohólica, daño hepático inducido por alcohol, colestasis, enfermedad hepática idiosincrátíca, hepatitis inducida por drogas, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por tipo Th2 y tipo Th1, dolor agudo y crónico (distintas formas de dolor), cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga, de colon, de páncreas, de ovario, de próstata o rectal), malignidades hematopoyéticas, leucemia, linfoma, abetalipoproteinemia, acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos o crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL de las células T, ALL FAB, leucemia mieloide aguda (AML), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia del AIDS, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo a aloinjertos, déficit de alfa-1 -antitripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina pectoris, degeneración de células del asta anterior, terapia anti-CD3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arterioesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrílación auricular (sostenida o paroxística), taquicardia auricular, bloqueo aurículoventricular, linfoma de células B, rechazo de injerto óseo, rechazo de transplante de médula ósea (BMT), bloqueo de ramas de haz de His, linfoma de Burkitt, acidez estomacal, arritmias cardiacas, síndrome de atontamiento cardiaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación a una derivación, rechazo al transplante de cartílago, degeneraciones de la corteza del cerebelo, trastornos del cerebelo, taquicardia auricular caótica o multifocal, trastornos asociados a la quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CML), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), intoxicación crónica por salicilato, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis con cultivo negativo, fibrosis quística, trastornos asociados a una terapia con citocinas, demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica del dengue, dermatitis, afecciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad ateriosclerótica diabética, enfermedad de cuerpos difusos de Lewy, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos del ganglio basal, síndrome de Down en la edad madura, trastornos del movimiento inducidos por drogas que bloquean los receptores de dopamina del CNS, sensibilidad a drogas, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por el virus Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo al implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos funcionales de las arterias periféricas, sepsis fúngicas, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo a injertos de cualquier órgano o tejido, sepsis Gram-negativa, sepsis Gram-positiva, granulomas debidos a organismos intracelulares, leucemia de células pilosas, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo al transplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolitica, hemorragia, hepatitis A, arritmias del haz de His, infección por HlV/neuropatía por HIV, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimientos hiperquinéticos, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos de movimientos hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática (? P F ) , citotoxicidad mediada por anticuerpos, astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, lesiones por reperfusión isquémica, accidente cerebrovascular isquémico, artritis reumática juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo al transplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo al transplante de hígado, linfedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, cefalea de migraña de síndrome metabólico, cefalea de migraña idiopática, trastorno mitocondrial multisistémico, enfermedad del tejido conectivo mixto, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de múltiples sistemas (Menzel Dejerine-Thomas Shy-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobacterium avium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodiplástico, infarto de miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar neonatal crónica, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica, linfoma no Hodgkins, oclusión de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos arteriales oclusivos, terapia con OKT3®, orquitis/epididimitis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo al transplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia maligna, rechazo al transplante de paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad del pericardio, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía neumocistitis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal y síndrome de cambios de piel), síndrome de post-perfusión, síndrome postbomba, síndrome de cardiotomía post-MI, preeclampsia, parálisis supranuclear progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsums, taquicardia por QRS estrecho regular, hipertensión renovascular, lesión por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías seronegatívas, shock, anemia de células falsiformes, rechazo de aloinjertos de piel, síndrome de cambios de piel, rechazo al transplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelosas, miositis estreptococcica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxia sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumática juvenil de comienzo sistémico, telangiectasia, tromboangitís obliterans, trombocytopenia, toxicidad, transplantes, traumatismo/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades de las válvulas cardiacas, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado a virus, síndrome Wernicke-Korsakoff, síndrome Wilson, rechazo a xenoinjertos de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, polirradiculopatía inflamatoria desmielinizante aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, Alopecia areata, anafilaxis, síndrome de anticuerpo antifosfolipido, anemia aplásica, aterosclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado a una infección de estreptococos, enteropatía autoinmune, pérdida de la audición autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), miocarditis autoinmune, falla ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquiectasias, penfigoide bulloso, enfermedad cardiovascular, síndrome antifosfolipido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatrizal, síndrome clínicamente aislado (CIS) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico de la niñez, dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, hernia de disco, prolapso de disco, anemia hemolítica inmune inducida por drogas, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barre (GBS), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad inflamatoria infecciosa ocular, enfermedad inflamatoria desmielinizante, enfermedad inflamatoria del corazón, enfermedad inflamatoria del riñon, iritis, queratitis, queratoconjuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de las células de Langerhans, Livedo reticularis, degeneración macular, poliangitis microscópica, morbus Bechterev, trastornos neuronales motores, penfigoide de la membrana mucosa, insuficiencia multiorgánica, miastenia gravis, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de las raíces nerviosas, neuropatía, hepatitis no-A no-B, neuritis óptica, osteolisis, JRA pauciarticular, enfermedad oclusiva arterial periférica (PAOD), enfermedad vascular periférica (PVD), enfermedad arterial periférica (PAD), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, JRA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendócrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR), síndrome de post-bomba, parkinsonismo primario, prostatitis, aplasia de glóbulos rojos pura, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, restenosis, enfermedad del corazón reumático, SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, pulmón de shock, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad del tejido conectivo asociada a siliconas, dermatosis de Sneddon-Wiikinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis temporal, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversa, TRAPS (síndrome periódico asociados al receptor del factor de necrosis tumoral de tipo 1 (TNFR), resistencia a insulina tipo B con Acanthosis nigricans), reacción alérgica de Tipo 1, diabetes de Tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP), conjuntivitis vernal, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome VKH), degeneración macular húmeda, cicatrización de heridas y artropatía asociada a Yersinia y Salmonella.
Los anticuerpos y las porciones de anticuerpos de la invención pueden usarse para tratar seres humanos que padecen enfermedades autoinmunes, en particular las que están asociadas a una inflamación, artritis reumática (RA), osteoartritis, psoriasis, esclerosis múltiple (MS), y otras enfermedades autoinmunes.
Un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención también puede ser administrado con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son de utilidad en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias.
En una modalidad, las enfermedades que pueden ser tratadas o diagnosticadas con las composiciones y los métodos de la invención incluyen, sin limitaciones, cánceres primarios y metastáticos, incluyendo carcinomas de mama, colon, recto, pulmón, orofaringe, hipofaringe, esófago, estómago, páncreas, hígado, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario (incluyendo riñon, vejiga y urotelío), tracto genital femenino (incluyendo cuello uterino, útero y ovarios, y también el coriocarcinoma y la enfermedad trofoblástica gestacional), tracto genital masculino (incluyendo próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de las células germinales), glándulas endocrinas (incluyendo las glándulas tiroides, adrenal y pituitaria), y piel, así como hemangiomas, melanomas, sarcomas (incluyendo los que surgen de tejidos óseos y blandos, y también el sarcoma de Kaposi), tumores de cerebro, los nervios, los ojos y las meninges (incluyendo astrocitomas, gliomas, glioblastomas, retinoblastomas, neuromas, neuroblastomas, Schwannomas y meningiomas), tumores sólidos que surgen de tumores malignos hematopoyéticos, tales como leucemias y linfomas (linfomas de Hodgkin y no Hodgkin).
En otra modalidad, un anticuerpo de la invención, o una porción de unión al antigeno de éste, se usa para tratar el cáncer o para prevenir las metástasis de un tumor. Este tratamiento puede comprender administrar el anticuerpo, o la porción de unión al antígeno de éste, solo o en combinación con otro agente terapéutico o tratamiento, por ejemplo, la radioterapia y/o un agente quimioterapéutico.
Los anticuerpos de la invención, o las porciones de unión al antígeno de éstos, pueden combinarse con agentes que incluyen, sin limitaciones, agentes antineoplásticos, radioterapia, quimioterapia, por ejemplo, con agentes alquilantes del DNA, cisplatina, carboplatina, agentes anti-tubulina, paclitaxel, docetaxei, taxol, doxorrubicina, gemcitabina, gemzar, antraciclinas, adriamicina, inhibidores de la topoisomerasa I, inhibidores de la topoisomerasa II, 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina, irinotecano, inhibidores de la tirosin cinasa receptora (por ejemplo, erlotinib, gefitinib), inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), inhibidores de cinasas y RNApi.
Una proteína de unión de la invención también pueden administrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de varias enfermedades.
Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de éstos, pueden usarse solos o en combinación para tratar dichas enfermedades. Ha de comprenderse que los anticuerpos de la invención, o sus porciones de unión al antígeno, pueden usarse solos o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico, donde dicho agente adicional es seleccionado por aquellos versados en la técnica en función del propósito deseado. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como útil para tratar la enfermedad o la afección que se está tratando con el anticuerpo de la presente invención. El agente adicional también puede ser un agente que confiere un atributo benéfico a la composición terapéutica por ejemplo, un agente que afecta la viscosidad de la composición.
También se debería comprender que las combinaciones que se van a incluir án la presente invención son aquellas combinaciones útiles para el propósito que se le desea dar. Los agentes que se establecen más adelante se dan con propósitos de ilustración y no con intención de ser limitantes. Las combinaciones que son parte de esta invención pueden comprender los anticuerpos de la presente invención y al menos un agente adicional elegido entre las listas que se presentarán más adelante. La combinación también puede incluir más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición que se forma puede llevar a cabo la función que se le ha destinado.
Las combinaciones preferidas son droga(s) antiinflamatoria(s) no esteroidal(es) que también se denominan NSAID que incluyen drogas como el ibuprofeno. Otras combinaciones preferidas son los corticosteroides incluyendo prednisolona; los bien conocidos efectos secundarios del uso de esferoides pueden reducirse o incluso eliminarse disminuyendo la dosis requerida de esteroide cuando los pacientes son tratados con una combinación que incluye los anticuerpos a nti-l L- 1 ß de esta invención. Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para artritis reumática con los cuales pueden combinarse un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención incluyen, sin limitaciones, los siguientes: droga(s) antiinflamatoria(s) supresora(s) de citocina (CSAID); anticuerpos para otras citocinas o factores de crecimiento humanos o antagonistas de éstos, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-18, IL-21, interferones, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de éstos, pueden combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA o sus ligandos, incluyendo CD154 (gp39 o CD40L).
Las combinaciones preferidas de agentes terapéuticos pueden interferir en diferentes puntos en la cascada autoinmune y subsiguiente proceso inflamatorio; los ejemplos preferidos incluyen antagonistas de TNF como anticuerpos TNF quiméricos, humanizados o humanos, D2E7, (Publicación PCT N° WO 97/29131), CA2 (REMICADE™), CDP 571, y receptores solubles de TNF p55 o p75, derivados de éstos (p75TNFR1gG (ENBREL™) o p55TNFR1gG (Lenercept), y también inhibidores de la enzima convertidora de TNFa (TACE); de manera similar, los inhibidores de la IL-1 (Inhibidores de la enzima convertidora de lnterleuquina-1 , IL-1RA etc.) pueden ser efectivos por la misma razón. Otras combinaciones preferidas incluyen la interleuquina 11. Aún otra combinación preferida comprende otros participantes fundamentales de la respuesta autoinmune, que pueden actuar en paralelo con la función de la I L- 1 ß , de manera dependiente de ella o en combinación con ella. Aaún otra combinación preferida es una de inhibidores no agotadores anti-CD4. aún otras combinaciones preferidas incluyen antagonistas de la vía coestimulatoria de CD80 (B7.1) o de CD86 (B7.2), incluyendo anticuerpos, receptores solubles o ligandos antagonistas.
Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de éstos, también pueden combinarse con agentes tales como metotrexato, 6-MP, azatioprina sulfasalazina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina, penicilamina, aurotiomalato (intramuscular y oral), azatioprina, colchicina, corticosteroides (oral, inhalados y por inyección local), agonistas del adrenorreceptor beta-2 (salbutamol, terbutalina, salmeteral), xantinas (teofilina, aminofilina), cromoglicato, nedocromil, ketotifen, ipratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetil, leflunomida, NSAID, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias, tales como el TNFa o la IL-1 (por ejemplo, IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de MAP cinasa), inhibidores de la enzima convertidora de IL-?ß, inhibidores de la enzima convertidora de TNFa (TACE), inhibidores de la señalización de células T tales como inhibidores de cinasas, inhibidores de metaloproteinasas, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citocinas y derivados de éstos (por ejemplo, receptores de TNF solubles, p55 o p75 y los derivados p75TNFRIgG (EnbrelTm y p55TNFRIgG (Lenercept)), slL-1RI, slL-1RII, SIL-6R), citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGFP), celecoxib, ácido fólico, sulfato de hidroxicloroquina, rofecoxib, etanercept, infliximab, naproxeno, valdecoxib, sulfasalazina, metilprednisolona, meloxicam, acetato de metilprednisolona, tiomalato de oro y sodio, aspirina, triamcinolona acetonida, napsilato de propoxifeno/apap, folato, nabumetona, diclofenaco, piroxicam, etodolaco, diclofenaco sódico, oxaprozina, clorhidrato de oxicodona, bitartrato de hidrocodona/apap, diclofenaco sódico/misoprostol, fentanilo, anakinra recombinante humano, clorhidrato de tramadol, salsalato, sulindac, cianocobalamina/fa/piridoxina, acetaminofeno, alendronato sódico, prednisolona, sulfato de morfina, clorhidrato de lidocaina, indometacina, sulfato de glucosamina/condroitina, clorhidrato de amitriptilina, sulfadiazina, clorhidrato de oxicodona/acetaminofeno, clorhidrato de olopatadina, misoprostol, naproxeno sódico, omeprazol, ciclofosfamida, rituximab, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, anti-IL-18, anti-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX740, Roflumilast, IC-485, CDC-801 y Mesopram. Las combinaciones preferidas incluyen metotrexato o leflunomida y en casos de artritis reumática moderada o severa cases, ciclosporina.
Los agentes adicionales no limitantes que también pueden usarse para tratar la artritis reumática incluyen, sin limitaciones, las siguientes drogas: las drogas antünflamatorias no esteroidales (NSAID), las drogas antiinflamatorias supresoras de citocinas (CSAID), CDP-571/BAY-10-3356 (un anticuerpo anti-TNFa humanizado, Celltech/Bayer), cA2/infliximab (un anticuerpo anti-TNFa quimérico, Centocor), TNFR de 75 kd-lgG/etanercept (una proteína de fusión del TNF de 75 kD con IgG, Immunex; véanse, por ejemplo, Moreland et al. (Resumen N° 813), Arthritis Rheum., 37: S295 (1994), Baumgartner et al., J. Invest. Med., 44(3): 235A (Mazo de 1996)), TNF de 55 kd-lgG (una proteína de fusión del TNF de 55 kD con IgG; Hoffmann-LaRoche), IDEC-CE9.1/SB 210396 (un anticuerpo anti-CD4 no agotador primatizado; I DEC/SmithKIine; véase, por ejemplo, Kaine et al. (Resumen N° 195), Arthritis Rheum., 38: S185 (1995)), DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2 (proteínas de fusión de IL-2; Seragen; véase, por ejemplo, Sewell et al., Arthritis Rheum., 36(9): 1223-1233 (Septiembre de 1993)), Anti-Tac (un anticuerpo anti-IL-2Ra humanizado; Proteína Design Labs/Roche), IL-4 (una citocina antünflamatoria; DNAX/Schering), IL-10 (SCH 52000, IL-10 recombinante, citocina antiinflamatoria; DNAX/Schering), IL-4, agonistas de IL-10 y/o de IL-4 (por ejemplo, anticuerpos agonistas), IL-1RA (un antagonista del receptor de IL-1; Synergen/Amgen), anakinra (Kineret®/Amgen), TNF-bp/s-TNF (una proteína de unión al TNF soluble; véanse, por ejemplo, Evans et al. (Resumen N° 1540), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S284 (1996), Kapadia et al., Amer. J. Physiol. -Heart and Circulatory Physiology, 268: H517-H525 (1995)), RP73401 (un inhibidor de la fosfodiesterasa tipo IV; véase, por ejemplo, Chikanza et al. (Resumen N° 1527), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S282 (1996)), MK-966 (un inhibidor de COX-2; véase, por ejemplo, Erich et al. (Resúmenes N° 328 y 329), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S81 (1996)), lloprost (véase, por ejemplo, Scholz, P. (Resumen N° 336), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S82 (1996)), el metotrexato, la talidomida (véase, por ejemplo, Lee et al. (Resumen N° 1524), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S282 (1996)) y las drogas relacionadas con la talidomida (por ejemplo, Celgen), la leflunomida (un antiinflamatorio y un inhibidor de citocinas; véanse, por ejemplo, Finnegan et al. (Resumen N° 627), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S131 (1996), Thoss et al., Inflamm. Res., 45: 103-107 (1996)), el ácido tranexámico (un inhibidor de la activación del plasminógeno; véase, por ejemplo, Ronday et al. (Resumen N° 1541), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S284 (1996)), T-614 (un inhibidor de citocinas; véase, por ejemplo, Hará et al. (Resumen N° 1526), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S282 (1996)), la prostaglandina E1 (véase, por ejemplo, Moriuchi et al. (Resumen N° 1528), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S282 (1996)), Tenidap (una droga antiinflamatoria no esferoidal; véase, por ejemplo, Guttadauria, M. (Resumen N° 1516), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S280 (1996)), el naproxeno (una droga antiinflamatoria no esteroidal; véase, por ejemplo, Fiebich et al., Neuro Report, 7: 1209-1213 (1996)), el meloxicam (una droga antiinflamatoria no esteroidal), el ¡Ibuprofeno (una droga antünflamatoria no esteroidaí), el piroxicam (una droga antiinflamatoria no esferoidal), el diclofenaco (una droga antiinflamatoria no esferoidal), la indometacina (una droga antiinflamatoria no esteroidaí), la sulfasalazina (véase, por ejemplo, Farr et al. (Resumen N° 1519), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S281 (1996)), la azatioprina (véase, por ejemplo, Hickey et al. (Resumen N° 1521), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S281 (1996)), un inhibidor de la ICE (inhibidor de la enzima convertidora de interleuquina-1 ß), un inhibidor de zap-70 y/o de Ick (un inhibidor de la tirosina cinasa zap-70 o de Ick), un inhibidor del VEGF y/o un inhibidor del VEGF-R (inhibidores del factor de crecimiento vascular endotelial o del receptor del factor de crecimiento vascular endotelial, inhibidores de la angiogénesis), las drogas antiinflamatorias corticosteroidales (por ejemplo, SB203580), los inhibidores de la convertasa del TNF, los anticuerpos anti-IL-12, los anticuerpos anti-IL-18, los inhibidores de la interleuquina--11 (véase, por ejemplo, Keith Jr. et al. (Resumen N° 1613), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S296 (1996)), los inhibidores de la interleuquina-13 (véase, por ejemplo, Bessis et al. (Resumen N° 1681), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S308 (1996)), los inhibidores de la interleuquina-17 (véase, por ejemplo, Lotz et al. (Resumen N° 559), Arthritis Rheum., 39(9) (suplemento): S120 (1996)), el oro, la penicillamina, la cloroquina, el clorambucil, la hidroxicloroquina, las ciclosporinas, la ciclofosfamida, la irradiación linfática total, la globulina anti-timocitos, los anticuerpos anti-CD4, las toxinas CD5, los péptidos de administración oral, el colágeno, el lobenzarit disósido, los agentes reguladores de citocinas (CRA) HP228 y HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.), los oligo-deoxinucleótidos de fosforotioato antisentido de ICAM-1 (ISIS 2302, Isis Pharmaceuticals, Inc.), el receptor del complemento soluble 1 (TP10, T Cell Sciences, Inc.), la prednisona, la orgoteína, el polisulfato de glicosaminoglicano, la minociclina, los anticuerpos anti-IL2R, los lípidos marinos y botánicos (ácidos grasis derivados de pescado o de semillas de plantas; véase, por ejemplo, DeLuca et al., Rheum. Dis. Clin. North Am., 21: 759-777), la auranofina, la fenilbutazona, el ácido meclofenámico, el ácido flufenámico, la globulina inmune intravenosa, el zileuton, la azaribina, el ácido micofenólico (RS-61443), el tacrolimus (FK-506), el sirolimus (la rapamicina), la amiprilosa (terafectina), la cladribina (2-clorodeoxiadenosina), los inhibidores de bcl-2 (véase Bruncko, Milán et al., Journal of Medicinal Chemistry (2007), 50(4), 641-662), los antivirales y los agentes moduladores del sistema inmune.
En una modalidad, la proteína de unión o la porción de unión al antígeno de ésta se administra en combinación con uno de los siguientes agentes para el tratamiento de artritis reumática (RA): inhibidor de moléculas pequeñas de KDR, inhibidor de moléculas pequeñas de Tie-2; metotrexato; prednisona; celecoxib; ácido fólico; sulfato de hidroxicloroquina; rofecoxib; etanercept; infliximab; lefunomida; naproxeno; valdecoxib; sulfasalazina; metilprednisolona; ibuprofeno; meloxicam; acetato de metilprednisolona; tiomalato de oro y sodio; aspirina; azatioprina; triamcinolona acetonida; napsilato de propoxifeno/apap; folato; nabumetona; diclofenaco; piroxicam; etodolaco; diclofenaco sódico; oxaprozina; clorhidrato de oxicodona; bitartrato de hidrocodona/apap; diclofenaco sódico/misoprostol; fentanilo; anakinra recombinante humano; clorhidrato de tramadol; salsalato; sulindac; cianocobalamina/fa/piridoxina; acetaminofeno; alendronato sódico; prednisolona; sulfato de morfina; clorhidrato de lidocaína; indometacina; sulfato de glucosamina/condroitina; ciclosporina; clorhidrato de amitriptilina; sulfadiazina; clorhidrato de oxicodona/acetaminofeno; clorhidrato de olopatadina; misoprostol; naproxeno sódico; omeprazol; micofenolato mofetil; ciclofosfamida; rituximab; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-18 BP; IL-1 ß/23; anti-IL 18; anti-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; Roflumilast; IC-485; CDC-801; y mesopram.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para el síndrome de intestino irritable con los cuales pueden combinarse una proteína de unión de la invención incluyen los siguientes: budenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticosteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de la lipooxigenasa; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores del tromboxano; antagonistas del receptor de IL-1; anticuerpos monoclonales a nti-l L- 1 ß ; anticuerpos monoclonales anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de la elastasa; compuestos de piridinil-imidazol; anticuerpos o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento humanos, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-1 ß, IL-18, EMAP-II, G -CSF, FGF y PDGF. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de éstos, pueden combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos. Los anticuerpos de la invención, o las porciones de unión al antígeno de éstos, también pueden combinarse con agentes tales como metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, mofetil micofenolato, leflunomida, NSAID, por ejemplo, ibuprofeno, corticosteroides, tales como prednisolona, inhibidores de la fosfodiesterasa, agonistas de la adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, agentes que interfieren con la señalización de citocinas proinflamatorias, tales como el TNFa o la IL-1 (por ejemplo, inhibidores de IRAK, NIK, IKK, p38 o la MAP cinasa), inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 ß , inhibidores de la enzima convertidora de TNFa, inhibidores de la señalización de las células T, tales como inhibidores de cinasas, inhibidores de metaloproteinasas, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores de citocinas solubles y derivados de éstos (por ejemplo, receptores solubles de p55 o p75 TNF, sIL-IRI, sIL-IRII, slL-6R), y citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGF ), e inhibidores de bcl-2.
Los ejemplos de agentes terapéuticos para la enfermedad de Crohn con los cuales puede combinarse una proteina de unión incluyen los siguientes: antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, ADALIMUMAB (Publicación PCT N° WO 97/29131; HUMIRA®), CA2 (REMICADE), CDP 571, construcciones de TNFR-lg, inhibidores de p75TNFRIgG (ENBREL®) y p55TNFRIgG (LENERCEPT™), e inhibidores de PDE4. Los anticuerpos de la invención, o porciones de unión al antígeno de éstos, pueden combinarse con corticosteroides, por ejemplo, budenosida y dexametasona. Las proteínas de unión de la invención o porciones de unión al antígeno de éstos, también pueden combinarse con agentes tales como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y olsalazina, y agentes que interfieren con la síntesis o acción de citocinas proinflamatorias tales como la IL-1, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de IL-1 e IL-1 ra. Los anticuerpos de la invención, o una porción de unión al antígeno de éste, también puede usarse con inhibidores de la señalización de células T, por ejemplo, inhibidores de tirosina de las cinasa 6-mercaptopur¡nas. Las proteínas de unión de la invención, o porciones de unión al antígeno de éstos, pueden combinarse con la IL-11. Las proteínas de unión de la invención, o porciones de unión al antígeno de éstos, pueden combinarse con mesalamina, prednisona, azatioprina, mercaptopurina, infliximab, metilprednisolonsuccinato de sodio, difenoxilato/sulfato de atropina, clorhidrato de loperamida, metotrexato, omeprazol, folato, ciprofloxacina/dextrosa-agua, bitartrato de hidrocodona/apap, clorhidrato de tetraciclina, fluocinonida, metronidazol, timerosal/ácido bórico, colestíramina/sacarosa, clorhidrato de ciprofoxacina, sulfato de hiosciamina, clorhidrato de meperidina, clorhidrato de midazolam, clorhidrato de oxicodona/acetaminofeno, clorhidrato de prometazina, fosfato de sodio, sulfametoxazol/trimetoprim, celecoxib, policarbofilo, napsilato de propoxifeno, hídrocortisona, multivitaminas, balsalazída disódica, fosfato de codeína/apap, clorhidrato de colesevelam, cianocobalamina, ácido fólico, levofloxacina, metilprednisolona, natalizumab e interferón-gamma.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la esclerosis múltiple (MS) con los cuales pueden combinarse una proteina de unión de la invención incluyen los siguientes. Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple con los cuales pueden combinarse un compuesto de la fórmula I incluyen los siguientes: corticoesteroides; prednisolona; metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; ciclosporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferón-ß? a (Avonex®; Biogen);- interferón-ß? b (Betaseron®; Chiron/Berlex); interferón a-n3) (Interferon Sciences/Fujimoto), interferón-a (Alfa Wassermann/J&J), interferón ß1?-IF (Serono/lnhale Therapeutics), Peglnterferon a 2b (Enzon/Schering-Plough), Copolímero 1 (Cop-1; Copaxone®; Teva Pharmaceutical Industries, Inc).; oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabríbine; anticuerpos para otras citocinas o factores de crecimiento humanos o antagonistas de éstos y sus receptores, por ejemplo, TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-?ß, IL-23, IL-15, IL-16, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF. Las proteínas de unión de la invención pueden combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular, tales como CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80, CD86, CD90, o sus ligandos. Las proteínas de unión de la invención también pueden combinarse con agentes tales como el metotrexato, la ciclosporina, FK506, la rapamicina, el micofenolato de mofetil, la leflunomida, los NSAID, por ejemplo, el ¡buprofeno, los corticosteroides, tales como la prednisolona, los inhibidores de la fosfodiesterasa, los agonistas de la adensosina, los agentes antitrombóticos, los inhibidores del complemento, los agentes adrenérgicos, los agentes que interfieren con la señalización por citocinas proinflamatorias, tales como el TNFa o la IL-1 (por ejemplo, inhibidores de las cinasas IRAK, NIK, IKK, p38 o MAP), los inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 , inhibidores de TACE, los inhibidores de la señalización de las células T, tales como los inhibidores de cinasas, los inhibidores de metaloproteínasas, la sulfasalazina, la azatioprina, las 6-mercaptopurinas, los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, los receptores de citocinas solubles, y sus derivados (por ejemplo, receptores de TNF p55 o p75 solubles, slL-1RI, sIL-IRII, slL-6R), y las citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGFp) e inhibidores de bcl-2.
Los ejemplos preferidos de agentes terapéuticos para esclerosis múltiple con los que pueden combinarse proteínas de unión de la invención para incluir interferón-ß, son por ejemplo, IFN la y IF^1b; copaxone, corticoesteroides, inhibidores de caspasa, por ejemplo, inhibidores de caspasa-1, inhibidores de la IL-1, inhibidores de TNF, y anticuerpos para los ligandos CD40 y CD80.
Las proteínas de unión de la invención también pueden combinarse con agentes tales como alemtuzumab, dronabinol, unimed, daclizumab, mitoxantrona, clorhidrato de xaliproden, fampridina, acetato de glatiramer, natalizumab, sinnabidol, a-inmunoquina NNS03, ABR- 215062, AnergiX.MS, antagonistas del receptor de quimioquina, BBR-2778, calagualina, CPI-1189, LEM (mitoxantrona encapsulada en liposomas), THC.CBD (agonista de canabinoides) MBP-8298, mesopram (inhibidor de PDE4), MNA-715, anticuerpo contra el receptor de anti-IL-6, neurovax, pirfenidone allotrap 1258 (RDP-1258), sTNF-R1, talampanel, teriflunomida, TGF-beta2, tiplimotida, antagonistas de VLA-4 (por ejemplo, TR-14035, VLA4 Ultrahaler, Antegran-ELAN/Biogen), antagonistas del interferón gamma, agonistas de la IL-4.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la Angina con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: aspirina, nitroglicerina, mononitrato de isosorbide, succinato de metoprolol, atenolol, tartrato de metoprolol, besilato de amlodipina, clorhidrato de diltiazem, dinitrato de isosorbide, bisulfato de clopidogrel, nifedipina, atorvastatina cálcica, cloruro de potasio, furosemide, simvastatina, verapamil HCI, digoxina, clorhidrato de propranolol, carvedilol, lisinoprilo, espironolactona, hidroclorotiazida, maleato de enalapril, nadolol, ramiprilo, enoxaparin sódico, heparina sódica, valsarían, clorhidrato de sotalol, fenofibrato, ezetimibe, bumetanide, losarían potásico, lisinopril/hidroclorotiazida, felodipina, captoprilo y fumarato de bisoprolol.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la Spondilitis Anquilosante con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: ibuprofeno, diclofenaco, misoprostol, naproxeno, meloxicam, indometacina, diclofenaco, celecoxib, rofecoxib, sulfasalazina, metotrexato, azatioprina, minociclina, prednisona, etanercept e infiximab.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para el Asma con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes. Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para asma con los cuales pueden combinarse un compuesto de la fórmula I incluyen los siguientes: albuterol, salmeterol/fluticasona, montelukast sódico, propionato de fluticasona, budesonide, prednisona, xinafoato de salmeterol, levalbuterol HCI, albuterol sulfato/ipratropio, prednisolona fosfato de sodio, triancinolona acetonida, dipropionato de beclometasona, bromuro de ipratropio, azitromicina, acetato de pirbuterol, prednisolona, teofilina anhidra, metilprednisolona succinato de sodio, claritromicina, zafirlukast, fumarato de formoterol, vacuna para el virus de la gripe, trihidrato de amoxicilina, flunisolide, inyecciones para alergias, cromolyn sódico, clorhidrato de fexofenadine, flunisolide/mentol, amoxicilina/clavulanato, levofloxacina, dispositivo para asistencia de inhalación, guaifenesina, dexametasona fosfato de sodio, moxifloxacina HCI, doxiciclina hidrato, guaifenesina/d-metorphan, p-efedrina/cod/clorfenir, gatifloxacina, clorhidrato de cetirizine, mometasona furoato, xinafoato de salmeterol, benzonatato, cefalexina, pe/hidrocodona/clorfenir, cetirizine HCI/pseudoefedrina, fenilefrina/cod/prometazina, codeína/prometazina, cefprozilo, dexametasona, guaifenesina/pseudoefedrina, clorfeniramina/hidrocodona, nedocromil sódico, sulfato de terbutalina, epinefrina, metilprednisolona y metaproterenol sulfato.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para COPD con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: albuterol sulfato/ipratropio, bromuro de ipratropio, salmeterol/fluticasona, albuterol, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, prednisona, teofilina anhidra, metilprednisolona succinato de sodio, montelukast sódico, budesonide, fumarato de formoterol, triancinolona acetonida, levofloxacina, guaifenesina, azitromicina, dipropionato de beclometasona, levalbuterol HCI, flunisolide, ceftriaxone sódico, trihidrato de amoxicilina, gatifloxacina, zafirlukast, amoxicilina/clavulanato, flunisolide/mentol, clorfeniramina/hidrocodona, metaproterenol sulfato, metilprednisolona, mometasona furoato, p-efedrina/cod/clorfenir, acetato de pirbuterol, p-efedrina/loratadina, sulfato de terbutalina, tiotropio bromuro, (R,R)-formoterol, TgAAT, cilomilast, roflumilast.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para HCV con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: interferón-a-2a, interferón-a-2b, interferón-a con1, interferón-a-n1 , interferón-a-2a tratado con PEG, interferón-a-2b tratado con PEG, ribavirina, peginterferon alfa-2b + ribavirina, ácido ursodesoxicólico, ácido glicirrícico, timalfasina, Maxamína, VX-497 y cualquier compuesto que se utilice para tratar HCV con intervención con los siguientes objetivos: polimerasa del HCV, proteasa del HCV, helicasa del HCV, e IRES del HCV (sitio de entrada interna del ribosoma).
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la Fibrosis Pulmonar Idiopática con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: prednisona, azatioprina, albuterol, colchicina, sulfato de albuterol, digoxina, interferón gamma, metilprednisolona sod succ, lorazepam, furosemida, lisinopril, nitroglicerina, espironolactona, ciclofosfamida, bromuro de ipratropio, actinomicina d, alteplasa, propionato de fluticasona, levofloxacina, sulfato de metaproterenol, sulfato de morfina, oxicodona HCI, cloruro de potasio, tramcinolona, acetonida, tacrolimus anhidro, calcio, interferó-alfa, metotrexato, micofenolato, mofetil e interferón gamma 1 ß.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para el Infarto del Miocardio con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para infarto de miocardio con los cuales pueden combinarse un compuesto de la fórmula (I) incluyen los siguientes: aspirina, nitroglicerina, tartrato de metoprolol, enoxaparin sódico, heparina sódica, bisulfato de clopidogrel, carvedilol, atenolol, sulfato de morfina, succinato de metoprolol, warfarina sódica, lisinoprilo, mononitrato de isosorbide, digoxina, furosemide, simvastatina, ramiprilo, tenecteplase, maleato de enalapril, torsemide, retavase, losartan potásico, quinapril HCI/mag carb, bumetanide, alteplase, enalaprilat, amiodarone clorhidrato, tirofiban HCI m-hidrato, clorhidrato de diltiazem, captoprilo, irbesartan, valsartan, clorhidrato de propranolol, fosinopril sódico, clorhidrato de lidocaína, eptifibatide, cefazolin sódico, sulfato de atropina, ácido aminocaproico, espironolactona, interferón, clorhidrato de sotalol, cloruro de potasio, docusato sódico, dobutamina HCI, alprazolam, pravastatin sódico, atorvastatina cálcica, clorhidrato de midazolam, clorhidrato de meperidina, dinitrato de isosorbide, epinefrina, dopamina clorhidrato, bivalirudin, rosuvastatina, ezetimibe/simvastatina, avasimibe, y cariporide.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la Psoriasis con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: KDR, pequeña molécula inhibidora de Tie-2, calcipotrieno, propionato de clobetasol, triancinolona acetonida, propionato de halobetasol, tazaroteno, metotrexato, fluocinonide, betametasona diprop aumentada, fluocinolona acetonida, acitretin, shampú de alquitrán, valerato de betametasona, mometasona furoato, ketoconazol, pramoxine/fluocinolona, valerato de hidrocortisona, flurandrenolide, urea, betametasona, clobetasol propionato/emoll, propionato de fluticasona, azitromicina, hidrocortisona, fórmula humectante, ácido fólico, desonide, pimecrolimus, alquitrán de carbón, diacetato de diflorasona, etanorcept folato, ácido láctico, metoxsalen, hc/bismuto subgal/znox/resor, acetato de metílprednisolona, prednisona, pantalla solar, halcinonide, ácido salicílico, antralina, pivalato de clocortolona, extracto de carbón mineral, alquitrán de carbón/ácido salicílico, alquitrán de carbón/ácido salicílico/azufre, desoximetasona, diazepam, emoliente, fluocinonide/emoliente, aceite mineral/aceite de castor/na lact, aceite mineral/aceite de maní, petróleo/miristato de isopropilo, psoralen, ácido salicílico, jabón/tribromsalan, timerosal/ácido bórico, celecoxib, ¡nfliximab, ciclosporina, alefacept, efalizumab, tacrolimus, pimecrolimus, PUVA, UVB, y sulfasalazina.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la Artritis Psoriática con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: metotrexato, etanorcept, rofecoxib, celecoxib, ácido fólico, sulfasalazina, naproxeno, leflunomide, acetato de metilprednisolona, indometacina, sulfato de hidroxicloroquina, prednisona, sulindac, betametasona diprop aumentada, infliximab, metotrexato, folato, triancinolona acetonida, diclofenaco, dimetilsulfóxido, piroxicam, diclofenaco sódico, ketoprofeno, meloxicam, metilprednisolona, nabumetona, tolmetín sódico, calcipotrieno, ciclosporina, diclofenaco sódico/misoprostol, fluocinonide, sulfato de glucosamina, tiomalato sódico de oro, hidrocodona bitartrato/apap, ibuprofeno, risedronato sódico, sulfadiazina, tioguanina, valdecoxib, alefacept, efalizumab e inhibidores de bcl-2.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la Restenosis con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: sirolimus, paclitaxel, everolimus, tacrolimus, Zotarolimus y acetaminofeno.
Los ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos para la Ciática con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: hidrocodona bitartrato/apap, rofecoxib, ciclobenzaprina HCI, metilprednisolona, naproxeno, ibuprofeno, oxicodona HCI/acetaminofeno, celecoxib, valdecoxib, acetato de metilprednisolona, prednisona, fosfato de codeína/apap, tramadol HCI/acetaminofeno, metaxalona, meloxicam, metocarbamol, clorhidrato de lidocaína, diclofenaco sódico, gabapentin, dexametasona, carisoprodol, ketorolac trometamina, indometacina, acetaminofeno, diazepam, nabumetona, oxicodona HCI, tizanidina HCI, diclofenaco sódico/misoprostol, propoxifeno napsilato/apap, asa/oxicod/oxicodona ter, ¡buprofeno/hidrocodona bit, tramadol HCI, etodolaco, propoxifeno HCI, amitripti!ina HCI, carisoprodol/codeina fos/asa, sulfato de morfina, multivitaminas, naproxeno sódico, citrato de orfenadrina, y temazepam.
Los ejemplos de agentes terapéuticos para SLE (Lupus) con los cuales pueden combinarse proteínas de unión de la invención incluyen los siguientes: NSAID, por ejemplo, diclofenaco, naproxeno, ibuprofeno, piroxicam, indometacina; inhibidores de COX2, por ejemplo, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib; anti-malaria, por ejemplo, hidroxicloroquina; esteroides, por ejemplo, prednisona, prednisolona, budenoside, dexametasona; citotóxicos, por ejemplo, azatioprina, ciclofosfamida, micofenolato mofetilo, metotrexato; inhibidores de PDE4 o inhibidor de la síntesis de purina, por ejemplo, Cellcept®. Las proteínas de unión de la invención también pueden combinarse con agentes tales como sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico, olsalazina, Imuran y agentes que interfieren con la síntesis, producción o acción de citocinas proinflamatorias tales como la IL-1, por ejemplo, inhibidores de caspasa como inhibidores de la enzima convertidora de I L- 1 ß y I L-1 ra . Proteínas de unión de la invención también pueden usarse con inhibidores de la señalización de las células T, por ejemplo, inhibidores de la tirosina cinasa, o con moléculas dirigidas a la activación de las células T, por ejemplo, CTLA-4-lgG o anticuerpos de la familia anti-B7, anticuerpos de la familia anti-PD-1. Proteínas de unión de la invención pueden combinarse con la IL-11 o anticuerpos anti-citocinas, por ejemplo, fonotolizumab (un anticuerpo anti-IFNg), o anticuerpos anti-receptores, por ejemplo, anticuerpos contra el receptor de IL-6 y anticuerpos contra las moléculas de la superficie de las células B. Los anticuerpos de la invención, o las porciones de unión al antígeno de éstos, también pueden usarse con LJP 394 (abetimus), agentes que agotan o inactivan las células B, por ejemplo, Rituximab (un anticuerpo anti-CD20), linfostat-B (un anticuerpo anti-BlyS), antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, Adalimumab (Publicación PCT N° WO 97/29131; HUMIRA®), CA2 (REMICADE®), CDP 571, construcciones de TNFR-lg (p75TNFRIgG (ENBREL®) y p55TNFRIgG (Lenercept®)), e inhibidores de bcl-2, ya que se ha demostrado que la sobreexpresión de bcl-2 en ratones transgénicos provoca un fenotipo similar al lupus (véase Marquina, Regina et al., Journal of Immunology (2004), 172(11), 7177-7185), por lo que se espera que su inhibición tenga efectos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad eficaz para el uso terapéutico" o una "cantidad eficaz para el uso profiláctico" de un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad eficaz para el uso terapéutico" hace referencia a una cantidad eficaz, a dosificaciones y por los períodos de tiempo necesarios para obtener el resultado terapéutico deseado. Una cantidad eficaz para el uso terapéutico del anticuerpo o la porción de anticuerpo puede ser determinada por un aquellos versados en la técnica y puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o la porción de anticuerpo de producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz para el uso terapéutico también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o la porción de anticuerpo es superado por los efectos terapéuticos beneficiosos. Una "cantidad eficaz para el uso profiláctico" hace referencia a una cantidad eficaz, a dosificaciones y por los períodos de tiempo necesarios para obtener el resultado profiláctico deseado. Típicamente, dado que se usa una dosis profiláctica en los sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad eficaz para el uso profiláctico será menor que la cantidad eficaz para el uso terapéutico.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proveer la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas en el tiempo o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente según lo indican las exigencias de la situación terapéutica. Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y mayor uniformidad de dosificación. La forma de dosificación individual, como se la usa en la presente, hace referencia a unidades físicamente discretas, apropiadas para dosificaciones individuales en los sujetos mamíferos a tratar; donde cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico que se requiera. La especificación para la forma de dosificación individual de la invención está dictada y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se desea obtener, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de las composiciones de un compuesto activo tal para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.
Se debe tener en cuenta que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la severidad de la afección a aliviar. También ha de comprenderse que, para un sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el correr del tiempo, de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional del encargado de administrar o supervisar la administración de las composiciones, y que los rangos de dosificación que se indican en la presente solamente se presentan a modo de ejemplo y no han de limitar el alcance o la práctica de la composición que se reivindica.
Diagnóstico En la presente también se proveen aplicaciones de diagnóstico. Esto se explica con mayor detalle a continuación. Los anticuerpos que se unen a la l L- ß de la invención pueden emplearse en cualquiera de los diversos formatos que permiten detectar I L- 1 ß in vivo, in vitro o ex vivo (es decir, en células o tejidos que se han obtenido de un individuo vivo, que han sido sometidos a un procedimiento y luego han sido colocados nuevamente en el individuo). Las DVD-lg de la invención ofrecen la ventaja adicional de poder unirse a un epitope de la IL-?ß, así como a otros antígenos o epitopes en diversos formatos de diagnóstico y de ensayo de detección.
I. Método de ensayo En esta invención también se provee un método para determinar la presencia, la cantidad o la concentración de una I L- 1 ß o de un fragmento de ésta (el "analito") en una muestra de prueba, que comprende usar al menos una proteína de unión anti-l L- 1 ß o una porción de unión al antígeno de ésta, lo que abarca una DVD-lg, según se describe en la presente. En el método puede usarse cualquier ensayo apropiado conocido en la técnica. Entre los ejemplos se incluyen, sin limitaciones, el inmunoensayo, tal como un ¡nmunoensayo en sándwich (por ejemplo, los inmunoensayos en sándwich con anticuerpos monoclonales o policlonales y/o con DVD-lg, o cualquier variación de éstos (por ejemplo, con anticuerpos monoclonales/DVD-lg, con DVD-lg/anticuerpos policlonales, etcéter), lo que abarca la detección con radioisótopos (el radioinmunoensayo (RIA)) y la detección enzimática (el inmunoensayo enzimático (EIA) o el ensayo ¡nmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) (por ejemplo, los ensayos de Quantikine ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN)), el inmunoensayo de inhibición competitiva (por ejemplo, directa e inversa), el inmunoensayo de polarización fluorescente (FPIA), las técnicas de ¡nmunoensayo con multiplicación enzimática (EMIT), la transferencia de energía de resonancia bioluminiscente (BRET), el ensayo quimioluminiscente homogéneo, etcétera. En un inmunoensayo basado en SELDI, se adhiere un reactivo de captura que une específicamente un analito (o un fragmento de éste) de interés a la superficie de una sonda para espectrometría de masa, tal como un arreglo en chip de proteína preactivada. Por consiguiente, el analito (o el fragmento de éste) se captura específicamente sobre el biochip y se detecta su captura (o la captura de un fragmento de éste) por espectrometría de masa. Como alternativa, el analito (o el fragmento de éste) puede eluirse desde el reactivo de captura y detectarse por medio de MALDI tradicional (desorción/ionización láser asistida por matriz) o mediante SELDI. Un inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscente, en particular uno que emplea el analizador automático ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), es un ejemplo de un inmunoensayo preferido.
En la práctica de la presente invención se usan métodos bien conocidos en la técnica para recolectar, manipular y procesar orina, sangre, suero y plasma y otros fluidos corporales, por ejemplo, cuando se emplea una proteína de unión a nti-l L-1 ß como las que se describen en la presente como reactivo de inmunodiagnostico y/o en un conjunto de elementos para el inmunoensayo de un analito. La muestra de prueba puede comprender otros grupos además del analito de interés, tales como anticuerpos, antigenos, haptenos, hormonas, drogas, enzimas, receptores, proteínas, péptidos, polipéptidos, oligonucleótidos y/o polinucleótidos. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre completa obtenida de un sujeto. Puede ser necesario o deseable que una muestra de prueba, en particular la sangre completa, se trate antes del inmunoensayo como se describe en la presente, por ejemplo, con un reactivo de pretratamiento. Incluso en los casos en lo que no es necesario un pretratamiento (por ejemplo, en la mayoría de las muestras de orina), opcionalmente puede realizarse un pretratamiento (por ejemplo, como parte de un régimen en una plataforma comercial).
El reactivo de pretratamiento puede ser cualquier reactivo apropiado para usar con el inmunoensayo y los conjuntos de elementos de la invención. El pretratamiento comprende opcionalmente: (a) uno o más solventes (por ejemplo, metanol y etilenglicol) y opcionalmente, sal, (b) uno o más solventes y sal, y opcionalmente, detergente, (c) detergente, o (d) detergente y sal. Los reactivos de pretratamiento son conocidos en la técnica, y dicho pretratamiento puede emplearse, por ejemplo, como se usa para los ensayos en analizadores Abbott TDx, AxSYM®, y ARCHITECT® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), como se describe en la literatura (véase, por ejemplo, Yatscoff et al., Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36: Chem., 36: 1969-1973 (1990), y Wallemacq et al., Evaluation ofr the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: Chem., 45: 432-435 (1999)), y/o como los comercialmente disponibles. Adicionalmente, el pretratamiento puede realizarse como se describe en la Patente estadounidense N° 5135875, de Abbott, en la Publicación Europea N° EP 0471 293, en la Publicación PCT N° WO 2008/082984 y en la Publicación estadounidense N° 2008/0020401 (que se incorporan a modo de referencia en su totalidad, con relación a las descripciones del pretratamiento). El reactivo de pretratamiento puede ser un reactivo heterogéneo o un agente homogéneo.
Con el uso de un reactivo de pretratamiento heterogéneo, el reactivo de pretratamiento precipita la proteína de unión al analito (por ejemplo, la proteína que puede unirse a un analito o a un fragmento de éste) presente en la muestra. Dicho paso de pretratamiento comprende eliminar cualquier proteína de unión al analito mediante la separación de la proteína de unión al analito precipitada del sobrenadante de la mezcla que se forma mediante el agregado del agente de pretratamiento a la muestra. De dicho modo, en el ensayo se usa el sobrenadante de la mezcla carente de cualquier proteína de unión, procediendo directamente al paso de captura con anticuerpo.
Con el uso de un reactivo de pretratamiento homogéneo no existe dicho paso de separación. Se ponen en contacto la mezcla entera de muestra de prueba y reactivo de pretratamiento con un miembro marcado de unión específica para el analito (o un fragmento de ésta), tal como un anticuerpo anti-analito (o fragmento antígénicamente reactivo de éste) marcado. El reactivo de pretratamiento que se emplea para dicho ensayo típicamente se diluye en la mezcla con muestra de prueba pretratada, ya sea antes o durante la captura mediante el primer miembro de unión específica. A pesar de dicha dilución, aún hay presente (o permanece) una cierta cantidad del reactivo de pretratamiento en la mezcla de muestra de prueba durante la captura. De acuerdo a la invención, un miembro de unión específica marcada preferido puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta).
En un formato heterogéneo, una vez que se obtiene la muestra de prueba de un sujeto, se prepara una primera mezcla. La mezcla contiene la muestra de prueba en la que se desea evaluar la presencia de un analito (o un fragmento de éste) y un primer miembro de unión específica, donde el primer miembro de unión específica y cualquier analito contenido en la muestra de prueba forman un complejo. Preferiblemente, el primer miembro de unión específica es un anticuerpo anti-analito o un fragmento de éste. El primer miembro de unión específica puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta) como se describe en la presente. El orden en que se agregan la muestra de prueba y el primer miembro de unión específica, para formar la mezcla, no es crítico. Preferiblemente, el primer miembro de unión específica se inmoviliza sobre una fase sólida. La fase sólida que se usa en el inmunoensayo (para el primer miembro de unión específica y, opcionalmente, el segundo miembro de unión específica) puede ser cualquier fase sólida conocida en la técnica, tal como, sin limitaciones, una partícula magnética, una esfera, un tubo de ensayo, una placa de microtitulación, una cubeta, una membrana, una molécula de andamiaje, una película, un papel de filtro, un disco y un chip.
Una vez que se forma la mezcla que contiene el complejo con el primer miembro de unión específica y el analito, se elimina cualquier analito no unido del complejo, mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el analito no unido puede eliminarse con un lavado. Deseablemente, sin embargo, el primer miembro de unión específica está presente en exceso sobre cualquier analito presente en la muestra de prueba, de tal forma que todo el analito presente en la muestra de prueba se une al primer miembro de unión específica.
Después de eliminar el analito no unido, se agrega un segundo miembro de unión específica a la mezcla para formar un complejo con el primer miembro de unión específica, el analito y el segundo miembro de unión específica. El segundo miembro de unión especifica preferiblemente es un anticuerpo anti-analito que se une a un epitope en el analito que difiere del epitope al que se une el primer miembro de unión específica. Más aún, también preferiblemente, el segundo miembro de unión específica se marca con, o contiene, una marca detectable como se describe previamente. El segundo miembro de unión específica puede ser una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta) como se describe en la presente.
Puede usarse cualquier marca detectable apropiada conocida en la técnica. Por ejemplo, la marca detectable puede ser una marca radiactiva (tal como 3H, 125l, 35S, 4C, 32P, y 33P), una marca enzimática (tal como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, glucosa 6-fosfato dehidrogenasa, y similares), una marca quimioluminiscente (tal como ésteres de acridina, tioésteres, o sulfonamidas; luminol, isoluminol, ésteres de fenantridino, y similares), una marca fluorescente (tal como fluoresceína (por ejemplo, 5-fluoresceínaa, 6-carboxifluoresceína, 3'6-carboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 6-hexaclorofluoresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, y similares)), rhodamina, ficobiliproteínas, R-ficoeritrina, quantum dots (por ejemplo, seleniuro de cadmio enchapado con sulfuro de zinc), una marca termométrica, o una marca de immunoreacción en cadena de polimerasa. La introducción a marcas, procedimientos de mareaje y detección de marcas se encuentra en Polak y Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2da ed., Springer Verlag, N.Y. (1997), y en Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996), que es una combinación de manual y catálogo publicado por Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon. Puede usarse una marca fluorescente en FPIA (véanse, por ejemplo, las Patentes estadounidenses N° 5593896, 5573904, 5496925, 5359093 y 5352803). Puede usarse un compuesto de acridinio como marca detectable en un ensayo quimioluminiscente homogéneo o heterogéneo (véase, por ejemplo, Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006); Adamczyk et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14: 2313-2317 (2004); Adamczyk et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004); Adamczyk et al., Org. Lett., 5: 3779-3782 (2003)).
Un compuesto de acridinio preferido es una acridinio-9-carboxamida. Los métodos para preparar acridinio 9-carboxamidas se describen en Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 (1991); Adamczyk et al., J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998); Adamczyk et al., Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999); Adamczyk et al., Org. Lett., 1: 779-781 (1999); Adamczyk et al., Bioconjugate Chem., 11: 714-724 (2000); Adamczyk y Mattingly et al., en Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications; (Dyke, K.V., editor) (CRC Press: Boca Ratón, pp. 77-105 (2002); Adamczyk et al., Org. Lett., 5: 3779-3782 (2003); y las Patentes estadounidenses N° 5468646, 5543524 y 5783699. Otro compuesto de acridinio preferido es un éster de acridinio-9-carboxilato de arilo. Un ejemplo de un éster de acridinio-9-carboxilato de arilo es el fluorosulfonato de 10-metil-9-(fenoxicarbonil)acridinio (disponible de Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Los métodos para preparar ésteres de acridinio-9-carboxilato de arilo se describen en McCapra et al., Photochem. Photobiol., 4: 1111-21 (1965); Razavi et al., Luminescence 15: 245-249 (2000); Razavi et al., Luminescence 15: 239-244 (2000); y la Patente estadounidense N° 5241070. Otros detalles respecto de éster de acridinio-9-carboxilato de arilo y su uso pueden consultarse en US 2008-0248493.
Los ensayos quimioluminiscentes (por ejemplo, usando acridinio como se describe previamente u otros agentes quimioluminiscentes) pueden llevarse a cabo de acuerdo con los métodos que se describen en Adamczyk et al., Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (2006). Mientras que puede usarse cualquier formato de ensayo apropiado, un quimioluminómetro de microplacas (Mithras LB-940, Berthold Technologies U.S. A., LLC, Oak Ridge, TN) permite el ensayo de múltiples muestras de volúmenes pequeños rápidamente.
El orden en que se agregan la muestra de prueba y lo(s) miembro(s) de unión específica para formar la mezcla para el ensayo quimioluminiscente no es crítico. Si el primer miembro de unión específica está marcado de manera detectable con un agente quimioluminiscente, tal como un compuesto de acridinio, se forman complejos marcados de manera detectable con el primer miembro de unión específica y el analito. Como alternativa, si se usa un segundo miembro de unión específica y el segundo miembro de unión específica está marcado de manera detectable con un agente quimioluminiscente, tal como un compuesto de acridinio, se forman complejos marcados de manera detectable con el primer miembro de unión específica, el analito y el segundo miembro de unión específica. Puede eliminarse cualquier miembro de unión específica no unido, esté marcado o no, a partir de la mezcla usando cualquier técnica conocida en la técnica, tal como un lavado.
El peróxido de hidrógeno puede generarse in situ en la mezcla o puede proveerse o introducirse en la mezcla (por ejemplo, cuando la fuente de peróxido de hidrógeno comprende uno o más amortiguadores u otras soluciones de las que se sabe que contienen peróxido de hidrógeno), antes de agregar los compuestos de acridinio que se mencionaron con anterioridad, de manera simultáneamente con su adición o después de agregarlos. El peróxido de hidrogeno puede generarse in situ de varias maneras tales como será evidente para un versado en la técnica.
Junto con la adición simultánea o subsiguiente de al menos una solución básica a la muestra, se genera una señal detectable, tal como una señal quimioluminiscente, que es indicativa de la presencia del analito. La solución básica contiene al menos una base y tiene un pH mayor o igual que 10, preferiblemente, mayor o igual que 12. Entre los ejemplos de soluciones básicas se incluyen, sin limitaciones, el hidróxido de sodio, el hidróxido de potasio, el hidróxido de calcio, el hidróxido de amonio, el hidróxido de magnesio, el carbonato de sodio, el bicarbonato de sodio, el hidróxido de calcio, el carbonato de calcio y el bicarbonato de calcio. La cantidad de solución básica que se agrega a la muestra depende de la concentración de la solución básica. En base a la concentración de la solución básica que se usa, un versado en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de solución básica a agregar a la muestra.
La señal quimioluminiscente que se genera puede detectarse usando procedimientos de rutina conocidos por aquellos versados en la técnica. En base a la intensidad de la señal que se genera, puede determinarse la cantidad de analito en la muestra. Específicamente, la cantidad de analito en la muestra es proporcional a la intensidad de la señal que se genera. La cantidad de analito presente puede determinarse mediante la comparación de la cantidad de luz que se genera con una curva de referencia para el analito o mediante comparación con una referencia. La curva de referencia puede generarse usando diluciones en serie o soluciones con una concentración conocida del analito, por espectroscopia de masa, con métodos gravimétricos o de acuerdo con otros procedimientos conocidos en la técnica. Mientras que lo anterior se describe con énfasis en el uso de un compuesto de acridinio como agente quimioluminiscente, cualquier versado en la técnica puede adaptar fácilmente esta descripción para usar con otros agentes quimioluminiscentes.
Por lo general los inmunoensayos analíticos pueden llevarse a cabo usando cualquier formato conocido en la técnica, tal como, sin limitaciones, un formato en sándwich. Específicamente, en un formato de inmunoensayo, se emplean al menos dos anticuerpos para separar y cuantificar el analito, tal como un analito humano o un fragmento de éste, en una muestra. Más específicamente, los al menos dos anticuerpos se unen a distintos epitopes en el analito (o un fragmento de éste) formando un complejo inmune, que se denomina como "sándwich". Por lo general, en los inmunoensayos pueden usarse uno o más anticuerpos para capturar el analito (o un fragmento de éste) en la muestra de prueba (estos anticuerpos se denominan con frecuencia como un anticuerpo de "captura" o anticuerpos de "captura") y pueden usarse uno o más anticuerpos para unir una marca detectable (o sea, cuantificable) al sándwich (estos anticuerpos se denominan frecuentemente como "anticuerpo de detección", "anticuerpos de detección", "conjugado", o "conjugados"). Por consiguiente, en el contexto de un inmunoensayo en formato de sándwich, puede usarse una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta) como se describe en la presente como anticuerpo de captura, anticuerpo de detección, o ambos. Por ejemplo, puede usarse una DVD-lg que tiene un dominio que puede unirse a un primer epitope en un analito (o un fragmento de éste) como anticuerpo de captura y/o otra DVD-lg que tiene un dominio que puede unirse a un segundo epitope en un analito (o un fragmento de éste) como anticuerpo de detección. Con relación a esto, puede usarse una DVD-lg que tiene un primer dominio que puede unirse a un primer epitope en un analito (o un fragmento de éste) y un segundo domino que puede unir un segundo epitope en un analito (o un fragmento de éste) como anticuerpo de captura y/o como anticuerpo de detección. Como alternativa, puede usarse una DVD-lg que tiene un primer dominio que puede unirse a un epitope en un primer analito (o fragmento de éste) y un segundo domino que puede unir un epitope en un segundo analito (o fragmento de éste) como anticuerpo de captura y/o como anticuerpo de detección para detectar, y opcionalmente cuantificar dos o más analitos. En el caso en que un analito pueda estar presente en la muestra en más de una forma, tal como una forma monomérica y una forma dimérica/multimérica, que puede ser homomérica o heteromérica, puede usarse una DVD-lg que tiene un dominio que puede unirse a un epitope que solo está expuesto sobre la forma monomérica y otra DVD-lg que tiene un dominio que puede unirse a un epitope en una parte diferente de una forma dimérica/multimérica, como anticuerpos de captura y/o anticuerpos de detección, permitiendo por lo tanto la detección y la cuantificación opcional de diferentes formas de un analito dado. Más aún, el empleo de DVD-lg con afinidades diferenciales dentro de una sola DVD-lg y/o entre diferentes DVD-lg puede proveer una ventaja de avidez. En el contexto de los ¡nmunoensayos como se describen en la presente, por lo general puede ser útil o deseable incorporar uno o más conectores dentro de una estructura de una DVD-lg. Cuando está presente, óptimamente el conector debe ser de longitud y flexibilidad estructural suficiente para permitir la unión de un epitope mediante los dominios internos así como también la unión de otro epitope mediante los dominios externos. Con relación a esto, si una DVD-lg puede unir dos analitos diferentes y un anaiito es más grande que el otro, deseablemente el anaiito más grande se une mediante los dominios externos.
Hablando en forma general, una muestra que se está ensayando para (por ejemplo, por ser sospechosa de contener) la presencia de una proteína I L- 1 ß (o un fragmento de ésta) puede ponerse en contacto con al menos un anticuerpo (o anticuerpos) de captura y al menos un anticuerpo de detección (que puede ser un segundo anticuerpo de detección o un tercer anticuerpo de detección o incluso un anticuerpo numerado sucesivamente, por ejemplo, como en el caso en que el anticuerpo de captura y/o detección comprenda anticuerpos múltiples) ya sea en forma simultánea o en forma sucesiva y en cualquier orden. Por ejemplo, la muestra de prueba puede ponerse en contacto primero con al menos un anticuerpo de captura y luego (en forma sucesiva) con al menos un anticuerpo de detección. Como alternativa, la muestra de prueba puede ponerse en contacto primero con al menos un anticuerpo de detección y luego (en forma sucesiva) con al menos un anticuerpo de captura. En aún otra alternativa, la muestra de prueba puede ponerse en contacto en forma simultánea con un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección.
En el formato de ensayo en sándwich, una muestra que se sospecha que contiene I L- 1 ß (o fragmento de ésta) primero se pone en contacto con al menos una primera proteína de unión de captura (por ejemplo, un anticuerpo contra la I L- 1 ß ) bajo condiciones que permiten la formación de un complejo con la primera proteína de unión y la IL-?ß. Si se usa más de una proteína de unión de captura, se forma un complejo con la primera proteína de unión de captura y la I L- 1 ß que comprende dos o más formas de la proteína de unión de captura. En un ensayo en sándwich, las proteínas de unión, es decir, preferiblemente la al menos una proteína de unión de captura, se usan en cantidades molares en exceso con relación a la cantidad máxima del analito de la ! L- 1 ß (o del fragmento de éste) que se espera hallar en la muestra de prueba. Por ejemplo, puede usarse entre alrededor de 5 g y alrededor de 1 mg de anticuerpo por mi de amortiguador (por ejemplo, amortiguador de recubrimiento de micropartículas).
Los inmunoensayos de inhibición competitiva, los que se emplean con frecuencia para medir analitos pequeños debido a que se requiere la unión mediante solo un anticuerpo, comprenden formatos sucesivos o clásicos. En un inmunoensayo de inhibición competitiva sucesiva se recubre una cavidad de una placa de microtitulación u otro soporte sólido con una proteína de unión de captura hacia I L- 1 ß . Cuando la muestra que contiene la I L- 1 ß se coloca en la cavidad, la I L- 1 ß se une a la proteína de unión de captura. Después de lavar, se agrega una cantidad conocida de la I L - ß marcada (por ejemplo, con biotina o peroxidasa de rábano (HRP)) a la cavidad. Se necesita un sustrato para la marca enzimática para poder generar una señal. Un ejemplo de un sustrato apropiado para HRP es la 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). Después de lavar, se mide la señal generada por el analito marcado, que es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra. En un inmunoensayo de inhibición competitiva clásico, se recubre un soporte sólido con una proteína de unión hacia ¡ L- 1 ß (por ejemplo, una cavidad de una placa de microtitulación). Sin embargo, a diferencia del inmunoensayo de inhibición competitiva sucesiva, se agregan la muestra y la I L- ß marcada la cavidad en el mismo momento. Cualquier I L- 1 ß en la muestra compite con la I L- 1 ß marcada por la unión a la proteína de unión de captura. Después de lavar, se mide la señal generada por el analito marcado, que es inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra.
Opcionalmente, antes de poner en contacto la muestra de prueba con la al menos una proteína de unión de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), puede unirse la el menos una proteína de unión de captura a un soporte sólido, que facilita la separación del complejo primera proteína de unión/IL-?ß (o fragmento de éste) de la muestra de prueba. El sustrato al que se une la proteína de unión puede ser cualquier soporte sólido apropiado o fase sólida que facilite la separación del complejo de anticuerpo de captura-analito de la muestra.
Entre los ejemplos se incluye una cavidad de una placa, tal como una placa de microtitulación, un tubo de ensayo, un gel poroso (por ejemplo, gel de sílice, agarosa, dextrano, o gelatina), una película polimérica (por ejemplo, poliacrilamida), esferas (por ejemplo, esferas de poliestireno o esferas magnéticas), una tira de filtro/membrana (por ejemplo, nitrocelulosa o nylon), micropartículas (por ejemplo, partículas de látex, micropartículas magnetizables (por ejemplo, micropartículas que tienen núcleos de óxido férrico u óxido de cromo y recubrimientos homo o heteropoliméricos, y radios de aproximadamente entre 1 y 10 micrones). El sustrato puede comprender un material poroso apropiado con una afinidad de superficie apropiada para unir antígenos y porosidad suficiente para permitir el acceso por parte de los anticuerpos de detección. Por lo general se prefiere un material microporoso, a pesar de que puede usarse un material gelatinoso en un estado hidratado. Dichos sustratos porosos están preferiblemente en forma de hojas con un espesor de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,5 mm, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mm. Mientras que el tamaño de poro puede variar un poco, el tamaño de poro preferiblemente es de entre aproximadamente 0,025 y aproximadamente 15 micrones, más preferiblemente entre aproximadamente 0,15 y aproximadamente 15 micrones. La superficie de dichos sustratos puede activarse mediante procesos químicos que causan una unión covalente del anticuerpo al sustrato. Por lo general, se obtiene una unión irreversible mediante la adsorción, a través de fuerzas hidrofóbicas, del antígeno o del anticuerpo sobre el sustrato. Como alternativa, puede usarse un agente de unión química u otros medios para unir de manera covalente el anticuerpo al sustrato, con la condición de que dicha unión no interfiera con la capacidad del anticuerpo de unirse al analito. Como alternativa, puede unirse el anticuerpo con micropartículas, las cuales han sido previamente recubiertas con estreptavidina (por ejemplo, DYNAL® Magnetic Beads, Invitrogen, Carlsbad, CA) o biotina (por ejemplo, micropartículas recubiertas con estreptavidina usando Power-BindTM-SA-MP (Seradyn, Indianapolis, IN)) o anticuerpos monoclonales específicos anti-especie. Si es necesario, puede derivarse el sustrato para permitir su reactividad con diferentes grupos funcionales sobre el anticuerpo. Para esta derivación, es necesario usar determinados agentes de unión, que incluyen, sin limitaciones, el anhídrido maleico, la N-hidroxisuccinimida y la 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida. Si se lo desea, pueden adherirse uno o más reactivos de captura, por ejemplo, anticuerpos (o fragmentos de éstos), cada uno de los cuales es especifico para uno o más analitos, a fases sólidas en distintas ubicaciones físicas o localizables (por ejemplo, como en el caso de una configuración en un biochip (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense N° 6225047, la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N° WO 99/51773, la Patente estadounidense N° 6329209, la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N° WO 00/56934 y la Patente estadounidense N° 5242828). Si el reactivo de captura se adhiere a una sonda para espectrometría de masa como soporte sólido, la cantidad de analito que se une a la sonda puede detectarse mediante espectrometría de masa de desorción e ionización láser. Como alternativa, puede envasarse una columna individual con diferentes esferas, que se derivan con uno o más reactivos de captura, capturando de ese modo el analito en un solo lugar (véase, tecnologías de derivación de anticuerpos, en base a esferas, por ejemplo, la tecnología xMAP de Luminex (Austin, TX)).
Una vez que se ha evaluado la presencia del analito (o de un fragmento de éste) en la muestra de prueba, se la pone en contacto con al menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, con el primer anticuerpo de captura) y se incuba la mezcla para permitir la formación de un complejo con el primer anticuerpo (o los diversos anticuerpos) y el analito (o un fragmento de éste). La incubación puede llevarse a cabo a un pH de entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 10,0, a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 45°C, y durante un periodo de al menos entre aproximadamente (1) minuto y aproximadamente dieciocho (18) horas, preferiblemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 24 minutos, más preferiblemente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 18 minutos. El inmunoensayo que se describe en la presente puede llevarse a cabo en un paso (lo que significa que se agregan la muestra de prueba, al menos un anticuerpo de captura y al menos un anticuerpo de detección en forma sucesiva o en forma simultánea a un recipiente de reacción) o en más de un paso, tal como dos pasos, tres pasos, etc.
Una vez formado el complejo con el (primero o múltiple) anticuerpo de captura y el analito (o un fragmento de éste), el complejo se pone entonces en contacto con al menos un anticuerpo de detección bajo condiciones que permiten la formación de un complejo con el (primero o múltiple) anticuerpo de captura, el analito (o un fragmento de éste) y el segundo anticuerpo de detección. Si bien en aras de la claridad se lo denomina "segundo" anticuerpo (por ejemplo, segundo anticuerpo de detección), en el caso en el que se empleen múltiples anticuerpos para la captura y/o la detección, el al menos un anticuerpo de detección podrá ser el segundo, tercero o cuarto anticuerpo, etcétera, que se use en el inmunoensayo. Si el complejo con el anticuerpo de captura y el analito (o un fragmento de éste) se pone en contacto con más de un anticuerpo de detección, entonces se forma un complejo con el (primero o múltiple) anticuerpo de captura, el analito (o un fragmento de éste) y el anticuerpo de detección (o varios de ellos). Como en el caso del anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura), cuando se pone en contacto el al menos un anticuerpo de detección (por ejemplo, dos o más) con el complejo con el anticuerpo de captura y el analito (o un fragmento de éste), es necesario que transcurra un periodo de incubación bajo condiciones similares a las que se describieron con anterioridad para la formación del complejo con el (primero o múltiple) anticuerpo de captura, el analito (o un fragmento de éste) y el (segundo o múltiple) anticuerpo de detección. Preferiblemente, al menos un anticuerpo de detección contiene una marca detectable. La marca detectable puede unirse con el al menos un anticuerpo de detección (por ejemplo, el segundo anticuerpo de detección) antes de de la formación del complejo con el (primero o múltiple) anticuerpo de captura, el analito (o un fragmento de éste) y el (segundo o múltiple) anticuerpo de detección, de manera simultánea con la formación de dicho complejo o después de ello. Puede usarse cualquier marca detectable conocida en la técnica (véase la discusión previa, incluyendo las referencias de Polak y Van Noorden (1997) y Haugland (1996)).
La marca detectable puede unirse a los anticuerpos ya sea en forma directa o a través de un agente de acoplamiento. Un ejemplo de un agente de unión que puede usarse es el EDAC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida), que está disponible comercialmente en Sigma-Aldrich, St. Louis, Misurí. En la técnica se conocen otros agentes de unión que pueden usarse. En la técnica se conocen métodos para unir una marca detectable a un anticuerpo. Adicionalmente, es posible adquirir o sintetizar muchas marcas detectables que ya contienen grupos terminales que facilitan la unión de la marca detectable al anticuerpo, tales como el CPSP-éster de acridinio (es decir, carboxamida de 9-[N-tosil-N-(3-carboxipropil)]-10-(3-sulfopropil)acridinio) o el SPSP-éster de acridinio (es decir, N10-(3-sulfopropil)-N-(3-sulfopropil)-acridinio-9-carboxamida).
El complejo con el (primer o múltiple) anticuerpo de captura, el analito y el (segundo o múltiple) anticuerpo de detección puede separarse del resto de la muestra de prueba antes de la cuantificacion de la marca, aunque no de manera obligatoria. Por ejemplo, si el al menos un anticuerpo de captura (por ejemplo, el primer anticuerpo de captura) se une a un soporte sólido, tal como una cavidad o una esfera, puede llevarse a cabo la separación mediante la eliminación del fluido (de la muestra de prueba) que está en contacto con el soporte sólido. Como alternativa, si el al menos primer anticuerpo de captura se une a un soporte sólido, puede ponérselo en contacto de manera simultánea con la muestra que contiene el analito y el al menos un segundo anticuerpo de detección, de manera tal de formar un complejo con el primer (múltiple) anticuerpo, el analito y el segundo (múltiple) anticuerpo, a lo que sigue la eliminación del fluido (muestra de prueba) que está en contacto con el soporte sólido. Si el al menos un primer anticuerpo de captura no está unido a un soporte sólido, entonces el complejo del (primero o múltiple) anticuerpo de captura, el analito y el (segundo o múltiple) anticuerpo de detección no tiene que ser eliminado de la muestra de prueba para la cuantificación de la cantidad de marca.
Una vez formado el complejo marcado con el anticuerpo de captura, el analito y el anticuerpo de detección (por ejemplo, el complejo con el primer anticuerpo de captura, el analito y el segundo anticuerpo de detección), se cuantifica la cantidad de marca en el complejo usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, si se usa una marca enzimática, se hace reaccionar el complejo marcado son un sustrato para la marca que da una reacción cuantificable tal como un desarrollo de color. Si la marca es una marca radiactiva, se cuantifica la marca usando medios apropiados, tal como un contador de centelleo. Si la marca es una marca fluorescente, se cuantifica la marca mediante la estimulación de la marca con una luz de un color (que se conoce como la "longitud de onda de excitación") y detectando otro color (que se conoce como "longitud de onda de emisión") que es emitida por la marca en respuesta a la estimulación. Si la marca es una marca quimioluminiscente, se cuantifica la marca mediante la detección de la luz emitida ya sea en forma visual o mediante el uso de luminómetros, películas de rayos X, películas fotográficas de alta velocidad, cámara CCD, etc. Una vez que se ha cuantificado la cantidad de marca en el complejo, se determina la concentración del analito o del fragmento de éste en la muestra de prueba mediante medios apropiados, tal como mediante el uso de una curva de referencia que se ha generado usando diluciones en serie del analito o de un fragmento de éste con una concentración conocida. Además de generar la curva de referencia usando diluciones en serie del analito o de un fragmento de éste, es posible generarla gravimétricamente, por espectroscopia de masa y con otros procedimientos conocidos en la técnica.
En un ensayo quimioluminiscente de micropartículas que emplea el analizador ARCHITECT®, el pH del diluyente del conjugado debe ser de aproximadamente 6,0 +/- 0,2, el amortiguador de recubrimiento de micropartículas se debe mantener a alrededor de temperatura ambiente (o sea, a entre alrededor de 17 y alrededor de 27°C), el pH del amortiguador de recubrimiento de las micropartículas debe ser de aproximadamente 6,5 +/- 0,2, y el pH del diluyente de las micropartículas debe ser de aproximadamente 7,8 +/- 0,2. Los sólidos preferiblemente son menos de aproximadamente 0,2%, tal como menos de aproximadamente 0,15%, menos de aproximadamente 0,14%, menos de aproximadamente 0,13%, menos de aproximadamente 0,12%, o menos de aproximadamente 0,11%, tal como aproximadamente 0,10%.
Los FPIAs se basan en los principios de los inmunoensayos de unión competitiva. Un compuesto marcado fluorescentemente, cuando se excita mediante una luz linealmente polarizada, emitirá fluorescencia con un grado de polarización inversamente proporcional a su tasa de rotación. Cuando se excita un complejo trazador fluorescentemente marcado-anticuerpo mediante una luz linealmente polarizada, la luz emitida permanece altamente polarizada debido a que el fluoróforo está restringido en su rotación entre el tiempo en que se absorbe la luz y el tiempo en que se emite la luz. Cuando se excita un compuesto trazador "libre" (o sea, un compuesto que no está unido a un anticuerpo) mediante luz linealmente polarizada, su rotación es mucho más rápida que el correspondiente conjugado de trazador-anticuerpo que se produce en un inmunoensayo de unión competitiva. Los FPIAs son más ventajosos que los RIAs en vista de que no hay sustancias radiactivas que requieran una manipulación y una eliminación especial. Además, los FPIAs son ensayos homogéneos que pueden llevarse a cabo fácilmente y rápidamente.
En vista de lo anterior, se provee un método para determinar la presencia, cantidad o concentración del analito (o de un fragmento de éste) en una muestra de prueba. El método comprende ensayar la muestra de prueba para investigar un analito (o un fragmento de éste) mediante un ensayo (i) que emplea (i') al menos uno de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que puede unirse a un analito, una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito y una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta) que puede unirse a un analito, y (¡i') al menos una marca detectable y (ii) que comprende comparar una señal generada por la marca detectable como indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración de un analito (o un fragmento de éste) en la muestra de prueba con una señal generada como indicación directa o indirecta de la presencia, cantidad o concentración del analito (o de un fragmento de éste) en un control o calibrador. Opcionalmente el calibrador es parte de una serie de calibradores, donde cada uno de los calibradores difiere de los otros calibradores en su concentración del analito.
El método puede comprender (i) poner en contacto la muestra de prueba con al menos un primer miembro de unión específica al analito (o fragmento de éste) que se elige del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que puede unirse a un analito, una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito, y una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta) que puede unirse a un analito de manera de formar un complejo con el primer miembro de unión específica y el analito (o un fragmento de éste), (ii) poner en contacto el complejo con el primer miembro de unión específica y el analito (o un fragmento de éste) con al menos un segundo miembro de unión específica al analito (o fragmento de éste) que se elige del grupo que consiste en un anticuerpo marcado de manera detectable anti-analito, un fragmento de un anticuerpo marcado de manera detectable anti-analito que puede unirse a un analito, un variante de un anticuerpo marcado de manera detectable anti-analito que puede unirse a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo marcado de manera detectable anti-analito que puede unirse a un analito, y una DVD-lg detectablemente marcada (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta) de manera de formar un complejo con el primer miembro de unión específica, el analito (o un fragmento de éste) y el segundo miembro de unión específica, y (iii) determinar la presencia, la cantidad o la concentración del analito en la muestra de prueba mediante la detección o medida de la señal generada por la marca detectable en el complejo con el primer miembro de unión específica, el analito (o un fragmento de éste) y el segundo miembro de unión específica que se formó en (ii). Puede resultar preferible un método en el cual al menos un primer miembro de unión específica al analito (o fragmento de éste) y/o al menos un segundo miembro de unión específica al analito (o fragmento de éste) es una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta) como se describe en la presente.
Como alternativa, el método puede comprender poner en contacto la muestra de prueba con al menos un primer miembro de unión específica para un analito de I L- 1 ß (o fragmento de éste) que se elige del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo que puede unirse a un analito, una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito, un fragmento de una variante de un anticuerpo que puede unirse a un analito y una DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta) y en forma simultánea o en forma sucesiva, en cualquier orden, poner en contacto la muestra de prueba con al menos un segundo miembro de unión específica, que puede competir con el analito (o un fragmento de éste) por la unión con el al menos un primer miembro de unión específica y que se elige del grupo que consiste en un analito marcado de manera detectable, un fragmento marcado de manera detectable de un analito que puede unirse al primer miembro de unión específica, una variante detectablemente marcada de analito que puede unirse al primer miembro de unión específica, y un fragmento marcado de manera detectable de una variante de un analito que puede unirse al primer miembro de unión específica. Cualquier I L- 1 ß (o un fragmento de ésta) que esté presente en la muestra de prueba y el al menos un segundo miembro de unión específica compiten entre ellos para formar un complejo con el primer miembro de unión específica, el analito (o un fragmento de éste) y un complejo de primer miembro de unión específica y el segundo miembro de unión específica, respectivamente. El método además comprende determinar la presencia, cantidad o concentración del analito en la muestra de prueba mediante la detección o medida de la señal generada por la marca detectable en el complejo de primer miembro de unión específica y el segundo miembro de unión específica que se formó en (ii), donde la señal generada por la marca detectable en el complejo de primer miembro de unión específica y el segundo miembro de unión específica es inversamente proporcional a la cantidad o concentración del analito en la muestra de ensayo.
Los métodos anteriores además pueden comprender diagnosticar, pronosticar, o evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico de un paciente del cual se obtuvo la muestra de prueba. Si el método además comprende evaluar la eficacia de un tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente del que se obtuvo la muestra de prueba, el método opcionalmente también comprende modificar el tratamiento terapéutico/profiláctico del paciente según la necesidad para mejorar la eficacia. El método puede adaptarse para usar en un sistema automatizado o en un sistema semiautomatizado.
Con relación a los métodos de ensayo (y al conjunto de elementos de éste), puede ser posible emplear anticuerpos anti-analito disponibles comercialmente o métodos para la producción de anticuerpo anti-analito como se describen en la literatura. Las fuentes comerciales de distintos anticuerpos incluyen, sin limitaciones, Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), GenWay Biotech, Inc. (San Diego, CA), y R&D Systems (RDS; Minneapolis, MN).
Por lo general, puede emplearse un nivel predeterminado como referencia comparativa para evaluar los resultados obtenidos en la evaluación del analito o de un fragmento de éste en una muestra de prueba, por ejemplo, para detectar una enfermedad o el riesgo de contraer una enfermedad. Por lo general, al hacer dicha comparación, se obtiene el nivel predeterminado corriendo un ensayo en particular un número de veces suficiente y bajo condiciones apropiadas tales para poder hacer una conexión o asociación entre la presencia, cantidad o concentración del analito con una etapa particular o punto final de una enfermedad, trastorno o afección o con indicios clínicos particulares. Típicamente, el nivel predeterminado se obtiene con ensayos de sujetos de referencia (o poblaciones de sujetos). El analito medido puede incluir fragmentos de éste, productos de degradación de éste y/o productos de la escisión enzimática de éste.
En particular, con relación a un nivel predeterminado como el que se emplea para monitorear el progreso de la enfermedad y/o del tratamiento, la cantidad o concentración del analito o un fragmento de éste puede estar "inalterada", "favorable" (o "favorablemente alterada"), o "desfavorable" (o "desfavorablemente alterada"). "Elevada" o "incrementada" hace referencia a una cantidad o una concentración en una muestra de prueba que es más alta que un nivel o rango típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado), o es mayor que otro nivel o rango de referencia (por ejemplo, muestra anterior o de línea de base). El término "disminuida" o "reducida" hace referencia a una cantidad o una concentración en una muestra de prueba que es menor que un nivel o rango típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado), o es menor que otro nivel o rango de referencia (por ejemplo, muestra anterior o de línea de base). El término "alterada" hace referencia a una cantidad o una concentración en una muestra que está alterada (incrementada o disminuida) a través de un nivel o rango típico o normal (por ejemplo, nivel predeterminado), o a través de otro nivel o rango de referencia (por ejemplo, muestra anterior o de línea de base).
El nivel o rango típico o normal para analito se define de acuerdo con la práctica convencional. Debido a que los niveles del analito en algunos casos serán muy bajos, un denominado nivel alterado o alteración puede considerarse como ocurrida cuando existe un cambio neto en comparación con el nivel o rango típico o normal, o nivel o rango de referencia, que no puede explicarse por el error experimental o la variación de muestra. Por consiguiente, se comparará el nivel medido en una muestra particular con el nivel o rango de niveles determinados en muestras similares provenientes de un denominado sujeto normal. En este contexto, un "sujeto normal" es un individuo sin enfermedad detectable, por ejemplo, y un sujeto o población "normal" (a veces denominado como "control") es uno(unos) que no exhibe(n) enfermedad detectable, respectivamente, por ejemplo. Más aún, debido a que el analito no se encuentra comúnmente en un alto nivel en la mayoría de la población humana, un "sujeto normal" puede considerarse como un individuo sin cantidad o concentración del analito detectable sustancialmente incrementada o elevada, y un paciente o población "normal" (a veces denominada "control") es uno(s) que no exhibe(n) una cantidad o concentración del analito detectable sustancialmente incrementada o elevada. Un "sujeto aparentemente normal" es uno en el que no se ha evaluado o no se está evaluando actualmente el analito. El nivel de un analito se dice que está "elevado" cuando el analito es normalmente indetectable (por ejemplo, el nivel normal es cero, o está dentro de un rango de entre alrededor de 25 y alrededor de 75 percentiles de poblaciones normales), pero se lo detecta en una muestra de prueba, así como también cuando el analito está presente en la muestra de prueba en un nivel más alto que el normal. Por consiguiente, entre otras cosas, la exposición provee un método para detectar un sujeto que tiene, o que está en riesgo de tener, una enfermedad, un trastorno o una afección particular. El método de ensayo también puede abarcar el ensayo de otros marcadores y similares.
Por consiguiente, los métodos que se describen en la presente también pueden usarse para determinar si un sujeto tiene o no, o está en riesgo o no de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección dada. Específicamente, dicho método puede comprender los siguientes pasos: (a) determinar la concentración o la cantidad de analito (o fragmento de éste) en una muestra de prueba de un sujeto (por ejemplo, usando los métodos que se describen en la presente, o métodos conocidos en la técnica); y (b) comparar la concentración o la cantidad de I L- 1 ß (o un fragmento de ésta) que se determinó en el paso (a) con un nivel predeterminado, donde, si la concentración o la cantidad de analito que se determinó en el paso (a) es favorable con relación a un nivel predeterminado, entonces se determina que el sujeto no tiene o no está en riego de tener una enfermedad, trastorno o afección dada. Sin embargo, si la concentración o la cantidad de analito que se determinó en el paso (a) no es favorable con relación al nivel predeterminado, entonces se determina que el sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad, trastorno o afección dada.
Además, en la presente se provee un método para monitorear el progreso de una enfermedad en un sujeto. En forma óptima, el método comprende los siguientes pasos: (a) determinar la concentración o la cantidad de t L- 1 ß en una muestra de prueba de un sujeto; (b) determinar la concentración o la cantidad de I L- 1 ß en una muestra de prueba posterior del sujeto; y (c) comparar la concentración o la cantidad de analito que se determinó en el paso (b) con la concentración o la cantidad de I L- 1 ß que se determinó en el paso (a), donde si la concentración o la cantidad que se determinó en el paso (b) está inalterada o no es favorable en comparación con la concentración o la cantidad de l L- 1 ß que se determinó en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad del sujeto ha continuado, progresado o empeorado. Por comparación, si la concentración o la cantidad de I L- 1 ß que se determinó en el paso (b) es favorable en comparación con la concentración o la cantidad de ??_-1ß que se determinó en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad del sujeto se ha discontinuado, ha retrocedido o ha mejorado.
Opcionalmente, el método también comprende comparar la concentración o la cantidad de I L- 1 ß que se determinó en el paso (b), por ejemplo, con un nivel predeterminado. Además, opcionalmente el método comprende tratar al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo si la comparación muestra que la concentración o la cantidad de analito que se determinó en el paso (b), por ejemplo, está desfavorablemente alterada con relación al nivel predeterminado.
Más aún, los métodos pueden usarse para monitorear el tratamiento de un sujeto que recibe tratamiento con una o más composiciones farmacéuticas. Específicamente, dichos métodos comprenden proveer una primera muestra de prueba de un sujeto antes que se administre al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas. Luego, se determina la concentración o la cantidad de I L- 1 ß en una primera muestra de prueba de un sujeto (por ejemplo, usando los métodos que se describen en la presente o que se conocen en la técnica). Una vez determinada la concentración o la cantidad de ??_-1ß, se compara opcionalmente la concentración o la cantidad de I L- 1 ß con un nivel predeterminado. Si la concentración o la cantidad de IL-?ß que se determinó en la primera muestra de prueba es inferior que el nivel predeterminado, entonces no se trata al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas. Sin embargo, si la concentración o la cantidad de I L- 1 ß que se determinó en la primera muestra de prueba es mayor que el nivel predeterminado, entonces se trata al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas durante un periodo de tiempo. El periodo de tiempo durante el que se trata al sujeto con la una o más composiciones farmacéuticas puede ser determinado por un versado en la técnica (por ejemplo, el periodo de tiempo puede ser de entre alrededor de siete (7) días y alrededor de dos años, preferiblemente entre alrededor de catorce (14) días y alrededor de un (1) año).
Durante el curso del tratamiento con la una o más composiciones farmacéuticas, se obtienen entonces segunda y subsiguientes muestras de prueba del sujeto. El número de muestras de prueba y el tiempo en el cual se obtienen dichas muestras de prueba del sujeto, no son críticos. Por ejemplo, puede obtenerse una segunda muestra de prueba siete (7) días después administrarle por primera vez al sujeto las una o más composiciones farmacéuticas, puede obtenerse una tercera muestra de prueba dos (2) semanas después de administrarle por primera vez al sujeto la una o más composiciones farmacéuticas, puede obtenerse una cuarta muestra de prueba tres (3) semanas después de administrarle por primera vez al sujeto la una o más composiciones farmacéuticas, puede obtenerse una quinta muestra de prueba cuatro (4) semanas después de administrarle por primera vez al sujeto la una o más composiciones farmacéuticas, etc.
Después de obtener cada segunda o subsiguiente muestra de prueba del sujeto, se determina la concentración o la cantidad de I L- 1 ß en la segunda o subsiguiente muestra de prueba (por ejemplo, usando los métodos que se describen en la presente o que se conocen en la técnica). La concentración o la cantidad de I L- 1 ß que se determina en cada una de las segunda o subsiguientes muestras de prueba se compara entonces con la concentración o la cantidad de analito que se determinó en la primera muestra de prueba (por ejemplo, la muestra de prueba que opcionalmente se comparó originalmente con el nivel predeterminado). Si la concentración o la cantidad de I L- 1 ß que se determinó en el paso (c) es favorable en comparación con la concentración o la cantidad de analito que se determinó en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el sujeto se ha discontinuado, ha retrocedido o ha mejorado, y el sujeto debe continuar siendo administrado con la una o más composiciones farmacéuticas del paso (b). Sin embargo, si la concentración o la cantidad que se determinó en el paso (c) está inalterada o no es favorable en comparación con la concentración o la cantidad de analito que se determinó en el paso (a), entonces se determina que la enfermedad en el sujeto ha continuado, progresado o empeorado, y se debe tratar al sujeto con una concentración más alta de la una o más composiciones farmacéuticas que se administraron al sujeto en el paso (b) o se debe tratar al sujeto con una o más composiciones farmacéuticas que son diferentes de la una o más composiciones farmacéuticas que se administraron al sujeto en el paso (b). Específicamente, puede tratarse el sujeto con una o más composiciones farmacéuticas que son diferentes de la una o más composiciones farmacéuticas que el sujeto había recibido previamente para disminuir o aminorar en nivel del analito en dicho sujeto.
Por lo general, para los ensayos en los que puede realizarse una prueba repetida (por ejemplo, monitoreo del progreso de una enfermedad y/o de la respuesta al tratamiento), se obtiene una segunda o subsiguiente muestra de prueba en un periodo de tiempo después de obtener la primera muestra de prueba del sujeto. Específicamente, puede obtenerse una segunda muestra de prueba del sujeto minutos, horas, días, semanas o años después de obtener la primera muestra de prueba del sujeto. Por ejemplo, la segunda muestra de prueba puede obtenerse del sujeto en un periodo de tiempo de aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1,5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente 2,5 años, aproximadamente 3,0 años, aproximadamente 3,5 años, aproximadamente 4,0 años, aproximadamente 4,5 años, aproximadamente 5,0 años, aproximadamente 5,5, años, aproximadamente 6,0 años, aproximadamente 6,5 años, aproximadamente 7,0 años, aproximadamente 7,5 años, aproximadamente 8,0 años, aproximadamente 8,5 años, aproximadamente 9,0 años, aproximadamente 9,5 años o aproximadamente 10,0 años después de obtener la primera muestra de prueba del sujeto.
Cuando se usa para monitorear el progreso de una enfermedad, puede usarse el ensayo previo para monitorear el progreso de una enfermedad en sujetos que padecen afecciones agudas. Las afecciones agudas, también conocidas como afecciones de cuidado crítico, hacen referencia a enfermedades agudas, que amenazan la vida u otras afecciones médicas críticas que abarcan, por ejemplo, el sistema cardiovascular o el sistema secretorio. Típicamente, la afecciones de cuidado crítico hacen referencia a aquellas afecciones que requieren una intervención médica aguda en un ámbito hospitalario (incluyendo, sin limitaciones, la sala de emergencias, la unidad de cuidados intensivos, el centro de trauma, u otros ámbitos de cuidado emergentes) o la administración por parte de un paramédico u otro personal médico de campo. Para la afecciones de cuidado crítico, por lo general se hace el monitoreo repetitivo dentro de un marco de tiempo menor, o sea, minutos, horas o días (por ejemplo, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 días), y por lo general, de la misma manera, el ensayo inicial se hace dentro de un periodo de tiempo más corto, por ejemplo, aproximadamente minutos, horas o días desde el inicio de la enfermedad o la afección.
También pueden usarse los ensayos para monitorear el progreso de una enfermedad en sujetos que padecen afecciones crónicas no agudas. Las afecciones de cuidado no crítico, no agudas, hacen referencia a afecciones distintas a las afecciones agudas, que amenazan la vida, o a otras afecciones médicas críticas que están relacionadas, por ejemplo, con el sistema cardiovascular y/o el sistema excretorio. Típicamente, las afecciones no agudas incluyen aquellas que se prolongan durante un período prolongado o que son crónicas. Para las afecciones no agudas, el monitoreo repetitivo generalmente se realiza durante un período de tiempo mayor, por ejemplo, horas, días, semanas, meses o años (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 13 semanas, aproximadamente 14 semanas, aproximadamente 15 semanas, aproximadamente 16 semanas, aproximadamente 17 semanas, aproximadamente 18 semanas, aproximadamente 19 semanas, aproximadamente 20 semanas, aproximadamente 21 semanas, aproximadamente 22 semanas, aproximadamente 23 semanas, aproximadamente 24 semanas, aproximadamente 25 semanas, aproximadamente 26 semanas, aproximadamente 27 semanas, aproximadamente 28 semanas, aproximadamente 29 semanas, aproximadamente 30 semanas, aproximadamente 31 semanas, aproximadamente 32 semanas, aproximadamente 33 semanas, aproximadamente 34 semanas, aproximadamente 35 semanas, aproximadamente 36 semanas, aproximadamente 37 semanas, aproximadamente 38 semanas, aproximadamente 39 semanas, aproximadamente 40 semanas, aproximadamente 41 semanas, aproximadamente 42 semanas, aproximadamente 43 semanas, aproximadamente 44 semanas, aproximadamente 45 semanas, aproximadamente 46 semanas, aproximadamente 47 semanas, aproximadamente 48 semanas, aproximadamente 49 semanas, aproximadamente 50 semanas, aproximadamente 51 semanas, aproximadamente 52 semanas, aproximadamente 1,5 años, aproximadamente 2 años, aproximadamente años, aproximadamente 3,0 años, aproximadamente 3,5 años, aproximadamente 4,0 años, aproximadamente 4,5 años, aproximadamente 5,0 años, aproximadamente 5,5, años, aproximadamente 6,0 años, aproximadamente 6,5 años, aproximadamente 7,0 años, aproximadamente 7,5 años, aproximadamente 8,0 años, aproximadamente 8,5 años, aproximadamente 9,0 años, aproximadamente 9 ,5 años o aproximadamente 10,0 años), y de manera similar, el ensayo inicial generalmente se realiza dentro de un período de tiempo más prolongado, por ejemplo, aproximadamente horas, días, meses o años desde el inicio de la enfermedad o la afección.
Además, los ensayos previos pueden llevarse a cabo usando una primera muestra de prueba que se obtiene de un sujeto donde la primera muestra de prueba se obtiene a partir de una fuente, tal como orina, suero o plasma. Opcionalmente, los ensayos previos pueden repetirse usando una segunda muestra de prueba que se obtiene del sujeto donde la segunda muestra de prueba se obtiene de otra fuente. Por ejemplo, si la primera muestra de prueba se obtuvo de orina, la segunda muestra de prueba puede obtenerse del suero o plasma. Los resultados obtenidos a partir de los ensayos usando la primera muestra de prueba y la segunda muestra de prueba pueden compararse. Puede usarse la comparación para evaluar el estado de una enfermedad o una afección en el sujeto.
Más aún, la presente exposición también se relaciona con métodos para determinar si un sujeto predispuesto a, o que sufre de, una enfermedad, trastorno o afección dada se beneficiará con el tratamiento. En particular, la exposición se relaciona con métodos diagnósticos y productos relacionados con el analito. Por consiguiente, el método de "monitorear el tratamiento de una enfermedad en un sujeto" como se describe en la presente, óptimamente puede abracar además la selección o identificación de candidatos para terapia.
Por consiguiente, en modalidades particulares, la exposición también provee un método para determinar si un sujeto que tiene, o que está en riesgo de tener, una enfermedad, trastorno o afección dada es un candidato para terapia. Por lo general, el sujeto es uno que ha experimentado algún síntoma de una enfermedad, trastorno o afección dada o que realmente ha sido diagnosticado como portador, o en riesgo de padecer, una enfermedad, trastorno o afección dada, y/o que demuestra una concentración o una cantidad desfavorable de analito o fragmento de éste, como se describe en la presente.
El método opcionalmente comprende un ensayo como se describe en la presente, donde se evalúa la I L- 1 ß antes y después del tratamiento de un sujeto con una o más composiciones farmacéuticas (por ejemplo, particularmente con un fármaco relacionado al mecanismo de acción relacionado con el analito), con terapia inmunosupresora, o mediante terapia de inmunoabsorción, o cuando se evalúa el analito después de dicho tratamiento y la concentración o la cantidad de analito se compara contra un nivel predeterminado. Una concentración o una cantidad desfavorable de IL-13 observado después del tratamiento confirma que el sujeto no se beneficiará por recibir otro tratamiento o uno continuo, mientras que una concentración o una cantidad favorable de analito observado después del tratamiento confirma que el sujeto se beneficiará de recibir más tratamiento o uno continuo. Esta conformación ayuda con el manejo de los estudios clínicos, y con la provisión de un mejor cuidado para el paciente.
Es evidente que, mientras que ciertas modalidades de la presente son ventajosas cuando se las emplea para evaluar una enfermedad, trastorno o afección dada como se expuso en la presente, pueden emplearse los ensayos y conjuntos de elementos para evaluar el analito en otras enfermedades, trastornoes o afecciones. El método de ensayo también puede comprender el ensayo de otros marcadores y similares.
El método de ensayo también puede usarse para identificar un compuesto que alivia una enfermedad, trastorno o afección dada. Por ejemplo, puede ponerse en contacto una célula donde se expresa el analito con un compuesto candidato. El nivel de expresión del analito en la célula que está en contacto con el compuesto puede compararse con el de una célula control usando el método de ensayo que se describe en la presente.
II. Conjuntos de elementos (kits) También se provee un conjunto de elementos (kit) para analizar una muestra de ensayo para estudiar la presencia, cantidad o concentración de un analito (o un fragmento de éste) en una muestra de prueba. El conjunto de elementos comprende al menos un componente para ensayar la muestra de prueba para estudiar la f L- 1 ß (o un fragmento de ésta) e instrucciones para ensayar la muestra de prueba para estudiar el analito (o un fragmento de éste). El al menos un componente para ensayar la muestra de prueba para estudiar el analito (o un fragmento de éste) puede incluir una composición que comprende una proteína de unión anti-l L-1 ß, tal como un anticuerpo monoclonal o DVD-lg (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta), como se describe en la presente que opcionalmente esta inmovilizada sobre una fase sólida.
El kit puede comprender al menos un componente para ensayar la muestra de prueba para investigar un analito de la l L- 1 ß mediante inmunoensayo, por ejemplo, inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscente, e instrucciones para ensayar la muestra de prueba para investigar un analito de la I L- 1 ß mediante inmunoensayo, por ejemplo, inmunoensayo de micropartículas quimioluminiscente. Por ejemplo, el conjunto de elementos puede comprender al menos un miembro de unión específica para investigar IL-?ß, tal como un anticuerpo anti-l L- 1 ß monoclonal/policlonal (o fragmento de éste que puede unirse al analito de la IL-?ß, una variante de éste que pueda unirse al analito, o un fragmento de una variante que puede unirse al analito) o una DVD-lg anti-l L-1 ß (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta), cualquiera de las cuales puede estar detectablemente marcada. Como alternativa o adicionalmente, el conjunto de elementos puede comprender un analito marcado de manera detectable (o fragmento de éste que puede unir a un anticuerpo anti-analíto, monoclonal/policlonal o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta)), que puede competir con cualquier analito en una muestra de prueba por la unión con un anticuerpo anti-analito, monoclonal/policlonal (o fragmento de éste que puede unirse al analito, una variante de éste que pueda unirse al analito, o un fragmento de una variante que puede unirse al analito) o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento, una variante, o un fragmento de una variante de ésta), cualquiera de los cuales puede estar inmovilizado sobre un soporte sólido. El conjunto de elementos puede comprender un calibrador o control, por ejemplo, analito aislado o purificado. El conjunto de elementos puede comprender al menos un recipiente (por ejemplo, tubo, placas de microtitulación o tiras, que ya pueden estar recubiertas con un primer miembro de unión específica, por ejemplo) para llevar a cabo el ensayo, y/o un amortiguador, tal como un amortiguador de ensayo o un amortiguador de lavado, cualquiera de los cuales puede proveerse como una solución concentrada, una solución de sustrato para la marca detectable (por ejemplo, una marca enzimática), o una solución de detención. Preferiblemente, el conjunto de elementos comprende todos los componentes, o sea, reactivos, referencias, amortiguadores, diluyentes, etc., que son necesarios para llevar a cabo el ensayo. Las instrucciones pueden estar en forma de papel o en forma asequible por computadora, tal como un disco, CD, DVD, o similar.
Cualquier anticuerpo, tal como una proteína de unión anti-IL-?ß o una DVD-lg anti-analito, o trazador puede incorporar una marca detectable como se describe en la presente, tal como un fluoróforo, un grupo radiactivo, una enzima, una marca de biotina/avidina, un cromóforo, una marca quimioluminiscente, o similares, o el conjunto de elementos puede incluir reactivos para llevar a cabo el mareaje detectable. Los anticuerpos, calibradores y/o controles pueden proveerse en recipientes separados o pre-dispensados en un formato de ensayo apropiado, por ejemplo, en placas de microtitulación.
Opcionalmente, el conjunto de elementos incluye componentes de control de calidad (por ejemplo, paneles de sensibilidad, calibradores, y controles positivos). La preparación de los reactivos de control de calidad es bien conocida en la técnica y se describe en las instrucciones de una variedad de productos de inmunodiagnóstico. Los miembros del panel de sensibilidad opcionalmente se usan para estableces características del rendimiento del ensayo, y además opcionalmente son indicadores útiles de la integridad de los reactivos del conjunto de elementos de inmunoensayo, y la estandarización de los ensayos.
El conjunto de elementos o kit opcionalmente también puede incluir otros reactivos que se requieren para llevar a cabo un ensayo diagnostico o para facilitar las evaluaciones de control de calidad, tales como amortiguadores, sales, enzimas, cofactores de enzimas, sustratos de enzimas, reactivos de detección, y similares. Otros componentes, tales como amortiguadores y soluciones para el aislamiento y/o tratamiento de una muestra de prueba (por ejemplo, reactivos de pretratamiento), también pueden incluirse en el conjunto de elementos. El conjunto de elementos además puede incluir uno o más de otros controles. Uno o más de los componentes del conjunto de elementos puede esta liofilizado, en cuyo caso el conjunto de elementos además puede comprender reactivo apropiados para la reconstitución de los componentes liofilizados.
Los diferentes componentes del kit opcionalmente se proveen en recipientes apropiados según sea necesario, por ejemplo, una placa de microtitulación. El conjunto de elementos además puede incluir recipientes para sostener o almacenar una muestra (por ejemplo, un recipiente o cartucho para una muestra de orina). En los casos apropiados, el conjunto de elementos opcionalmente también pueden contener recipientes de reacción, recipientes de mezclado, y otros componentes que facilite la preparación de reactivos o de la muestra de prueba. El conjunto de elementos también puede incluir uno o más instrumentos para asistir en la obtención de una muestra de prueba, tal como una jeringa, pipeta, pinzas, cuchara de medida, o similares.
Si la marca detectable es al menos un compuesto de acridinio, el conjunto de elementos puede comprender al menos una acridinio-9-carboxamida, al menos un éster de acridinio-9-carboxilato de arilo, o cualquier combinación de éstos. Si la marca detectable es al menos un compuesto de acridinio, el conjunto de elementos también puede comprender una fuente de peróxido de hidrógeno, tal como un amortiguador, una solución, y/o al menos una solución básica. Si se desea, el conjunto de elementos puede contener una fase sólida, tal como una partícula magnética, esfera, tubo de ensayo, placa de microtitulación, cubeta, membrana, molécula de andamiaje, película, papel de filtro, disco o chip.
III. Adaptación del Conjunto de elementos (kit) y Método El kit o conjunto de elementos (o sus componentes), así como también el método para determinar la presencia, cantidad o concentración de un analito en una muestra de prueba mediante un ensayo, tal como un inmunoensayo como se describe en la presente, puede adaptarse para usar en una variedad de sistemas automatizados y semiautomatizados (incluyendo a aquellos donde la fase sólida comprende una micropartícula), como se describe, por ejemplo, en las Patentes estadounidenses N°. 5089424 y 5006309, y como se encuentra comercialmente en el mercado, por ejemplo, en Abbott Laboratories (Abbott Park, IL) como ARCHITECT®.
Algunas de las diferencias entre un sistema automatizado o semiautomatizado en comparación con un sistema no automatizado (por ejemplo, ELISA) incluye el sustrato sobre el que se adhiere el primer miembro de unión específica (por ejemplo, un anticuerpo anti-analito, monoclonal/policlonal (o fragmento de éste, una variante de éste, o un fragmento de una variante de éste) o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento de ésta, una variante de ésta, o un fragmento de una variante de ésta); de cualquier forma, puede haber un impacto sobre la formación del sándwich y la reactividad del analito, y la longitud y ritmo de la captura, detección y/o cualquier paso de lavado opcional. Mientras que un formato no automatizado, tal como un ELISA, puede requerir un tiempo de incubación relativamente más largo con la muestra y con el reactivo de captura (por ejemplo, alrededor de 2 horas), un formato automatizado o semiautomatizado (por ejemplo, ARCHITECT®, Abbott Laboratories) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, de aproximadamente 18 minutos para ARCHITECT®). En forma similar, mientras que un formato no automatizado, tal como un ELISA, puede incubar a un anticuerpo de detección, tal como el reactivo conjugado, durante un tiempo de incubación relativamente más largo (por ejemplo, alrededor de 2 horas), un formato automatizado o semiautomatizado (por ejemplo, ARCHITECT®) puede tener un tiempo de incubación relativamente más corto (por ejemplo, de aproximadamente 4 minutos para el ARCHITECT®).
Otras plataformas disponibles de Abbott Laboratories incluyen, sin limitaciones, AxSYM®, IMx® (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense N° 5294404), PRISM®, EIA (esfera), y Quantum™ II, así como también otras plataformas. Además, los ensayos, conjuntos de elementos y los componentes del conjunto de elementos pueden emplearse en otros formatos, por ejemplo, en otros sistemas de ensayo electroquímicos manuales o cerca del paciente. La presente exposición es, por ejemplo, aplicable al sistema de inmunoensayo electroquímico Abbott Point de Care (i-STAT®, Abbott Laboratories) que lleva a cabo inmunoensayos en sándwich. Los inmunosensores y los métodos para manufacturarlos y operarlos en dispositivos de prueba de un solo uso se describen, por ejemplo, en la Patente estadounidense N° 5063081, en la Publicación estadounidense N° 2003/0170881, en la Publicación estadounidense N° 2004/0018577, en la Publicación estadounidense N° 2005/0054078 y en la Publicación estadounidense N° 2006/0160164.
En particular, con relación a la adaptación del ensayo del analito con el sistema l-STAT®, se prefiere la siguiente configuración. Se fabrica un chip de silicio microfabricado con un par de electrodos de trabajo amperométricos de oro y un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. Sobre uno de los electrodos de trabajo, se adhieren esferas de poliestireno (con un diámetro de 0,2 mm) con un anticuerpo anti-analito monoclonal/policlonal (o un fragmento de éste, una variante de éste o un fragmento de una variante de éste) o con una DVD-lg (o un fragmento de ésta, una variante de ésta o un fragmento de una variante de ésta) inmovilizada, sobre un recubrimiento polimérico de alcohol polivinílico aplicado sobre el electrodo. Este chip se ensambla en un cartucho l-STAT® con un formato para fluidos apropiado para inmunoensayos. Sobre una porción de la pared de la cámara que sostiene la muestra en el cartucho hay una capa que comprende un miembro de unión específica para investigar un analito, tal como un anticuerpo anti-analito, monoclonal/policlonal (o fragmento de éste, una variante de éste, o un fragmento de una variante de éste que puede unirse al analito) o una DVD-lg anti-analito (o un fragmento de ésta, una variante de ésta, o un fragmento de una variante de ésta que puede unirse al analito), cualquiera de los cuales puede estar marcado de manera detectable. Dentro de la bolsa para fluidos del cartucho hay un reactivo acuoso que incluye fosfato de p-aminofenol.
Durante la operación, se coloca una muestra sospechada de contener un analito en la cámara para las muestras del cartucho de pruebas, y se inserta el cartucho en el lector l-STAT®. Una vez que se ha disuelto el miembro de unión específica para investigar un analito en la muestra, un elemento bomba dentro del cartucho fuerza a la muestra hacia un conducto que contiene el chip. Aquí, se la hace oscilar para promover la formación del sandwich. En el penúltimo paso del ensayo, se fuerza al fluido para que salga de la bolsa y para que entre al conducto para lavar la muestra para sacarla del chip y llevarla hacia la cámara de deshechos. En el paso final del ensayo, la marca de fosfatasa alcalina reacciona con el fosfato de p-aminofenol para escindir el grupo fosfato y permitir al p-aminofenol liberado ser oxidado electroquímicamente en el electrodo de trabajo. En base a la corriente medida, el lector es capaz de calcular la cantidad de analito en la muestra por medio de un algoritmo y una curva de calibración determinada en fábrica.
Es evidente que los métodos y conjuntos de elementos como se los describe la presente abarcan necesariamente otros reactivos y métodos para llevar a cabo el inmunoensayo. Por ejemplo, están abarcados diferentes amortiguadores tales como los que se conocen en la técnica y/o que pueden prepararse fácilmente u optimizarse para su empleo, por ejemplo, para lavar, como diluyente de conjugado, diluyente de micropartículas, y/o como diluyente de calibrador. Un ejemplo de diluyente de conjugado es el diluyente de conjugado ARCHITECT® que se emplea en ciertos conjuntos de elementos (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) y que contiene ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), una sal, un bloqueador de proteínas, un agente antimicrobiano, y un detergente. Un ejemplo de diluyente de calibrador es el diluyente de calibrador humano ARCHITECT® que se emplea en ciertos conjuntos de elementos (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), que comprende un amortiguador que contiene MES, otra sal, un bloqueador de proteínas, y un agente antimicrobiano. Adicionalmente, como se describe en la Solicitud estadounidense con el N° de Acta 12/650241 (Publicación estadounidense N° 2010/0167301, véase también la Publicación PCT N° WO 2010/078443), es posible obtener una generación de señales mejorada, por ejemplo, en un formato de cartucho l-Stat, usando una secuencia de ácido nucleico unida al anticuerpo señalizador como amplificador de la señal.
Para aquellos versados en la técnica será fácilmente evidente que son obvias otras modificaciones y adaptaciones apropiadas para los métodos de la invención que se describen en la presente, y que dichos métodos también pueden llevarse a cabo usando equivalentes apropiados, sin alejarse del alcance de la invención o las modalidades que se detallan en la presente.
Habiéndose descrito la presente invención en detalle, ésta podrá comprenderse más claramente con referencia a los siguientes ejemplos, que solamente se incluyen con fines ilustrativos y no pretenden limitar la invención.
Ejemplos Ejemplo 1. Generación de anticuerpos contra la IL-?ß humanizados y madurados por afinidad a partir del clon E26 En la tabla 6 se proveen las secuencias de aminoácidos de la VH y la VL del anticuerpo de ratón humanizado E26 (GlaxoSmithKIine, Publicación PCT N° WO 95/01997). Los residuos de aminoácidos de las CDR individuales de las secuencias de la VH y de la VL se indican en negrita.
Tabla 6. Secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL del anticuerpo E26 humanizado Los anticuerpos de ratón E26 humanizados y madurados por afinidad se obtuvieron como se describe a continuación. Se construyó una biblioteca de cadenas ligeras de manera tal que presentara mutaciones en los siguientes residuos: CDRL1: 30, 31 y 32; CDRL2: 50, 53, 55 y 56; CDRL3: 92, 93, 94, 96 y 97 (de acuerdo con la numeración de Kabat). Se construyeron dos bibliotecas de cadenas pesadas de manera tal que presentaran mutaciones en CDRH1 y en CDRH2, en los residuos 31, 33, 50, 52a, 55, 56, 57, 58 y 60 (de acuerdo con la numeración de Kabat), o en los residuos de CDRH3 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a, 100b y 102. Las bibliotecas de cadenas pesadas también contenían diversidades binarias en los residuos 23(A/S), 24(A/S), 62(T7S), 84(P/A), 88(G/A), 91(F/Y) y 108(P/L), para permitir la creación de marcos de trabajo de la línea germinal durante la selección de las bibliotecas. Las tres bibliotecas se seleccionaron por separado, por medio de la disminución de las concentraciones de IL-?ß de mono Cynomolgus (cyno). Después, se combinaron todas las secuencias de las CDR mutadas en una biblioteca que presentaba mutaciones solamente en la CDR de la VH y en otra biblioteca que presentaba mutaciones en las seis CDR. Estas dos bibliotecas combinadas se sometieron a condiciones de selección más estrictas, con IL-?ß humana o de mono Cynomolgus, antes de identificar los anticuerpos individuales y expresarlos como proteínas de IgG para realizar la caracterización.
En la tabla 7 se provee una lista de secuencias de aminoácidos de la región VH de los anticuerpos contra la I L- 1 ß madurados por afinidad derivados de E26 humanizado. Los residuos de aminoácidos de las CDR individuales de cada secuencia VH se indican en negrita.
Tabla 7. Secuencias de aminoácidos de las variantes de la VH de E26 maduradas por afinidad La Tabla 8 provee una lista de secuencias de aminoácidos de regiones VL de anticuerpos humanizados I L- 1 ß madurados por afinidad derivados de E26. Los residuos de aminoácidos de CDR individuales de cada secuencia VL se indicant en negrita. La mutación N-terminal D (Asp) a G (Gly) que se observa en algunas de las secuencias VL maduradas por afinidad de la Tabla 8 siguiente fue probablemente el resultado de una mutagenesis no intencional ocurrida durante la reacción de cadena de poiimerasas (PCR) que se llevó a cabo durante la construcción de la biblioteca. El residuo N-terminal G se pudo eliminar sin consecuencias cuando estas regiones se utilizaron para construir moléculas de IgG.
Tabla 8. Secuencias de aminoácidos de variantes E26 VL maduradas por afinidad Las secuencias de las CDR individuales de las regiones VH y VL de los anticuerpos contra la I L- 1 ß madurados por afinidad a partir de E26 humanizado en las tablas anteriores pueden alinearse para proveer secuencias de CDR consenso como las que se detallan en la tabla 9.
Tabla 9. Secuencia consenso para las secuencias de la VH y la VL maduradas or afinidad Las secuencias de la tabla 10 se convirtieron en IgG para poder caracterizarlas. El clon E26.13 se mutó en la sección J de la región variable de las cadenas pesada y ligera para proveer E26.13 JM VH y E26.13 JM VL, respectivamente, con el propósito de eliminar las mutaciones en el marco de trabajo que no estuvieran relacionadas con la línea germinal. Los residuos de aminoácidos de las CDR individuales se indican en negrita.
Tabla 10. Secuencias de aminoácidos de las variantes de la VH y la VL de E26 maduradas por afinidad Ejemplo 2. Caracterización funcional de los anticuerpos contra la ??_-1ß Ejemplo 2.1. Protocolo del ensayo inmunosorbente ligado a enzimas de la IL-1 ß Para determinar si los anticuerpos monoclonales a nti- 1 L- 1? se unen a la I L- ß humana, se incubaron placas de ELISA (Nunc, axiSorp, Rochester, NY) durante la noche a 4°C con un anticuerpo anti-Fc humano diluido en el amortiguador Pierce Coat, a razón de 2 pg/ml (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Las placas se lavaron cinco veces en el amortiguador de lavado (PBS que contenía 0,05% de Tween 20) y se bloquearon durante 1 hora a 25°C con 200 µ? por cavidad del amortiguador de bloqueo Superblock (Thermo scientific, N° 37515). Se retiró el amortiguador de bloqueo golpeando las placas, se agregaron 2 pg/ml de cada anticuerpo en PBS que contenía 10% de Superblock y 0,5% de tween-20 a las cavidades, a razón de 100 µ? por cavidad, y se incubó a 25°C durante 1 hora. Se lavaron las cavidades cinco veces en PBST 1X y se realizó una titulación con 1 g/ml del antígeno biotinililado en diluciones de 1:6 en serie (para un rango de pg/pg en PBS que contenía 10% de Superblock y 0,05% de tween 20). Después, se agregó cada dilución del antígeno a las placas y se incubó durante 1 hora a 25°C. Las cavidades se lavaron cinco veces en PBST 1X y se incubaron durante 1 hora a 25°C con estreptavidina poliHRP (KPL N° 474-3000, Gaithersburg, MD). Las cavidades se lavaron cinco veces con PBST 1X y se agregaron 100 µ? de ULTRA-TMB ELISA (Pierce, Rockford, IL) por cavidad. Una vez revelado el color, se detuvo la reacción con HCI 1 N y se midió la absorbencia a 450 nM. Los resultados se detallan en la tabla 11, donde los valores numéricos representan la unión de los anticuerpos anti-IL-1 ß a la I L- 1 ß humana.
Tabla 11. Unión de los anticuerpos a la I L- 1 ß humana en el ELISA Ejemplo 2.2. Potencia de neutralización de los anticuerpos contra la IL- 1ß Para examinar la actividad funcional de los anticuerpos anti-IL- ß humana de la invención, se usaron los anticuerpos en el ensayo MRC-5, que permite medir la capacidad de los anticuerpos de inhibir la actividad de la IL-?ß. La línea celular MRC-5 es una línea de fibroblastos pulmonares humanos que producen IL-8 en respuesta a la I L- 1 ß humana de una manera dependiente de la dosis. Esta línea celular también produce IL-8 en respuesta a la IL-?ß de mono Cynomolgus (cyno IL-?ß). Las células MRC-5 se obtuvieron originalmente en la ATCC, se subcultivaron en MEM completo con 10% de FBS y se cultivaron a 37°C en una incubadora con 5% de C02. Para determinar la potencia de neutralización de un anticuerpo contra t L- 1 ß , se agregaron los anticuerpos (a razón de 50 µ?) a una placa de 96 cavidades (con una concentración final en un rango de entre 1E-7 y 1E-15 M) y se los preincubó con 50 µ? de I L- 1 ß humana o de cyno I L- 1 ß (con una concentración final de 50 pg/ml) durante 1 hora a 37°C, con 5% de C02. Luego se agregaron complejos de antígenos y anticuerpos (a razón de 100 µ?) a las células MRC-5 (que habían sido sembradas 24 horas antes, en una concentración de 1E5/ml, a razón de 100 µ? de células/cavidad). Las placas de ensayo se incubaron durante la noche a 37°C en una incubadora con 5% de C02. La potencia de los anticuerpos se determinó en función de su capacidad de inhibir la producción de IL-8. La producción de IL-8 humana se midió con un ensayo basado en la quimioluminiscencia. En la tabla 10 se resumen las potencias de los anticuerpos con relación a la I L- 1 ß humana y la cyno I L- .
Tabla 12. Potencias de neutralización de los anticuerpos humanizados contra la I L- 1 ß ND: no determinada Ejemplo 2.3. Medición de la afinidad de los anticuerpos contra la I L- 1 ß por resonancia de plasmón superficial El ensayo de BIACORE (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) permite determinar la afinidad de los anticuerpos con mediciones cinéticas de las constantes de afinidad y desactivación. Se determinó la unión de los anticuerpos para ! L- 1 ß humana e I L- 1 ß cyno recombinantes purificados mediante mediciones basadas en resonancia de plasmón superficial, con un instrumento Biacore® 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Suecia), usando HBS-EP continuo (HEPES 10 mM [pH 7,4], NaCI 150 mM, EDTA 3 mM y el agente tensioactivo P20 al 0,005%) a 25°C. Todas las sustancias químicas se obtuvieron en Biacore® AB (Uppsala, Suecia), a menos que se indique lo contrario. Se inmovilizaron directamente aproximadamente 5000 RU del fragmento específico de un anticuerpo policlonal de IgG de cabra anti-ratón (FcD) (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, Illinois), diluido en acetato de sodio 10 mM (pH 4,5), a través de un chip biosensor CM5 de grado de investigación, usando un conjunto de elementos convencional para la asociación de aminas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y procedimientos con una concentración de 25 pg/ml. Las fracciones no reactivas sobre la superficie del biosensor fueron bloqueadas con etanolamina. Como superficie de reacción, se usó una superficie de carboximetil dextrano modificado en las celdas de flujo 2 y 4. El carboximetil dextrano no modificado sin IgG de cabra anti-humana en las celdas de flujo 1 y 3 se usó como superficie de referencia. Para el análisis cinético, se ajustaron las ecuaciones de velocidad derivadas del modelo de unión 1:1 de Langmuir, de manera simultánea con las fases de activación y desactivación de las ocho inyecciones (usando el análisis de ajuste global), con el uso del programa informático Biaevaluation 4.0.1. Los anticuerpos purificados se diluyeron en solución salina amortiguada con HEPES para capturarlos a través de superficies de reacción específicas para IgG de cabra antiratón. Se inyectaron los anticuerpos de ratón para capturarlos como ligandos (a razón de 25 µ?/???) sobre las matrices de reacción con una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto. Los anticuerpos que habrían de capturarse como ligandos (a razón de 25 pg/ml) se inyectaron en las matrices de reacción con una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto. Se determinaron las constantes de activación y de desactivación, kon (unidad M"1s"1) y koff (unidad s"1), con una velocidad de flujo continua de 25 µ?/minuto. Las constantes se obtuvieron realizando mediciones cinéticas de la unión con diez concentraciones diferentes del antígeno en el rango de entre 10 y 200 nM. A continuación, se calculó la constante de equilibrio de desactivación (unidad M) de la reacción entre los anticuerpos humanizados y el antígeno objetivo a partir de las constantes cinéticas, a través de la siguiente fórmula: KD = koff/kon. Se registró la unión en función del tiempo y se calculan las constantes cinéticas. Con este ensayo pueden medirse velocidades de activación de hasta 106 M"1s"1 y velocidades de desactivación mínimas de 10"6 s"1. En la tabla 13 se presentan las mediciones de la afinidad de los anticuerpos anti-IL-1 ß humana.
Tabla 13. Afinidad de los anticuerpos por la I L- 1 ß humana y por la l L- 1 ß en el ensayo de Biacore ND: no determinada Ejemplo 3. Generación de moléculas DVD-lg™ contra IL-1 a/ß Ejemplo 3.1. Preparación de las construcciones de DNA de las DVD-lg contra I L- 1 a/ß Se combinó un dominio variable de un anticuerpo anti-IL-1a ("X3", véase la Publicación PCT N° WO 95/14780) con múltiples dominios variables de anticuerpos contra la I L- ß en un formato de DVD-lg (Wu et al., Nature Biotechnol., 25: 1290-1297 (2007); Publicación PCT N° WO 2007/024715 A2), por medio de una amplificación por PCR de superposición, con secuencias de DNA conectoras intermedias. X3 también se mutó en la sección J de la región variable de las cadenas pesada y ligera para obtener X3 JM VH y X3 JM VL, respectivamente, con el propósito de eliminar las mutaciones en el marco de trabajo que no estuvieran relacionadas con la línea germinal. Los productos amplificados en la PCR se subclonaron en vectores de expresión apropiados para la expresión transitoria en células HEK293, y las regiones del marco abierto de lectura se confirmaron por secuenciación antes de la expresión de las DVD-lg.
Ejemplo 3.2. Expresión y producción de las proteínas de unión a IL-?a/ß DVD-lg Una vez confirmada la secuencia del DNA, todas las construcciones de DNA de DVD-lg se expandieron en E. coli, después de lo cual se purificó el DNA usando el conjunto de elementos Qiagen Hispeed Maxi Prep (N° de catálogo 12662, QIAGEN). El DNA de las DVD-lg se transfectó en células 293E en fase logarítmica (0,5 x 106/ml, con una viabilidad >95%), mediante la mezcla de PEI y DNA en una proporción de 2:1, con 0,2 pg/ml de DNA de la cadena pesada y 0,3 g/ml de DNA de la cadena ligera. El complejo de DNA y PEI se formó a temperatura ambiente en una campana TC durante quince minutos, antes de agregar las células 293E. Veinticuatro horas después, se agregó 0,5% de TN1 a las células 293E. El quinto día, se recolectó el sobrenadante para medir la titulación de la lgG1 humana. El séptimo día, se recolectó el sobrenadante celular y se lo filtró a través de un tamiz de PES de 0,2 µ?. El sobrenadante se purificó usando una cromatografía de afinidad con proteína A en sefarosa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las DVD-lg purificadas se eluyeron de la columna con glicina 0,1 M (pH 2,99) y se dializaron en un amortiguador de histid i na 15 mM (pH 6,0) de inmediato. Las proteínas de unión se cuantificaron sobre la base de la A280 y se sometieron a análisis de espectrometría de masa y de SEC.
Ejemplo 3.3. Secuencias de las construcciones de DVD-lg contra IL-1a/ß Se determinaron las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de las proteínas DVD-lg capaces de unirse a la IL-?ß humana y a la I L-1 a humana. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada variable (VH), la cadena ligera variable (VL), la cadena ligera constante (CL) y la cadena pesada constante (CH) de las proteínas de unión a IL-?a/ß DVD-lg se detallan en la tabla 14 a continuación. En la tabla 14, las secuencias de aminoácidos de las regiones E26.13 y E26.35 VL se denominan SEQ ID N° 238 y SEQ ID N° 239, respectivamente, en lugar de SEQ ID N° 205 y SEQ ID N° 209, como se había indicado con anterioridad en la tabla 10, para dar cuenta de la inclusión de un residuo de arginina (R) en el extremo C. Aquellos versados en la técnica del diseño de anticuerpos han de comprender que este residuo de arginina en el extremo C es el residuo de aminoácido que se halla en la unión de las regiones VL y CL kappa en una molécula de IgG, y en ocasiones se lo incluye en la región CL, o como en el caso de la tabla 14 a continuación, en la región VL.
Tabla 14. Secuencias de las regiones variables y constantes de las proteínas de unión a IL-?a/ß DVD-lg Las secuencias conectoras se señalan como residuos subrayados.
Ejemplo 4. Caracterización funcional de las proteínas de DVD-lg contra IL-?a/ß Ejemplo 4.1. Protocolo del ensayo inmunosorbente ligado a enzimas con IL-?a/ß La unión entre las proteínas de unión a IL-?a/ß DVD-lg y la IL-?ß o la IL-1a se evaluó con un ELISA (el ensayo que se describió con anterioridad en el ejemplo 2.1). Los resultados se proveen en la tabla 15.
Tabla 15. Unión de las proteínas de DVD-lg contra IL-?a/ß a la IL-1 a o la l L- 1 ß humana, determinada por ELISA Ejemplo 4.2. Ensayo con I L- 1 a/ß y ensayo de neutralización Se sembraron células MRC5 a razón de 1,5-2 x 104 células por cavidad en un volumen de 100 µ?, después de lo cual se las incubó durante la noche a 37°C, con 5% de C02. Se preparó una solución madre de trabajo con 20 pg/ml de DVD-lg (concentrada 4x) en un medio MEM completo. Se realizó una dilución en serie de ocho puntos (5 pg/ml-0,0003 pg/ml) en MEM completo en placas de dilución Marsh. Se colocaron sesenta y cinco µ?/cavidad de cada dilución del anticuerpo por cuadruplicado en una placa de 96 cavidades con fondo en V (Costar N° 3894) y se agregaron 65 µ? de una solución con 200 pg/ml de 1L-1 a o de I L- 1 ß , o bien 65 µ? de una solución mixta que contenía 50 pg/ml de IL-1a e I L- 1 ß . En las cavidades, se colocaron 65 µ? de una solución con 200 pg/ml de I L-1 a o de I L- ß , o bien de una solución con 50 pg/ml de una combinación de I L-1 a/ß (concentrada 4x) más 65 µ? del medio MEM. En 'as cavidades control, se colocaron 130 µ? de del medio. Después de una incubación que se prolongó durante 1 hora, se agregaron 100 µ? de la mezcla de DVD-lg/Ag a las cavidades con las células MRC5. Los volúmenes de todas las cavidades fueron idénticos entre sí: 200 µ?. Posteriormente, los reactivos de todas las placas se llevaron hasta una concentración 1x. Después de incubar durante 16-20 horas, se transfirieron los contenidos de las cavidades (150 µ?) a una placa de 96 cavidades con fondo redondo (Costar N° 3799) y se los colocó en un congelador a -20°C. Se evaluaron los niveles de hlL-8 en los sobrenadantes usando un conjunto de elementos de ELISA para la IL-8 humana (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) o un ensayo de MSD para la hlL-8 (conjunto de elementos de quimioluminiscencia). La potencia de neutralización se determinó calculando el porcentaje de inhibición con relación al valor control de la IL-1a, la IL-?ß o las IL-?a/ß (tabla 16).
Tabla 16. Potencia de las moléculas de DVD-lg contra IL-?a/ß sobre la IL-1a y la I L- 1 ß humanas y la I L- 1 a y la l L- 1 ß de mono Cynomolgus ND: no determinada Ejemplo 4.3. Medición de la afinidad de las moléculas de DVD-lg contra IL-?a/ß La unión de las DVD-lg contra IL-?a/ß a la I L-1 ß y la IL-1a humanas recombinantes y a la I L- 1 ß y la I L- 1 a de mono Cynomolgus recombinante se determinó usando una resonancia de plasmón superficial, según se describió en el ejemplo 2.3. Los resultados se proveen en la tabla 17.
Tabla 17. Medición de la afinidad de las moléculas de I L-1 a/ß con DVD- lg Incorporación a modo de referencia En la presente invención se incorporan por completo a modo de referencia las técnicas bien conocidas en el campo de la biología molecular. Estas técnicas incluyen, sin limitaciones, las técnicas que se describen en las siguientes publicaciones. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Ausubel, F. M. et al. editores, Short Protocols In Molecular Biology (4a edición, 1999) John WHey & Sons, NY. (ISBN 0-471 -32938-X). Controlled Drug Bioavailability Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (editores), Wiley, Nueva York (1984); Giegé et al., capítulo 1 de Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach, 2a edición (Ducruix y Giegé, editores) (Oxford University Press, Nueva York, 1999) pp. 1-16; Goodson, J.M., Chapter 6, In Medical Applications of Controlled Reléase, Vol. II, Applications and Evaluation (Langer y Wise, editores) (CRC Press, Inc., Boca Ratón, 1984), pp. 115-138; Hammerling et al., editores, "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas", en Research Monographs in Immunology, vol. 3 (J.L. Turk, editor general) (Elsevier, Nueva York, 1981), pp. 563-587; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edición, 1988); Kabat et al., Secuencias of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987); Kabat, E. A., et al. (1991) Secuencias of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación del INS N° 91-3242; Kontermann y Dübel, editores, Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. Nueva York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual. Stockton Press, NY (1990); Lu y Weiner editores, Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press. Westborough, Mass. 298 pp. (ISBN 1 -881299-21 -X); Goodson, J.M., Medical Applications of Controlled Reléase (Langer y Wise, editores) (CRC Press, Boca Ratón, 1974); Oíd y Primrose, Principies of Gene Manipularon: An Introduction To Genetic Engineerinq (3a edición, 1985) Blackwell Scientific Publications, Boston; Studies in Microbioloqy, V.2:409 pp. (ISBN 0-632-01318-4); Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. Vol. 1-3 (ISBN 0-87969-309-6); Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems (J.R. Robinson, ed.) (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978); Winnacker, E.L. From Genes To Clons: Introduction To Gene Technology (1987) VCH Publishers, N.Y. (traducido por Horst Ibelgaufts), 634 pp. (ISBN 0-89573-61 -4).
El contenido de todas las referencias citadas (incluyendo las referencias bibliográficas, las patentes, las solicitudes de patentes y los sitios de Internet) que se citan a lo largo de esta solicitud se incorpora en su totalidad en la presente a modo de referencia y para todo propósito, del mismo modo que las referencias citadas en ellas. A menos que se indique lo contrario, en la práctica de la presente invención se emplearán procedimientos convencionales de inmunología, biología molecular y biología celular bien conocidos en la técnica.
Equivalentes La presente invención puede realizarse en otras formas específicas sin apartarse de su espíritu o sus características esenciales. Por consiguiente, las modalidades precedentes se consideran ilustrativas en todos los aspectos y no limitantes de la invención que se describe en la presente. En consecuencia, el alcance de la invención está indicado por las reivindicaciones adjuntas, en lugar de la descripción precedente. Todas las modificaciones que se encuentren dentro del significado y el rango de equivalencia de las reivindicaciones estarán comprendidas dentro de dicho alcance.

Claims (122)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de unión que comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica, caracterizada porque dicha cadena polipeptídica comprende VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un conector con la condición de que no sea CH1. X2 es una región Fe; y n es independientemente 0 ó 1; y donde dicha segunda cadena polipeptídica comprende un segundo VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un conector con la condición de que no sea CH1. X2 no comprende una región Fe; y n es independientemente 0 ó 1; donde, en dicha primera cadena polipeptídica, VD1 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 60-148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 y 210, y VD2 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 213 y 227; donde, en dicha segunda cadena polipeptídica, VD1 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 149-189, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209 y 211, y VD2 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 216 y 229; y donde la proteína de unión se une a la I L- 1 ß humana y a la I L- 1 a humana.
2. Una proteína de unión que comprende una primera y una segunda cadena polipeptídica, caracterizada porque dicha cadena polipeptídica comprende VD1 -(X1 )n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena pesada; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada; C es un dominio constante de la cadena pesada; X1 es un conector con la condición de que no sea CH1. X2 es una región Fe; y n es independientemente 0 ó 1; y donde dicha segunda cadena polipeptídica comprende un segundo VD1- (X1)n-VD2-C-(X2)n, donde VD1 es un primer dominio variable de la cadena ligera; VD2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera; C es un dominio constante de la cadena ligera; X1 es un conector con la condición de que no sea CH1. X2 no comprende una región Fe; y n es independientemente 0 ó 1; donde, en dicha primera cadena polipeptídica, VD1 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 213 y 227, y VD2 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 60-148, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 y 210; donde, en dicha segunda cadena polipeptídica, VD1 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 216 y 229, y VD2 comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 149-189, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209 y 211; y donde la proteína de unión se une a la I L- ß humana y a la I L- 1 a humana.
3. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha primera cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 212, 217, 226, 230, 232, 234 y 236.
4. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 215, 218, 228, 231, 233, 235 y 237.
5. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque dicha primera cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 219 y 221.
6. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 220 y 222.
7. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque, cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 212, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 215, 228, 231, 233 y 235; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 217, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 218 y 237; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 219, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 220; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 221, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 222; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 226, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 228, 215, 231, 233 y 235; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 230, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 231, 215, 228, 233 y 235; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 232, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 233, 215, 228, 231 y 235; cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 234, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 235, 215, 228, 231, y 233; y cuando dicha primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N° 236, luego dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 237.
8. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada porque dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 212 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 215; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 217 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 218; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 219 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 220; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 221 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 222; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 226 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 228; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 230 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 231; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 232 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 233; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 234 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 235; o dicha primera cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 236 y dicha segunda cadena polipeptídica comprende SEQ ID N° 237.
9. La proteína de unión de la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de unión comprende dos primeras cadenas polipeptídicas y dos segundas cadenas polipeptídicas.
10. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque X1 o X2 son una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 26-57, 233, 224 y 225.
11. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque la región Fe se selecciona del grupo que consiste en una región Fe con una secuencia nativa y una región Fe con una secuencia que es una variante.
12. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque la región Fe se selecciona del grupo que consiste en una región Fe de una lgG1, una lgG2, una lgG3, una lgG4, una IgA, una IgM, una IgE o una IgD.
13. Un conjugado con una proteína de unión que comprende una proteína de unión como la que se describe en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque dicho conjugado con la proteína de unión también comprende un agente que se selecciona del grupo que consiste en una molécula de inmunoadhesión, un agente para el diagnóstico por imágenes, un agente terapéutico y un agente citotóxico.
14. El conjugado con una proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho agente es un agente para el diagnóstico por imágenes que se selecciona del grupo que consiste en una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética y la biotina.
15. El conjugado con una proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque dicho agente para el diagnóstico por imágenes se selecciona del grupo que consiste en 3?, 14C. 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho y 153Sm.
16. El conjugado con una proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicho agente es un agente terapéutico o citotóxico que se selecciona del grupo que consiste en un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, una toxina y un agente apoptótico.
17. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha proteína de unión es una proteína de unión cristalizada.
18. La proteína de unión cristalizada de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque dicha proteína de unión cristalizada es una proteína de unión a la l L- 1 ß cristalizada farmacéutica de liberación controlada que está libre de vehículos.
19. La proteína de unión cristalizada de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizada porque dicha proteína de unión cristalizada presenta una vida media in vivo más prolongada que la de su contraparte soluble.
20. La proteína de unión cristalizada de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizada porque dicha proteína de unión cristalizada conserva su actividad biológica.
21. Una composición para la liberación de una proteína de unión, caracterizada porque comprende (a) una formulación, donde dicha formulación comprende una proteína de unión cristalizada como la que se describe en la reivindicación 17 y un ingrediente; y (b) al menos un vehículo polimérico.
22. La composición de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizada porque dicho vehículo polimérico es un polímero que se selecciona del grupo que consiste en el ácido poli(acrílico), los poli(cianoacrilatos), los poli(aminoácidos), los poli(anhídridos), los poli(depsipéptidos), los poli(ésteres), el ácido poli(láctico), el ácido poli(láctico-co-glicólíco) o PLGA, el poli(b-hidroxibutirato), la poli(caprolactona), la poli(dioxanona), el poli(etilenglicol), la poli((hidroxipropil)metacrilamida, el poli[(organo)fosfaceno], los poli(ortoésteres), el alcohol poli(vinílico), la poli(vinilpirrolidona), los copolímeros de anhídrido maleico-éter alquilvinilico, los polioles plurónicos, la albúmina, el alginato, la celulosa y los derivados de celulosa, el colágeno, la fibrina, la gelatina, el ácido hialurónico, los oligosacáridos, los glucaminoglucanos y los polisacáridos sulfatados, así como las mezclas o los copolímeros de éstos.
23. La composición de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizada porque dicho ingrediente se selecciona del grupo que consiste en la albúmina, la sacarosa, la trehalosa, el lactitol, la gelatina, la hidroxipropil- -ciclodextrina, el metoxipolietilenglicol y el polietilenglicol.
24. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una proteína de unión como la que se describe en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
25. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizada porque también comprende al menos un agente adicional.
26. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 25, caracterizada porque dicho agente adicional se selecciona del grupo que consiste en un agente terapéutico, un agente para el diagnóstico por imágenes, un agente citotóxico, un inhibidor de la angiogénesis, un inhibidor de cinasas, un bloqueador de las moléculas de co-estimulación, un bloqueador de las moléculas de adhesión, un anticuerpo anti-citocina o un fragmento funcional de éste, el metotrexato, la ciclosporina, la rapamicina, FK506, una marca o un indicador detectable, un antagonista del TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, una droga antiinflamatoria no esferoidal (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteriode, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, una droga de reemplazo hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, una medicación para el asma, un beta agonista, un esferoide inhalado, un esteroide oral, una epinefrina o un análogo de ésta, una citocina y un antagonista de citocina.
27. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un conjugado con una proteína de unión como el que se describe en la reivindicación 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
28. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizada porque el conjugado con una proteína de unión comprende un agente para el diagnóstico por imágenes que se selecciona del grupo que consiste en una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética y la biotina.
29. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 28, caracterizada porque dicho agente para el diagnóstico por imágenes se selecciona del grupo que consiste en 3H, C. 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 166Ho y 53Sm.
30. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 27, caracterizada porque dicho conjugado con una proteína de unión comprende un agente terapéutico o citotóxico que se selecciona del grupo que consiste en un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, una toxina y un agente apoptótico.
31. Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena polipeptídica que tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión como la que se describe en la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
32. Un vector caracterizado porque comprende una o más moléculas de ácidos nucleicos aisladas de acuerdo con la reivindicación 31.
33. El vector de acuerdo con la reivindicación 32, caracterizado porque dicho vector se selecciona del grupo que consiste en pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pcDNA3.1 TOPO, pEF6 TOPO y pBJ.
34. Una célula huésped caracterizada porque comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 32.
35. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 34, caracterizada porque dicha célula huésped es una célula procariótica.
36. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 35, caracterizada porque dicha célula huésped es Escherichia col¡.
37. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 34, caracterizada porque dicha célula huésped es una célula eucariótica.
38. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 37, caracterizada porque dicha célula eucariótica se selecciona del grupo que consiste en una célula protista, una célula animal, una célula vegetal y una célula fúngica.
39. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 38, caracterizada porque dicha célula huésped es una célula de levadura.
40. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 39, caracterizada porque dicha célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae.
41. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 38, caracterizada porque dicha célula animal se selecciona del grupo que consiste en una célula de mamífero, una célula de ave y una célula de insecto.
42. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizada porque dicha célula animal es una célula CHO o una célula COS.
43. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 41, caracterizada porque dicha célula huésped es una célula de insecto Sf9.
44. Un método para producir una proteína de unión caracterizado porque comprende cultivar una célula huésped como la que se describe en la reivindicación 34 en un medio de cultivo, bajo condiciones apropiadas para producir la proteina de unión.
45. Una proteína de unión caracterizada porque es producida de acuerdo con el método de la reivindicación 44.
46. Un método para reducir la actividad de la IL-1 humana caracterizado porque comprende poner en contacto una proteína IL-1 humana con una proteína de unión como la que se describe en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, de manera tal de reducir la actividad de la proteína IL-1 humana.
47. Un método para reducir la actividad de la IL-1 humana en un sujeto humano que padece un trastorno en el cual la actividad de la IL-1 es perjudicial, caracterizado porque comprende administrarle al sujeto humano la proteína de unión de la reivindicación 12, de manera tal de reducir la actividad de la IL-1 humana en el sujeto humano.
48. Un método para tratar un sujeto que padece un trastorno en el cual la actividad de la IL-1 es perjudicial, caracterizado porque comprende administrarle al sujeto una proteina de unión como la que se describe en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o un cristal de ésta, de manera tal de efectuar el tratamiento.
49. El uso de la reivindicación 48, caracterizado porque dicho trastorno se selecciona del siguiente grupo: diabetes, uveitis, dolor neuropático, dolor osteoartítico, dolor inflamatorio, artritis reumática, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes autoinmune, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, escleroderma, enfermedad de injerto versus huésped, rechazo de transplante de órganos, enfermedad inmune aguda o crónica asociada al transplante de órganos, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada (DIC), enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis crónica activa, uveítis autoinmune, shock séptico, síndrome de shock tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, malignidades, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, esporádica, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II (síndrome de Schmidt), síndrome agudo de dificultad respiratoria de adultos (ARDS), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriática, artropatía eolítica ulcerosa, sínovitis enteropática, artropatía asociada a Chlamydia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliácea, penfigoide, enfermedad por IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica Coombs positiva, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes (GCA), hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (AIDS), enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia común variada (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, esterilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a enfermedades del tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a enfermedades del tejido conectivo mixtas, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémicas, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la artritis reumática, enfermedad pulmonar asociada al lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada a la dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada a la espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada a la hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por drogas, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterans, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar linfocítica infiltrante, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo-1 (hepatitis autoinmune o lupoíde clásica), hepatitis autoinmune tipo-2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, esterilidad masculina idiopática, infertilidad masculina asociada con óxido nítrico, autoinmunidad al esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos, incluyendo la esclerosis múltiple primaría progresiva, la esclerosis múltiple secundaria progresiva y la esclerosis múltiple recurrente remitente), oftalmía simpática, hipertensión pulmonar secundaria a una enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumática, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjorgren, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocítopenia autoinmune (AITP), trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroide autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primaría, uveítis facogénica, vasculitis primaria, vitíligo, enfermedad hepática aguda, enfermedad hepática crónica, cirrosis alcohólica, daño hepático inducido por alcohol, colestasis, enfermedad hepática idiosincrátíca, hepatitis inducida por drogas, esteatohepatitís no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por tipo Th2 y tipo Th1, dolor agudo y crónico (distintas formas de dolor), cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga, de colon, de páncreas, de ovario, de próstata o rectal), malignidades hematopoyéticas, leucemia, linfoma, abetalipoproteinemia, acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos o crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL de las células T, ALL FAB, leucemia mieloide aguda (AML), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia del AIDS, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo a aloinjertos, déficit de alfa-1 -antitripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina pectoris, degeneración de células del asta anterior, terapia anti-CD3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arterioesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación auricular (sostenida o paroxística), taquicardia auricular, bloqueo aurículoventricular, linfoma de células B, rechazo de injerto óseo, rechazo de transplante de médula ósea (B T), bloqueo de ramas de haz de His, linfoma de Burkitt, acidez estomacal, arritmias cardiacas, síndrome de atontamiento cardiaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación a una derivación, rechazo al transplante de cartílago, degeneraciones de la corteza del cerebelo, trastornos del cerebelo, taquicardia auricular caótica o multifocal, trastornos asociados a la quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CML), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), intoxicación crónica por salicilato, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis con cultivo negativo, fibrosis quística, trastornos asociados a una terapia con citocinas, demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica del dengue, dermatitis, afecciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad ateriosclerótica diabética, enfermedad de cuerpos difusos de Lewy, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos del ganglio basal, síndrome de Down en la edad madura, trastornos del movimiento inducidos por drogas que bloquean los receptores de dopamina del CNS, sensibilidad a drogas, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por el virus Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo al implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos funcionales de las arterias periféricas, sepsis fúngicas, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo a injertos de cualquier órgano o tejido, sepsis Gram-negativa, sepsis Gram-positiva, granulomas debidos a organismos intracelulares, leucemia de células pilosas, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo al transplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, hemorragia, hepatitis A, arritmias del haz de His, infección por HlV/neuropatía por HIV, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimientos hiperquinéticos, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos de movimientos hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática (IPF), citotoxicidad mediada por anticuerpos, astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, lesiones por reperfusión isquémica, accidente cerebrovascular isquémico, artritis reumática juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo al transplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo al transplante de hígado, linfedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, cefalea de migraña de síndrome metabólico, cefalea de migraña idiopática, trastorno mitocondrial multisistémico, enfermedad del tejido conectivo mixto, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de múltiples sistemas (Menzel Dejerine-Thomas Shy-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobacterium avium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodiplástíco, infarto de miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar neonatal crónica, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica, linfoma no Hodgkins, oclusión de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos arteriales oclusivos, terapia con OKT3®, orquitis/epididimitis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo al transplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia maligna, rechazo al transplante de paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad del pericardio, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía neumocistitis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal y síndrome de cambios de piel), síndrome de post-perfusión, síndrome postbomba, síndrome de cardiotomía post-MI, preeclampsia, parálisis supranuclear progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsums, taquicardia por QRS estrecho regular, hipertensión renovascular, lesión por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, shock, anemia de células falsiformes, rechazo de aloinjertos de piel, síndrome de cambios de piel, rechazo al transplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelosas, miositis estreptococcica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxia sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumática juvenil de comienzo sistémico, telangiectasia, tromboangitis obliterans, trombocitopenia, toxicidad, transplantes, traumatismo/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades de las válvulas cardiacas, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado a virus, síndrome Wernicke-Korsakoff, síndrome Wilson, rechazo a xenoinjertos de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, polirradiculopatía inflamatoria desmielinizante aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, Alopecia areata, anafilaxis, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, anemia aplásica, aterosclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado a una infección de estreptococos, enteropatía autoinmune, pérdida de la audición autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), miocarditis autoinmune, falla ovárica prematura autoinmune, blefaritis, bronquiectasias, penfigoide bulloso, enfermedad cardiovascular, síndrome antifosfolípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatrizal, síndrome clínicamente aislado (CIS) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico de la niñez, dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, hernia de disco, prolapso de disco, anemia hemolítica inmune inducida por drogas, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de. Guillain-Barre (GBS), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad inflamatoria infecciosa ocular, enfermedad inflamatoria desmielinizante, enfermedad inflamatoria del corazón, enfermedad inflamatoria del riñon, iritis, queratitis, queratoconjuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de las células de Langerhans, Livedo reticularis, degeneración macular, poliangitis microscópica, morbus Bechterev, trastornos neuronales motores, penfigoide de la membrana mucosa, insuficiencia multiorgánica, miastenia gravis, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de las raíces nerviosas, neuropatía, hepatitis no-A no-B, neuritis óptica, osteolisis, JRA pauciarticular, enfermedad oclusiva arterial periférica (PAOD), enfermedad vascular periférica (PVD), enfermedad arterial periférica (PAD), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, JRA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendócrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR), síndrome de post-bomba, parkinsonismo primario, prostatitis, aplasia de glóbulos rojos pura, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, restenosis, enfermedad del corazón reumático, SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, pulmón de shock, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad del tejido conectivo asociada a siliconas, dermatosis de Sneddon-Wilkínson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis temporal, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversa, TRAPS (síndrome periódico asociados al receptor del factor de necrosis tumoral de tipo 1 (TNFR), resistencia a insulina tipo B con Acanthosis nigricans), reacción alérgica de Tipo 1, diabetes de Tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP), conjuntivitis vernal, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome VKH), degeneración macular húmeda, cicatrización de heridas, artropatía asociada a Yersinia y Salmonella.
50. El método de acuerdo con la reivindicación 48, caracterizado porque dicha administración al sujeto comprende al menos un modo seleccionado entre las vías parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, ¡ntrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, ¡ntraventricular, intracerebelosa, ¡ntracerebroventricular, intracolónica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraósea, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmica.
51. Un método para tratar un paciente que padece un trastorno en el que la IL-1 es perjudicial, caracterizado porque comprende el paso de administrar una proteína de unión como la que se describe en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o un cristal de ésta, antes de la administración de un segundo agente, de manera concurrente con él o después de él, donde el segundo agente se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo capaz de unirse a la I L- 1 ß humana o un fragmento de éste, un anticuerpo capaz de unirse a la I L- 1 a humana o un fragmento de éste, el metotrexato, un corticosteroide, un agonista beta, un antagonista del leucotrieno, un antagonista del receptor de leucotrieno, ADVAIR, un inhibidor de la IgE, un anticuerpo anti-lgE, XOLAIR, un inhibidor de la fosfodiesterasa, un inhibidor de la PDE4, una xantina, una droga anticolinérgica, un agente estabilizador de los mastocitos, la cromolina, un inhibidor de la IL-4, un inhibidor de la IL-5, un inhibidor de la eotaxina/CCR3, un antagonista de la histamina, un antagonista de un receptor de histamina, un antagonista de la prostaglandina D, un inhibidor del receptor DP1, un inhibidor de CRTH2, un antagonista del TNF, un fragmento soluble de un receptor del TNF, ENBREL, un antagonista enzimático del TNF, un inhibidor de la enzima convertidora del TNF (TACE), un antagonista de los receptores muscarínicos, un antagonista del TGF-beta, el interferón gamma, la perfenidona, un agente quimioterapéutico, la leflunomida, el sirolimus (la rapamicina) o un análogo de éste, CCI-779, un inhibidor de COX2 o de cPLA2, una droga antiinflamatoria no esteroidal (NSAID), un inmunomodulador, un inhibidor de p38, un inhibidor de TPL-2, un inhibidor de MK-2, un inhibidor de NFKB, la budenosida, el factor de crecimiento epidérmico, la ciclosporina, la sulfasalazina, un aminosalicilato, la 6-mercaptopurina, la azatioprina, el metronidazol, un inhibidor de la lipoxigenasa, la mesalamina, la olsalazina, la balsalazida, un antioxidante, un inhibidor del tromboxano, un antagonista del receptor de IL-1, un factor de crecimiento, un inhibidor de la elastasa, un compuesto de piridinil-imidazol, un anticuerpo o un agonista del TNF, LT, la IL-2, la IL-3, la IL-4, la IL-5, la IL-6, la IL-7, la IL-8, la IL-9, la IL-10, la IL-11, la IL-12, la IL-14, la IL-15, la IL-16, la IL-?ß, la IL-18, la IL- 19, la IL-20, la IL-21, la IL-22, la IL-23, la IL-24, la IL-25, la IL-26, la IL-27, la IL-28, la IL-29, la IL-30, la IL-31, la IL-32, la IL-33, EMAP-II, el GM-CSF, el FGF o el PDGF, un anticuerpo contra CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69 o CD90, FK506, el mofetil micofenolato, el ibuprofeno, la prednisolona, un agonista de la adenosina, un agente antitrombótico, un inhibidor del complemento, un agente adrenérgico, un inhibidor de cinasas, un inhibidor de la enzima convertidora de la 1 L- 1 ß , un inhibidor de la señalización de las células T, un inhibidor de metaloproteinasas, un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, un receptor de citocinas soluble, un receptor del TNF p55 soluble, un receptor del TNF p75 soluble, la IL-1RI soluble, la IL-1RII soluble, la IL-6R soluble, una citocina antiinflamatoria, la IL-4, la IL-10, la IL-11 y el TGF-ß.
52. Una proteína de unión caracterizada porque comprende un dominio de unión al antígeno, donde dicha proteína de unión puede unirse a la IL-?ß humana y dicho dominio de unión al antígeno comprende seis CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, que son como se las define a continuación: CDR-H1 : ?,-?-D-M-S (SEQ ID N° 190), donde X! es S, K o R; CDR-H2: Y-X2-S-X4-G-G-X7-G-T-Y-Y-P-D-X14-X15-K-G (SEQ ID N° 191), donde X2 es I o V; X4 es S o H; X7 es G o A; X14 es T o S; y X15 es V o A; CDR-H3: G-G-V-X4-K-G-X7-F-D-X10 (SEQ ID N° 192), donde X4 es T o Y; X7 es Y o C; y X10 es V, E, L, M, Q o Y; CDR-L1: R-A-S-G-N-I-Xy-Xs-Xg-L-Xn (SEQ ID N° 193), donde X7 es H, Y o W; X8 es N, G, T, Q, E, H, D o K; X9 es Y o W; y Xn es T, A o N; CDR-L2: X1-A-K-X4-L-X6-X7 (SEQ ID N° 194), donde X! es N, Q o D; X4 es T, N, I, E o S; X6 es A, M o E; y X7 es D, E, S o A; y CDR-L3: Q-X2-F-W-X5-X6-P-X8-X9 (SEQ ID N° 195), donde X2 es H o Q; X5 es S, N, T, K, R o M; X6 es I o L; X8 es Y o A; y X9 es T, I o N; excepto que, cuando CDR-H1 es S-Y-D-M-S (SEQ ID N° 17), luego CDR-H2 no puede ser Y-l-S-S-G-G-G-G-T-Y-Y-P-D-T-V-K-G (SEQ ID N° 18); CDR-H3 no puede ser G-G-V-T-K-G-Y-F-D-V (SEQ ID N° 19); CDR-L1 no puede ser R-A-S-G-N-l-H-N-Y-L-T (SEQ ID N° 20); CDR-L2 no puede ser N-A-K-T-L-A-D (SEQ ID N° 21); y CDR-L3 no puede ser Q-H-F-W-S-l-P-Y-T (SEQ ID N° 22).
53. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 52, caracterizada porque al menos una CDR comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del siguiente grupo:
54. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 52, caracterizada porque al menos tres CDR provienen de un conjunto de
CDR que se selecciona del siguiente grupo de conjuntos de CDR: proteina de unión de acuerdo con la reivindicación 54, caracterizada porque comprende CDR de dos conjuntos de CDR.
56. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 55, caracterizada porque dichos dos conjuntos de CDR se seleccionan del siguiente grupo:
57. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53 y 56, caracterizada porque también comprende un marco de trabajo aceptor humano.
58. La proteína de unión de la reivindicación 57, caracterizada porque dicho marco aceptor humano comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 7-10, 13-16, 25, 240-316 y 317-381.
59. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 57, caracterizada porque dicho marco de trabajo aceptor humano comprende al menos una sustitución de aminoácidos en la región del marco de trabajo, donde la secuencia de aminoácidos del marco de trabajo es al menos 65% idéntica a la secuencia de dicho marco de trabajo aceptor humano y comprende al menos 70 residuos de aminoácidos idénticos a los de dicho marco de trabajo aceptor humano.
60. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 57, caracterizada porque dicho marco de trabajo aceptor humano comprende al menos una sustitución de aminoácido en un residuo clave en la región del marco de trabajo, donde el residuo clave se selecciona del grupo que consiste en un residuo adyacente a una CDR, un residuo de un sitio de glicosilación, un residuo raro, un residuo capaz de interactuar con la ??_-1ß humana, un residuo capaz de interactuar con una CDR, un residuo canónico, un residuo de contacto entre una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, un residuo en una zona de Vernier y un residuo en una región de superposición entre la CDR1 de una cadena pesada variable, de acuerdo con la definición de Chotia, y el primer marco de una cadena pesada, de acuerdo con la definición de Kabat.
61. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 60, caracterizada porque el residuo, de acuerdo con la numeración de Kabat, se selecciona del grupo que consiste en 2H, 4H, 24H, 26H, 27H, 29H, 34H, 35H, 37H, 39H, 44H, 45H, 47H, 48H, 49H, 50H, 51H, 58H, 59H, 60H, 63H, 67H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H, 91H, 93H, 94H, 2L, 4L, 25L, 29L, 27bL, 33L, 34L, 36L, 38L, 43L, 44L, 46L, 47L, 48L, 49L, 55L, 58L, 62L, 64L, 71 L, 87L, 89L, 90L, 91L, 94L y 95L.
62. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 57, caracterizada porque la proteína de unión es un dominio variable humano consenso.
63. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53 y 56, caracterizada porque dicha proteína de unión comprende al menos un dominio variable que tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 60-189.
64. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 63, caracterizada porque dicha proteína de unión comprende dos dominios variables.
65. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 64, caracterizada porque dichos dos dominios variables comprenden secuencias de aminoácidos que se seleccionan del siguiente grupo:
66. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53 y 56, caracterizada porque la proteína de unión puede modular una función biológica de la IL-1.
67. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53 y 56, caracterizada porque la proteína de unión puede neutralizar la IL-1.
68. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53 y 56, caracterizada porque la proteína de unión tiene una constante de activación (Kon) con relación a la l L- 1 ß que se selecciona del grupo que consiste en al menos aproximadamente 102M' 1s"1, al menos aproximadamente 103M"1s"1, al menos aproximadamente 104M'1s"1, al menos aproximadamente 105M" s"1 y al menos aproximadamente 106M'V1, medida por resonancia de plasmón superficial.
69. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53 y 56, caracterizada porque la proteína de unión tiene una constante de desactivación (Koff) con relación a la I L- 1 ß que se selecciona del grupo que consiste en a lo sumo aproximadamente 10" 3s"1, a lo sumo aproximadamente 10"4s"1, a lo sumo aproximadamente 10" 5s"1 y a lo sumo aproximadamente 10"6s"\ medida por resonancia de plasmón superficial.
70. La proteína de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52, 53 y 56, caracterizada porque la proteína de unión tiene una constante de disociación (KD) con relación a la I L- 1 ß que se selecciona del grupo que consiste en a lo sumo aproximadamente 10~7 M, a lo sumo aproximadamente 10"8 M, a lo sumo aproximadamente 10"9 M, a lo sumo aproximadamente 10'10 M, a lo sumo aproximadamente 10" 11 M, a lo sumo aproximadamente 10"12 M y a lo sumo aproximadamente 10"13 M.
71. Una construcción con una proteína de unión a la IL-?ß, caracterizada porque comprende una proteína de unión como la que se describe en la reivindicación 52, donde dicha construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß también comprende un conector o un dominio constante de inmunoglobulina.
72. La construcción con una proteína de unión a la l L- 1 ß de acuerdo con la reivindicación 71, caracterizada porque dicha proteína de unión a la I L- 1 ß se selecciona del grupo que consiste en una molécula de inmunoglobulina, un fragmento Fv unido por enlaces disulfuro, un anticuerpo monoclonal, un fragmento scFv, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con una CDR injertada, un diacuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo multiespecífico, un fragmento Fab, un anticuerpo con especificidad doble, un fragmento Fab', un anticuerpo biespecífico, un fragmento F(ab')2, una DVD-lg™ y un fragmento Fv.
73. La construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß de acuerdo con la reivindicación 71, caracterizada porque dicha construcción con una proteína de unión comprende un dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina seleccionada del grupo formado por un dominio constante de la IgM humana, un dominio constante de la lgG4 humana, un dominio constante de la lgG1 humana, un dominio constante de la IgE humana, un dominio constante de la lgG2 humana, un dominio constante de la lgG3 humana y un dominio constante de la IgA humana.
74. La construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß de acuerdo con la reivindicación 71, caracterizada porque dicha construcción con una proteína de unión comprende un dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 y SEQ ID N° 6.
75. Un conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß caracterizado porque comprende una construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß como la que se describe en la reivindicación 71, donde dicho conjugado con una proteína de unión a la ??_-1ß también comprende un agente que se selecciona del grupo que consiste una molécula de inmunoadhesión, un agente para el diagnóstico por imágenes, un agente terapéutico y un agente citotóxico.
76. El conjugado de proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 75, caracterizado porque dicho agente es un agente para el diagnóstico por imágenes que se selecciona del grupo que consiste en una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética y la biotina.
77. El conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß de acuerdo con la reivindicación 76, caracterizado porque dicha radiomarca se selecciona del grupo que consiste en 3H 4C, 35S, 90Y, 99Tc, 111ln, 25l, 131l, 177Lu, 166Ho y 153Sm.
78. El conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß de acuerdo con la reivindicación 75, caracterizado porque dicho agente es un agente terapéutico o citotóxico que se selecciona del grupo que consiste en un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una cítocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, una toxina y un agente apoptótico.
79. La construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß de acuerdo con la reivindicación 71, caracterizada porque dicha proteína de unión presenta un patrón de glicosilación humano.
80. La proteína de unión de acuerdo con la reivindicación 52, caracterizada porque dicha proteína de unión es una proteína de unión cristalizada.
81. La construcción con una proteína de unión a la IL-?ß de acuerdo con la reivindicación 71, caracterizada porque dicha construcción con una proteína de unión a la IL-?ß es una construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada.
82. El conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß de acuerdo con la reivindicación 75, caracterizado porque dicho conjugado con una proteína de unión a la I L- ß es una proteína de unión cristalizada.
83. La proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 80, caracterizada porque dicha proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada es una proteína de unión a la 1 L- 1 ß cristalizada farmacéutica de liberación controlada que está libre de vehículos.
84. La construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 81, caracterizada porque dicha construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada es una construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada farmacéutica de liberación controlada que está libre de vehículos.
85. El conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 82, caracterizado porque dicho conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada es un conjugado con una proteína de unión a la l L- 1 ß cristalizada farmacéutica de liberación controlada que está libre de vehículos.
86. La proteína de unión a la IL-?ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 80, caracterizada porque dicha proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada presenta una vida media in vivo más prolongada que la de su contraparte soluble.
87. La construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß de acuerdo con la reivindicación 81, caracterizada porque dicha construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada presenta una vida media in vivo más prolongada que la de su contraparte soluble.
88. El conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 82, caracterizado porque dicho conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada presenta una vida media in vivo más prolongada que la de su contraparte soluble.
89. La proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 80, caracterizada porque dicha proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada conserva su actividad biológica.
90. La construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 81, caracterizada porque dicha construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada conserva su actividad biológica.
91. El conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 82, caracterizado porque dicho conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada conserva su actividad biológica.
92. Una composición para la liberación de una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 80, de una construcción con una proteína de unión a la I L- ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 81 o de un conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 82, caracterizada porque dicha composición comprende (a) una formulación, donde dicha formulación comprende una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 80, una construcción con una proteína de unión a la I L- 1 ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 81 o un conjugado con una proteína de unión a la IL-?ß cristalizada de acuerdo con la reivindicación 82, así como un ingrediente; y (b) al menos un vehículo polimérico.
93. La composición de acuerdo con la reivindicación 92, caracterizada porque dicho vehículo polimérico es un polímero que se selecciona del grupo que consiste en el ácido poli(acrílico), los poli(cianoacrilatos), los poli(aminoácidos), los poli(anhídridos), los poli(depsipéptidos), los poli(ésteres), el ácido poli(láctico), el ácido poli(láctico-co-glicólico) o PLGA, el poli(b-hidroxibutírato), la poli(caprolactona), la poli(dioxanona), el poli(etilenglicol), la poli((hidroxipropil)metacrilamida, el poli[(organo)fosfaceno], los poli(ortoésteres), el alcohol poli(vinílico), la poli(vinilpirrolidona), los copolímeros de anhídrido maleico-éter alquilvinílico, los polioles plurónicos, la albúmina, el alginato, la celulosa y los derivados de celulosa, el colágeno, la fibrina, la gelatina, el ácido hialurónico, los oligosacáridos, los glucaminoglucanos y los polisacáridos sulfatados, así como las mezclas o los copolímeros de éstos.
94. La composición de acuerdo con la reivindicación 92, caracterizada porque dicho ingrediente se selecciona del grupo que consiste en la albúmina, la sacarosa, la trehalosa, el lactitol, la gelatina, la hidroxipropil- -ciclodextrina, el metoxipolietilenglicol y el polietilenglicol.
95. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una proteína de unión como la que se describe en la reivindicación 52 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
96. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 95 caracterizada porque también comprende al menos un agente adicional.
97. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 96, caracterizada porque dicho agente adicional se selecciona del grupo que consiste en un agente terapéutico, un agente para el diagnóstico por imágenes, un agente citotóxico, un inhibidor de la angiogénesis, un inhibidor de cinasas, un bloqueador de las moléculas de co-estimulación, un bloqueador de las moléculas de adhesión, un anticuerpo anti-citocina o un fragmento funcional de éste, el metotrexato, la ciclosporina, la rapamicina, FK506, una marca o un indicador detectable, un antagonista del TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, una droga antiinflamatoria no esteroidal (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteriode, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, una droga de reemplazo hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, una medicación para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un esteroide oral, una epinefrina o un análogo de ésta, una citocina y un antagonista de citocina.
98. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß como el que se describe en la reivindicación 75 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
99. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 98, caracterizado porque el conjugado con una proteína de unión a la IL-?ß comprende un agente para el diagnóstico por imágenes que se selecciona del grupo que consiste en una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética y la biotina.
100. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 99, caracterizado porque dicho agente para el diagnóstico por imágenes se selecciona del grupo que consiste en 3H, 14C, 35S, 90Y, "Te, 111ln, 125l, 131l, 177Lu, 1B6Ho y 153Sm.
101. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 98, caracterizada porque dicho conjugado con una proteína de unión a la I L- 1 ß comprende un agente terapéutico o citotóxico que se selecciona del grupo que consiste en un anti-metabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-mitótico, una antraciclina, una toxina y un agente apoptótico.
102. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína de unión a la I L- 1 ß como la que se describe en la reivindicación 52.
103. Un vector caracterizado porque comprende un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 102.
104. El vector de la reivindicación 103, caracterizado porque dicho vector se selecciona del grupo que consiste en DNApc, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV y pBJ.
105. Una célula huésped caracterizada porque comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 103.
106. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 105, caracterizada porque dicha célula huésped es una célula procariótica.
107. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 106, caracterizada porque dicha célula huésped es Escherichia coli.
108. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 105, caracterizada porque dicha célula huésped es una célula eucariótica.
109. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 108, caracterizada porque dicha célula eucariótica se selecciona del grupo que consiste en una célula protista, una célula animal, una célula vegetal y una célula fúngica.
110. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 109, caracterizada porque dicha célula huésped es una célula de levadura.
111. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 110, caracterizada porque dicha célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae.
112. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 109, caracterizada porque dicha célula animal se selecciona del grupo que consiste en una célula de mamífero, una célula de ave y una célula de insecto.
113. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 112, caracterizada porque dicha célula animal es una célula CHO o una célula COS.
114. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 112, caracterizada porque dicha célula huésped es una célula de insecto Sf9.
115. Un método para producir una proteína de unión a la I L- 1 ß caracterizado porque comprende cultivar una célula huésped como la que se describe en la reivindicación 105 en un medio de cultivo, bajo condiciones apropiadas para producir la proteína de unión a la I L- 1 ß .
116. Una proteína de unión a la IL-?ß caracterizada porque ha sido producida de acuerdo con el método de la reivindicación 115.
117. Un método para reducir la actividad de la IL-1 humana caracterizado porque comprende poner en contacto una proteína IL-humana con una proteína de unión como la que se describe en la reivindicación 52, de manera tal de reducir la actividad de la proteína IL-1 humana.
118. Un método para reducir la actividad de la IL-1 humana en un sujeto humano que padece un trastorno en el cual la actividad de la IL-1 es perjudicial, caracterizado porque comprende administrarle al sujeto humano la proteína de unión de la reivindicación 52, de manera tal de reducir la actividad de la IL1 humana en el sujeto humano.
119. Un método para tratar un sujeto que padece un trastorno en el cual la actividad de la IL-1 es perjudicial, caracterizado porque comprende administrarle al sujeto una proteína de unión como la que se describe en la reivindicación 52, o un cristal de ésta, de manera tal de efectuar el tratamiento.
120. El uso de la reivindicación 119, caracterizado porque dicho trastorno se selecciona del siguiente grupo: diabetes, uveitis, dolor neuropático, dolor osteoartítico, dolor inflamatorio, artritis reumática, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriática, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico (SLE), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes autoinmune, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis, escleroderma, enfermedad de injerto versus huésped, rechazo de transplante de órganos, enfermedad inmune aguda o crónica asociada al transplante de órganos, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada (DIC), enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis crónica activa, uveítis autoinmune, shock séptico, síndrome de shock tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, mielitis transversa aguda, corea de Huntíngton, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, malignidades, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, esporádica, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II (síndrome de Schmidt), síndrome agudo de dificultad respiratoria de adultos (ARDS), alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriátíca, artropatía eolítica ulcerosa, sinovitis enteropática, artropatía asociada a Chlamydia, Yersinia y Salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad bullosa autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliácea, penfigoide, enfermedad por IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica Coombs positiva, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes (GCA), hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (AIDS), enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia común variada (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, esterilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótíca, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial post-inflamatoria, neumonítis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a enfermedades del tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a enfermedades del tejido conectivo mixtas, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémicas, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la artritis reumática, enfermedad pulmonar asociada al lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada a la dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada a la espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada a la hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por drogas, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterans, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar linfocítica infiltrante, enfermedad pulmonar intersticial postinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo-1 (hepatitis autoinmune o lupoide clásica), hepatitis autoinmune tipo-2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia autoinmune, resistencia a insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidisnno, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis tipo 1, psoriasis tipo 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal NOS, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, esterilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad al esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos, incluyendo la esclerosis múltiple primaria progresiva, la esclerosis múltiple secundaria progresiva y la esclerosis múltiple recurrente remitente), oftalmía simpática, hipertensión pulmonar secundaria a una enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumática, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjorgren, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenia autoinmune (AITP), trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroíde autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune bocioso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primaria, uveítís facogénica, vasculitis primaria, vitíligo, enfermedad hepática aguda, enfermedad hepática crónica, cirrosis alcohólica, daño hepático inducido por alcohol, colestasis, enfermedad hepática idíosincrática, hepatitis inducida por drogas, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos grupo B (GBS), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por tipo Th2 y tipo Th1, dolor agudo y crónico (distintas formas de dolor), cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón, de mama, de estómago, de vejiga, de colon, de páncreas, de ovario, de próstata o rectal), malignidades hematopoyéticas, leucemia, linfoma, abetalipoproteinemia, acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos o crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL de las células T, ALL FAB, leucemia mieloide aguda (AML), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, insuficiencia renal aguda, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia del AIDS, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis por contacto alérgica, rinitis alérgica, rechazo a aloinjertos, déficit de alfa-1-antitripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina pectoris, degeneración de células del asta anterior, terapia anti-CD3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad anti-receptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección aórtica, hipertensión arterial, arterioesclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación auricular (sostenida o paroxística), taquicardia auricular, bloqueo aurículoventricular, linfoma de células B, rechazo de injerto óseo, rechazo de transplante de médula ósea (BMT), bloqueo de ramas de haz de His, linfoma de Burkitt, acidez estomacal, arritmias cardiacas, síndrome de atontamiento cardiaco, tumores cardiacos, cardiomiopatía, respuesta de inflamación a una derivación, rechazo al transplante de cartílago, degeneraciones de la corteza del cerebelo, trastornos del cerebelo, taquicardia auricular caótica o multifocal, trastornos asociados a la quimioterapia, leucemia mielocítica crónica (CML), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), intoxicación crónica por salicilato, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardiaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis por contacto, cor pulmonale, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis con cultivo negativo, fibrosis quística, trastornos asociados a una terapia con citocinas, demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica del dengue, dermatitis, afecciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad ateriosclerótica diabética, enfermedad de cuerpos difusos de Lewy, cardiomiopatía congestiva dilatada, trastornos del ganglio basal, síndrome de Down en la edad madura, trastornos del movimiento inducidos por drogas que bloquean los receptores de dopamina del CNS, sensibilidad a drogas, eczema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por el virus Epstein-Barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y del cerebelo, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo al implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos funcionales de las arterias periféricas, sepsis fúngicas, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo a injertos de cualquier órgano o tejido, sepsis Gram-negativa, sepsis Gram-positiva, granulomas debidos a organismos intracelulares, leucemia de células pilosas, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo al transplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, hemorragia, hepatitis A, arritmias del haz de His, infección por HlV/neuropatía por HIV, enfermedad de Hodgkin, trastornos de movimientos hiperquinéticos, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos de movimientos hipoquinéticos, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-adrenal, enfermedad de Addtson idiopática, fibrosis pulmonar idiopática (IPF), citotoxicidad mediada por anticuerpos, astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, influenza a, exposición a radiación ionizante, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, lesiones por reperfusión isquémica, accidente cerebrovascular isquémico, artritis reumática juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo al transplante de riñon, legionella, leishmaniasis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo al transplante de hígado, linfedema, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, cefalea de migraña de síndrome metabólico, cefalea de migraña idiopática, trastorno mitocondrial multisistémico, enfermedad del tejido conectivo mixto, gammopatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de múltiples sistemas (Menzel Dejerine-Thomas Shy-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobacterium avium intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodiplástico, infarto de miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar neonatal crónica, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas I, fiebre neutropénica, linfoma no Hodgkins, oclusión de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos arteriales oclusivos, terapia con OKT3®, orquitis/epididimitis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo al transplante de páncreas, carcinoma pancreático, síndrome paraneoplásíco/hípercalcemia maligna, rechazo al transplante de paratiroides, enfermedad inflamatoria pélvica, rinitis perenne, enfermedad del pericardio, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía neumocistitis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (políneuropatía, organomegalia, endocrinopatia, gammopatía monoclonal y síndrome de cambios de piel), síndrome de post-perfusíón, síndrome postbomba, síndrome de cardiotomía post-MI, preeclampsia, parálisis supranuclear progresiva, hipertensión pulmonar primaria, terapia de radiación, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsums, taquicardia por QRS estrecho regular, hipertensión renovascular, lesión por reperfusión, cardiomiopatía restrictiva, sarcomas, escleroderma, corea senil, demencia senil de tipo cuerpo de Lewy, artropatías seronegativas, shock, anemia de células falsiformes, rechazo de aloinjertos de piel, síndrome de cambios de piel, rechazo al transplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelosas, miositis estreptococcica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafilaxia sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumática juvenil de comienzo sístémico, telangiectasia, tromboangitis obliterans, trombocytopenia, toxicidad, transplantes, traumatismo/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades de las válvulas cardiacas, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones virales y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico asociado a virus, síndrome Wernicke-Korsakoff, síndrome Wilson, rechazo a xenoinjertos de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, polirradiculopatía inflamatoria desmielinizante aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, Alopecia areata, anafilaxis, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, anemia aplásica, aterosclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmune, trastorno autoinmune asociado a una infección de estreptococos, enteropatía autoinmune, pérdida de la audición autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), miocarditis autoinmune, falla ovárica prematura autoinniune, blefaritis, bronquiectasias, penfigoide bulloso, enfermedad cardiovascular, síndrome antifosfolípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatrizal, síndrome clínicamente aislado (CIS) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico de la niñez, dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, hernia de disco, prolapso de disco, anemia hemolítica inmune inducida por drogas, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, episcleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barre (GBS), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmune, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad inflamatoria infecciosa ocular, enfermedad inflamatoria desmielinizante, enfermedad inflamatoria del corazón, enfermedad inflamatoria del riñon, iritis, queratitis, queratoconjuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de las células de Langerhans, Livedo reticularis, degeneración macular, poliangitis microscópica, morbus Bechterev, trastornos neuronales motores, penfigoide de la membrana mucosa, insuficiencia multiorgánica, miastenia gravis, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de las raíces nerviosas, neuropatía, hepatitis no-A no-B, neuritis óptica, osteolisis, JRA pauciarticular, enfermedad oclusiva arterial periférica (PAOD), enfermedad vascular periférica (PVD), enfermedad arterial periférica (PAD), flebitis, poliarteritis nodosa (o periarteritis nodosa), policondritis, polímialgía reumática, poliosis, JRA poliarticular, síndrome de deficiencia poliendócrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR), síndrome de post-bomba, parkinsonismo primario, prostatitis, aplasia de glóbulos rojos pura, insuficiencia adrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, restenosis, enfermedad del corazón reumático, SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), escleroderma, amiloidosis secundaria, pulmón de shock, escleritis, ciática, insuficiencia adrenal secundaria, enfermedad del tejido conectivo asociada a siliconas, dermatosis de Sneddon-Wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis temporal, retinitis toxoplásmica, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversa, TRAPS (síndrome periódico asociados al receptor del factor de necrosis tumoral de tipo 1 (TNFR), resistencia a insulina tipo B con Acanthosis nigricans), reacción alérgica de Tipo 1, diabetes de Tipo II, urticaria, neumonía intersticial usual (UIP), conjuntivitis vernal, retinitis viral, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome VKH), degeneración macular húmeda, cicatrización de heridas y artropatía asociada a Yersinia y Salmonella.
121. El método de acuerdo con la reivindicación 119, caracterizado porque dicha administración al sujeto comprende al menos un modo seleccionado entre las vías parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intraventricular, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracolónica, intracervical, intragástrica, ¡ntrahepática, intramiocárdica, intraósea, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, íntrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, ¡ntratorácica, intrauterina, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmica.
122. Un método para tratar un paciente que padece un trastorno en el que la IL-1 es perjudicial, caracterizado porque comprende el paso de administrar una proteína de unión como la que se describe en la reivindicación 52, o un cristal de ésta, antes de la administración de un segundo agente, de manera concurrente con él o después de él, donde el segundo agente se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo capaz de unirse a la I L- 1 ß humana o un fragmento de éste, un anticuerpo capaz de unirse a la I L- 1 a humana o un fragmento de éste, el metotrexato, un corticosteroide, un agonista beta, un antagonista del leucotrieno, un antagonista del receptor de leucotrieno, ADVAIR, un inhibidor de la IgE, un anticuerpo anti-lgE, XOLAIR, un inhibidor de la fosfodiesterasa, un inhibidor de la PDE4, una xantina, una droga anticolinérgica, un agente estabilizador de los mastocitos, la cromolina, un inhibidor de la IL-4, un inhibidor de la IL-5, un inhibidor de la eotaxina/CCR3, un antagonista de la histamina, un antagonista de un receptor de histamina, un antagonista de la prostaglandina D, un inhibidor del receptor DP1, un inhibidor de CRTH2, un antagonista del TNF, un fragmento soluble de un receptor del TNF, ENBREL, un antagonista enzimático del TNF, un inhibidor de la enzima convertidora del TNF (TACE), un antagonista de los receptores muscarínicos, un antagonista del TGF-beta, el interferón gamma, la perfenidona, un agente quimioterapéutico, la leflunomida, el sirolimus (la rapamicina) o un análogo de éste, CCI-779, un inhibidor de COX2 o de cPLA2, una droga antiinflamatoria no esteroidal (NSAID), un inmunomodulador, un inhibidor de p38, un inhibidor de TPL-2, un inhibidor de MK-2, un inhibidor de NFKB, la budenosida, el factor de crecimiento epidérmico, la ciclosporina, la sulfasalazina, un aminosalicilato, la 6-mercaptopurina, la azatioprina, el metronidazol, un inhibidor de la lipoxigenasa, la mesalamina, la olsalazina, la balsalazida, un antioxidante, un inhibidor del tromboxano, un antagonista del receptor de IL-1, un factor de crecimiento, un inhibidor de la elastasa, un compuesto de piridinil-imidazol, un anticuerpo o un agonista del TNF, LT, la IL-2, la IL-3, la IL-4, la IL-5, la IL-6, la IL-7, la IL-8, la IL-9, la IL-10, la IL-11, la IL-12, la IL-14, la IL-15, la IL-16, la IL-17, la IL-18, la IL-19, la IL-20, la IL-21, la IL-22, la IL-23, la IL-24, la IL-25, la IL-26, la IL-27, la IL-28, la IL-29, la IL-30, la IL-31, la IL-32, la IL-33, EMAP-II, el GM-CSF, el FGF o el PDGF, un anticuerpo contra CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69 o CD90, FK506, el mofetil micofenolato, el ibuprofeno, la prednisolona, un agonista de la adenosina, un agente antitrombótico, un inhibidor del complemento, un agente adrenérgico, un inhibidor de cinasas, un inhibidor de la enzima convertidora de la IL- ß, un inhibidor de la señalización de las células T, un inhibidor de metaloproteinasas, un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, un receptor de citocinas soluble, un receptor del TNF p55 soluble, un receptor del TNF p75 soluble, la IL-1RI soluble, la IL-1RII soluble, la IL-6R soluble, una citocina antiinflamatoria, la IL-4, la IL-10, la IL-11 y el TGF-ß.
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