MX2011004818A

MX2011004818A - Composiciones y metodos que comprenden variantes de serina proteasa.

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Publication number: MX2011004818A
Application number: MX2011004818A
Authority: MX
Inventors: David A Estell; James T Kellis Jr; Ayrookaran J Poulose; Frits Goedegebuur; Wolfgang Aehle; Luis G Cascao-Pereira; Brian F Schmidt
Original assignee: Danisco Inc
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2011-05-31
Also published as: AR073420A1; CN102209778A; EP2647692A3; US20100192985A1; BR122013014156A2; EP2589651A2; JP5727378B2; KR20110091671A; CN102209778B; CN103396904A; JP2013240328A; EP2589651A3; WO2010056640A3; EP2362897A2; US20150132825A1; RU2011123911A; BRPI0922084B1; WO2010056640A2; US10093887B2; JP6021983B2

Abstract

La presente invención proporciona métodos para fabricación por ingeniería de proteína y variantes de serina proteasa producidos de ellos. Específicamente, la presente invención proporciona variantes de serina proteasa que tienen una o más sustituciones como se compara con una serina proteasa de referencia. Además, la presente invención proporciona composiciones que comprenden estas variantes de serina proteasa. En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de limpieza que comprenden al menos una de estas variantes de serina proteasa.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS QUE COMPRENDEN VARIANTES DE SERINA PROTEASA Campo de la Invención La presente invención proporciona métodos para la fabricación por ingeniería de proteína y variantes de serina proteasa producidos de los mismos. Específicamente, la presente invención proporciona variantes de serina proteasa que tienen una o más sustituciones como se compara con una serina proteasa de referencia. Además, la presente invención proporciona composiciones que comprenden estas variantes de serina proteasa. En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de limpieza que comprenden al menos una de estas variantes de serina proteasa.

Antecedentes de la Invención Diversos métodos de fabricación por ingeniería de proteína se conocen por aquellos en la técnica. En general, las proteínas se modifican con objeto de obtener propiedades de proteína deseadas. En la mayoría de los métodos, la secuencia de nucleótido de un gen clonado que codifica una proteína se muta y el gen modificado se expresa para producir mutantes, que se separan por exclusión para actividades de interés. Frecuentemente, las propiedades de mutante se Ref . :219426 comparan con las propiedades de proteína tipo natural.

Históricamente, el proceso de diseño de proteínas se ha abordado como equivalente al problema de encontrar en todo el espacio de proteína la mejor secuencia para la aplicación deseada. Este problema es extremadamente difícil y es "NP duro." En la teoría de la > complejidad, los problemas definidos como de clase P, se consideran fáciles y eficientes, algoritmos de tiempo polinómico existen para su solución. Los problemas de NP duro son problemas para los cuales algoritmos de tiempo polinómico eficientes no se conocen actualmente, y si cualquier problema NP duro se pudiera resolver, todos los problemas de NP duro se podrían resolver (Ver por ejemplo, Pierce and infree, protein Engineer., 15: 779-782, 2002). Las estrategias actuales para la construcción y cribado de colecciones generalmente implican generar diversidad de secuencia de proteína aleatoriamente a través de la secuencia completa o en forma aleatoria controlada en posiciones definidas dentro de la proteína. Estas colecciones generalmente tienen un gran número de miembros que son "negativos" con respecto a la propiedad principal de interés, y requiere proyectarse grandes números con objeto de encontrar los números relativamente pequeños de mutaciones positivas. Generalmente, las mutaciones negativas se ignoran, y la información de secuencia se obtiene únicamente para los miembros positivos.

La mutagénesis de saturación (Estell et al., in World Biotech Report 1984, vol . 2, USA, Online Publications , London, pp. 181-187, 1984; and Wells et al., Gene, 34: 315-323, 1985) es una técnica que se puede usar para buscar espacio de proteína para mutaciones que optimizan diversas propiedades en una proteína. Diversos grupos han desarrollado estrategias para identificar sitios que se cambian por mutagénesis de saturación (Reetz et al., Angew. Chem. Int Edn, 44: 4192-4196, 2005; Kato et al., J Mol Biol, 351: 683-692, 2005; and Sandberg et al., Proc Nati Acad Sci USA, 90: 8367-8371, 1993) , pero no se ha propuesto sistema general para identificación de sitio.

Además, ya que la mayoría de los métodos de fabricación por ingeniería de proteína producen un gran número de opciones de mutación de aminoácido, se requiere el cribado de un gran número de variantes generalmente para producir una propiedad de proteína deseada. Generalmente, el cribado se repite múltiples veces para producir una variante benéfica. Así, la mayoría de los métodos son laboriosos y lentos. Hay una necesidad continua en la técnica para métodos de fabricación por ingeniería de proteína que son eficientes y producen los resultados deseados.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona métodos para fabricación por ingeniería de proteína. Específicamente, la invención proporciona métodos que utilizan colecciones de evaluación de sitio. En particular, la presente invención proporciona medios para usar información obtenida alrededor de un número de propiedades deseadas, con objeto de diseñar racionalmente y eficientemente colecciones que optimizarán aquellas propiedades. En algunas modalidades, la presente invención proporciona medios para diseñar colecciones que se mejoran por al menos dos propiedades deseadas. La presente invención también proporciona variantes de serina proteasa que tienen una o más sustituciones como se compara con una serina proteasa de referencia, producida usando los métodos de fabricación por ingeniería de proteína descritos en la presente .

La presente invención proporciona medios para identificar posiciones dentro de una secuencia de aminoácido de una proteína que son relevantes en mejorar propiedades deseadas de la proteína. En algunas modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona medios para determinar que mutaciones son deseables con objeto de producir proteínas con aquellas propiedades deseadas, así como propiedades mejoradas. En algunas modalidades particularmente preferidas adicionales, la presente invención proporciona medios para identificar posiciones y mutaciones de aminoácido que tienen mejoras de un porcentaje particular mejor que la proteína tipo natural (por ejemplo, mejor que alrededor de 110% del tipo natural para una propiedad) . En todavía modalidades preferidas adicionales, la presente invención proporciona medios para identificar mutaciones que proporcionan al menos una propiedad muy mejorada y al menos una propiedad adicional que no es significativamente peor que la proteína tipo natural (por ejemplo, mejor que 110% de tipo natural para una propiedad, aún no peor que 90% de tipo natural para otra propiedad) . En aún modalidades preferidas adicionales, las colecciones se construyen con base en su información. En algunas modalidades, las colecciones se construyen usando todas de las mutaciones identificadas, mientras que en algunas otras modalidades las colecciones se construyen usando un subconjunto de las mutaciones identificadas. De hecho, no se pretende que las colecciones se restrinjan a cualquier número particular y/o tipo de mutaciones.

La presente invención proporciona métodos para fabricación por ingeniería de proteína que comprenden las etapas de: proporcionar una colección de variantes de proteína; probar la colección de variantes de proteína por al menos una propiedad de interés en una prueba de interés; identificar un intervalo de valores para al menos una propiedad de interés; identificar un mínimo dentro del intervalo de valores que se asocian con un resultado favorable en la prueba de interés; y proporcionar una pluralidad de variantes de proteína que tienen al menos una mutación por arriba del mínimo en el intervalo de al menos una propiedad de interés, de tal modo proporcionar una colección de variantes de proteína que comprende al menos una mutación, y en donde la colección se enriquece en miembros que tienen un resultado favorable en la prueba de interés . En algunas modalidades, el resultado favorable corresponde a un valor de mayor que alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, o alrededor de 95% de un valor máximo observado en la prueba establecida en la primera etapa anterior. En algunas modalidades alternativas, más de una prueba de interés se usa en los métodos de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, la proteína es una enzima. En algunas modalidades particularmente preferidas, la enzima se selecciona de proteasas, transíerasas , metaloproteasas , esterasas, amilasas, celulasas, oxidasas, cutinasas, y lipasas .

La presente invención también proporciona métodos para la fabricación por ingeniería de proteína que comprenden las etapas de: proporcionar una colección de variantes de proteína; probar la colección de variantes de proteína por al menos dos propiedades de interés en una prueba de interés; identificar un intervalo de valores para al menos dos propiedades de interés; identificar un mínimo dentro del intervalo de valores que se asocia con un resultado favorable en la prueba de interés; y proporcionar una pluralidad de variantes de proteína por encima del mínimo del intervalo de al menos dos propiedades de interés, de tal modo proporcionar una colección de variantes de proteína enriquecida en miembros que tienen el resultado favorable en la prueba de interés. En algunas modalidades preferidas, el resultado favorable corresponde a un valor de mayor que alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, o alrededor de 95% de un valor máximo observado en la prueba establecida en la primera etapa anterior. En algunas modalidades preferidas, la proteína es una enzima. En algunas modalidades particularmente preferidas, la enzima se selecciona de proteasas, transferasas , metaloproteasas , esterasas, amilasas, celulasas, oxidasas, cutinasas, y lipasas.

La presente invención también proporciona métodos para la fabricación por ingeniería de proteína que comprenden las etapas de: proporcionar una proteína tipo natural y una colección de variantes de proteína de la proteína tipo natural; probar la colección de variantes de proteína y la proteína tipo natural por al menos una propiedad de interés en una prueba de interés; identificar un intervalo de valores para al menos una propiedad de interés; identificar un mínimo dentro del intervalo de valores que se asocia con un resultado favorable en la prueba de interés; identificar las variantes de proteína que tienen un resultado favorable como se compara con los resultados obtenidos para el tipo natural, en donde el resultado favorable es una propiedad mejorada de interés; y proporcionar una pluralidad de variantes de proteína por encima del mínimo, del intervalo de al menos una propiedad de interés, de tal modo proporcionar una colección de variantes de proteína mejoradas enriquecidas en miembros que tienen el resultado favorable en la prueba de interés. En algunas modalidades preferidas, los métodos además comprenden la etapa de determinar el índice de desempeño, en donde el índice de desempeño se determina al dividir el valor obtenido para cada una de las variantes de proteína mejoradas y el valor obtenido para la proteína tipo natural. En algunas modalidades particularmente preferidas, los métodos además comprenden la etapa de identificar las variantes de proteína mejoradas, en donde las variantes de proteína mejoradas alcanzan valores de índice de desempeño mayores que alrededor de 1.1 en la prueba de interés. En algunas modalidades adicionales, la proteína es una enzima. En algunas modalidades particularmente preferidas, la enzima se selecciona de proteasas, transíerasas , metaloproteasas , esterasas, amilasas, celulasas, oxidasas, cutinasas, y lipasas. En algunas modalidades alternativas, la proteína se selecciona de anticuerpos y factores de crecimiento. En todavía modalidades adicionales preferidas, la proteína tipo natural es una forma madura de una enzima seleccionada de proteasas, transferasas , metaloproteasas , esterasas, amilasas, celulasas, oxidasas, cutinasas, y lipasas. En algunas modalidades preferidas, la propiedad de interés se selecciona de carga, desempeño de lavado, desempeño de limpieza de superficie dura, estabilidad térmica, estabilidad de almacenamiento, estabilidad de detergente, enlace de sustrato, inhibición de enzima, nivel de expresión, velocidad de reacción, y degradación de sustrato. En algunas modalidades, la proteína tipo natural y la variante de proteína son componentes de al menos una composición de detergente. En algunas modalidades preferidas, el desempeño de lavado se prueba en una composición de detergente formulada en un detergente en polvo o líquido que tiene un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 12.0.

La presente invención también proporciona métodos para producir una variante mejorada de una proteína de referencia dentro de un pliegue de proteína, que comprende: evaluar múltiples variantes de una prueba proteína dentro del pliegue de proteína que abarca un intervalo de una propiedad de interés en un ensayo de interés; identificar un mínimo dentro del intervalo de la propiedad de interés que se asocia con un resultado favorable en el ensayo de interés evaluar una proteína de referencia del pliegue de proteína en el ensayo de interés; y producir una variante mejorada de la proteína de referencia al introducir una sustitución de aminoácido es la proteína de referencia tal que la variante mejorada está por arriba del mínimo del intervalo de la propiedad de interés. En algunas modalidades preferidas, la proteína de referencia y la proteína de prueba son diferentes. En algunas modalidades, los métodos además comprenden la etapa de determinar el índice de desempeño, en donde el índice de desempeño se determina al dividir el valor obtenido para la variante de proteína mejorada y el valor obtenido para la proteína de referencia. En algunas modalidades, las proteínas de prueba y las proteínas de referencia son enzimas. En algunas modalidades particularmente preferidas, las enzimas se seleccionan de proteasas, transíerasas , metaloproteasas , esterasas, amilasas, celulasas, oxidasas, cutinasas, y lipasas. En algunas modalidades alternativas, las proteínas de prueba y referencia se seleccionan de anticuerpos y factores de crecimiento. En todavía modalidades adicionales preferidas, la proteína de referencia es una forma madura de una enzima seleccionada de proteasas, transferasas , metaloproteasas, esterasas, amilasas, celulasas, oxidasas, cutinasas, y lipasas. En algunas modalidades preferidas, la propiedad de interés se selecciona de carga, desempeño de lavado, desempeño de limpieza de superficie dura, estabilidad térmica, estabilidad de almacenamiento, estabilidad de detergente, enlace de sustrato, inhibición de enzima, nivel de expresión, velocidad de reacción, y degradación de sustrato. En algunas modalidades, las proteínas de prueba y referencia son componentes de al menos una composición de detergente. En alguna modalidad alternativa, la variante de proteína mejorada es un componente de una composición de detergente. En algunas modalidades preferidas, el desempeño de lavado se prueba en una composición de detergente formulada en un detergente en polvo o líquido que tiene un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 12.0.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de limpieza que comprenden al menos una variante de serina proteasa descrita en la presente. En algunas modalidades preferidas, la composición de limpieza es un detergente de lavandería. En un subconjunto de estas modalidades, el detergente de lavandería es un detergente de agua fría, un detergente de bajo pH, o un detergente compacto. En otras modalidades, la composición de limpieza es un detergente de lava platos. En algunas modalidades, el detergente de lava platos es un detergente libre de fosfato, mientras que en otras modalidades el detergente de lava platos es un detergente que contiene fosfato. En algunas modalidades preferidas, las composiciones de limpieza además comprenden al menos una enzima adicional, que en modalidades particularmente preferidas se seleccionan de una raetaloproteasa neutra, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, y una peroxidasa. También se proporcionan por la presente invención ácidos nucleicos aislados que codifican la variante de serina proteasa, vectores de expresión que comprenden el ácido nucleico, y células hospederas que comprenden el vector de expresión.

Además, la presente invención proporciona métodos para producir una variante de serina proteasa de una serina proteasa Bacillus, que comprende: transformar una célula hospedera con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la variante de serina proteasa; y cultivar la célula hospedera transformada bajo condiciones adecuadas para la producción de la variante de serina proteasa. En algunas modalidades, los métodos además comprenden la etapa de cosechar la variante de serina proteasa producida. En algunas modalidades, la célula hospedera es una especie Bacillus, y en un subconjunto de estas modalidades, la especie Bacillus es B. subtilis . Por otra parte, la presente invención proporciona métodos de limpieza, que comprenden la etapa de poner en contacto una superficie y/o un artículo que comprende una tela con una composición de limpieza que comprende una variante de serina proteasa aislada. En algunos métodos alternativos, la presente invención proporciona métodos de limpieza, que comprenden la etapa de poner en contacto una superficie y/o un artículo que comprende una vajilla con una composición de limpieza que comprende una variante de serina proteasa aislada .

Adicionalmente la presente invención proporciona métodos para la fabricación por ingeniería de proteasa que comprende las etapas de: a) proporcionar una pluralidad de colecciones de evaluación de sitio (SELs) cada una comprende una pluralidad de variantes de proteasa que tienen sustituciones distintas en una posición de aminoácido idéntica de la proteasa; b) probar las variantes de proteasa de los SEL y una proteasa estándar en una prueba de una propiedad de interés; c) determinar un índice de desempeño (PI) para cada una de las variantes de proteasa para la prueba; d) identificar dos o más de las posiciones de aminoácido como posiciones no restrictivas, en donde al menos una de la pluralidad de variantes de proteasa en cada una de dos de los SEL tiene un PI mayor que alrededor de 0.5; y f) proporcionar una colección de mutación múltiple que comprende una pluralidad de variantes de proteasa sustituidas por multiplicado cada una comprende sustituciones en las dos o más posiciones no restrictivas. En algunas modalidades, la prueba comprende dos o más ensayos diferentes seleccionados de ensayos de remoción de manchas (micromuestra) , ensayos de estabilidad LAS, ensayos de estabilidad de detergente, y ensayos de actividad específica. En algunas modalidades adicionales, los métodos de ensayo adicional y/o alternativo encuentran uso.

En algunas modalidades adicionales, la presente invención proporciona métodos para producir una variante de serina proteasa sustituida por multiplicado de una serina proteasa Bacillus, que comprende: probar una pluralidad de variantes de serina proteasa sustituidas individualmente en una primera prueba de una primera propiedad y una segunda prueba de una segunda propiedad, en donde la propiedad de una serina proteasa de referencia se da un valor de 1.0 en cada prueba, una primera o segunda propiedad favorable tiene un valor mayor que 1.0, y una primera o segunda propiedad indebidamente desfavorable tiene un valor menor que alrededor de 0.80 o en algunas modalidades preferidas, menor que alrededor de 0.60; identificar una sustitución en al menos una de las variantes de serina proteasa sustituidas individualmente que se asocia con una primera propiedad favorable y que no se asocia con una segunda propiedad indebidamente desfavorable; identificar una sustitución en al menos una de las variantes de serina proteasa sustituidas individualmente que se asocian con una segunda propiedad favorable y que no se asocia con una primera propiedad indebidamente desfavorable; e introducir la sustitución de las etapas previas en una serina proteasa hasta producir una variante de serina proteasa sustituida por multiplicado. En algunas modalidades, los métodos además comprenden probar la variante de serina proteasa sustituida por multiplicado en la primera prueba y la segunda prueba, en donde una variante de serina proteasa mejorada alcanza un valor de mayor que alrededor de 1.0 en tanto la primera como la segunda pruebas, o un valor de mayor que 1.0 en la primera prueba y un valor de alrededor de 0.80 hasta alrededor de 1.0 en la segunda prueba. En algunas modalidades, los métodos además comprenden producir las variantes de serina proteasa mejoradas. En algunas modalidades, la primera y segunda propiedades se correlacionan negativamente. En algunas modalidades, una primera o segunda propiedad favorable tiene un valor mayor que alrededor de 1.2. En algunas modalidades, una primera o segunda propiedad indebidamente desfavorable tiene un valor menor que alrededor de 0.40. En algunas modalidades, la primera propiedad es estabilidad, y la segunda propiedad es desempeño de lavado. En un subconjunto de estos la estabilidad comprende estabilidad en detergente y el desempeño de lavado comprende desempeño de lavado de sangre leche tinta (BMI por sus siglas en ingles) en detergente. En algunas modalidades, la serina proteasa bacteriana de referencia es una forma madura tipo natural de una serina proteasa B. amyloliquefaciens BPN' que tiene una secuencia de aminoácido establecida como la SEQ ID NO: 1. En otras modalidades, la serina proteasa bacteriana de referencia es una tipo natural de serina proteasa GG36 que tiene una secuencia de aminoácido establecida como la SEQ ID NO: 2 (esto es, la serina proteasa bacteriana de referencia usada para producir "variantes GG36"). En algunas modalidades de la presente invención, el desempeño de lavado se prueba en una composición de detergente en polvo o líquido que tiene un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 12.0. No se pretende que las etapas limiten al orden exacto antes enlistado, como cualquier orden adecuado encuentra uso en la presente invención. Sin embargo en algunas modalidades preferidas, las sustituciones son en posiciones en una serina proteasa de referencia que tiene una superficie accesible de solvente (SAS) de mayor que alrededor de 50% o mayor que alrededor de 65%.

Además la presente invención proporciona variantes de subtilisina, en donde las variantes son formas maduras que tienen actividad proteolítica y que comprenden una sustitución en una o más (preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o más) posiciones seleccionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274 y 275 y en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BP ' B . amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

En algunas modalidades preferidas, la sustitución comprende uno o más de: X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008 , X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I, X010K, X010L, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010V, X010W, X010Y, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I, X011M, X011R, X011S, X011T, X011V, X011Y, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X012Y, X013A, X013G, X013I, X013M, X013Q, X013T, X013V, X014A, X014C, X014D, X014E, X014F, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X017A, X017D, X017E, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017T, X017V, X017 , X017Y X018A X018C X018D, X018E X018F, X018G, X018H X018I X018K X018L X018M, X018N X018P, X018Q, X018R X018S X018T X018V X018W, X018Y X019A, X019C, X019D X019E X019F X019G X019H, X019K X019L, X019M, X019N X019P X019R X019S X019T, X019V X019 , X019Y, X020A X020C X020D X020F X020G, X020I X020K, X020L, X020M X020P X020Q X020R X020S, X020T X020V, X020W, X020Y X021A X021C X021D X021E, X021G X021H, X021I, X021K X021L X021M X021N X021P, X021Q X021R, X021S, X021T X021V X021 X022A X022C, X022G X022I, X022K, X022L X022M X022N X022P X022Q, X022R X022S, X022T, X022V X022W X022Y X023A X023G, X023S X024A, X024C, X024D X024F X024G X024H X024L, X024M X024N, X024P, X024Q X024R X024S X024T X024V, X024W X025C, X025D, X025E X025F X025G X025H X025K, X025L X025M, X025N, X025Q X025R X025S X025T X025V, X025W X026C, X026F, X026G X026I X026L X026M X026N, X026P X026R, X026S, X026T X026V X027A X027C X027D, X027F X027G, X027I, X027K X027L X027M X027N X027P, X027R X027S, X027T, X027V X027W X027Y X028A X028E, X028G X028H, X028I , X028L X028M X028N X028P X028S, X028V X028Y, ?029?, X029C X029G X029I X029K X029S, X029T X029V, ?030?, X030C X030D X030E X030F X030G, X030L X030M, X030Q, X030S X030T X030V X031A X031F, X031I X031L, X031M, X031S X031T X031V X032A X032C, X032D X032E, X032G, X032V, X032 X033A, X033C, X033D, X033E, X033G X033H, ?033? X033L X033M X033N X033Q X033R X033S X033T, X033V X033Y X034E X034G X034H X034L X034Q X034S, X035A X035F X035H X035I X035K X035L X035M X035P, X035Q X035R X035S X035A X035C X035E X035F X035G, X035H X035I X035L X035M X035N X035P X035Q X035R, X035T X035V X035W X035Y X038C X038F X038G X038H, X038I X038K X038L X038M X038N X038Q X038R X038T, X038V X038W X038Y X039A X039E X039G X039H X039L, X039M X039N X039Q X039S X039T X039V X039Y X040A, X040C X040D X040E X040G X040H X040I X040K X040L, X040M X040N X040P X040R X040S X040T X040V X040W, X040Y X041C X041D X041E X041N X041P X041Q X041S, X042A X042C X042F X042G X042H X042I X042L X042M, X042N X042Q X042S X042T X042V X042Y X043A X043C, X043D X043E X043F X043G X043I X043L X043M X043N, X043P X043R X043S X043T X043V X043W X043Y X044A, X044C X044D X044F X044G X044I X044K X044L X044M, X044N X044P X044Q X044R X044S X044T X044V X044W, X044Y X045A X045D X045F X045G X045H X045I X045K, X045L X045M X045N X045P X045Q X045R X045S X045T, X045V X045W X045Y X046C X046D X046E X046F X046G, X046H X046I X046K X046L X046M X046N X046P X046Q, X046R X046S X046T X046V X046W X047A X047C X047E, X047F X047G X047H X047K X047L X047M X047N X047P, X047Q, X047R, X047S, ?047?, X047W, ?048?, X048C, ?048?, X048F, X048G, ?048?, ?048?, ?048?, X048L, ?048?, ?048?, X048P, X048Q, X048R, X048S, ?048?, X048V, ?048?, ?049?, X049E, X049F, X049G, ?049?, ?049?, X049L, ?049?, ?049?, X049Q, X049R, X049S, ?049?, X050C, X050F, X050G, ?050?, X050I, X050L, ?050?, ?050?, X050V, ?050?, X051F, X051G, X051H, X051K, X051L, X051N, X051P, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, ?052?, X052C, ?052?, X052F, X052G, ?052?, X052I, X052L, ?052?, ?052?, ?052?, X052Q, X052R, ?052?, X052V, X052 , ?052?, ?053?, X053C, X053D, ?053?, X053G, X053H, X053I, ?053?, X053L, ?053?, ?053?, X053Q, X053R, X053S, X053T, X053V, X053W, ?053?, ?054?, X054C, X054D, X054E, X054F, X054G, ?054?, ?054?, ?054?, X054L, ?054?, X054N, X054P, X054Q, X054R, X054S, X054V, X054W, ?054?, X055A, X055C, ?055?, X055F, X055G, ?055?, 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X170S, X170V X170W X170Y X171A X171C X171D X171E X171F, X171G X171H X171I X171L X171M X171N X171Q X171S, X171T X171V X171W X171Y X172A X172C X172D X172F, X172G X172I X172K X172L X172M X172P X172Q X172R, X172S, X172T X172V, X172W, X172Y X173A, X173C X173D, X173E, X173F X173G X173H X173I X173K X173L X173M, X173N, X173P X173Q X173R X173T X173V X173 X173Y, X174A, X174G X174I X174N X174P X174S X174T X174V, X175A, X175C X175E X175G X175H X175I X175K X175L, X175M, X175Q X175S X175T X175V X175W X175Y X176A, X176C, X176E X176G X176I X176K X176P X176S X176T, X176V, X177A X177C X177I X177T X177V X178A X178G, X178S, X178T X179A X179C X179G X179H X179I X180C, X180G, X180H X180I X180L X180N X180Q X180S X180T, X180V, X181A X181D X181E X181G X181H X181L X181M, X181N, X182A X182D X182E X182F X182G X182H X182I, X182K, X182L X182M X182N X182P X182Q X182R X182S, X182T, X182V X182W X182Y X183A X183D X183F X183G, X183H, X183I X183K X183L X183M X183N X183P X183Q, X183R, X183S X183T X183V X183 X183Y X184A X184C, X184D, X184E X184F X184G X184H X184L X184M X184N, X184S, X184T X184 X184Y X185A X185C X185E X185F, X185G, X185H X185I X185K X185L X185M X185N X185Q, X185R, X185S X185T X185V X185Y X186A X186C X186G, X186H, X186I X186K X186L X186M X186N X186P X186Q, X186R, X186S X186T X186 X187A X187C X187D X187E, X187F, X187G X187H X187I X187L X187M X187N X187P, X187Q, X187S X187T X187V X187W X187Y X188A X188D, X188E, X188F X188G X188H X188I X188K X188L X188P, X188Q, X188R X188S X188T X188V X188 X188Y, X189C, X189E X189F X189G X189H X189K X189L, X189N, X189P X189Q X189R X189S X189T X189V, X190A, X190D X190E X190F X190G X190H X190I, X190L, X190M X190N X190P X190Q X190R X190S, X190W, X190Y X191A X191D X191E X191F X191H, X191K, X191L X191P X191Q X191R X191S X191T( X191W, X191Y X192C X192D X192E X192G X192H, X192K, X192L X192M X192N X192P X192Q X192R, X192T, X192V X192 X192Y X193A X193D X193E, X193G, X193H X193I X193K X193L X193R X193S, X193V, X193 X193Y X194A X194C X194D X194E, X194G, X194H X194I X194L X194M X194P X194Q, X194S, X194T X194V X194 X194Y X195A X195C, X195E, X195F X195G X195I X195K X195L X195Q, X195S, X195T X195V X195W X195Y X196A X196D, X196F, X196I X196L X196M X196P X196Q X196T, X196Y, X197A X197C X197D X197E X197F X197G, X197I, X197L X197M X197N X197Q X197R X197S, X197V, X197W X197Y X198A X198D X198E X198F, X198H, X198I X198L X198M X198N X198Q X198R, X198T, X198W X198Y X199A X199C X199D X199E, X199G, X199H X199I X199L X199M X199Q X199S, X199V, X199W X200A X200C X200G X200H ?200?, X201C, X201G X201P X201S X201T X201V X202F, X203A X203C, X203E X203F, X203G X203H, X203I X203K, X203L X203N X203R X203S X203T X203V X203W X203Y, X204A X204C X204E X204F X204G X204I X204K X204L, X204N X204P X204R X204S X204T X204 X204Y X205A, X205F X205G X205I X205L X205M X205Q X205T X205V, X206A X206C X206D X206E X206F X206G X206H X206I, X206K X206L X206N X206P X206Q X206R X206S X206T, X206V X206W X206Y X207A X207G X207H X207S X208A, X208C X208L X208N X208P X208S X208T X208V X209A, X209C 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X218T X218V X218W X218Y X219A X219G, X220A X220C X220G X220H X220N X220S X220T, X221G X221S X221T X222A X222C X222E X222F, X222I X222K X222L X222M X222N X222P X222Q, X222S X222T X222V X222W X223A X223C X223G, X223S X223T X224A X224D X224E X224G X224I, X224M X224N X224P X224S X224T X225A X225C, X225I X225N X225P X225S X225T X225V X226C, X226G X226H X226I X226L X226M X226N X226R, X226T X226V X226Y X227A X227C X227F X227G, X227L X227M X227P X227Q X227S X227T X227V, X228A X228C X228G X228I X228L X228M X228P, X228V X229A X229G X229P X229S X230A X230D, X230F X230G X230H X230I X230L X230N X230P, X230S X230T X230V X230 X230Y X231A X231C, X231G X231H X231I X231L X231S X231T X231W, X232A X232G X232H X232K X232L X232M X232P, X232V X233A X233C X233E X233F X233G X233I, X233M X233N X233P X233Q X233R X233S X233T( X233Y X234D X234F X234G X234H X234L ?234?, X234P, X234Q X234S X234T, X234V X234Y, X235C X235D, X235E, X235F X235G X235H, X235I X235K, X235L ?235?, X235N, X235Q X235R X235S, X235V X235W, ?235? ?236?, X236C, X236E X236F X236G, X236H X236K, X236L ?236?, X236P, X236Q X236R X236S, X236T X236V, X236W ?236?, X237A, X237C X237F X237G, X237H X237I , ?237? X237L, X237M, X237P X237Q X237R, X237S ?237?, X237V X237W, X237Y, X238C X238D X238E, X238F X238G, ?238? ?238?, X238K, X238L X238M X238N, X238Q X238R, X238S ?238?, X238V, X238Y X239C X239D, X239F X239G, ?239? ?239?, X239K, X239L X239M X239N, X239P X239Q, X239R X239S, X239T, X239V X239 X239Y, X240A X240C, ?240? X240F, X240I, X240K X240L X240M, X240N X240Q, X240R X240S, X240T, X240W X240Y X241A, X241C X241D, X241E X241F, X241G, X241H X241I X241K, X241L X241M, X241N X241P, X241Q, X241R X241S X241T, X241V X241W, X241Y ?242?, X242C, X242D X242F X242G, X242H ?242?, X242L ?242?, X242P, X242Q X242R X242S, X242T X242V, X242W X243C, X243D, X243E X243F X243G, X243H ?243? , ?243? X243L, X243M, X243N X243P X243Q, X243R X243S, ?243? X243V, X243 , X244A X244D X244E, X244F ?244?, ?244? X244L, X244M, X244N X244P X244Q, X244R X244S, ?244? X244V, X244W, X244Y X245A X245C, X245E X245G, ?245? ?245?, X245L, X245P X245Q X245R, X245S X245V, X245 ?245?, X246A, X246C X246E X246F, X246G ?246?, ?246? X246L, X246M, X246N, X246P, X246Q, X246R, X246S, X246T, X246V, X246W, X246Y, X24 7A, X247C, X247D, X2 47E, X247F, X247G, X247H, X247I, X24 7K, X247L, X247M, X2 47N, X247P, X247Q, X247R, X247S, X24 7T, X247V, X247W, X2 47Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X24 8?, X248I, X248K, X2 48L, X248M, X248N, X248P, X248R, X24 8S, X248T, X248V, X2 48 , X248Y, X249A, X249D, X249E, X24 9F, X249G, X249H, X2 491, X249K, X249L, X249M, X249N, X24 9Q, X249R, X249S, X2 49T, X249V, X249 , X249Y, X250A, X25 OC, X250E, X250F, X2 50G, X250H, X250I , X250L, X250M, X25 ON, X250Q, X250S, X2 50V, X250Y, X251A, X251D, X251E, X25 1F, X251G, X251K, X2 51L, X251M, X251P, X251Q, X251R, X25 is, X251T, X251V, X2 51Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X25 2G, X252H, X252I, X2 52K, X252L, X252M, X252N, X252P, X25 2R, X252S, X252V, X2 52W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X25 3F, X253G, X253H, X2 531, X253K, X253M, X253R, X253S, X25 3T, X253V, X253W, X2 54A, X254C, X254D, X254E, X254G, X25 4N, X254P, X254S, X2 54T, X254V, X255A, X255C, X255D, X25 5E, X255F, X255H, X2 551, X255L, X255N, X255P, X255Q, X25 5R, X255S, X255T, X2 55V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X25 6D, X256E, X256G, X2 56H, X256I, X256K, X256L, X256 , X25 6N, X256P, X256R, X2 56S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X25 7A, X257C, X257E, X2 57F, X257G, X257H, X257I, X257K, X25 7L, X257M, X257P, X2 57S, X257T, X257V, X257 , X257Y, X25 8A, X258C, X258D,, X2 58E, X258F, X258G, X258H, X258I, X25 8L, X258M, X258P, X2 58Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, ?259?, X259G, X259I, X259L X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, ?259?, X259V, X260A X260D, X260E, X260F, ?260?, ?260?, X260L, X260M, X260N X260P, X260R, X260S, ?260?, X260V, ?260?, X261A, X261C X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A X262C, X262D, X262F, X262G, ?262?, ?262?, X262K, X262L X262M, X262P, X262Q, X262R, X262S, ?262?, X262V, X262W X262Y, X263A, X263C, X263D, X263F, X263G, X263H, X263I X263K, X263L, X263M, ?263?, ?263?, X263Q, X263R, X263 X263Y, X264A, X264C, ?264?, X264F, X264G, X264H, X264I X264L, X264P, X264Q, X264S, ?264?, X264V, X264Y, X265A X265C, X265D, X265F, X265G, ?265?, ?265?, X265K, X265L X265M, X265N, X265P, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265V X265W, X265Y, X266G, X266W, ?266?, ?267?, X267C, X267D X267E, X267F, X267G, ?267?, ?267? , ?267?, X267L, X267M X267N, X267S, X267T, X267V, ?267?, ?268?, X268D, X268E X268G, X268H, X268K, X268L, ?268?, ?268?, X268P, X268Q X268R, X268S, X268V, X268W, ?268?, X269C, X269D, X269F X269G, X269H, X269I, X269L, ?269?, ?269?, X269Q, X269R X269S, X269T, X269V, ?270?, X270C, X270D, X270E, X270F X270G, X270H, X270I , X270L, ?270?, ?270?, X270P, X270Q X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T X271V, X271Y, ?272?, X272C, X272D, ?272?, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273W, X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, y X275W.

La presente invención también proporciona composiciones de lava platos que comprenden la variante de subtilisina, y composiciones de limpieza de tela que comprenden la variante de subtilisina. En algunas modalidades preferidas, las composiciones de limpieza de lava platos y de tela además comprenden al menos una enzima adicional. En algunas modalidades preferidas, la enzima adicional se selecciona de: una proteasa (por ejemplo, una metaloproteasa neutra, una serina proteasa de tipo natural, o una segunda serina proteasa variante) una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa , una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, y una peroxidasa. Por otra parte, la presente invención proporciona métodos de lava platos, que comprenden las etapas de: proporcionar i) la composición de lava platos que comprende la variante de subtilisina, y ii) vajilla que necesita de limpieza; y poner en contacto la vajilla con la composición de lava platos bajo condiciones efectivas para proporcionar limpieza de la vajilla. Similarmente , la presente invención proporciona métodos de limpieza de tela, que comprenden las etapas de: proporcionar i) la composición de limpieza de tela que comprende la variante de subtilisina, y ii) ropa sucia que necesita de limpieza; y poner en contacto la ropa sucia con la composición de limpieza de tela bajo condiciones efectivas para proporcionar limpieza de la ropa sucia. En todavía modalidades adicionales, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica la variante, un vector de expresión que comprende el ácido nucleico aislado en combinación operable con un promotor, y/o células hospederas que comprenden el vector de expresión se proporcionan .

La presente invención también proporciona variantes de subtilisina aisladas de una subtilisina Bacillus, en donde la variante de subtilisina es una forma madura que tiene actividad proteolítica y que comprende sustituciones en tres o más posiciones seleccionas de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 , 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, y 275, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN 1 B . amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la variante de subtilisina comprende cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de las posiciones enumeradas arriba.

En algunas modalidades, la variante de subtilisina es una forma madura que tiene actividad proteolítica y que comprende sustituciones en tres o más posiciones seleccionadas de: 1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 68, 69, 72, 73, 76, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, .139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 194, 195, 198, 199, 203, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272,· 273, 274, y 275, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BP ' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la variante de subtilisina comprende cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de las posiciones enumeradas arriba.

La presente invención también proporciona variantes de subtilisina aisladas, en donde las variantes de subtilisina son formas maduras que tienen actividad proteolítica y que comprenden sustituciones en tres o más posiciones seleccionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 126, 127 128, 129 130 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137 138, 139 140, 141 142 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 150, 151 152, 153 156 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169 170, 171 172, 173 174 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 182, 183 184, 185 186 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196 197, 198 199, 200 203 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 211, 212 213, 214 215 216 , 217, 218, 220, 222, 223, 224 225, 226 227, 228 229 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236 237, 238 239, 240 241 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248 249, 250 251, 252 253 254 , 255, 256, 257, 258, 259, 260 261, 262 263, 264 265 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273 274, y 275, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN1 B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la variante de subtilisina comprende cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de las posiciones enumeradas arriba.

La presente invención además comprende variantes de subtilisina aisladas que comprenden sustituciones en tres o más posiciones seleccionadas de: X001A, , X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I, X010 , X010L, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010V, X010W, X010Y, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I, X011M, X011R, X011S, X011T, X011V, X011Y, X012D, X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P, X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X012Y, X013A, X013G, X013I, X013M, X013Q, X013T, X013V, X014A, X014C, X014D, X014E, X014F, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V, X017A, X017D, X017E, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R, X017S, X017T, X017V, X017 , X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E, X018F, X018G, X018H, X018I, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019P, X019R, X019S, X019T, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020 , X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020 , X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, X022N, X022P, X022Q, X022R, X022S, X022T, X022V, X022W, X022Y, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024 , X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, X025H, X025K, X025L, X025M, X025N, X025Q, X025R, X025S, X025T, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026I, X026L, X026M, X026N, X026P, X026R, X026S, X026T, X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G, X027I, X027K, X027L, X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T, X027V, X027W, X027Y, X028A, X028E, X028G, X028H, X028I, X028L, X028M, X028N, X028P X028S X028V X028Y, X029A, X029C, X029G, X029I, X029K X029S X029T X029V, X030A, X030C, X030D, X030E, X030F X030G X030L X030M, X030Q, X030S, X030T, X030V, X031A X031F X031I X031L, X031M, X031S, X031T, X031V, X032A X032C X032D X032E, X032G, X032V, X032 , X033A, X033C X033D X033E X033G, X033H, X033I, X033L, X033M, X033N X033Q X033R X033S, X033T, X033V, X033Y, X034E, X034G X034H X034L X034Q, X034S, X035A, X035F, X035H, X035I X035K X035L X035M, X035P, X035Q, X035R, X035S, X035A X035C X035E X035F, X035G, X035H, X035I, X035L, X035M X035N X035P X035Q, X035R, X035T, X035V, X035W, X035Y X038C X038F X038G, X038H, X038I, X038K, X038L, X038M X038N X038Q X038R, X038T, X038V, X038 , X038Y, X039A X039E X039G X039H, X039L, X039M, X039N, X039Q, X039S X039T X039V X039Y, X040A, X040C, X040D, X040E, X040G X040H X040I X040K, X040L, X040M, X040N, X040P, X040R X040S X040T X040V, X040 , X040Y, X041C, X041D, X041E X041N X041P X041Q, X041S, X042A, X042C, X042F, X042G X042H X042I X042L, X042M, X042N, X042Q, X042S, X042T X042V X042Y X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G X043I X043L X043M, X043N, X043P, X043R, X043S, X043T X043V X043W X043Y, X044A, X044C, X044D, X044F, X044G X044I X044K X044L, X044M, X044N, X044P, X044Q, X044R X044S X044T X044V, X044W, X044Y, X045A, X045D, X045F X045G X045H X045I, X045K, X045L, X045M, ?045?, ?045?, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, ?045?, X046C, X046D, ?046?, X046F, X046G, X046H, X046I , ?046?, X046L, ?046?, ?046?, ?046?, X046Q, X046R, X046S, ?046?, X046V, X046W, ?047?, X047C, X047E, X047F, X047G, ?047?, ?047 , X047L, ?047?, ?047?, X047P, X047Q, X047R, X047S, ?047?, X047W, ?048?, X048C, X048E, X048F, X048G, ?048?, ?048?, ?048?, X048L, ?048?, X048N, X048P, X048Q, X048R, X048S, ?048?, X048V, ?048?, X049A, X049E, X049F, X049G, ?049?, ?049?, X049L, ?049?, X049P, X049Q, X049R, X049S, ?049?, X050C, X050F, X050G, X050H, X050I, X050L, ?050?, ?050?, X050V, ?050?, X051F, X051G, X051H, X051K, X051L, X051N, X051P, X051R, X051S, X051T, X051V, X051 , ?052?, X052C, ?052?, X052F, X052G, X052H, X052I, X052L, ?052?, ?052?, ?052?, X052Q, X052R, X052T, X052V, X052W, ?052?, ?053?, X053C, X053D, ?053?, X053G, X053H, ?053?, ?053?, X053L, ?053?, ?053?, X053Q, X053R, X053S, ?053?, X053V, X053W, ?053?, ?054?, X054C, X054D, X054E, X054F, X054G, ?054?, ?054?, ?054?, X054L, X054M, X054N, ?054?, X054Q, X054R, X054S, X054V, X054W, X054Y, X055A, X055C, ?055?, X055F, X055G, ?055?, ?055?, X055K, X055L, ?055?, ?055?, ?055?, X055Q, X055R, X055S, X055T, X055W, ?055?, ?056?, X056C, X056D, ?056?, ?056?, X056L, X056M, ?056?, ?056?, X056Q, X056R, X056S, ?056?, X056V, X057A, X057C, ?057?, X057F, X057G, ?057?, ?057?, X057K, X057L, ?057?, ?057?, ?057?, X057Q, X057R, X057S, X057T, X057V X057 X057Y, X059A, X059C, X059D, X059F, X059G X059I X059K, X059L, X059M, X059N, X059Q, X059R X059S X059T, X059V, X059W, X059Y, X060C, X060D X060F X060G, X060K, X060L, X060M, X060P, X060Q X060S X060T, X060V, X060W, X060Y, X061C, X061D X061F X061G, X061H, X061I, X061L, X061N, X061P X061R X061S, X061T, X061V, X061Y, X062E, X062F X062G X062H, X062I, X062K, X062L, X062N, X062P X062Q X062R, X062S, X062T, X062V, X063A, X063C X063D X063E, X063F, X063G, X063H, X063K, X063 X063P X063Q, X063R, X063S, X063T, X063W, X064H X064S X065G, X066A, X066C, X066D, X066I, X066K X066L X066N, X066Q, X066S, X066T, X067C, X067F X067H X067L, X067M, X067N, X067P, X067R, X067S X067T X067V, X068A, X068C, X068D, X068G, X068H X068I X068L, X068M, X068N, X068Q, X068T, X068V X069A X069C, X069E, X069F, X069G, X069L, X069M X069N X069P, X069R, X069S, X069T, X069W, X070G X071A X071C, X071D, X071E, X071G, X071L, X071M X071N X071P, X071S, X071T, X071V, X072C, X072D X072F X072H, X072I, X072K, X072L, X072N, X072Q X072S X072T, X072V, X072 , X073A, X073D, X073E X073H X073K, X073L, X073N, X073R, X073T, X073V X074A X074C, X074S, X074T, X075A, X075D, X075E X075F X075G, X075H, X075I, X075L, X075N, X075P, X075Q, X075R, X075S, ?075?, X075V, X075W, X076C, X076D, X076E, X076F, X076G, ?076?, ?076?, ?076?, X076L, X076 , X076N, X076Q, X076R, X076S, ?076?, X076W, X076Y, X077A, X077C, X077D, ?077?, X077F, X077G, ?077?, X077K, 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X088G, X088H, X088K, X088M, X088Q, X088R, X088S, X088V, X088 , X089A, X089C, X089D, ?089?, X089F, X089G, ?089?, ?089?, X089L, X089N, X089P, X089Q, X089R, X089S, ?089?, X089V, X089 , X090A, X090C X090E, X090F, X090G X090I X090K, X090L X090M X090P X090Q X090T X090V X090W X090Y, X091C X091D X091F X091I X091K X091L X091M X091N, X091Q X091R X091S X091T X091V X091W X091Y X092A, X092C X092D X092E X092F X092G X092H X092I X092K, X092L X092N X092P X092Q X092R X092T X092V X092 , X092Y X093A X093C X093D X093F X093G X093L X093M, X093N X093P X093S X093T X093V X093 X093Y X094A, X094D X094E X094G X094H X094I X094K X094L X094M, X094N X094Q X094R X094V X095A X095C X095E X095G, X095I X095K X095L X095M X095R X095S X095T X095V, X095W X096A X096E X096F X096G X096H X096I X096L, X096M X096Q X096R X096S X096T X096W X096Y X097A, X097D X097E X097F X097G X097H X097I X097K X097L, X097M X097N X097P X097Q X097R X097S X097T X097V, X097W X097Y X098A X098C X098D X098E X098F X098G, X098K X098L X098N X098P X098Q X098R X098S X098T, X098V X098Y X099A X099C X099F X099G X099K X099M, X099P X099Q X099R X099S X099T X099V X099Y XIOOD, X100E XIOOF XIOOG XIOOI XIOOK XIOOL XIOOM XIOON, XIOOP XIOOQ XIOOR XIOOS XIOOT XIOOV XIOOW XIOOY, XIOIA X101C X101D X101E X101F X101G X101H X101I, X101K X101N X101P X101Q X101R X101S X101T X101V, X101Y X102A X102C X102D X102E X102F X102G X102H, X102M X102N X102T X103A X103C X103D X103E X103F, X103G X103I X103L X103N X103P X103Q X103R, X103T X103V X103 X103Y X104A X104C X104D, X104F X104G X104H X104I X104L X104P X104R, X104T X104V X104W X104Y X105A X105C X105D, X105F X105G X105H X105I X105K X105L X105M, X105Q X105R X105S X105T X105V X105W X105Y, X106D X106E X106F X106G X106I X106L X106M, X106R X106S X106T X106V X106W X107A X107C, X107F X107H X107I X107L X107M X107Q X107S, X107V X107W X107Y X108A X108C X108F X108G, X108L X108M X108Q X108S X108T X108V X109A, X109E X109F X109G X109H X109I X109K X109L, X109N X109P X109Q X109R X109S X109T X109W, X110A X110G X110S X111A X111C X111E X111F, X111L X111M X111P X111T X111V X111Y X112A, X112D X112E X112F X112G X112I X112L X112M, X112Q X112S X112T X112V X112W X112Y X113A, X113D X113E X113L X113M X113N X113S X113V, X114A X114C X114G X114T X115C X115E X115F, X115H X115I X115K X115L X115 X115N X115P, X115R X115S X115T X115V X115W X115Y X116A, X116D X116F X116G X116I X116K X116L X116M, X116Q X116S X116T X116V X116W X117A X117C, X117F X117G X117I X117N X117Q X117R X117T XH8A X118C X118D X118E X118F X118G X118I, X118L, X118M, X118N, X118P X118R, X118S, X118T X118 , X119A X119C X119E X119F X119G X119H X119M, X119N X119P X119Q X119T X119W X120A X120E, X120F X120G X120H X120I X120L X120M X120R, X120S X120T X120 X121A X121C X121E X121G, X121I X121K X121L X121M X121Q X121S X121V, X121Y X122A X122C X122G X122I X122L X122T, X122V X123E X123G X123I X123L X123M X123P, X123S X123V X124G X124H X124L X124N X124S, X124T X124Y X125A X125C X125G X125P X125T, X126A X126C X126E X126F X126G X126H X126K, X126L X126M X126N X126Q X126S X126T X126 , X126Y X127D X127F X127G X127I X127L X127R, X127S X127T X127V X128A X128C X128D X128G, X128H X128I X128K X128L X128M X128N X128Q, X128R X128S X128T X128W X128Y X129A X129F, X129G X129I X129L X129M X129N X129P X129S, X129T X129V X129W X129Y X130C X130K X130N, X130P X130Q X130R X130S X130V X130W X131A, X131D X131E X131F X131G X131I X131K X131M, X131P X131Q X131R X131V X132A X132E X132H, X132I X132L X132M X132N X132Q X132R X132T, X132W X133A X133F X133K X133L X133N X133Q, X133S X133T X133V X133Y X134A X134F X134L, X134M X134P X134S X134T X134V X135A X135E, X135F, X135L X135M X135Q X135T X135 X136A, X136D, X136E X136F X136G X136K X136M X136N X136Q, X136R, X136S X136V X136W X136Y X137A X137C X137E, X137G, X137H X137K X137L X137M X137Q X137R X137S, X137V, X137 X138A X138C X138E X138G X138H X138L, X138M, X138Q X138R X138V X139A X139C X139E X139F, X139G, X139I X139M X139Q X139S X139T X139V X139Y, X140A, X140C X140D X140E X140F X140G X140I X140K, X140L, X140M X140N X140Q X140R X140S X140T X140V, X140Y, X141D X141E X141G X141H X141I X141K X141L, X141N, X141Q X141R X141S X141V X141Y X142A X142C, X142E, X142G X142I X142L X142M X142N X142Q X142S, X142T, X142V X142Y X143C X143D X143F X143G X143H, X143I, X143K X143L X143M X143N X143R X143S X143T, X143V, X143 X143Y X144A X144C X144D X144G X144H, X144I, X144L X144 X144N X144Q X144R X144S X144T, X144V, X144 X144Y X145A X145C X145D X145E X145F, X145G, X145K X145L X145M X145N X145Q X145R X145S, X145T, X145W X145Y X146A X146C X146D X146E X146F, X146G, X146I X146K X146L X146M X146Q X146R X146S, X146T, X146W X146Y X147F X147G X147I X147L X147M, X147P, X147Q X147T X147V X148A X148C X148E X148F, X148G, X148H X148I X148L X148M X148N X148S X148T, X148V, X148W X148Y X149A X149C X149F X149G X149H, X149I, X149L X149M X149P X149Q X149S X149T X149V, X150A, X150E X150F, X150G X150H X150L X150P, X150S, X150T X150V X151A X151G X151M X151S, X151V, X152A X152C X152P X152R X152S X152T, X153A, X153E X153F X153G X153I X153M X153N, X153S, X153V X153Y X154A X154C X154G X154N, X154S, X155A X155D X155E X155F X155I X155L, X155P, X155Q X155R X155S X155T X155V X155Y, X156C, X156D X156E X156F X156G X156I X156K, X156M, X156N X156P X156Q X156R X156S X156T( X156Y, X157A X157C X157D X157G X157K X157L, X157R, X157S X157V X158A X158C X158E X158F, X158K, X158L X158M X158P X158Q X158R X158S, X158V, X158W X159A X159C X159E X159G X159H, X159M, X159P X159Q X159R X159S X159V X159W, X160A, X160C X160D X160F X160G X160I X160L, X160N, X160Q X160R X160S X160T X160V X160Y, X165C, X165D X165E X165F X165G X165H X165I, X165L, X165M X165P X165R X165S X165T X165V, X165Y, X166A X166C X166D X166E X166F X166H, X166L, X166M X166N X166P X166R X166S X166T, X166 , X166Y X167A X167C X167D X167E X167F, X167H, X167I X167K X167L X167M X167N X167P, X167R, X167S X167T X167V X167W X167Y X168A, X168F, X168I X168M X168N X168P X168S X168T, X169A, X169C X169G X169I X169L X169S X170A, X170E, X170G, X170H, X170K X170L, X170N, X170P X170R X170S X170V X170W X170Y X171A X171C X171E X171F X171G X171H X171I X171L X171M X171Q X171S X171T X171V X171 X171Y X172A X172D X172F X172G X172I X172K X172L X172M X172Q X172R X172S X172T X172V X172W X172Y X173C X173D X173E X173F X173G X173H X173I X173L X173M X173N X173P X173Q X173R X173T X173W X173Y X174A X174G X174I X174N X174P X174T X174V X175A X175C X175E X175G X175H X175K X175L X175M X175Q X175S X175T X175V X175Y X176A X176C X176E X176G X176I X176K X176S X176T X176V X177A X177C X177I X177T X178A X178G X178S X178T X179A X179C X179G X179I X180C X180G X180H X180I X180L X180N X180S X180T X180V X181A X181D X181E X181G X181L X181M X181N X182A X182D X182E X182F X182H X182I X182K X182L X182M X182N X182P X182R X182S X182T X182V X182W X182Y X183A X183F X183G X183H X183I X183K X183L X183M X183P X183Q X183R X183S X183T X183V X183 X184A X184C X184D X184E X184F X184G X184H X184M X184N X184S X184T X184 X184Y X185A X185E X185F X185G X185H X185I X185K X185L X185N X185Q X185R X185S X185T X185V X185Y X186C, X186G X186H X186I, X186K, X186L X186M, X186N, X186P, X186Q X186R X186S, X186T, X186W X187A, X187C, X187D, X187E X187F X187G, X187H, X187I X187L, X187M, X187N, X187P X187Q X187S, X187T, X187V X187W, X187Y, X188A, X188D X188E X188F, X188G, X188H X188I, X188K, X188L, X188P X188Q X188R, X188S, X188T X188V, X188W, X188Y, X189A X189C X189E, X189F, X189G X189H, X189K, X189L, X189M X189N X189P, X189Q, X189R X189S, X189T, X189V, X189Y X190A X190D, X190E, X190F X190G, X190H, X190I, X190K X190L X190M, X190N, X190P X190Q, X190R, X190S, X190V X190W X190Y, X191A, X191D X191E, X191F, X191H, X191I X191K X191L, X191P, X191Q X191R, X191S, X191T, X191V X191W X191Y, X192C, X192D X192E, X192G, X192H, X192I X192K X192L, X192M, X192N X192P, X192Q, X192R, X192S X192T X192V, X192W, X192Y X193A, X193D, X193E, X193F X193G X193H, X193I, X193K X193L, X193R, X193S, X193T X193V X193W, X193Y, X194A X194C, X194D, X194E, X194F X194G X194H, X194I, X194L X194M, X194P, X194Q, X194R X194S X194T, X194V, X194W X194Y, X195A, X195C, X195D X195E X195F, X195G, X195I X195K, X195L, X195Q, X195R X195S X195T, X195V, X195 X195Y, X196A, X196D, X196E X196F X196I, X196L, X196M X196P, X196Q, X196T, X196V X196Y X197A, X197C, X197D X197E, X197F, X197G, X197H X197I X197L, X197M, X197N X197Q, X197R, X197S, X197T X197V X197 , X197Y, X198A X198D, X198E, X198F, X198G X198H X198I X198L X198 X198N, X198R X198S X198T X198W X198Y X199A X199C, X199E X199F X199G X199H X199I X199L X199M, X199S X199T X199V X199 X200A X200C X200G, X200I X200S X201C X201G X201P X201S X201T, X202F X202G X203A X203C X203E X203F X203G, X203I X203K X203L X203 X203R X203S X203T, X203 X203Y X204A X204C X204E X204F X204G, X204K X204L X204N X204P X204R X204S X204T, X204Y X205A X205F X205G X205I X205L X205M, X205T X205V X206A X206C X206D X206E X206F, X206H X206I X206K X206L X206N X206P X206Q, X206S X206T X206V X206W X206Y X207A X207G, X207S X208A X208C X208L X208N X208P X208S, X208V X209A X209C X209D X209E X209F X209G, X209I X209K X209L X209M X209N X209R X209S, X209V X209W X209Y X210A X210C X210D X210E, X210G X210H X210I X210L X210M X210N X210P, X210R X210S X210V X210 X210Y X211A X211C, X211F X211G X211H X211I X211L X211M X211P, X211R X211T X211V X211 X211Y X212C X212F, X212H X212I X212M X212N X212P X212R X212S, X212V X212Y X213A X213C X213D X213E X213F, X213I X213K X213L X213M X213N X213P X213Q, X213S X213T X213V X213W X213Y X214A X214C, X214F, X214G, X214H, X214I, X214K, X214L X214M X214N, X214P, X214Q X214R X214S X214T X214V X214W X214Y, X215A, X215C X215D X215E X215F X215G X215H X215I, X215K, X215M X215N X215P X215R X215S X215T X215V, X215W, X215Y X216A X216C X216D X216E X216F X216G, X216H, X216I X216K X216L X216M X216N X216P X216Q, X216R, X216S X216V X216W X216Y X217A X217C X217D, X217E, X217F X217G X217I X217K X217L X217M X217N, X217Q, X217S X217T X217V X217Y X218C X218D X218E, X218F, X218G X218H X218I X218L X218M X218N X218P, X218Q, X218R X218S X218T X218V X218W X218Y X219A, X219G, X219S X220A X220C X220G X220H X220N X220S, X220T, X220V X221G X221S X221T X222A X222C X222E, X222F, X222G X222I X222K X222L X222M X222N X222P, X222Q, X222R X222S X222T X222V X222 X223A X223C, X223G, X223M X223S X223T X224A X224D X224E X224G, X224I, X224L X224M X224N X224P X224S X224T X225A, X225C, X225G X225I X225N X225P X225S X225T X225V, X226C, X226F X226G X226H X226I X226L X226M X226N, X226R, X226S X226T X226V X226Y X227A X227C X227F, X227G, X227I X227L X227M X227P X227Q X227S X227T, X227V, X227Y X228A X228C X228G X228I X228L X228M, X228P, X228S X228V X229A X229G X229P X229S X230A, X230D, X230E X230F X230G X230H X230I X230L X230N, X230P, X230Q X230S X230T X230V X230W X230Y X231A, X231C, X231F, X231G, X231H, X231I, X231L, X231S, X231T, X231W, X231Y, X232A, X232G, X232H, X232K, X232L, X232M, X232P, X232S, X232V, X233A, X233C, X233E, X233F, X233G, X233I, X233L, X233M, X233N, X233P, X233Q, X233R, X233S, X233T, X233V, X233Y, X234D, X234F, X234G, X234H, X234L, X234M, X234N, X234P, X234Q, X234S, X234T, X234V, X234Y, X235C, X235D, X235E, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236G, X236H, X236K, X236L, X236N, X236P, X236Q, X236R, X236S, X236T, X236V, X236W, X236Y, X237A, X237C, X237F, X237G, X237H, X237I , X237K, X237L, X237M, X237P, X237Q, X237R, X237S, ?237?, X237V, X237 , X237Y, X238C, X238D, X238E, X238F, X238G, X238H, X238I, X238K, X238L, X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239I, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239 , X239Y, X240A, X240C, X240E, X240F, X240I, X240K, X240L, X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y, X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I, X241K, X241L, X241M, X241N, X241P, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242F, X242G, X242H, ?242?, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242R, X242S, X242T, X242V, X242W, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, ?243?, X243K, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243R, X243S, X243T, X243V X243 X244A X244D X244E X244F, X244I, X244L X244M X244N X244P X244Q X244R, X244T, X244V X244W X244Y X245A X245C X245E, X245H, X245K X245L X245P X245Q X245R X245S, X245W, X245Y X246A X246C X246E X246F X246G, X246I, X246L X246M X246N X246P X246Q X246R, X246T, X246V X246W X246Y X247A X247C X247D, X247F, X247G X247H X247I X247K X247L X247 , X247P, X247Q X247R X247S X247T X247V X247W, X248C, X248D X248E X248G X248H X248I X248K, X248M, X248N X248P X248R X248S X248T X248V, X248Y, X249A X249D X249E X249F X249G X249H, X249K, X249L X249M X249N X249Q X249R X249S, X249V, X249W X249Y X250A X250C X250E X250F, X250H, X250I X250L X250M X250N X250Q X250S, X250Y, X251A X251D X251E X251F X251G X251K, X251M, X251P X251Q X251R X251S X251T X251V, X252A, X252C X252D X252F X252G X252H X252I, X252L, X252M X252N X252P X252R X252S X252V, X252Y, X253A X253D X253E X253F X253G X253H, X253K, X253M X253R X253S X253T X253V X253W, X254C, X254D X254E X254G X254N X254P X254S, X254V, X255A X255C X255D X255E X255F X255H, X255L, X255N X255P X255Q X255R X255S X255T, X255 , X255Y X256A X256C X256D X256E X256G, X256I, X256K, X256L X256M, ?256? ?256? X256R, X256S, X256T, X256V, X256W X256Y, ?257? X257C ?257?, X257F, X257G, X257H, X257I X257K, X257L ?257? ?257?, X257S, X257T, X257V, X257 X257Y, ?258? X258C X258D, ?258?, X258F, X258G, X258H X258I, X258L ?258? ?258?, X258Q, X258R, X258S, X258T X258V, X258W ?258? ?259?, X259C, X259E, X259G, X259I X259L, ?259? ?259? X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V X260A, X260D ?260? X260F, ?260?, X260I, X260L, X260M X260N, ?260? X260R X260S, ?260?, X260V, X260Y, X261A X261C, X261E X261F X261G, X261I, X261K, X261L, X261N X261P, X261Q X261R X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y X262A, X262C X262D X262F, X262G, X262H, X262I, X262K X262L, ?262? ?262? X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V X262W, ?262? ?263? X263C, X263D, X263F, X263G, X263H X263I, ?263? X263L ?263?, ?263?, X263P, X263Q, X263R X263W, ?263? ?264? X264C, ?264?, X264F, X264G, X264H X264I , X264L ?264? X264Q, X264S, X264T, X264V, X264Y ?265?, X265C X265D X265F, X265G, X265H, X265I, X265K X265L, ?265? ?265? ?265?, X265Q, X265R, X265S, X265T X265V, X265 ?265? X266G, X266 , X266Y, X267A, X267C X267D, ?267? X267F X267G, ?267?, X267I, X267K, X267L ?267?, ?267? X267S ?267?, X267V, X267Y, X268A, X268D ?268?, X268G ?268? ?268?, X268L, X268M, X268N, X268P X268Q, X268R X268S X268V, X268W, X268Y, X269C, X269D X269F, X269G ?269? ?269?, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270E, X270F, X270G, X270H, X270I, X270L, X270M, X270N, X270P, X270Q, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273 , X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274 , X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, y X275W, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN1 B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO : 1. En algunas modalidades, la variante de subtilisina comprende cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de las posiciones enumeradas arriba .

En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona variantes de subtilisina aisladas que tienen un índice de desempeño mayor que 1 en al menos un ensayo seleccionado de un ensayo BMI, un ensayo de micromuestra de yema de huevo, y/o un ensayo de actividad AAPF, y un índice de desempeño mayor que 0.8 para estabilidad LAS o en un ensayo TCA, en donde las variantes comprenden al menos una sustitución en una o más posiciones seleccionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 , 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 , 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174 , 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183 , 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206 , 207, 208, 209, 210, 211, 212 , 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222 , 223, 224 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243 , 244 , 245, 246 , 247, 248 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260 261, 262, 263, 264 , 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, y 275, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN1 B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la variante subtilisina comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de las posiciones enumeradas arriba.

En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona variantes de subtilisina aisladas que tienen un índice de desempeño mayor que 1 en al menos un ensayo seleccionado de un ensayo BMI , un ensayo de micromuestra de yema de huevo, y/o un ensayo de actividad AAPF, y un índice de desempeño mayor que 0.8 para estabilidad LAS y/o en un ensayo TCA, en donde las variantes comprenden al menos una sustitución en una o más posiciones seleccionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, y 275, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina ???' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la variante de subtilisina comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de las posiciones enumeradas arriba.

En algunas modalidades adicionales, la presente invención proporciona variantes de subtilisina aisladas que tiene un índice de desempeño mayor que 0.8 en al menos un ensayo seleccionado de un ensayo BMI , ensayo de micromuestra de yema de huevo, y/o un ensayo de actividad AAPF, y un índice de desempeño mayor que 0.8 para estabilidad LAS y en un ensayo TCA, en donde las variantes comprenden al menos una sustitución en una o más posiciones seleccionadas de: 1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 68, 69, 72, 73, 76, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 , 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 194, 195, 198, 199, 203, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227 , 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242 , 243 , 244 , 245, 246 , 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271 , 272 , 273, 274, y 275, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina ???' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la variante de subtilisina comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de las posiciones enumeradas arriba.

En algunas modalidades adicionales, la presente invención proporciona variantes de subtilisina aisladas que tienen un índice de desempeño mayor que 1 en al menos un ensayo seleccionado de un ensayo BMI , ensayo de micromuestra de yema de huevo, y/o ensayo de actividad AAPF, y un índice de desempeño mayor que 0.8 para estabilidad LAS/EDTA o en un ensayo TCA, en donde las variantes comprenden al menos tres sustituciones seleccionadas de: X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L X002M X002N X002P X002Q X002R, X002T X002V X002 X002Y X003D X003E X003F, X003H X003I X003L X003M X003 X003P X003R, X003T X003V X003W X003Y X004A X004C X004D, X004F X004H X004K X004L X004N X004P X004R, X004T X004V X004W X005A X005C X005D X005E, X005P X005Q X005S X005T X007A X007C X007D, X007H X007N X007S X007T X008A X008F X008I, X008M X008T X008V X009D X009E X009F X009G, X009L X009N X009P X009Q X009R X009S X009T, X009W X009Y XOIOA XOIOC XOIOG XOIOH XOIOK, XOION XOIOQ XOIOR XOIOS XOIOT XOIOW X011A, X011M X011S X011V X012D X012F X012G X012H, X012K X012L X012M X012N X012Q X012R X012S, X012V X012 X013A X013G X013I X013T X013V, X014D X014E X014F X014H X014I X014K X014L, X014Q X014S X014T X014V X014Y X015A X015D, X015G X015I X015K X015L X015M X015P X015Q, X015S X015V X015W X016A X016G X016L X016N( X016Q X016S X016T X016V X017A X017F X017H, X017K X017M X017N X017R X017S X017V X017 , X018A X018C X018D X018E X018F X018G X018H, X018L X018M X018N X018P X018Q X018R X018S, X018V X018W X018Y X019A X019C X019D X019E, X019G X019H X019K X019L X019M X019N X019R, X019T, X019V X019W, X019Y, ?020?, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I X020K, X020L, ?020?, ?020?, X020Q, X020R, X020S, X020T X020V, X020 , ?020?, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G X021H, X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q X021R, X021S, X021T, X021V, X021 , ?022?, X022C, X022G X022I, ?022?, X022L, ?022?, ?022?, ?022?, X022Q, X022R X022S, ?022?, X022V, X022W, ?022?, ?023?, X023G, X023S X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, ?024?, X024L, X024M X024N, ?024?, X024Q, X024R, X024S, ?024?, X024V, X024W X025C, X025D, ?025?, X025F, X025G, ?025?, X025K, X025L X025M, ?025?, X025Q, X025R, X025S, ?025?, X025V, X025W X026C, X026F, X026G, ?026?, X026L, ?026?, X026N, X026P X026R, X026S, ?026?, X026V, ?027?, X027C, X027D, X027F X027G, ?027?, ?027?, X027L, ?027?, ?027?, X027P, X027R X027S, ?027?, X027V, X027W, ?027?, ?028?, X028E, X028H X028I , X028L, ?028?, ?028?, X028S, X028V, X029A, X029C X029G, X029S, X029V, X030C, ?030?, X030L, X030S, X030T X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031T X031V, ?033?, X033D, ?033?, X033G, ?033?, X033M, X033N X033Q, X033S, ?033?, ?033?, ?035?, X035F, X035I, X035L ?035?, ?035?, ?036?, X036C, ?036?, X036F, X036G, X036H ?036? , X036L, ?036?, ?036?, X036Q, X036R, X036S, X036T X036V, X038C, X038F, X038G, ?038?, ?038? , X038K, X038L ?038?, ?038?, X038Q, X038R, ?038?, X038V, X038W, X038Y ?039?, X039V, ?040?, X040C, X040D, ?040?, X040G, X040H, X040I, X040K, X040L, ?040?, ?040?, ?040?, X040R, X040S, X040T, X040V, X040 , ?040?, X041D, X041E, X042C, X042H, X042I, X042L, X042M, ?042?, ?042?, X042V, X043A, X043C, X043D, X043E, X043F, X043G, ?043?, X043L, X043M, X043N, X043P, X043R, X043S, ?043?, X043V, X043W, X043Y, X044A, X044C, X044D, X044G, ?044?, ?044?, X044L, X044M, X044N, X044P, X044Q, X044R, X044S, ?044?, X044V, X044W, X044Y, X045A, X045D, X045F, X045G, ?045?, ?045?, X045K, X045L, X045M, X045N, X045P, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D, ?046?, X046F, X046G, X046H, X046I, X046K, X046L, ?046?, ?046?, ?046?, X046Q, X046R, X046S, X046T, X046V, X046W, ?047?, X047F, X047G, X047N, X047R, X047S, X047T, X047 , ?048?, X048C, X048E, X048F, X048G, X048H, X048I, ?048?, X048L, ?048?, X048N, X048P, X048Q, X048R, X048S, ?048?, X048V, ?048?, X049A, X049F, X049G, X049L, X049M, ?049?, X049S, ?049?, X050C, X050F, X050H, X050I, X050L, ?050?, ?050?, X050V, X050Y, X051F, X051G, X051H, X051K, X051L, X051N, X051P, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, ?052?, X052C, ?052?, X052F, X052G, X052H, X052I, X052L, ?052?, ?052?, ?052?, X052Q, X052R, X052T, X052V, X052 , ?052?, ?053?, X053C, X053D, X053E, X053G, X053H, X053K, X053L, ?053?, ?053?, X053Q, X053R, X053S, X053T, X053V, X053 , ?053?, ?054?, X054C, X054D, X054E, X054F, X054I , ?054?, ?054?, X054Q, X054S, X054V, X055A, X055C, ?055?, X055F, X055G, ?055?, X055I, X055K X055L X055M, X055N X055P X055Q X055S, X055T, X055W X055Y X056A X056C X056D X056E X056H, X056L, X056M X056N X056P X056Q X056S X056T X057A, X057C, X057E X057F X057G X057H X057I X057K X057L, X057M, X057N X057P X057Q X057R X057S X057T X057V, X057W, X057Y X059A X059C X059D X059E X059F X059G, X059I, X059L X059M X059N X059P X059Q X059R X059S, X059T, X059V X059 X059Y X060D X060S X060V X061A, X061C, X061D X061F X061G X061H X061I X061L X061M, X061N, X061P X061R X061S X061T X061V X061Y X062C, X062E, X062F X062G X062H X062I X062K X062L X062M, X062N, X062P X062Q X062R X062S X062T X062V X062Y, X063A, X063C X063D X063E X063F X063G X063H X063K, X063M, X063Q X063R X063S X063W X066K X066S X066T, X068I, X068T X068V X069A X069E X069G X069N X069S, X069T, X071A X071I X071N X071T X071V X072C X072F, X072I, X072L X072 X072T X072V X073A X073C X073D, X073E, X073H X073K X073L X073N X073S X073T X073V, X074A, X074C X074S X075A X075H X075I X075L X075M, X075N, X075P X075Q X075R X075S X075V X076D X076E, X076F, X076G X076H X076K X076M X076N X076Q X076R, X076S, X076T X076W X076Y X077D X077N X078A X078C, X078E, X078F X078G X078H X078I X078K X078L X078M, X078N, X078P X078Q X078R X078S X078T X078V X078Y, X079C, X079D X079E X079F X079G X079I X079 X079L, X079N X079Q X079R X079S X079T X079V X079W, X081C X081G X081H X081I X081L X081M X081Q, X081T X081V X082A X082E X082F X082K X082L, X082Q X082R X082T X082V X082Y X083G X083S, X084E X084G X084I X084L X084M X084N X084T, X085A X085C X085I X086A X086C X086D X086E, X086P X086S X086 X086Y X087A X087C X087D, X087F X087G X087I X087K X087L X087N X087S, X087V X087Y X088A X088C X088D X088G X088Q, X088W X089A X089C X089D X089E X089F X089G, X089I X089L X089N X089P X089Q X089R X089S, X089V X089W X090A X090C X090F X090G X090I X090L X090M X090Q X090T X090V X091C X091D, X091I X091K X091L X091M X091N X091Q X091R, X091T X091V X091W X091Y X092A X092D X092G, X092P X092R X092T X092V X093A X093C X093G, X093M X093S X093T X093V X093Y X094K X094N, X094R X095A X095C X095G X095I X095K X095R, X095T X095V X095W X096E X096I X096L X096M, X097A X097D X097E X097G X097H X097I X097K, X097M X097N X097P X097Q X097R X097S X097T, X097Y X098A X098C X098D X098E X098F X098G, X098L X098N X098P X098Q X098R X098S X098T, X098Y X099A X099C X099F X099G X099K X099M, X099Q X099R X099S X099T X099V X099Y X100D, X100G, X100I X100P, X100S X100V X100Y X101A, X101E, X101F X101G, X101H X101I X101K X101N, X101Q, X101R X101S, X101T X101V X101Y X102A, X102D, X102G X102N, X102T X103A X103D X103E, X103G, X103I X103L, X103N X103P X103Q X103R, X103T, X103V X103Y, X104A X104C X104D X104E, X104H, X104I X104L, X104P X104R X104S X104T, X104W, X104Y X105A, X105C X105D X105E X105F, X105H, X105I X105K, X105L X105N X105Q X105R, X105T, X105V X105W, X105Y X106A X106D X106E, X106G, X106I X106L, X106M X106P X106R X106S, X106 , X107A X107F, X107I X107L X107M X107Q, X107T, X107V X108A, X108G X108I X108L X108S, X108V, X109A X109C, X109E X109F X109G X109H, X109K, X109L X109M, X109N X109Q X109R X109S, X109W, X109Y X110A, X110G X110S X111C X111E, X111I, X111L X111 , X111V X111Y X112A X112C, X112E, X112F X112G, X112I X112L X112N X112Q, X112T, X112V X112W, X112Y X114A X114C X114G, X115C, X115E X115F, X115G X115H X115I X115K, X115M, X115N X115P, X115Q X115R X115S X115T, X115W, X115Y X116A, X116C X116D X116F X116G, X116K, X116L X116M, X116N X116Q X116S X116T, X116W, X117A X117C, X117D X117F X117G X117I, X117Q, X117R X117T, X117Y X118A X118C X118D, X118F, X118G, X118I, X118K, X118L, X118M, X118N, X118P, X118R, X118S, X118T, X118V, X118W, X119A, X119C, X119F, X119H, X119M, X119N, X119Q, X119T, X119W, X120A, X120C, X120E, X120F, X120G, X120H, X120I, X120L, X120M, X120N, X120R, X120S, X120T, X120W, X121A, X121C, X121E, X121F, X121G, X121I, X121L, X121M, X121Q, X121S, X121T, X121V, X121Y, X122A, X122C, X122G, X122I , X122L, X122S, X122T, X122V, X123G, X123N, X123S, X124G, X124L, X124S, X124T, X125A, X125S, X126A, X126F, X126L, X127F, X127G, X127I , X127R, X127S, X127T, X128A, X128F, X128G, X128I, X128K, X128L, X128 , X128N, X128Q, X128R, X128S, X128T, X128W, X129A, X129E, X129F, X129G, X129I, X129L, X129M, X129N, X129P, X129R, X129S, X129T, X129V, X129W, X129Y, X130C, X130K, X130L, X130N, X130Q, X130R, X130S, X130V, X130W, X130Y, X131A, X131D, X131E, X131F, X131G, X131I, X131K, X131L, X131P, X131Q, X131R, X131V, X132A, X132E, X132F, X132H, X132I, X132L, X132M, X132N, X132Q, X132S, X132T, X132W, X133A, X133F, X133K, X133L, X133N, X133P, X133Q, X133S, X133T, X133V, X133Y, X134A, X134F, X134I, X134L, X134M, X134P, X134S, X134T, X134V, X135C, X135E, X135L, X135M, X135W, X136A, X136E, X136F, X136K, X136Q, X136R, X136S, X136V, X136W, X136Y, X137A, X137C, X137E, X137G, X137H, X137K, X137L, X137M, X137Q, X137R, X137S, X137V, X137W, X138A, X138G, X138M, X138R, X138V, X139A, X139C, X139I, X139M, X139T, X139V, X140A, X140C, X140D, X140E, X140F, X140G X140I X140L X140 X140N X140Q, X140S, X140T X140V X140Y X141D X141E X141G, X141I, X141K X141L X141N X141Q X141R X141S, X141Y, X142A X142C X142L X142T X142V X142Y, X143D, X143F X143G X143H X143I X143K X143L, X143N, X143S X143 X143V X143W X143Y X144A, X144D, X144G X144H X144I X144L X144M X144N, X144R, X144S X144T X144V X144W X144Y X145A, X145D, X145E X145F X145G X145K X145L X145M, X145Q, X145R X145S X145T X145 X145Y X146A, X146D, X146E X146G X146K X146Q X147I X147L, X147T, X147V X148A X148C X148E X148F X148H( X148L, X148M X148N X148S X148T X148V X148Y, X149C, X149I X149L X149M X149P X149S X149T, X150A, X150F X150L X150T X150V X151A X151G, X152A, X152S X153A X153G X153S X153V X156A, X156D, X156E X156F X156L X156M X156N X156S, X158A, X158C X158E X158F X158H X158K X158L, X158Q, X158R X158S X158T X158V X158 X159A, X159E, X159G X159H X159M X159P X159Q X159R, X159W, X160A X160C X160D X160F X160G X160I, X160M, X160N X160Q X160R X160S X160T X160V, X165I, X165L X165T X165V X166A X166C X166D, X166H, X166M X166N X166S X167C X167D X167E, X167P, X167V X167W X167Y X169A X169G X169S, X170D, X170E X170G X170H X170K, X170L X170P, X170Q, X170R, X170S X170V X170W X170Y, X171C X171F, X171L, X171N, X171Y X172A X172C X172D, X172F X172G, X172I, X172K, X172L X172M X172P X172Q, X172R X172S, X172T, X172V, X172Y X173A X173C X173D, X173E X173F, X173G, X173H, X173K X173L X173M X173N, X173Q X173R, X173T, X173V, X173 X174A X174G X174S, X174T X174V, X175A, X175C, X175I X175L X175M X175Q, X175T X175V, X175Y, X176A, X176G X176S X177A X177C, X177I X177T, X177V, X178A, X178G X179A X179G X180C, X180I X180L, X180S, X180T, X180V X181D X181N X182A, X182D X182E, X182F, X182G, X182H X182I X182K X182L, X182M X182N, X182P, X182Q, X182R X182S X182T X182V, X182 X182Y, X183A, X183D, X183F X183G X183H X183I, X183K X183L, X183M, X183N, X183Q X183R X183S X183T, X183V X183W, X183Y, X184D, X184N X185A X185C X185E, X185F X185G, X185H, X185I, X185K X185L X185M X185N, X185Q X185R, X185S, X185T, X185V X185Y X186H X186I, X186K X186L, X186R, X187A, X187P X187W X188A X188D, X188E X188F, X188G, X188H, X188I X188K X188L X188P, X188Q X188R, X188S, X188T, X188V X188 X188Y X191D, X191Q X192 , X192Y, X194A, X194C X194D X194E X194F, X194G X194H, X194I, X194L, X194M X194P X194Q X194R, X194S X194T, X194V, X194 , X194Y X195A X195C X195D, X195E X195G, X195Q, X195Y, X196L X196M X197A X197C, X197D X197E, X197G, X197N, X197Q X197S X197T X198A X198F X198G, X198I, X198L X198M X198N X198R X198S X198T, X199A, X199C X199I X199M X199S X199T X199V X200C, X200G X200S X203A X203C X203E X203I X203S, X203T X203V X204A X204C X204E X204F, X204I, X204K X204L X204N X204R X204S ?204?\ X204Y, X205I X205T X205V X206A X206C X206D( X206G, X206H X206I X206K X206L X206N ?206?, X206R, X206S X206T X206V X206W X206Y ?207?, X208C, X208L X208S X208T X208V X209A X209C, X209G, X209H X209I X209K X209L X209M ?209?, X209S, X209V X209W X209Y X210A X210C X210E, X210H, X210I X210L X210M X210N X210P X210R, X210V, X210Y X211A X211C X211E X211F X211G, X211I, X211L X211M X211P X211Q X211R X211T, X211W, X211Y X212C X212F X212G X212H X212I X212N, X212P X212R X212S X212T X212V X212Y, X213C, X213D X213E X213F X213G X213I X213K, X213M, X213N X213Q X213R X213S X213T X213V, X213Y, X214F X214L X214W X214Y X215A X215C, X215E, X215F X215G X215H X215I X215K X215M, X215P, X215R X215S X215T X215V X215W X215Y X216C, X216D X216E X216F X216G X216H X216I X216L, X216M X216N X216P X216Q X216R X216S, X216W, X216Y X217A X217C X217E X217F X217G, X217K, X217L, X217M, X217Q, X218C, X218D, X218E, X218F, X218G, X218H, X218I, X218M, X218N, X218Q, X218R, X218S, X218T, X218V, X218Y, X220S, X220T, X222A, X222M, X222Q, X223A, X223G, X223S, X224A, X224G, X224L, X224N, X224S, X224T, X225C, X225P, X226C, X226F, X226H, X226M, X226V, X227A, X227C, X227G, X227I, X227L, X227M, X227S, X227T, X227V, X228A, X228C, X228G, X228I, X228S, X228V, X229A, X229G, X229P, X229S, X230A, X230D, X230E, X230G, X230H, X230I, X230L, X230N, X230Q, X230S, X230T, X230V, X231A, X231C, X231F, X231G, X231H, X231I, X231L, X231S, X231T, X231Y, X232A, X232G, X232H, X232L, X232M, X232S, X232V, X233A, X233C, X233E, X233F, X233G, X233I, X233L, X233M, X233N, X233P, X233Q, X233S, X233T, X233V, X233Y, X234D, X234F, X234G, X234H, X234L, X234M, X234N, X234Q, X234S, X234T, X234V, X234Y, X235C, X235D, X235E, X235F, X235G, X235H, X235I, X235K, X235L, X235M, X235N, X235Q, X235R, X235S, X235V, X235 , X235Y, X236A, X236C, X236E, X236F, X236H, X236K, X236N, X236P, X236Q, X236R, X236S, X236T, X236V, X236 , X236Y, X237A, X237C, X237F, X237G, X237H, X237I, X237K, X237L, X237M, X237P, X237Q, X237R, X237S, X237T, X237V, X237W, X237Y, X238C, X238D, X238E, X238F, X238G, X238H, X238I, X238K, X238L, X238M, X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C, X239D, X239F, X239G, X239H, X239I, X239K, X239L, X239M, X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W, X239Y, X240A, X240C, X240E X240F X240I X240K X240L X240M, X240Q, X240R X240S X240T X240W X240Y X241A, X241D, X241E X241F X241G X241H X241I X241K, X241M, X241N X241P X241Q X241R X241S X241T, X241W, X241Y X242A X242C X242D X242F X242G, X242I, X242L X242M X242P X242Q X242R X242S, X242V, X242 X243C X243D X243E X243F X243G, X243I, X243K X243L X243M X243N X243P X243Q, X243S, X243T X243V X243W X244A X244D X244E, X244H, X244I X244L X244M X244N X244P X244Q, X244S, X244T X244V X244W X244Y X245A X245C, X245G, X245H X245K X245L X245P X245Q X245R, X245V, X245W X245Y X246A X246C X246E X246F, X246H, X246I X246L X246M X246N X246Q X246S, X246V, X246W X246Y X247A X247C X247D X247E, X247G, X247H X247I X247K X247L X247M X247N, X247Q, X247R X247S X247T X247V X247W X247Y, X248D, X248E X248G X248H X248I X248K X248L, X248P, X248R X248S X248T X248V X248W X248Y, X249D, X249E X249F X249G X249H X249I X249K, X249M, X249N X249Q X249R X249S X249T X249V, X249Y, X250A X250C X250F X250I X250L X250M, X250S, X250V X251A X251D X251E X251F X251G, X251L, X251M X251Q X251R X251T X251V X251Y, X252C, X252D X252F X252G X252H X252I X252K, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X252Y, X253A, X253D, X253E, X253F, X253G, X253H, X253I, X253K, X253M, X253R, X253S, X253T, X253V, X253W, X254A, X254C, X254G, X254S, X254T, X255A, X255C, X255D, X255E, X255F, X255H, X255I, X255L, X255N, X255P, X255Q, X255R, X255S, X255T, X255V, X255W, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256R, X256S, X256T, X256V, X256W, X256Y, X257C, X257F, X257I, X257K, X257L, X257M, X257V, X258A, X258C, X258D, X258E, X258F, X258G, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, X259T, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, X260Y, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, X262I, X262K, X262L, X262M, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262W, X262Y, X263C, X263F, X263L, X263Y, X264A, X264G, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265K, X265M, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265W, X265Y, X267G, X267I, X267L, X267M, X267N, X267V, X268A, X268G, X268H, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268S, X268V, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270G, X270I, X270L, X270M, X270N, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, ?272?, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272 , X272Y, ?273?, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I , X273L, X273S, X273T, X273V, X274A, X274C, X274D, ?274?, X274G, X274H, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274 , X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, y X275W, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de B . amyloliquefaciens subtilisina BPN1 establecida como la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la variante de subtilisina comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de las posiciones enumeradas arriba.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona variantes de subtilisina aisladas que tienen un índice de desempeño mayor que 1 en al menos un ensayo seleccionado de un ensayo BMI , un ensayo de micromuestra de yema de huevo, y/o un ensayo de actividad AAPF, y un índice de desempeño mayor que 0.8 para estabilidad LAS y en un ensayo TCA, en donde la variante comprende al menos tres sustituciones seleccionadas de: X001A, X001E, X001G, X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I, X003M, X003S, X003T, X003V, X004T X004V X008I X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S X009T X010A X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, XOION X010R X010S X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N X012Q X012S X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D X015F X015G X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S X015V X015W X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T X016V X017H X017I , X017M, X017N, X018A, X018C, X018D X018E X018G X018H, X018L, X018 , X018N, X018P, X018Q X018S X018T X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E X019F X019G X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R X019S X019V X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F X020G X020I X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q, X020R X020S X020T X020V, X020 , X020Y, X021A, X021C, X021E X021G X021H X021I, X021K, X021L, X021M, X021N, X021P X021Q X021S X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G X022I X022L X022M, X022N, X022P, X022Q, X022T, X022V X022W X023A X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F X024G X024H X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R X024S X024T X024V, X024W, X025C, X025D, X025E, X025F X025G X025K X025L, X025M, X025Q, X025R, X025S, X025T X025V X025W X026C, X026F, X026G, X026M, X026N, X026R X026S X026T X026V, X027A, X027C, X027D, X027F, X027G X027K X027L X027M, X027N, X027P, X027R, X027S, X027T X027W X028A X028I, X028L, X028M, X028V, X029A, X029C X029G X029S X029V, X030A, X030C, X030L, X030M, X030T, X030V, X031A, X031F X031I X031L, X031M, X031S X031V X033C X033M X033S X033T X035I, X035L, X035M X035P X036A X036E X036S X036T X036V, X038C, X038F X038H X038I X038K X038L X038M X038N, X038Q, X038R X038T X038V X038Y X040A X040D X040E, X040I, X040L X040P X040V X043A X043C X043D X043E, X043F, X043G X043I X043L X043M X043N X043R X043S, X043T, X043W X043Y X044A X044C X044D X044F X044G, X044I, X044K X044L X044M X044N X044Q X044R X044S, X044T, X044V X044Y X045A X045D X045F X045G X045H, X045I, X045K X045L X045 X045N X045P X045Q X045R, X045S, X045T X045V X045W X045Y X046C X046D X046E, X046G, X046H X046I X046K X046L X046M X046N X046P, X046Q, X046R X046S X046T X046V X047G X047R X048A, X048C, X048E X048F X048H X048I X048K X048L X048M, X048N, X048P X048Q X048R X048S X048T X048V X048Y, X049A, X049G X049H X049S X049T X050F X050H X050I, X050L, X050T X050V X050Y X051F X051H X051K X051L, X051R, X051S X051T X051V X051W X052A X052C X052E, X052F, X052G X052H X052I X052L X052M X052N X052P, X052Q, X052R X052T X052V X052W X052Y X053A X053C, X053D, X053E X053G X053H X053K X053L X053M X053Q, X053R, X053S X053T X053W X053Y X054A X054C X054D, X054E, X054F X054H X054M X054N X054Q X054S X055C, X055E, X055G X055H X055K X055L X055P X055Q X055S, X055T, X055W, X056A, X056C, X056D, X056E, X056H, X056L, X056M, X056N, X056P, X056Q, X056S, X056T, X057C, X057E, X057F, X057G, X057H, X057I, X057L, X057M, X057N, X057P, X057Q, X057R, X057S, X057T, X057V, X057W, X057Y, X059A, X059D, X059G, X059I, X059L, X059M, X059N, X059Q, X059R, X059S, X059T, X059V, X059W, X061A, X061C, X061D, X061F, X061G, X061H, X061I, X061L, X061M, X061N, X061P, X061R, X061S, X061T, X061V, X061Y, X062C, X062E, X062F, X062H, X062I, X062K, X062L, X062M, X062N, X062Q, X062R, X062S, X062T, X062V, X068I, X068L, X068V, X069A, X069G, X069S, X069T, X072I, X072L, X072T, X072V, X073A, X073C, X073S, X076D, X076N, X078A, X078C, X078E, X078H, X078L, X078M, X078N, X078Q, X078S, X078T, X084C, X084G, X084I, X084M, X084V, X086C, X086P, X087A, X087C, X087D, X087E, X087G, X087K, X087L, X087N, X087S, X087V, X088A, X088C, X088G, X088S, X089A, X089D, X089E, X089G, X089H, X089I, X089N, X089Q, X089R, X089S, X089T, X089W, X090C, X090I, X090L, X090M, X090Q, X090T, X090V, X091D, X091F, X091I, X091N, X091S, X091V, X091W, X091Y, X092A, X092G, X092P, X092R, X092V, X093A, X093C, X093G, X093L, X093M, X093T, X093V, X094K, X094R, X095A, X095C, X095I, X095S, X095V, X096F, X096I, X096L, X096M, X097A, X097D, X097E, X097F, X097G, X097H, X097K, X097L, X097 , X097N, X097P, X097Q, X097R, X097S, X097T, X097V, X097W, X097Y, X098A, X098C, X098D, X098E, X098F, X098G, X098K, X098L, X098N, X098P, X098Q, X098R, X098S, X098T, X098V, X098Y, X099A, X099C, X099F, X099G, X099K, X099M, X099P, X099Q, X099R, X099S, X099T, X099V, X099Y, X100D, X100E, X100G, X100I, X100K, X100N, X100R, X100S, X100T, X100V, X100Y, X101A, X101C, X101D, X101E, X101F, X101G, X101H, X101I, X101K, X101N, X101P, X101Q, X101R, X101S, X101T, X101V, X101Y, X102A, X102G, X102T, X103A, X103C, X103D, X103F, X103G, X103I, X103L, X103N, X103P, X103Q, X103R, X103S, X103T, X103V, X103W, X104C, X104F, X104H, X104I, X104L, X104R, X104S, X104T, X104V, X104 , X104Y, X105A, X105C, X105D, X105E, X105F, X105G, X105K, X105L, X105N, X105Q, X105R, X105S, X105T, X105V, X106A, X106D, X106E, X106G, X106I, X106L, X106R, X106S, X106T, X106V, X106W, X107A, X107C, X107F, X107I, X107L, X107M, X107Q, X107S, X107T, X107V, X108A, X108C, X108I, X108S, X108T, X108V, X109A, X109E, X109F, X109G, X109H, X109I, X109K, X109L, X109M, X109N, X109Q, X109R, X109S, X109T, X109W, X109Y, X110A, X110G, X110F, X110I, X111L, X111M, X112D, X112E, X112I, X112Q, X112V, X114A, X114C, X115C, X115E, X115G, X115L, X115M, X115P, X115Q, X115S, X115T, X115 , X115Y, X116A, X116C, X116D, X116F, X116G, X116I, X116K, X116L, X116M, X116N, X116Q, X116S, X116T, X116V, X116 , X117A, X117C, X117N, X117Q, X117R, X117T, X117Y, X118A, X118C, X118D, X118E, X118F, X118G, X118K, X118M, X118N, X118R, X118S, X118V, X118W, X119A, X119F, X119M, X119T, X120A, X120C, X120E, X120F, X120G, X120H, X120I, X120L, X120M, X120N, X120R, X120S, X120T, X120 , X121A, X121C, X121F, X121I, X121L, X121M, X121S, X121T, X121V, X122A, X122G, X122S, X122V, X124G, X124L, X124T, X126A, X126F, X126I, X126L, X126M, X126V, X128A, X128F, X128G, X128I, X128K, X128L, X128M, X128N, X128Q, X128R, X128S, X128T, X128W, X129A, X129E, X129F, X129G, X129M, X129N, X129P, X129R, X129S, X129Y, X130C, X130K, X130L, X130N, X130Q, X130R, X130S, X130V, X130 , X130Y, X131A, X131D, X131E, X131F, X131G, X131K, X131P, X131Q, X132A, X132H, X132I, X132N, X132Q, X132R, X132S, X132T, X133A, X133F, X133K, X133N, X133P, X133S, X133T, X133V, X133Y, X134A, X134S, X134T, X134V, X135L, X135M, X135W, X136E, X136Q, X137A, X137C, X137E, X137H, X137K, X137L, X137M, X137Q, X137R, X137S, X137W, X139C, X139I, X139V, X140D, X140E, X140N, X141D, X141E, X141G, X141H, X141I, X141K, X141L, X141N, X141Q, X141R, X141S, X141V, X141Y, X142A, X142C, X142V, X143C, X143D, X143F, X143H, X143N, X143T, X144A, X144C, X144D, X144G, X144H, X144I, X144L, X144M, X144N, X144R, X144S, X144T, X144V, X144Y, X145A, X145C, X145D, X145F, X145K, X145L, X145N, X145Q, X145R, X146D, X146G, X147I, X147L, X147T, X147V, X148C, X148I, X148L, X148M, X148N, X148V, X149C, X149I, X149L, X149V, X150A, X150L, X150T, X150V, X151A, X151S, X152A, X152S, X156D, X156E, X156L, X156N, X156S, X156T, X158A, X158C, X158E, X158F, X158H, X158K, X158L, X158M, X158Q, X158R, X158S, X158T, X158V X159A X159C X159E X159G X159H, X159P X159S X160A X160C X160D X160F X160I, X160M X160N X160Q X160S X160T X160V X160Y, X165L X165V X166A X166C X166D X166E X166H, X166S X166T X167F X167Y X170A X170D X170E, X170H X170K X170Q X170R X170S X170V X170Y, X171Y X172A X172C X172D X172G X172I X172K, X172M X172P X172Q X172R X172S X172V X172Y, X173C X173D X173H X173M X173N X173Q X173T, X174S X174T X174V X175L X175M X175V X176A, X177C X177V X180T X180V X182A X182D X182E, X183A X183D X183N X183Q X183S X184D X184N, X185C X185E X185H X185K X185M X185N X185Q, X185V X186I X186K X186L X186R X187A X187C, X188D X188E X188F X188H X188I X188K X188L, X188Q X188S X188T X191A X191D X191Q X191S, X194C X194D X194E X194F X194H X194I X194L, X194P X194Q X194R X194S X194T X194 X194Y, X195D X195E X195G X195Q X198I X198L X199C, X199S X199V X203C X203E X203T X203V X204A, X204E X204G X204N X204S X206D X206E X206H, X206N X206Q X206S X209F X209M X209W X209Y, X210C X210I X210L X210M X210N X210P X211A, X211E X211G X211H X211I X211M X211P X211Q, X211V X212C X212F X212G X212H X212M X212N, X212S, X212Y X213A, X213D X213E X213N X213Q, X213T X215A X215C X215D X215E X215H X215I X215M X215N X215S X215T X215V X215Y X216A, X216D X216E X216F X216H X216I X216L X216M, X216Q X216S X216V X216W X216Y X217A X217C, X217E X217F X217K X217L X217M X217Q X218C, X218E X218N X218Q X222C X222M X222S X223A, X224A X224N X224S X224T X227A X227C X227V, X228G X228S X228V X230A X230G X230N X230S, X230V X231A X231C X231F X231G X231S X232A, X232M X233A X233C X233E X233G X233I X233L, X233Q X233S X233T X233V X234L X234M X234N( X234S X234T X234V X235C X235F X235G X235H, X235K X235L X235M X235N X235Q X235R X235S, X235W X235Y X236A X236C X236E X236F X236H, X236Q X236S X236T X236Y X237A X237C X237F, X237H X237I X237K X237L X237M X237Q X237R, X237T X237V X237W X237Y X238C X238D X238E, X238G X238H X238I X238K X238L X238M X238N, X238R X238S X238T X238V X238Y X239C X239D, X239G X239H X239K X239L X239M X239N X239P, X239R X239S X239T X239V X239W X239Y X240A, X24.0E X240F X240I X240K X240M X240N X240Q, X240S X240T X240W X240Y X241A X241C X241D, X241F X241G X241H X241I X241K X241L X241M, X241Q, X241R, X241S, X241T, X241V, X241W, X241Y, X242A, X242C, X242D, X242G, X242H, X242I, X242L, X242M, X242P, X242Q, X242S, X242T, X242V, X243C, X243D, X243E, X243F, X243G, X243H, X243I, X243L, X243M, X243N, X243P, X243Q, X243S, X243T, X243V, X243W, X244D, X244E, X244F, X244H, X244I, X244L, X244M, X244N, X244Q, X244S, X244T, X244V, X244W, X245A, X245C, X245E, X245G, X245H, X245K, X245L, X245P, X245Q, X245S, X245V, X245W, X245Y, X246A, X246C, X246I, X246L, X246M, X246T, X246V, X247A, X247C, X247F, X247G, X247H, X247K, X247L, X247M, X247N, X247R, X247S, X247T, X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D, X248E, X248G, X248H, X248I, X248L, X248N, X248P, X248R, X248S, X248T, X248V, X248Y, X249A, X249D, X249E, X249F, X249G, X249H, X249I, X249K, X249L, X249M, X249N, X249Q, X249S, X249T, X249W, X249Y, X250C, X250I, X250L, X250M, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, X252A, X252C, X252D, X252F, X252G, X252H, X252I, X252K, X252L, X252M, X252N, X252R, X252S, X252V, X252W, X253A, X253E, X253H, X253M, X253S, X253T, X253W, X255A, X255C, X255D, X255E, X255I, X255L, X255N, X255Q, X255T, X255V, X255Y, X256A, X256C, X256D, X256E, X256G, X256H, X256I, X256K, X256L, X256M, X256N, X256P, X256S, X256V, X256W, X256Y, X258D, X258G, X259A, X259C, X259E, X259P, X259Q, X259S, X260A, X260D, X260E, X260H, X260I, X260N, X260P, X260S, X260T, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, ?262?, X262C, X262D, X262F, X262H, X262I, X262L, X262M, X262Q, ?262?, X262V, X262Y, X265A, X265D, X265S, X267I , X267L, ?268?, X268L, X268V, X269D, X269H, X269N, X269Q, X269S, ?270?, X270C, X270G, X270I, X270L, X270N, X270S, ?270?, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, ?272?, X272F, X272G, X272H, X272L, X272M, X272N, X272P, X272S, ?272?, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273G, X273S, ?274?, X274C, X274G, X274L, X274M, X274N, X274S, X274T, X275D, ?275?, X275F, ?275?, ?275?, X275L, ?275?, ?275?, X275Q, y X275R, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina ???' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la variante de subtilisina comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de las posiciones enumeradas arriba.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona variantes de subtilisina aisladas que tienen un índice de desempeño mayor que 1 en al menos un ensayo seleccionado de un ensayo BMI , un ensayo de micromuestra de yema de huevo, y/o un ensayo de actividad AAPF, y un índice de desempeño mayor que 0.8 para estabilidad LAS o en un ensayo TCA, en donde la variante comprende al menos tres sustituciones seleccionadas de: X001A, X001E, X001G, X001H, X001Q X001V X003E, X003H X003I X003M, X003S X003V X004T X004V, X008I X008V X009E X009H X009Q X009S X009T, X010A X010C X010G X010H XOIOM X010N X010R, X010S X010T X011I X011V X012I X012N X012Q, X012S X012T X012V X013A X015A X015D X015F, X015G X015I X015L X015M X015Q X015S X015V, X015W X016A X016G X016N X016S X016T X016V, X017H X017I X017M X017N X018C X018D X018E, X018G X018H X018L X018M X018P X018Q X018S, X018T X018V X018Y X019A X019D X019E X019F, X019G X019H X019K X019L X019N X019R X019S, X019V X019W X019Y X020A X020D X020F X020G, X020I X020K X020L X020M X020Q X020R X020S, X020T X020V X020W X020Y X021C X021E X021G, X021H X021I X021K X021L X021N X021P X021Q, X021S X021T X021V X021W X022C X022G X022I, X022L X022M X022N X022P X022T X022V X022W, X023A X023G X023S X024A X024D X024F X024G, X024H X024L X024M X024N X024Q X024R X024S, X024T X024V X024W X025C X025E X025F X025G, X025 X025L X025M X025Q X025S X025T X025V, X025W X026C X026F X026G X026N X026R X026S, X026T X026V X027A X027C X027F X027G X027K, X027L X027M X027N X027P X027S X027T X027W, X028A X028I X028L X028M X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, ?030?, X030C, X030L, X030M, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031V, X033C, ?033?, X033S, ?033?, ?035?, X035L, X035M, X035P, ?036?, ?036?, X036S, ?036?, X036V, X038C, X038F, X038H, ?038?, ?038?, X038L, ?038?, ?038?, X038Q, X038R, X038T, X038V, ?038?, ?040?, X040D, ?040?, ?040?, X040L, X040P, X040V, ?043?, X043C, X043D, ?043?, X043F, X043G, X043I, X043L, ?043?, ?043?, X043R, X043S, ?043?, X043W, X043Y, ?044?, X044C, X044D, X044F, X044G, ?044?, X044K, X044L, ?044?, ?044?, X044Q, X044R, X044S, ?044?, X044V, X044Y, ?045?, X045D, X045F, X045G, ?045?, ?045?, X045K, X045L, ?045?, ?045?, ?045?, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V, X045W, ?045?, X046C, X046D, ?046?, X046G, X046H, X046I , ?046?, X046L, ?046?, ?046?, ?046?, X046Q, X046R, X046S, ?046?, X046V, X047G, X047R, ?048?, X048C, X048E, X048F, ?048?, ?048? , ?048?, X048L, ?048?, ?048?, X048P, X048Q, X048R, X048S, ?048?, X048V, ?048?, ?049?, X049G, ?049?, X049S, ?049?, X050F, ?050?, ?050?, X050L, X050T, X050V, ?050?, X051F, X051H, X051K, X051L, X051R, X051S, X051T, X051V, X051W, ?052?, X052C, ?052?, X052F, X052G, ?052?, ?052?, X052L, ?052?, ?052?, ?052?, X052Q, X052R, ?052?, X052V, X052W, ?052?, ?053?, X053C, X053D, X053E, X053G, ?053?, ?053?, X053L, ?053?, X053Q, X053R, X053S, ?053?, X053 , ?053?, ?054?, X054C, X054D, ?054?, X054F, ?054?, ?054?, ?054?, X054Q, X054S, X055C, ?055?, X055G, X055H X055K X055L, X055P X055Q X055S, X055T, X055W, X056A X056C X056D, X056E X056H X056L, X056M, X056N, X056P X056Q X056S, X056T X057C X057E, X057F, X057G, X057H X057I X057L, X057M X057N X057P, X057Q, X057R, X057S X057T X057V, X057W X057Y X059A, X059D, X059G, X059I X059L X059M, X059N X059Q X059R, X059S, X059T, X059V X059W X061A, X061C X061D X061F, X061G, X061H, X061I X061L X061M, X061N X061P X061R, X061S, X061T, X061V X061Y X062C, X062E X062F X062H, X062I , X062K, X062L X062M X062N, X062Q X062R X062S, ?062?, X062V, X068I X068L X068V, X069A X069G X069S, ?069?, X072I, X072L X072T X072V, X073A X073C X073S, X076D, X076N, X078A X078C X078E, X078H X078L X078M, ?078?, X078Q, X078S X078T X084C, X084G X084I X084M, X084V, X086C, X086P X087A X087C, X087D X087E X087G, ?087?, X087L, X087N X087S X087V, X088A X088C X088G, X088S, X089A, X089D X089E X089G, X089H X089I X089N, X089Q, X089R, X089S X089T X089W, X090C X090I X090L, ?090?, X090Q, X090T X090V X091D, X091F X091I X091N, X091S, X091V, X091 X091Y X092A, X092G X092P X092R, X092V, X093A, X093C X093G X093L, X093M X093T X093V, ?094?, X094R, X095A X095C X095I, X095S X095V X096F, ?096?, X096L, X096M X097A X097D, X097E X097F X097G, ?097?, X097K, X097L X097M X097N, X097P X097Q X097R, X097S, X097T, X097V X097W X097Y, X098A X098C X098D, ?098?, X098F, X098G, X098K, X098L, X098N, X098P, X098Q, X098R, X098S, X098T, X098V, X098Y, X099A, X099C, X099F, X099G, X099K, X099M, X099P, X099Q, X099R, X099S, X099T, X099V, X099Y, X100D, X100E, X100G, X100I, X100K, X100N, X100R, X100S, X100T, X100V, X100Y, X101A, X101C, X101D, X101E, X101F, X101G, X101H, X101I, X101K, X101N, X101P, X101Q, X101R, X101S, X101T, X101V, X101Y, X102A, X102G, X102T, X103A, X103C, X103D, X103F, X103G, X103I, X103L, X103N, X103P, X103Q, X103R, X103S, X103T, X103V, X103 , X104C, X104F, X104H, X104I, X104L, X104R, X104S, X104T, X104V, X104W, X104Y, X105A, X105C, X105D, X105E, X105F, X105G, X105K, X105L, X105N, X105Q, X105R, X105S, X105T, X105V, X106A, X106D, X106E, X106G, X106I, X106L, X106R, X106S, X106T, X106V, X106W, X107A, X107C, X107F, X107I, X107L, X107M, X107Q, X107S, X107T, X107V, X108A, X108C, X108I, X108S, X108T, X108V, X109A, X109E, X109F, X109G, X109H, X109I, X109K, X109L, X109M, X109N, X109Q, X109R, X109S, X109T, X109 , X109Y, X110A, X110G, X111F, X111I, X111L, X111M, X112D, X112E, X112I, X112Q, X112V, X114A, X114C, X115C, X115E, X115G, X115L, X115M, X115P, X115Q, X115S, X115T, X115 , X115Y, X116A, X116C, X116D, X116F, X116G, X116I, X116K, X116L, X116M, X116N, X116Q, X116S, X116T, X1169V, X116 , X117A, X117C X117N, X117Q, X117R, X117T, X117Y, X118A, X118C, X118D, X118E, X118F, X118G, X118K, X118M, X118N, X118R, X118S, X118V, X118W, X119A, X119F, X119M, X119T, X120A, X120C, X120E, X120F, X120G, X120H, X120I, X120L, X120M, X120N, X120R, X120S, X120T, X120W, X121A, X121C, X121F, X121I, X121L, X121M, X121S, X121T, X121V, X122A, X122G, X122S, X122V, X124G, X124L, X124T, X126A, X126F, X126I, X126L, X126M, X126V, X128A, X128F, X128G, X128I, X128K, X128L, X128 , X128N, X128Q, X128R, X128S, X128T, X128W, X129A, X129E, X129F, X129G, X129M, X129N, X129P, X129R, X129S, X129Y, X130C, X130K, X130L, X130N, X130Q, X130R, X130S, X130V, X130 , X130Y, X131A, X131D, X131E, X131F, X131G, X131K, X131P, X131Q, X132A, X132H, X132I, X132N, X132Q, X132R, X132S, X132T, X133A, X133F, X133K, X133N, X133P, X133S, X133T, X133V, X133Y, X134A, X134S, X134T, X134V, X135L, X135M, X135 , X136E, X136Q, X137A, X137C, X137E, X137H, X137K, X137L, X137M, X137Q, X137R, X137S, X137W, X139C, X139I, X139V, X140D, X140E, X140N, X141D, X141E, X141G, X141H, X141I, X141K, X141L, X141N, X141Q, X141R, X141S, X141V, X141Y, X142A, X142C, X142V, X143C, X143D, X143F, X143H, X143N, X143T, X144A, X144C, X144D, X144G, X144H, X144I, X144L, X144M, X144N, X144R, X144S, X144T, X144V, X144Y, X145A, X145C, X145D, X145F, X145K, X145L, X145N, X145Q, X145R, X146D, X146G, X147I, X147L, X147T, X147V, X148C, X148I, X148L, X148M, X148N, X148V, X149C, X149I, X149L, X149V, X150A, X150L, X150T, X150V, X151A, X151S, X152A, X152S, X156D, X156E, X156L, X156N, X156S, X156T, X158A, X158C, X158E, X158F, X158H, X158K, X158L, X158M, X158Q, X158R, X158S, X158T, X158V, X159A, X159C, X159E, X159G, X159H, X159M, X159P, X159S, X160A, X160C, X160D, X160F, X160I, X160L, X160M, X160N, X160Q, X160S, X160T, X160V, X160Y, X165I, X165L, X165V, X166A, X166C, X166D, X166E, X166H, X166M, X166S, X166T, X167F, X167Y, X170A, X170D, X170E, X170G, X170H, X170K, X170Q, X170R, X170S, X170V, X170Y, X171C, X171Y, X172A, X172C, X172D, X172G, X172I, X172K, X172L, X172M, X172P, X172Q, X172R, X172S, X172V, X172Y, X173A, X173C, X173D, X173H, X173M, X173N, X173Q, X173T, X174A, X174S, X174T, X174V, X175L, X175M, X175V, X176A, X176S, X177C, X177V, X180T, X180V, X182A, X182D, X182E, X182Q, X183A, X183D, X183N, X183Q, X183S, X184D, X184N, X185A, X185C, X185E, X185H, X185K, X185M, X185N, X185Q, X185T, X185V, X186I , X186K, X186L, X186R, X187A, X187C, X188A, X188D, X188E, X188F, X188H, X188I, X188K, X188L, X188P, X188Q, X188S, X188T, X191A, X191D, X191Q, X191S, X194A, X194C, X194D, X194E, X194F, X194H, X194I, X194L, X194M, X194P, X194Q, X194R, X194S, X194T, X194W, X194Y, X195C, X195D, X195E, X195G, X195Q, X198I, X198L, X199C, X199M, X199S, X199V, X203C, ?203?, ?203?, X203V, ?204?, X204C, X204E, X204G, ?204?, X204S, X206D, ?206?, ?206?, X206L, X206N, X206Q, X206S, X209F, ?209?, X209W, ?209?, X210A, X210C, X210I , X210L, X210 , X210N, X210P, X211A, X211C, X211E, X211G, X211H, X211I, X211M, X211P, X211Q, X211T, X211V, X212C X212F X212G X212H X212M X212N, X212R, X212S, X212Y X213A X213D X213E X213N X213Q, X213S, X213T, X215A X215C X215D X215E X215H X215I, X215K, X215M, X215N X215S X215T X215V X215Y X216A, X216C, X216D, X216E X216F X216H X216I X216L X216M, X216N, X216Q, X216S X216V X216W X216Y X217A X217C, X217D, X217E, X217F X217K X217L X217M X217Q X218C, X218D, X218E, X218N X218Q X222C X222M X222S X223A, X223S, X224A, X224N X224S X224T X227A X227C X227V, X228A, X228G, X228S X228V X230A X230G X230N X230S, X230T, X230V, X231A X231C X231F X231G X231S X232A, X232L, X232M, X233A X233C X233E X233G X233I X233L, X233N, X233Q, X233S X233T X233V X234L X234M X234N, X234Q, X234S, X234T X234V X235C X235F X235G X235H, X235I , X235K, X235L X235M X235N X235Q X235R X235S, X235V, X235W, X235Y X236A X236C X236E X236F X236H, ?236?, X236Q, X236S X236T X236Y X237A X237C X237F, X237G, X237H, X237I X237K X237L X237M X237Q X237R, X237S, X237T, X237V X237W X237Y X238C X238D X238E, X238F, X238G, X238H X238I X238K X238L X238M X238N, X238Q, X238R, X238S X238T X238V X238Y X239C X239D, X239F, X239G, X239H X239K X239L X239M X239N X239P, X239Q, X239R, X239S X239T X239V X239 X239Y X240A, X240C, X240E, X240F X240I X240K X240M X240N X240Q, X240R, X240S, X240T X240W X240Y X241A X241C X241D, X241E, X241F, X241G X241H, X241I X241K, X241L, X241M X241Q, X241R X241S X241T X241V X241 X241Y X242C, X242D X242G X242H X242I X242L X242M X242Q, X242S X242T X242V X243C X243D X243E X243G, X243H X243I X243L X243M X243N X243P X243S, X243T X243V X243W X244D X244E X244F X244I, X244L X244M X244N X244Q X244S X244T X244 , X245A X245C X245E X245G X245H X245K X245P, X245Q X245S X245V X245W X245Y X246A X246I, X246L X246M X246T X246V X247A X247C X247G, X247H X247K X247L X247M X247N X247R X247T, X247V X247W X247Y X248C X248D X248E X248H, X248I X248L X248N X248P X248R X248S X248V, X248Y X249A X249D X249E X249F X249G X249I, X249K X249L X249M X249N X249Q X249S X249W, X249Y X250C X250I X250L X250M X250V X251D, X251E X251F X251G X251K X251L X251M X251R, X251T X251V X251Y X252A X252C X252D X252G, X252H X252I X252 X252L X252M X252N X252S, X252V X252 X253A X253E X253H X253M X253T, X253W X255A X255C X255D X255E X255I X255N, X255Q X255T X255V X255Y X256A X256C X256E, X256G X256H X256I X256K X256L X256M X256P, X256S X256V X256W X256Y X258D X258G X259C, X259E X259P X259Q X259S X260A X260D X260H, X260I, X260N, X260P, X260S, X260T, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262H, X262I, X262L, X262M, X262Q, X262T, X262V, X262Y, X265A, X265D, X265S, X267I, X267L, X268A, X268L, X268V, X269D, X269H, X269N, X269Q, X269S, X270A, X270C, X270G, X270I, X270L, X270N, X270S, X270T, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272L, X272M, X272N, X272P, X272S, X272T, X272 , X272Y, X273A, X273C, X273G, X273S, X274A, X274C, X274G, X274L, X274M, X274N, X274S, X274T, X275D, X275E, X275F, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, y X275R, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN1 B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, la variante de subtilisina comprende dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más de las posiciones enumeradas arriba.

En algunas modalidades, las variantes de subtilisina comprenden una sustitución adicional en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de: 18, 52, 72, 117, 119, 127, 144, 185, 209 y 213, y en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina ???' 23. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

En algunas modalidades particularmente preferidas, las variantes de subtilisina aisladas descritas anteriormente y en la presente son variantes GG36. En algunas modalidades preferidas, las variantes GG36 son variantes de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades alternativas, las variantes de subtilisina aisladas descritas arriba y en la presente son variantes BP ' .

En todavía algunas modalidades adicionales, las variantes de subtilisina aisladas comprenden una combinación de sustituciones seleccionadas de: S87N/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87D/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q10.9R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D, y S87N/Q109Q/G118V/S128LP129Q/S130A/S188R/T213E/N248R, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BP 1 B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

En todavía algunas modalidades adicionales, las variantes de subtilisina aisladas comprenden una combinación de sustituciones seleccionadas de: S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, y S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BP 1 B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

En aún algunas modalidades adicionales, las variantes de subtilisina aisladas comprenden una combinación de sustituciones seleccionadas de: S87D/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, S87N/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87D/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D, y S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina ???' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

En algunas modalidades adicionales, la presente invención proporciona variantes de subtilisina aisladas que comprenden una combinación de sustituciones seleccionadas de: A001C/S024V/I107L, A001I/R045T/I107R/A172T, A001K/A172L, A001K/A172W, A001K/I072C/L126F, A001K/I072C/L126F/S164Q, A001K/I072C/V104I/L126F, A001K/I072C/V104I/L126F/S164Q, A001K/I072V, A001K/I072V/L126F, A001K/I072V/L126F/S164F, A001K/I072V/V104I, A001K/I072V/V104I/L126F/S164I , A001K/I072V/V104I/S164F, A001K/I072V/V104I/S164Q, A001K/I107T/A172Q, A001K/I107V/G127Q, A001K/I107V/G127Q/A172Q, A001K/I107V/G127R/A172Q, A001K/L126F, A001K/L126F/S164F, A001K/L126F/S164I , A001K/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072C, A001K/R045F/I072C/L126F, A001K/R045F/I072C/V104I/S16 F, A001K/R045F/I072V/L126F/S164I, A001K/R045F/I072V/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072V/S164F, A001K/R045F/I072V/V104G/S164T, A001K/R045F/I107L/A172N, A001K/R045F/I107T, A001K/R045F/I107V/G127Q, A001K/R045F/L126F/S164F, A001K/R045F/L126F/S164I, A001K/R045F/S164F, A001K/R045F/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072C/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/L126F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164F, A001K/R045 /I072V/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/S164F, A001K/R045K/I072V/S164Q, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I107A/A172T, A001K/R045K/I107R/G127A/A172N, A001K/R045K/I107T/G127R, A001K/R045K/I107T/G127R/A172Q, A001K/R045K/L126F, A001K/R045K/L126F/S164I, A001K/R045K/L126F/S164P, A001K/R045K/L126F/S164Q, A001K/R045K/S164F, A001K/R045K/V104I/S164Q, A001K/R045K/V104L/S164A, A001K/R045N/I107T/G127Q, A001K/R045S/V104C/L126Y/S164F, A001K/S024H/I107T/G127Q, A001K/S024H/I107T/G127R, A001K/S024H/I107V, A001K/S024H/R045N/I107T, A001K/S024H/R045N/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024L/R045A, A001K/S024N/I107V/G127T, A001K/S024N/R045K/A172Y, A001K/S024R/I107T, A001K/S024R/R045N/A172C, A001K/S024R/R045N/I107T, A001K/S024R/R045N/I107T/G127R, A001K/S024T/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024T/R045N/G127Q/A172Q, A001K/S024W/I107T/G127R, A001K/S024W/I107V/G127T/A172Q, A001K/S164Q, A001K/V104E, A001K/V104I/L126F, A001K/V104I/L126F/S164I, A001K/V104I/L126F/S164Q, A001L/I072C, A001L/R045Q/G127H/A172R, A001L/S024D/R045Y/I107Y, A001M/R045S/I107E/A172D, A001P/A172V, A001Q/R045K/I107T, A001R/A172G, A001R/A172Q, A001R/I107T, A001R/I107T/A172Q, A001R/I107T/G127Q/A172Q, A001R/I107V/A172Q, A001R/R045F, A001R/R045K/A172Q, A001R/R045 /G127R, A001R/R045K/I107T/G127Q, A001R/R045K/I107V/G127R, A001R/R045N/A172K, A001R/R045N/A172Q, A001R/R045N/I107T, A001R/R045N/I107T/G127Q, A001R/R045N/I107V/A172V, A001R/R045N/I107V/G127Q/A172Q, A001R/R045N/I107V/G127R, A001R/S024H/I107T, A001R/S024H/R045K/I107T, A001R/S024H/R045K/I107T/A172Q, A001R/S024H/R045N/I107T/A172Q, A001R/S024N, A001R/S024R, A001R/S024R/A172H, A001R/S024R/A172Q, A001R/S024R/I107V/A172L, A001R/S024R/I107V/G127R, A001R/S024R/R045F/I107T/G127Q, A001R/S024R/R045F/I107T/G127R, A001R/S024R/R045K/I107T/G127Q, A001R/S024T/I107T/A172Q, A001R/S024T/R045 /A172Q, A001R/S024T/R045K/I107L/G127P/A172P, A001R/S024T/R045N/I107T/A172Q, A001R/S024 /I107V/A172S , A001R/S024W/R045F/I107V/G127Q, A001R/S024W/R045F/I107V/G127R, A001R/S024 /R045K, A001R/S024W/R045K/I107T/A172Q, A001R/S024W/R045N/I107T, A001S/A172V, A001S/S024L/I107Y/A172S, A001T/S024H/I107L/A172Y, A001V/I107L/A172I, G097P/N185Q/A215I , G097P/Y209W/A215V/S256W, G118L/G127R/S132L, G118T/G127Q, I107A/G127K/A172G, I107C/A172S, I107P/A172S, I107Q/A172D, L126A/S164N, L126F/S164V, M119F/N185R, M119F/N185R/Y209W/S256T, M119F/N185V/Y209W, M119F/S144T/N185V/S256I, M119F/S144W/N185R/S256L, M119F/Y209W, M119F/Y209W/S256I , N018K/A215I, N018K/A215R, N018K/A215V, N018K/G097P/A215I/S256W, N018K/G097P/N185K/S256W, N018K/G097P/N185K/Y209W/A215I/S256W, N018K/G097P/N185Q/Y209W/A215V/S256W, N018K/G097P/N185R/A215R/S256W, N018K/G097P/N185R/A215V/S256W, N018K/G097P/N185R/S256 , N018K/G097P/N185R/Y209W, N018K/G097P/N185R/Y209W/S256W, N018K/G097P/Y209W/A215V/S256W, 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S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185K/Y209W/A215V/S256 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185Q/Y209W/A215R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185Q/Y209W/A215V/S256W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185R/A215V/S256 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185R/S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185R/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185R/Y209W/A215V/S256R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185R/Y209W/S256L, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N248I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052I/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052I/S101E/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052I/S101F/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052I/S101V/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/G097T/N185R/Y209 /S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S101E/N248I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S101R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144T/N185R/S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144T/N185R/Y209 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144T/Y209W/S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144V/N185R/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144V/N185R/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144V/N185R/Y209W/S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144V/N185V/Y209 /S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144V/Y209 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144Y/N185R/Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144Y/N185R/Y209 /S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144Y/N185V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/S144Y/N185V/Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/Y209 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/Y209 /S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Q109I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Q109L/G127Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Q109T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Q109T/G127Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Q109V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/R045F/I107T/A172Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/R045K/I072C/L126F, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/R045N/A172Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/R045N/I107V/A172P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/R045S, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/I107V/A172S, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/Q109V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/Q109V/G127Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/R045N/I107T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/S099K/S103N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/S099K/S103N/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/S099Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/S099Q/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/S099Q/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/S099T/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/S099T/S103P/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/S099T/S103P/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/S099T/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/S103P/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024L/S099K/S103P/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024N/I107N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024N/I107T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024N/I107V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024N/Q109K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024N/Q109T/G127T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024R/G127R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024R/I107T/A172Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024R/I107V/A172S, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024R/Q109K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024R/Q109L, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024R/Q109L/G127Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024R/Q109V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024R/R045F/I107T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024T/G127T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024T/I107T/A172Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024T/Q109V/G127T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024T/R045N/I107V/A172S, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/G127T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/I107T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /Q109I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/Q109L, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/Q109R/G127Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/Q109T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/Q109V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/R045F/I107V/A172Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /S099K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /S099K/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /S099K/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /S099Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /S099Q/S103N/G127R/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099Q/S103N/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099Q/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /S099Q/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099Q/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/G127R/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/S103N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/S103N/G127R/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/S103N/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /S099T/S103P/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099K/S103N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099K/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099K/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q/S103N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q/S103P/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/G127Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/S103N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/S103N/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/S103P/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101E, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101E/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101F/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101N/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101R/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S103N/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R/Y209 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R/Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185V/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185R/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185R/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V/Y209 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/Y209W/S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144W/Y209 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R/Y209W/S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164F, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164I , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/A215I/S256W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/S256W, S099H/S103I/G118N, S099K/G118R, S099K/S103N/G118T, S099K/S103P/G118L/S132N, S099K/S103P/G127Q, S099K/S103P/S132H, S099K/S103R/G118A/S132P, S099N/S132R, S099Q/G118F/G127R, S099Q/G118T/G127Q, S099Q/S103N/G118R/S132N, S099Q/S103N/G118T, S099Q/S103N/G118T/S132H, S099Q/S103N/S132H, S099Q/S103P/G118R, S099Q/S103P/G118R/S132N, S099Q/S103P/S132H, S099Q/S132R, S099T/G118F, S099T/G118R/S132H, S099T/G118T/S132H, S099T/G118T/S132N, S099T/S103P, S099T/S103P/G118L/S132H, S101E/N117I, S101E/N117Y/N248K, S101F/N117I/N248I , S101F/N117Y/N248I, S101F/N117Y/N248K, S101F/N248K, S101R/N117I/N248K, S101R/N117Y, S101R/N248K, S101T/N117Y/N248K, S101T/N248I, S101V/N248K, S101Y/N117I/N248K, S101Y/N117Y, S101Y/N248K, S103G/G118I/G127E/S132E, S103L/S132E, S103R/S132P, S144T/N185R, S144T/N185R/Y209 /S256I , S144T/N185R/Y209W/S256T, S144T/N185V, S144V/N185R/S256I , S144V/N185R/Y209W, S144V/N185R/Y209W/S256T, S144V/S256I, S144V/Y209W, S144W/N185R/Y209 /S256T, S144 /N185V/Y209W/S256I, S144W/S256I, S144Y/Y209W/S256I , V104E/L126I/S164L, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina ???' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO : 1.

En todavía algunas modalidades adicionales, la presente invención proporciona variantes de subtilisina aisladas que comprenden una combinación de sustituciones seleccionadas de: TS87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109R/N185R/A215 R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109L/N185R/A215 R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101K/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24 /S101L/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109R/N185R/A215 R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/I72V/S164I/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24 /S101Y/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N43S/P52V/S101R/Q109R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24 /S101Y/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/N76D/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/V118R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101M, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/N76D/G97P/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101V/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101V/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101H/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101H/S164I , S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109L/N185R/A215 R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101M/S188D/N248R, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A S188D,* N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/N248K, S87N/G118V/G127S/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101H/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101K/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101V/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101Y/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101L/G118V/S128L/P129Q/S130A, I72V/S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A//S164I, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN 1 B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO : 1.

La presente invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican las variantes de subtilisina establecidas arriba y en la presente. La presente invención además proporciona vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos que codifican las variantes de subtilisina proporcionadas arriba y en la presente. Además, la presente invención proporciona células hospederas que comprenden el vector de expresión que codifica los ácidos nucleicos que codifican las variantes de subtilisina proporcionadas arriba y en la presente.

La presente invención también proporciona composiciones de limpieza que comprenden las variantes de subtilisina proporcionadas en la presente. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza comprenden un detergente líquido, en gel, en polvo y/o en gránulo. En algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpieza se seleccionan de detergentes para lavandería y detergentes para platos . En algunas modalidades preferidas, las composiciones de limpieza comprenden detergentes para lavandería . En algunas modalidades particularmente preferidas, las composiciones de limpieza son detergentes de alta resistencia. En algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpieza comprenden detergentes para platos seleccionados de detergentes de lava platos automáticos y lava platos a mano. En algunas modalidades preferidas adicionales, las composiciones de limpieza proporcionadas en la presente además comprenden al menos un agente blanqueador. En algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpieza proporcionadas en la presente son libres de fosfatos, mientras que en algunas modalidades alternativas, las composiciones de limpieza proporcionadas en la presente son detergentes que contienen fosfatos. En todavía algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpieza proporcionadas en la presente son detergentes de agua fría. En aún algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpieza proporcionadas en la presente además comprenden al menos una enzima adicional. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza comprenden al menos una enzima adicional seleccionada de hemicelulasas, celulasas, peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, liasas de pectato, mananasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas, arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, y amilasas, o mezclas de los mismos.

La presente invención también proporciona métodos para limpieza, que comprenden proporcionar un artículo que va a limpiarse y una composición que comprende al menos una composición de limpieza proporcionada en la presente, y poner en contacto el artículo con la composición, bajo condiciones efectivas para proporcionar limpieza del artículo. En algunas modalidades, los métodos además comprenden la etapa de enjuagar el artículo después de poner en contacto el artículo con la composición de limpieza. En algunas modalidades preferidas, el artículo que va a limpiarse comprende vajilla. En algunas modalidades alternativas, el artículo que va a limpiarse comprende tela.

Breve Descripción de las Figuras La FIG. 1 proporciona una alineación de diversas proteasas de referencia que incluyen: BPN ' (SEQ ID N0:1), GC GCI-P036 (SEQ ID NO : 2 ) , GCI-P037 (SEQ ID NO:3), y GCI-P038 (SEQ ID N0:4) . A menos que se especifique de otra manera, posiciones de sustitución se dan en relación con BPN1.

La FIG. 2 proporciona un mapa de pHPLT-GG36.

La FIG. 3 proporciona un mapa de p2JH-GG36ci.

La FIG. 4 representa la concentración de proteasa como se determina usando un ensayo de inhibición de eglina c para proteasas variantes.

La FIG. 5 representa desempeño de lavado (microensayo BMI) de proteasas variantes.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona métodos para la fabricación por ingeniería de proteína y variantes de serina proteasa producidas por los mismos. Específicamente, la presente invención proporciona variantes de serina proteasa que tienen una o más sustituciones como se compara con una serina proteasa de referencia. Además, la presente invención proporciona composiciones que comprenden estas variantes de serina proteasa. En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de limpieza que comprenden al menos una de estas variantes de serina proteasa .

Para propósitos prácticos, no es usualmente necesario encontrar la mejor secuencia en un espacio de proteína con objeto de crear una proteína que es óptima para una aplicación particular. Para la mayoría de las aplicaciones, el problema a resolverse es identificar al menos una secuencia de proteína que cumple o excede el valor mínimo requerido por un número de propiedades. Esto requiere el conocimiento de las mutaciones que son buenas para una propiedad particular, así como conocimiento de estas mutaciones que son malas para cualquiera de las propiedades deseadas. La presente invención proporciona medios para cumplir la meta al identificar aquellas posiciones en la proteína que se pueden alterar para mejorar la propiedad principal y mantener los valores para otras propiedades dentro de los límites deseados.

La presente invención proporciona medios para evaluar todas las posiciones en una proteína para todas las propiedades de interés por la construcción de "colecciones de evaluación de sitio" en cada sitio. En modalidades preferidas, estas colecciones contienen 9-19 mutaciones en cada posición, y se usan para evaluar cada posición para usar en fabricación por ingeniería de la proteína y construcción de colecciones. Cada propiedad se mide en relación a la enzima de referencia y se calcula una aparente diferencia de energía libre para cada mutante vs . tipo natural. Estos valores aparentes delta delta G ("esto es, AAG" ) se usan luego para determinar su aditividad.

Una forma ideal para analizar variantes podría ser a través de la diferencia en energía libre para la variante contra la proteína de referencia en el proceso de interés. Loa Energía Libre Gibbs para un proceso representa la cantidad máxima de trabajo que se puede realizar por un sistema. El cambio en Energía Libre relativa a la enzima de referencia (??? se da como sigue; ?? G = -RT ln (kvariante/kreferencia) donde kvariante es la constante de velocidad para la enzima de variante, y kreferencia es la constante de velocidad para la enzima de referencia, R es la ley de Gas constante y T es la temperatura absoluta. La mayoría de los ensayos no se construyen para permitir la determinación de Energías Libres verdaderas, por lo que se utiliza una cantidad ?? G a = -RT ln (Pvariante/Preferencia) donde Pvariante es el valor de desempeño para la variante y referencia es el valor de desempeño para la enzima de referencia bajo las mismas condiciones. Los valores ?? G app se pueden esperar para comportarse en una forma similar como a ?? G para distribuciones de datos y aditividad. Sin embargo, ya que ?? G es la cantidad máxima de trabajo que se puede llevar a cabo por la variante comparada con la enzima de referencia, la cantidad ?? G app generalmente subestimará el ?? G y lleva a resultados que aparecen sinérgicos en que las propiedades de dos posiciones aditivas pueden ser mayores q e el valor previsto al agregar sus valores ?? G app juntos.

Además, la presente invención proporciona variantes de subtilisina y composiciones que comprenden estas variantes.

Definiciones A menos que se indique de otra manera, la práctica de la presente invención implica técnicas convencionales comúnmente usadas en biología molecular, la fabricación por ingeniería de proteína, microbiología, y ADN recombinante , que están dentro de la capacidad de la técnica. Tales técnicas se conocen por aquellos de experiencia en la técnica y se describen en numerosos textos y trabajos de referencia bien conocidos por aquellos de experiencia en la técnica. Todas las patentes, solicitudes de patentes, artículos y publicaciones mencionadas en la presente, ambos supra e infra, se incorporan expresamente en la presente como referencia .

A menos que se defina de otra manera en la presente, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de experiencia ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Muchos diccionarios técnicos se conocen por aquellos de experiencia en la técnica. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente encuentran uso en la práctica de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen en la presente. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente abajo se describen más completamente en referencia a la Especificación en su conjunto. También, como se usa en la presente, el singular "un", "uno" y "el" incluye la referencia en plural a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' hasta 3'; las secuencias de aminoácido se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxi, respectivamente. Es de entenderse que esta invención no se limita a la metodología particular, protocolos, y reactivos descritos, ya que estos pueden variar, dependiendo en el contexto en que se usan por aquellos de experiencia en la técnica.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de purificación de proteína, biología molecular, microbiología, técnicas de ADN recombinante y secuenciación de proteína, todos de los cuales están dentro de la experiencia de aquellos en la técnica.

Por otra parte, los encabezados proporcionados en la presente no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de la invención que se pueden tener por referencia a la especificación en su conjunto. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente abajo se definen más completamente por referencia a la especificación en su conjunto. No obstante, con objeto de facilitar el entendimiento de la invención, un número de términos se definen abajo.

Como se usa en la presente, los términos "proteasa," y "actividad proteolítica" se refieren a una proteína o péptido que exhibe la capacidad para hidrolizar péptidos o sustratos que tienen ligaduras de péptido. Muchos procedimientos bien conocidos existen para medir la actividad proteolítica (Kalisz, "Microbial Proteinases , " en: Fiechter (ed. ) , Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology.

[1988] ) . Por ejemplo, la actividad proteolítica se puede determinar por ensayos comparativos que analizan la capacidad de la proteasa respectiva para hidrolizar un sustrato comercial. Los sustratos ejemplares útiles en el análisis de proteasa o actividad proteolítica, incluyen, pero no se limitan a caseína de di-metilo (Sigma C-9801) , colágeno de bovino (Sigma C-9879) , elastina de bovino (Sigma E-1625) , y queratina de bovino (ICN Biomedical 902111) . Los ensayos colorimétricos que utilizan estos sustratos son bien conocidos en la técnica (Ver por ejemplo, O 99/34011; y Pat . de E.U.A. No. 6,376,450, ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia) . El ensayo pNA (Ver por ejemplo, Del Mar et al., Anal. Biochem. , 99:316-320

[1979]) también encuentra uso en determinar la concentración de enzima activa para fracciones colectadas durante la elución de gradiente. Este ensayo mide la velocidad en la cual p-nitroanilina se libera como la enzima hidroliza el sustrato sintético soluble , succinil -alanina-alanina-prolina- fenilalanina-p-nitroanilida (suc-AAPF-pNA) . La velocidad de producción de color amarillo de la reacción de hidrólisis se mide en 410 nm en un espectrofotómetro y es proporcional a la concentración de enzima activa. Además, las mediciones de absorbancia en 280 nm se pueden usar para determinar la concentración de proteína total. La relación enzima activa/proteína total da la pureza de enzima.

Como se usa en la presente, el término "subtilisina" se refiere a cualquier miembro de la familia de serina proteasa S8 como se describe en MEROPS - La base de Datos de Peptidasa (Rawlings et al., MEROPS : the peptidase datábase, Nucí Acids Res, 34 Datábase issue, D270-272, 2006). Como se describe en él, la familia S8 de peptidasa contiene la serina endopeptidasa subtilisina y sus homólogos (Biochem J, 290: 205-218, 1993). La familia S8, también conocida como la familia de subtilasa, es la segunda familia más grande de peptidasas de serina, y se puede dividir en dos subfamilias, con subtilisina (S08.001) el tipo de ejemplo para la subfamilia S8A y kexin (S08.070) el tipo de ejemplo para la subfamilia S8B. El tripeptidil-peptidasa II (TPP-II; S08.090) se consideró anteriormente a ser el tipo de ejemplo de una tercera subfamilia, pero desde entonces se ha determinado que está mal clasificada. Los miembros de la familia S8 tienen una tríada catalítica en el orden Asp, His y Ser en la secuencia, que es un orden diferente al de las familias SI, S9 y S10. En la subfamilia S8A, los residuos del sitio activo frecuentemente ocurren en las porciones Asp-Thr/Ser-Gly (que es similar a la secuencia porción en las familias de endopeptidasas aspárticas en el clan AA) , His-Gly-Thr-His y Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro. En la subfamilia S8B, los residuos catalíticos f ecuentemente ocurren en las porciones Asp-Asp-Gly, His-Gly-Thr-Arg y Gly-Thr-Ser-Ala/Val -Ala/Ser-Pro . La mayoría de los miembros de la familia S8 son endopeptidasas, y son activos en pH alcalino ligeramente neutral. Muchas peptidasas en la familia son termoestables . La caseína se usa frecuentemente como un sustrato de proteína y un sustrato sintético típico es suc-AAPF. La mayoría de los miembros de la familia son peptidasas no específicas con una preferencia para partir después de residuos hidrofóbicos . Sin embargo, los miembros de la subfamilia S8B, tal como kexina (S08.070) y furina (S08.071), parten después aminoácidos dibásicos. La mayoría de los miembros de la familia S8 se inhiben por inhibidores de serina peptidasa general tal como DFP y PMSF . Ya que muchos miembros de la familia enlazan calcio para la estabilidad, la inhibición se puede ver con EDTA y EGTA, que frecuentemente se cree que son inhibidores específicos de metalopeptidasas . Los inhibidores de proteína incluyen tercer dominio ovomucoide de pavo (101.003), El inhibidor de subtilisina Streptomyces (116.003), y los miembros de la familia 113 tal como eglina C (113.001) e inhibidor CI-1A de cebada (113.005), muchos de los cuales también inhiben la quimotripsina (S01.001). El propéptido de subtilisina es inhibitorio por sí mismo, y el inhibidor de proteinasa B homólogo de Saccharomyces inhibe cerevisina (S08.052). Las estructuras terciarias para diversos miembros de la familia S8 han sido determinadas. Una estructura de proteína S8 típica consiste de tres capas con una hoja de siete hebras ß intercalada entre dos capas de hélices. La subtilisina (S08.001) es el tipo de estructura para el clan SB (SB) . A pesar de la estructura diferente, los sitios activos de subtilisina y quimotripsina (S01.001) se pueden superponer, lo que sugiere que la similitud es el resultado de evolución convergente en lugar de divergente.

Como se usa en la presente, los términos "variante de proteasa" y "proteasa variante" se usan en referencia a proteasas que son similares a una proteasa de referencia, particularmente en su función, pero tienen mutaciones en su secuencia de aminoácido que las hacen diferentes en secuencia de la proteasa tipo natural en desde uno hasta 20 posiciones.

Las secuencias de aminoácido de la región madura de diversas proteasas de referencia ejemplares se muestran en la alineación de FIG. 1. En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona "variantes GG36," en donde las mutaciones se presentan en la secuencia GG36 madura establecida en la SEQ ID NO: 2.

Como se usa en la presente, "el género Bacillus" incluye todas las especies dentro del género "Bacillus" como se conoce por aquellos de experiencia en la técnica, que incluye pero no se limita a B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, y B. thuringiensis . Se reconoce que el género Bacillus continua experimentando reorganización taxonómica. Por lo tanto, se pretende que el género incluye especies que se han reclasificado, que incluye pero no se limita a tales organismos como B . stearothermophilus, que se nombra ahora "Geojbacillus stearothermophilus." La producción de endosporas resistentes en la presencia de oxígeno se considera la característica que define el género Bacillus, aunque esta característica también aplica a la recientemente llamada Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxyjbac llus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus, y Virgibacillus .

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico", usados intercambiablemente en la presente, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o deoxiribonucleótidos . Estos términos incluyen, pero no se limitan a, un ADN de hebra sencilla, doble o triple, ADN genómico, cADN, ARN, híbrido ADN-ARN, o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina, u otras bases de nucleótido natural, químicamente, bioquímicamente modificado, no natural o derivado. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleótidos : genes, fragmentos de gen, fragmentos de cromosomas, ESTs, exones, intrones, mARN, tARN, rARN, ribozimas, cADN, polinucleótidos recombinantes , polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. En algunas modalidades, los polinucleótidos comprenden nucleótidos modificados, tal como nucleótidos metilados y análogos de nucleótido, uracilo, otros azúcares y grupos de ligadura tal como fluororibosa y tioato, y ramificaciones de nucleótido. En modalidades alternativas, la secuencia de nucleótidos se interrumpe por componentes no nucleótidos .

Como se usa en la presente, los términos "constructo de ADN" y "ADN de transformación" se usan intercambiablemente para referirse a ADN usado para introducir secuencias en una célula hospedera u organismo. El ADN se puede generar in vitro por PCR o cualquiera de otras técnicas adecuadas conocidas por aquellos en la técnica. En modalidades particularmente preferidas, el constructo de ADN comprende una secuencia de interés (por ejemplo, como una secuencia de entrada). En algunas modalidades, la secuencia se liga operativamente a elementos adicionales tal como elementos de control (por ejemplo, promotores, etc.) . El constructo de ADN puede además comprender un marcador seleccionable . Esto puede además comprender una secuencia de entrada flanqueada por cajas de homología. En una modalidad adicional, el ADN de transformación comprende otras secuencias no homologas, agregadas a los extremos (por ejemplo, secuencias de relleno o de flancos) . En algunas modalidades, los extremos de la secuencia de entrada se cierran de tal manera que el ADN de transformación forma un círculo cerrado. Las secuencias de transformación pueden ser de tipo natural, mutantes o modificadas. En algunas modalidades, el constructo de ADN comprende secuencias homologas al cromosoma de célula hospedera. En otras modalidades, el constructo de ADN comprende secuencias no homologas. Una vez que el constructo de ADN se monta in vitro se puede usar para: 1) insertar secuencias heterólogas en una secuencia objetivo deseada de un célula hospedera, y/o 2) mutagenizar una región de la cromosoma de célula hospedera (esto es, reemplaza una secuencia endógena con una secuencia heteróloga) , 3) eliminar genes objetivo, y/o 4) introducir un plásmido de replicación en el hospedero.

Como se usa en la presente, los términos "cásete de expresión" y "vector de expresión" se refiere a constructos de ácido nucleico generados recombinantemente o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula objetivo. El cásete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial , ADN de plásmido, virus, o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de cásete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, una secuencia de ácido nucleico a transcribirse y un promotor. En modalidades preferidas, los vectores de expresión tienen la capacidad para incorporar y expresar fragmentos de ADN heterologos en un célula hospedera. Muchos vectores de expresión procarióticos y eucarióticos están comercialmente disponibles. La selección de vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de aquellos de experiencia en la técnica. El término "cásete de expresión" se usa indistintamente en la presente con "constructo de ADN, " y sus equivalentes gramáticos. La selección de vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de aquellos de experiencia en la técnica.

Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a un constructo de polinucleótido diseñado para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de célula. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores de transporte, plásmidos, casetes y similares. En algunas modalidades, el constructo de polinucleótido comprende una secuencia de ADN que codifica la proteasa (por ejemplo, precursor o proteasa madura) que se liga operativamente a una pro-secuencia adecuada (por ejemplo, secretora, etc.) capaz de efectuar la expresión del ADN en un hospedero adecuado.

Como se usa en la presente, el término "plásmido" se refiere a un constructo de ADN de hebra doble circular (ds) usado como un vector de clonación, y que forma un elemento genético de auto-replicación extracromosomal en algunos eucariotas o procariotas, o se integra en el cromosoma de hospedero .

Como se usa en la presente en el contexto de introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula, el término "introducir" se refiere a cualquier método adecuado para transferir la secuencia de ácido nucleico en la célula. Tales métodos para introducción incluyen pero no se limitan a fusión de protoplasto, transfección, transformación, conjugación, y transducción (Ver por ejemplo, Ferrari et al., "Genetics," en Hardwood et al, (eds.), Bacillus . Plenum Publishing Corp., páginas 57-72,

[1989]).

Como se usa en la presente, los términos "transformado" y "transformado establemente" se refieren a una célula que tiene una secuencia de polinucleótido no nativo (heteróloga) integrada en su genoma o como un plásmido episomal que se mantiene por al menos dos generaciones.

Como se usa en la presente, un ácido nucleico es "ligado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN que codifica un líder secretor (esto es, un péptido de señal) , se liga operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o aumentador se liga operativamente a una secuencia de codificación si esto afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma se liga operativamente a una secuencia de codificación si se coloca con el fin de facilitar la traducción. Generalmente, "ligado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se ligan son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguo y en fase de lectura. Sin embargo, los aumentadores no tienen que ser contiguos. La ligadura se realiza por ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótido sintético o ligadores se usan de acuerdo con práctica convencional.

Como se usa en la presente el término "gen" se refiere a un polinucleótido (por ejemplo, un segmento de ADN) , que codifica un polipéptido e incluye regiones anteriores y después de las regiones de codificación así como secuencias de intervención (intrones) entre segmentos de codificación individuales (exones) .

Como se usa en la presente, "genes homólogos" se refiere a un par de genes de diferentes, pero usualmente especies relacionadas, que corresponden entre sí y que son idénticas o muy similares el uno al otro. El término abarca genes que se separan por especiación (esto es, el desarrollo de nuevas especies) (por ejemplo, genes ortólogos), así como genes que se han separado por duplicación genética (por ejemplo, genes parálogos) .

Como se usa en la presente, las proteínas se definen como que tienen un "pliegue" común si tienen las mismas estructuras secundarias importantes en la misma configuración y con las mismas conexiones topológicas. Diferentes proteínas con el mismo pliegue frecuentemente tienen elementos periféricos de estructura secundaria y regresa a regiones que difieren en tamaño y conformación. En algunos casos, estas diferentes regiones periféricas pueden comprender la mitad de la estructura. Las proteínas colocadas juntas en la misma categoría de pliegue no necesariamente tienen un origen evolutivo común (por ejemplo, similitudes estructurales que surgen desde la física y química de proteínas favoreciendo ciertas configuraciones de empaque y topologías de cadena) .

Como se usa en la presente, "homología" se refiere a similitud o identidad de secuencia, con identidad que es preferida. Esta homología se determina usando técnicas estándar conocidas en la técnica (Ver por ejemplo, Smith and Waterman, Adv. Ap l . Math. , 2:482

[1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol . , 48:443

[1970]; Pearson and Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444

[1988]; programas tales como GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI) ; y Devereux et al., Nucí. Acid Res., 12:387-395

[1984]).

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. El PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones en pareja, progresivas. Esto puede también trazar un árbol que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. El PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle (Feng and Doolittle, J. Mol. Evol, 35: 351-360

[1987]). El método es similar a ese descrito por Higgins and Sharp (Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153

[1989]). Los parámetros útiles PILEUP que incluyen un peso de espacio predeterminado de 3.00, un peso de longitud de espacio predeterminado de 0.10, y espacios finales pesados.

Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al., (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410,

[1990]; y Karlin et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787

[1993]). Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 (Ver, Altschul et al, Meth. Enzymol . , 266: 460-480

[1996]). El WU-BLAST-2 usa diversos parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se establecen en los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se establecen con los siguientes valores: amplitud de traslape = 1, fracción de traslape = 0.125, umbral de palabra (T) = 11. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el propio programa dependiendo sobre la composición de la secuencia particular y composición de la base de datos particular contra la cual la secuencia de interés se está buscando. Sin embargo, los valores se pueden ajustar para incrementar la sensibilidad. Un % de valor de identidad de secuencia de aminoácido se determina por el número de residuos idénticos igualados divididos por el número total de residuos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es una que tiene los residuos más actuales en la región alineada (se ignoran espacios introducidos por WU-Blast-2 para maximizar la puntuación de alineación) .

Por lo tanto, "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" se define como el porcentaje de residuos de nucleótido en una secuencia candidato que son idénticos con los residuos de nucleótido de la secuencia de partida (esto es, la secuencia de interés). Un método preferido utiliza el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 establecido en los parámetros predeterminados, con amplitud de traslape y fracción de traslape establecida a 1 y 0.125, respectivamente .

Como se usa en la presente, "recombinante" incluye referencia a una célula o vector, que se ha modificado por la introducción de una secuencia de ácido nucleico heterologa o que la célula se deriva de una célula tan modificada. Por lo tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que se expresan anormalmente de otra manera, bajo lo expresado o no expresado en todo como un resultado de intervención humana deliberada. La "recombinación," "que recombina," y que genera un ácido nucleico "recombinado" son generalmente el ensamble de dos o más fragmentos de ácido nucleico en donde el ensamble da lugar a un gen quimérico.

En algunas modalidades preferidas, las secuencias de ADN mutante se generan con mutagénesis de saturación de sitio en al menos un codón. En otra modalidad preferida, la mutagénesis de saturación de sitio se realiza para dos o más codones . En una modalidad adicional, las secuencias de ADN mutante tienen más que alrededor de 50%, más que alrededor de 55%, más que alrededor de 60%, más que alrededor de 65%, más que alrededor de 70%, más que alrededor de 75%, más que alrededor de 80%, más que alrededor de 85%, más que alrededor de 90%, más que alrededor de 95%, o más que alrededor de 98% de homología con la secuencia de tipo natural. En modalidades alternativas, el ADN mutante se genera in vivo usando cualquier procedimiento mutagénico conocido tal como, por ejemplo, radiación, nitrosoguanidina y similares. La secuencia de ADN deseada se aisla luego y usa en los métodos proporcionados en la presente.

Como se usa en la presente, los términos "amplificación" y "amplificación de gen" se refiere a un proceso por el cual las secuencias de ADN específicas se replican desproporcionadamente tal que el gen amplificado se vuelve presente en un número de copia mayor que fue que fue inicialmente presente en el genoma. En algunas modalidades, la selección de células por crecimiento en la presencia de un fármaco (por ejemplo, un inhibidor de una enzima de inhibición) resulta en la amplificación de ya sea el gen endógeno que codifica el producto de gen requerido para el crecimiento en la presencia del fármaco o por la amplificación de secuencias exógenas (esto es, de entrada) que codifican este producto de gen, o ambos.

La "amplificación" es un caso especial de replicación de ácido nucleico que implica especificidad de plantilla. Esto se debe poner en contraste con replicación de plantilla no específica (esto es, replicación que es dependiente de plantilla pero no dependiente en una plantilla específica) . La especificidad de plantilla se distingue aquí de fidelidad de replicación (esto es, síntesis de la secuencia de polinucleótido correcta) y especificidad de nucleótido (ribo-o deoxiribo-) . La especificidad de plantilla se describe f ecuentemente en términos de especificidad "objetivo". Las secuencias objetivo son "objetivos" en el sentido que se tratan de resolver de otro ácido nucleico. Las técnicas de amplificación se han diseñado principalmente para esta clasificación.

Como se usa en la presente, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, si ocurre naturalmente como en una restricción purificada resumida o producida sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de inicio de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales las síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico se induce, (esto es, en la presencia de liucleótidos y un agente de inducción tal como polimerasa de ADN y en una temperatura y H adecuados) . El cebador es preferiblemente de hebra sencilla para eficiencia máxima en la amplificación, pero puede ser alternativamente de hebra doble. Si es de hebra doble, el cebador se trata primero para separar sus hebras antes de que se usen para preparar productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un oligodeoxiribonucleótido . El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en la presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente de cebador y el uso del método.

Como se usa en la presente, el término "sonda" se refiere a un oligonucleótido (esto es, una secuencia de nucleótidos) , si ocurre naturalmente como en una restricción purificada resumida o producida sintéticamente, recombinantemente o por amplificación de PCR, que es capaz de hibridizar a otro oligonucleótido de interés. Una sonda puede ser de hebra sencilla o de hebra doble. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias de gen particular. Se contempla que cualquier sonda usada en la presente invención se etiquetará con cualquier "molécula de reportero," de manera que es perceptible en cualquier sistema de detección, que incluye, pero no se limita a enzima (por ejemplo, ELISA, así como ensayos histoquímicos basados en enzima) , fluorescente, radioactivo, y sistemas luminiscentes. No se pretende que la presente invención se limite a cualquier sistema de detección particular o etiqueta .

Como se usa en la presente, el término "objetivo," cuando se usa en referencia a la reacción de cadena de polimerasa, se refiere a la región de ácido nucleico limitado por los cebadores usados para reacción de cadena de polimerasa. Por lo tanto, el "objetivo" se pretende separarse de otras secuencias de ácidos nucleicos. Un "segmento" se define como una región de ácido nucleico dentro de la secuencia objetivo.

Como se usa en la presente, el término "reacción de cadena de polimerasa" (PCR) se refiere a los métodos de Patente de E.U.A. Nos. 4,683,195, 4,683,202, y 4,965,188, incorporado por la presente como referencia, lo que incluye métodos para incrementar la concentración de un segmento de una secuencia objetivo en una mezcla de ADN genómico sin clonación o purificación. Este proceso para amplificar la secuencia objetivo es bien conocido en la técnica.

Como se usa en la presente, el término "reactivos de amplificación" se refiere a aquellos reactivos (deoxiribonucleótido trifosfatos, solución amortiguadora, etc.), necesarios para la amplificación excepto para cebadores, plantilla de ácido nucleico y la enzima de amplificación. Típicamente, los reactivos de amplificación junto con otros componentes de reacción se colocan y figuran en un recipiente de reacción (tubo de prueba, micropozo, etc . ) .

Como se usa en la presente, los términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las cuales corta ADN de hebra doble en o cerca de una secuencia de nucleótido específico .

Un "sitio de restricción" se refiere a una secuencia de nucleótido reconocida ya partida por una endonucleasa de restricción dada y es frecuentemente el sitio para la inserción de fragmentos de ADN. En ciertas modalidades de los sitios de restricción de la invención se fabrican por ingeniería en el marcador selectivo y en los extremos 5 ' y 31 del constructo de ADN.

La "recombinación homologa" significa el intercambio de los fragmentos de ADN entre dos moléculas de ADN o cromosomas pareados en el sitio de secuencias de nucleótido idénticas o casi idénticas. En una modalidad preferida, la integración cromosomal es recombinación homologa.

Como se usa en la presente "aminoácido" se refiere a péptido o secuencias de proteína o porciones de los mismos. Los términos "proteína," "péptido," y "polipéptido" se usan intercambiablemente .

Como se usa en la presente, "proteína de interés" y "polipéptido de interés" se refiere a una proteína/polipéptido que se desea y/o que se evalúa. En algunas modalidades, la proteína de interés se expresa intercelularmente, mientras en otras modalidades, esto es un polipéptido secretado. En modalidades particularmente preferidas, estas enzimas incluyen la serina proteasas de la presente invención. En algunas modalidades, la proteína de interés es un polipéptido secretado que se fusiona a un péptido de señal (esto es, una extensión de terminal amino en una proteína a secretarse) . Casi todas las proteínas secretadas usan una extensión de proteína de terminal amino que juega un papel crucial en la focalización a y transubicación de proteínas precursoras a través de la membrana. Esta extensión se remueve proteolíticamente por una peptidasa de señal durante o inmediatamente después de la transferencia de membrana.

Un polinucleótido se dice que "codifica" un ARN o un polipéptido si, en su estado nativo o cuando se manipula por métodos conocidos por aquellos de experiencia en la técnica, se pueden transcribir y/o traducidos para producir el ARN, el polipéptido o un fragmento del mismo. La hebra anti-sentido de tal ácido nucleico también se dice que codifica las secuencias. Como se conoce en la técnica, un ADN se puede transcribir por una polimerasa de ARN para producir ARN, pero un ARN se puede transcribir inversamente por transcriptasa inversa para producir un ADN. Por lo tanto un ADN puede codificar un ARN y vice versa.

La "cepa hospedera" o "célula hospedera" se refiere a un hospedero adecuado para un vector de expresión que comprende ADN de acuerdo con la presente invención.

Una enzima se "sobreexpresa" en una célula hospedera si la enzima se expresa en la célula en un nivel mayor que el nivel en el cual esto se expresa en una célula tipo natural correspondiente .

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan intercambiablemente en la presente. El código de 3 letras para aminoácidos como se define de conformidad con la Comisión Mixta IUPAC-IUB en Nomenclatura Bioquímica (JCBN por sus siglas en ingles) se usa a lo largo de esta descripción. Se entiende también que un polipéptido se puede codificar por más de una secuencia de nucleótido debido a la degeneración del código genético.

Una "pro-secuencia" es una secuencia de aminoácido entre la secuencia de señal y la proteasa madura que es necesaria para la secreción de la proteasa. El desdoblamiento de la pro secuencia resulta en una proteasa activa madura. El término "secuencia de señal" o "péptido de señal" se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos que pueden participar en la secreción de las formas maduras o precursoras de la proteína. Esta definición de la secuencia de señal es funcional, significa que incluye todas aquellas secuencias de aminoácido codificadas por la porción de N-terminal del gen de proteína, que participa en la realización de la secreción de proteína. Ellos son frecuentemente, pero no universalmente , enlazados a la porción de N-terminal de una proteína o a la porción de N-terminal de una proteína precursora. La secuencia de señal puede ser endógena o exógena. La secuencia de señal puede ser que normalmente se asocia con la proteína (por ejemplo, proteasa) , o puede ser desde un gen que codifica otra proteína secretada. Una secuencia de señal exógena ejemplar comprende los primeros siete residuos de aminoácido de la secuencia de señal de Bacillus subtilis subtilisina fusionada a el resto de la secuencia de señal de la subtilisina de Bacillus lentus (ATCC 21536) .

El término "secuencia de señal de híbrido" se refiere a secuencias de señales en cuya parte de la secuencia se obtiene del hospedero de expresión fusionado a la secuencia de señal del gen a expresarse. En algunas modalidades, las secuencias sintéticas se utilizan.

El término forma "madura" de una proteína o péptido se refiere a la forma funcional final de la proteína o péptido.

El término forma de "precursor" de una proteína o péptido se refiere a una forma madura de la proteína que tiene una prosecuencia ligada operativamente a la terminal amino o carbonilo de la proteína. El precursor puede también tener una secuencia de "señal" ligada operativamente, a la terminal amino de la prosecuencia. El precursor puede también tener polinucleótidos adicionales que se involucran en actividad post-traduccional (por ejemplo, polinucleótidos partidos de los mismos para dejar la forma madura de una proteína o péptido) .

La "enzima que se presenta naturalmente" se refiere a una enzima que tiene la secuencia de aminoácido no modificada idéntica a la encontrada en la naturaleza. Las enzimas que se presentan naturalmente incluyen enzimas nativas, cuyas enzimas naturalmente expresadas o encontradas en el microorganismo particular.

Los términos "derivado de" y "obtenido de" se refiere a no únicamente una proteasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, pero también una proteasa codificada por una secuencia de ADN aislada de tal cepa y producida en un organismo hospedero que contiene tal secuencia de ADN. Adic onalmente , el término se refiere a una proteasa que se codifica por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de cADN y que tiene las características de identificación de la proteasa en cuestión. Para ejemplificar, "proteasas derivadas de Bacillus" se refiere a cuyas enzimas que tienen actividad proteolítica que se producen naturalmente por Bacillus, así como a serinas proteasas como aquellas producidas por fuentes Bacillus pero que a través del uso de técnicas de fabricación por ingeniería genética se producen por organismos no Bacillus transformados con un ácido nucleico que codifica la serina proteasas.

Un "derivado" dentro del alcance de esta definición generalmente conserva la actividad proteolítica característica observada en la forma tipo natural, nativa o de referencia en la medida en que el derivado es útil para propósitos similares como la forma tipo natural, nativa o de referencia. Los derivados funcionales de serina proteasa abarcan péptidos producidos que se presentan naturalmente, sintéticamente o recombinantemente o fragmentos de péptido que tienen las características generales de la serina proteasa de la presente invención.

El término "derivado funcional" se refiere a un derivado de un ácido nucleico que tiene las características funcionales de un ácido nucleico que codifica serina proteasa. Los derivados funcionales de un ácido nucleico que codifica serina proteasa de la presente invención abarcan ácidos nucleicos producidos que se presentan naturalmente, sintéticamente o recombinantemente o fragmentos y codifica característica de serina proteasa de la presente invención. El ácido nucleico tipo natural que codifica serina proteasas de acuerdo con la invención incluye alelos que se presentan naturalmente y homólogos basados en la degeneración del código genético conocido en la técnica.

El término "idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o secuencias de polipéptido se refieren a los residuos en las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para correspondencia máxima, como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación y análisis de secuencia .

El término "alineación óptima" se refiere a la alineación dando el porcentaje más alto de puntuación de identidad .

El "porcentaje de identidad de secuencia," "porcentaje de identidad de secuencia de aminoácido," "porcentaje de identidad de secuencia de gen," y/o "porcentaje de identidad de secuencia de ácido nucleico/polinocleótido," con respecto a dos secuencias de aminoácido, polinucleótido y/o gen (como sea apropiado) , se refiere al porcentaje de residuos que son idénticos en las dos secuencias cuando la secuencias se alinean óptimamente. Por lo tanto, 80% de identidad de secuencia de aminoácido significa que el 80% de los aminoácidos en dos secuencias de polipéptido alineadas óptimamente son idénticos.

La frase "sustancialmente idéntico" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos por lo tanto se refieren a un polinucleótido o polipéptido que comprende al menos alrededor de 70% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos alrededor de 75%, preferiblemente al menos alrededor de 80%, preferiblemente al menos alrededor de 85%, preferiblemente al menos alrededor de 90%, preferiblemente al menos alrededor de 95%, preferiblemente al menos alrededor de 97%, preferiblemente al menos alrededor de 98%, y preferiblemente al menos alrededor de 99% identidad de secuencia como se compara con una secuencia de referencia usando los programas o algoritmos (por ejemplo, BLAST, ALIGN, CLUSTAL) usando parámetros estándares. Una indicación que dos polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el primer polipéptido es inmunológicamente reactivo cruzado con el segundo polipéptido. Típicamente, los polipéptidos que difieren en sustituciones de aminoácido conservadoras son inmunológicamente reactivo cruzado. Por lo tanto, un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren únicamente por una sustitución conservadora. Otra indicación que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas hibridizan el uno al otro bajo condiciones rigurosas (por ejemplo, dentro de un intervalo de rigor medio a alto) .

La frase "equivalente," en este contexto, se refiere a enzimas de serina proteasas que se codifican por un polinucleótido capaz de hibridizar al polinucleótido que tiene la secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 5, bajo condiciones de rigor medio a máximo. Por ejemplo, que es equivalente significa que una serina proteasa madura equivalente comprende al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 75%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 91%, al menos alrededor de 92%, al menos alrededor de 93%, al menos alrededor de 94%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al imenos alrededor de 98% , y/o al menos alrededor de 99% identidad de secuencia al BPN 1 maduro o serina proteasa GG36 que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO : 2.

El término "aislado" o "purificado" se refiere a un material que se remueve de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si se presenta naturalmente) . Por ejemplo, el material se dice que se "purifica" cuando se presenta en una composición particular en una concentración más alta o más baja que existe en un organismo que se presenta naturalmente o de tipo natural o en combinación con componentes normalmente no presentes sobre la expresión de un organismo que se presenta naturalmente o de tipo natural. Por ejemplo, un polinucleótido que se presenta naturalmente o polipéptido presente en un animal vivo no se aisla, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos de los co-existentes en el sistema natural, se aisla. En algunas modalidades, tales polinucleótidos son parte de un vector, y/o tales polinucleótidos o polipéptidos son parte de una composición, y todavía se aislan en ese tal vector o composición no es parte de su ambiente natural. En modalidades preferidas, un ácido nucleico o proteína se dice que se purifica, por ejemplo, si da lugar a esencialmente una banda en una mancha o gel electroforético .

El término "aislado" , cuando se usa en referencia a una secuencia de ADN, se refiere a una secuencia de ADN que se ha removido de su medio genético natural y es por lo tanto libre de otras secuencias de codificación extraña o no deseada, y está en una forma adecuada para usar dentro de sistemas de producción de proteína genéticamente fabricada por ingeniería. Tales moléculas aisladas son aquellas que se separan de su ambiente natural e incluye cADN y clones genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención son libres de otros genes con los cuales se asocian ordinariamente, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' que se presentan naturalmente tal como promotores y terminadores . La identificación de regiones asociadas será evidente para uno de experiencia ordinaria en la técnica (Ver por ejemplo, Dynan and Tijan, Nature 316: 774-78

[1985]). El término "una secuencia de ADN aislada" se refiere alternativamente a como "una secuencia de ADN clonada" .

El término "aislado," cuando se usa en referencia a una proteína, se refiere a una proteína que se encuentra en una condición diferente a su ambiente nativo. En una forma preferida, la proteína aislada es sustancialmente libre de otras proteínas, particularmente otras proteínas homologas. Una proteína aislada es más que alrededor de 10% pura, preferiblemente más que alrededor de 20% pura, y aún más preferiblemente más que alrededor de 30% pura, como se determina por SDS-PAGE. Aspectos adicionales de la invención abarcan la proteína en una forma altamente purificada (esto es, más que alrededor de 40% pura, más que alrededor de 60% pura, más que alrededor de 70% pura, más que alrededor de 80% pura, más que alrededor de 90% pura, más que alrededor de 95% pura, más que alrededor de 97% pura, y aún más que alrededor de 99% pura), como se determina por SDS-PAGE.

Como se usa en la presente, el término, "mutagénesis combinatoria" se refiere a métodos en los cuales las colecciones de variantes de una secuencia de partida se generan. En estas colecciones, las variantes contienen una o varias mutaciones elegidas de un conjunto predefinido de mutaciones. Además, los métodos proporcionan medios para introducir mutaciones aleatorias que no fueron miembros del conjunto predefinido de mutaciones. En algunas modalidades, los métodos incluyen aquellos establecidos en la Sol. de Patente de E.U.A. No. de Serie 09/699.250, presentado el 26 de octubre de 2000, incorporado por la presente como referencia. En modalidades alternativas, los métodos de mutagénesis combinatoria abarcan kits comercialmente disponibles (por ejemplo, QUIKCHANGE® Multisite (Stratagene) .

Como se usa en la presente, el término "colección de mutantes" se refiere a una población de células que son idénticas en la mayor parte de su genoma pero incluyen diferentes homólogos de uno o más genes. Tales colecciones se pueden usar, por ejemplo, para identificar genes u operones con rasgos mejorados.

Como se usa en la presente, el término "gen de partida" se refiere a un gen de interés que codifica una proteína de interés que es para mejorar y/o cambiar usando la presente invención .

Como se usa en la presente, el término "alineación de secuencia múltiple" ( "MSA" ) se refiere a las secuencias de homólogos múltiples de un gen de partida que se alinean usando un algoritmo (por ejemplo, Clustal W) .

Como se usa en la presente, los términos "secuencia de consenso" y "secuencia canónica" se refiere a una secuencia de aminoácido arquetípica contra la cual todas las variantes de una proteína o secuencia particular de interés se comparan. Los términos también se refieren a una secuencia que establece los nucleótidos que se presentan más frecuentemente en una secuencia de ADN de interés. Para cada posición de un gen, la secuencia de consenso da el aminoácido que es más abundante en esa posición en el MSA.

Como se usa en la presente, el término "mutación de consenso" se refiere a una diferencia en la secuencia de un gen de partida y una secuencia de consenso. Las mutaciones de consenso se identifican al comparar las secuencias del gen de partida y la secuencia de consenso que resulta de un MSA.

En algunas modalidades, las mutaciones de consenso se introducen en el gen de partida tal que llegan a ser más similares a la secuencia de consenso. Las mutaciones de consenso también incluyen cambios de aminoácido que cambian un aminoácido en un gen de partida a un aminoácido que es más frecuentemente encontrado en un MSA en esa posición relativa a la frecuencia de ese aminoácido en el gen de partida. Por lo tanto, el término mutación de consenso comprende todos los cambios de aminoácido sencillos que reemplazan un aminoácido del gen de partida con un aminoácido que es más abundante que el aminoácido en el MSA.

Como se usa en la presente, el término "golpe inicial" se refiere a una variante que se identificó al cribar una colección de mutagénesis de consenso combinatoria. En modalidades preferidas, los golpes iniciales tienen características de desempeño mejorado, como se compara con el gen de partida.

Como se usa en la presente, el término "golpe mejorado" se refiere a una variante que se identificó por el cribado de una colección de mutagénesis de consenso combinatoria aumentada .

Como se usa en la presente, los términos "mejora de la mutación" y "mutación que aumenta el desempeño" se refiere a una mutación que lleva a desempeño mejorado cuando se introduce en el gen de partida. En algunas modalidades preferidas, aquellas mutaciones se identifican por golpes de secuenciación que se identificaron durante la etapa de cribado del método. En la mayoría de las modalidades, las mutaciones que se encuentran más frecuentemente en los golpes son probablemente para mejorar las mutaciones, como se compara con una colección de mutagénesis de consenso combinatoria no cibrada.

Como se usa en la presente, el término "colección de mutagénesis de consenso combinatoria aumentada" se refiere a una colección CCM que se diseña y construye con base en cribado y/o resultados de secuenciación de una ronda anterior de mutagénesis de CCM y cribado. En algunas modalidades, la colección CCM aumentada se basa en la secuencia de un golpe inicial que resulta de un ciclo anterior de CCM. En modalidades adicionales, el CCM aumentado se diseña tal que las mutaciones que se observaron frecuentemente en los golpes iniciales de ciclos anteriores de mutagénesis y cribado se favorecen. En algunas modalidades preferidas, esto se logra al omitir cebadores que codifican mutaciones de reducción de desempeño o al incrementar la concentración de cebadores que codifican mutaciones que aumentan el desempeño relativo a otros cebadores que se usaron en colecciones CCM tempranas.

Como se usa en la presente, el término "mutaciones que reducen el desempeño" se refiere a mutaciones en la colección de mutagénesis de consenso combinatoria que se encuentran menos frecuentemente en golpes que resultan de cribado como se compara con una colección de mutagénesis de consenso combinatoria no cibrada. En modalidades preferidas, el proceso de cribado remueve y/o reduce la abundancia de variantes que contienen "mutaciones de reducción de desempeño . " Como se usa en la presente, el término "ensayo funcional" se refiere a un ensayo que proporciona una indicación de una actividad de la proteína. En modalidades particularmente preferidas, el término se refiere a sistemas de ensayo en los cuales una proteína se analiza por su capacidad para funcionar en su capacidad usual. Por ejemplo, en el caso de enzimas, un ensayo funcional implica determinar la eficacia de la enzima en catalizar una reacción.

Como se usa en la presente, el término "propiedad objetivo" se refiere a la propiedad del gen de partida que se debe modificar. No se pretende que la presente invención se limite a cualquier propiedad objetivo particular. Sin embargo, en algunas modalidades preferidas, la propiedad objetivo es la estabilidad de un producto de gen (por ejemplo, resistencia a la desnaturalización, proteólisis u otros factores de degradación) , mientras en otras modalidades, el nivel de producción en un hospedero de producción se altera. En efecto, se contempla que cualquier propiedad de un gen de partida encontrará uso en la presente invención.

El término "propiedad" o equivalentes gramáticos de los mismos en el contexto de un ácido nucleico, como se usa en la presente, se refieren a cualquier característica o atributo de un ácido nucleico que se puede seleccionar o detectar. Estas propiedades incluyen, pero no se limitan a, una propiedad que afecta el enlace de un polipéptido, una propiedad conferida en una célula que comprende un ácido nucleico particular, una propiedad que afecta la transcripción de gen (por ejemplo, fuerza de promotor, reconocimiento de promotor, regulación de promotor, función aumentadora) , una propiedad que afecta procesamiento de ARN (por ejemplo, empalme de ARN, estabilidad de ARN, conformación de ARN, y modificación post-transcripcional) , una propiedad que afecta la traducción (por ejemplo, nivel, regulación, enlace de mARN a proteínas ribosomales, modificación post-traduccional) . Por ejemplo, un sitio de enlace para un factor de transcripción, polimerasa, factor regulador, etc., de un ácido nucleico se puede modificar para producir características deseadas o para identificar características no deseadas.

El término "propiedad" o equivalentes gramáticos de los mismos en el contexto de a polipéptido (que incluye proteínas) , como se usa en la presente, se refiere a cualquier característica o atributo de un polipéptido que se puede seleccionar o detectar. Estas propiedades incluyen, pero no se limitan a estabilidad oxidativa, especificidad de sustrato, actividad catalítica, estabilidad térmica, estabilidad alcalina, perfil de actividad de pH, resistencia a degradación proteolítica, KM, kcat, relación kcat/kM, plegamiento de proteína, que induce una respuesta inmunitaria, capacidad para enlazar a un ligando, capacidad para enlazar a un receptor, capacidad para secretarse, capacidad para visualizarse en la superficie de una célula, capacidad para oligomerizar, capacidad de señal, capacidad para estimular la proliferación celular, capacidad para inhibir la proliferación celular, capacidad para inducir apoptosis, capacidad para modificarse por fosforilación o glicosilación, y/o capacidad para tratar la enfermedad, etc.

Como se usa en la presente, el término "cribado" tiene su significado usual en la técnica y es, en general un proceso multi-etapa. En la primera etapa, un ácido nucleico mutante o polipéptido variante de los mismos se proporciona. En la segunda etapa, una propiedad del ácido nucleico mutante o polipéptido variante se determina. En la tercera etapa, la propiedad determinada se compara con una propiedad del ácido nucleico precursor correspondiente, a la propiedad del polipéptido que se presenta naturalmente correspondiente o a la propiedad del material de partida (por ejemplo, la secuencia inicial) para la generación del ácido nucleico mutante .

Será evidente para el técnico experto que el procedimiento de cribado para obtener un ácido nucleico o proteína con una propiedad alterada depende de la propiedad del material de partida la modificación de la cual la generación del ácido nucleico mutante se pretende para facilitar. El técnico experto apreciará por lo tanto que la invención no se limita a cualquier propiedad específica para cribarse y que la siguiente descripción de listas de propiedades ilustrativos de ejemplos únicamente. Los métodos para cribado por cualquier propiedad particular se describen generalmente en la técnica. Por ejemplo, uno puede medir el enlace, pH, especificidad, etc., antes y después de la mutación, en donde un cambio indica una alteración. Preferiblemente, los cribados se realizan en una manera de alto rendimiento, que incluye muestras múltiples que está cribado simultáneamente, que incluye, pero no se limita a ensayos que utilizan chips, visualización de fago, y sustratos múltiples y/o indicadores.

Como se usa en la presente, en algunas modalidades, el cribado abarca las etapas de selección en cuyas variantes de interés se enriquecen de una población de variantes. Los ejemplos de estas modalidades incluyen la selección de variantes que confieren una ventaja de crecimiento al organismo hospedero, así como visualización de fago o cualquier otro método de visualización, donde las variantes se puede capturar de una población de variantes basadas en sus propiedades de enlace o catalíticas. En una modalidad preferida, una colección de variantes se expone a esfuerzo (calor, proteasa, desnaturalización) y posteriormente variantes que están todavía intactas se identifican en una pantalla o enriquecen por selección. Se pretende que el término abarca cualquiera de los medios adecuados para selección. De hecho, no se pretende que la presente invención se limite a cualquier método particular de cribado.

Como se usa en la presente, el término "aleatorización objetivo" se refiere a un proceso que produce una pluralidad de secuencias donde una o más posiciones se han aleatorizado . En algunas modalidades, la aleatorización se completa (esto es, todos los cuatro nucleótidos, A, T, G, y C pueden ocurrir en una posición aleatoria. En modalidades alternativas, la aleatorización de un nucleótido se limita a un subconjunto de los cuatro nucleótidos. La aleatorización objetivo se puede aplicar a uno o varios codones de una secuencia, que codifica una o varias proteínas de interés. Cuando se expresa, las colecciones resultantes producen poblaciones de proteína en las cuales una o más posiciones de aminoácido pueden contener una mezcla de todos los 20 aminoácidos o un subconjunto de aminoácidos, como se determina por el esquema de aleatorización del codón aleatorizado . En algunas modalidades, los miembros individuales de una población que resulta de aleatorización objetivo difieren en el número de aminoácidos, debido a inserción objetivo o al azar o eliminación de codones. En modalidades adicionales, los aminoácidos sintéticos se incluyen en las poblaciones de proteína producidas. En algunas modalidades preferidas, la mayoría de miembros de una población que resulta de aleatorización objetivo muestra mayor homología de secuencia a la secuencia de consenso que el gen de partida. En algunas modalidades, la secuencia codifica una o más proteínas de interés. En modalidades alternativas, las proteínas tienen diferentes funciones biológicas. En algunas modalidades preferidas, la secuencia de entrada comprende al menos un marcador seleccionable. Esta secuencia puede codificar para una o más proteínas de interés. Esto puede tener otra función biológica. En muchos casos la secuencia de entrada incluirá un marcador seleccionable, tal como un gen que confiere resistencia a un antibiótico.

Los términos "secuencia modificada" y "genes modificados" se usan intercambiablemente en la presente para referirse a una secuencia que incluye una eliminación, inserción o interrupción de secuencia de ácido nucleico que se presenta naturalmente. En algunas modalidades preferidas, el producto de expresión de la secuencia modificada es una proteína truncada (por ejemplo, si la modificación es una eliminación o interrupción de la secuencia) . En algunas modalidades particularmente preferidas, la proteína truncada conserva la actividad biológica. En modalidades alternativas, el producto de expresión de la secuencia modificada es una proteína alargada (por ejemplo, modificaciones que comprenden una inserción en la secuencia de ácido nucleico) . En algunas modalidades, una inserción lleva a una proteína truncada (por ejemplo, cuando la inserción resulta en la formación de un codón de detención) . Por lo tanto, una inserción puede resultar en ya sea una proteína truncada o una proteína alargada como un producto de expresión.

Como se usa en la presente, los términos "secuencia mutante" y "gen mutante" se usan intercambiablemente y se refieren a una secuencia que tiene una alteración en al menos un codón que se presenta en una secuencia tipo natural de la célula hospedera. El producto de expresión de la secuencia mutante es una proteína con una secuencia de aminoácido alterada relativa al tipo natural. El producto de expresión puede tener una capacidad funcional alterada (por ejemplo, actividad enzimática aumentada) .

Los términos "cebador mutagénico" o "oligonucleótido mutagénico" (usado intercambiablemente en la presente) se pretenden para referirse a composiciones de oligonucleótido que corresponden a una porción de la secuencia de plantilla y que son capaces de hibridizar al mismo. Con respecto a cebadores mutagénicos, el cebador no precisamente igualará el ácido nucleico de plantilla, la desigualdad o desigualdades en el cebador que se usa para introducir la mutación deseada en la colección de ácido nucleico. Como se usa en la presente, "cebador no mutagénico" o "oligonucleótido no mutagénico" se refiere a composiciones de oligonucleótido que igualarán precisamente al ácido nucleico de plantilla. En una modalidad de la invención, únicamente los cebadores mutagénicos se usan. En otra modalidad preferida de la invención, los cebadores se diseñan de manera que por lo menos una región en la cual un cebador mutagénico se ha incluido, también hay cebador no mutagénico incluido en la mezcla de oligonucleótido. Al agregar una mezcla de cebadores mutagénicos y cebadores no mutagénicos que corresponden a al menos uno de los cebadores mutagénicos, esto es posible para producir una colección de ácido nucleico resultante en la cual una variedad de patrones de mutaciones combinatorios se presentan. Por ejemplo, si se desea que algunos de los miembros de la colección de ácido nucleico mutante mantengan su secuencia de precursor en ciertas posiciones mientras otros miembros son imitantes en tales sitios, los cebadores no mutagénicos proporcionan la capacidad de obtener un nivel específico de miembros no mutantes dentro de la colección de ácido nucleico para un residuo determinado. Los métodos de la invención emplean oligonucleótido mutagénicos o no mutagénicos que están generalmente entre alrededor de 10-50 bases en longitud, o más preferiblemente, alrededor de 15-45 bases en longitud. Sin embargo, puede ser necesario usar cebadores que son ya sea más cortos que alrededor de 10 bases o más largos que alrededor de 50 bases para obtener el resultado de la mutagénesis deseada. Con respecto a cebadores mutagénicos y no mutagénicos correspondientes, no es necesario que los oligonucleótidos correspondientes sean de longitud idéntica, sino que únicamente hay traslape en la región que corresponde a la mutación a agregarse. Los cebadores se pueden agregar en una relación predefinida de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, si se desea que la colección resultante tiene un nivel significativo de una cierta mutación específica y una cantidad menor de una mutación diferente en el mismo o diferente sitio, al ajustar la cantidad de cebador agregado, esto es posible para producir la colección parcial deseada. Alternativamente, al agregar cantidades mayores o menores de cebadores no mutagénicos, es posible ajustar la frecuencia con la cual las mutaciones correspondientes se producen en la colección de ácido nucleico mutante.

Como se usa en la presente, la frase "mutaciones contiguas" se refiere a mutaciones que se presentan dentro del mismo cebador de oligonucleótido . Por ejemplo, las mutaciones contiguas pueden ser adyacentes o cercanas entre sí, sin embargo, se introducirán en los ácidos nucleicos de plantilla mutantes resultantes por el mismo cebador.

Como se usa en la presente, la frase "mutaciones discontiguas" se refiere a mutaciones que se presentan en cebadores de oligonucleótido separados. Por ejemplo, mutaciones discontiguas se introducirán en los ácidos nucleicos de plantilla mutantes resultantes al preparar separadamente cebadores de oligonucleótido.

Los términos "secuencia tipo natural" o "gen tipo natural" se usan intercambiablemente en la presente, para referirse a una secuencia que es nativa o se presenta naturalmente en una célula hospedera. En algunas modalidades, la secuencia de tipo natural se refiere a una secuencia de interés que es el punto de partida de un proyecto de fabricación por ingeniería de proteína. La secuencia de tipo natural puede codificar ya sea una proteína homologa o heteróloga. Una proteína homologa es una célula hospedera que se produciría sin intervención. Una proteína heteróloga es una que la célula hospedera no produciría sino para la intervención.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpos" se refiere a inmunoglobulinas . Los anticuerpos incluyen pero no se limitan a inmunoglobulinas obtenidas directamente de cualquiera de las especies de las cuales es deseable para producir anticuerpos. Además, la presente invención abarca anticuerpos modificados. El término también se refiere a fragmentos de anticuerpo que mantienen la capacidad para enlazar al epítopo que el anticuerpo intacto enlaza e incluye anticuerpos policlonales , anticuerpos monoclonales , anticuerpos quiméricos, anticuerpos anti-idiotipo (anti-ID) . Los fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) , regiones variables de fragmento de cadena sencilla (scFv) , región variable de cadena pesada (VH) , región variable de cadena ligera (VL) . Los Anticuerpos policlonales y monoclonales también se abarcan por la presente invención. Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales .

Como se usa en la presente, la frase "alteración en especificidad de sustrato" se refiere a cambios en la especificidad de sustrato de una enzima. En algunas modalidades, un cambio en especificidad de sustrato se define como un cambio en kcat y/o , para un sustrato particular, que resulta de mutaciones de la enzima o alteración de condiciones de reacción. La especificidad de sustrato de una enzima se determina al comparar las eficiencias catalíticas exhibidas con sustratos diferentes. Estas determinaciones encuentran uso particular en evaluar la eficiencia de enzimas mutantes, como se desea generalmente para producir enzimas de variante que exhiben mayores relaciones de kcat/K,,, para sustratos de interés. Sin embargo, no se pretende que la presente invención se limite a cualquier composición de sustrato particular o especificidad de sustrato.

Como se usa en la presente, "propiedad de superficie" se usa en referencia a carga electrostática, así como propiedades tales como la hidrofobicidad e hidrofilicidad exhibida por la superficie de una proteína.

Como se usa en la presente, la frase "se selecciona independientemente del grupo que consiste de ..." significa que las porciones o elementos que se seleccionan del grupo Markush de referencia pueden ser los mismos, puede ser diferente o cualquier mezcla de elementos como se indica en el siguiente ejemplo: Una molécula que tiene 3 grupos R en donde cada grupo R se selecciona independientemente del grupo que consiste de A, B y C. Aquí los tres grupos R pueden ser: AAA, BBB , CCC, AAB, AAC, BBA, BBC, CCA, CCB, o ABC.

En referencia a composiciones químicas, el término "sustituido" como se usa en la presente, significa que la composición orgánica o radical a la cual el término se aplica es : (a) hecha insaturada por la eliminación de al menos un elemento o radical; o (b) al menos un hidrógeno en el compuesto o radical se reemplaza con una porción que contiene uno o más átomos de (i) carbono, (ii) oxígeno, (iii) azufre, (iv) nitrógeno o (v) halógeno; o (c) tanto (a) como (b) .

Las porciones que pueden reemplazar hidrógeno como se describe en (b) inmediatamente arriba, que contienen únicamente átomos de carbono e hidrógeno, son porciones de hidrocarburos que incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquenilo, alquinilo, alquildienilo, cicloalquilo, fenilo, alquil fenilo, naftilo, antrilo, fenantrilo, fluorilo, grupos esteroides, y combinaciones de estos grupos uno con el otro y con grupos de hidrocarburos polivalentes tales como grupos alquileno, alquilideno y alquilidino. Las porciones que contienen átomos de oxígeno que pueden reemplazar hidrógeno como se describe en (b) inmediatamente arriba incluyen, pero no se limitan a, hidroxi, acilo o ceto, éter, epoxi, carboxi, y grupos que contienen éster. Las porciones que contienen átomos de azufre que pueden reemplazar hidrógeno como se describe en (b) inmediatamente arriba incluyen, pero no se limitan a, los ácidos que contienen azufre y grupos de éster ácido, grupos de tioéter, grupos de mercapto y grupos de tioceto. Las porciones que contienen átomos de nitrógeno que pueden reemplazar hidrógeno como se describe en (b) inmediatamente arriba incluyen, pero no se limitan a, grupos amino, el grupo nitro, grupos de azo, grupos de amonio, grupos de amida, grupos de azido, grupos de isocianato, grupos de ciano y grupos de nitrilo. Las porciones que contienen átomos de halógeno que pueden reemplazar hidrógeno como se describe en (b) inmediatamente arriba incluyen grupos de cloro, bromo, fluoro, yodo y cualquiera de las porciones previamente descritas donde un hidrógeno o un grupo de alquilo colgante se sustituye por un grupo halo para formar una porción estable sustituida.

Se entiende que cualquiera de las porciones anteriores (b) (i) a (b) (v) se puede sustituir en uno al otro en ya sea una sustitución monovalente o por pérdida de hidrógeno en una sustitución polivalente para formar otra porción monovalente que puede reemplazar hidrógeno en el compuesto orgánico o radical .

El término "oxidación estable" se refiere a proteasas de la presente invención que mantienen una cantidad especificada de actividad enzimática durante un periodo de tiempo determinado bajo condiciones predominantes durante el proceso proteolítico, de hidrolización, de limpieza u otro proceso de la invención, por ejemplo mientras se expone a o pone en contacto con agentes blanqueadores o agentes de oxidación. En algunas modalidades, las proteasas mantienen al menos alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 75%, alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 92%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99% actividad proteolítica después de poner en contacto con un agente blanqueador u oxidante durante un periodo de tiempo determinado, por ejemplo, al menos alrededor de 1 minuto, alrededor de 3 minutos, alrededor de 5 minutos, alrededor de 8 minutos, alrededor de 12 minutos, alrededor de 16 minutos, alrededor de 20 minutos, etc. En algunas modalidades, la estabilidad se mide como se describe en los Ejemplos.

El término "quelador estable" se refiere a proteasas de la presente invención que mantienen una cantidad especificada de actividad enzimática durante un periodo de tiempo determinado bajo condiciones que prevalecen durante el proceso proteolítico, de hidrolización, de limpieza u otro proceso de la invención, por ejemplo mientras se expone a o pone en contacto con agentes quelantes. En algunas modalidades, las proteasas mantienen al menos alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 75%, alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 92%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99% de actividad proteolítica después del contacto con un agente quelante durante un periodo de tiempo determinado, por ejemplo, al menos alrededor de 10 minutos, alrededor de 20 minutos, alrededor de 40 minutos, alrededor de 60 minutos, alrededor de 100 minutos, etc. En algunas modalidades, la estabilidad del quelador se mide como se describe en los Ej emplos .

Los términos "térmicamente estable" y "termostable" se refiere a proteasas de la presente invención que mantienen una cantidad especificada de actividad enzimática después de la exposición a temperaturas identificadas durante un periodo de tiempo determinado bajo condiciones que prevalecen durante el proceso proteolítico, hidrolización, de limpieza u otro proceso de la invención, por ejemplo mientras se expone a temperaturas alteradas. Las temperaturas alteradas incluyen temperaturas incrementadas o disminuidas. En algunas modalidades, las proteasas mantienen al menos alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 75%, alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 92%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, o alrededor de 99% de actividad proteolítica después de la exposición a temperaturas alteradas durante un periodo de tiempo determinado, por ejemplo, al menos alrededor de 60 minutos, alrededor de 120 minutos, alrededor de 180 minutos, alrededor de 240 minutos, alrededor de 300 minutos, etc. En algunas modalidades, la termoestabilidad se determina como se describe en los Ejemplos.

El término "estabilidad aumentada" en el contexto de una oxidación, quelador, proteasa térmica y/o de pH estable se refiere a una actividad proteolítica mantenida más alta con el tiempo, como se compara con otra serina proteasas (por ejemplo, subtilisina proteasas) y/o enzimas de tipo natural.

El término "disminución de estabilidad" en el contexto de una oxidación, quelator, proteasa térmica y/o de pH estable se refiere a una actividad proteolítica mantenida más baja con el tiempo, como se compara con otra serina proteasas (por ejemplo, subtilisina proteasas) y/o enzimas de tipo natural .

El término "actividad de limpieza" se refiere al desempeño de limpieza alcanzado por la proteasa bajo condiciones que prevalecen durante el proceso proteolítico, de hidrolización, de limpieza u otro proceso de la invención. En algunas modalidades, el desempeño de limpieza se determina por la aplicación de diversos ensayos de limpieza con respecto a manchas sensibles de la enzima, por ejemplo grasa, sangre, leche, o proteína de huevo como se determina por diversas metodologías cromatográficas , espectrofotométricas u otras cuantitativas después de someter a las manchas a condiciones de lavado estándares. Los ensayos ejemplares incluyen, pero no se limitan a aquellos descritos en O 99/34011, y Patente de E.U.A. 6,605,458 (ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia) , así como aquellos métodos incluidos en los Ejemplos.

El término "cantidad efectiva de limpieza" de una proteasa se refiere a la cantidad de proteasa descrita en la presente antes de que alcance un nivel deseado de actividad enzimática en una composición de limpieza específica. Tales cantidades efectivas son fácilmente comprobadas por uno de experiencia ordinaria en la técnica y se basan en muchos factores, tales como la proteasa particular usada, la aplicación de limpieza, la composición específica de la composición de limpieza, y si una composición líquida o seca (por ejemplo, granular, barra) se requiere, etc.

El término "materiales adjuntos de limpieza," como se usa en la presente, significa cualquier material líquido, sólido o gaseoso seleccionado para el tipo particular de composición de limpieza deseada y la forma del producto (por ejemplo, composición líquida, de gránulo, polvo, barra, pasta, rocío, comprimido, gel; o espuma) , cuyos materiales también son preferiblemente compatibles con la enzima de proteasa usada en la composición. En algunas modalidades, las composiciones granulares son en forma "compacta", mientras que en otras modalidades, las composiciones líquidas son en una forma "concentrada" .

El término "desempeño aumentado" en el contexto de actividad de limpieza se refiere a una actividad de limpieza incrementada o mayor de ciertas manchas sensibles de la enzima tal como huevo, leche, grasa o sangre, como se determina por la evaluación habitual después de un ciclo de lavado estándar y/o múltiples ciclos de lavado.

El término "desempeño disminuido" en el contexto de actividad de limpieza se refiere a una actividad de limpieza disminuida o menor de ciertas manchas sensibles de la enzima tal como huevo, leche, grasa o sangre, como se determina por la evaluación habitual después de un ciclo de lavado estándar .

El término "desempeño comparativo" en el contexto de la actividad de limpieza se refiere a al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95% de la actividad de limpieza de una proteasa comparativa o de referencia (por ejemplo, proteasas comercialmente disponibles) , que incluyen pero no se limitan a proteasa OPTIMASE™ (Genencor) , productos de proteasa PURAFECT™ (Genencor) , proteasa SAVINASE™ (Novozymes) , variantes BPN ' (Ver por ejemplo, Pat . de E.U.A. No. Re 34,606), proteasa RELASE™, DURAZYME™, EVERLASE™, KANNASE™ (Novozymes) , proteasas MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE™ (Genencor; Ver también, Pat. de E.U.A. No. Re 34,606, y Patente de E.U.A.

Nos. 5,700,676; 5,955,340; 6,312,936; y 6,482,628), y productos de proteasa variante B. lentus (por ejemplo, aquellos descritos en WO 92/21760, WO 95/23221 y/o O 97/07770) . El desempeño de limpieza se puede determinar al comparar las proteasas de la presente invención con aquellas subtilisina proteasas en diversos ensayos de limpieza con respecto a manchas sensibles de la enzima tales como grasa, sangre o leche como se determina por metodologías espectrofotométricas o analíticas habituales después de condiciones de ciclo de lavado estándares.

Como se usa en la presente, "composiciones de limpieza" y "formulaciones de limpieza" se refiere a composiciones que encuentran uso en la remoción de compuestos no deseados de artículos a limpiarse, tal como tela, platos, lentes de contacto, otros sustratos sólidos, cabello (champús) , piel (jabones y cremas), dientes (enjuagues bucales, pastas de dientes) etc. El término abarca cualquiera de los materiales/compuestos seleccionados para el tipo particular de composición de limpieza deseada y la forma del producto (por ejemplo, composición líquida, gel, gránulo, o rocío), siempre y cuando la composición sea compatible con la proteasa y otras enzimas usadas en la composición. La selección específica de materiales de composición de limpieza se hace fácilmente al considerar la superficie, artículo o tela a limpiarse, y la forma deseada de la composición para las condiciones de limpieza durante el uso.

Los términos además se refieren a cualquier composición que es adecuada para limpieza, blanquear, desinfectar, y/o esterilizar cualquier objeto y/o superficie. Se pretende que los términos incluyan, pero no se limitan a composiciones de detergente (por ejemplo, detergentes líquidos y/o sólidos para ropa sucia y detergentes para tela fina; formulaciones de limpieza de superficie dura, tal como para vidrio, madera, mostradores de cerámica y metal y ventanas; limpiadores de alfombras; limpiadores de horno; refrescantes de telas; suavizantes de telas; y textiles y pre-marcadores de ropa sucia, así como detergentes para platos) .

En efecto, el término "composición de limpieza" como se usa en la presente, incluye a menos que se indique de otra manera, agentes de lavado de alta resistencia o para todos los propósitos en forma de polvo o granular, especialmente detergentes de limpieza; agentes de lavado para todos los propósitos en forma líquida, gel o pasta, especialmente los llamados tipos de líquido de alta resistencia (HDL) ; detergentes de tela fina líquidos; agentes lavavaj illas a mano o agentes lavavaj illas de baja resistencia, especialmente aquellos del tipo de alta formación de espuma; agentes de lava platos a máquina, que incluyen los diversos comprimido, granular, líquido y tipos de abrillantador para uso domestico e institucional; agentes de limpieza y desinfectantes líquidos, que incluyen tipos de lava manos antibacterianos, barras de limpieza, enjuagues bucales, limpiadores de la dentadura, champús para carro, champús para alfombras, limpiadores para baño; champús para cabello y/o enjuagues para cabello para humanos y otros animales; geles de ducha y baños de espuma y limpiadores de metal; así como auxiliares para la limpieza tales como aditivos para blanquear y "barra para mancha" o tipos de pre-tratamiento .

Como se usa en la presente, "composiciones de limpieza de tela" incluyen composiciones de detergente para lavar ropa sucia a mano o máquina que incluyen composiciones aditivas para lavar ropa sucia y composiciones adecuadas para usar en el enjuague y/o pre-tratamiento de telas teñidas (por ejemplo, prendas, linos, y otros materiales textiles).

Como se usa en la presente, "composiciones de limpieza no para tela" incluyen composiciones de limpieza de superficie no textil (esto es, tela), que incluyen pero no se limita a composiciones de detergente de lava platos, composiciones de limpieza oral, composiciones de limpieza para dentadura, y composiciones de limpieza personal.

Como se usa en la presente, los términos "composición de detergente" y "formulación de detergente" se usan en referencia a mezclas que se pretenden para usar en un medio de lavado para la limpieza de objetos sucios. En modalidades preferidas, el término se usa en referencia a detergentes usados para limpiar platos, cubiertos, etc. (por ejemplo, "detergentes para platos" o "detergentes de lava platos"). No se pretende que la presente invención se limite a cualquier formulación o composición de detergente particular. De hecho, se pretende que además de los detergentes que contienen al menos una proteasa de la presente invención, el término abarca detergentes que contienen tensioactivos , transferasas , enzimas hidrolíticas , reductasas de óxido, mej oradores, agentes blanqueadores, activadores del blanqueado, agentes de azulado y tintes fluorescentes, inhibidores de apelmazamiento, agentes enmascaradores , activadores de enzima, antioxidantes, y solubilizadores .

Como se usa en la presente, "composición de lava platos" se refiere a todas las formas de composiciones para limpieza de vajilla, que incluyen cubiertos, que incluye pero no se limita a formas granulares y líquidas. En algunas modalidades, la composición de lava platos es una composición de "lava platos automático" que encuentra uso en máquinas de lavado de platos automáticas. No se pretende que la presente invención se limite a cualquier tipo particular o composición de vajilla. De hecho, la presente invención encuentra uso en limpieza de vajilla (por ejemplo, platos, que incluye, pero no se limita a platos, copas, vasos, tazones, etc.) y cubiertos (por ejemplo, utensilios, que incluyen pero no se limitan a cucharas, cuchillos, tenedores, utensilios para servir, etc.) de cualquier cáncer, que incluye pero no se limita a cerámicas, plásticos, metales, porcelana, vidrio, acrílico, etc. El término "vajilla" se usa en la presente en referencia a tanto platos como cubiertos.

Como se usa en la presente, el término "blanqueador" se refiere a el tratamiento de un material (por ejemplo, tela, ropa sucia, pulpa, etc.) o superficie por un periodo de tiempo suficiente y bajo pH adecuado y condiciones de temperatura para efectuar un brillo (esto es, blanqueo) y/o limpieza del material. Los ejemplos de químicos adecuados para blanquear incluye pero no se limitan a C102, H202, perácidos, N02, etc.

Como se usa en la presente, "desempeño de lavado" de una proteasa variante se refiere a la contribución de una proteasa variante a lavarse que proporciona desempeño de limpieza adicional al detergente sin la adición de la proteasa variante a la composición. Desempeño de lavado se compara bajo condiciones de lavado relevantes.

El término "condiciones de lavado relevantes" se usa en la presente para indicar las condiciones, particularmente temperatura de lavado, tiempo, mecánicos de lavado, concentración de espuma, tipo de detergente y dureza del agua, actualmente usada en hogares en una segmento de mercado de detergente para platos o ropa sucia.

El término "desempeño de lavado mejorado" se usa para indicar que un mejor resultado final se obtiene en remoción de manchas bajo condiciones de lavado relevantes, o que menos proteasa variante, en base de peso, se necesita para obtener el mismo resultado final relativo al tipo natural correspondiente o proteasa precursora de partida.

Como se usa en la presente, el término "desinfección" se refiere a la remoción de contaminantes de las superficies, así como la inhibición o muerte de microbios en las superficies de los artículos. No se pretende que la presente invención se limite a cualquier superficie en particular, artículo, o contaminantes o microbios a eliminarse.

La forma "compacta" de las composiciones de limpieza en la presente se refleja mejor por la densidad y, en términos de composición, por la cantidad de sal inorgánica de relleno. Las sales inorgánicas de relleno son ingredientes convencionales de composiciones de detergente en forma de polvo. En las composiciones de detergente convencionales, las sales de relleno se presentan en cantidades sustanciales, típicamente alrededor de 17 hasta alrededor de 35% en peso de la composición total. En contraste, en composiciones compactas, la sal de relleno se presenta en cantidades que no excedan alrededor de 15% de la composición total. En algunas modalidades, la sal de relleno se presenta en cantidades que no exceden alrededor de 10%, o más preferiblemente, alrededor de 5%, en peso de la composición. En algunas modalidades, las sales inorgánicas de relleno se seleccionan de las sales de metal alcalino y alcalino terreo de sulfatos y cloruros. En algunas modalidades, una sal de relleno preferida es sulfato de sodio.

Composiciones de Limpieza A menos que se anote de otra manera, todos los niveles de componente o composición proporcionados en la presente se hacen en referencia al nivel activo de ese componente o composición, y son exclusivos de impurezas, por ejemplo, solventes residuales o sub-productos, que se pueden presentar en fuentes comercialmente disponibles. Los pesos de componentes de enzima se basan en proteína activa total. Todos los porcentajes y relaciones se calculan en peso a menos que se indique de otra manera. Todos los porcentajes y relaciones se calculan con base en la composición total a menos que se indique de otra manera. En las composiciones de detergente ejemplificadas, los niveles de enzimas se expresan por la enzima pura en peso de la composición total y a menos que se especifique de otra manera, los ingredientes de detergente se expresan en peso de las composiciones totales.

Como se indica en la presente, en algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden materiales adjuntos que incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos , mejoradores, blanqueadores, activadores del blanqueado, catalizadores de blanqueo, otras enzimas, sistemas de estabilización de enzima, quelantes, blanqueadores ópticos, polímeros de liberación del suelo, agentes de transferencia de tintes, dispersantes, supresores de espuma, tintes, perfumes, colorantes, sales de relleno, hidrótropos, fotoactivadores , agentes de fluorescencia, suavizantes de tela, tensioactivos hidrolizables , conservadores, anti-oxidantes , agentes anti-contracción, agentes anti-arrugas , germicidas, fungicidas, manchas de color, cuidado de la plata, agentes anti-manchas y/o anticorrosión, fuentes de alcalinidad, agentes solubilizantes , portadores, auxiliares de procesamiento, pigmentos, y agentes de control de pH (Ver por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos. 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 y 5,646,101, todos de los cuales se incorporan en la presente como referencia) . Las modalidades de materiales de composición de limpieza específicos se ejemplifican en detalle abajo. En modalidades en las cuales los materiales adjuntos de limpieza no son compatibles con las proteasas variantes de la presente invención en las composiciones de limpieza, entonces los métodos adecuados se usan para mantener los materiales adjuntos de limpieza y las proteasas separadas (esto es, no en contacto uno con el otro) hasta que la combinación de los dos componentes es apropiada. Tales métodos de separación incluyen cualquier método adecuado conocido en la técnica (por ejemplo, -cápsulas de gel, encapsulación, comprimidos, separación física, etc.).

Las composiciones de limpieza de la presente invención se emplean ventajosamente por ejemplo, en aplicaciones para ropa sucia, limpieza de superficie dura, aplicaciones de lava platos, así como aplicaciones cosméticas tales como dentaduras postizas, dientes, cabello y piel. Además, debido a las ventajas únicas de eficacia incrementada en soluciones de temperatura más baja, las enzimas de la presente invención son idealmente adecuadas para aplicaciones de ropa sucia. Por otra parte, la enzimas de la presente invención encuentran uso en composiciones granulares y líquidas.

Las proteasas variantes de la presente invención también encuentran uso en productos aditivos de limpieza. En algunas modalidades, las aplicaciones de limpieza de solución de temperatura baja encuentran uso. En algunas modalidades, la presente invención proporciona productos aditivos de limpieza que incluyen al menos una enzima de la presente invención es idealmente adecuada para la inclusión en un proceso de lavado cuando la eficacia del blanqueador adicional se desea. Tales casos incluyen, pero no se limitan a aplicaciones de limpieza de solución de temperatura baja. En algunas modalidades, el producto aditivo está en su forma más simple, una o más proteasas. En algunas modalidades, el aditivo se envasa en forma de dosificación para la adición a un proceso de limpieza. En algunas modalidades, el aditivo se envasa en forma de dosificación para la adición a un proceso de limpieza donde una fuente de peroxígeno se emplea y se desea el incremento de la eficacia del blanqueador. Cualquier forma unitaria de dosificación sencilla adecuada encuentra uso con la presente invención, que incluyen pero no se limitan a pastillas, comprimidos, cápsulas de gel, u otras unidades de dosificación sencilla tal como polvos pre-medidos o líquidos. En algunas modalidades, los materiales de rellenos o portadores se incluyen para incrementar el volumen de tales composiciones. Los materiales de relleno o portadores incluyen, pero no se limitan a, diversas sales de sulfato, carbonato y silicato así como talco, arcilla y similares. Los materiales de relleno o portadores para composiciones líquidas incluyen, pero no se limitan a agua o alcoholes primarios y secundarios de peso molecular bajo que incluyen polioles y dioles. Los ejemplos de tales alcoholes incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, propanol e isopropanol. En algunas modalidades, las composiciones contienen desde alrededor de 5% hasta alrededor de 90% de tales materiales. Los rellenos ácidos encuentran uso para reducir el pH. Alternativamente, en algunas modalidades, el aditivo de limpieza incluye ingredientes adjuntos, como más completamente se describe abajo.

Las composiciones de limpieza presentes y aditivos de limpieza requieren una cantidad efectiva de al menos una de las variantes de proteasa proporcionadas en la presente, sólo o en combinación con otras proteasas y/o enzimas adicionales. El nivel requerido de enzima se alcanza por la adición de una o más variantes de proteasa de la presente invención. Típicamente las composiciones de limpieza presentes comprenderá al menos alrededor de 0.0001 por ciento en peso, desde alrededor de 0.0001 hasta alrededor de 10, desde alrededor de 0.001 hasta alrededor de 1, o aún desde alrededor de 0.01 hasta alrededor de 0.1 por ciento en peso de al menos una de las proteasas variantes de la presente invención .

Las composiciones de limpieza en la presente se formulan típicamente de tal manera que, durante el uso en operaciones de limpieza acuosas, el agua de lavado tendrá un pH de desde alrededor de 5.0 hasta alrededor de 11.5 o aún desde alrededor de 7.5 hasta alrededor de 10.5. Las formulaciones de producto líquido se formulan típicamente para tener un pH limpio desde alrededor de 3.0 hasta alrededor de 9.0 o aún desde alrededor de 3 hasta alrededor de 5. Los productos de lavandería granulares se formulan típicamente para tener un pH desde alrededor de 9 hasta alrededor de 11. Las técnicas para controlar el pH en niveles de uso recomendados incluyen el uso de soluciones amor iguadoras, álcalis, ácidos, etc., y son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Las composiciones de limpieza de pH bajo adecuadas típicamente tienen un pH limpio desde alrededor de 3 hasta alrededor de 5, y son típicamente libres de tensioactivos que hidrolizan en tal un ambiente de pH. Tales tensioactivos incluyen tensioactivos de alquil sulfato de sodio que comprenden al menos una porción de óxido de etileno o aún desde alrededor de 1 hasta alrededor de 16 moles de óxido de etileno. Tales composiciones de limpieza típicamente comprenden una cantidad suficiente de un modificador de pH, tal como hidróxido de sodio, monoetanolamina o ácido clorhídrico, para proporcionar tal composición de limpieza con un pH limpio de desde alrededor de 3 hasta alrededor de 5. Tales composiciones típicamente comprenden al menos una enzima estable de ácido. En algunas modalidades, las composiciones son líquidos, mientras que en otras modalidades, son sólidos. El pH de tales composiciones líquidas se mide típicamente como un pH limpio. El pH de tales composiciones sólidas se mide como una solución de sólidos al 10% de tal composición en donde el solvente es agua destilada. En estas modalidades, todas las mediciones de pH se toman en 20°C, a menos que se indique de otra manera.

En algunas modalidades, cuando las proteasas de variante son empleadas en una composición granular o líquida, es deseable para la proteasa variante estar en la forma de una partícula encapsulada para proteger la proteasa variante de otros componentes de la composición granular durante el almacenamiento. Además, la encapsulación es también un medio para controlar la disponibilidad de la proteasa variante durante el proceso de limpieza. En algunas modalidades, la encapsulación aumenta el desempeño de las proteasas variantes y/o enzimas adicionales. En este sentido, las proteasas variantes de la presente invención se encapsulan con cualquier material de encapsulación adecuado conocido en la técnica. En algunas modalidades, el material de encapsulación típicamente encapsula al menos parte del catalizador para las proteasas variantes de la presente invención. Típicamente, el material de encapsulación es soluble en agua y/o dispersable en agua. En algunas modalidades, el material de encapsulación tiene una temperatura de transición de vidrio (Tg) de 0°C o mayor. La temperatura de transición de vidrio se describe en más detalle en la WO 97/11151. El material de encapsulación se selecciona típicamente de consistir de carbohidratos, gomas naturales o sintéticas, quitina, quitosan, celulosa y derivados de celulosa, silicatos, fosfatos, boratos, alcohol de polivinilo, glicol de polietileno, ceras de parafina, y combinaciones de los mismos. Cuando el material de encapsulación es un carbohidrato, esto se selecciona típicamente de monosacáridos, oligosacáridos , polisacáridos , y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades típicas, el material de encapsulación es un almidón (Ver por ejemplo, EP 0 922 499; US 4,977,252; US 5,354,559, y US 5,935,826). En algunas modalidades, el material de encapsulación es una microesfera hecha de plástico tal como termoplásticos , acrilonitrilo, metacrilonitrilo, poliacrilonitrilo, polimetacrilonitrilo y mezclas de los mismos; las microesferas comercialmente disponibles que encuentran uso incluyen, pero no se limitan a aquellas suministradas por EXPANCEL® (Stockviksverken, Suecia) , y PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES®, LUXSIL®, Q-CEL®, y SPHERICEL® (PQ Corp., Valley Forge, PA) .

Como se describe en la presente, las proteasas variantes de la presente invención encuentran uso particular en la industria de la limpieza, que incluyen, pero no se limita a detergentes para lavandería y para platos. Estas aplicaciones colocan enzimas bajo diversas presiones ambientales. Las proteasas variantes de la presente invención proporcionan ventajas sobre muchas enzimas usadas actualmente, debido a su estabilidad bajo diversas condiciones.

De hecho, hay una variedad de condiciones de lavado que incluyen diferentes formulaciones de detergente, volúmenes de agua de lavado, temperaturas de agua de lavado, y longitudes de tiempo de lavado, a las cuales las proteasas implicadas en el lavado se exponen. Además, las formulaciones de detergente usadas en diferentes áreas geográficas tienen diferentes concentraciones de sus componentes relevantes presentes en el agua de lavado. Por ejemplo, los detergentes Europeos típicamente tienen alrededor de 4500-5000 ppm de componentes de detergente en el agua de lavado, mientras que los detergentes Japoneses típicamente tienen aproximadamente 667 ppm de componentes de detergente en el agua de lavado. En América del Norte, particularmente los Estados Unidos, los detergentes típicamente tienen alrededor de 975 ppm de los componentes de detergente presentes en el agua de lavado.

Un sistema de baja concentración de detergente incluye detergentes donde menor que alrededor de 800 ppm de los componentes de detergente se presentan en el agua de lavado. Los detergentes Japoneses se consideran típicamente sistema de baja concentración de detergente ya que tienen aproximadamente 667 ppm de componentes de detergente presentes en el agua de lavado.

Una concentración de detergente media incluye detergentes donde entre alrededor de. 800 ppm y alrededor de 2000 ppm de los componentes de detergente se presentan en el agua de lavado. Los detergentes de América del Norte se consideran generalmente para ser los sistemas de concentración de detergente media ya que tienen aproximadamente 975 ppm de los componentes de detergente presentes en el agua de lavado. Brasil típicamente tiene aproximadamente 1500 ppm de componentes de detergente presentes en el agua de lavado.

Un sistema de alta concentración de detergente incluye detergentes donde mayor que alrededor de 2000 ppm de los componentes de detergente se presentan en el agua de lavado. Los detergentes Europeos se consideran generalmente para ser sistemas de alta concentración de detergente ya que tienen aproximadamente 4500-5000 ppm de los componentes de detergente en el agua de lavado.

Los detergentes de América Latina son generalmente detergentes mej oradores de fosfato de alta espuma y el intervalo de detergentes usados en América Latina puede caer en ambas las concentraciones de detergente media y alta ya que van desde 1500 ppm hasta 6000 ppm de los componentes de detergente en el agua de lavado. Como se menciona arriba, Brasil típicamente tiene aproximadamente 1500 ppm de componentes de detergente presente en el agua de lavado. Sin embargo, otras zonas geográficas de detergente mej orador de fosfato de alta espuma, no limitado a otros países de América Latina, pueden tener sistema de alta concentración de detergentes hasta alrededor de 6000 ppm de componentes de detergente presentes en el agua de lavado.

En vista de lo anterior, es evidente que las concentraciones de composiciones de detergente en soluciones de lavado típicas en todo el mundo varía desde menor que alrededor de 800 ppm de composición de detergente ("zonas geográficas de baja concentración de detergente"); por ejemplo alrededor de 667 ppm en Japón, hasta entre alrededor de 800 ppm hasta alrededor de 2000 ppm ("zonas geográficas de concentración de detergente media"), por ejemplo alrededor de 975 ppm en E.U.A. y alrededor de 1500 ppm en Brasil, hasta mayor que alrededor de 2000 ppm ("zonas geográficas de alta concentración de detergente"), por ejemplo alrededor de 4500 ppm hasta alrededor de 5000 ppm en Europa y alrededor de 6000 ppm en zonas geográficas de mej orador de fosfato de alta espuma .

Las concentraciones de las soluciones de lavado típicas se determinan empíricamente. Por ejemplo, en los E.U.A. , una máquina de lavado típica mantiene un volumen de alrededor de 64.4 L de solución de lavado. En consecuencia, con objeto de obtener una concentración de alrededor de 975 ppm de detergente dentro de la solución de lavado alrededor de 62.79 g de composición de detergente se debe agregar a los 64.4 L de solución de lavado. Esta cantidad es la cantidad típica medida en el agua de lavado por el consumidor usando la taza de medida proporcionada con el detergente.

Como un ejemplo adicional, diferentes zonas geográficas usan diferentes temperaturas de lavado. La temperatura del agua de lavado en Japón es típicamente menor que la usada en Europa. Por ejemplo, la temperatura del agua de lavado en América del Norte y Japón está típicamente entre alrededor de ío y alrededor de 30°C (por ejemplo, alrededor de 20°C) , mientras que la temperatura de agua de lavado en Europa está típicamente entre alrededor de 30 y alrededor de 60°C (por ejemplo, alrededor de 40°C) . Sin embargo, en el interés de ahorrar energía, muchos consumidores están cambiando a lavar con agua fría. Además, en algunas regiones más, el agua fría se usa típicamente para lavandería, así como aplicaciones de lava platos. En algunas modalidades, el "lavado con agua fría" de la presente invención utiliza lavado en temperaturas desde alrededor de 10°C hasta alrededor de 40°C, o desde alrededor de 20°C hasta alrededor de 30°C, o desde alrededor de 15°C hasta alrededor de 25°C, así como todas las otras combinaciones dentro del intervalo de alrededor de 15°C hasta alrededor de 35°C, y todos los intervalos dentro de 10°C hasta 40°C.

Como un ejemplo adicional, diferentes zonas geográficas típicamente tienen diferente dureza del agua. La dureza del agua se describe usualmente en términos de los granos por galón mezclado Ca2+/Mg2+ . La dureza es una medida de la cantidad de calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+) en el agua. La mayoría del agua en los Estados Unidos es dura, pero el grado de dureza varía. El agua moderadamente dura (60-120 ppm) a dura (121-181 ppm) tiene 60 hasta 181 partes por millón (partes por millón convertida a granos por galón E.U.A es # de ppm dividido por 17.1 granos iguales por galón) de minerales de dureza.

Agua Granos por galón Partes por millón Suave Menos de 1.0 Menos de 17 Ligeramente dura 1.0 hasta 3.5 17 hasta 60 Moderadamente dura 3.5 hasta 7.0 60 hasta 120 Dura 7.0 hasta 10.5 120 hasta 180 Muy dura Mayor que 10.5 Mayor que 180 La dureza del agua Europea típicamente es mayor que alrededor de 10.5 (por ejemplo alrededor de 10.5 hasta alrededor de 20.0) granos por galón mezclado Ca2~VMg2+ (por ejemplo, alrededor de 15 granos por galón mezclado Ca2~VMg+) . La dureza del agua de América del Norte es típicamente mayor que la dureza del agua Japonesa, pero menor que la dureza del agua Europea. Por ejemplo, la dureza del agua de América del Norte puede ser de entre alrededor de 3 hasta alrededor de 10 granos, alrededor de 3 hasta alrededor de 8 granos o alrededor de 6 granos. La dureza del agua Japonesa es típicamente menor que la dureza del agua de América del Norte, usualmente menor que alrededor de 4, por ejemplo alrededor de 3 granos por galón mezclado Ca2~VMg2+.

En consecuencia, en algunas modalidades, la presente invención proporciona proteasas variantes que muestran un desempeño de lavado sorprendente en al menos un conjunto de condiciones de lavado (por ejemplo, temperatura del agua, dureza del agua, y/o concentración de detergente) . En algunas modalidades, las proteasas variantes de la presente invención son comparables en desempeño de lavado a otras subtilisina proteasas. En algunas modalidades, las proteasas variantes de la presente invención exhiben desempeño de lavado aumentado como se compara con las subtilisina proteasas comercialmente disponibles actualmente. De esta manera, en algunas modalidades preferidas de la presente invención, las proteasas variantes proporcionadas en la presente exhiben estabilidad oxidante aumentada, estabilidad térmica aumentada, capacidades de limpiado aumentadas bajo diversas condiciones, y/o estabilidad al quelador aumentada. Además, las proteasas variantes de la presente invención encuentran uso en las composiciones de limpieza que no incluyen detergentes, de nuevo ya sea solas o en combinación con mejoradores y estabilizantes.

En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención a un nivel desde alrededor de 0.00001 % hasta alrededor de 10% en peso de la composición y el balance (por ejemplo, alrededor de 99.999% hasta alrededor de 90.0%) comprende materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden al menos una proteasa variante a un nivel de alrededor de 0.0001% hasta alrededor de 10%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 5%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 2%, alrededor de 0.005% hasta alrededor de 0.5% en peso de la composición y el balance de la composición de limpieza (por ejemplo, alrededor de 99.9999% hasta alrededor de 90.0%, alrededor de 99.999 % hasta alrededor de 98%, alrededor de 99.995% hasta alrededor de 99.5% en peso) comprende materiales adjuntos de limpieza.

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden una o más enzimas detergentes adicionales, que proporcionan desempeño de limpieza y/o cuidado de telas y/o beneficios de lavaplatos. Los ejemplos de enzimas apropiadas incluyen, pero no se limitan a, hemicelulasas , celulasas, peroxidasas, proteasas, xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, cutinasas, pectinasas, pectato liasas, mananasas, queratinasas , reductases, oxidasas, fenoloxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas, arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, y amilasas, o mezclas de los mismos. En algunas modalidades, se usa una combinación de enzimas (esto es, un "cóctel") que comprende enzimas aplicables convencionales tipo proteasa, lipasa, cutinasa y/o celulasa en conjunto con amilasa .

Además de las variantes de proteasa proporcionadas en la presente, cualquier otros proteasa apropiada encuentra uso en las composiciones de la presente invención. Las proteasas apropiadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. En algunas modalidades particularmente preferidas, se usan proteasas microbianas. En algunas modalidades, se incluyen mutantes químicamente o genéticamente modificados. En algunas modalidades, la proteasa es una serina proteasa, preferiblemente una proteasa microbiana alcalina o una proteasa tipo tripsina. Los ejemplos de proteasas alcalinas incluyen subtilisinas , especialmente aquellas derivadas de Bacillus (por ejemplo, subtilisina, lentus, amyloliquefaciens, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168) . Los ejemplos adicionales incluyen aquellas proteasas mutantes como se describe en las Patentes de E.U.A. Nos. RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936, y 6,482,628, todos de los cuales se incorporan en la presente como referencia. Los ejemplos de proteasas adicionales incluyen, pero no se limitan a tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino), y la proteasa Fusariu descrita en O 89/06270. En algunas modalidades, las enzimas proteasas comercialmente disponibles que encuentran uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a MAXATASE®, MAXACAL™ , MAXAPEM™, OPTICLEAN® , OPTIMASE®, PROPERASE®, PURAFECT®, PURAFECT® OXP, PURAMAX™, EXCELLASE™, y PURAFAST™ (Genencor) ; ALCALASE®, SAVINASE®, PRIMASE®, DURAZYM™, POLARZYME®, OVOZYME®, KANNASE® , LIQUA ASE®, NEUTRASE® , RELASE® y ESPERASE® (Novozymes) ; y BLAP™ (Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien, Duesseldorf, Alemania) . Se describen varias proteasas en W095/23221, WO 92/21760, Publ. de Patente de E.U.A. No. 2008/0090747, y Patentes de E.U.A. Nos. 5,801,039, 5,340,735, 5,500,364, 5,855,625, US RE 34,606, 5,955,340, 5,700,676, 6,312,936, y 6,482,628, y varias otras patente. En algunas modalidades adicionales, las metaloproteasas que encuentran uso en la presente invención, incluyen pero no se limitan a la metaloproteasa neutra descrita en WO 07/044993.

Además, cualquier lipasa adecuada encuentra uso en la presente invención. Las lipasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes químicamente o genéticamente modificados se abarcan por la presente invención. Los ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasa Humicola lanuginosa (Ver por ejemplo, EP 258 068, y EP 305 216), lipasa Rhizomucor miehei (Ver por ejemplo, EP 238 023), lipasa Candida, tal como lipasa C. antárctica (por ejemplo, la lipasa C. antárctica A o B; Ver por ejemplo, EP 214 761) , lipasas Pseudomonas tal como lipasa P. alcaligenes y lipasa P. pseudoalcaligenes (Ver por ejemplo, EP 218 272) , lipasa P. cepacia (Ver por ejemplo, EP 331 376), lipasa P. stutzeri (Ver por ejemplo, GB 1,372,034), lipasa P. fluorescens, lipasa Bacillus (por ejemplo, lipasa 23. subtilis [Dartois et al., Biochem. Biophys. Acta 1131: 253-260

[1993] ) ; lipasa B. stearothermophilus [Ver por ejemplo, JP 64/744992] ; y lipasa B . pumilus [Ver por ejemplo, O 91/16422] ) .

Por otra parte, un número de lipasas clonadas encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención, que incluyen pero no se limita a lipasa Penicillium camembertii (Ver, Yamaguchi et al., Gene 103: 61-67

[1991]), lipasa Geotricum candidum (Ver, Schimada et al, J. Biochem. , 106: 383-388

[1989]), y diversas lipasas Rhizopus tal como lipasa R. delemar (Ver, Hass et al, Gene 109: 117-113

[1991]), una lipasa R. niveus (Kugimiya et al, Biosci . Biotech. Biochem. 56: 716-719

[1992]) y lipasa R. oryzae.

Otros tipos de enzimas lipolíticas tal como cutinasas también encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención, que incluyen pero no se limitan a la cutinasa derivada de Pseudomonas mendocina (Ver, WO 88/09367) , y la cutinasa derivada de Fusarium solani pisi (Ver, WO 90/09446) .

Las lipasas adecuadas adicionales incluyen lipasas comercialmente disponibles tal como MI LIPASE™, LUMA FAST™, y LIPOMAX™ (Genencor) ; LIPOLASE® y LIPOLASE® ULTRA (Novozymes) ; y LIPASA P™ "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Japón).

En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden lipasas a un nivel desde alrededor de 0.00001% hasta alrededor de 10% de la lipasa adicional en peso de la composición y el equilibrio de materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden lipasas a un nivel de alrededor de 0.0001% hasta alrededor de 10%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 5%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 2%, alrededor de 0.005% hasta alrededor de 0.5% lipasa en peso de la composición.

En algunas modalidades de la presente invención, cualquier amilasa adecuada encuentra uso en la presente invención. En algunas modalidades, cualquier amilasa (por ejemplo, alfa y/o beta) adecuada para usar en soluciones alcalinas también encuentran uso. Las amilasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes químicamente o genéticamente modificados se incluyen en algunas modalidades. Las amilasas que encuentran uso en la presente invención, incluyen, pero no se limitan a a-amilasas obtenidas de B. licheniformis (Ver por ejemplo, GB 1,296,839). Las amilasas comercialmente disponibles que encuentran uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a DURAMYL®, TERMAMYL®, FUNGAMYL®, STAINZYME®, STAINZYME PLUS®, STAINZYME ULTRA®, y BA ™ (Novozymes) , así como POWERASE™, RAPIDASE® y MAXAM YL® P (Genencor) .

En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden amilasas a un nivel desde alrededor de 0.00001% hasta alrededor de 10% de amilasa adicional en peso de la composición y el equilibrio de materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden amilasas a un nivel de alrededor de 0.0001% hasta alrededor de 10%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 5%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 2%, alrededor de 0.005% hasta alrededor de 0.5% de amilasa en peso de la composición.

En algunas modalidades adicionales, cualquier celulasa adecuada encuentra uso en las composiciones de limpieza de la presente invención. Las celulasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes químicamente o genéticamente modificados se incluyen en algunas modalidades. Las celulasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a celulasas Humicola insolens (Ver por ejemplo, Pat . de E.U.A. No. 4,435,307). Especialmente celulasas adecuadas son las celulasas que tienen beneficios del cuidado de color (Ver por ejemplo, EP 0 495 257) . Las celulasas comercialmente disponibles que encuentran uso en la presente incluyen, pero no se limitan a CELLUZYME®, CAREZYME® (Novozymes) , y KAC-500(B)™ (Kao Corporation). En algunas modalidades, las celulasas se incorporan como porciones o fragmentos de celulosas de variante o tipo natural mutante, en donde una porción de la N-terminal se elimina (Ver por ejemplo, Pat . de E.U.A. No. 5,874,276). En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden celulasas a un nivel desde alrededor de 0.00001% hasta alrededor de 10% de la celulasa adicional en peso de la composición y el equilibrio de materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden celulasas a un nivel de alrededor de 0.0001% hasta alrededor de 10%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 5%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 2%, alrededor de 0.005% hasta alrededor de 0.5% de celulasa en peso de la composición.

Cualquier mananasa adecuada para usar en composiciones de detergente también encuentra uso en la presente invención. Las mananasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a aquellas de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes químicamente o genéticamente modificados se incluyen en algunas modalidades. Diversas mananasas se conoce que encuentran uso en la presente invención (Ver por ejemplo, Pat. de E.U.A. No. 6,566,114, Pat. de E.U.A. No .6 , 602 , 842 , y Patente de E.U.A. No. 6,440,991, todas de los cuales se incorporan en la presente como referencia) . En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden mananasas a un nivel desde alrededor de 0.00001% hasta alrededor de 10% de la mananasa adicional en peso de la composición y el equilibrio de materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden mananasas a un nivel de alrededor de 0.0001% hasta alrededor de 10%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 5%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 2%, alrededor de 0.005% hasta alrededor de 0.5% mananasa en peso de la composición.

En algunas modalidades, las peroxidasas se usan en combinación con peróxido de hidrógeno o una fuente del mismo (por ejemplo, un percarbonato, perborato o persulfato) en las composiciones de la presente invención. En algunas modalidades alternativas, las oxidasas se usan en combinación con oxígeno. Ambos tipos de enzimas se usan para "solución blanqueadora" (esto es, para prevenir la transferencia de un tinte para textil de una tela teñida a otra tela cuando las telas se lavan juntas en un licor de lavado) , preferiblemente junto con un agente de aumento (Ver por ejemplo, WO 94/12621 y WO 95/01426). Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a aquellas de planta, de origen bacteriano o fúngico. Los mutantes químicamente o genéticamente modificados se incluyen en algunas modalidades. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden enzimas de peroxidasa y/u oxidasa a un nivel desde alrededor de 0.00001% hasta alrededor de 10% de peroxidasa y/u oxidasa adicional en peso de la composición y el equilibrio de materiales adjuntos de limpieza en peso de la composición. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de limpieza de la presente invención también comprenden, enzimas de peroxidasa y/u oxidasa a un nivel de alrededor de 0.0001% hasta alrededor de 10%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 5%, alrededor de 0.001% hasta alrededor de 2%, alrededor de 0.005% hasta alrededor de 0.5% de enzimas de peroxidasa y/u oxidasa en peso de la composición.

En algunas modalidades, las enzimas adicionales encuentran uso, que incluyen pero no se limita a perhidrolasas (Ver por ejemplo, WO 05/056782). Además, en algunas modalidades particularmente preferidas, las mezclas de las enzimas antes mencionadas se abarcan en la presente, en particular una o más proteasa adicional, amilasa, lipasa, mananasa, y/o al menos una celulasa. De hecho, se contempla que diversas mezclas de estas enzimas encontrarán uso en la presente invención. Se contempla también que los niveles de variación de las proteasas variantes y una o más enzimas adicionales pueden ambos independientemente variar hasta alrededor de 10%, el equilibrio de la composición de limpieza siendo materiales adjuntos de limpieza. La selección específica de materiales adjuntos de limpieza se hace fácilmente al considerar la superficie, artículo, o tela a limpiarse, y la forma deseada de la composición por las condiciones de limpieza durante el uso (por ejemplo, a través del uso de detergente de lavado) .

Los ejemplos de materiales adjuntos de limpieza adecuados incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos , mej oradores, blanqueadores, activadores del blanqueado, catalizadores de blanqueo, otras enzimas, sistemas de estabilización de enzima, quelantes, blanqueadores ópticos, polímeros de liberación del suelo, agentes de transferencia de tintes, agentes que inhiben la transferencia de tintes, materiales catalíticos, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de eliminación de suelo de arcilla, agentes de estructura elástica, dispersantes, supresores de espuma, tintes, perfumes, colorantes, sales de relleno, hidrótropos, fotoactivadores , agentes de fluorescencia, suavizantes de tela, suavizantes de telas, portadores, hidrótropos, auxiliares de procesamiento, solventes, pigmentos, tensioactivos hidrolizables , conservadores, anti-oxidantes , agentes anti-contracción, agentes anti-arrugas , germicidas, fungicidas, manchas de color, cuidado de la plata, agentes anti -manchas y/o anti-corrosión, fuentes de alcalinidad, agentes solubilizantes , portadores, auxiliares de procesamiento, pigmentos, y agentes de control de pH (Ver por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos. 6,610,642, 6,605,458, 5,705,464, 5,710,115, 5,698,504, 5,695,679, 5,686,014 y 5,646,101, todos de los cuales se incorporan en la presente como referencia) . Las modalidades de materiales de composición de limpieza específicos se ejemplifican en detalle abajo. En modalidades en las cuales los materiales adjuntos de limpieza no son compatibles con las proteasas variantes de la presente invención en las composiciones de limpieza, además se usan los métodos adecuados para mantener los materiales adjuntos de limpieza y la proteasa (s) separada (esto es, sin contacto uno con el otro) hasta que la combinación de los dos componentes sea apropiada. Tales métodos de separación incluyen cualquier método adecuado conocido en la técnica (por ejemplo, cápsulas de gel, encapsulación, comprimidos, separación física, etc.).

En algunas modalidades preferidas, una cantidad efectiva de una o más proteasa variante proporcionadas en la presente se incluyen en composiciones útiles para limpiar una variedad de superficies con la necesidad de eliminación de manchas proteicas. Tales composiciones de limpieza incluyen composiciones de limpieza para tales aplicaciones como limpiar superficies duras, telas, y platos. De hecho, en algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de limpieza de tela, mientras en otras modalidades, la presente invención no proporciona composiciones de limpieza para telas. Notablemente, la presente invención también proporciona composiciones de limpieza adecuadas para el cuidado personal, que incluyen cuidado oral (que incluyen dentrífieos, pastas de dientes, enjuagues bucales, etc., así como composiciones de limpieza para dentadura), composiciones de limpieza para la piel, y cabello. Se pretende que la presente invención abarque composiciones de detergentes en cualquier forma (esto es, líquida, granular, barra, semi-sólida, geles, emulsiones, comprimidos, cápsulas, etc.).

A modo de ejemplo, varias composiciones de limpieza en donde las variantes de proteasas de la presente invención encuentran uso, se describen con más detalle a continuación. En algunas modalidades en las cuales las composiciones de limpieza de la presente invención se formulan como composiciones adecuadas para usar en método (s) de lavado a máquina de ropa sucia, las composiciones de la presente invención preferiblemente contienen al menos un tensioactivo y al menos un compuesto mejorado, así como uno o más materiales adjuntos de limpieza preferiblemente selecciona de compuestos poliméricos orgánicos, agentes blanqueadores, enzimas adicionales, supresores de espuma, dispersantes, dispersantes de jabón de limón, agentes de suspensión de suelo y anti-redeposición e inhibidores de corrosión. En algunas modalidades, composiciones de ropa sucia también contienen agentes suavizantes (esto es, como materiales adjuntos de limpieza adicionales) . Las composiciones de la presente invención también encuentran uso de productos aditivos de detergente en forma sólida o líquida. Tales productos aditivos se pretenden para complementar y/o aumentar el rendimiento de composiciones de detergentes convencionales y se pueden agregar en cualquier etapa del proceso de limpieza. En algunas modalidades, la densidad de las composiciones del detergente de lavandería en la presente van desde alrededor de 400 hasta alrededor de 1200 g/litro( mientras en otras modalidades, van desde alrededor de 500 hasta alrededor de 950 g/litro de composición medido a 20 °C.

En modalidades formuladas como composiciones para usar en métodos de lava platos manuales, las composiciones de la invención preferiblemente contienen al menos un tensioactivo y preferiblemente al menos un material adjunto de limpieza adicional seleccionado de compuestos poliméricos orgánicos, agentes que aumentan la espuma, iones metálicos del grupo II, solventes, hidrótropos y enzimas adicionales.

En algunas modalidades, varias composiciones de limpieza tal como aquellas proporcionadas en la Pat . E.U.A. No. 6,605,458, encuentra uso con las variantes de proteasas de la presente invención. Así, en algunas modalidades, las composiciones que comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención es una composición de limpieza de tela granular compacta, mientras en otras modalidades, la composición es una composición de limpieza de tela granular útil en el blanqueo de telas de colores, en modalidades adicionales, la composición es una composición de limpieza de tela granular la cual proporciona suavidad a través de la capacidad e lavado, en modalidades adicionales, la composición es una composición de limpieza de tela líquido resistente. En algunas modalidades, las composiciones que comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención son composiciones de limpieza de tela tal como aquellos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642 y 6,376,450. Además, la variantes de proteasas de la presente invención encuentra uso en composiciones de ropa sucia de detergente granular de utilidad particular bajo condiciones de lavado Europeas o Japonesas (Ver por ejemplo, Pat . de E.U.A. No. 6, 610, 642) .

En algunas modalidades alternativas, la presente invención proporciona composiciones de limpieza de superficies duras que comprenden al menos una proteasa variante proporcionadas en la presente. Así, en algunas modalidades, las composiciones que comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención es una composición de limpieza de superficies duras tal como aquellas descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642, 6,376,450, y 6,376,450. En aún modalidades adicionales, la presente invención proporciona composiciones de lava platos que comprenden al menos una proteasa variante proporcionadas en la presente. Así, en algunas modalidades, las composiciones que comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención es una composición de limpieza de superficies duras tal como aquellas en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,610,642 y 6,376,450. En todavía algunas modalidades adicionales, la presente invención proporciona composiciones de lava platos que comprenden al menos una proteasa variante proporcionadas en la presente. En algunas modalidades adicionales, las composiciones que comprenden al menos una proteasa variante de la presente invención comprenden composiciones de cuidado oral tal como aquellas en las Pat . de E.U.A. No. 6,376,450, y 6,376,450. Las formulaciones y descripciones de los compuestos y materiales adjuntos de limpieza contenidos en las Pat. E.U.A. Nos. 6,376,450, 6,605,458, 6,605,458, y 6,610,642, antes mencionadas encuentran uso con las proteasas variantes proporcionadas en la presente. Las composiciones de limpieza de la presente invención se formulan en cualquier forma adecuada y preparadas por cualquier proceso elegido por el formulador, sin limitar ejemplos de los cuales se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,565,422, 5,516,448, 5,489,392, y 5,486,303, todos de los cuales se incorporan en la presente como referencia. Cuando se desea una composición de limpieza baja en pH, el pH de tal composición se ajusta por medio de adición de un material tal como monoetanolamina o un material ácido tal como HCl .

Aunque no es esencial para los propósitos de la presente invención, la lista no limitada de adjuntos ilustrados de aquí en adelante es adecuada para usar en las composiciones de limpieza instantáneas. En algunas modalidades, estos adjuntos se incorporan por ejemplo, para ayudar o aumentar al desempeño de limpieza, para tratamiento del substrato a limpiarse, o para modificar la estética de la composición de limpieza como es el caso con perfumes, colorantes, tintes o similares. Se entiende que tales adjuntos están en adición a las proteasas variantes de la presente invención. La naturaleza precisa de estos componentes adicionales, y niveles de incorporación del mismo, dependerá en la forma física de la composición y la naturaleza de la operación de limpieza para lo cual se usa. Materiales adjuntos adecuados incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos , mej oradores, agentes quelantes, agentes que inhiben la transferencia de tintes, ayudas de posición, dispersantes, enzimas adicionales, y estabilizadores de enzimas, materiales catalíticos, activadores del blanqueado, aumentadores de cloro, peróxido de hidrógeno, fuentes de peróxido de hidrógeno, perácidos preformados, agentes dispersantes poliméricos, agentes de eliminación de suelo de arcilla/anti-redeposición, abrillantadores, supresores de espuma, tintes, perfumes, agentes de estructura elástica, suavizantes de telas, portadores, hidrótropos, auxiliares de procesamiento y/o pigmentos. En adición a lo descrito a continuación, ejemplos adecuados de tales otros adjuntos y niveles de uso se encuentran en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,576,282, 6,306,812, y 6,326,348, incorporadas para referencia. Los ingredientes adjuntos antes mencionados pueden constituir el balance de las composiciones de limpieza de la presente invención .

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de acuerdo con la presente invención comprenden al menos un tensioactivo y/o un sistema tensioactivo en donde el tensioactivo se selecciona de tensioactivos no iónicos, tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos amfolíticos, tensioactivos zwitteriónicos , tensioactivos no iónicos semi-polares y mezclas de los mismos. En algunas modalidades de composición de limpieza baja en pH (por ejemplo, composiciones que tienen un pH limpio desde alrededor de 3 hasta alrededor de 5) , la composición típicamente no contiene sulfato de alquilo etoxilado, ya que se cree que tal tensioactivo se puede hidrolizar por tales composiciones de contenidos ácidos. En algunas modalidades, el tensioactivo se presenta en un nivel desde alrededor de 0.1% hasta alrededor de 60%, mientras en modalidades alternativas el nivel es desde alrededor de 1% hasta alrededor de 50%, mientras en todavía modalidades adicionales el nivel es desde alrededor de 5% hasta alrededor de 40%, en peso de la composición de limpieza.

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden uno o más mejoradores de detergente o sistemas mej oradores. En algunas modalidades que incorporan al menos un mej orador, las composiciones de limpieza comprenden al menos alrededor de 1%, desde alrededor de 3% hasta alrededor de 60% o incluso desde alrededor de 5% hasta alrededor de 40% de mej oradores en peso de la composición de limpieza. Los mej oradores incluyen, pero no se limitan a, al metal alcalino, amonio y sales alcanolamonio de polifosfatos , silicatos de metal alcalino, tierra alcalinotérreo y carbonatos de metal alcalino, aluminosilicatos , compuestos de policarboxilato, hidroxipolicarboxilatos de éter, copolímeros de anhídrido maléico con etileno o vinil metil éter, 1 , 3 , 5-trihidroxi benzeno-2, ácido 4 , 6-trisulfónico, y ácido carboximetiloxisuccinico, varios metales alcalinos, amonio y sales de amonio sustituidas de ácidos poliáceticos tal como ácido etilendiamina tetraacético y ácido nitrilotriacético, así como policarboxilatos tal como ácido melítico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido oxidisuccínico, ácido polimaleico, ácido benceno 1, 3 , 5-tricarboxílico, ácido carboximetiloxisuccínico, y sales solubles de los mismos. De hecho, se contempla que cualquier mej orador adecuado encontrará uso en varias modalidades de la presente invención.

En algunas modalidades, los mej oradores forman complejos de iones duros solubles en agua (por ejemplo, mejoradores de secuestro) , tal como citratos y polifosfatos (por ejemplo, tripolifosfato de sodio y hexahidrato tripolifosfato de sodio, tripolifosfato de potasio, y sodio mezclado y tripolifosfato de potasio, etc.). Se contempla que cualquier mejorador adecuado encontrará uso en la presente invención, que incluyen aquellos conocidos en la técnica (Ver por ejemplo, EP 2 100 949) .

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención contienen al menos un agente quelante. Los agentes quelantes adecuados incluyen, pero no se limitan a cobre, hierro y/o agentes quelantes de manganeso y mezclas de los mismos. En modalidades en las cuales al menos un agente quelante se usa, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden desde alrededor de 0.1% hasta alrededor de 15% o incluso desde alrededor de 3.0% hasta alrededor de 10% de agente quelante en peso de la composición de limpieza sometida.

En todavía algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpieza proporcionadas en la presente contienen al menos una ayuda de deposición. Los auxiliares de deposición incluyen, pero no se limitan a, polietilen glicol, polipropilen glicol, policarboxilato, polímeros de liberación del suelo tal como ácido politeleftálico, arcillas tal como caolinita, montmorillonita, atapulgita, illita, bentonita, halloysita, y mezclas de los mismos.

Como se indica en la presente, en algunas modalidades, agentes anti-redeposición encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, tensioactivos no iónicos encuentran uso. Por ejemplo, en modalidades de lava platos automático, tensioactivos no iónicos encuentran uso para propósitos de modificación de superficie, en particular para láminas, para evitar la filmación y manchado y para mejorar el brillo. Estos tensioactivos no iónicos también encuentran uso en prevenir la re-deposición del suelo. En algunas modalidades preferidas, el agente anti-redeposición es un tensioactivo no iónicos como se conoce en la técnica (Ver por ejemplo, EP 2 100 949) .

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención incluyen uno o más agentes que inhiben la transferencia de tintes. Los agentes poliméricos adecuados que inhiben la transferencia de tintes incluyen, pero no se limitan a, polímeros de polivinilpirrolidona , polímeros de poliamina N-oxido, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol , poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o mezclas de los mismos. En modalidades en las cuales al menos un agente que inhibe la transferencia del tinte se usa, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden desde alrededor de 0.0001% hasta alrededor de 10%, desde alrededor de 0.01% hasta alrededor de 5%, o incluso desde alrededor de 0.1% hasta alrededor de 3% en peso de la composición de limpieza.

En algunas modalidades, los silicatos se incluyen dentro de las composiciones de la presente invención. En algunas tales modalidades, los silicatos de sodio (por ejemplo, disilicatos de sodio, metasilicato de sodio, y filosilicatos cristalinos) encuentran uso. En algunas modalidades, los silicatos se presentan en un nivel desde alrededor de 1 % hasta alrededor de 20%. En algunas modalidades preferidas, los silicatos se presentan en un nivel desde alrededor de 5% hasta alrededor de 15% en peso de la composición.

En todavía algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpieza de la presente invención también contienen dispersantes. Los materiales orgánicos solubles en agua adecuados incluyen, pero no se limitan a los ácidos homo- o co-polimérico o sus sales, en el cual el ácido policarboxílico comprende al menos dos radicales de carboxilo separados uno del otro por no más de dos átomos de carbono.

En algunas modalidades adicionales, las enzimas usadas en las composiciones de limpieza estabilizan cualquier técnica adecuada. En algunas modalidades, las enzimas empleadas en la presente se estabilizan por la presencia de fuentes de calcio solubles en agua y/o iones de magnesio en las composiciones finales que proporcionan tales iones a las enzimas. En algunas modalidades, los estabilizadores de enzimas incluyen oligosacáridos , polisacáridos , y sales de metal divalente inorgánicas, que incluyen metales alcalinotérreos , tal como sales de calcio. Se contempla que varias técnicas para estabilización de enzimas encontrarán uso en la presente invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, la enzimas empleadas en la presente se estabilizan por la presencia de iones de fuentes de zinc (II) , calcio (II) y/o magnesio (II) solubles en agua en las composiciones finales que proporcionan tales iones a las enzimas, así como otros iones de metal (por ejemplo, bario (II) , escandio (II), hierro (II), manganeso (II), aluminio (III) , Estaño (II) , cobalto (II) , cobre (II) , níquel (II) , y vanadio oxo (IV) . Los cloruros y sulfates también encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención. Los Ejemplos de oligosacáridos y polisacáridos adecuados (por ejemplo, dextriñas) se conocen en la técnica (Ver por ejemplo, WO 07/145964). En algunas modalidades, inhibidores de proteasa reversibles también encuentran uso, tal como compuestos que contienen boro (por ejemplo, borato, ácido borónico fenil 4-formilo) y/o un aldehido tripéptido encuentra uso para estabilidad mejorada adicional, como se desea.

En algunas modalidades, blanqueadores, activadores del blanqueado y/o catalizadores de blanqueo se presentan en las composiciones de la presente invención. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden compuestos blanqueadores inorgánicos y/u orgánicos. Los blanqueadores inorgánicos incluyen, pero no se limitan a sales de perhidrato (por ejemplo, perborato, percarbonato, perfosfato, persulfato, y sales de persilicato) . En algunas modalidades, las sales de perhidrato inorgánicas son sales de metal alcalino. En algunas modalidades, las sales de perhidrato inorgánicas se incluyen como el sólido cristalino, sin protección adicional, aunque en algunas otras modalidades, la sal se recubre. Cualquier sal adecuada conocida en la técnica encuentra uso en la presente invención (Ver por ejemplo, EP 2 100 949) .

En algunas modalidades, los activadores del blanqueado se usan en las composiciones de la presente invención. Los activadores del blanqueado son típicamente precursores de perácido orgánicos que aumentan la acción blanqueadora en el curso de limpieza a temperatura de 60°C y por debajo. Los activadores del blanqueado adecuados para uso en la presente incluyen compuestos los cuales, bajo condiciones de perhidrólisis , dan ácidos de peroxicarboxílico alifático que tienen preferiblemente desde alrededor de 1 hasta alrededor de 10 átomos de carbono, en particular desde alrededor de 2 hasta alrededor de 4 átomos de carbono, y/o ácido perbenzoico opcionalmente sustituido. Los activadores del blanqueado adicionales se conocen en la técnica y encuentran uso en la presente invención (Ver por ejemplo, EP 2 100 949) .

Además, en algunas modalidades y como descritos adicionales en la presente, las composiciones de limpieza de la presente invención además comprenden al menos un catalizador de cloro. En algunas modalidades, el triazaciclononano de manganeso y complejos relacionados encuentran uso, así como complejo de cobalto, cobre, manganeso, y hierro. Los catalizadores de blanqueo adicionales encuentran uso en la presente invención (Ver por ejemplo, US 4,246,612, 5,227,084, 4,810410, WO 99/06521, y EP 2 100 949).

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención contienen uno o más complejos de metal catalítico. En algunas modalidades, un catalizador de cloro que contiene metal encuentra uso. En algunas modalidades preferidas, el catalizador de cloro de comprenden un sistema catalizador que comprende un catión de metal de transición de actividad catalítica de blanqueador definida, (por ejemplo, cationes de cobre, hierro, titanio, rutenio, tungsteno, molibdeno, o manganeso) , un catión de metal auxiliar que tiene poca o no tiene actividad catalítica de blanqueamiento (por ejemplo, cationes de zinc o aluminio) , y un embargador que tiene estabilidad definida constante para los cationes de metal catalíticos y auxiliares, particularmente ácido etilendiamintetraacético, etilendiaminetetra (ácido metilenfosfónico) y sales solubles en agua de los mismos se usan (Ver por ejemplo, Patente E.U.A. No. 4,430,243). En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención son catalizadas por medio de un compuesto de manganeso. Tales compuestos y niveles de uso son bien conocidos en la técnica (Ver por ejemplo, Patente E.U.A. No. 5,576,282). En modalidades adicionales, los catalizadores de blanqueo de cobalto encuentran uso en las composiciones de limpieza de la presente invención. Varios catalizadores de blanqueo de cobalto se conocen en la técnica (Ver por ejemplo, Patentes E.U.A. Nos. 5,597,936 y 5,595,967) y se preparan fácilmente por los procedimientos conocidos .

En algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpieza de la presente invención incluyen un complejo de metal de transición de un ligando rígido macropoliciclíco (MRL) . Como una materia practica, y no por la limitación, en algunas modalidades, las composiciones y procesamientos de limpieza proporcionado por la presente invención se ajustan para proporcionar con objeto de al menos una parte por cien millones de las especies activas MRL en el medio de lavado acuoso, y en algunas modalidades preferidas, proporcionando desde alrededor de 0.005 ppm hasta alrededor de 25 ppm, más preferiblemente desde alrededor de 0.05 ppm hasta alrededor de 10 ppm, y más preferiblemente desde alrededor de 0.1 ppm hasta alrededor de 5 ppm, del MRL en el licor de lavado.

En algunas modalidades, los metales de transición preferidos en el catalizador de blanqueamiento de metal de transición incluyen, pero no se limitan a manganeso, hierro y cromo. Los MRL preferidos también incluyen, pero no se limitan a ligandos ultra-rígidos especiales que se cruzan en un puente (por ejemplo, 5,12-dietil-1, 5, 8, 12-tetraazabiciclo [6.6.2] hexadécano) . Los MRL de metal de transición adecuados son fácilmente preparados por procedimientos conocidos (Ver por ejemplo, WO 2000/32601, y Patente E.U.A. No. 6,225,464).

En algunas modalidades, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden agentes de cuidado de metal . Los agentes de cuidado de metal encuentran uso en prevención y/o reducción de empañamiento, corrosión, y/o oxidación de metales, que incluyen aluminio, acero inoxidable, y metales no ferrosos (por ejemplo, plata y cobre) . Los agentes de cuidado de metal adecuados incluyen aquellos descritos en EP 2 100 949, WO 9426860 y WO 94/26859) . En algunas modalidades, el agente de cuidado de metal es una sal de zinc. En algunas modalidades adicionales, las composiciones de limpieza de la presente invención comprenden desde alrededor de 0.1% hasta alrededor de 5% en peso de uno o más agentes de cuidado de metal .

Como se indica anteriormente, las composiciones de limpieza de la presente invención se formulan en cualquier forma adecuada y preparado por cualquier proceso elegido por el formulador, ejemplos no limitados los cuales se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,879,584, 5,691,297, 5,574,005, 5,569,645, 5,516,448, 5,489,392, y 5,486,303, todos de los cuales se incorporan en la presente como referencia. En algunas modalidades en los cuales se desea una composición de limpieza baja en pH, el pH de tal composición se ajusta por medio de la adición de un material ácido tal como HCl .

Las composiciones de limpieza descritas en la presente encuentran uso en sitio de limpieza (por ejemplo, una superficie, vajilla, o tela). Típicamente, al menos una porción del sitio se contacta con una modalidad de la presente composición de limpieza, en forma ordenada o diluida en un baño de lavado, y luego el sitio se lava y/o enjuaga opcionalmente . Para propósitos de la presente invención, "lavar" incluye pero no se limita a, fregado, y agitación mecánica. En algunas modalidades, las composiciones de limpieza son típicamente empleadas en concentraciones desde alrededor de 500 ppm hasta alrededor de 15,000 ppm en solución. Cuando el solvente de lavado es agua, la temperatura del agua típicamente va desde alrededor de 5°C hasta alrededor de 90°C y, cuando el sitio comprende una tela, el agua para la relación de masa de la tela es típicamente desde alrededor de 1:1 hasta alrededor de 30:1.

EXPERIMENTOS La presente invención se describe en detalle adicional en los siguientes ejemplos que no son de ninguna manera pretendida para limitar el alcance de la invención como se reivindica.

En la descripción experimental que sigue, las siguientes abreviaturas aplican: PI (inhibidor de proteinasa) , ppm (partes por millón) ; M (molar) ; mM (milimolar) ; µ? (micromolar) ; nM (nanomolar) ; mol (moles) mmol (milimoles) ; µp??? (micromoles) ; nmol (nanomoles) ; gm (gramos) ; mg (miligramos) ; µg (microgramos) ; pg (picogramos) ; L (litros) ; mi y mL (mililitros) ; µ? y iL (microlitros) ; cm (centímetros) ; mm (milímetros) ; µt? (micrómetros) ; nm (nanómetros) ; U (unidades) ; V (volts) ; PM (peso molecular) ; seg (segundos) ; min(s) (minuto/minutos); h(s) y hr(s) (hora/horas) ; °C (grados Centígrados) ; CS (cantidad suficientes) ; ND (no hecho) ; rpm (revoluciones por minuto) ; H20 (agua) ; dH20 (agua desionizada) ; (HCl (ácido clorhídrico) ; aa (aminoácido) ; pb (pares base) ; kb (pares kilobase) ; kD (kilodaltons) ; cADN (ADN de copia o complementario) ; ADN (ácido desoxiribonucleico) ; ssADN (ADN de hebra sencilla) ; dsADN (ADN de hebra doble) ; dNTP (trifosfato desoxiribonucleótido) ; ARN (ácido ribonucleico) ; MgCl2 (cloruro de magnesio) ; NaCl (cloruro de sodio) ; p/v (peso hasta volumen) ; v/v (volumen hasta volumen) ; g (gravedad) ; OD (densidad óptica) ; ppm (partes por millón) ; solución amortiguadora de fosfato de Dulbecco (DPBS) ; SOC (Bacto-Triptona al 2%, Extracto de Bacto Levadura al 0.5%, NaCl 10 mM, KC1 2.5 mM) ; Caldo Terrific (TB; 12 g/1 Bacto-Triptona, 24 g/1 glicerol, 2.31 g/1 KH2P04/ y 12.54 g/1 K2HP04) ; OD28o (densidad óptica a 280 nm) ; OD600 (densidad óptica a 600 nm) ; A40s (absorbancia a 405 nm) ; Vmax (la velocidad inicial máxima de una reacción catalizada por enzima) ; PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) ; PBS (solución amortiguadora salina de fosfato [NaCl 150 mM, solución amortiguadora de fosfato de sodio 10 mM, pH 7.2]); PBST (PBS+T EEN®-20 al 0.25%); PEG (polietilen glicol) ; PCR (reacción de cadena de polimerasa) ; RT-PCR (PCR de transcripción inversa) ; SDS (sulfato dodecil de sodio) ; Tris (tris (hidroximetil) aminometano) ; HEPES (N- [2- Hidroxietil] piperazin-N- [ácido 2 -etansulfónico] ) ; HBS (solución amortiguadora salina HEPES) ; Tris-HCl (tris [Hidroximetil] aminometan-clorohidrato) ; Tricina (N- [tris- (hidroximetil) -metil] -glicina) ; CHES (ácido 2- (N-ciclo-hexilamino) etan-sulfónico) ; TAPS (ácido 3-{[tris- (hidroximetil) -metil] -amino} -propansulfónico) ; CAPS (ácido 3- (ciclo-hexilamino) -propan-sulfónico; DMSO (sulfóxido de dimetilo); DTT (1, 4-ditio-DL-treitol) ; SA (ácido sinapínico (ácido s, 5-dimetoxi-4-hidroxi cinámico); TCA (ácido tricloroacético) ; Glut y GSH (glutationa reducida) ; GSSG (glutationa oxidada); TCEP (Tris [2 -carboxietil] fosfina) ; Ci (Curies) ; mCi (miliCuries) ; yCi (microCuries) ; HPLC (cromatografía líquida de presión alta) ; RP-HPLC (cromatografía líquida de presión alta de fase inversa) ; CCD (cromatografía de capa delgada) ; ALDI-TOF (tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz); Ts (tosil) ; Bn (bencilo) ; Ph (fenilo) ; Ms (mesilo) ; Et (etilo) , Me (metilo) ; Taq (polimerasa de ADN Thermus aquaticus) ; Klenow (fragmento grande de polimerasa I de ADN (Klenow) ) ; EGTA (ácido etilen glicol-bis (éter ß-aminoetilo) ?,?,?',?'-tetraacético) ; EDTA (ácido etilendiaminatetracético) ; bla (gen de resistencia a la ampicilina o ß-lactamasa) ; HDL (líquido de alta densidad) ; MJ Research (MJ Research, Reno, NV) ; Baseclear (Baseclear BV, Inc., Leiden, Países Bajos); PerSeptive (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) ; ThermoFinnigan (ThermoFinnigan, San José, CA) ; Argo (Argo BioAnalytica, Morris Plains, NJ) ; Seitz EKS (SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemania); Pall (Pall Corp., East Hills, NY and Bad Kreuznach, Alemania) ; Spectrum (Spectrum Laboratories, Domínguez Rancho, CA) ; Molecular Structure (Molecular Structure Corp., oodlands, TX) ; Accelrys (Accelrys, Inc., San Diego, CA) ; Chemical Computing (Chemical Computing Corp., Montreal, Canadá); New Brunswick (New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ) ; CFT (Center for Test Materials, Vlaardingen, Países Bajos); Procter & Gamble (Procter & Gamble, Inc., Cincinnati, OH); GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido); ADN2.0 (ADN2.0, Menlo Park, CA) ; 0X0ID (Oxoid, Basingstoke, , Hampshire, RU) ; Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd., Bray Business Park, Bray, Co., Wicklow, Irlanda) ; Finnzymes (Finnzymes Oy, Espoo, Finlandia) ; Kelco (CP Kelco, ilmington, DE) Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY) ; (NEN (NEN Life Science Products, Boston, MA) ; Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Noruega) ; Dynal (Dynal, Oslo, Noruega) ; Bio-Synthesis (Bio-Synthesis , Lewisville, TX) ; ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) ; Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island, NY) ; Sigma (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) ; Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ; NCBI (National Center for Biotechnology Information) ; Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA) ; BD Biosciences y/o Clontech (BD Biosciences CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA) ; Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA) ; MWG Biotech (MWG Biotech, High Point, NC) ; Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OR) ; Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA) ; Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI); Mediatech (Mediatech, Herndon, VA; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) ; Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY) ; Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) ; GIBCO BRL o Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) ; Millipore (Millipore, Billerica, MA) ; Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA) ; Invitrogen (Invitrogen Corp. , San Diego, CA) ,· NEB (New England Biolabs, Beverly, MA) ; Sigma (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) ; Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ; Takara (Takara Bio Inc . Otsu, Japón) ; Roche (Hoffmann-La Roche, Basel, Suiza) ; EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ) ; Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA) ; Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine) ; Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA) ; Sorvall (Sorvall brand, from Kendro Laboratory Products, Asheville, NC) ; Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA) ; R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN) ; Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) ; Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, NY) ; Geneart (Geneart GmbH, Regensburg, Alemania) ; Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) ; (Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) ; PeproTech (PeproTech, Rocky Hill, NJ) ; SynPep (SynPep, Dublin, CA) ; New Objective (New Objective brand; Scientific Instrument Services, Inc., Ringoes, NJ) ; Waters (Waters, Inc., Milford, MA) ,· Matrix Science (Matrix Science, Boston, MA) ; Dionex (Dionex, Corp., Sunnyvale, CA) ; Monsanto (Monsanto Co., St. Louis, MO) ; intershall (Wintershall AG, Kassel, Alemania); BASF (BASF Co . , Florham Park, NJ) ,- Huntsman (Huntsman Petrochemical Corp., Salt Lake City, UT) ; Enichem (Enichem Ibérica, Barcelona, Spain) ; Fluka Chemie AG (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza); Gist-Brocades (Gist-Brocades, NV, Delft, Países Bajos); Dow Corning (Dow Corning Corp., Midland, MI); y Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, WA) .

Como se usa en la presente, en algunas listas, un "0" principal se indica, con objeto de proporcionar una designación de tres números para cada sitio (por ejemplo, "001" es el mismo como "1," así "A001C" es el mismo como "A1C" ) . En algunas listas, el "0" principal no se incluye. Además, como se usa en la presente, "X" se refiere a cualquier aminoácido.

En las composiciones de detergente ejemplificadas proporcionadas en la presente, los niveles de enzimas se expresan por la enzima pura en peso de la composición total y a menos que se especifique de otra manera, los ingredientes de detergente se expresan en peso de las composiciones totales. Las identificaciones de componente abreviadas ahí tienen los siguientes significados: Abreviatura Ingrediente LAS : Sulfonato bencen alquilo Cn-i3 lineal de sodio NaC16-17HSAS: Sulfato alquilo altamente soluble Ci6-i7 de sodio TAS : Sulfato alquilo de cebo de sodio CxyAS : Sulfato alquilo Clx-Cly de sodio CxyEz : Alcohol primario predominantemente lineal Cix-Ciy condensado con un promedio de z moles de óxido de etileno CxyAEzS : Sulfato de alquil sodio Cix-Cly condensado con un promedio de z moles de óxido de etileno. Agregar nombre de la molécula en los ejemplos.

No iónico Alcohol graso de etoxilado/propoxilado mezclado por ejemplo Plurafac LF404 siendo un alcohol con un grado promedio de etoxilación de 3.8 y un grado promedio de propoxilación de 4.5.

QAS : R2.N+ (CH3) 2 (C2H4OH) con R2 = Ci2-Ci4 Silicato : Silicato de sodio amorfo (relación Si02:Na20 = 1.6-3.2:1) .

Metasilicato : Metasilicato de sodio (relación Si02:Na20 = 1.0) Zeolito A: Aluminosilicato hidratado de fórmula Na12(Al02Si02) 12.27H20 SKS-6 : Silicato de capa cristalina de fórmula d- Na2Si205.

Sulfato : Sulfato de sodio anhidro.

STPP: Tripolifosfato de sodio.

MA/AA: Copolímero aleatorio de 4:1 acrilato/maleato, peso molécula promedio alrededor de 70,000-80,000.

AA: Polímero de poliacrilato de sodio de peso molecular promedio 4,500.

Policarboxilat Copolímero que comprende mezcla de o : monómeros carboxilados tales como acrilato, maleato y metacrilato con un intervalo de PM entre 2,000-80,000 tal como Sokolan comercialmente disponible de BASF, siendo un copolímero de ácido acrílico, PM 4,550.

BB1 : Sulfonato de 3- (3,4- dihidroisoquinolinio) propano BB2 : 1- (3 , 4-dihidroisoquinolinio) -decan-2-sulfato PB1 : Monohidrato de perborato de sodio.

PB4 : Tetrahidrato de perborato de sodio de fórmula nominal NaB03.4H20.

Percarbonato : Percarbonato de sodio de fórmula nominal 2Na2C03.3H202.

TAED: Tetraacetil etilen diamina.

NOBS: Sulfonato de nonanoiloxibenceno en la forma de la sal de sodio.

DTPA: Ácido dietilen triamina pentaacético.

HEDP: Ácido 1 , 1-hidroxietan difosfónico.

DETPMP : Dietiltriamina penta (metilen) fosfonato, comercializado por Monsanto bajo el nombre comercial Dequest 2060.

EDDS : Ácido etilendiamina-N, ' -disuccínico, isómero (S,S) en la forma de su sal de sodio Diamina : Dimetil aminopropil amina; 1,6-hezan diamina; 1,3-propan diamina; 2-metil-l,5- pentan diamina; 1 , 3 -pentandiamina ; 1-metil- diaminopropano .

DETBCHD : 5, 12-dietil-l, 5,8, 12-tetraazabiciclo [6 , 6 , 2] hexadecano, dicloruro, SAL de Mn(II) PAAC: Sal de cobalto (III) de acetato de pentaamina .

Parafina : Aceite de parafina vendido bajo el nombre comercial Winog 70 por Wintershall.

Sulfonato de Una cera o aceite de parafina en el cual parafina : algunos de los átomos de hidrógeno se han reemplazado por grupos de sulfonato.

Aldosa Enzima de oxidasa vendida bajo el nombre oxidasa: comercial Aldosa Oxidasa por Novozymes A/S Galactosa Galactosa oxidasa de Sigma oxidasa : nprE : La forma recombinante de metaloproteasa neutra expresada en Bacillus subtilis (Ver, por ejemplo, WO 07/044993) .

PMN: Metaloproteasa neutra purificada de Bacillus amyloliquefacients.

Amilasa: Una enzima amilolítica adecuada, tal como aquella vendida bajo los nombres comerciales PURAFECT ® Ox descrita en WO 94/18314, WO 96/05295 vendida por Genencor; NATALASE®, TERMAMYL®, FUNGAMY1® y DURAMYL™, todos disponibles de Novozymes A/S.

Lipasa : Una enzima lipolítica adecuada tal como aquella vendida bajo los nombres comerciales LIPOLASE®, LIPOLASE® Ultra por Novozymes A/S y Lipomax™ por Gist- Brocades .

Celulosa : Una enzima celulítica adecuada tal como aquella vendida bajo los nombres comerciales CARE YME® , CELLUZYME® y/o ENDOLASE® por Novozymes A/S.

Pectin Lyasa: Una pectina liasa adecuada, tal como aquella vendida bajo los nombres comerciales PECTAWAY® y PECTAWASH® disponible de Novozymes A/S.

PVP: Polivinilpirrolidona con un peso molecular promedio de 60,000 PV O: Polivinilpiridina-N-óxido, con un peso molecular promedio de 50,000.

PVPVI : Copolímero de vinilimidazol y vinilpirrolidona, con un peso molecular promedio de 20,000.

Abrillantador 4,4' -bis (2-sulfoestiril) biefnilo de 1 : disodio .

Antiespuma de Controlador de espuma de silicón : polidimetilsiloxano con copolímero de siloxano-oxialquileno como agente de dispersión con una relación del controlador de espuma al agente de dispersión de 10:1 hasta 100:1.

Supresor de Silicón/sílice al 12%, alcohol de estearilo espuma de al 18%, almidón al 70% en forma granular. j abón : SRP 1: Poli ésteres aniónicamente tapados finales.

PEG X: Polietilen glicol, de un peso molecular de .

PVP K60®: Homopolímero de vinilpirrolidona (PM promedio 160,000) Jeffamine ® Polietilen glicol tapado de Huntsman ED-2001 : Isachem® AS: Sulfato alquilo de alcohol ramificado de Enichem MME PEG Monometil éter polietilen glicol (PM 2000) (2000) : de Fluka Chemie AG.

DC3225C: Supresor de espuma de jabón de silicón, mezcla de aceite de silicón y sílice de Dow Corning .

TEPAE : Tetraetilenpentaamina etoxilato BTA: Benzotriazol .

Betaína : (CH3) 3N+CH2COO~ Azúcar : D-glucosa de grado industrial o azúcar de grado alimenticio CFAA: Alquil C12-C14 N-metil glucamida TPKFA : Ácidos grados de corte completo en la parte superior Ci2-Ci4 Arcillar Un silicato de aluminio hidratado en una fórmula general Al203Si02 · xH20. Tipos: caolinito, montmorilonito, atapulgita, ilito, bentonita, haloisito. pH: Medido como una solución al 1% en agua destilada a 20°C.

EJEMPLO 1 Ensayos En el siguiente ejemplo, varios ensayos se usaron como se establece a continuación para facilidad de lectura. Se indican cualquiera de las desviaciones de los protocolos proporcionados a continuación.

A. Ensayo TCA para Determinación de Contenido de Proteína en Placas de Microtitulación de 96 pozos ("Ensayo TCA") Para BPN' (por ejemplo, una proteasa de referencia) y variantes del mismo, se inició este ensayo usando sobrenadante de cultivo filtrado de placas de microtitulación crecidas 3-4 días a 33 °C con agitación a 230 rpm y aeración humidificada . Se usó una placa de microtitulación (MTP) de fondo plano de 96 pozos reciente para el ensayo. Primero, se colocó 100 yL/pozo de HC1 0.25 N en cada pozo. Luego, se agregó 50 yL de caldo de cultivo filtrado. Luego se determinó la absorbancia/dispersión de luz en 405 nm (usar modo de mezclado de 5 seg en el lector de placa), con objeto de proporcionar la lectura "en blanco". Para la prueba, se colocó 100 yL/pozo de ácido tricloroacético (TCA) al 15% (p/v) en las placas e incubó entre 5 y 30 min a temperatura ambiente . Luego se determinó la absorbancia/dispersión de luz a 405 nm (usar modo de mezclado de 5 seg en el lector de placa) .

Se realizó el ensayo TCA para determinación de contenido de proteína de GCI-P036 y variantes del mismo usando sobrenadante de cultivo filtrado de placas de microtitulación crecidas aproximadamente 3 días a 37°C con agitación a 300 rpm y aeración humidificada . En este ensayo, se agregó 100 yL de una solución HCl 0.25 M a cada pozo de una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pozos. Posteriormente, se agregaron a los pozos 25 yL alícuotas de los sobrenadantes de cultivo filtradas (que contienen las proteasas) . Luego se determinó la absorbancia/dispersión de luz a 405 nm (usando el modo de mezclado de 5 seg en el lector de placa) , con objeto de proporcionar la lectura "en blanco". Después de esta medición, se agregó 100 yL de una solución de TCA al 30% (p/v) a cada pozo y las placas de microtitulación se incubaron entre 5 y 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se determinó la absorbancia/dispersión de luz resultante a 405 nm (usando el modo de mezclado de 5 seg en el lector de placa) . El equipo usado fue un Biomek FX Robot (Beckman Coulter) y un SpectraMAX (tipo 340; Molecular Devices) Lector MTP ; los MTP fueron de Costar (tipo9017) .

Se realizaron los cálculos al sustraer el blanco (sin TCA) de la lectura de prueba con TCA para proporcionar una medición relativa del contenido de proteína en las muestras. Si se desea, una curva estándar puede crearse al calibrar las lecturas TCA con ensayos AAPF de clones con factores de conversión conocidos. Sin embargo, los resultados TCA son lineales con respecto a la concentración de proteína desde 50 hasta 500 microgramos de proteína por mi (ppm) y de esta manera pueden graficarse directamente contra el desempeño de enzima para el propósitos de elegir variantes de buen desempeño. La turbiedad/dispersión de luz incrementa en las muestras correlacionadas con la cantidad total de proteína precipitable en el sobrenadante de cultivo.

B. Ensayo de Proteasa AAPF en Placas de Microtitulación de 96 pozos ("Ensayo AAPF") Con objeto de determinar la actividad de proteasa de las proteasas y variantes de la misma de la presente invención, Se midió la hidrólisis de N-succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenil-p-nitroanilida (suc-AAPF-pNA) . Las soluciones del reactivo usadas fueron: Tris/HCl 100 mM, pH 8.6, que contiene T EEN®-80 al 0.005% (solución amortiguadora de dilución Tris); solución amortiguadora Tris 100 mM, pH 8.6, que contiene CaCl2 10 mM y T EEN®-80 al 0.005% (solución amortiguadora Tris/Ca) ; y suc-AAPF-pNA 160 mM en DMSO (solución madre suc-AAPF-pNA) (Sigma: S-7388) . Para preparar una solución de trabajo suc-AAPF-pNA, se agregó 1 mi de solución madre suc-AAPF-pNA a 100 mi de solución amortiguadora Tris/Ca y mezcló bien durante al menos 10 segundos. Se realizó el ensayo al agregar 10 µ? de solución de proteasa diluida a cada pozo, inmediatamente seguido por la adición de 190 µ? 1 mg/ml de solución de trabajo suc-AAPF-pNA. Las soluciones se mezclaron durante 5 seg, y el cambio de absorbancia en modo cinético (20 lecturas en 5 minutos) se leyó a 410 nm en un lector MTP, a 25°C. La actividad de proteasa se expresó como AU (actividad = ??? min"1 mi"1) .

Método de Hidrólisis AAPF La termoestabilidad de serina proteasas se determinó al procesar por ensayo la actividad de proteasa usando el ensayo AAPF después de la incubación de variantes de proteasa a 68°C durante 1 hora. Bajo las condiciones del ensayo, la actividad residual de la proteasa de referencia (por ejemplo, GG36 de tipo natural = GCI-P036) fue alrededor de 50%. El equipo usado fue: MTP de fondo F (Costar No. 9017), Biomek FX y/o Biomek FXp Robot (Beckman Coulter) , Lector Spectramax Plus 384 MTP (Molecular Devices) , Incubador/Agitador iEMS (1 mm de amplitud) (Thermo/Labsystems) , cinta de Sellado (Nunc No. 236366), y baño de hielo. Se preparó solución amortiguadora de glicina al disolver 3.75g de glicina (Merck No. 1.04201.1000) en 960 mL de agua. Se agregó 1 mi de Tween 80 al 5% (Sigma No. P-8074) y 10 mi de una solución madre de 1000 mM CaCl2 (Merck No. 1.02382.1000) (29.4 g disuelto a 200 mi) a esta solución. El pH se ajustó hasta 10.5 con NaOH 4N y el volumen se llevó hasta 1000 mi. Las concentraciones finales de glicina, CaCl2 y TWEEN®-80 fueron: 50 mM, 10 mM y 0.005% respectivamente. Los incubadores se ajustaron a 68 °C (para incubación) y a 25°C (para el ensayo AAPF) . Se agregó 90 µ? y 190 µ? de solución amortiguadora de glicina a la dilución vacía y placas de incubación respectivamente. Luego se agregó 10 µ? de sobrenadante a la placa de dilución, seguido por adición de 10 µ? de la placa de dilución a la placa de incubación. Luego se agregó 10 µ? de mezcla de la placa de incubación a una placa pre-entibiada que contiene sustrato de suc-AAPF-pNA. La placa suc-AAPF-pNA se leyó en Lector MTP a 410 nm (t = 0 medición) . La placa de incubación se cubrió con cinta e incuba durante 1 hora a 68°C y 400 rpm. Al final de la incubación, la placa se removió del incubador y enfrió completamente en hielo durante al menos 5 minutos.

Se transfirió 10 µ? de mezcla de la placa de incubación a la placa que contiene sustrato suc-AAPF-pNA y la placa se leyó a 410 nm (t=60 medición) . Se calculó el porcentaje de la actividad residual como: % de actividad residual: (mOD.min-1 a t=60) / (mOD.min-1 a t=0) x 100 C. Ensayo de Estabilidad LAS/EDTA ("Ensayo LAS/EDTA" o "Ensayo LAS-EDTA" o "Ensayo LAS" Se midió la estabilidad LAS/EDTA después de la incubación de la proteasa de prueba en la presencia de LAS/EDTA respectivamente, como una función de actividad residual determinada usando el ensayo AAPF.

Se midió la estabilidad de variantes de proteasa en la presencia de un tensioactivo aniónico representativos (LAS=sulfonato alquilbeno lineal, dodecilbencensulfonato de sodio-DOBS) y EDTA de di-sodio después de la incubación bajo condiciones definidas y la actividad residual se determinó usando el ensayo AAPF. Los reactivos usados fueron dodecilbencen sulfonato, sal de sodio (DOBS, Sigma No. D-2525), T EEN®-80 (Sigma No. P-8074), EDTA de di-sodio (Siegfried Handel No. 164599-02), HEPES (Sigma No. H-7523), solución amortiguadora sin tensión: HEPES 50 mM (11.9 g/l) + TWEEN®-80 al 0.005%, pH 8.0, solución amortiguadora de tensión: HEPES 50 mM (11.9 g/l), DOBS al 0.1% (p/v) (1 g/l), EDTA 10 mM (3.36.g/l), pH 8.0, proteasa de referencia y sobrenadantes de cultivo de variante de proteasa, que contiene 200 - 400 yg/ml de proteína. El equipo usado fue MTP de fondo V o U como placas de dilución (Greiner 651101 y 650161 respectivamente) , MTP de fondo F (Corning 9017) para solución amortiguadora sin tensión y LAS/EDTA así como para placas suc-AAPF-pNA, Biomek FX (Beckman Coulter) , Lector Spectramax Plus 384 MTP (Molecular Devices) , incubador/agitador iEMS (1 mm de amplitud) de Thermo Electron Corporation, cinta de sellado: Nunc (236366) .

El incubador/agitador iEMS (Thermo/Labsystems) se ajustó a 29°C. Se diluyeron sobrenadantes de cultivo en placas que contienen solución amortiguadora sin tensión a una concentración de ~ 25 ppm (placa de dilución principal) . Se agregó 20 µ? de muestra de la placa de dilución principal a placas que contienen 180 µ? de solución amortiguadora sin tensión para dar una concentración de incubación final de 2.5 ppm. Los contenidos se mezclaron y mantuvieron a temperatura ambiente y se realizó un ensayo AAPF en esta placa. También se agregó 20 µ? de muestra de la placa de dilución principal a placas que contienen 180 µ? de solución de tensión (HEPES 50 mM (11.9 g/l), DOBS al 0.1% (p/v) (1 g/l) , EDTA 10 mM (3.36 g/l), pH 8.0). Se mezclaron las soluciones y colocaron inmediatamente en agitador iEMS a 29°C durante 30 min a 400 rpm. Después de 30 minutos de incubación, se realizó un ensayo AAPF en la placa de tensión. La estabilidad de las muestra se determinó al calcular la ración de la actividad residual y AAPF inicial como sigue: Actividad Residual (%) = [mOD.min-1 tensionada] *100 / [mOD. min-1 no tensionada] .

D. Ensayos de Desempeño de Limpieza Se determinó el desempeño de remoción de mancha de las variantes de proteasa en detergentes comercialmente disponibles. La inactivación de calor de fórmulas de detergente comerciales sirve para destruir la actividad enzimática de cualquiera de los componentes de proteína mientras que mantiene las propiedades de los componentes no enzimáticos. De esta manera, este método fue adecuado para preparar detergentes adquiridos comercialmente para uso al probar las variantes de enzima de la presente invención. icromuestras : Se ordenaron y suministraron micromuestras de diámetro circular de 0.6 cms (¾ de pulgada) por CFT (Vlaardingen, Países Bajos) . Las micromuestras sencillas o dos micromuestras se colocaron verticalmente en cada pozo de un MTP de 96 pozos para exponer el área de superficie completa (esto es, no plana en el fondo del pozo) .

Ensayo de Micromuestra BMI Las micromuestras que contienen sangre, leche y tinta (BMI) de diámetro circular de 0.635 cm ,(0.25 pulgadas) se obtuvieron de CFT Vlaardingen. Antes del corte de las muestras, la tela (EMPA 116) se lavó con agua. Una micromuestra se colocó verticalmente en cada pozo de una placa de microtitulación de 96 pozos con objeto de exponer el área de superficie completa (esto es, no plana en el fondo del pozo) . Se preparó la solución de detergente deseada como se describe en la presente. Después de equilibrar el Termomezdador a 25°C, 190 µ? de solución de detergente se agregó a cada pozo del MTP, que contiene micromuestras . A esta mezcla, se agregó 10 µ? de la solución de enzima diluida de manera que la concentración de enzima final fue 1 yg/ml (determinado del ensayo BCA) . El MTP se selló con cinta y colocó en el incubador durante 30 minutos, con agitación a 1400 rpm. Después de la incubación bajo las condiciones apropiadas, 100 µ? de la solución de cada pozo se transfierion en un MTP fresco. El MTP nuevo que contiene 100 µ? de solución/pozo se leyó a 405 nm usando un lector MTP SpectraMax. Los controles en blanco, así como un control que contiene dos micromuestras y detergente pero no enzima también se incluyeron.

Ensayo de Microtitulación de Huevo Cocido Para este ensayo, se prepararon placas de sustrato de yema de huevo cocido de 96 pozos de yemas de huevo de gallina. Se separaron las yemas de huevo de gallina de las claras, liberaron de la membrana sac, y diluyeron 20% (vol/peso) con agua Milli-Q. La yema diluida se agitó durante 15 min a temperatura ambiente usando un agitador magnético. Cinco µL se pipeteó cuidadosamente en el centro de cada pozo de una placa de fondo V de 96 pozos (Costar #3894) usando una pipeta de 8 canales. Las placas se cocinaron a 90°C durante 1 hora y enfriaron a temperatura ambiente. Las placas de sustrato de yema de huevo cocido se almacenaron a temperatura ambiente y usaron dentro de una semana de preparación. Se prepararon detergentes automáticos para platos como se describe en la presente y pre-calentaron hasta 50°C. Se agregó una alícuota 190 pL de detergente a cada pozo de la placa de 96 pozos usando una pipeta de 8 canales. Se agregó diez L de enzima diluida a cada pozo usando un dispositivo pipeteado de 96 canales. La placa se selló cuidadosamente con un sellador de papel adhesivo e incubó a 50 °C con agitación durante 30 min. Se transfirió 120 µL de la mezcla de reacción a una nueva placa de fondo plano de 96 pozos, y se determinó la absorbancia/dispersión de luz a 405 nm. La absorbancia/dispersión de luz a 405 nm es proporcional a la eliminación de yema de huevo.

Ensayo de Micromuestra de Yema de Huevo ("Ensayo de icromuestra CS-38"; o "EGG" o "Plato") se prepararon los detergentes automáticos para platos como se describe en la presente . El equipo usado incluye un agitador/incubador New Brunswick Innova 4230 y un Lector SpectraMAX (tipo 340) MTP. Los MTP se obtuvieron de Costar (tipo 9017) . Se obtuvieron yemas de huevo añejadas con muestras de pigmento (CS-38) de Center for Test Materials (Vlaardingen, Países Bajos) . Antes de cortar las micromuestras circulares de 0.635 cm (0.25 pulgadas), la tela se lavó con agua. Una micromuestra se colocó en cada pozo de una placa de microtitulación de 96 pozos. Se equilibró el detergente de prueba a 50°C. Se agregó 190 µ? de solución de detergente a cada pozo del MTP, que contiene micromuestras. A esta mezcla, se agregó 10 µ? de la solución de enzima diluida. El MTP se selló con papel adhesivo y colocó en el incubador durante 30 minutos, con agitación. Después de la incubación, se transfirió 100 µ? de la solución de cada pozo en un MTP fresco. Este MTP se leyó a 405 nm usando un lector SpectraMax MTP. También se incluyeron controles en blanco, así como controles que contienen micromuestras y detergente pero ninguna enzima.

Muestra uPre- lavada" Se pre-lavó este tipo de micromuestra en agua desionizada durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la etapa pre-lavada, las muestras se colocaron en la parte superior de toallas de papel para secar. Las muestras secadas con aire luego se adquirieron usando un pigmento circular de 0.6 cms (¼ de pulgada) en una prensa de expulsión. Finalmente dos micromuestras se colocaron en cada pozo de un MTP de 96 pozos verticalmente para exponer el área de superficie completa (esto es no plana en el fondo del pozo) .

Detergentes Para detergentes de lavandería líquidos de trabajo pesado (HDL) para América del Norte (NA) y Europea Occidental (WE) , se realizó la inactivación de calor al colocar el detergente líquido pre-pesado (en una botella de vidrio) en un baño de agua a 95°C durante 2 horas. Todos de los detergentes usados en los Ejemplos fueron detergentes comercialmente disponibles adquiridos de almacenes de supermercado locales. Las enzimas actuales en estos detergentes se inactivaron por tratamiento con calor, como se describe en la presente. El tiempo de incubación para inactivación por calor de detergente de lavandería granular de trabajo pesado (HDG) de América del Norte (NA) y Japonés (JPN) fue 8 horas y que para detergente HDG de Europa Occidental (WE) fue 5 horas. El tiempo de incubación para inactivación de calor de detergentes de lavaplatos automático (ADW) de NA y WE fue 8 horas. Tanto los detergentes calentados como no calentados se procesaron por ensayo dentro de 5 minutos al disolver el detergente para determinar exactamente el porcentaje desactivado. Se probó la actividad de enzima por el ensayo AAPF .

Para probar la actividad de enzima en detergentes inactivados por calor, las soluciones de trabajo de detergentes se hicieron de las soluciones madre inactivadas por calor. Las cantidades apropiadas de dureza del agua (6 gpg o 12 gpg) y solución amortiguadora se agregaron a las soluciones de detergente para igualar las condiciones deseadas. Las soluciones se mezclaron al colocar en vórtice o invertir las botellas. La Tabla 1-1 proporciona información con respecto a algunos de los detergentes comercialmente disponibles y condiciones de prueba usadas en la presente. En algunos experimentos, los detergentes adicionales y/u otros comercialmente disponibles se usaron como se describe en los siguientes Ejemplos.

*Abreviaturas : Procter y Gamble (PyG) ; y Reckitt Benckiser (RB) .

Enzimas y Equipo Se obtuvieron muestras de GCI-P036 y variantes del mismo de caldo de cultivo filtrado de cultivos crecidos en placas MTP . El equipo usado fue un Biomek FX Robot (Beckman Coulter) , un Lector SpectraMAX MTP (tipo 340; Molecular Devices) , un incubador/agitador iEMS (Thermo/Labsystems) ; MTP de fondo F (Costar tipo 9017 usado para placas de reacción de lectura después de la incubación) ; y MTP de fondo V (Greiner 651101 usado para pre-dilución de sobrenadante) . En este ensayo, las proteasas hidrolizan el sustrato y liberan pigmento y partículas insolubles del sustrato. De esta manera la velocidad de turbiedad es una medición de la actividad de enzima .

Se determinó el desempeño de remoción de manchas de las serina proteasas de referencia y variantes de las mismas en micromuestras en una escala MTP en detergente comercialmente disponible (Calgonit 5 en 1) . Las micromuestras CS-38 (yema de huevo con pigmento, añejada por calentamiento) , obtenidas de CFT Vlaardingen se usaron como sustrato. Dos muestras se usaron por pozo. Los comprimidos ADW de Calgonit 5 en 1 se usaron para preparar la solución de detergente. Para inactivar la actividad de proteasa presente en los comprimidos, se disolvió un comprimido de 21g en agua Milli-Q calentada en un baño de agua a una temperatura de 60°C. La solución se enfrió hasta temperatura ambiente y el volumen de agua ajustado hasta 700 mL . La solución se diluyó además con agua para alcanzar una concentración final de 3 g/1. Se ajustó la dureza del agua hasta 21°GH al agregar 1.46 mi de la mezcla Ca/Mg (mezcla Ca/Mg [(3:1), CaCl2 1.92 M =282.3 g/L CaCl2.2H20; MgCl2 0.64 M = 130.1 g/L MgCl2.6H20), 15000gpg] . Las muestras de enzima se prediluyeron en NaCl 10 mM, CaCl2 0.1 mM, solución de TWEEN®-80 al 0.005% y probaron a concentraciones apropiadas.

El incubador se ajustó a la temperatura deseada de 50°C. Se agregó 72 µ? de solución amortiguadora de dilución a la placa de fondo V vacía (esto es, una "placa de dilución") seguido por 8 µ? de sobrenadante. Se agregó 9 µ? de la placa de dilución a placas que contienen las micromuestras incubadas en 171 µ? de solución de detergente. Se agregó 9 µ? de la placa de dilución a placas que contienen las micromuestras para dar una dilución total de sobrenadante de 200X. La placa de micromuestra (con detergente y enzima) se cubrió con cinta y colocó en el incubador/agitador durante 30 minutos a 1400 rpm. Después de la incubación, se transfirió 75 µ? de la mezcla de reacción a una placa de fondo F vacía y la absorbancia se leyó en un Lector MTP a 405 nm después de quitar las burbujas con una secadora de cabello. Los controles en blanco, que contienen una o dos micromuestras y detergente sin la adición de proteasa de referencia que contiene muestras también se incluyeron en la prueba.

El desempeño de remoción de manchas de las serina proteasas de referencia y variantes de las mismas en micromuestras también se determinó en una escala MTP en detergente comercialmente disponible (Calgonit 5 en 1) . Los reactivos usados fueron: HEPES 5 mM, pH 8.0 o MOPS 5 mM, pH 7 buffer, 3:1 Ca:Mg para dureza del agua media. (CaCl2 :MgC12*6H20) ; 15000 granos por galón (gpg) de solución madre diluida hasta 6 gpg, 2 muestras BMI (sangre/leche/tinta) por placa: muestras de algodón EMPA-116 BMI procesadas por CFT: 2 muestras pre- enjuagadas y adquiridas por pozo, y se confirmó el detergente disponible para la venta para agua fría 2X TIDE® inactivado con calor en el cual carece de actividad de proteasa. En algunos experimentos descritos en la presente, las siguientes soluciones se usaron, como se indica en los Ejemplos.

Tabla 1-2. Soluciones de Detergente de Trabajo El incubador se ajustó a la temperatura deseada (16°C o 32 °C) . Para la prueba, se agregó 10 yL de muestras de la placa de dilución principal de -10 ppm de enzima a placas de 2 muestras BMI con 190 iL de soluciones de detergente de trabajo enlistadas arriba. El volumen se ajustó para dar concentración final de 0.5 ppm para variantes en las placas de ensayo. Las placas se transfirieron inmediatamente a incubadores i EMS e incubaron durante 30 minutos con agitación a 1400 rpm a temperatura dada. Después de la incubación, 100 de sobrenadante se transfirió en una placa de 96 pozos nueva y la absorbancia se midió en Lector MTP a 405nm y/o 600nm. Los pozos de control, que contienen 1 o 2 micromuest ras y detergente sin la adición de muestras de proteasa también se incluyeron en la prueba. La medición en 405 nra proporciona un valor superior y remoción de huellas de pigmento, mientras que la medición a 600 nm huellas de turbiedad y 1 impieza .

Cálculo de la Actividad Remoción de Manchas para todos los Métodos de Ensayo de Micromues tra : El valor de absorbancia obtenido se corrigió por el valor en blanco (sustrato sin enzima) , proporciona una medición de actividad hidrolítica. Se calculó para cada muestra (variante) el índice de desempeño. El índice de desempeño compara el desempeño de la variante (valor actual) y la enzima estándar (valor teórico) en la misma concentración de proteína. Además, los valores teóricos pueden calcularse, usando los parámetros de la ecuación Langmuir de la enzima estándar.

E. Actividad Específica Relativa de Proteasas y Variantes de la Misma Con objeto de discriminar las variantes de proteasa, se calculó la actividad específica relativa usando suc-AAPF-pNA como un sustrato, que permite la comparación y clasificación de las variantes contra la proteasa de tipo natural o estándar. La actividad específica del sustrato suc-AAPF-pNA se determinó al dividir la actividad proteolítica por los valores TCA medidos de cada muestra, usando los ensayos descritos arriba. Usando estos valores, se calculó la actividad específica relativa (actividad específica de actividad variante/específica de proteasa de referencia).

F. Ensayo de Inhibición de Eglina C Como se describe en la presente, la concentración de serina proteasa y actividad específica se determinó por titulación con in inhibidor. La eglina c de la Hirudo medicinalis de sanguijuela es un inhibidor de proteína enlazado hermético de subtilisinas (Heinz et al., Biochemistry, 31:8755-66, 1992), y por lo tanto puede usarse para medir la concentración de enzima, que a su vez permite la actividad específica a calcularse. Brevemente, se mide la cantidad de inhibición de enzima producida por diversas concentraciones conocidas de eglina c. De su información, se calcula la concentración de eglina c requerida para inhibición completa. Esto es equivalente a la concentración de enzima en la muestra.

Se midió la actividad de proteasa usando el ensayo AAPF cromogénico descrito arriba. El gen para eglina c se sintetizó y expresión en E. coli por métodos estándares. Sus propiedades y potencia inhibidora fueron las mismas como eglina c adquirida de Sigma. La concentración de una solución madre de eglina c se determinó al medir la inhibición de una muestra de subtilisina Bacillus lentus de actividad específica conocida. Luego se usó la muestra de eglina c calibrada para determinar la concentración y actividad específica de variantes de subtilisina. Estos valores se usaron para crear placas madre de enzima de 96 pozos normalizados, donde todas de las variantes se diluyeron a una concentración común.

G. índice de Desempeño El índice de desempeño compara el desempeño de la variante (valor actual) y la proteasa estándar o de referencia (valor teórico) en la misma concentración de proteína. Además, los valores teóricos pueden calcularse, usando los parámetros de la ecuación Langmuir de la proteasa estándar. Un índice de desempeño (PI) que es mayor que 1 (PI>1) identifica una mejor variante como se compara con la estándar (por ejemplo, de tipo natural) , mientras que un PI de 1 (PI=1) identifica una variante que realiza lo mismo que la estándar, y un PI que es menor que 1 (PI<1) identifica una variante que realiza peor que la estándar. De esta manera, el PI identifica los ganadores, así como variantes que son menos deseables para uso bajo ciertas circunstancias.

EJEMPLO 2 Producción de Proteasa GCI-P036 en B. subtilis En este Ejemplo, se describen los experimentos conducidos para producir proteasa GCI-P036 en B. subtilis . Se realizó la transformación del vector de expresión que codifica GCI-P036 y variantes del mismo en células B. subtilis (AaprE, AnprE, oppA, AspoIIE, degUHy32, AamyE:: [xylR, xylA-comK] ) como se describe previamente (ver por ejemplo, WO 2002/014490) .

Producción de Proteasa GCI-P036 - pAC-GCI-P036ci Se proporcionan los métodos ejemplares para producir GCI-P036 (también se refieren en la presente como "subtilisina B . lentus" y "GG36") en B. subtilis. El plásmido de expresión pAC-GG36ci se ensambló usando el gen mejorado de codón GCI-P036 fusionado a los ocho codones de la secuencia de señal aprE bajo el control del promotor aprE de consenso y el terminador transcripcional BPN' . En la secuencia proporcionada a continuación, la fuente en negritas y cursiva indica el promotor aprE de consenso, la fuente estándar indica la secuencia de señal, la fuente subrayada indica la pro secuencia, la fuente en negrita indica ADN que codifica la proteasa madura GCI-P036, y la fuente en cursiva subrayada indica el terminador BPN' . La región codificada de la proteasa madura GCI-P036 es flanqueada por sitios de restricción Kpnl y Xhol para propósitos de clonación : atcica aatgggtctactaaaatattactccaickitt taataa Ucacagaaíagtcttltaagtaagtcíactctga g gtoaflgagtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcattgctgatttctgttgcttttagctcatccatcgcatccgctgctgaagaagc aaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagttgaggcaaatgacpapgtagccattctctctgaggaag aggaagtcgaaattgaatt cttcatgaatttgaaacgattcctgttctgtccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgttagagctcgatccagctat ttcttatattgaagaggatgcagaagtaactacaatggcgcaatcggtaccatggggaattagcagagtacaagccccagctgcacataaccgtgg attgacaggttctggtgtaaaagttgctgtccttgataccggtatttccactcatccagacttaaatattcgtggtggagctagctttgtaccaggg gaaccatccactcaagatggcaatggacatggcactcatgttgccggcacaatcgcggctcttaacaattcaattggtgttcttggcgtagcgcc aagcgcagaactatacgctgttaaagtattaggagcaagcggttcaggctctgtcagctctattgcccaaggattggaatgggcagggaacaa tggcatgcacgttgctaatcttagtttaggatctccttcgccaagtgccacacttgagcaagctgttaatagcgcgacttctagaggcgttcttgtt gtagcggcctctggaaattcaggtgcaggctcaatcagctatccggcccgttatgcgaacgctatggcagtcggagctactgaccaaaacaac aaccgcgccagcttttcacagtatggcgcagggcttgacattgtcgcaccaggtgtaaacgtgcagagcacttacccaggttcaacatatgcca gcttaaacggtacatcaatggctactcctcatgttgcaggtgcggctgcacttgttaaacaaaagaacccatcttggtccaatgtacaaatccgc aatcatcttaagaatacggcaactagcttaggaagcacaaacttgtatggaagcggacttgtcaatgcagaagctgcaactcgttaaoíi^ íto actceagataaaaaaccjMccttggcccceccegttttttat (SEQ ID NO:5).

La secuencia de aminoácido de la proteína precursora GCI-P036 se proporciona a continuación. En esta secuencia, el péptido de señal se muestra en cursiva (iniciando con una f ormilmetionina de N- terminal) , la pro-secuencia está subrayada, y la secuencia de proteasa GCI-P036 madura se muestra en negritas: MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAkEEAKEKYUGFNEOEAVSEFVEOVEANDEVATLSEEEEVEl ELLHEFETTPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAOSVPWGISRVOAPAAHNRGLT GSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVA PSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRG VLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYP GSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNA EAATR (SEQIDNO:6).

La secuencia de aminoácido de la proteasa GCI-P036 madura : AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGT HVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPS PSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLD IVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGST NLYGSGLVNAEAATR (SEQ ID NO:2).

Los elementos de pAC-GG36ci plásmido incluyen: pUBUO = fragmento de ADN de pUBUO plásmido (McKenzie et al, Plasmid 15:93-103, 1986), pBR322 = fragmento de ADN de pBR322 plásmido (Bolívar et al, Gene 2:95-113, 1977), pC194 = fragmento de ADN de pC194 plásmido (Horinouchi et al, J Bacteriol, 150:815-825, 1982). Las características de plásmido son como sigue: Ori para B. subtilis = origine de replicación de pUBUO, CAT = gen de resistencia de cloranfenicol de pC194, origen pMBl = origen de replicación de pBR322, bla = beta-lactamasa de pBR322, promotor aprE corto = promotor transcripcional de consenso, Péptido de señal= péptido de señal, Pro Péptido = pro región GCI-P036, Péptido Maduro GG36ci = GCI-P036 maduro (reemplazado por las regiones codificadas para cada variante expresada en este trabajo) , Terminador BPN' = terminador transcripcional de subtilisina BPN1.

Producción de Proteasa GCI-P036 - pHPLT-GCI-P036 Se describen métodos adicionales para producir la proteasa de referencia GCI-P036 en B. subtilis . El gen sintético que codifica el precursor de proteasa GCI-P036 se ensambló de oligonucleótidos sintéticos y productos PCR. El fragmento se clonó en pHPLT de estructura de plásmido (Patente de E.U.A. No. 5,024,943) usando sitios de restricción BsmBI y HindIII. La secuencia de aminoácido de la proteasa GCI-P036 madura (SEQ ID NO: 2) de pHPLT-GCI-P036 es idéntica a aquella de pAC-GG36ci. El vector de expresión pHPLT B. subtilis contiene el promotor LAT B. licheniformis (Plat) , y elementos adicionales de pUBUO (McKenzie et al., Plasmid, 15:93-103, 1986) que incluyen un gen de replicasa (reppUB) , un gen de resistencia a neomicina/canamicina (neo) y un marcador de resistencia de bleomicina (bleo) . El ADN plásmido se purificó de bacterias transformadas usando kit Puré Yield™ Plasmid Midiprep (Promega) , y la concentración de ADN se determinó por espectrometría UV como se conoce en la técnica. El constructo de vector final se verificó por procesado por secuencia de ADN del gen GCI-P036 y mostró 100% de congruencia de secuencia con la secuencia esperada. La secuencia de ADN del gen de proteasa GCI-P036 de pHPLT-GCI-P036 se muestra a continuación con los sitios de clonación SacI y HindIII subrayados: GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTCAG TTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGC AGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTC TGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAAT TGAAACGATTCCTGTTTTATCCG TTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAGCTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAA GAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAG CCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACA GGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACC ATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTAAAC AATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGG GGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAAT GGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGC TGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAG GCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAA CAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAA ACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTAC TCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTAC AAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAG CGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAAAGCTT (SEQ ID NO: 7).

Proteasas Recombinantes - Escala de 2 mi Se replicaron clones B. subtilis que contienen vectores de expresión de proteasa con un replicador de 96 pozos de acero de soluciones madre de glicerol en placas de cultivo de 96 pozos (BD, 353075) que contienen 200 µ? de medio LB + 25 g/ml de cloranfenicol , se hicieron crecer durante la noche a 37°C, 220 rpm en un recinto humidificado . Se usó una alícuota de 200 µ? del cultivo durante la noche para inocular 2000 µ? de medio definido + 25µ9/t?1 de cloranfenicol en 5ml de tubos de cultivos de plástico. El medio de cultivo fue un medio semi-definido enriquecido basado en solución amortiguadora MOPS, con urea como fuente de nitrógeno principal, glucosa como la fuente de carbono principal, y complementado con soytona al 1% para crecimiento celular robusto. Los tubos de cultivo se incubaron a 37°C, 220 rpm, durante 60 horas. Después de esta incubación, los caldos de cultivo se centrifugaron en mayor que 8000 x RCF . La solución de sobrenadante se decantó en 15ml de tubos cónicos de polipropileno para almacenamiento. No se realizó concentración o purificación adicional. Las soluciones madre del sobrenadante se formularon hasta concentración final de propilen glicol al 40% para estabilidad de larga duración y se almacenaron a 4°C.

Proteasas Recombinantes - Escala de Placa de Microtitulación (MTP) Alternativamente, las proteasas variantes se produjeron al hacer crecer los transformantes B. subtilis en placas de microtitulación (MTP) de 96 pozos en 200 L de un medio definido basado en MOPS ( "MBD" ) . El medio MBD se hizo esencialmente como se conocen en la técnica (Ver, Neidhardt et al., J Bacteriol, 119: 736-747, 1974), excepto que NH4C12, FeS04, y CaCl2 se dejaron fuera del medio base, se usó K2HP04 3 mM, y el medio base se complementó con urea 60 mM, 75 g/L de glucosa, y soytona al 1%. También se hicieron los micronutrientes como una solución madre 100X contenida en un litro, 400 mg de FeS04.7H20, 100 mg de MnS04.H20, 100 mg de ZnS04.H20, 50 mg de CuCl2.2H20, 100 mg de CoCl2.6H20, 100 mg de NaMo04.2H20, 100 mg de Na2B407.10H2O, 10 mi de CaCl21M, y 10 mi de citrato de sodio 0.5 M. Las placas se incubaron a 37°C durante 68 horas, las células se separaron por centrifugación, y las proteínas de interés se obtuvieron del medio de cultivo.

EJEMPLO 3 Generación de Variantes GCI-P036 En este Ejemplo, se describen los métodos usados para producir las variantes de proteasa.

Generación de Colecciones de Evaluación de Sitio GCI-P036 (SEL) Se realizó la producción de SEL por GENEART usando un proceso propietario (WO 2004/059556A3 ) . Los métodos y dispositivos para optimizar una secuencia de nucleótido para el propósito de expresión de una proteína por PCR, y la fabricación de moléculas de ADN utilizan tecnología de propiedad de o licenciada por GENEART (Patente Europea Nos. 0 200 362 y 0 201 184; y Patente de EUA Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 6,472,184). La construcción de GCI-P036 SEL descrita en este ejemplo se realizó por GENEART usando sus métodos y plataforma de tecnología para optimización del gen, síntesis del gen y generación de colección y análisis.

Se produjeron GCI-P036 SEL por GENEART en posiciones pre-seleccionadas por los inventores. El ADN plásmido pHPLT-GCI-P036 (Ver, FIG. 2) se digirió con enzimas de restricción SacI y HindIII, liberando un fragmento 3.9kb que se purificó posteriormente de un gel de agarosa usando un kit de purificación Qiagen. Cada aminoácido de la secuencia madura se mutó en al menos 16 aminoácidos diferentes. Para construir GCI-P036 SELs, tres reacciones PCR se realizaron: dos reacciones de mutagénesis para introducir el codón mutado de interés en la secuencia de ADN GCI-P036 madura, y una tercera reacción para fusionar los dos productos PCR de mutagénesis juntos para construir el vector de expresión pHPLT-GCI-P036 que tiene los codones mutados deseados en la secuencia GCI-P036 madura.

Se realizó el método de mutagénesis fue basado en el enfoque de mutación específico de codón en el cual la creación de todas las mutaciones posibles en un triplete de ADN específico usando un cebador de oligonucleótido delantero e inverso con una longitud de 25 hasta 45 nucleótidos usando un NNS de secuencia de ADN triple específicamente diseñado ((A,C,T o G) , (A,C,T o G) , (C o G) ) que corresponde con la secuencia del codón a mutarse y garantiza la incorporación aleatoria de nucleótidos en el codón específico de interés. Dos cebadores adicionales que se usan para construir una colección de evaluación del sitio incluyen un cebador cadena arriba que contiene un sitio SacI, y un cebador cadena abajo que contiene un sitio HindIII. La construcción de cada SEL inicia con dos amplificaciones PCR primarias usando el cebador SacI delantero y un cebador de mutagénesis inverso GCI-P036 específico, y para la segunda reacción PCR el cebador HindIII inverso y un cebador de mutagénesis delantero GCI-P036 específico (posiciones de codón maduro GCI-P036 iguales para los cebadores de mutagénesis inversa y delantera) .

Se realizó la introducción de las mutaciones en la secuencia GCI-P036 madura usando Polimerasa de ADN de Alta Fidelidad Phusion (Finnzymes catalogo no. F-530L) . Todas las reacciones PCR se ejecutaron de acuerdo con los protocolos del fabricante que se suministraron con la polimerasa. Las condiciones PCR fueron como sigue: para PCR1 primario: Cebador SacI FW y un cebador de mutagénesis inverso GCI- P036 específico - ambos 1 pL (10 µ?) ; y para PCR 2 primario: Cebador RV HindIII y un cebador de mutagénesis delantero GCI-P036 específico - ambos 1 pL (10 µ?) .

Las secuencias de cebador usadas en este Ejemplo se proporcionan a continuación: Cada reacción incluida: 10 pL de solución amortiguadora 5X Phusion HF, 1 pL de mezcla d TP 10 mM, 0.75 pL de polimerasa de ADN Phusion (2 unidades/ pL) , 1 pL DMSO puro, 1 pL de ADN de plantilla pHPLT-GCI-P036 (0.1 - 1 ng/ pL) , y dH20 hasta 50 pL de volumen total .

Se completó la PCR usando un formador de ciclo térmico MJ Research PTC-200 Peltier con el siguiente programa: 30 segundos 98°C, 30X (10 segundos 98°C, 20 segundos 55°C, 1 minuto 72°C) y 5 min 72°C. Las reacciones proporcionan dos fragmentos de aproximadamente 2 hasta 3 kb que tienen aproximadamente 30 nucleótidos traslapados que rodean el codón maduro GCI-P036 de interés .

Los fragmentos se fusionaron en una tercera reacción usando los dos fragmentos antes mencionados y los cebadores Sacl-Fw y HindIII-Rv delantero e inverso. La reacción PCR de fusión se llevo a cabo en una solución que contiene: 1 pL de cada uno de los cebadores Sacl-Fw y HindIII-Rv (10 µ?) , 10 pL de solución amortiguadora 5X Phusion HF, 1 pL de mezcla dNTP 10 mM, 0.75 pL de polimerasa de ADN Phusion™ (2 unidades / pL) , 1 pL de DMSO puro, 1 µ?? de mezcla de reacción PCR 1 primario, 1 iL de mezcla de reacción PCR 2 primario, y dH20 para ajustar el volumen final hasta 50 µ??. El programa de fusión PCR fue como sigue: 30 segundos 98°C, 30X (10 segundos 98°C, 20 segundos 55°C, 40 segundos 72°C) y 5 min 72°C, usando un formador de ciclo térmico MJ Research PTC-200 Peltier. Se purificó el fragmento de 859 pb lineal amplificado que codifica el gen GCI-P036 (usando kit de purifica PCR QIAGE ® Qiaquick, catalogo no. 28106) y digirió con enzima de restrccion SacI y HindIIII para crear extremos cohesivos en ambos lados del fragmento de fusión. Alrededor de 50ng de pHPLT-GCI-P036 plásmido se digirió con enzimas de restricción SacI y HindIIII . El fragmento de estructura de vector 3.9kb se aisló y ligó con 50ng del fragmento 859bp digerido que codifica la enzima variante, usando ligasa de ADN T4 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante para clonación de extremos cohesivos. Posteriormente, la mezcla de ligación se usó para transformar celular B. subtilis (AaprE, ñnprE, oppA, AspoIIE, degUHy32, AamyE : : [xylR,pxylA-comK] ) como se describe (WO 2002/014490) .

Para cada colección, se seleccionaron e hicieron crecer 96 colonias sencillas en medio líquido TSB (caldo basado en triptona y soya) bajo selección de neomicina para aislamiento de ADN posterior y análisis de la secuencia del gen. Los números de colección están en el intervalo desde 1 hasta 269, con cada número que representa el codón de la secuencia GCI-P036 madura que se mutó. Cada colección contiene un máximo de 19 variantes GCI-P036.

Generación de Colecciones de Mutación Múltiple GCI-P036 (MML) Cada colección de mutación múltiple GCI-P036 sintética contiene una mezcla de genes GCI-P036 los cuales dos o más codones seleccionados se reemplazan por secuencias de ADN específicas. La clonación de genes GCI-P036 combinatoria se realizó por Sloning BioTechnology GmbH usando la Tecnología Slonomax. Las Tablas 3-1 y 3-2 más abajo enlistan las sustituciones presentes en miembros del MML numerado de acuerdo con la secuencia de referencia GCI-P036 la secuencia de referencia BP' respectivamente.

Tabla 3-1 Colecciones de Mutación Múltiple GCI-P036 (numeración GCI-P036) Colección 12 024 (S, H, L, W) 097 (S, , Q, T) 101 (S, N, P) 125 (G, Q, R, T) 130 (S, II, N) con 85N, 116V, 126L, 127Q v 128A 576 Colección 13 018 (N, K, Q, R) 095 (G, P) 179 (N, K, Q, R) 203 (Y, W) 209 (A, I, R, V) 250 (S, P, W) 768 Colección 14 042 (Ñ, E, F, I, S, T, V, W), 096 (A, E, L, N, T, V) 099 (S, E, F, N, R, T, V, Y) 115 (N, I, Y) 242 (N. I. K) 3456 Colección 15 051 (P, I, V) 117 (M, F) 142 (S, T, V, W, Y) 179 (N, R, V) 203 (Y, W) 250 (S, I, P, T) 1200 Colección 16 018 (N, K, Q, R) 095 (G, P) 179 (N, K, Q, R) 203 (Y, W) 209 (A, I, R, V) 250 (S, P, W) con 85N, 116V, 126L, 127Q y ' 128a 768 Colección 17 042 (Ñ, E, F, I, S, T, V, W), 051 (P, I, V) 096 (A, E, L, N, T, V) 099 (S, E, F, N, R, T, V, Y) 242 (N, I, K) co„ 1 85N, 116V, 126L, 127Q v ' 128A 2880 Colección 18 024 (S, H, L, W) 097 (S, K, Q, T) 101 (S, N, P) 125 (G, Q, R, T) 130 (S, H, N) con 85N, 116V, 126L, 127Q y 128A 2880 EJEMPLO 4 Desempeño de variantes GCI-P036 Se describen los experimentos para determinar el desempeño de remoción de manchas de varias variantes GCI-P036 de sustitución sencilla en un ensayo BMI (TIDE 2X® frió; 32°C, pH8) y ensayo de micromuestra CS-38 (CALGONIT® ; WE ADW) . También se determinan los índices de desempeño para estabilidad LAS/EDTA, actividad AAPF y contenido de proteína. Todos los ensayos son preformados usando los métodos del Ejemplo 1.

La tabla 4-1 muestra valores de índice de desempeño para 4,210 variantes de subtilisina GCI-P036 en 269 posiciones. El desempeño de la variante GCI-P036 se comparó con la enzima GCI-P036 de tipo silvestre. Aquellas variantes con un índice de desempeño mayor que 1 (PI >1) tienen desempeño mejorado. Los índices de desempeño menor que o igual a 0.05 se fijaron a 0.05 y se indican en negritas y cursivas en la tabla.

Para la estabilidad medida, si el índice de desempeño de actividad en los ensayos de estabilidad fue menor que o igual a 0.05, el índice de desempeño de estabilidad asociado fue asignado el valor D, no determinado. También, las variantes para las cuales los valores no se determinaron se listan como ND.

El índice de desempeño (PI) es la relación de desempeño de la variante a la proteasa precursora o de referencia. Varios términos se establecidos a continuación se usan para describir la mutación: mutaciones superiores tienen un PI>1; mutaciones neutrales tienen un PI>0.5, mutaciones no deterioradas tienen un PI>0.05; mutaciones deterioradas tienen un PI=0.05; mutaciones combinables son aquellas para las cuales la variante tiene valores de índice de desempeño = 0.5 por al menos una propiedad, y >0.05 para todas las propiedades. Las mutaciones combinables son mutaciones que se pueden combinar para entregar proteínas con índices de desempeño apropiado para una o más propiedades deseadas. Las posiciones en que las mutaciones se presentan se clasifican como sigue: posiciones no restrictivas tienen >20% de mutaciones neutrales para al menos una propiedad; y posiciones restrictivas tienen <20% de mutaciones neutrales para actividad y estabilidad.

Estos datos encuentran uso en la fabricación por ingeniería de cualquier subtilisina/subtilasa . Incluso si la subtilasa para la ingeniería tien un aminoácido diferente del de la subtilisina GCI-P036 en una posición particular, estos datos encuentran uso en descubrimiento de una substitución que podría alterar las propiedades deseadas por identificar la mejor elección para substitución ( s) , que incluyen substitución (s) al aminoácido de tipo silvestre GCI-P036.

Tabla 4-1. Valores del Indice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI-P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PIBMI LAS- Pide (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 1 A001C 0.93 0.87 1.14 0.62 1.11 1 A001E 1.25 0.94 1.00 1.08 1.34 1 A001F 1.15 1.18 1.01 0.53 1.24 1 A001G 1.19 1.37 1.01 0.92 1.47 1 A001H 1.33 0.97 0.93 0.83 1.43 1 A001I 1.40 0.92 0.97 0.63 1.74 1 A001K 1.24 1.13 0.76 0.63 1.30 1 A001L 1.31 1.05 0.98 0.72 1.33 1 A001N 1.38 0.96 1.02 0.68 1.55 1 A001P 0.44 0.05 1.20 0.37 0.47 1 A001Q 1.30 1.23 1.07 0.98 1.58 1 A001R 1.28 0.97 0.74 0.39 1.41 1 A001S 1.39 1.10 0.98 0.74 1.43 1 A001T 1.54 0.82 1.01 0.76 1.59 1 A001V 1.48 0.89 0.94 0.89 1.53 1 A001Y 1.42 0.86 0.79 0.70 1.34 2 Q002A 1.55 1.29 1.06 0.05 1.73 2 Q002C 1.19 0.68 0.95 0.05 1.44 2 Q002E 1.80 0.94 1.03 0.05 1.79 2 Q002G 1.67 1.22 0.92 0.05 1.70 2 Q002K 1.32 1.16 0.73 0.05 1.40 2 Q002L 1.27 1.00 1.09 0.05 1.31 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 2 Q002M 1.35 1.08 0.94 0.05 1.37 2 Q002N 1.57 1.11 0.91 0.05 1.67 2 0002P 1.81 1.04 0.89 0.05 1.90 2 Q002R 1.31 1.08 0.67 0.05 1.38 2 Q002S 1.79 1.20 0.95 0.05 1.86 2 Q002T 1.55 1.04 0.89 0.05 1.33 2 Q002V 1.60 0.97 0.91 0.05 1.64 2 Q002W 1.60 1.10 0.87 0.05 1.67 2 Q002Y 1.52 0.95 0.95 0.05 1.48 3 S003D 1.36 1.01 1.09 0.43 1.55 3 S003E 1.25 0.99 1.17 1.03 1.33 3 S003F 1.07 0.98 0.90 0.23 1.10 3 S003G 1.48 1.00 0.79 0.05 1.47 3 S003H 1.40 0.90 0.91 0.87 1.42 3 S003I 1.41 0.91 0.93 1.02 1.37 3 S003L 1.24 1.00 0.86 0.57 1.27 3 S003M 1.45 0.89 0.89 0.90 1.45 3 S003N 1.42 0.97 0.94 0.71 1.45 3 S003P 1.41 0.94 0.90 0.05 1.54 3 S003R 1.27 1.09 0.75 0.05 1.44 3 S003T 1.46 0.95 0.90 1.14 1.66 3 S003V 1.37 0.99 0.81 0.95 1.39 3 S003W 1.42 0.88 0.81 0.30 1.33 3 S003Y 1.38 0.95 0.86 0.29 1.35 4 V004A 1.23 1.13 0.92 0.05 1.47 4 V004C 1.16 1.00 0.90 0.34 1.40 4 V004D 1.15 0.99 1.16 0.05 1.47 4 V004E 1.34 0.95 1.05 0.19 1.54 4 V004F 1.30 0.92 1.05 0.05 1.34 4 V004G 0.73 1.90 1.09 0.05 0.90 4 V004H 1.27 0.97 0.91 0.05 1.47 4 V004K 1.36 0.93 0.75 0.05 1.51 4 V004L 1.33 0.96 0.86 0.22 1.34 4 V004N 1.46 0.86 0.86 0.05 1.50 4 V0 4P 1.27 1.02 0.87 0.05 1.40 4 V004R 1.20 1.03 0.76 0.05 1.37 4 V004S 1.12 1.33 0.99 0.05 1.35 4 V004T 1.32 1.02 0.80 0.93 1.55 4 V004W 1.24 1.01 1.00 0.05 1.35 5 P005A 1.60 1.71 1.02 0.05 1.03 5 P005C 0.95 1.22 1.22 0.11 0.92 5 P005D 1.35 1.48 1.22 0.05 1.52 5 P005E 1.30 1.97 1.19 0.05 1.31 5 P005F 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 5 P005G 1.63 1.77 0.91 0.39 2.04 5 P005I 0.26 0.05 1.77 0.05 0.56 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') PI TCA CS-38 32°C AAPF 5 P005K 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 5 P005L 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 5 P005M 0.69 2.30 1.15 0.05 0.45 5 P005Q 1.46 1.56 0.83 0.05 0.47 5 P005R 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 5 P005S 1.91 1.34 0.99 0.07 1.12 5 P005T 1.40 1.85 1.00 0.05 1.88 5 P005W 0.10 0.05 3.05 0.05 0.28 5 P005Y 0.07 0.05 5.25 0.05 0.25 6 W006A 0.12 0.05 2.59 0.05 0.21 6 W006D 0.13 0.05 4.70 0.42 0.30 6 W006E 0.12 0.05 4.66 0.41 0.23 6 W006G 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 6 W006I 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 6 W006K 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 6 W006M 0.07 0.05 5.94 0.05 0.23 6 W006P 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 6 W006Q 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 6 W006R 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 6 W006S 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 6 W006T 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 6 W006V 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 7 G007A 1.97 1.10 1.02 0.05 1.88 7 G007C 1.77 1.12 0.92 0.08 1.76 7 G007D 1.51 0.69 1.03 0.05 1.24 7 G007E 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 • 7 G007F 0.06 0.05 0.05 ND 0.05 7 G007H 1.93 1.08 0.96 0.05 1.68 7 G007I 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 7 G007K 0.58 0.05 0.05 ND 0.05 7 G007L 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 7 G007M 0.17 0.05 0.62 0.11 0.09 7 G007N 2.08 0.95 0.97 0.29 1.52 7 G007P 0.12 0.05 2.42 0.05 0.35 7 G007Q 0.37 0.05 1.23 0.05 0.36 7 G007R 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 7 G007S 2.29 1.04 0.97 0.17 1.67 7 G007T 1.64 1.05 0.97 0.05 1.24 7 G007V 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 7 G007W 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 8 I008A 1.90 1.12 0.88 0.05 1.92 8 I008E 0.06 0.05 0.05 ND 0.05 8 I008F 1.68 1.02 0.93 0.05 1.81 8 I008G 0.22 0.05 1.82 0.05 0.42 8 I008K 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 8 I008L 2.13 0.91 0.96 0.08 2.08 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') PI TCA CS-38 32°C AAPF 8 I008 2.08 1.01 0.82 0.05 2.01 8 I008P 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 8 I008Q 0.80 1.03 1.03 0.05 0.98 8 I008R 0.08 0.05 0.05 ND 0.05 8 I008T 1.79 1.35 0.98 0.46 2.15 8 I008V 2.16 0.92 0.94 1.09 2.00 8 I008W 0.14 0.05 2.66 0.05 0.50 8 I008Y 0.22 0.05 2.27 0.05 0.61 9 S009A 0.78 3.26 1.15 0.75 1.02 9 S009C 0.73 2.26 1.39 0.72 0.90 9 S009D 0.77 2.59 1.49 1.17 0.91 9 S009E 0.94 1.28 1.28 1.14 1.12 9 S009F 1.06 1.13 1.02 0.15 1.21 9 S009G 0.88 1.97 1.27 0.70 1.12 9 S009H 1.23 1.05 1.19 1.02 1.33 9 S009L 1.25 0.75 1.01 0.30 1.31 9 S009N 1.29 0.89 1.03 0.91 1.58 9 S009P 1.03 1.31 1.19 0.05 1.28 9 S0090 1.38 0.86 0.90 0.89 1.69 9 S009R 1.27 0.99 0.77 0.09 1.49 9 S009T 0.97 1.54 1.09 0.92 1.11 9 S009V 1.18 1.05 0.98 0.57 1.22 9 S009W 1.29 0.89 0.99 0.16 1.52 9 S009Y 1.16 0.84 1.03 0.34 1.36 10 R010A 1.05 1.05 1.16 0.98 1.09 10 R010C 0.90 1.04 1.15 0.90 0.92 10 R010F 0.64 1.71 1.46 0.57 0.61 10 R010G 0.92 1.07 1.22 0.83 1.14 10 R010H 1.06 0.83 1.24 1.19 1.01 10 R010I 0.69 1.18 1.28 0.45 0.71 10 R010K 1.20 1.08 1.09 0.99 1.23 10 R010L 0.61 1.60 1.38 0.18 0.53 10 R010M 1.26 0.79 1.11 1.02 1.32 10 R010N 0.86 0.75 1.16 1.15 0.87 10 R010P 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 10 R010Q 0.24 0.05 2.44 1.25 0.27 10 ROI OS 1.00 0.94 1.29 0.99 1.04 10 ROIOT 1.21 0.98 0.99 1.08 1.27 10 R010V 0.78 0.74 1.19 0.74 0.77 10 R010W 0.85 0.74 1.24 0.66 0.74 10 R010Y 0.62 1.73 1.40 0.55 0.54 11 V011A 1.42 1.16 1.10 0.59 2.07 11 V011C 0.64 1.38 1.48 0.62 0.89 11 V011D 0.20 0.05 1.40 0.62 0.13 11 V011F 0.20 0.05 0.05 ND 0.05 11 V011G 0.38 0.05 2.03 0.05 0.53 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 11 V011I 1.13 1.30 1.25 0.98 1.34 11 V011K 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 11 V011M 1.13 1.14 1.20 0.19 1.44 11 V011N 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 11 V011P 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 11 V011 R 0.17 0.05 0.05 ND 0.05 11 V011S 1.26 1.30 1.15 0.47 1.78 11 V011T 0.28 0.05 2.38 0.47 0.40 11 V01 1W 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 11 V011Y 0.17 0.05 0.05 ND 0.05 12 O012D 0.85 0.46 1.28 0.79 0.93 12 Q012F 1.24 1.21 1.10 0.63 1.59 12 Q012G 1.30 0.83 1.10 1.18 1.60 12 Q012H 1.21 1.23 1.00 0.60 1.46 12 Q012I 1.39 1.06 1.13 0.80 1.58 12 Q012K 1.16 1.34 0.88 0.15 1.50 12 Q012L 0.21 0.05 2.38 0.97 0.30 12 Q012M 0.57 1.67 1.40 0.98 0.76 12 Q012N 1.17 1.27 1.14 1.14 1.46 12 Q012P 0.16 0.05 0.88 1.02 0.09 12 Q012R 1.17 1.19 1.09 0.23 1.49 12 Q012S 1.59 1.10 1.01 0.96 1.74 12 Q012T 1.26 0.96 1.07 1.00 1.32 12 Q012V 1.33 1.00 1.12 0.84 1.57 12 Q012W 1.37 1.05 0.89 0.49 1.58 12 Q012Y 0.21 0.05 0.83 0.92 0.10 13 A013E 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 13 A013G 1.37 1.04 1.00 1.00 1.62 13 A013I 0.92 0.91 1.09 0.05 1.01 13 A013K 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 13 A013L 0.23 0.05 0.46 0.77 0.08 13 A013M 0.40 0.05 1.26 0.09 0.44 13 A013N 0.20 0.05 0.05 ND 0.05 13 A013P 0.18 0.05 0.05 0.56 0.08 13 A013Q 0.62 4.03 1.33 0.09 0.72 13 A013R 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 13 A013T 1.14 1.24 1.00 0.24 1.29 13 A013V 1.13 1.02 0.93 0.08 1.20 13 A013Y 0.12 0.05 0.05 ND 0.05 14 P014A 1.06 1.25 0.05 0.27 1.32 14 P014C 0.57 35.83 1.39 0.56 0.81 14 P014D 0.73 2.04 1.43 0.93 0.97 14 P014E 0.68 2.26 1.49 1.06 0.90 14 P014F 0.81 1.68 1.00 0.05 1.02 14 P014G 0.62 26.84 1.26 0.49 0.78 14 P014H 0.89 1.45 1.14 0.28 1.11 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') 32°C I BPN') TCA CS-38 AAPF 14 P014I 1.06 1.23 1.08 0.66 1.14 14 P014K 1.16 1.15 0.84 0.05 1.32 14 P014L 1.29 1.12 1.13 0.77 1.40 14 P014Q 1.20 1.07 0.91 0.62 1.32 14 P014S 0.84 1.60 1.27 0.37 1.07 14 P014T 1.06 1.25 1.13 0.80 1.18 14 P014V 1.08 1.29 1.06 0.63 1.32 14 P014Y 1.09 1.20 1.09 0.13 1.24 15 A015D 1.02 0.87 1.10 1.13 1.16 15 A015F 1.23 1.04 1.08 0.84 1.56 15 A015G 1.14 1.17 1.04 1.00 1.25 15 A015I 1.47 0.89 0.95 1.03 1.47 15 A015K 1.25 1.06 0.82 0.30 1.23 15 A015L 1.38 0.94 0.90 1.09 1.45 15 A015M 1.43 0.89 0.98 0.99 1.53 15 A015P 1.53 0.79 0.97 0.99 1.57 15 A015O 1.40 0.92 1.00 1.08 1.42 15 A015R 1.14 1.00 0.89 0.08 1.32 15 A015S 1.35 1.07 0.84 1.14 1.33 15 A015V 1.36 0.90 0.95 1.02 1.50 15 A015W 1.44 0.80 0.87 0.87 1.41 16 A016D 0.16 0.05 1.24 0.05 0.13 16 A016E 0.20 0.05 1.39 0.09 0.19 16 A016F 0.27 0.05 0.05 ND 0.05 16 A016G 1.28 1.13 1.02 1.00 1.51 16 A016K 0.13 0.05 0.05 0.05 0.10 16 A016L 1.19 0.90 1.10 0.53 1.50 16 A016N 1.15 1.05 1.05 0.89 1.40 16 A016P 1.41 0.92 0.98 0.87 1.55 16 A016Q 0.59 3.00 1.13 0.84 0.72 16 A016R 0.40 0.05 1.02 0.05 0.49 16 A016S 1.30 0.98 0.93 1.01 1.25 16 A016T 1.16 1.01 1.12 0.86 1.27 16 A016V 1.46 1.00 1.01 0.89 1.45 16 A016W 0.13 0.05 0.05 ND 0.05 16 A016Y 0.12 0.05 0.05 ND 0.05 17 H017A 0.88 1.01 1.02 0.70 1.07 17 H017D 0.31 0.05 1.81 0.57 0.39 17 H017E 0.70 1.87 1.29 0.75 0.93 17 H017F 1.40 0.91 0.93 0.69 1.60 17 H017G 0.69 2.24 1.09 0.73 0.91 17 H017I 1.28 0.91 0.91 1.01 1.37 17 11017K 0.90 1.25 0.81 0.05 1.05 17 H017 0.92 1.26 1.00 1.04 1.05 17 H017N 1.10 0.99 1.03 0.84 1.30 17 H017P 0.13 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (?G) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32 TCA CS-38 °C PI AAPF 17 H017R 0.94 1.35 0.98 0.05 1.11 17 II017S 0.97 1.32 1.01 0.60 1.16 17 H017T 0.78 1.73 1.10 0.54 0.91 17 H017V 0.81 1.38 1.13 0.52 0.88 17 H017W 1.16 0.98 1.01 0.13 1.41 17 H017Y 1.20 0.94 0.94 0.56 1.26 18 N018A 1.21 0.88 0.91 0.96 1.28 18 N018C 1.13 1.01 1.03 0.86 1.34 18 N018D 1.26 1.12 1.11 1.15 1.41 18 N018E 1.46 0.92 1.02 1.20 1.47 18 N018F 1.14 1.07 1.05 0.66 1.32 18 N018G 1.10 1.10 1.05 1.01 1.17 18 N018H 1.26 1.08 1.01 1.02 1.37 18 N018I 0.94 0.21 0.05 ND 0.05 18 N018K 1.39 0.95 0.74 0.43 1.43 18 N018L 1.35 0.91 0.97 0.92 1.26 18 N018M 0.88 1.57 0.97 0.87 1.06 18 N018P 1.26 1.09 1.00 0.92 1.37 18 NO 180 1.32 1.01 0.92 1.02 1.44 18 N018R 1.20 1.02 0.82 0.12 1.36 18 N018S 1.02 1.19 1.07 1.03 1.08 18 N018T 1.21 1.03 0.90 0.97 1.41 18 N018V 1.32 0.92 1.09 0.86 1.36 18 N018W 1.39 0.90 0.89 0.54 1.38 18 N018Y 1.36 0.83 1.04 0.90 1.31 19 R019A 1.31 1.04 1.07 1.06 1.38 19 R019C 1.23 0.79 1.03 1.31 1.26 19 R019D 1.09 1.07 1.15 1.08 1.33 19 R019E 1.36 0.74 1.00 1.21 1.58 19 R019F 1.35 0.90 1.07 1.16 1.46 19 R019G 1.06 1.05 1.11 1.10 1.15 19 R019H 0.99 0.90 1.05 1.04 1.22 19 R019K 1.38 0.88 0.92 1.08 1.57 19 R019L 1.24 1.01 1.16 1.23 1.27 19 R019 1.30 1.03 1.12 1.14 1.34 19 R019N 1.18 0.98 1.15 1.18 1.21 19 R019P 0.27 0.05 1.89 0.58 0.27 19 R019Q 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 19 R019S 0.95 1.28 1.26 1.05 1.04 19 R019T 0.71 2.30 1.34 1.06 0.86 19 R019V 1.00 1.26 1.12 1.05 1.18 19 R019W 1.22 0.94 1.11 1.17 1.13 19 R019Y 1.50 0.84 1.04 1.03 1.36 20 G020A 1.76 0.87 0.82 0.90 2.04 20 G020C 1.25 0.83 1.00 0.99 1.55 20 G020D 1.20 0.77 1.07 1.14 1.59 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 20 G020F 1.43 0.90 0.85 1.04 1.58 20 G020I 1.66 0.92 0.86 1.11 1.71 20 G020K 1.89 1.07 0.69 0.92 1.98 20 G020L 1.77 0.96 0.83 1.03 2.1 1 20 G020M 0.99 0.89 1.15 1.04 1.22 20 G020P 1.47 0.98 0.92 0.91 1.59 20 G020Q 1.95 0.96 0.76 1.02 2.27 20 G020R 1.75 0.95 0.70 0.81 1.94 20 G020S 1.25 1.32 0.95 0.92 1.66 20 G020T 1.39 0.94 0.92 1.03 1 .54 20 G020V 1 .68 0.95 0.86 1 .04 1 .77 20 G020W 1 .31 0.91 0.93 0.91 1 .39 20 G020Y 1.94 0.88 0.80 0.92 2.22 21 L021A 1.43 0.88 0.81 0.87 1.82 21 L021C 0.99 1 .06 1.10 0.92 1.22 21 L021 D 0.63 0.05 1.64 0.86 0.92 21 L021E 1.08 1.00 1.22 1.08 1.24 21 L021G 0.96 1.22 1.30 0.87 1.23 21 L021 H 1.37 0.96 0.83 1.01 1.64 21 L021I 1.53 0.94 0.81 0.96 1.82 21 L021K 1.52 0.91 0.78 0.97 1.88 21 IJ021 M 1 .17 0.91 0.96 0.93 1 .42 21 L021 N 1 .47 0.94 0.80 0.97 1 .72 21 L021 P 1 .41 0.89 0.82 0.89 1 .59 21 L021Q 1.56 0.86 0.78 0.95 2.07 21 L021R 1.46 0.98 0.79 0.79 1.68 21 L021S 1.12 1.10 1.1 1 0.84 1.57 21 L021T 1.44 0.97 0.78 0.95 1.86 21 L021 V 1.56 0.73 0.78 0.91 2.04 21 L021W 1.58 0.86 0.69 0.98 1.84 22 T022A 1.21 1.29 0.91 0.95 1.47 22 T022C 1.15 0.97 1.18 1.09 1.27 22 T022G 1.14 1.30 1.04 0.97 1.24 22 T022I 1.26 1 .04 1 .03 1 .13 1 .46 22 T022K 1 .27 0.96 0.80 0.76 1 .32 22 T022L 1 .36 0.88 0.93 0.95 1 .35 22 T022M 1.39 1.03 0.90 0.97 1.34 22 ??22? 1.28 0.95 0.88 1.20 1.43 22 T022P 1.25 0.85 0.94 1.12 1.45 22 T022Q 1.31 0.95 0.95 1.02 1.48 22 T022R 1.16 0.94 0.83 0.57 1.34 22 T022S 0.49 0.05 1.1 1 1.01 0.54 22 T022V 1.33 1.04 1.05 1.15 1.31 22 T022W 1.46 1.02 0.88 1.28 1.48 22 T022Y 1.30 0.93 0.82 0.58 1.40 23 . G023A 1 .73 1 .12 0.87 0.95 1 .80 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 23 G023C 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 23 G023D 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 23 G023E 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 23 G023F 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 23 G023I 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 23 G023K 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 23 G023L 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 23 G023M 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 23 G023Q 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 23 G023R 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 23 G023S 1.32 0.88 0.92 0.82 1.38 23 G023T 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 24 S024A 1.26 1.17 0.99 0.98 1.51 24 S024C 1.00 1.04 1.24 1.11 1.14 24 S024D 1.38 0.83 1.03 1.13 1.31 24 S024F 1.18 1.24 1.01 1.02 1.47 24 S024G 1.27 1.10 0.91 1.06 1.51 24 S024H 1.21 1.13 0.94 1.08 1.32 24 S024I 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 24 S024L 1.35 0.86 1.02 1.12 1.49 24 S024M 1.41 0.87 0.95 1.12 1.36 24 S024N 1.18 1.05 0.97 0.96 1.44 24 S024P 1.50 0.75 0.86 0.95 1.62 24 S024Q 1.34 0.94 0.95 1.05 1.52 24 S024R 1.21 1.03 0.87 1.00 1.29 24 S024T 1.40 0.95 0.98 1.01 1.40 24 S024V 1.25 1.12 1.05 1.10 1.29 24 S024W 1.01 1.05 0.98 1.11 1.08 25 G025C 0.87 1.85 1.16 0.99 1.04 25 G025D 1.16 1.03 1.10 1.13 1.32 25 G025E 1.01 1.39 1.15 1.15 1.21 25 G025F 0.90 1.80 1.18 1.02 1.15 25 G025H 0.56 0.05 1.28 1.06 0.75 25 G025K 1.17 1.05 0.88 0.99 1.36 25 G025L 1.24 0.80 0.91 1.12 1.34 25 G025M 0.98 1.39 1.12 0.98 1.15 25 G025N 0.74 4.69 1.24 1.04 0.86 25 G025Q 1.34 0.90 1.01 1.11 1.49 25 G025R 1.05 1.35 0.96 1.01 1.28 25 G025S 0.81 5.94 1.24 0.98 1.03 25 G025T 0.95 1.51 1.23 0.99 1.38 25 G025V 0.98 1.20 1.12 1.03 1.23 25 G025W 1.04 1.36 1.10 1.01 1.28 26 V026C 0.85 1.29 1.09 0.85 1.06 26 V026F 1.38 0.95 1.04 1.00 1.24 26 V026G 1.04 1.04 1.08 0.89 1.14 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 26 V026I 0.58 1.19 0.86 1.13 0.30 26 V026L 1.68 0.76 0.91 0.67 1.37 26 V026M 1.56 0.91 0.99 0.86 1.54 26 V026N 1.72 0.77 0.97 0.91 1.44 26 V026P 1.13 0.71 0.92 0.74 1.12 26 V026R 1.24 1.24 0.95 0.90 1.30 26 V026S 1.22 1.13 1.10 1.07 1.25 26 V026T 1.32 0.93 0.90 0.97 1.37 26 V026Y 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 27 K027A 1.35 0.76 1.08 0.94 1.60 27 K027C 1.07 0.55 1.10 1.14 1.31 27 K027D 1.41 0.75 1.12 1.10 1.46 27 K027F 1.04 0.63 1.23 1.11 1.19 27 K027G 1.51 0.74 0.99 1.10 1.67 27 K027H 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 27 K027I 0.38 0.05 1.73 0.91 0.53 27 K027L 0.97 0.57 1.18 1.08 1.21 27 K027M 0.82 1.01 1.39 0.96 1.03 27 K027N 1.85 0.81 0.90 1.14 1.86 27 K027P 1.92 0.75 0.92 1.10 1.56 27 K027R 1.79 1.11 0.78 1.02 1.85 27 K027S 1.52 1.35 0.96 0.95 1.66 27 K027T 1.18 0.86 1.10 0.96 1.22 27 K027V 0.58 4.24 1.45 0.91 0.74 27 K027W 1.06 0.65 1.02 0.94 1.12 27 K027Y 0.59 3.29 1.68 0.98 1.00 28 V028A 0.85 1.07 1.01 0.84 0.93 28 V028D 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 28 V028E 0.37 0.05 1.10 1.07 0.33 28 V028G 0.18 0.05 0.05 0.97 0.07 28 V028H 0.51 8.94 1.17 0.83 0.54 28 V028I 1.39 0.89 1.05 1.07 1.48 28 V028L 1.49 0.83 0.94 0.93 1.28 28 V028M 1.28 0.97 0.99 0.98 1.20 28 V028N 0.41 0.05 1.13 1.01 0.44 28 V028P 0.22 0.05 0.92 0.98 0.18 28 V028S 0.80 0.79 1.08 1.04 0.70 28 V028W 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 28 V028Y 0.41 0.05 1.07 0.65 0.41 29 A029C 1.00 1.28 1.04 1.04 1.24 29 A029D 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 29 A029E 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 29 A029F 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 29 A029G 0.98 1.11 1.09 1.00 0.93 29 A029H 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 29 ?029G 0.17 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 29 A029K 0.37 0.05 1.29 ND 0.05 29 A029L 0.17 0.05 0.05 ND 0.05 29 A029P 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 29 A029Q 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 29 A029R 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 29 A029S 0.98 1.28 1.20 0.96 1.04 29 A029T 0.34 0.05 1.27 0.79 0.44 29 A029V 0.95 1.13 1.07 0.81 0.96 29 A029Y 0.32 0.05 0.05 ND 0.05 30 V030A 0.98 0.88 0.96 0.95 0.79 30 V030C 1.17 1.00 1.01 1.14 0.94 30 V030D 0.21 0.05 1.10 ND 0.05 30 V030E 0.41 0.05 1.23 1.09 0.35 30 V030F 0.62 1.57 1.36 0.55 0.29 30 V030G 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 30 V030K 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 30 V030L 1.14 0.64 1.05 0.97 0.87 30 V030M 1.40 0.62 0.97 0.89 0.70 30 V030Q 0.31 0.05 0.98 1.10 0.08 30 V030R 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 30 V030S 0.54 4.91 1.16 0.89 0.28 30 V030T 1.05 0.92 1.13 0.90 0.69 30 V030W 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 31 L031A 0.90 1.27 1.04 1.04 1.04 31 L031C 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 31 L031E 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 31 L031F 1.54 1.42 0.70 0.94 2.86 31 L031G 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 31 L031 I 1.80 0.92 0.81 1.13 1.20 31 L031M 1.97 1.09 0.81 0.83 2.32 31 L031P 0.08 0.05 0.05 ND 0.05 31 L031R 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 31 L031S 1.74 0.93 1.03 0.90 1.15 31 L031T 0.16 0.05 3.09 0.94 0.42 31 L031V 1.43 1.20 1.12 0.95 1.41 31 L031Y 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 32 D032A 0.50 ND 0.05 ND 0.05 32 D032C 1.09 ND ND ND 0.05 32 D032E 0.44 0.05 ND ND 0.05 32 D032F 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 32 D032G 1.57 ND ND ND 0.05 32 D032H 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 32 D032I 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 32 D032L 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 32 D032M 0.50 0.05 0.05 ND 0.05 32 D032N 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMl LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 32 D032P 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 32 D032R 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 32 D032S 0.67 0.05 0.05 ND 0.05 32 D032T 0.58 0.05 0.05 ND 0.05 32 D032V 0.48 ND 0.05 ND 0.05 32 D032W 0.51 ND 0.05 ND 0.05 32 D032Y 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 33 T033A 1.14 1.22 1.08 0.71 0.40 33 T033C 1.14 0.29 0.97 1.02 0.32 33 T033D 0.95 1.09 1.50 0.62 0.23 33 T033E 0.82 0.81 1.60 0.71 0.09 33 T033F 0.63 0.05 0.80 0.80 0.10 33 T033G 1.48 1.22 0.96 0.75 0.49 33 T033H 0.78 2.54 1.14 1.01 0.06 33 T033I 0.45 0.05 1.04 0.60 0.06 33 T033L 0.34 0.05 1.74 0.80 0.07 33 ??33? 1.20 0.99 1.07 0.82 0.85 33 T033N 0.98 0.64 1.28 0.39 0.19 33 T033P 0.58 0.05 0.05 ND 0.05 33 T033Q 0.93 0.77 1.41 0.64 0.41 33 T033R 0.72 2.46 0.93 ND 0.05 33 T033S 2.07 0.89 0.72 0.92 1.65 33 T033V 0.43 0.05 2.28 0.17 0.06 33 T033W 0.59 0.05 0.34 ND 0.05 33 T033Y 0.75 0.75 1.17 0.82 0.07 34 G034C 0.33 0.05 0.38 ND 0.05 34 G034D 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 34 G034E 0.40 0.05 1.36 0.16 0.06 34 G034F 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 34 G034H 0.29 0.05 0.81 ND 0.05 34 G034K 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 34 G034L 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 34 G034P 0.33 0.05 0.05 ND 0.05 34 G034Q 0.30 0.05 0.98 ND 0.05 34 G034R 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 34 G034S 0.28 0.05 1.18 ND 0.05 34 G034T 0.26 0.05 0.47 ND 0.05 34 G034V 0.27 0.05 0.05 ND 0.05 34 G034W 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 34 G034Y 0.37 0.05 0.37 ND 0.05 35 I035A 1.13 1.09 1.00 0.64 1.07 35 I035F 0.97 0.19 1.15 ND 0.05 35 I035H 0.26 0.05 2.04 ND 0.05 35 I035K 0.36 0.05 1.08 0.71 0.19 35 I035L 1.14 0.92 1.05 0.95 1.00 35 I035M 1.16 1.03 1.17 0.82 1.12 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 35 I035P 0.94 0.69 1.21 1.1 1 0.50 35 I035Q 0.79 0.87 1.24 0.75 0.63 35 I035R 0.37 0.05 1.00 0.77 0.18 35 I035S 0.77 2.18 1.18 0.58 0.91 35 I035Y 0.61 0.05 0.05 ND 0.05 36 S036A 1.48 0.91 0.76 1.02 1.88 36 S036C 0.69 0.05 1.54 0.88 0.79 36 S036E 1.10 0.82 1.09 1.16 1.30 36 S036F 0.82 5.10 1.34 0.26 0.74 36 S036G 1.26 0.75 0.86 0.73 1.51 36 S036H 1.52 0.69 0.79 0.79 1.51 36 S036I 1.13 1.06 1.08 0.57 1.30 36 S036L 1.02 1.08 1.19 0.05 0.90 36 S036M 1.40 0.71 0.83 0.68 1.56 36 S036N 1.47 0.84 0.81 0.26 1.73 36 S036P 0.43 0.05 2.03 0.07 0.12 36 S036O 1.27 0.94 0.68 0.42 1.69 36 S036R 1.12 1.00 0.75 0.46 1.32 36 S036T 1.35 0.87 0.78 0.83 1.63 36 S036V 1.31 0.82 1.03 0.80 1.56 36 S036W 0.78 17.10 1.29 0.21 0.68 36 S036Y 1.27 0.53 0.92 0.29 0.86 38 T038C 1.34 0.92 0.99 1.01 1.60 38 T038F 1.57 0.78 0.75 0.91 1.81 38 T038G 0.98 1.17 1.09 0.78 1.27 38 T038H 1.51 0.88 0.80 0.90 1.82 38 T038I 1.42 0.90 0.86 1.09 1.71 38 T038K 1.86 0.77 0.55 1.10 2.20 38 T038L 1.47 0.87 0.83 1.08 1.75 38 T038M 0.94 1.64 1.13 0.94 1.17 38 T038N 1.44 0.89 0.79 0.91 1.75 38 T038Q 1.69 0.75 0.68 0.92 1.87 38 T038R 1.80 0.70 0.51 1.22 2.04 38 T038V 1.04 1.37 1.04 1.02 1.31 38 T038W 0.72 0.05 1.41 0.99 0.91 38 T038Y 1.26 1.09 0.77 0.80 1.59 39 H039A 0.37 0.05 1.72 0.05 0.47 39 H039D 0.14 0.05 0.05 ND 0.05 39 H039E 0.63 0.05 1.58 0.05 0.95 39 H039F 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 39 H039G 0.17 0.05 1.32 0.05 0.09 39 H039K 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 39 H039L 0.14 0.05 0.98 0.05 0.07 39 H039M 0.15 0.05 0.86 0.05 0.07 39 H039N 0.36 0.05 1.66 0.05 0.34 39 H039P 0.17 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') PI TCA CS-38 32°C AAPF 39 H039O 0.45 0.05 1.53 0.05 0.52 39 H039R 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 39 H039S 0.40 0.05 1.58 0.05 0.46 39 H039T 0.13 0.05 2.04 0.05 0.10 39 H039V 0.91 1.70 1.08 0.05 1.17 39 I1039W 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 39 H039Y 0.33 0.05 2.16 0.05 0.42 40 P040A 1.67 1.03 0.83 0.83 2.20 40 P040C 0.89 2.43 1.68 0.79 1.49 40 P040D 1.03 1.34 1.35 1.12 1.51 40 P040E 0.92 1.93 1.44 1.67 1.40 40 P040G 1.21 1.61 1.10 0.06 1.96 40 P040H 1.51 1.14 0.95 0.22 2.04 40 P040I 1.32 1.25 0.99 1.01 1.81 40 P040K 1.51 1.24 0.75 0.05 2.02 40 P040L 1.26 1.21 1.11 1.04 1.85 40 P040M 1.34 1.20 1.09 0.62 1.65 40 P040N 1.71 1.02 0.86 0.59 2.21 40 P040R 1.48 1.15 0.74 0.05 2.20 40 P040S 1.34 1.32 1.00 0.27 2.08 40 P040T 1.42 1.23 0.90 0.18 2.02 40 P040V 1.29 1.23 1.02 1.06 1.70 40 P040W 1.14 1.41 0.96 0.55 1.65 40 P040Y 0.96 1.80 1.14 0.27 1.40 41 D041A 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 41 D041C 0.17 0.05 1.65 0.05 0.17 41 D041E 1.11 1.19 0.99 0.05 1.29 41 D041F 0.18 0.05 0.05 ND 0.05 41 D041G 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 41 D041I 0.15 0.05 0.05 ND 0.05 41 D041K 0.13 0.05 0.05 ND 0.05 41 D041L 0.15 0.05 0.05 ND 0.05 41 D041M 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 41 D041N 0.20 0.05 1.47 0.05 0.17 41 D041P 0.41 0.05 0.88 ND 0.05 41 D041Q 0.19 0.05 2.38 0.05 0.21 41 D041R 0.12 0.05 0.05 ND 0.05 41 D041S 0.16 0.05 0.90 0.05 0.10 41 D041T 0.14 0.05 0.05 0.05 0.08 41 D041V 0.14 0.05 0.05 ND 0.05 41 D041W 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 41 D041Y 0.16 0.05 0.05 ND 0.05 42 L042A 0.63 0.05 1.60 0.05 0.61 42 L042C 0.82 1.99 1.29 0.11 1.08 42 L042D 0.33 0.05 0.05 ND 0.05 42 L042E 0.27 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo ???') BPN') PI TCA CS-38 32°C AAPF 42 L042F 0.79 2.39 1.48 0.05 0.91 42 L042G 0.30 0.05 1.64 0.05 0.24 42 L042H 1.31 0.79 0.94 0.10 1.35 42 L042I 1.56 0.96 0.76 0.63 2.08 42 L042K 0.19 0.05 0.05 0.05 0.07 42 L042M 1.77 0.89 0.66 0.78 2.27 42 L042N 1.20 0.92 1.15 0.14 1.50 42 L042P 0.57 0.05 0.05 ND 0.05 42 L042Q 0.39 0.05 2.03 0.05 0.38 42 L042 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 42 L042S 0.40 0.05 2.19 0.06 0.47 42 L042T 0.84 2.22 1.18 0.10 1.10 42 L042V 1.39 0.87 0.83 0.34 1.74 42 L042Y 0.39 0.05 2.41 0.05 0.45 43 N043A 1.28 1.01 0.97 1.12 1.71 43 N043C 0.92 1.43 1.38 1.29 1.21 43 N043D 0.98 0.85 1.27 1.29 1.25 43 N043E 1.05 0.94 1.43 1.39 1.34 43 N043F 0.97 1.26 1.23 1.00 1.45 43 N043G 1.64 0.56 0.75 1.12 2.06 43 N043I 1.69 0.82 0.87 0.91 1.92 43 N043L 1.39 0.81 0.97 0.94 1.77 43 N043M 1.70 0.83 0.80 1.16 1.96 43 N043P 1.46 0.82 0.74 0.05 1.78 43 N043R 1.47 0.78 0.64 1.84 1.67 43 N043S 1.79 0.86 0.79 1.07 2.36 43 N043T 1.52 1.03 0.87 1.09 1.90 43 N043V 1.52 0.79 0.90 0.77 1.75 43 N043W 1.25 0.85 1.06 0.98 1.62 43 N043Y 1.35 0.86 0.96 1.06 1.67 44 I044A 1.24 0.94 0.93 1.01 1.29 44 I044C 1.52 0.89 0.80 0.86 1.77 44 I044D 1.48 0.77 0.93 1.07 1.76 44 I044F 1.37 0.79 0.98 1.22 1.00 44 I044G 1.51 0.77 0.75 1.19 1.54 44 I044K 1.29 0.98 0.76 1.49 1.48 44 I044L 1.47 0.77 0.92 1.00 1.67 44 I044M 0.95 1.83 1.14 0.95 1.25 44 I044N 1.49 0.77 0.74 0.99 1.68 44 I044P 1.26 0.93 0.91 0.76 1.61 44 I044Q 1.23 0.91 0.93 0.91 1.41 44 I044R 1.05 1.08 0.76 1.57 1.04 44 I044S 1.56 0.79 0.80 1.08 1.56 44 I044T 1.07 1.06 1.13 0.93 1.38 44 I044V 1.28 1.22 0.88 0.90 1.71 44 I044W 1.01 0.52 1.24 0.74 0.12 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 44 I044Y 1.18 0.98 1.05 0.81 1.25 45 R045A 1.27 1.02 1.13 1.06 1.50 45 R045D 1.26 0.91 1.15 1.32 1.51 45 R045E 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 45 R045F 1.35 0.87 1.11 1.21 1.39 45 R045G 1.23 1.00 1.04 1.04 1.36 45 R045H 1.28 1.01 1.06 1.19 1.35 45 R045I 1.40 0.79 0.93 1.22 1.37 45 R045K 1.27 0.91 1.03 1.02 1.49 45 R045L 1.37 0.85 1.02 1.12 1.40 45 R045M 1.44 0.90 0.99 1.19 1.39 45 R045N ° 1.32 0.95 1.09 1.16 1.44 45 R045P 0.88 0.88 1.11 1.15 0.99 45 R045O 1.35 1.08 0.93 1.08 1.55 45 R045S 1.28 1.04 1.07 1.10 1.63 45 R045T 1.32 0.96 1.07 1.20 1.40 45 R045V 1.32 0.85 1.09 1.06 1.39 45 R045W 1.30 0.94 1.00 1.04 1.40 45 R045Y 1.22 0.86 1.11 0.97 1.24 46 G046C 0.99 0.75 1.33 1.23 0.84 46 G046D 1.20 0.90 1.15 1.05 1.48 46 G046E 1.24 0.89 1.22 1.11 1.33 46 G046F 0.59 0.05 1.45 1.05 0.54 46 G046H 1.10 0.72 1.17 1.13 1.18 46 G046I 1.03 0.97 1.00 1.29 0.98 46 G046K 1.57 0.79 0.70 1.19 1.53 46 G046L 0.83 1.97 1.27 1.17 0.78 46 G046M 0.95 1.29 1.34 1.09 0.96 46 G046N 1.10 0.85 1.11 1.03 1.30 46 G046P 1.24 0.72 0.82 1.22 1.20 46 G046Q 1.08 0.99 1.08 1.04 1.18 46 G046R 1.19 0.92 0.83 1.27 1.35 46 G046S 1.45 0.84 1.00 1.08 1.50 46 G046T 1.26 0.89 1.01 1.03 1.33 46 G046V 1.20 0.86 1.13 1.05 1.17 46 G046W 0.79 25.56 0.96 0.90 0.71 47 G047A 0.89 1.76 1.1 1 0.76 0.94 47 G047C 0.58 6.57 1.19 0.61 0.45 47 G047E 0.69 1.91 1.54 0.60 0.55 47 G047F 0.92 0.87 1.15 0.59 0.79 47 G047H 0.35 0.05 1.10 0.77 0.26 47 G047K 0.61 5.82 0.96 0.57 0.54 47 G047L 0.46 0.05 1.21 0.50 0.34 47 G047M 0.62 1.38 1.09 0.54 0.44 47 G047N 0.83 0.97 1.24 0.61 0.75 47 G047P 0.20 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') PI TCA CS-38 32°C AAPF 47 G047Q 0.73 1.13 1.34 0.44 0.76 47 G047R 1.07 1.13 0.94 0.99 1.04 47 G047S 1.02 1.06 1.13 0.71 1.03 47 G047T 0.80 0.76 1.27 0.57 0.57 47 G047W 1.07 0.80 1.16 0.48 0.85 48 A048C 1.16 0.93 1.19 1.01 1.45 48 A048E 1.25 0.86 1.17 1.01 1.45 48 A048F 1.07 1.15 1.34 1.06 1.23 48 A048G 0.27 0.05 1.01 1.12 0.11 48 A048H 1.41 0.94 1.01 0.97 1.63 48 A048I 1.28 0.93 1.07 1.16 1.25 48 A048K 1.51 1.00 0.88 1.14 1.59 48 A048L 1.29 0.89 1.02 1.09 1.37 48 A048M 1.31 1.11 1.05 1.03 1.52 48 A048N 1.24 0.99 1.09 1.08 1.40 48 A048P 1.11 0.77 1.22 0.96 0.98 48 A048Q 1.32 1.15 0.99 1.05 1.55 48 A048R 1.38 1.00 0.86 1.12 1.74 48 A048S 1.26 1.08 1.13 0.94 1.51 48 A048T 1.51 0.85 1.02 1.14 1.46 48 A048V 1.09 0.84 1.11 0.97 1.05 48 A048Y 1.33 0.96 0.84 1.05 1.47 49 S049A 0.96 1.28 1.19 1.02 0.99 49 S049E 0.70 0.05 2.15 0.16 0.35 49 S049F 0.74 0.05 1.26 1.05 0.59 49 S049G 0.90 1.12 1.35 0.81 0.78 49 S049H 1.09 0.42 0.91 0.92 0.94 49 S049K 0.74 0.05 1.39 0.57 0.49 49 S049L 0.59 0.05 1.38 1.12 0.35 49 S049M 0.51 0.05 1.52 0.99 0.26 49 S049P 0.39 0.05 2.01 0.86 0.32 49 S049O 0.70 0.05 1.48 0.62 0.39 49 S049R 0.80 3.76 1.45 0.70 0.65 49 S049T 0.93 1.81 1.16 0.94 1.23 50 F050C 0.79 1.24 1.29 1.11 0.79 50 F050D 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 50 F050G 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 50 F050H 1.04 1.03 1.16 1.23 0.92 50 F050I 0.81 1.27 1.16 1.12 0.67 50 F050L 1.13 1.12 0.99 1.21 1.07 50 F050N 0.24 0.05 1.10 0.99 0.14 50 F050P 0.32 0.05 0.05 ND 0.05 50 F050T 1.24 1.01 1.04 1.13 1.07 50 F050V 1.33 0.96 1.02 1.13 1.01 50 F050Y 1.12 0.95 1.01 1.14 1.10 51 V051F 1.45 0.82 0.84 0.94 1.15 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo ¡Vlicromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 51 V051G 0.61 0.05 1.58 0.89 0.40 51 V051H 1.27 0.98 0.93 1.06 1.36 51 V051 K 0.92 0.68 1.03 0.93 1.35 51 V051L 1.55 0.83 1.12 0.93 1.28 51 V051N 0.96 0.91 1.11 0.80 0.75 51 V051P 0.34 0.05 2.34 0.81 0.13 51 V051R 1.07 0.73 1.05 1.03 1.33 51 V051S 0.96 1.31 1.44 0.98 0.89 51 V051T 1.49 0.84 0.83 0.98 1.53 51 V051W 1.20 1.00 1.07 0.93 0.46 52 P052A 1.23 1.36 1.08 0.94 1.45 52 P052C 0.82 1.43 1.11 0.95 0.91 52 P052E 1.06 1.20 1.21 1.04 1.21 52 P052F 0.92 1.79 1.11 0.88 1.36 52 P052G 0.95 1.72 1.08 0.93 1.24 52 P052H 1.11 1.30 0.98 1.05 1.36 52 P052I 1.00 1.45 1.01 1.02 1.36 52 P052L 1.07 1.31 0.98 0.99 1.32 52 P052M 0.80 2.68 1.11 1.06 1.04 52 P052N 1.21 1.14 1.07 1.05 1.39 52 P052Q 1.15 1.36 1.08 1.00 1.55 52 P052R 1.12 1.28 0.85 0.96 1.61 52 P052T 1.07 1.51 1.18 0.99 1.34 52 P052V 1.00 1.66 1.10 1.03 1.25 52 P052W 1.00 1.74 0.89 0.94 1.31 52 P052Y 1.04 1.52 1.01 0.99 1.30 53 G053A 1.44 0.91 1.06 0.91 1.38 53 G053C 0.88 0.75 1.37 0.96 0.85 53 G053D 1.19 1.13 1.27 1.05 1.05 53 G053E 1.20 0.79 1.28 1.01 1.04 53 G053H 1.25 1.11 0.86 1.00 1.35 53 G053I 1.43 0.18 0.88 0.45 0.34 53 G053K 1.35 0.95 0.94 0.93 1.77 53 G053L 1.16 0.87 1.08 0.95 1.10 53 G053M 1.38 0.92 1.05 0.92 1.41 53 G053P 0.92 0.83 1.23 0.35 0.59 53 G053Q 1.34 0.96 1.06 0.89 1.54 53 G053R 1.37 0.82 0.86 1.00 1.69 53 G053S 1.55 0.88 0.89 0.99 1.52 53 G053T 1.36 0.84 0.97 0.98 1.36 53 G053V 0.99 0.81 1.18 0.46 0.74 53 G053W 1.28 0.97 0.88 0.92 1.10 53 G053Y 1.20 0.87 0.95 0.83 1.23 54 E054A 1.04 1.08 0.89 0.90 1.08 54 E054C 0.83 0.97 1.36 1.00 0.71 54 E054D 1.25 0.95 0.95 1.10 1.54 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra |)1I 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 54 E054F 1.34 1.00 0.93 0.85 1.03 54 E054G 0.77 1.94 1.20 0.56 0.58 54 E054H 1.04 0.90 0.96 0.95 0.99 54 E054I 1.25 0.67 1.07 0.77 0.86 54 E054K 1.09 0.91 0.89 0.79 0.89 54 E054L 1.13 0.75 0.95 0.71 0.79 54 E054M 0.98 1.04 1.03 0.85 0.91 54 E054N 1.08 0.88 1.07 1.00 1.07 54 E054P 1.28 0.73 1.00 0.80 0.97 54 E054Q 1.41 0.75 0.87 1.02 1.74 54 E054R 1.09 0.65 0.79 0.44 0.81 54 E054S 1.41 0.92 0.85 0.91 1.33 54 E054V 1.10 0.73 0.91 0.80 1.16 54 E054W 0.91 0.72 0.99 0.50 0.63 54 E054Y 1.25 0.69 0.78 0.65 1.00 55 P055A 0.22 0.05 1.71 1.11 0.08 55 P055C 1.07 0.65 1.16 1.01 1.27 55 P055E 1.22 0.92 0.99 1.09 1.37 55 P055F 1.04 0.85 1.34 0.38 0.76 55 P055G 1.23 1.20 0.95 0.99 1.56 55 P055H 1.22 1.42 1.10 1.06 1.38 55 P055I 1.30 0.84 0.90 0.71 1.20 55 P055K 1.41 1.09 0.85 1.01 1.65 55 P055L 1.16 0.87 1.16 0.87 1.28 55 P055M 1.34 0.90 1.10 0.74 1.27 55 P055N 1.41 0.77 0.88 0.05 1.61 55 P055Q 1.31 0.82 0.85 0.85 1.24 55 P055R 2.15 0.49 0.59 ND 0.05 55 P055S 1.32 1.08 1.03 0.99 1.45 55 P055T 1.12 0.99 1.07 1.03 1.27 55 P055V 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 55 P055W 1.20 0.84 1.07 0.80 1.22 55 P055Y 0.92 0.60 1.38 0.39 0.70 56 S056A 0.86 1.76 1.19 1.05 0.93 56 S056C 1.10 1.01 1.08 0.97 1.28 56 S056D 1.20 0.99 1.12 1.20 1.26 56 S056E 1.08 0.98 1.10 0.98 1.30 56 S056F 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 56 S056G 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 56 S056H 1.06 1.12 1.02 1.13 1.06 56 S056L 1.14 0.81 1.03 0.94 1.33 56 S056M 1.05 1.62 0.89 1.09 0.16 56 S056N 1.14 1.11 1.08 1.09 1.25 56 S056P 1.19 0.99 1.11 0.99 1.02 56 S056Q 1.18 0.81 1.03 0.85 1.38 56 S056R 1.99 0.48 0.57 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 56 S056T 0.80 6.42 1.22 0.89 1.01 56 S056V 1.15 0.40 0.71 ND 0.05 57 T057A 1.08 1.18 1.11 0.59 1.38 57 T057C 0.84 1.28 1.35 1.00 1.00 57 T057E 1.35 1.14 1.04 0.97 1.65 57 T057F 0.92 1.13 1.26 0.95 1.21 57 T057G 1.10 1.17 1.08 0.85 1.12 57 T057H 1.38 0.99 1.05 1.07 1.65 57 T057I 1.47 0.92 0.90 0.96 1.72 57 T057K 1.08 1.03 1.05 0.41 1.05 57 T057L 1.52 0.95 0.96 1.07 1.50 57 T057M 1.19 1.09 0.97 0.91 1.30 57 T057N 1.45 0.86 1.00 0.96 1.63 57 T057P 1.36 0.88 0.93 1.03 1.73 57 T057Q 1.31 0.92 0.95 0.90 1.38 57 T057R 1.34 0.90 0.96 1.18 1.44 57 T057S 0.99 1.36 1.17 1.07 1.20 57 T057V 1.39 0.90 0.91 0.91 1.60 57 T057W 1.65 0.85 0.85 1.11 1.91 57 T057Y 1.38 0.97 0.86 0.95 1.22 59 O059A 1.02 1.03 1.11 0.86 1.30 59 Q059C 0.74 1.68 1.23 0.94 0.86 59 Q059D 0.82 1.66 1.32 0.96 0.92 59 Q059E 0.79 1.41 1.48 1.14 0.97 59 Q059F 1.13 0.97 1.08 0.77 1.25 59 Q059G 1.42 0.83 0.79 0.88 1.68 59 Q059I 1.50 0.92 0.85 0.88 1.66 59 Q059K 0.67 0.94 0.05 ND 0.05 59 Q059L 1.40 0.95 0.96 0.92 1.45 59 Q059M 1.45 0.96 1.05 0.82 1.62 59 Q059N 1.43 0.97 0.95 0.96 1.67 59 Q059P 1.49 0.89 1.04 0.80 1.47 59 Q059R 1.38 0.93 0.77 1.16 1.62 59 Q059S 1.39 0.96 0.97 0.96 1.66 59 O059T 1.49 0.88 0.93 0.86 1.66 59 O059V 1.65 0.81 0.92 0.86 1.61 59 Q059W 1.45 0.86 0.89 0.90 1.43 59 Q059Y 1.44 0.88 1.00 0.78 1.67 60 D060A 0.74 2.20 1.25 0.05 0.28 60 D060C 0.63 1.07 1.42 0.16 0.17 60 D060E 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 60 D060F 0.68 1.06 1.07 0.06 0.20 60 D060G 0.65 3.32 1.34 0.08 0.23 60 D060K 0.47 0.05 1.15 0.05 0.14 60 D060L 0.64 2.31 1.23 0.07 0.21 60 D060M 0.68 3.41 1.32 0.05 0.22 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') PI S-38 32°C TCA C AAPF 60 D060N 0.58 0.05 1.51 0.09 0.27 60 D060P 0.75 1.46 1.12 0.08 0.25 60 D060Q 0.59 0.05 1.24 0.05 0.23 60 D060R 0.35 0.05 0.66 0.12 0.06 60 D060S 0.86 1.19 1.26 0.05 0.39 60 D060T 0.52 0.05 1.42 0.05 0.24 60 D060V 0.83 0.65 1.10 0.06 0.28 60 D060W 0.59 0.05 1.04 0.05 0.28 60 D060Y 0.66 1.77 1.33 0.07 0.21 61 G061A 1.42 0.99 0.98 1.02 1.69 61 G061C 1.14 0.88 1.07 0.97 1.52 61 G061D 1.48 0.90 1.00 1.13 1.74 61 G061F 1.45 0.98 0.91 1.01 1.87 61 G061H 1.39 0.89 0.77 1.08 1.74 61 G061I 1.42 0.97 0.91 1.08 2.06 61 G061L 1.33 0.97 0.99 1.07 1.43 61 G061M 1.44 0.87 1.01 1.08 1.79 61 G061N 1.48 0.91 0.86 1.03 1.79 61 G061P 1.23 0.80 0.89 1.02 1.67 61 G061R 1.58 0.84 0.69 1.00 1.81 61 G061S 0.97 1.42 1.06 1.05 1.31 61 G061T 0.88 1.51 1.14 1.09 1.45 61 G061V 0.90 1.35 1.07 1.02 1.48 61 G061Y 0.92 1.06 1.02 0.95 1.12 62 N062C 1.51 0.94 1.02 1.09 1.25 62 N062E 1.79 1.01 1.09 1.10 1.54 62 N062F 0.90 1.18 1.16 0.89 1.00 62 N062G 1.38 1.06 1.08 0.62 0.82 62 N062H 1.14 1.21 1.21 1.07 1.26 62 N062I 1.70 0.98 0.99 1.01 1.26 62 N062K 1.94 0.90 0.73 0.98 1.21 62 N062L 1.10 1.54 1.04 0.92 1.92 62 N062M 1.30 1.08 1.06 0.98 2.03 62 N062P 1.20 1.04 1.19 0.59 0.65 62 N062Q 1.46 1.22 1.10 0.93 1.68 62 N062R 1.90 1.05 0.73 0.95 0.94 62 N062S 1.17 1.46 1.17 0.90 1.64 62 N062T 2.21 0.84 0.89 0.94 3.23 62 N062V 1.73 1.03 1.03 1.05 1.30 62 N062Y 1.31 0.96 1.05 0.73 1.30 63 G063A 1.20 1.06 1.28 0.33 1.37 63 G063C 0.91 0.58 1.35 0.39 0.80 63 G063D 0.89 0.80 1.33 0.24 0.79 63 G063E 1.23 0.84 1.30 0.43 1.00 63 G063F 0.90 1.01 1.11 0.05 0.60 63 G063H 1.10 0.77 1.21 0.11 0.95 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 63 G063I 0.44 0.05 1.44 0.05 0.46 63 G063K 1.22 0.80 0.83 0.05 1.59 63 G063M 0.87 1.11 1.28 0.05 0.88 63 G063P 0.44 0.05 1.46 0.05 0.22 63 G063Q 1.07 1.06 1:14 0.07 0.99 63 G063R 1.07 0.98 0.87 0.05 1.28 63 G063S 1.19 0.90 1.21 0.31 1.31 63 G063T 0.66 3.06 1.49 0.09 0.62 63 G063V 0.50 0.05 1.46 0.05 0.53 63 G063W 1.37 0.81 0.87 0.05 2.28 64 H064D 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064E 0.56 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064F 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064G 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064I 0.55 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064K 0.53 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064L 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064M 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064N 0.61 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064Q 0.77 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064R 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064S 0.55 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064T 0.53 0.05 0.05 ND 0.05 64 H064W 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 65 G065C 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 65 G065F 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 65 G065H 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 65 G065K 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 65 G065L 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 65 G065M 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 65 G065N 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 65 G065R 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 65 G065T 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 65 G065W 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 66 T066A 0.25 0.05 1.76 0.09 0.06 66 T066C 0.34 0.05 2.11 0.28 0.17 66 T066D 0.28 0.05 1.69 0.12 0.09 66 T066E 0.25 0.05 1.79 ND 0.05 66 T066F 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 66 T066I 0.23 0.05 2.39 0.13 0.09 66 T066K 0.17 0.05 2.46 1.03 0.12 66 T066L 0.23 0.05 1.85 0.05 0.08 66 T066N 0.21 0.05 1.28 0.05 0.09 66 T066Q 0.22 0.05 2.31 0.05 0.13 66 T066R 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 66 T066S 1.07 1.11 1.13 0.66 1.13 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 66 T066W 0.32 0.05 0.05 ND 0.05 66 T066Y 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 67 H067A 1.47 0.56 0.49 0.59 0.30 67 H067C 1.24 0.73 0.59 0.07 0.22 67 H067D 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 67 H067E 0.54 0.05 0.58 ND 0.05 67 H067F 0.38 0.05 1.73 0.05 0.15 67 H067G 0.65 0.05 0.79 ND 0.05 67 H067I 0.67 0.05 0.70 ND 0.05 67 H067L 1.71 0.40 0.32 0.37 0.08 67 H067M 1.82 0.39 0.40 0.77 0.12 67 H067N 0.40 0.05 1.12 0.05 0.10 67 H067P 1.85 0.43 0.43 0.25 0.37 67 H067Q 1.83 0.43 0.34 0.28 0.11 67 I I067R 1.59 0.34 0.21 ND 0.05 67 H067S 1.54 0.58 0.54 0.46 0.32 67 H067T 1.20 0.84 0.61 0.05 0.20 67 H067V 0.54 0.05 1.15 ND 0.05 67 H067W 0.18 0.05 0.05 ND 0.05 68 V068A 1.55 0.72 0.78 0.38 0.33 68 V068C 0.59 0.05 1.87 0.63 0.66 68 V068D 0.25 0.05 1.71 ND 0.05 68 V068E 1.22 0.34 0.87 ND 0.05 68 V068F 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 68 V068G 0.64 0.05 1.55 ND 0.05 68 V068H 1.41 0.05 0.05 ND 0.05 68 V068I 1.23 0.91 1.07 0.96 0.75 68 V068K 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 68 V068L 1.37 0.62 0.88 0.87 0.18 68 V068M 1.26 0.68 0.74 0.27 0.08 68 V068N 1.77 0.28 0.71 ND 0.05 68 V068P 0.33 0.05 0.05 ND 0.05 68 V068Q 2.13 0.16 0.38 ND 0.05 68 V068R 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 68 V068S 1.80 0.57 0.71 0.27 0.11 68 V068T 1.10 1.05 1.06 0.30 0.56 68 V068W 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 68 V068Y 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 69 A069C 0.49 0.05 1.48 0.59 0.29 69 A069D 0.33 0.05 0.05 ND 0.05 69 A069E 0.28 0.05 1.24 0.87 0.32 69 A069F 0.29 0.05 1.25 0.22 0.16 69 A069G 0.99 1.22 1.09 0.86 1.12 69 A069I 0.23 0.05 1.48 0.25 0.07 69 A069K 0.20 0.05 0.05 ND 0.05 69 A069L 0.19 1 0.05 1.33 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 69 A069M 0.54 0.05 1.49 ND 0.05 69 A069N 0.51 0.05 1.24 0.98 0.54 69 A069P 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 69 A069O 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 69 A069R 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 69 A069S 1.10 1.13 1.08 0.90 1.21 69 A069T 0.91 1.06 1.14 1.00 0.97 69 A069V 0.40 0.05 1.40 0.67 0.46 69 A069W 0.51 0.05 1.32 0.48 0.35 69 A069Y 0.19 0.05 0.76 0.05 0.08 70 G070C 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 70 G070D 0.33 0.05 0.05 ND 0.05 70 C.070E 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 70 G070I 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 70 G070K 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 70 G070N 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 70 G070P 0.50 0.05 0.05 ND 0.05 70 G070Q 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 70 G070R 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 70 G070S 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 70 G070V 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 70 G070Y 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 71 T071A 1.03 1.43 1.21 0.05 0.91 71 T071 C 0.66 2.03 1.65 0.05 0.64 71 T071D 0.18 0.05 1.17 ND 0.05 71 T071E 0.13 0.05 1.15 0.05 0.06 71 T071F 0.18 0.05 0.05 ND 0.05 71 T071G 0.63 0.05 1.58 0.06 0.59 71 T071H 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 71 ??71? 1.11 1.26 0.97 0.72 1.05 71 T071 0.15 0.05 0.05 ND 0.05 71 T071L 0.67 1.13 1.04 0.12 0.52 71 T071M 0.30 0.05 2.00 0.05 0.20 71 T071N 0.95 1.75 1.20 0.05 1.44 71 T071P 0.57 0.05 1.59 0.05 0.67 71 T071R 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 71 T071S 0.74 5.02 1.36 0.71 0.89 71 T071V 1.11 1.17 1.03 0.57 0.88 71 T071W 0.26 0.05 1.88 0.60 0.18 71 T071Y 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 72 I072C 0.76 1.96 1.21 0.93 0.80 72 I072D 0.27 0.05 0.05 ND 0.05 72 I072E 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 72 I072F 1.17 1.17 0.84 0.72 1.23 72 I072G 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 72 I072H 0.34 0.05 1.26 0.74 0.28 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') PI TCA CS-38 32°C AAPF 72 I072K 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 72 I072L 1.48 0.89 0.87 0.98 1.24 72 I072M 1.03 1.41 1.01 0.80 1.05 72 I072N 0.33 0.05 1.29 0.71 0.26 72 I072Q 0.38 0.05 1.23 0.77 0.32 72 I072R 0.48 0.05 0.27 ND 0.05 72 I072S 0.69 1.71 1.19 0.73 0.78 72 I072T 1.38 1.02 0.94 0.95 1.09 72 I072V 1.19 1.07 1.10 1.12 1.24 72 I072W 0.26 0.05 1.17 0.47 0.18 73 A073C 1.00 1.51 1.02 0.81 1.30 73 A073D 0.88 1.50 1.13 0.32 1.03 73 ?073? 1.09 1.17 1.03 0.42 1.33 73 A073H 0.90 1.30 1.18 0.26 1.23 73 A073I 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 73 ?073? 0.97 1.11 0.85 0.24 1.09 73 A073L 1.02 1.04 1.12 0.48 1.10 73 A073M 0.55 0.05 0.05 ND 0.05 73 ?073? 1.27 1.08 0.93 0.23 1.39 73 A073R 0.18 0.05 3.24 0.20 0.21 73 A073S 0.97 1.18 1.17 1.02 1.1 1 73 A073T 1.27 1.10 0.87 0.74 1.55 73 A073V 1.16 1.09 1.06 0.63 1.49 73 A073W 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074C 1.12 1.08 0.98 0.05 1.44 74 A074D 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074E 0.59 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074F 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074I 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074L 0.33 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074M 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074N 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074P 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074Q 0.53 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074R 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074S 1.15 1.10 1.03 0.07 1.24 74 A074T 0.47 0.05 1.10 0.05 0.59 74 A074V 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 74 A074W 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 75 L075A 0.88 2.41 1.23 0.05 1.25 75 L075C 0.52 0.05 1.50 0.32 0.83 75 L075D 0.77 3.90 1.71 0.05 1.23 75 L075E 0.77 4.37 1.70 0.05 1.10 75 L075F 0.72 3.86 1.47 0.05 1.02 75 L075G 0.72 4.00 1.53 0.05 0.40 75 L075H 0.82 2.72 1.31 0.05 0.98 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') PI TCA CS-38 32°C AAPF 75 L075I 1.12 1.13 1.19 0.11 1.43 75 L075M 1.01 1.50 1.24 0.09 1.36 75 L075N 1.04 1.52 1.08 0.05 1.52 75 L075P 0.80 2.62 1.31 0.05 1.34 75 L075Q 1.03 1.65 1.22 0.05 1.40 75 L075R 0.94 1.94 1.15 0.05 1.32 75 L075S 0.89 2.48 1.35 0.05 1.29 75 L075T 0.68 1.17 1.43 0.05 1.11 75 L075V 0.99 1.56 1.28 0.05 1.34 75 L075W 0.55 0.05 1.73 0.05 0.84 76 N076C 0.60 1.56 1.15 0.07 0.74 76 N076D 1.43 1.03 0.99 1.19 1.64 76 N076E 1.41 1.05 1.09 0.22 1.66 76 N076F 0.81 1.45 0.94 0.05 1.05 76 N076G 1.10 1.28 0.93 0.05 1.41 76 N076H 1.40 0.97 0.97 0.49 1.47 76 N076I 0.65 3.73 1.16 0.05 0.74 76 N076K 1.33 1.08 0.89 0.05 1.40 76 N076L 0.78 0.91 1.07 0.05 0.81 76 N076M 0.96 1.01 1.00 0.05 0.99 76 N076Q 1.62 0.87 0.96 0.12 1.70 76 N076R 1.30 0.97 0.72 0.05 1.27 76 N076S 1.29 0.97 0.87 0.05 1.36 76 N076T 1.07 0.92 1.04 0.05 1.08 76 N076W 1.09 1.15 0.91 0.05 1.22 76 N076Y 0.93 1.15 1.12 0.05 1.01 77 N077A 0.21 0.05 1.81 0.05 0.11 77 N077C 0.23 0.05 2.82 0.07 0.17 77 N077D 0.86 2.01 1.46 0.05 1.30 77 N077E 0.22 0.05 2.55 0.05 0.14 77 N077F 0.20 0.05 2.11 0.05 0.14 77 N077G 0.25 0.05 2.04 0.05 0.27 77 N077H 0.24 0.05 2.37 0.05 0.19 77 N077K 0.17 0.05 2.60 0.05 0.16 77 N077L 0.17 0.05 2.22 0.05 0.12 77 N077M 0.21 0.05 1.53 0.05 0.11 77 N077P 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 77 N077Q 0.24 0.05 2.70 0.05 0.37 77 N077R 0.20 0.05 1.43 0.05 0.16 77 N077S 0.44 0.05 2.06 0.05 0.56 77 N077T 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 77 N077V 0.15 0.05 2.33 0.05 0.12 77 N077Y 0.18 0.05 3.14 0.05 0.15 78 S078A 1.10 1.30 1.17 1.07 1.43 78 S078C 0.96 1.38 1.20 1.24 1.18 78 S078E 1.26 0.93 1.01 1.24 1.73 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 78 S078F 1.08 1.33 1.02 0.69 1.34 78 S078G 1.20 1.14 1.08 0.05 1.43 78 S078H 1.18 1.11 1.09 1.22 1.47 78 S078I 1.04 1.38 1.13 0.44 1.33 78 S078K 1.20 1.19 0.82 0.58 1.33 78 S078L 0.94 1.45 1.11 0.98 1.08 78 S078M 1.09 1.12 1.09 1.11 1.35 78 S078N 1.17 1.19 0.93 1.35 1.42 78 S078P 1.18 1.11 0.98 0.07 1.45 78 S078Q 1.18 1.05 0.91 1.14 1.46 78 S078R 1.21 1.10 0.75 0.74 1.53 78 S078T 0.87 1.81 1.64 1.31 1.09 78 S078V 0.89 1.68 1.26 0.63 1.10 78 S078W 0.70 8.50 1.31 0.33 0.91 78 S078Y 1.09 1.00 1.00 0.69 1.36 79 I079C 0.91 2.06 1.33 0.05 1.22 79 I079D 1.14 1.02 1.13 0.05 1.50 79 I079E 1.11 1.10 1.21 0.05 1.47 79 I079F 1.10 1.16 1.03 0.67 1.28 79 I079G 0.85 3.12 1.15 0.05 1.08 79 I079K 1.50 0.71 0.65 0.05 1.78 79 I079L 1.26 0.91 0.87 0.11 1.61 79 I079M 0.75 4.59 1.44 0.05 1.12 79 I079N 0.92 2.30 1.17 0.05 1.24 79 I079P 0.27 0.05 2.25 0.05 0.22 79 I079Q 1.46 0.73 0.75 0.05 1.81 79 I079R 1.19 0.96 0.83 0.05 1.48 79 I079S 0.82 6.60 1.28 0.05 1.15 79 I079T 0.85 3.62 1.42 0.05 1.28 79 I079V 1.02 1.34 0.93 0.05 1.38 79 I079W 1.05 1.20 1.07 0.12 1.32 79 I079Y 0.89 1.89 1.30 0.50 1.05 80 G080A 0.31 0.05 1.92 0.05 0.35 80 G080D 0.27 0.05 2.80 0.05 0.21 80 G080E 0.29 0.05 2.61 0.05 0.28 80 G080K 0.29 0.05 2.05 0.05 0.26 80 G080L 0.31 0.05 2.17 0.25 0.25 80 G080M 0.43 0.05 1.62 0.05 0.45 80 G080P 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 80 G080R 0.23 0.05 1.51 0.05 0.20 80 G080T 0.24 0.05 2.33 0.05 0.22 80 G080V 0.50 0.05 1.24 0.05 0.22 80 G080W 0.23 0.05 1.45 0.05 0.15 80 G080Y 0.66 0.05 1.33 0.05 0.73 81 V081A 0.75 2.80 1.45 0.05 0.86 81 V081C 0.86 3.09 1.28 0.05 1.01 Tabla 4-1 (cont). Valores del Indice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 81 V081D 0.12 0.05 1.46 0.07 0.06 81 V081E 0.29 0.05 2.85 0.05 0.30 81 V081F 1.21 0.94 0.86 0.05 0.66 81 V081G 0.90 2.53 1.23 0.05 0.54 81 V081H 1.22 0.90 1.01 0.05 0.55 81 V081I 1.44 0.69 0.73 0.05 1.22 81 V081K 0.76 0.99 1.11 0.05 0.79 81 V081 L 1.19 1.03 0.98 0.05 1.43 81 V081M 1.16 1.04 1.02 0.05 1.25 81 V081P 0.38 0.05 2.50 0.05 0.52 81 V081Q 0.82 2.73 1.11 0.05 0.84 81 V081R 0.73 0.05 1.12 0.05 0.67 81 V081S 0.90 3.07 1.11 0.05 0.65 81 V081T 1.13 1.06 0.95 0.18 0.73 81 V081W 0.38 0.05 1.98 0.05 0.24 81 V081Y 1.20 0.84 0.92 0.28 0.59 82 L082A 0.92 1.23 1.23 0.05 1.02 82 L082E 0.83 1.61 1.18 0.05 0.98 82 L082F 1.06 1.07 0.94 0.05 1.27 82 L082G 0.19 0.05 0.92 ND 0.05 82 L082H 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 82 L082 1.24 1.07 0.77 0.05 1.23 82 L082M 1.21 1.22 0.99 0.05 1.37 82 L082N 0.59 0.05 1.49 0.05 0.65 82 L082P 0.17 0.05 0.05 ND 0.05 82 L082Q 1.17 1.00 1.00 0.05 1.21 82 L082R 0.93 1.04 0.99 0.05 0.91 82 L082S 0.61 2.58 1.38 0.05 0.65 82 L082T 1.01 1.33 1.18 . 0.05 1.05 82 L082V 1.10 1.06 1.16 0.18 1.26 82 L082W 0.13 0.05 2.32 0.06 0.10 82 L082Y 0.92 1.45 1.32 0.05 0.94 83 C.083D 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 83 G083F 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 83 G083H 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 83 G083I 0.55 0.05 0.05 ND 0.05 83 G083L 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 83 G083N 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 83 G083P 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 83 G083R 0.27 0.05 0.05 ND 0.05 83 G083S 1.20 0.99 1.00 0.05 1.37 83 G083V 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 84 V084C 1.04 1.00 1.01 0.90 1.18 84 V084E 0.90 1.04 1.05 0.18 0.85 84 V084F 0.77 1.42 1.03 0.05 0.88 84 V084G 1.21 0.99 1.12 0.88 1.29 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pll 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 84 V084H 0.18 0.05 1.25 0.10 0.18 84 V084I 1.28 0.86 1.03 0.84 1.34 84 V084L 1.19 1.00 1.02 0.67 1.33 84 V084M 1.32 0.94 0.92 0.91 1.35 84 V084N 0.98 1.31 0.97 0.57 1.11 84 V084P 0.16 0.05 0.72 0.17 0.07 84 V084Q 0.45 0.05 1.35 0.05 0.52 84 V084R 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 84 V084S 0.23 0.05 0.80 0.74 0.14 84 V084T 1.06 1.16 1.01 0.76 1.20 84 V084W 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 84 V084Y 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 85 A085C 0.66 3.56 1.30 0.86 0.77 85 A085E 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 85 A085F 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 85 A085G 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 85 A085I 0.87 4.15 0.78 ND 0.05 85 A085L 0.22 0.05 1.08 0.08 0.16 85 A085M 0.20 0.05 0.05 ND 0.05 85 A085N 0.15 0.05 0.86 0.27 0.09 85 A085Q 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 85 A085R 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 85 A085W 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 86 P086A 1.02 0.91 1.09 0.74 1.14 86 P086C 1.01 0.96 1.01 1.00 1.03 86 P086D 0.62 3.78 1.39 1.23 0.74 86 P086E 0.68 1.77 1.27 0.84 0.86 86 P086G 0.89 1.22 1.13 0.07 1.06 86 P086I 0.68 1.55 1.07 0.15 0.71 86 P086L 0.50 0.05 1.23 0.05 0.63 86 P086M 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 86 P086R 0.22 0.05 0.83 0.05 0.22 86 P086S 1.00 1.31 1.01 0.79 1.19 86 P086V 0.80 1.35 1.07 0.09 0.95 86 P086W 0.89 1.44 1.02 0.57 1.17 86 P086Y 0.96 1.38 0.93 0.77 1.20 87 S087A 1.20 1.19 1.03 0.82 1.36 87 S087C 1.21 1.04 1.05 0.93 1.32 87 S087D 1.26 1.15 1.14 1.17 1.46 87 S087E 1.38 1.01 1.02 1.14 1.57 87 S087F 0.95 1.17 1.19 0.62 1.06 87 S087G 1.35 1.01 0.99 0.92 1.33 87 S087I 1.37 0.89 0.97 0.57 1.37 87 S087K 1.35 0.99 0.92 0.84 1.18 87 S087L 1.37 0.93 0.99 0.97 1.34 87 S087N 1.37 0.97 0.98 0.95 1.50 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numerario (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo 32°C PI n BPN') BPN') TCA CS-38 AAPF 87 S087P 0.22 0.05 1.01 0.60 0.17 87 S087T 1.33 1.01 1.00 0.79 1.39 87 S087V 1.40 0.96 1.00 0.96 1.44 87 S087Y 1.35 0.92 0.95 0.62 1.42 88 A088C 0.87 2.13 1.31 0.92 1.12 88 A088D 0.82 5.32 1.41 0.74 1.23 88 A088E 0.72 5.29 1.46 0.75 1.05 88 A088F 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 88 A088G 1.68 0.57 0.82 0.96 1.93 88 A088H 0.22 0.05 1.88 0.69 0.23 88 A088K 0.24 0.05 2.99 0.69 0.33 88 ?088? 0.48 0.05 1.97 0.78 0.59 88 A088Q 0.96 1.63 1.33 0.68 1.28 88 A088R 0.12 0.05 2.18 0.10 0.09 88 A088S 0.92 1.85 1.44 1.00 1.17 88 A088V 0.78 4.36 0.05 ND 0.05 88 A088W 0.23 0.05 2.85 0.93 0.26 88 A088Y 0.18 0.05 0.05 ND 0.05 89 E089A 0.91 1.97 1.09 0.85 1.15 89 E089C 0.79 3.65 1.19 1.00 0.96 89 E089D 1.06 1.19 1.07 1.00 1.37 89 E089F 0.63 0.05 1.27 0.92 0.89 89 E089G 1.01 1.64 1.04 0.90 1.41 89 E089H 1.02 1.50 1.00 0.97 1.31 89 E089I 0.92 1.36 1.09 0.97 1.13 89 E089L 0.66 0.05 1.10 1.03 0.78 89 E089M 0.27 0.05 0.05 ND 0.05 89 E089N 1.15 1.39 0.94 0.86 1.64 89 E089P 1.30 0.94 0.95 0.80 1.46 89 E089Q 1.30 1.11 0.89 0.96 1.47 89 E089R 0.92 1.81 0.87 1.13 1.21 89 E089S 1.12 1.33 1.06 0.86 1.51 89 E089T 0.90 1.82 1.02 0.89 1.08 89 E089V 0.78 3.34 1.14 0.93 0.86 89 E089W 0.93 1.35 1.07 0.99 1.03 90 L090A 0.97 1.08 0.98 0.75 1.25 90 L090C 0.81 0.98 1.06 0.97 0.90 90 L090D 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 90 L090E 0.41 0.05 1.38 0.79 0.47 90 L090F 0.84 1.16 1.27 0.48 0.95 90 L090G 0.43 0.05 1.27 0.82 0.52 90 L090I 1.31 0.91 0.97 1.21 1.31 90 L090K 0.30 0.05 1.08 0.82 0.28 90 L090M 1.51 0.98 0.86 1.01 1.72 90 L090P 0.40 0.05 1.15 0.74 0.36 90 L0900 1.09 0.93 0.91 0.97 1.25 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo 32°C PI BPN') BPN') TCA CS-38 AAPF 90 L090R 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 90 L090T 1.23 1.02 0.88 0.93 1.31 90 L090V 1.06 1.25 1.04 0.97 1.39 90 L090W 0.36 0.05 1.63 0.26 0.21 90 L090Y 0.72 1.79 1.22 0.49 0.89 91 Y091C 0.69 45.17 1.24 0.99 0.96 91 Y0 1D 1.09 1.12 1.07 0.94 ' 1.39 91 Y091F 1.07 1.23 1.13 0.92 1.49 91 Y091I 1.00 1.26 1.22 1.03 1.19 91 Y091K 0.22 0.05 1.32 1.14 0.14 91 Y091L 0.55 0.05 1.49 1.11 0.66 91 Y091M 0.74 6.69 1.32 1.01 0.97 91 Y091N 1.05 1.12 1.06 0.96 1.26 91 Y091P 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 91 Y091Q 0.32 0.05 1.84 0.96 0.39 91 Y091 R 0.24 0.05 1.29 1.03 0.20 91 Y091S 0.90 1.40 1.23 0.90 1.02 91 Y091T 0.68 1.72 1.19 0.92 0.86 91 Y091V 1.07 1.11 1.19 1.09 1.15 91 Y091W 1.10 1.15 1.04 1.03 1.25 92 A092C 0.54 0.05 1.75 0.31 0.37 92 A092D 1.17 0.83 1.31 0.44 0.48 92 A092E 0.60 0.05 1.91 0.08 ' 0.21 92 A092F 0.49 0.05 1.83 ND 0.05 92 A092G 1.07 1.23 1.28 0.94 1.27 92 A092H 0.21 0.05 2.34 ND 0.05 92 A092I 0.74 2.38 1.45 0.75 0.67 92 A092K 0.28 0.05 1.98 0.65 0.21 92 A092L 0.21 0.05 2.22 ND 0.05 92 A092N 1.02 1.05 1.12 0.62 0.89 92 A092P 1.52 0.70 1.10 1.12 1.46 92 A092Q 0.34 0.05 2.14 0.10 0.28 92 A092R 0.94 1.10 0.95 1.00 0.96 92 A092T 0.87 1.74 1.32 0.80 0.93 92 A092V 0.93 1.48 1.25 0.82 1.11 92 A092W 0.27 0.05 2.43 0.34 0.23 92 A092Y 0.35 0.05 2.14 0.46 0.25 93 V093A 0.97 1.22 1.06 0.89 0.87 93 V093C 1.03 1.17 1.08 1.02 1.02 93 V093D 0.26 0.05 0.87 1.00 0.11 93 V093F 0.20 0.05 0.60 1.09 0.10 93 V093G 0.95 1.00 1.15 0.92 0.87 93 V093H 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 93 V093K 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 93 V093L 1.26 0.89 1.00 1.11 1.38 93 V093M 0.91 0.74 1.06 1.00 0.85 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 93 V093N 0.22 0.05 0.57 1.09 0.09 93 V093P 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 93 V093R 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 93 V093S 0.34 0.05 1.42 0.99 0.24 93 V093T 1.45 0.82 0.91 1.05 1.22 93 V093W 0.31 0.05 0.83 ND 0.05 93 V093Y 0.33 0.05 1.41 1.11 0.29 94 K094A 0.30 0.05 1.53 0.25 0.07 94 K094D 0.36 0.05 1.33 ND 0.05 94 K094E 0.63 0.05 1.54 0.10 0.20 94 K094F 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 94 094G 0.27 0.05 1.83 ND 0.05 94 K094H 0.46 0.05 2.33 0.09 0.08 94 K094I 0.31 0.05 2.52 ND 0.05 94 K094L 0.24 0.05 1.48 ND 0.05 94 K094 0.25 0.05 2.47 0.35 0.07 94 K094N 1.01 0.97 1.21 0.77 0.39 94 K094P 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 94 K094Q 0.80 1.10 1.49 0.10 0.39 94 K094R 1.01 1.35 1.23 0.86 0.86 94 K094S 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 94 K094T 0.53 0.05 0.05 ND 0.05 94 K094V 0.55 0.05 1.77 0.14 0.23 94 K094W 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 94 K094Y 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 95 V095A 1.56 0.92 0.88 0.98 1.47 95 V095C 1.08 0.93 1.21 1.10 1.04 95 V095D 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 95 V095E 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 95 V095F 0.32 0.05 0.05 ND 0.05 95 V095G 0.44 0.05 1.23 1.07 0.40 95 V095H 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 95 V095I 1.21 1.33 1.19 0.98 0.37 95 V095K 0.46 0.05 1.64 0.95 0.33 95 V095L 0.35 0.05 1.80 ND 0.05 95 V095M 0.34 0.05 1.28 ND 0.05 95 V095P 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 95 V095Q 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 95 V095R 0.55 0.05 1.49 0.98 0.38 95 V095S 1.07 1.00 1.04 0.99 0.70 95 V095T 0.97 1.50 1.06 0.79 0.77 95 V095W 0.19 0.05 1.87 0.98 0.10 95 V095Y 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 96 L096A 1.93 0.78 0.72 ND 0.05 96 L096C 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 96 L096D 0.60 0.05 0.56 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo 32°C PI BPN') BPN') TCA Cív38 AAPF 96 L096E 1.41 0.14 1.06 ND 0.05 96 L096F 2.15 0.76 0.85 0.92 0.32 96 L096G 2.30 0.36 0.58 ND 0.05 96 L096H 2.15 0.53 0.85 ND 0.05 96 L096I 1.47 1.20 0.98 1.11 1.47 96 L096M 1.12 1.36 1.17 1.09 1.14 96 L096P 0.41 0.05 0.05 ND 0.05 96 L096Q 2.16 0.58 0.76 1.03 0.32 96 L096R 1.62 0.10 0.50 ND 0.05 96 L096S 1.92 0.74 0.84 ND 0.05 96 L096T 1.65 1.01 0.98 ND 0.05 96 L096W 0.77 1.52 0.78 ND 0.05 96 L096Y 1.17 0.27 0.79 ND 0.05 97 G097A 1.06 1.29 1.23 0.93 1.32 97 G097D 1.00 1.76 1.38 1.12 0.45 97 G097E 1.29 1.13 1.15 1.10 0.89 97 G097F 1.31 0.86 0.91 1.05 0.71 97 G097H 1.17 1.20 1.10 1.07 1.13 97 G097I 0.76 1.49 1.50 1.12 0.34 97 G097K 1.24 0.92 0.88 1.15 2.02 97 G097L 1.71 0.70 0.83 1.13 1.13 97 G097M 1.48 0.71 0.93 0.90 1.26 97 G097N 1.41 0.96 0.93 0.99 1.18 97 G097P 2.33 0.78 0.60 1.23 5.70 97 G097Q 1.02 0.95 1.20 1.01 1.34 97 G097R 1.08 0.99 0.87 1.10 2.25 97 G097S 1.32 1.03 1.00 0.92 1.50 97 G097T 1.06 1.26 1.21 0.95 1.13 97 G097V 1.03 1.11 1.33 1.05 0.68 97 G097W 1.24 0.91 0.88 0.91 0.60 97 G097Y 1.33 1.10 0.98 1.12 0.74 98 A098C 0.82 8.98 1.36 1.05 0.92 98 A098D 0.98 1.11 1.49 1.13 1.14 98 A098E 0.91 2.10 1.60 1.12 1.33 98 A098F 0.84 4.17 1.40 0.96 1.30 98 A098G 1.10 1.08 1.19 1.03 1.00 98 A098K 1.62 0.78 0.73 1.13 1.97 98 A098L 1.17 1.02 1.12 1.19 1.61 98 ?098? 1.29 0.91 0.98 0.99 1.92 98 A098P 1.25 0.68 1.09 0.95 1.23 98 A098Q 1.47 0.86 0.87 1.03 2.08 98 A098R 1.45 0.96 0.70 0.95 2.03 98 A098S 1.31 1.02 0.98 1.05 1.58 98 A098T 1.39 0.81 0.95 0.94 2.17 98 A098V 1.09 1.29 1.13 1.07 1.62 98 A098Y 1.13 0.99 1.06 0.99 1.41 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 99 S099A 1.26 1.17 1.04 0.98 1.42 99 S099C 0.84 1.38 1.19 0.91 0.69 99 S099E 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 99 S099F 1.03 0.86 0.92 0.97 1.10 99 S099G 1.19 1.31 1.07 0.88 1.41 99 S099K 1.33 1.10 0.88 1.05 1.60 99 S099L 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 99 S099M 1.34 0.90 1.09 1.01 1.34 99 S099P 1.17 0.89 1.12 1.11 0.61 99 S099Q 1.34 0.96 1.04 1.08 1.33 99 S099R 1.24 0.96 0.75 1.05 1.48 99 S099T 1.24 1.14 1.06 1.00 1.18 99 S099V 1.28 0.84 0.98 1.09 1.40 99 S099Y 1.24 0.76 0.97 1.00 1.26 100 G100D 1.63 0.69 1.05 1.06 0.31 100 G100E 2.32 0.74 0.84 1.01 1.02 100 G100F 1.12 0.50 0.73 ND 0.05 100 G100I 1.65 1.01 0.86 1.16 1.68 100 G100K 2.67 0.83 0.55 1.00 0.20 100 G100L 2.51 0.78 0.66 1.11 0.19 100 GIOOM 2.79 0.60 0.67 0.96 0.17 100 G100N 2.75 0.86 0.65 0.94 0.91 100 G100P 0.62 0.05 1.01 0.98 0.10 100 G1000 3.36 0.55 0.60 1.01 0.50 100 G100R 2.68 0.86 0.63 1.07 0.15 100 G100S 2.34 0.84 0.84 1.04 1.17 100 G100T 1.91 0.92 0.81 0.93 0.67 100 G100V 1.07 1.17 0.81 1.03 0.15 100 G100W 0.69 9.51 0.84 ND 0.05 100 G100Y 0.94 1.31 1.10 1.00 0.13 101 S 101A 1.11 1.35 0.95 1.04 1.25 101 S101C 0.96 0.44 0.85 0.87 0.19 101 S101D 1.29 1.36 1.22 1.05 0.62 101 S 101E 1.46 1.31 1.10 1.08 0.66 101 S101 F 1.39 1.23 0.87 1.16 2.18 101 S 101G 1.32 0.96 1.06 1.06 1.45 101 S 101H 1.34 1.24 1.06 1.21 1.65 101 S101I 1.45 1.11 0.79 1.11 1.29 101 S101K 1.39 1.32 0.91 1.23 1.77 101 S101N 1.34 1.18 1.11 1.07 1.42 101 S101P 1.51 0.89 1.15 1.33 2.74 101 S 101Q 1.49 1.15 1.02 1.03 1.37 101 S101R 1.35 1.34 0.73 1.10 2.15 101 S101T 1.37 1.30 1.07 1.10 1.29 101 S101V 1.47 1.17 0.80 1.07 1.22 101 S101W 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 101 S101Y 1.38 1.36 0.77 1.04 2.11 102 G102A 1.46 1.05 1.05 1.02 0.59 102 G102C 1.04 0.21 1.08 ND 0.05 102 G102D 0.61 0.05 1.42 0.99 0.06 102 G102E 0.57 0.05 1.65 ND 0.05 102 G102F 0.68 1.09 0.44 ND 0.05 102 G102H 0.58 0.05 1.34 ND 0.05 102 G102I 0.56 0.05 0.05 ND 0.05 102 G102K 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 102 G102L 0.63 0.05 0.24 ND 0.05 102 G102M 0.58 0.74 1.22 ND 0.05 102 G102N 0.74 1.25 1.47 1.08 0.21 102 G102P 0.50 0.05 0.05 ND 0.05 102 G102S 0.52 0.05 0.05 ND 0.05 102 G102T 1.21 0.97 1.12 1.00 0.26 102 G102V 0.49 0.05 0.33 ND 0.05 102 G102Y 0.79 0.50 0.72 ND 0.05 103 SI 03 A 1.08 1.18 1.17 1.10 1.29 103 S103C 0.96 0.63 0.88 1.07 0.52 103 S103D 0.93 0.81 1.32 1.09 0.47 103 S103E 0.73 0.80 1.13 1.12 0.27 103 S103F 1.22 0.83 0.83 0.98 1.24 103 S103G 0.84 1.22 1.09 0.91 0.71 103 S103I 0.85 1.20 0.95 0.98 0.72 103 S103L 1.28 0.93 0.98 1.06 1.52 103 S103N 1.25 1.08 1.06 1.08 0.84 103 S103P 1.05 1.10 1.00 1.09 1.20 103 SI 03Q 1.15 1.09 1.10 1.02 1.25 103 S103R 1.37 0.88 0.82 1.03 1.93 103 S103T 1.28 1.20 1.08 0.95 1.16 103 S1 3V 0.93 1.15 0.98 0.89 1.01 103 S103W 1.03 0.96 0.88 0.93 0.97 103 SI 03 Y 1.12 0.95 0.81 0.72 1.18 104 V104A 0.73 2.15 0.99 0.89 0.27 104 V104C 1.24 0.41 1.02 1.03 0.21 104 V104D 0.50 0.05 1.18 1.13 0.11 104 V104E 0.60 1.43 1.41 1.11 0.16 104 V104F 1.05 0.94 0.90 1.31 4.30 104 V104G 0.30 0.05 0.68 0.89 0.06 104 V104H 1.22 0.91 0.97 1.02 1.25 104 V104I 1.32 0.90 1.05 1.23 2.84 104 V104L 1.33 0.88 1.00 0.95 3.16 104 V104P 0.60 1.16 1.08 1.16 0.07 104 V104R 1.11 1.11 0.85 0.96 1.00 104 V104S 1.01 1.04 0.98 0.83 0.57 104 V104T 1.01 1.09 1.04 1.07 1.23 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') PI TCA CS-38 32°C AAPF 104 V104W 0.96 0.67 0.88 0.96 4.85 104 V104Y 0.98 1.07 0.77 1.03 3.89 105 S105A 1.29 0.88 0.97 1.00 1.62 105 S105C 1.13 0.44 1.00 1.04 0.89 105 S105D 1.02 0.56 1.26 1.02 1.04 105 S105E 1.13 0.62 1.25 1.00 1.11 105 S105F 0.90 1.10 0.97 1.00 1.08 105 S105G 0.87 1.23 1.33 0.96 1.12 105 S105H 0.79 1.40 1.08 1.10 0.74 105 S105I 0.45 0.05 1.58 0.99 0.63 105 S105K 1.60 1.03 0.70 0.93 2.20 105 S105L 1.00 0.83 0.97 1.05 1.21 105 S105M 0.80 0.76 0.67 1.12 0.36 105 S105N 1.10 0.73 1.01 1.06 1.14 105 S105P 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 105 S105Q 1.41 0.72 0.98 0.92 1.51 105 S105R 1.43 0.78 0.72 0.94 1.57 105 S105T 1.62 0.88 0.83 0.92 1.77 105 S105V 0.85 1.28 1.11 0.89 1.26 105 S105W 0.28 0.05 1.15 0.94 0.36 105 SI 05 Y 0.49 0.05 1.31 0.84 0.61 106 S106A 1.35 1.16 0.82 0.96 1.94 106 S106D 1.37 0.78 1.15 1.00 1.57 106 S106E 1.53 0.89 1.14 1.02 1.05 106 S106F 0.43 0.05 1.42 1.05 0.53 106 S106G 1.18 1.18 1.11 1.04 1.65 106 S106I 0.99 1.13 1.16 1.09 1.43 106 S106L 1.16 1.33 1.16 1.02 1.10 106 S106M 0.80 2.04 1.07 1.07 1.15 106 S106N 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 106 S106P 0.29 0.05 1.12 1.06 0.24 106 S106R 1.11 1.16 0.78 0.98 1.15 106 S106T 1.40 0.98 0.99 1.09 0.74 106 S106V 0.89 1.19 1.08 1.19 1.36 106 S106W 1.00 1.07 0.94 1.20 1.42 107 ?07? 2.12 1.08 0.57 0.82 0.50 107 I107C 1.72 0.96 0.45 0.93 0.89 107 I107D 0.57 0.05 0.05 ND 0.05 107 I107E 0.71 5.00 0.96 ND 0.05 107 I107F 2.25 1.15 0.72 0.87 0.22 107 I107G 0.39 0.05 0.77 ND 0.05 107 I107H 0.73 1.65 1.19 ND 0.05 107 ?07 0.50 0.05 0.05 ND 0.05 107 I107L 1.32 1.50 0.45 0.92 1.35 107 I107M 2.15 1.09 0.73 0.84 0.45 107 I107P 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 107 I107Q 1.02 1.22 1.18 1.11 0.06 107 I107R 0.55 0.05 0.05 ND 0.05 107 I107S 1.47 1.53 0.49 0.91 0.38 107 I107T 2.29 1.01 0.43 0.85 0.59 107 I107V 1.05 1.29 0.51 0.93 2.10 107 I107W 0.73 2.83 0.70 ND 0.05 107 1107 Y 2.08 0.58 0.65 ND 0.05 108 A108C 1.00 0.80 0.98 0.99 0.97 108 A108D 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 108 A108E 0.56 0.05 0.05 ND 0.05 - 108 A108F 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 108 A108G 0.61 2.14 1.20 0.96 0.62 108 A108H 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 108 A108I 1.12 1.02 1.01 0.95 1.41 108 A108L 0.91 1.07 0.82 0.40 0.91 108 A108M 0.74 1.26 0.94 0.61 0.73 108 A108P 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 108 A108Q 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 108 A108R 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 108 A108S 0.84 1.94 1.12 0.86 0.72 108 A108T 0.96 1.40 0.85 0.86 0.72 108 A108V 1.26 0.92 0.87 1.00 1.38 108 A108W 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 109 O109A 1.29 1.11 0.85 0.98 1.39 109 Q109C 0.70 31.03 1.35 0.97 0.84 109 Q109E 0.84 1.41 1.16 0.95 1.15 109 Q109F 0.93 1.78 0.98 1.06 1.28 109 Q109G 0.96 1.62 1.10 0.96 1.06 109 Q109H 1.01 1.10 0.86 1.01 1.19 109 Q109I 0.91 1.85 1.19 1.11 1.33 109 Q109K 1.65 0.81 0.74 0.93 1.93 109 Q109L 1.19 1.12 1.07 1.12 1.60 109 Q109M 1.28 1.19 1.03 1.04 1.73 109 Q109N 0.93 1.10 1.06 0.98 0.87 109 Q109P 0.23 0.05 0.82 1.00 0.17 109 Q109R 1.43 0.95 0.73 1.00 1.78 109 Q109S 1.08 1.19 1.12 0.98 1.16 109 O109T 0.91 1.62 1.14 0.97 1.15 109 Q109V 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 109 Q109W 0.92 1.21 0.95 0.91 1.22 109 Q109Y 0.93 1.47 0.99 1.00 1.18 110 G110 A 1.25 1.29 0.81 0.95 1.36 110 G110D 0.62 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110E 0.70 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110H 0.58 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110I 0.53 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Mkromuestra pH 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 110 G110K 0.54 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110L 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110M 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110N 0.54 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110P 0.54 0.05 0.05 ND 0.05 1 10 G110Q 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110R 0.41 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110S 0.39 0.05 1.26 0.89 0.28 110 G110T 0.52 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110V 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110W 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 110 G110Y 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 111 LU IA 0.24 0.05 0.90 0.83 0.11 1 1 1 L1 1 1C 0.31 0.05 1.85 0.86 0.40 111 L111E 0.24 0.05 1.35 0.86 0.07 111 L111F 0.96 1.41 1.28 0.89 0.16 111 L111G 0.41 0.05 0.05 ND 0.05 111 L111I 1.02 1.60 1.41 0.80 0.69 111 L111K 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 111 L111M 0.90 1.69 1.31 0.84 0.94 111 L111P 0.21 0.05 0.54 ND 0.05 111 L111Q 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 111 LU IR 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 111 LU IS 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 1 1 1 L111T 0.20 0.05 0.98 0.92 0.07 111 L111V 1.05 1.37 1.13 0.80 0.76 111 L111W 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 1 1 1 L1 1 1Y 0.30 0.05 1.36 1.05 0.07 112 E112A 0.69 5.15 1.16 0.93 0.86 112 E112C 0.59 0.05 1.40 0.98 0.57 112 E112D 1.25 0.93 1.01 1.00 1.48 112 E112F 0.26 0.05 1.08 0.98 0.20 112 E112G 0.27 0.05 1.42 1.04 0.26 112 El 121 1.09 1.13 0.91 1.08 1.09 112 E112K 0.20 0.05 0.05 ND 0.05 1 12 E112L 0.78 2.81 1.29 1.05 0.87 112 E112M 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 112 E112N 0.26 0.05 1.42 1.04 0.27 1 12 E112Q 0.82 3.22 1.15 0.93 1.03 112 E112R 0.16 0.05 0.05 ND 0.05 112 E112S 0.28 0.05 1.38 0.92 0.34 112 E112T 0.42 0.05 1.51 0.95 0.46 1 12 E112V 0.85 1.77 1.18 0.99 0.83 112 E112W 0.19 0.05 1.58 0.92 0.13 112 E112Y 0.21 0.05 1.23 0.94 0.16 113 W113A 0.20 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 113 W113C 0.20 0.05 0.48 ND 0.05 113 W113D 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 1 13 W113E 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 113 W113G 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 113 W113I 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 113 W113K 0.32 0.05 0.05 ND 0.05 113 W113L 0.19 0.05 0.89 1.03 0.10 113 W113M 0.28 0.05 0.84 1.01 0.14 1 13 W1 13N 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 113 W113R 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 113 W113S 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 113 W113V 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 1 14 AU4C 1.22 1.12 0.93 0.96 1.56 114 A114F 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 1 14 Al 14G 0.50 0.05 1.34 1.05 0.60 114 A114K 0.41 0.05 0.05 ND 0.05 114 A114M 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 114 A114Q 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 114 A114R 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 114 A114S 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 114 A114T 0.76 2.09 1.10 0.85 0.85 114 A114W 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 114 A114Y 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 115 G115C 0.90 1.79 1.22 0.93 1.32 115 G115E 1.06 1.11 1.22 0.99 1.33 1 15 G115F 1.45 0.99 0.95 0.70 1.92 1 15 G1 15H 1.50 1.01 0.92 0.71 2.33 115 G115I 1.19 1.16 0.96 0.79 1.93 115 G115K 1.63 0.88 0.75 0.37 1.80 115 G115L 1.21 1.09 1.04 0.80 1.71 115 G115M 1.19 1.04 1.09 0.96 1.50 115 G115N 1.08 1.02 0.98 0.16 1.33 115 G115P 1.03 1.28 1.10 1.06 1.24 1 15 G115Q 1.13 1.22 1.06 0.89 1.66 1 15 G115R 1.28 1.24 0.86 0.12 1.50 115 G115S 0.97 1.63 1.15 1.00 1.45 1 15 G115T 1.06 1.10 1.15 0.93 1.51 1 15 G1 15V 0.19 0.05 2.21 0.86 0.43 1 15 G1 15W 1.46 0.86 0.82 1.01 1.98 115 G115Y 1.31 1.03 0.97 0.87 1.68 116 N116A 1.26 1.07 1.01 0.92 1.44 116 N116C 1.10 0.83 1.20 0.91 1.20 1 16 N116D 1.28 0.93 1.24 0.91 1.70 116 N116F 1.09 1.40 1.08 0.97 1.33 116 N116G 0.99 1.89 1.27 0.91 1.32 1 16 N116I 0.86 1.60 1.40 1.00 1.00 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 1 16 N1 16K 1.41 0.95 0.83 1.04 1.56 116 N116L 1.30 0.77 1.06 1.10 1.40 116 NI 16M 1.39 0.82 0.99 0.99 1.36 116 N116Q 1.27 0.89 1.08 1.01 1.49 116 N116S 1.22 1.07 1.01 0.92 1.45 116 N116T 1.33 0.89 1.09 0.96 1.56 1 16 N116V 1.21 1.00 1.13 0.85 1.59 116 N116W 0.88 2.02 1.24 0.99 1.08 117 N117A 1.21 1.43 1.00 0.96 1.29 117 N117C 0.91 1.30 1.19 0.93 1.15 117 N117D 0.74 1.58 1.08 1.02 1.01 117 N117F 0.79 1.47 1.01 1.03 0.95 117 N117G 0.65 4.40 1.20 1.01 0.84 117 N117I 0.78 1.42 1.25 1.05 1.01 117 N117P 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 117 NI 170 1.22 0.92 0.84 1.08 1.38 117 N117R 1.03 1.34 0.84 1.01 1.40 117 NI 17T 1.05 1.15 0.93 1.04 1.24 117 NI 17 Y 1.09 1.00 1.02 1.12 1.16 118 G118A 1.50 1.01 0.98 0.98 1.48 1 18 G118C 0.86 1.29 1.20 1.00 0.91 118 G118D 1.02 1.16 1.19 1.03 1.09 118 G118E 1.11 1.22 1.07 1.04 1.20 118 G118F 1.08 1.23 1.03 1.00 1.12 118 G118I 0.74 1.45 1.07 1.18 0.73 118 G118K 1.17 1.08 0.81 0.96 1.20 1 18 G1 18L 0.79 1.51 1.23 1.09 0.84 118 G118M 1.01 1.33 1.08 1.04 1.05 118 G118N 0.87 1.13 1.05 1.08 0.95 118 G118P 0.20 0.05 1.54 1.06 0.18 118 G118Q 0.05 0.05 0.05 ND 0.05 118 G118R 1.08 1.09 0.95 1.07 1.06 118 G118S 1.06 1.42 1.04 1.05 1.12 118 G118T 0.71 1.74 1.04 1.02 0.80 118 G118V 0.81 1.20 1.02 1.03 0.90 118 G118W 0.85 1.07 1.04 1.01 0.85 119 M119A 0.94 1.33 0.95 0.94 1.08 119 M119C 0.64 1.90 1.13 0.99 0.85 119 M119E 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 1 19 M119F 1.07 1.08 1.13 1.08 1.14 119 119G 0.22 0.05 0.05 1.00 0.07 1 19 119H 0.49 0.05 1.36 1.08 0.60 119 M119K 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 119 M119N 0.30 0.05 1.45 1.12 0.29 119 M119P 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 119 119Q 0.72 0.52 1.11 1.13 0.80 Tabla 4-1 (cont). Valores del Indice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C I AAPF 119 M119R 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 119 M119T 1.07 0.95 0.81 0.97 1.19 119 M119W 0.16 0.05 1.88 1.03 0.15 120 II 120 A 1.14 1.12 0.97 0.93 1.81 120 H120C 0.92 1.36 1.12 1.04 1.21 120 H120E 1.12 1.17 1.12 1.11 1.30 120 H120F 1.05 1.16 1.01 1.09 1.31 120 H120G 1.08 1.56 1.07 0.99 1.33 120 H120I 1.06 0.93 0.92 1.17 1.24 120 H120L 1.04 1.17 1.20 1.13 1.32 120 H120M 1.19 1.12 1.08 0.97 1.50 120 H120N 1.21 1.04 1.04 1.08 1.43 120 H120R 1.05 1.13 0.98 0.91 1.49 120 H120S 1.19 1.16 1.07 1.11 1.61 120 H120T 1.19 1.05 0.98 1.12 1.53 120 H120W 0.95 1.07 1.07 1.01 1.08 121 V121A 1.09 0.96 1.07 0.91 1.52 121 V121C 0.85 1.67 1.41 0.97 1.08 121 V121E 0.82 2.12 1.37 0.79 0.99 121 V121F 1.01 1.42 1.29 0.95 1.12 121 V121G 0.46 0.05 2.16 0.96 0.59 121 V121I 1.40 0.90 1.11 0.95 1.58 121 V121K 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 121 V121 L 1.15 0.99 1.05 0.99 1.31 121 V121M 1.04 1.18 1.37 1.05 1.24 121 V121P 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 121 V121Q 0.71 0.71 1.49 1.08 0.79 121 V121R 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 121 V121S 1.18 1.00 1.09 0.95 1.52 121 V121T 0.91 1.64 1.40 1.04 1.12 121 V121Y 0.27 0.05 2.38 0.87 0.24 122 A122C 0.80 2.00 1.17 0.87 1.03 122 A122G 0.81 1.60 1.16 0.88 0.91 122 A122H 0.32 0.05 0.05 ND 0.05 122 A122I 0.95 1.04 1.14 0.58 0.79 122 A122L 1.12 0.71 1.05 0.69 0.72 122 A122N 0.18 0.05 0.05 ND 0.05 122 A122Q 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 122 A122R 0.32 0.05 0.05 ND 0.05 122 A122S 1.04 1.17 1.18 0.87 1.41 122 A122T 1.04 1.13 1.10 0.72 1.62 122 A122V 1.05 1.09 1.20 0.82 0.98 122 A122Y 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 123 N123E 1.48 0.68 0.89 0.35 0.06 123 N123F 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 123 N123G 1.71 0.82 1.15 0.53 0.43 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo 32°C PI BPN') BPN') TCA CS-38 AAPF 123 N123H 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 123 N123I 1.04 0.23 0.82 ND 0.05 123 N123L 1.17 0.27 0.81 ND 0.05 123 N123M 0.97 0.42 0.86 ND 0.05 123 N123P 0.91 0.52 0.93 ND 0.05 123 N123R 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 123 N123S 1.15 1.13 1.12 0.48 0.45 123 N123V 0.93 0.25 0.94 ND 0.05 123 N123W 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 124 L124D 0.50 0.05 0.05 ND 0.05 124 L124E 0.40 0.05 0.62 ND 0.05 124 L124G 1.31 1.26 1.05 0.98 1.72 124 L124H 0.43 0.05 1.28 ND 0.05 124 L124K 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 124 L124N 0.44 0.05 1.97 ND 0.05 124 L124P 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 124 L124Q 0.38 0.05 1.89 ND 0.05 124 L124R 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 124 L124S 0.74 3.78 1.36 0.80 0.25 124 L124T 1.32 1.11 1.14 0.85 0.70 124 L124Y 0.78 0.87 0.86 ND 0.05 125 SI 25 A 1.12 1.13 0.80 0.73 0.32 125 S 125C 2.09 0.45 0.84 ND 0.05 1 5 S125E 0.54 0.05 0.05 ND 0.05 125 S125G 2.41 0.17 0.17 ND 0.05 125 S125H 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 125 S125I 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 125 S125K 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 125 S125L 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 125 S125M 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 125 S125N 0.74 0.05 0.05 ND 0.05 125 S125P 0.93 0.05 0.05 ND 0.05 125 S 125R 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 125 S125T 1.75 0.07 0.14 ND 0.05 125 S125W 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 125 SI 25 Y 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 126 L126A 1.08 1.68 0.81 0.82 0.26 126 L126C 1.09 0.05 0.05 ND 0.05 126 L126E 2.16 0.05 0.90 ND 0.05 126 L126F 1.30 1.15 0.93 1.07 0.47 126 L126G 2.16 0.49 0.42 0.88 0.07 126 L126H 2.49 0.43 0.73 ND 0.05 126 L126I 1.60 0.88 0.88 0.94 0.25 126 L126K 0.82 0.36 0.81 ND 0.05 126 L126M 1.55 0.92 0.93 1.03 0.13 126 L126N 2.30 0.56 0.92 N¡) 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo 32°C PI BPN') BPN') TCA CS-38 AAPF 126 L126P 0.63 0.05 0.05 ND 0.05 126 L126Q 2.51 0.34 0.73 ND 0.05 126 L126R 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 126 L126S 2.36 0.58 0.68 0.86 0.07 126 L126T 2.24 0.53 0.73 ND 0.05 126 L126V 1.54 0.84 0.94 0.85 0.16 126 L126W 2.63 0.32 0.59 ND 0.05 126 L126Y 2.76 0.10 0.30 ND 0.05 127 G127A 0.77 0.05 0.05 ND 0.05 127 G127D 1.85 0.93 0.87 ND 0.05 127 G127F 0.83 2.63 0.40 ND 0.05 127 G127I 1.88 1.02 0.69 ND 0.05 127 G127L 1.68 0.87 0.58 ND 0.05 127 G127P 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 127 G127Q 2.00 0.96 0.78 ND 0.05 127 G127R 1.65 1.14 0.63 ND 0.05 127 G127S 1.41 1.37 1.03 ND 0.05 127 G127T 1.76 1.17 0.89 ND 0.05 127 G127V 2.00 0.93 0.70 ND 0.05 127 G127W 0.35 0.05 0.28 ND 0.05 128 S128A 1.30 0.87 0.97 1.02 1.46 128 S 128C 1.69 0.14 0.66 1.10 0.06 128 S 128D 2.83 0.72 0.64 1.03 0.33 128 S128F 2.91 0.62 0.58 0.96 1.59 128 S128G 0.95 1.33 1.11 1.01 1.32 128 S128H 2.62 0.73 0.63 1.06 0.54 128 S128I 2.96 0.72 0.58 1.12 3.27 128 S 128K 2.21 0.96 0.48 1.01 1.44 128 S128L 3.03 0.69 0.62 1.08 2.47 128 S 128M 2.62 0.77 0.63 1.10 5.64 128 S128N 1.38 1.16 1.09 0.95 0.51 128 S1 8P 1.28 0.14 0.48 ND 0.05 128 S 128Q 2.70 0.80 0.56 1.10 1.17 128 S128R 1.39 1.10 0.66 1.11 1.55 128 S128T 1.48 1.02 0.82 1.13 2.85 128 S128W 1.47 0.69 1.03 1.09 0.18 128 SI 28 Y 2.90 0.62 0.54 1.06 0.58 129 P129A 1.37 0.86 0.82 0.82 2.33 129 P129E 1.09 0.80 1.32 1.16 1.26 129 P129F 1.23 0.71 0.94 0.89 2.01 129 P129G 1.61 0.91 0.88 0.86 2.57 129 P129I 0.96 0.59 1.13 0.74 1.30 129 P129L 1.45 0.51 0.86 0.79 1.56 129 P129M 1.70 0.75 0.80 0.92 1.83 129 P129N 1.57 0.93 0.81 0.99 2.66 129 P129R 1.22 1.03 0.77 0.98 3.28 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pll 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°G PI AAPF 129 P129S 1.68 0.87 0.88 0.92 2.68 129 P129T 1.34 0.54 0.93 0.58 1.98 129 P129V 1.28 0.36 0.84 0.65 1.36 129 P129W 1.12 0.77 0.86 0.74 1.21 129 P129Y 1.08 0.77 1.16 0.91 1.90 130 S130C 1.18 0.44 1.12 0.98 0.74 130 S 130K 1.62 0.86 0.82 1.11 2.07 130 S130L 1.25 1.12 0.83 1.07 1.29 130 S130 1.33 1.03 1.02 1.14 1.53 130 S130P 1.00 0.16 0.91 ND 0.05 130 S130Q 1.31 1.00 1.05 1.10 1.17 130 S130R 1.43 0.87 0.70 0.93 2.06 130 S 130V 1.08 1.21 0.95 0.93 1.29 130 S130W 1.33 0.92 0.83 0.91 1.18 130 S130Y 1.31 1.12 0.96 0.87 1.37 131 P131A 1.15 1.21 1.02 0.89 1.16 131 P131D 1.29 0.87 1.20 1.04 1.35 131 P131E 1.35 0.77 1.16 1.07 1.13 131 P131F 1.23 0.77 0.98 0.91 1.30 131 P131G 1.12 1.34 1.06 0.84 0.90 131 P131I 1.04 0.47 1.01 0.68 0.87 131 P131K 1.43 0.74 0.80 0.91 1.33 131 P131L 0.88 0.83 1.16 0.64 0.73 131 P131M 1.06 0.86 0.96 0.77 0.99 131 P131Q 1.33 0.76 0.93 0.94 1.18 131 P131R 1.30 0.87 0.79 0.78 1.54 131 P131V 0.96 0.94 1.07 0.55 0.99 132 S132A 1.04 1.07 1.08 0.98 1.00 132 S132E 0.72 3.77 1.51 0.92 0.57 132 S132F 0.72 8.36 1.05 1.05 1.08 132 S132H 0.89 1.54 1.04 0.97 1.01 132 S132I 0.83 1.39 1.09 0.89 0.86 132 S132L 0.75 3.33 1.21 0.83 1.35 132 S132M 0.73 4.11 1.32 0.91 1.20 132 S 132N 0.82 2.12 1.19 0.99 1.06 132 SI 320 1.04 0.88 1.08 0.88 0.87 132 S132R 0.93 0.76 0.92 0.90 0.57 132 S132T 1.24 0.79 0.91 0.82 1.45 132 S 132W 0.67 1.28 0.99 0.91 1.12 133 A133F 1.17 1.05 0.92 0.88 1.30 133 A133K 1.44 0.96 0.86 1.11 1.56 133 A133L 0.39 0.05 1.38 1.14 0.23 133 A133N 1.13 0.97 1.11 1.15 1.20 133 A133P 1.42 0.95 1.04 1.17 1.26 133 A133Q 0.62 0.05 1.20 1.00 0.71 133 A133S 1.15 1.06 0.97 1.01 1.14 Tabla 4-1 (cont). Valores del Indice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 133 A133T 1.14 0.95 1.09 0.94 1.24 133 A133V 1.11 1.18 1.12 0.95 1.21 133 A 133 Y 1.37 0.97 0.89 0.90 1.45 134 T134A 0.85 2.30 1.32 1.00 1.07 134 T134D 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 134 T134F 0.40 0.05 1.52 0.98 0.36 134 T134H 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 134 TI 341 0.44 0.05 1.40 1.11 0.47 134 T134L 0.26 0.05 1.59 1.02 0.26 134 T134M 0.31 0.05 1.73 0.94 0.32 134 T134N 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 134 T134P 0.25 0.05 2.25 1.05 0.19 134 T134S 1.08 1.28 1.32 0.81 1.21 134 T134V 0.81 2.14 1.36 0.99 0.99 134 T134Y 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 135 L135A 0.41 0.05 1.25 0.29 0.21 135 L135C 0.49 0.05 1.52 0.86 0.24 135 L135D 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 135 L135E 0.42 0.05 1.35 1.02 0.20 135 L135F 0.57 0.05 1.03 0.19 0.91 135 L135G 0.27 0.05 0.05 0.13 0.09 135 L135M 1.02 1.40 0.98 0.84 1.91 135 L135N 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 135 L135Q 0.33 0.05 1.66 0.41 0.32 135 L135 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 135 L135S 0.23 0.05 0.75 0.09 0.12 135 L135T 0.61 0.05 1.24 0.53 0.64 135 L135W 1.48 0.66 1.09 0.92 3.30 136 E136A 1.12 1.05 0.80 0.78 1.28 136 E136D 0.69 0.38 1.24 0.42 0.66 136 E136F 1.08 1.19 0.78 0.43 1.34 136 E136G 0.78 1.90 0.80 0.78 0.89 136 E136I 0.65 0.05 0.57 0.58 0.37 136 E136K 1.16 0.71 0.63 0.22 1.34 136 E136L 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 136 E136M 0.45 0.05 0.83 0.69 0.46 136 E136N 0.62 0.05 1.05 0.49 0.47 136 E136P 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 136 E136Q 1.13 1.07 0.92 0.84 1.46 136 E136R 1.01 0.71 0.37 0.15 1.41 136 E136S 0.96 1.05 0.74 0.78 0.92 136 E136T 0.46 0.05 0.45 0.55 0.20 136 E136V 0.82 1.04 0.68 0.57 0.76 136 E136W 0.84 1.47 0.49 0.18 1.03 136 E136Y 1.08 1.03 0.81 0.52 1.23 137 Q137A 1.28 1.38 1.15 1.00 1.42 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') PI BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 137 Q137C 0.82 1.20 1.17 1.02 0.96 137 Q137E 1.16 0.84 1.19 1.07 1.22 137 Q137G 0.71 2.29 1.12 0.91 0.89 137 Q137H 1.25 1.00 1.01 0.99 1.33 137 Q137K 1.40 0.77 0.79 0.92 1.44 137 Q137L 1.22 1.12 1.04 1.01 1.31 137 Q137M 1.27 1.14 0.92 1.07 1.30 137 Q137P 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 137 Q137R 1.19 0.99 0.80 0.88 1.28 137 Q137S 1.07 1.57 1.03 0.97 1.13 137 0137V 0.82 1.70 1.12 0.79 1.15 137 Q137W 1.27 1.18 0.81 0.81 1.47 138 A138C 0.68 2.54 1.24 0.60 0.62 138 A138D 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 138 A138E 0.18 0.05 1.52 0.80 0.1 1 138 A138G 0.48 0.05 1.35 0.88 0.86 138 A138H 0.14 0.05 0.05 ND 0.05 138 A138K 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 138 A138L 0.61 1.35 1.01 0.07 0.43 138 A138M 1.07 1.02 0.98 0.53 0.79 138 A138P 0.16 0.05 0.05 ND 0.05 138 A138Q 0.23 0.05 1.45 0.63 0.21 138 A138R 0.23 0.05 1.65 1.02 0.35 138 A138S 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 138 A138V 0.90 1.33 0.80 0.17 0.64 138 A138W 0.16 0.05 0.05 ND 0.05 139 V139A 1.06 1.01 1.22 0.26 0.88 139 V139C 0.92 1.91 1.34 0.84 1.09 139 V139D 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 139 V139E 0.34 0.05 1.74 0.33 0.12 139 V139F 0.66 0.05 1.32 0.05 0.10 139 V139G 0.40 0.05 1.41 0.06 0.21 139 VI 391 1.27 0.80 1.13 0.92 1.56 139 V139L 0.41 0.05 0.05 ND 0.05 139 V139M 0.85 1.99 1.38 0.22 0.86 139 V139Q 0.59 0.05 1.51 0.05 0.27 139 V139R 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 139 V139S 0.74 0.22 1.34 0.12 0.46 139 V139T 0.95 2.01 1.32 0.72 0.95 139 V139W 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 139 VI 39 Y 0.35 0.05 1.74 ND 0.05 140 N140A 1.28 0.73 0.98 0.80 1.25 140 N140C 0.89 1.48 1.34 0.72 0.93 140 N140D 1.31 0.85 1.13 1.09 1.57 140 N140E 1.32 0.95 1.04 0.96 1.28 140 N140F 0.86 1.32 1.24 0.57 1.01 Tabla 4-1 (cont). Valores del Indice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 140 N140G 1.09 1.19 1.19 0.62 1.32 140 N1401 1.10 0.82 1.22 0.65 1.16 140 N140K 0.22 0.05 2.81 0.05 0.15 140 N140L 1.03 1.18 1.18 0.56 1.13 140 N140 1.10 0.81 1.16 0.62 1.15 140 N140P 0.33 0.05 0.05 ND 0.05 140 N140Q 1.16 0.96 1.10 0.73 1.15 140 N140 1.03 1.02 0.91 0.27 1.01 140 N140S 1.10 1.10 1.10 0.64 1.27 140 N140T 1.05 1.17 1.25 0.60 1.41 140 N140V 0.96 1.39 1.29 0.39 1.20 140 N140Y 0.91 1.54 1.20 0.39 0.98 141 S141D 1.17 0.71 1.06 1.12 1.19 141 S 141 E 0.87 0.75 1.10 0.95 0.99 141 S 141G 1.06 1.29 1.12 0.99 1.21 141 S 141H 1.11 1.08 1.07 1.03 1.17 141 S1411 1.19 1.02 0.95 0.97 1.29 141 S141K 1.29 1.12 0.87 0.99 1.36 141 S141L 0.80 0.83 1.12 1.01 0.90 141 S141N 1.05 1.07 1.10 1.09 1.15 141 S 141P 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 141 S 141Q 1.04 0.92 0.93 0.97 1.16 141 S141R 1.19 1.01 0.84 1.01 1.40 141 S141V 1.33 0.90 0.86 0.86 1.42 141 S141Y 1.02 1.08 1.13 1.02 0.93 142 A142C 0.91 2.30 1.25 0.94 1.08 142 A142D 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 142 A142E 0.34 0.05 1.71 0.49 0.33 142 A142F 0.27 0.05 0.05 ND 0.05 142 A142G 0.43 0.05 1.70 0.17 0.51 142 A142H 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 142 A142I 0.72 O.OS 1.08 0.42 0.50 142 A142K 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 142 A142L 1.05 1.04 1.01 0.08 0.70 142 A142M 0.71 16.35 1.04 0.05 0.48 142 A142N 0.40 0.05 1.58 0.18 0.43 142 A142P 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 142 A1420 0.78 9.76 1.11 0.24 0.67 142 A142R 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 142 A142S 0.77 6.91 1.35 0.72 1.19 142 A142T 0.87 2.44 1.18 0.70 1.12 142 A142V 1.15 1.20 0.99 0.94 1.36 142 A142W 0.18 0.05 0.05 0.07 0.06 142 A 142 Y 0.33 0.05 2.25 0.84 0.41 143 T143C 1.24 0.85 1.15 0.87 1.46 143 T143D 1.10 1.05 1.11 0.96 1.19 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 143 T143 1.20 0.80 1.10 0.98 1.20 143 T143G 0.94 1.12 1.04 0.31 0.95 143 14311 1.26 0.93 0.96 1.08 1.18 143 T143I 0.95 0.92 1.04 0.46 0.98 143 T143 1.25 0.95 0.84 0.08 1.45 143 T143L 1.10 0.74 1.09 0.18 1.19 143 T143M 0.90 1.12 1.10 0.52 1.05 143 T143N 1.25 0.91 1.09 0.94 1.39 143 T143R 0.55 0.05 1.00 0.05 0.61 143 T143S 0.94 1.31 1.22 0.75 1.09 143 T143V 1.27 0.86 0.96 0.77 1.63 143 T143W 1.37 0.79 1.03 0.79 1.38 143 ??43? 0.97 1.15 1.20 0.77 1.09 144 S 144A 1.29 1.04 0.98 1.02 1.45 144 S144C 1.08 0.75 1.15 1.00 1.31 144 S144D 1.36 0.82 1.11 1.05 1.55 144 S 144E 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 144 S 144G 1.19 1.13 0.98 1.03 1.41 144 S144H 1.21 0.94 0.85 1.04 1.43 144 S144I 1.15 1.01 1.05 0.97 1.41 144 S144K 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 144 S 144L 0.97 0.98 1.04 0.92 1.23 144 S144M 1.28 0.88 0.93 1.01 1.46 144 S144N 1.32 0.90 1.08 0.96 1.53 144 S144P 0.25 0.05 0.54 0.05 0.10 144 S 144Q 0.62 0.05 1.29 0.94 0.74 144 S144R 1.30 0.86 0.91 0.92 1.46 144 S 144T 1.21 1.01 1.00 0.86 1.63 144 S144V 1.25 1.06 1.09 0.92 1.44 144 S144W 0.98 1.31 1.04 0.55 1.22 144 S144Y 1.03 1.26 1.04 0.87 1.17 145 R145A 1.46 0.85 0.99 1.01 1.51 145 R145C 0.98 1.03 1.24 1.04 1.06 145 R145D 1.08 0.84 1.10 1.04 1.20 145 R14512 0.65 12.81 1.54 0.92 0.87 145 R145F 0.83 1.06 1.31 1.01 0.94 145 R145G 0.69 2.91 1.42 0.99 0.80 145 R145I 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 145 R145K 1.30 1.03 1.06 1.08 1.37 145 R145L 1.01 1.06 1.20 1.06 1.20 145 R145M 0.73 1.73 1.50 1.02 0.87 145 R145N 1.12 1.09 1.13 0.98 1.32 145 R145P 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 145 R145Q 1.51 0.87 1.06 1.00 1.68 145 R145S 0.57 0.05 1.56 0.95 0.79 145 R145T 0.77 1.06 1.21 1.04 0.93 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pll 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') CS-38 32°C TCA AAPF 145 R145W 0.64 2.55 1.28 0.95 0.85 145 R145Y 0.69 3.13 1.39 1.04 0.82 146 G146A 0.84 2.28 1.33 0.58 0.88 146 G146C 0.68 0.05 1.56 0.85 0.74 146 G146D 1.15 1.10 1.23 1.03 1.39 146 G146E 0.80 2.87 1.31 0.71 0.93 146 G146F 0.43 0.05 1.66 0.42 0.45 146 G146I 0.22 0.05 1.14 0.37 0.19 146 G146K 0.83 1.83 1.15 0.07 0.91 146 G146L 0.37 0.05 1.61 0.56 0.36 146 G146M 0.58 0.05 1.65 0.74 0.66 146 G146P 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 146 G146Q 0.89 1.43 1.02 0.72 1.08 146 G146R 0.70 0.05 1.06 0.05 0.86 146 G146S 0.59 0.05 1.44 0.54 0.75 146 G146T 0.27 0.05 1.86 0.08 0.25 146 G146V 0.18 0.05 0.79 0.11 0.09 146 G146W 0.19 0.05 1.80 0.44 0.18 146 G146Y 0.30 0.05 2.16 0.45 0.31 147 V147D 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 147 V147F 0.27 0.05 1.86 0.72 0.17 147 V147G 0.31 0.05 1.85 0.51 0.24 147 V147H 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 147 V 147I 1.07 1.28 0.93 1.09 1.66 147 V147L 1.19 0.85 0.92 0.90 1.54 147 V147M 1.18 0.93 1.03 0.73 1.43 147 V147P 0.27 0.05 1.25 0.05 0.13 147 V147Q 0.53 0.05 1.30 0.51 0.82 147 V147R 0.27 0.05 0.05 ND 0.05 147 V147S 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 147 V147T 1.28 0.92 0.85 0.87 1.30 148 L148A 1.29 0.83 1.01 0.76 1.48 148 L148C 0.90 2.31 1.04 0.94 0.99 148 L148D 0.20 0.05 0.05 ND 0.05 148 L148E 0.24 0.05 1.80 0.89 0.19 148 L148F 1.06 1.25 1.07 0.69 1.08 148 L148G 0.71 0.05 1.25 0.73 0.82 148 L1481I 0.91 1.65 1.18 0.77 1.30 148 L148I 0.98 1.54 1.05 0.95 1.21 148 L148K 0.17 0.05 0.05 ND 0.05 148 L148M 1.12 1.24 1.00 0.92 1.29 148 L148N 1.17 0.98 0.94 0.91 1.16 148 L148P 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 148 L148R 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 148 L148S 1.29 0.92 0.91 0.70 1.33 148 L148T 1.61 0.81 0.72 0.76 1.66 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de Pide Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 148 L148V 0.94 1.76 1.04 0.84 1.17 148 L148W 0.16 0.05 1.23 0.09 0.08 148 L148Y 1.25 1.02 0.86 0.13 1.05 149 VI 49 A 0.50 0.05 1.94 0.89 0.72 149 V149C 0.81 1.23 1.66 1.04 1.22 149 V149D 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 149 V149E 0.18 0.05 0.05 ND 0.05 149 V149F 0.29 0.05 2.43 ND 0.05 149 V149G 0.16 0.05 1.51 0.55 0.13 149 V149H 0.21 0.05 2.36 0.27 0.22 149 V149I 1.07 0.94 1.17 1.02 1.48 149 V 149 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 149 V149L 0.98 1.18 1.27 1.04 1.19 149 V149M 0.81 1.06 1.18 0.76 0.99 149 V149P 0.46 0.05 1.91 1.21 0.59 149 V149Q 0.21 0.05 2.42 0.78 0.36 149 V149R 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 149 V149S 0.39 0.05 2.27 0.89 0.59 149 V149T 0.83 0.84 1.48 0.77 1.04 149 V149W 0.15 0.05 0.05 ND 0.05 150 VI 50 A 0.84 1.16 1.42 0.82 1.20 150 V150D 0.18 0.05 0.05 ND 0.05 150 V150E 0.21 0.05 1.09 0.14 0.08 150 V150F 0.99 1.22 1.14 0.05 1.01 150 V150G 0.23 0.05 2.66 0.49 0.27 150 V150H 0.20 0.05 2.79 0.20 0.27 150 V150K 0.17 0.05 0.05 ND 0.05 150 V150L 1.23 1.15 0.92 0.89 1.37 150 V150P 0.13 0.05 1.71 0.61 0.14 150 V150O 0.16 0.05 3.34 0.39 0.19 150 V150R 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 150 V150S 0.75 1.27 1.43 0.62 0.89 150 V150T 1.18 0.90 1.01 0.97 1.54 150 V150W 0.14 0.05 0.05 ND 0.05 151 A151D 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 151 A151E 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 151 A151F 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 151 A151G 0.85 1.54 1.08 0.35 0.81 151 A151H 0.52 0.05 0.05 ND 0.05 151 A151L 0.70 0.05 0.42 ND 0.05 151 A151M 1.05 0.13 0.59 ND 0.05 151 A151P 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 151 A151R 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 151 A151S 1.26 0.93 1.01 0.87 1.13 151 A151T 1.27 0.38 0.93 0.64 0.44 151 A151V 1.19 0.59 0.92 0.36 0.82 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 151 A151W 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 152 A152C 1.48 0.34 0.70 ND 0.05 152 A152D 0.66 0.05 0.05 ND 0.05 152 A152E 0.60 0.05 0.05 ND 0.05 152 A152K 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 152 A152L 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 152 A152M 0.62 0.05 0.05 ND 0.05 152 A1 2P 2.74 0.23 0.56 ND 0.05 152 A152R 0.45 0.05 1.07 ND 0.05 152 A152S 0.88 2.71 0.70 0.84 0.37 152 A152T 1.08 0.07 0.68 ND 0.05 152 A152V 0.96 0.70 0.69 ND 0.05 152 A152W 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 152 A152Y 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 153 S153A 1.06 0.90 1.16 0.72 1.65 153 S153E 0.89 0.05 0.05 ND 0.05 153 S153F 0.94 0.05 0.05 ND 0.05 153 S153G 0.92 0.60 1.07 0.62 0.70 153 S153I 1.02 0.33 0.66 0.08 0.15 153 S153K 0.55 0.05 0.05 ND 0.05 153 S153M 1.03 0.35 0.42 ND 0.05 153 S153N 0.84 0.54 0.70 0.05 0.27 153 S153P 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 153 SI 530 1.10 0.05 0.05 ND 0.05 153 S153R 0.59 0.05 0.05 ND 0.05 153 S 153V 0.99 0.95 1.03 0.78 2.29 153 S153Y 0.85 0.48 0.05 ND 0.05 154 G154A 0.90 0.05 0.05 ND 0.05 154 G154C 0.97 0.53 0.20 ND 0.05 154 G154D 0.61 0.05 0.37 ND 0.05 154 G154F 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 154 G154H 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 154 G154I 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 154 G154M 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 154 G154N 0.99 0.05 0.05 ND 0.05 154 G154P 0.52 0.05 0.05 ND 0.05 154 G154Q 0.64 3.28 0.05 ND 0.05 154 G154R 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 154 G154S 0.89 0.50 0.05 ND 0.05 154 G154T 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 154 G154V 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 154 G154W 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 154 G154Y 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 155 N155A 1.66 0.05 0.13 ND 0.05 155 N155D 1.55 0.10 0.05 ND 0.05 155 N155E 0.86 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 158 A158H 1.31 1.03 0.92 1.21 1.34 158 A158K 1.44 0.86 0.72 1.02 1.61 158 A158L 1.34 0.86 0.91 0.93 1.58 158 A158M 1.35 0.89 1.00 1.02 1.36 158 A158P 1.67 0.07 0.21 ND 0.05 158 A158Q 1.46 0.88 0.85 0.96 1.58 158 A158R 1.24 1.06 0.74 0.90 1.47 158 A158S 0.85 1.04 1.07 0.88 0.95 158 A158T 1.07 0.99 1.01 0.94 1.21 158 A158V 1.16 0.92 0.98 0.89 1.32 158 A158W 1.10 0.97 0.86 0.75 1.00 159 G159A 1.15 1.04 1.12 0.96 1.34 159 G159C 1.01 0.85 1.02 1.06 1.01 159 G159D 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 159 G159E 1.29 0.77 1.11 1.20 1.36 159 G159F 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 159 G159H 1.19 0.81 0.93 0.86 1.15 159 G159I 0.71 0.05 0.76 0.78 0.21 159 G159L 0.85 0.36 0.58 0.85 0.19 159 G159 0.89 0.71 1.06 0.97 0.77 159 G159P 1.50 0.74 0.89 1.07 1.66 159 G159Q 1.15 0.64 1.01 0.73 1.20 159 G159R 1.17 0.63 0.73 0.79 1.04 159 G159S 1.17 1.22 1.23 0.91 1.47 159 G159T 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 159 G159V 0.74 5.22 0.78 0.62 0.23 159 G159W 0.82 1.05 0.81 0.72 0.65 159 G159Y 0.80 1.09 0.86 0.70 0.35 160 S160A 1.12 1.14 1.00 0.92 1.23 160 S160C 0.93 1.29 1.27 1.21 0.93 160 S160D 1.10 0.98 1.24 1.03 1.17 160 S160F 1.23 0.99 0.96 1.08 1.56 160 S160G 1.08 0.82 1.11 0.60 1.06 160 S160I 1.29 0.81 0.87 1.13 1.58 160 S160L 1.19 0.88 0.94 0.99 1.53 160 S160M 1.11 1.06 0.97 0.99 1.40 160 S160N 1.23 0.92 0.98 0.99 1.53 160 S160Q 1.24 0.91 0.91 1.05 1.60 160 S160R 1.03 1.29 0.76 0.76 1.72 160 S160T 1.19 0.98 1.01 1.11 1.60 160 S160V 1.26 0.86 0.93 1.08 1.68 160 S160W 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 160 S160Y 1.23 0.91 1.00 1.10 1.58 165 I165A 0.92 0.12 0.05 ND 0.05 165 U65C 0.64 0.05 0.89 0.41 0.18 165 I165D 1.72 0.05 0.23 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI B I LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 165 I165E 1.38 0.10 0.05 ND 0.05 165 I165F 1.45 0.05 0.14 ND 0.05 165 I165G 1.53 0.05 0.05 ND 0.05 165 I165H 1.54 0.05 0.05 ND 0.05 165 I165K 1.53 0.06 0.05 ND 0.05 165 I165L 0.95 0.63 1.17 1.08 0.79 165 I165M 0.92 0.31 0.53 0.76 0.14 165 I165P 0.92 0.29 0.94 0.09 0.72 165 I165R 1.54 0.05 0.05 ND 0.05 165 I165S 0.91 0.20 0.30 ND 0.05 165 I165T 0.80 1.12 0.81 0.15 0.32 165 I165V 1.20 1.07 0.95 0.99 1.41 165 I165W 1.53 0.05 0.12 ND 0.05 165 1165 Y 1.28 0.05 0.05 ND 0.05 166 SI 66 A 1.22 1.25 1.05 0.89 1.80 166 S166C 1.15 0.69 1.08 0.94 0.34 166 S166D 1.19 1.12 1.24 1.23 0.16 166 S166E 1.14 1.23 1.00 1.16 0.22 166 S166F 0.90 0.47 0.67 0.40 0.09 166 S166H 0.95 1.53 1.10 0.85 0.14 166 SI 661 0.98 0.36 0.72 1.07 0.07 166 S166L 1.13 0.37 0.76 ND 0.05 166 S166M 1.02 1.13 0.90 0.95 0.23 166 S166N 1.23 1.08 1.01 ND 0.05 166 S166P 1.02 0.05 0.44 0.05 0.18 166 S166R 1.08 0.95 0.74 0.63 0.06 166 S166T 1.22 0.68 0.98 0.83 0.13 166 S166V 1.27 0.82 0.64 ND 0.05 166 S166W 1.27 0.86 0.71 ND 0.05 166 S166Y 0.95 0.49 1.00 0.55 0.13 167 Y167A 1.25 0.13 0.88 0.17 0.31 167 Y167C 0.88 0.24 1.01 0.29 0.07 167 Y167D 1.04 0.11 1.18 0.05 0.06 167 Y167E 1.54 0.14 1.01 0.10 0.17 167 Y167F 1.32 0.88 0.95 0.93 1.35 167 Y167G 1.18 0.06 0.46 ND 0.05 167 Y167H 0.92 0.29 0.94 0.13 0.60 167 Y167I 1.06 0.10 0.98 0.15 0.56 167 Y167K 0.91 0.05 0.05 ND 0.05 167 Y167L 0.98 0.16 0.73 0.05 0.23 167 Y167M 0.91 0.18 0.49 0.07 0.11 167 Y167N 0.97 0.13 0.57 0.05 0.10 167 Y167P 1.02 0.21 1.10 0.18 0.24 167 Y167Q 1.26 0.05 0.35 ND 0.05 167 Y167R 0.87 0.05 0.05 ND 0.05 167 Y167S 0.82 0.24 0.64 0.07 0.10 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 167 Y167T 0.91 0.21 0.74 0.07 0.11 167 Y167V 0.91 0.33 1.12 0.20 0.45 167 Y167W 1.19 0.88 1.05 0.73 1.49 168 P168A 0.84 0.36 0.32 ND 0.05 168 P168C 0.84 0.05 0.05 ND 0.05 168 P168D 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 168 P168E 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 168 P168F 1.07 0.05 0.35 ND 0.05 168 P168G 0.57 0.05 0.48 ND 0.05 168 P168H 0.47 0.05 0.49 ND 0.05 168 P168I 1.28 0.07 0.39 ND 0.05 168 P168K 0.49 0.05 0.49 ND 0.05 168 P168L 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 168 P168M 1.01 0.05 0.26 ND 0.05 168 P168N 0.83 0.56 0.05 ND 0.05 168 P1680 0.62 0.05 0.05 ND 0.05 168 P168R 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 168 P168S 0.82 0.05 0.24 ND 0.05 168 P168T 0.91 0.23 0.20 ND 0.05 168 P168V 0.90 0.05 0.70 ND 0.05 168 P168W 0.76 0.05 0.29 ND 0.05 169 A169C 0.72 1.61 0.05 ND 0.05 169 A169D 0.41 0.05 . 0.05 ND 0.05 169 A169E 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169F 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169G 1.08 1.21 1.08 0.80 0.56 169 A169H 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169I 0.33 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169K 0.50 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169L 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169M 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169N 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169P 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169Q 0.55 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169R 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169S 1.03 1.12 1.00 0.57 0.97 169 A169T 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169V 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 169 A169W 0.50 0.05 0.45 ND 0.05 169 A169Y 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 170 R170A 1.18 0.82 1.09 1.06 1.15 170 R170D 0.85 0.49 1.29 0.89 0.43 170 R170E 0.87 0.44 1.29 0.85 0.53 170 R170G 0.97 1.73 1.19 1.13 0.98 170 R170H 0.95 0.68 1.32 0.92 0.84 170 R170 0.89 2.15 1.29 1.05 1.18 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pII 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 170 R170L 0.19 0.05 1.19 0.97 0.06 170 R170N 0.20 0.05 0.91 0.91 0.07 170 R170P 0.45 0.05 1.50 0.93 0.31 170 R170Q 1.09 0.67 1.14 1.01 1.03 170 R170S 0.98 0.68 1.19 0.85 0.85 170 R170V 0.88 1.07 1.39 0.88 0.93 170 R170W 0.90 0.56 1.23 0.80 0.68 170 R170Y 1.05 0.82 1.19 0.94 0.93 171 Y171A 0.70 1.25 1.26 0.12 0.38 171 Y171C 0.97 0.89 1.19 0.81 0.83 171 Y171D 0.65 0.05 1.24 0.09 0.41 171 Y171E 0.61 0.05 0.92 0.10 0.17 171 Y171F 1.24 0.86 1.07 0.60 1.40 171 Y171G 0.77 2.68 1.25 0.05 0.52 171 Y171H 0.77 1.78 1.27 0.33 0.82 171 Y171I 0.67 0.05 1.18 0.05 0.45 171 Y171K 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 171 Y171L 1.03 0.66 0.94 0.23 1.08 171 Y171M 0.85 0.05 0.90 0.05 0.51 171 Y171N 0.86 1.24 1.14 0.28 1.00 171 Y171P 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 171 Y171Q 0.67 0.05 1.20 0.05 0.40 171 Y171R 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 171 Y171S 0.77 2.64 1.21 0.34 0.86 171 Y171T 0.59 0.05 1.23 0.08 0.39 171 Y171V 0.60 0.05 0.89 0.06 0.35 171 Y171W 0.69 1.22 1.30 0.14 0.46 172 A172C 1.15 0.88 1.11 1.13 1.18 172 A172D 1.17 1.09 1.10 1.12 1.24 172 A172F 1.16 0.99 0.93 0.77 1.34 172 A172G 1.12 1.23 1.07 0.92 1.32 172 A172I 1.21 0.95 0.98 1.00 1.30 172 A172K 0.91 1.12 0.82 0.92 1.16 172 A172L 1.22 0.85 1.04 0.93 1.26 172 A172M 1.08 1.04 0.97 1.02 1.14 172 A172P 1.37 1.02 1.10 1.03 1.60 172 A172Q 1.27 1.05 1.12 0.88 1.48 172 A172R 1.27 0.98 0.75 0.82 1.52 172 A172S 1.08 0.87 1.03 0.85 1.18 172 A172T 0.92 1.47 1.14 0.79 1.24 172 A172V 1.08 1.24 1.00 0.91 1.26 172 A172W 0.96 0.86 0.91 0.61 0.92 172 A172Y 1.29 1.07 0.89 0.84 1.33 173 NI 73 A 1.23 1.03 0.92 0.96 1.37 173 N173C 0.89 0.87 1.13 1.01 0.94 173 N173D 0.93 0.78 1.07 1.01 0.94 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

Tabla 4-1 (cont). Valores del Indice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 175 M175T 1.78 0.80 0.93 0.54 1.63 175 M175V 1.31 0.94 0.97 0.89 1.32 175 M175W 0.54 0.05 0.93 0.05 0.41 175 M175Y 1.38 0.97 0.97 0.08 1.03 176 A176C 0.77 3.85 1.32 0.58 0.84 176 A176D 0.68 0.05 0.23 ND 0.05 176 A176E 2.03 0.05 0.21 ND 0.05 176 A176G 1.29 0.85 0.94 0.55 1.59 176 A176H 0.61 0.05 0.05 ND 0.05 176 A176I 1.08 0.18 0.19 ND 0.05 176 A176K 0.98 0.05 0.05 ND 0.05 176 A176L 0.57 0.05 0.05 ND 0.05 176 A176N 0.61 0.05 0.05 ND 0.05 176 A176P 0.35 0.05 1.66 0.05 0.14 176 A176R 0.75 0.05 0.05 ND 0.05 176 A176S 1.25 1.07 1.10 0.92 1.50 176 A176T 1.63 0.05 0.34 ND 0.05 176 A176V 1.30 0.07 0.25 ND 0.05 176 A176W 0.64 0.05 0.05 ND 0.05 176 A176Y 0.61 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177A 1.27 0.96 1.10 0.17 1.35 177 V177C 1.06 1.17 1.10 0.81 1.18 177 V177D 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177F 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177G 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177H 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177I 1.14 1.02 1.10 0.57 1.19 177 V177K 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177L 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177M 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177N 0.25 0.05 0.05 0.05 0.06 177 V177Q 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177R 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177S 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177T 1.67 0.78 0.93 0.33 1.59 177 V177W 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 177 V177Y 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 178 G178A 1.08 0.53 1.01 0.05 0.92 178 G178C 0.38 0.05 0.69 0.05 0.21 178 G178D 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 178 G178E 0.53 0.05 0.05 ND 0.05 178 G178F 0.27 0.05 0.05 ND 0.05 178 G178I 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 178 G178L 0.20 0.05 0.05 0.05 0.12 178 G178M 0.30 0.05 0.05 ND 0.05 178 G178N 0.30 0.05 0.42 0.05 0.16 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') PI TCA CS-38 32°C AAPF 181 D181R 0.31 0.05 0.39 0.05 0.34 181 D181V 0.27 0.05 0.56 0.05 0.28 182 Q182A 1.26 1.00 0.92 0.86 1.57 1 2 Q182D 1.15 0.95 1.21 1.11 1.47 182 Q182E 1.12 1.00 1.21 1.14 1.66 182 Q182F 1.21 1.14 0.94 0.43 1.48 182 Q182G 1.16 0.92 0.95 0.49 1.34 182 Q182H 1.15 0.94 0.95 0.73 1.36 182 Q182I 1.28 0.89 0.80 0.48 1.56 182 Q182K 1.25 0.99 0.77 0.08 1.54 182 Q182L 1.20 0.98 0.96 0.20 1.53 182 Q182M 1.55 0.87 0.65 0.75 1.83 182 Q182N 1.20 1.01 0.88 0.73 1.33 182 0182P 1.12 0.93 0.95 0.51 1.27 182 Q182R 1.08 1.06 0.75 0.06 1.24 182 Q182S 1.30 0.96 0.97 0.74 1.68 182 Q182T 1.23 1.09 1.03 0.66 1.61 182 Q182V 1.18 1.04 0.95 0.57 1.32 182 Q182W 1.57 0.80 0.63 0.09 1.61 182 Q182Y 1.31 0.91 0.83 0.78 1.30 183 N183A 1.30 1.01 0.98 0.82 1.21 183 N183D 0.97 1.08 1.22 1.15 1.10 183 N183F 1.12 1.00 0.93 0.27 1.27 183 N183G 1.16 1.26 0.99 0.69 1.28 183 N183H 1.43 0.88 0.90 0.75 1.36 183 N183I 1.28 0.81 0.89 0.05 1.31 183 N183K 1.52 0.98 0.75 0.06 1.40 183 N183L 1.48 0.84 0.91 0.28 1.34 183 N183M 1.30 0.76 0.89 0.57 1.35 183 N183P 0.16 0.05 1.75 0.05 0.15 183 N183Q 1.51 0.93 0.83 0.89 1.65 183 N183R 1.43 0.91 0.60 0.05 1.42 183 N183S 1.05 1.20 1.07 0.90 1.22 183 N183T 1.26 0.93 0.98 0.67 1.31 183 N183V 1.34 0.80 0.90 0.14 1.29 183 N183W 1.44 0.93 0.73 0.19 1.37 183 N183Y 1.32 0.83 0.89 0.65 1.32 184 NI 84 A 0.22 0.05 1.48 0.05 0.15 184 N184C 0.60 5.16 1.27 0.25 0.53 184 N184D 1.31 0.99 1.09 1.18 1.51 184 N184E 0.50 0.05 1.44 0.58 0.43 184 N184F 0.23 0.05 0.91 0.05 0.11 184 N184G 0.78 1.45 1.26 0.05 0.77 184 N184H 0.31 0.05 1.31 0.14 0.19 184 N184I 0.15 0.05 0.70 ND 0.05 184 N184K 0.14 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 187 A187F 1.58 0.42 0.68 0.05 0.21 187 A187G 0.76 1.54 0.97 0.05 0.63 187 A187H 1.30 0.18 0.64 0.05 0.11 187 A187I 1.04 0.14 0.41 0.13 0.13 187 A187K 0.52 0.05 0.05 ND 0.05 187 A187L 0.90 0.27 0.93 0.15 0.34 187 A187M 0.66 2.14 0.77 0.10 0.19 187 A187N 0.36 0.05 0.95 0.05 0.10 187 A187P 1.42 0.76 0.90 0.55 1.01 187 A187Q 0.57 0.05 0.92 0.05 0.11 187 A187R 0.55 0.05 0.05 ND 0.05 187 A187S 0.90 0.80 0.93 0.07 0.79 187 A187T 0.86 0.80 0.82 0.28 0.71 187 A187V 0.89 0.26 0.65 0.29 0.30 187 A187W 1.42 1.24 0.93 0.53 0.80 187 A187Y 2.08 0.69 0.87 0.32 0.40 188 S188A 1.39 0.80 0.87 0.96 1.38 188 S188D 1.25 0.86 1.11 1.11 1.36 188 S188E 1.24 0.84 0.98 1.12 1.27 188 S188F 1.10 0.59 0.78 0.87 1.03 188 S188G 1.29 0.90 0.92 0.80 1.40 188 S188H 1.28 0.74 0.92 0.98 1.23 188 S188I 1.39 0.86 0.78 0.89 1.64 188 S188K 1.53 0.81 0.72 0.95 1.40 188 S188L 1.41 0.73 0.91 0.86 1.51 188 S188P 1.55 0.71 0.97 1.16 1.29 188 S188Q 1.45 0.82 0.94 0.90 1.50 188 S188R 1.38 0.71 0.72 0.80 1.25 188 S188T 1.31 0.82 0.92 0.90 1.19 188 S188V 1.42 0.80 0.87 0.80 1.56 188 S188W 1.46 0.56 0.73 0.80 1.23 188 S188Y 1.40 0.59 0.81 0.74 1.31 189 F189A 0.50 0.05 1.04 0.07 0.07 189 F189C 2.04 0.43 0.86 0.77 0.20 189 F189E 2.15 0.54 0.92 0.24 0.28 189 F189G 2.00 0.50 0.90 0.16 0.45 189 F189II 1.28 0.29 0.81 0.08 0.21 189 F189K 1.82 0.34 0.64 0.07 0.32 189 F189L 1.79 0.58 0.99 0.11 0.49 189 F189M 2.27 0.63 0.92 0.49 0.47 189 F189N 2.35 0.51 0.89 0.07 0.67 189 F189P 1.12 0.19 0.69 0.05 0.10 189 F189Q 2.29 0.48 0.97 0.06 0.47 189 F189R 1.51 0.48 0.70 0.12 0.30 189 F189S 1.85 0.50 0.91 0.15 0.65 189 F189T 1.64 0.58 0.93 0.11 0.57 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C I AAPF 189 189V 1.97 0.26 0.67 0.05 0.16 189 F189Y 0.97 0.29 0.91 0.19 0.85 190 S190A 0.86 0.30 0.89 0.11 0.44 190 S190C 0.77 0.05 0.22 ND 0.05 190 S190D 1.97 0.05 0.05 ND 0.05 190 S 190E 1.51 0.05 0.05 ND 0.05 1 0 S190F 1.74 0.05 0.15 ND 0.05 190 S 190G 1.01 0.10 0.55 0.10 0.19 190 S190H 1.84 0.05 0.19 ND 0.05 190 SI 901 1.40 0.05 0.05 ND 0.05 190 S190K 1.15 0.05 0.05 ND 0.05 1 0 S190L 1.60 0.05 0.15 ND 0.05 190 S190M 1.56 0.05 0.18 ND 0.05 190 S190N 1.86 0.05 0.14 ND 0.05 190 S 190P 1.58 0.05 0.05 ND 0.05 190 S190Q 1.92 0.05 0.23 ND 0.05 190 S190R 1.10 0.09 0.05 ND 0.05 190 S190T 0.80 0.33 0.61 0.05 0.24 190 S190V 1.50 0.05 0.18 ND 0.05 190 S190W 1.45 0.06 0.05 ND 0.05 190 S190Y 1.33 0.07 0.20 ND 0.05 191 Q191A 1.08 0.54 0.91 0.96 0.60 191 Q191D 1.33 0.54 1.22 0.96 0.70 191 Q191E 0.95 0.15 0.93 0.24 0.58 191 Q191F 1.64 0.05 0.24 ND 0.05 191 Q191G 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 191 Q191H 1.79 0.38 0.76 0.21 0.39 191 Q191I 1.94 0.05 0.34 ND 0.05 191 Q191K 1.72 0.05 0.05 ND 0.05 191 Q191L 1.63 0.05 0.27 ND 0.05 191 Q191P 2.08 0.19 0.47 ND 0.05 191 Q191R 0.94 0.35 0.48 0.53 0.38 191 Q191S 1.14 0.54 0.90 1.01 0.59 191 Q191T 0.81 0.20 0.63 0.51 0.11 191 Q191V 1.82 0.06 0.34 ND 0.05 191 Q191W 1.80 0.05 0.17 ND 0.05 191 Q191Y 1.39 0.09 0.35 ND 0.05 192 Y192C 0.96 0.14 0.71 0.29 0.13 192 Y192D 1.89 0.05 0.27 ND 0.05 192 Y192E 1.95 0.05 0.42 ND 0.05 192 Y192G 0.87 0.05 0.50 0.37 0.11 192 Y192H 1.07 0.78 0.97 0.56 1.00 192 Y192I 0.88 0.16 0.35 ND 0.05 192 Y192K 0.88 0.15 0.21 ND 0.05 192 Y192L 1.56 0.05 0.22 ND 0.05 192 Y192M 1.06 0.15 0.46 0.59 0.07 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 192 Y192N 0.89 0.36 0.54 0.05 0.14 192 Y192P 2.31 0.05 0.05 ND 0.05 192 Y 1920 1.39 0.06 0.35 ND 0.05 192 Y192R 1.01 0.10 0.18 ND 0.05 192 Y192S 0.82 0.35 0.72 0.08 0.20 192 Y192T 0.60 5.73 0.94 0.12 0.24 192 Y192V 1.09 0.11 0.43 0.82 0.08 192 Y192W 0.91 1.15 1.05 0.73 0.89 193 G193A 1.01 0.05 0.47 0.14 0.17 193 G193D 1.15 0.05 0.49 0.17 0.07 193 G193E 1.13 0.05 0.49 0.05 0.10 193 G193F 2.15 0.05 0.05 ND 0.05 193 G193H 1.66 0.05 0.05 ND 0.05 193 G193I 1.82 0.05 0.24 ND 0.05 193 G193K 1.95 0.05 0.14 ND 0.05 193 G193L 1.81 0.05 0.05 ND 0.05 193 G193M 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 193 G193R 1.87 0.05 0.05 ND 0.05 193 G193S 1.00 0.05 0.31 0.12 0.08 193 G193T 2.32 0.05 0.10 ND 0.05 193 G193V 2.17 0.05 0. 1 ND 0.05 193 G193W 1.65 0.05 0.05 ND 0.05 193 G193Y 1.94 0.06 0.05 ND 0.05 194 A194C 1.47 0.72 0.93 1.07 1.56 194 A194D 1.78 0.81 0.98 1.07 2.13 194 A194E 1.64 0.93 1.00 1.10 2.02 194 A194F 1.37 1.19 0.86 0.95 1.73 194 A194G 1.64 0.62 0.78 0.55 1.53 194 A194H 1.78 0.96 0.71 1.01 2.06 194 A194I 1.72 1.09 0.73 1.06 2.17 194 A194L 1.57 0.83 0.84 0.95 1.77 194 A194M 1.66 1.01 0.83 0.95 2.14 194 A194P 1.48 0.67 0.89 1.07 1.58 194 A194Q 1.29 0.89 1.00 0.97 1.62 194 A194R 1.48 0.87 0.68 0.83 2.03 194 A194S 1.62 0.90 0.77 0.84 1.98 194 A194T 1.03 1.04 1.09 0.90 1.32 194 A194V 0.52 0.05 1.84 0.92 0.73 194 A194W 1.06 1.17 0.99 0.81 1.31 194 A194Y 1.19 1.12 0.95 0.92 L53 195 G195A 0.81 1.51 1.06 0.61 0.81 195 G195C 0.98 1.06 1.29 0.90 1.00 195 G195D 1.07 0.51 1.15 1.09 0.83 195 G195E 1.00 1.11 1.32 1.03 1.13 195 G195F 0.90 0.43 0.92 0.59 0.70 195 G195I 0.83 0.05 0.50 0.08 0.11 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra µ?1 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 195 G19 1.04 0.28 0.83 0.42 0.68 195 G195L 0.90 0.38 0.98 0.25 0.45 195 G195P 0.76 0.68 0.57 0.14 0.15 195 G195Q 0.92 1.07 1.08 0.80 0.91 195 G195R 0.77 1.49 0.87 0.59 0.52 195 G195S 0.78 2.14 1.11 0.57 0.87 195 G195T 0.73 2.97 1.22 0.54 0.56 195 G195V 0.15 0.05 2.20 0.22 0.17 195 G19 W 0.80 0.67 0.93 0.36 0.55 195 G195Y 0.84 0.50 1.06 0.52 0.64 196 L196A 1.22 0.05 0.05 ND 0.05 196 L196D 1.61 0.05 0.17 ND 0.05 1 6 L196E 1.23 0.11 0.28 ND 0.05 196 L196F 0.75 1.57 0.24 ND 0.05 196 L196G 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 196 L196H 0.52 0.05 0.41 ND 0.05 196 L196I 1.25 0.49 0.90 0.49 0.99 196 L196M 1.19 1.08 1.06 0.47 1.29 196 L196P 2.27 0.05 0.05 ND 0.05 196 L196Q 0.46 0.05 1.22 0.05 0.21 196 L196R 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 196 L196T 0.68 0.05 1.03 0.05 0.29 196 L196V 0.98 0.05 0.62 0.23 0.18 196 L196Y 0.84 0.05 0.05 ND 0.05 197 DI 97 A 1.36 1.15 1.03 0.05 1.59 197 D197C 1.25 0.84 1.27 0.48 1.26 197 D197E 0.78 1.16 1.36 0.87 1.02 197 D197F 0.49 1.32 1.52 0.05 0.58 197 D197G 1.16 0.93 1.04 0.05 1.29 197 D197H 0.58 1.45 1.60 0.05 0.48 197 D197I 0.41 0.05 1.39 0.05 0.48 197 D197L 0.31 0.05 1.72 0.05 0.32 197 D1 7M 0.61 1.06 1.60 0.05 0.63 197 D197N 1.67 0.93 1.00 0.05 1.95 197 D197P 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 197 D197Q 1.30 0.97 1.13 0.05 1.34 197 D197R 0.16 0.05 0.90 0.05 0.1 1 197 D197S 1.86 1.00 0.94 0.05 2.10 197 D197T 1.41 1.16 1.01 0.05 1.71 197 D197V 0.73 1.17 1.50 0.05 0.93 197 D197W 0.60 1.20 1.47 0.05 0.66 197 D197Y 0.35 0.05 1.56 0.05 0.41 198 I198A 1.25 1.07 1.02 0.41 1.71 198 I198D 0.25 0.05 1.44 0.18 0.17 198 I198E 0.51 0.05 1.58 0.08 0.59 198 I198F 1.97 0.78 0.61 0.05 1.93 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 198 I198G 2.10 0.77 0.64 0.05 2.40 198 I198H 1.78 0.71 0.76 0.05 1.52 198 I198L 1.66 0.80 0.67 0.86 1.97 198 I198M 1.04 1.02 1.13 0.71 1.43 198 I198N 1.62 0.71 0.74 0.05 1.54 198 I198P 0.62 0.05 0.05 ND 0.05 198 I198Q 0.51 0.05 1.10 0.11 0.43 198 I198R 0.22 o.os 1.40 0.88 0.10 198 I198S 2.18 0.82 0.53 0.05 2.46 198 I198T 2.02 0.84 0.63 0.31 2.07 198 I198V 0.27 0.05 0.05 0.33 0.07 198 I198W 0.30 0.05 1.22 0.05 0.22 198 I198Y 1.31 0.62 0.82 0.05 1.12 199 V199A 1.01 1.52 0.93 0.41 1.05 199 V199C 1.21 1.02 0.99 0.94 1.19 199 V199D 0.30 0.05 1.40 0.05 0.24 199 V199E 0.18 0.05 1.60 0.06 0.12 199 V199F 0.52 0.05 1.05 0.31 0.20 199 V199G 0.76 1.38 1.09 0.14 0.83 199 V199H 0.40 0.05 0.96 0.05 0.31 199 VI 991 0.86 1.13 1.32 0.05 0.87 199 V199K 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 199 V199L 0.57 0.05 1.15 0.05 0.51 199 V199M 1.46 0.93 0.98 1.03 1.36 199 V199P 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 199 V199Q 0.32 0.05 1.35 0.05 0.30 199 V199R 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 199 V199S 1.38 0.95 1.03 1.01 1.42 199 V199T 1.21 1.10 0.94 0.53 1.36 199 V199W 0.49 0.05 0.82 0.12 0.18 200 A200C 1.06 1.02 1.12 0.05 1.14 200 A200E 0.18 0.05 0.05 0.05 0.06 200 A200G 0.93 1.14 1.05 0.28 0.93 200 A200H 0.29 0.05 1.47 ND 0.05 200 A200I 0.51 0.05 1.30 0.37 0.53 200 A200L 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 200 A200P 0.24 0.05 0.05 ND O.OS 200 A200R 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 200 A200S 1.17 1.13 0.99 0.16 1.31 200 A200W 0.46 0.05 0.05 ND O.OS 200 A200Y 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 201 P201A 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 201 P201C 0.70 3.09 1.11 0.05 0.91 201 P201D 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 201 P201E 0.26 0.05 0.05 ND 0.05 201 P201 F 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración 1)11 8 Ensayo Micromuestra EDTA Ensayo BPN') BPN') PI CS-38 32°C TCA AAPF 201 P201G 0.48 0.05 1.43 0.05 0.65 201 P201I 0.19 0.05 0.05 0.05 0.06 201 P201K 0.33 0.05 0.05 ND 0.05 201 P201 L 0.17 0.05 0.05 ND 0.05 201 P201M 0.18 0.05 0.05 ND 0.05 201 P201N 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 201 P201Q 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 201 P201R 0.32 0.05 0.05 ND 0.05 201 P201S 0.75 1.98 1.20 0.05 0.95 201 P201T 0.25 0.05 1.21 0.05 0.31 201 P201V 0.21 0.05 1.59 0.05 0.26 202 G202A 0.29 0.05 0.71 0.05 0.13 202 G202C 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202D 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202E 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202F 1.11 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202H 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202K 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202L 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202M 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202N 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202P 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202Q 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202R 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202S 0.17 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202T 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202V 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202W 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 202 G202Y 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 203 V203A 0.86 1.14 1.10 0.38 0.94 203 V203C 0.84 0.94 1.19 0.97 0.75 203 V203E 0.82 1.06 1.25 1.07 0.88 203 V203F 0.71 0.58 1.25 0.05 0.54 203 V203G 0.17 0.05 1.58 0.05 0.16 203 V203H 0.45 0.05 1.27 0.09 0.31 203 V203I 1.43 0.93 1.04 0.65 1.27 203 V203K 1.09 0.79 0.81 0.05 0.89 203 V203L 1.09 0.92 1.01 0.25 1.00 203 V203N 0.50 0.05 1.42 0.10 0.52 203 V203P 0.16 0.05 0.05 0.08 0.06 203 V203R 0.76 0.60 0.88 0.05 0.60 203 V203S 0.82 0.90 1.04 0.43 0.72 203 V203T 1.29 1.10 0.87 1.02 1.42 203 V203W 0.70 0.76 1.18 0.05 0.47 203 V203Y 0.71 0.74 1.19 0.14 0.52 204 N204A 1.32 1.10 0.89 0.82 1.34 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Mkromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 204 N204C 1.27 0.72 0.81 0.85 1.27 204 N204E 1.52 0.86 1.06 1.08 1.56 204 N204F 1.50 0.82 0.80 0.33 1.44 204 N204G 1.38 1.04 0.95 0.91 1.43 204 N204I 1.27 0.71 0.85 0.13 1.23 204 N204K 1.62 0.89 0.72 0.08 1.48 204 N204L 1.43 0.87 0.96 0.56 1.39 204 N204P 0.21 0.05 1.41 0.05 0.19 204 N204R 1.42 0.74 0.66 0.05 1.21 204 N204S 1.23 1.02 0.94 0.82 1.26 204 N204T 1.17 1.06 0.99 0.51 1.19 204 N204W 1.27 0.86 0.83 0.21 1.16 204 N204Y 1.34 0.78 0.87 0.38 1.31 205 V205A 0.61 3.19 0.98 0.05 0.64 205 V205D 0.08 0.05 0.05 ND 0.05 205 V205E 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 205 V205F 0.27 0.05 0.43 1.07 0.07 205 V205G 0.23 0.05 1.16 0.05 0.12 205 V205I 0.31 0.05 1.52 1.08 0.25 205 V205K 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 205 V205L 0.40 0.05 1.34 0.05 0.25 205 V205M 0.27 0.05 1.14 0.05 0.15 205 V205P 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 205 V205Q 1.07 0.81 0.92 0.05 0.84 205 V205R 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 205 V205T 1.03 1.22 1.05 0.73 1.41 205 V205W 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 205 V205Y 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 206 Q206A 0.91 0.87 1.16 0.77 1.15 206 Q206C 0.78 0.95 1.51 1.11 1.06 206 Q206D 0.92 1.06 1.40 1.14 1.31 206 Q206E 0.90 1.12 1.39 1.05 1.33 206 Q206F 0.51 0.05 1.68 0.37 0.65 206 Q206G 0.98 0.90 1.03 0.11 1.22 206 Q206H 1.40 0.82 0.97 0.99 1.50 206 Q206I 1.56 0.96 0.80 0.31 1.71 206 Q206K 1.69 0.87 0.71 0.14 2.04 206 Q206L 1.63 0.70 0.83 0.81 1.75 206 Q206N 1.11 0.91 1.10 0.93 1.52 206 Q206P 1.05 0.97 1.07 0.42 1.28 206 Q206R 1.62 0.94 0.71 0.39 1.85 206 Q206S 0.93 1.68 1.20 0.91 1.35 206 Q206T 0.95 1.03 1.25 0.79 1.25 206 Q206V 0.96 0.88 1.02 0.44 1.17 206 Q206W 1.13 0.96 0.82 0.08 1.26 206 Q206Y 0.95 1.05 1.18 0.65 1.16 Tabla 4-1 (cont). Valores del Indice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 207 S207A 0.95 1.71 1.09 0.05 1.05 207 S207C 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207D 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207E 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207F 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207G 0.74 12.54 1.05 0.05 0.42 207 S207H 0.37 0.05 0.98 ND 0.05 207 S207I 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207K 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207L 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207M 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207N 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207P 0.24 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207R 0.34 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207T 0.34 0.05 0.78 ND 0.05 207 S207V 0.32 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207W 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 207 S207Y 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 208 T208A 0.71 2.56 1.42 0.05 0.93 208 T208C 0.93 1.15 1.37 0.65 1.31 208 T208D 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 208 T208E 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 208 T208F 0.30 0.05 0.68 0.05 0.10 208 T208G 0.2Ü 0.05 0.05 ND 0.05 208 T208H 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 208 T208K 0.27 0.05 0.05 ND 0.05 208 T208L 1.01 0.92 1.21 0.05 1.23 208 T208M 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 208 T208N 0.22 0.05 1.51 0.05 0.12 208 T208 - 0.28 0.05 2.26 0.05 0.39 208 T208Q 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 208 T208R 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 208 T208S 1.15 1.04 1.05 0.05 1.49 208 T208V 0.89 1.57 1.24 0.05 1.18 208 T208W 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 208 T208Y 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 209 Y209A 0.81 1.59 1.37 0.64 1.12 209 Y209C 1.19 0.80 1.21 0.78 1.72 209 Y209D 0.44 0.05 1.57 0.05 0.33 209 Y209E 0.72 1.68 1.58 0.05 1.09 209 Y209F 1.26 1.02 1.05 0.89 1.80 209 Y209G 0.93 1.29 1.29 0.11 1.15 209 Y209H 1.07 1.30 1.08 0.29 1.39 209 Y209I 1.25 0.86 1.04 0.63 2.04 209 Y209K 1.32 0.98 0.87 0.05 2.11 209 Y209L 1.03 0.83 1.14 0.23 1.79 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 209 Y209M 0.94 1.41 1.24 0.87 1.73 209 Y209N 1.02 1.11 1.14 0.05 1.33 209 Y209P 0.33 0.05 0.05 ND 0.05 209 Y209R 1.07 1.18 0.98 0.05 1.23 209 Y209S 0.96 1.05 1.38 0.54 1.56 209 Y209T 0.76 1.83 1.32 0.59 1.49 209 Y209V 0.83 1.30 1.35 0.77 1.61 209 Y209W 0.89 1.61 1.24 0.87 1.45 210 P210A 0.97 1.80 1.26 1.08 1.55 210 P210C 0.85 1.50 1.54 0.94 1.39 210 P210D 0.67 2.94 1.79 0.24 0.86 210 P210E 0.82 1.78 1.52 0.71 1.01 210 P210F 0.79 2.14 1.40 0.57 1.14 210 P210G 1.03 1.75 1.24 0.55 1.53 210 P210H 0.89 2.43 1.34 0.79 1.44 210 P210I 1.06 1.77 1.23 1.20 1.58 210 P210L 0.81 1.93 1.45 1.03 1.23 210 P210M 1.01 1.78 1.37 1.08 1.41 210 P210N 1.01 1.62 1.25 0.84 1.64 210 P210Q 0.69 4.64 1.58 0.76 1.17 210 P210R 0.85 2.12 1.17 0.29 1.39 210 P210S 0.67 5.84 1.68 0.95 1.21 210 P210V 0.64 9.61 1.78 1.05 1.05 210 P210W 0.61 14.30 1.57 0.14 1.07 210 P210Y 0.71 3.88 1.55 0.82 1.17 21 1 G211A 1.05 1.55 1.13 0.89 1.21 211 G211C 1.10 0.93 1.10 0.92 1.24 211 G211E 1.26 1.08 1.17 1.06 1.48 211 G211F 1.01 1.41 0.87 0.54 1.25 211 G211H 1.22 1.22 1.01 1.11 1.27 211 G211I 1.13 1.16 1.22 0.91 1.30 211 G211L 1.31 0.95 0.85 0.78 1.37 211 G211M 1.25 1.09 0.96 0.81 1.44 211 G211P 1.12 1.04 0.93 1.17 1.25 211 G211Q 1.34 0.83 1.14 0.99 1.50 211 G211R 1.30 0.90 0.85 0.57 1.37 211 G211T 1.29 0.99 1.10 0.81 1.53 211 G211V 1.13 1.08 0.97 0.95 1.32 211 G211W 1.18 1.05 0.80 0.39 1.28 211 G211Y 0.79 1.53 1.03 0.84 0.86 212 S212C 1.14 1.57 1.21 1.10 1.57 212 S212F 1.25 1.54 0.88 1.04 1.78 212 S212G 1.12 1.35 1.08 0.95 1.77 212 S212H 1.38 1.00 0.97 1.09 1.75 212 S212I 1.06 1.61 1.19 0.53 1.51 212 S212M 1.14 1.36 1.14 1.03 1.59 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de meración Micromuestra CS-(Numeración (Nu pH 8 EDTA Ensayo 38 Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA AAPF 212 S212N 1.55 0.97 0.88 1.10 2.11 212 S212P 1.56 0.94 0.85 0.65 2.14 212 S212R 1.44 1.03 0.70 0.85 1.84 212 S212T 1.28 0.96 1.06 0.62 1.79 212 S212V 1.32 0.93 1.06 0.58 1.76 212 S212W 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 212 S212Y 1.57 0.78 0.75 0.96 1.94 213 T213A 1.36 1.05 0.98 0.94 1.94 213 T213C 1.07 1.18 1.35 0.65 1.60 213 T213D 1.31 1.05 1.17 0.87 1.94 213 T213E 1.40 1.02 1.20 0.93 1.97 213 T213F 1.27 1.10 0.87 0.05 2.00 213 T213G 1.34 0.74 0.99 0.72 1.86 213 T213I 1.57 0.88 0.82 0.56 2.08 213 T213K 1.69 0.96 0.75 0.24 2.28 213 T213L 1.45 1.07 0.89 0.48 2.10 213 T213M 1.54 0.99 0.90 0.62 2.16 213 T213N 1.58 0.96 0.92 0.99 2.20 213 T213P 0.70 0.05 1.62 0.05 0.87 213 T213Q 1.57 0.82 0.90 0.95 2.32 213 T213R 1.59 0.86 0.66 0.12 2.08 213 T213S 1.53 0.93 0.92 1.05 2.14 213 T213V 1.60 0.92 0.94 0.56 2.23 213 T213W 1.52 0.81 0.74 0.05 2.07 213 T213Y 1.33 1.14 0.82 0.05 1.71 214 Y214A 0.23 0.05 1.09 0.05 0.10 214 Y214C 0.74 4.58 1.42 0.10 1.00 214 Y214E 0.67 2.33 1.49 0.05 0.87 214 Y214F 1.10 1.24 1.08 0.05 1.37 214 Y214G 0.19 0.05 2.32 0.05 0.17 214 Y214H 0.62 0.05 1.39 0.09 0.62 214 Y214I 0.77 6.29 1.24 0.05 0.79 214 Y214K 0.41 0.05 1.09 0.05 0.35 214 Y214L 1.15 1.12 1.09 0.08 1.27 214 Y214M 0.73 5.63 1.26 0.05 0.79 214 Y214N 0.35 0.05 1.71 0.05 0.34 214 Y214P 0.22 0.05 1.41 0.05 0.17 214 Y214Q 0.56 0.05 1.56 0.05 0.58 214 Y214R 0.23 0.05 1.10 0.05 0.16 214 Y214S 0.28 0.05 2.05 0.05 0.25 214 Y214T 0.60 0.05 1.48 0.05 0.79 214 Y214V 0.73 2.05 1.17 0.05 0.83 214 Y214W 1.14 0.98 1.05 0.05 1.40 215 A215C 0.96 1.27 1.30 1.04 1.30 215 A215D 1.22 0.93 1.26 1.00 1.32 215 A215E 1.09 0.78 1.35 1.30 1.14 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') PI CS-38 32°C TCA AAPF 215 A215F 1.40 1.28 1.06 0.71 1.70 215 A215G 1.50 0.93 0.99 0.49 1.89 215 A215H 1.24 1.43 1.14 1.12 1.46 215 A215I 1.53 1.07 1.01 1.31 2.23 215 A215K 1.47 1.51 0.95 0.85 1.80 215 A215M 1.54 0.89 0.95 1.08 1.81 215 A215N 1.25 0.96 1.14 0.90 1.50 215 A215P 1.13 0.66 1.18 0.05 1.88 215 A215R 1.17 1.08 0.90 0.60 1.45 215 A215S 1.13 1.22 1.27 0.88 1.47 215 A215T 1.12 0.70 1.14 1.18 1.40 215 A215V 1.02 1.18 1.13 1.27 1.46 215 A215W 1.27 1.02 0.97 0.58 1.40 215 A215Y 1.13 1.28 1.12 0.99 1.29 216 S216A 1.13 1.26 1.02 0.87 1.52 216 S216C 1.03 1.06 1.15 1.04 1.11 216 S216D 1.14 1.15 1.17 0.96 1.40 216 S216E 1.13 1.05 1.17 1.11 1.43 216 S216F 1.31 0.98 0.88 1.02 1.54 216 S216G 1.05 1.11 1.04 0.26 1.23 216 S216H 1.08 1.30 1.04 1.06 1.24 216 S216I 1.24 1.01 0.86 1.04 1.50 216 S216K 1.24 1.00 0.82 0.08 1.35 216 S216L 1.20 0.96 0.95 0.93 1.23 216 S216M 1.12 1.23 1.00 0.95 1.24 216 S216N 1.19 1.06 0.95 0.90 1.50 216 S216P 1.26 1.00 0.91 0.73 1.33 216 S216Q 1.10 1.34 1.04 0.91 1.23 216 S216R 1.15 1.07 0.93 0.28 1.43 216 S216V 1.18 0.80 1.03 0.84 1.29 216 S216W 1.24 0.95 0.95 0.97 1.57 216 S216Y 1.06 1.25 1.12 1.08 1.18 217 L217A 0.85 3.15 0.95 0.84 0.42 217 L217C 0.95 1.63 1.08 1.05 0.34 217 L217D 1.78 0.93 0.89 0.95 0.09 217 L217E 0.84 4.61 1.44 0.98 0.10 217 L217F 1.22 1.09 0.79 0.87 1.06 217 L217G 0.90 2.21 0.78 0.66 0.58 217 L217I 0.98 1.92 0.93 0.06 0.50 217 L217K 1.31 1.06 0.79 1.08 0.59 217 L217M 0.81 4.01 1.10 1.09 0.56 217 L217N 0.79 5.86 1.31 0.60 0.26 217 L217P 0.19 0.05 0.05 ND 0.05 217 L217Q 0.91 2.34 1.18 1.05 0.44 217 L217S 0.60 0.05 1.55 0.75 0.27 217 L217T 0.74 13.21 1.19 0.13 0.27 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 217 L217V 077 7.00 1.13 0.05 0.25 217 L217Y 077 2.80 0.78 0.36 0.55 218 N218C 0.97 1.46 1.09 1.08 1.76 218 N218D 1.21 1.15 1.11 1.25 1.22 218 N218E 1.14 1.28 1.10 1.15 1.28 218 N218F 1.00 1.64 0.89 0.05 1.19 218 N218G 1.04 1.29 0.97 0.49 2.03 218 N218H 1.03 1.61 1.11 0.67 1.49 218 N218I 0.95 1.27 0.99 0.05 1.32 218 N218L 0.78 3.74 1.20 0.05 1.35 218 N218 0.91 1.72 1.07 0.25 1.51 218 N218P 0.67 0.05 1.36 0.05 0.69 218 N218Q 1.11 1.09 1.11 0.82 1.58 218 N218R 1.17 0.97 0.80 0.05 1.80 218 N218S 0.65 0.05 1.55 0.97 1.24 218 N218T 0.63 0.05 1.45 1.03 1.34 218 N218V 1.00 1.26 1.08 0.05 1.76 218 N218W 0.77 4.67 1.01 0.18 0.55 218 N218Y 0.81 3.45 1.24 0.25 1.05 219 G219A 1.33 0.17 0.05 ND 0.05 219 G219E 0.56 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219F 0.58 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219H 0.67 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219I 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219K 0.61 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219L 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219 0.64 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219P 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219Q 0.55 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219R 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219S 0.92 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219T 0.52 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219V 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219W 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 219 G219Y 0.52 0.05 0.05 ND 0.05 220 T220A 1.82 0.21 0.71 0.20 0.11 220 T220C 0.86 0.30 0.75 ND 0.05 220 T220D 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 220 T220E 0.66 0.64 0.05 ND 0.05 220 T220F 0.54 0.05 0.05 ND 0.05 220 T220G 1.75 0.27 0.66 ND 0.05 220 T220H 0.65 3.46 0.68 ND 0.05 220 T220M 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 220 T220N 1.83 0.05 0.19 ND 0.05 220 T220P 0.74 0.71 0.05 ND 0.05 220 T220R 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 220 T220S 1.18 0.74 1.05 0.23 0.35 220 T220V 1.70 0.23 0.66 0.07 0.10 220 T220W 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 220 T220Y 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221A 0.62 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221C 0.79 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221E 0.65 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221F 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221G 1.23 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221H 0.50 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221K 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221L 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221M 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221N 0.72 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221P 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221R 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221T 0.98 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221V 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221W 0.53 0.05 0.05 ND 0.05 221 S221Y 0.65 0.05 0.05 ND 0.05 222 M222A 1.17 1.05 0.80 0.77 0.08 222 M222C 1.19 0.85 0.89 1.10 0.48 222 M222E 1.76 0.63 0.76 ND 0.05 222 M222F 1.23 0.80 0.91 ND 0.05 222 222G 1.63 0.60 0.58 0.32 0.10 222 M222I 2.14 0.45 0.64 ND 0.05 222 M222K 2.31 0.37 0.20 ND 0.05 222 M222L 1.84 0.52 0.65 0.05 0.38 222 M222N 2.01 0.60 0.77 0.84 0.24 222 M222P 1.90 0.34 0.59 0.29 0.09 222 222Q 1.32 1.13 1.01 ND 0.05 222 M222R 2.15 0.14 0.10 ND 0.05 222 M222S 1.53 0.86 0.74 0.91 0.11 222 M222T 1.85 0.50 0.53 0.89 0.18 222 M222V 1.75 0.51 0.68 0.56 0.09 222 M222W 2.41 0.33 0.36 ND 0.05 222 M222Y 0.26 0.05 0.64 ND 0.05 223 A223C 1.25 0.37 0.76 0.05 0.21 223 A223D 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 223 A223F 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 223 A223G 1.11 1.17 1.12 0.09 0.98 223 A223H 0.48 0.05 0.05 ND 0.05 223 A223I 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 223 A223K 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 223 A223L 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 223 A223M 0.48 0.05 1.05 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pll 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 223 A223N 0.42 0.05 0.31 ND 0.05 223 A223P 0.52 0.05 0.05 ND 0.05 223 A223Q 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 223 A223R 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 223 A223S 1.35 0.84 0.98 0.97 1.09 223 A223T 0.40 0.05 0.90 0.05 0.18 223 A223V 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 223 A223W 0.44 0.05 0.05 ND 0.05 223 A223Y 0.35 0.05 0.05 ND 0.05 224 T224A 1.41 0.88 0.93 1.01 2.56 224 T224D 0.32 0.05 1.86 0.05 0.25 224 T224E 0.54 0.05 1.15 ND 0.05 224 T224F 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 224 T224G 0.89 1.72 1.21 0.41 0.87 224 T224H 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 224 T224I 1.23 0.09 0.67 0.05 0.09 224 T224K 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 224 T224L 1.09 1.05 1.03 0.08 0.59 224 T224 0.63 0.05 0.80 ND 0.05 224 T224N 1.52 0.87 0.90 0.84 1.56 224 T224P 2.00 0.05 0.41 0.37 0.08 224 T224Q 0.49 0.05 0.05 ND 0.05 224 T224R 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 224 T224S 1.15 1.15 1.04 1.10 1.90 224 T224W 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 224 T224Y 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 225 P225A 1.92 0.49 0.64 1.26 0.09 225 P225C 0.81 2.26 0.79 0.57 0.12 225 P225E 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 225 P225F 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 225 P225G 1.81 0.56 0.73 ND 0.05 225 P225H 0.41 0.05 0.05 ND 0.05 225 P225I 0.68 0.05 0.84 ND 0.05 225 P225K 0.41 0.05 0.05 ND 0.05 225 P225L 0.36 0.05 0.05 ND 0.05 225 P225M 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 225 P225N 1.14 0.30 0.40 ND 0.05 225 P225Q 0.38 0.05 0.05 ND 0.05 225 P225R 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 225 P225S 1.76 0.57 0.67 0.99 0.08 225 P225T 1.32 0.73 0.65 0.18 0.17 225 P225V 1.39 0.62 0.69 ND 0.05 225 P225W 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 225 P225Y 0.39 0.05 0.05 ND 0.05 226 I I226C 0.91 1.50 1.05 0.05 0.94 226 H226D 0.14 0.05 0.60 ND 0.05 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 226 H226F 1.16 0.89 1.10 0.05 0.54 226 H226G 0.49 0.05 1.33 0.05 0.49 226 H226I 0.70 2.09 1.17 0.05 0.64 226 H226K 0.23 0.05 0.68 0.05 0.15 226 H226L 0.57 1.68 1.18 0.05 0.61 226 H226M 0.87 1.69 1.17 0.05 0.83 226 H226N 0.51 0.05 1.46 0.05 0.54 226 H226P 0.20 0.05 0.05 ND 0.05 226 H226R 0.19 0.05 1.16 0.05 0.14 226 H226S 0.78 1.83 1.36 0.05 0.72 226 H226T 0.47 0.05 1.34 0.05 0.47 226 H226V 0.86 1.33 1.02 0.05 1.01 226 H226W 0.17 0.05 0.05 ND 0.05 226 H226Y 0.71 2.12 1.18 0.05 0.32 227 V227A 1.15 1.15 1.06 0.91 1.23 227 V227C 0.88 1.63 1.36 0.95 1.08 227 V227E 0.31 0.05 0.05 ND 0.05 227 V227F 0.56 0.05 1.39 0.05 0.48 227 V227G 1.08 0.67 1.03 0.79 0.97 227 V227H 0.25 0.05 0.05 ND 0.05 227 V227I 1.17 1.12 1.12 0.70 1.46 227 V227L 1.22 1.07 1.04 0.26 1.30 227 V227M 1.53 0.78 0.88 0.05 1.63 227 V227P 0.21 0.05 0.05 ND 0.05 227 V227Q 0.18 0.05 1.02 ND 0.05 227 V227R 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 227 V227S 1.15 1.00 0.90 0.33 1.22 227 V227T 1.55 0.60 0.78 0.44 1.80 227 V227W 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 227 V227Y 0.16 0.05 1.27 0.06 0.09 228 A228C 0.76 33.67 1.52 0.89 1.06 228 A228D 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 228 A228E 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 228 A228F 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 228 A228G 1.51 0.79 0.89 1.03 1.72 228 A228H 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 228 A228I 1.86 0.59 0.70 0.64 2.03 228 A228K 0.50 0.05 0.05 ND 0.05 228 A228L 0.45 0.05 1.92 0.41 0.55 228 A228M 0.34 0.05 2.16 ND 0.05 228 A228N 0.23 0.05 0.05 ND 0.05 228 A228P 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 228 A228Q 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 228 A228R 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 228 A228S 1.42 0.93 0.90 1.01 1.81 228 A228V 1.47 0.71 0.82 0.90 1.98 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') PI TCA CS-38 32°C AAPF 228 A228Y 0.47 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229A 0.88 1.72 1.27 0.65 1.09 229 G229C 0.22 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229D 0.41 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229E 0.41 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229F 0.46 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229H 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229K 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229L 0.40 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229P 0.22 0.05 2.34 0.96 0.21 229 G229R 0.54 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229S 1.06 1.36 1.02 0.28 1.38 229 G229T 0.18 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229V 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229W 0.51 0.05 0.05 ND 0.05 229 G229Y 0.43 0.05 0.05 ND 0.05 230 A230D 1.23 0.88 1.03 0.45 1.30 230 A230E 1.08 1.44 1.15 0.42 1.35 230 A230F 0.22 0.05 2.16 0.05 0.20 230 A230G 1.46 0.66 0.92 1.01 1.67 230 A230H 1.14 1.19 1.18 0.32 1.16 230 A230I 1.02 1.20 1.04 0.64 1.23 230 A230L 0.97 1.45 1.19 0.26 1.21 230 A230N 1.84 0.64 0.76 0.93 1.81 230 A230P 0.80 4.61 1.39 0.20 0.62 230 A230O 1.29 0.86 1.01 0.05 1.46 230 A230R 0.27 0.05 0.05 ND 0.05 230 A230S 0.98 1.57 1.25 0.93 1.30 230 ?230? 0.86 2.87 1.31 0.92 1.06 230 A230V 0.97 1.62 1.25 0.82 1.14 230 A230W 0.28 0.05 1.29 0.05 0.21 230 A230Y 0.19 0.05 2.62 0.16 0.19 2 1 A231C 1.01 1.48 1.21 0.82 1.19 231 A231 D 0.45 0.05 0.05 ND 0.05 231 A231E 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 231 A231F 1.90 1.07 0.84 ' 0.80 1.88 231 A231G 1.43 0.85 0.96 1.02 1.67 231 A231H 0.21 0.05 1.13 0.91 0.12 231 A231I 1.76 1.01 0.86 0.71 1.40 231 A231K 0.50 0.05 0.05 ND 0.05 231 A231 L 2.24 0.84 0.74 0.53 1.55 231 A231P 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 231 A231Q 0.29 0.05 0.05 ND 0.05 231 A231R 0.42 0.05 0.05 ND 0.05 231 A231S 1.83 0.90 0.86 0.81 2.21 231 A231T 1.63 1.07 0.91 0.63 1.79 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración µ1? 8 EDTA Ensayo Micromuestra Ensayo PI BPN') BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 235 K235I 1.05 1.62 1.23 1.01 1.37 235 K235L 1.21 1.00 1.13 1.10 1.39 235 K235M 1.47 1.01 1.02 0.91 1.58 235 K235N 1.69 0.76 1.05 1.02 2.05 235 K235Q 1.22 1.13 1.06 1.14 1.41 235 K235R 1.19 1.24 1.11 0.96 1.39 235 K235S 1.56 0.91 1.06 1.04 1.65 235 K235V 1.59 0.97 1.02 0.98 2.22 235 K235W 1.41 1.06 1.06 0.94 1.63 235 K235Y 1.77 0.74 1.00 0.97 1.94 236 Q236A 1.02 1.33 1.16 0.85 1.19 236 Q236C 0.87 2.36 1.37 0.89 1.14 236 0236E 1.00 1.36 1.41 1.25 1.14 236 Q236F 0.98 1.58 1.22 0.95 1.12 236 Q236G 0.78 6.07 1.53 0.77 0.93 236 Q236H 1.01 1.31 1.17 1.02 1.39 236 Q236K 1.12 1.20 0.95 0.69 1.39 236 Q236L 0.72 1.99 1.56 0.71 0.57 236 0236N 1.04 1.13 1.24 0.95 1.24 236 Q236P 0.17 0.05 2.71 0.81 0.17 236 Q236R 1.05 1.26 1.01 0.69 1.28 236 Q236S 0.89 2.14 1.28 0.86 1.03 236 Q236T 1.16 1.16 1.12 0.90 1.36 236 0236V 0.45 0.05 2.14 0.92 0.62 236 Q236W 0.82 4.08 1.39 0.75 1.01 236 Q236Y 1.22 1.02 1.07 0.81 1.49 237 K237A 1.25 1.26 1.19 1.00 1.57 237 K237C 0.97 1.73 1.34 1.19 1.17 237 K237D 0.57 0.05 0.05 ND 0.05 237 K237F 1.19 1.25 1.13 0.92 1.58 237 K237G 1.25 0.83 1.03 1.11 1.45 237 K237I-I 1.28 1.02 1.09 1.18 1.45 237 K237I 1.23 1.05 1.13 1.11 1.53 237 K237L 1.27 1.14 1.17 1.12 1.46 237 K237M 1.11 1.04 1.07 1.03 1.42 237 K237P 0.36 0.05 1.60 0.93 0.42 237 K237Q 1.42 0.96 1.05 1.00 1.82 237 K237R 1.05 1.86 1.25 1.02 1.48 237 K237S 1.15 1.20 1.20 0.98 1.54 237 K237T 1.49 1.06 1.01 1.13 1.61 237 K237V 1.26 1.02 1.03 1.12 1.34 237 K237W 1.65 0.83 1.04 1.08 1.87 237 K237Y 1.17 1.05 1.19 0.99 1.43 238 N238C 1.24 1.08 1.13 1.12 1.45 238 N238D 1.23 1.03 1.04 1.02 1.51 238 N238E 1.14 1.31 1.02 1.09 1.35 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra |)1I 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 238 N238F 1.26 1.16 1.10 1.02 1.56 238 N238G 1.05 1.36 1.21 0.94 1.33 238 N238H 1.17 1.08 0.99 1.01 1.37 238 N238I 1.47 1.01 0.95 1.10 1.75 238 N238K 1.47 0.95 0.89 0.99 1.60 238 N238L 1.59 0.89 0.98 1.11 1.68 238 N238M 1.03 1.17 1.11 0.92 1.28 238 N238P 0.28 0.05 0.05 ND 0.05 238 N238Q 1.29 0.94 1.03 0.94 1.50 238 N238R 1.10 1.14 1.06 0.90 1.34 238 N238S 1.15 1.34 1.02 0.91 1.33 238 N238T 1.32 1.04 1.06 1.03 1.33 238 N238V 0.94 1.62 1.02 0.96 1.15 238 N238Y 1.19 0.88 1.09 0.90 1.28 239 P239C 1.00 1.38 1.18 1.05 1.37 239 P239D 1.18 1.14 1.12 1.10 1.37 239 P239F 1.12 1.51 1.18 1.08 1.35 239 P239G 1.11 1.38 1.09 1.05 1.55 239 P239H 1.07 1.50 1.12 1.06 1.51 239 P239I 1.62 0.99 0.80 0.05 2.27 239 P239K 1.13 1.25 0.91 0.98 1.55 239 P239L 1.13 1.09 1.06 1.11 1.37 239 P239M 0.96 1.58 1.21 0.99 1.30 239 P239N 1.43 1.00 1.00 1.08 1.64 239 P2390 1.53 0.93 0.99 1.04 1.61 239 P239R 0.99 1.78 0.96 1.03 1.13 239 P239S 1.06 1.34 1.18 1.00 1.28 239 P239T 1.11 1.29 1.10 1.00 1.32 239 P239V 1.04 1.45 1.09 1.05 1.21 239 P239W 0.94 1.48 1.25 0.97 1.15 239 P239Y 1.02 1.14 1.18 0.94 1.21 240 S240A 1.04 1.52 1.11 0.97 1.46 240 S240C 1.04 1.55 1.23 1.00 1.30 240 S240E 1.09 1.15 1.24 1.04 1.37 240 S240F 1.26 1.24 1.06 0.96 1.59 240 S240I 1.10 1.00 1.02 0.95 1.50 240 S240K 1.24 1.13 0.88 0.97 1.59 240 S240L 0.67 12.41 1.50 1.07 0.92 240 S240M 0.91 1.59 1.18 0.95 1.20 240 S240N 0.94 1.57 1.27 0.95 1.29 240 S240Q 1.03 1.06 1.17 1.00 1.32 240 S240R 1.02 1.23 0.97 0.87 1.31 240 S240T 1.06 1.29 0.91 0.93 1.35 240 S240W 1.18 1.02 1.01 0.97 1.41 240 S240Y 1.34 0.97 0.97 0.98 1.46 241 W241A 1.52 1.23 0.86 0.98 1.96 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') CS-38 32°C TCA AAPF 241 W241C 1.72 0.93 0.86 1.07 2.04 241 W241D 1.29 1.00 1.15 1.07 1.68 241 W241E 1.13 1.08 1.12 1.01 1.56 241 W241F 0.94 1.41 1.28 1.02 1.25 241 W241G 0.87 2.18 1.40 0.97 1.21 241 W241H 1.94 0.93 0.74 1.04 2.21 241 W241I 1.84 1.02 0.84 1.15 1.99 241 W241K 1.83 0.93 0.75 1.03 2.19 241 W241L 1.26 1.13 1.02 1.17 1.52 241 W241 M 1.38 1.01 0.93 0.95 1.79 241 W241N 1.52 1.10 0.91 1.04 1.89 241 W241P 0.22 0.05 1.52 0.84 0.14 241 W241Q 1.59 0.96 0.87 1.03 2.06 241 W241R 1.55 1.05 0.78 0.96 1.80 241 W241S 1.55 1.13 0.87 0.91 2.00 241 W241T 1.14 1.24 1.14 1.05 1.47 241 W241V 1.95 0.79 0.75 1.06 2.07 241 W241Y 1.14 1.06 1.09 0.95 1.52 242 S242A 1.08 1.20 1.16 1.04 1.36 242 S242C 0.98 1.15 1.33 1.02 1.24 242 S242D 0.93 1.51 1.45 1.11 1.12 242 S242F 1.35 0.58 0.88 0.73 1.66 242 S242G 0.94 1.71 1.31 1.14 1.19 242 S242H 1.65 0.73 0.73 0.97 1.88 242 S242I 1.55 0.73 0.85 1.02 1.82 242 S242L 1.37 0.79 0.91 0.97 1.64 242 S242M 1.65 0.73 0.80 0.94 1.75 242 S242P 1.72 0.72 0.79 1.00 1.88 242 S242Q 1.32 0.90 0.98 1.04 1.45 242 S242R 1.29 0.90 0.86 0.63 1.42 242 S242T 0.93 1.70 1.30 0.88 1.28 242 • S242V 1.49 0.80 0.88 0.98 1.62 242 S242W 1.14 0.91 0.99 0.65 1.22 243 N243A 0.60 0.05 0.05 ND 0.05 243 N243C 0.94 1.35 1.26 1.00 1.20 243 N243D 1.64 0.69 0.91 0.92 1.58 243 N243E 1.46 1.02 0.96 1.11 1.48 243 N243F 1.71 0.90 0.82 0.93 1.46 243 N243G 1.36 1.02 1.00 1.03 1.68 243 N243H 1.30 1.11 0.94 1.13 1.47 243 243I 1.27 0.99 1.01 0.97 1.42 243 N243K 1.66 0.74 0.82 0.07 1.62 243 N243L 1.21 1.42 1.06 0.90 1.51 243 N243 1.14 1.28 1.06 0.99 1.48 243 N243P 1.63 0.90 0.78 0.96 2.05 243 N243Q 1.28 0.97 0.92 1.12 1.44 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Microniuestra pH 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') CS-38 32°C TCA AAPF 246 I246S 074 3.01 1.38 0.96 0.92 246 I246T 2.16 0.72 0.74 0.99 2.45 246 I246V 1.33 0.94 1.04 0.90 1.97 246 I246W 0.35 0.05 2.29 1.02 0.47 246 I246Y 0.34 0.05 2.59 0.89 0.38 247 R247A 1.13 1.23 1.03 0.87 1.44 247 R247C 1.25 1.05 1.10 1.02 1.30 247 R247D 1.40 0.96 0.96 0.65 1.46 247 R247E 0.95 1.63 1.29 0.68 1.06 247 R247F 1.15 1.08 0.99 0.93 1.35 247 R247G 1.52 0.97 0.96 0.95 1.77 247 R247H 1.71 1.15 0.92 1.03 1.58 247 R247I 1.42 1.02 0.97 0.79 1.25 247 R247K 1.35 1.13 0.93 1.12 1.24 247 R247L 1.56 0.99 0.92 0.93 1.33 247 R247M 1.07 1.57 1.09 0.82 1.26 247 R247N 1.82 0.83 0.83 1.09 1.55 247 R247P 0.31 0.05 1.90 0.87 0.20 247 R247Q 1.65 0.88 0.81 0.78 1.65 247 R247S 1.20 1.58 1.07 0.91 1.28 247 R247T 0.97 1.78 1.26 0.88 0.93 247 R247V 1.01 1.15 1.13 0.90 0.95 247 R247W 0.96 1.02 1.27 0.87 1.04 247 R247Y 1.10 1.21 1.10 0.98 1.22 248 N248C 0.89 1.59 1.43 1.00 1.30 248 N248D 1.20 0.96 1.21 0.99 1.41 248 N248E 1.28 0.86 0.92 1.04 1.57 248 N248G 1.22 0.83 1.06 1.00 1.68 248 N248H 1.33 1.05 1.03 1.01 1.79 248 N248I 1.07 1.57 1.15 0.92 1.61 248 N248K 1.38 1.03 0.96 0.76 2.01 248 N248L 1.08 1.26 1.15 0.93 1.56 248 N248M 0.55 0.05 2.27 ND 0.05 248 N248P 1.21 0.72 1.04 0.95 1.57 248 N248R 1.39 0.98 0.79 0.87 1.79 248 N248S 1.50 0.99 0.94 0.98 2.10 248 N248T 1.28 1.02 1.03 1.03 1.76 248 N248V 1.11 1.46 1.02 0.95 1.68 248 N248W 1.22 1.06 1.06 0.77 1.74 248 N248Y 1.19 1.04 0.98 0.90 1.65 249 H249A 1.12 1.09 1.08 0.88 1.54 249 H249D 1.84 0.76 0.83 1.10 2.01 249 H249E 1.57 1.02 0.94 1.03 2.03 249 H249F 0.98 0.84 1.20 1.01 1.32 249 H249G 2.16 0.75 0.72 1.00 2.26 249 H249I 1.34 1.03 0.92 1.13 1.63 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo 32°C PI BPN') BPN') TCA CS-38 AAPF 252 N252F 1.18 1.25 0.85 1.10 1.46 252 N252G 1.10 1.17 0.89 1.03 1.66 252 N252H 1.21 1.19 1.02 1.02 1.62 252 N252I 1.19 1.43 0.89 1.24 1.50 252 N252K 1.47 1.08 0.88 0.92 1.92 252 N252L 1.31 1.22 0.99 1.17 1.66 252 N252M 1.12 1.19 1.00 0.90 1.64 252 N252P 0.56 0.05 1.26 0.05 0.57 252 N252R 1.19 1.15 0.85 0.87 1.64 252 N252S 1.12 1.10 0.89 1.1 1 1.34 252 N252V 0.98 1.03 0.92 1.00 1.34 252 N252W 1.18 1.04 0.81 0.91 1.56 252 N252Y 0.49 0.05 1.65 1.05 0.63 253 T253A 1.13 1.28 1.20 0.84 1.50 253 T253D 1.13 0.67 0.93 0.39 1.17 253 T253E 1.33 0.61 1.04 1.00 1.64 253 T253F 0.91 1.45 1.25 0.74 1.27 253 T253G 1.78 0.88 0.78 0.61 1.86 253 T253H 1.55 0.85 0.84 0.91 1.79 253 T253I 1.05 0.92 1.01 0.21 1.16 253 T253K 1.51 0.76 0.84 0.74 1.93 253 T253M 0.99 1.33 0.97 0.91 1.28 253 T253P 0.15 0.05 0.05 ND 0.05 253 T253R 1.32 1.00 0.81 0.60 1.69 253 T253S 1.40 0.95 0.90 0.84 1.91 253 T253V 1.17 1.01 0.84 0.60 1.34 253 T253W 1.24 0.77 1.01 0.83 1.40 254 A254C 0.81 8.81 1.48 0.69 1.16 254 A254D 0.20 0.05 1.90 0.80 0 17 254 A254E 0.81 0.53 0.05 ND 0.05 254 A254F 0.14 0.05 0.05 ND 0.05 254 A254G 1.02 1.02 1.08 0.40 1.22 254 A254H 0.11 0.05 0.05 ND 0.05 254 A254K 0.15 0.05 0.05 0.05 0.13 254 A254L 0.11 0.05 0.05 ND 0.05 254 A254M 0.13 0.05 0.05 ND 0.05 254 ?254? 0.29 0.05 1.84 0.05 0.29 254 A254P 0.28 0.05 2.02 0.05 0.24 254 A254Q 0.13 0.05 0.05 0.05 0.07 254 A254R 0.18 0.05 0.05 0.05 0.19 254 A254S 1.20 1.12 0.99 0.79 1.66 254 A254T 0.97 1.59 1.23 0.39 1.37 254 A254V 0.71 0.05 1.56 0.05 0.90 254 A254W 0.10 0.05 0.05 ND 0.05 254 A254Y 0.11 0.05 0.05 ND 0.05 255 T255A 1.44 0.88 0.98 0.81 1.85 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pII 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 255 T255C 1.37 0.89 1.01 1.04 1.84 255 T255D 1.58 0.88 0.99 1.31 2.04 255 T255E 1.59 0.84 0.95 1.29 1.87 255 T255F 1.28 1.13 1.05 0.78 1.75 255 T255G 0.20 0.05 0.05 ND 0.05 255 T255H 1.40 0.93 0.98 0.05 1.85 255 T255I 1.71 0.93 0.85 1.09 2.21 255 T255L 1.46 1.05 0.89 1.00 1.89 255 T255N 1.51 1.22 0.92 0.88 2.03 255 T255P 1.57 0.92 0.80 0.13 2.11 255 T255Q 1.67 0.85 0.81 0.99 2.11 255 T255R 1.58 1.02 0.63 0.05 2.13 255 T255S 1.24 1.08 1.03 0.75 1.81 255 T255V 1.54 0.94 0.92 1.02 1.96 255 T255W 1.65 0.90 0.77 0.52 2.13 255 T255Y 1.54 0.89 0.88 0.81 1.93 256 S256A 0.89 1.75 1.13 1.05 1.15 256 S256C 1.12 1.09 0.89 1.06 1.39 256 S256D 1.24 1.07 1.15 1.15 1.58 256 S256E 1.28 0.92 1.06 1.13 1.48 256 S256G 0.94 1.06 1.22 0.98 1.09 256 S256H 1.16 1.14 0.96 1.03 1.34 256 S256I 1.16 1.02 0.92 0.91 1.53 256 S256K 1.46 0.94 0.76 0.80 1.71 256 S256L 1.20 1.00 0.86 0.93 1.42 256 S256M 0.99 1.23 1.15 0.91 1.26 256 S256N 0.99 1.46 1.09 1.07 1.21 256 S256P 1.26 1.09 0.94 0.93 1.59 256 S256R 1.37 0.99 0.73 0.60 1.76 256 S256T 0.92 1.75 1.40 0.76 1.32 256 S256V 0.91 1.43 1.31 0.82 1.24 256 S256W 1.09 1.09 0.93 0.91 1.15 256 S256Y 1.02 1.22 0.88 0.90 1.19 257 L257A 0.80 2.90 1.28 0.05 1.06 257 L257C 0.89 1.29 1.32 0.57 0.96 257 L257E 0.26 0.05 2.35 0.05 0.33 257 L257F 0.92 1.42 1.17 0.05 1.04 257 L257G 0.55 0.05 1.48 0.05 0.73 257 L257H 0.61 0.05 1.56 0.05 0.79 257 L257I 1.38 0.96 0.82 0.77 1.59 257 L257K 0.92 2.29 0.98 0.05 1.33 257 L257M 1.02 1.11 1.03 0.64 1.29 257 L257P 0.42 0.05 1.82 0.05 0.50 257 L257S 0.50 0.05 1.76 0.05 0.69 257 L257T 0.60 0.05 1.65 0.05 0.83 257 L257V 0.95 1.32 1.29 0.43 1.28 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pII 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 257 L257W 0.46 0.05 1.58 0.05 0.57 257 L257Y 0.60 0.05 1.38 0.05 0.82 258 G258A 1.04 1.01 1.11 0.26 1.25 258 G258C 1.01 0.92 1.17 0.60 1.24 258 G258D 1.02 0.99 1.33 0.93 1.28 258 G258E 0.79 1.18 1.52 0.90 0.99 258 G258F 1.23 0.90 0.95 0.05 1.40 258 G258H 1.27 0.83 0.97 0.28 1.45 258 G258I 0.85 1.11 1.27 0.08 0.97 258 G258L 0.95 1.08 1.14 0.08 1.35 258 G258M 1.09 0.91 1.07 0.16 1.20 258 G258P 0.99 0.81 1.19 0.05 1.11 258 G258Q 1.12 0.77 1.10 0.34 1.40 258 G258R 1.15 1.07 0.86 0.05 1.31 258 G258S 1.25 1.21 1.00 0.28 1.49 258 G258T 0.90 1.07 1.16 0.05 1.14 258 G258V 0.85 1.03 1.32 0.05 0.96 258 G258W 0.88 1.31 1.02 0.05 1.02 258 G258Y 0.99 1.01 1.18 0.15 1.21 259 S259A 1.27 1.24 0.76 0.98 1.49 259 S259C 0.88 1.08 1.38 0.98 1.18 259 S259E 0.99 1.15 1.32 1.08 1.36 259 S259G 1.15 1.03 1.11 0.58 1.37 259 S259I 0.94 1.18 1.12 0.41 1.16 259 S259L 0.81 1.65 1.26 0.41 1.21 259 S259M 0.88 1.47 1.17 0.52 1.11 259 S259P 0.96 1.53 1.33 1.00 1.40 259 S259Q 0.92 1.76 1.22 0.87 1.15 259 S259R 0.97 1.64 0.83 0.26 1.29 259 S259T 0.98 1.25 1.19 0.75 1.25 259 S259V 1.05 1.07 1.18 0.45 1.30 260 T260A 1.52 1.06 0.98 0.88 1.66 260 T260D 0.89 1.30 1.45 1.01 1.11 260 T260E 0.93 1.15 1.26 1.11 1.11 260 T260F 1.03 1.22 1.05 0.47 1.29 260 T260H 1.37 1.19 0.90 0.81 1.79 260 T260I 1.23 1.27 1.09 0.95 1.42 260 T260L 1.36 1.09 1.09 0.54 1.59 260 T260M 1.30 1.17 1.14 0.77 1.59 260 T260N 1.29 0.99 1.00 0.94 1.73 260 T260P 1.32 1.01 1.11 1.15 1.53 260 T260R 1.19 1.25 0.89 0.60 1.65 260 T260S 1.07 1.34 1.19 0.94 1.38 260 T260V 0.97 1.32 1.06 0.93 1.24 260 T260Y 1.07 0.89 0.99 0.76 1.30 261 N261A 1.26 1.33 1.04 1 0.98 1.70 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración pH 8 EDTA Ensayo Micromuestra Ensayo BPN') BPN') 32°C PI TCA CS-38 AAPF 261 N261C 0.93 1.06 1.38 1.15 1.12 261 N261E 1.01 1.10 1.34 1.11 1.33 261 N261F 1.05 1.13 1.05 1.08 1.41 261 N261G 1.42 0.76 0.92 0.73 1.70 2 1 N261 I 1.37 1.10 0.99 1.14 1.72 261 N261K 1.59 1.05 0.80 0.88 1.91 261 N261L 1.34 1.01 1.00 1.27 1.44 261 N261P 1.40 0.96 1.04 0.97 1.70 261 N261Q 1.13 1.17 1.06 1.11 1.35 261 N261R 1.26 1.05 0.75 0.78 1.71 261 N261S 1.32 1.06 1.06 1.00 1.53 261 ?26GG 0.91 1.44 1.06 1.09 1.23 261 N261V 0.96 1.27 1.08 1.14 1.23 261 N261W 1.15 1.02 0.89 1.16 1.42 261 N261Y 0.97 1.19 0.95 1.18 1.13 262 L262A 1.24 1.31 1.02 0.85 1.66 262 L262C 1.22 0.90 1.16 1.04 1.60 262 L262D 1.07 1.09 1.33 1.20 1.38 262 L262F 1.21 1.12 1.05 1.03 1.60 262 L262G 0.99 0.89 1.06 0.39 1.31 262 L262H 1.34 0.98 0.96 1.21 1.60 262 L262I 1.40 1.00 0.97 1.06 1.78 262 L262K 1.32 0.99 0.72 0.62 1.67 262 L262M 1.42 1.05 0.96 0.99 1.80 262 L262P 0.62 0.05 1.53 0.06 0.86 262 L262Q 1.19 1.05 1.00 1.09 1.46 262 L262R 1.29 1.11 0.62 0.19 1.47 262 L262S 1.14 1.16 1.04 0.75 1.52 262 L262T 1.05 1.18 1.19 0.85 1.31 262 L262V 1.10 1.32 1.06 0.91 1.52 262 L262W 1.10 1.08 1.11 0.72 1.36 262 L262Y 1.16 1.13 1.04 0.90 1.63 263 Y263A 0.64 19.07 1.22 0.05 0.89 263 Y263C 0.84 0.62 1.19 0.38 0.85 263 Y263D 0.32 0.05 1.75 0.05 0.19 263 Y263F 1.35 1.10 1.13 0.69 1.84 263 Y263G 0.26 0.05 1.31 0.05 0.18 263 Y263H 0.71 4.21 1.15 0.48 0.98 263 Y2631 0.53 0.05 1.31 0.05 0.67 263 Y263K 0.54 0.05 0.84 0.05 0.60 263 Y263L 0.84 2.05 1.28 0.06 1.20 263 Y263M 0.53 0.05 1.44 0.13 0.63 263 Y263N 0.59 1.27 1.42 0.09 0.86 263 Y263P 0.33 0.05 1.27 0.07 0.09 263 Y263Q 0.36 0.05 1.68 0.05 0.43 263 Y263R 0.30 0.05 1.00 0.05 0.25 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pide Ensayo de ?? ??? LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo I BPN') BPN') CS-38 32°C TCA AAPF 263 Y263W 0.45 0.05 1.36 0.05 0.44 264 G264A 0.92 1.99 1.10 0.05 1.18 264 G264C 0.27 0.05 2.39 0.06 0.22 264 G264E 0.28 0.05 1.97 0.05 0.07 264 G264F 0.21 0.05 1.36 0.06 0.08 264 G264H 0.15 0.05 1.36 0.13 0.06 264 G264I 0.21 0.05 1.07 ND 0.05 264 G264L 0.22 0.05 0.98 0.07 0.06 264 G264P 0.24 0.05 1.06 0.05 0.09 264 G264Q 0.22 0.05 1.38 0.08 0.07 264 G264R 0.15 0.05 0.05 0.10 0.06 264 G264S 0.62 0.05 1.47 0.05 0.74 264 G264T 0.22 0.05 0.96 0.18 0.07 264 G264V 0.22 0.05 1.10 ND 0.05 264 G264Y 0.24 0.05 1.16 0.09 0.06 265 S265A 1.21 ' 1.49 1.05 0.86 1.65 265 S265C 0.79 1.85 1.22 0.99 1.06 265 S265D 1.02 1.07 1.17 1.04 1.16 265 S265F 1.02 1.32 1.09 0.26 1.25 265 S265G 0.94 1.76 1.05 0.31 1.22 265 S265H 1.11 1.17 1.07 0.73 1.59 265 S265I 0.34 0.05 1.45 0.05 0.33 265 S265K 1.46 1.12 0.83 0.16 2.00 265 S265L 0.77 3.33 1.18 0.05 0.90 265 S265M 1.02 1.45 1.16 0.55 1.42 265 S265N 0.37 0.05 0.05 ND 0.05 265 S265P 0.26 0.05 1.23 0.05 0.16 265 S265Q 1.06 1.00 1.20 0.79 1.26 265 S265 1.03 1.99 0.86 0.05 1.56 265 S265T 0.87 2.15 1.20 0.39 1.26 265 S265V 0.75 4.75 1.34 0.05 0.97 265 S265W 0.93 1.08 1.29 0.31 1.17 265 S265Y 0.97 1.17 1.19 0.49 1.22 266 G266A 0.19 0.05 0.62 ND 0.05 266 G266C 0.25 0.05 0.72 0.05 0.09 266 G266D 0.24 0.05 0.78 0.08 0.07 266 G266E 0.22 0.05 0.55 ND 0.05 266 G266H 0.23 0.05 0.53 0.06 0.06 266 G266I 0.17 0.05 0.05 0.05 0.06 266 G266K 0.17 0.05 0.69 0.06 0.09 266 G266L 0.22 0.05 0.75 0.05 0.08 266 G266M 0.20 0.05 0.05 ND 0.05 266 G266N 0.21 0.05 0.59 0.12 0.06 266 G266Q 0.19 0.05 0.62 ND 0.05 266 G266R 0.18 0.05 0.05 0.06 0.09 266 G266S 0.20 0.05 0.05 0.05 0.06 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pII 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 266 G266T 0.11 0.05 0.05 ND 0.05 266 C.266V 0.11 0.05 0.05 0.05 0.07 266 G266W 0.12 0.05 1.08 0.05 0.10 266 G266Y 0.13 0.05 0.95 0.05 0.10 267 L267A 0.77 3.80 1.43 0.05 1.03 267 L267C 0.55 0.05 1.63 0.05 0.75 267 L267D 0.20 0.05 1.41 0.05 0.12 267 L267E 0.15 0.05 2.22 0.16 0.16 267 L267F 0.70 0.89 1.47 0.05 0.87 267 L267G 0.85 2.17 1.08 0.05 1.18 267 L267H 0.65 0.05 1.29 0.05 0.88 267 L267I 1.32 1.05 0.96 0.90 1.54 267 L267K 0.76 1.17 1.21 0.05 1.24 267 L267M 0.87 2.12 1.22 0.58 1.12 267 L267N 0.92 1.55 1.08 0.05 1.37 267 L267P 0.19 0.05 0.05 0.09 0.06 267 L267S 0.58 0.05 1.74 0.05 0.85 267 L267T 0.46 0.05 1.81 0.05 0.63 267 L267V 0.94 1.50 0.93 0.08 1.26 267 L267W 0.17 0.05 0.05 0.05 0.24 267 L267Y 0.48 0.05 1.38 0.05 0.64 268 V268A 1.29 0.89 1.12 0.81 1.42 268 V268D 0.70 0.05 1.39 0.26 0.79 268 V268E 0.65 0.05 1.45 0.65 0.72 268 V268G 1.54 0.79 0.93 0.08 1.77 268 V268H 0.88 1.38 1.13 0.05 0.83 268 V268K 0.59 0.05 1.43 0.32 0.73 268 V268L 1.28 0.99 0.99 0.87 1.62 268 V268 1.00 1.17 0.97 0.60 1.35 268 V268N 1.33 0.87 0.96 0.14 1.72 268 V268P 1.67 0.56 0.81 0.20 1.70 268 V2680 1.39 0.89 0.93 0.35 1.69 268 V268R 0.33 0.05 2.81 ND 0.05 268 V268S 1.18 0.92 0.94 0.33 1.47 268 V268W 0.16 0.05 2.12 0.06 0.06 268 V268Y 0.15 0.05 2.50 0.05 0.12 269 N269C 0.67 3.47 1.37 0.99 1.06 269 N269D 0.95 1.22 1.39 1.12 1.39 269 N269F 1.33 1.35 1.10 0.07 1.96 269 N269G 1.29 1.00 1.08 0.43 1.61 269 N269H 1.04 1.72 1.17 0.94 1.41 269 N269I 1.59 1.14 1.04 0.44 2.15 269 N269L 1.68 0.99 1.03 0.19 2.17 269 N269M 1.18 1.31 1.18 0.75 1.61 269 N269Q 1.38 1.02 1.00 0.99 1.80 269 N269R 0.95 1.47 0.91 0.05 1.33 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de Pi de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo 32°C PI BPN') BPN') TCA CS-38 AAPF 269 N269S 0.97 1.45 1.25 0.81 1.26 269 N269T 1.19 1.27 1.23 0.48 1.55 269 N269V 1.1 1 1.28 1.06 0.42 1.72 270 A270C 1.25 1.31 1.19 0.99 1.76 270 A270D 1.19 1.29 1.18 0.60 1.54 270 ?270? 0.22 0.05 1.54 0.05 0.26 270 A270F 0.72 4.90 1.17 0.05 0.98 270 A270G 1.09 1.22 1.14 0.97 1.39 270 A270H 0.57 0.05 1.34 0.05 0.65 270 A270I 1.13 1.27 1.15 0.81 1.39 270 A270K 0.19 0.05 0.05 Ni) 0.05 270 A270L 0.97 1.66 1.19 0.86 1.30 270 A270M 1.19 1.20 1.18 0.54 1.52 270 A270N 0.92 1.84 1.20 0.82 1.33 270 A270P 0.80 1.50 1.25 0.25 1.05 270 A270Q 0.49 0.05 1.53 0.12 0.59 270 A270S 1.10 1.07 1.06 0.85 1.61 270 A270T 0.94 1.64 1.04 0.96 1.30 270 A270V 0.90 1.63 1.21 0.94 1.34 270 A270W 0.14 0.05 0.05 ND 0.05 271 E271A 1.52 1.14 0.79 0.42 1.81 271 E271C 1.20 1.09 1.21 0.88 1.61 271 E271F 1.13 1.44 0.91 0.22 1.56 271 E271G 1.22 1.40 0.89 0.36 1.73 271 E271H 1.18 1.73 1.00 0.52 1.63 271 E271I 1.23 1.04 0.98 0.06 1.60 271 E271K 1.21 1.28 0.70 0.06 1.62 271 E271L 0.98 1.53 0.93 0.29 1.24 271 E271M 1.21 1.35 0.92 0.39 1.65 271 E271N 1.01 1.35 0.93 0.33 1.32 271 E271P 0.95 1.43 0.94 0.05 1.21 271 E271T 0.94 1.64 1.05 0.30 1.32 271 E271V 0.95 1.25 1.00 0.13 1.57 271 E271 Y 0.98 1.22 0.86 0.44 1.27 272 A272C 1.00 1.21 1.08 0.97 1.28 272 A272D 0.98 1.25 1.09 1.04 1.37 272 A272E 0.98 1.40 1.13 1.02 1.37 272 A272F 1.06 1.40 0.95 0.95 1.44 272 A272G 1.26 0.79 1.00 0.95 1.66 272 A272I-I 1.29 0.96 0.88 0.92 1.68 272 A272K 1.31 0.99 0.87 0.64 1.53 272 A272L 1.38 0.85 1.00 1.07 1.75 272 ?272? 1.17 1.06 1.09 0.97 1.58 272 A272N 1.10 1.15 1.02 0.98 1.36 272 A272P 1.43 0.85 0.94 0.95 1.96 272 A272R 0.96 1.24 1.04 0.65 1.33 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICIÓN Variante GG36 PI de PI de Ensayo de Pl BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo PI BPN') BPN') TCA CS-38 32°C AAPF 272 A272S 0.86 2.78 1.26 0.92 1.20 272 A272T 1.02 1.35 1.06 0.97 1.38 272 A272W 1.16 0.92 1.02 0.94 1.35 272 A272Y 1.03 1.08 1.17 1.02 1.28 273 A273C 1.01 1.38 1.14 0.99 1.23 273 A273D 0.95 1.36 1.11 0.05 1.23 273 A273E 0.99 1.31 1.15 0.05 1.31 273 A273F 1.14 1.09 1.08 0.05 1.28 273 A273G 0.99 1.43 1.01 1.03 1.24 273 A273H 0.99 1.19 1.10 0.08 1.19 273 A273I 0.97 1.61 1.04 0.17 1.12 273 A273 0.65 0.05 1.18 0.05 0.85 273 A273L 1.12 1.08 1.01 0.40 1.41 273 A273R 0.68 0.05 1.12 0.05 0.76 273 A273S 0.89 2.21 1.06 0.82 1.29 273 A273T 0.81 4.52 1.09 0.53 1.06 273 A273V 1.07 1.22 1.03 0.62 1.36 273 A273W 0.38 0.05 1.70 0.05 0.48 273 A273Y 0.54 0.05 1.39 0.05 0.64 274 T274A 1.09 1.29 1.05 0.97 1.40 274 T274C 1.06 1.26 1.01 1.01 1.18 274 T274D 0.86 2.23 1.27 0.69 1.00 274 T274E 0.91 1.44 1.33 0.21 1.14 274 T274G 0.92 1.55 1.20 0.87 1.16 274 T274H 1.03 1.42 1.07 0.21 1.34 274 T274K 0.76 3.48 1.19 0.10 1.00 274 T274L 1.28 0.97 0.97 0.97 1.55 274 T274M 1.17 1.01 1.04 0.90 1.26 274 T274N 1.05 1.20 1.12 0.92 1.27 274 T274P 0.88 1.60 1.25 0.05 1.05 274 T274Q 1.23 0.97 1.03 0.49 1.38 274 T274R 0.89 1.52 1.06 0.05 1.09 274 T274S 1.33 0.98 0.97 1.02 1.44 274 T274W 1.09 1.27 1.14 0.13 1.27 275 R275A 0.51 0.05 1.62 1.06 0.67 275 R275C 0.46 0.05 1.37 1.06 0.62 275 R275D 1.12 1.25 0.94 1.07 1.70 275 R275E 1.26 0.92 1.19 1.12 1.65 275 R275F 1.12 1.02 1.03 1.16 1.42 275 R275G 0.64 0.05 1.42 1.10 0.90 275 R275H 1.15 1.06 1.05 1.13 1.46 275 R275K 1.30 0.95 1.02 1.07 1.59 275 R275L 0.82 2.73 1.25 1.08 1.13 275 R275M 0.81 5.83 1.31 1.16 1.03 275 R275P 1.05 0.94 1.09 0.90 1.38 275 R275Q 1.21 0.90 0.86 1.09 1.51 Tabla 4-1 (cont). Valores del índice de Desempeño (PI) para Variantes de GCI- P036 para Varias Propiedades Probadas.

POSICION Variante GG36 PI de PI de Ensayo de PI BMI LAS- PI de (Numeración (Numeración Ensayo Micromuestra pH 8 EDTA Ensayo BPN') BPN') TCA CS-38 32°C PI AAPF 275 R275V 0.75 3.80 1.21 0.99 0.99 275 R275W 079 10.11 1.31 0.96 1.20 EJEMPLO 5 Evaluación Comparativa de Datos Variantes GCI-P036 En este Ejemplo, se comparan los resultados de los experimentos conducidos para determinar la expresión de proteína, actividad de remoción de mancha, estabilidad LAS/EDTA, y actividad 7AAPF (purebas de propiedades de interés) de variantes GCI-P036 y GCI-P036. Como se describe a través de este, la funcionalidad de las variantes GCI-P036 se cuantifica como un índice de desempeño (PI) , que es la relación de desempeño de una variante a una proteasa de referencia. Las clasificaciones PI usadas en la presente incluyen: mutaciones Hacia Arriba (PI > 1.0); mutaciones Neutrales (PI > 0.5); mutaciones no Perjudiciales (PI > 0.05); y mutaciones Perjudiciales (PI < 0.05).

En las separaciones por exclusión iniciales de variantes GCI-P036, al menos una mutación en las siguientes posiciones se asoció con un índice de desempeño mayor que 1.0 (PI > 1.0) para al menos una propiedad: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, y 275 (por ejemplo, mutaciones Hacia Arriba) . Las mutaciones en estas posiciones pueden combinarse para mejorar la actividad o estabilidad o expresión.

En particular, se asociaron las siguientes sustituciones en GCI-P036 con un resultado favorable en al menos una prueba de interés (por ejemplo, mejor que la enzima de tipo natural) . Estas mutaciones son especialmente útiles para mejorar propiedades individuales. Como se indica en cualquier lugar en la presente, en esta lista, el primer "0" se incluye para proporcionar una designación de tres números para cada sitio (por ejemplo, "001" es el mismo como "1," así "A001C" es el mismo como "A1C"). Además, como se indica en cualquier lugar en la presente, "X" se refiere a cualquier residuo de aminoácido. X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005 , X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I, X010K, X010L, X010M, X010N, X010Q, X010R, X010S, X010T, X010V, X010 , X010Y, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I, X011M X011S X011T X011V X012D X012F X012G X012H, X012I X012K X012L X012M X012N X012P X012Q X012R, X012S X012T X012V X012W X013A X013G X013I X013M, X013Q X013T X013V X014A X014C X014D X014E X014F, X014G X014H X014I X014K X014L X014P X014Q X014S, X014T X014V X014Y X015A X015D X015F X015G X015I, X015K X015L X015M X015P X015Q X015R X015S X015V, X015 X016A X016D X016E X016G X016L X016N X016P, X016Q X016R X016S X016T X016V X017A X017D X017E, X017F X017G X017H X017I X017K X017M X017N X017R, X017S X017T X017V X017 X017Y X018A X018C X018D, X018E X018F X018G X018H X018K X018L X018M X018N, X018P X018Q X018R X018S X018T X018V X018 X018Y, X019A X019C X019D X019E X019F X019G X019H X019K, X019L X019M X019N X019P X019R X019S X019T X019V, X019 X019Y X020A X020C X020D X020F X020G X020I, X020K X020L X020 X020P X020Q X020R X020S X020T, X020V X020W X020Y X021A X021C X021D X021E X021G, X021H X021I X021K X021L X021M X021N X021P X021Q, X021R X021S X021T X021V X021W X022A X022C X022G, X022I X022K X022L X022M X022N X022P X022Q X022R, X022S X022T X022V X022 X022Y X023A X023G X023S, X024A X024C X024D X024F X024G X024H X024L X024M, X024N X024P X024Q X024R X024S X024T X024V X024W, X025C X025D X025E X025F X025G X025H X025K X025L, X025M X025N X025Q X025R X025S X025T X025V X025W, X026C X026F X026G X026I X026L X026M X026N X026P, X026R X026S X026T X026V X027A X027C X027D X027F, X027G X027I X027K X027L X027 X027N X027P X027R, X027S X027T X027V X027W X027Y X028A X028E X028H, X028I X028L X028M X028N X028S X028V X028Y X029A, X029C X029G X029K X029S X029T X029V X030C X030D, X030E X030F X030L X030M X030Q X030S X030T X030V, X031A X031F X031I X031L X031M X031S X031T X031V, X032C X032D X032G X033A X033C X033D X033E X033G, X033H X033I X033L X033M X033N X033Q X033R X033S, X033T X033V X033Y X034E X034G X034S X035A X035F, X035H X035I X035K X035L X035M X035P X035Q X035R, X035S X036A X036C X036E X036F X036G X036H X036I, X036L X036M X036N X036P X036Q X036R X036S X036T, X036V X036W X036Y X038C X038F X038G X038H X038I, X038K X038L X038M X038N X038Q X038R X038T X038V, X038W X038Y X039A X039E X039G X039H X039N X039Q, X039S X039T X039V X039Y X040A X040C X040D X040E, X040G X040H X040I X040K X040L X040M X040N X040P, X040R X040S X040T X040V X040 X040Y X041C X041D, X041E X041N X041Q X042A X042C X042F X042G X042H, X042I X042L X042M X042N X042Q X042S X042T X042V, X042Y X043A X043C X043D X043E X043F X043G X043I, X043L X043M X043N X043P X043R X043S X043T X043V, X043 , X043Y, ?044?, X044C, X044D, X044F, X044G, ?044?, X044K, X044L, ?044?, ?044?, ?044?, X044Q, X044R, X044S, X044T, X044V, X044 , ?044?, ?045?, X045D, X045F, X045G, X045H, X045I, ?045?, X045L, ?045?, ?045?, ?045?, X045Q, X045R, X045S, ?045?, X045V, X045 , ?045?, X046C, X046D, X046E, X046F, X046G, ?046?, ?046?, ?046?, X046L, ?046?, X046N, X046P, X046Q, X046R, X046S, ?046?, X046V, X046W, X047A, X047C, ?047?, X047F, X047G, ?047?, ?047?, X047L, X047M, X047N, X047Q, X047R, X047S, ?047?, X047W, ?048?, X048C, X048E, X048F, X048G, ?048?, ?048?, ?048?, 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X129F X129G X129I , X129L X129M X129N X129P X129R X129S X129T X129V, X129W X129Y X130C X130K X130L X130N X130Q X130R, X130S X130V X130W X130Y X131A X131D X131E X131F, X131G X131I X131K X131L X131M X131P X131Q X131R, X131V X132A X132E X132F X132H X132I X132L X132M, X132N X132Q X132S X132T X132W X133A X133F X133K, X133L X133N X133P X133Q X133S X133T X133V X133Y, X134A X134F X134I X134L X134M X134P X134S X134T, X134V X135A X135C X135E X135F X135L X135M X135Q, X135T X135W X136A X136D X136E X136F X136G X136K, X136N X136Q X136R X136S X136V X136W X136Y X137A, X137C, X137E, X137G, X137H, X137K X137L X137M, X137R, X137S, X137V X137 X138A X138C X138E, X138L, X138M, X138Q X138R X138V X139A X139C, X139F, X139G, X 1391, X139M X139Q X139S X139T, X139Y, X140A, X140C X140D X140E X140F X140G, X140K, X140L, X140M X140N X140Q X140R X140S, X140V, X140Y, X141D X141E X141G X141H X141I, X141L, X141N, X141Q X141R X141S X141V X141Y, X142C, X142E, X142G X142I X142L X142M X142N, X142S, X142T, X142V X142Y X143C X143D X143F, X143H, X143I, X143K X143L X143M X143N X143S, X143V, X143W, X143Y X144A X144C X144D X144G( X144I, X144L, X144M X144N X144Q X144R X144S, X144V, X144W, X144Y X145A X145C X145D X145E, X145G, X145K, X145L X145M X145N X145Q X145R, X145T, X145W, X145Y X146A X146C X146D X146E, X146G, X146I, X146K X146L X146M X146Q X146R, X146T, X146W, X146Y X147F X147G X147I X147L, X147P, X147Q, X147T X147V X148A X148C X148E, X148G, X148H, X148I X148L X148M X148N X148S, X148V, X148W, X148Y X149A X149C X149F X149G, X149I, X149L, X149M X149P X149Q X149S X149T, X150A, X150E, X150F X150G X150H X150L X150P, X150S, X150T, X150V X151A X151G X151M X151S, X151V, X152A, X152C X152P X152R X152S X152T, X153G, X153I X153M X153Q X153S X153V X154G X154Q, X155A, X155D X155F X155I X155N X155P X155Q X155R, X155S, X155T X155V X155Y X156A X156C X156D X156E, X156F, X156G X156K X156L X156M X156N X156P X156Q, X156R, X156S X156T X157G X157L X157V X158A X158C, X158E, X158F X158H X158K X158L X158M X158P X158Q, X158R, X158S X158T X158V X158W X159A X159C X159E, X159G, X159H X159M X159P X159Q X159R X159S X159V, X159W, X159Y X160A, X160C, X160D, X160F, X160G, X 1601, X160L, X160M X160N X160Q X160R X160S X160T X160V, X160Y, X165D X165E X165F X165G X165H X165I X165K, X165L, X165R X165T X165V X165W X165Y X166A X166C, X166D, X166E X166H X166I X166L X166M X166N X166P, X166R, X166S X166T X166V X166 X167A X167C X167D, X167E, X167F X167G X167I X167P X167Q X167V X167W, X167Y, X168F X168I X168M X168P X169A X169C X169G, X169S, X170A X170D X170E X170G X170H X170K X170L, X170P, X170Q X170R X170S X170V X170W X170Y X171A, X171C, X171D X171F X171G X171H X171I X171L X171N, X171Q, X171S X171T X171W X171Y X172A X172C X172D, X172F, X172G X172I X172K X172L X172M X172P X172Q, X172R, X172S X172T X172V X172Y X173A X173C X173D, X173E, X173F X173G X173H X173I X173K X173L X173M, X173N, X173P X173Q X173R X173T X173V X173 X173Y, X174A, X174G X174I X174N X174P X174S X174T X174V, X175A, X175C, X175E X175G, X175H, X175I X175K, X175M, X175Q X175S X175T X175V X175Y X176A, X176E, X176G X176I X176P X176S X176T X176V, X177C, X177I X177T X177V X178A X178G X178S, X179C, X179G X180C X180G X180H X180I X180L, X180Q, X180S X180T X180V X181A X181D X181E, X181L, X181N X182A X182D X182E X182F X182G, X1821, X182K X182L X182M X182N X182P X182Q, X182S, X182T X182V X182W X182Y X183A X183D, X183G, X183H X183I X183K X183L X183M X183N, X183Q, X183R X183S X183T X183V X183 X183Y, X184C, X184D X184E X184G X184H X184L X184M, X184S, X184T X184Y X185A X185C X185E X185F, X185H, X185I X185K X185L X185M X185N X185Q, X185S, X185T X185V X185Y X186A X186G X186H, X186K, X186L X186M X186Q X186R X186T X186 , X187C, X187E X187F X187G X187H X187I X187M, X187 , X187Y X188A X188D X188E X188F X188G, X188I, X188K X188L X188P X188Q X188R X188S, X188V, X188W X188Y X189A X189C X189E X189F, X189H, X189K X189L X189M X189N X189P X189Q, X189S, X189T X189V X190D X190E X190F X190G, X190I, X190K X190L X190M X190N X190P X190Q, X190S, X190V X190W X190Y X191A X191D X191F, X191I, X191K X191L X191P X191Q X191S X191V, X191Y, X192D X192E, X192H X192L, X192M, X192P, X192Q, X192R, X192T X192V, X192W X192Y, X193A, X193D, X193E, X193F, X193G X193H, X193I X193K, X193L, X193R, X193T, X193V, X193W X193Y, X194A X194C, X194D, X194E, X194F, X194G, X194H X194I, X194L X194M, X194P, X194Q, X194R, X194S, X194T X194V, X194W X194Y, X195A, X195C, X195D, X195E, X195G X195K, X195Q X195R, X195S, X195T, X195V, X195Y, X196A X196D, X196E X196F, X196I, X196L, X196M, X196P, X196Q X196T, X197A X197C, X197D, X197E, X197F, X197G, X197H X197I, X197L X197M, X197N, X197Q, X197S, X197T, X197V X197W, X197Y X198A, X198D, X198E, X198F, X198G, X198H X198I, X198L X198M, X198N, X198Q, X198R, X198S, X198T X198W, X198Y X199A, X199C, X199D, X199E, X199F, X199G X199I, X199L X199M, X199Q, X199S, X199T, X199V, X200A X200C, X200G X200H, X200I, X200S, X201C, X201G, X201P X201S, X201T X201V, X202F, X202G, X203A, X203C, X203E X203F, X203G X203H, X203I, X203K, X203L, X203N, X203S X203T, X203V X203W, X203Y, X204A, X204C, X204E, X204F X204G, X204I X204K, X204L, X204N, X204P, X204R, X204S X204T, X204W X204Y, X205A, X205F, X205G, X205I, X205L X205M, X205Q X205T, X205V, X206A, X206C, X206D, X206E X206F, X206G X206H, X206I, X206K, X206L, X206N, X206P X206Q, X206R X206S, X206T, X206V, X206W, X206Y, X207A X207G, X207S X208A, X208C, X208L, X208N, X208P, X208S X208T, X208V X209A, X209C, X209D, X209E, X209F, X209G X209H X209I X209K X209L X209M, X209R, X209S X209T X209V X209W X209Y X210A, X210D, X210E X210F X210G X210H X210I X210L, X210N, X210P X210Q X210R X210S X210V X210W, X211A, X211C X211E X211F X211G X211H X211I, X211M, X211P X211Q X211R X211T X211V X211W, X212C, X212F X212G X212H X212I X212M X212N, X212R, X212S X212T X212V X212Y X213A X213C, X213E, X213F X213G X213I X213K X213L X213M, X213P, X213Q X213R X213S X213T X213V X213W, X214A, X214C X214E X214F X214G X214H X214I X214L, X214M X214N X214P X214Q X214R X214S, X214V, X214W X214Y X215A X215C X215D X215E, X215G, X215H X215I X215K X215M X215N X215P, X215S, X215T X215V X215W X215Y X216A X216C, X216E, X216F X216G X216H X216I X216K X216L, X216N, X216P X216Q X216R X216S X216V X216 , X217A, X217C X217D X217E X217F X217G X217I, X217L, X217M X217N X217Q X217S X217T X217V, X218C, X218D X218E X218F X218G X218H X218I, X218M, X218N X218P X218Q X218R X218S X218T, X218W, X218Y X219A X219G X220A X220G X220H, X220S, X220T X220V X221G X221S X222A X222C, X222F, X222G X222I X222K X222L X222M X222N, X222Q, X222R X222S X222T X222V X222W X223A, X223G, X223M, X223S X224A, X224D X224E X224G, X224L, X224N X224P X224S X224T X225A X225C, X225N, X225P X225S X225T X225V X226C X226F, X226H, X226I X226L X226M X226N X226R X226S X226V, X226Y X227A X227C X227F X227G X227I X227M, X227Q X227S X227T X227V X227Y X228A, X228G, X228I X228L X228M X228S X228V X229A, X229P, X229S X230A X230D X230E X230F X230G, X230I, X230L X230N X230P X230Q X230S X230T, X230W, X230Y X231A X231C X231F X231G X231H, X231L, X231S X231T X231W X231Y X232A X232G, X232L, X232M X232S X232V X233A X233C X233E, X233G, X233I X233L X233M X233N X233P X233Q, X233S, X233T X233V X233Y X234D X234F X234G, X234L, X234M X234N X234P X234Q X234S X234T, X234Y, X235C X235D X235E X235F X235G X235H, X235K, X235L X235M X235N X235Q X235R X235S, X235W, X235Y X236A X236C X236E X236F X236G, X236K, X236L X236N X236P X236Q X236R X236S, X236V, X236 X236Y X237A X237C X237F X237G, X237I, X237K X237L X237M X237P X237Q X237R, X237T, X237V X237W X237Y X238C X238D X238E, X238G, X238H X238I X238K X238L X238M X238N, X238R, X238S X238T X238V X238Y X239C X239D, X239G, X239H X239I X239K X239L X239M X239N, X239Q, X239R X239S X239T X239V, X239W X239Y, X240C, X240E X240F X240I X240K X240L X240M, X240Q, X240R X240S X240T X240W X240Y X241A, X241D, X241E X241F X241G X241H X241I X241K, X241M, X241N X241P X241Q X241R X241S X241T, X241W, X241Y X242A X242C X242D X242F X242G, X242I, X242L X242M X242P X242Q X242R X242S, X242V, X242 X243C X243D X243E X243F X243G, X243I, X243K X243L X243M X243N X243P X243Q, X243S, X243T X243V X243W X244A X244D X244E, X244H, X244I X244L X244M X244N X244P X244Q, X244S, X244T X244V X244 X244Y X245A X245C, X245G, X245H X245K X245L X245P X245Q X245R, X245V, X245W X245Y X246A X246C X246E X246F, X246H, X246I X246L X246M X246N X246P X246Q, X246S, X246T X246V X246 X246Y X247A X247C, X247E, X247F X247G X247H X247I X247K X247L, X247N, X247P X247Q X247R X247S X247T X247V, X247Y, X248C X248D X248E X248G X248H X248I, X248L, X248M X248N X248P X248R X248S X248T, X248W, X248Y X249A X249D X249E X249F X249G, X249I, X249K X249L X249 X249N X249Q X249R, X249T, X249V X249W X249Y X250A X250C X250E, X250G, X250H X250I X250L X250M X250N X250Q, X250V, X250Y X251A X251D X251E X251F X251G, X251L X251M X251P X251Q X251R, X251S, X251T X251Y X252A X252C X252D X252F X252G X252H X252K X252L X252M X252 X252P X252R X252S X252 X252Y X253A X253D X253E X253F X253G X253I X253K X253M X253R X253S X253T X253V X254A X254C X254D X254G X254N X254P X254S X254V X255A X255C X255D X255E X255F X255H X255L X255N X255P X255Q X255R X255S X255T X255W X255Y X256A X256C X256D X256E X256G X256I X256K X256L X256M X256N X256P X256R X256T X256V X256W X256Y X257A X257C X257E X257G X257H X257I X257K X257L X257M X257P X257T X257V X257W X257Y X258A X258C X258D X258F X258G X258H X258I X258L X258M X258P X258R X258S X258T X258V X258 X258Y X259A X259E X259G X259I X259L X259M X259P X259Q X259S X259T X259V X260A X260D X260E X260F X260I X260L X260 X260N X260P X260R X260S X260V X260Y X261A X261C X261E X261F X261G X261K X261L X261N X261P X261Q X261R X261S X261V X261W X261Y X262A X262C X262D X262F X262H X262I X262K X262L X262M X262P X262Q X262S X262T X262V X262W X262Y X263A X263C X263F X263G X263H X263I X263L X263M X263N X263Q X263R X263W X263Y X264A X264C X264E X264G X264H X264I X264P X264Q X264S X264V X264Y, X265A X265C X265D X265F X265G X265H X265I X265K, X265L X265M X265P X265Q X265R X265S X265T X265V, X265W X265Y X266G X266 X267A X267C X267D X267E, X267F X267G X267H X267I X267K X267L X267M X267N, X267S X267T X267V X267Y X268A X268D X268E X268G, X268H X268K X268L X268M X268N X268P X268Q X268R, X268S X268V X268W X268Y X269C X269D X269F X269G, X269H X269I X269L X269M X269N X269Q X269R X269S, X269T X269V X270A X270C X270D X270E X270F X270G, X270H X270I X270L X270M X270N X270P X270Q X270S, X270T X270V X271A X271C X271E X271F X271G X271H, X271I X271K X271L X271M X271N X271P X271T X271V, X271Y X272A X272C X272D X272E X272F X272G X272H, X272K X272L X272M X272N X272P X272R X272S X272T, X272W X272Y X273A X273C X273D X273E X273F X273G, X273H X273I X273K X273L X273R X273S X273T X273V, X273 X273Y X274A X274C X274D X274E X274G X274H, X274K X274L X274M X274N X274P X274Q X274R X274S, X274T X274W X275A X275C X275D X275E X275F X275G, X275H X275K X275L X275M X275P X275Q X275R X275V, X275W X275W En contraste, no existieron mutaciones identificadas en separaciones por exclusión iniciales de posiciones 64, 65 y 70 que se asociaron con un índice de desempeño mayor que 1.0 (PI>1.0) para al menos una propiedad.

En separaciones por exclusión de variantes GCI-P036, al menos una mutación en las siguientes 248 posiciones se asoció con un índice de desempeño mayor que 1 para ya sea BMI , ensayo de micromuestra CS-38 o actividad AA.PF y tiene un índice de que 0.8 para estabilidad LAS o en un ensayo TCA: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117 119, 120, 121 122, 123 124, 125, 126, 127, 128, 129 131, 132, 133 134, 135 136, 137, 138, 139, 140, 141 143, 144, "145 146, 147 148, 149, 150, 151, 152, 153 158, 159, 160 165, 166 167, 169, 170, 171, 172, 173 175, 176, 177 178, 179 180, 181, 182, 183, 184, 185 187, 188, 191 192, 194 195, 196, 197, 198, 199, 200 204, 205, 206 207, 208 209, 210, 211, 212, 213, 214 216, 217, 218 220, 222 223, 224, 225, 226 227, 228 230, 231, 232 233, 234 235, 236, 237, 238 239, 240 242, 243, 244 245, 246 247, 248, 249, 250 251, 252 254, 255, 256 257, 258 259, 260, 261, 262 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, y 275. Las mutaciones en estas posiciones pueden combinarse para mejorar la actividad mientra que mantenga cualquiera estabilidad o expresión. Las mutaciones en estas posiciones también pueden combinarse para producir variantes con estabilidad o expresión mejorada, mientras que mantenga o potencie la actividad.

La siguiente lista proporciona las sustituciones con un índice de desempeño mayor que 1 para ya sea BMI , ensayo de micromuestra CS-38, o actividad AAPF y que tiene un índice de que 0.8 para estabilidad LAS o en un ensayo TCA (como se usa en la presente, "X" se refiere a cualquier aminoácido) . Estas variantes pueden combinarse para mejorar la actividad mientras que mantenga o potencie la estabilidad o expresión, o para mejorar la estabilidad o expresión, mientras que mantenga o potencie la actividad: X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I , X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003 , X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005P, X005Q, X005S, X005T, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007S, X007T, X008A, X008F, X008I, X008L, X008M, X008T, X008V, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N, X009P, X009Q X009R, X009S, X009T, X009V, X009W, X009Y, X010A, X010C X010G, X010H, X010K, X010M, XOION, X010Q, X010R, X010S X010T, X010W, X011A, X011I, X011M, X011S, X011V, X012D X012F, X012G, X012H, X012I, X012K, X012L, X012M, X012N X012Q, X012R, X012S, X012T, X012V, X012W, X013A, X013G X013I, X013T, X013V, X014A, X014D, X014E, X014F, X014H X014I, X014K, X014L, X014P, X014Q, X014S, X014T, X014V X014Y, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015K, X015L X015M, X015P, X015Q, X015R, X015S, X015V, X015W, X016A X016G, X016L, X016N, X016P, X016Q, X016S, X016T, X016V X017A, X017F, X017H, X017I, X017K, X017M, X017N, X017R X017S, X017V, X017W, X017Y, X018A, X018C, X018D, X018E X018F, X018G, X018H, X018K, X018L, X018M, X018N, X018P X018Q, X018R, X018S, X018T, X018V, X018W, X018Y, X019A X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L X019M, X019N, X019R, X019S, X019T, X019V, X019 , X019Y X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L X020M, X020P, X020Q, X020R, X020S, X020T, X020V, X020W X020Y, X021A, X021C, X021D, X021E, X021G, X021H, X021I X021K, X021L, X021M, X021N, X021P, X021Q, X021R, X021S X021T, X021V, X021W, X022A, X022C, X022G, X022I, X022K X022L, X022 , X022N, X022P, X022Q, X022R, X022S, X022T X022V, X022 , X022Y, X023A, X023G, X023S, X024A, X024C X024D, X024F, X024G, X024H, X024L, X024M, X024N, X024P X024Q, X024R, X024S, X024T, X024V, X024W, X025C, X025D, ?025?, X025F, X025G, ?025?, X025K, X025L, X025M, ?025?, X025Q, X025R, X025S, ?025?, X025V, X025 , X026C, X026F, X026G, ?026?, X026L, ?026?, X026N, X026P, X026R, X026S, ?026?, X026V, ?027?, X027C, X027D, X027F, X027G, ?027?, ?027?, X027L, ?027?, ?027?, X027P, X027R, X027S, ?027?, X027V, X027W, ?027?, ?028?, X028E, X028H, X028I , X028L, ?028?, ?028?, X028S, X028V, X029A, X029C, X029G, X029S, X029V, X030C, ?030?, X030L, X030S, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031M, X031S, X031T, X031V, ?033?, X033D, ?033?, X033G, ?033?, X033M, X033N, X033Q, X033S, ?033?, ?033?, ?035?, X035F, X035I, X035L, ?035?, ?035?, ?036?, X036C, ?036?, X036F, X036G, X036H, ?036?, X036L, ?036?, ?036?, X036Q, X036R, X036S, X036T, X036V, X038C, X038F, X038G, ?038?, ?038?, X038K, X038L, ?038?, ?038?, X038Q, X038R, ?038?, X038V, X038W, X038Y, ?039?, X039V, ?040?, X040C, X040D, ?040?, X040G, X040H, ?040?, ?040?, X040L, ?040?, ?040?, ?040?, X040R, X040S, ?040?, X040V, X040 , ?040?, X041D, X041E, X042C, X042H, ?042?, X042L, ?042?, ?042?, ?042?, X042V, X043A, X043C, X043D, ?043?, X043F, X043G, ?043?, X043L, X043M, X043N, ?043?, X043R, X043S, ?043?, X043V, X043 , X043Y, X044A, X044C, X044D, X044G, ?044?, ?044?, X044L, X044M, X044N, ?044?, X044Q, X044R, X044S, ?044?, X044V, X044W, X044Y, ?045?, X045D, X045F, X045G, ?045?, ?045? , X045K, X045L, ?045?, ?045?, ?045?, X045Q, X045R, X045S, X045T, X045V X045W, X045Y, X046C X046D X046E, X046F, X046G, X046H X046I, X046K, X046L X046M X046N, X046P, X046Q, X046R X046S, X046T, X046V X046W X047A, X047F, X047G, X047N X047R, X047S, X047T X047 X048A, X048C, X048E, X048F X048G, X048H, X048I X048K X048L, X048M, X048N, X048P X048Q, X048R, X048S X048T X048V, X048Y, X049A, X049F X049G, X049L, X049M X049P X049S, X049T, X050C, X050F X050H, X050I, X050L X050N X050T, X050V, X050Y, X051F X051G, X051H, X051K X051L X051N, X051P, X051R, X051S X051T, X051V, X051W X052A X052C, X052E, X052F, X052G X052H, X052I, X052L X052M X052N, X052P, X052Q, X052R X052T, X052V, X052W X052Y X053A, X053C, X053D, X053E X053G, X053H, X053K X053L X053M, X053P, X053Q, X053R X053S, X053T, X053V X053 X053Y, X054A, X054C, X054D X054E, X054F, X054I X054M X054N, X054Q, X054S, X054V X055A, X055C, X055E X055F X055G, X055H, X055I, X055K X055L, X055M, X055N X055P X055Q, X055S, X055T, X055W X055Y, X056A, X056C X056D X056E, X056H, X056L, X056M X056N, X056P, X056Q X056S X056T, X057A, X057C, X057E X057F, X057G, X057H X057I X057K, X057L, X057M, X057N X057P, X057Q, X057R X057S X057T, X057V, X057W, X057Y X059A, X059C, X059D X059E X059F, X059G, X059I, X059L X059M, X059N, X059P X059Q X059R, X059S, X059T, X059V X059 , X059Y, X060D X060S X060V, X061A, X061C, X061D X061F, X061G, X061H X061I X061L, X061M, X061N, X061P, X061R, X061S, X061T, X061V, X061Y, X062C, X062E, X062F, X062G, X062H, X062I, X062K, X062L, X062M, X062N, X062P, X062Q, X062R, X062S, X062T, X062V, X062Y, X063A, X063C, X063D, X063E, X063F, X063G, X063H, X063K, X063M, X063Q, X063R, X063S, X063W, X066K, X066S, X066T, X068I, X068T, X068V, X069A, X069E, X069G, X069N, X069S, X069T, X071A, X071I, X071N, X071T, X071V, X072C, X072F, X072I, X072L, X072M, X072T, X072V, X073A, X073C, X073D, X073E, X073H, X073K, X073L, X073N, X073S, X073T, X073V, X074A, X074C, X074S, X075A, X075H, X075I, X075L, X075M, X075N, X075P, X075Q, X075R, X075S, X075V, X076D, X076E, X076F, X076G, X076H, X076K, X076M, X076N, X076Q, X076R, X076S, X076T, X076W, X076Y, X077D, X077N, X078A, . X078C, X078E, X078F, X078G, X078H, X078I, X078K, X078L, X078M, X078N, X078P, X078Q, X078R, X078S, X078T, X078V, X078Y, X079C, X079D, X079E, X079F, X079G, X079I, X079K, X079L, X079N, X079Q, X079R, X079S, X079T, X079V, X079W, X079Y, X081C, X081G, X081H, X081I, X081L, X081M, X081Q, X081S, X081T, X081V, X082A, X082E, X082F, X082K, X082L, X082M, X082Q, X082R, X082T, X082V, X082Y, X083G, X083S, X084C, X084E, X084G, X084I, X084L, X084M, X084N, X084T, X084V, X085A, X085C, X085I, X086A, X086C, X086D, X086E, X086G, X086P, X086S, X086W, X086Y, X087A, X087C, X087D, X087E, X087F, X087G, X087I, X087K, X087L, X087N, X087S, X087T, X087V, X087Y, X088A, X088C, X088D, X088G, X088Q, X088S, X088W, X089A X089C, X089D X089E X089F X089G, X089I, X089L X089N X089P X089Q X089R X089S, X089V, X089 X090A X090C X090F X090G X090I, X090L, X090M X090Q X090T X090V X091C X091D, X091I, X091K X091L X091M X091N X091Q X091R, X091T, X091V X091W X091Y X092A X092D X092G, X092P, X092R X092T X092V X093A X093C X093G, X093M, X093S X093T X093V X093Y X094K X094N, X094R, X095A X095C X095G X095I X095K X095R, X095T, X095V X095W X096E X096I X096L X096M, X097A, X097D X097E X097G X097H X097I X097K, X097M, X097N X097P X097Q X097R X097S X097T, X097Y, X098A X098C X098D X098E X098F X098G, X098L, X098N X098P X098Q X098R X098S X098T, X098Y, X099A X099C X099F X099G X099K X099M, X099Q, X099R X099S X099T X099V X099Y X100D, X100G, X100I X100P X100S X100V X100Y X101A, X101E, X101F X101G X101H X101I X101K X101N, X101Q, X101R X101S X101T X101V X101Y X102A, X102D, X102G X102N X102T X103A X103D X103E, X103G, X103I X103L X103N X103P X103Q X103R, X103T, X103V X103Y X104A X104C X104D X104E, X104H, X1041 X104L X104P X104R X104S X104T, X104W, X104Y X105A X105C X105D X105E X105F, X105H, X105L X105K X105L X105N X105Q X105R, X105T, X105V X105W X105Y X106A X106D X106E X106G, X106L X106L X106M X106P X106R X106S X106W, X107A X107F X107I X107L X107M X107Q X107T, X107V X108A X108G X108L X108L X108S X108V, X109A X109C X109E X109F X109G X109H X109K, X109L X109M X109N X109Q X109R X109S X109W, X109Y X110A X110G X110S X111C X111E X111I, X111L X111M X111V X111Y X112A X112C X112E, X112F X112G X112I X112L X112N X112Q X112T, X112V X112W X112Y X114A X114C X114G X115C, X115E X115F X115G X115H X115L X115K X115M, X115N X115P X115Q X115R X115S X115T X115W, X115Y X116A X116C X116D X116F X116G X116K, X116L X116M X116N X116Q X116S X116T X116 , X117A X117C X117D X117F X117G X117L X117Q, X117R X117T X117Y X118A X118C X118D X118F, X118G X1181 X118K X118L X118M X118N X118R, X118S X118T X118V X118W X119A X119C X119H, X119M X119N X119Q X119T X119W X120A X120E, X120F X120G X120H X120L X120L X120M X120R, X120S X120T X120W X121A X121C X121E X121G, X121L X121L X121 X121Q X121S X121T X121Y, X122A X122C X122G X122L X122L X122S X122V, X123G X123N, X123S, X124G, X124L, X124S X125A, X125S, X126A, X126F, X126L, X127F, X127G, X127L X127S, X127T, X128A, X128F, X128G, X128L X128K, X128L, X128M, X128N, X128Q, X128R, X128S, X128T, X128W, X129A, X129E, X129F, X129G, X129L X129L, X129M, X129N , X129P, X129R, X129S, X129T, X129V, X129 , X129Y, X130C, X130K, X130L, X130N, X130Q, X130R, X130S, X130V, X130W, X130Y, X131A, X131D, X131E, X131F, X131G, X131L, X131K, X131L, X131P, X131Q, X131R, X131V, X132A, X132E, X132F, X132H, X132L, X132L, X132M, X132N, X132Q, X132S, X132T, X132W, X133A, X133F, X133K, X133L, X133N, X133P, X133Q, X133S, X133T, X133V, X133Y, X134A, X134F, X134L, X134L, X134M, X134P, X134S, X134T, X134V, X135C, X135E, X135L, X135M, X135W, X136A, X136E, X136F, X136K, X136Q, X136R, X136S, X136V, X136W, X136Y, X137A, X137C, X137E, X137G, X137H, X137K, X137L, X137M, X137Q, X137R, X137S, X137V, X137 , X138A, X138G, X138M, X138R, X138V, X139A, X139C, X139L, X139M, X139T, X139V, X140A, X140C, X140D, X140E, X140F, X140G, X140L, X140L, X140M, X140N, X140Q, X140R, X140S, X140T, X140V, X140Y, X141D, X141E, X141G, X141H, X141L, X141K, X141L, X141N, X141Q, X141R, X141S, X141V, X141Y, X142A, X142C, X142L, X142T, X142V, X142Y, X143C, X143D, X143F, X143G, X143H, X143L, X143K, X143L, X143M, X143N, X143S, X143T, X143V, X143 , X143Y, X144A, X144C, X144D, X144G, X144H, X144L, X144L, X144M, X144N, X144Q, X144R, X144S, X144T, X144V, X144W, X144Y, X145A, X145C, X145D, X145E, X145F, X145G, X145K, X145L, X145M, X145N, X145Q, X145R, X145S, X145T, X145W, X145Y, X146A, X146C, X146D, X146E, X146G, X146K, X146Q, X147L, X147L, X147M, X147T, X147V, X148A, X148C, X148E, X148F, X148H, X148L, X148L, X148M, X148N, X148S, X148T, X148V, X148Y, X149A, X149C, X149I , X149L, X149M, X149P, X149S, X149T, X149V, X150A, X150F, X150L, X150T, X150V, X151A, X151G, X151S, X152A, X152S, X153A, X153G, X153S, X153V, X156A, X156C, X156D, X156E, X156F, X156L, X156 , X156N, X156S, X156T, X158A, X158C, X158E, X158F, X158H, X158K, X158L, X158M, X158Q, X158R, X158S, X158T, X158V, X158W, X159A, X159C, X159E, X159G, X159H, X159M, X159P, X159Q, X159R, X159S, X159W, X160A, X160C, X160D, X160F, X160G, X160I, X160L, X160M, X160N, X160Q, X160R, X160S, X160T, X160V, X160Y, X165I, X165L, X165T, X165V, X166A, X166C, X166D, X166E, X166H, X166M, X166N, X166S, X167C, X167D, X167E, X167F, X167P, X167V, X167W, X167Y, X169A, X169G, X169S, X170A, X170D, X170E, X170G, X170H, X170K, X170L, X170P, X170Q, X170R, X170S, X170V, X170 , X170Y, X171C, X171F, X171L, X171N, X171Y, X172A, X172C, X172D, X172F, X172G, X172I , X172K, X172L, X172M, X172P, X172Q, X172R, X172S, X172T, X172V, X172Y, X173A, X173C, X173D, X173E, X173F, X173G, X173H, X173K, X173L, X173M, X173N, X173Q, X173R, X173T, X173V, X173 , X174A, X174G, X174S, X174T, X174V, X175A, X175C, X175I, X175L, X175M, X175Q, X175T, X175V, X175Y, X176A, X176G, X176S, X177A, X177C, X177I, X177T, X177V, X178A, X178G, X179A, X179G, X180C X180I X180L X180S X180T, X180V( X181N X182A X182D X182E X182F X182G, X182H, X182K X182L X182M X182N X182P X182Q, X182R, X182T X182V X182W X182Y X183A X183D, X183F, X183H X183I X183K X183L X183M X183N, X183Q, X183S X183T X183V X183W X183Y X184D, X184N, X185C X185E X185F X185G X185H X185I, X185K, X185M X185N X185Q X185R X185S X185T, X185V, X186H X186I X186K X186L X186R X187A, X187P X188A X188D X188E X188F X188G X188H, X188I X188L X188P X188Q X188R X188S X188T, X188V X188Y X191D X191Q X192W X192Y X194A, X194C, X194E X194F X194G X194H X194I X194L, X194M, X194Q X194R X194S X194T X194V X194W, X194Y, X195C X195D X195E X195G X195Q X195Y, X196L, X197A X197C X197D X197E X197G X197N, X197Q, X197T X198A X198F X198G X198H X198I, X198L, X198N X198R X198S X198T X198Y X199A, X199C, X199M X199S X199T X199V X200A X200C, X200G, X203A X203C X203E X203I X203L X203S, X203T, X204A X204C X204E X204F X204G X204I, X204K, X204N X204R X204S X204T X204W X204Y, X205I, X205V X206A X206C X206D X206E X206G, X206H, X206K X206L X206N X206P X206Q X206R, X206S, X206V X206W X206Y X207A X207S X208C, X208L, X208T, X208V X209A X209C, X209F, X209G X209H X209I, X209K, X209L X209M X209N X209R X209S X209V X209W, X209Y, X210A X210C X210E X210G X210H X210I X210L, X210M, X210N X210P X210R X210S X210V X210Y X211A, X211C, X211E X211F X211G X211H X211I X211L X211M, X211P, X211Q X211R X211T X211V X211W X211Y X212C, X212F, X212G X212H X212I X212 X212N X212P X212R, X212S, X212T X212V X212Y X213A X213C X213D X213E, X213F, X213G X213I X213K X213L X213M X213N X213Q, X213R, X213S X213T X213V X213W X213Y X214F X214L, X214W, X214Y X215A X215C X215D X215E X215F X215G, X215H, X215I X215K X215 X215N X215P X215R X215S, X215T, X215V X215W X215Y X216A X216C X216D X216E, X216F, X216G X216H X216I X216K X216L X216M X216N, X216P, X216Q X216R X216S X216V X216W X216Y X217A, X217C, X217E X217F X217G X217I X217K X217L X217M, X217Q, X218C X218D X218E X218F X218G X218H X218I, X218M, X218N X218Q X218R X218S X218T X218V X218Y, X220S( X220T X222A X222M X222Q X223A X223G X223S, X224A, X224G X224L X224N X224S X224T X225C X225P, X226C, X226F X226H X226M X226V X227A X227C X227G, X227I, X227L X227M X227S X227T X227V X228A X228C, X228G, X228I X228S X228V X229A X229G X229P X229S, X230A, X230D X230E X230G X230H X230I X230L X230N, X230Q, X230S X230T X230V X231A X231C X231F X231G, X231H, X231I X231L X231S X231T X231Y X232A X232G, X232H, X232L X232M X232S X232V X233A X233C X233E, X233F, X233G X233I X233L X233M X233N X233P X233Q, X233S, X233T X233V X233Y X234D X234F X234G X234H, X234L, X234 X234N X234Q X234S X234T X234V X234Y, X235C, X235D X235E X235F X235G X235H X235I X235K, X235L, X235M X235N X235Q X235R X235S X235V X235W, X235Y, X236A X236C X236E X236F X236H X236K X236N, X236P, X236Q X236R X236S X236T X236V X236W X236Y, X237A, X237C X237F X237G X237H X237I X237K X237L, X237M, X237P X237Q X237R X237S X237T X237V X237W, X237Y, X238C X238D X238E X238F X238G X238H X238I, X238K, X238L X238 X238N X238Q X238R X238S X238T, X238V, X238Y X239C X239D X239F X239G X239H X239I, X239K, X239L X239M X239N X239P X239Q X239R X239S, X239T, X239V X239W X239Y X240A X240C X240E X240F, X240I, X240K X240L X240 X240N X240Q X240R X240S, X240T, X240W X240Y X241A X241C X241D X241E X241F, X241G, X241H X241I X241K X241L X241M X241N X241P, X241Q, X241R X241S X241T X241V X241W X241Y X242A, X242C, X242D X242F X242G X242H X242I X242L X242M, X242P, X242Q X242R X242S X242T X242V X242W X243C, X243D, X243E X243F X243G X243H X243I X243K X243L, X243M, X243N X243P X243Q X243R X243S X243T X243V, X243W, X244A X244D X244E X244F X244H X244I X244L, X244M, X244N, X244P X244Q X244R X244S X244T, X244W X244Y X245A X245C X245E X245G X245H, X245L X245P X245Q X245R X245S X245V X245W, X246A X246C X246E X246F X246G X246H X246I, X246M X246N X246Q X246S X246T X246V X246W, X247A X247C X247D X247E X247F X247G X247H, X247K X247L X247M X247N X247P X247Q X247R, X247T X247V X247 X247Y X248C X248D X248E, X248H X248I X248K X248L X248N X248P X248R, X248T X248V X248W X248Y X249A X249D X249E, X249G X249H X249I X249K X249L X249M X249N, X249R X249S X249T X249V X249W X249Y X250A, X250F X250I X250L X250M X250Q X250S X250V, X251D X251E X251F X251G X251K X251L X251M, X251R X251T X251V X251Y X252A X252C X252D, X252G X252H X252I X252K X252L X252M X252N, X252S X252V X252W X252Y X253A X253D X253E, X253G X253H X253I X253K X253M X253R X253S, X253V X253W X254A X254C X254G X254S X254T, X255C X255D X255E X255F X255H X255I X255L, X255P X255Q X255R X255S X255T X255V X255W, X256A X256C X256D X256E X256G X256H X256I, X256L X256M X256N X256P X256R X256S X256T, X256W X256Y X257C X257F X257I X257K X257L, X257V X258A X258C X258D X258E X258F X258G, X258I, X258L X258M X258P X258Q X258R X258S, X258V, X258W X258Y X259A X259C X259E X259G, X259L, X259M X259P X259Q X259R X259S X259T, X260A, X260D X260E X260F X260H X260I X260L, X260N, X260P X260R X260S X260T X260V X260Y, X261C, X261E X261F X261G X261I X261K X261L, X261P, X261Q X261R X261S X261T X261V X261W, X262A, X262C X262D X262F X262G X262H X262I X262L, X262M X262Q X262R X262S X262T X262V, X262Y, X263C X263F X263L X263Y X264A X264G, X265C, X265D X265F X265G X265H X265K X265M, X265R, X265S X265T X265 X265Y X267G X267I, X267M, X267N X267V X268A X268G X268H X268L, X268N, X268P X268Q X268S X268V X269C X269D( X269G, X269H X269I X269L X269M X269N X269Q, X269S, X269T X269V X270A X270C X270D X270G, X270L, X270M X270N X270S X270T X270V X271A, X271E, X271F X271G X271H X271I X271K X271L, X271N, X271P X271T X271V X271Y X272A X272C, X272E, X272F X272G X272H X272K X272L X272M, X272P, X272R X272S X272T X272 X272Y X273A, X273D, X273E X273F X273G X273H X273I X273L, X273T, X273V X274A X274C X274D X274E X274G, X274L, X274M X274N X274P X274Q X274R X274S, X274W, X275A X275C X275D X275E X275F X275G, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, y X275W.

En separaciones por exclusión de variantes GCI-P036, al menos una mutación en las siguientes 204 posiciones se asoció con un índice de desempeño mayor que 0.8 para ya sea BMI, actividad EGG o AAPF y tiene un índice de que 0.8 tanto en estabilidad LAS como en un ensayo TCA: 1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 68, 69, 72, 73, 76, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 194, 195, 198, 199, 203, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, y 275.

Las mutaciones en estas posiciones pueden combinarse para mejorar la actividad mientras que mantiene ya sea la estabilidad y/o expresión. Las mutaciones en estas posiciones también pueden combinarse para producir variantes con estabilidad y/o expresión mejorada, mientras que mantiene o potencia la actividad.

La siguiente lista proporciona las sustituciones con un índice de desempeño mayor que 0.8 para ya sea BMI, ensayo de micromuestra CS-38 o ensayo de actividad AAPF, y que tiene un índice de que 0.8 para estabilidad LAS y en un ensayo TCA (como se usa en la presente, "X" se refiere a cualquier aminoácido) . Estas variantes pueden combinarse para mejorar la actividad mientras que mantiene o potencia la estabilidad y/o expresión, o para mejorar la estabilidad y/o expresión, mientras que mantiene o potencia la actividad : X001A, X001E, X001G, X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I , X003M, X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I, X017M, X017N, X018A, X018C, X018D, X018E, X018G, X018H, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018S, X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, ?020?, ?020? X020L ?020? ?020?, X020R, X020S ?020? X020V X020W ?020? X021A, X021E, X021G X021H X021I X021K X021L X021M, X021P, X021Q X021S X021T X021V X021W ?022?, X022G, ?022? X022L ?022? ?022? ?022? X022Q, X022V, X022 ?023? X023G X023S ?024? X024C, X024F, X024G ?024? X024L ?024? ?024? ?024?, X024R, X024S ?024? X024V X024W X025C X025D, X025F, X025G ?025? X025L ?025? X025Q X025R, X025T, X025V X025 X026C X026F X026G ?026?, X026R, X026S ?026? X026V ?027? X027C X027D( X027G, ?027? X027L ?027? ?027? ?027? X027R, X027T, X027W ?028? ?028? X028L ?028? X028V, X029C, X029G X029S X029V ?030? X030C X030L, X030T, X030V X031A X031F X031I X031L X031M, X031V, X033C ?033? X033S ?033? ?035? X035L, X035P, ?036? ?036? X036S ?036? X036V X038C, X038H, ?038? ?038? X038L ?038? ?038? X038Q, X038T, X038V ?038? ?040? X040D ?040? ?040? X040P, X040V ?043? X043C X043D ?043? X043F, ?043?( X043L ?043? ?043? X043R X043S ?043?, ?043?, ?044? X044C X044D X044F X044G ?044? , X044L, ?044? ?044? X044Q X044R X044S ?044?, ?044?, ?045? X045D X045F X045G ?045? ?045?, X045L, ?045? ?045? ?045? X045Q X045R X045S, X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D X046E X046G, X046I X046K X046L X046M X046N X046P X046Q, X046S X046T X046V X047G X047R X048A X048C, X048F X048H X048I X048 X048L X048M X048N, X048Q X048R X048S X048T X048V X048Y X049A, X049H X049S X049T X050F X050H X050I X050L, X050V X050Y X051F X051H X051K X051L X051R, X051T X051V X051W X052A X052C X052E X052F, X052H X052I X052L X052M X052N X052P X052Q, X052T X052V X052 X052Y X053A X053C X053D, X053G X053H X053K X053L X053M X053Q X053R, X053T X053W X053Y X054A X054C X054D X054E, X054H X054M X054N X054Q X054S X055C X055E, X055H X055K X055L X055P X055Q X055S X055T, X056A X056C X056D X056E X056H X056L X056M, X056P X056Q X056S X056T X057C X057E X057F, X057H X057I X057L X057 X057N X057P X057Q, X057S X057T X057V X057W X057Y X059A X059D, X059I X059L X059M X059N X059Q X059R ?0593( X059V X059W X061A X061C X061D X061F X061G, X061I X061L X061M X061N X061P X061R X061S, X061V X061Y X062C X062E X062F X062H ?062? X062L X062 X062N X062Q X062R X062S ?062?, X068I X068L X068V X069A X069G X069S ?069?, X072L X072T X072V X073A X073C X073S X076D, X078A, X078C, X078E, X078H, X078L, X078M, X078N, X078Q, X078S, X078T, X084C, X084G, X084I , X084M, X084V, X086C, X086P, X087A, X087C, X087D, X087E, X087G, X087K, X087L, X087N, X087S, X087V, X088A, X088C, X088G, X088S, X089A, X089D, X089E, X089G, X089H, X089I, X089N, X089Q, X089R, X089S, X089T, X089W, X090C, X090I, X090L, X090M, X090Q, X090T, X090V, X091D, X091F, X091I , X091N, X091S, X091V, X091 , X091Y, X092A, X092G, X092P, X092R, X092V, X093A, X093C, X093G, X093L, X093M, X093T, X093V, X094K, X094R, X095A, X095C, X095I, X095S, X095V, X096F, X096I, X096L, X096M, X097A, X097D, X097E, X097F, X097G, X097H, X097K, X097L, X097M, X097N, X097P, X097Q, X097R, X097S, X097T, X097V, X097W, X097Y, X098A, X098C, X098D, X098E, X098F, X098G, X098K, X098L, X098N, X098P, X098Q, X098R, X098S, X098T, X098V, X098Y, X099A, X099C, X099F, X099G, X099K, X099M, X099P, X099Q, X099R, X099S, X099T, X099V, X099Y, X100D, X100E, X100G, X100I, X100K, X100N, X100R, X100S, X100T, X100V, X100Y, X101A, X101C, X101D, X101E, X101F, X101G, X101H, X101I, X101K, X101N, X101P, X101Q, X101R, X101S, X101T, X101V, X101Y, X102A, X102G, X102T, X103A, X103C, X103D, X103F, X103G, X103I, X103L, X103N, X103P, X103Q, X103R, X103S, X103T, X103V, X103W, X104C, X104F, X104H, X104I, X104L, X104R, X104S, X104T, X104V, X104W, X104Y, X105A, X105C, X105D, X105E, X105F, X105G, X105K, X105L, X105N, X105Q, X105R, X105S, X105T, X105V, X106A, X106D, X106E, X106G X106I, X106L X106R, X106S, X106V, X106 , X107A X107C, X107F X107I, X107L, X107Q, X107S, X107T X107V, X108A X108C, X108I, X108T, X108V, X109A X109E, X109F X109G, X109H, X109K, X109L, X109M X109N, X109Q X109R, X109S, X109W, X109Y, X110A X110G, X111F X111I, X111L( X112D, X112E, X112I X112Q, X112V X114A, X114C, X115E, X115G, X115L X115M, X115P X115Q, X115S, X115W, X115Y, X116A X116C, X116D X116F, X116G, X116K, X116L, X116M X116N, X116Q X116S, X116T, X116W, X117A, X117C X117N, X117Q X117R, X117T, X118A, X118, X118D, XI18E, X118F, Xll8G, X118K, X118M, X118R, X118S, X118V X118 , X119A X119F, X119M, X120A, X120C, X120E X120F, X120G X120H, X120I, X120 , X120N, X120R X120S, X120T X120W, X121A, X121F, X121I, X121L X121M, X121S X121T, X121V, X122G, X122S, X122V X124G, X124L X124T, X126A, X126I, X126L, X126M X126V, X128A X128F, X128G, X128K, X128L, X128M X128N, X128Q X128R, X128S, X128W, X129A, X129E X129F, X129G X129M, X129N, X129R, X129S, X129Y X130C, X130K X130L, X130N, X130R, X130S, X130V X130W, X130Y X131A, X131D, X131F, X131G, X131K X131P, X131Q X132A, X132H, X132N, X132Q, X132R X132S, X132T X133A, X133F, X133N, X133P, X133S X133T, X133V X133Y, X134A, X134T, X134V, X135L X135M, X135 X136E X136Q X137A, X137C, X137E X137H X137K X137L X137M X137Q X137R, X137S, X137W X139C X139I X139V X140D X140E X140N, X141D, X141E X141G X141H X141I X141K X141L X141N, X141Q, X141R X141S X141V X141Y X142A X142C X142V, X143C, X143D X143F X143H X143N X143T X144A X144C, X144D, X144G X144H X144I X144L X144M X144N X144R, X144S( X144T X144V X144Y X145A X145C X145D X145F, X145K, X145L X145N X145Q X145R X146D X146G X147I , X147L, X147T X147V X148C X148I X148L X148M X148N, X148V, X149C X149I X149L X149V. X150A X150L X150T, X150V, X151A X151S X152A X152S X156D X156E X156L, X156N, X156S X156T X158A X158C X158E X158F X158H, X158K, X158L X158M X158Q X158R X158S X158T X158V, X159A, X159C X159E X159G X159H X159M X159P X159S, X160A, X160C X160D, X160F, X 160] X160L X160M X160N, X160Q, X160S X160T X160V X160Y X165I X165L X165V, X166A, X166C X166D X166E X166H X166M X166S X166T, X167F, X167Y X170A X170D X170E X170G X170H X170K, X170Q, X170R X170S X170V X170Y X171C X171Y X172A, X172C, X172D X172G X172I X172K X172L X172M X172P, X172Q, X172R X172S X172V X172Y X173A X173C X173D, X173H, X173M X173N X173Q X173T X174A X174S X174T, X174V, X175L X175M X175V X176A X176S X177C X177V, X180T, X180V X182A X182D X182E X182Q X183A X183D, X183N X183Q X183S X184D X184N, X185A, X185C X185H X185K X185M X185N X185Q X185T X185V X186K X186L X186R X187A X187C X188A X188D X188F X188H X188I X188K X188L X188P X188Q X188T X191A X191D X191Q X191S X194A X194C X194E X194F X194H X194I X194L X194M X194P X194R X194S X194T X194W X194Y X195C X195D X195G X195Q X198I X198L X199C X199M X199S X203C X203E X203T X203V X204A X204C X204E X204N X204S X206D X206E X206H X206L X206N X206S X209F X209 X209W X209Y X210A X210C X210L X210M X210N X210P X211A X211C X211E X211H X211I X211M X211P X211Q X211T X211V X212F X212G X212H X212M X212N X212R X212S X213A X213D X213E X213N X213Q X213S X213T X215C X215D X215E X215H X215I X215K X215M X215S X215T X215V X215Y X216A X216C X216D X216F X216H X216I X216L X216M X216N X216Q X216V X216W X216Y X217A X217C X217D X217E X217K X217L X217M X217Q X218C X218D X218E X218Q X222C X222M X222S X223A X223S X224A X224S X224T X227A X227C X227V X228A X228G X228V X230A X230G X230N X230S X230T X230V X231C X231F X231G X231S X232A X232L X232M X233C X233E X233G X233I X233L X233N X233Q X233T X233V X234L X234M X234N X234Q X234S X234T, X234V X235C X235F X235G X235H X235I X235K X235L, X235M X235N X235Q X235R X235S X235V X235W X235Y, X236A X236C X236E X236F X236H X236N X236Q X236S, X236T X236Y X237A X237C X237F X237G X237H X237I, X237K X237L X237M X237Q X237R X237S X237T X237V, X237W X237Y X238C X238D X238E X238F X238G X238H, X238I X238K X238L X238M X238N X238Q X238R X238S, X238T X238V X238Y X239C X239D X239F X239G X239H, X239K X239L X239M X239N X239P X239Q X239R X239S, X239T X239V X239W X239Y X240A X240C X240E X240F, X240I X240K X240M X240N X240Q X240R X240S X240T, X240W X240Y X241A X241C X241D X241E X241F X241G, X241H X241I X241 X241L X241M X241N X241Q X241R, X241S X241T X241V X241W X241Y X242A X242C X242D, X242G X242H X242I X242L X242M X242P X242Q X242S, X242T X242V X243C X243D X243E X243F X243G X243H, X243I X243L X243M X243N X243P X243Q X243S X243T, X243V X243W X244D X244E X244F X244H X244I X244L, X244M X244N X244Q X244S X244T X244V X244W X245A, X245C X245E X245G X245H X245K X245L X245P X245Q, X245S X245V X245W X245Y X246A X246C X246I X246L, X246M X246T X246V X247A X247C X247F X247G X247H, X247K X247L X247M X247N X247R X247S X247T X247V, X247W X247Y X248C X248D X248E X248G X248H X248I, X248L, X248N, ?248?, X248R, X248S, ?248?, X248V, ?248?, X249A, X249D, ?249?, X249F, X249G, ?249?, ?249?, ?249?, X249L, X249M, ?249?, X249Q, X249S, ?249?, X249W, ?249?, X250C, X250I , X250L, ?250?, X250V, X251A, X251D, X251E, X251F, X251G, X251K, X251L, X251M, X251Q, X251R, X251T, X251V, X251Y, ?252?, X252C, X252D, X252F, X252G, ?252?, X252I, ?252?, X252L, ?252?, ?252?, X252R, X252S, X252V, X252W, ?253?, ?253?, ?253?, ?253?, X253S, ?253?, X253W, X255A, X255C, X255D, ?255?, ?255?, X255L, ?255?, X255Q, X255T, X255V, ?255?, ?256?, X256C, X256D, ?256?, X256G, X256H, ?256?, ?256?, X256L, ?256?, ?256?, ?256?, X256S, X256V, X256W, ?256?, X258D, X258G, ?259?, X259C, ?259?, X259P, X259Q, X259S, ?260?, X260D, ?260?, ?260?, ?260?, X260N, ?260?, X260S, ?260?, X260V, X261A, X261C, X261E, X261F, X261I , X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261S, X261T, X261V, X261 , X261Y, ?262?, X262C, X262D, X262F, X262H, ?262?, X262L, ?262?, X262Q, ?262?, X262V, ?262?, X265A, X265D, X265S, ?267?, X267L, ?268?, X268L, X268V, X269D, ?269?, ?269?, X269Q, X269S, ?270?, X270C, X270G, X270I, X270L, ?270?, X270S, ?270?, X270V, X271C, X271E, X272A, X272C, X272D, ?272?, X272F, X272G, ?272?, X272L, X272M, ?272?, ?272?, X272S, ?272?, X272 , ?272?, ?273?, X273C, X273G, X273S, ?274?, X274C, X274G, X274L, ?274?, X274N, X274S, ?274?, X275D, ?275?, X275F, ?275?, ?275?, X275L, ?275?, ?275?, X275Q, X275R.

EJEMPLO 6 Evaluación Comparativa de Datos de Proteasa Variante En este Ejemplo, se comparan los resultados de experimentos conducidos para determinar el desempeño de limpieza, estabilidad LAS/EDTA, actividad AAPF y contenido de proteína (pruebas de propiedades de interés) de BPN', GCI-P036 y proteasas variantes. Se proporcionan los detergentes usados y condiciones usadas en el Ejemplo 1. En las siguientes Tablas, los resultados "EGG" se refieren a resultados de ensayo de micromuestra CS-38 en CALGONIT® ( E AD ) como se describe en la Tabla 1-1. Como se describe totalmente se cuantifica la funcionalidad de las proteasas variantes como un índice de desempeño (PI) , que es la relación de desempeño de una variante a una proteasa de referencia. Las clasificaciones PI usadas en la presente incluyen: mutaciones Hacia Arriba (PI > 1.0) ; mutaciones Neutrales (PI > 0.5 ) ; mutaciones no Pe judiciales (PI > 0.05); y mutaciones Perjudiciales (PI < 0.05) . Las variantes BPN' se produjeron y procesaron por ensayo como se describe en PCT/09/046066 y PCT/US 09/046156, incorporadas en la presente para referencia en su totalidad.

"Sitios productivos" son aquellos que tienen al menos una mutación hacia Arriba para cualquier propiedad. Sitios "productivos, no restrictivos" son aquellos que tienen ^20% de mutaciones neutrales (PI > 0.5) y al menos una mutación hacia Arriba (PI > 1.0) para cualquier propiedad probada (además expresión de proteína) . En la Tabla 6-1 a continuación, los resultados para variantes que contienen sitios que cumplen la definición de un sitio productivo, no restrictivo se muestran como un porcentaje ( % ), de variantes probadas que cumplen la definición de una mutación hacia Arriba (PI > 1) . 10 to H H s? O un O ? t to I—1 o s? ui O to s? o ? t\_> Ln o ? to ?—1 s? o en o s? tí. ? s o OS 5' ro. n o S9 t ttí ¾ O O os to l-1 (Jl O O s? s? s (Jl (Jl Sitios "altamente productivos" son aquellos que tienen >20% de mutaciones hacia Arriba (PI > 1) para al menos una propiedad diferente de la expresión de proteína (por ejemplo, como se indica en un ensayo TCA) . En la Tabla 6-2 a continuación, los resultados para variantes que contienen sitios que cumplen la definición de un sitio altamente productivo se muestran como un porcentaje (%) de variantes probadas que cumplen la definición de una mutación hacia Arriba (PI > 1) . tO t o un s? O t to 171 o 171 t Ha t s? o en en O LT1 Tabla 6-2 (cont). Sitios Altamente Productivos para BPN' y GG36 Los sitios "restrictivos" son aquellos sitios que tienen menor que 20% de mutaciones neutrales para actividad y estabilidad. En la Tabla 6-3 a continuación, los resultados para variantes que contienen sitios que cumplen la definición de un sitio restrictivo se muestran como un porcentaje (%) de variantes evaluadas que cumplen la definición de una mutación neutral (PI > 0.5) .

En pocas palabras, como se determina durante el desarrollo de la presente invención, 10 posiciones en la región madura de dos substilisinas de referencia son posiciones restrictivas para actividad y estabilidad. De esta manera las 265 posiciones restantes en la región madura de dos subtilisinas de referencia son posiciones no restrictivas (> 20% de mutaciones neutrales) para actividad y estabilidad.

EJEMPLO 7 Evaluación de Remoción de mancha por Variantes de Colección Combinatoria GCI P036 En este ejemplo, se probaron los resultados para variantes de GCI-P036 se proporcionan por su desempeño de remoción de mancha en aplicaciones de detergente de lavandería líquido y lavaplatos automático. Se realizó clonación de la colección combinatoria por Sloning BioTechnology usando Slonomax Technology. Se realizó la preparación de muestras de proteasa variante como se describe arriba. Brevemente, se probaron las variantes de colección combinatoria en ensayos de micromuestra de sangre, leche, tinta (BMI) y micromuestra CS-38 en detergentes que representan varias geografías comercializadas (por ejemplo, diferente pH, temperatura, y/o dureza del agua) , en tanto aplicaciones de lavaplatos automático (AD ) como lavandería. Como se describe totalmente, se cuantificó la funcionalidad de variantes de proteasa como un índice de desempeño (PI) , que es la relación de desempeño de una variante para aquella de una proteasa de referencia. Las sustituciones se enlistan con relación a la proteasa de referencia GCI-P036 usando numeración BPN' y el PI se determina en relación a la referencia GCI-P036. Se muestran los datos en las Tablas 7-1 hasta 7-5.

Tabla 7-1 (cont). Variantes de Proteasa con PI > 0.8 en Ensayo de Huevo Cocido en Detergente CASCADE® (NA ADW) Tabla 7-2. Variantes de Proteasa con PI > 0.8 en Ensayo de Huevo Cocido en Detergente Tabla 7-3. Variantes de Proteasa con PI > 0.8 en Ensayo de Micromuestra CS-38 en Deter gente CASCADEd S> (NA ADW) Variante S87 Q109 G118 S128 P129 S130 S188 T213 S248 PI 38 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188R T213R N248D 4.02 1 S87N Q109Q G118V S128L P129Q SI 30 A S188S T213T N248N 4.00 74 S87N Q109Q G118R S128L P129Q SI 30 A S188D T213E N248R 3.87 33 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188R T213T N248N 3.78 40 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188R T213E N248R 3.47 75 S87N Q109Q G1 18D S128L P129Q S130A S 188S T213E N248R 3.01 42 S87N Q109R G118V S128L P129Q S130A S188D T213T N248R 2.74 32 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188S T213E N248R 2.52 12 S87N Q109Q G118V S128L P129Q SI 30 A S188R T213R N248N 2.48 73 S87N Q109R G118R S128L P129Q SI 30 A S188D T213E N248R 2.46 21 S87N Q109Q G118V S128L P129Q S130A S188D T213R N248R 2.43 66 S87R Q109Q G118R S128L P129Q SI 30 A S188D T213E N248N 2.41 63 S87R Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188D T213E N248R 2.41 10 S87N Q109Q G118V S128L P129Q SI 30 A S188R T213T N248R 2.38 39 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188R T213E N248N 2.31 45 S87N Q109R G118V S128L P129Q S130A S188D T213R N248R 2.30 35 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188R T213T N248D 2.25 37 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188R T213R N248R 2.19 17 S87N Q109Q G118V S128L P129Q S130A S188D T213T N248N 2.16 7 S87N Q109Q G118V S128L P129Q SI 30 A S188S T213E N248N 2.14 31 S87N Q109R G1 18V S 128L P129Q S 130A S 188S T213E N248N 2.02 15 S87N Q109Q G118V S128L P129Q SI 30 A S 188R T213E N248N 2.02 79 S87R Q109R G118R S 128L P129Q SI 30 A S188D T213T N248R 1.95 27 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188S T213T N248D 1.93 30 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188S T213R N248D 1.83 34 S87N Q109R G118V S128L P129Q S130A S188R T213T N248R 1.81 62 S87R Q109R G118R S128L P129Q SI 30 A S188D T213E N248R 1.69 16 S87N Q109Q G118V S128L P129Q SI 30 A S188R T213E N248R 1.63 46 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188D T213R N248D 1.61 67 S87R Q109Q G118R S128L P129Q SI 30 A S188S T213E N248R 1.56 13 S87N Q109Q G118V S128L P129Q S130A S188R T213R N248R 1.55 47 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188D T213E N248N 1.52 64 S87R Q109Q G118R S128L P129Q SI 30 A S188D T213E N248R 1.49 4 S87N QI09Q G1 18V S 128L P129Q SI 30 A S 188S T213R N248N 1.48 8 S87N Q109Q G118V S128L P129Q SI 30 A S188S T213E N248R 1.46 25 S87N Q109R G1 18V S128L P1290 S130A S188S T213T N248N 1.39 3 S87N 01090 G118V S128L P129Q S130A S 188S T213T N248D 1.13 49 S87N Q109Q G118V S128L P129Q SI 30 A S188S T213E N248D 1.13 69 S87R Q109D G118R S128L P129Q SI 30 A S188D T213E N248R 1.08 14 S87N Q109Q G118V S128L P129Q SI 30 A S188R T213R N248D 0.96 28 S87N Q109R G118V S128L P129Q S130A S188S T213R N248N 0.88 61 S87R Q109D G1 18R S128L P129Q S130A S188S T213E N248R 0.82 Tabla 7-4. Variantes de Proteasa con PI > 0.8 en Ensayo de Micromuestra CS-38 en Detergente Tabla 7-4 (cont). Variantes de Proteasa con PI > 0.8 en Ensayo de Micromuestra CS-38 en Detergente CALGONIT® (WE ADW) Tabla 7-5. Variantes de Proteasa con PI > 0.8 en Ensayo BMI en Agua Fría TIDE® 2X (Lavandería Líquida NA) Tabla 7-5. Variantes de Proteasa con PI > 0.8 en Ensayo BMI en Agua Fría TIDE® 2X (Lavandería Líquida NA) Variante S87 Q109 G118 S128 P129 S130 S188 T213 S248 PI PI GCI- FNA P036 48 S87N Q109R G118V S128L P129Q S130A S188D T213E N248R 1.05 0.70 42 S87N Q109R G118V S128L P129Q S130A S188D T213T N248R 1.04 0.70 35 S87N Q109R G118V S128L P129Q S130A SI88R T213T N248D 1.02 0.68 32 S87N Q109R G118V S128L P129Q S130A S188S T213E N248R 1.02 0.68 78 S87R Q109D G118R S128L P129Q S130A S188D T213T N248R 1.01 0.68 44 S87N Q109R G118V S128L P129Q S130A S188D T213R N248N 1.00 0.67 53 S87N Q109R G118V S128L P129Q S130A S188R T213E N248D 0.97 0.65 12 S87N Q109Q G118V S128L P129Q S130A S188R T213R N248N 0.93 0.62 16 S87N Q109Q G118V S128L P129Q S130A S188R T213E N248R 0.85 0.57 67 S87R Q109Q G118R S128L P129Q S130A S188S T213E N248R 0.85 0.57 39 S87N Q109R G118V S128L P129Q SI 30 A S188R T213E N248N 0.83 0.55 14 S87N Q109Q GU8V S128L P129Q SI 30 A S188R T213R N248D 0.82 0.55 10 S87N Q109Q G1 18V S128L P129Q S130A S188R T213T N248R 0.81 0.54 64 S87R Q109Q G118R S128L P129Q S130A S188D T213E N248R 0.81 0.54 26 S87N Q109R G118V S128L P129Q S130A S188S T213T N248R 0.80 0.53 Evaluación de Remoción de mancha por Variantes de Colección de Mutación Múltiple (MML) de GCI-P036 Se probaron variantes de GCI-P036 por su desempeño de remoción de mancha en aplicaciones de limpieza. Se realizó la clonación de la colección combinatoria por Sloning BioTechnology usando la Slonomax Technology. Se realizó la preparación de muestras de proteasa variante como se describe previamente. Brevemente, se probaron variantes MML en ensayos de micromuestra CS-38 de micromuestra en sangre, leche, tinta, usando los métodos del Ejemplo 1. Como se describe totalmente, se cuantificó la funcionalidad de variantes de proteasa como un índice de desempeño (PI) , que es la relación de desempeño de una variante a aquella de una proteasa de referencia.

Las sustituciones se enlistan con relación a la proteasa de referencia GCI-P036 usando numeración BPN' y el PI se determina en relación a la referencia GCI-P036. Los resultados se muestran en las Tablas 7-6 y 7 - 7.

Tabla 7-6 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI > 0.5 en Ensayo BMI (pH 8; 32°C) PI N043S/S101Y/N117I 1.32 N043I/N117Y 1.29 N043S/S101F 1.07 S101E/N117Y/N248K 1.37 S101Y/N1 17Y 1.19 N043V/S101V/N248K 1.08 N043I/S101R/N248K 1.14 N043F/N117I 1.21 S101F/N248K 1.05 N043S/S101Y/N248K 1.10 N043S N248I 1.78 N043I/S 101 E/N248I 1.79 N043V/S101R/N117I/N248K 0.76 N043V/S101F/N248K 0.99 S101T/N248I 1.53 N043E/S101 Y/Nl 17Y/N248K 1.23 N043V/S101Y/N117I 1.27 N043V/S101V/N117I 1.56 S101Y/N248K 1.06 N043S/S101R/N117I/N248K 0.85 N043V/N248I 2.00 N043V/S101F/N117Y 1.29 N043E/S 101F 1.36 N043S/S101N/ 117I 1.41 S 101V/N248K 1.33 N043I7S 101 N/Nl 17 Y/N248K 1.19 S101F/N117I/N248I 2.01 S101F/N117Y/N248 0.82 N043I/S 101F/N117Y/N248K 1.25 N043S/S101F/N248K 1.16 N043E/S101N/N117Y 1.53 S101T/N117Y/N248 0.97 N043S/S101E/N248K 1.46 S 101R N117I/N248K 0.65 N043E/S101 Y/Nl 17I 248K 1.21 N043S/S101Y 1.97 N043E/S 101E/N248K 1.39 N043V/S101Y 1.26 S101F/N117Y/N248I 1.21 N043S/S101FVN117I/N248I 2.68 N043F/S 101R 1.14 N043V/S101E/N248I 1.54 N043V/N248K 1.23 S101E/N117I 1.84 N043V/S101Y/N117I/N248K 1.01 N043S/S101 E 1 .50 S101R/N1 17Y 1.62 N043I/S 101 Y/Nl 17 Y/N248K 0.89 N043V/S101F 1 .09 Tabla 7-6 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI > 0.5 en Ensayo BMI (pH 8; 32°C) PI N043S/S101Y/N117Y 1.27 S101Y/N117I/N248K 0.82 P052I/S144Y/N185R/Y209W 1.01 P052V/S144T 1.56 P052V/M119F/S144T/N185R/S256T 1.62 S144Y Y209W/S256I 1.15 P052I/S144Y/Y209W/S256I 1.36 S144T/N185V 1.33 S144V/N185R/Y209W/S256T 0.93 M119F/Y209W 0.78 M119F/N185V/Y209W 1.19 M119F/ 185R 0.79 S144V Y209W 1.21 P052I/S144T/N185R/Y209W/S256T 1.20 P052I/N185V/Y209W 1.34 P052V/S144V/N185R/Y209W/S256T 1.13 S144W/S256I 1.30 S 144V/ 185R/Y209W 0.98 P052V/S144W/Y209W 1.50 P052V/M119F/S144T/Y209W 1.73 P052V/S 144T/Y209W/S256I 1.58 P052V/S144Y/Y209W 1.36 P052I/S 144T/Y209W/S256T 1.60 P052I/N185R/Y209W/S256I 1.07 P052V/S144W/ 185R 1.47 P052V/M119F/S144T7N185R Y209W 1.05 P052V/N185V/Y209W/S256I 1.54 P052I7S144Y/N185V/S256T 1.63 S 144V/ 185R/S256I 0.75 S 144T/N185R 1.02 P052I/S144Y/N185V 1.75 P052V/M119F/S144T 2.01 MI 19F/ 185R Y209W/S256T 0.84 P052I/S144T/N185V/Y209W/S256T 1.47 M119F/Y209W/S256I 1.26 S 144W/N185R/Y209W/S256T 0.81 P052V/S 144 V/Nl 85 V/Y209W 1.37 P052I/M119F 1.52 M 119F/S 144W/N 185R/S256L 0.94 P052V/S144W/ 185V/Y209W 1.47 N185V/Y209W 0.99 P052I/M119F/S144V/Y209W 1.91 P052I S144V/Y209W 1.25 P052I/M119F/S144T/N185R/Y209W 1.52 S 144W/N185V/Y209W/S256I 1.22 M119F/S144T/N185V/S256I 1.18 P052I/M119F/Y209W/S256I 2.11 P052I/N185V/Y209W/S256I 1.60 S 144T/N185R/Y209W/S256I 0.82 Tabla 7-6 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI > 0.5 en Ensayo BMI (pH 8; 32°C) PI P052V/M119F/N185V/Y209W/S256I 1.93 P052I/S144T 1.44 S 144T/N185R/Y209W/S256T 0.83 S144V/S256I 1.27 P052I S144T/S256I 1.46 P052V/S144T/N185V/Y209W/S256T 1.47 P052V/S144Y/S256T 1.68 P052I/S144T/Y209W/S256I 1.01 P052V/S256T 1.48 P052V/S 144V/Y209W/S256I 1.63 P052 V/S 144T/N185 V/Y209W/S256I 1.62 A001K/R045K/I072V/L126F/S164Q 0.81 A001K/L126F/S164Q 1.11 A001K/R045F/V104I/L126F/S 164O 0.86 A001K/I072V/V104I 0.92 A001K/R045K/I072V/S 164F 0.95 A001K/L126F 0.93 A001 K/R045F/I072 V/V 104G/S 164T 1.06 R045L/I072S/S164I 1.15 L126A/S 164N 0.96 A001K/L126F/S164F 0.82 R045K/L126F/S164F 0.73 A001 K/R045K/I072V/V 104I/L126F/S 164F 0.66 AOO 1 K/I072C/V104I/L 126F/S 164Q 0.73 A001K/I072V/V104I/S 164F 0.83 AOO 1 K/V 104I/L 126F/S 1 41 0.85 A001K/R045K/L126F 1.17 A001K/R045F/L126F/S164I 0.70 A001K/R045K/L126F/S164I 0.77 A001L/I072C 0.80 A001K/R045K/I072V/S164Q 0.92 A001 K/I072C/L126F/S 1640 0.78 A001K/V104E 0.91 A001K/I072C/L126F 0.95 L126F/S 164V 0.98 R045 F/I072 V Ll 26F/S 164Q 1.22 A001K/R045S/V104C/L126Y/S 164F 0.72 A001K/R045F/I072V/L126F/S164I 0.76 A001K/V104I/L126F/S164Q 0.76 A001K/R045K/V104I7S164Q 0.81 A001 K/R045K/I072V/L126F 0.73 A001K/R045K/I072V V104I/L126F/S 164I 1.48 A001K/R045K/V104L/S 164A 1.02 A001 K/R045F/L126F/S 164F 0.82 A001K/I072V/V104I/S164Q 0.87 A001K/I072V/L126F 1.08 A001 K/I072 V/L126F/S 164F 0.87 V104E L126I/S164L 1.13 AOOl K/R045K/L126F/S 164Q 0.73 Tabla 7-6 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI > 0.5 en Ensayo BMI (pH 8; 32°C) Pl S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024H/I107 V/A 172S 0.81 S087N/G118V/S128L P129Q/S130A/A001K/I107W/A172P 0.69 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001R 0.82 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A AOO 1K/I107T/A172Q 0.63 S087N/G 1 18 V/S 128IJP 129Q/S 130 A/AOO 1 K/R045N/11 7 V 0.80 S087N/G 1 18 V/S 128L P 129Q/S 130A/AOO 1 K S024H/A 172Q 0.93 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/A001R/S024W/A172W 0.68 S087N/G 118 V/S 128LVP 129Q/S 130 A/A 172N 0.69 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/AOO 1 R/I107 V/A 172Q 0.68 S087N/G118V/S128L P129Q/S130A S024T/I107T/A172Q 0.78 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001K/S024H/I107V 0.77 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S024W/1107T 0.85 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 13OA/A001 R/R045K 1.02 S087N/GU8V/S128L/P129O/S130A/A001R/I107V/A172W 0.67 S087N/GU8V/S128L/P129Q/S130A A001K/R045K/I107S 0.75 S087N/G118V/S128L/P129O/S130A/S024T/R045N/I107V/A172S 0.82 S087N/G 118 V/S 128LVP 129Q/S 130A/S024N/I107N 0.67 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/S024H/R045N/I107T 0.95 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 13OA/A001 K S024T/I107 V/A 172W 0.69 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/R045N/I107V/A172P 0.78 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/R045F/I107T/A172Q 0.91 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/AOO 1 K/R045 F 0.73 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001R/S024H/R045F/I107T 0.65 S087N/G118V/S128L/P129Q S130A/??lK/R045 /I107T/?172Q 0.88 S087N/G118V/S128L/P129O/S130A/A001R/S024R/R045K I107G/A172L 0.63 S087N/G118V/S128IVP129Q/S130A/S024R/I107V/A172S 0.78 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/AOO 1 R/S024N/1107T 0.63 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/AOO 1 R/S024T/R045N/1107T 0.74 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A A001R/A172I 0.61 S087N/G118 V/Sl 28L/P129Q/S 130A/A001R/S024H/R045K/A172N 0.72 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A S024R/R045F/1107T 0.82 S087N/G1 18V/S128I.7P129Q/S130A/A001R/I107V/A172P 0.72 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024T 1.03 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001R/R045N/I107T/A172Q 0.70 S087N/G118V/S128L/P129O/S130A/R045N/A172O 1.06 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S024 W/R045 F/1107 V/A 172Q 0.83 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/AOO 1 R/A 172Q 0.79 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024N/I107T 0.57 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001R/S024H/R045K/I107T/A172Q 0.54 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024 W/S099K 1.07 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A S024W/S099T/S 103N/G127R/S 132N 0.51 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A S024 W/S099K S 103P 1.32 S087N/G118V/S128L/P129Q/S 130 A/S099T/S 103N/S 132H 0.70 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S099Q/S 103N 1.06 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S099Q 0.96 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024 W 1.20 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S024W/S099T/S 103N/S 132N 1.77 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S024 W/S099T/S 132N 1.28 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024 W/S099T 0.99 Tabla 7-6 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI > 0.5 en Ensayo BMI (pH 8; 32°C) PI S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024 W/S099T/S 103N 0.96 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S 103N/S 132H 1.52 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/S024 W/S099T/G 127R/S 132H 0.65 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S099K/S 103N 0.95 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/S024H/S099Q/S 132N 1.70 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024W/S099Q/S 103P 1.36 S087N/G 118 V/Sl 28L/P 129Q7S 130A7S024H/S099Q 0.98 S087N/G 1 18V/S128IJP129Q/S 130A/S 103P 1.25 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S099K S 132H 1.17 S087N/G118V/S128L P129O/S130A/S024H/S099O/S103P 1.36 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024H/S 103P/S 132N 0.98 S087N/G 1 18V/S128L/P129Q/S 130A/S024H/S099T/S 103P/S 132N 0.87 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S099T/S 132H 1.09 S087N/ 118 V/S 128L/ 129Q7S 130 A/S024L/S099K S 103P/S 132N 0.98 S087N/G 118 V/S 128L/ 129Q/S 130 A/S099T/S 103N 1.49 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S099K S 103P 1.25 S087N/G 118 V/Sl 28L/P 129Q/S 130A/S024W/G 127T 0.93 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024H/S099T/S 132N 1.73 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024H/S099T/S 103P 1.41 S087N/G 118 V/S 128L/ 129Q/S 130 A7S099Q/S 132H 1.43 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130 A/S024W/S099Q/S 132H 1.29 S087N/G1 18V/S1281JP129Q/S130A/S099K 0.92 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024W/S099Q 0.97 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S099T/S 103P 1.20 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024H/S099K S 103N 0.99 S087N/G 118 V/Sl 28L/P 129Q/S 130A/S024W/S099Q/S 132N 1.41 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A S099Q/S 103P 0.85 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130 A/S024H/S099K/S 103N/S 132N 1.32 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024W/S099Q/S 103N/S 132N 1.53 S087N/G118V/S128L/P129Q/S 130A S024W/S099K/S 132H 0.99 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N018K/N185K 0.82 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130A/N018R/G097P/N185K/A215R 0.75 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185R/Y209W 0.83 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018R/N185K 0.68 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N018K 1.03 S087N/G 1 18 V/Sl 28L/ 129Q/S 130A/N018K G097P/N185Q/A215 VS256W 0.83 S087N/G 118 V/S128L/P129Q/S 130 A/N018Q/N185Q/S256W 0.91 S087N/G 118 V/Sl 28L/P129Q/S 130A/N018Q/N185Q/Y209W/S256W 0.85 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018Q/N185R/A215R/S256P 1.03 S087N/G118V/S128iyP129Q/S130AyN018R/N185K/Y209W/A215yS256W 0.71 S087N/G 118 V/Sl 28L/P 129Q/S 130A/Y209W/S256W 0.86 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018R/S256W 0.89 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A7N018R/Y209W/A215I/S256W 0.73 S087N/G1 18V/S128L/P129O/S130A/N018K/ 185R 0.82 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S 130A N018K/N185K/S256W 0.76 S087N/G118V/S128L/P129O/S130A/N018Q/Y209W/S256W 0.87 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185R/Y209W/A215V/S256R 0.81 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N185K/A215V/S256W 0.97 S087N/G 1 18 V/S 1281.7P129Q/S 130A/N018K/Y209W 0.82 Tabla 7-6 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI > 0.5 en Ensayo BMI (pH 8; 32°C) PI S087N/G 1 18V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018K/ 185Q/S256W 0.80 S087N/G118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018R/Y209 W/S256W 0.73 S087N/G 118V/S 128L/P 129Q/S 130A/ 018K A215R/S256W 0.57 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018K/G097P/N185R/A215R 0.68 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018R/N185R/Y209W/S256W 0.68 S087N/G 118V/S 128L P 129Q/S 130A/N018Q/A215R/S256W 0.76 S087N/G 118 V/S 128 L/P 129Q/S 130 A/N018K G097P/N 185R/Y209W 0.70 S087N/G 118 V/S 128ÍJP 129Q/S 130A/A215 V/S256W 1.00 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ 185K/Y209W/A215V/S256W 0.85 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018R/N185R/A215R 0.82 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N185K/Y209W/A215 V 0.89 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ 018K/N185R/A215V/S256W 0.63 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018R/N185K/A215 V/S256W 0.74 S087N/G118V/S128I P129Q/S130A/G097P/N185R/A215I/S256W 0.83 S087N/G118V/S128L/P129Q/S 130 A/N018R 0.92 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/ 018K/ 185K/Y209W/A2151 0.91 S087N/G 118V/S 128L/P 129Q/S 130A/ 018Q/A215I/S256W 0.90 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q7S 130 A/NO 18K/ 1850 0.77 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/N018K N185R/A215I/S256W 0.71 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A G097P/N 185Q/Y209W/A215 V/S256W 0.82 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N018K/N 185Q/A215R 0.62 S087N/G 118V/S 128L/P 129Q/S 130A/Y209W/A215 S256W 0.98 S087N/G 118 V/Sl 28L/P 129Q/S 130A/N018K N185Q/A215 V/S256W 0.72 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N 185Q/Y209W/A215R 0.88 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018Q/G097P/N 185R 1.01 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185R/A215V/S256W 0.83 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A N018R/ 185 K Y209W 0.63 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/A215 V 1.20 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018R/N185Q/A215I/S256W 0.88 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/G097P/N 185K A2151 0.87 S087N/G 118V/S 128L P 129Q/S 130A/N018Q/N185K/A215R 0.84 S087N/G 118 V/Sl 28L/P 129Q/S 130A/N018K/Y209W/A215 V 0.84 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/NO 18K/N 185K/Y209W 0.76 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/N018R/G097P/N185K/Y209W/A215I/S256W 0.67 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018Q/N 185K/A215 V 0.88 S087N/G118V/S 128L/P 129Q/S 130A/N 185R/Y209 W/S256L 0.80 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018K/S256W 0.72 S087N/G 118V/S 128L P 129Q/S 130A/N018Q/N185K S256W 0.84 S087N/G 118V/S 128L/P 129Q/S 130A/N 185Q/Y209W/A215 V/S256W 0.77 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/P052I/N248K 1.07 S087N/G 118 V/S 128 L/P 129Q/S 130 A/N043 W/S 101 F/N248K 0.97 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043 V/P052I/S 101 Y 1.33 S087N/G 118 V/S 128L 129Q/S 130A N043 V/S 101 T 1.08 S087N/G 118 V/S 128L/ 129Q/S 130 A N043 V/P052 V/S 101 F/N248K 1.53 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/P052V 1.20 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/N043S 1.37 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A N043 V/S 101 Y 1.04 S087N/G 118 V/S 128 L/P 129Q/S 130A/N043S/P052V/S 101 R 1.18 S087N/G 118V/S128G.7?129Q/S130A/N043S/P052V/S 101 F 1.30 Tabla 7-6 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI > 0.5 en Ensayo BMI (pH 8; 32°C) PI S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A7N043F/P052 V/S 101 T/ 248K 1.12 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A7N043I/S101EyN248K 1.13 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101E/N248K 1.08 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/ 248K 0.97 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043W/S 101 E 1.09 S087N/G 1 18 V/S 128L P 129Q/S 130AVN043S/S 1 1 E/N248K 1.29 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/P052I/S 101 V/N248K 0.99 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A S 101 F/N248K 0.72 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N043V/S101T/N248K 1.00 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N043V/P052V/N248K 1.52 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N043S/S101N N248I 1.64 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y 0.86 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043S/P052 V/S 101 Y/N248K 1.28 S087N/G 118 V/S 128L/P 1290/S 130AyN043I/S 101 N 1.19 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N043E/P052V/S 101E/N248K 1.72 S087N/G 118 V/S 128L/P1290/S 130A/N043V/P052I 1.40 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/P052I/S 101 F/N248K 1.20 S087N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052V/S 101 E 248I 1.59 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A N043 W/P052 V/S 101 E/N248K 1.69 S087N/G 1 18V/S128L/P129Q/S 130 A/ 043E 0.99 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N043S/S101T 1.07 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A7N043 V/S 101 F 1.09 S087N/G 118V/S 128L/P129Q/S 130A/ 043 V/P052I/S 101T/N248K 1.67 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/ 043 V/S 101 Y/N248I 1.34 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A7N043E/S 101 R 0.92 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043S/P052I/N248K 1.39 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A N043E/S 101 Y 1.16 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A7N043E/S 101 E 1.30 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043I/P052I S 101 F/N248K 1.58 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A 043T/ 248K 0.98 S087N/G118 V/S 128L/P 129Q/S 130A N043T7P052I/S 101 Y 1.38 S087N/G 118 V/S 128L P1290/S 130A/P052V/S 101 R 0.90 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043I P052V/S 101 F/N248 1.38 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043W/P052 V/S 101 Y/N248K 1.48 S087N/G 1 18 V/S 128IJP129Q/S 130A/P052I/S 101 E/N248K 1.42 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S 101 N/ 248K 1.00 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043 V/S 101 E/N248K 1.31 S087N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130 A/N043 V/S 101 R 0.94 S087N/G1 18V/S128L P129Q/S130A/ 043V/P052V/S101F 1.35 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101E 0.70 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043F/S 101 Y/N248K 0.97 S087N/G 1 18V/S 128L/P129Q/S 130A/N043S/P052V 1.19 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N043W/P052V/S101Y 1.39 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/ 043S/P0521 1.55 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043T/S 101 E/N248I 1.99 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A7N043 V/S 101 E/N248I 2.15 S087N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A/ 043V/S 101R/N248I 1.32 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/ 248I 1.37 S087N/G118V/S128L P129O/S130A/ 043E/P052yS101Y/N248K 1.79 Tabla 7-6 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI > 0.5 en Ensayo BMI (pH 8; 32°C) PI S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 AJS 101 R/ 248K 0.69 S087N/G 1 18 V/S 12817P129Q/S 130 A/N043S/P052V/N248K 1.41 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A7N043I/S 101 Y 1.01 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130AVN043I S 101 Y/N248K 1.00 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043S/P052V/S 101 V/ 248K 1.22 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043T 1.09 S087N/G 118V/S 128L/P129Q/S 130A/N043T/P052V/S 101 Y 248K 1.20 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A7P052 V/S 144T 1.24 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/Y209 W 1.02 S087N/G 118 V/S 128IVP129Q/S 130A/G097S/S 144Y/S256I 1.02 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N043S/N185V/S256T 1.10 S087N/G118V/S128L/P129Q/S 130A/P052V/Y209W 1.07 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/G097S/S 144V Y209 W/S256I 1.17 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S 144V/N 185 V/S256I 1.23 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/G097T/S 144W/Y209W/S256I 0.96 S087N/G 1 18 V/S 128IJP129Q/S 130 AJS 144V/ 185R/S256I 1.12 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 AJS 144T/N 185R/Y209W/S256I 1.02 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043S/S 144W/N 185R/S256P 0.96 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A7S 144 V/N 185R/Y209 W 0.95 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/P052V/S 144Y/N 185R/Y209 W/S256I 1.05 S087N/G 118 V/S 128 L/P 129Q/S 130 AJS 144V/Y209W/S256T 1.10 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052V/G097T/N 185R/Y209W/S256T 0.95 S087N/G 118V/S 128L/P129Q/S 130A/G097S/N185R/S256I 0.85 S087N/G 118 V/S 128LVP 129Q/S 130 A/N043S/S 144W/N 185 V/S256T 1.14 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043 V/S 144 Y/N 185R/Y209 W 1.02 S087N/G 1 18 V/S 128L P129Q/S 130A/S 144W/Y209W 1.14 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 AJS 144 V/N 185 V/Y209W 1.04 S087N/G118V/S128IVP129Q/S130A N043V/P052V/S 144Y/ 185R/Y209W S256T 0.74 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 AJS 144 V/ 185 V 1.15 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/P052V/S 144T/N 185R/Y209W 0.96 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/S 144 Y/N 185R 0.97 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/N043 V/S 144W/N 185 V 1.16 S087N/G 118V/S 128L/P129Q/S 130A/S 144?7?185R/Y209W 0.96 S087N/G 118V/S 128L P129Q/S 130A/G097T/S 144W/N 185R/Y209W/S256I 0.59 S087N/G 118 V/S 128L7P129Q/S 130A/S 144T/N185R 0.83 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A7S 144T/Y209 W/S256I 1.10 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N043V/S144Y/N185V/Y209W/S256I 0.75 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130AyP052V/S144V/N185R/S256I 0.91 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 AJS 144 V/Y209 W/S256I 1.15 S087N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A N043 V/S 144W/Y209 W/S256I 1.12 S087N/C 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N 185 V/Y209 W 0.86 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052V/S 144T/ 185R/S256T 0.97 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S 144?/? 185 V/S256I 1.17 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A7N043S/N 185R/Y209 W/S256T 0.86 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A7S 144T/N185 V/Y209W 1.01 S087N/G 118 V/S 128L7P 129Q/S 130 AJS 144 V 0.99 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130AyN043T/S 144V/Y209W/S256T 1.17 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052 V/S 144Y/N185R/Y209W/S256T 1.30 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A7S 144Y/N 185 V/Y209W 1.25 Tabla 7-6 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI > 0.5 en Ensayo BMI (pH 8; 32°C) PI S087N/G 118V/S 128L7P129Q/S 130A/G097T/Y209W/S256I 1.08 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N 185R/S256T 0.87 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/P052V/S 144V N185 V/Y209W/S256I 1.29 S087N/G 118V/S 128L/P129Q/S 130A/P052V/S 144T/Y209W/S256T 1.12 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S 144T/S256I 1.11 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R/S256I 0.80 S087N/G 118 V/S 128171' 129Q/S 130A 043S/S256I 0.94 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R Y209W/S256T 1.06 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043 V/ 185 V/Y209W/S256I 1.00 S087N/G118V/S128L7P129O/S130A/P052V/S144Y/N185V/Y209W/S256I 1.23 S087N/G 118 V/S 128L7P129Q/S 130A/G097T/S 144T/S256I 1.11 S087N/G 118 V/Sl 28I7P 129Q/S 130A/P052V/S 144V/Y209W 1.27 S087N/G 118 V/S128L P 129Q/S 130A/N043 V/P052V/S 144V/N185R/Y209 W/S256I 0.90 S087N/G118V/S128L/P129O/S130A/G097T/S144T/N185R/Y209W/S256I 0.90 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043S/S 144 W 1.23 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q7S 130 A/N043 V/S 144T/N 185 V/S256I 1.19 S087N/G 118 V/Sl 28L P 129Q/S 130A/P052V/S 144Y/N 185 V 1.37 S087N/G 118V/S12817P 129Q/S 130A/P052V/Y209W/S256T 1.02 S087N/G 118 V/S 128L7P 129Q/S 130A/A001 K I072C/V 104I/S 1641 0.67 S087N/G 118 V/S 128LVP 129Q/S 130A/S 1641 1.03 S087N/G 118 V/S 128L7P 129Q7S 130 A/A001 K/V 104I/S 1641 0.87 S087N/G 118 V/Sl 2817P 129Q/S 130A/AOO 1 K/I072C 1.24 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/R045 K/I072C/L126F 1.05 S087N/G 118 V/S 128m 29Q/S 130A/A001 K/V 104I/S 164F 0.93 S087N/G118V/S128L/P129O/S130A/I072C/S164I 1.46 S087N/G118V/S128I71'129Q/S130A/AW1K/1072C/S164Q 1.16 S087N/G 118 V/S 12817P 129Q/S 130 A/A001 K/S 164F 0.99 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S 164Q 0.94 S087N/G 118 V/S 128I7P 129Q/S 130 A/I072C/L126F 1.08 S087N/G 118V/S128L/P 129Q/S 130A/A001 K/I072 V/S 164Q 0.57 S087N/G 1 18 V/S 128L P 129Q/S 130A/A001 K/S 1641 0.99 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A I072C/S 164Q 1.48 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A A001K L126F/S164F 1.32 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001K I072C/S164I 0.68 S087N/G 118 V/S 128I7P 129Q/S 130A/L 126F/S 1641 0.85 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/A001 K/I072 V/S 1641 1.07 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/I072 V/S 164F 1.13 S087N/G 118 V/S 128L7P 129Q/S 130 M072C/L126F/S 164F 1.01 S087N/G118V/S128I7P129Q/S130A/V104I/L126F/S164F 0.89 S087N/G 118 V/S 128L7P 129Q/S 130 A/V 1041/S 164Q 0.88 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/A001 K V 104I/L126F/S 164Q 0.77 S087N/G118V/S128L/P129Q/S 130A V 104I/L126F/S 1641 0.90 S087N/G 118 V/S 12817P 129Q/S 130A/I072C 1.51 S087N/G 118 V/S 128171' 129Q/S 130 A AOO 1 K I072C/V 104I/L126F 0.91 S087N/G 118 V/S 128I.7P 129Q/S 130 A/V 1041/S 1641 1.00 S087N/G 118 V/S 128L7P 129Q/S 130 A/AOO 1 K/I072 V/V 104I/L126F/S 164F 0.75 S087N/G 118 V/S 12817P 129Q/S 130A/AOO 1 K/I072V/S 164F 1.07 S087N/ 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/I072P 1.27 S087N/G 118 V/S 12817P 129Q/S 130 A/AOO 1 K/I072C/L 126F/S 1641 0.92 Tabla 7-6 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI > 0.5 en Ensayo BMI (pH 8; 32°C) PI S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/Ll 26F 0.93 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/I072C/V 104I/L 126F/S 1641 1.06 S087 /G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/V 1041 0.99 S087N/G 118V/S 128L/P129Q/S 130A/A001 K/V 104I/L126F/S 164F 0.71 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/A001 K/I072C/L 126F 0.99 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/AOO 1 K/I072C/L 126F/S 164F 0.78 Tabla 7-7. Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI PI > 0.5 en Ensayo de Micromuestra CS-38 (pH 10; 32°C) G097P/N185Q/A215I 0.97 N018R/ 185R/S256W 0.96 N018Q/N185R/A215R 0.72 N018Q/N185Q/Y209W/S256W 0.90 N018K/G097P/N 185K S256W 0.93 N018Q/N185K/Y209W/A215V/S256W 0.97 N018R/N185Q/A215V/S256W 0.81 N018R/G097P/Y209W/S256W 0.92 N018R/N 185R/Y209W/S256W 0.98 N185Q/A215R/S256W 0.83 N018K/A215R 1.12 N018K/G097P/Y209W/A215V/S256W 1.02 N018K/N185R/A215V 0.81 N018K/N185K/Y209W/A215R 0.68 N185K/A215V 1.19 N018K/N185K 1.22 N018R/N185R/A215R 1.48 N018K/G097P/ 185K/Y209W/A215I/S256W 1.12 G097P Y209 W/A215 V/S256W 1.01 N018R/Y209W/S256W 0.93 N018Q/N185K/S256W 0.88 N018K/N185Q/A215V/S256W 1.46 N018K/S256W 0.94 N018R/Y209W/A215 V/S256W 0.80 N018Q/G097P/ 185K/Y209W 1.33 NO 18R/G097P/Y209W/A215 V 1.21 N185R/S256W 0.99 NO 18K/G097P/ 185Q/Y209W/A215 V/S256W 1.09 N018K G097P/N185R/A215R/S256W 0.64 NO 18K/N185R/A215I/S256 W 0.67 N185R/Y209W/A215I 1.10 N018R/N185K/S256W 0.76 N018K/G097P/N185R/S256W 0.97 N018K/N185Q/A215RVS256W 0.91 N018K/N185K A215V/S256W 0.95 N018Q/N185RyS256W 0.79 Tabla 7-7 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que PI Tienen un PI > 0.5 en Ensayo de Micromuestra CS-38 (pH 10; 32°C) N043E/S101E/ 248K 3.98 N043V/S101Y > 4.0 S101F/N117Y/ 248I > 4.0 N043F/S101R > 4.0 N043V/S101E/N248I > 4.0 N043V/N248K 1.93 N043V/S101 Y/Nl 17I/N248K > 4.0 N043S/S101E > 4.0 N043I/S101Y/N117Y/N248K 2.50 N043V/S101 F 3.24 N043S/S101Y/N117Y > 4.0 S101Y/ 117I/N248K 2.65 P052US 144 Y 185R/Y209W 3.93 P052V/S144T 1.41 S144Y/Y209W/S256I 2.38 S 144T/ 185V 1.83 S 144V/N185R/Y209W/S256T 2.22 M119F/Y209W 0.98 M119F/N185V/Y209W 1.46 M119F/N185R 0.73 S144V Y2Ü9W 2.25 P052I/N185V/Y209W > 4.0 S144V/N185R/Y209W 1.89 P052V/S144Y/Y209W 2.15 P052I/N185R/Y209W/S256I 3.36 S144V/N185R/S256I 0.98 S144T/ 185R 1.23 Mi l 9F/N 185 R/Y209W/S256T 1.17 M119F/Y209W/S256I 1.52 S 144W/N185R/Y209W/S256T > 4.0 P052V/S144V/N185V/Y209W > 4.0 N185V/Y209W 1.09 P052I S144V/Y209W > 4.0 S 144W/N185 V/Y209W/S256I > 4.0 MI 19F/S144T/N185V/S256I 1.10 S144T7N185R/Y209W/S256I 2.35 S 144T/N185R/Y209W/S256T 1.12 S144V/S256I 1.73 P052I/S 144T/Y209W/S256I 1.01 A001 K/R045K/I072V/L126F/S 164Q 1.14 A001K/L126F/S164Q 0.92 A001 K/R045F/V 104I/L126F/S 164Q 0.83 A001K/I072V/V104I 1.16 A001 K/R045K/I072 V/S 164F 1.09 A001K/L126F 1.46 AOO 1 K/R045F/I072 V/V 104G/S 164T 0.93 R045L I072S/S164I 1.35 A001K/L126F/S 164F 0.92 Tabla 7-7 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que PI Tienen un PI > 0.5 en Ensayo de Micromuestra CS-38 (pH 10; 32°C) A001R I107T/A172Q 1.01 A001R/I107V/A172Q > 4.0 A001K/R045F/I107L/A172N 1.01 A001P/A172V 0.93 S024H/I107K 1.02 A001L/S024D/R045Y/I107Y 1.60 A001 M/R045S/I107E A 172D 1.34 S024I/1107R/G127I/A172R 1.17 A001K/S024T/I107T/G127Q/A172Q 1.72 A001R/S024R/R045F/I107T/G127R 2.38 A001C/S024V/I107L 1.76 A001K/S024H/R045N/I107T 1.09 A001K/I107V/G127Q 0.91 A001 K/S024R/R045N/1107T/G 127R 2.47 A001R/S024T R045K/A172Q 0.85 A001R/A172G 0.73 A001R/R045N/A172K 0.93 A001L/R045Q/G127H/A172R 0.86 A001K/I107V/G 127R/A172Q 3.07 A001K/R045F/I107T 1.07 A001K/S024T/R045N/G127Q/A172Q 1.08 A001K/R045K/I107A/A172T 1.41 A001R I107T/G127Q/A172Q 1.12 A001K/R045K/I107R/G127A/A172N 0.86 A001R/S024W/R045F/I107V/G127Q 2.33 R045N I107A/A172R 1.27 A001R/R045N/I107T/G127Q 1.09 I107P/A172S 1.47 A001R/S024W/I107V/A172S 1.54 A001K/S024H/I107T/G127Q 1.46 A001R/S024H/R045K/I107T/A172Q 1.01 A001R/R045N/A172Q 0.83 A001 K/R045 F/Il 07 V/G 127Q 0.82 A001 K/S024N/I107 V/G 127T 0.80 S024T R045K/I107T/G127R/A172Q 3.14 A001 K/R045N/I107T/G 127Q 1.14 A001K/S024W I107 V/G 127T/A 172Q 1.27 A001K/I107V/G127Q/A172Q 1.02 A001R/R045N/I107V/G127R 1.03 A001 K/S024H/I 107T/G 127R 1.46 A001R/I107T 0.93 A001 K/S024H/I107V 2.10 I107A/G127K/A172G 1.05 A001R/R045K/G127R 1.84 A001R/R045K/I107T/G127Q 1.30 A001R/S024W/R045K 0.89 A001R/R045N/I107T 0.83 A001 K S024R/R045N I107T 1.77 Tabla 7-7 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que PI Tienen un PI > 0.5 en Ensayo de Micromuestra CS-38 (pH 10; 32°C) S 87N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S024H/I107 V/A 172S 1.23 S87N/G1 18V/S128UP129Q/S130A/A001K/I107W/A172P 1.73 S87N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/A001 R 1.05 S87N/G 118 V/S 128UP129Q/S 130A/A001 K/R045N 07 V 1.30 S87N/G118V/S128L7P129Q/S130A/A001K/S024H/A172O 1.34 S87N/G118V/S128UP129O/S130A/A001R/S024W/A172W 1.95 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A172N 1.68 S87N/G118V/S128UP129Q/S130A/A001R I107V/A172Q 1.59 S87N/G118V/S128L P129Q/S13OA/A001KySO24H/I107V 1.65 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001R/R045K 1.66 S87N/G118V/S128L/P129O/S130A/A001R/I107V/A172W 1.65 S87N/G118V/S128UP129Q/S130A/A001K/R045K/I107S 1.61 S87N/G118V/S128LVP129Q/S130A/S024T/R045N/I107V/A172S 2.52 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024N/I107N 1.04 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001K/S024T/I107V/A172W 1.20 S87N/G 1 18 V/S 128I.7P129Q/S 130A/R045N/I107 V/A 172P 1.29 S87N/G118V/S128IJP129Q/S130A/A001K/R045F 2.32 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A A001R/S024R/R045K I107G/A172L 1.99 S87N/G 118 V/S 128L P 1290/S130A S024R I107V/A 172S 1.50 S87N/G118V/S128L/P129O/S130A/A001R/A172I 1.64 S87N/G118V/S128L P129Q/S130A/A001R/S024H/R045K A172N 1.46 S87N/G1 18V/S128L P129Q/S130A/A001R/I107V/A172P 1.57 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024T 0.96 S87N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S130A/R045N/A172Q 1.03 S87N/G118V/S128I P129Q/S130A/S024W/R045F/I107V/A172Q 1.75 S87N/G118V/S128L P129Q/S130A A001R/A172Q 1.37 S87N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099K > 4.0 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q/S103N 2.62 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q 1.12 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W 0.90 S 87 N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S024W/S099T 1.33 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/S103N 1.61 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099K/S103N 1.69 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024H/S099Q 1.39 S87N/G118V/S128L7P129Q/S130A/S024W/G127T > 4.0 S87N/G 118 V/S 128L/P1290/S 130A/S099K 1.33 S87N/GU8V/S128L/P129O/S130A/S024W/S099O 1.56 S87N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S024H/S099K S 103N 1.52 S87N/G 118 V/S 128I7P 129Q/S 130A/N018K N 185K 0.94 S87N/G118V/S128L/P129O/S130A/N185R/Y209W 0.97 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018K 1.35 S87N/G118V/S128L/P129O/S130A/N018Q/ 185O/S256 1.02 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018Q/N185Q/Y209W/S256W 1.24 S87N/G118V/S128L/P129O/S130A/N018R/ 185K/Y209W/A215I/S256W 1.65 S87N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/Y209W/S256W 0.79 S87N/G1 18V/S128I7P129Q/S130A/ 018R/Y209W/A215I/S256W 1.61 S87N/G 118 V/S 128L/P129Q/S130A/N018K 185R 1.00 S87N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018K 185K/S256W 1.22 Tabla 7-7 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que PI Tienen un PI > 0.5 en Ensayo de Micromuestra CS-38 (pH 10; 32°C) S87N/G118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018Q/Y209W/S256W 1.26 S87N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N185R/Y209W/A215 V/S256R 0.81 S87N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N185K/A215 V/S256W 1.15 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018K/Y209W 0.99 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018K/N 185Q/S256W 1.07 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018R/Y209W/S256W 1.28 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018K/A215R/S256W 1.23 S87N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018Q/A215R/S256W 1.16 S87N/G 118 V/S 128L/P 1290/S 130A/N018K/G097P/N185R/Y209W 2.83 S87N/G118V/S128L P129Q/S130A/A215V/S256W 1.54 S87N/G 118 V/S 128UP129Q/S 130A/N185K/Y209W/A215 V/S256W 0.85 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018R/N185R/A215R 1.27 S87N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N 185K/Y209W/A215 V 0.88 S87N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018K N 185R/A215 V/S256W 1.03 S87N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018R 0.98 S87N/G118V/S 128L/P129Q/S130A/N018K/N185K Y209W/A215I > 4.0 S87N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/ 018Q/A215I S256W 2.09 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018K/N185Q 1.09 S87N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018K/ 185R/A215US256W 1.12 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/G097P/N185Q/Y209W/A215V/S256W 0.68 S87N/G118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018K 185Q/A215R 0.98 S87N/G118V/S128UP129Q/S130A/Y209W/A215I/S256W 1.96 S87N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018K/ 185Q/A215 V/S256W 1.04 S87N/G 1 18V/S128L/P129Q/S130A/N185Q/Y209W/A215R 0.82 S87N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N 185R/A215 V/S256W 1.11 S87N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018R/N185K/Y209W 0.85 S87N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A A215 V > 4.0 S87N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018R N185Q/A215I S256W > 4.0 S87N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A/G097P/N 185K/A2151 > 4.0 S87N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018Q/ 185K/A215R 1.14 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018K/Y209W/A215V 1.21 S87N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018K/ 185K/Y209W 0.89 S87N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018Q/ 185K/A215 V 0.68 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N185R/Y209W/S256L 0.87 S87N/G118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018K/S256W 1.10 S87N/G118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018Q 185K/S256W 0.71 S87N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N 185OA^209W/A215 V/S256W 0.79 S87N/G118 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052I/N248K 1.24 S87N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043 V/S 101T 1.84 S87N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/P052V > 4.0 S87N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043 V/S 101 Y > 4.0 S87N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S 101 E/N248K 3.92 S87N/G1 18V/S 128L/P129Q/S130A/N248K 1.40 S87N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043 W/S 101 E 3.08 S87N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130A/P0521/S 101 V/N248 > 4.0 S87N/G118V/S 128L/P129Q/S130A/S 101F/N248K > 4.0 S87N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/ 043 V/S 101T/N248K 3.71 S87N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S 101 Y > 4.0 Tabla 7-7 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que PI Tienen un PI > 0.5 en Ensayo de Micromuestra CS-38 (pH 10; 32°C) S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N043E 1.36 S87N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N043S/S101T 2.49 S87N/G 1 18 V/S 128IJP 129Q/S 130 A/N043 V/S 101 F > 4.0 S87N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N043E/S101R 1.17 S87N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/N043E/S 101 Y > 4.0 S87N/G 1 18V/S 128L P129Q/S 130A/N043E/S 101 E 3.61 S87N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/N043T/N248K > 4.0 S87N/G 1 18 V/S 128L P 129Q/S 130 A/P052 V/S 101 R > 4.0 S87N/G 118 V/S 128L/P1290/S 130A/S 101 NW248K > 4.0 S87N/G 118V/S 128L/P129Q/S 130A/N043 V/S 101 R 1.63 S87N/G 1 18 V/S 128 L P 129Q/S 130 A/N043F/S 101 Y/N248 K > 4.0 S87N/G 1 18V/S 128L/P129Q/S130A/S 101 R/N248K 0.94 S87N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/N043I/S 101 Y > 4.0 S87N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N043T > 4.0 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W 0.54 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/P052V/Y209W 2.14 S87N/G118V/S128L/P129O/S130A/S144V/N185R/Y209W > 4.0 S87 N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/G097S/N 185R/S256I > 4.0 S87N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S 144 V/N 185 V/Y209W > 4.0 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S 144V/N185V 0.63 S87N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052 V/S 144T/N185R Y209W > 4.0 S87N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S 144T/N 185R/Y209 W 1.63 S87N/G 1 18V/S 128L/P129Q/S130A/S 144T/N185R 1.79 S87N/G 1 18V/S 128L/P129Q/S130A/S 144T/Y209W/S256I 3.43 S87N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N043S/N185R/Y209W/S256T 1.35 S87N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/S 144T/N185V/Y209W 1.11 S87N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/G097T/Y209W/S256I > 4.0 S87N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N185R/S256T 0.99 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/S256I > 4.0 S87N/G1 18V/S 128L/P129Q/S130A/S 144T/N185R/S256I > 4.0 S87N/G118V/S 128L/P129Q/S130A/N043S/S256I > 4.0 S87N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S130A/N043 V/N 185 V/Y209W/S256I > 4.0 S87N/G 1 18 V/S 128L P 129Q/S130A/P052 V/Y209W/S256T > 4.0 S87N/G1 18V/S 128L/P129Q/S130A/S164I 0.97 S87N/G1 18V/S 128L/P129Q/S130A/A001 V 104I S 1641 0.99 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001K/V104I/S164F 1.12 S 87N/G 118 V/S 1281 JP 129Q/S 130A AO01 K S 164F 1.67 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164Q 0.95 S87N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A A001 K/S 1641 1.74 S87N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/L126F/S 1641 1.01 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I072V/S 164F 3.75 S87N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/V 104I/L 126F/S 164F 0.76 S87N/G 1 18 V/S 128L P 129Q/S 1 0A V 104I/S 164Q 0.87 S87N/G 1 18 V/S 128L P 129Q/S 130A/ AOO 1 K V 104I/L 126F/S 164Q 1.91 S87N/G118V/S128L P129Q/S130A/V104I/L126F/S164I 0.65 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S 164I 0.75 S87N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 13OA/AO01 K/I072 V/V 104I L 126F/S 164F 1.25 S87N/G 118V/S 128L P 129Q/S 130A/L126F 0.76 Tabla 7-7 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que PI Tienen un PI > 0.5 en Ensayo de Micromuestra CS-38 (pH 10; 32°C) S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I 0.87 S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001K/V104I/L126F/S164F 0.83 Evaluación de Estabilidad LAS/EDTA por Variantes de Colección de Mutación Múltiple (MML ) de GCI-P036 Se probaron variantes de GCI-P036 por su estabilidad después de la incubación en una composición que contiene estabilidad LAS y EDTA. Se realizó clonación de la colección combinatoria por Sloning BioTechnology usando la Slonomax Technology. Se realizó la preparación de muestras de proteasa variante como se describe arriba. Brevemente, las variantes MML estuvieron en un ensayo de estabilidad LAS/EDTA usando los métodos del Ejemplo 1. Como se describe totalmente, se cuantificó la funcionalidad de variantes de proteasa como un índice de desempeño (PI) , que es la relación de desempeño de una variante a aquella de una proteasa de referencia. Las sustituciones se enlistan con relación a la proteasa de referencia GCI-P036 usando numeración BPN' y el PI se determina en relación a la referencia GCI-P036. Los resultados se muestran en la Tabla 7-8.

Tabla 7-8. Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que Tienen un PI PI > 0.5 para Estabilidad LAS/EDTA G097P/N185Q/A215I 1.51 NOl 8Q/N185Q/Y209W/S256W 1.08 N018K/G097P/N185K/S256W 0.54 N185K/Y209W/S256W 0.93 N018Q/N185K/Y209W/A215V/S256W 1.23 N185Q/A215R/S256W 0.72 N018K/G097P/Y209W/A 15V/S256W 0.87 N185K/A215V 1.15 NO 18K/G097P/N 185K/Y209 W/A21 I/S256 W 0.85 G097P Y209W/A215V/S256W 1.55 N018Q/N185K/S256W 0.52 NOl 8K/N185Q/A215 V/S256W 1.34 NOl 8Q/G097P/N185K/Y209W 1.06 N185R/S256W 0.78 N018K/G097P/N185Q/Y209W/A215V/S256W 0.95 N185R/Y209W/A215I 0.96 NOl 8K/N185K/A215 V/S256W 0.68 N018Q/N185R/S256W 0.64 N018K/A215I 1.39 N018Q/N185Q/A215V 1.37 N185R/Y209W/S256W 0.83 N018K/N185Q/Y209W/S256W 0.53 NOl 8Q N185K/Y209W/A215 V 1.12 N018K/A215V 0.77 N018Q/N185Q/S256W 1.14 N018 /N185O/S256W 0.56 Tabla 7-8 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 para Estabilidad LAS/EDTA N043I/S101 Y/Nl 17I/ 248I 0.85 N043V/S101F/N117I 0.68 N043E/S 101 Y/N 117I/N248K 1.09 N043S/S101Y 0.58 N043E/S101E/N248K 1.24 N043V/S101Y 0.86 S101F/N1 17Y/ 248I 1.03 N043S/S101E/N117I/N248I 1.24 N043F/S 101R 0.95 N043V/S101E/N248I 0.80 N043V/N248K 0.61 S 101E/N117I 0.96 N043V/S101Y/ 117I/N248K 0.66 N043S/S101E 1.30 S 101R/N117Y 1.06 N043I/S 101Y/N117Y/N248K 0.73 N043V/S101F 0.72 N043S/S101Y/ 117Y 1.15 S101Y/N1 17I/N248K 0.81 P052V/S144T 0.98 P052V/M119F/S144T/N185R/S256T 0.61 S 144Y/Y209W/S256I 0.89 P052I/S 144 Y/Y209W/S256I 0.83 S 144T/N185V 0.94 S 144V/N185R/Y209W/S256T 0.60 M119F/Y209W 0.94 M119F/N185V/Y209W 0.96 M119F/N185R 0.71 S144V/Y209W 0.90 P052I/N185V/Y209W 0.95 P052I/M119F/S144Y/N185R/Y209W/S256I 0.52 S 144V/N185R/Y209W 0.51 P052V/S144W/Y209W 0.62 P052V M119F/S144T/Y209W 0.99 P052V/S144T/Y209W/S256I 0.83 P052V/S144Y/Y209W 0.94 P052I/N185R/Y209W/S256I 0.51 P052V/M119F/S144T/N185R/Y209W 0.76 P052V/N185V/Y209W/S256I 0.91 P052I/S144Y/N185V/S256T 0.78 P052I/M1 19F/S144Y/N185R 0.53 S1 4T N185R 0.58 P052I/S144Y/N185V 0.96 P052V/M119F/S144T 1.12 P0521/S 144T/N 185 V/Y209 W/S256T 0.89 119F/Y209W/S256I 0.99 P052 V/S 144 V/N 185 V Y209W 0.84 P052I/M119F 0.99 P052V/S144W/N185VA'209W 0.66 Tabla 7-8 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 para Estabilidad LAS/EDTA N185V/Y209W 0.92 P052I/ 119F/S144V/Y209W 0.88 P052I/S144V/Y209W 0.84 P052I/M 119F/S 144T/N185R/Y209W 0.65 S 144W/N185 V/Y209W/S256I 0.61 M119F/S144T/ 185V/S256I 0.85 P052I/M119F/Y209W/S256I 0.89 P052I/N185V/Y209W/S256I 0.81 P052V M1 19F/S144T/S256T 0.94 P052V M119F/N185V/Y209W/S256I 0.87 P052I/S144T 0.93 S 144T/N185R/Y209W/S256T 0.56 S 144V/S256I 0.66 P052I/S144T/S256I 0.80 P052V/S144T/N185V/Y209W/S256T 0.90 P052V/M119F/S144V/N185V/S256I 0.87 P052V/S144Y/S256T 0.78 P052I/S 144T/Y209W/S256I 0.83 P052V/S256T 0.83 P052V/S144V Y209W/S256I 0.74 P052V/S144T/N185V/Y209W/S256I 0.78 A001K/R045K/I072V/L126F/S164Q 0.74 A001K/L126F/S 164Q 0.78 A001 K/R045F/V 104I/L 126F/S 164Q 0.96 A001K/I072V/V104I 0.66 AOO 1 K/R045K/I072V/S 164F 0.99 A001K/L126F 0.72 A001 K/R045F I072V/V104G/S164T 0.76 R045K/I072C/V104I/L126F/S 164F 0.79 R045L/I072S/S164I 0.93 L126A/S 164N 1.08 A001K/L126F/S164F 1.18 R045K/L126F/S 164F 1.20 AOOl K/R045K/I072V/V104I/L126F/S 164F 1.09 AOO 1 K/I072C/V 104I/L126F/S 1640 0.64 A001K/I072V/V104I S164F 0.90 AOO 1 K/V 104I/L126F/S 1641 1.12 AOO 1 K/R045F/L 126F/S 1641 1.08 A001K/R045 /L126F/S164I 1.22 A001L I072C 1.07 A001K/R045K/I072V/S164Q 0.76 A001K/I072C/L126F/S164Q 0.60 A001K/V104E 0.63 A001K/I072C/L126F 0.68 L126F/S164V 1.16 R045 F I072 V/Ll 26F/S 164Q 1.09 AOO 1 K/R045 S V 104C/L126 Y/S 164F 0.88 A001K/R045F/I072V/L126F/S 164I 1.24 A001K/V104I/L126F/S 164Q 0.71 Tabla 7-8 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 para Estabilidad LAS/EDTA S024W/S099Q/S103P/S132N 1.02 S024W/S099Q/S103P 1.12 S024H/S132N 0.96 S024W/S099T/G118R 0.96 S024H/S099Q/S103N/G118T/S132H 1.21 S099Q/S103P/S132H 1.01 S024W/S099T/S 103P/G 118T 0.87 S024H/S099T/G1 18R 0.86 S024W/S099O/S 103P/G 118T/S 132N 0.88 S024H/S099T/S 103P/G 118R 0.97 S087N/G118V/S128L/P129Q/S 130 A/S024R/Q 109K 0.80 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A S024W/Q 109 V 1.06 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130AyS024W/Q109T 0.95 S087N/G118V/S12817P129O/S130A/S024W/O109L 0.61 S087N/G118V/S128LVP129Q/S130A/S024H/Q109V 0.97 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024R 0.84 S087N/G 118 V/S 12817P 129Q/S 130 A/S024H 1.04 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024R/Q 109L 0.86 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Q109T 1.05 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024R/Q109V 0.91 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/Q109I 1.04 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Q 109V 1.03 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W 1.01 S087N/G 118 V/Sl 28UP129Q/S 130A/G 127T 0.90 S087N/G 118 V/Sl 28IJP 129Q/S 130A/Q 1091 1.10 S087N/G 118 V/Sl 28L P 129Q/S 130A/S024T 0.98 S087N/G118V/S128IJP129Q/S130A/S024N/Q109K 1.11 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/R045S 0.50 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001N/R045N I107T 0.72 S087N/G118V/S128IJP129O/S130A/AmiS/S024l7R045Lyil07W/A172F 0.60 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S024R/I 107T/A 172Q 0.67 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/AOO 1 K/S024 W R045N/I 107T 0.60 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A S024N/I107 V 0.92 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S024H/I107V/A 172S 0.99 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/A001 K S024H/A 172Q 0.58 S087N/G118V/S12817P129Q/S130A/S024T/I107T/A172Q 0.82 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/AOO 1 K/Il 07T 0.57 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/I107T 0.92 S087N/G 1 18 V/S 128IJP 129Q/S 130 A7S024T/R045N/1107 V/A 172S 0.98 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/AOO 1C/S024E/1107G 0.95 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /I107N 0.89 S087N/G 118 V/Sl 28L 129Q/S 130A/S024H/R045N/I107T 0.94 S087N/G118V/S12817P129Q/S130A R045N/I107V/A172P 1.08 S087N/G 118 V/Sl 28L/P 129Q/S 130A/R045 F/Il 07T/A 172Q 0.89 S087N/G118V/S128UP129Q/S130A/A001K/R045F 0.56 S087N/G118V/S12817P129Q/S130A S024R/I107 V/Al 72S 0.85 S087N/G118V/S128L7P129O/S130A/S024R/R045F/I107T 0.77 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/S024T 0.99 S087N/G 118 V/S 128IJP 129Q/S 130 A R045N/A 172Q 1.02 Tabla 7-8 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 para Estabilidad LAS/EDTA S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/S024W/R045F/I107V/A172Q 0.95 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024 W/S099K 0.74 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024W/S099K/S 103P 0.68 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S099T/S 103N/S 132H 0.62 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S099Q/S 103N 0.93 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S099Q 0.98 S087N/G 118 V/S 128LVP129Q/S 130A/S024W 1.01 S087N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130 A/S024W/S099T/S 103N/S 132N 0.89 S087N/G 118 V/S 128L/P129G7S 130 A/S024 W/S099T/S 132N 1.01 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130 A/S024 W/S099T 0.97 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A S024H/S099T/S 103P/S 132H 1.14 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A S024 W/S099T/S 103 N 0.91 S087N/G 1 18 V/S 128L P129Q/S 130A S 103N/S 132H 1.02 S087N/G 1 18V/S 128L/P129Q7S 130A S024W/S099T/G 127R/S 132H 1.14 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S099K S 103N 0.72 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A S024H/S099Q/S 132N 1.00 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024 W/S099Q/S 103P 0.87 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S024H/S099Q 1.04 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S103P 1.01 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/S099K S 132H 0.97 S087N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130 A/S024H/S099Q/S 103P 0.52 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S024I-I/S 103P/S 132N 1.07 S087N/G 118 V/S 128L/P1290/S 130A/S024H/S099T/S 103P/S 132N 1.15 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S099T/S 132H 1.14 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S024L/S099K/S 103P/S 132N 0.84 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130 A/S099T/S 103N 0.91 S087N/G 118 V/S 128L7P129Q/S 130 A/S099K/S 103P 0.82 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A S024H/S099T/S 132N 1.00 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A S024H/S099T/S 103P 0.94 S087N/G 118 V/S 128L/P1290/S 130A/S099O/S 132H 0.86 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S099T/G 127Q 0.66 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130A/S024W/S099Q/S 132H 1.10 S087N/G 118 V/S 128L 129Q/S 130 A/S024 W/S099T/S 103P/S 132H 1.34 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/S099K 0.82 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q7S 130 A/S099Q/S 103P/S 132H 1.11 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S024 W/S099Q 0.93 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S099T/S 103P 0.61 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A7S024H/S099K/S 103N 0.73 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/S024W/S099Q/S 132N 0.95 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/S099Q/S 103P 0.83 S087N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130 A/S099T/S 103P/S 132H 1.09 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S024W/S099Q/S 103N/G 127R/S 132N 0.92 S087N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A/S024H/S099K/S 103N/S 132N 0.74 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099K/S 132H 0.93 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N 185R/Y209 W 1.23 S087N/G1 18V/S128L P129Q/S130A/N018K/G097P/N185Q/A215I/S256W 0.86 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A N018Q/N185Q/S256W 1.09 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018Q/N185Q/Y209W/S256W 1.1 1 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/Y209W/S256W 1.08 Tabla 7-8 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 para Estabilidad LAS/EDTA S087N/G 1 18 V/Sl 28L/P 129Q/S 130A/N018Q/Y209W/S256W 0.98 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N 185R/Y209 W/A215 V/S256R 0.97 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N185K/A215V/S256W 1.31 S087N/G 118 V/Sl 28L/P129Q/S 130A N018Q/A215R/S256W 0.55 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A A215 V/S256 W 1.37 S087N/G 118 V/Sl 28L/P129Q/S 130A N 185K Y209W/A215 V/S256W 1.26 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N185K/Y209W/A215V 1.26 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130A N018K/N185R/A215 V/S256W 0.59 S087N/G 118 V/Sl 28L P 129Q/S 130A/G097P/N185R/A215I/S256W 1.13 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018K/N185K/Y209W/A215I 0.57 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018Q/A215I/S256W 1.20 S087N/G 118 V/Sl 28L P 129Q/S 130A/G097P/N 185Q/Y209 W/A215 V/S256W 1.16 S087N/G118V/S128IJP129Q/S130A/Y209W/A215I/S256W 1.50 S087N/G 118 V/Sl 28L/P 1290/S 130A/N018K/N185Q/A215 V/S256 W 0.82 S087N/G 1 18 V/S 128L P129Q/S 130A/N 185Q/Y209W/A215R 0.66 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N018Q/G097 P/N 185R 0.71 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N 185R/A215 V/S256 W 1.06 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/A215 V 1.19 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/G097P/ 185 K/A2151 1.28 S087N/G118V/S128L 13129Q/S130A/N018K/Y209W/A215V 0.75 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N018Q/N185K/A215V 1.17 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N 185R/Y209W/S256L 0.93 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A N018O/N185K/S256W 0.82 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/N 185Q/Y209 W/A215 V/S256 W 1.31 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130A/P052I/N248K 0.83 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A N043 W/S 101 F N248K 0.93 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A N043 V/P052I/S 101 Y 0.76 S087N/G 1 18 V/S 128IJP129Q/S 130A/N043 V/S 101 T 0.72 S087N/G 1 18 V/S 128I7P 129Q/S 130 A/N043 V/P052V/S 101 F/N248K 0.63 S087N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052 V 0.96 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043S 1.19 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/N043 V/S 101 Y 0.79 S087N/G118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043S/P052 V/S 101 R 1.08 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043S/P052V/S 101 F 1.10 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/N043F/P052 V/S 101T/N248K 0.85 S087N/G 1 18 V/S 128IJP129Q/S 130A/N043I/S 101 E N248K 0.81 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S 101 E/N248K 1.02 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N248K 0.69 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043W/S 101 E 1.10 S087N/G 1 18 V/S 128LVP129Q/S 130A N043S/S 101 E/N248K 1.00 S087N/G118V/S128L/P129Q/S 130A/P052I/S 101 V/N248K 0.84 S087N/G 1 18 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S 101 F/N248K 0.97 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043 V/S 101 T/N248K 0.73 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A N043V/P052V N248K 0.70 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A N043S/S 101 N/ 2481 1.03 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y 1.02 S087N/GU 8V/S128L/P129O/S130A N043S/P052V/S101Y/N248K 1.00 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A N043I/S 101 N 0.74 S087N/G118V/S128L/P1290/S 130A N043E/P052V/S 101E/N248K 1.23 Tabla 7-8 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 para Estabilidad LAS/EDTA S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043V/P052I 0.73 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/P052I/S 101 F/N248 K 0.97 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/P052 V/S 101 E/ 248I 0.83 S087N/G 118V/S 128I7P129Q/S 130A/N043 W/P052 V/S 101 E/N248 1.05 S087N/G 118 V/S 12817P 129Q/S 130 A/N043E 1.14 S087N/G 118 V/Sl 28L/P 129Q/S 130A/N043S/S 101T 1.20 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043 V/S 101 F 0.75 S087N/G118V/S128L/P129O/S130A/N043V/P052I/S101T/ 248K 0.66 S087N/G 118 V/Sl 28L P 129Q/S 130A/N043V/S 101 Y/ 248I 0.78 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043E/S 101 R 1.26 S087N/G 118V/S128L/P 129Q/S 130A/N043S/P052I/N248K 1.11 S087N/G 118 V/Sl 28L/P 129Q/S 130A/ 043E/S 101 Y 1.41 S087N/G 118 V/Sl 28L P 129Q/S 130A N043E/S 101 E 1.25 S087N/G 118 V/S 128IVP 129Q7S 130A/ 043I/P052yS 101 F N248K 0.63 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N043T/N248K 0.98 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A N043T/P052I/S 101 Y 1.1 1 S087N/G 118 V/S 128b? 129Q/S 130 A/P052 V/S 101 R 0.82 S087N/G 118V/S 128L/P 129Q7S 130A/N043I/P052V/S 101 F/N248K 0.71 S087N/G 118 V/Sl 28L P 129Q/S 130A/N043W/P052 V/S 101 Y/N248K 0.91 S087N/G 118 V/Sl 28L P 129Q/S 130A/P052I S 101 E/N248K 1.08 S087N/G118V/S128I7P129Q/S130A/S101N/N248K 0.89 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130?/?043 V/S 101 E/N248K 0.61 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043 V/S 101 R 0.70 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043 V/P052 V/S 101 F 0.69 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S 101 E 1.03 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043F/S 101 Y/N248K 0.96 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043S/P052 V 1.07 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A N043 W/P052 V/S 101 Y 1.05 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/N043S/P052I 1.13 S087N/G 118V/S128L/P1290/S 130A/N043T/S 101 E/N248I 1.14 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043 V/S 101 E/N248I 0.74 S087N/G 118 V/S 128IJP 129Q/S 130 A/ 043 V/S 101 R/N248I 0.57 S087N/G 118V/S128L P 129Q/S 130A/N248I 1.00 S087N/G 118 V/Sl 28L P 129Q/S 130A/ 043E/P052I/S 101 Y/N248K 0.97 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101R/N248K 0.86 S087N/G118V/S128IJP129Q/S130A/N043S/P052V/N248K 0.96 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130 A/N0431 S 101 Y 0.79 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/N043I/S 101 Y/N248K 0.72 S087N/G 118 V/Sl 28L/P 129Q/S 130A/N043S/P052V/S 101 V/N248K 0.93 S087N/G 118 V/Sl 28L P 1290/S 130A/N043T 0.89 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/N043T/P052V/S 101 Y/ 248K 0.88 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/P052 V/S 144T 0.93 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/Y 209 W 1.01 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/G097S/S 144 Y/S256I 0.96 S087N/G 118V/ 128L/P 129Q/S 130A/N043S/N 185 V/S256T 1.10 S087N/G 118V/S 128LVP 129Q/S 130 A/P052V/Y209W 0.99 S087N/G 1 18V/S128L P 129Q/S 130 A/G097S/S 144 V/Y209W/S256I 0.85 S087N/G 118V/S128L/P 129Q/S 130A/S 144V/N185 V/S256I 0.91 S087N/G 118V/S128L P129Q/S 130A/G097T/S 144W Y209W/S256I 0.77 Tabla 7-8 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 para Estabilidad LAS/EDTA S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A S 144T/N 185 R/Y209W/S256I 0.55 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/G097T/Y209W 0.66 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/N043S/S 144W/N185R/S256P 0.78 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S 144 V/N 185R/Y209W 0.71 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052V/S 144 Y/N 185R Y209W/S256I 0.62 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/S 144V/Y209W/S256T 0.96 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/P052V/G097T/N 185R/Y209W/S256T 0.70 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043S/S 144W/N 185 V/S256T 0.93 S087N/G 118 V/S 128L/P 129G7S 130A/S 144W/Y209W 0.94 S087N/G 118 V/S 128 L/P 129Q/S 130A/S 144 V/N 185 V/Y209 W 1.03 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S 144 V/N 185 V 1.01 S087N/G 118 V/S 128I7P129Q/S 130A/P052V/S 144T/N185R/Y209W 0.76 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S 144Y/N185R 0.68 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043V/S 144W/N185 V 0.70 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R/Y209W 0.73 S087N/G 118 V/S 128L P 1290/S 130A/S 144T/N 185 R 0.68 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S 144T/Y209W/S256I 0.99 S087N/G 118 V/S 128L/P129G7S 130A/N043 V/S 144 Y/N 185 V/Y209W/S256T 0.68 S087N/G 118 V/S 128L7P129Q/S 130A/P052V/S 144 V/N 185R/S256I 0.52 S087N/G 118 V/Sl 28L/P129Q/S 130A/P052V/S 144V/N 185R/Y209W/S256T 0.66 S087N/G 118 V/S 128 L P 129Q/S 130 A/S 144 V/Y209 W/S 2561 0.86 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043V/S 144W/Y209W/S256I 0.59 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/N 185 V/Y209W 0.90 S087N/G118 V/Sl 28L/P129Q/S130A/P052V/S144T/N185R/S256T 0.56 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A S 144T/N185 V/S256I 1.06 S087N/G 1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043S/N 185R/Y209W/S256T 0.93 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185V/Y209W 1.01 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052V/S 144V/N 185R/Y209W 0.66 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S 144V 1.04 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A N043T/S 144 V/Y209W/S256T 0.98 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/S 144 Y/N 185 V/Y209W 1.02 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q7S 130A G097T/Y209W/S256I 1.06 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A N 185R/S256T 0.66 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052V/S 144 V/N 185 V/Y209W/S256I 0.86 S087N/G 118 V/Sl 28L/P129Q/S 130A/P052V/S 144T Y209W/S256T 0.93 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S 144T/S2561 0.99 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/S 144T/N185R S256I 0.52 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043S/S256I 1.11 S087N/G 1 18 V/Sl 28L/P129Q/S 130A/S 144Y/N 185R/Y209W/S256T 0.65 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q7S 130A N043 V/P052V/S 144W/S256T 0.70 S087N/G1 18V/S128IJP129Q/S130A/N043V/N185V/Y209W/S256I 0.77 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/P052V/S 144 Y/N 185 V/Y209W/S256I 0.91 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A G097T/S 144T/S256I 0.91 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A P052 V/S 144 V/Y209W 0.85 S087N/G 118 V/S 128I./P129Q/S 130A G097T/S 144T/N185R/Y209W/S256I 0.65 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043S/S 144 W 1.09 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/N043 V/S 144T/N 185 V/S256I 0.63 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/P052V/S 144Y/N 185 V 0.94 S087N/G 118 V/Sl 28L/P129Q/S 130A/P052V/Y209W/S256T 0.88 Tabla 7-8 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que PI Tienen un PI > 0.5 para Estabilidad LAS/EDTA S087N/G 118V/S 128L/P 129Q/S 130A/A001 K/I072C/V 104I/S 1641 0.60 S087N/G 118 V/S 128 LP 129Q/S 130A/S 1641 1.04 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/AOO 1 K/V 104I/S 1641 0.64 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/R045K/I072C/L126F 0.84 S087N/G118V/S128IÍP129Q/S130A/A0O1K/V104I/S164F 0.75 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I072C/S164I 0.83 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/A001 K/S 164F 0.72 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S 164Q 0.92 S087N/G 118V/S 128LP 129Q/S 130A/I072C/L126F 0.83 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/A001 K/I072 V/S 164Q 0.65 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/A001 K/S 1641 0.74 S087N/G 118 V/S 128LP 129Q/S 130A/I072C/S 164Q 0.89 S087N/G 118 V/S 128 L/P 129Q/S 130 A/AOO 1 K/L 126F/S 164F 0.92 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130AA001 K/I072C/S 1641 0.52 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/L126F/S164I 0.91 S087N/G118V/S128LP129Q/S130A/AM1K/I072V/S164I 0.76 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/1072 V/S 164F 1.08 S087N/G 118 V/S 128IJP 129Q/S 130A/I072C/L126F/S 164F 0.84 S087N/G 118 V/S 128IVP 129Q/S 130A/V 104I/L126F/S 164F 1.03 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/V 104I/S 164Q 1.06 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/A001K/V104I/L126F/S164Q 0.74 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S130A/V 104I/L126F/S 1641 0.98 S087N/G 118 V/S 128L7P 1290/S 130A/I072C 0.85 S087N/G 118V/S 128LP 129Q/S 130A/V 104I/S 1641 0.97 S087N/G 118 V/S 128LP 129Q/S 130A/AOO 1 K/I072V/V 104I/L 126F/S 164F 0.71 S087N/G 118 V/S 128LP 129Q/S 130A/AOO 1 K/I072V/S 164F 0.74 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I072P 0.96 S087N/G 118 V/S 128LP 129Q/S 130A/L 126F 1.00 S087N/G 118 V/S 128UP 129Q/S 130 072C/V104I/ 26F/S 1641 0.80 S087N/G 118 V/S 128LP 129Q/S 130 A/V 1041 0.92 S087N/G 118 V/S 128LP 129Q/S 130 A/AOO 1 K/V 104I/L126F/S 164F 0.66 Evaluación de Contenido de Proteína de Cultivos Variantes de Colección de Mutación Múltiple (MML) que Expresan GCI-P036 Se midió la expresión recombinante de variantes de GCI-P036 al evaluar el contenido de proteína de cultivos en el ensayo TCA del Ejemplo 1. Se realizó la clonación de la colección combinatoria por Sloning BioTechnology usando Slonomax Technology. Se realizó la preparación de muestras de proteasa variante como se describe arriba. Brevemente, se probaron variantes MML en un ensayo TCA usando los métodos del Ejemplo 1. Como se describe totalmente, se cuantificó la funcionalidad de variantes de proteasa como un índice de desempeño (PI) , que es la relación de desempeño de una variante a aquella de una proteasa de referencia. Las sustituciones se enlistan con relación a la proteasa de referencia GCI-P036 usando numeración BPN' y el PI se determina en relación a la referencia GCI-P036. Los resultados se muestran en la Tabla 7-9.

Tabla 7-9. Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 que PI Tienen un PI > 0.5 en un Ensayo TCA G097P/N185Q/A215I 1.59 N018R/N185R/S256W 1.08.

N018Q/N185R/A215R 1.16 N018Q/N185Q/Y209W/S256W 1.17 N018K/GO97P/N185K/S256W 1.72 N185K/Y209W/S256W 0.66 N018Q N185K/Y209W/A215V/S256W 1.10 N018R/N185Q/A215V/S256W 1.15 NOl 8R/GO97P/Y209W/S256W 1.48 NO 18R/N 185 R/Y209 W/S 256 W 1.14 N018K/N185R/A215R/S256W 1.01 N185Q/A21 R/S256W 1.06 N018K/A215R 0.98 N018K/G097P/Y209W/A215V/S256W 1.52 N018K/N185R/A215V 1.18 N018K N185K/Y209W/A215R 1.29 N185K/A215V 0.98 N018K/N185K 1.01 N018R/N185R/A215R 1.09 N018K/GO97P/N185K/Y2O9W/A215I/S256W 1.44 G097P/Y2O9W/A215V/S256W 1.63 N018K/N185K/S256W 0.91 N018R Y209W/S256W 1.19 N018Q N185K/S256W 1.12 NOl 8K/N185Q/A215V/S256W 1.00 N018K/S256W 1.19 NOl 8R/Y209W/A215V/S256W 1.04 NOl 8Q/G097P/N185K/Y209W 1.08 NO 18 R/G097P/Y 209W/ A 15 V 1.52 N185R S256W 1.03 NOl 8K/G097P N185Q/Y209W/A215 V/S256W 1.44 N018K/GO97P/N185R/A215R/S256W 2.30 NOl 8K/N185R/A215I/S256W 1.13 N185R/Y209W/A215I 1.18 N018R/N185K/S256W 1.06 NOl 8K/G097P N185R S256W 1.70 NOl 8K/N185Q/A215R S256W 1.15 N018K/N185K/A215V/S256W 1.16 N018Q/N185R/S256W 1.06 N018K/A215I 0.57 N018Q/N185Q/A215V 1.07 NOl 8R/N185Q/Y209W/S256W 1.13 N185R Y209W/S256W 0.95 NOl 8K/N185QAr209W/S256W 1.19 N018Q N185K/Y209W/A215V 1.10 N018K/A215V 0.91 N018Q/N185Q/S256W 1.16 N018K/N185Q/S256W 0.68 N018R^185K/A215V/S256W 1.14 Tabla 7-9 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 en un Ensayo TCA S101R/N117I/N248K 0.83 N043E/S101 Y l 17I/N248K 0.66 N043E/S101E/N248K 0.90 N043V/S101Y 0.83 S101F/N117Y N248I 0.77 N043F/S101R 0.79 N043V/S101E/N248I 0.92 N043V/N248K 0.89 S101E/ 1 17I 0.64 N043V/S 101 Y/Nl 171/N248K 0.77 N043S/S101E 0.89 S101R/ 117Y 0.50 N043I/S101 Y/Nl 17Y/N248K 0.99 N043V/S101F 0.85 N043S/S101Y/N117Y 0.76 S101Y/N117I/N248K 0.96 P052I/S 144 Y/Nl 85 R/Y209W 0.91 P052V/S144T 0.70 S144Y/Y209W/S256I 0.82 P052I/S I44Y/Y209W/S256I 0.71 S 144T/N185V 0.96 S 144V/N185R/Y209W/S256T 0.90 M119F/Y209W 1.39 M119F/N185V/Y209W 0.95 M119F/N185R 1.33 S144V/Y209W 0.87 P052I/S 144T/ 185R/Y209W/S256T 0.65 P052I/N185V/Y209W 0.78 P052V/S144V N185R/Y209W/S256T 0.74 S144W/S256I 0.73 S144V/N185R/Y209W 0.97 P052V/S144W/Y209W 0.64 P052V/M1 19F/S144T/Y209W 0.64 P052V/S 144T Y209W/S256I 0.71 P052V/S144Y/Y209W 0.75 P052I/S 144T/Y209W/S256T 0.57 P052I N185R/Y209W/S256I 0.79 P052V/M119F/S144T/N185R/Y209W 0.64 P052V N185V/Y209W/S256I 0.67 P052I/S144Y/N185V/S256T 0.60 S144V/N185R/S256I 0.93 S144T/N185R 0.98 P052I/S144Y/N185V 0.62 P052I/S144Y/S256T 0.51 P052V/M119F/S144T 0.54 M119F/N185R/Y209W/S256T 1.09 P052I/S 144T/N185 V Y209W/S256T 0.70 M119F/Y209W/S256I 0.90 S 144 W N 185R/Y209W/S256T 0.83 Tabla 7-9 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 en un Ensayo TCA P052V/S 144V/N185 V/Y209W 0.81 P052I/M119F 0.74 M 119F/S 144W/N185 R/S 256L 0.75 P052V/S 144W/N185V/Y209W 0.75 N185V/Y209W 1.03 P052I/S144V/Y209W 0.81 S 144W/N 185 V/ Y209 W/S256I 0.80 MI 19F/S 144T/N 185V/S256I 0.93 P052I N185 V/Y209W/S256I 0.69 S144T7N185R/Y209W/S256I 0.89 P052V/M1 19F N185V/Y209W/S256I 0.56 P052I/S144T 0.70 S144T/ 185R/Y209W/S256T 1.06 S144V/S256[ 0.74 P052I S144T/S256I 0.69 P052 V/S 144T/N185 V/Y209W/S256T 0.73 P052V/S144Y/S256T 0.62 P052I/S144T/Y209W/S256I 1.19 P052V/S256T 0.68 P052V/S 144V/Y209W/S256I 0.66 P052 V/S 144T/N 185 V/ Y209W/S256I 0.62 A001 K/R045K I072V L126F/S 164Q 1.38 A0O1K/L126F/S164Q 1.03 A001 K/R045F/V 104I/L126F/S 164Q 1.58 A001K/I072V/V104I 1.13 AOO 1 K/R045K/I072V/S 164F 1.18 A0O1K/L126F 0.76 AOO 1 IOR045F I072V/V 104G/S 164T 1.25 R045L I072S/S164I 1.03 L126A/S164N 0.99 A001K/L126F/S164F 1.42 R045K/L126F/S164F 1.66 A001 K/R045K/I072V/V104I L126F/S 164F 1.71 AOO 1 K/I072C/V 104I/L 126F/S 164Q 1.53 A001 K/I072V/V104I/S 164F 1.25 AOO 1 K/V 104I/L126F/S 1641 1.56 A001K/R045K/L126F 0.73 AOO 1 K/R045F/L126F/S 1641 1.84 A001K/R045K/L126F/S164I 1.10 A001L/I072C 1.55 A001K/R045K/I072V/S164Q 1.39 AOO 1 K/I072C L126F/S 1 4Q 1.53 A001K R045F/S164F 0.60 A001K/V104E 1.25 A001K/I072C/L126F 1.05 L126F/S164V 1.32 R045F/I072V L126F/S 164Q 0.59 A001K/R045S/V104C/L126Y/S164F 1.25 AOO 1 K/R045F/I072V/L126F/S 1641 1.87 Tabla 7-9 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 en un Ensayo TCA A001 R/S024T/R045N/1107T/A 172Q 1.60 A001Q/R045K/I107T 1.73 S024N/R045K/I107V/A172N 1.42 A001 R/S024T7I 107T/A172Q 1.40 A001 K/S024N/R045K A172Y 1.44 S024R/R045F/I107T7A172Q 1.84 A0O1 R/I1O7T/A172Q 1.53 R045N/I107V/A172Q 0.89 A0O1R I107V/A172Q 0.76 A0O1 K/R045F/I107L A172N 1.21 A0O1P/A172V 1.18 S024H/I107K 1.54 A001L/S024D/R045Y/I107Y 1.01 A001 M R045S/1107E/A172D 1.33 S024I T107R/G127I/A 172R 1.06 AOO 1 K/S 024T/1107T/G 127Q/A172Q 1.34 AOO 1 R/S024R/R045F/1107T/G127 R 1.15 A0O1C/SO24V I107L 0.96 AOO 1 K S024H/R045N 1107T 1.47 A001K I107V/G127Q 1.80 AOO 1 K/S024R/R045N 1107T/G127R 1.12 AOO 1 R/S024T/R045K/A 172Q 1.46 A001R/A172G 1.72 A001R R045N/A172K 1.32 A001L/R045Q/G127H/A172R 1.23 A0O1K/I107V/G 127R A172Q 1.01 A0O1K/RO45F I107T 1.51 A001K/S024T/R045N/G127Q/A172Q 1.69 A0O1K/RO45K/I1O7A/A172T 1.03 AOO 1 R/Il 07T/G 127Q/A 1720 1.75 A001K/R045K/I107R/G127A/A172N 1.56 AOO 1 R S024W R045F/1107V/G127Q 1.11 R045N/I107A/A172R 1.07 AOO 1 R/R045N/1107T/G 1270 1.69 I107P/A172S 1.08 AOO 1 R/S024W/I107V/A 172S 1.03 A001K S024H/I107T/G127Q 1.45 A001R S024H/R045K I107T/A172O 1.60 A001R/R045N/A172Q 1.42 A001K/R045F/I107V/G127Q 1.94 AOO 1 K/S 024N/1107 V/G 127T 2.01 A001 R/S024W/R045F/I107V/G127R 0.73 S024T/R045K/I107T/G127R/A 172Q 0.75 A0O1K/RO45N/I1O7T/G127Q 1.65 AOO 1 K/S024W/1107 V/Gl 27T/A172Q 1.45 AOO 1 K/l 107 V/Gl 27Q/A 172Q 1.68 A001 R/R045N/I107V/G 127R 1.53 A001K S024H/I107T/G127R 1.35 A001R I107T 1.65 Tabla 7-9 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 en un Ensayo TCA S087N/G 118 V/S 128IVP 129Q/S 130A/S024 W/S099T 0.69 S087N/G118V/S128I P129Q/S130A/S024W/S099T/S103N 1.00 S087N/G1 18 V/S 128L/P129Q/S 130A/S099K/S 103N 1.06 S087N/G 1 18V/S128L/P129Q/S 130A/S024H/S099Q 1.09 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/G127T 0.83 S087N/G 118 V/S 128UP129Q/S 130A/S099K 1.20 S087N/G 118 V/S 128 P129Q/S 130A/S024 W/S099Q 1.02 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130A/S024H S099K S 103N 1.09 S087N/G 118 V/S 128IVP 129Q/S 130A/N018K/N 185K 1.26 S087N/G118V/S 128L P129Q/S 130A/N018R/G097P/N185K/A215R 0.58 S087N/G118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N 185R/Y209W 1.22 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N018R/N185K 0.65 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018K 1.07 S087N/G118 V/S 12817P 129Q/S 130A/N018K G097P/N 185Q/A215I/S256W 0.71 S087N/G118 V/S 128IVP129Q/S 130A/N018Q/N185Q/S256W 1.16 S087N/G118 V/S128UP129Q/S 130A/N018Q/N185Q/Y209W/S256W 1.12 S087N/G118V/S128I7P129Q/S130A/N018Q/N185R A215R/S256P 0.73 S087N/G118V/S 128 P129Q/S 130A/ 018R N185K/Y209W/A215I/S256W 1.00 S087N/G118V/S128IVP129Q/S130A/Y209W/S256W 1.27 S087N/G118V/S 128IVP129Q/S 130A 018R/S256W 0.69 S087N/G1 18V/S128 P129Q/S130A/N018R Y209W/A215I S256W 0.98 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/N018K/ 185R 1.24 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130 A/NO 18K/ 185K/S256W 1.15 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/NO 18Q/Y209W/S256W 1.07 S087N/G 1 18 V/S 1281VP 129Q/S 130 A/N 185R Y209W/A215 V/S256R 1.23 S087N/G 1 18V/S128L P129Q/S 130 A N 185 /A215 V/S256W 1.10 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130 A/NO 18K Y209W 1.24 S087N/G118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/NO 18K/N 185Q/S256W 1.16 S087N/G118 V/S 128L/P 129Q/S 130A N018R/Y209W/S256W 1.09 S087N/G118 V/Sl 2817P129Q/S 130A/N018 A215R/S256W 1.13 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N018 G097P/N185R A215R 0.74 S087N/G118V/S128L/P129Q/S 130A/N018R/N185R Y209W/S256W 0.64 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N018Q/A215R S256W 1.1 1 S087N/G118V/S128IVP129Q/S13OA/NO18K/GO97P/N185R/Y2O9W 0.91 S087N/G118 V/S 128L/P129Q/S 130A/A215V/S256W 0.98 S087N/G118V/S 128I P129Q/S 130A/N185 /Y209W/A215 V/S256W 1.27 S087N/G1 18V/S128IVP129Q/S 130A/N018R/N185R/A215R 1.07 S087N/G118V/S 128I./P129Q/S 130A/N185K/Y209W/A215 V 1.32 S087N/G 118 V/S 128I7P129Q/S 130A/N018K/ 185R A215 V/S256W 1.10 S087N/G118V/S128IVP129Q/S130A/NO18R/N185K/A215V/S256W 0.60 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/G097P/N185R/A215I/S256W 0.70 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130 A N018R 1.22 S087N/G 118 V/S 128U 129Q/S 130 A/NO 18K/N 185K/Y209W/A2151 0.74 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130 A/NO 18Q/A215I/S256W 0.92 S087N/G118V/S128L P129Q/S130A/N018K/N185Q 1.21 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130 A/NO 18K N 185R/A215I/S256W 1.06 S087N/G1 18 V/S 128L P129Q/S 130A/G097P/N185Q/Y209W/A215 V/S256W 1.41 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130 A/NO 18K/N 185Q/A215R 1.12 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/Y209W/A215I/S256W 0.90 Tabla 7-9 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 en un Ensayo TCA S087N/G118V/S128 P129Q/S130A/N018K/N185Q/A215V/S256W 1.1 1 S087N/G118 V/S 128IVP129Q/S 130A/N 185Q/Y209W/A215 R 1.32 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130 A/NO 18Q/G097P N 185R 0.72 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/Nl 85R A215 V/S256W 1.16 S087N/G118 V/S 128L P129Q/S 130 A/NO 18R/N185K/ Y209W 1.27 S087N/G118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/A215 V 0.79 S087N/G118V/S128UP129Q/S130A/N018R/N185Q/A215I/S256W 0.74 S087N/G118 V/S128L/P129Q/S 130A/G097P/N185K/A2151 0.81 S087N/G118V/S128 P129Q/S130A/N018Q/N185K A215R 1.07 S087N/G118V/S128L P129Q/S130A/N018K/Y209W/A215V 1.09 S087N/G1 18V/S128L7P129Q/S130A/N018K/N185K/Y209W 1.36 S087N/G118V/S 128IVP129Q/S130A/N018R/G097P/N185K/Y209W/A215I S2S6W 0.73 S087N/G 118 V/S 128UP129Q/S 130 A/NO 18Q/N 185K/A215 V 1.44 S087N/G 118 V/S 128L P129Q/S 130A/N 185R Y209W/S256L 1.31 S087N/G118 V/S 128IV 129Q/S 130 A/NO 18 /S256W 1.13 S087N/G118V/S128UP129Q/S130A N018Q/N185K/S256W 1.37 S087N/G118 V/S 128I P 129Q/S 130A/N 185Q/Y209W/A215 V/S256W 1.28 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A P052I N248K 0.63 S087N/G 118 V/Sl 28IVP129Q/S 130A/N043W/S 101 F/N248K 0.51 S087N/G 1 18 V/S 128L P 129Q/S 130A/N043V/S 10 IT 1.05 S087N/G118 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052V 0.84 S087N/G1 18V/S128L/P129Q/S130A/N043S 0.52 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130A/N043V/S 101 Y 0.87 S087N/G118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043S/P052 V/S 101 R 0.70 S087N/G 118 V/Sl 28L/P129Q/S 130A/N043F/P052V/S 101T/N248K 0.51 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043I/S 101E/N248K 0.68 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S 101 E N248K 0.90 S087N/G118 V/Sl 28L P129Q/S 130A/N248K 0.93 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/N043W/S 101 E 0.88 S087N/G118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043S/S 101 E/N248K 0.66 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052I/S 101 V 248K 0.75 S087N/G1 18V/S128L P129Q/S 130A/S 101 F/N248K 0.80 S087N/G118V/S128L/P129Q/S 130A/N043V/S 101T/N248 0.89 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y 0.89 S087N/G 118 V/S 128IVP129Q/S 130A N043 V/P052I 0.65 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/N043E 0.98 S087N/G118 V/S 128UP129Q/S 130A/N043S/S 101 T 0.97 S087N/G118 V/S 128UP129Q/S 130 A/N043V/S 101 F 0.79 S087N/G118 V/Sl 28L/P129Q/S 130A/N043E/S 101 R 1.31 S087N/G1 18 V/Sl 281V 129Q/S 130A/N043E/S 101 Y 0.73 S087N/G118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043E/S 101 E 0.87 S087N/G118V/S128L/P129Q/S 130A/N043T/N248K 0.79 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130A/P052V/S 101 R 0.89 S087N/G118 V/Sl 28UP129Q/S 130A/P052I/S 101E/N248K 0.52 S087N/G 118 V/S 128 P129Q/S 130A/S 101 N/N248K 0.86 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043V/S 101 E/N248K 0.59 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130A/N043 V/S 101 R 1.17 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/N043F/S 101 Y/N248 0.70 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130A N043S/P052 V 0.57 Tabla 7-9 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 en un Ensayo TCA S087N/G1 18 V/S 1281 P 129Q/S 130A/S 101 R/N248K 1.45 S087N/G 118 V/S 128IVP 129Q/S 130A/N0431/S 101 Y 0.80 S087N/G 118 V/S 128I7P 129Q/S 130A/N043I/S 101 Y/N248K 0.54 S087N/G 118 V/S 128UP 129Q/S 130A/N043S/P052 V/S 101 V/N248K 0.53 S087N/G 118 V/S 128I7P 129Q/S 130A/ 043T 0.83 S087N/G 118 V/S 128I7P 129Q/S 130A/Y209W 1.1 1 S087N/G 118V/S 128L/P129Q/S 130A/N043S/N185V/S256T 0.52 S087N/G 118 V/S 128I P 129Q/S 130A P052 V/Y209W 0.92 S087N/G 118V/S128L P129Q/S 130A/S 144 V/Nl 85R/Y209W 0.74 S087N/G118V/S128L P129Q/S130A/S 144V/Y209W/S256T 0.59 S087N/G118V/S128IVP129Q/S 130A/P052V/G097T/N185R Y209W/S256T 0.51 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/G097S/N185R S256I 0.75 S087N/G 118 V/S 128IVP 129Q/S 130A/S 144 V/Nl 85 V/Y209W 0.71 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/S 144 V/N 185 V 0.72 S087N/G 118V/S128L P129Q/S 130A/P052 V/S 144T/N 185R/Y209W 0.70 S087N/G 118 V/S 128IVP 129Q/S 130A S 144I7N 185R/Y209W 0.93 S087N/G118 V/Sl 28IVP129Q/S 130A/S 144T/N 185R 0.91 S087N/G 118 V/S 128UP 129Q/S 130A/S 144T/Y209W/S256I 0.77 S087N/G 118 V/S 128L/P129Q/S 130A/P052 V/S 144T/N185R/S256T 0.54 S087N/G118V/S128L P129Q/S130A/S144T/N185V/S256I 0.64 S087N/G118 V/S 128L P129Q/S 130A/N043S/N185R/Y209W/S256T 1.05 S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S 144T/N185V/Y209W 1.04 S087N/G 1 18V/S128L P 129Q/S 130A/S 144 V 0.66 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A N043T/S 144V/Y209W/S256T 0.51 S087N/G 118V/S128L P129Q/S 130A/S 144Y/N185 V/Y209W 0.50 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A G097T/Y209W/S256I 0.68 S087N/G118 V/Sl 28L P 129Q/S 130A/N185R/S256T 1.26 S087N/G 118 V/S 128LVP129Q/S 130A/P052 V/S 144T/Y209W/S256T 0.55 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S 144T/S256I 0.65 S087N/G 118V/S128I7P129Q/S 130A/S 144T/N185R/S256I 0.74 S087N/G118 V/Sl 28L/P129Q/S 130A/N043S/S256I 0.75 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A 043V/N 185 V Y209W/S256I 0.76 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130A/GO97T/S 1 4T N 185R/Y209W/S256I 0.53 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130A/ 043V/S 144T/N185V/S256I 0.55 S087N/G118 V/S 128L P 129Q/S 130A/P052V/Y209W/S256T 0.79 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/S 1641 1.19 S087N/G 118 V/S 128I P 129Q/S 130A/A001 K V 104I S 1641 1.19 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/A001 K/V 104I/S 164F 1.15 S087N/G 118V/S128L/P129Q/S 130A/A001 /S 164F 0.98 S087N/G 118 V/S 128L/P 1 9Q/S 130A/S 164Q 1.24 S087N/G118 V/S 128L/P 129Q/S 130A A001K/S 1641 0.95 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A L 126F/S 1641 1.10 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A I072 V/S 164F 0.82 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/V104I L126F/S164F 1.02 S087N/G118 V/S 128L/P 129Q/S 130A V104I S 164Q 0.84 S087N/G118 V/Sl 28 P129Q/S 130A/A001 K/V 1041/1,126F/S 164Q 1.00 S087N/G118 V/Sl 28UP129Q/S 130A/V104I/L126F/S1641 1.00 S087N/G 118 V/S 128L/P 129Q/S 130A/V 104I/S 1641 1.36 S087N/G 118 V/S 128L P 129Q/S 130A/A001K/I072V/V 104I/L126F/S 164F 1.02 Tabla 7-9 (cont). Variantes de Mutación Múltiples de GCI-P036 PI que Tienen un PI > 0.5 en un Ensayo TCA S087N/G118V/S128L P129Q/S130A/A001K/I072V/S164F 0.59 S087N/G118 V/S 128IVP 129Q/S 130 A L 126F 1.31 S087N/G118 V/S 128L P 129Q/S 130 A/V 1041 1.38 S087N/G118V/S128iyP129Q/S130A/A001K/V104I/L126F/S164F 1.37 EJEMPLO 8 Evaluación de Remoción de mancha por Variantes de Colección de Mutación Múltiple (MML) de GCI-P036 Los resultados de los experimentos se conducen para determinar la actividad de remoción de mancha (ensayo de micromuestra para determinar el desempeño de limpieza en detergentes de lavaplatos automáticos usando muestras CS-38) , estabilidad LAS/EDTA, termoestabilidad, y determinación de proteína por un ensayo TCA (pruebas de propiedades de interés) de variantes de GCI-P036 se muestran en la Tabla 8-1. Se obtuvieron los resultados usando los métodos descritos en el Ejemplo 1, con las siguientes modificaciones para el ensayo de desempeño de remoción de mancha. Los detergentes de prueba se inactivaron con calor (CALGONIT® 5 en 1 y CASCADE® Complete) y el MTP se selló con papel adhesivo y colocó en un incubadora IEMS durante 30 minutos con agitación a temperaturas indicadas.

Para probar el desempeño de remoción de mancha y estabilidad de clones variantes 1-44, se usaron sobrenadantes de cultivo filtrados diluidos. Para clones 100-105, se usaron muestras purificadas en diferentes concentraciones. El promedio de los valores PI para clones 100-105 calculado en dosificaciones de 4ppm y 6 ppm se muestra en la Tabla 8-1. Se usaron para los clones 47-50 y clon 106, concentrado ultra filtrado formulado (UFC) de muestras. Los caldos de cultivo de células Bacillus subtilis que expresan clones 47-50 se centrifugaron a 9000xg durante 30 minutos y el sobrenadante filtrado a través de un filtro Seitz-EKS Depth (Pall) en un embudo Buchner, seguido por filtración de filtro Seitz-EKS Depth estéril bajo presión y almacenado a 4°C. Se concentró el sobrenadante libre de célula resultante con una unidad de filtración PALL UF, usando un filtro con un recorte de 10 kDa . Se formuló el concentrado ultraf iltrado resultante al agregar 51% (WAV) de propilen glicol y 1.2 % (WAV) de formiato de sodio. Se usó ácido fórmico para disminuir el pH hasta 6.0.

Como se describe totalmente, se cuantificó la funcionalidad de variantes GCI-P036 como un índice de desempeño (Pi) , que es la relación de desempeño de una variante a una proteína GCI-P036 precursora. ND indica "no determinado" . 5 10 Ejemplo 9 Evaluación de Remoción de mancha por Variantes de Colección de Mutación Múltiple (MML) en Estudios de Aplicación de Lavandería Los resultados de los experimentos se conducen para determinar la actividad de remoción de mancha (ensayo de micromuestra para determinar el desempeño de limpieza en aplicaciones de lavandería) de variantes de GCI-P036 (clones 8, 47, 49 como se describe en el Ejemplo 8) se muestran en la Tabla 9-1. Los resultados se obtuvieron usando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Los detergentes de prueba usados se inactivaron con calor P&G TIDE® 2X (NA HDL) y P&G TIDE® (NA HDG) . Se probó el desempeño de limpieza de micromues tras teñidas B I usando 0.2ppm de las variantes a 25°C durante 30 minutos con agitación a 1400rpm en un volumen de 200uL. Como se describe totalmente, se cuantificó la funcionalidad de variantes GCI-P036 como un índice de desempeño (Pi) , que es la relación de desempeño de una variante a una proteína GCI-P036 precursora. También se probaron la subtilisina FNA (BPN'-Y217L) y proteínas GCI-P036-S87N-G118V-S128L-P129Q-S130A.

Tabla 9-1. Valores P, de Variantes GCI-P036 Probados para Desempeño de Eliminación de Tinción en Micromuestras BMI en Detergentes NA HDL y NA HDG Variantes basados # de Clon en GCÍ-P036 NA HDL pH 8 NA HDG pH 10 GCI-P036 - 1.00 1.00 N18 /S87N/ G97P/ Q109R/ G118V/S128L/ P129Q/S130A/ 8 N185R/A215R 0.46 0.38 S87R/ N76D/ G118R/S12817 47 P129Q/S130A/ S188D 1.12 1.19 N76D/S87R/ G118R/S128LV P129Q/S130A/ 49 S188D/N248K 0.92 1.06 S87N-G118V- Variante S128L·P129Q- GCI-P036 S130A 1.22 1.14 FNA BPN' Y217L 1.29 0.66 Ejemplo 10 Variantes de Proteasa con Titulaciones de Producción Incrementadas Se seleccionaron mutaciones dentro de la región madura de GCI-P036 basadas en ganancias benéficas en titulación de proteína o desempeño de lavado de micromuestra observado durante la superseparación por exclusión llevada acabo en placas de microt i tulación . Se obtuvieron las muestras de proteasa probadas en los ejemplos previos usando un sistema de expresión de plásmido replicado. Para la expresión de las 45 variantes descritas en este ejemplo, se usó un gen etiquetado GCI-P036ci, que codifica la proteína GCI-P036 de tipo natural. Este gen sintético "ci" consiste de una versión mejorada de codón basada en uso de codón FNA (una proteína expresada para niveles muy altos) . Los ácidos nucleicos que codifican estas variantes se introdujeron en la plantilla de gen GCI-P036ci como se describe a continuación, para generar una serie de plásmidos en la estructura p2JH (p2JH-GCI-P036ci, FIG. 3), un sistema de vector integrado capaz de la producción de proteína a gran escala. Se usó este sistema de expresión Bacillus integrado para evaluar las variantes enlistadas en la Tabla 9-1 usando caldo de cultivo de cultivos de matraz de agitación. Se evaluó de nuevo la expresión de proteína y desempeño de micromuestra. Ya que ciertas variantes exhiben actividad de proteasa disminuida contra el sustrato suc-AAPF-pNA cuando se compara con la de tipo natural, se usó un ensayo de titulación de eglina c para determinar la concentración de proteasa. Los resultados obtenidos para ensayos de eglina c y BMI se muestran en la FIG. 4 y FIG. 5, respectivamente .

Plásmido Integrado Se ensambló el plásmido integrado p2 JH - GCI - P036c i usando un gen sintético mejorado de codón GCI-P036 (GCI-P036ci) , fusionado en el codón ocho de la secuencia de señal AprE, bajo el control del promotor AprE y terminador FNBase (Wells et al. , Nucleic Acids Res, 11: 7911-25, 1983) . En la secuencia GCI-P036ci de p2JH-GCI-P036ci proporcionada a continuación, la fuente en negrita y cursiva indica el promotor AprE, la fuente estándar indica la región de secuencia de señal, la fuente subrayada indica la región de pro secuencia GCI-P036, la fuente en negrita indica ADN que codifica la región de proteasa madura GCI-P036, y la fuente en cursiva subrayada indica el terminador FNBase .

AA TTCTCCA TTTTCTTCTGCTA TCAAAA TAA CA GACTCG TGA TTTTCCAAA CGA GCTTTCAAAA AAGCCTCTGCCCCTTGCAAA TCGGA TGCCTGTCTA TAAAA TTCCCGA TA TTGGTTAAA CAGCG GCGCAA TGGCGGCCGCA TCTGA TGTCTTTGCTTGGCGAA TGTTCA TCTTA TTTCTTCCTCCCTC TCAA TAA TTTTTTCA TTCTA TCCCTTTTCTGTAAAGTTTA TTTTTCA GAA TA CTTTTA TCA TCA TG CTTTGAAAAAA TA TCACGA TAA TA TCCA TTGTTCTCACGGAA GCACACGCAGGTCA TTTGAA CG AATTTTTTCGACAGGAATTTGCCGGGACTCAGGAGCATTTAACCTAAAAAAGCATGACATTTCA GCATAATGAACATTTACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTGTATGAAAATAGTTATTTCGAGTC TCTACGGAAATAGCGAGAGA TGATA TACCTAAA TAGAGA TAAAATCA TCTCAAAAAAA TGGGT CTACTAAAA TA TTA TTCCA TCTATTACAA TAAATTCACAGAA TAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTC TGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCG ?GGGtG???G.G?Gt????G G???G?G?G^ AGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTG CAGTGAGTTTGTAGAACAAGTT GAGGCAAATGACGAGGTAGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTC ATGAATTTGAAACGATTCCTGTTCTGTCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGTTA GAGGTCGATCCAGCTATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACTACAATGGCGCAAT CGGTACCATGGGGAATTAGCAGAGTACAAGCCCCAGCTGCACATAACCGTGGATTGAC AGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTTGATACCGGTAT TCCACTCATCCAGACTTAA AT ATTCGTGGTGGAGCTAGCTTTGTACC AGGGGAA CCATCCACTCA A GATGGCA ATGG ACATGGCACTCATGTTGCCGGCACAATCGCGGCTCTTAACAATTCAATTGGTGTTCTTG GCGTAGCGCCAAGCGCAGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGAGCAAGCGGTTCAGG CTCTGTCAGCTCTATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTT GCTAATCTTAGTTTAGGATCTCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAG CGCGACTTCTAGAGGCGTTCT GTTGTAGCGGCCTCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCA ATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCTATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACA ACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGCCTTGACATTCTCCCACCAGCTCT AAACGTGCAGAGCACTTACCCAGGTTCAACATATGCCAGCTTAAACGGTACATCAATG GCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCGGCTGCACTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGT CCAATGTACAAATCCGCAATCATCTTAAGAATACGGCAACTAGCTTAGGAAGCACAAA CTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAAAAGCTTAACTCGA GAT AAAAAA CCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTT (SEQ ID NO:8).

Características de p2 JH-GCI - P036ci incluyen: CAT = gen de resistencia de cloranf enicol de pC194, origen pMBl = origen de replicación de pBR322, bla = beta- lactamasa de pBR322, promotor aprE = promotor transcripcional , Péptido de Señal = péptido de señal, Pro Péptido = pro región GCI-P036, Péptido Maduro GCI-P036ci = GCI-P036 maduro, Terra FNBase Terminador FNBase. La secuencia de aminoácido del precursor GCI-P036 y proteasa madura GCI-P036 se proporciona arriba como las SEQ ID NOS: 6 y SEQ ID NO: 2, respectivamente.

Generación de Variantes GCI-P036 Adicionales Se llevo a cabo la mutagénesis dirigida al sitio usando usando Kit QuickChange de sitio Múltiple (Stratagene) usando el plásmido p2 JH-GCI-P036ci como una plantilla y conjuntos de cebador específicos del sitio, delantero (F) e inverso (R) con las secuencias mostradas en la Tabla 9-2. Se usó cinco microlitros del producto mutado para transformar células E. coli Top 10 químicamente competentes (Invitrogen) y colocarlas en placa en LA + 50 ppm de carbenicilina para crecimiento bajo selección. Las placas se incubaron durante la noche a 37°C.

Tabla 10-2: Conjuntos de Cebador específícos del Sitio Usados para Crear Mutantes de Región Maduros en p2JH-GCI-P036ci.

Nombre del SEQ ID cebador NO: Secuencia de cebador (5'-3') S126A-F 9 ctaatcttagtttaggagctccttcgccaagtgcc S126A-R 10 ggcacttggcgaaggagctcctaaactaagattag S126C-F 11 cacgttgctaatcttagtttaggatgcccttcgccaagtgc S 126C-R 12 gcacttggcgaagggcatcctaaactaagattagcaacgtg S 126D-F 13 gcacgttgctaatcttagtttaggagatccttcgccaagtg S126D-R 14 cacttggcgaaggatctcctaaactaagattagcaacgtgc S 126E-F 15 catgcacgttgctaatcttagtttaggagaaccttcgccaagtgcc S126E-R 16 ggcacttggcgaaggttctcctaaactaagattagcaacgtgcatg S126F-F 17 cacgttgctaatcttagtttaggattcccttcgccaagtgc S126F-R 18 gcacttggcgaagggaatcctaaactaagattagcaacgtg S126G-F 19 catgcacgttgctaatcttagtttaggaggcccttcgccaagtgcc S 126G-R 20 ggcacttggcgaagggcctcctaaactaagattagcaacgtgcatg S 126H-F 21 catgcacgttgctaatcttagtttaggacacccttcgccaagtgcc S 126H-R 22 ggcacttggcgaagggtgtcctaaactaagattagcaacgtgcatg S 126I-F 23 catgcacgttgctaatcttagtttaggaatcccttcgccaagtgcc S126I-R 24 ggcacttggcgaagggattcctaaactaagattagcaacgtgcatg S126K-F 25 Catgcacgttgctaatcttagtttaggaaaaccttcgccaagtgcc S126K-R 26 Ggcacttggcgaaggttttcctaaactaagattagcaacgtgcatg S126L-F 27 Gcacgttgctaatcttagtttaggacttccttcgccaagtg S126L-R 28 Cacttggcgaaggaagtcctaaactaagattagcaacgtgc S 126M-F 29 Catgcacgttgctaatcttagtttaggaatgccttcgccaagtgcc S 126M-R 30 Ggcacttggcgaaggcattcctaaactaagattagcaacgtgcatg S126N-F 31 Catgcacgttgctaatcttagtttaggaaacccttcgccaagtgcc S 126N-R 32 Ggcacttggcgaagggtttcctaaactaagattagcaacgtgcatg S 126P-F 33 Ctaatcttagtttaggacctccttcgccaagtgcc S 126P-R 34 Ggcacttggcgaaggaggtcctaaactaagattag S 126Q-F 35 Catgcacgttgctaatcttagtttaggacaaccttcgccaagtgcc S 126Q-R 36 Ggcacttggcgaaggttgtcctaaactaagattagcaacgtgcatg S126R-F 37 Catgcacgttgctaatcttagtttaggaagaccttcgccaagtgcc S126R-R 38 Ggcacttggcgaaggtcttcctaaactaagattagcaacgtgcatg S126T-F 39 Cacgttgctaatcttagtttaggaacaccttcgccaagtg S126T-R 40 Cacttggcgaaggtgttcctaaactaagattagcaacgtg S126V-F 41 Gcacgttgctaatcttagtttaggagttccttcgccaagtg S126V-R 42 Cacttggcgaaggaactcctaaactaagattagcaacglgc Tabla 10-2: Conjuntos de Cebador específicos del Sitio Usados para Crear Mutantes de Región Maduros en p2JH-GCI-P036ci.

Nombre del SEQ ID cebador NO: Secuencia de cebador (5'-3') S 126W-F 43 Cacgugctaatcttagtttaggatggccttcgccaagtgc S126W-R 44 Gcacttggcgaaggccatcctaaactaagattagcaacgtg S126Y-F 45 Cacgttgctaatcttagtttaggatacccttcgccaagtgc S126Y-R 46 Gcacttggcgaagggtatcctaaactaagattagcaacgtg S9L-F 47 Gcaatcggtaccatggggaattcttagagtacaagccccagc S9L-R 48 Gctggggcttgtactctaagaattccccatggtaccgattgc S9G-F 49 Aatcggtaccatggggaattggcagagtacaagc S9G-R 50 Gcttgtactctgccaattccccatggtaccgatt A106C-F 51 Caggctctgtcagctctatttgccaaggattggaatggg A106C-R 52 Cccattccaatccttggcaaatagagctgacagagcctg A106I-F 53 Ggaacaatggcatgcacgctgctaatcttagtttagg A106I-R 54 Cctaaactaagattagcagcgtgcatgccattgttcc A106M-F 55 Tcaggctctgtcagctctattatgcaaggattggaatgggcag A106M-R 56 Ctgcccattccaatccttgcataatagagctgacagagcctga V119A-F 57 Caggctctgtcagctctattatccaaggattggaatggg V1 19A-R 58 Cccattccaatccttggataatagagctgacagagcctg L124F-F 59 gcatgcacgttgctaatcttagtttcggatctccttcgc L124F-R 60 Gcgaaggagatccgaaactaagattagcaacgtgcatgc L124N-F 61 Acaatggcatgcacgttgctaatcttagtaacggatctccttcgcca L124N-R 62 Tggcgaaggagatccgttactaagattagcaacgtgcatgccattgt G125S-F 63 Atggcatgcacgttgctaatcttagtttatcttctccttcgccaagt G125S-R 64 Acttggcgaaggagaagataaactaagattagcaacgtgcatgccat N167H-F 65 Cggcccgttatgcgcacgctatggcagtc N167H-R 66 Gactgccatagcgtgcgcataacgggccg V28A-F 67 Gttctggtgtaaaagctgctgtccttgataccggtatttccact V28A-R 68 Caagaccacattttcgacgacaggaactatggccataaaggtga V30A-F 69 Gttctggtgtaaaagttgctgctcttgataccggtatttccact V30A-R 70 Agtggaaataccggtatcaagagcagcaacttttacaccagaac N60S-F 71 Ccatccactcaagatggctctggacatggcactcatgt N60S-R 72 Acatgagtgccatgtccagagccatcttgagtggatgg V91T-F 73 Ccaagcgcagaactatacgctacaaaagtattaggagcaagcggt V91T-R 74 Accgcttgctcctaatacttttgtagcgtatagttctgcgcttgg L94A-F 75 Aagcgcagaactatacgctgttaaagtagctggagcaagcggttca L94A-R 76 Tgaaccgcttgctccagctactttaacagcgtatagltctgcgctt G95P-F 77 Gcgcagaactatacgctgttaaagtattacctgcaagcggttcaggc G95P-R 78 Gcctgaaccgcttgcaggtaatactttaacagcgtatagttctgcgc I105F-F 79 Gttcaggctctgtcagctctttcgcccaaggattggaa I105F-R 80 Ttccaatccttgggcgaaagagctgacagagcctgaac G1 13M-F 81 Tcaggctctgtcagctctattatgcaaggattggaatgggcag G1 13M-R 82 Ctgcccattccaatccttgcataatagagctgacagagcctga S123A-F 83 Catgcacgttgctaatcttgctttaggatctccttcgcca S123A-R 84 Tggcgaaggagatcctaaagcaag S130N-F 85 Tttaggatctccttcgccaaacgccacacttgagcaagc Tabla 10-2: Conjuntos de Cebador específicos del Sitio Usados para Crear Mutantes de Región Maduros en p2JH-GCI-P036ci.

Nombre del SEQ ID cebador NO: Secuencia de cebador (5'-3') S 130N-R 86 Gcttgctcaagtgtggcgtttggcgaaggagatcctaaa " V145I-F 87 Cgcgacttctagaggcatccttgttgtagcggcct V145I-R 88 Aggccgctacaacaaggatgcctctagaagtcgcg F183G-F 89 Acaacaaccgcgccagcggctcacagtatggcgcagg F183G-R 90 Cctgcgccatactgtgagccgctggcgcggttgttgt I192L-F 91 Cgcagggcttgaccttgtcgcaccagg I192L-R 92 Cctggtgcgacaaggtcaagccctgcg T218N-F 93 Aaacggtacatcaatggctaaccctcatgttgcaggtgcg T218N-R 94 Cgcacctgcaacatgagggttagccattgatgtaccgttt A222G-F 95 Gctactcctcatgttggcggtgcggctgcactt A222G-R 96 Aagtgcagccgcaccgccaacatgaggagtagc Se seleccionaron y separaron por exclusión cinco transformantes por mutación para la presencia de inserto usando perlas PCR (GE/Amersham) como por instrucciones del fabricante. Las secuencias de cebadores PCR de inserción fueron como sigue: cebador delantero = ISH-PCR-GCI-P036-5832F 5 ' -acaaataggg gttccgcgca-3 ' (SEQ ID NO: 97); y cebador inverso = ISH-PCR-GCI-P036-1902R 5 ' -cgcaagaattg attggctcc-3' (SEQ ID NO: 98) . Las condiciones de ciclizado fueron como sigue: inicia caliente a 95°C durante 2 min, 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 1 min, se alinea en sus pares base el cebador a 53°C durante 1 min, alargamiento a 72 °C durante 1 min, luego se mantiene a 4°C. Se analizó cinco microlitros de producto PCR por electroforesis en gel de agarosa. Se purificaron y procesaron por secuencia productos PCR del tamaño de fragmento esperado de ~2 Kb. Se expandieron clones con mutaciones verificadas para preparaciones de plásraido usando Kit QiaPrep Spin Miniprep (Qiagen) .

Se procesaron por secuencia de plásmidos purificados y 5 µ? de plásmido se transformó en células B. s btilis competentes (fenotipo: AaprE, AnprE, oppA, AspoIIE, degUHy32, AamyE: : [xylR,pxylA-comK] ) , incubaron durante una hora en agitador a 37°C (250 rpm) , luego se colocaron en placa en LA + 1.6 de Leche Descremada + 5 ppm de cloranfenicol incubaron durante la noche a 37°C. Dos transformantes (por mutación) que muestran halos se seleccionaron y subcultivaron en LA + 1.6 de Leche Descremada + 25 ppm de cloranfenicol para seleccionar la amplificación del gen adicional. Las colonias sencillas, de placas frescas (después de la amplificación) , se seleccionaron y transfirieron en 5 mi de caldo LB + 25 ppm de cloranfenicol e incubaron en agitador a 37°C (250 rpm) durante 6-7 horas para generar un pre- cultivo. Se hicieron soluciones madre congeladas al mezclar 800µ1 de alícuotas de pre-cultivo con 400µ1 de glicerol estéril al 50% (v/v) . Los matraces agitados que contienen 25mL de medio semi -definido (medio basado en urea y harina de soya amortiguada de fosfato, que contiene sales) se inocularon con lmL de pre-cultivo, e incubaron en agitador a 37°C (250 rpm) durante 48 horas. Las muestras se tomaron a 18, 24, 42 y 48 horas para análisis por SDS-PAGE, AAPF, ensayo de inhibición EglinC, y ensayo de desempeño de lavado BMI como se describe en el Ejemplo 1 de arriba.

Análisis de proteína Se realizó el análisis de la expresión de proteína en matraces de agitación por SDS-PAGE, con titulaciones basadas en una curva estándar de GCI-P036 purificado de concentración de proteína conocida. Para SDS-PAGE, se agregó 10 µ?, de HC1 2M a 45µ1 de sobrenadante de cultivo e incubó en hielo durante 10 min. Luego, se agregó 50 L de solución amortiguadora de muestra de glicina 2X a cada muestra y se cargó ??µ?? de cada mezcla de muestra en un gel 10 Bis-Tris y se corrió en solución amortiguadora MES a 200V durante 30 min. El gel se lavó tres veces en agua desionizada, luego se tiñó con tinción SimplyBlue Safe (Invitrogen) durante una hora y destiñó con agua desionizada durante la noche. La expresión de proteína también se vigiló por un ensayo de inhibición de eglina c. En el caso de ciertas mutaciones, se infirió que la mutación lleva a una reducción de actividad de proteasa contra el sustrato sintético suc-AAPF-pNA, cuando una estimación de la cantidad de la variante por SDS PAGE no fue comparable con la actividad de la variante en el sustrato suc-AAPF-pNA. Por esta razón, el enlace de eglina c también se midió para eliminar parcialidad potencial del ensayo AAPF. Se calcularon las actividades específicas relativas de variantes se calcularon al dividir la actividad específica de mutantes por la actividad específica del control de tipo natural. Se obtuvieron titulaciones de proteasa corregidas (normalizadas) al dividir titulaciones de ensayo de actividad AAPF por actividad específica relativa del mutante obtenido por el ensayo de inhibición de eglina C. Las titulaciones de proteína normalizadas para proteasas variantes múltiples se muestran en la FIG. 4.

Se condujo el análisis de desempeño de variante por ensayo de lavado B I como se describe en el Ejemplo 1, excepto que se usó una micromuestra por pozo y se dosificaron las proteasas variantes en 0.5ppm e incubaron a temperatura ambiente. Se usaron las micromuestras EMPA 116 BMI como una fuente de tinción, y se usó detergente en polvo de referencia sin fosfato ECE para probar el desempeño de limpieza bajo condiciones alcalinas. Se hizo la solución amortiguadora en carbonato de sodio 2 mM (Na2C03, PM=105.99 g/mol, anhidro) en pH 10.5. Las concentraciones finales de componentes de solución amortiguadora fueron como sigue: 6 gpg de dureza de agua, 6.16 g/L de detergente en polvo sin fosfato ECE-2, 1.6 g/L de tetrahidrato de perborato de sodio (PB4) , y 0.24 g/L tetraacetil etilen diamina (TAED) . Se realizaron las diluciones de enzima basadas en titulaciones corregidas de análisis de inhibición EglinC en NaCl 10 mM + 0.005 de solución amortiguadora TWEEN®80. Los resultados para el ensayo BMI se muestran en la FIG. 5. Diversas proteasas de variante (G95P, S126M, Q, y R, S9L y A106C con numeración GCI-P036 = G97P, S128M, Q, y R, S9L y A108C con numeración BPN' ) muestran la producción incrementada en cultivos líquidos mientras que mantienen el desempeño de lavado comparable con la proteasa de referencia GCI-P036.

EJEMPLO 11 Generación de Variantes Líderes de Carga de GCI-P036 Este Ejemplo describe la producción de colecciones de carga combinatoria y líderes de carga GCI-P036. Probar las proteasas variantes de la presente invención se hizo en comparación con las proteasas de referencia para determinar un índice de desempeño (PI) para las proteasas variantes.

Líderes de Carga Se seleccionan variantes de proteína múltiple que abarcan un intervalo de propiedades físicas de interés de colecciones existentes o se generan por técnicas de mutagénesis dirigidas al sitio como se conocen en la técnica (Ver por ejemplo, Solicitud de EUA Ser/ Nos., 10/576,331, 11/581,102, y 11/583,334). Este conjunto definido de proteínas de sonda luego se procesa por ensayo en una prueba de interés. Se muestran variantes líderes de carga de proteasa ejemplares en las siguientes Tablas y se procesan por ensayo como se describe en la presente. En estas tablas, el cambio de carga es relativo a la proteasa de referencia, que en este ejemplo es la proteasa de tipo natural.

Generación de Colecciones de Carga Combinatoria GCI-P036 (CCL) El plásmido pAC-GG36ci que contiene el gen mejorado por codón se usó para generar CCL por cepa ADN 2.0. Bacillus subtilis (genotipo: AaprE, AnprE, AspoIIE, amyE: : xylRPxylAcomK-phleo) se usó para transformaciones. Además, se produjeron las colecciones posicionales en cada uno de los cuatro sitios en proteasa GCI-P036 que se muestran en la Tabla 10-2. Se suministraron las variantes como soluciones madre de glicerol en placas de 96 pozos .

Se diseñó el GCI-P036 CCL al identificar cuatro residuos de aminoácido polares no cargados, expuestos a la superficie, bien distribuidos fuer del sitio activo. Estos residuos son Ser-85, Gln-107, Ser-182, y Asn-242 (residuos 87, 109, 188, y 248 en numeración BPN' ) . Se creó una colección combinatoria de 81 miembros (G-l hasta G-81) al hacer todas las combinaciones de tres posibles en cada sitio: tipo natural, arginina, o ácido aspártico.

Tabla 11-2. Variantes GCI-P036 CCL Tabla 11-2 (cont). Variantes GCI-P036 CCL # de Variante S 85 O 107 S 182 N 242 Carga ? G-51 D R D R 0 G-52 D R R - +1 G-53 D R R D 0 G-54 D R R R +2 G-55 R - - - +1 G-56 R - - D 0 G-57 R - - R +2 G-58 R - D - 0 G-59 R - D D -1 G-60 R - D R +1 G-61 R - R - +2 G-62 R - R D +1 G-63 R - R R +3 G-64 R D - - 0 G-65 R D - D -1 G-66 R D - R +1 G-67 R D D - -1 G-68 R D D D -2 G-69 R D D R 0 G-70 R D R - +1 G-71 R D R D 0 G-72 R D R R +2 G-73 R R - - +2 G-74 R R - D +1 G-75 R R - R +3 G-76 R R D - +1 G-77 R R D D 0 G-78 R R D R +2 G-79 R R R - +3 G-80 R R R D +2 G-81 R R R R +4 EJEMPLO 12 Desempeño de Remoción de mancha de Variantes de Carga GCI - P036 En este Ejemplo, se proporcionan los resultados para variantes de GCI-P036 probados en ensayos de micromuestra de sangre, leche, tinta (BMI) y micromuestra de yema de huevo cocido en detergentes que representan varias geografías comercializadas (por ejemplo, H diferido, temperatura, y/o dureza del agua) , en tanto aplicaciones de lavandería y lavaplatos automático (ADW) . Las geografías comercializadas representadas en las Tablas de este ejemplo incluyen NA (Norteamérica), WE (Europa Occidental) , y WE (ADW) , como se describe en la Tabla 1-1. En la Tabla 12-1, los resultados para el disco (esto es, "disco PI") son para ensayos conducidos usando el ensayo de microt i tulación de huevo cocido en CALGONIT® ( Recki 11 - Bencki ser ) , a 40°C 12 gpg, pH 10, como se describe en el Ejemplo 1.

Tabla 12-1 : Evaluación del Desempeño de Eliminación de Tinción de Variantes de carga GCI-P036 Variantes GCI- PI NA PI WE PI Carga pura P036 Lavandería Lavandería Plato GCI-P036 0 1.000 1.000 1.000 G-2 -1 0.950 0.939 1.450 G-3 1 0.578 0.759 1.231 G-4 - 1 1.219 1.539 1.467 G-5 -2 1.261 1.194 1.508 G-6 0 0.936 0.999 1.563 G-7 1 0.568 0.834 0.712 G-8 0 0.043 0.151 -0.033 G-9 2 0.350 0.601 0.708 G-10 -1 1.266 1.089 1.022 G- l l -2 1.280 1.209 0.788 G- 12 0 0.810 1.074 0.977 G-13 -2 1.317 1.411 1.300 G-14 -3 0.080 0.144 -0.007 G- 15 -1 0.917 1.254 1.393 G- 16 0 0.750 1.081 0.742 G- 17 -1 0.815 0.894 0.909 G- 18 1 0.675 0.931 0.867 G-19 1 0.713 0.856 1.310 G-20 0 0.071 0.129 -0.015 G-21 2 0.434 0.834 1.098 G-22 0 0.782 1.014 1.447 G-23 -1 0.964 0.939 1.396 G-24 1 0.466 0.729 1.368 G-25 2 0.322 0.744 0.638 G-26 1 0.517 0.984 0.694 G-27 3 0.303 1.074 0.971 G-28 - 1 1.126 1.141 1.023 G-29 -2 1.126 0.991 1.037 G-30 0 0.945 1.149 1.006 G-31 -2 1.331 1.149 1.412 G-32 -3 1.345 0.999 1.303 G-33 -1 0.950 1.036 1.420 G-34 0 0.671 0.999 0.673 G-35 -1 0.694 1.021 1.026 G-36 1 0.415 0.774 0.704 G-37 -2 1.410 1.554 -0.011 G-38 -3 0.457 0.759 1.081 G-39 -1 0.936 1.186 0.940 G-40 -3 0.043 0.106 -0.006 G-41 -4 1.163 0.496 0.988 G-42 -2 1.359 1.276 1.165 G-43 -1 0.782 1.119 0.740 G-44 -2 0.926 1.051 0.748 G-45 0 0.503 0.961 0.619 Tabla 12-1: Evaluación del Desempeño de Eliminación de Tinción de Variantes de carga GCI-P036 Variantes GCI- PI NA PI WE PI Carga pura P036 Lavandería Lavandería Plato G-46 0 0.759 0.916 1.035 G-47 -1 0.871 1.051 1.057 G-48 1 0.452 0.864 1.060 G-49 -1 0.885 0.909 1.239 G-50 -2 0.912 0.909 1.613 G-51 0 0.638 1.006 1.723 G-52 1 0.396 0.909 0.820 G-53 0 0.568 0.909 0.806 G-54 2 0.345 0.766 0.641 G-55 1 0.689 1.036 1.230 G-56 0 0.675 1.134 0.818 G-57 2 0.452 0.766 0.922 G-58 0 1.024 1.216 1.444 G-59 -1 1.131 1.306 1.473 G-60 1 0.699 0.946 1.520 G-61 2 0.457 0.886 0.680 G-62 1 0.759 1.059 1.169 G-63 3 0.327 0.669 0.687 G-64 0 0.847 1.119 1.001 G-65 -1 0.601 0.879 1.014 G-66 1 1.001 1.261 1.042 G-67 -1 1.196 1.411 1.489 G-68 -2 1.131 1.179 1.163 G-69 0 0.768 0.999 1.488 G-70 1 0.647 1.809 0.229 G-71 0 0.620 1.081 0.631 G-72 2 0.364 0.819 0.634 G-73 2 0.387 0.729 0.997 G-74 1 0.638 0.939 1.105 G-75 3 0.657 0.856 1.081 G-76 1 0.071 0.136 -0.018 G-77 0 0.866 0.969 1.400 G-78 2 0.434 0.789 1.175 G-79 3 0.327 0.789 0.874 G-80 2 0.355 0.781 0.833 G-81 4 0.229 0.466 0.653 EJEMPLO 13 Composiciones de Detergente de Lavandería Líquido En este ejemplo, se proporcionan varias formulaciones para composiciones de detergente de lavandería líquido. Las siguientes composiciones de detergente de lavandería líquido de la presente invención se preparan como se muestra a continuación. En cada una de estas formulaciones, al menos una variante proteasa proporcionada en la presente se incluye en una concentración desde alrededor de 0.0001 hasta alrededor de 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, como se determina por el formulador, basadas en sus necesidades.

Tabla 13-1: Composiciones de Detergente de Lavandería Líquido Compues o Formulaciones I II III IV V Hidróxido de sodio - - 2.5 1.0 1.5 Solución acuosa HCl 1N #1 #1 - - - Propandiol 12.7 14.5 13.1 10 8.0 Etanol 1.8 2.4 4.7 5.4 1.0 DTPA 0.5 0.4 0.3 0.4 0.5 Pectina Liasa - - - 0.005 - Amilasa 0.001 0.002 - - Celulasa - - 0.0002 0.0001 Lipasa 0.1 - 0.1 - 0.1 NprE (opcional) 0.05 0.3 - 0.5 0.2 PMN - - 0.08 - - Proteasa A (opcional) - - - - 0.1 Aldosa Oxidasa - - 0.3 - 0.003 ZnC12 0.1 0.05 0.05 0.05 0.02 Formiato de Ca 0.05 0.07 0.05 0.06 0.07 DETBCHD - - 0.02 0.01 - SRP1 0.5 0.5 - 0.3 0.3 Ácido bórico - - - - 2.4 Sulfonato de xileno de 3.0 sodio Sulfonato de eumeno de 0.3 0.5 sodio DC 3225C 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 2-butil-octanol 0.03 0.04 0.04 0.03 0.03 Abrillantador 1 0.12 0.10 0.18 0.08 0.10 Equilibrio hasta 100% perfume/pigmento y/o agua #1: Agregar solución acusa de HCl 1N para ajustar el pH puro de la fórmula en el intervalo desde alrededor de 3 hasta alrededor de 5.

El pH de los Ejemplos de arriba 13(1) -(II) es alrededor de 5 hasta alrededor de 7, y de 13 (III) -(V) es alrededor de 7.5 hasta alrededor de 8.5.

EJEMPLO 14 Composiciones de detergente líquido para lavado de manos En este Ejemplo, se proporcionan varias formulaciones de detergente líquido para lavado de manos. Las siguientes composiciones de detergente líquido para lavado de manos de la presente invención se proporcionan a continuación. En cada una de estas formulaciones, al menos una variante de proteasa proporcionada en la presente se incluye en una concentración desde alrededor de 0.0001 hasta alrededor de 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, como se determina por el formulador, basadas en sus necesidades.

Tabla 14-1: Composiciones de detergente líquido para lavado de manos Compuesto Formulaciones I II III IV V VI Sulfonato de 20.0 parafina Óxido de alquil 5.0 3.0 7.0 dimetil amina Cl0- i8 Betaína 3.0 - 1.0 3.0 1.0 - Amida de ácido 3.0 1.0 graso poli-OH C12 Amida de ácido 1.5 1.0 graso poli-OH Ci4 CnEg 2.0 - 4.0 - - 20.0 DTPA - - - - 0.2 - Dihidrato de 0.25 0.7 citrato de tri-sodio Diamina 1.0 5.0 7.0 1.0 5.0 7.0 MgCl2 0.25 - - 1.0 - -nprE (opcional) 0.02 0.01 - 0.01 - 0.05 P N - - 0.03 - 0.02 - Proteasa A - 0.01 - - - - (opcional ) Amilasa 0.001 - - 0.002 - -0.001 Aldosa oxidasa 0.03 - 0.02 - 0.05 - Sulfonato eumeno 2.0 1.5 3.0 de sodio El pH de los Ejemplos 14(1) -(VI) es alrededor de 8 hast dedor de 11 EJEMPLO 15 Composiciones de Detergente de Lavaplatos Automático Líquido En este Ejemplo, se proporcionan varias formulaciones de detergente de lavaplatos automático líquido. Las siguientes composiciones de detergente líquido para lavado de manos de la presente invención se proporcionan a continuación. En cada una de estas formulaciones, al menos una variante de proteasa proporcionada en la presente se incluye en una concentración desde alrededor de 0.0001 hasta alrededor de 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, como se determina por el formulador, basadas en sus necesidades .

Tabla 15: Composiciones de Detergente de Lavaplatos Automático Liquido Compuesto Formulaciones I II III IV V STPP 16 16 18 16 16 Sulfato de potasio - 10 8 - 10 1,2 propandiol 6.0 0.5 2.0 6.0 0.5 Ácido bórico - - - 4.0 3.0 Dihidrato CaCl2 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 No iónico 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 nprE (opcional) 0.1 0.03 - 0.03 - PMN - - 0.05 - 0.06 Proteasa B (opcional) - - - 0.01 - Amilasa 0.02 - 0.02 0.02 - Aldosa oxidasa - 0.15 0.02 - 0.01 Galactosa oxidasa - - 0.01 - 0.01 PAAC 0.01 - - 0.01 - DETBCHD - 0.01 - - 0.01 Equilibrio hasta 100% de perfume/pigmento y/o agua EJEMPLO 16 Composiciones de Lavandería Granulares y/o en Comprimidos Este Ejemplo proporciona varias formulaciones para detergentes de lavandería granulares y/o en comprimidos. Las siguientes composiciones de lavandería de la presente invención, que pueden estar en la forma de gránulos o comprimidos, se proporcionan a continuación. En cada una de estas formulaciones, al menos una variante de proteasa proporcionada en la presente se incluye en una concentración desde alrededor de 0.0001 hasta alrededor de 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, como se determina por el formulador, basadas en sus necesidades.

Tabla 16-1: Composiciones de Lavandería Granulares y/o en Comprimido Compuesto Formulaciones I II III IV V Producto base C14- C15AS O TAS 8.0 5.0 3.0 3.0 3.0 LAS 8.0 - 8.0 - 7.0 C12 - C15AE3S 0.5 2.0 1.0 - - C12-C15E5 0 E3 2.0 - 5.0 2.0 2.0 QAS - - - 1.0 1.0 Zeolita A 20.0 18.0 11.0 - 10.0 SKS-6 (agregar seco) - - 9.0 - - MA/AA 2.0 2.0 2.0 - - AA - - - - 4.0 Citrato 3Na 2H20 - 2.0 - - - Ácido cítrico (anhidro) 2.0 - 1.5 2.0 - DTPA 0.2 0.2 - - - EDDS - - 0.5 0.1 - HEDP - - 0.2 0.1 - PB1 3.0 4.8 - - 4.0 Percarbonato - - 3.8 5.2 - NOBS 1.9 - - - - NACA OBS - - 2.0 - - Tabla 16-1: Composiciones de Lavandería Granulares y/o en Comprimido Compuesto Formulaciones I II III IV V TAED 0.5 2.0 2.0 5.0 1.00 BB1 0.06 - 0.34 - 0.14 BB2 - 0.14 - 0.20 - Carbonato Na anhidro 15.0 18.0 - 15.0 15.0 Sulfato 5.0 12.0 5.0 17.0 3.0 Silicato - 1.0 - - 8.0 nprE (opcional) 0.03 - 0.1 0.06 - PMN - 0.05 - - 0.1 Proteasa B (opcional) - 0.01 - - - Proteasa C (opcional) - - - 0.01 - Lipasa - 0.008 - - - Amilasa 0.001 - - - 0.001 Celulasa - 0.0014 - - - Pectina liasa 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 Aldosa oxidasa 0.03 - 0.05 - - PAAC - 0.01 - - 0.05 Equilibrio hasta 100% de Humedacl y/o Menor* * Perfume, pigmento, abrillantados/SRPl/carboximetilcelulosa Na/fotoblanqueador/MgS04/PVPVI/supresor de espuma de jabón/PEG molecular alto/arcilla .

EJEMPLO 17 Detergentes de Lavandería Líquidos Este Ejemplo proporciona varias formulaciones para detergentes de lavandería líquidos. Las siguientes formulaciones de detergente de lavandería líquido de la presente invención se proporcionan a continuación. En cada una de estas formulaciones, al menos una variante proteasa proporcionada en la presente se incluye a una concentración desde alrededor de 0.0001 hasta alrededor de 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, como se determina por el formulador, basadas en sus necesidades.

Tabla 17-1: Detergentes de Lavandería líquidos Compuesto Formulaciones I I II III IV V Borato 0.6 0.6 1.5 - - - Hidró ido de NA 6.0 6.0 2.0 3.5 4.0 3.0 Etanol 2.0 2.0 1.0 4.0 4.0 3.0 1,2 propandiol 3.0 3.0 2.0 8.0 8.0 5.0 Monoetanolamina 3.0 3.0 1.5 1.0 2.5 1.0 TEPAE 2.0 2.0 - 1.0 1.0 1.0 nprE (opcional) 0.03 0.05 - 0.03 - 0.02 PMN - - 0.01 - 0.08 - Proteasa A 0.01 (opcional ) Lipasa - - - 0.02 - - Amilasa - - - - 0.02 - Celulasa - - - - - 0.0001 Pectina liasa 0.005 0.005 - - - Aldosa oxidasa 0.05 - - 0.05 - 0.02 Galactosa 0.04 oxidasa PAAC 0.03 0.03 0.02 - - - DETBCHD - - - 0.02 0.01 - SRP1 0.2 0.2 - 0.1 - - DTPA - - - 0.3 - - PV O - - - 0.3 - 0.2 Abrillantador 1 0.2 0.2 0.07 0.1 - - Antiespuma de 0.04 0.04 0.02 0.1 0.1 0.1 silicón Equilibrio hasta 100% de perfume/pigmento y/o agua EJEMPLO 18 Detergentes de Lavaplatos de Densidad Alta Este Ejemplo proporciona varias formulaciones para detergentes de lavaplatos de densidad alta. Los siguientes detergentes de lavaplatos de densidad alta compactos de la presente invención se proporcionan a continuación. En cada una de estas formulaciones, al menos una variante proteasa proporcionada en la presente se incluye a una concentración desde alrededor de 0.0001 hasta alrededor de 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, como se determina por el formulador, basadas en sus necesidades .

Tabla 18-1: Detergentes de Lavaplatos de Densidad Alta Compuesto Formulaciones I II III IV V VI BB1 - 0.1 0.1 - 0.5 - BB2 0.2 0.05 - 0.1 - 0.6 No iónico 2.0 1.5 1.5 3.0 1.9 5.9 HEDP 1.0 - - - - - DETPMP 0.6 - - - - - PAAC 0.03 0.05 0.02 - - - Parafina 0.5 0.4 0.4 0.6 - - nprE (opcional) 0.072 0.053 - 0.026 - 0.01 PMN - - 0.053 - 0.059 - Proteasa B (opcional) - - - - - 0.01 Amilasa 0.012 - 0.012 - 0.021 0.006 Lipasa - 0.001 - 0.05 - - Pectina liasa 0.001 0.001 0.001 - - - Aldosa oxidasa 0.05 0.05 0.03 0.01 0.02 0.01 BTA 0.3 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 Policarboxilato 6.0 - - - 4.0 0.9 Perfume 0.2 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 Equilibrio hasta 100% de Humera y/o Menor* *Abrillantador/pigmento/SRPl/carboximetilcelulosa de Na/fotoblanqueador/MgS04/PVPVl/supresor de espuma de jabón/ PEG molecular alto/arcilla.

El pH de los Ejemplos 18(1) hasta (VI) es desde alrededor de 9.6 hasta alrededor de 11.3.

EJEMPLO 19 Composiciones de Detergente en Comprimidos Este Ejemplo proporciona varias formulaciones de detergente en comprimidos. Las siguientes composiciones de detergente en comprimidos de la presente invención se preparan por compresión de una composición de detergente de lavaplatos granular a una presión de 13K /cm2 usando una prensa de 12 cabezas rotatoria estándar. En cada una de estas formulaciones, al menos una variante proteasa proporcionada en la presente se incluye a una concentración desde alrededor de 0.0001 hasta alrededor de 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, como se determina por el formulador, basadas en sus necesidades.

Na/fotoblanqueador/MgS04/PVPVI/supresor de espuma de jabón/PEG molecular alto/arcilla.

El pH de los Ejemplos 19(1) hasta 19 (VII) es desde alrededor de 10 hasta alrededor de 11.5; pH de 19 (VIII) es desde 8-10. El peso del comprimido de los Ejemplos 19(1) hasta 19 (VIII) es desde alrededor de 20 gramos hasta alrededor de 30 gramos.

EJEMPLO 20 Detergente de Limpieza de Superficie Dura Líquidos Este ejemplo proporciona varias formulaciones detergentes de limpieza de superficie dura líquidos. Las siguientes composiciones de detergente de limpieza de superficie dura líquidos de la presente invención se proporcionan a continuación. En cada una de estas formulaciones, al menos una variante de proteasa proporcionada en la presente se incluye en una concentración desde alrededor de 0 . 0001 hasta alrededor de 10 por ciento en peso. En algunas modalidades alternativas, otras concentraciones encontrarán uso, como se determina por el formulador, basadas en sus necesidades. 2-butil octanol 0.3 0.3 - 0.3 0.3 0.3 0.3 PEG DME-2000® 0.4 - 0.3 0.35 0.5 - - PVP 0.3 0.4 0.6 0.3 0.5 - - MME PEG (2000) ® - - - - - 0.5 0.5 Jeffamine ® ED- 0.4 0.5 2001 PAAC - - - 0.03 0.3 0.3 - DETBCHD 0.03 0.05 0.05 - - - - nprE (opcional) 0.07 - 0.08 0.03 - 0.01 0.04 PM - 0.05 - - 0.06 - - Proteasa B 0.01 (opcional) Amilasa 0.12 0.01 0.01 - 0.02 - 0.01 El pH de los Ejemplos 20(1) hasta (VII) es desde alrededor de 7.4 hasta alrededor de 9.5.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una variante de subtilisina aislada de una subtilisina Bacillus, caracterizada porque la variante de subtilisina es una forma madura que tiene actividad proteolítica y que comprende sustituciones en tres o más posiciones seleccionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, y 275, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B . amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

2. La variante de subtilisina aislada de una subtilisina Bacillus de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante de subtilisina es una forma madura que tiene actividad proteolítica y que comprende sustituciones en tres o más posiciones seleccionadas de: 1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 68, 69, 72, 73, 76, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 194, 195, 198, 199, 203, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, y 275, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO : 1.

3. La variante de subtilisina aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante de subtilisina es una forma madura que tiene actividad proteolítica y que comprende sustituciones en tres o más posiciones seleccionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233 , 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273 , 274, y 275, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

4. La variante de subtilisina aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las sustituciones en tres o más posiciones se seleccionan de: X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001P, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002 , X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003 , X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004G, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004 , X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005I, X005M, X005P, X005Q, X005S, X005T, X005W, X005Y, X006A, X006D, X006E, X006M, X006W, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007P, X007Q, X007S, X007T, X008A, X008F, X008G, X008I, X008L, X008M, X008Q, X008T, X008V, X008W, X008Y, X009A, X009C, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H X009L, X009N( X009Q, X009R, X009S, X009T, X009V X009W, X009Y, X010C, X010F, X010G, X010H, X010I X010K, X010L, XOION, X010Q, X010R, X010S, X010T X010V, X010W, X011A, X011C, X011D, X011G, X011I X011M, X011R, X011T, X011V, X011Y, X012D, X012F X012G, X012H, X012K, X012L, X012M, X012N, X012P X012Q, X012R, X012T, X012V, X012W, X012Y, X013A X013G, X013I, X013Q, X013T, X013V, X014A, X014C X014D, X014E, X014G, X014H, X014I, X014K, X014L X014P, X014Q, X014T, X014V, X014Y, X015A, X015D X015F, X015G, X015K, X015L, X015M, X015P, X015Q X015R, X015S, X015W, X016A, X016D, X016E, X016G X016L, X016N, X016Q, X016R, X016S, X016T, X016V X017A, X017D, X017F, X017G, X017H, X017I, X017K X017M, X017N, X017S, X017T, X017V, X017 , X017Y X018A, X018C, X018E, X018F, X018G, X018H, X018I X018K, X018L, X018N, X018P, X018Q, X018R, X018S X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E X019F, X019G, X019K, X019L, X019M, X019N, X019P X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C X020D, X020F, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P X020Q, X020R, X020T, X020V, X020W, X020Y, X021A X021C, X021D, X021G, X021H, X021I, X021K, X021L X021M, X021N, X021Q, X021R, X021S, X021T, X021V X021W, X022A, X022G, X022I, X022K, X022L, X022M, ?022?, ?022?, X022Q, X022R, X022S, X022T, X022V, X022W, ?022?, ?023?, X023G, X023S, X024A, X024C, X024D, X024F, X024G, ?024?, X024L, X024M, X024N, X024P, X024Q, X024R, X024S, ?024?, X024V, X024 , X025C, X025D, X025E, X025F, X025G, ?025?, ?025?, X025L, X025 , X025N, X025Q, X025R, X025S, ?025?, X025V, X025W, X026C, X026F, X026G, X026I, X026L, ?026?, ?026?, X026P, X026R, X026S, X026T, X026V, ?027?, X027C, X027D, X027F, X027G, X027I, X027K, X027L, ?027?, ?027?, ?027?, X027R, X027S, X027T, X027V, X027 , ?027?, ?028?, ?028?, X028G, X028H, X028I, X028L, X028M, ?028?, ?028?, X028S, X028V, X028Y, X029A, X029C, X029G, ?029?, ?029?, X029S, X029T, X029V, X030A, X030C, X030D, ?030?, X030F, X030G, X030L, X030M, X030Q, X030S, X030T, X030V, X031A, X031F, X031I, X031L, X031 , X031S, X031T, X031V, ?032?, X032C, X032D, X032E, X032G, X032V, X032W, ?033?, X033C, X033D, X033E, X033G, X033H, X033I, X033L, ?033?, ?033?, X033Q, X033R, X033S, X033T, X033V, X033Y, ?034?, X034G, ?034?, X034L, X034Q, X034S, X035A, X035F, ?035?, ?035?, ?035?, X035L, X035M, X035P, X035Q, X035R, X035S, ?035?, X035C, X035E, X035F, X035G, X035H, X035I , X035L, ?035?, ?035?, X035P, X035Q, X035R, X035T, X035V, X035 , ?035?, X038C, X038F, X038G, X038H, X038I, ?038?, X038L, ?038?, ?038?, X038Q, X038R, X038T, X038V, X038W, ?038?, ?039?, ?039?, X039G, X039H, X039L, X039M, ?039?, X039Q, X039S, ?039?, X039V, X039Y X040A X040C, X040D, X040E, X040G, X040H, X040I, X040K X040L X040M, X040N, X040P, X040R, X040S, X040T, X040V X040W X040Y, X041C, X041D, X041E, X041N, X041P, X041Q X041S X042A, X042C, X042F, X042G, X042H, X042I, X042L X042M X042N, X042Q, X042S, X042T, X042V, X042Y, X043A X043C X043D, X043E, X043F, X043G, X043I, X043L, X043M X043N X043P, X043R, X043S, X043T, X043V, X043 , X043Y X044A X044C, X044D, X044F, X044G, X044I, X044K, X044L X044M X044N, X044P, X044Q, X044R, X044S, X044T, X044V X044W X044Y, X045A, X045D, X045F, X045G, X045H, X045I X045K X045L, X045M, X045N, X045P, X045Q, X045R, X045S X045T X045V, X045W, X045Y, X046C, X046D, X046E, X046F X046G X046H, X046I, X046K, X046L, X046M, X046N, X046P X046Q X046R, X046S, X046T, X046V, X046 , X047A, X047C X047E X047F, X047G, X047H, X047K, X047L, X047M, X047N X047P X047Q, X047R, X047S, X047T, X047 , X048A, X048C X048E X048F, X048G, X048H, X048I, X048K, X048L, X048M X048N X048P, X048Q, X048R, X048S, X048T, X048V, X048Y X049A X049E, X049F, X049G, X049H, X049K, X049L, X049M X049P X049Q, X049R, X049S, X049T, X050C, X050F, X050G X050H X050I, X050L, X050N, X050T, X050V, X050Y, X051F X051G X051H, X051K, X051L, X051N, X051P, X051R, X051S X051T X051V, X051W, X052A, X052C, X052E, X052F, X052G X052H X052I, X052L, X052M, X052N, X052P, X052Q, X052R X052T X052V, X052W, X052Y, X053A, X053C, X053D, X053E, X053G, X053H, X053I, X053K, X053L, X053M, X053P, X053Q, X053R, X053S, X053T, X053V, X053W, X053Y, ?054?, X054C, X054D, X054E, 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X108S X108T X108V, X109A X109C X109E X109F X109G X109H X109I X109K, X109L X109M X109N X109P X109Q X109R X109S X109T, X109W X109Y XllOA XllOG XllOS X111A X111C X111E, X111F X111I X111L X111M X111P X111T X111V X111Y, X112A, X112C, X112D, X112E, X112F, X112G, X1121 X112M, X112N X112Q X112S X112T X112V X112W X113A, X113C X113D X113E X113L X113M X113N X113V, X113W X114A X114C X114G X114T X115C X115F, X115G X115H X1151 X115K X115L X115M X115P, X115Q X115R X115S X115T X115V X115W X116A, X116C X116D X116F X116G X1161 X116K X116M, X116N X116Q X116S X116T X116V X116W X117C, X117D X117F X117G X1171 X117N X117Q, X117T, X117Y, X118A, X118C XI18D, Xll8E, Xllí F, X118C, X118K, X118L X118M X118N X118P X118R X118S, X118V, X118W X119A X119C X119E X119F X119G X119K, X119M X119N X119P X119Q X119T X119 X120C, X120E X120F X120G X120H X120I X120L X120N, X120R X120S X120T X120W X121A X121C X121F, X121G X121I X121K X121L X121M X121Q X121T, X121V X121Y X122A X122C X122G X122I X122S, X122T X122V X123E X123G X123I X123L X123N, X123P X123S X123V X124G X124H X124L X124Q, X124S X124T X124Y X125A X125C X125G X125S, X125T X126A X126C X126E X126F X126G X126I, X126K X126L X126M X126N X126Q X126S X126V, X126 X126Y X127D X127F X127G X127I X127Q, X127R X127S X127T X127V X128A X128C X128F, X128G X128H X128I X128K X128L X128M X128P X128Q X128R X128S X128T X128 X128Y, X129E X129F X129G X129I X129L X129M X129N, X129R X129S X129T X129V X129W X129Y X130C, X130L X130N X130P X130Q X130R X130S X130V, X130Y X131A X131D X131E X131F X131G X131I, X131L X131M X131P X131Q X131R X131V X132A, X132F X132H X132I X132L X132M X132N X132Q, X132S X132T X132W X133A X133F X133K X133L, X133P X133Q X133S X133T X133V X133Y X134A, X134I X134L X134M X134P X134S X134T X134V, X135C X135E X135F X135L X135M X135Q X135T, X136A X136D X136E X136F X136G X136K X136M, X136Q X136R X136S X136V X136W X136Y X137A, X137E X137G X137H X137K X137L X137M X137Q, X137S X137V X137W X138A X138C X138E X138G, X138L X138M X138Q X138R X138V X139A X139C, X139F X139G X139I X139M X139Q X139S X139T, X139Y X140A X140C X140D X140E X140F X140G, X140K X140L X140M X140N X140Q X140R X140S, X140V X140Y X141D X141E X141G X141H X141I X141L X141N X141Q X141R X141S X141V X141Y, X142C X142E X142G X142I X142L X142M X142N, X142S X142T X142V X142Y X143C X143D X143F, X143H X143I X143K X143L X143M X143N X143R, X143T X143V X143W X143Y X144A X144C X144D, X144H, X144I, X144L X144M X144N X144Q X144R X144S, X144T X144V X144W X144Y X145A X145C X145D X145E, X145F X145G X145K X145L X145M X145N X145Q X145R, X145S X145T X145W X145Y X146A X146C X146D X146E, X146F X146G X146I X146K X146L X146M X146Q X146R, X146S X146T X146 X146Y X147F X147G X147I X147L, X147M X147P X147Q X147T X147V X148A X148C X148E, X148F X148G X148H X148I X148L X148M X148 X148S, X148T X148V X148W X148Y X149A X149C X149F X149G, X149H X149I X149L X149M X149P X149Q X149S X149T, X149V X150A X150E X150F X150G X150H X150L X150P, X150Q X150S X150T X150V X151A X151G X151M X151S, X151T X151V X152A X152C X152P X152R X152S X152T, X152V X153A X153E X153F X153G X153I X153M X153N, X153Q X153S X153V X153Y X154A X154C X154G X154N, X154Q X154S X155A X155D X155E X155F X155I X155L, X155N X155P X155Q X155R X155S X155T X155V X155Y, X156A X156C X156D X156E X156F X156G X156I X156K, X156L X156M X156N X156P X156Q X156R X156S X156T, X156V X156Y X157A X157C X157D X157G X157K X157L, X157Q X157R X157S X157V X158A X158C X158E X158F, X158H X158K X158L X158M X158P X158Q X158R X158S, X158T X158V X158W X159A X159C X159E X159G X159H, X159L X159M X159P X159Q X159R X159S X159V X159W, X159Y X160A X160C X160D X160F X160G X160I X160L, X160M X160N X160Q X160R X160S X160T X160V, X165A X165C X165D X165E X165F X165G X165H, X165K X165L X165M X165P X165R X165S X165T, X165 X165Y X166A X166C X166D X166E X166F, X166I X166L X166M X166 X166P X166R X166S, X166V X166W X166Y X167A X167C X167D X167E, X167G X167H X167I X167K X167L X167M X167N, X167Q X167R X167S X167T X167V X167W X167Y, X168C X168F X168I X168M X168N X168P X168S1 X168V X169A X169C X169G X169I X169L X169S, X170D X170E X170G X170H X170K X170L X170N, X170Q X170R X170S X170V X170W X170Y X171A, X171D X171E X171F X171G X171H X171I X171L, X171N X171Q X171S X171T X171V X171 X171Y, X172C X172D X172F X172G X172I X172K X172L, X172P X172Q X172R X172S X172T X172V X172W, X173A X173C X173D X173E X173F X173G X173H, X173K X173L X173M X173N X173P X173Q X173R, X173V X173W X173Y X174A X174G X174I X174N, X174S X174T X174V X175A X175C X175E X175G, X175I X175K X175L X175M X175Q X175S X175T, X175W X175Y X176A X176C X176E X176G X176I , X176P X176S X176T X176V X177A X177C X177I, X177V X178A X178G X178S X178T X179A X179C, X179H X179I X180C X180G X180H X180I X180L, X180Q, X180S X180T X180V, X181A X181D, X181E, X181G, X181H, X181L X181M X181N, X182A X182D, X182E, X182F, X182G, X182H X182I X182K, X182L X182M, X182N, X182P, X182Q, X182R X182S X182T, X182V X182W, X182Y, X183A, X183D, X183F X183G X183H, X183I X183K, X183L, X183M, X183N, X183P X183Q X183R, X183S X183T, X183V, X183W, X183Y, X184A X184C X184D, X184E X184F, X184G, X184H, X184L, X184M X184N X184S, X184T X184 , X184Y, X185A, X185C, X185E X185F X185G, X185H X185I , X185K, X185L, X185M, X185N X185Q X185R, X185S X185T, X185V, X185Y, X186A, X186C X186G X186H, X186I X186K, X186L, X186M, X186N, X186P X186Q X186R, X186S X186T, X186W, X187A, X187C, X187D X187E X187F, X187G X187H, X187I, X187L, X187M, X187N X187P X187Q, X187S X187T, X187V, X187W, X187Y, X188A X188D X188E, X188F X188G, X188H, X188I, X188K, X188L X188P X188Q, X188R X188S, X188T, X188V, X188W, X188Y X189A X189C, X189E X189F, X189G, X189H, X189K, X189L X189M X189N, X189P X189Q, X189R, X189S, X189T, X189V X189Y X190A, X190D X190E, X190F, X190G, X190H, X190I X190K X190L, X190M X190N, X190P, X190Q, X190R, X190S X190V X190W, X190Y X191A, X191D, X191E, X191F, X191H X191I X191K, X191L X191P, X191Q, X191R, X191S, X191T X191V X191 , X191Y X192C, X192D, X192E, X192G, X192H X192I X192K, X192L X192M, X192N, X192P, X192Q, X192R X192S X192T, X192V X192W, X192Y, X193A, X193D, X193E X193F X193G X193H X193I X193K, X193R, X193S X193T X193V X193W X193Y X194A, X194D, X194E X194F X194G X194H X194I X194L, X194P, X194Q X194R X194S X194T X194V X194 X195A, X195C X195D X195E X195F X195G X195I X195L, X195Q X195R X195S X195T X195V X195W, X196A, X196D X196E X196F X196I X196L X196M, X196Q, X196T X196V X196Y X197A X197C X197D, X197F, X197G X197H X197I X197L X197M X197N, X197R, X197S X197T X197V X197W X197Y X198A, X198E, X198F X198G X198H X198I X198L X198M, X198Q, X198R X198S X198T X198W X198Y X199A, X199D, X199E X199F X199G X199H X199I X199L, X199Q, X199S X199T X199V X199 X200A X200C, X200H, X200I X200S X201C X201G X201P X201S, X201V, X202F X202G X203A X203C X203E X203F, X203H, X203I X203K X203L X203N X203R X203S, X203V, X203 X203Y X204A X204C X204E X204F( X204I, X204K X204L X204N X204P X204R X204S, X204W, X204Y X205A X205F X205G X205I X205L, X205Q, X205T X205V X206A X206C X206D X206E, X206G, X206H X206I X206K X206L X206N X206P, X206R, X206S X206T X206V X206W X206Y X207A, X207H, X207S X208A X208C X208L X208N X208P, X208T, X208V X209A X209C X209D X209E X209F, X209H, X209I X209K X209L X209M, X209N X209R, X209T X209V X209W X209Y X210A X210C X210D, X210F X210G X210H X210I X210L X210M X210N, X210Q X210R X210S X210V X210W X210Y X211A, X211E X211F X211G X211H X211I X211L X211M, X211Q X211R X211T X211V X211W X211Y X212C, X212G X212H X212I X212 X212N X212P X212R, X212T X212V X212Y X213A X213C X213D X213E, X213G X213I X213K X213L X213M X213N X213P, X213R X213S X213T X213V X213W X213Y X214A, X214E X214F X214G X214H X214I X214K X214L, X214N X214P X214Q X214R X214S X214T X214V, X214Y X215A X215C X215D X215E X215F X215G, X215I X215K X215M X215N X215P X215R X215S, X215V X215W X215Y X216A X216C X216D X216E, X216G X216H X216I X216K X216L X216M X216N, X216Q X216R X216S X216V X216 X216Y X217A, X217D X217E X217F X217G X217I X217K X217L, X217N X217Q X217S X217T X217V X217Y X218C, X218E X218F X218G X218H X218I X218L X218M, X218P X218Q X218R X218S X218T X218V X218W, X219A X219G X219S X220A X220C X220G X220H, X220S X220T X220V X221G X221S X221T X222A, X222E X222F X222G X222I X222K X222L X222M, X222P X222Q X222R X222S X222T X222V X222W, X223C, X223G, X223M X223S, X223T X224A X224D X224E, X224G X224I X224L X224M X224N X224P X224S X224T, X225A X225C X225G X225I X225N X225P X225S X225T, X225V X226C X226F X226G X226H X226I X226L X226M, X226N X226R X226S X226T X226V X226Y X227A X227C, X227F X227G X227I X227L X227M X227P X227Q X227S, X227T X227V X227Y X228A X228C X228G X228I X228L, X228M X228P X228S X228V X229A X229G X229P X229S, X230A X230D X230E X230F X230G X230H X230I X230L, X230N X230P X230Q X230S X230T X230V X230W X230Y, X231A X231C X231F X231G X231H X231I X231L X231S, X231T X231W X231Y X232A X232G X232H X232K X232L, X232M X232P X232S X232V X233A X233C X233E X233F, X233G X233I X233L X233M X233N X233P X233Q X233R, X233S X233T X233V X233Y X234D X234F X234G X234H, X234L X234M X234N X234P X234Q X234S X234T X234V, X234Y X235C X235D X235E X235F X235G X235H X235I, X235K X235L X235M X235N X235Q X235R X235S X235V, X235 X235Y X236A X236C X236E X236F X236G X236H, X236K X236L X236N X236P X236Q X236R X236S X236T, X236V X236W X236Y X237A X237C X237F X237G X237H, X237I X237K X237L X237M X237P X237Q X237R X237S, X237T X237V X237W X237Y X238C X238D X238E X238F, X238G X238H X238I X238K X238L X238M X238N X238Q, X238 X238S X238T X238V X238Y X239C X239D X239F, X239G, X239H, ?239? ?239? X239L, ?239? ?239?, ?239?, X239Q, X239R, X239S ?239? X239V, X239W ?239?, ?240?, X240C, X240E, X240F ?240? ?240?, X240L ?240?, ?240?, X240Q, X240R, X240S ?240? X240W, ?240? X241A, X241C, X241D, X241E, X241F X241G X241H, X241I X241K, X241L, X241M, X241N, X241P X241Q X241R, X241S X241T, X241V, X241W, X241Y, ?242? X242C X242D, X242F X242G, ?242?, X242I, X242L, ?242 ?242? X242Q, X242R X242S, ?242?, X242V, X242 , X243C X243D ?243?, X243F X243G, ?243?, X243I, X243K, X243L ?243? ?243?, ?243? X243Q, X243R, X243S, X243T, X243V X243W ?244?, X244D ?244?, X244F, X244H, X244I, X244L ?244? ?244?, ?244? X244Q, X244R, X244S, X244T, X244V X244W ?244?, ?245? X245C, ?245?, X245G, X245H, ?245? X245L ?245?, X245Q X245R, X245S, X245V, X245 , ?245? ?246? X246C, ?246? X246F, X246G, X246H, X246I , X246L ?246? ?246?, ?246? X246Q, X246R, X246S, ?246?, X246V X246W ?246?, ?247? X247C, X247D, X247E, X247F, X247G ?247? ?247?, ?247? X247L, ?247?, X247N, ?247?, X247Q X247R X247S, ?247? X247V, X247W, X247Y, X248C, X248D ?248? X248G, ?248? ?248?, ?248?, X248L, ?248?, ?248? ?248? X248R, X248S ?248?, X248V, X248 , ?248?, ?249? X249D ?249?, X249F X249G, ?249?, X249I, ?249?, X249L ?249? ?249?, X249Q X249R, X249S, X249T, X249V, X249W ?249? ?250?, X250C ?250?, X250F, X250G, ?250?, ?250? X250L ?250?, ?250? X250Q, X250S, X250V, X250Y X251A X251D X251E X251F X251G( X251L, X251M X251P X251Q X251R X251S X251T, X251Y, X252A X252C X252D X252F X252G X252H, X252K, X252L X252 X252N X252P X252R X252S, X252 , X252Y X253A X253D X253E X253F X253G, X253I, X253K X253M X253R X253S X253T X253V, X254A, X254C X254D X254E X254G X254N X254P, X254T, X254V X255A X255C X255D X255E X255F, X255I, X255L X255N X255P X255Q X255R X255S, X255V, X255W X255Y X256A X256C X256D X256E, X256H, X256I X256K X256L X256 X256N X256P, X256S, X256T X256V X256 X256Y X257A X257C, X257F, X257G X257H X257I X257K X257L X257M, X257S, X257T X257V X257W X257Y X258A X258C, X258E, X258F X258G X258H X258I X258L X258M, X258Q, X258R X258S X258T X258V X258W X258Y, X259C, X259E X259G X259I X259L X259M X259P, X259R, X259S X259T X259V X260A X260D X260E, X260H, X260I X260L X260M X260N X260P X260R, X260T, X260V X260Y X261A X261C X261E X261F, X261I, X261K X261L X261N X261P X261Q X261R, X261T, X261V X261W X261Y X262A X262C X262D, X262G, X262H X262I X262K X262L X262M X262P, X262R, X262S X262T X262V X262W X262Y X263A, X263D, X263F X263G X263H X263I X263K X263L, X263N, X263P, X263Q, X263R, X263W, X263Y, X264A, X264C, X264E, X264F, X264G, X264H, X264I, X264L, X264P, X264Q, X264S, X264T, X264V, X264Y, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265I, X265K, X265L, X265M, X265N, X265P, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265V, X265W, X265Y, X266G, X266 , X266Y, X267A, X267C, X267D, X267E, X267F, X267G, X267H, X267I, X267K, X267L, X267 , X267N, X267S, X267T, X267V, X267Y, X268A, X268D, X268E, X268G, X268H, X268K, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268R, X268S, X268V, X268W, X268Y, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270E, X270F, X270G, X270H, X270I, X270L, X270M, X270N, X270P, X270Q, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, X272M, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272W, X272Y, X273A, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273 , X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274 , X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, y X275W, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

5. Una variante de subtilisina aislada caracterizada porque tiene un índice de desempeño mayor que 1 en al menos un ensayo seleccionado de un ensayo BMI , un ensayo de micromuestra de yema de huevo, y/o un ensayo de actividad AAPF, y un índice de desempeño mayor que 0.8 para estabilidad LAS o en un ensayo TCA, en donde la variante comprende al menos una sustitución en una o más posiciones seleccionadas de: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 192, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 220, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, y 275, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

6. Una variante de subtilisina aislada caracterizada porque tiene un índice de desempeño mayor que 0.8 en al menos un ensayo seleccionado de un ensayo BMI , ensayo de micromuestra de yema de huevo, y/o un ensayo de actividad AAPF, y un índice de desempeño mayor que 0.8 para estabilidad LAS y en un ensayo TCA, en donde la variante comprende al menos una sustitución en una o más posiciones seleccionadas de: 1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 35, 36, 38, 40, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 59, 61, 62, 68, 69, 72, 73, 76, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 156, 158, 159, 160, 165, 166, 167, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 180, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 191, 194, 195, 198, 199, 203, 204, 206, 209, 210, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 222, 223, 224, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 255, 256, 258, 259, 260, 261, 262, 265, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, y 275, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

7. La variante de subtilisina aislada de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la variante aislada tiene un índice de desempeño mayor que 1 en al menos un ensayo seleccionado de un ensayo BMI , ensayo de micromuestra de yema de huevo, y/o ensayo de actividad AAPF, y un índice de desempeño mayor que 0.8 para estabilidad LAS/EDTA o en un ensayo TCA, en donde la variante comprende al menos tres sustituciones seleccionadas de : X001A, X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N, X001Q, X001R, X001S, X001T, X001V, X001Y, X002A, X002C, X002E, X002G, X002K, X002L, X002M, X002N, X002P, X002Q, X002R, X002S, X002T, X002V, X002W, X002Y, X003D, X003E, X003F, X003G, X003H, X003I, X003L, X003M, X003N, X003P, X003R, X003S, X003T, X003V, X003W, X003Y, X004A, X004C, X004D, X004E, X004F, X004H, X004K, X004L, X004N, X004P, X004R, X004S, X004T, X004V, X004W, X005A, X005C, X005D, X005E, X005G, X005P, X005Q, X005S, X005T, X007A, X007C, X007D, X007G, X007H, X007N, X007S, X007T, X008A, X008F, X008I, X008L, X008M, X008T, X008V, X009D, X009E, X009F, X009G, X009H, X009L, X009N X009P X009Q X009R X009S X009T X009V, X009W X009Y XOIOA XOIOC XOIOG XOIOH XOIOK XOIOM, XOIO XOIOQ XOIOR XOIOS XOIOT XOIOW X011A X011I, X011M X011S X011V X012D X012F X012G X012H X012I, X012K X012L X012M X012N X012Q X012R X012S X012T, X012V X012W X013A X013G X013I X013T X013V X014A, X014D X014E X014F X014H X014I X014K X014L X014P, X014Q X014S X014T X014V X014Y X015A X015D X015F, X015G X015I X015K X015L X015M X015P X015Q X015R, X015S X015V X015W X016A X016G X016L X016N X016P, X016Q X016S X016T X016V X017A X017F X017H X017I, X017K X017M X017N X017R X017S X017V X017W X017Y, X018A X018C X018D X018E X018F X018G X018H X018K, X018L X018M X018N X018P X018Q X018R X018S X018T, X018V X018W X018Y X019A X019C X019D X019E X019F, X019G X019H X019K X019L X019M X019N X019R X019S, X019T X019V X019 X019Y X020A X020C X020D X020F, X020G X020I X020K X020L X020M X020P X020Q X020R, X020S X020T X020V X020W X020Y X021A X021C X021D, X021E X021G X021H X021I X021K X021L X021M X021N, X021P X021Q X021R X021S X021T X021V X021W X022A, X022C X022G X022I X022K X022L X022 X022N X022P, X022Q X022R X022S X022T X022V X022W X022Y X023A, X023G X023S X024A X024C X024D X024F X024G X024H, X024L X024M X024N X024P X024Q X024R X024S X024T, X024V, X024W, X025C X025D, X025E X025F, X025G, X025K X025L X025M X025N, X025Q X025R, X025S, X025V X025W X026C X026F, X026G X026I, X026L, X026N X026P X026R X026S, X026T X026V, X027A, X027D X027F X027G X027I, X027K X027L, X027M, X027P X027R X027S X027T, X027V X027 , X027Y, X028E X028H X028I X028L, X028M X028N, X028S, X029A X029C X029G X029S, X029V X030C, X030E, X030S X030T X030V X031A, X031F X031I, X031L, X031S X031T X031V X033A, X033D X033E, X033G, X033M X033N X033Q X033S, X033T X033Y, X035A, X035I X035L X035M X035P, X036A X036C, X036E, X036G X036H X036I X036L, X036M X036N, X036Q, X036S X036T X036V X038C, X038F X038G, X038H, X038K X038L X038M X038N, X038Q X038R, X038T, X038W X038Y X039H X039V, X040A X040C, X040D, X040G X040H X040I X040K, X040L X040M, X040N, X040R X040S X040T X040V, X040W X040Y, X041D, X042C X042H X042I X042L, X042M X042N, X042T, X043A X043C X043D X043E, X043F X043G, X043I X043 X043N X043P X043R, X043S X043T, X043V, X043Y X044A X044C X044D, X044G X044I, X044K, X044M X044N X044P X044Q, X044R X044S, X044T, X044 X044Y X045A X045D, X045F X045G, X045H, X045K X045L X045M X045N, X045P X045Q, X045R, X045T, X045V, X045 X045Y, X046C X046D X046E X046F, X046G X046H X046I X046K X046L X046M X046N X046P, X046Q X046R X046S X046T X046V X046W X047A X047F, X047G X047N X047R X047S X047T X047W X048A X048C, X048E X048F X048G X048H X048I X048K X048L X048M, X048N X048P X048Q X048R X048S X048T X048V X048Y, X049A X049F X049G X049L X049M X049P X049S X049T, X050C X050F X050H X050I X050L X050N X050T X050V, X050Y X051F X051G X051H X051K X051L X051N X051P, X051R X051S X051T X051V X051 X052A X052C X052E, X052F X052G X052H X052I X052L X052M X052N X052P, X052Q X052R X052T X052V X052W X052Y X053A X053C, X053D X053E X053G X053H X053K X053L X053M X053P, X053Q X053R X053S X053T X053V X053W X053Y X054A, X054C X054D X054E X054F X054I X054M X054N X054Q, X054S X054V X055A X055C X055E X055F X055G X055H, X055I X055K X055L X055M X055N X055P X055Q X055S, X055T X055W X055Y X056A X056C X056D X056E X056H, X056L X056M X056N X056P X056Q X056S X056T X057A, X057C X057E X057F X057G X057H X057I X057K X057L, X057M X057N X057P X057Q X057R X057S X057T X057V, X057 X057Y X059A X059C X059D X059E X059F X059G, X059I X059L X059M X059N X059P X059Q X059R X059S, X059T X059V X059W X059Y X060D X060S X060V X061A, X061C X061D X061F X061G X061H X061I X061L X061M, X061N, X061P, X061R, X061S, X061T, X061V, X061Y, X062C, X062E, X062F, X062G, X062H, X062I, X062K, X062L, X062M, X062N, X062P, X062Q, X062R, X062S, X062T, X062V, X062Y, X063A, X063C, X063D, X063E, X063F, X063G, X063H, X063K, X063M, X063Q, X063R, X063S, X063W, X066K, X066S, X066T, X068I, X068T, X068V, X069A, X069E, X069G, X069N, X069S, X069T, X071A, X071I, X071N, X071T, X071V, X072C, X072F, X072I, X072L, X072 , X072T, X072V, X073A, X073C, X073D, X073E, X073H, X073K, X073L, X073N, X073S, X073T, X073V, X074A, X074C, X074S, X075A, X075H, X075I, X075L, X075M, X075N, X075P, X075Q, X075R, X075S, X075V, X076D, X076E, X076F, X076G, X076H, X076K, X076M, X076N, X076Q, X076R, X076S, X076T, X076W, X076Y, X077D, X077N, X078A, X078C, X078E, X078F, X078G, X078H, X078I, X078K, X078L, X078M, X078N, X078P, X078Q, X078R, X078S, X078T, X078V, X078Y, X079C, X079D, X079E, X079F, X079G, X079I, X079K, X079L, X079N, X079Q, X079R, X079S, X079T, X079V, X079W, X079Y, X081C, X081G, X081H, X081I, X081L, X081M, X081Q, X081S, X081T, X081V, X082A, X082E, X082F, X082K, X082L, X082M, X082Q, X082R, X082T, X082V, X082Y, X083G, X083S, X084C, X084E, X084G, X084I, X084L, X084M, X084N, X084T, X084V, X085A, X085C, X085I, X086A, X086C, X086D, X086E, X086G, X086P, X086S, X086 , X086Y, X087A, X087C, X087D, X087E, X087F, X087G, X087I, X087K, X087L, X087N, X087S, X087T, X087V, X087Y, X088A, X088C, X088D, X088G, X088Q, X088S, X088W, X089A X089C, X089D X089E, X089F X089G, X089I X089L X089N X089P X089Q X089R X089S X089V X089W X090A X090C X090F X090G X090I X090L X090M X090Q X090T X090V X091C X091D, X091I X091K X091L X091M X091N X091Q X091R, X091T X091V X091W X091Y X092A X092D X092G, X092P X092R X092T X092V X093A X093C X093G, X093M X093S X093T X093V X093Y X094K X094N, X094R X095A X095C X095G X095I X095K X095R, X095T X095V X095 X096E X096I X096L X096M, X097A X097D X097E X097G X097H X097I X097K, X097M X097N X097P X097Q X097R X097S X097T, X097Y X098A X098C X098D X098E X098F X098G, X098L X098N X098P X098Q X098R X098S X098T( X098Y X099A X099C X099F X099G X099K X099M, X099Q X099R X099S X099T X099V X099Y XIOOD, X100G XIOOI XIOOP XIOOS XIOOV IOOY X101A, X101E X101F X101G X101H X101I X101K X101N, X101Q X101R X101S X101T X101V X101Y X102A, X102D X102G X102N X102T X103A X103D X103E, X103G X103I X103L X103N X103P X103Q X103R, X103T X103V X103Y X104A X104C X104D X104E, X104H X104I X104L X104P X104R X104S X104T, X104W X104Y X105A X105C X105D X105E X105F, X105H X105I X105K X105L X105N X105Q X105R, X105T, X105V X105W X105Y, X106A, X106D, X106E X106G, X106I X106L X106M, X106P, X106R, X106S X106W, X107A X107F X107I, X107L, X107M, X107Q X107T, X107V X108A X108G, X108I, X108L, X108S X108V, X109A X109C X109E, X109F, X109G, X109H X109K, X109L X109M X109N, X109Q, X109R, X109S X109W, X109Y, X110A, XllOC XllOS, Xll1C, X111E, XlllJ X111L, X111M X111V X111Y, X112A, X112C, X112D X112F, X112G X112I X112L, X112N, X112Q, X112S X112V, X112W X112Y X114A, X114C, X114G, X114T X115E, X115F X115G X115H, X115I, X115K, X115L X115N, X115P X115Q X115R, X115S X115T, X115V X115Y, X116A X116C X116D, X116F X116G, X116I X116L, X116M X116N X116Q, X116S X116T, X116V X117A, X117C X117D X117F, X117G X117I, X117N X117R, X117T X117Y X118A, X118C X118D, X118E X118G, X118I X118K X118L, X118M X118N, X118P X118S, X118T X118V X118W, X119A X119C, X119F X119M, X119N X119Q X119T, X119W X120A, X120C X120F, X120G X120H X120I, X120L X120M, X120N X120S, X120T X120W X121A, X121C X121E, X121F X121I, X121L X121 X121Q, X121S X121T, X121V X122A, X122C X122G X122I, X122L X122S, X122T X123G( X123N X123S, X124G, X124L X124S, X124T X125S, X126A, X126F, X126L, X127F, X127G, X127L X127R, X127T, X128A, X128F, X128G, X128I, X128K, X128L, X128M, X128N, X128Q, X128R, X128S, X128T, X128W, X129A, X129E, X129F, X129G, X129I, X129L, X129M, X129N, X129P, X129R, X129S, X129T, X129V, X129 , X129Y, X130C, X130K, X130L, X130N, X130Q, X130R, X130S, X130V, X130 , X130Y, X131A, X131D, X131E, X131F, X131G, X131I, X131K, X131L, X131P, X131Q, X131R, X131V, X132A, X132E, X132F, X132H, X132I, X132L, X132M, X132N, X132Q, X132S, X132T, X132 , X133A, X133F, X133K, X133L, X133N, X133P, X133Q, X133S, X133T, X133V, X133Y, X134A, X134F, X134I, X134L, X134M, X134P, X134S, X134T, X134V, X135C, X135E, X135L, X135M, X135 , X136A, X136E, X136F, X136K, X136Q, X136R, X136S, X136V, X136W, X136Y, X137A, X137C, X137E, X137G, X137H, X137K, X137L, X137M, X137Q, X137R, X137S, X137V, X137W, X138A, X138G, X138M, X138R, X138V, X139A, X139C, X139I, X139M, X139T, X139V, X140A, X140C, X140D, X140E, X140F, X140G, X140I, X140L, X140M, X140N, X140Q, X140R, X140S, X140T, X140V, X140Y, X141D, X141E, X141G, X141H, X141I, X141K, X141L, X141N, X141Q, X141R, X141S, X141V, X141Y, X142A, X142C, X142L, X142T, X142V, X142Y, X143C, X143D, X143F, X143G, X143H, X143I, X143K, X143L, X143M, X143N, X143S, X143T, X143V, X143W, X143Y, X144A, X144C, X144D, X144G, X144H, X144I, X144L, X144M, X144N, X144Q, X144R, X144S, X144T, X144V, X144 , X144Y, X145A, X145C, X145D, X145E, X145F, X145G, X145K, X145L, X145M, X145N, X145Q, X145R, X145S, X145T X145W X145Y X146A, X146C X146D, X146G X146K X146Q X147I X147L X147M X147T, X148A X148C X148E X148F X148H X148I X148L, X148N X148S X148T X148V X148Y X149A X149C, X149L X149M X149P X149S X149T X149V X150A, X150L X150T X150V X151A X151G X151S X152A, X153A X153G X153S X153V X156A X156C X156D, X156F X156L X156M X156N X156S X156T X158A, X158E X158F X158H X158K X158L X158M X158Q, X158S X158T X158V X158W X159A X159C X159E, X159H X159M X159P X159Q X159R X159S X159W, X160C X160D X160F X160G X160I X160L X160M, X160Q X160R X160S X160T X160V X160Y X165I, X165T X165V X166A X166C X166D X166E X166H, X166N X166S X167C X167D X167E X167F X167P, X167 X167Y X169A X169G X169S X170A X170D, X170G X170H X170K X170L X170P X170Q X170R, X170V X170 X170Y X171C X171F X171L X171N, X172A X172C X172D X172F X172G X172I X172K, X172M X172P X172Q X172R X172S X172T X172V, X173A X173C X173D X173E X173F X173G X173H, X173L X173M X173N X173Q X173R X173T X173V, X174A X174G X174S X174T X174V X175A X175C, X175L X175M X175Q X175T X175V X175Y X176A, X176S X177A X177C X177I X177T X177V X178A, X179A, X179G, X180C, X180I, X180L, X180S, X180T, X180V, X181D, X181N, X182A, X182D, X182E, X182F, X182G, X182H, X182I, X182K, X182L, X182M, X182N, X182P, X182Q, X182R, X182S, X182T, X182V, X182W, X182Y, X183A, X183D, X183F, X183G, X183H, X183I, X183K, X183L, X183M, X183N, X183Q, X183R, X183S, X183T, X183V, X183W, X183Y, X184D, X184N, X185A, X185C, X185E, X185F, X185G, X185H, X185I, X185K, X185L, X185M, X185N, X185Q, X185R, X185S, X185T, X185V, X185Y, X186H, X186I, X186K, X186L, X186R, X187A, X187P, X187W, X188A, X188D, X188E, X188F, X188G, X188H, X188I, X188K, X188L, X188P, X188Q, X188R, X188S, X188T, X188V, X188W, X188Y, X191D, X191Q, X192W, X192Y, X194A, X194C, X194D, X194E, X194F, X194G, X194H, X194I, X194L, X194M, X194P, X194Q, X194R, X194S, X194T, X194V, X194W, X194Y, X195A, X195C, X195D, X195E, X195G, X195Q, X195Y, X196L, X196M, X197A, X197C, X197D, X197E, X197G, X197N, X197Q, X197S, X197T, X198A, X198F, X198G, X198H, X198I, X198L, X198M, X198N, X198R, X198S, X198T, X198Y, X199A, X199C, X199I, X199M, X199S, X199T, X199V, X200A, X200C, X200G, X200S, X203A, X203C, X203E, X203I, X203L, X203S, X203T, X203V, X204A, X204C, X204E, X204F, X204G, X204I, X204K, X204L, X204N, X204R, X204S, X204T, X204W, X204Y, X205I, X205T, X205V, X206A, X206C, X206D, X206E, X206G, X206H, X206I, X206K, X206L, X206N, X206P, X206Q, X206R, X206S, X206T, X206V, X206W, X206Y, X207A, X207S, X208C, X208L, X208S, X208T, X208V, X209A, X209C, X209F, X209G, ?209?, X209I, X209K, X209L, X209M, X209N, X209R, X209S, X209V, X209 , X209Y, X210A, X210C, X210E, X210G, X210H, X210I, X210L, X210M, X210N, X210P, X210R, X210S, X210V, X210Y, X211A, X211C, X211E, X211F, X211G, X211H, X211I, X211L, X211M, X211P, X211Q, X211R, X211T, X211V, X211W, X211Y, X212C, X212F, X212G, X212H, X212I, X212M, X212N, X212P, X212R, X212S, X212T, X212V, X212Y, X213A, X213C, X213D, X213E, X213F, X213G, X213I, X213K, X213L, X213M, X213N, X213Q, X213R, X213S, X213T, X213V, X213W, X213Y, X214F, X214L, X214W, X214Y, X215A, X215C, X215D, X215E, X215F, X215G, X215H, X215I, X215K, X215M, X215N, X215P, X215R, X215S, X215T, X215V, X215 , X215Y, X216A, X216C, X216D, X216E, X216F, X216G, X216H, X216I, X216K, X216L, X216M, X216N, X216P, X216Q, X216R, X216S, X216V, X216W, X216Y, X217A, X217C, X217E, X217F, X217G, X217I , X217K, X217L, X217M, X217Q, X218C, X218D, X218E, X218F, X218G, X218H, X218I, X218M, X218N, X218Q, X218R, X218S, X218T, X218V, X218Y, X220S, X220T, X222A, X222M, X222Q, ?223?, X223G, X223S, X224A, X224G, X224L, X224N, X224S, ?224?, X225C, X225P, X226C, X226F, X226H, X226M, X226V, ?227?, X227C, X227G, X227I, X227L, X227M, X227S, ?227?, X227V, ?228?, X228C, X228G, X228I, X228S, X228V, ?229?, X229G, ?229?, X229S, X230A, X230D, X230E, X230G, ?230?, ?230?, X230L, X230N, X230Q, X230S, X230T, X230V, X231A, X231C, X231F, X231G, X231H, X231I, X231L X231S, X231T, X231Y, ?232?, X232G, X232H, X232L, X232M X232S, X232V, X233A, X233C, X233E, X233F, X233G, X233I X233L, X233M, X233N,. ?233?, X233Q, X233S, X233T, X233V X233Y, X234D, X234F, X234G, X234H, X234L, X234 , X234N X234Q, X234S, X234T, X234V, X234Y, X235C, X235D, X235E X235F, X235G, X235H, ?235?, X235K, X235L, X235M, X235N X235Q, X235R, X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A, X236C X236E, X236F, X236H, ?236?, X236N, X236P, X236Q, X236R X236S, X236T, X236V, X236W, X236Y, X237A, X237C, X237F X237G, X237H, X237I, ?237?, X237L, X237M, X237P, X237Q X237R, X237S, X237T, X237V, X237 , X237Y, X238C, X238D X238E, X238F, X238G, ?238?, X238I, X238K, X238L, X238M X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T, X238V, X238Y, X239C X239D, X239F, X239G, ?239?, X239I, X239K, X239L, X239M X239N, X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T, X239V, X239W X239Y, X240A, X240C, ?240?, X240F, X240I, X240K, X240L X240M, X240N, X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W, X240Y X241A, X241C, X241D, X241E, X241F, X241G, X241H, X241I X241K, X241L, X241M, X241N, X241P, X241Q, X241R, X241S X241T, X241V, X241 , X241Y, X242A, X242C, X242D, X242F X242G, X242H, X242I , X242L, X242M, X242P, X242Q, X242R X242S, X242T, X242V, X242W, X243C, X243D, X243E, X243F X243G, X243H, ?243?, ?243?, X243L, X243M, X243N, X243P X243Q, X243R, X243S, ?243?, X243V, X243W, X244A, X244D X244E, X244F, ?244?, ?244?, X244L, X244M X244N, X244P X244Q X244R X244S, X244V X244W X244Y X245A X245C X245E X245G, X245K X245L X245P X245Q X245R X245S X245V, X245Y X246A X246C X246E X246F X246G X246H, X246L X246M X246N X246Q X246S X246T X246V, X246Y X247A X247C X247D X247E X247F X247G, X247I X247K X247L X247M X247 X247P X247Q, X247S X247T X247V X247W X247Y X248C X248D, X248G X248H X248I X248K X248L X248N X248P, X248S X248T X248V X248W X248Y X249A X249D, X249F X249G X249H X249I X249K X249L X249M, X249Q X249R X249S X249T X249V X249W X249Y, X250C X250F X250I X250L X250M X250Q X250S, X251A X251D X251E X251F X251G X251K X251L( X251Q X251R X251T X251V X251Y X252A X252C, X252F X252G X252H X252I X252K X252L X252M, X252R X252S X252V X252W X252Y X253A X253D, X253F X253G X253H X253I X253K X253M X253R, X253T X253V X253W X254A X254C X254G X254S X255A X255C X255D X255E X255F X255H X255I X255N X255P X255Q X255R X255S X255T X255V, X255Y X256A X256C X256D X256E X256G X256H, X256K X256L X256M X256N X256P X256R X256S, X256V X256W X256Y X257C X257F X257I X257K, X257M X257V X258A X258C X258D X258E X258F, X258H, X258I, X258L, X258M, X258P, X258Q, X258R, X258S, X258T, X258V, X258W, X258Y, X259A, X259C, X259E, X259G, X259I, X259L, X259M, X259P, X259Q, X259R, X259S, ?259?, X259V, X260A, X260D, X260E, X260F, X260H, X260I, X260L, X260M, X260N, X260P, X260R, X260S, X260T, X260V, ?260?, X261A, X261C, X261E, X261F, X261G, X261I, X261K, X261L, X261N, X261P, X261Q, X261R, X261S, X261T, X261V, X261W, X261Y, X262A, X262C, X262D, X262F, X262G, X262H, ?262?, X262K, X262L, X262M, X262Q, X262R, X262S, X262T, X262V, X262 , X262Y, X263C, X263F, X263L, X263Y, X264A, X264G, X265A, X265C, X265D, X265F, X265G, X265H, X265K, ?265?, X265Q, X265R, X265S, X265T, X265W, X265Y, X267G, ?267?, X267L, X267M, X267N, X267V, X268A, X268G, X268H, X268L, X268M, X268N, X268P, X268Q, X268S, X268V, X269C, X269D, X269F, X269G, X269H, X269I, X269L, X269M, X269N, X269Q, X269R, X269S, X269T, X269V, X270A, X270C, X270D, X270G, X270I, X270L, X270M, X270N, X270S, X270T, X270V, X271A, X271C, X271E, X271F, X271G, X271H, X271I, X271K, X271L, X271M, X271N, X271P, X271T, X271V, X271Y, X272A, X272C, X272D, X272E, X272F, X272G, X272H, X272K, X272L, ?272?, X272N, X272P, X272R, X272S, X272T, X272 , X272Y, ?273?, X273C, X273D, X273E, X273F, X273G, X273H, X273I , X273L, X273S, X273T, X273V, X274A, X274C, X274D, ?274?, X274G, X274H, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q, X275R, X275V, y X275W, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

8. La variante de subtilisina aislada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la variante tiene un índice de desempeño mayor que 1 en al menos un ensayo seleccionado de un ensayo BMI , un ensayo de micromuestra de yema de huevo, y/o un ensayo de actividad AAPF, y un índice de desempeño mayor que 0.8 para estabilidad LAS y en un ensayo TCA, en donde la variante comprende al menos tres sustituciones seleccionadas de : X001A, X001E, X001G, X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I, X003M, X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I , X017M, X017N, X018A, X018C, X018D, X018E, X018G, X018H, X018L, X018M, X018N, X018P, X018Q, X018S, X018T, X018V, X018Y, X019A, X019C, X019D, X019E, X019F, X019G, X019H, X019K, X019L, X019M, X019N, X019R, X019S, X019V, X019W, X019Y, X020A, X020C, X020D, X020F, X020G, X020I, X020K, X020L, X020M, X020P, X020Q-, X020R X020S, X020T, X020V X020W X020Y X021A, X021C, X021E X021G X021H X021I X021K X021L X021M, X021N, X021P X021Q X021S X021T X021V X021W X022A, X022C, X022G X022I X022L X022M X022N X022P X022Q, X022T, X022V X022W X023A X023G X023S X024A X024C, X024D, X024F X024G X024H X024L X024M X024N X024P, X024Q, X024R X024S X024T X024V X024W X025C X025D, X025E, X025F X025G X025K X025L X025M X025Q X025R, X025S, X025T X025V X025 X026C X026F X026G X026M, X026N, X026R X026S X026T X026V X027A X027C X027D, X027F, X027G X027K X027L X027M X027N X027P X027R, X027S, X027T X027W X028A X028I X028L X028M X028V, X029A, X029C X029G X029S X029V X030A X030C X030L, X030M, X030T X030V X031A X031F X031I X031L X031M, X031S, X031V X033C X033M X033S X033T X035I X035L, X035M, X035P X036A X036E X036S X036T X036V X038C, X038F, X038H X038I X038K X038L X038M X038N X038Q, X038R, X038T X038V X038Y X040A X040D X040E X040I, X040L, X040P X040V X043A X043C X043D X043E X043F, X043G, X043I X043L X043M X043N X043R X043S X043T, X043W, X043Y X044A X044C X044D X044F X044G X044I, X044K, X044L X044M X044N X044Q X044R X044S X044T, X044V, X044Y X045A X045D X045F X045G X045H X045I, X045K, X045L X045M X045N X045P X045Q X045R X045S, X045T, X045V X045 X045Y X046C X046D X046E X046G, X046H, X046I, X046K, X046L, X046M, X046N, X046P X046R X046S X046T X046V X047G X047R X048A X048E X048F X048H X048I X048K X048L X048M X048P X048Q X048R X048S X048T X048V X048Y X049G X049H X049S X049T X050F X050H X050I X050T X050V X050Y X051F X051H X051K X051L X051S X051T X051V X051W X052A X052C X052E X052G X052H X052I X052L X052M X052N X052P X052R X052T X052V X052 X052Y X053A X053C X053E X053G X053H X053K X053L X053M X053Q X053S X053T X053 X053Y X054A X054C X054D X054F X054H X054M X054N X054Q X054S X055C X055G X055H X055K X055L X055P X055Q X055S X055W X056A X056C X056D X056E X056H X056L X056N X056P X056Q X056S X056T X057C X057E X057G X057H X057I X057L X057M X057N X057P X057R X057S X057T X057V X057 X057Y X059A X059G X059I X059L X059M X059N X059Q X059R X059T X059V X059W X061A X061C X061D X061F X061H X061I X061L X061M X061N X061P X061R X061T X061V X061Y X062C X062E X062F X062H X062K X062L X062M X062N X062Q X062R X062S X062V X068I X068L X068V X069A X069G X069S X072I X072L X072T X072V X073A X073C X073S X076N X078A X078C X078E X078H X078L X078M X078Q, X078S, X078T, X084C, X084G, X084I, X084M, X084V, X086C, X086P, X087A, X087C, X087D, X087E, X087G, X087K, X087L, X087N, X087S, X087V, X088A, X088C, X088G, X088S, X089A, X089D, X089E, X089G, X089H, X089I, X089N, X089Q, X089R, X089S, X089T, X089W, X090C, X090I, X090L, X090M, X090Q, X090T, X090V, X091D, X091F, X091I, X091N, X091S, X091V, X091W, X091Y, X092A, X092G, X092P, X092R, X092V, X093A, X093C, X093G, X093L, X093M, X093T, X093V, X094K, X094R, X095A, X095C, X095I, X095S, X095V, X096F, X096I, X096L, X096M, X097A, X097D, X097E, X097F, X097G, X097H, X097K, X097L, X097M, X097N, X097P, X097Q, X097R, X097S, X097T, X097V, X097W, X097Y, X098A, X098C, X098D, X098E, X098F, X098G, X098K, X098L, X098N, X098P, X098Q, X098R, X098S, X098T, X098V, X098Y, X099A, X099C, X099F, X099G, X099K, X099M, X099P, X099Q, X099R, X099S, X099T, X099V, X099Y, X100D, X100E, X100G, X100I , X100K, X100N, X100R, X100S, X100T, X100V, X100Y, X101A, X101C, X101D, X101E, X101F, X101G, X101H, X101I, X101K, X101N, X101P, X101Q, X101R, X101S, X101T, X101V, X101Y, X102A, X102G, X102T, X103A, X103C, X103D, X103F, X103G, X103I, X103L, X103N, X103P, X103Q, X103R, X103S, X103T, X103V, X103 , X104C, X104F, X104H, X104I, X104L, X104R, X104S, X104T, X104V, X104W, X104Y, X105A, X105C, X105D, X105E, X105F, X105G, X105K, X105L, X105N, X105Q, X105R, X105S, X105T, X105V, X106A, X106D, X106E, X106G, X106I, X106L, X106R, X106S, X106T, X106V X106W, X107A, X107C X107F, X107I X107M, X107Q X107S, X107T, X107V X108A X108C X108S, X108T X108V, X109A, X109E X109F X109G X109I, X109K X109L, X109M, X109N X109Q X109R X109T, X109W X109Y, X110A, X110G X111F X111I X111M, X112D X112E, X1121, X112Q X112V X114A, X115C, X115E X115G, X115L, X115M X115P X115Q, X115T, X115W X115Y, X116A, X116C X116D X116F, X116I, X116K X116L, X116M, X116N X116Q X116S, X116V, X116W X117A, X117C, X117N X117Q X117R, X117Y, X118A, X118C XI18D, Xll8E, Xll8F, Xll 8G, X118K, X118N, X118R X118S, X118V, X118W X119A X119F, X119T, X120A X120C, X120E, X120F X120G X120H, X120L, X120M X120N, X120R, X120S X120T X120W, X121C, X121F X121I, X121L, X121M X121S X121T X122A, X122G X122S, X122V, X124G X124L X124T X126F, X126I X126L, X126M, X126V X128A X128F X128I, X128K X128L, X128M, X128N X128Q X128R X128T, X128W X129A, X129E, X129F X129G X129M X129P, X129R X129S, X129Y, X130C X130K X130L X130Q, X130R X130S, X130V, X130W X130Y X131A X131E, X131F X131G, X131K, X131P X131Q X132A X132I, X132N X132Q, X132R, X132S X132T X133A X133K, X133N X133P, X133S, X133T X133V X133Y X134S, X134T X134V, X135L, X135M X135W X136E X137A, X137C X137E X137H X137K X137L X137M, X137R X137S X137W X139C X139I X139V X140D, X140N X141D X141E X141G X141H X141I X141K, X141N X141Q X141R X141S X141V X141Y X142A, X142V X143C X143D X143F X143H X143N X143T, X144C X144D X144G X144H X144I X144L X144M, X144R X144S X144T X144V X144Y X145A X145C, X145F X145K X145L X145N X145Q X145R X146D, X147I X147L X147T X147V X148C X148I X148L, X148N X148V X149C X149I X149L X149V X150A, X150T X150V X151A X151S X152A X152S X156D, X156L X156N X156S X156T X158A X158C X158E, X158H X158K X158L X158M X158Q X158R X158S, X158V X159A X159C X159E X159G X159H X159M, X159S X160A X160C X160D X160F X160I X160L X160N X160Q X160S X160T X160V X160Y X165I X165V X166A X166C X166D X166E X166H X166M, X166T X167F X167Y X170A X170D X170E X170G, X170K X170Q X170R X170S X170V X170Y X171C, X172A X172C X172D X172G X172I X172K X172L, X172P X172Q X172R X172S X172V X172Y X173A, X173D X173H X173M X173N X173Q X173T X174A, X174T X174V X175L X175M X175V X176A X176S, X177V X180T X180V X182A X182D X182E X182Q, X183D X183N X183Q X183S X184D X184N X185A, X185E, X185H X185K X185M X185N X185Q X185T, X186I, X186K X186L X186R X187A X187C X188A, X188E, X188F X188H X188I X188K X188L X188P, X188S, X188T X191A X191D X191Q X191S X194A, X194D, X194E X194F X194H X194I X194L X194M, X194Q, X194R X194S X194T X194W X194Y X195C, X195E, X195G X195Q X198I X198L X199C X199M, X199V, X203C X203E X203T X203V X204A X204C, X204G, X204N X204S X206D X206E X206H X206L, X206Q, X206S X209F X209M X209 X209Y X210A, X210I, X210L X210M X210N X210P X211A X211C, X211G, X211H X211I X211M X211P X211Q X211T, X212C, X212F X212G X212H X212M X212N X212R, X212Y, X213A X213D X213E X213N X213Q X213S, X215A, X215C X215D X215E X215H X215I X215K, X215N, X215S X215T X215V X215Y X216A X216C, X216E, X216F X216H X216I X216L X216M X216N, X216S, X216V X216W X216Y X217A X217C X217D, X217F, X217K X217L X217M X217Q X218C X218D, X218N, X218Q X222C X222M X222S X223A X223S, X224N, X224S X224T X227A X227C X227V X228A, X228S, X228V X230A X230G X230N X230S X230T, X231A, X231C X231F X231G X231S X232A X232L, X233A, X233C X233E X233G X233I X233L X233N, X233S, X233T X233V X234L X234M X234N X234Q( X234T, X234V X235C X235F, X235G X235H, X235I, X235K, X235L, X235M X235N X235Q, X235R X235S, X235V, X235W, X235Y, X236A X236C X236E, X236F X236H, X236N, X236Q, X236S, X236T X236Y X237A, X237C X237F, X237G, X237H, X237I, X237K X237L X237M, X237Q X237R, X237S, X237T, X237V, X237W X237Y X238C, X238D X238E, X238F, X238G, X238H, X238I X238K X238L, X238M X238N, X238Q, X238R, X238S, X238T X238V X238Y, X239C X239D, X239F, X239G, X239H, X239K X239L X239M, X239N X239P, X239Q, X239R, X239S, X239T X239V X239W, X239Y X240A, X240C, X240E, X240F, X240I X240K X240M, X240N X240Q, X240R, X240S, X240T, X240W X240Y X241A, X241C X241D, X241E, X241F, X241G, X241H X241I X241 , X241L X241M, X241N, X241Q, X241R, X241S X241T X241V, X241 X241Y, X242A, X242C, X242D, X242G X242H X242I, X242L X242M, X242P, X242Q, X242S, X242T X242V X243C, X243D X243E, X243F, X243G, X243H, X243I X243L X243 , X243N X243P, X243Q, X243S, X243T, X243V X243W X244D, X244E X244F, X244H, X244I, X244L, X244M X244N X244Q, X244S X244T, X244V, X244W, X245A, X245C X245E X245G, X245H X245K, X245L, X245P, X245Q, X245S X245V X245W, X245Y X246A, X246C, X246I, X246L, X246M X246T X246V, X247A X247C, X247F, X247G, X247H, X247K X247L X247M, X247N X247R, X247S, X247T, X247V, X247W X247Y X248C, X248D X248E, X248G, X248H, X248I, X248L X248N X248P, X248R X248S, X248T, X248V, X248Y X249A X249D X249E, X249F, X249G, X249H X249K X249L X249M X249 X249Q X249S X249T X249Y X250C X250I X250L X250M X250V X251A X251E X251F X251G X251K X251L X251M X251Q X251T X251V X251Y X252A X252C X252D X252F X252H X252I X252K X252L X252M X252N X252R X252V X252W X253A X253E X253H X253M X253S X253W X255A X255C X255D X255E X255I X255L X255Q X255T X255V X255Y X256A X256C X256D X256G X256H X256I X256 X256L X256M X256N X256S X256V X256W X256Y X258D X258G X259A X259E X259P X259Q X259S X260A X260D X260E X260I X260N X26ÓP X260S X260T X260V X261A X261E X261F X261I X261K X261L X261N X261P X261S X261T X261V X261 X261Y X262A X262C X262F X262H X262I X262L X262M X262Q X262T X262Y X265A X265D X265S X267I X267L X268A X268V X269D X269H X269N X269Q X269S X270A X270G X270I X270L X270N X270S X270T X270V X271E X272A X272C X272D X272E X272F X272G X272L X272M X272N X272P X272S X272T X272 X273A X273C X273G X273S, X274A, X274C, X274G X274M X274N X274S X274T, X275D, X275E, X275F X275K X275L, X275M, X275P, X275Q, y X275R, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

9. La variante de subtilisina de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante de subtilisina comprende una sustitución adicional en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de: 18, 52, 72, 117, 119, 127, 144, 185, 209 y 213, y en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO : 1.

10. La variante de subtilisina aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque la variante de subtilisina es una variante GG36.

11. La variante de subtilisina aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante de subtilisina aislada comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de: S87N/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87D/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248R, S87N/Q109R/G118V/S123L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D, y S87N/Q109Q/G118V/S128LP129Q/S130A/S188R/T213E/N248R, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

12. La variante de subtilisina aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de: S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, y S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BP ' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

13. La variante de subtilisina aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de: S87D/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, S87N/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87D/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D, y S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

14. La variante de subtilisina aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de: A001C/S024V/I107L, A001I/R045T/I107R/A172T, A001K/A172L, A001K/A172W, A001K/I072C/L126F, A001K/I072C/L126F/S164Q, A001K/I072C/V104I/L126F, A001K/I072C/V104I/L126F/S164Q, A001K/I072V, A001K/I072V/L126F, A001K/I072V/L126F/S164F, A001K/I072V/V104I, A001K/I072V/V104I/L126F/S164I , A001K/I072V/V104I/S164F, A001K/I072V/V104I/S164Q, A001K/I107T/A172Q, A001K/I107V/G127Q, A001K/I107V/G127Q/A172Q, A001K/I107V/G127R/A172Q, A001K/L126F, A001K/L126F/S164F, A001K/L126F/S164I , A001K/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072C, A001K/R045F/I072C/L126F, A001K/R045F/I072C/V104I/S164F, A001K/R045F/I072V/L126F/S164I, A001K/R045F/I072V/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072V/S164F, A001K/R045F/I072V/V104G/S164T, A001K/R045F/I107L/A172N, A001K/R045F/I107T, A001K/R045F/I107V/G127Q, A001K/R045F/L126F/S164F, A001K/R045F/L126F/S164I, A001K/R045F/S164F, A001K/R045F/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072C/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/L126F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/S164F, A001K/R045K/I072V/S164Q, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I107A/A172T, A001K/R045K/I107R/G127A/A172N, A001K/R045K/I107T/G127R, A001K/R045K/I107T/G127R/A172Q, A001K/R045K/L126F, A001K/R045K/L126F/S164I, A001K/R045K/L126F/S164P, A001K/R045 /L126F/S164Q, A001K/R045K/S164F, A001K/R045K/V104I/S164Q, A001K/R045K/V104L/S164A, A001K/R045N/I107T/G127Q, A001K/R045S/V104C/L126Y/S164F, A001K/S024H/I107T/G127Q, A001K/S024H/I107T/G127R, A001K/S024H/I107V, A001K/S024H/R045N/I107T, A001K/S024H/R045N/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024L/R045A, A001K/S024N/I107V/G127T, A001K/S024N/R045K/A172Y, A001K/S024R/I107T, A001K/S024R/R045N/A172C, A001K/S024R/R045N/I107T, A001K/S024R/R045N/I107T/G127R, A001K/S024T/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024T/R045N/G127Q/A172Q, A001K/S024 /I107T/G127R, A001K/S024W/I107V/G127T/A172Q, A001K/S164Q, A001K/V104E, A001K/V104I/L126F, A001K/V104I/L126F/S164I, A001K/V10 I/L126F/S164Q, A001L/I072C, A001L/R045Q/G127H/A172R, A001L/S024D/R045Y/I107Y, A001M/R045S/I107E/A172D, A001P/A172V, A001Q/R045K/I107T, A001R/A172G, A001R/A172Q, A001R/I107T, A001R/I107T/A172Q, A001R/I107T/G127Q/A172Q, A001R/I107V/A172Q, A001R/R045F, A001R/R045K/A172Q, A001R/R045K/G127R, A001R/R045K/I107T/G127Q, A001R/R045K/I107V/G127R, A001R/R045N/A172K, A001R/R045N/A172Q, A001R/R045N/I107T, A001R/R045N/I107T/G127Q, A001R/R045N/I107V/A172V, A001R/R045N/I107V/G127Q/A172Q, A001R/R045N/I107V/G127R, A001R/S024H/I107T, A001R/S024H/R045K/I107T, A001R/S024H/R045K/I107T/A172Q, A001R/S024H/R045N/I107T/A172Q, A001R/S024N, A001R/S024R, A001R/S024R/A172H, A001R/S024R/A172Q, A001R/S024R/I107V/A172L, A001R/S024R/I107V/G127R, A001R/S024R/R045F/I107T/G127Q, A001R/S024R/R045F/I107T/G127R, A001R/S024R/R045K/I107T/G127Q, A001R/S024T/I107T/A172Q, A001R/S024T/R045K/A172Q, A001R/S024T/R045K/I107L/G127P/A172P, A001R/S024T/R045N/I107T/A172Q, A001R/S024W/I107V/A172S, A001R/S024W/R045F/I107V/G127Q, A001R/S024W/R045F/I107V/G127R, A001R/S024W/R045K, A001R/S024W/R045K/I107T/A172Q, A001R/S024 /R045N/I107T, A001S/A172V, A001S/S024L/I107Y/A172S, A001T/S024H/I107L/A172Y, A001V/I107L/A172I, G097P/N185Q/A215I , G097P/Y209 /A215V/S256 , G118L/G127R/S132L, G118T/G127Q, I107A/G127K/A172G, I107C/A172S, I107P/A172S, I107Q/A172D, L126A/S164N, L126F/S164V, M119F/N185R, M119F/N185R/Y209W/S256T, M119F/N185V/Y209 , M119F/S144T/N185V/S256I, M119F/S144W/N185R/S256L, M119F/Y209 , M119F/Y209W/S256I , N018K/A215I, N018K/A215R, N018K/A215V, N018K/G097P/A215I/S256W, N018K/G097P/N185K/S256 , N018K/G097P/N185K/Y209W/A215I/S256W, N018K/G097P/N185Q/Y209W/A215V/S256W, N018K/G097P/N185R/A215R/S256 , N018K/G097P/N185R/A215V/S256W, N018K/G097P/N185R/S256 , N018K/G097P/N185R/Y209W, N018K/G097P/N185R/Y209 /S256 , N018K/G097P/Y209 /A215V/S256W, N018K/N185K, N018K/N185K/A215V/S256W, N018K/N185K/S256W, N018K/N185K/Y209W/A215R, N018K/N185Q/A215R/S256W, N018K/N185Q/A215V/S256 , N018K/N185Q/S256 , N018K/N185Q/Y209 /S256 , N018K/N185R/A215I/S256W, N018K/N185R/A215R/S256W, N018K/N185R/A215V, N018K/N185R/Y209 /A215V/S256 , N018K/S256W, N018Q/G097P/N185K/A215V, N018Q/G097P/N185K/Y209W, N018Q/N185K, N018Q/N185K/S256W, N018Q/N185K/Y209 /A215I/S256 , N018Q/N185K/Y209W/A215V, N018Q/N185K/Y209 /A215V/S256W, N018Q/N185Q/A215V, N018Q/N185Q/S256 , N018Q/N185Q/Y209 /S256W, N018Q/N185R/A215R, N018Q/N185R/S256W, N018R/G097P/N185Q/A215I , N018R/G097P/Y209W/A215V, N018R/G097P/Y209W/S256W, N018R/N185K/A215V/S256 , N018R/N185K/S256W, N018R/N185Q/A215V/S256W, N018R/N185Q/Y209W/S256W, N018R/N185R/A215R, N018R/N185R/S256 , N018R/N185R/Y209W/S256 , N018R/Y209W/A215V/S256 , N018R/Y209W/S256 , N043E/S101E, N043E/S101E/N248K, N043E/S101F, N043E/S101N/N117Y, N043E/S101V, N043E/S101Y/N117I/N248K, N043E/S101Y/N117Y/N248K, N043F/N117I, N043F/S101E/N117I/N248K, N043F/S101R, N043I/N117Y, N043I/S101E/N248I , N043I/S101F/N117Y/N248K, N043I/S101N/N117Y/N248K, N043I/S101R/N248K, N043I/S101Y/N117I/N248I, N043I/S101Y/N117Y/N248K, N043S/N117Y/N248K, N043S/N248I, N043S/S101E, N043S/S101E/N117I/N248I, N043S/S101E/N117Y/N248K, N043S/S101E/N248K, N043S/S101F, N043S/S101F/N248K, N043S/S101N/N117I, N043S/S101R/N117I/N248K, N043S/S101V/N117I/N248I, N043S/S101Y, N043S/S101Y/N117I , N043S/S101Y/N117Y, N043S/S101Y/N248K, N043V/N117Y/N248I , N043V/N248I, N043V/N248K, N043V/S101E/N117I/N248K, N043V/S101E/N248I, N043V/S101F, N043V/S101F/N117I , N043V/S101F/N117Y, N043V/S101F/N248K, N043V/S101R/N117I/N248K, N043V/S101T/N248K, N043V/S101V/N117I, N043V/S101V/N248K, N043V/S101Y, N043V/S101Y/N117I, N043V/S101Y/N117I/N248K, N185K/A215V, N185K/Y209W/S256W, N185Q/A215R/S256 , N185Q/S256W, N185R/S256 , N185R/Y209W/A215I , N185R/Y209W/S256W, N185V/Y209W, P052I/M119F, P052I/M119F/S144T/N185R/Y209 , P052I/M119F/S144V/Y209W, P052I/M119F/S144Y/N185R, P052I/M119F/S144Y/N185R/Y209W/S256I, P052I/M119F/Y209W/S256I , P052I/N185R/Y209W/S256I, ?052 I/N185V/Y209W, P052I/N185V/Y209W/S256I, P052I/S144T, P052I/S144T/N185R/Y209W/S256T, P052I/S144T/N185V/Y209W/S256T, P052I/S144T/S256I, P052I/S144T/Y209 /S256I , P052I/S144T/Y209W/S256T, ?052 I/S144V/Y209W, P052I/S144Y/N185R/Y209W, P052I/S144Y/N185V, P052I/S144Y/N185V/S256T, P052I/S144Y/S256T, P052I/S144Y/Y209W/S256I, P052V/M119F/N185V/Y209W/S256I , P052V/M119F/S144T, P052V/M119F/S144T/N185R/S256T, P052V/M119F/S144T/N185R/Y209 , P052V/M119F/S144T/S256T, P052V/ 119F/S144T/Y209W, P052V/M119F/S144V/N185V/S256I , P052V/N185V/Y209W/S256I, P052V/S144T, P052V/S144T/N185V/Y209 /S256I, P052V/S144T/N185V/Y209W/S256T, P052V/S144T/Y209W/S256I, P052V/S144V/N185R/Y209 /S256T, P052V/S144V/N185V/Y209W, P052V/S 144V/Y209W/S256I , P052V/S 144W/N185R, P052V/S 144W/N185V/Y209W, P052V/S144W/Y209W, P052V/S144Y/S256T, P052V/S144Y/Y209W, P052V/S256T, Q109A/G118S, Q109D/G118V/G127H, Q109H/G118S/S132P, Q109H/G127R, Q109I/G118R, Q109I/G118S, Q109I/G127C, Q109I/G127T/S132Y, Q109I/S132N, Q109K/G118F/G127Q/S132N, Q109L/G118L/G127Q/S132N, Q109P/G118Q, Q109R/G118V, Q109S/G118R, Q109T/G118N, Q109V/G118F, Q109V/G127Q, Q109V/G127R, Q109V/G127R/S132N, Q109V/G127R/S132Y, R045F/I072V/L126F/S164Q, R045F/I107T, R045K/I072C/V104I/L126F/S164F, R045K/I107T, R045K/L126F/S164F, R045L/I072S/S164I , R045N/I107A/A172R, R045N/I107T/A172Q, R045N/I107V/A172Q, R045S/I107L, R045V/I107R/A172D, S024A/G118I, S024A/Q109Y/G118C, S024C/Q109K/G118I, S024G/G118F/G127R/S132N, S024H/G118K/G127I, S024H/G118L/G127T/S132Y, S024H/G127R, S024H/I107K, S024H/Q109L, S024H/Q109T/G118R, S024H/Q109V/G127R/S132N, S024H/Q109V/G127T, S024H/S099K/G118F/G127R, S024H/S099K/G118R/G127R/S132H, S024H/S099K/S103P, S024H/S099K/S103P/G118F, S024H/S099K/S103R/G118A/S132P, S024H/S099Q/G118R/G127Q/S132H, S024H/S099Q/G118R/S132H, S024H/S099Q/S103N/G118R/G127T/S132N, S024H/S099Q/S103N/G118T/S132H, S024H/S099Q/S103P, S024H/S099Q/S103P/G118R/S132H, 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S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /Q109I , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /Q109L, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/Q109R/G127Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /Q109T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/Q109V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/R045F/I107V/A172Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024 /S099K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099K/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099K/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099Q/S103N/G127R/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099Q/S103N/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099Q/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099Q/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099Q/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/G127R/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/S103N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/S103N/G127R/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/S103N/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/S103P/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S024W/S099T/S132N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099K/S103N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099K/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099K/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q/S103N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q/S103P/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099Q/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/G127Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/S103N, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/S103N/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/S103P/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S099T/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101E, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101E/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101F/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101N/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101R/N248K, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S103N/S132H, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S103P, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R/Y209 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185R/Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185V/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/Y209W/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185R/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185R/Y209 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V/S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V/Y209 , S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/Y209 /S256I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/Y209W/S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144 /Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R/Y209 /S256T, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185V/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164F, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/A215I/S256W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/S256W, S099H/S103I/G118N, S099K/G118R, S099K/S103N/G118T, S099K/S103P/G118L/S132N, S099K/S103P/G127Q, S099K/S103P/S132H, S099K/S103R/G118A/S132P, S099N/S132R, S099Q/G118F/G127R, S099Q/G118T/G127Q, S099Q/S103N/G118R/S132N, S099Q/S103N/G118T, S099Q/S103N/G118T/S132H, S099Q/S103N/S132H, S099Q/S103P/G118R, S099Q/S103P/G118R/S132N, S099Q/S103P/S132H, S099Q/S132R, S099T/G118F, S099T/G118R/S132H, S099T/G118T/S132H, S099T/G118T/S132N, S099T/S103P, S099T/S103P/G118L/S132H, S101E/N117I, S101E/N117Y/N248K, S101F/N117I/N248I , S101F/N117Y/N248I, S101F/N117Y/N248K, S101F/N248K, S101R/N117I/N248K, S101R/N117Y, S101R/N248K, S101T/N117Y/N248K, S101T/N248I, S101V/N248K, S101Y/N117I/N248K, S101Y/N117Y, S101Y/N248K, S103G/G118I/G127E/S132E, S103L/S132E, S103R/S132P, S144T/N185R, S144T/N185R/Y209 /S256I, S144T/N185R/Y209W/S256T, S144T/N185V, S144V/N185R/S256I , S144V/N185R/Y209 , S144V/N185R/Y209W/S256T, S144V/S256I, S144V/Y209W, S144W/N185R/Y209W/S256T, S144 /N185V/Y209 /S256I, S144W/S256I, S144Y/Y209W/S256I , V104E/L126I/S164L, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

15. La variante de subtilisina aislada de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante comprende una combinación de sustituciones seleccionadas de: TS87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109R/N185R/A215 R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109L/N185R/A215 R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101K/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109R/N185R/A215 R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/T72V/S164I/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N43S/P52V/S101R/Q109R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109R/S164I , S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/N76D/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/V118R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101M, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/N76D/G97P/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109L/S164I , S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101V/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101V/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109L/S1641, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101H/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101H/S164I , S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109L/N185R/A215 R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101M/S188D/N248R, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/N248K, S87N/G118V/G127S/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101H/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101K/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101V/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101Y/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101L/G118V/S128L/P129Q/S130A, I72V/S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A//S164I, en donde las posiciones se numeran por correspondencia con la secuencia de aminoácido . de subtilisina BPN' B. amyloliquefaciens establecida como la SEQ ID NO: 1.

16. Un ácido nucleico aislado caracterizado porque codifica la variante de subtilisina establecida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

17. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 16.

18. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 17.

19. Una composición de limpieza caracterizada porque comprende la variante de subtilisina establecida de conformidad con las reivindicaciones 1-15.

20. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la composición comprende un detergente líquido, en gel, en polvo y/o en gránulo .

21. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 19 y/o 20, caracterizada porque la composición de limpieza se selecciona de detergentes de lavandería y de detergentes para platos.

22. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque comprende un detergente de lavandería.

23. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el detergente de lavandería es un detergente de trabajo pesado.

24. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque comprende un detergente para platos seleccionado de detergentes de lavaplatos automático y lavado a mano.

25. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-24, caracterizada porque comprende además al menos un agente blanqueador.

26. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-25, caracterizada porque la composición de limpieza es un detergente que contiene fosfato o está libre de fosfato.

27. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-26, caracterizada porque la composición de limpieza es un detergente de agua fría .

28. La composición de limpieza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-27, caracterizada porque comprende además al menos una enzima adicional.

29. La composición de limpieza de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque al menos un enzima adicional se selecciona de hemicelulasas, celulasas, peroxidasas, proteasas, metaloproteasas , xilanasas, lipasas, fosfolipasas , esterasas, perhidrolasas , cutinasas, pectinasas, pectato liasas, mananasas, queratinasas , reductasas, oxidasas, fenoloxidasas , lipoxigenasas , ligninasas, pululanasas, tanasas, pentosanasas , malanasas, ß-glucanasas, arabinosidasas , hialuronidasa, condroitinasa, lacasa, y amilasas, o mezclas de los mismos.

30. Un método para limpieza caracterizado porque comprende proporcionar un artículo que va a limpiarse y una composición que comprende la composición de limpieza establecida de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-29, y poner en contacto el artículo con la composición, bajo condiciones efectivas para proporcionar limpieza del artículo.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque comprende además la etapa de enjuagar el artículo después de poner en contacto el artículo con la composición de limpieza.

32. El método de conformidad con las reivindicaciones 30 y/o 31, caracterizado porque el artículo que va a limpiarse comprende lavaplatos.

33. El método de conformidad con la reivindicación 30 y/o 31, caracterizado porque el artículo que va a limpiarse comprende tela.