DE19736591A1

DE19736591A1 - Verfahren zum Herstellen von Nukleinsäurepolymeren

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Publication number: DE19736591A1
Application number: DE19736591A
Authority: DE
Inventors: Peter Prof Dr Hegemann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-08-22
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 1999-02-25
Also published as: US6472184B1; WO1999010358A3; EP1005574A2; WO1999010358A2; DE29823795U1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Nukleinsäurenpolymeren.

Der zunehmende Einsatz rekombinanter Gene in der Gen- und Biotechnologie sowie der medizinischen Analytik hat einen großen Bedarf an Verfahren zur "de novo"-Synthese von langen Nukleinsäureketten ausgelöst. Die synthetische Herstellung beliebig gewähl ter Nukleinsäuresequenzen kann in vielen Fällen eine zeitsparende Alternative für auf wendige Klonierungs- und Modifizierungsverfahren sein. Eine routinemäßige Synthese langer Nukleinsäureketten kann ebenfalls entscheidende Vorteile beim "drug-design" bieten, z. B. bei der Herstellung von "maßgeschneiderten" Antikörpern, Inhibitor/Aktiva tormolekülen, Ribozymen oder in der DNA-Chip-Technologie. Desweiteren könnten auf diese Weise gezielt modifizierte Nukleotide, z. B. markiert durch (Fluoreszenz)Farbstoffe oder Enzyme, in eine Nukleinsäurekette eingebaut werden. Neben den hier aufgeführten Beispielen ergeben sich noch eine Vielzahl weiterer Anwendungsmöglichkeiten für ge zielt hergestellte Nukleinsäurepolymere.

Bei der einfachsten Variante der herkömmlichen Gensynthese, der direkten Klonierung, werden zwei lange, einander vollständig komplementäre Oligonukleotide miteinander hybridisiert. Auf Grund der derzeitigen technischen Limitierung bei der Herstellung der Oligonukleotide auf eine Länge von 150-200 Basen ist auch die Größe der resultieren den Hybridisierungsprodukte auf diesen Längenbereich beschränkt.

Ein weiteres Verfahren zum Herstellen langer Nukleinsäurepolymere ist die sogenannte Fill-in-Methode, bei der zwei einzelsträngige Nukleinsäureketten miteinander hybridisiert werden, wobei überhängende Enden mit Hilfe von DNA-Polymerasen aufgefüllt werden, so daß das doppelsträngige Produkt länger als die eingesetzten Oligonukleotide ist. Aber auch mit der Fill-in-Methode kann kein Produkt erzeugt werden, das länger als die Sum me der beiden eingesetzten Nukleinsäureketten ist.

Bei der "Shot Gun-Gensynthese" werden komplementäre, einzelsträngige Oligonukleoti de zusammen mit einem durch Restriktionsenzyme geöffneten Expressionsvektor direkt in Zellen transfiziert, wobei ein zirkularisiertes Produkt nur entstehen kann, wenn alle Teilsequenzen durch die Enzymmaschinerie des Wirtsorganismus in geeigneter Weise ligiert werden. Die Effizienz der erfolgreichen Ligationen bei dieser Methode ist i.a. sehr gering, insbesondere wenn viele Oligonukleotide für die Gensynthese eingesetzt werden.

1972 entwickelte Khorana ein nach ihm benanntes Verfahren, bei dem mehrere che misch synthetisierte Oligonukleotide von durchschnittlich 15 Nukleotiden Länge, die sich in geeigneter Anordnung lückenlos überlappen, enzymatisch durch Polynukleotidligase zu einem Doppelstrang verbunden wurden (Khorana, H.G. et al., J. Mol. Biol. 27, 209-17, 1972, und Folgeveröffentlichungen; Khorana, H.G et al., J. Biol. Chem. 251, 3 (10), 565-70, 1976 und Folgeveröffentlichungen). Durch sequenzielles Ligieren von wenigen (4-8) Oligonukleotiden zu längeren Zwischenprodukten, Aufreinigen der Zwischenpro dukte und anschließendes Ligieren der Zwischenprodukte miteinander wurden doppel strängige Nukleinsäureketten mit einer Länge von 514 Basenpaaren (Edge, M.D. et al., Nature 292, 756-62, 1981), später bis ca. 1000 bp synthetisiert, die anschließend in bakterielle Expressionsvektoren kloniert werden konnten.

Mit diesen Verfahren sind mehrere entscheidende Nachteile verbunden:

1) Nach jedem Ligationsschritt mußten die Produkte bzw. Zwischenprodukte durch Auftrennung auf einem Polyacrylamid-Gel (PAA-Gel) von unerwünschten Neben produkten der Ligationsreaktion gereinigt werden. Dieser zeitintensive Arbeits schritt ist mit einem hohen personellen und finanziellen Aufwand verbunden.
2) Bei der Elution der Zwischen- und Endprodukt aus dem PAA-Gel mußten beträchtliche Ausbeuteverluste in Kauf genommen werden.
3) Das bisher längste Produkt, das mit Hilfe dieser Technik hergestellt werden konnte, hatte eine Länge von ca. 1000 Basenpaaren. Da die meisten eu- und prokaryotischen Gene eine kodierende Sequenz von durchschnittlich 300-3000 Basenpaaren haben, ist diese Länge für die meisten Anwendungen ungenügend.
4) Für die benötigte Aufreinigung über PAA-Gele wurden die Nukleotide bei dem von Khorana beschriebenen Verfahren üblicherweise radioaktiv markiert, um die Ban de des gewünschten Produktes im Gel identifizieren zu können. Die Verwendung hoch radioaktiver ³²P-Marker stellt ein Gefährdungspotential dar, das bei diesem Verfahren nicht vermieden werden konnte.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein unkompliziertes, zuverlässi ges und preiswertes Verfahren für die Synthese von Nukleinsäurepolymeren mit einer Länge von mehr als 1000 Basen in einem Schritt bereitzustellen, bei dem die oben auf geführten Nachteile überwunden werden können.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsäurepoly mers, umfassend

a) das Bereitstellen von 2 oder mehr verknüpfbaren Oligonukleotiden, die bei kon tinuierlicher Anordnung und nach Verknüpfen einen Primärstrang bilden können, und einem oder mehreren nicht verknüpfbaren Oligonukleotiden, wobei jedes der nicht verknüpfbaren Oliognukleotide zwei aneinandergrenzende Bereiche umfaßt, deren erster dem 3'-Ende eines verknüpfbaren Oligonukleotids kom plementär ist und deren zweiter dem 5'-Ende eines weiteren verknüpfbaren Oli gonukleotids komplementär ist,
b) das Hybridisieren von Oligonukleotiden für den Primärstrang mit den komple mentären Bereichen der nicht verknüpfbaren Oligonukleotide und
c) das Verknüpfen der Oligonukleotide des Primärstranges.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist in den Abb. 1 und 2 schematisch dargestellt. Es bietet im Unterschied zum Khorana-Verfahren den entscheidenden Vorteil, daß die Synthese eines einzelsträngigen Nukleinsäurepolymers in einem einzigen Reaktionsan satz durchgeführt werden kann. Dabei werden alle zur Synthese des Primärstrangs be nötigten verknüpfbaren und nicht verknüpfbare-n Oligonukleotide gleichzeitig eingesetzt; durch Zugeben eines Verknüpfungsmittels entsteht ein Primärstrang kovalent verknüpf ter Oligonukleotide, der eine Länge von mehr als 1000, z. B. 1500 Basen erreichen kann.

In bevorzugten Ausführungsformen werden die Schritte (b) und (c) mehrfach wiederholt, wobei vor jeder Wiederholung dieser beiden Schritte die zuvor miteinander hybridisierten Oligonukleotide voneinander getrennt werden, d. h. der durch die Hybridisierung zuvor gebildete Doppelstrang denaturiert wird. Die Denaturierung kann durch Temperaturer höhung oder Erhöhung des pH-Wertes auf dem Fachmann bekannte Weise durchge führt werden. Das mehrfache Denaturieren und Renaturieren mit anschließendem Ver knüpfen führt zu einer erheblichen Verbesserung der Ausbeute an Primärstrang, die sonst z. B. durch Kettenabbrüche, die eine Folge des Einbaus unvollständig phosphory lierter Primärstrangoligonukleotide sind, beeinträchtigt wird. Der Einfluß solcher Ketten abbrüche auf die Gesamtausbeute wird durch die Wiederholung der Schritte (b) und (c) minimiert.

Die Schritte (b) und (c) werden erfindungsgemäß nicht nur 1 Mal, sondern mehrfach durchgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden sie 1 bis 8 Mal, besonders bevorzugt 3 bis 5 Mal wiederholt.

Die Anzahl der eingesetzten Oligonukleotide kann zwischen 2 verknüpfbaren Oligonu kleotiden und 150 verknüpfbaren Oligonukleotiden schwanken. Die Anzahl der nicht ver knüpfbaren Oligonukleotide ist jeweils gleich der Anzahl der verknüpfbaren Oligonukleo tide, um eines höher oder um eines niedriger, mindestens also eins. Bevorzugt werden zwischen 5 und 100, besonders bevorzugt 10 und 50 verknüpfbare Oligonukleotide ein gesetzt.

Das Verknüpfen der verknüpfbaren Oligonukleotide des Primärstranges kann verschie dene Reaktionen umfassen. Unter Verknüpfen wird hier z. B. eine Reaktion enzymati scher, chemischer oder auch photochemischer Natur verstanden. So wird im Fall der enzymatischen Verknüpfung (Ligation) als Verknüpfungsmittel z. B. T4-DNA-Ligase ver wendet. In der bevorzugten Ausführungsform wird eine thermostabile Ligase, z. B. Pfu- Ligase (Stratagene), eingesetzt, die den Vorteil bietet, daß bei wiederholten Zyklen des Denaturierens durch Temperaturerhöhung, des Hybridisierens und Ligierens der Oligo nukleotide kein neues Enzym zugesetzt werden muß, während dies bei Verwendung thermolabiler DNA-Ligasen, wie z. B. T4-DNA-Ligase, der Fall ist.

Desweiteren gestattet die Verwendung dieser thermostabilen Ligase, die Schritte des Hybridisierens und des Ligierens der Oligonukleotide bei hohen Temperaturen von 45° bis 80°C, bevorzugt 70°C, durchzuführen. Diese stringenten Temperaturbedingungen bedeuten, daß der Schritt des Hybridisierens der Oligonukleotide in komplementärer An ordnung mit hoher Spezifität erfolgt und im Vergleich zum Khorana-Verfahren erheblich weniger Nebenprodukte anfallen. Ligationen mit herkömmlicher Ligase werden üblicher weise in einem Temperaturbereich von 40°C bis 4°C durchgeführt und können daher zu einem höheren Anteil unspezifischer Hybridisierungen durch Fehlpaarung oder Sekun därstrukturen führen.

Eine chemische Verknüpfung der Oligonukleotide, die von Goeddel und Kollegen be schrieben worden ist (Goeddel, D.V. et al., PNAS 76, 1979), ist ebenfalls möglich.

Eine weitere Möglichkeit, Oligonukleotide miteinander verknüpfen, bietet die photoche mische Verknüpfung. Dabei müssen die zu verknüpfenden Oligonukleotide an den end ständigen Nukleotiden mit photosensitiven Molekülen markiert sein, die Kohlenstoff- Kohlenstoff-Doppelbindungen enthalten und einer (2+2) Photocyclodimerisation unterlie gen können, wie z. B. Stilben-, Allen-, Mono-, Di- und Triendicarbonsäurederivate oder Styrolderivate.

Erfindungsgemäß dienen die nicht verknüpfbaren Oligonukleotide lediglich als Matrize zur Bildung des Nukleinsäurepolymers. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die se Oligonukleotide an ihrem 5'-Ende nicht phosphoryliert. Dadurch ist eine enzymatische Verknüpfung dieser Oligonukleotide, die nur für die Anlagerung der verknüpfbaren Oli gonukleotide in der gewünschten Anordnung verantwortlich sind, nicht möglich.

Es können ebenfalls nicht verknüpfbare Oligonukleotide eingesetzt werden, bei denen z. B. das 3'-Ende ein Didesoxynukleotid oder ein Thionukleotid ist. Entsprechende Modi fizierungen sind auch am 5'-Ende möglich. Weiterhin kann das Verfahren mit nicht ver knüpfbaren Oligonukleotiden, die am 3'-Ende phosphoryliert sind, durchgeführt werden. Diese Modifikation verhindert ebenfalls die enzymatische Verknüpfung der Oligonukleo tide. Sofern das erfindungsgemäße Verfahren nicht mittels enzymatischer Ligation, son dern chemischer oder photochemischer Verknüpfung durchgeführt wird, müssen die nicht verknüpfbaren Oligonukleotide dementsprechend so konzipiert sein, daß sie unter den zur Verknüpfung der den Primärstrang bildenden Oligonukleotide gewählten Bedin gungen keine kovalente Bindung zum jeweils benachbarten nicht verknüpfbaren Oligo nukleotid bilden können.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Oligonukleotide können eine Länge von 30 bis 1500 Nukleotiden haben. Die Länge des jeweils gewählten Nukleotides ist von mehreren Faktoren einschließlich der Wahrscheinlichkeit der Ausbildung von Se kundärstrukturen und der Reinheit der gewählten Ausgangsmaterialien abhängig. Es ist jedoch bevorzugt, daß die Oligonukleotide des Primärstranges eine Länge von 30 bis 200, besonders bevorzugt von 30 bis 100 oder 30 bis 60 Nukleotiden haben.

Bei der Synthese bereits erzeugte einzelsträngige Nukleinsäurepolymere können in ei nem weiteren Schritt wiederum mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in einzelsträngi ge Nukleinsäurepolymere von mehreren Kilobasen Länge zusammengeführt werden (Abb. 3). Dazu wird das Verfahren so, wie oben ausgeführt, durchgeführt, wobei als ver knüpfbare Oligonukleotide für den Primärstrang Nukleinsäurepolymere von beispielswei se 1500 Basen eingesetztwerden können.

Die nicht verknüpfbaren Oligonukleotide, die die korrekte Anordnung der Oligonukleotide des Primärstranges nebeneinander gewährleisten sollen, sind gegebenenfalls nur 30 bis 50 Nukleotide lang. Diese Größenordnung erlaubt die Hybridisierung mit zwei benach bart anzuordnenden Oligonukleotiden des Primärstranges. Es besteht keine Notwendig keit, den ganzen Primärstrang abdeckende nicht verknüpfbare Oligonukleotide zur Ver fügung zu stellen. Selbstverständlich ist jedoch die Verwendung von nicht verknüpfbaren Oligonukleotiden mit bis zu 300 Nukleotiden oder mehr ebenfalls möglich und kann, wo z. B. im Primärstrang ansonsten starke Sekundärstrukturen ausgebildet werden würden, durchaus sinnvoll sein.

Jedes der nicht verknüpfbaren Oligonukleotide enthält zwei aneinandergrenzende Berei che, die Komplementarität mit dem 3'- bzw. 5'-Ende zweier benachbarter Oligonukleotide für den Primärstrang aufweisen. Die Bereiche der Komplementarität zwischen den ver knüpfbaren Oligonukleotiden für den Primärstrang und den nicht verknüpfbaren Oligo nukleotiden des Gegenstranges sind jeweils ca. 15 bis 30 Basenpaare lang, bevorzugt 20 bis 25 bp (s. Abb. 2).

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens besteht darin, in einer vorgeschalteten Reaktion die endständigen Oligonukleotide für den Primärstrang und/oder zu den end ständigen Oligonukleotiden des Primärstranges ganz oder teilweise komplementäre Oli gonukleotide an die Enden eines linearisierten Vektors anzulagern, sie mit dem Vektor zu verknüpfen und nachfolgend das Verfahren gemäß Anspruch 1 durchzuführen. Die Vek torenden sind dabei bevorzugt kohäsiv. Dieses Verfahren führt zu einem zirkularisierten Produkt, das direkt in einen geeigneten Wirtsorganismus, z. B. Bakterien, Säuger- oder Insektenzellen, transfiziert werden kann. Unter "Transfektion" sind in diesem Fall ver schiedene Techniken, wie z. B. Elektroporation, Mikroinjektion, Infektion, Transfektion unterstützt durch z. B. "Ca-PO₄", DEAE, hydrophobe Moleküle etc., zu verstehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist entweder das 5'-endständige Oligonukleotid des Primärstrangs an seinem 5'-Ende oder das 3'-endständige Oligonukleotid des Pri märstrangs an seinem 3'-Ende mit einem Hapten oder beide endständigen Oligonukleo tide mit verschiedenen Haptenen versehen. Dies ermöglicht die Fixierung des mit dem Hapten gekoppelten Oligonukleotids vor oder nach seiner Verknüpfung mit weiteren Oli gonukleotiden des Primärstranges an einen festen Träger. Damit wird eine Abtrennung des Hapten-gekoppelten Stranges von allen Vorstufen und Nebenprodukten ohne Hap ten z. B. unter denaturierenden Bedingungen (z. B. pH 13) möglich. Die jeweils gewählte Hapten-Träger-Kombination muß unter den vorgesehenen Bedingungen stabil sein. Ein bevorzugtes Hapten ist z. B. Biotin, das durch an einen Träger gekoppeltes Streptavidin gebunden wird. Weiter können die Oligonukleotide mit Antigenen gekoppelt werden, die von an einen Träger fixierten Antikörpern erkannt und gebunden werden. Die weitere Synthese des Primärstranges oder einer der im folgenden beschriebenen weiteren Schritte kann dann an diesem Träger durchgeführt werden. Das zweite Hapten könnte beispielsweise für später mit dem Nukleinsäurepolymer durchzuführende Detektionsver fahren nützlich sein.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird dem Reaktionsansatz einer nach dem vorliegenden Verfahren durchgeführten Synthesereaktion ein Polymeraseenzym zugesetzt, um aus dem Primärstrang, der ein Nukleinsäure-Einzelstrang ist, einen Nu kleinsäure-Doppelstrang zu bilden oder gezielt den komplementären Strang (d. h. den Gegenstrang zum Primärstrang) zu amplifizieren (asymmetrische PCR). Als spezifischer Primer dient ein zum 3'-Ende des vollständigen Primärstranges komplementäres Oligo nukleotid (Rückwärtsprimer).

In einer bevorzugten Ausführungsform werden dem Reaktionsansatz einer nach dem vorliegenden Verfahren durchgeführten Synthesereaktion ein Polymeraseenzym und zusätzlich endständige Vorwärts- und Rückwärtsprimer im großen Überschuß zum ein gesetzten Syntheseprodukt zugesetzt. Auf diese Weise werden nach dem Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (Saiki et al., Science 239, 487-491, 1988) aus den einzel strängigen Nukleinsäurepolymeren doppelsträngige Nukleinsäurepolymere gebildet.

Das Polymeraseenzym wird dabei aus der Gruppe der DNA-Polymerasen, z. B. E. coli Polymerase I, Klenow-Polymerase, T4 DNA-Polymerase und Reverse Transkriptase, ausgewählt. Die dabei gebildeten Nukleinsäure-Doppelstränge können entweder DNA- DNA-Doppelstränge oder DNA-RNA-Doppelstränge sein (Kleppe et al., Proc., Natl. Acad. Sci. 67, 68-79, 1970).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die zugesetzte Polymerase eine temperaturstabile Polymerase, z. B. Taq-Polymerase. Das temperaturstabile Enzym ver liert auch nach mehreren Temperaturzyklen nur wenig von seiner Aktivität und kann deshalb die Polymerasereaktionen mehrerer aufeinander folgender Zyklen katalysieren.

Die Polymerasereaktion wird bevorzugt mehrfach wiederholt durchgeführt, um den Nu kleinsäure-Doppelstrang exponentiell zu amplifizieren. Nach dem Prinzip der Polyme rasekettenreaktion umfaßt dabei jeder Zyklus eine Denaturierung bereits bestehender Nukleinsäure-Doppelstränge durch übliche Maßnahmen, z. B. durch Erhöhen der Tem peratur oder des pH, das Anlagern endständiger Primer unter geeigneten Bedingungen und eine Polymerase-katalysierte Nukleinsäuresynthese. Im Fall einer temperaturstabi len Polymerase erübrigt sich die Zugabe weiterer Polymerase; wo jedoch eine der nicht temperaturstabilen Polymerasen für die Polymerisationsreaktion verwendet worden ist, wird diese durch die thermische Denaturierung inaktiviert; in diesem Fall muß in jedem Zyklus frisches Polymeraseenzym zugefügt werden. Üblicherweise wird die Polymerase reaktion 5 bis 15 Mal durchgeführt, bevorzugt etwa 8 bis 12 Mal. Der wesentliche Vorteil der Wiederholung der Polymerasereaktion liegt darin, daß aufgrund der Position der Primer (endständig) gezielt vollständiges Syntheseprodukt exponentiell amplifiziert wer den kann.

Die Denaturierung der Doppelstränge wird üblicherweise bei Temperaturen von mehr als 90°C durchgeführt. Der Reaktionsansatz wird sodann langsam abgekühlt, so daß die endständigen Primer in Abhängigkeit von ihrer Zusammensetzung bei Temperaturen zwischen 80°C und 45°C mit den dann vorliegenden Einzelsträngen hybridisieren kön nen. Die Polymerase-katalysierte DNA-Synthese kann bei Verwendung eines tempera turstabilen Enzymes im Bereich von 45 bis 70°C durchgeführt werden, wodurch die Bil dung unspezifischer Hybride minimiert wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter ein einzelsträngiges Nukleinsäurepoly mer, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden ist. Durch geschickte Kopplung des erfindungsgemäßen Verfahrens, mit dem zunächst einzelsträngige Pri märstränge hergestellt werden, mit der Fill-in-Methode lassen sich ohne weiteres dop pelsträngige Nukleinsäurepolymere von mehreren 1000 Basen erzeugen (Abb. 4). Dazu müssen z. B. Primärstränge so konzipiert sein, daß sie an ihrem 3'-Ende in einem Be reich von wenigen Basenpaaren, z. B. 20 bis 60, bevorzugt 30 bis 40 Basenpaaren, ein ander komplementär sind, so daß bei einer nachfolgend in vitro oder in vivo ablaufenden Polymerasereaktion das 3'-Ende jedes Primärstranges als Primer für eine matrizenab hängige Polymerase dienen kann.

Die folgenden Abbildungen und das Beispiel erläutern die Erfindung.

Abb. 1 beschreibt eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Es werden zunächst phosphorylierte Oligonukleotide für den Primärstrang und nicht ver knüpfbare Oligonukleotide für den Gegenstrang, die zu den Oligonukleotiden des Pri märstrangs komplementär sind und mit jeweils zwei der phosphorylierten Oligonukleotide überlappen, bereitgestellt (a). Anschließendes Ligieren führt zu einem einzelsträngigen Nukleinsäurepolymer (b), dem Primärstrang.

Abb. 2 zeigt eine Detailaufnahme des Überlappungsbereiches zwischen zwei be nachbarten verknüpfbaren Oligonukleotiden und einem nicht verknüpfbaren Oligonu kleotid, das zwei aneinandergrenzende Bereiche umfaßt, deren einer dem 3'-Ende eines ersten verknüpfbaren Oligonukleotides komplementär ist, und deren zweiter dem 5'- Ende eines zweiten verknüpfbaren Oligonukleotides komplementär ist. Der Überlap pungsbereich zwischen einem Bereich des nicht verknüpfbaren Oligonukleotids mit dem komplementären Bereich eines der verknüpfbaren Oligonukleotide sollte mindestens 15 bp betragen.

Abb. 3 veranschaulicht die Durchführung des Verfahrens mit sehr langen ver knüpfbaren Oligonukleotiden, die jeweils durch Hybridisierung mit weitaus kürzeren nicht verknüpfbaren Oligonukleotiden korrekt nebeneinander angeordnet werden. Für diesen Zweck ist es ausreichend, wenn die nicht verknüpfbaren Oligonukleotide eine stabile Hybridisierung mit den beiden benachbart anzuordnenden verknüpfbaren Oligonukleoti den gewährleisten, ohne daß eine Komplementarität zum gesamten späteren Pri märstrang gegeben sein muß.

Abb. 4 zeigt das Prinzip der Fill-in-Methode am Beispiel zweier nur in ihrem 3'- Bereich komplementärer langer Oligonukleotide. Durch Hybridisierung der komplementä ren 3'-Bereiche dient das 3'-Ende jedes der Oligonukleotide als Primer für eine Polyme rasereaktion entlang der Matrize des jeweils anderen Oligonukleotides.

Abb. 5:

a) Oligonukleotide zur Synthese des Primärstranges der algenadaptierten GFP-Mutante S65T/F64L (FG1 bis FG15)
b) Oligonukleotide des Gegenstranges (nicht verknüpfbar) (FG14rev bis FG1rev)
c) Oligonnukleotid FG15rev, Primer für die Polymerase-katalysierte Synthese des Ge genstranges.

Abb. 6: Modifiziertes Gen (S65T/F64L) für das Grüne Fluoreszierende Protein (Green Fluorescent Protein - GFP) aus Aquorea victorea. Das Gen wurde gegenüber dem natürlichen GFP-Gen so modifiziert, daß es nur Kodons enthält, die von Grünalgen, beispielsweise Chlamydomonas, bevorzugt werden. Die unterstrichenen Nukleotide wur den erst durch die Polymerasereaktion aufgefüllt (Matrize: FG15rev).

Beispiel Synthese eines algenadaptierten Genes, das für Grünes Fluoreszierendes Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victorea kodiert

Im folgenden wird die Synthese eines modifizierten Genes für Grünes Fluoreszierendes Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victorea gezeigt. Der Kodongebrauch wird im synthetischen Gen dahingehend modifiziert, daß die Kodons von Grünalgen, wie bei spielsweise Chlamydomonas, bevorzugt werden. Für die Synthese wurden 30 Oligonu kleotide mit einer Länge von 45 bis 50 Basen eingesetzt. Die Oligonukleotide des Pri märstranges werden dabei als FG1 bis FG15 bezeichnet und sind 45 bis 47 Basen lang. Die nicht verknüpfbaren Oligonukleotide des komplementären Stranges werden als FG14rev bis FG1rev bezeichnet und sind 46 Basen (FG14rev bis FG1rev) lang. Die Se quenzen der Oligonukleotide sind in Abb. 5a, b gezeigt.

Die Reaktion wurde in einem programmierbaren Thermocycler durchgeführt. Die Oligo nukleotide, die den verknüpfbaren Strang bilden, wurden vor der Synthesereaktion am 5'-Ende phosphoryliert.

Schritt 1 Oligonukleotid-Phosphorylierung am 5'-Ende (100 µl-Ansatz)

10 µl Oligonukleotide FG1 bis FG15 (500 pMol total, gleiche molare Konzentrati on jedes Oligonukleotides)
10 µl Kinasepuffer (10-fach konzentriert, Biolabs)
10 µl ATP 2 mM
69 µl H₂

O
1 µl T4 Polynukleotidkinase (10 Einheiten Biolabs).

Die Reaktion wird für 4 h bei 37°C durchgeführt und anschließend durch 5-minütige In kubation bei 95°C beendet.

Schritt 2 Trägerfreie Nukleotidpolymersynthese (Primärstrang)

Die Reaktion wurde in einem programmierbaren Thermocycler durchgeführt. Es wurde rekombinante Pfu-DNA-Ligase der Firma Stratagene verwendet. Die Pufferbedingungen wurden mit KCl, NP-40, MgCl₂ auf die Ligasebedingungen umgestellt, wobei die Ionen im Kinaseansatz berücksichtigt wurden.
10 µl 5'-phosphorylierte Oligonukleotide (50 pMol total) aus Schritt 1 (FG1-FG15)
1 µl nicht-phosphorylierte Oligonukleotide (50 pMol total) (FG1rev-FG14rev)
6 µl KCl (100 mM)
3 µl NP-40 (0,5%)
4 µl MgCl₂ (50 mM)
3 µl ATP (10 mM).

Der Reaktionsansatz wird 3 Min. bei 95°C und 3 Min. bei 80°C inkubiert. Während der Inkubation bei 80°C werden 3 µl Pfu-DNA-Ligase (12 Einheiten thermostabile Ligase der Firma Stratagene) zugesetzt und anschließend 3-mal der folgende Temperaturzyklus durchgeführt:

a) 1 Min. 95°C
b) in 1 Min. von 95°C auf 70°C abkühlen
c) über den Zeitraum von 1 Std. linear von 70°C auf 55°C abkühlen
d) 2 Std. bei 55°C inkubieren

Variante 1: Das Produkt wird zur Abtrennung der Pfu-Ligase ausgefällt, gegebenenfalls über PCR und Taq-Polymerase amplifiziert und kloniert.

Variante 2: Um die Abtrennung zu erleichtern, wird der Primer FG1 biotinyliert einge setzt. Nach Beendigung der Synthese wird der Reaktionsansatz mit NaOH auf pH 13 gebracht. Es werden Streptavidin-Magnetkugeln (Dynal) zugesetzt und das Synthese produkt mit einem Magneten an der Wand des Reaktionsgefäßes festgehalten, während alle Rückwärtsprimer, unverbrauchte Vorwärtsprimer sowie Ligase mit dem Überstand abgenommen werden. Das saubere, nun an Streptavidin gekoppelte Syntheseprodukt wird in 30 µl neutralem Puffer aufgenommen und kann z. B. wie im Schritt 3 (s. unten) amplifiziert werden.

Schritt 3 Amplifizierung des Syntheseproduktes mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR)

Variante 1: 1 µl des Syntheseproduktes werden mit 1 E thermostabiler Pfu-Polymerase (Stratagene) in 12 Zyklen im Standardpuffer (lt. Hersteller) in einem 50 µl-Ansatz ampli fiziert. Als Vorwärtsprimer dient das Oligonukleotid FG1, als Rückwärtsprimer dient das Oligonukleotid FG15rev (50 Basen; Abb. 5c). Endkonzentration: 25 pMol pro 50 µl.

Variante 2: Zur Amplifizierung mittels PCR werden zwei endständige Primer zugegeben, die zwar eine Gesamtlänge von 30 bzw. 33 Basen aufweisen, wovon aber nur 21 bzw. 24 bp mit dem Syntheseprodukt hybridisieren. Die "Überhänge" enthalten jeweils eine Schnittstelle der "Multiplen Klonierungsregion" des Vektors pBenescript II KS⁻ (Stratagene). Das amplifizierte Produkt wird mit den Enzymen Xhol und Knpl geschnit ten, über Quiaex II (Quiagen) gereinigt und standardmäßig kloniert.

Vorwärtsprimer mit Xhol-Schnittstelle:

Rückwärtsprimer mit Kpnl-Schnittstelle:

Claims

1. Verfahren zum Herstellen eines Nukleinsäurepolymeres, umfassend

a) das Bereitstellen von 2 oder mehr verknüpfbaren Oligonukleotiden, die bei kontinu ierlicher Anordnung und nach Verknüpfen einen Primärstrang bilden können, und einem oder mehr nicht verknüpfbaren Oligonukleotiden, wobei jedes der nicht ver knüpfbaren Oligonukleotide zwei aneinandergrenzende Bereiche umfaßt, deren erster dem 3'-Ende eines verknüpfbaren Oligonukleotids komplementär ist und de ren zweiter dem 5'-Ende eines weiteren verknüpfbaren Oligonukleotids komple mentär ist,
b) das Hybridisieren von Oligonukleotiden für den Primärstrang mit den komplementä ren Bereichen der nicht verknüpfbaren Oligonukleotide und
c) das Verknüpfen der Oligonukleotide des Primärstranges.

2. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend eine oder mehrere Wiederholungen der Schritte (b) und (c), wobei vor jeder Wiederholung eine Denaturierung durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Schritte (b) und (c) 1 bis 8 Mal, bevorzugt 3 bis 5 Mal wiederholt werden.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Oligonukleotide des Primärstranges enzymatisch verknüpft werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei zur enzymatischen Verknüpfung thermostabile Ligase zugesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei das Hybridisieren und Verknüp fen zwischen 45°C und 80°C, bevorzugt bei 70°C durchgeführt wird.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Oligonukleotide des Primärstranges chemisch verknüpft werden.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Oligonukleotide des Primärstranges photochemisch verknüpft werden.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die nicht verknüpfba ren Oligonukleotide nicht phosphoryliert sind.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das 3'-Ende oder das 5'-Ende der nicht verknüpfbaren Oligonukleotide modifiziert ist.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die verknüpfbaren und nicht verknüpfbaren Oligonukleotide jeweils 30 bis 1500 Nukleotide umfassen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die verknüpfbaren Oligonukleotide jeweils 30 bis 200 Nukleotide, bevorzugt 30 bis 60 Nukleotide, umfassen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die nicht verknüpfbaren Oligonukleotide 30 bis 50 Nukleotide umfassen.

14. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Bereiche der Komplementarität zwischen verknüpfbaren Oligonukleotiden des Primärstranges und nicht verknüpfbaren Oligonukleotiden jeweils ca. 15 bis 30 bp, bevorzugt 20 bis 25 bp lang sind.

15. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei vor den Schritten (a) bis (c) gemäß Anspruch 1 die endständigen Oligonukleotide für den Primär strang und/oder zu den endständigen Oligonukleotiden für den Primärstrang ganz oder teilweise komplementäre Oligonukleotide an die Enden eines linearisierten Vektors angelagert und mit diesen verknüpft werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das 3-endständige Oligonu kleotid für den Primärstrang ein Hapten am 3'-Ende trägt und/oder das 5'- endständige Oligonukleotid für den Primärstrang ein Hapten am 5'-Ende trägt.

17. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend weiter

d) das Zusetzen einer Polymerase, um ein Nukleinsäure-Doppelstrangpolymer zu bilden, und
e) das Durchführen einer Polymerasereaktion.

18. Verfahren nach Anspruch 14, wobei vor oder nach dem Zusatz von Polymerase im Schritt d) zusätzlich endständige Rückwärtsprimer oder endständige Vorwärts- und Rückwärtsprimer zugesetzt werden.

19. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die zugesetzte Polymerase eine temperaturstabile Polymerase ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, umfassend eine oder mehrere Wie derholungen des Schrittes (e), wobei vor jeder Wiederholung eine Denaturierung durchgeführt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Denaturierung bei Temperaturen von mehr als 90°C und die Anlagerung endständiger Primer sowie die Polymerase-katalysierte DNA-Synthese bei 45°C bis 70°C durchgeführt werden.

22. Einzelsträngiges Nukleinsäurepolymer, erhalten nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21.

23. Verwendung eines einzelsträngigen Nukleinsäurepolymers nach Anspruch 22 zum Erzeugen doppelsträngiger Nukleinsäurepolymere von mehr als 1000 bp, bevorzugt mehr als 1500 bp.