MX2012005932A - Plantas de soya tolerantes a herbicidas y metodos para indentificar las mismas. - Google Patents
Plantas de soya tolerantes a herbicidas y metodos para indentificar las mismas.Info
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Abstract
La invención proporciona plantas de fríjol de soya transgénicas específicas, material de planta y semillas, caracterizados en que estos productos albergan una pila de eventos de transformación específicos en ubicaciones específicas en el genoma del fríjol de soya. También se proporcionan las herramientas que permiten identificación rápida e inequívoca de estos eventos en muestras biológicas.
Description
PLANTAS DE SOYA TOLERANTES A HERBICIDAS Y MÉTODOS PARA
IDENTIFICAR LAS MISMAS
REFERENCIA CRUZADA CON LAS SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/367,251, presentada el 23 de julio de 2010; la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/263,707, presentada el 23 de noviembre de 2009; y la solicitud de patente europea núm. EP 09014565.7, presentada el 23 de noviembre de 2009, cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se relaciona con plantas transgénicas de soya, material vegetal y semillas, que se caracterizan porque alojan al menos dos eventos de transformación específicos, particularmente por la presencia de al menos dos conjuntos de genes que codifican proteínas que confieren tolerancia a herbicida, cada uno en una ubicación específica en el genoma de la soya. Las plantas de soya de la invención combinan el fenotipo de tolerancia a herbicida con un desempeño agronómico, estabilidad genética y funcionalidad en diferentes fondos genéticos equivalentes a la línea de soya no transformada en ausencia de herbicida (s) . Esta invención proporciona además métodos y kits para identificar la presencia del material vegetal que comprende específicamente el evento de transformación EE-GM3 y EE-GM2 o EE-GM1 en muestras biológicas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La expresión fenotípica de un transgen en una planta se determina tanto por la propia estructura del gen o los genes mismos como por su(s) ubicación (es) en el genoma de la planta. Al mismo tiempo la presencia de los transgenes o "ADN foráneo" en diferentes ubicaciones en el genoma influirá de maneras diferentes en el fenotipo entero. La introducción agronómica o industrialmente próspera de un rasgo comercialmente interesante en una planta por manipulación genética puede ser un procedimiento largo en función de diferentes f ctores. La transformación y regeneración verdadera de las plantas genéticamente transformadas sólo son las primeras de una serie de etapas de selección, que incluyen la caracterización genética extensiva, reproducción, y la evaluación en ensayos de campo, que conducen al final a la selección de un evento élite.
La identificación inequívoca de un evento élite se vuelve cada vez más importante en vista de los debates sobre nuevos alimentos/piensos, segregación de GMO y productos no-GMO y la identificación del material registrado. Lo mejor sería que tal método de identificación sea rápido y simple, sin la necesidad de un montaje extensivo de laboratorio. Además, el método debe proporcionar resultados que permitan la determinación inequívoca del evento élite sin la interpretación del experto, pero si es necesario que se mantenga bajo el escrutinio de un experto. En este documento se describen las herramientas específicas para usar en la identificación del evento élite EE-GM3 y de EE-GMl o EE-GM2 en muestras biológicas.
En esta invención, se identificó EE-GM3 como un evento élite de una población de plantas transgénicas de soya en el desarrollo de soya tolerante a herbicida (Glycine max) que comprende un gen que codifica para la tolerancia al glifosato combinado con un gen que confiere la tolerancia a inhibidores de 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) , cada uno bajo el control de un promotor expresable en plantas .
Se identificaron previamente EE-GMl y EE-GM2 como los eventos élites de una población de plantas transgénicas de soya en el desarrollo de soya tolerante a herbicida {Glycine max) que comprende un gen que codifica para la tolerancia a glufosinato bajo el control de un promotor expresable en planta y se describen en O2006/108674 y WO2006/108675 (ambas publicaciones se incorporan en este documento como referencia) .
Se describieron en la técnica las plantas de soya que comprenden un gen de tolerancia a herbicida. Sin embargo, ninguna de las descripciones de la técnica anterior enseña o sugiere la presente invención.
Se conoce en la técnica que lograr un evento de transformación élite de tolerancia a herbicida comercial en plantas de soya con desempeño agronómico aceptable, sin retrasar el rendimiento, y que proporcione una tolerancia a herbicida suficiente para 3 clases diferentes de herbicidas, no es de ningún modo sencillo.
En efecto se reportó que el primer evento de la soya (evento 40-3-2) liberado en el mercado con tolerancia a herbicida, tuvo un retraso significativo del rendimiento comparado con líneas (casi-) isogénicas (Elmore y otros (2001) Agron. J. 93:408-412).
También, las soyas Optimum™ GAT™ (evento 356043) se desarrollaron al combinar la tolerancia a glifosato con la tolerancia a herbicidas ALS, pero se reportó que estas soyas solas no cumplieron los estándares para la tolerancia a glifosato (sin la combinación con otro evento de soya de tolerancia a glifosato (tal como evento 40-3-2) (ver, por ejemplo, 0
www . bloomberg . com/apps/news?pid=newsarchive&sid=ad4L0hH9MKWE) ) .
Sumario de las modalidades preferidas de la invención
La presente invención se relaciona con la planta transgénica de soya, o semilla, células o tejidos de esta, que comprenden un cásete de expresión establemente integrado dentro de su genoma que comprende un gen de tolerancia a herbicida que comprende la secuencia de codificación del gen de 2mEPSPS y otro gen de tolerancia a herbicida que comprende la secuencia de codificación de HPPD-PF 336 (ambos como se describe en este documento en el ejemplo 1.1 y según se representa en la sec . con núm. de ident.:l) así como un segundo cásete de expresión que comprende un gen de tolerancia a herbicida que comprende la secuencia de codificación de una fosfinotricina acetil transferasa, como se describe en el Ejemplo 1 en este documento y según se representa en la sec. con núm. de ident.:ll. La planta transgénica de soya, o semilla, células o tejidos de esta es tolerante a herbicidas basados en glifosato, basados en glufosinato, y un herbicida inhibidor de HPPD tal como isoxaflutol, y, en la ausencia de herbicida (s) , tiene un desempeño agronómico que es sustancialmente equivalente a la línea isogénica no transgénica. Después de la aplicación de uno o más herbicidas para los que se proporciona la tolerancia, la planta tendrá un fenotipo agronómico superior comparado con la planta no transgénica
De acuerdo con la presente invención la planta de soya, o semilla, células o tejidos de esta comprende los eventos élites EE-GM3 y EE-GM1 o EE-GM3 y EE-GM2.
Más específicamente, la presente invención se relaciona con una planta transgénica de soya, o semilla, células o tejidos de estas, cuyo ADN genómico se caracteriza por el hecho de que, cuando se analiza en un protocolo de identificación por PCR como se describe en este documento, usando dos cebadores dirigidos a la región de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM3 y el ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicidas en EE-GM3, respectivamente, produce un fragmento que es específico para EE-GM3 y además cuando se analiza en un Protocolo de identificación por PCR como se describe en este documento, usando dos cebadores dirigidos a la región de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM1 o EE-GM2 y el ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a glufosinato, respectivamente, produce un fragmento que es específico para EE-GM1 o EE-GM2. Los cebadores para la detección de EE-GM3 se pueden dirigir contra la región de flanqueo 5' dentro de la sec . con núm. de ident . : 2 y el ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicidas, respectivamente. Los cebadores para la detección de EE-GM3 se pueden dirigir también contra la región de flanqueo 3' dentro de la sec. con núm. de ident .: 3 y el ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicidas respectivamente, tales como los cebadores que comprenden o consistente de (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 5 y sec . con núm. de ident. :4 o sec. con núm. de ident. :7 respectivamente, y producen un fragmento de ADN de entre 100 y 800 bp, tal como un fragmento de aproximadamente 263 bp o aproximadamente 706 bp. Los cebadores para la detección de EE-G l se pueden dirigir contra la región de flanqueo 51 dentro de la sec. con núm. de ident.: 12 y el ADN foráneo que comprende- los genes para la tolerancia a herbicida, respectivamente. Los cebadores para la detección de EE-GMl se pueden dirigir también contra la región de flanqueo 3 ' dentro de la sec. con núm. de ident. : 13 y el ADN foráneo que comprende los genes para la tolerancia a herbicida, respectivamente, tales como los cebadores que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :16 y sec. con núm. de ident. :17 respectivamente, y producen un fragmento de ADN de entre 100 y 500 bp, tal como un fragmento de aproximadamente 183 bp. Los cebadores para la detección de EE-GM2 que comprenden los genes para la tolerancia a herbicida se pueden dirigir contra la región de flanqueo 5' dentro de la sec. con núm. de ident.: 14 y el ADN foráneo, respectivamente. Los cebadores para la detección de EE-GM2 se pueden dirigir también contra la región de flanqueo 3' dentro de la sec . con núm. de ident.:15 y el ADN foráneo que comprende los genes para la tolerancia a herbicida, respectivamente, tales como los cebadores que comprenden o consisten en (esencialmente) las secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:18 y sec. con núm. de ident.:19 respectivamente, y producen un fragmento de ADN de entre 100 y 500 bp, tal como un fragmento de aproximadamente 151 bp.
La semilla de referencia que comprende el evento élite EE-GM3 de la invención se depositó en el NCIMB con el número de acceso NCIMB 41659. La semilla de referencia que comprende el evento élite EE-GM1 de la invención se depositó en el NCIMB con el número de acceso NCIMB 41658. La semilla de referencia que comprende el evento élite EE-GM2 ¦ de la invención se depositó en el NCIMB con el número de acceso NCIMB 41660. La semilla de referencia que comprende el evento élite EE-GM3 y EE-GM1 se depositó en la ATCC con el número de acceso PTA-11041. La semilla de referencia que comprende el evento élite EE-GM3 y EE-GM2 se depositó en la ATCC con el número de acceso PTA-11042.
7Una modalidad de la invención es la semilla que comprende el evento élite EE-GM3 (semilla de referencia que comprende dicho evento que se depositó como NCIMB con número de acceso NCIMB 41659) y que comprende además el evento élite EE-GMl (semilla de referencia que comprende dicho evento que se depositó como NCIMB con número de acceso NCIMB 41658) , o la semilla que comprende los eventos EE-GM3 y EE-GMl (semilla de referencia que comprende dichos eventos que se depositó en ATCC con el número de acceso PTA- 11041) las cuales se convertirán en una planta de soya tolerante al menos a tres herbicidas, en particular a glifosato y/o inhibidores HPPD tales como isoxaflutol y/o inhibidores de glutamina sintetasa tal como glufosinato.
Otra modalidad de la invención es la semilla que comprende el evento élite EE-GM3 (semilla de referencia que comprende dicho evento que se depositó como NCIMB con número de acceso NCIMB 41659) y comprende además el evento élite EE-GM2 (semilla de referencia que comprende dicho evento que se depositó como NCIMB con número de acceso NCIMB 41660) , o la semilla que comprende los eventos EE-GM3 y EE-GM2 (semilla de referencia que comprende dichos eventos que se depositó en ATCC con el número de acceso PTA- 11042) las cuales se convertirán en una planta de soya tolerante al menos a tres herbicidas particularmente tolerante a glifosato y/o inhibidores HPPD tal como isoxaflutol y/o inhibidores de glutamina sintetasa tal como glufosinato.
La semilla de NCIMB con número de depósito NCIMB 41659, es un lote de semilla consistente de al menos aproximadamente 95% de semillas transgénicas, que comprende el evento élite EE-GM3 que se convertirá en plantas en tolerantes a herbicida, por lo cual las plantas son plantas tolerantes a glifosato y/o isoxaflutol. La semilla o semilla de la progenie disponible u obtenidas de la semilla depositada (por ejemplo, a continuación del cruzamiento con otras plantas de soya con un fondo genético diferente) que comprende el evento élite EE-GM3, se puede sembrar y las plantas que crecen se pueden tratar con glifosato o inhibidores HPPD tal como isoxaflutol como se describe en este documento para obtener plantas tolerantes a glifosato o isoxaflutol, que comprenden el evento élite EE-GM3. La semilla de NCIMB con número de depósito NCIMB 41658 y NCIMB 41660 son lotes de semillas consistente de al menos aproximadamente 95% de semillas transgénicas, que comprenden los eventos élites EE-GMl o EE-GM2 , respectivamente, que se convertirán en plantas tolerantes a herbicida, por lo cual las plantas son plantas tolerantes a glufosinato. La semilla se puede sembrar y las plantas que crecen se pueden tratar con glufosinato, como se describe en este documento para obtener plantas tolerantes a glufosinato, que comprende los eventos élites EE-GMl o EE-GM2 La semilla con número de ATCC con número de depósito PTA-11041, es un lote de semilla consistente de al menos aproximadamente 95% de semillas transgénicas, que comprenden el evento élite EE-GM3 y el evento élite EE-GM1 en forma homocigótica, que se convertirán en las plantas tolerantes a herbicida por lo cual las plantas son tolerantes a glifosato, glufosinato y/o isoxaflutol. La semilla o semilla de la progenie disponible u obtenida de la semilla depositada (por ejemplo, a continuación del cruzamiento con otras plantas de soya con un fondo genético diferente) que se puede sembrar y las plantas que crecen se pueden tratar con glifosato, glufosinato y/o inhibidores HPPD tal como isoxaflutol, como se describe en este documento para obtener plantas tolerantes a glifosato, glufosinato y/o isoxaflutol, que comprende el evento élite EE-GM3 y EE-GM1.
La semilla de ATCC con número de depósito PTA-11042, es un lote de semilla consistente de al menos aproximadamente 95% de semillas transgénicas , que comprende el evento élite EE-GM3 y el evento élite EE-GM2 en forma homocigótica, que se convertirán en plantas tolerantes a herbicida, por lo cual las plantas son tolerantes a glifosato, glufosinato y/o isoxaflutol. La semilla o semilla de la progenie disponible u obtenida de la semilla depositada (por ejemplo, a continuación del cruzamiento con otras plantas de soya con un fondo genético diferente) que se puede sembrar y las plantas que crecen se pueden tratar con glifosato, glufosinato y/o inhibidores HPPD tal como isoxaflutol, como se describe en este documento para obtener plantas tolerantes a glifosato, glufosinato y/o isoxaflutol, que comprende el evento élite EE-GM3 y EE-GM2.
La invención se relaciona además con las células, tejidos, progenie, y descendientes de una planta que comprende el evento élite EE-GM3 y que comprende además el evento élite EE-GM1, y que se puede obtener cultivando una planta que comprende el evento élite EE-G 3 y EE-GM1 depositada en ATCC como PTA- 11041, o cultivando una planta que comprende el evento élite EE-GM3 de la semilla depositada en el NCIMB que tiene número de acceso NCIMB 41659 y cruzando dicha planta con una planta que comprende el evento élite EE-GM1 cultivada a partir de la semilla depositada en el NCIMB con número de acceso NCIMB 41658. La invención se relaciona también con las células, tejidos, progenie, y descendientes de una planta que comprende el evento élite EE-GM3 y comprende además el evento élite EE-GM2, y que se puede obtener cultivando una planta que comprende el evento élite EE-GM3 y EE-GM2 depositada en ATCC como PTA- 11042, ' o cultivando una planta que comprende el evento élite EE-GM3 de la semilla depositada en el NCIMB con que tiene número de acceso NCIMB 41659 y cruzando dicha planta con una planta que comprende el evento élite EE-GM2 cultivada a partir de la semilla depositada en el NCIMB que tiene número de acceso NCIMB 41660. La invención se relaciona además con las plantas obtenibles de (tal como por propagación de y/o cruzamiento con) una planta de soya o semilla como se describió justo anteriormente. La invención se relaciona también con plantas de soya que comprenden el evento élite EE-GM3 y EE-GMl o EE-GM3 y EE-GM2.
La invención se relaciona además con un método para identificar una planta transgénica, o células o tejidos de esta, que comprende el evento élite EE-GM3 y EE-GMl o EE-GM3 y EE-GM2, cuyo método se basa en identificar la presencia de secuencias de ADN características o aminoácidos codificados por tales secuencias de ADN en la planta transgénica, células o tej idos .
De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, tales las secuencias de ADN características son secuencias de por lo menos 15bp, 15bp, al menos 20 bp, y 20 bp, o 30 bp o más que comprenden el sitio de inserción del evento, es decir, tanto una parte del ADN foráneo insertado que comprende los genes de tolerancia a herbicida como una parte del genoma de soya (ya sea la región de flanqueo 5' ó 3') contiguo con éste, lo. que permite la identificación específica del evento élite.
La presente invención se relaciona además con los métodos para identificar eventos élites EE-GM3 y EE-GMl o los eventos élites EE-GM3 y EE-GM2 en muestras biológicas, cuyos métodos se basan en cebadores o sondas que reconocen específicamente la secuencia de flanqueo 5' y/o 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 y EE-GMl o EE-GM3 y EE-GM2.
Más específicamente, la invención se relaciona con un método que comprende amplificar dos secuencias de un ácido nucleico presente en las muestras biológicas, usando dos reacciones en cadena de la polimerasa cada una con al menos dos cebadores o una reacción en cadena de la polimerasa con al menos cuatro cebadores, el primer cebador que reconoce la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo comprende los genes de tolerancia a herbicida comprendiendo los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3, el segundo cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo comprende los genes de tolerancia a herbicida de EE-GM3, el tercer cebador que reconoce la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GMl o EE-GM2 , y el cuarto cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo comprende los genes de tolerancia a herbicida de EE-GMl GM1 o EE-GM2, preferentemente para obtener dos fragmentos de ADN de entre 100 y 800 bp. Los cebadores para la identificación de EE-GM3 pueden reconocer una secuencia dentro de la región de flanqueo 5' de EE-GM3 (sec. con núm. de ident.:2, de la posición 1 a la posición 1451) o dentro de la región de flanqueo 3' de EE-GM3 (complementaria de la sec. con núm. de ident . :3 de la posición 241 a la posición 1408) y una secuencia dentro del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida (complementaria de la sec. con núm. de ident .: 2 de la posición 1452 a 1843 o sec. con núm. de ident .: 3 de la posición 1 a la posición 240, o sec. con núm. de ident.: 20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16638 o su complementaria), respectivamente. El cebador que reconoce la región de flanqueo 3' puede comprender la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 5 y el cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida puede comprender la secuencia de nucleótidos de las secs. con núms . de ident. :4 o sec. con núm. de ident. :7 descritos en este documento. Los cebadores para la identificación de EE-GM1 pueden reconocer una secuencia dentro de la región de flanqueo 5' de EE-GM1 (sec. con núm. de ident. :12, de la posición 1 a la posición 209) o dentro de la región de flanqueo 3' de EE-GM1 (complementaria de la sec. con núm. de ident. : 13 de la posición 569 a la posición 1000) y una secuencia dentro del ADN foráneo que comprende gen de tolerancia a herbicida de EE-GM1 GM1 (complementaria de la sec. con núm. de ident. : 12 de la posición 210 a 720, o la sec. con núm. de ident . : 13 de la posición 1 a la posición 568) , respectivamente. El cebador que reconoce la región de flanqueo 5' de EE-GM1 puede comprender la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 16 y el cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM1 puede comprender la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.: 17 descritos en este documento. Los cebadores para identificar EE-GM2 pueden reconocer una secuencia dentro de la región de flanqueo 5' de EE-GM2 (sec. con núm. de ident .: 1 , de la posición 1 a la posición 311) o dentro de la región de flanqueo 3' de EE-GM2 (complementaria de la sec. con núm. de ident. : 15 de la posición 508 a la posición 1880) y una secuencia dentro del ADN foráneo que comprende el gen de tolerancia a herbicida de EE-G 1 GM1 (complementaria de la sec. con núm. de ident .: 14 de la posición 312 a 810, o la sec. con núm. de ident. : 15 de la posición 1 a la posición 507), respectivamente. El cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE-GM2 puede comprender la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.: 18 y el cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM2 puede comprender la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.: 19 descrita en este documento. La amplificación por PCR se puede hacer simultáneamente o secuencialmente .
La presente invención se relaciona más específicamente con un método para la identificación del evento élite EE-G 3 y EE-GM1 en muestras biológicas cuyo método comprende amplificar al menos dos secuencias de ácidos nucleicos presentes en una muestra biológica, usando una reacción en cadena de la polimerasa con dos cebadores que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de las secs . con núms . de ident . : 4 y sec . con núm. de ident . : 5 , respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 263 bp, o con dos cebadores que comprenden o consistentes de (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 5 y sec. con núm. de ident .: 7 respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 706 bp, y una reacción en cadena de la polimerasa con dos cebadores que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 16 y sec. con núm. de ident. :17 respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 183 b . Las dos reacciones en cadena de la polimerasa se pueden realizar simultáneamente o secuencialmente .
La presente invención se relaciona más específicamente con un método para la identificación del evento élite EE-GM3 y EE-GM2 en muestras biológicas, cuyo método comprende amplificar al menos dos secuencias de ácidos nucleicos
presentes en una muestra biológica, usando una reacción en cadena de la polimerasa con dos cebadores que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident . : 4 y sec . con núm. de ident . : 5 respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 263 bp, o con dos cebadores que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 5 y sec. con núm. de ident .: 7 respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 706 bp, y una reacción en cadena de la polimerasa con dos cebadores que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :18 y sec. con núm. de ident. :19 respectivamente, para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 151 bp . Las dos reacciones en cadena de la polimerasa se pueden realizar simultáneamente o secuencialmente .
La presente invención se relaciona además con las secuencias de flanqueo específicas de EE-GM3 descritas en este documento en combinación con las secuencias de flanqueo específicas de EE-GMl que se pueden usar para desarrollar los métodos específicos de identificación para la presencia simultánea de EE-GM3 y EE-GMlen muestras biológicas. Tales secuencias de flanqueo específicas combinadas se pueden usar también como material de control de referencia en los ensayos de identificación. Más particularmente, la invención se relaciona con la regiones de flanqueo 5 'y/o 3' de EE-GM3 en combinación con la regiones de flanqueo 5' y/o 3' de EE-GMl que se pueden usar para el desarrollo de cebadores específicos y sondas como se describe además en este documento. Son adecuadas también las moléculas de ácido nucleico, preferentemente de aproximadamente 150-850 bp, que comprenden la secuencia que se puede amplificar por los cebadores que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de 1 ident . : 7 y sec . con núm. de ident .: 5 o de sec. con núm. de ident.: 4 y sec. con núm. de ident .: 5 en combinación con las moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia que se puede amplificar por los cebadores que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 16 y sec. con núm. de ident.: 17, particularmente tales moléculas de ácido nucleico se obtienen usando tales cebadores en el material que comprende EE-GM3 y EE-GMl.
La presente invención se relaciona además con las secuencias de flanqueo específicas de EE-GM3 descritas en este documento en combinación con la secuencia de flanqueo específica de EE-GM2 que se puede usar para desarrollar los métodos específicos de identificación para la presencia simultánea de EE-GM3 y EE-GM2 en muestras biológicas. Tales secuencias de flanqueo específicas combinadas se pueden usar también T como material de control de referencia en los ensayos de identificación. Más particularmente, la invención se relaciona con las regiones de flanqueo 5' y/o 3' de EE-GM3 en combinación con las regiones de flanqueo 5' y/o 3' de EE-GM2 que se pueden usar para el desarrollo de cebadores específicos y sondas como se describe además en este documento. Las moléculas de ácido nucleico son adecuadas también como material de referencia, preferentemente de aproximadamente 150-850 bp, que comprenden la secuencia que se puede amplificar por los cebadores que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de secs. con núms . de ident . : 7 y sec . con núm. de ident . : 5 o de sec . con núm. de ident .: 4 y sec. con núm. de ident. :5 en combinación con moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia que se puede amplificar por los cebadores que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 18 y sec. con núm. de ident.: 19, particularmente tales moléculas de ácido nucleico se obtienen usando tales cebadores en el material que comprende EE-GM3 y EE-GM2.
La presente invención se relaciona además con métodos para identificar la presencia simultánea de EE-GM3 y EE-GM1 en muestras biológicas basado en el uso de tales cebadores o
sondas específicas. Los cebadores para la detección de EE-GM3 pueden comprender, consistir o consistir esencialmente de una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o la complementaria de la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, combinadas con los cebadores que comprenden, consistentes, o consistentes esencialmente de una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :1, tales como una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240. Los cebadores para la detección de EE-GM1 pueden comprender, consistir o consistir esencialmente de una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 12 del nucleótido 1 al nucleótido 209 o la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 13 desde el nucleótido 569 al nucleótido 1000, combinado con cebadores que comprenden, consistentes, o consistentes esencialmente de una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de la sec . con núm. de ident.:ll, tal como una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionada de la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:12 desde el nucleótido 219 al nucleótido 720 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:13 desde el nucleótido 1 al nucleótido 568. Los cebadores pueden comprender también estas secuencias de nucleótidos ubicadas en su extremo 3' terminal, y comprender además las secuencias no relacionadas o secuencias derivadas de las secuencias de nucleótidos mencionadas, pero que comprenden apareamiento incorrecto.
La invención se relaciona además con métodos para identificar la presencia simultánea de EE-GM3 y EE-GM2 en muestras biológicas basadas en el uso de cebadores específicos o sondas de ese tipo. Los cebadores para la detección de EE-GM3 pueden comprender, consistir o consistir esencialmente de una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos como se describió en el párrafo anterior. Los cebadores para la detección de EE-GM2 pueden comprender, consistir o consistir esencialmente de una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de sec- con núm. de ident.:14 desde el nucleótido 1 al nucleótido 311 o la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880, en combinación con cebadores que comprenden, consisten o consisten esencialmente en una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionada de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll, tal como una secuencia de nucleótidos de 17 a aproximadamente 200 nucleótidos consecutivos seleccionada de la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:14 del nucleótido 312 al nucleótido 810 o la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident-:15 del nucleótido 1 al nucleótido 507. Los cebadores pueden comprender también secuencia de nucleótidos ubicadas en su extremo 3.' terminal, y comprender además secuencias no relacionadas o secuencias derivadas de las secuencia de nucleótidos mencionadas, pero que comprenden apareamiento incorrecto.
La invención se relaciona además con los kits para identificar los eventos élites EE-GM3 y EE-GM1 en muestras biológicas, dichos kits comprenden al menos un cebador o sonda que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 y al menos un cebador o sonda que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM1.
La invención se relaciona además con los kits para identificar los eventos élites EE-GM3 y EE-GM2 en muestras biológicas, dichos kits comprenden al menos un cebador o sonda que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 y al menos un cebador o sonda que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende un gen de tolerancia a herbicida en
EE-GM2.
Los kits de la invención pueden comprender, además de un cebador que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM3 y la región de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM1, un cebador adicional que reconoce específicamente una secuencia dentro del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida de EE-GM3 y un cebador adicional que reconoce específicamente una secuencia dentro del ADN foráneo que comprende genes de tolerancia a herbicida de EE-GM1 , para el uso en un protocolo de identificación por PCR.
Los kits de la invención pueden comprender también, además de un cebador que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM3 y la región de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM2, un cebador adicional que reconoce específicamente una secuencia dentro del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida de EE-GM3 y un cebador adicional que reconoce específicamente una secuencia dentro del ADN foráneo que comprende genes de tolerancia a herbicida de EE-GM2 , para el uso en un protocolo de identificación por PCR.
El cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE- GM3 puede comprender la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident . : 5 y el cebador que reconoce los transgenes o ADN foráneo que comprende genes de tolerancia a herbicida de EE-GM3 puede comprender la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 4 ó 7, o cualquier otro cebador o combinación de cebador para la detección de EE-GM3 como se describe en este documento, en combinación con un cebador que reconoce la región de flanqueo 5' de EE-GM1 que puede comprender la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 16 y un cebador que reconoce los transgenes de ADN foráneo que comprende el gen de tolerancia a herbicida de EE-GMl puede comprender la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.: 17.
El cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE-GM3 puede comprender la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:5 y el cebador que reconoce los transgenes o ADN foráneo que comprende genes de tolerancia a herbicida de EE-GM3 puede comprender la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . :4 ó 7, o cualquier otro cebador o combinación de cebadores para la detección de EE-GM3 como se describe en este documento, en combinación con un cebador que reconoce la región de flanqueo -5' de EE-GM2 que puede comprender la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 18 y un cebador que reconoce los transgenes de ADN foráneo que comprende el gen de tolerancia a herbicida de EE-GM2 puede comprender la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident.: 19.
La invención se relaciona además con un kit para identificar el evento élite EE-GM3 y EE-GM1 en muestras biológicas, dicho kit comprende los cebadores de PCR que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 5 y sec. con núm. de ident .: 4 y cebadores de PCR que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 16 y sec. con núm. de ident.: 17 para su uso en la identificación de EE-GM3/EE-GM1 basada en PCR.
La invención se relaciona además con un kit para la identificación del evento élite EE-GM3 y EE-GM2 en muestras biológicas, dicho kit comprende cebadores de PCR que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 5 y sec. con núm. de ident.:4 y cebadores de PCR que comprenden o consisten en (esencialmente) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 18 y sec. con núm. de ident.: 19 para el uso en la identificación de EE-GM3/EE-GM2 basada en PCR
La invención se relaciona también con un kit para identificar el evento élite EE-GM3 y EE-GM1 en muestras biológicas, cuyo kit comprende dos sondas específicas, una primera sonda que comprende o consiste en (esencialmente) una secuencia que se corresponde (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con una región específica de EE-GM3 y una segunda sonda que comprende o consiste en (esencialmente) una secuencia que se corresponde (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y el 100% de identidad de secuencia con una región específica del EE-GM1. Preferentemente, la secuencia de la primera sonda se corresponde con una región específica que comprende parte de la región de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM3 y la segunda sonda se corresponde con una región específica que comprende parte de la región de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM1. Con la máxima preferencia, las sondas específicas para EE-GM3 comprenden o consiste en (esencialmente) (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con la secuencia entre el nucleótido 1411 al 1462 de la sec . con núm. de ident.:2 o una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con la secuencia entre el nucleótido 220 al 260 de la sec. con núm. de ident . : 3 y las sondas específicas de EE-GM1 comprenden, consisten de (esencialmente) (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con la secuencia entre el nucleótido 199 al 220 de la sec. con núm. de ident.: 12, o una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con la secuencia entre el nucleótido 558 al 579 de la sec. con núm. de iden . : 13.
La invención se relaciona también con un kit para la identificación del evento élite EE-GM3 y EE-GM2 en muestras biológicas, cuyo kit comprende dos sondas específicas, una primera sonda que comprende o consiste en (esencialmente) una secuencia que se corresponde con (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con una región específica de EE-GM3 y una segunda sonda que comprende o consiste en (esencialmente) . una secuencia que se corresponde con (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con una región específica de EE-GM2. Preferentemente, la secuencia de la primera sonda se corresponde con una región específica que comprende parte de la región de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM3 y la segunda sonda se corresponde con una región específica que comprende parte de la región de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM2. Con la máxima preferencia la sonda específica de EE-GM3 comprende o consiste de (esencialmente) (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con la secuencia entre el nucleótido 1411 al 1462 de la sec . con núm. de ident . : 2 o una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con la secuencia entre el nucleótido 220 al 260 de la sec. con núm. de ident .: 3 y la sonda específica de EE-GM2 comprende o consiste de (esencialmente) (o es complementaria a) una secuencia que tiene entre 80% y 100% de identidad de secuencia con la secuencia de entre el nucleótido 301 al 322 de la sec. con núm. de ident. :14, o una secuencia que tiene entre 80% y -100% de identidad de secuencia con la secuencia entre el nucleótido 497 al 518 de la sec. con núm. de ident. :15.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se describen las secuencias de ADN que comprenden un sitio de unión del evento y una longitud suficiente de polinucleótidos del ADN genómico de soya y el ADN foráneo que comprenden los genes de tolerancia a herbicida (transgen) de cada evento, para que sean útiles como cebador o sonda para la detección de EE-GM3 y EE-GM1. Tales secuencias pueden comprender al menos 9 nucleótidos del ADN genómico de soya y un número similar de nucleótidos de ADN foráneo que comprenden los genes de la tolerancia a herbicida (transgen) de EE-GM3 o EE-GM1 , a cada lado del sitio de unión respectivamente. Con la máxima preferencia, las secuencias de ADN de ese tipo comprenden al menos 9 nucleótidos del ADN genómico de soya y un número similar de nucleótidos del ADN foráneo que comprenden los genes de tolerancia a herbicida contiguos con el sitio de unión en sec . con núm. de ident . : 2 o sec . con núm. de ident .: 3 y al menos 9 nucleótidos del ADN genómico de soya y un número similar de nucleótidos del ADN foráneo que comprenden los genes de tolerancia a herbicida contiguos con el sitio de unión en sec. con núm. de ident.: 12 o sec. con núm. de ident.: 13.
De acuerdo con aún otro aspecto de la invención, se describen secuencias de ADN que comprenden un sitio de unión del evento y longitud suficiente de polinucleótidos tanto de ADN genómico de soya como ADN foráneo que comprenden los genes de tolerancia a herbicida (transgen) de cada evento, para que sean útiles como cebador o sonda para la detección de EE-GM3 y EE-G 2. Las secuencias de ese tipo pueden comprender al menos 9 nucleótidos del ADN genómico de soya y un número similar de nucleótidos del ADN foráneo que comprenden los genes de tolerancia a herbicida (transgen-) de EE-G 3 o EE-GM2, a cada lado del sitio de inserción, respectivamente. Con máxima preferencia, las secuencias de ADN de ese tipo comprenden al menos 9 nucleótidos del ADN genómico de soya y un número similar de nucleótidos del ADN foráneo que comprenden los genes de tolerancia a herbicida contiguos con el sitio de unión en sec. con núm. de ident . : 2 o sec. con núm. de ident. : 3 y al menos 9 nucleótidos del ADN genómico de soya y un número similar de nucleótidos del ADN foráneo que comprenden genes de ' tolerancia a herbicida contiguos con el sitio de unión en sec. con núm. de ident. :14 o sec. con núm. de ident. : 15.
Los métodos y kits que se incluyen en la presente invención se pueden usar para diferentes propósitos, tales como, pero sin limitarse a los siguientes: identificar la presencia o determinar el umbral (inferior) de EE-G 3 y EE-G 1 o de EE-GM3 y EE-GM2 en plantas, material vegetal o en productos tales como, pero sin limitarse a productos alimenticios o piensos (frescos o procesados) comprendidos o derivados del material vegetal; adicionalmente o alternativamente, los métodos y los kits de la presente invención se pueden usar para identificar el material vegetal transgénico para propósitos de segregación entre el material transgénico y no transgénico; adicionalmente o alternativamente, los métodos y los kits de la presente invención se pueden usar para determinar la calidad (es decir, el porcentaje de material puro) de material vegetal que comprende EE-G 3 y EE-GM1 o EE-GM3 y EE-GM2.
La invención se relaciona además con las regiones de flanqueo 5' y/o 3' de EE-GM3 en combinación con cebadores y sondas específicos desarrollados de la secuencias de flanqueo 5' y/o 3' de EE-GM1 o EE-GM2 , así como a las sondas y cebadores específicos desarrollados de las secuencias de flanqueo 5' y/o 3' de EE-GM3 en combinación con cebadores y sondas específicos desarrollados de las secuencias de flanqueo 5' y/o 3' de EE-GM1 o EE-GM2.
La invención también se relaciona con el ADN genómico obtenido de plantas que comprenden los eventos élites EE-GM3 y EE-GM1 o plantas que comprenden los eventos élites EE-GM3 y EE-GM2. Dicho ADN genómico se puede usar como material de control de referencia en los ensayos de identificación descritos en este documento.
En este documento se proporciona además una planta de soya transgénica tolerante a herbicida, o células, partes, semillas o progenie de esta, cada una comprende al menos dos eventos élites, dicho primer evento élite que comprende un ADN foráneo que comprende :
i) un primer gen quimérico que comprende un gen epsps modificado de Zea mays que codifica una enzima EPSPS tolerante a glifosato bajo el control de un promotor expresable en plantas, y
ii) un segundo gen quimérico que comprende un gen hppd modificado de Pseudomonas fluorescens que codifica una enzima inhibidora HPPD tolerante a herbicida bajo el control de un promotor expresable en plantas, y dicho segundo evento élite comprende un (tercer) gen quimérico que comprende un gen modificado de tolerancia a glufosinato derivado de Streptomyces viridochromogenes que codifica una enzima acetiltransferasa glufosinato (o fosfinotricina) bajo el control de un promotor expresable en planta.
En una modalidad, dicho primer evento élite comprende los nucleotidos del 1 al 1451 de. sec. con núm. de ident . : 2 inmediatamente corriente arriba y contiguos a dicho ADN foráneo y los nucleotidos 241 al 1408 de sec. con núm. de ident .: 3 inmediatamente corriente abajo y contiguos con dicho ADN foráneo, y dicho segundo evento comprende los nucleotidos 1 al 209 de sec. con núm. de ident.: 12, inmediatamente corriente arriba y contiguos con dicho ADN foráneo y los nucleótidos 569 al 1000 de sec . con núm. de ident.:13 inmediatamente corriente abajo y contiguos con dicho ADN foráneo, o dicho segundo evento comprende los nucleótidos 1 al 311 de sec. con núm. de ident . : 14 inmediatamente corriente arriba y contiguos con dicho ADN foráneo y los nucleótidos 508 al 1880 de sec. con núm. de ident. : 15 inmediatamente corriente abajo y contiguos a dicho ADN foráneo.
En una modalidad adicional, dicho evento élite se obtiene por el cultivo con una planta de soya que crece de semillas de referencia que comprenden dichos eventos que se han depositado en la ATCC con el número de depósito PTA- 11041 o PTA-11042, o se obtiene de semillas de referencia, que comprenden dicho primer evento que se han depositado en el NCIMB con el número de acceso NCIMB 41659, y se obtiene de semillas de referencia, que comprende dicho segundo evento que se han depositado en el NCIMB con el número de acceso NCIMB 41658 o NCIMB con número de acceso NCIMB 41660.
En otra modalidad, el ADN genómico de dicha planta de soya, o células, partes, semillas, o progenie de esta cuando se analiza usando el protocolo de identificación del evento élite para dicho primer evento élite con dos cebadores que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 4 y sec. con núm. de ident .: 5 respectivamente, produce un fragmento de ADN de aproximadamente 263 bp o 263 bp y cuando se analiza usando el protocolo de identificación del evento élite para dicho segundo evento élite con dos cebadores que comprende la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:16 y sec. con núm. de ident.:17 respectivamente, produce un fragmento de ADN de aproximadamente 183 bp o 183 bp, o con dos cebadores que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:18 y sec. con núm. de ident.:19 respectivamente, produce un fragmento de ADN de aproximadamente 151bp o 151 bp.
En este documento se proporciona además un método para la identificación de una planta de soya transgénica, o células, partes, semilla o progenie de esta que comprende 2 eventos élites, donde dicha planta, células, semilla o progenie son tolerantes a glifosato, glufosinato y a un herbicida inhibidor de HPPD (tal como isoxaflutol) en muestras biológicas, dicho método comprende amplificar un fragmento de ADN de entre 100 y 500 bp de un ácido nucleico de dicho primer evento presente en muestras biológicas usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de dichos cebadores que reconoce la región de flanqueo 5' del primer evento élite especificado anteriormente, dicha región de flanqueo 5' que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:2 del nucleótido 1 al 1451, o la región de flanqueo 3' de dicho primer evento élite, que comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec . con núm. de ident . : 3 del nucleótido 241 al 1408, el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de dicho cebador evento que comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident.: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 1 al nucleótido 240, y que comprende amplificar un fragmento de ADN de entre 50 y 1000 bp, o entre 100 y 500 bp de un ácido nucleico de dicho segundo evento presente en muestras biológicas usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de dichos cebadores que reconoce la región de flanqueo 5' del segundo evento élite especificado anteriormente, dicha región de flanqueo 5' que comprende la secuencia de nucleótidos del nucleótido 1 al 209 de sec. con núm. de ident. :12, o la región de flanqueo 3' de dicho segundo evento élite, dicha región de flanqueo 3' que comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de los nucleótidos del 569 al 1000 de sec. con núm. de ident. :13, el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de dicho segundo evento que comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec . con núm. de ident.:12 del nucleótido 210 al 720 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 1 al 568.
En este documento se proporciona además un método para identificar una planta de soya transgénica, o células, partes, semilla o progenie de esta que comprende 2 eventos élites, donde dicha planta, células, semilla o progenie son tolerantes a glifosato, glufosinato y/o un herbicida inhibidor de HPPD (tal como isoxaflutol) en muestras biológicas, dicho método que comprende amplificar un fragmento de ADN de entre 50 y 1000 o entre 100 y 500 bp de un ácido nucleico de dicho primer evento presente en muestras biológicas usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de dichos cebadores reconoce la región de flanqueo 5' del primer evento élite especificado anteriormente, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al 1451, o la región de flanqueo 3' de dicho primer evento élite, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al 1408, el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de dicho primer evento comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de, ident.: 3 del nucleótido 1 al 240, y comprende amplificar un fragmento de ADN de entre 50 y 1000 bp o entre 100 y 500 bp de un ácido nucleico de dicho segundo evento presente en muestras biológicas usando una reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de dichos cebadores reconoce la región de flanqueo 5' del segundo evento élite especificado anteriormente, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos del nucleótido 1 al 311 de sec. con núm. de ident .: 14 , o la región de flanqueo 3' de dicho segundo evento élite, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria del nucleótido 508 al 1880 de sec. con núm. de ident. :15, el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de dicho segundo evento comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident.: 14 del nucleótido 312 al 810 o la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident. : 15 del nucleótido 1 al nucleótido 507.
En este documento se proporciona además un kit para identificar una planta de soya transgénica, o células, partes, semilla o progenie de esta que comprende 2 eventos élites y que es tolerante a glifosato, glufosinato y un herbicida inhibidor de HPPD (tal como isoxaflutol) en muestras biológicas, dicho kit comprende un cebador que reconoce la región de flanqueo 5' del primer evento élite especificado anteriormente, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al 1451, o un cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de dicho primer evento élite, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al 1408, y un cebador que reconoce, una secuencia dentro del ADN foráneo de dicho primer evento, dicho ADN foráneo comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240, y dicho kit comprende un cebador que reconoce la región de flanqueo 5 'del segundo evento élite especificado anteriormente, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1 al 209 de sec. con núm. de ident.: 12, o un cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de dicho segundo evento élite, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de los nucleótidos 569 al 1000 de sec. con núm. de ident.:13, el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de dicho segundo evento comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec . con núm. de ident.:12 del nucleótido 210 al nucleótido 720 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 1 al nucleótido 568.
En este documento se proporciona además un kit para identificar una planta de soya transgénica, o células, partes, semilla o progenie de esta que comprende 2 eventos élites y que es tolerante a glifosato, glufosinato y un herbicida inhibidor de HPPD (tal como isoxaflutol) en muestras biológicas, dicho kit comprende un cebador que reconoce la región de flanqueo 5' del primer evento élite especificado anteriormente, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451, o un cebador que reconoce la región de flanqueo 3 ' de dicho primer evento élite, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408 y un cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de dicho primer evento, dicho ADN foráneo comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240, y dicho kit comprende un cebador que reconoce la región de flanqueo 5' del segundo evento élite especificado anteriormente, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1 al 311 de sec. con núm. de ident. :14, o la región de flanqueo 3' de dicho segundo evento élite, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de los nucleótidos 508 al 1880 de sec. con núm. de ident.: 15, el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de dicho segundo evento comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident .: 14 del nucleótido 312 al nucleótido 810 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :15 del nucleótido 1 al nucleótido 507.
En este documento se proporciona además una planta de soya, célula vegetal, tejido, o semilla que comprende en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 97, 98 o al menos 99% o 99.5% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16638, la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición del nucleótido 2257 a la posición del nucleótido 16601 o su complementaria, o una secuencia de nucleótidos con al menos el 97, 98 o al menos 99% o 99.5% de identidad de secuencia con la sec . con núm. de ident.:20, o la complementaria de esta, y que comprende en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 97, 98 o al menos 99% o 99.5% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de EE-GMl o EE-GM2 o las complementarias de estas, la semilla de referencia comprende EE-GMl que se depositó con el número de depósito NCIMB 41658, y la semilla de referencia que comprende EE-GM2 que se depositó con que se depositó con el número de depósito NCIMB 41660. En una modalidad de esta invención, la secuencia de nucleótidos de EE-GMl o EE-GM2 en dicha planta, célula vegetal, tejido, o semilla, es la secuencia de ADN (tal como la secuencia de ADN foráneo) en las secs. con núms. de ident.:12 ó 13, o la secuencia de ADN (tal como la secuencia de ADN foráneo) en sec. con núm. de ident . : 14 ó 15, o la secuencia de ADN en el genoma de la planta (tal como en las semillas depositadas que comprenden EE-GMl o EE-GM2 de la invención) que comprende las secs. con núms. de ident.: 12 y 13 entre el primer nucleótido de la secuencia de sec: con núm. de ident .: 12 , y el último nucleótido de la secuencia de sec. con núm. de ident. :13, o la secuencia de ADN en el genoma de la planta que comprende las secs. con núms . de ident.:l4 y 15 entre el primer nucleótido de la secuencia de sec. con núm. de ident.:14, y el último nucleótido de la secuencia de sec. con núm. de ident . : 15.
Una modalidad de esta invención proporciona una planta de soya, célula vegetal, tejido, o semilla que comprende en su genoma una molécula de ácido nucleico que híbrida con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :1, o la complementaria de esta, o que híbrida con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16638 o la complementaria de esta, o que híbrida con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 o la complementaria de esta, y que comprende en su genoma una molécula de ácido nucleico que híbrida con la secuencia de nucleótidos de EE-GMl o EE-GM2 o las complementarias de estas, la semilla de referencia que comprende EE-GMl que se depositó con el número de depósito NCIMB 41658, y la semilla de referencia que comprende a EE-GM2 que se depositó con el número de depósito NCIMB 41660. En una modalidad de esta invención, la secuencia de nucleótidos de EE- GM1 o EE-GM2 en dicha planta, célula vegetal, tejido, o semilla, es el ADN foráneo en las secs. con núms. de ident.: 12 ó 13, o el ADN foráneo en las secs. con núms . de ident . : 14 ó 15, o la secuencia de ADN foráneo en el genoma de la planta (tal como en las semillas depositadas que comprenden a EE-GM1 o EE-GM2 de la invención) que comprende las secs . con núms. de ident.: 12 y 13 entre el primer nucleótido de la secuencia de sec . con núm. de ident.: 12, y el último nucleótido de la secuencia de sec. con núm. de ident.: 13, o la secuencia de ADN foráneo en el genoma de la planta que comprende las secs. con núms. de ident .: 14 y 15 entre el primer nucleótido de la secuencia de sec. con núm. de ident .: 14 , y el último nucleótido de la secuencia de sec. con núm. de ident.: 15.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Los siguientes Ejemplos, no pretenden limitar la invención a las modalidades específicas descritas, y se pueden interpretar junto con las Figuras adjuntas, que se incorporan en este documento como referencia, en los que:
Fig. 1: Representación esquemática de la relación entre las secuencia de nucleótidos citadas y los cebadores del evento élite EE-GM3. barra negra: ADN foráneo; barra sombreada: ADN de origen vegetal; flecha, a cuadros (a) : gen quimérico que codifica HPPD PF W366 (ver Tabla 1 para la composición del gen quimérico) ; flecha sombreada (b) : gen quimérico que codifica 2mEPSPS (ver Tabla 1 para la composición del gen quimérico); flechas negras: cebadores oligonucleotídicos , las figuras bajo las- barras representan las posiciones de los nucleótidos; (c) se refiere a la complementaria de la secuencia de nucleótidos indicada; Nota: el esquema no está dibujado a escala.
Fig. 2: Resultados obtenidos por el protocolo de identificación por PCR desarrollado para EE-GM3. Secuencia de carga del gel: Carril 1: Marcador de peso molecular (escala de 100 bp) , carriles 2 y 3: muestras de ADN de plantas de soya que comprenden el evento transgénico EE-GM3 ; carriles 4-7: muestras de ADN de plantas de soya transgénica que no comprenden el evento élite EE-GM3, sino que comprenden los mismos genes de tolerancia a herbicidas (otros eventos de transformación); carril .8: muestra de ADN de soya silvestre; carril 9: control sin ADN molde; carril 10: marcador de peso molecular.
Fig. 3: Representación esquemática de la relación entre las secuencia de nucleótidos citadas y los cebadores del evento élite EE-GM1. barra negra: ADN foráneo; barra sombreada: ADN de origen vegetal; flecha de rayas horizontales (d) : gen quimérico que codifica la fosfinotricina acetiltransferasa (ver sec . con núm. de ident.:ll para la composición del gen quimérico); flechas negras: cebadores oligonucleotídicos, las figuras bajo las barras representan posiciones de los nucleótidos; (c) se refiere a la complementaria de la secuencia de nucleótidos indicada; Nota: el esquema no está dibujado a escala.
Fig.4: Representación esquemática de la relación entre las secuencias de nucleótidos citadas y los cebadores del evento élite EE-GM2. barra negra: ADN foráneo; barra sombreada: ADN de origen vegetal; flecha de rayas horizontales (d) : gen quimérico que codifica para la fosfinotricina acetiltransferasa (ver sec . con núm. de ident.:ll para la composición del gen qµimérico) ; flechas negras: cebadores oligonucleotídicos , las figuras bajo las barras representan posiciones de los nucleótidos; (c) se refiere a la complementaria de la secuencia de nucleótidos indicada; NA: no aplicable. Nota: el esquema no está dibujado a escala.
Fig.5: Protocolo de identificación por PCR desarrollado para EE-GM1. Secuencia de carga del gel : carril 1: muestra de ADN de plantas de soya que comprenden el evento transgénico EE-GM1; carril 2: muestra de ADN de una planta de soya transgénica que no comprende el evento élite EE-GM1; carril 3: muestras de ADN de control de plantas de soya silvestre; carril 4: control sin molde; carril 5: marcador de peso molecular .
Fig. 6: Protocolo de identificación por PCR desarrollado para EE-GM2. Secuencia de carga del gel: carril 1: muestra de ADN de plantas de soya que comprenden el evento transgénico EE-GM2 ; carril 2: muestra de ADN de una planta de soya transgénica que no comprende el evento élite EE-GM2; carril 3 : muestras de ADN control de plantas de soya silvestre; carril 4: control sin molde; carril 5: marcador de peso molecular.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS DE LA
INVENCIÓN
La incorporación de una molécula de ADN recombinante en el genoma de la planta típicamente resulta de la transformación de una célula o tejido. El sitio en particular de la incorporación es por lp general debido a la integración aleatoria .
El ADN introducido dentro del genoma de la planta como un resultado de la transformación de una célula vegetal o tejido con un ADN recombinante o "ADN transformante", y procedente de dicho ADN transformante de ese tipo, se refiere de aquí en lo adelante como "ADN foráneo" que comprende uno o más transgenes . Los transgenes de EE-GM3 son genes de tolerancia a glifosato y al inhibidor de HPPD . "ADN vegetal" en el contexto de la presente invención se referirá al ADN procedente de la planta que se transforma. El ADN vegetal se puede encontrar generalmente en el mismo locus genético en la planta silvestre correspondiente. El ADN foráneo se puede caracterizar por la ubicación y la configuración en el sitio de incorporación de la molécula de ADN recombinante en el genoma de la planta. El sitio en el genoma vegetal donde el ADN recombinante se insertó se refiere también como el "sitio de inserción" o "sitio objetivo". La inserción del ADN recombinante dentro de la región del genoma de la planta referido como "pre- inserción de ADN vegetal" se puede asociar con una supresión del ADN vegetal, referido como "sitio objetivo de supresión". Una "región de flanqueo" o una "secuencia de flanqueo" como se usa en este documento se refiere a una secuencia de al menos 20 bp, preferentemente al menos 50 bp, y hasta 5000 bp de ADN diferente del ADN introducido, preferentemente el ADN del genoma de planta que se ubica ya sea inmediatamente corriente arriba y contiguo con o inmediatamente corriente abajo y contiguo con el ADN foráneo. Los procedimientos de transformación que conducen a la integración aleatoria del ADN foráneo resultarán en transformantes con regiones de flanqueo distintas, que son características y únicas para cada transformante. Cuando el ADN recombinante se introduce dentro de una planta a través de cruzamientos tradicionales, su sitio de inserción en el genoma de la planta o sus regiones de flanqueo generalmente no se podrán cambiar.
Un "ácido nucleico aislado (secuencia)" o "ADN aislado (secuencia)" como se usa en este documento, se refiere a un ácido nucleico o ADN (secuencia) que ya no está en el medio ambiente natural y se aisló de, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico en otro huésped bacteriano o en un genoma de la planta, o un ácido nucleico o ADN fusionado con ADN o ácido nucleico de otro origen, tal como cuando se incluye en un gen quimérico bajo el control de un promotor expresable de planta.
Un evento se define como un locus genético (artificial) que, como un resultado de la ingeniería genética, porta un ADN foráneo o transgen que comprende al menos una copia de un gen de interés o de los genes de interés. Los estados alélicos típicos de un evento son la presencia o ausencia del ADN foráneo. Un evento se caracteriza fenotípicamente por la expresión del transgen. A nivel genético, un evento es parte de la herencia de una planta. A nivel molecular, un evento se puede caracterizar por el mapa de restricción (por ejemplo como se determina por transferencia de Southern) , por secuencias de flanqueo corriente arriba y corriente abajo del transgen, la ubicación de marcadores moleculares y/o la configuración molecular del transgen. Por lo general la transformación de una planta con un ADN transformante que comprende al menos un gen de interés conduce a una población de transformantes que comprende una multitud de eventos separados, cada uno de los cuales es único. Un evento se caracteriza por el ADN foráneo y al menos una de las secuencias de flanqueo.
Un evento élite, como se usa en este documento, es un evento que se selecciona de un grupo de eventos obtenidos por la transformación con el mismo ADN transformante, que se basa en la expresión y estabilidad del transgen (es) y su compatibilidad con características agronómicas óptimas de la planta que lo comprende. De este modo los criterios para la selección del evento élite son uno o más, preferentemente dos o más, ventajosamente todos de los siguientes:
a) que la presencia del ADN foráneo no comprometa otras características deseadas de la planta, tales como aquellas relativas con el desempeño agronómico o valor comercial;
b) que el evento se caracterice por una configuración molecular bien definida que se hereda establemente y para el que se puede desarrollar herramientas apropiadas para . el control de identidad;
c) que el gen (es) de interés muestre (n) una expresión fenotípica correcta, adecuada y estable espacial y temporal, tanto en el estado del evento heterocigoto (o hemicigoto) como homocigoto, a un nivel aceptable en el comercio en un intervalo de condiciones ambientales en las que las plantas que portan el evento deben estar probablemente expuestas en el uso agronómico normal .
Se prefiere que el ADN foráneo se asocie con una posición en el genoma de la planta que permita la introgresión fácil dentro de los fondos genéticos comerciales deseados .
El estado de un evento como un evento élite se confirma por la introgresión del evento élite en diferentes fondos genéticos relevantes y la observación del cumplimiento de uno, dos o todos los criterios por ejemplo a) , b) y c) anteriores .
Un "evento élite" de este modo se refiere a un locus genético que comprende un ADN foráneo, que satisface los criterios descritos anteriormente. Una planta, material vegetal o progenie tales como semillas pueden comprender uno-o más eventos élite en su genoma.
Las herramientas desarrolladas para identificar un evento élite o la planta o material vegetal que comprende un evento élite, o productos que comprenden material vegetal que comprende el evento élite, se basan en las características genómicas específicas del evento élite, tales como el mapa específico de restricción de la región genómica que comprende el ADN foráneo, marcadores moleculares o las secuencias de la(s) región (es) de flanqueo del ADN foráneo.
Una vez que una u otra de las regiones que flanquean el ADN foráneo se secuenciaron, se pueden desarrollar cebadores y sondas que reconocen específicamente esta (estas) secuencia (s) en el ácido nucleico (ADN o ARN) de una muestra por medio de una técnica biológica molecular. Por ejemplo, un método de PCR se puede desarrollar para identificar el evento élite en muestras biológicas (tales como muestras de plantas, material vegetal o productos que comprenden material vegetal) . Un PCR de ese tipo se basa en al menos dos "cebadores" específicos, uno que reconoce una secuencia dentro de la región de flanqueo 5' ó 3' del evento élite y otro que reconoce una secuencia de ADN foráneo. Los cebadores tienen preferentemente una secuencia de entre 15 y 35 nucleótidos que bajo condiciones óptimas de PCR "reconocen específicamente" una secuencia dentro de la región de flanqueo 5' ó 3' del evento élite y del ADN foráneo del evento élite respectivamente, de manera que un fragmento específico ("fragmento de integración" o amplicón discriminante) se amplifica de una muestra de ácido nucleico, que comprende el evento élite. Esto significa que sólo el fragmento de integración objetivo, y ninguna otra secuencia del genoma de la planta o ADN foráneo, se amplifica bajo condiciones optimizadas de PCR.
Los cebadores de PCR adecuados para la identificación EE-GM3 pueden ser los siguientes:
- oligonucleótidos de longitud en el intervalo de 17 nucleótido a aproximadamente 200 nucleótido, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos consecutivos, seleccionados del ADN vegetal en la secuencia de flanqueo 5' (sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451) en su terminal 3 ' (cebadores que reconocen las secuencias de flanqueo 5'); o
- oligonucleótidos de longitud en el intervalo de 17 nucleótido a aproximadamente 200 nucleótido, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos consecutivos, seleccionados del ADN vegetal en la secuencia de flanqueo 3' (sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408) en su terminal 3' (cebadores que reconocen las secuencias de flanqueo 3 ' ) ; o
oligonucleótidos de longitud en el intervalo de 17 nucleótido a aproximadamente 200 nucleótido, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos consecutivos, seleccionados de las secuencias de ADN insertadas (complementaria de la sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843) en su terminal 3' (cebadores que reconocen ADN foráneo) ; o
- oligonucleótidos de longitud en el intervalo de 17 nucleótido a aproximadamente 200 nucleótido, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente 20 nucleótidos consecutivos, seleccionados de las secuencias de ADN insertadas (sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240) ; o
- oligonucleótidos adecuados de longitud en el intervalo de 17 nucleótido a aproximadamente 200 nucleótido, que comprenden una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos, preferentemente
20 nucleótidos consecutivos, seleccionados de la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN insertado o su complementaria (sec. con núm. de ident .: 1 o sec. con núm. de ident. :20 de la posición del nucleótido 1452 al 16638) .
Los cebadores pueden por supuesto ser más largos qüe los 17 nucleótidos consecutivos mencionados, y pueden ser, por ejemplo, 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 nucleótidos de largo o incluso más largos. Los cebadores pueden consistir enteramente de la secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las secuencia de nucleótidos mencionadas de secuencias de flanqueo y secuencias de ADN foráneo. Sin embargo, es menos crítica la secuencia de nucleótidos de los cebadores en su terminal 5' (es decir, fuera de los 17 nucleótidos consecutivos ubicados en el 3'). De este modo, la secuencia 5' de los cebadores pueden comprender o consistir de una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de flanqueo o del ADN foráneo, según proceda, pero puede, contener varios apareamientos incorrectos (por ejemplo 1, 2, 5, o 10) . La secuencia 5' de los cebadores puede ser incluso totalmente una secuencia de nucleótidos no relacionada con las secuencias de flanqueo o ADN foráneo, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que representa uno o más sitios de reconocimiento de enzimas de restricción. Las secuencias no relacionadas de ese tipo o secuencias de ADN de flanqueo con apareamientos incorrectos deben ser preferentemente no más de 100, con mayor preferencia no más de 50 o incluso 25 nucleótidos.
Además, los cebadores adecuados pueden comprender, consistir o consistir esencialmente de una secuencia de nucleótidos en su terminal 3' que abarca la región de unión entre las secuencias derivadas del ADN vegetal y las secuencias del ADN foráneo (ubicados en los nucleótidos 1451-1452 en la sec . con núm. de ident . : 2 y los nucleótidos 240-241 en la sec. con núm. de ident. :3 de EE-GM3) proporcionados de los mencionados 17 nucleótidos consecutivos ubicados en el 3' que no se derivan exclusivamente ya sea del ADN foráneo o de las secuencias derivadas de plantas en las secs. con núms . de ident . : 2 ó 3.
Resultará inmediatamente claro para el experto en la materia que los pares de cebadores de PCR debidamente seleccionados no deben comprender además secuencias complementarias entre sí.
Para el propósito de la invención, la "complementaria de una secuencia de nucleótidos representada en la sec. con núm. de ident.: X" es la secuencia de nucleótidos que se puede derivar de la secuencia de nucleótidos representada por la sustitución de los nucleótidos con sus nucleótidos complementarios de acuerdo con las reglas de Chargaff (A<=í>T; G<=C) y la lectura de la secuencia en la dirección 5' a 3', es decir, en sentido inverso de la secuencia de nucleótidos representad .
Los ejemplos de cebadores adecuados para EE-GM3 son las secuencias oligonucleotídicas de sec. con núm. de ident .: 5 (cebador que reconoce la secuencia de flanqueo 3'), sec. con núm. de ident .: 4 (cebador que reconoce el ADN foráneo para el uso con los cebadores que reconocen la secuencia de flanqueo -3' ) o sec . con núm. de ident . : 7 (cebador que reconoce el ADN foráneo para el uso con los cebadores que reconocen la secuencia de flanqueo -3').
Otros ejemplos de cebadores oligonucleotídicos adecuados de EE-GM3 comprenden en su terminal 3' las secuencias siguientes o consisten (esencialmente) de tales secuencias :
a. secuencia de flanqueo -5' que reconocen los cebadores :
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident .: 2 del nucleótido 264 al nucleótido 283
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 266 al nucleótido 285
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident .: 2 del nucleótido 1240 al nucleótido 1259
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident .: 2 del nucleótido 265 al nucleótido 285
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident .: 2 del nucleótido 265 al nucleótido 283
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident .: 2 del nucleótido 1239 al nucleótido 1259
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident .: 2 del nucleótido 1241 al nucleótido 1259
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1244 al nucleótido 1263
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1248 al nucleótido 1267
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 2 del nucleótido 1250 al nucleótido 1269
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 262 al nucleótido 279
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 263 al nucleótido 279
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident: 2 del nucleótido 264 al nucleótido 285
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 2 del nucleótido 266 al nucleótido 283
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 2 del nucleótido 1238 al nucleótido 1259
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 2 del nucleótido 1242 al nucleótido 1259
- ' la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 2 del nucleótido 1243 al nucleótido 1263
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1245 al nucleótido 1263
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident.:2 del nucleótido 1247 al nucleótido 1267
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1249 al nucleótido 1269
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1249 al nucleótido 1267
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident.: 2 del nucleótido 263 al nucleótido 285
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident .: 2 del nucleótido 267 al nucleótido 283
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1242 al nucleótido 1263
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1243 al nucleótido 1259
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1246 al nucleótido 1267
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1246 al nucleótido 1263
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1248 al nucleótido 1269
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1250 al nucleótido 1271
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident . : 2 del nucleotido 1250 al nucleotido 1267
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident .: 2 del nucleotido 1241 al nucleotido 1263
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident .: 2 del nucleotido 1245 al nucleotido 1267
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident. :2 del nucleotido 1247 al nucleotido 1269
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident.: 2 del nucleotido 1247 al nucleotido 1263
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident .: 2 del nucleotido 1249 al nucleotido 1271
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident .: 2 del nucleotido 1242 al nucleotido 1261
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident.: 2 del nucleotido 1241 al nucleotido 1261
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident.: 2 del nucleotido 1243 al nucleotido 1261
- la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident.: 2 del nucleotido 1240 al nucleotido 1261
la secuencia de nucleótidos de la sec. con de ident.: 2 del nucleotido 1244 al nucleotido 1261
la secuencia de nucleotidos de la sec. con de ident . : 2 del nucleótido 1239 al nucleótido 1261
- la secuencia de nucleotidos de la sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1245 al nucleótido 1261
b. secuencia de ADN foráneo que reconocen los cebadores para usar con la secuencia de flanqueo 5 ' que reconocen los cebadores :
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1732 al nucleótido 1751 - la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1735 al nucleótido 1754
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1731 al nucleótido 1750
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1732 al nucleótido 1750
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de iden .: 2 del nucleótido 1732 al nucleótido 1752
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1731 al nucleótido 1749 - la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1732 al nucleótido 1749
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec . con de ident.: 2 del nucleótido 1731 al nucleótido 1751 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.:2 del nucleótido 1732 al nucleótido 1753
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident . : 2 del nucleótido 1731 al nucleótido 1748 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1732 al nucleótido 1748
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1735 al nucleótido 1751
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1731 al nucleótido 1752
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1732 al nucleótido 1754
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1731 al nucleótido 1747 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1731 al nucleótido 1753
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1727 al nucleótido 1746
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1727 al nucleótido 1745
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1727 al nucleótido 1747 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec . con de ident.:2 del nucleótido 1727 al nucleótido 1744
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident . : 2 del nucleótido 1727 al nucleótido 1748 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1727 al nucleótido 1749
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1726 al nucleótido 1745
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1726 al nucleótido 1744
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1726 al nucleótido 1746
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1726 al nucleótido 1747 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1726 al nucleótido 1748
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1724 al nucleótido 1744 la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident ·. :2 del nucleótido 1724 al nucleótido 1745 la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1724 al nucleótido 1746 - la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident . : 2 del nucleótido 1461 al nucleótido 1478
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1670 al nucleótido 1686 - la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1469 al nucleótido 1486
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1508 al nucleótido 1527
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1667 al nucleótido 1686
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1670 al nucleótido 1687
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1673 al nucleótido 1689 - la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1688 al nucleótido 1704
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1688 al nucleótido 1705
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1692 al nucleótido 1709
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1467 al nucleótido 1486 la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec . con de ident . : 2 del nucleótido 1481 al nucleótido 1497
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1481 al nucleótido 1498 - la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1491 al nucleótido 1507
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1491 al nucleótido 1508
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1672 al nucleótido 1688
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1673 al nucleótido 1690
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1673 al nucleótido 1691 - la complementaria.de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1688 al nucleótido 1706
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1691 al nucleótido 1707
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1691 al nucleótido 1708
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1469 al nucleótido 1487 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec . con de ident .: 2 del nucleótido 1481 al nucleótido 1499
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1489 al nucleótido 1505 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1489 al nucleótido 1506
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. -. 2 del nucleótido 1489 al nucleótido 1507
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1489 al nucleótido 1508
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1666 al nucleótido 1686
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1667 al nucleótido 1687 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1670 al nucleótido 1688
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1672 al nucleótido 1689 la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1688 al nucleótido 1707
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1691 al nucleótido 1709 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec . con de ident . : 2 del nucleótido 1692 al nucleótido 1710
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1481 al nucleótido 1500 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1491 al nucleótido 1509
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1670 al nucleótido 1689
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1672 al nucleótido 1690
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1672 al nucleótido 1691
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1687 al nucleótido 1705 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1687 al nucleótido 1706
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1691 al nucleótido 1710
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1472 al nucleótido 1488
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1488 al nucleótido 1507 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de on de ident . : 2 del nucleótido 1491 al nucleótido 1510
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de on de ident. :2 del nucleótido 1495 al nucleótido 1512
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de on de ident .: 2 del nucleótido 1495 al nucleótido 1513
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de on de ident. :2 del nucleótido 1495 al nucleótido 1514
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de on de ident .: 2 del nucleótido 1673 al nucleótido 1692
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de on de ident .: 2 del nucleótido 1678 al nucleótido 1694
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de on de ident.: 2 del nucleótido 1678 al nucleótido 1695
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de on de ident .: 2 del nucleótido 1678 al nucleótido 1696
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de on de ident .: 2 del nucleótido 1687 al nucleótido 1703
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de on de ident .: 2 del nucleótido 1687 al nucleótido 1704 la complementaria de la secuencia de nucleótidos de on de ident .: 2 del nucleótido 1692 al nucleótido 1711 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec . con de ident.:2 del nucleótido 1469 al nucleótido 1488
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident . : 2 del nucleótido 1488 al nucleótido 1506 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1491 al nucleótido 1511
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1670 al nucleótido 1690
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1678 al nucleótido 1697
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1688 al nucleótido 1709
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1467 al nucleótido 1487 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. conx de ident. :2 del nucleótido 1488 al nucleótido 1508
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1495 al nucleótido 1511
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1491 al nucleótido 1512
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1666 al nucleótido 1687 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.:2 del nucleótido 1667 al nucleótido 1688
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident . : 2 del nucleótido 1672 al nucleótido 1692 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1673 al nucleótido 1693
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1687 al nucleótido 1707
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1472 al nucleótido 1490
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1472 al nucleótido 1491
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1481 al nucleótido 1501 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1489 al nucleótido 1509
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1495 al nucleótido 1515
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1670 al nucleótido 1691 la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1673 al nucleótido 1694 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident . : 2 del nucleótido 1678 al nucleótido 1698
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1469 al nucleótido 1489 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1667 al nucleótido 1689
- la complementaria de la secuencia e nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1687 al nucleótido 1708
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1688 al nucleótido 1710
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1691 al nucleótido 1711
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1472 aj nucleótido 1492 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1489 al nucleótido 1510 la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1666 al nucleótido 1688
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident. :2 del nucleótido 1687 al nucleótido 1709
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1692 al nucleótido 1712 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec . con de ident . : 2 del nucleótido 1467 al nucleótido 1488
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1469 al nucleótido 1490 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1488 al nucleótido 1509
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1489 al nucleótido 1511
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1678 al nucleótido 1699
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1472 al nucleótido 1493
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1472 al nucleótido 1494 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1481 al nucleótido 1502
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1670 al nucleótido 1692
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1469 al nucleótido 1491
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1488 al nucleótido 1510 la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec . con de ident.:2,del nucleótido 1691 al nucleótido 1712
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident . : 2 del nucleótido 1692 al nucleótido 1713 - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1692 al nucleótido 1714
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1467 al nucleótido 1489
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de ' sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1678 al nucleótido 1700·
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident .: 2 del nucleótido 1481 al nucleótido 1503
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con de ident.: 2 del nucleótido 1691 al nucleótido 1713
c. secuencia de flanqueo 3' que reconoce los cebadores:
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 828 al nucleótido 847
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 830 al nucleótido 849
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec . con núm. de ident.:3 del nucleótido 828 al nucleótido 846
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident.:3 del nucleótido 828 al nucleótido
848
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 830 al nucleótido 848
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 830 al nucleótido 850
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 828 al nucleótido 845
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 830 al nucleótido 847
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 828 al nucleótido
849
- la complementaria de la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 830 al nucleótido
851
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:3 del nucleótido 828 al nucleótido 844
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:3 del nucleótido 830 al nucleótido
846
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 828 al nucleótido 850
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 830 al nucleótido 852
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 992 al nucleótido 1009
la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 731 al nucleótido 752
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 776 al nucleótido
795
la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 731 al nucleótido - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:3 del nucleótido 776 al nucleótido 794
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 776 al nucleótido
796
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 776 al nucleótido
793
- - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 776 al nucleótido 797
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 776 al nucleótido 792
la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 776 al nucleótido 798
la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 733 al nucleótido 752
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 733 al nucleótido - la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:3 del nucleótido 733 al nucleótido 754
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:3 del nucleótido 733 al nucleótido
755
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 838 al nucleótido 854
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 246 al nucleótido 263
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 838 al nucleótido 855
- la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 245 al nucleótido 264
d. secuencia de ADN foráneo que reconoce los cebadores para el uso con la secuencia de flanqueo 31 que reconoce los cebadores :
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 173 al nucleótido 192
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 22 al nucleotido 41
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 172 al nucleotido 192
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 174 al nucleotido 192
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 191 al nucleotido 210
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 171 al nucleotido 192
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 175 al nucleotido 192
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 190 al nucleotido 210
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 192 al nucleotido 210
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 3 del nucleotido 176 al nucleotido 192
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 189 al nucleotido 210
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 3 del nucleotido 193 al nucleotido 210
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 188 al nucleotido 210
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 3 del nucleotido 194 al nucleotido 210
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 199 al nucleotido 218
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 200 al nucleotido 218
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 197 al nucleotido 218
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 201 al nucleotido 218
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 201 al nucleotido 220
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 3 del nucleotido 200 al nucleotido 220
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 199 al nucleotido 220
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de iden . : 3 del nucleotido 200 al nucleotido 221
la secuencia de nucleótidos de sec. con núm . de ident . : 3 del nucleotido 199 al nucleotido 221
- la secuencia de nucleótidos de sec. con núra. de ident . : 3 del nucleótido 150 al nucleótido 172
Los cebadores de PCR adecuados para la identificación de EE-GM1 se describieron en O2006/108674 , en particular de la línea 4 de la página 8, a la línea 7 de la página 26, (incorporada en este documento como referencia) .
Los cebadores de PCR adecuados para la identificación de EE-GM2 se describieron en WO2006/108675 , en particular de la línea 4 de la página 8, a la línea 4 de la página 33, (incorporada en este documento como referencia) .
Como se usa este documento, "la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: Z de la posición X a la posición Y" indica la secuencia de nucleótidos que incluye ambos extremos de nucleótidos.
Preferentemente, el fragmento amplificado tiene una longitud de entre 50 y 500 nucleótidos, tal como una longitud entre 100 y 350 nucleótidos. Los cebadores específicos puedén tener una secuencia que es entre 80 y 100% idéntica a una secuencia dentro de la región de flanqueo 5 1 o 31 del evento élite y el ADN foráneo del evento élite, respectivamente, que aún proporcionando los apareamientos incorrectos permite la identificación específica del evento élite con estos cebadores bajo condiciones óptimas de PCR. El intervalo de apareamientos incorrectos permisible sin embargo, puede ser fácilmente determinado experimentalmente y se conoce por un experto en la técnica.
La detección de los fragmentos de integración puede realizarse de diversas maneras, por ejemplo, a través de la estimación del tamaño después del análisis del gel . Los fragmentos de integración se pueden también secuenciar directamente. Otros métodos de secuencia específica para la detección de fragmentos de ADN amplificados se conocen también en la técnica.
Como la secuencia de los cebadores y su ubicación relativa en el genoma son exclusivas para el evento élite, la amplificación del fragmento de integración sólo se producirá en muestras biológicas que comprenden (el ácido nucleico del) evento élite. Preferentemente , al realizar una PCR para detectar la presencia de los eventos élites EE-GM3 y EE-GM1 o los eventos élites EE-GM3 y EE-GM2 en muestras desconocidas, se incluye un control de un conjunto de cebadores con los que se puede amplificar un fragmento dentro de un' "gen constitutivo" de las especies vegetales del evento. Los genes constitutivos son los genes que se expresan en la mayoría de los tipos de células y que están relacionados con actividades metabólicas básicas comunes a todas las células. Preferentemente, el fragmento amplificado del gen constitutivo es un fragmento que es mayor que el fragmento de integración amplificado. Se pueden incluir otros controles dependiendo de las muestras que se analizan.
Los protocolos estándar de PCR se describen en la técnica, tal como en "PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2da Edición, 1999) y otras referencias. Las condiciones óptimas para la PCR, incluyendo la secuencia de los cebadores específicos, se especifican en un "Protocolo de identificación por PCR (o Reacción en Cadena de la Polimerasa) para cada evento élite. Sin embargo, se entiende que una serie de parámetros en el protocolo de identificación por PCR se necesitarían ajustar a determinadas condiciones de laboratorio, y se pueden modificar ligeramente para obtener resultados similares. Por ejemplo, el uso de un método diferente para la preparación del ADN puede requerir el ajuste de, por ejemplo, la cantidad de cebadores, polimerasa y condiciones de hibridación usadas. Del mismo modo, la selección de otros cebadores puede imponer otras condiciones óptimas para el protocolo de identificación por PCR. Estos ajustes sin embargo, serán evidentes para una persona experta en la técnica, y además se detallan en los presentes manuales de aplicación de PCR, tal como el mismo que se citó anteriormente.
Como alternativa, se pueden usar cebadores específicos para amplificar fragmentos de integración que se pueden usar como "sondas especificas" para identificar EE-GM3 y EE-GM1 o EE-GM3 y EE-GM2 en muestras biológicas. El contacto del ácido nucleico de una muestra biológica con las sondas, bajo condiciones que permiten la hibridación de las sondas con sus correspondientes fragmentos en el ácido nucleico de la muestra, resulta en la formación de híbridos ácido nucleico/sonda. La formación de estos híbridos se puede detectar (por ejemplo a través del mareaje del ácido nucleico o sonda) , por lo cual la formación de estos híbridos indica la presencia de EE-GM3 y EE-GM1 o EE-GM3 y EE-GM2. Los métodos de identificación de este tipo basados en hibridación con una sonda específica (ya sea en un vehículo de fase sólida o en solución) se describieron en la técnica. La sonda específica es preferentemente una secuencia que bajo condiciones óptimas se híbrida específicamente a una región dentro de la región de flanqueo 5' ó 3' del evento élite y preferentemente comprende también una parte del ADN foráneo contiguo con éste (en lo adelante se refiere como "región específica") . Preferentemente, la sonda comprende una secuencia específica de entre 50 y 500 bp, preferentemente de 100 a 350 bp que es al menos 80%, preferentemente entre 80 y 85%, con mayor preferencia entre 85 y 90%, especialmente preferentemente entre 90 y 95%, con la máxima preferencia entre 95% y 100%) idéntica (o complementaria) a la secuencia de nucleótidos de la región específica. Preferentemente, la sonda específica comprende una secuencia de aproximadamente 15 a aproximadamente 100 nucleótidos contiguos idénticos (o complementarios) a una región específica del evento élite.
Además, los métodos de detección para los eventos élites específicos EE-GM3 y EE-GMl o para los eventos élites EE-GM3 y EE-GM2 que difieren de los métodos de amplificación basados en PCR se pueden desarrollar también usando la información de la secuencia específica del evento élite que se proporciona en este documento. Los métodos de detección alternativos de este tipo incluyen métodos de detección de amplificación lineal de la señal basados en la escisión invasiva de estructuras de ácidos nucleicos en particular, conocido también como tecnología InvaderTM (como se describe por ejemplo en la patente de los Estados Unidos 5,985,557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6,001,567 "Detection of Nucleic Acid Sequences by Invader Directed Cleavage, que se incorporan en este documento como referencia) . Para la detección de EE-GM3 por este método la secuencia objetivo puede hibridar con un primer oligonucleótido marcado de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1469 o su complementaria o dicha sonda marcada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident . : 3 del nucleótido 223 al nucleótido 240 o su complementaria y se híbrida además con un segundo oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :2 del nucleótido 1434 al nucleótido 1451 o su complementaria o dicha sonda de ácido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 258 o su complemento, donde el primer y segundo oligonucleótido se superponen en al menos un nucleótido. La estructura dúplex o triplex que se produce por esta hibridación permite la escisión selectiva de la sonda con una enzima (Cleavase®) dejando intacta la secuencia objetivo. La sonda marcada escindida se detecta a continuación, potencialmente a través de una etapa intermediaria que resulta en una amplificación de señal adicional. Para la detección de EE-GM1 por este método, la secuencia objetivo se puede hibridar con un primer oligonucleótido marcado de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :12 del nucleótido 210 al nucleótido 227 o su complemento o dicha sonda de ácido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 13 del nucleótido 561 al nucleótido 568 y se híbrida además con un segundo oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:12 del nucleótido 192 al nucleótido 209 o su complemento o dicha sonda marcada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 569 al nucleótido 586 o su complemento, donde el primer y segundo oligonucleótido se superponen en al menos un nucleótido. La estructura dúplex o triplex que se produce por esta hibridación permite la escisión selectiva de la sonda con una enzima (Cleavase®) dejando intacta la secuencia objetivo. La sonda marcada escindida se detecta a continuación, potencialmente a través de una etapa intermediaria que resulta en una amplificación de señal adicional. Para la detección de EE-GM2 por este método, la secuencia objetivo se puede hibridar con un primer oligonucleótido marcado de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 14 del nucleótido 312 al nucleótido 329 o su complemento o dicha sonda marcada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :15 del nucleótido 490 al nucleótido 507 o su complemento y se híbrida además con un segundo oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 14 del nucleótido 294 al nucleótido 311 o su complemento o dicha sonda marcada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:15 del nucleótido 508 al nucleótido 525 o su complemento, donde el primer y segundo oligonucleótido se superponen en al menos un nucleótido. La estructura dúplex o triplex que se produce por esta hibridación permite la escisión selectiva de la sonda con una enzima (Cleavase ®) dejando intacta la secuencia objetivo. La sonda marcada escindida se detecta a continuación, potencialmente a través de una etapa intermediaria que resulta en una amplificación de señal adicional.
Un "kit" como se usa en este documento, se refiere a un conjunto de reactivos para el propósito de realizar el método de la invención, más particularmente, la identificación del evento élite EE-GM3 en muestras biológicas o la determinación del estado de cigocidad de EE-GM3 que contiene el material vegetal. Más particularmente, una modalidad preferida del kit de la invención comprende al menos uno o dos cebadores específicos, como se describió anteriormente para identificar el evento élite, o tres cebadores específicos para determinar el estado de cigocidad. Opcionalmente, el kit puede comprender además cualquier otro reactivo descrito en este documento en el protocolo de identificación por PCR. Como alternativa, de acuerdo con otra modalidad de esta invención, el kit puede comprender una sonda específica, como se describió anteriormente, la cual se híbrida específicamente con ácidos nucleicos de muestras biológicas para identificar la presencia de EE-GM3 en estas. Opcionalmente , dicho kit puede comprender además cualquier otro reactivo (tales como, pero no limitado al tampón, marcador de hibridación) para identificación de EE-GM3 en muestras biológicas usando la sonda específica.
El kit de la invención puede usarse, y sus componentes pueden ajustarse específicamente, para los propósitos del control de calidad (por ejemplo, pureza de lotes de semillas) detección de la presencia o ausencia del evento élite en el material vegetal o material que comprende o se deriva del material vegetal, tales como, pero no se limita a alimento o piensos .
Como se usa en este documento, "identidad de secuencia" con respecto a las secuencias de nucleótidos (ADN o ARN) , se refiere al número de posiciones con nucleótidos idénticos dividido por el número de nucleótidos en la más corta de las dos secuencias . La alineación de las dos secuencias de nucleótidos se realiza mediante el algoritmo de Wilbur y Lipmann (Wilbur y Lipmann, 1983, Proc . Na . Acad. Sei . Estados Unidos 80:726) usando una ventana de tamaño de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, y una penalización de brecha de 4. El análisis asistido por computadoras y la interpretación de datos de secuencia, incluyen el alineamiento de secuencia se describió anteriormente, que se puede, por ejemplo, convenientemente realizar usando el paquete de programas informáticos de análisis de secuencia genética del Grupo Computarizado de Genética (GCG, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin) . Las secuencias se indican como "esencialmente similar" cuando las secuencias de este tipo tienen una secuencia idéntica de al menos aproximadamente 75%, en particular al menos aproximadamente 80%, más particularmente al menos aproximadamente 85%, muy en particular al menos aproximadamente 90%, especialmente al menos aproximadamente 95%, más especialmente al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99%. Está claro que cuando las secuencias de ARN se denominan para ser esencialmente similar o que tienen un determinado grado de identidad de secuencia con las secuencias de ADN, la timina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. También, está claro que pueden aparecer con el tiempo pequeñas diferencias o mutaciones en las secuencias de ADN y que se pueden permitir algunos apareamientos incorrectos para los cebadores o sondas específicos del evento de la invención, por lo que cualquier secuencia de ADN indicada en este documento en cualquier modalidad de esta invención para cualquier ADN de flanqueo 31 ó 51 o para cualquier inserto o ADN foráneo o cualquier cebador o sonda de la presente invención, incluye también secuencias esencialmente similares a las secuencias que se proporcionan en este documento, tales como secuencias que se hibridan a o con al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos el 99% de identidad de secuencia a la secuencia dada para cualquier ADN de flanqueo 3' o 5', para cualquier cebador o sonda o para cualquier inserto o ADN foráneo de esta invención.
El término "cebador" como se usa en este documento incluye cualquier ácido nucleico capaz de cebar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un proceso dependiente de molde, tal como PCR. Típicamente los cebadores son oligonucleótidos de 10 a 30 nucleótidos, pero pueden emplearse secuencias más largas. Los cebadores se pueden proporcionar en forma de doble cadena, aunque se prefiere la forma monocatenaria . Las sondas se pueden usar como cebadores, pero se diseñan para unirse con los ADN o ARN objetivos y no se necesitan usar en un proceso de amplificación.
El término "reconocimiento" según se usa en este documento cuando se refiere a cebadores específicos, se refiere al hecho de que los cebadores específicos hibridan específicamente a una secuencia de ácido nucleico en el evento élite bajo las condiciones establecidas en el método (tales como las condiciones del protocolo de identificación por PCR) , por lo cual la especificidad se determina por la presencia de controles positivos y negativos.
El término "hibridación" según se usa en este documento cuando se refiere a sondas específicas, se refiere al hecho de que la sonda se une a una región específica en la secuencia de ácido nucleico del evento élite bajo condiciones estándares estrictas. Las condiciones estándares estrictas según se usa en este documento se refiere a las condiciones de hibridación descritas en este documento o a las condiciones convencionales de hibridación como se describieron por Sambrook y otros., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) , que, por ejemplo, puede comprender las siguientes etapas: 1) inmovilizar fragmentos de ADN genómico de planta en un filtro 2) prehibridar el filtro durante 1 a 2 horas a 42°C en formamida al 50%, SSPE 5 X, reactivo de Denhardt 2 X y SDS al 0.1%, o durante 1 a 2 horas a 68°C en SSC 6 X, reactivo de Denhardt 2 X y SDS al 0.1%, 3) adicionar la sonda de hibridación que se marcó, 4) incubar durante 16 a 24 horas, 5) lavar el filtro durante 20 minutos a temperatura ambiente en SSC IX y SDS al 0.1%, 6) lavar el filtro tres veces durante 20 minutos cada vez a 68 °C en SSC 0.2 X y SDS al 0.1%, y 7) exponer el filtro durante 24 a 48 horas en una película de rayos X a -70 °C con una pantalla intensificadora .
Como se usa en este documento, una muestra biológica es una muestra de una planta, material vegetal o, productos que comprenden el material vegetal. El término "planta" pretende incluir tejidos de planta de soya (Glycine ax) , en cualquier fase de madurez, así como cualquier células, tejidos u órganos tomados de o derivados de cualquier planta de este tipo, incluyendo sin limitación, cualquier semilla, hojas, tallos, flores, raíces, células individuales, gametos, cultivos de células, cultivos de tejidos o protoplastos . El "material vegetal" como se usa en este documento se refiere a un material que se obtiene o deriva de una planta. Los productos que comprenden el material vegetal se relacionan con alimentos, piensos u otros productos que se fabrican usando el material vegetal o se pueden contaminar por material vegetal. Se entiende que, en el contexto de la presente invención, las muestras biológicas de este tipo se prueban para la presencia de ácidos nucleicos específicos para EE-GM3, EE-GM1 y EE-GM2 , lo que implica la presencia de los ácidos nucleicos en las muestras. De este modo, los métodos referidos en este documento para identificar los eventos élites EE-GM3 y EE-GM2 o EE-GM3 y EE-GM1 en muestras biológicas, se relacionan con la identificación en muestras biológicas de ácidos nucleicos que comprenden el evento élite .
Como se usa en este documento, "que comprende" debe interpretarse como que especifica la presencia de las características indicadas, números enteros, etapas, reactivos o componentes a que se refiere, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas o componentes, o agrupaciones de estas. De este modo, por ejemplo, un ácido nucleico o proteína que comprende una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede comprender más nucleótidos o aminoácidos de los realmente citados, es decir, integrarse en un ácido nucleico o proteína más grandes. Un gen quimérico que comprende una secuencia de ADN que se define funcionalmente o estructuralmente , puede comprender secuencias de ADN adicionales, tales como secuencias promotoras y de terminación de la transcripción.
La presente invención se refiere también al desarrollo de un acumulado del evento élite EE-GM3 y evento élite EE-GM1 o un acumulado del evento élite EE-GM3 y evento élite EE-GM2 en la soya, de las plantas que comprenden un acumulado de estos eventos, la descendencia que se obtiene de estas plantas y de las células vegetales, o material vegetal derivado de plantas que comprenden estos acumulados . Las plantas que comprenden los eventos élites EE-GM3 y EE-GM1 o EE-GM3 y EE-GM2 se pueden obtener según se describe en el Ejemplo 1. Los acumulados se obtienen cruzando las plantas que comprenden eventos únicos usando métodos de cultivo convencionales e identificación de la progenie de estas comprendiendo dos eventos diferentes.
Las plantas de soya o material vegetal que comprende EE-GM3 y EE-GM1 se pueden identificar según el protocolo de identificación por PCR descrito para EE-GM3 y EE-GM1 en el Ejemplo 2. En resumen, el ADN genómico de soya presente en la muestra biológica se amplifica por PCR usando un cebador que reconoce específicamente una secuencia dentro de la secuencia de flanqueo 5 '? 31 de EE-GM3 tal como el cebador con la secuencia de sec . con núm. de ident . : 5 , y un cebador que reconoce una secuencia en el ADN foráneo, tal como el cebador con la secuencia de sec. con núm. de ident .: 4 y además usando un cebador que reconoce específicamente una secuencia dentro de la secuencia de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM1 tal como el cebador con la secuencia de sec. con núm. de ident.: 16, y un cebador que reconoce una secuencia en el ADN foráneo, tal como el cebador con la secuencia de sec. con núm. de ident . : 17.
Las plantas de soya o material vegetal que comprenden EE-GM3 y EE-GM2 se pueden identificar de acuerdo con el protocolo de identificación por PCR descrito para EE-GM3 y EE-GM2 en el Ejemplo 2. En resumen, el ADN genómico de soya presente en la muestra biológica se amplifica por PCR usando un cebador que reconoce específicamente una secuencia dentro de la secuencia de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM3 tal como el cebador con la secuencia de sec. con núm. de ident.:5, y un cebador que reconoce una secuencia en el ADN foráneo, tal como el cebador con la secuencia de sec. con núm. de ident.:4 y usando además un cebador que reconoce específicamente una secuencia dentro de la secuencia de flanqueo 5' ó 3' de EE-GM2 tal como el cebador con la secuencia de sec. con núm. de ident.:18, y un cebador que reconoce una secuencia en el ADN foráneo, tal como el cebador con la secuencia de sec. con núm. de ident.:19.
Los cebadores de ADN que amplifican parte de una secuencia de soya endógena se usan como control positivo para la amplificación de PCR. Si, tras la amplificación de PCR, el material produce los fragmentos de los tamaños esperados, el material contiene el material vegetal de una planta de soya que contiene el evento élite EE-GM3, EE-GM1 o procedente de una planta de soya que contiene el evento élite EE-GM3 y EE-GM2.
Las plantas que contienen EE-GM3 y EE-GM1 o EE-GM3 y EE-GM2 se caracterizan por su tolerancia a glifosato, así como por su tolerancia a los inhibidores de HPPD tal como isoxaflutol y además por su tolerancia a glufosinato. Las plantas que contienen los acumulados de eventos se caracterizan también por tener características agronómicas que son comparables con las variedades de soya comercialmente disponibles, en la ausencia de aplicación de herbicidas. Se observó que la presencia del ADN foráneo en las regiones de inserción del genoma de la planta de soya que se describe en este documento, confiere características fenotípicas y moleculares especialmente interesantes a las plantas que comprenden este evento.
Una modalidad de la presente invención proporciona una combinación de eventos élite EE-GM3, EE-GM1 y/o EE-GM2 en plantas de soya, obtenible mediante la inserción de transgenes en ubicaciones específicas en el genoma de la soya cuyos eventos élites confieren tolerancia a glifosato, glufosinato y un herbicida inhibidor de HPPD tal como isoxaflutol, en las plantas de soya de este tipo, y en donde los eventos élites de este tipo no causan ningún efecto sobre el comportamiento agronómico de las soyas de este tipo, que afectan negativamente el rendimiento de las plantas de soya de este tipo en comparación con líneas isogénicas (como se usa en este documento, "líneas isogénicas" o "líneas casi isogénicas" son las líneas de soya del mismo fondo genético pero que carecen de los transgenes, tales como las plantas del mismo fondo genético como la planta que se usa para la transformación o segregación de líneas hermanas después de haber perdido los transgenes) . En particular, la presente invención proporciona una combinación de eventos élite EE-G 3, EE-GMl y/o EE-GM2 en plantas de soya, donde la inserción o presencia de dicho evento élite en el genoma de las plantas de soya de este tipo no provoca una susceptibilidad aumentada a la enfermedad, no provoca un retraso en el rendimiento, o no provocan un alojamiento aumentado en las plantas de soya de este tipo, comparado con las líneas isogénicas. Por lo tanto, la presente invención proporciona una combinación de eventos élites en plantas de soya, designados como EE-GM3 y EE-GMl y/o EE-GM2, que dan lugar a plantas de soya que pueden tolerar la aplicación de glifosato, glufosinato y un herbicida inhibidor de HPPD (ya sea simultáneo o separadamente) sin afectar negativamente el rendimiento de dichas plantas de soya comparado con las líneas isogénicas, cuyas plantas de soya no tienen ninguna diferencia estadísticamente significativa en su susceptibilidad a la enfermedad o alojamiento, comparado con las plantas de soya isogénicas . Estas características hacen muy interesante la presente combinación de eventos élites para controlar malezas resistentes a glifosato en campos de soya, y también pueden usarse en los enfoques para evitar o retrasar el desarrollo adicional de resistencia a glifosato en los campos de soya (por ejemplo mediante la aplicación de glifosato e isoxaflutol y/o glufosinato, o por aplicación de isoxaflutol y glifosato y/o glufosinato, o mediante la aplicación de glufosinato y glifosato y/o isoxaflutol, asegurando al menos dos o incluso tres modos diferentes de actuación de los herbicidas aplicados sobre un campo de soya) .
En este documento se proporciona además una planta de soya o parte de esta que comprende el evento EE-GM3 y el evento élite EE-GM1 o EE-GM2, donde la semilla representativa de soya que comprende el evento EE-GM3 se depositó en el NCIMB con el número de acceso 41659, la semilla representativa de soya que comprende el evento élite EE-GM1 se depositó en el NCIMB con el número de acceso 41658, la semilla representativa de soya que comprende el evento élite EE-GM2 se depositó en el NCIMB con el número de acceso NCIMB 41660, la semilla representativa de soya que comprende el evento EE-GM3 y EE-GM1 se depositó en la ATCC con el número de acceso PTA-11041, y, la semilla representativa de soya que comprende el evento EE-GM3 y EE-GM2 se depositó en la ATCC bajo número de acceso PTA-11042.
Las plantas de soya o partes de estas que comprenden EE-GM3 y EE-GM1 o EE-GM3 y EE-GM2 se pueden obtener combinando los respectivos eventos élites que pueden encontrarse en las semillas depositadas correspondientes a través de cualquiera de los medios disponibles en la técnica, incluyendo el cruzamiento de las plantas a partir de las semillas depositadas, colecta de la progenie de esta, e identificación de aquellas plantas de la progenie, que comprenden la combinación adecuada de los eventos élite. En este documento se proporcionan además tales semillas de las plantas, que comprenden tales eventos así como un producto de soya que se produce a partir de dichas semillas, donde dicho producto de soya comprende los eventos EE-GM3 y EE-GMl o EE-GM2. Tal producto de soya puede ser o puede comprender comida, semillas molidas, harina, copos, etc.). Particularmente, dicho producto de soya comprende un ácido nucleico que produce amplicones de diagnóstico para el evento EE-GM3 y evento élite EE-GMl o EE-GM2, los amplicones de este tipo que comprenden las secs . con núm. de ident . : 2 ó 3, secs. con núm. de ident 14 ó 15 y/o secs. con núm. de ident. : 12 ó 13. En este documento se proporciona además un método para producir un producto de soya, que comprende obtener semillas de soya que comprenden el evento EE-GM3 y evento élite EE-GMl o EE-GM2, y producir por tanto dicho producto de soya.
En este documento se proporciona además una planta de soya, que es la progenie de cualquiera de las plantas de soya anteriores, y que comprenden los eventos EE-GM3 y EE-GMl, o EE-GM2.
En este documento se proporciona además un método para producir una planta de soya tolerante a glifosato y/o glufosinato y/o herbicidas de isoxaflutol, que comprende introducir en el genoma de tal planta el evento EE-GM3 ' y evento EE-GMl o EE-GM2, particularmente por el cruzamiento de una primera planta de soya que contiene el evento EE-GM3 con una planta de soya que comprende EE-GMl y/o EE-GM2, y seleccionar una progenie de la planta tolerante a glifosato y/o glufosinato y/o isoxaflutol.
En este documento se proporciona además una planta tolerante a glifosato y glufosinato y/o isoxaflutol, particularmente sin retraso del rendimiento, y con características agronómicas aceptables, que comprende una proteína 2mEPSPS, HPPD y PAT, y es capaz de producir un amplicón de diagnóstico para los eventos EE-GM3 y EE-GMl o EE-GM3 y EE-GM2.
Además en este documento se proporciona un método para controlar las malezas en un campo de plantas de soya que comprenden los eventos EE-GM3 y EE- GM1 o EE-GM3 y EE-GM2, o un campo que se cultiva con tales plantas de soya, que comprende tratar el campo con una cantidad efectiva de un herbicida basado en isoxaflutol, basado en glifosato y/o basado en glufosinato, donde tales plantas son tolerantes a herbicida (s) de este tipo.
En este documento se proporciona además una planta de soya, célula, tejido o semilla, que comprende a EE-GM3 y EE-GMl , que se caracteriza por comprender en el genoma de sus células una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95%, o 100% de identidad de secuencia con la sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1431 al 1472 y una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95%, o 100% de identidad de secuencia con la sec. con- núm. de ident. :3 del nucleótido 220 al 261, o las complementarias de dichas secuencias, y una secuencia de ácido nucleico también con al menos 80%, 90%, 95%, o 100% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident. : 12 del nucleótido 199 al 220, y una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95%, o 100% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 13 del nucleótido 558 al 579, o las complementarias de dichas secuencias.
En este documento se proporciona además una planta de soya, célula, tejido o semilla, que comprenden a EE-GM3 y EE-GM2 , que se caracteriza por comprender en el genoma de sus células una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95%, o 100% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1431 al 1472 y una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95%, o 100% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:3 del nucleótido 220 al 261, o las complementarias de dichas secuencias, y una secuencia de ácido nucleico también con al menos 80%, 90%, 95%, o 100% de identidad^ de secuencia con la sec. con núm. de ident.:14 del nucleótido 301 al 322, y una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95%, o 100% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:15 del nucleótido 497 al 518, o las complementarias de dichas secuencias.
El término "isoxaflutol" , como se usa en este documento, se refiere al herbicida isoxaflutol [es decir (5-ciclopropil-4-isoxazolil) [2- (metilsulfonil) -4- ( trifluorometil) fenil] metanona] , el metabolito activo de éste, dicetonitrilo, y cualquiera de las mezclas o soluciones que comprenden dichos compuestos . Los herbicidas inhibidores de HPPD útiles para aplicar en las plantas que comprenden los eventos de esta invención son los dicetonitrilos , por ejemplo 2-ciano-3 -ciclopropil-1- ( 2 -metilsulfonil-4 -trifluorometilfenil) -propano-1 , 3 -diona y 2 - ciano- 1 - [4 - (metilsulfonil) -2 -trifluorometilfenil] -3- (1-metilciclopropil) propano-1, 3 -fiona'; otros isoxazoles; y los pirazolinatos, por ejemplo topramezona [es decir [3- (4, 5-dihidro-3-isoxazolil) -2-metil-4- (metilsulfonil) fenil] (5-
hidroxi-l-metil-lH-pirazol-4-il)metanona] , y pirasulfotol [ (5-hidroxi-1, 3-dimetilpirazol-4-il (2-mesil-4-trifluarometilfenil) metanona] ; o pirazofen [2- [4- (2 , 4-diclorobenzoil) -1, 3-dimetilpirazol-5-iloxi] acetofenona] .
En una modalidad de esta invención, un campo que se cultiva con las plantas de soya que contienen el evento EE-GM3 , se puede tratar con un herbicida inhibidor de HPPD, tal como isoxaflutol ('IFT'), antes de que se cultiven las plantas de soya o se siembren las semillas, que limpia el campo de malezas que se mueren por el inhibidor de HPPD, lo que favorece las prácticas de siembra directa, seguido el cultivo o siembra de la soya en ese mismo campo pre-tratado más tarde (aplicación de quemado usando un herbicida inhibidor de HPPD) . La actividad residual de IFT protegerá también a las plantas de soya emergentes y en crecimiento de la competencia con las malezas en las fases tempranas del crecimiento. Una vez que las plantas de soya tienen cierto tamaño y las malezas tienden a reaparecer, se puede aplicar como herbicida post-emergente el glifosato o una mezcla de glifosato- inhibidor de HPPD, por encima de las plantas.
En otra modalidad de esta invención, un campo en el que se sembraron las semillas que contienen el evento EE-GM3 , se puede tratar con un herbicida inhibidor de HPPD, tal como IFT, antes de que las plantas de soya emerjan pero después de que las semillas se siembran (el campo se puede preparar libre de maleza antes de sembrar usando otros medios, típicamente prácticas convencionales de labranza tales como arado, arado de cincel, o preparación de semillero) , donde la actividad residual mantendrá el campo libre de malezas que mueren con el herbicida así que las plantas de soya que emergen y crecen no tienen competencia de malezas (aplicación pre-emergente de un herbicida inhibidor de HPPD) . Una vez que las plantas de soya tienen determinado tamaño, y las malezas tienden a reaparecer, puede aplicarse como herbicida post-emergente el glifosato o una mezcla de glifosato- inhibidor de HPPD, por encima de las plantas.
En otra modalidad de esta invención las plantas que comprenden el evento de EE-GM3, se pueden tratar con un herbicida inhibidor de HPPD, tal como IFT por encima de las plantas de soya (que emergieron de las semillas que se sembraron) , lo que limpia el campo de malezas que mueren por el inhibidor de HPPD, cuya aplicación puede ser junto con (por ejemplo en una mezcla en tanque pulverizador) , seguido de o precedido por un tratamiento con glifosato como herbicida post-emergente por encima de las plantas (la aplicación post-emergente de un herbicida inhibidor de HPPD (con o sin glifosato) ) .
También, de conformidad con la presente invención, las plantas de soya que alojan a EE-GM3 y EE-GM1 o EE-GM2 se pueden tratar con los siguientes insecticidas, herbicidas o fungicidas o las semillas de soya que alojan a EE-GM3 y EE-G 1 o EE-GM2 se pueden recubrir con un recubrimiento de semilla que comprende los siguientes insecticidas, herbicidas o fungicidas:
Herbicidas de la soya:
Alaclor, Bentazona, Trifluralina, Clorimurón-etilo, Cloransulam-Metilo, Fenoxaprop, Fomesafen, Fluazifop, Glifosato, Imazamox, Imazaquin, Imazetapir, (S- ) Metolacloro, Metribuzina, Pendimetalina, Tepraloxidim, Isoxaflutol, Glufosinato.
Insecticidas de la soya:
Lambda-cihalotrina, Metomil, Parationa, Tiocarb,
Imidacloprid, Clotianidina, Tiametoxam, Tiacloprid,
Acetamiprid, Dinetofurán, Flubendiamida, Rinaxipir, Ciazipir, Espinosad, Espinotoram, Emamectina-Benzoato, Fipronilo, Etiprol, Deltametrina, ß-Ciflutrina, gamma y lambda cihalotrina, 4 - [ [ (6-clorpiridin-3 - il ) metil] ( 2 , 2 -difluoretil) amino] furan-2 (5H) -ona, Espirotetramat ,
Espinodiclofeno, Triflumurón, Flonicamid, Tiodicarb, beta-Ciflutrina .
Fungicidas de la soya:
Azoxistrobina, Ciproconazol , Epoxiconazol , Flutriafol,
Piraclostrobina, Tebuconazol, Trifloxistrobina,
Protioconazol , Tetraconazol .
Los siguientes ejemplos describen la identificación de los eventos élite EE-G 3, EE-GM1 y EE-GM2 y de plantas que contienen un acumulado de EE-GM3 con EE-GM1 o EE-GM3 con EE- /
GM2 y el desarrollo de herramientas para la identificación específica del evento élite EE-GM3, EE-GM1 o EE-GM2 y los acumulados de éstos en las muestras biológicas.
A menos que se indique lo contrario en los Ejemplos, todas las técnicas recombinantes se llevan a cabo de acuerdo a los protocolos estándares, que se describen en "Sambrook J y Russell DW (ediciones) (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ra Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York" y en "Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA y Struhl K (ediciones) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Nueva York" .
Los materiales estándares y las referencias se describen en "Croy RDD (edición) (1993) Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers Ltd. , Oxford y Blackwell Scientific Publications , Oxford" y en "Brown TA, (1998) Molecular Biology LabFax, 2da Edición, Academic Press, San Diego" . Los materiales estándares y métodos para reacciones se pueden encontrar en "McPherson MJ y Moller SG (2000) PCR (The Basics) , BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford" y en "PCR Applications Manual, 3ra Edición (2006) , Roche Diagnostics GmbH, Mannheim o www. roche-applied-science . com" .
Se debe comprender que una serie de parámetros en cualquier protocolo de laboratorio tal como los protocolos de PCR en los Ejemplos a continuación pueden necesitar ser ajustados a las condiciones específicas del laboratorio, y se pueden modificar ligeramente para obtener resultados similares. Por ejemplo, el uso de un método diferente para la preparación del ADN o la selección de otros cebadores en un método de PCR puede imponer otras condiciones óptimas para el protocolo de PCR. Estos ajustes serán evidentes sin embargo para una persona experta en la técnica, y se detallan además en los presentes manuales de aplicación de PCR.
En la descripción y los ejemplos se hace referencia a las siguientes secuencias:
sec. con fragmento Salí de la secuencia de núm. de ident .1 : nucleótidos del vector pSFlO.
sec. con secuencia de nucleótidos núm. de ident .2 : comprendiendo la región 5' que flanquea el
ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3.
sec. con secuencia de nucleótidos que núm. de ident .3 : comprenden la región 3' que flanquea el
ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3.
sec. con cebador SOY028
núm . de ident .4 :
sec. con cebador SOY029
núm. de ident .5 :
sec. con cebador SMP187
núm . de ident .6 :
sec. con cebador STV019
núm . de ident .7 :
sec. con secuencia de nucleótidos del núm. de ident .8 : amplicón
sec. con cebador 1 para la amplificación núm. de ident .9 : del fragmento control (SOY01)
sec. con cebador 2 para la amplificación núm. de ident.10: del fragmento control (SOY02)
sec. con secuencia de nucleótidos de núm. de ident.11: pB2/P35SAcK
sec. con secuencia de nucleótidos que núm. de ident .12 : comprende la región 5' que flanquea el
ADN foráneo en EE-GM1
sec. con secuencia de nucleótidos que núm. de ident .13 : comprende la región 3' que flanquea el
ADN foráneo en EE-GM1
sec. con secuencia de nucleótidos que núm. de ident .14 : comprende la región 5' que flanquea el
ADN foráneo en EE-GM2
sec. con secuencia de nucleótidos que núm. de ident.15: comprende la región 3' que flanquea el
ADN foráneo en EE-GM2
sec. con cebador SOY06
núm. de ident.16:
sec. con cebador SOY07
núm. de ident.17:
sec. con cebador SOY09
núm. de ident.18:
sec. con cebador SOYOlO
núm. de ident.19:
sec. con secuencia de nucleótidos de un ADN núm. de ident.20: foráneo y secuencias de flanqueo de la planta en EE-GM3
sec. con cebador SHA 130
núm. de ident.21:
sec. con cebador SHA 178
núm. de ident.22:
Ejemplos
1. Transformación de Glycine max con genes de tolerancia a herbicida.
1.1. Descripción del ADN foráneo que comprende los genes quiméricos 2mEPSPS y HPPD-Pf-W336
El plásmido pSFlO es un pUC19 derivado del vector de clonación, el cual contiene un gen quimérico 2mepsps y un gen quimérico hppd-Pf-W336 , ubicado sobre un fragmento Salí de aproximadamente 7.3 kb. Una descripción completa del ADN comprendido entre los dos sitios de restricción Salí se muestran en la Tabla 1 a continuación. La secuencia de nucleótidos se representa en la sec . con núm. de ident .1.
Tabla 1. Posiciones de nucleótidos del ADN comprendido entre los sitios de restricción Salí de pSFlO (sec. con núm. de ident. 1)
2070 -3359 complementaria Ph4a748 ABBC: secuencia que incluye la región promotora del gen H4de la histona de Arabidopsis thaliana, que contiene una duplicación interna (Chabouté y otros, 1987) Plant Molecular Biology, 8, 179-191.
3360 -4374 Ph4a748 ABBC: secuencia que incluye la región promotora del gen H4de la histona de Arabidopsis thaliana, que contiene una duplicación interna (Chabouté y otros, 1987) Plant Molecular Biology, 8, 179-191.
4375 -4855 intronl h3At : primer intrón del gen II de la variante H3.III de la histona de Arabidopsis thaliana
(Chaubet y otros, 1992) Journal of Molecular Biology, 225, 569-574.
4856 -5227 TPotp C: secuencia de codificación del péptido de tránsito optimizado, que contiene la secuencia de los genes de la subunidad pequeña de RuBisCO de Zea ays (maíz) y Helianthus annuus (girasol) , como se describió por Lebrun y Otros (1996) US5510471
1.2. Evento EE-GM3
El fragmento pSFlO lineal por Salí purificado por HPLC, de aproximadamente 7.3 kb (que contiene el gen de tolerancia al glifosato 2mESPS y el gen de tolerancia al inhibidor HPPD HPPD-Pf- W336) se usó para obtener plantas de soya transformadas por medio de la transferencia directa de genes en células de soya tipo Jack (Nickell, C. D. , G. R. Noel, D. J. Thomas, y R. Waller. Registration of 'Jack' soybean. Crop Sci 1365. 30.1990) , seguido por la regeneración de las células vegetales transformadas en plantas de soya transgénicas fértiles.
1.2.1 Identificación del evento élite EE-GM3
El evento élite EE-GM3 se seleccionó en base a un procedimiento de selección extensiva, se evaluaron en base a la buena expresión y estabilidad de los genes de tolerancia a herbicida, y su compatibilidad con características agronómicas óptimas, tales como altura de las plantas, altura hasta el nodo, sostenimiento, vigor, rendimiento de las semillas. Las plantas de soya que contienen este evento se seleccionaron a partir de un amplio intervalo de eventos de transformación diferentes obtenidos usando los mismos genes quiméricos. Los parámetros que se usan en la selección de este evento fueron: a) tolerancia aceptable a la aplicación del herbicida isoxaflutol en los ensayos de campo, b) tolerancia aceptable a la aplicación del herbicida glifosato en los ensayos de campo, c) tolerancia aceptable a la aplicación combinada de los herbicidas isoxaflutol y glifosato en los ensayos de campo, d) una inserción de los transgenes de tolerancia a herbicida en un único locus en el genoma de la planta de soya, con ausencia del vector principal, e) agronomía total similar a la de las plantas parentales que se usan para la transformación (madurez, alojamiento, susceptibilidad a las enfermedades, etc.), y f) retraso del rendimiento no significativo causado por la inserción del ADN transformador (al compararse con una línea isogénica sin el evento, tal como la línea de planta que se usa para la transformación, cultivada bajo las mismas condiciones) . '
En la generación T3 , se seleccionó una línea homocigótica del evento de transformación de la soya EE-G 3, para la producción de semilla. Los estudios agronómicos de campo replicados en múltiples ubicaciones, se condujeron en las regiones de adaptación de la variedad parental, Jack. Las evaluaciones de campo incluyeron tolerancia a herbicidas y desempeño agronómico. El desempeño agronómico de las plantas que contienen EE-GM3 se encontró comparable al de Jack (cuando no se aplicaron herbicidas) .
Las evaluaciones de campo mostraron también que las plantas que portan el evento EE-GM3 tienen:
- morfología vegetal similar y características de semilla comparadas con Jack,
- sin cambios en la respuesta a enfermedades de la soya comparadas con Jack, y
- sin cambios en la germinación o dormancia de semilla comparado con Jack.
Las semillas (generación TI o SI) , cosechadas en el invernadero a partir de la planta transformante inicial (T0) (la planta transformada con el constructo para producir el evento EE-GM3), se sembraron en el campo. Tres bloques se sembraron y rociaron con 0, 2, o 4 kg/ha de glifosato. La semilla se cosechó de las plantas que demostraron el nivel deseado de tolerancia al herbicida, glifosato.
Las semillas (generación T2) , cosechadas a partir de las plantas TI auto-polinadas cultivadas en el campo, se sembraron en "planta por fila" . Los análisis de Chi cuadrado de los datos de segregación por filas (total o parcialmente tolerantes) y de plantas individuales dentro de filas (tolerantes o sensibles) demuestran la herencia Mendeliana esperada para una inserción única de EE-G 3.
La selección e incremento de las semillas continuó hasta que se determinó una línea para ser homocigótica por el evento de transformación EE-GM3, y se seleccionó para la producción de semillas de núcleo en la cuarta generación. Entonces, la semilla de generación T5 sirvió como candidato para el desarrollo de diferentes variedades . Las plantas en la sexta generación (generación T6) se cruzaron con líneas convencionales de reproducción de la soya en un programa de introgresión diseñado para mover el evento en una base más amplia de germoplasma comercial de la soya. Las plantas híbridas Fl (líneas EE-GM3 x líneas convencionales) se cultivaron hasta la madurez y la semilla F2 se sembró. Las muestras de hojas de plantas 901 F2 se analizaron mediante PCR con cebadores de diseñados para identificar la cigosidad del inserto EE-GM3. Se observó la relación esperada de 1:2:1 por las leyes de Mendel para una segregación de inserción única. .
El evento EE-GM3 seleccionado se introdujo en diferentes fondos genéticos comerciales, y se compararon los resultados de los ensayos de campo en diferentes ubicaciones. Las plantas se retaron con el herbicida glifosato y/o herbicida isoxaflutol empleando diferentes tratamientos. Las plantas presentaron una buena tolerancia al herbicida. Cientos de cultivares de soya diferentes que contienen el evento EE-GM3 se usaron en un estudio de herencia, y se aplicaron los herbicidas. Las líneas seleccionadas a partir de este ensayo se incrementaron posteriormente en el campo y se trataron también con el herbicida. De este ensayo, se incrementaron 50 líneas seleccionadas, y estas se trataron también con herbicida. Los acumulados de fitotoxicidad para estas últimas líneas rociadas con isoxaflutol y glifosato, mostraron cierta variabilidad en la respuesta, pero el intervalo de respuestas entre las líneas reflejó una variabilidad similar como se observó por las 4 réplicas del evento EE-GM3 en el fondo Jack original, cultivado bajo el mismo tratamiento y condiciones ambientales. Por lo tanto, se observó tolerancia a los herbicidas relevantes por un amplio intervalo de germoplasma para plantas que comprenden EE-GM3.
Además, las plantas que contienen el evento EE-GM3 tuvieron morfología normal de hoja, flor y vaina, fertilidad excelente, y no mostraron enfermedades ni susceptibilidad anormal a insectos en múltiples fondos genéticos. Durante la introgresión hacia múltiples fondos genéticos no se observaron aberraciones ni anomalías.
En una estación, se diseñó un estudio de 10 ubicaciones para comparar el desempeño agronómico de la soya tolerante a doble herbicida que comprende el evento de transformación EE-GM3 con la transformación de la variedad parental, Jack y otras variedades de soya no transgénicas . Mediante el uso de un diseño de bloques completo al azar, las plantas EE-GM3 se cultivaron en terrenos replicados, ya sea con control convencional de malezas o con los herbicidas pretendidos, glifosato e isoxaflutol. Los terrenos con plantas de soya que contienen el evento de transformación EE-GM3 se rociaron con el herbicida isoxaflutol en un radio objetivo de 70 gramos ai/Ha y con el herbicida glifosato en un radio objetivo de 1060 gramos ai/Ha. La aplicación del herbicida a estas plantas se realizó como un rocío foliar en aproximadamente la fase V4-V5- del crecimiento de la planta. Las observaciones agronómicas se realizaron en el inicio, medio y final de la estación. La densidad de la planta (parámetro; conteo de sostenimiento) fue mayor para los terrenos Jack y la variedad no transgénicas , que en los terrenos del evento EE-GM3, por una desviación estándar. La diferencia inicial de conteo de sostenimiento puede haber sido resultado de la calidad del lote de semillas, dado que la semilla de siembra EE-GM3 se produjo en vivero de estación contraria, mientras que la semilla de las variedades no transgénicas se produjeron en la estación de producción normal contigua a Estados Unidos. Sin embargo, el número de días para alcanzar el 50% de emergencia y los índices de vigor de la planta fueron los mismos, indicando que los lotes de semillas fueron comparables para estos parámetros de desempeño. En los conteos de sostenimiento al final de estación, Jack y las variedades no transgénicas se mantuvieron diferentes de las plantas EE-GM3 por una desviación estándar. Los rendimientos de los terrenos de plantas de evento EE-GM3 fueron también más bajos que aquellos de Jack por una desviación estándar, como resultado quizás de la densidad más baja de la planta de los terrenos de evento EE-GM3. El rendimiento de las variedades no transgénicas como se puede esperar fue mayor que para Jack debido al progreso en el potencial de rendimiento encontrado en las variedades más nuevas.
En un ensayo, los índices de salud de la planta se realizaron en tres' fases de crecimiento: V4-5, Rl y madurez total. La primera evaluación fue justo después de la aplicación pretendida del herbicida. En el momento de evaluación final de la salud de la planta, las plantas que contienen EE-GM3 rociadas con ambos herbicidas tuvieron la misma puntuación que las plantas Jack no rociadas, o las plantas no rociadas que comprenden a EE-G 3. En Indices por el personal agronómico, las plantas rociadas con herbicida recibieron un índice de salud de 3-4 (daño moderado) en las fases de crecimiento de la planta V4-5 y Rl . Las plantas no rociadas (plantas Jack no transformada o plantas de soya que contienen EE-GM3) se promediaron como 4.6-4.8 (índices de 5 indican ausencia de daño) . En el índice de salud final de la planta, todos los terrenos recibieron el mismo índice de 5 (ausencia de daño) .
Una estación de ensayo fue una de caída de lluvia excepcional y el daño del cultivo en las plantas EE-GM3 a continuación del herbicida pretendido, fue más obvio que el observado en otras estaciones. Las evaluaciones de campo incluyeron también el monitoreo de características de buena forma (reproducción, resistencia a enfermedades, fecundidad, dispersión de semilla, dormancia, persistencia) . Para las características reproductivas; no fueron diferentes los días para la emergencia, días para el 50% de floración y días para el 90% de maduración de las vainas, las plantas EE-GM3 y Jack. Ninguna diferencia se notó en la reacción a infecciones naturales de enfermedades de plantas y plagas de insectos . Aunque EE-GM3 produjo un menor rendimiento final que Jack, no se encontró diferencia en la fecundidad (peso de 100 semillas) . La evaluación de los parámetros de dispersión de semilla (desgranado de la vaina y mantenimiento de la planta) encontró que EE-GM3 y Jack tienen los mismos acumulados de dispersión de la vaina, pero encontraron que las plantas EE-GM3 son menos propensas al mantenimiento. La evaluación de las semillas cosechadas a partir de las 10 ubicaciones no encontró preocupaciones incrementadas por la germinación o prueba de dormancia.
En estos ensayos durante la estación con caída de lluvia excepcional, el rendimiento final de las plantas EE-GM3 , a pesar del tratamiento de control de malezas, fue menor que el rendimiento de Jack por una desviación estándar (como resultado quizás de la más baja densidad de plantas de los terrenos del evento EE-G 3) . En la estación excepcionalmente seca, el daño al cultivo (blanqueamiento en el 10-30% del área de cultivo) se reportó para los terrenos EE-GM3, hasta seis semanas siguientes a la aplicación foliar de los herbicidas glifosato e isoxaflutol. No obstante, por la madurez, los índices de "ausencia de daño" en la salud de la planta se asignaron a todos los terrenos. Los ensayos de campo replicados en multi-ubicaciones con EE-GM3 introgresado en un fondo del cultivar élite de soya , cuando se comparan con las líneas hermanas casi-isogénicas que no contienen el transgen, se espera que no muestren diferencia de rendimiento entre las plantas que contienen evento EE-GM3 y las líneas casi-isogénicas (en ausencia del tratamiento con el herbicida) .
Adicionalmente , en un ensayo de campo replicado se encontró una tolerancia significativa del cultivo (blanqueamiento menor del' 10%), en plantas de soya que comprende a EE-GM3 cuando se trataron ya sea pre- como postemergencia con IFT (70 gr ai/ha con 0.5% NIS, Agridex) tanto, se encontró también tolerancia significativa del cultivo (blanqueamiento de menos que el 10%) en plantas de soya que comprenden a EE-G 3 cuando se trataron con una aplicación post-emergencia de pirasulfotol (35 gr ai/ha con 0.5% NIS, Agridex) , otro herbicida inhibidor de HPPD.
1.2.2 Identificación de las regiones de flanqueo y ADN foráneo del evento élite EE-GM3
La secuencia de. las regiones que flanquean el ADN foráneo que comprenden los genes de tolerancia a herbicida en el evento élite EE-GM3 se determinó de la manera siguiente:
1.2.2.1. Región derecha de flanqueo (51)
El fragmento identificado que comprende la región de flanqueo 51 se secuenció y su secuencia de nucleótidos se representa en la sec. con núm. de ident . : 2. La secuencia entre el nucleótido 1 y 1451 corresponde al ADN vegetal, mientras que la secuencia entre el nucleótido 1452 y 1843 corresponde al ADN foráneo.
1.2.2.2. Región izquierda de flanqueo (3')
El fragmento identificado que comprende la región de flanqueo 31 se secuenció y su secuencia de nucleótidos se representa en la sec. con núm. de ident . : 3. La secuencia entre el nucleótido 1 y 240 corresponde al ADN foráneo, mientras que la secuencia entre el nucleótido 241 y 1408 corresponde al ADN vegetal.
1.2.2.3. ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida de EE-GM3
El uso de diversas técnicas moleculares, determinó que el ADN foráneo del evento élite EE-GM3, que comprende los genes de tolerancia a herbicida, contiene dos secuencias parciales de 3' histonAt en una orientación cabeza a cabeza, seguidas por 2 copias casi completas del fragmento Salí de pSFlO ordenadas en una orientación cabeza a cola (ver Figura 1) .
El ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida de EE-GM3 contiene de ese modo en orden las siguientes secuencias:
- del nucleótido 1 al nucleótido 199: la secuencia de nucleótidos que se corresponde con la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:l del nucleótido 6760 al nucleótido 6958;
- del nucleótido 200 al nucleótido 624 : la secuencia de nucleótidos que se corresponde con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 1 del nucleótido 6874 al nucleótido 7298;
- del nucleótido 625 al nucleótido 7909: la secuencia de nucleótidos que se corresponde con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 del nucleótido 7 al nucleótido 7291;
- del nucleótido 7910 al nucleótido 15163: la secuencia de nucleótidos que se corresponde con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 del nucleótido 12 al nucleótido 7265; y
del nucleótido 15164 al nucleótido 15187: la secuencia de nucleótidos que se corresponde con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 217 al nucleótido 240 (esta secuencia no se corresponde ni con el ADN del plásmido pSFlO ni ADN de la planta silvestre por lo tanto se designa ADN de relleno) .
Este ADN foráneo se precede inmediatamente, en dirección corriente arriba y contiguo con el ADN foráneo, por la secuencia de flanqueo 5' de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al 1451 y se continua inmediatamente corriente abajo y contiguo con el ADN foráneo por la secuencia de flanqueo 3' de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408.
La secuenciación del ADN completo confirmada del ADN foráneo y las secuencias de ADN de flanqueo en EE-GM3 resultaron en la secuencia reportada en sec. con núm. de ident.: 20. En esta secuencia, el ADN se inserta de la posición de nucleótido 1452 a la posición de nucleótido 16638, y las 2 copias casi completas a partir de pSFlO ordenadas en una orientación cabeza-cola están de la posición de nucleótido 2257 hasta la posición del nucleótido 16601. La secuencia de ADN de flanqueo 5' con sec. con núm. de ident.: 20 es la secuencia de la posición de nucleótido 1 hasta la posición de nucleótido 1451 en sec. con núm. de ident. :20, y la secuencia de ADN de flanqueo 3' con sec. con núm. de ident. :20 es la secuencia de la posición de nucleótido 16639 hasta la posición de nucleótido 17806 con sec. con núm. de ident. :20.
1.3. Descripción del ADN foráneo que comprende los genes quiméricos para la fosfinotricinacetiltransferasa
El plásmido pB2/P35SAcK es un vector de clonación derivado de pUC19, el cual contiene gen quimérico pat. Una descripción del vector se muestra a continuación en la Tabla 2. La secuencia de nucleótidos de éste se representa en la sec . con núm. de ident.:ll.
Tabla 2 Posiciones de los nucleótidos de los constituyentes de pB2/P35SAcK (sec. con núm. de ident.ill)
1.4. Evento EE-GM1
1.4.1 Identificación de EE-GM1
La soya resistente a herbicida se desarrolló mediante la transformación de la soya con el vector pB2/P35S AcK empleando la transferencia génica directa.
El evento élite EE-GM1 se seleccionó basado en un procedimiento de selección extensiva basado en una buena expresión y estabilidad del gen de resistencia a herbicida y su compatibilidad con las características agronómicas óptimas .
1.4.2 Identificación de las regiones de flanqueo y del ADN foráneo del evento élite EE-GM1
1.4.2.1. Región derecha de flanqueo ( 5 ' )
El fragmento identificado que comprende la región de flanqueo 5 ' se secuenció y su secuencia de nucleótidos se representa en la sec. con núm. de ident.:12. La secuencia entre el nucleótido 1 y 209 que corresponde con el ADN vegetal, mientras que la secuencia entre el nucleótido 210 y 720 se corresponde con el ADN foráneo.
1.4.2.2. Región izquierda de flanqueo (3·)
El fragmento identificado que comprende la región de flanqueo 3 ' se secuenció y su secuencia de nucleótidos se representa en la sec. con núm. de ident.:13. La secuencia entre el nucleótido 1 y 568 se corresponde con el ADN foráneo, mientras que la secuencia entre el nucleótido 569 y el 1000 se corresponde con el ADN vegetal.
1.4.2.3. ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida de EE-GM1
El uso de diferentes técnicas moleculares, determinó que el ADN foráneo del evento élite EE-GM1, que comprende el gen de tolerancia a herbicida, comprende dos copias del gen quimérico pat en una estructura repetitiva directa (ver Figura 3 ) .
El ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida de EE-GM 1 contiene de ese modo en orden las siguientes secuencias:
- del nucleótido 1 al nucleótido 3122: la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll del nucleótido 340 al nucleótido 3461;
- del nucleótido 3123 al nucleótido 3458: la secuencia de nucleótidos que corresponde a la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll del nucleótido 1 al nucleótido 336;
- del nucleótido 3459 al nucleótido 4073: la secuencia de nucleótidos que corresponde a la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll del nucleótido 3462 al nucleótido 4076; y
del nucleótido 4074 al nucleótido 6780: la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll del nucleótido 337 al nucleótido 3043; y
del nucleótido 6781 al nucleótido 6790: la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 559 al nucleótido 568 (esta secuencia no se corresponde con ya sea el ADN plasmídico o ADN de la planta silvestre y se designa por lo tanto como ADN de relleno) .
Este ADN foráneo de EE-GM1 se precede inmediatamente corriente arriba y contiguo con el ADN foráneo en la secuencia de flanqueo 5' de sec . con núm. de ident . : 12 del nucleótido 1 al 209 y se continua inmediatamente corriente abajo y contiguo con el ADN foráneo en la secuencia de flanqueo 3' de sec. con núm. de ident. :13 del nucleótido 569 al nucleótido 1000.
1.5. Evento EE-GM2
La soya resistente a herbicida se desarrolló por transformación de la soya con el vector pB2/P35SAcK empleando una transferencia génica directa.
El evento élite EE-GM2 se seleccionó basado en un procedimiento de selección extensiva basado en una buena expresión y estabilidad del gen de resistencia a herbicida y su compatibilidad con las características agronómicas óptimas .
1.5.1. Identificación de las regiones de flanqueo y ADN foráneo del evento élite EE-GM2
1.5.1.1. Región derecha de flanqueo (5')
El fragmento identificado que comprende la región de flanqueo 5' se secuenció y su secuencia de nucleótidos se representa en la sec . con núm. de ident.:14. La secuencia entre el nucleótido 1 y 311 se corresponde con el ADN vegetal, mientras que la secuencia entre el nucleótido 312 y 810 se corresponde con el ADN foráneo.
1.5.1.2. Región izquierda extremo terminal (31)
El fragmento identificado que comprende la región de flanqueo 31 se secuenció y su secuencia de nucleótidos se representa en la sec. con núm. de ident.:15. La secuencia entre el nucleótido 1 y 507 se corresponde con el ADN foráneo, mientras que la secuencia entre el nucleótido 569 y 1880 se corresponde con el ADN vegetal.
1.5.1.3. ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida de EE-GM2
El uso de diferentes técnicas moleculares, determinó que el ADN foráneo del evento élite EE-GM2, que comprende el gen de tolerancia a herbicida, comprende una copia del gen quimérico pat (ver Figura 4) .
El ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida de EE-GM2 contiene de este modo en orden las siguientes secuencias:
- del nucleótido 1 al nucleótido 391: la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll del nucleótido 3458 al nucleótido 3848; y
- del nucleótido 392 al nucleótido 3436: la secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:ll del nucleótido 413 al nucleótido 3457.
Este ADN foráneo de EE-GM2 se precede inmediatamente corriente arriba y contiguo con el ADN foráneo en la secuencia de flanqueo 5' de sec. con núm. de ident . : 14 del nucleótido 1 al 311 y se continua inmediatamente corriente abajo y contiguo con el ADN foráneo en la secuencia extremo terminal 3' de sec. con núm. de ident. :15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880.
2. Desarrollo de los protocolos de identificación por la reacción en cadena de la polimerasa para EE-GM3.
2.1. Cebadores
Se desarrollaron cebadores específicos, los cuales reconocen las secuencias dentro del evento élite.
Se desarrolló un cebador, el cual reconoce una secuencia dentro de la región de flanqueo 31 de EE-GM3. Un segundo cebador se seleccionó después dentro de la secuencia del ADN foráneo, tal que los cebadores extienden una secuencia de aproximadamente 263 nucleótidos. Los siguientes cebadores se encontraron que dan resultados particularmente claros y reproducibles en una reacción de PCR del ADN EE-GM3 :
SOY028: 5 ' -ATC.gCT.TTA.ACg.TCC.CTC.Ag -3 (sec. con núm.
(objetivo: ADN inserto) de ident.:4)
SOY029: 5 ' -CAA.ggC.CTC.gAg.ATT.ATC -31 (sec. con núm.
(objetivo: ADN vegetal) de ident.:5)
Los cebadores dirigidos a una secuencia endógena se incluyen preferentemente en el cóctel de PCR. Estos cebadores sirven como un control internp en muestras desconocidas y en el control positivo del ADN. Un resultado positivo con el par de cebadores endógenos (presencia de un fragmento de 413 bp amplificado por de PCR) demuestra que existe abundante ADN, de calidad adecuada, en la preparación de ADN genómico para que se genere el producto de PCR. Los cebadores endógenos se seleccionaron para reconocer el gen de la actina endógena de soya:
SOY01: 5'-gTC.Agc.CAC.ACA.gTg.ccT.AT -3' (sec. con núm. de ident . : 9)
SOY02 5'-gTT. ACC.gTA.CAg.gTC.TTT.ee -31 (sec. con núm. de ident . : 10)
2.2. Fragmentos amplificados
Los fragmentos amplificados esperados en la reacción de de PCR son:
Para el par de cebadores SO Y01- 413bp (control
SOY02 : endógeno)
Para el par de cebadores SOY028- 263bp (evento élite
SOY029: EE-GM3)
2.3. ADN molde
El ADN molde se preparó a partir de hojas perforadas de acuerdo a Edwards y otros (Nucleic Acid Research, 19, pl349, 1991) . Cuando se usa ADN preparado con otros métodos, se debe realizar una corrida de prueba utilizando cantidades diferentes de molde. En general 50 ng del ADN genómico molde rinde los mejores resultados.
2.4. Controles positivos y negativos asignados
Para evitar falsos positivos o negativos, se determinó que los siguientes controles positivos y negativos deben incluirse en una corrida de PCR:
Control de Mezcla Maestra (control negativo de ADN) . Este es un PCR en el cual no se adiciona ADN a la reacción. Con el resultado esperado, ninguno de los productos de PCR se observa, esto indica que el cóctel de de PCR no está contaminado con el ADN objetivo.
- Un control positivo de ADN (muestra de ADN genómico que se conoce por contener las secuencias transgénicas) . La amplificación exitosa de este control positivo demuestra que el PCR se corrió bajo las condiciones que permiten la amplificación de las secuencias objetivo.
Un control de ADN silvestre. Este es un PCR en el cual el ADN molde proporcionado es un ADN genómico preparado a partir de una planta no transgénica. Con el resultado esperado, ninguna amplificación de un producto transgen de PCR pero la amplificación de un producto endógeno de PCR, se observa esto indica que no existe amplificación de fondo detectable del transgen en una muestra de ADN genómico.
2.5. Condiciones de PCR
Los resultados óptimos se obtuvieron bajo las siguientes condiciones (En la descripción de las diversas condiciones para los resultados óptimos se entiende proporcionar ejemplos de condiciones de este tipo. Claramente un experto en la técnica puede variar las condiciones, reactivos y parámetros tales como el uso de otras polimerasas Taq, y alcanzar resultados deseables) :
- la mezcla PCR para reacciones de 25ul contiene: 20 ng ADN molde
2.5 µ? de tampón de amplificación lOx (suministrado por el fabricante con la polimerasa Taq polimerasa)
0.5 µ? 10 mM de los dNTP
0.4 µ? de SOY01 ( lOpmoles/µ?)
0.4 µ? de SOY02 ( lOpmoles/µ?)
0.7 µ? de SOY028 ( lOpmoles/µ? )
0.7 µ? de SOY029 (lOpmoles/µ?)
0.1 µ? de ADN- Taq polimerasa (5 unidades/µ?)
agua hasta 25 µ?
- el perfil de termociclaje que se sigue para los resultados óptimos es el siguiente
4 minutos a 95°C
Seguido por: 1 minuto a 95 °C
1 minuto a 57 °C
2 minutos a 72°C
Durante 5 ciclos
Seguido por: 30 segundos a 92°C
30 segundos a 57 °C
1 minuto a 72°C
Durante 25 ciclos
Seguido por: 10 minutos a 72°C
2.6. Análisis del gel de agarosa
Para visualizar óptimamente los resultados del PCR se determinó que se deben aplicar entre 10 y 20µ1 de las muestras de PCR, sobre un gel de agarosa 1.5% (tampón Tris-borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo marcador de lOObp Pharmacia) .
2.7. Validación de los resultados
De las muestras de ADN de la planta transgénica dentro de una única corrida de PCR y un único cóctel de PCR no se deben aceptar a menos que 1) el control positivo de ADN muestre los productos de PCRPCR esperados (fragmentos endógenos y transgénicos) , 2) el control negativo de ADN sea negativo para la amplificación por PCRPCR (sin fragmentos) y 3) el control de ADN silvestre muestre el resultado esperado (amplificación del fragmento endógeno) .
Cuando se sigue el protocolo de identificación PCRPCR para EE-GM3, como se describió anteriormente, los carriles que muestran cantidades visibles de productos de PCRPCR transgénicos y endógenos de los tamaños esperados, indican que la planta correspondiente de la que se preparó el ADN genómico molde, ha heredado el evento élite EE-GM3. Las líneas que no muestran cantidades visibles de cualquiera de los productos transgénicos del PCRPCR y que muestran cantidades visibles de los productos endógenos de PCR, indican que la planta correspondiente de que se preparó el ADN genómico molde, no comprende el evento élite. Las líneas que no muestran cantidades visibles de los productos endógenos y transgénicos, indican que la calidad y/o la cantidad del ADN genómico no permitió que se genere un producto de PCR. Estas plantas no se pueden anotar. La preparación del ADN genómico se debe repetir y un nuevo PCR correr PCR, con los controles apropiados, se tiene que realizar.
2.8. Uso de un protocolo de PCR de discriminación para identificar a EE-GM3
Antes del intento para detectar los desconocidos, se realizó una corrida de prueba con los apropiados controles. El protocolo de desarrollo puede requerir la optimización de componentes que pueden diferir entre los laboratorios (preparación del ADN molde, ADN polimerasa Taq, calidad de los cebadores, los dNTP, termociclador, etc.).
La amplificación de la secuencia endógena juega un papel clave en el protocolo. Se tienen que alcanzar condiciones de termociclaje y PCR que amplifiquen cantidades equimolares de tanto la secuencia endógena como transgénica en un molde de ADN genómico transgénico conocido. Cada vez que el fragmento endógeno especificado no se amplifica o cada vez que las secuencias especificadas no se amplifican con las mismas intensidades de bromuro de etidio, según se considera por la electroforesis en gel de agarosa, se puede requerir la optimización de las condiciones del PCR.
El material de hojas de un número de plantas de soya, algunas de las que contienen EE-GM3 se probaron de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. Las muestras del evento élite EE-GM3 y de soya silvestre se tomaron como controles positivo y negativo, respectivamente.
La Figura 2 ilustra el resultado obtenido con el protocolo de identificación por PCR del evento élite para EE-G 3 en un número de muestras de plantas de soya. Las muestras en los carriles 2 y 3 se encontraron que contienen el evento élite EE-GM3 conforme se detectó la banda de 263bp, mientras las muestras en los carriles 4 a 8 no comprenden EE-GM3. Los carriles 6 y 7 comprenden muestras de otros eventos de transformación de soya obtenidos usando los mismos genes quiméricos de tolerancia a herbicida, el carril 8 contiene el ADN de plantas de soya silvestre y la línea 9 representa la muestra del control negativo (agua) , los carriles 1 y 10 representan los Marcadores de Peso Molecular (marcador de lOObp) .
2.9. Ensayo de dPCR para la detección de EE-GM3 en semillas abultadas
Un ensayo de PCR de discriminación PCR (dPCR) se establece para detectar la presencia en bajos niveles de EE-GM3 en semillas abultadas. Se detectó exitosamente un nivel mínimo de 0.4% (p/p) de semillas transgénicas en un volumen de semillas no transgénicas, bajo condiciones repetibles. Por tanto el Límite de Detección se determinó que es 0.4% (p/p) .
Se aplicaron los siguientes cebadores en esta reacción de PCR objetivo:
Cebador directo especificado para la secuencia T-ADN :
SHA130 5' - CTA . TAT . TCT . ggT . TCC . AAT . TTA . TC - 3' (sec. con núm .
de ident . : 12)
Cebador reverso especificado para la secuencia de flanqueo 3' SMP178 5' - TgA.ggC.ACg.TAT.TgA.TgA.CC - 3' (sec. con núm.
de ident . : 13 )
El fragmento amplificado esperado en la reacción de PCR a partir de estos cebadores es de 115 bp.
La reacción de PCR blanco se realiza sobre aproximadamente 200 ng de ADN molde preparado de semillas abultadas molidas de acuerdo con un kit de extracción y purificación de ADN Gentra Puregene modificado (Qiagen) . Cuando se usa el ADN preparado con otros métodos, se debe realizar una corrida de prueba usando muestras con niveles relativos conocidos de EE-GM3.
Una reacción de PCR del sistema de referencia validado, especificando una secuencia endógena, se debe realizar idealmente en una corrida de PCR separada para verificar la conveniencia de la muestra de ADN para el análisis de PCR, para evitar resultados falsos negativos.
Para muestras de ensayo desconocidas el experimento de PCR debe incluir, idealmente, las muestras control apropiadas positiva y negativa, es decir:
- Control de la Mezcla Maestra (control negativo de ADN) .Este es un PCR en el que no se adiciona ADN a la reacción. Cuando el resultado esperado (sin producto de PCR) se observa para tanto el objetivo como la reacción del sistema de referencia, esto indica que el cóctel de PCR no se contaminó con el ADN objetivo.
- Un control positivo de ADN (muestra de ADN genómico conocida por contener las secuencias transgénicas) . La amplificación exitosa de este control positivo demuestra que el PCR se corrió bajo las condiciones que permiten la amplificación de las secuencias objetivos.
- Se puede adicionar también en este PCR un control de ADN silvestre. Este es un PCR en el que el ADN molde proporcionado es un ADN genómico preparado de una planta no transgénica. Cuando el resultado esperado, sin amplificación de un producto transgen por PCR pero la amplificación de un producto endógeno por PCR, se observa esto indica que no existe amplificación de fondo detectable del transgen en una muestra de ADN genómico.
Los resultados óptimos se obtienen bajo las siguientes condiciones :
- la mezcla PCR para reacciones de 25µ1 contiene:
200 ng de ADN molde
5 µ? de tampón de reacción 5x
0.25 µ? de 20 mM de los dNTP
0.7 µ? de SHA130 (10pmoles/l)
0.4 µ? de SMP178 (10pmoles/l)
0.1 µ? de GO-ADN taq polimerasa (5 unidades/1) Añadir agua hasta 25 µ?
- el perfil de termociqlaje que se sigue para resultados óptimos es el siguiente:
4 minutos, a 95°C
Seguido por: 1 minuto, a 95°C
1 minuto, a 57°C
2 minutos, a 72 °C
Durante 5 ciclos
Seguido por: 30 segundos a 92 °C
30 segundos a 57°C
1 minuto a 72 °C
Durante 30 ciclos
Seguido por: 10 minutos a 72 °C
Para visualizar óptimamente los resultados del PCR se determinó que 25 µ? del producto de PCR se debe aplicaren un gel de agarosa al 1.5% (tampón Tris-borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo marcador de 50bp) .
Cuando se sigue el método de PCR como se describió anteriormente, los carriles que muestran cantidades visibles de los productos de PCR objetivo y del sistema de referencia de los tamaños esperados, indican que la muestra de ensayo de la que se preparó el ADN genómico molde, contuvo los niveles de evento élite EE-GM3 por encima del límite de detección de la reacción objetivo.
Los carriles que no muestran cantidades visibles de los productos objetivos de PCR pero que muestran cantidades visibles del producto de PCR del sistema de referencia, indican que la muestra de ensayo de la que se preparó el ADN genómico molde, contuvo niveles del evento élite EE-GM3 por debajo del límite de detección de la reacción objetivo
Los carriles que no muestran cantidades visibles de los productos endógenos y transgénicos del PCR, indican que la calidad y/o cantidad del ADN genómico no permitió que se genere un producto de PCR.
Estas plantas no se pueden anotar. La preparación del ADN genómico se debe y correr una nueva corrida de PCR, con los controles apropiados.
3. Uso de un fragmento de integración específico como una sonda para la detección del material que comprende a EE-GM3.
Se obtiene un fragmento de integración específico de EE-GM3 por amplificación en PCR, usando cebadores específicos SOY028 (sec. con núm. de ident.:4) y SOY029 (sec. con núm. de ident.:5), que produce un amplicón con una secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:8 ó por síntesis química y se marca. Este fragmento de integración se usa como una sonda específica para la detección de EE-M3 en muestras biológicas. El ácido nucleico se extrae de las muestras de acuerdo con los procedimientos estándares. Este ácido nucleico se pone en contacto después con la sonda específica bajo condiciones de hibridación, que se optimizan para permitir la formación del híbrido. La formación del híbrido se detecta después, para indicar la presencia del ácido nucleico EE-GM3 en la muestra. Opcionalmente, el ácido nucleico en las muestras se amplifica usando los cebadores específicos, antes de contactar con la sonda específica. Como alternativa, el ácido nucleico se marca antes de contactar con la sonda específica en lugar del fragmento de integración. Opcionalmente, la sonda específica se adjunta a un vehículo sólido (tal como, pero sin limitarse a un filtro, tira o perlas) antes de contactar con las muestras.
4. Protocolo de identificación por reacción en cadena de la polimerasa de EE-GM1.
4.1. Cebadores
Se desarrollaron cebadores específicos, los que reconocen secuencias dentro del evento élite. 'Más particularmente, se desarrolló un cebador que reconoce una secuencia dentro de la región de flanqueo 5 'de EE-GM1. Un segundo cebador se seleccionó después dentro de la secuencia de ADN foráneo de manera que los cebadores abarcaran una secuencia de aproximadamente 183 nucleótidos. Los siguientes cebadores se encontraron para dar resultados particularmente claros y reproducibles en una reacción de PCR sobre el ADN EE--GM1 :
SOY06: 5'- ggC . gTT . CgT . AgT . gAC . TgA . gg -3' (sec. con núm.
(objetivo: ADN vegetal) de ident.:16)
SOY07: 5 ' -gT . TTA. CAA . CgT . CgT . gAC . gg-3 ' (sec. con núm.
(objetivo: ADN inserto) de ident.:17)
Los cebadores que especifican una secuencia endógena se prefieren incluir en el cóctel del PCR. Estos cebadores sirven como un control interno en muestras desconocidas y en el control positivo del ADN. Un resultado positivo con el par cebador endógeno demuestra que existe abundante ADN de calidad adecuada en la preparación de ADN genómico para que se genere un producto de PCR. Los cebadores endógenos se seleccionaron para reconocer un gen doméstico de Glycine max-.
SOY01: 5' -gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT- 3' con núm . de
(ubicado en el gen 1 de actina de ident . : 9)
Glycine max (Acceso J01298))
SOY02 : 5' -gTT . ACC . gTA . CAg . gTC . TTT . (sec. con núm. de
(ubicado en el gen 1 de actina de ident . : 10)
Glycine max (Acceso J01298))
4.2. Fragmento.s amplificados
Los fragmentos amplificados esperados en la reacción de PCR son:
Para el par cebador 413bp (control endógeno)
SOY01-SOY02:
Para el par cebador 183bp (Evento élite EE-GM 1) SOY06-SOY07 :
4.3. ADN molde
El ADN molde se preparó de hojas perforadas de acuerdo con Edwards y otros (Nucleic Acid Research, 19, pl349, 1991) . Cuando se usa el ADN preparado con otros métodos, se debe realizar una corrida de ensayo utilizando cantidades diferentes de molde. Por lo general 50 ng del ADN genómico molde produce los mejores resultados.
Controles asignados positivo y negativo
Para evitar falsos positivos o negativos, se determinó que los siguientes controles positivos y negativos se deben incluir en una corrida de PCR:
- Control de la Mezcla Maestra (control negativo de ADN) . Este es un PCR en el que no se adiciona ADN a la reacción. Cuando el resultado esperado, sin productos de PCR, se observa esto indica que el cóctel de PCR no se contaminó con el ADN objetivo.
- Un control positivo de ADN (muestra de ADN genómico conocida por contener las secuencias transgénicas) . La amplificación exitosa de este control positivo demuestra que el PCR se corrió bajo las condiciones que permiten la amplificación de las secuencias objetivo.
- Un control de ADN silvestre. Este es un PCR en el que el ADN molde proporcionado es un ADN genómico preparado de una planta no transgénica. Cuando el resultado esperado, sin amplificación de un producto transgen de PCR pero la amplificación de un producto endógeno de PCR, se observa esto indica que no existe amplificación de fondo detectable del transgen en una muestra de ADN genómico.
4.5. Condiciones de PCR
Los resultados óptimos se obtuvieron bajo las siguientes condiciones:
- la mezcla PCR para reacciones de 25 µ? contiene: 2.5 µ? de ADN molde
2.5 µ? de tampón de amplificaciónlOx (suministrado con la Taq polimerasa)
0.5 µ? de 10 mM de dNTP
0.5 µ? de SOY06 ( lOpmoles/µ?)
0.5 µ? de SOY07 (lOpmoles/µ?)
0.25 µ? de SOY01 (lOpmoles/µ?)
0.25 µ? de SOY02 ( lOpmoles/µ?)
0.1 µ? de ADN- Taq polimerasa (5 unidades/µ?)
agua hasta 25 µ?
- el perfil de termociclaje que se sigue para resultados óptimos es el siguiente:
4 minutos, a 95°C
Seguido por: 1 minuto, a 95 °C
1 minuto, a 57°C
2 minuto, a 72 °C
Durante 5 ciclos
Seguido por: 30 segundos a 92 °C
30 segundos a 57 °C
1 minuto a 72°C
Durante 25 ciclos
Seguido por: 5 minutos a 72 °C
4.6. Análisis del gel de agarosa
Para visualizar óptimamente los resultados de la PCR se determinó que se deben aplicar entre 10 y 20µ1 de las muestras de PCR, sobre un gel de agarosa al 1.5% (tampón Tris -borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo escala de lOObp Pharmacia)..
4.7. Validación de los resultados
Se determinó que los datos a partir de las muestras de ADN de plantas transgénicas en una única corrida de PCR y un único cóctel de PCR no se deben aceptar a menos que 1) el control positivo de ADN muestre los productos de PCR esperados (fragmentos transgénicos y endógenos) , 2) el control negativo de ADN sea negativo para la amplificación por PCR (ausencia de fragmentos) y 3) el control de ADN silvestre muestre el resultado esperado (amplificación del fragmento endógeno) .
Cuando se sigue el protocolp de identificación por PCR para EE-GM1 como se describió anteriormente, los carriles que muestran cantidades visibles de los productos de PCR endógeno y transgénico de los tamaños esperados, indican que la planta correspondiente de la cual se preparó el ADN genómico molde, heredó el evento élite EE-GM1. Los carriles que no muestran cantidades visibles ya sea de cualquier producto de PCR transgénico y que muestran cantidades visibles del producto de PCR endógeno, indican que la planta correspondiente de la cual se preparó el ADN genómico molde, no contiene el evento élite. Los carriles que no muestran cantidades visibles de los productos de PCR endógenos y transgénicos, indican que la calidad y/o cantidad del ADN genómico no dejó que se generara un producto de PCR. Estas plantas no se pudieron anotar. La preparación del ADN genómico se debe repetir y se debe realizar una nueva corrida de PCR, con los controles apropiados .
4.8. Uso de un protocolo de PCR de discriminación para identificar a EE-GM1
Antes del intento de detectar los desconocidos, se debe realizar una corrida de prueba con todos los controles apropiados. El protocolo de desarrollo puede requerir la optimización de componentes que pueden diferir entre los laboratorios (preparación del ADN molde, ADN Taq polimerasa, calidad de los cebadores, los dNTP, termociclador, etc.).
La amplificación de la secuencia endógena juega un papel clave en el protocolo. Se tienen que alcanzar condiciones de termociclaje y PCR que amplifiquen cantidades equimolares tanto de la secuencia endógena como transgénica en un ADN molde conocido genómico transgénico. Cualquiera sea el fragmento endógeno especificado que no se amplifica o cualquiera sea las secuencias especificadas que no se amplifican con las mismas intensidades de tinción con bromuro de etidio, según se juzga por una electroforesis en gel de agarosa, se puede requerir la optimización de las condiciones del PCR.
El material de hoja Glycine max de una serie de plantas, algunas de las cuales comprenden EE-GM1 se probaron de acuerdo al protocolo que se describió anteriormente . Las muestras del evento élite EE-GM1 y de Glycine max silvestre se tomaron como controles positivo y negativo, respectivamente .
La Figura 5 ilustra el resultado obtenido con el protocolo de identificación por PCR del evento élite para EE-GM1 en una serie de muestras de planta de soya (carriles 1 al 14) . Las muestras en el carril 1 se encontraron que contenían el evento élite que se detecta con la banda de 185bp, mientras que las muestras en los carriles 2, 3 y 4 no contienen a EE-G 1. El carril 2 contiene otro evento élite de soya, 1 carril 3 representa un control Glycine max no transgénico, el carril 4 representa la muestra de control negativo (agua) , y el carril 5 representa el Marcador de Peso Molecular (lOObp) .
5. Uso de un fragmento de integración específico como una sonda para la detección del material que comprende a EE-GMl .
Se obtiene un fragmento de integración específico de EE-GM1 mediante la amplificación por PCR, usando cebadores específicos SOY06 (sec. con núm. de ident.:16) y SOY07 (sec. con núm. de ident.:17), o por síntesis química y se marca.
Este fragmento de integración se usa como una sonda específica para la detección de EE-GM1 en muestras biológicas. El ácido nucleico se extrae de las muestras de acuerdo con los procedimientos estándares. Este ácido nucleico se pone en contacto después con la sonda específica bajo condiciones de hibridación, que se optimizaron para permitir la formación de un híbrido. La formación del híbrido se detecta después, para indicar la presencia de EE-GM1 en la muestra de ácido nucleico. Opcionalmente, se amplifica el ácido nucleico en las muestra usando los cebadores específicos, antes del contacto con la sonda específica. Como alternativa, en lugar del fragmento de integración el ácido nucleico se marca antes del contacto con la sonda específica. Opcionalmente, la sonda específica se une a un vehículo sólido (tal como, pero no se limita, a un filtro, tira o perlas) antes del contacto con las muestras.
6. Protocolo de identificación por la reacción en cadena de la polimerasa para EE-GM2.
6.1. Cebadores
Se desarrollaron cebadores específicos, que reconocen secuencias dentro del evento élite. Más particularmente, se desarrolló un cebador el cual reconoce una secuencia dentro de la región de flanqueo 3' de EE-GM2. Un segundo cebador se seleccionó después dentro de la secuencia de ADN foráneo tal que los cebadores abarcan una secuencia de aproximadamente 150 nucleótidos. Los siguientes cebadores se encontraron que daban resultados particularmente claros y reproducibles en una reacción de PCR del ADN de EE-GM2 :
SOY09: 5'- TgT . ggT . TAT. ggC . ggT . gCC .ATC-3 ' (sec. con núm. de
(objetivo: ADN vegetal) ident.:18)
SOY010: 5' -TgC.TAC.Agg.CAT.CgT.ggT.gTC-3' (sec. con núm. de
(objetivo: ADN inserto) ident.:19)
Los cebadores que se dirigen a una secuencia endógena se incluyen preferentemente en el cóctel del PCR. Estos cebadores sirven como un control interno en muestras desconocidas y en el control positivo del ADN. Un resultado positivo con el par cebador endógeno demuestra que existe abundante ADN de calidad adecuada en la preparación de ADN genómico para que se genere un producto de PCR. Los cebadores endógenos se seleccionaron para reconocer un gen constitutivo de Glycine max:
SOY01: 5' -gTC.AgC.CAC.ACA.gTg.CCT.AT- (sec. con núm. de
3 ' ident . : 9) (ubicado en el gen de actina 1 de Glycine max
(Acceso J01298) )
SOY02: 5' -gTT.ACC.gTA.CAg.gTC.TTT. ee- (sec. con núm. de
3' ident. : 10)
(ubicado en el gen de actina 1 de Glycine max (Acceso J01298 ) )
6.2. Fragmentos amplificados
Los fragmentos amplificados esperados en la reacción de PCR son:
Para el par cebador SOY01 - 413bp (control endógeno)
SOY02:
Para el par cebador SOY09- 151bp (evento élite EE-GM2) SOY010:
6.3. ADN molde
El ADN molde se preparó a partir de hoja perforada de acuerdo a Edwards y otros (Nucleic Acid Research, 19, pl349, 1991) . Cuando se usa el ADN preparado con otros métodos, se debe realizar una corrida de prueba utilizando cantidades diferentes de molde. Por lo general 50 ng del ADN genómico molde rinde los mejores resultados.
6.4. Controles positivos y negativos asignados
Para evitar falsos positivos o negativos, se determinó que los siguientes controles positivos y negativos deben incluirse en una corrida de PCR:
- Control de Mezcla Maestra (control negativo de ADN) . Este es un PCR en el que no se adiciona ADN a la reacción. Con el resultado esperado, ninguno de los productos de PCR se observa, esto indica que el cóctel de PCR no se contaminó con el ADN objetivo.
Un control positivo de ADN (muestra de ADN genómico que se conoce que contiene las secuencias transgénicas) . La amplificación exitosa de este control positivo demuestra que el PCR se corrió bajo las condiciones que permiten la amplificación de las secuencias objetivo.
Un control de ADN silvestre. Este es un PCR en el cual el ADN molde proporcionado es un ADN genómico preparado a partir de una planta no transgénica. Con el resultado esperado, ninguna amplificación de un producto PCR transgen pero la amplificación del producto PCR endógeno se observa, esto indica que no existe amplificación de fondo del transgen detectable en una muestra de ADN genómico.
6.5. Condiciones de PCR
Los resultados óptimos se obtuvieron bajo las . siguientes condiciones:
- la mezcla PCR para reacciones de 25µ1 contiene:
2.5 µ? ADN molde
2.5 µ? tampón de amplificación lOx (suministrado con la Taq polimerasa)
0.5 µ? 10 mM de dNTP
0.5 µ? de SOY09 ( lOpmoles/µ?)
0.5 µ? de SOY010 ( lOpmoles/µ?)
0.25 µ? de SOY01 (lOpmoles/µ?)
0.25 µ? de SOY02 ( lOpmoles/µ?)
0.1 µ? de ADN- Taq polimerasa (5 unidades/µ?) agua hasta 25 µ?
el perfil de termociclaj e a seguir para resultados óptimos es el siguiente:
4 minutos a 95 °C
Seguido por: 1 minuto a 95°C
1 minuto a 57 °C
2 minutos a 72°C
Durante 5 ciclos
Seguido por: 30 segundos a 92 °C
30 segundos a 57 °C
1 minuto a 72 °C
Para durante 25 ciclos
Seguido por: 5 minutos a 72 °C
6.6. Análisis del gel de agarosa
Para visualizar de forma óptima los resultados del PCR se determinó que se deben aplicar entre 10 y 20µ1 de las muestras de de PCR, en un gel de agarosa 1.5% (tampón Tris-borato) con un marcador de peso molecular apropiado (por ejemplo marcador de lOObp, Pharmacia) .
6.7. Validación de los resultados
Se determinó que los datos de las muestras de ADN de plantas transgénicas dentro de una única corrida de PCR y un único cóctel de PCR no se deben aceptar a menos que 1) el control positivo de ADN muestre los productos de PCR esperados (fragmentos endógenos y transgénicos) , 2) el control negativo de ADN sea negativo para la amplificación por PCR (ausencia de fragmentos) y 3) el control de ADN silvestre muestre el resultado esperado (amplificación del fragmento endógeno) .
Cuando se sigue el protocolo de Identificación por PCR para EE-GM2 como se describió anteriormente, los carriles que muestran cantidades visibles de los productos de PCR endógeno y transgénico de los tamaños esperados, indican que la planta correspondiente de la que se preparó el ADN genómico molde, heredó el evento élite de EE-GM2. Los carriles que no muestran cantidades visibles ya sean de productos transgénicos del PCR como que muestran cantidades visibles del producto endógeno del PCR, indican que la planta correspondiente de la que se preparó el ADN genómico molde, no contiene el evento élite. Los carriles que no muestran cantidades visibles de los productos endógenos y transgénicos del PCR, indican que la calidad y/o la cantidad del ADN genómico no permitió que se generara un producto de PCR. Estas plantas no se pudieron anotar. La preparación del ADN genómico se debe repetir y se debe realizar una nueva corrida de PCR, con los controles apropiados.
6.8. Uso de un protocolo de PCR de discriminación para identificar a EE-GM2
Antes del intento para detectar los desconocidos, se realizó una corrida de prueba con los controles apropiados. El protocolo de desarrollo puede requerir la optimización de componentes que pueden diferir entre los laboratorios (preparación del ADN molde, ADN Taq polimerasa, calidad de los cebadores, los dNTP, termociclador , etc.).
La amplificación de la secuencia endógena juega un papel clave en el protocolo. Se tienen que alcanzar condiciones de termociclaje y de PCR que amplifiquen cantidades equimolares tanto de secuencias endógenas como transgénicas en un ADN molde conocido genómico transgénico. Cualquiera sea el fragmento endógeno especificado que no se amplifica o cualquiera sean las secuencias especificadas que no se amplifican con las mismas intensidades de la tinción de bromuro de etidio, como se juzga por una electroforesis en gel de agarosa, se puede requerir la optimización de las condiciones del PCR.
El material de hoja de Glycine ma.x, de una serie de plantas, algunas de las que contienen EE-GM2 se probaron de acuerdo al protocolo que se describió anteriormente. Las muestras del evento élite EE-GM2 y de Glycine max silvestre se tomaron como controles positivo y negativo, respectivamente .
La Figura 6 ilustra los resultados obtenidos con el protocolo de identificación por de PCR del evento élite para EE-GM2 en una serie de muestras de plantas de soya (carriles 1 al 14) . Las muestras en el carril 1 se encontraron que contenían el evento élite dado que se detecta con la banda de 185bp, mientras que las muestras en los carriles 2, 3 y 4 no contuvieron a EE-GM2. El carril 2 contiene otro evento élite de la soya, el carril 3 representa un control de Glycine max no transgénico, el carril 4 representa la muestra control negativo (agua) , y el carril 5 representa el patrón de peso molecular (lOObp) .
7. Uso de un fragmento de integración específico como una sonda para la detección del material que comprende a EE-GM2.
Se obtiene un fragmento de integración específico de EE-GM2 por amplificación en PCR, usando cebadores específicos SOY09 (sec. con núm. de ident.:18) y SOY010 (sec. con núm. de ident.:19), o por síntesis química y se marca. Este fragmento de integración se usa como una sonda específica para la detección de EE-GM2 en muestras biológicas. El ácido nucleico se extrae de las muestras de acuerdo a los procedimientos estándares .
Este ácido nucleico se pone en contacto después con la sonda específica bajo condiciones de hibridación, las que se optimizaron para permitir la formación de un híbrido. La formación del híbrido' se detecta después, para indicar la presencia del ácido nucleico EE-GM2 en la muestra. Opcionalmente , el ácido nucleico en las muestra se amplifica usando los cebadores específicos, antes^ del contacto con la sonda específica. Como alternativa, el ácido nucleico en lugar del fragmento de integración se marca antes del contacto con la sonda específica. Opcionalmente, la sonda específica se adjunta a un vehículo sólido (tal como, pero no se limita a un filtro, tira o perlas) antes del contacto con las muestras.
8. Generación de plantas de soya que comprenden EE-GM3 y EE-GM1 o EE-GM3 y EE-GM2 y evaluación del desempeño agronómico de las plantas de ese tipo.
Se obtuvo una planta de soya que contiene una combinación de los eventos élites EE-GM3 y EE-GM1 por el cruzamiento convencional entre una planta de soya parental que comprende EE-GM3 y una planta de soya parental que contiene EE-GM1. Las plantas de la progenie que comprenden ambos eventos se identifican usando los protocolos de identificación por PCR para EE-GM1 y EE-GM3 como se describe en este documento. Específicamente, los cruzamientos se realizaron con plantas que contienen EE-GM3 y varias líneas EE-GM1. Las plantas Fl resultantes se cultivaron y rociaron con glifosato y glufosinato. Las semillas F2 se cosecharon de plantas Fl y se plantaron (las plantas F2 no se rociaron) . Las plantas únicamente F2 se sacaron. Las filas de plantas F2 : F3 se cultivaron y rociaron con glifosato y glufosinato. Las filas homocigóticas para ambas EE-GM3 y EE-GM1 se identificaron y posteriormente se cosecharon. Los datos de segregación de este ensayo mostraron una segregación Mendeliana esperada de estos eventos.
Una planta de soya que contiene una combinación de los eventos élite EE-GM3 y EE-GM2 se obtuvo por cruzamiento convencional entre una planta de soya parental que comprende EE-GM3 y una planta de soya parental que comprende EE-GM2. Las plantas de la progenie que comprenden ambos eventos se identifican usando los protocolos de identificación por PCR para EE-GM2 y EE-G 3 como se describe en este documento. Específicamente, se realizaron los cruzamientos con plantas que contienen EE-GM3 y plantas que contienen EE-GM2. Las plantas Fl resultantes se cruzaron hasta 4 líneas convencionales. Las Fl de estos cruzamientos se cultivaron en el campo y se rociaron con glifosato y glufosinato. Las semillas F2 cosechadas de las plantas Fl resistentes a ambos herbicidas se plantaron después. Las plantas F2 se rociaron con tanto glifosato como glufosinato. Novecientas plantas tolerantes a ambos herbicidas se cosecharon y plantaron en un ensayo de campo. Los datos de la segregación Mendeliana esperada para estos eventos se obtienen en este ensayo. Aproximadamente 40 líneas de homocigotos para la tolerancia a ambos herbicidas se seleccionaron por su uniformidad agronómica para estudios adicionales. Estas líneas tuvieron buena tolerancia a ambos herbicidas, con buenas características agronómicas.
Los ensayos de campo con plantas de soya de ese tipo que comprenden los eventos combinados en diferentes tipos de germoplasma comerciales realizan en múltiples locaciones y se evalúan varios parámetros agronómicos, incluyendo altura de la planta, altura hasta el nodo, sostenimiento, vigor, rendimiento de semillas y niveles de tolerancia a glifosato, isoxaflutol y glufosinato.
9. Introgresión de EE-GM3 y EE-GM1 o EE-GM2 dentro de los cultivares preferidos.
El evento élite EE-GM3 y evento élite EE-GM1 o EE-GM2 se introducen por retrocruzamiento repetido en cultivares comerciales de soya tal como pero sin limitarse a Cultivar de soya 7631014 (US2009252860) ; Cultivar de soya 7431014 (US2009252859) ; Cultivar de soya 7925084 (US2009.252858) ; Cultivar de soya 7311153 (US2009252857) ; Cultivar de soya S070159 (US2009252856) ; Cultivar de soya 7535357 (US2009246353) ; Cultivar de soya S070160 (US2009246352 ) ; Cultivar de soya 26074414 (US2009249508 ) ; Cultivar de soya 7509171 (US2009249507) ; Cultivar de soya S070158 (US2009246351) ; Cultivar de soya 7511119 (US2009249506) ; Cultivar de soya 7113111 (US2009238945 ) ; Cultivar de soya
506- 02RM018047 (US7592518) ; Cultivar de soya 7013345 (US2009232957) ; Cultivar de soya 7041461 (US2009235376) ; Cultivar de soya 7549450 (US2009232956) ; Cultivar de soya 7317090 · (US2009232955) ; Cultivar de soya 2N2V58Q15 (US2009226597) ; Cultivar de soya 7243182 (US2009226596) ; Cultivar de soya 7143182 (US2009226595 ) ; Cultivar de soya 7043182 (US2009220673) ; Cultivar de soya S070157 (US2009222950) ; Cultivar de soya 306924721 (US2009220672) ; Cultivar de soya 7614385 (US2009220671 ) ; Cultivar de soya 7925118 (US2009214750) ; Cultivar de soya 7821295 (US2009214749) ; Cultivar de soya 7811336 (US2009214748 ) ; Cultivar de soya S070150 (US2009214747) ; Cultivar de soya 6214260 (US2009214746) ; Cultivar de soya S070152 (US2009214745) ; Cultivar de soya 7429331 (US2009214751) ; Cultivar de soya 26034631 (US2009208634) ; Cultivar de soya
507- 03JR108674 (US7560621); Cultivar de soya S07- 03KLQ16279 (US7560620) ; Cultivar de soya S06-CL95941 1 ' (US7554017) ; Cultivar de soya SG3870NRR (US2009158453 ) ; Cultivar de soya HFPR-G (CA2645702) ; Cultivar de soya S06-02JR423016 (US7521606) ; Cultivar de soya S06-01JR1 19814 (US7518039) ; Cultivar de soya S06-01JR119448 (US7518038) ; Cultivar de soya 6540220 (US2009055960) ; Cultivar de soya S060292 (US2009055959) ; Cultivar de soya S050228 (US2009055958 ) ; Cultivar de soya S06-02JR423003 (US7491873) ; Cultivar de soya S06-02JR423005 (US7491872) ; Cultivar de soya S06-02JR409114 (US7485782) ; Cultivar de soya S06-SJ144056 (US7473823) ; Cultivar de soya (US7470835) ; Cultivar de soya 6910450 (US2008282369) ; Cultivar de soya 6223012 (US7446246) ; Cultivar de soya 6549250 (US7446245) ; Cultivar de soya 17731225 (US2008271204 ) ; Cultivar de soya 6928285 (US2008271203) ; Cultivar de soya 6736054 (US2008271169) ; Cultivar de soya S060299 (US2008271199) ; Cultivar de soya S060294 (US2008271202) ; Cultivar de soya 6943322 (US2008271201) ; Cultivar de soya 5343260 (US2008263719) ; Cultivar de soya 6439359 (US2008263704 ) ; Cultivar de soya 6238359 (US2008263703 ) ; Cultivar de soya 6547272 (US2008263702) ; Cultivar de soya 6929431 (US2008263701) ; Cultivar de soya 6703392 (US2008263700) ,- Cultivar de soya 6044483 (US2008263699) ; Cultivar de soya S050224 (US2008263698) ; Cultivar de soya 6719022 (US2008263697) ; Cultivar de soya 5826056 (US2008263696) ; Cultivar de soya 6265047 (US2008263724) ; Cultivar de soya 6928331 (US2008263695) ; Cultivar de soya 6719331 (US2008263694 ) : Cultivar de soya 6636454 (US2008263693) ; Cultivar de soya 6226454 (US2008263718 ) ; Cultivar de soya Q0073801 (US2008256657) ; Cultivar de soya 6326393 (US2008256652) ; Cultivar de soya 6408448 (US2008256651) ; Cultivar de soya 6449315 (US2008250524) ; Cultivar de soya S060296 (US2008250523) ; Cultivar de soya 6012078 (US2008250522 ) ; Cultivar de soya 6342078 (US2008250521) ; Cultivar de soya 6419156 (US2008250520) ; Cultivar de soya 5723264 (US2008250519) ; Cultivar de soya S050225 (US2008250518 ) ; Cultivar de soya S060298 (US2008244783) ; Cultivar de soya 6935331 (US2008244782) ; Cultivar de soya 6819456
(US2008244787) ; Cultivar de soya S060297 (US2008244781) ; Cultivar de soya 6135319 (US2008244786) ; Cultivar de soya 6819331 (US2008244780) ; Cultivar de soya 6137445
(US2008244779) ; Cultivar de soya 6917445 (US2008244778) ; Cultivar de soya 6111333 (US2008244777) ; Cultivar de soya S050229 (US2008244776) ; Cultivar de soya 6114011
(US2008244775) ; Cultivar de soya 6900358 (US2008244784 ) ; Cultivar de soya 6345184 (US2008244774) ; Cultivar de soya 6836085 (US2008244773) ; Cultivar de soya 6635047
(US2008244772) ; Cultivar de soya 6139105 (US2008244771) ; Cultivar de soya 6434385 (US2008244770) ; Cultivar de soya S060295 (US2008244769) ; Cultivar de soya 6035184 (US2008244768) ; Cultivar de soya SQ60293 (US2008209590 ) ; Cultivar de soya 6733322 (US2008209594 ) ; Cultivar de soya 6421326 (US2008209593) ; Cultivar de soya S060077 (US2008209589) ; Cultivar de soya 6600375 (US2008209592 ) ; Cultivar de soya S06-CL821457 (US7420104) ; Cultivar de soya S07-02KG294306 (US7414178); Cultivar de soya S06-BA0461 19 (US7414175) ; Cultivar de soya S07-02KG294307 (US7411114) ; Cultivar de soya SG3865N (US2008189802 ) ; Cultivar de soya 6701475 (US7408097) ; Cultivar de soya 1335025 (US2008178316 ) ; Cultivar de soya 1686017 (US2008178315 ) ; Cultivar de soya 2388028 (US2008178314) ; Cultivar de soya 2387029 (US2008178313) ; Cultivar de soya S06-WW152330 (US7388129) ; Cultivar de soya 6424090 (US7385118) Cultivar de soya 6723322 (US7385115) ; Cultivar de soya SG4377NRR (US73851 14) ; Cultivar de soya S06 - 02JR111334 (US7381864) ; Cultivar de soya 6141287 (US7378577) ; Cultivar de soya MT110501 (US7378576) ; Cultivar de soya (US7378575) ; Cultivar de soya S06- W169267 (US7375261) ; Cultivar de soya 6223392 (US7371939) ; Cultivar de soya S06-CL968413 (US7371937) ; Cultivar de soya S06-CL91107 (US7368636) ; Cultivar de soya S06 -MT9152077 (US7361810) ; Cultivar de soya 4211676 (US2008092253 ) ; Cultivar de soya S06-M059029 (US7355101) ; Cultivar de soya 6548193 (US7345228) ; Cultivar de soya 6440261 (US7345227) ; Cultivar de soya S060291 (US7342151) ; Cultivar de soya S06-MT9206166 (US7339094); Cultivar de soya S06-WW013107 (US7339093) ; Cultivar de soya S06-M03256 (US7335820); Cultivar de soya 6134466 (US7332656) ; Cultivar de soya S06-01JR123373 (US7329800) ; Cultivar de soya S06-MT9211059 (US7326831) ; Cultivar de soya 26170838 (US2008016590) ; Cultivar de soya 306612412 (US2008016588) ; Cultivar de soya 26660135 (US2008016587 ) ; Cultivar de soya 306734323 (US2008016586) ; Cultivar de soya S06-01JR122235 (US7317144) ; Cultivar de soya 5900450 (US7314986) ; Cultivar de soya S06-MT116260 (US7314984) ; Cultivar de soya S06-SJ143606 (US7312381) ; Cultivar de soya S06-98181-G01-35167 (US7309819) ; Cultivar de soya 26082635 (US7304219) ; Cultivar de soya BA922834 (US7304217) ; Cultivar de soya 01JR123480 (US7304216) ; Cultivar de soya M061422 (US7304215); Cultivar de soya 17082821 (US2007277262) ; Cultivar de soya 17621620 (US2007277261) ; Cultivar de soya 00977706 (US2007277260) ; Cultivar de soya S060182 (US2007277259) ; Cultivar de soya 26312034 (US7301078) ; Cultivar de soya 26143837 (US7301077) ; Cultivar de soya 435. TCS (US2007271626) ; Cultivar de soya 495. RC (US2007271625) ; Cultivar de soya 5306230 (US7297845) ; Cultivar de soya S06-WW167686 (US7291772) ; Cultivar de soya 6141 145 (US2007245426) ; Cultivar de soya S050232 (US2007226829) ; Cultivar de soya 5333301 (US2007226828) ; Cultivar de soya S050215 (US2007226827) ; Cultivar de soya 3235020 (US2007226826) ; Cultivar de soya 5720482
(US2007226825) ; Cultivar de soya S050216 (US200722682 ) ; Cultivar de soya 5512112 (US2007226823) ; Cultivar de soya-3233021 (US2007226822) ; Cultivar de soya 1336024
(US2007226821) ; Cultivar de soya 5348287 (US2007226820) ; Cultivar de soya 5204220 (US2007226819) ; Cultivar de soya 6188027 (US2007226818) ; Cultivar de soya 4183026
(US2007226817) ; Cultivar de soya S06-WW157958 (US7271325) ; Cultivar de soya 5733056 (US2007209091) ; Cultivar de soya 90501911 (US2007209090) ; Cultivar de soya S050221
(US2007204361) ; Cultivar de soya 5802205 (US2007204360) ; Cultivar de soya 1000642 (US2007204359) ; Cultivar de soya 5420128 (US2007204358) ; Cultivar de soya S050222
(US2007199094) ; Cultivar de soya S050217 (US2007199093 ) ; Cultivar de soya S050223 (US2007199092) ; Cultivar de soya S050218 (US2007199091) ; Cultivar de soya 5419227
(US2007199089) ; Cultivar de soya 5319227 (US2007199088 ) ; Cultivar de soya 5723045 (US2007199087) ; Cultivar de soya 5051007 (US2007199086) ; Cultivar de soya 5826175
(US2007192893) ; Cultivar de soya S050231 (US2007192892) ; Cultivar de soya 5826376 (US2007192891) ; Cultivar de soya 5628386 (US2007192890) ; Cultivar de soya 5138236
(US2007186307) ; Cultivar de soya 5608398 (US2007186306) ; Cultivar de soya S050230 (US2007186305) ; Cultivar de soya 5624126 (US2007180561) ; Cultivar de soya 5019225 (US2007180560) ; Cultivar de soya 5549483 (US2007180559) ; Cultivar de soya 4189010 (US2007180551) ; Cultivar de soya 1486018 (US2007180550) ; Cultivar de soya S050235 (US2007180549) ; Cultivar de soya 5023230 (US2007180548 ) ; Cultivar de soya S050238 (US2007174930) ; Cultivar de soya 5830261 (US2007174928) ; Cultivar de soya S050226 (US7247772) ; Cultivar de soya 5806063 (US7247771) ; Cultivar de soya S050233 (US7244881) ; Cultivar de soya 5726085 (US7241939) ; Cultivar de soya MT000792 (US7238867) ; Cultivar de soya 5521161 (US7235718) ; Cultivar de soya WW109447 (US7235717) ; Cultivar de soya BA947474 (US7220898) ; Cultivar de soya 5939002 (US7217870) ; Cultivar de soya 5726175 (US7217869) ; Cultivar de soya 5432082 (US7217868) ; Cultivar de soya SG0850RR (US7211715) ; Cultivar de soya SG1750NRR (US7208658) ; Cultivar de soya MT017827 (US7208657) ; Cultivar de soya 4N2V74028 (US7205458 ) ; Cultivar de soya CL431203 (US7202400) ; Cultivar de soya 4N0S63222 (US7199288) ; Cultivar de soya 5520279 (US7196253) ; Cultivar de soya 5834401 (US7196252) ; Cultivar de soya 5621 161 (US7196251) ; Cultivar de soya CL722114 (US7196250) ; Cultivar de soya 5741081 (US7193140) ; Cultivar de soya CL727422 (US7186895) ; Cultivar de soya 4N2V55022 (US7183468 ) ; Cultivar de soya 5083011 (US7173169) ; Cultivar de soya 5626085 (US7169976) ; Cultivar de soya S050051 (US7169974) ; Cultivar de soya 4506816 (US2006294626) ; Cultivar de soya WW152201 (US7132594) ; Cultivar de soya CL727636 (US7132593 ) ; Cultivar de soya M08851 (US7126047) ; Cultivar de soya 4324401 (US7105728) ; Cultivar de soya S050164 (US7105727) ; Cultivar de soya 4136015 (US2006195931) ; Cultivar de soya 3133014 (US2006195930) ; Cultivar de soya S040132 (US2006195929) ; Cultivar de soya 4328386
(US2006195928) ; Cultivar de soya 1339013 (US2006195927) ; Cultivar de soya 4423183 (US2006195925 ) ; Cultivar de soya S040131 (US2006195924) ; Cultivar de soya 4929388 (US2006195923) ; Cultivar de soya 4817034 (US2006195922 ) ; Cultivar de soya 4916816 (US7098385) ; Cultivar de soya 4713487 (US2006191032) : Cultivar de soya 4348019 (US2006191031) ; Cultivar de soya SQ40122 (US2006191030 ) ; Cultivar de soya S040133 (US2006185031) ; Cultivar de soya CL821418 (US7091404) ; Cultivar de soya 4441080 (US7091403) ; Cultivar de soya 4805442 (US2006179509) ; Cultivar de soya 4921237 (US2006179508) ; Cultivar de soya 4417380 (US2006174369) ; Cultivar de soya 4405070 (US2006174368 ) ; Cultivar de soya 4417779 (US7084328) ; Cultivar de soya S040125 (US2006168678) ; Cultivar de soya 4909380 (US7081572) ; Cultivar de soya S050162 (US7081571) ; Cultivar de soya 6084016 (US7081570) ; Cultivar de soya S050163 (US7078600) ; Cultivar de soya S040135 (US7078598) ; Cultivar de soya S040117 (US7078597) ; Cultivar de soya M03393 (US7071391) ; Cultivar de soya 4145306 (US7064253); Cultivar de soya 900213 (US2006117405) ; Cultivar de soya 1000126 (US200611740 ) ; Cultivar de soya 901023 (US2006117403 ) ; Cultivar de soya S040130 (US7053280) ; Cultivar de soya 4706198 (US7053279) ; Cultivar de soya S040118 (US7053278) ; Cultivar de soya S040119 (US7053277) ; Cultivar de soya S040123 (US7053276) ; Cultivar de soya 4442112 (US7049497) ; Cultivar de soya 917013 (US7045689) ; Cultivar de soya S040124 (US7045691) ; Cultivar de soya 4238491 (US7045690) ; Cultivar de soya S010136 (US7041882) ; Cultivar de soya 900613 (US7030297) ; Cultivar de soya 4337175 (US7030301) ; Cultivar de soya S040121 (US7030300) ; Cultivar de soya 4216033 (US7030299) ; Cultivar de soya S040128 (US7022901) ; Cultivar de soya S040120 (US7022900) ; Cultivar de soya S040127 (US7019199) ; Cultivar de soya S040134 (US7015378) ; Cultivar de soya S040129 (US7015377) ; Cultivar de soya 4513420 (US7005564) ; Cultivar de soya 943013 (US2006031958 ) ; Cultivar de soya S030136 (US2006021081) ; Cultivar de soya 927013 (US2006021080) ; Cultivar de soya 1000109 (US2006015962 ) ; Cultivar de soya 90046112 (US2006010530) ; Cultivar de soya 90897327 (US2006010529) ; Cultivar de' soya 90362421 (US2006010528) ; Cultivar de soya 03022253 (US2006010527) ; Cultivar de soya 02022433 (US2006010526) ; Cultivar de soya 02022323 (US2006010525) ; Cultivar de soya 02912951 (US2006010524 ) ; Cultivar de soya 0102115 (US2006010523 ) ; Cultivar de soya 915034 (US2006010522) ; Cultivar de soya 0509255
(US2006010521) ; Cultivar de soya 4803070 (US6982368) ; Cultivar de soya 4704310 (US6979762) ; Cultivar de soya SJ919784 (US2005268362) ; Cultivar de soya CL615261
(US2005268361) ; Soya nueva (US2004199964 ) ; Cultivar de soya 0509214 (US2005210542) ; Cultivar de soya 70826751
(US2005193442) ; Cultivar de soya 0509243 (US2005193441) ; Cultivar de soya 0509246 (US2005193440) ; Cultivar de soya 0509253 (US2005193439) ; Cultivar de soya 0509247
(US2005193438) ; Cultivar de soya 0509252 (US2005193437 ) ; Cultivar de soya 0509241 (US2005193436) ; Cultivar de soya 0509249 (US6884927) ; Cultivar de soya 0509244 (US2005183158 ) ; Cultivar de soya 0509240 (US2005183157) ; Cultivar de soya 0509239 (US2005183156) ; Cultivar de soya 0509254
(US2005183155) ; Cultivar de soya 0509245 (US2005183154 ) ; Cultivar de soya 0509251 (US2005183153 ) ; Cultivar de soya 4283008 (US6888050) ; Cultivar de soya 2386009 (US2005183152) ; Cultivar de soya 3282002 (US6870080) ; Cultivar de soya 0509248 (US2005183151) ; Cultivar de soya 5091007 (US6906249) ; Cultivar de soya 0509236 (US2005166281) ; Cultivar de soya 0509235 (US2005166280) ; Cultivar de soya 0509237 (US2005166279) ; Cultivar de soya SG5322NRR (US2005164390) ;
Cultivar de soya SG5030NRR (US2005166278) ; Cultivar de soya SG4911NRR (US2005166277 ) ; Cultivar de soya S030153 (US2005160504) ; Cultivar de soya S030158 (US2005144680) ; Cultivar de soya S030160 (US2005144679) ; Cultivar de soya S030161 (US2005144678) ; Cultivar de soya S030157 (US2005144677) ; Cultivar de soya S030155 (US2005144676 ) Cultivar de soya S030156 (US2005144675 ) ; Cultivar de soya S030159 (US2005144674) ; Cultivar de soya S030154 (US6900376 ) ; Cultivar de soya S020030 (US2005114929) ; Cultivar de soya S030010 (US20051 14928) ; Cultivar de soya SG1431RR (US2005097629) ; Cultivar de soya SG1330NRR (US2005097642) ; Cultivar de soya S030150 (US2005071900) ; Cultivar de soya S022209 (US2005050601) ; Cultivar de soya S022217 (US2005050600) ; Cultivar de soya S022219 (US2005050599 ) ; Cultivar de soya S030151 (US2005050598 ) ; Cultivar de soya 0491735 (US2005022272) ; Cultivar de soya S022218 (US2005022271) ; Cultivar de soya 6190006 (US2004268447 ) ; Cultivar de soya SG1120RR (US2004250316) ; Cultivar de soya 0487681 (US2004237153) ; Cultivar de soya 0491717 (US2004237152) ; Cultivar de soya SO22220 (US2004237151) ; Cultivar de soya 0491715 (US2004237150 ) ; Cultivar de soya 0491712 (US2004237149) ; Cultivar de soya 0491718 (US2004237148) ; Cultivar de soya 99271316 (US2004221344) ; Cultivar de soya S022212 (US2004221343 ) ; Cultivar de soya 0491737 (US2004221342) ; Cultivar de soya S022211 (US2004221341) ; Cultivar de soya SO22210 (US2004221340) ; Cultivar de soya S022213 (US2004221339) ; Cultivar de soya 0491725 (US2004221346) ; Cultivar de soya 03129016 (US2004221329) ; Cultivar de soya SO22208 (US2004221328 ) ; Cultivar de soya SO22207 (US2004221345 ) ; Cultivar de soya 02932 (US2004210968) ; Cultivar de soya 94137321 (US2004205862) ; Cultivar de soya 94106224 (US2004205861) ; Cultivar de soya 94143901 (US2004205859) ; Cultivar de soya 0487685 (US2004205858 ) ; Cultivar de soya 92440927 (US2004205857) ; Cultivar de soya 0487686 (US2004205856) ; Cultivar de soya S022215 (US2004205855) ; Cultivar de soya S022214 (US2004205854) ; Cultivar de soya 0491726 (US2004205849) ; Cultivar de soya 92478609 (US2004205853 ) ; Cultivar de soya 922013 (US6781040) ; Cultivar de soya 0491727 (US2004205852) ; Cultivar de soya 0491728 (US2004205851) ; Cultivar de soya 1465003 (US2004098766) ; Cultivar de soya 3186004 (US2004019936) ; Cultivar de soya 7085005 (US2004205850) ; Cultivar de soya SO22204 (US2004199958) ; Cultivar de soya SO22206 (US2004199957) ; Cultivar de soya 0491731 (US2004199956) ; Cultivar de soya 0491733 (US2004199955) ; Cultivar de soya 0491738 (US2004199954 ) ; Cultivar de soya 0491732 (US2004199953 ) ; Cultivar de soya 0491729 (US2004199952) ; Cultivar de soya SO20011 (US2004199951) ; Cultivar de soya 0491739 (US2004199950) ; Cultivar de soya 0491730 (US2004199949) ; Cultivar de soya 13873 (US2004199948) ; Cultivar de soya 954011 (US2004181822 ) ; Cultivar de soya 010022 (US2004181831) ; Cultivar de soya 4181001 (US2003229926) ; Cultivar de soya 0491721 (US2004168228) ; Cultivar de soya 0491723 (US6911581 ( ) ; Cultivar de soya 0491716 (US2004168226 ) ; Cultivar de soya 0491713 (US2004168225) ; Cultivar de soya 0491711 (US2004168224) ; Cultivar de soya 0491722 (US2004168223) ; Cultivar de soya 0491724 (US2004168222 ) ; Cultivar de soya 0491720 (US2004168221) ; Cultivar de soya 0487682 (US2004168220) ; Cultivar de soya 0491714 (US2004168219) ; Cultivar de soya 0491719 (US2004168218 ) ; Cultivar de soya DP 5634 RR (US2003177540) ; Cultivar de soya S56-D7 (US2004098765) ; Cultivar de soya 926877 (US2004064859) ; Cultivar de soya SE73753 (US2004055059) ; Cultivar de soya SN83594 (US2004055058) ; Cultivar de soya SE71112 (US2004055056) Cultivar de soya SE73090 (US2004055054) ; Cultivar de soya SN79526 (US2004055053 ) ; Cultivar de soya SW90702 (US2004055052) ; Cultivar de soya SN79525 (US2004055051) ; Cultivar de soya SE90345 (US2004055050) ; Cultivar de soya 0149928 (US2004055049) ; Cultivar de soya SN83780 (US2004055048) ; Cultivar de soya 0053840 (US2004055047) ; Cultivar de soya 924001 (US2004055046) ;
Cultivar de soya 0004747 (US2004055057) ; Cultivar de soya 0037357 (US2004055045) ; Cultivar de soya SN83366
(US2004055044) ; Cultivar de soya SN76208 (US2004055043 ) ; Cultivar de soya 0037370 (US2004055042 ) ; Cultivar de soya SX95512 (US2004049821) ; Cultivar de soya 0096008 (US 2004049820) ; Cultivar de soya SN83544 (US2004049819) ; Cultivar de soya 0088401 (US2004049818) ; Cultivar de soya SN64195 (US2004049817) ; Cultivar de soya 0034754 (US2004049816) ; Cultivar de soya SN71173 (US2004049815) ; Cultivar de soya SN83211 (US2004049814 ) ; Cultivar de soya 92422749 (US2004045058) ; Cultivar de soya 012031 1 (US2004045057) ; Cultivar de soya S010344 (US2004003438) ; Cultivar de soya 70876922 (US2004003437) ; Cultivar de soya 924496 (US2004003436) ; Cultivar de soya 19705120 (US2003237116) ; Cultivar de soya 19704220 (US2003235914) ; Cultivar de soya 19704280 (US2003237115 ) ; Cultivar de soya 19704210 (US2003237114) ; Cultivar de soya S37-N4 (US2003237113) ; Cultivar de soya 19602310 (US2003233685) ; Cultivar de soya 19704120 (US2003233684 ) ; Cultivar de soya 19704230 (US2003233683 ) ; Cultivar de soya 1000126 (US2003233682) ; Cultivar de soya 93831526 (US2003221226) ; Cultivar de soya 0322581 (US2003221225 ) ; Cultivar de soya 0332149 (US2003213028) ; Cultivar de soya 0332144 (US2003213027) ; Cultivar de soya 924788 (US2003213026) ;
Cultivar de soya 924861 (US2003213025) ; Cultivar de soya 928070 (US2003213024) ; Cultivar de soya S010354
(US2003213023) ; Cultivar de soya S010360 (US2003213022) ; Cultivar de soya S010361 (US2003213021) ; Cultivar de soya S010363 (US2003213020) ; Cultivar de soya S010364
(US2003213019) ; Cultivar de soya 0332148 (US2003208805) ; Cultivar de soya 0332147 (US2003208804) ; Cultivar de soya 0332146 (US2003208803) ; Cultivar de soya 0332135
(US2003208802) ; Cultivar de soya 1000144 (US2003208801) ; Cultivar de soya 0332143 (US2003208800) ; Cultivar de soya 0332145 (US2003208799) ; Cultivar de soya S010345
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(US2003204880) ; Cultivar de soya S010350 (US2003204879) ; Cultivar de soya S010355 (US2003204878) ; Cultivar de soya 031766 (US2003204877) ; Cultivar de soya S010353
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(US2003200576) ; Cultivar de soya 0332141 (US2003200575) ; Cultivar de soya 0332142 (US2003200574) ; Cultivar de soya 0332133 (US2003200573) ; Cultivar de soya 0332134
(US2003200572) ; Cultivar de soya 0332139 (US2003200571) ;
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(US2006107356) : Variedad de soya XB32M06 (US2006107355) ; Variedad de soya XB 19F06 (US2006107354 ) ; Variedad de soya S03-95021 -55-138-AB (US7026531) ; Variedad de soya 94M41 (US7002061 ) : Variedad de soya 91M50 (US6998518) ; Variedad de soya 92B 13 (US6989475) ; Variedad de soya 93B68 (US6989474) ; Variedad de soya 93B09 (US6979759) ; Variedad de soya 92M00 (US6972352) ; Variedad de soya XB08P05 (US2005120433 ) ; Variedad de soya XB26V05 (US2005150023) ; Variedad de soya XB21R05 (US2005108795) ; Variedad de soya XB28E05 (US2005114942) ; Variedad de soya XB58K05 (US2005114941) ; Variedad de soya XB27B05 (US2005114940) ; Variedad de soya XB21S05 (US2005150022) ; Variedad de soya XB26U05 (US2005138695) ; Variedad de soya XB35K05 (US2005150021) ; Variedad de soya XB 18S05 (US2005120436) ; Variedad de soya XB25C05 (US2005120435) ; Variedad de soya 90M01 (US2005120434) ; Variedad de soya XB22H05 (US2005150020) ; Variedad de soya XB22K05 (US2005114939) ; Variedad de soya XB58G05 (US2005114938) ; Variedad de soya XB57U05 (US2005120432) ; Variedad de soya XB49M05 (US2005120431) ; Variedad de soya XB20D05 (US2005144683) ; Variedad de soya XB41B05 (US2005150019) ; Variedad de soya XB38T05 (US2005120430) ; Variedad de soya XB 13T05 (US2005120429) ; Variedad de soya XB 19Y05 (US2005120428 ) ; Variedad de soya XB43D05 (US2005120427) ; Variedad de soya XB40E05 (US2005120426) ; Variedad de soya XB39N05 (US2005120425) ; Variedad de soya 93M01 (US2005120424 ) ; Variedad de soya XB31W05 (US2005223439) ; Variedad de soya XB32C05
(US2005114937) ; Variedad de soya XB40D05 (US2005120423) ; Variedad de soya 92M61 (US2005120422) ; Variedad de soya 91M91
(US2005114936) ; Variedad de soya XB33Y05 (US2005120421 ) ; Variedad de soya XB34A05 (US2005120420 ) ; Variedad de soya XB
13U05 (US2005114935) ; Variedad de soya XB 12K05
(US2005114934) ; Variedad de soya XB30P05 (US2005120419) ; Variedad de soya XB57T05 (US2005114933 ) ; Variedad de soya XB
17S05 (US2005114932) ; Variedad de soya XB25Y05 (US2005114930) ; Variedad de soya XB25S05 (US2005150017) ; Variedad de soya XB43W04 (US2004177420) ; Variedad de soya XB44W04 (US2004177419) ; Variedad de soya XB53J04
(US2004199960) ; Variedad de soya XB43V04 (US2004216192 ) ; Variedad de soya XB49K04 (US2004172668 ) ; Variedad de soya XB27P04 (US 2004205864) ; Variedad de soya XB29L04
(US2004177418) ; Variedad de soya XB29K04 (US2004177417) ; Variedad de soya XB41U04 (US2004231017 ) ; Variedad de soya XB34D04 (US2004177416) ; Variedad de soya XB09J04
(US2004172711) ; Variedad de soya XB32Y04 (US2004194169) ; Variedad de soya XB44D04 (US2004172710) ; Variedad de soya XB44C04 (US2004172709) ; Variedad de soya XB 10L04
(ÜS2004172708) ; Variedad de soya XB 19U04 (US2004172707) ; Variedad de soya XB02F04 (US2004172706 ) ; Variedad de soya XB 25X04 (US2004172705) ; Variedad de soya XB26L04 (US2004172704) ; Variedad <ie soya XB 1 1F04 (US2004172703 ) ; Variedad de soya XB40Z04 (US2004177415) ; Variedad de soya XB40Y04 (US2004181833) ; Variedad de soya XB007C04
(US2004181832) ; Variedad de soya 96M20 (US2004172702 ) ; Variedad de soya XB39J04 (US2004172701) ; Variedad de soya XB29A04 (US2004172700) ; Variedad de soya XB35P04
(US2004172699) ; Variedad de soya XB58Z04 (US2004177414) ; Variedad de soya XB43R04 (US2004172698) ; Variedad de soya XB35L04 (US2004172697) ; Variedad de soya XB06H04 (US2004172696) ; Variedad de soya XB59U04 (US2004172695) ; Variedad de soya XB64C04 (US2004172694) ; Variedad de soya
95M80 (US2004172693) ; Variedad de soya XB35Q04
(US2004177413) ; Variedad de soya XB04D04 (US2004177412) ; Variedad de soya XB08L04 (US2004177411) ; Variedad de soya XB18Q04 (US2004177410) ; Variedad de soya XB16Q04
(US2004177409) ; Variedad de soya XB55 04 (US2004172692) ; Variedad de soya XB57M04 (US2004172691) ; Variedad de soya XB25L04 (US2004205863) ; Variedad de soya XB48T04
(US2004194168) ; Variedad de soya XB42X04 (US2004199959) ; Variedad de soya XB31T04 (US2004177408) ; Variedad de soya XB31U04 (US2004194167) ; Variedad de soya XB30E04
(US2004177407) ; Variedad de soya XB31R04 (US2004177406) ; Variedad de soya S03-95341-A98-60618 (ÜS6909033); Variedad de soya SN97-6946 (US20041É18227) ; Variedad de soya 94 70 (US6864408) ; Variedad de soya 92M70 (US6797866) ; Variedad de soya 92M71 (US6858782); Variedad de soya 91M40 (US6828490) ; Variedad de soya 93M80 (US6849789) ; Variedad de soya XB39N03 (US6864407) ; Variedad de soya 93M90 (US6846975) ; Variedad de soya 90M90 (US6852913 ) ; Variedad de soya 92M72 (US6960708) ; Variedad de soya 91M90 (US6849788) ; Variedad de soya 92M50 (US6855876) ; Variedad de soya 92M30 (US6951974); Variedad de soya 93M60 (US6797865) ; Variedad de soya 93M40 (US6791016) ; Variedad de soya 93M41 (US6835875) ; Variedad de soya XB 15P03 (US6797864); Variedad de soya XB24H03 (US6936752); Variedad de soya XB05A03 (US6815585); Variedad de soya 92M80 (US6849787) ; Variedad de soya XB33S03 (US6855875) ; Variedad de soya XB48P03 (US6797863) ; Variedad de soya XB29X03 (US6806406) ; Variedad de soya XB02C03 (US6800795) ; Variedad de soya XB29W03 (US6858781) ; Variedad de soya 91M10 (US6958437) ; Variedad de soya 92M10 (US6916975) ; Variedad de soya XB 10G03 (US6806405) ; Variedad de soya 92M31 (US6846974); Variedad de soya XB38D03 (US6806404); Variedad de soya XB34N03 (US6803508) ; Variedad de soya XB30 03 (US6809236) ; Variedad de soya XB37J03 (US6844488) ,- Variedad de soya SE72581 (US2004148665) ; Variedad de soya SE90076 (US20041486S4) ; Variedad de soya SD82997 (US2004148663 ) ; Variedad de soya 0037393 (US2004148662) ; Variedad de soya 0088414 (US2004148661) ; Variedad de soya 0149926 (US2004148660) ; Variedad de soya 0037209 (US2004148659) ; Variedad de soya 93B36 (US6833498) ; Variedad de soya 90B74 (US6812384); Variedad de soya 90B51 (US6818809) ; Variedad de soya 91B03 (US6815584) ; Variedad de soya 95B43 (US6818808) ; Variedad de soya 95B42 (US6815583) ; Variedad de soya 92B47 (US6812383) ; Variedad de soya SE90346 (US2004055055) ; Variedad de soya 0007583 (US2004010824 ) ; Variedad de soya 0008079 (US2004010823) ; Variedad de soya S02-AP98041-2-333-01 (US2003121076) ; Variedad de soya S02-98041-2-251-01 (US2003182694) ; Variedad de soya S02-AP98041-2-262-02 (US2003196220) ; Variedad de soya S02-95021-55-240-BA (US2003188348) ; Variedad de soya APA94-31572 (US2003061641) ; Variedad de soya AP98041-1-203 (US2003056251) ; Variedad de soya APA95-15294 (US2003061640) ; Variedad de soya AP98041-4-117 (US2003056250) ; Variedad de soya 91B33 (US6580018) ; Variedad de soya 93B85 (US6605762) ; Variedad de soya 92B76 (US661091 1) ; Variedad de soya 92B38 (US6605761) ; Variedad de soya 94B24 (US6613967) ; Variedad de soya 94B73 (US6605760) ; Variedad de soya 93B86 (US6610910) ; Variedad de soya 91B12 (US6583343) ; Variedad de soya 95B34 (US6605759) ; Variedad de soya 94B23 (US6605758) ; Variedad de soya 90B11 (US6583342) ; Variedad de soya 91B92 (US6586659) ; Variedad de soya 95B96 (US6605757) ; Variedad de soya 93B72 (US6566589) ; Variedad de soya 95B97 (US6613966) ; Variedad de soya 92B95 (US6608243) ;
Variedad de soya 93B47 (US6583341) ; Variedad de soya 97B52 (US6605756) ; Variedad de soya 93B 15 (US6617499) ; Variedad de soya 94B54 (US6613965) ; Variedad de soya 93B67 (US6573433) ;
Variedad de soya 93B87 (US6727410) ; Variedad de soya 96B51 (US6613964) ; Variedad de soya 92B84 (US6730829) ; Variedad de soya 92B 12 (US6605755) ; Variedad de soya 90A07 (US6320105) ;
Variedad de soya 93B26 (US6342659) ; Variedad de soya 96B21 (US6369301) ; Variedad de soya 92B63 (US6326529) ; Variedad de soya 93B46 (US6323402) ; Variedad de soya 92B75 (US6362400) ; Variedad de soya 93B08 (US6323401) ; Variedad de soya 97B62
(US6323400) ; Variedad. de soya 92B37 (US6323399) ; Variedad de soya 92B56 (US6339186) ; Variedad de soya 93B66 (US6307131) ;
Variedad de soya 92B62 (US6346657) ; Variedad de soya 92B36
(US6369300) ; Variedad de soya 90B73 (US6316700) ; Variedad de soya 95B95 (US6323398) ; Variedad de soya 93B65 (US6229074) :
Variedad de soya 92B24 (US6284950) ; Variedad de soya 94B53
(US6235976) ; Variedad de soya 94B22 (US6140557) ; Variedad de soya 93B84 (US6143956) ; Variedad de soya 95B32 (US6229073) ;
Variedad de soya 95B53 (US6147283) ; Variedad de soya 93B35 (US6153816) ; Variedad de soya 93B07 (US6143955) ; Variedad de soya 92B74 (US6124526) ; Variedad de soya 92B35 (US6166296) ;
Variedad de soya 94B45 (US6162968) ; Variedad de soya 96B01
(US6143954) ; Variedad de soya 93B53 (US6335197) .
Se observó que la introgresión de los eventos élite, dentro de estos cultivares, no influye significativamente en ninguna de las características agronómicas o fenotípicas deseables de estos cultivares (sin retrasar en el rendimiento) , mientras que la expresión del transgen, como se determina por la tolerancia a glifosato y/o isoxaflutol o glufosinato, cumple los niveles, aceptables en el comercio.
Las estacas se pueden combinar además ventajosamente con uno o más eventos de soya disponibles en el mercado, que incluyen pero no se limitan a otros eventos de tolerancia a herbicida, tales como los eventos descritos en las peticiones USDA-APHIS : 09-349-01p, 09-201-01p, 09-183-01p, 09-082-01p, 09-015-Olp, 06-354-Olp, 06-271-01p, 06-178-01p, 98-238-01p, 98-014-01p, 97-008-01p, 96-068-01p, 95-335-01p, 93-258-01p, (ver, por ejemplo, www.aphis.usda.gov/brs/not_reg.html) o evento MON89788 (Tolerancia a glifosato) descrito en US 2006-282915, evento DP-305423-1 (Tolerancia alta al inhibidor ALS / ácido oleico) descrito en W0 2008/054747, MON87701 descrito en US2009130071, evento 3560.4.3.5 descrito en US2009036308 , o evento DP-305423-1 descrito en US2008312082 , o evento BPS-CV127-9 (Evento 127) de WO 2010/080829.
Como se usa en las reivindicaciones a continuación, a menos que se indique claramente lo contrario, el término "planta" se entiende que incluye tejidos de las plantas, en cualquier fase de maduración, así como cualquiera de las células, tejidos u órganos tomados de o derivados de cualquiera planta de ese tipo, incluyendo sin limitación, cualquiera de semillas, hojas, tallos, flores, raíces, células individuales, gametos, cultivos de células, cultivos de tejidos o protoplastos.
La semilla de referencia que comprende el evento élite EE-GM3 se depositó como 32-RRMM-0531 en el NCIMB (Edificio Ferguson, Estado Craibstone, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Escocia) el 12 de Octubre de 2009, con el número de acceso NCIMB 41659 en el NCIMB, y se confirmó la viabilidad de esta. Un nombre alternativo para EE-GM3 es evento FG-072 ó MST-FG072-3.
La semilla de referencia que comprende el evento élite EE-GM1 se depositó como 32RRMM0368 en el NCIMB (Edificio Ferguson, Estado Craibstone, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Escocia) el 12 de octubre de 2009, con el número de acceso NCIMB 41658 en el NCIMB. Un nombre alternativo para EE-GM1 es LL27, A2704-12, o ACS-GM005-3.
La semilla de referencia que comprende el evento élite
EE-GM2 se depositó como 32CON0688 en el NCIMB (Edificio Ferguson, Estado Craibstone, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Escocia Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB9YA, Escocia) el 12 de octubre de 2009, con el número de acceso NCIMB 41660 en el NCIMB. Un nombre alternativo para EE-GM2 es LL55, A5547-127, o ACS-GM006-4.
La semilla de referencia que comprende el evento élite EE-GM3 y EE-GMl se depositó como soya 111606 en la ATCC (Colección americana de cultivos tipo, 10801 Universidad Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, Estados Unidos) el 11 de junio de 2010, con el número de acceso de la ATCC PTA-11041.
La semilla de referencia que comprende el evento élite EE-GM3 y EE-GM2 se depositó como Soya 05SHX2XEB en la ATCC (Colección americana de cultivos tipo, 10801 Universidad Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, Estados Unidos) el 11 de junio de 2010, con el número de acceso de la ATCC PTA-11042.
Se pretende que la descripción anterior de la invención sea ilustrativa y no limitativa.
Pueden ocurrir diversos cambios o modificaciones en las modalidades descritas por aquellos expertos en la técnica. Estas se pueden preparar sin apartarse del espíritu o alcance de la invención.
Claims (82)
1. Un método para identificar la presencia simultánea de los eventos élite EE-GM3 y EE- GM1 en muestras biológicas, el método comprende detectar una región EE-G 3 específica con un cebador o sonda específica que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 y detectar una región EE-GM1 específica con un cebador o sonda específica que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE- GM1.
2. El método de la reivindicación 1, dicho método comprende amplificar dos fragmentos de ADN de entre 50 y 1000 bp de un ácido nucleico presente en dichas muestras biológicas usando una primera reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de dichos cebadores que reconoce la región de flanqueo 5' del ADN foráneo comprende genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o la región de flanqueo 3' del ADN foráneo comprende genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 , dicha región de flanqueo 3 ' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM3 comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM3 comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 o su complementaria, o comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16638 o su complementaria, y usando una segunda reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de dichos cebadores que reconoce la región de flanqueo 5' del ADN foráneo que comprende genes de tolerancia a herbicida en EE-GM1, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :12 del nucleótido 1 al nucleótido 209 o la región de flanqueo 3' del ADN foráneo comprende genes de tolerancia a herbicida en EE-GM1, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 569 al nucleótido 1000, el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM1 comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident . : 12 del nucleótido 210 al nucleótido 720 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 13 del nucleótido 1 al nucleótido 568 o el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM1 comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :11o su complementaria, donde dicha primera y segunda reacción de la polimerasa puede ser secuencial o simultánea.
3. El método de la reivindicación 2, en donde dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 5 ' de EE-GM3 comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE-GM3 comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de iden .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM3 comprende 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 o su complementaria, o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16638 o su complementaria, y donde dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 5' de EE-GMl comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 12 del nucleótido 1 al nucleótido 209 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3 ' de EE-GM3 comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident. : 13 del nucleótido 569 al nucleótido 1000, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GMl comprende 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident.: 12 del nucleótido 210 al nucleótido 720 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 13 del nucleótido 1 al nucleótido 568 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll o su complementaria.
4. El método de la reivindicación 2, en donde dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 5' de EE-G 3 comprende en su extremo 3 ' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3 ' de EE-GM3 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM3 comprende en su extremo 3 ' al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec con núm. de ident. :3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 o su complemento, o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16638 o su complementaria, y donde dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 5' de EE-GM1 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:12 del nucleótido 1 al nucleótido 209 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE-GM1 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 569 al nucleótido 1000, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM1 comprende en su extremo 3' al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident . : 12 del nucleótido 210 al nucleótido 720 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 13 del nucleótido 1 al nucleótido 568 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 11 o su complementaria.
5. El método de la reivindicación 4, en donde dichos cebadores específicos a EE-GM3 comprenden la secuencia de sec. con núm. de ident . : .5 y sec. con núm. de ident. :4, respectivamente, o la secuencia de sec. con núm. de ident .: 5 y sec. con núm. de ident.: 7, respectivamente, y dichos cebadores específicos a EE-GM1 comprenden la secuencia de sec. con núm. de ident.: 16 y sec. con núm. de ident.: 17, respectivamente .
6. El método de la reivindicación 5, el método comprende amplificar un fragmento específico a EE-GM3 de aproximadamente 263 o aproximadamente 706 bp usando el protocolo de identificación de PCR EE-GM3 y un fragmento específico a EE-GMl de aproximadamente 183 bp.
7. Un kit para identificar la presencia simultánea del evento élite EE-GM3 y evento élite EE-GMl en muestras biológicas, dicho kit comprende un cebador que reconoce la región de flanqueo 5' de ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 , dicha región de flanqueo 5 'comprende la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o un cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3, dicha región de flanqueo 3 'comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident.:3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y un cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia herbicida en EE-GM3, dicho ADN foráneo comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident . : 1 o su complementaria, o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16S38 o su complementaria, y en donde dicho kit comprende además un cebador que reconoce la región de flanqueo 5 'del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM1, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 12 del nucleótido 1 al nucleótido 209 o un cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM1, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident.: 13 del nucleótido 569 al nucleótido 1000, y un cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM1, dicho ADN foráneo comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident.: 12 del nucleótido 210 al nucleótido 720 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :13 del nucleótido 1 al nucleótido 568 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 11 o su complementaria.
8. El kit de la reivindicación 7, en donde dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 5' de EE-GM3 comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE-GM3 comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec . con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM3 comprende 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 o su complementaria o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16638 o su complementaria, y en donde dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 5' de EE-GM1 comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 12 del nucleótido 1 al nucleótido 209 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE-GM1 comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 569 al nucleótido 1000, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GMl comprende 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident.:12 del nucleótido 210 al nucleótido 720 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 1 al nucleótido 568 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll o su complementaria .
9. El kit de la reivindicación 7, en donde dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 5 ' de EE-GM3 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 3' de EE-GM3 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de la sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro de dicho ADN foráneo de EE-GM3 comprende en su extremo 3 'al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec . con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 o su complementaria, o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16638 o su complementaria, y en donde, dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 5 'de EE-GMl comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al . menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :12 del nucleótido 1 al nucleótido 209 o dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 3 ' de EE- GM1 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos del complemento de sec. con núm. de ident.: 13 del nucleótido 569 al nucleótido 1000, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro de dicho ADN foráneo de EE-GMl comprende en su extremo 3' al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident.: 12 del nucleótido 210 al nucleótido 720 o la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident .: 13 del nucleótido 1 al nucleótido 568 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 11 o su complementaria.
10. El kit de la reivindicación 7, que comprende un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.: 4 y un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident .: 5 o que comprende un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident. :5 y un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.: 7 y que comprende además un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.: 16 y un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.: 17.
11. Un par de cebadores, dicho primer cebador comprende, una secuencia que, bajo condiciones de detección optimizadas reconoce específicamente una secuencia dentro de la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 , dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 y dicha región de flanqueo 3' que comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y dicho segundo cebador comprende una secuencia que, bajo condiciones de detección optimizadas reconoce específicamente una secuencia dentro de la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM1, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:12 del nucleótido 1 al nucleótido 209 y dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 569 al nucleótido 1000.
12. El par de cebadores de la reivindicación 11, en donde dicho primer cebador comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408 y en donde dicho segundo cebador comprende . una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :12 del nucleótido 1 al nucleótido 209 o una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident.: 13 del nucleótido 569 al nucleótido 1000.
13. El par de cebadores de la reivindicación 11, en donde dicho primer cebador comprende en su extremo 3 ' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408 y en donde dicho segundo cebador comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 12 del nucleótido 1 al nucleótido 209 o una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident.: 13 del nucleótido 569 al nucleótido 1000.
14. Un par de cebadores en donde el primer cebador comprende en su extremo 3' terminal la secuencia de sec. con núm. de ident. : 5 y en donde el segundo cebador comprende en su extremo 3' terminal la secuencia de sec. con núm. de ident . : 16.
15. Un conjunto que comprende cuatro cebadores, un primer cebador que comprende en su extremo 3/ terminal la secuencia de sec . con núm. de ident.: 5; un segundo cebador que comprende en su extremo 3' terminal la secuencia de sec. con núm. de ident. :4; un tercer cebador que comprende en su extremo 3 'terminal la secuencia de sec. con núm. de ident . : 16; y un cuarto cebador que comprende en su extremo 3 ' terminal la secuencia de sec. con núm. de ident. :17.
16. El método de la reivindicación 1, el método comprende hibridar un ácido nucleico de muestras biológicas con una primera sonda específica para EE-GM3 y con una segunda sonda específica para EE- GM1.
17. El método de la reivindicación 16, en donde la secuencia de dicha primera sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuenci'a con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' de EE-GM3 y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta y en donde la secuencia de dicha segunda sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' de EE-GM1 y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta.
18. El método de la reivindicación 17, en donde la secuencia de dicha primera sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:2 del nucleótido 1431 al 1472 o sec. con núm. de ident.:3 del nucleótido 220 al 261, o la complementaria de dichas secuencias y en donde la secuencia de dicha segunda sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec. con nüm. de ident.:12 del nucleótido 199 al 220 o sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 558 al 579, o la complementaria de dichas secuencias.
19. Un kit para identificar la presencia simultánea del evento élite EE-GM3 y evento élite EE- GM1 en muestras biológicas, dicho kit que comprende una primera sonda específica, capaz de hibridar específicamente con una región específica de EE-GM3 y una segunda sonda específica capaz de hibridar específicamente con una región específica de EE-GMl.
20. El kit de la reivindicación 19, en donde la secuencia de dicha primera sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta y en donde la secuencia de dicha segunda sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GMl y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta.
21. El kit de la reivindicación 20, en donde la secuencia de dicha primera sonda específica comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1441 al 1462 o la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 230 al 251, o la complementaria de dichas secuencias y en donde la secuencia de dicha segunda sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident. -.12 del nucleótido 199 al 220 o la sec. con núm. de ident. :13 del nucleótido 558 al 579, o la complementaria de dichas secuencias .
22. Un par de sondas específicas para la identificación de la presencia simultánea del evento élite EE-GM3 y el evento élite EE-GMl en muestras biológicas.
23. El par de sondas de la reivindicación 22, que comprende una primera sonda que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta, o la complementaria de esta y una segunda sonda que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM1 y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta, o la complementaria de esta.
24. El par de sondas de la reivindicación 23, en donde dicha primera sonda tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1441 al 1462 o sec . con núm. de ident .: 3 del nucleótido 230 al 251, o la complementaria de dichas secuencias, y en donde dicha segunda sonda tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident. : 12 del nucleótido 199 al 220 o la sec. con núm. de ident. : 13 del nucleótido 558 al 579, o la complementaria de dichas secuencias.
25. Un conjunto de sondas específicas para la identificación de la presencia simultánea del evento élite EE-GM3 y EE-GM1 en muestras biológicas, que comprende una primera sonda con una secuencia que comprende una secuencia de nucleótidos que sea esencialmente similar a la sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1441 al 1462 o sec. con núm. de ident .-.3 del nucleótido 230 al 251, o la complementaria de dichas secuencias y una segunda sonda con una secuencia de nucleótidos que sea esencialmente similar a la sec. con núm. de ident .: 12 del nucleótido 199 al 220 o sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 558 al 579, o la complementaria de dichas secuencias.
26. Un método para confirmar la pureza de la semilla, el método comprende la detección de una región específica a EE-GM3 con un cebador o sonda específica que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3, y la detección de una región específica a EE-GMl con un cebador o sonda específica que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GMl, en las muestras de semillas.
27. Un método para seleccionar semillas para la presencia de los eventos élites EE-GM3 y EE-GMl, el método comprende la detección de una región específica a EE-GM3 con un cebador o sonda. específica que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 y la detección de una región específica a EE-GMl con un cebador o sonda específica que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GMl, en muestras de lotes de semilla.
28. Un método para detectar la presencia de los eventos élites EE-GM3 y EE-GMl en muestras biológicas a través de la hibridación con una sonda de ácido nucleico sustancialmente marcada complementaria en la que la relación sonda: ácido nucleico objetivo se amplifica a través del reciclaje de la secuencia de ácido nucleico objetivo, dicho método comprende: a) hibridar dicha secuencia de ácido nucleico objetivo con un primer oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleotido 1452 al nucleotido 1469 o su complementaria o dicho primer oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleotido 223 al nucleotido 240 o su complementaria; b) hibridar dicha secuencia de ácido nucleico objetivo con un segundo oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleotido 1434 al nucleotido 1451 o su complementaria o dicha sonda de ácido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 258 o su complementaria, donde dicho primer y segundo oligonucleótido se solapan en al menos un nucleotido y en donde ya sea dicho primer o segundo oligonucleótido se marca para ser dicha sonda de ácido nucleico marcada; c) escindir solo la sonda marcada dentro de la secuencia dúplex de ácido nucleico obj etivo : sonda con una enzima que causa la escisión selectiva de la sonda lo que resulta en la disociación del dúplex, dejando la secuencia objetivo intacta; d) reciclar la secuencia de ácido nucleico objetivo repitiendo las etapas (a) a (c) ; y e) detectar la sonda marcada escindida, y determinar de ese modo la presencia de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo; y f) hibridar dicha secuencia de ácido nucleico objetivo con un tercer oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:12 del nucleótido 210 al nucleótido 227 p su complementaria o dicho tercer oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 561 al nucleótido 568 o su complementaria; g) hibridar dicha secuencia de ácido nucleico objetivo con un cuarto oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:12 del nucleótido 192 al nucleótido 209 o su complementaria o dicha sonda de ácido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 569 al nucleótido 586 o su complementaria, donde dicho tercer y cuarto oligonucleótido se solapan en al menos un nucleótido y en donde dicho tercer o dicho cuarto oligonucleótido se marcan para ser dicha sonda de ácido nucleico marcada; h) escindir sólo la sonda marcada dentro de la secuencia dúplex de ácido nucleico obj etivo : sonda con una enzima que causa la escisión selectiva de la sonda lo que resulta en la disociación del dúplex, dejando la secuencia objetivo intacta; i) reciclar la secuencia de ácido nucleico objetivo repitiendo las etapas (f ) a (h) ; y j) detectar la sonda marcada escindida, y determinar de ese modo la presencia de dicha secuencia de ácido nucleico obj etivo .
29. Una planta de soya transgénica, o células, partes, tejido, semilla o progenie de esta, cada una que comprende el evento élite EE-GM3 y evento élite EE-GM1 en su genoma, la semilla de referencia que comprende dicho evento EE-GM3 que se depositó en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41659 y la semilla de referencia que comprende dicho evento EE-GM1 que se depositó en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41658, o la semilla de referencia que comprende el evento élite EE-GM3 y el evento élite EE-GM1 en su genoma que se depositó en la ATCC con el número de depósito PTA-11041.
30. La planta de soya transgénica, semilla, célula, tejido, partes o progenie de la reivindicación 29, cuyo ADN genómico, cuando se analiza usando el protocolo de identificación del evento élite para EE-GM3 con dos cebadores que comprenden la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:4 y sec. con núm. de ident . : 5 respectivamente, produce un fragmento de ADN de aproximadamente 263 bp y cuyo ADN genómico, cuando se analiza usando el protocolo de identificación del evento élite para EE-GM1 con dos cebadores que comprenden la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 16 y sec. con núm. de ident.: 17 respectivamente, produce un fragmento de ADN de aproximadamente 183 bp.
31. Una planta de soya, parte de la planta, o semilla, célula o tejido de esta, cada una que comprende el evento élite EE- GM3 y el evento élite EE-GM1 en su genoraa, dicha planta de soya se obtiene por cruzamiento de una planta de soya que comprende el evento élite EE-G 3 obtenible por propagación de y/o cultivo con una planta de soya cultivada de la semilla depositada en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41659 con una planta de soya que comprende el evento élite EE-GM1 en su genoma, obtenible por propagación de y/o cultivo con una planta de soya cultivada de la semilla depositada en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41658, o dicha planta de soya estando obtenible por propagación de y/o cultivo con una planta de soya cultivada de la semilla depositada en la ATCC con el número de acceso PTA-11041.
32. Una semilla de soya que comprende los eventos élites EE-GM3 y EE-GMl , la semilla de referencia que comprende el evento EE-GM3 habiendo sido depositada en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41659, la semilla de referencia que comprende el evento EE-GMl que se depositó en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41658, y la semilla de referencia que comprende los eventos EE-GM3 y EE-GMl que se depositó en la ATCC con el número de depósito PTA-11041.
33. Una planta de soya transgénica, parte de la planta, célula o tejido, que comprende los eventos élites EE-GM3 y EE-GMl, obtenibles de la semilla de la reivindicación 32.
34. Un método para la producción de una planta de soya o semilla que comprende el evento élite EE-GM3 y EE- GM1 que comprende cruzar una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 con otra planta de soya, y plantar la semilla obtenida de dicho cruce.
35. ADN genómico de la soya que comprende el evento élite EE-GM3 y EE-GMl.
36. Un par de moléculas de ácido nucleico aisladas, la primera comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente similar a la sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1441 al nucleótido 1452 o sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 230 al 251, o las complementarias de dichas secuencias y la segunda comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente similar a la sec. con núm. de ident.:12 del nucleotido 199 al nucleotido 220 o la sec. con núm. de ident.:13 del nucleotido 558 al 579, o las complementarias de dichas secuencias
37. El par de moléculas de ácido nucleico aisladas de la reivindicación 36, la primera comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente similar a la sec. con núm. de ident . : 2 del nucleotido 1431 al nucleotido 1462 o sec. con núm. de ident .: 3 del nucleotido 220 al 261, o las complementarias de dichas secuencias y la segunda comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente similar a la sec. con núm. de ident .: 12 del nucleotido 189 al nucleotido 230 o la sec. con núm. de ident. : 13 del nucleótido 548 al 589, o las complementarias de dichas secuencias
38. Una planta de soya, que comprende en su genoma en orden las siguientes secuencias de nucleótidos: a) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 2 del nucleótido 1 al 1451; b) la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :1 del nucleótido 6760 al nucleótido 6958; c) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 del nucleótido 6874 al nucleótido 7298; d) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 del nucleótido 7 al nucleótido 7291; e) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 1 del nucleotido 12 al nucleotido 7265; f) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleotido 217 al nucleotido 240; y g) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408: y que comprende además en orden las siguientes secuencias: h) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 12 del nucleotido 1 al 209; i) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 11 del nucleotido 340 al nucleotido 3461; j ) la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 11 del nucleotido 1 al nucleotido 336; k) la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 11 del nucleotido 3462 al nucleotido 4076; 1) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 11 del nucleotido 337 al nucleotido 3043; m) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 13 del nucleotido 559 al nucleotido 568; y n) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 13 del nucleotido 569 al nucleotido 1000.
39. Una molécula de ADN que comprende las siguientes secuencias de nucleótidos en orden: a) la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:2 del nucleotido 1 al 1451 ; b) la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 1 del nucleotido 6760 al nucleotido 6958; c) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :1 del nucleotido 6874 al nucleotido 7298; d) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :1 del nucleotido 7 al nucleotido 7291; e) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 del nucleotido 12 al nucleotido 7265; f) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleotido 217 al nucleotido 240; g) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleotido 241 al nucleotido 1408; y que comprende además las siguientes secuencias en orden: h) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 12 del nucleotido 1 al 209; i) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 11 del nucleotido 340 al nucleotido 3461; j) la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll del nucleótido 1 al nucleótido 336; k) la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll del nucleótido 3462 al nucleótido 4076; 1) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll del nucleótido 337 al nucleótido 3043; m) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 559 al nucleótido 568; y n) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:13 del nucleótido 569 al nucleótido 1000.
40. Un método para identificar la presencia simultánea de los eventos élites EE-GM3 y EE-GM2 en muestras biológicas, cuyo método comprende la detección de una región específica de EE-GM3 con un cebador o sonda específica que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia herbicida en EE-GM3 y la detección de una región específica a EE- GM2 con un cebador o sonda específica que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende genes de tolerancia herbicida en EE-GM2.
41. El método de la reivindicación 40, dicho método comprende amplificar dos fragmentos de ADN de entre 50 y 1000 bp a partir de un ácido nucleico presente en dichas muestras biológicas usando una primera reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de dichos cebadores que reconoce la región de flanqueo 5' del ADN foráneo comprende genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o la región de flanqueo 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos la complementaria de la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM3 comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM3 comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 o su complementaria, o comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 20 de la posición de nucleótido 1452 a la posición de nucleótido 16638 o su complementaria, y usando una segunda reacción en cadena de la polimerasa con al menos dos cebadores, uno de dichos cebadores que reconoce la región de flanqueo 5' del ADN foráneo comprende genes de tolerancia a herbicida en EE-GM2, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:14 del nucleótido 1 al nucleótido 311 o la región de flanqueo 3' del ADN foráneo comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-G 2, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident.:15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880, el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM2 comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident.:14 del nucleótido 312 al nucleótido 810 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:15 del nucleótido 1 al nucleótido 507 o el otro cebador de dichos cebadores que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM2 comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll o su complementaria, por lo cual dicha primera y segunda reacción de la polimerasa puede ser se.cuencial o simultáne .
42. El método de la reivindicación 41, donde dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 5' de EE-GM3 comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE-GM3 comprende una secuencia de nucleotidos de 17 a 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de la complementaria a la sec . con núm. de ident . : 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM3 comprende 17 a 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident .: 1 o su complementaria, o la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición de nucleótido 1452 a la posición de nucleótido 16638 o su complementaria, y dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 5' de EE-GM2 comprende una secuencia de nucleotidos de 17 a 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident .: 14 del nucleótido 1 al nucleótido 311 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE-GM3 comprende una secuencia de nucleotidos de 17 a 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident. : 15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM2 comprende 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia" de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident.:14 del nucleótido 312 al nucleótido 810 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:15 del nucleótido 1 al nucleótido 507 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll o su complementaria .
43. El método de la reivindicación 41, en donde dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 5' de EE-GM3 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE-GM3 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM3 comprende en su terminal 3' al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 1 o su complementaria, o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16638 o su complementaria, y en donde dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 5' de EE-GM2 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 14 del nucleótido 1 al nucleótido 311 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE- GM2 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident.: 15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM2 comprende en su terminal 3' al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de · la complementaria a la sec. con núm. de ident .: 14 del nucleótido 312 al nucleótido 810 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 15 del nucleótido 1 al nucleótido 507 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 11 o su complementaria .
44. El método de la reivindicación 43, en donde dichos cebadores específicos a EE-GM3 comprenden la secuencia de sec . con núm. de ident.:5 y sec. con núm. de ident . : 4 , respectivamente, o la secuencia de sec. con núm. de ident .: 7 y sec. con núm. de ident .: 5 respectivamente, y dichos cebadores específicos a EE-GM2 comprenden la secuencia de sec. con núm. de ident. :18 y sec. con núm. de ident. :19 respectivamente .
45. El método de la reivindicación 44, el método comprende amplificar un fragmento EE-GM3 específico de aproximadamente 263 ó 706 bp usando el protocolo de identificación de PCR de EE-GM3 y un fragmento específico a EE-G 2 de aproximadamente 151 bp.
46. Un kit para identificar la presencia simultánea del evento élite EE-GM3 y el evento élite EE- GM2 en muestras biológicas, dicho kit comprende un cebador que reconoce la región de flanqueo 5' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-G 3, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o un cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident.:3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y un cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-G 3, dicho ADN foráneo comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 o su complementaria, o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16638 o su complementaria, y en donde dicho kit comprende además un cebador que reconoce la región de flanqueo 5' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM2, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 14 del nucleótido 1 al nucleótido 311 o un cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM2, dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria de la sec. con núm. de ident. :15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880, y un cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM2, dicho ADN foráneo comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident.:14 del nucleótido 312 al nucleótido 810 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :15 del nucleótido 1 al nucleótido 507 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:ll o su complementaria.
47. El kit de la reivindicación 46, en donde dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 5' de EE-GM3 comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE-GM3 comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM3 comprende 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 o su complementaria, o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición de nucleótido 1452 a la posición de nucleótido 16638 o su complementaria, y en donde dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 5' de EE-GM2 comprende una secuencia de nucleotidos de 17 a 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de sec . con núm. de ident.:14 del nucleótido 1 al nucleótido 311 o dicho cebador que reconoce la región de flanqueo 3' de EE-GM2 comprende una secuencia de nucleotidos de 17 a 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident.:15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro del ADN foráneo de EE-GM2 comprende de 17 a 200 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident . : 14 del nucleótido 312 al nucleótido 810 o la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident. :15 del nucleótido 1 al nucleótido 507 o la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident.: 11 o su complementaria .
48. El kit de la reivindicación 46, en donde dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 5' de EE-GM3 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleotidos de al menos 17 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleotidos de sec. con núm. de ident.: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 3' de EE-GM3 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro de dicho ADN foráneo de EE-GM3 comprende en su terminal 3' al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1452 al nucleótido 1843 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 1 al nucleótido 240 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 o su complementaria, o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición del nucleótido 1452 a la posición del nucleótido 16638 o su complementaria, y en donde, dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 5' de EE-GM2 comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 14 del nucleótido 1 al nucleótido 311 o dicho cebador que reconoce dicha región de flanqueo 3' de EE-GM2 comprende en su terminal 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec . con núm. de ident.:15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880, y dicho cebador que reconoce una secuencia dentro de dicho ADN foráneo de EE-GM2 comprende en su terminal 3' al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident . : 14 del nucleótido 312 al nucleótido 810 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :15 del nucleótido 1 al nucleótido 507 o la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 11 o su complementaria .
49. El kit de la reivindicación 46, que comprende un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident .: 4 y un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident . : 5 o que comprende un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident .: 5 y un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident. :7 y que comprende además un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.: 18 y un cebador que comprende la secuencia de sec. con núm. de ident.: 19.
50. Un par de cebadores adecuados para usar en una detección específica de EE-GM3 y EE-GM2, dicho primer cebador comprende una secuencia que, bajo condiciones de detección optimizadas reconoce específicamente una secuencia dentro de la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 y dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408 y dicho segundo cebador comprende una secuencia que, bajo condiciones de detección optimizadas reconoce específicamente una secuencia dentro de la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM2, dicha región de flanqueo 5' comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :14 del nucleótido 1 al nucleótido 311 y dicha región de flanqueo 3' comprende la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident. : 15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880.
51. El par de cebadores de la reivindicación 50, en donde dicho primer cebador comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408 y donde dicho segundo cebador comprende una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec . con nüm. de ident . : 14 del nucleótido 1 al nucleótido 311 o una secuencia de nucleótidos de 17 a 200 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident.: 15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880.
52. El par de cebadores de la reivindicación 50, en donde dicho primer cebador comprende en su extremo 3' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1 al nucleótido 1451 o una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408 y en donde dicho segundo cebador comprende en su extremo 3 ' terminal una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 14 del nucleótido 1 al nucleótido 311 o una secuencia de nucleótidos de al menos 17 nucleótidos consecutivos seleccionados de la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la sec. con núm. de ident.: 15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880.
53. Un par cebador en donde el primer cebador comprende en su extremo 3' terminal la secuencia de sec. con núm. de ident . : 5 y en donde el segundo cebador comprende en su extremo 3' terminal la secuencia de sec. con núm. de ident . : 18.
54. Un juego que comprende cuatro cebadores, un primer cebador que comprende en su extremo 3 ' terminal la secuencia de sec. con núm. de ident . : 5 ; un segundo cebador que comprende en su extremo 3 ' terminal la secuencia de sec. con núm. de ident. :4; un tercer cebador que comprende en su extremo 3 ' terminal la secuencia de sec. con núm. de ident.: 18; y un cuarto cebador que comprende en su extremo. 3' terminal la secuencia de sec. con núm. de ident.: 19.
55. El método de la reivindicación 40, el método comprende hibridar un ácido nucleico de las muestras biológicas con una primera sonda específica para EE-GM3 y con una segunda sonda específica para EE-GM2.
56. El método de la reivindicación 55, en donde la secuencia de dicha primera sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' de EE-GM3 y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta y en donde la secuencia de dicha segunda sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' de EE-GM2 y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta.
57. El método de la reivindicación 56, en donde la secuencia de dicha primera sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1431 al 1472 o la sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 220 al 261, o la complementaria de dichas secuencias y en donde la secuencia de dicha segunda sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident. : 14 del nucleótido 301 al 322 o la sec. con núm. de ident. : 15 del nucleótido 497 al 518, o la complementaria de dichas secuencias.
58. Un kit para identificar la presencia simultánea del evento élite EE-GM3 y el evento élite EE- GM2 en muestras biológicas, dicho kit comprende una primera sonda específica, capaz de hibridar específicamente una región específica de EE-GM3 y una segunda sonda específica capaz de hibridar específicamente una región específica de EE-GM2.
59. El kit de la reivindicación 58, donde la secuencia de dicha primera sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta y en donde la secuencia de dicha segunda sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM2 y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta.
60. El kit de la reivindicación 59, donde la secuencia de dicha primera sonda específica comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec . con núm. de ident.:2 del nucleótido 1441 al 1462 o sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 230 al 251, o la complementaria de dichas secuencias y en donde la secuencia de dicha segunda sonda específica tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 14 del nucleótido 301 al 322 o sec. con núm. de ident. :15 del nucleótido 497 al 518, o la complementaria de dichas secuencias.
61. Un par de sondas específicas para la identificación de la presencia simultánea en muestras biológicas del evento élite EE-GM3 y el evento élite EE-GM2.
62. El par de sondas de la reivindicación 61, que comprende una primera sonda que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-G 3 y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta, o la complementaria de esta, y una segunda sonda que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia que comprende parte de la secuencia de flanqueo 5' o la secuencia de flanqueo 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-G 2 y la secuencia del ADN foráneo contigua a esta, o la complementaria de esta.
63. El par de sondas de la reivindicación 62 donde dicha primera sonda tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1441 al 1462 o sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 230 al 251, o la complementaria de dichas secuencias y en donde dicha segunda sonda tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 14 del nucleótido 301 al 322 o sec. con núm. de ident. : 15 del nucleótido 497 al 518, o la complementaria de dichas secuencias.
64. Un conjunto de sondas específicas para la identificación de la presencia simultánea en muestras biológicas del evento élite EE-GM3 y EE-GM2, que comprende una primera sonda con una secuencia que comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente similar a la sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1441 al 1462 o sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 230 al 251, o la complementaria de dichas secuencias, y una segunda sonda con una secuencia de nucleótidos esencialmente similar a la sec. con núm. de ident.: 14 del nucleótido 301 al 322 o sec. con núm. de ident .: 15 del nucleótido 497 al 518, o la complementaria de dichas secuencias .
65. Un método para confirmar la pureza de la semilla, cuyo método comprende la detección de una región específica de EE-GM3 con un cebador específico o sonda que reconoce específicamente la región de flanqueo 5'ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3, y la detección de una región específica de EE-GM2 con un cebador específico o sonda que reconoce específicamente la región de flanqueo 5'ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM2, en las muestras de semilla .
66. Un método para clasificar las semillas para la presencia de EE-GM3, el método comprende la detección de una región específica dé EE-GM3 con un cebador específico o sonda que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que 'comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM3 y la detección de una región específica de EE-GM2 con un cebador específico o sonda que reconoce específicamente la región de flanqueo 5' ó 3' del ADN foráneo que comprende los genes de tolerancia a herbicida en EE-GM2, en muestras de lotes de semilla.
67. Un método para detectar la presencia de evento élites EE-G 3 y EE-GM2 en muestras biológicas a través de la hibridación con una sonda de ácido nucleico marcada sustancialmente complementaria en la cual la proporción sonda: ácido nucleico objetivo se amplifica a través del reciclaje de la secuencia de ácido nucleico objetivo, dicho método que comprende: a) hibridar dicha secuencia de ácido nucleico objetivo con un primer oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:2 del 'nucleótido 1452 al nucleótido 1469 o su complementaria o dicho primer oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 223 al nucleótido 240 o su complementaria; b) hibridar dicha secuencia de ácido nucleico objetivo con un segundo oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1434 al nucleótido 1451 o su complementaria o dicha sonda de ácido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 258 o su complementaria, donde dicho primer y segundo oligonucleótido se superponen en al menos un nucleótido y en donde ya sea dicho primer o dicho segundo oligonucleótidos se marcan para ser dicha sonda de ácido nucleico marcada; c) escindir sólo la sonda marcada dentro de la secuencia dúplex de sonda ¡ácido nucleico objetivo con una enzima que provoca la escisión selectiva de la sonda lo que resulta en disociación del dúplex, dejando la secuencia objetivo intacta; d) reciclar la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante la repetición de las etapas (a) a (c) ; y e) detectar la sonda marcada escindida, y determinar por lo tanto la presencia de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo, y f) hibridar dicha secuencia de ácido nucleico objetivo con un tercer oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 14 del nucleótido 312 al nucleótido 329 o su complementaria o dicho tercer oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 15 del nucleótido 490 al nucleótido 507 o su complementaria; g) hibridar dicha secuencia de ácido nucleico objetivo con un cuarto oligonucleótido de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 14 del nucleótido 294 al nucleótido 311 o su complementaria o dicha sonda de ácido nucleico marcada que comprende la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 15 del nucleótido 508 al nucleótido 525 o su complementaria, donde dicho tercer y cuarto oligonucleótido se superponen en al menos un nucleótido y en donde ya sea dicho tercer o dicho cuarto oligonucleótido se marcan para ser dicha sonda de ácido nucleico marcada; h) escindir sólo la sonda marcada dentro de la secuencia dúplex de sonda: cido nucleico objetivo con una enzima que provoca la escisión selectiva de la sonda lo que resulta en disociación del dúplex, dejando la secuencia objetivo intacta; i) reciclar la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante la repetición de las etapas (f) a (h) ; y j) detectar la sonda marcada escindida, y determinar por lo tanto la presencia de dicha secuencia de ácido nucleico objetivo.
68. Una planta de soya transgénica, o células, partes, semilla o progenie de esta, cada una comprende el evento élite EE-GM3 y el evento élite EE-GM2 en su genoma, la semilla de referencia que comprende dicho evento EE-GM3 se depositó en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41659 y la semilla de referencia que comprende dicho evento EE-GM2 se depositó en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41660, o la semilla de referencia que comprende evento élite EE-GM3 y el evento élite EE-GM2 en su genoma se depositó en la ATCC con el número de depósito PTA-11042.
69. La planta de soya transgénica, semilla, células, partes o progenie de la reivindicación 68, cuyo ADN genómico, cuando se analiza usando el protocolo de identificación del evento élite para EE-GM3 con dos cebadores que comprenden la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:4 y sec . con núm. de ident.:5 respectivamente, produce un fragmento de ADN de aproximadamente 263 bp y cuyo ADN genómico, cuando se analiza usando el protocolo de identificación del evento élite para EE-GM2 con dos cebadores que comprenden la secuencia de nucleótidos de sec. con 'núm. de ident.:18 y sec. con núm. de ident.:19 respectivamente, produce un fragmento de ADN de aproximadamente 151 bp.
70. Una planta de soya, o semilla, células o tejidos de esta, cada uno comprende el evento élite EE-GM3 y el evento élite EE-GM2 en su genoma, dicha planta de soya se obtiene por cruzamiento de una planta de soya que comprende el evento élite EE-GM3 en su genoma, obtenible por propagación de y/o cultivo con una planta de soya cultivada a partir de la semilla depositada en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41659 con una planta de soya que comprende el evento élite EE-GM2 en su genoma, obtenible por propagación de y/o cultivo con una planta de soya cultivada a partir de la semilla depositada en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41660, o dicha planta de soya obtenible por propagación de y/o cultivo con una planta de soya cultivada a partir de la semilla depositada en la ATCC con el número de acceso PTA-11042.
71. Una semilla de soya que comprende los eventos élite EE-GM3 y EE-GM2, la semilla de referencia que comprende el evento EE-GM3 que se depositó en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41659, la semilla de referencia que comprende el evento EE-GM2 que se depositó en el NCIMB con el número de depósito NCIMB 41660, y la semilla de referencia que comprende los eventos EE-GM3 y EE-GM2 que se depositó en la ATCC con el número de depósito PTA-11042.
72. Una planta de soya transgénica, célula o tejido, que comprende los eventos élites EE-GM3 y EE-GM2, producidos a partir de la semilla de la reivindicación 71.
73. Un método para producir ' una planta de soya o semilla que comprende el evento élite EE-GM3 y EE- GM2 que comprende cruzar una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 68 a 72 con otra planta de soya, y sembrar la semilla obtenida a partir de dicho cruzamiento.
74. El ADN genómico de la soya que comprende el evento élite EE-GM3 y EE-GM2.
75. Un par de moléculas de ácido nucleico aisladas, la primera comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente similar a la sec. con núm. de ident.:2 del nucleótido 1441 al nucleótido 1452 o sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 230 al 251, o la complementaria de dichas secuencias, y la segunda comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente similar a la sec. con núm. de ident. : 14 del nucleótido 301 al nucleótido 322 o sec. con núm. de ident. :15 del nucleótido 497 al 518, o la complementaria de dichas secuencias.
76. El par de moléculas de ácido nucleico aisladas de la reivindicación 75 la primera comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente similar a la sec. con núm. de ident.: 2 del nucleótido 1431 al nucleótido 1462 o sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 220 . al 261, o la complementaria de dichas secuencias, y la segunda comprende una secuencia de nucleótidos esencialmente similar a la sec . con núm. de ident . : 14 del nucleótido 301 al nucleótido 322 o sec. con núm. de ident. : 15 del nucleótido 487 al 518, o la complementaria de dichas secuencias.
77. Una planta de soya, que comprende en su genoma las siguientes secuencias de nucleótidos en orden: a) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 2 del nucleótido 1 al 1451; b) la secuencia de nucleótidos de la complementaria a la secuencia de nucleótidos de la sec. con núm. de ident .: 1 del nucleótido 6760 al nucleótido 6958; c) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 del nucleótido 6874 al nucleótido 7298; d) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :1 del nucleótido 7 al nucleótido 7291; e) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 del nucleótido 12 al nucleótido 7265; f) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 217 al nucleótido 240; y g) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.: 3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y que comprende además las siguientes secuencias en orden: h) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :14 del nucleótido 1 al 311; i) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :ll del nucleótido 3458 al nucleótido 3848; j) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :11 del nucleótido 413 al nucleótido 3457; k) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880.
78. Una molécula de ADN que comprende las siguientes secuencias de nucleótidos en orden: a) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :2 del nucleótido 1 al 1451 ; ) la secuencia de nucleótidos d de la complementaria a la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 1 del nucleótido 6760 al nucleótido 6958; c) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :1 del nucleótido 6874 al nucleótido 7298; d) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :1 del nucleótido 7 al nucleótido 7291; e) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :1 del nugleótido 12 al nucleótido 7265; f) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 217 al nucleótido 240; y g) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :3 del nucleótido 241 al nucleótido 1408, y que comprende además las siguientes secuencias en orden: h) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident . : 14 del nucleótido 1 al 311; i) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 11 del nucleótido 3458 al nucleótido 3848; j) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 11 del nucleótido 413 al nucleótido 3457: k) la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. : 15 del nucleótido 508 al nucleótido 1880.
79. Una planta de soya, célula, tejido o semilla, que comprende EE-QM3 y EE-GM1, que comprende en el genoma de sus células una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95% ó 100% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1431 al 1472 y una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95% ó 100% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident . : 3 del nucleótido 220 al 261, o la complementaria de dichas secuencias, y además una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95% ó 100% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident .: 12 del nucleótido 199 al 220 y una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95% ó 100% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident . : 13 del nucleótido 558 al 579, o la complementaria de dichas secuencias .
80. Una planta de soya, célula, tejido o semilla, que comprende EE-GM3 y EE-GM2 , que comprende en el genoma de sus células una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95% ó 100% de identidad de secuencia con la sec . con núm. de ident . : 2 del nucleótido 1431 al 1472 y una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95% ó 100% de identidad de secuencia a la sec. con núm. de ident.: 3 del nucleótido 220 al 261, o la complementaria de dichas secuencias, y además una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95% ó 100% de identidad de secuencia a la sec. con núm. de ident. : 14 del nucleótido 301 al 322 y una secuencia de ácido nucleico con al menos 80%, 90%, 95% ó 100% de identidad de secuencia a la sec. con núm. de ident. :15 del nucleótido 497 al 518, o la complementaria de dichas secuencias.
81. Una planta de soya, célula vegetal, tejido, o semilla, que comprende en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 97, 98, o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición de nucleótido 1452 a la posición de nucleótido 16638 o la complementaria de esta, o una secuencia de nucleótidos con al menos 97, 98, o al menos 99% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 20 o la complementaria de esta, y comprende en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 97, 98, o al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de EE-GM1 o EE-GM2 o la complementaria de esta, la semilla de referencia que comprende EE-GM1 se depositó con el número de depósito NCIMB 41658, y la semilla de referencia que comprende EE-GM2 se depositó con el número de depósito NCIMB 41660, tal como donde dicha secuencia de nucleótidos de EE-GM1 o EE-GM2 comprende o es la secuencia de ADN foráneo en la sec . con núm. de ident . : 12 ó 13, o la secuencia de ADN foráneo en la sec. con núm. de ident .: 14 ó 15, respectivamente, o la secuencia de ADN foráneo en el genoma de la planta entre la secuencia de sec. con núm. de ident.: 12 y aquella de sec. con núm. de ident.: 13, o la secuencia de ADN foráneo en el genoma de la planta entre la secuencia de sec. con núm. de ident .: 14 y aquella de sec. con núm. de ident. :15, respectivamente.
82. Una planta de soya, célula vegetal, tejido, o semilla, que comprende en su genoma una molécula de ácido nucleico que híbrida con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident .: 1 o la complementaria de esta, o híbrida con la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident. :20 de la posición de nucleótido 1452 a la posición de nucleótido 16638 o la complementaria de esta, o híbrida con la secuencia de nucleótidos de sec . con núm. de ident.:20 o la complementaria de esta, y que comprende en su genoma una molécula de ácido nucleico que híbrida con la secuencia de nucleótidos de EE-GMl o EE-GM2 o la complementaria de esta, la semilla de referencia que comprende EE-GMl se depositó con el número de depósito NCIMB 41658, y la semilla de referencia que comprende EE-GM2 se depositó con el número de depósito NCIMB 41660, tal como donde dicha secuencia de nucleótidos de EE-GMl o EE-GM2 comprende o es la secuencia de ADN foráneo en la sec. con núm. de ident . : 12 ó 13, o la secuencia de ADN foráneo en la sec. con núm. de ident. : 14 ó 15, o la secuencia de ADN foráneo en el genoma vegetal entre la secuencia de sec. con núm. de ident. : 12 y aquella de sec. con núm. de ident. :13, o la secuencia de ADN foráneo en el genoma de la planta entre la secuencia de sec. con núm. de ident.: 14 y aquella de sec. con núm. de ident. : 15.
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