MX2010011343A - Fsh recombinante que inlcuye alfa 2,3- y alfa 2,6-sialilacion. - Google Patents

Abstract

Preparaciones que incluyen la FSH (rFSH)recombinante.

Description

FSH RECOMBINAN E QUE INCLUYE ALFA 2,3- Y ALFA SIALILACION La presente invención se relaciona adotrofinas para uso en el tratamiento de la inf particular, se relaciona con la hormona estimu iculo (FSH) .

ECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las gonadotrofinas son un grupo de hormon coproteína heterodimérica que regulan la funci el hombre y en la mujer. Las mismas incluyen imuladora del folículo (FSH) , la hormona luteini a gonadotrofina coriónica (CG) .

La FSH resulta secretada naturalmente por l uitaria anterior y funciona dando soporte al icular y a la ovulación. La FSH comprende una no acida alfa 92, también común para las otra ena y Rathnam, 1976) . De este modo la FS icosilada a alrededor de 30% por masa (Días y 01. Fox et al. 2001) .

La FSH purificada de la orina humana post-meno o utilizada durante muchos años en el tratamie ertilidad; tanto para promover la ovulaci roducción natural como para proporcionar ooc nología de reproducción asistida. Se han posición dos versiones recombinantés de FSH rono) y Puregon (Organon) a mediados de 1990. resan en las células ováricas de Hámsters Ch lies, 1996) .

Existe heterogeneidad considerable asociada paraciones de FSH que se refiere a diferenci tidades de diversas isoformas presentes. Las is FSH individuales exhiben secuencias de a nticas pero difieren en la medida en la cual uitaria pueden contener una amplia gama de estru rán incluir combinaciones de bi-, tri-. y tetra-g ma de antena (Pierce y Parsons, 1981. Ryan et nziger y Green, 1988) . Los glicanos pueden ificaciones : fucosilación central, bisecció cosamina, cadenas extendidas con acetil la lilación parcial o completa, sialilación con un «2,6, y galactosamina sulfatada sustituida con lpathado et al., 2006). Asimismo, existen d re las distribuciones de estructuras de glican ios de glicosilación individual. Se ha encontrad parable de complejidad del glicano en la FSH de ro de individuos y de la orina de muje opáusicas [Wide et al., 2007).

La glicosilación de los productos de la FSH re leja la gama de glicosil-transferasas present ea celular huésped. Los productos de la rFSH exi osilación central y extensiones de acetil l rd et al., 1990). Además, las células CHO solo s agregar ácido siálico utilizando la unión OÍ2,3 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1 diferente de la FSH producida naturalmente qu canos con una mezcla de ácido siálico unido e Se ha demostrado que una preparación de FSH re ganon) difiere en las cantidades de FSH con eléctrico (pl) de menos de 4 (considerando las dicas) en comparación con la FSH pituitaria, sue t-menopáusica {Ulloa-Aguirre et al. 1995). La c formas acídicas en las preparaciones urinaria ho mayor en comparación con los productos rec al-f (Serono) y Puregon (Organon) (Andersen et o debe reflejar un contenido molar más bajo lico en la rFSH ya que el contenido de glicano entre individuos y cambios en el curso de u lación. Una de las mayores discusiones se relaci servación de que la concentración de FSH y el co ido siálico disminuyen durante la fase pre-ovul ió. El contenido de ácido siálico disminuid sultado una FSH más básica que es eliminada más r por lo menos in vitro, es más potente en el r se apunta (Zambrano et al. 1996). La cuestión specta a la relevancia biológica de estos cambi den involucrarse en la selección del folículo . manece sin resolver (revisado por ülloa-Aguirre, El tiempo de vida circulante de la FSH umentado para materiales de una variedad de unos de estos materiales han sido fraccionados e de una carga molecular general, en acterizada por su pl, en el cual más ácido equi ga negativa mayor. Como se ha manifestado previ recombinante se dividió en fracciones de p jas, la potencia in vivo de la fracción de ntenido de ácido siálico menor) disminuyó y el p vida media más corta (D'Antonio et al. 1999) . formó que la FSH más básica circulante durante l pas del ciclo de ovulación se debe a la baja reg 0.2,3 sialil-transíerasa en la pituitaria ant rre con los niveles crecientes de estradiol tsumara et al. 1999. Ulloa-Aguirre et al. 2 ultados de la 2 , 6 sialil-transferasa no formados .

El contenido total de ácido siálico de la FS H no resulta directamente comparable ya que licos están usualmente unidos de dos formas uitaria/sérica/urinaria contiene uniones tanto ,6- de ácido siálico, predominando la primera. No recombinados derivados de células CHO solamente gawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svenss 90) . Muchas glicoproteínas humanas contienen una as uniones 2,3- y 0.2,6-. Por lo tanto, las ombinantes expresadas utilizando el sistema CHO sus contrapartes naturales en el tipo de unione lico terminales. Esta es una consideración imp producción de productos biológicos para uso fa que las porciones de carbohidrato podrán contri ibutos farmacológicos de la molécula.

Sería más conveniente tener un producto itiera o imitara más estrechamente el perfil fis farmacocinético del producto producido de la ori ultaría conveniente tener un producto rFSH qu piedad o propiedades farmacocinéticas mej piedades comparadas al producto recombinante De acuerdo con la descripción de la presente proporciona FSH recombinante ( rFSH" o lilación a2,ß-. La rFSH (o la preparación de r ención podrá tener 5% o menos de la sialila ndo sialilación a2,8-# por ejemplo 0.1-4 lilación total puede ser sialilación OÉ2,8-. La paración de la rFSH) de acuerdo con la inven er un contenido de ácido siálico [expresado en t índice de moles de ácido siálico a moles de prot /mol o mayor, por ejemplo de entre 6 mol/mol y 1 Los solicitantes han encontrado que el tipo d ,3- o 2,6- del ácido siálico, puede tener una mática sobre la eliminación biológica de la eas de células humanas, en contraposición a las ulas CHO, pueden expresar una FSH recombinante c ácidos siálicos tanto de uniones 2,3 como 2 mplo 4 se realizó una línea celular recombinan expresó la FSH conteniendo glicanos con baj to dé uniones c.2,3- como 2,6-de ácido siálico ( embargo, el material fue eliminado muy rápidam culación de las ratas a un índice comparable erial original que tenía¦ contenido bajo de áci igura 8) . Esta fue una observación inesperada e que una proporción de ácido siálico en la ural y biológicamente está unida en a2,6-. Se en eliminación de la rFSH sialilada en a2,6- est el receptor asialoglicoproteína (ASGP) que se el hígado (Ejemplo 9) . Esto se demostró me queo transitorio de los receptores ASGP útil eso de otro sustrato para el receptor. Con e queado mediante asialofetuina, se restab nclinación esperada, para el material altamente gura 9) . Esto se mantuvo durante algunas horas bloqueo se redujo y la unión c¿2,6 altamente si H reanudó su eliminación rápida.

La FSH recombinante con una mezcla tanto de un nsfirió a nitrocelulosa y se visualizó utiliza Diferenciación de Glicano DIG (Cat. No. 11 21 c e) de acuerdo con las instrucciones de los ela reacciones positivas con Sambucus nigra agglut icaron uniones terminales (2-6) de ácido siáli ) . Las reacciones positivas con Maackla lutinin (MAA) : indicaron uniones terminales (2-3 lico (Figura 6B) . Control dé elaboradores de L tienen solamente, unioness 2,6. Control de el e II contiene unioness 0.2,6 y a2 , 3. Muestr ombinante derivada de CHO comercial - (Gonal-f , stra b, rRSH parental Per.C6, sin manipulación g lil-transferasa . Muestra c, rFSH Per.C6 con ma ética de a2 , 6-sialiltransferasa. Muestra d, r manipulación genética de o_2, 3 -sialiltransfer ne dos ventajas sobre la rFSH expresada en c vencionales : primero, el material está más dersen et al. 2004) .

Los solicitantes han encontrado en forma so la rFSH de la invención puede repetir mucho má perfil fisicoquímico y la farmacocinética de inario humano natural que otros productos recombi as palabras, la rFSH dé la invención puede estar la FSH "natural". Esto puede tener ventajas sign relación a la dosis, etc. Asimismo, un pr tural" o más "humano" podrá ser más convenient iente, quien puede querer una terapia, aun tido artificial, que sea tan "natural" como fuer de haber otras ventajas (por ej . macocinéticas) en un producto recombinante ructura de carbohidrato (por ej . glicano) que ca de la FSH natural (por ej . orina humana) düctos recombinantes .

Así, la invención es una versión recombinante !2 ombinante) que incluye sialilación OÍ2, 3 y siali La preparación de rFSH o rFSH podrá tambié ionalmente sialilación 2, 8.

El término "preparación de FSH recombinant sente incluye una preparación para, por eje macéutico que incluye FSH recombinante . En moda invención, la rFSH podrá estar presente como un ple o como una mezcla de isoformas.

La rFSH (o la preparación de la rFSH) de acue ención podrá tener un contenido de ácid presadq en términos de un índice de moles de ci moles de proteína] de 6 mol/mol o mayor (Ejempl . , entre 6 mol/mol y.15 mol/mol, por ej . , en¿re 8 mol/mol, por ejemplo entre 10 mol/mol y 14 mo . , entre 11 mol/mol y 14 mol/mol, por ej.. , entre 4 mol/mol, por ej . , entre 12 mol/mol y 13 mol/mo la invención podrá producirse o expresarse en' lilación total, por ejemplo de 71 a 79% de la s tal. La rFSH (o la preparación de la rFSH) de la rá tener 50% o menos de la sialilación tot lilación a2,6-. Por ejemplo 40, 30, 20, 10, 5% sialilación total podrá ser sialilación c¿2,6-. preparación de la rFSH) podrá incluir sialilació cantidad que va de 15 a 35% de la sialilación mplo de 20 a 30% de la sialilación total, por a 29%. de la sialilación total. La rFSH (o la p la rFSH) de la invención podrá tener 5% o me lilación total siendo sialilación a2 , 8- . Por ej enos de la sialilación total podrá ser sialilac rFSH (o la preparación de la rFSH) podr lilación cx2,8- en una cantidad de 0.1 a lilación total, por ejemplo de 0.5 a 3% de la s al, por ejemplo de 0.5 a 2.5% de la sialilación lilación se quiere significar la cantidad de lilación total es sialilación 2,6-" se refiere tidad total de residuos de ácido siálico prese que resultan sialilados en la posición 2,6.

La rFSH (o la preparación de la rFSH) de acue ención podrá tener un contenido de ácido siálico sialilación por molécula de FSH) (basado en l teína, antes que en la masa de la pro bohidrato) de 6% o mayor (por ej . entre 6% y 15 re 7% y 13%, por ej . entre 8% y 12%, por ej . e %, por ej . entre 12% y 14%) de masa.

La FSH recombinante expresada en células o sters Chinos (CHO) incluye exclusivamente sialil (Kagawa et al, 1988, Takeuchl et al. 1988, Svens 90) .

La rFSH de la invención podrá producirse o exp línea celular humana. Esto podrá simplificar (y más eficiente) el método de producción .C6 derivada o una línea celular Per.C6 modi ea celular podrá modificarse utilizan liltransferasa. La línea celular podrá m ilizando 2,6- sialiltransferasa. Altern cionalmente, la rFSH podrá incluir uniones a2,6 lico (sialilación 2,6) proporcionados por la nsferasa sialilo endógena [de la línea ,celular] .

La rFSH podrá producirse utilizando a2,3- liltransferasa. La rFSH podrá producirse utiliz liltransferasa . La rFSH podrá incluir uniones dos siálicos (sialilación 2,6) proporcionado ividad transferasa sialilo endógena.

De acuerdo con la presente invención, en otro porciona un método de producción de la prepara H y/o de la preparación de la rFSH tal como se d presente (de acuerdo con aspectos de la inve prende la etapa de producir o expresar la rF nica. La rFSH de la invención podrá tener gl sencia de sialilación en estructuras en forma o- y/o di- y/o tri- y/o tetra-. La rFSH pod ferentemente estructuras de glicano mono-siali liladas, tri-sialiladas y tetra-sialiladas con ativas de la siguiente manera: 9-15% mono-siali di--sialiladas; 30-36% tri- -sialiladas y 25-29 liladas (por ej . Como se exhiben en el anális canos cargados, como se muestra en el Ejemplo 8 De acuerdo con la presente invención, en otr proporciona la rFSH producida (por ej . expresa ea celular humana. La rFSH podrá incluir sialila c¿2,6-. La rFSH podrá producirse o expresarse en ular Per.C6, una línea celular Per.C6 derivada o ular Per.C6 modificada. La línea celular podrá m lizando a2 , 3-sialiltransferasa. La línea celu ificarse utilizando a2 , -sialiltransferasa. Alt ,6-, por ejemplo 15-35% de la sialilación total lilación a2,6-. La rFSH (o la preparación de l invención podrá tener 5% o menos de la sialila ndo sialilación OÍ2,8-, por ejemplo 0.5-4 lilación total podrá ser sialilación 2,8-. La er un contenido de ácido siálico [expresado en t proporción de moles de ácido siálico a moles de 6 mol/mol o mayor; por ejemplo entre 6mol/ /mol.

De acuerdo con la presente invención/ en otr proporciona una composición farmacéutica que H incluyendo sialilación a2,3- y sialilación en la forma exhibida anteriormente) . La c macéutica también podrá comprender hCG y/o LH.

La hCG podrá obtenerse por cualquier med nica. La hCG como se utiliza en la presente i ana derivada y recombinante . La hCG humana deri ina) mediante cualquier método conocido en la té odos para expresar y purificar la LH recombinant ocidos en la técnica.

La composición farmacéutica podrá ser tamiento de infertilidad, por ej . , para uso en t reproducción asistida (ART) , inducción de la o eminación intrauterina (IUI) . La composición fa rá utilizarse, por ejemplo, en indicaciones méd utilizan las preparaciones de la FSH cono sente invención también proporciona el us paración de la rFSH y/o de la rFSH descrita en l acuerdo con aspectos de la invención) para, boración de un medicamento para, el tratamie ertilidad. Las composiciones farmacéuticas de l ención podrán formularse en composiciones bien a cualquier ruta de administración de fármacos l, rectal, parenteral, transdérmica (por ej . tec macéuticas de Remingtoh] (Matt Publishing Compa las páginas 1405 a 1412 y 1461 - 87, y la déc ición XIV de Formulaciones Nacionales r aceutical Association, 1975), entre otros.

Ejemplos de portadores, diluyentes, sol ículos farmacéuticos acuosos y no acuosos luyen agua, etanol, polioles (tales como el pilenglicol, polietilenglicol , y s boximetilcelulosa y mezclas adecuadas de lo ites vegetales (tales como el aceite de oliva), ánicos inyectables tales como el etiloleato.

Las composiciones de la presente invenció den contener aditivos tales como, pero no li servadores , agentes humectantes, agentes emu ntes dispersantes. Los agentes antibacte ifungales pueden incluirse para prevenir el crec robios e incluyen, por ejemplo, parabeno, . clo stalino o amorfo con poca solubilidad en agua. absorción de la FSH entonces depende de su olución que, a su vez, puede depender del t stal y de la forma cristalina. Alternativa orción demorada de una combinación de FSH admin ma parenteral se realiza disolviendo o suspe binación de FSH en un vehículo aceitoso.

Se pueden realizar formas de depósito i mando matrices microencapsuladas de FSH (y demá estuvieran presentes) en polímeros biodegrada o el poliláctido-poliglicólido. Dependiendo de l la FSH y el polímero y de la naturaleza del ecial empleado, el índice de la liberación de controlado. Ejemplos de otro polímeros biod luyen la polivinilpirrolídona, poli (ortoéster hídridos) , etc. Las formulaciones de depósito i bién se preparan encerrando la FSH en li es de su uso. Las formulaciones inyectables inistradas en cualquier recipiente adecuado, olleta, jeringa pre- llenada, cartuchos inyec ilares.

Las formulaciones inyectables podrán suminist producto que tiene composiciones farmacéuticas c (opcionalmente con hCG, LH etc.) . Si hubiera rediente activo (es decir FSH y por ej . hCG o rían resultar adecuados para la administración conjunto. Si se administra en forma sep inistración podrá ser secuencial. El producto inistrado en cualquier tipo de paquete adec mplo, un producto podrá contener una cantidad d - llenadas conteniendo ya sea FSH, hCG, o una c to de FSH como de hCG, y las jeringas envasa ase de tipo blister u otros medios para ma erilidad. Un ' producto puede contener opc enteral . Los métodos generales para la preparac mulaciones parenterales se conocen en la téc criben en RE INGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE O CIENCIA Y LA PRÁCTICA FARMACÉUTICA] , supra, en -820. Las composiciones parenterales pueden sum formulación líquida o como un sólido que será me medio inyectable estéril justo antes de la admin una modalidad especialmente preferida, las com enterales se proporcionan en unidades para fa inistración y uniformidad de dosis, cripción detallada de los dibujos.

La presente invención se describirá a alladamente con referencia a los siguiente Eje dibujos adjuntos en los cuales: La Figura 1 muestra un mapa de plásmido del . resión pFSH alfa/beta; La Figura 2 muestra el vector de expresión d ducida por células Per.C6 estables expresand pués de la manipulación genética con GÍ2,3-liltransferasa; Las Figuras 6A y 6B muestran el análisis de l ácido siálico de la FSH Per.C6; La Figura 7 muestra índices de eliminación m Rs) de muestras de FSH Per.C6; La Figura 8 muestra MCRs de o¿2, 6-sialitrans stras de FSH Per.C6 después de la manipulación g La Figura 9 muestra MCRs de a2 , 6-sialitrans stras de FSH Perc.C6 después de la manipulación La Figura 10 muestra MCRs de a2 , 3 -sialitran stras de FSH Per. C6 después de la manipulación g La Figura 11 muestra- el aumento del pes iante clones de rFSH Per.C6 de la rFSH parental erdo con el método de Steelman y Pohley (1953) ; La Figura 12 muestra el aumento del pes FSH se utilizó de acuerdo con Fiddes y Goodman, uencia se ingresó como AH007338 y, al m strucción, no había otras variantes de esta teica. La secuencia se refiere en la presente c :1..

La región codificada. del gen para el polipépti FSH se utilizó de acuerdo con Keene et al uencia se ingresó como NM_000510 y al m strucción no había otras variantes de esta teica. La secuencia se refiere en la presente c :2. liltransferasa . ot2 , 3 -Sialiltransferasa - La región codificad a la beta-galactósida alfa-2 , 3 -sialiltransferas liltransferasa, ST3GAL4) se utilizó de ac tag la and Paulson (1994) . La secuencia se in 767 y se refiere en la presente como SEQ ID NO: 3. 007338, SEQ ID N0:1) y de la FSH beta p _003032, SEQ ID NO: 2) se amplificó mediante PCR combinaciones de cebador FSHa-fw y FSHa-rev y b-rec respectivamente. a- fw 5 ' -CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC- a-rev 5 ' -GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC- 3 ' b-fw 5 ' -CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC- 3 ' b-rev 5 ' -CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG- 3 ' El ADN de la FSH beta amplificado resultante enzimas de restricción AscI y Hpal y se inse íos AscI y Hpal en el vector de expresión mamífe CMV llevando una selección de marcador de neo rna similar la FSH alfa ADN se digirió con BarríHI se insertó en los sitios BamHI y Nhel en el resión que ya contenía el polipéptido beta FSH A expresión de pFSH alfa/beta pST3 y pST6 respe tiene que: CMV = promotor Citomegaloyirus , uencia poli-adenilación crecimiento hormona bovi fl origen de duplicación, SV40 = promotor 40 Vi = Marcador de resistencia de la Neomicina, Hig resistencia de la Higromicina, SV40 p(A) .= se i-adenilación 40 Virus Simio, FSH A = Hormona es folículo alfa polipéptida, FSH B = Hormona estin ículo beta polipéptida, ST3GAL4 = OÍ2 , 3 -sialiltr GAL1 = 2 , 6 -sialiltransferasa, CoIEl = CoIEl licación, Amp = marcador de resistencia de la am mplo 2 Construcción del vector de expresión ST3.

Se amplificó la secuencia de codificación de actosida alfa-2 , 3 -sialiltransferasa 4 (ST3, L237 :3) mediante PCR utilizando la combinación d STfw y 2, 3STrev. lificó el vector como se describió anteriorm uenció. El clon pST3#l (Figura 2) contenía la rrecta de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 y se selec nsfección. mplo 3 Construcción del vector de expresión ST6.

Se amplificó la secuencia de codificación de actosamida alfa-2 , ß-sialiltransferasa 1 (ST6, ID NO: 4) mediante PCR utilizando la combi ador 2,6STfw y 2,6STrev.

STfw 5' -CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3 ' STrev 5' -TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG- 3 ' La ST6 DNA amplificada resultante se digiere c restricción BamHI y Af/U y se insertó en los si Af/11 en el vector de expresión mamífero opera clones Per.C6 que producen la FSH se generaro expresión de ambas cadenas de polipéptido de la s ido simple (Ver Ejemplo 1) .

Para obtener clones estables de un liposoma nte de transfección con la construcción pFS eccionaron los clones estables en VPRO compleme de FCS y conteniendo G418. Tres semanas desp nsfección se obtuvieron clones resistentes eccionó un total de 250 clones para aislación. lados se cultivaron en medio de selección fluencia de 70-80%. Se analizaron los sobrenad contenido' de proteína de FSH utilizando ELISA se y la actividad farmacológica en el receptor de ea celular clonada, usando un ensayo de acumula clones (98) que expresan proteína funcional p a la expansión del cultivo en 24 cavidades, 6 c scos T80. formación del IEF se utilizó para seleccionar e lisis de índice de eliminación metabólico (Ejem leccionaron clones (005, 104, 179, 223, ductividad suficiente y calidad para la ma ética de la sialiltransferasa.

En la Figura 4 : Concentración isoeléctrica ombinante producida por células Per.C6 estables FSH . Los sobrenadantes líquidos de cultivo c arados bajo condiciones nativas sobre un gradi -7.0. El clon 005 es representativo de los ci ados para la manipulación genética dé la sialitr clones que contenían menos isoformas acidic cartados . mplo 5 Nivel de sialilación se incremente en c re-expresan la ot2,3- o 2 , 6 -sialiltransfe resión estable de pST3 o de pST6 en la FSH qu o se muestra en el Ejemplo 4 para sus carac luyendo productividad, buen perfil de er ducción de proteína funcional y FSH producida q o de sialilación.

Se generaron clones estables como se ha eriormente en el Ejemplo 4. Se aislaron, exp ayaron un total de 202 clones a partir del prog liltransferasa¦* y 210 clones del programa liltransferasa. La cantidad final de clones udio a2,3- fue 12 y 30 para el estudio a2,6-.

Los clones de 2 , 3-sialiltransferasa se adapt diciones de suspensión y medio libre de suero.

Se ensayaron clones como antes se mencionó SA selectiva para FSH, respuesta funcional en ular receptora de FSH, IEF (E emplo 6) , minación metabólica (Ejemplo 9) y análisis de ley (Ejemplo 10) . Se compararon los resultados c ipulación genética exitosa con una sialiltransf entar la cantidad de moléculas de ácido siálico unos clones no mostraron un incremento de sialil de observarse que la FSH producida por la mayo n'es tiene sialilación significativamente mej ir, en promedio más isoformas FSH con altas can dos siálicos) . comparado con la FSH expresada s ,6- sialiltransferasa.

En conclusión la expresión de FSH junt liltransferasa en' células Per.C6 da por resulta entados de FSH sialilada comparado con cé resan solamente FSH.

En la Figura 5: Ejemplo de clones analizado centración isoeléctrica de FSH recombinanté pro ulas Per.C6 estables expresando la FSH despu ipulación genética con a2,3- O 2 , 6 -sialiltransf renadantes líquidos de cultivo celular separ iante concentración isoeléctrica.

Se define la electroforesis como el tran éculas cargadas a través de un solvente mediant ctrico. La movilidad de una molécula biológica a campo eléctrico dependerá de la fuerza del ca a de la molécula, tamaño y forma de la istencia iónica y propiedades del medio a travé ran las moléculas.

La concentración isoeléctrica (IEF) es un ctroforética para la separación de proteínas ba El pl es el pH en el cual una proteína no t a y no migrará en un campo eléctrico. El co do siálico de las isoformas de FSH altera sut to de pl para cada isoforma, que puede ser ndo esta técnica para visualizar las isoformas cada clon.

Se analizaron los puntos isoeléctricos de las Se transfirieron las proteínas sobre nit ortada y se visualizaron utilizando un ocional primario anti-FSHa, anticuerpo conjugado alina IgG secundaria anti-ratón y 5-bromo-olil-fosfato (BCIP) y reactivo nitro azul tetraz a visualizar las bandas.

Como se indica en las Figuras 4 y 5, l resentan isoformas de FSH conteniendo tidades de moléculas de ácido siálico.

Se identificaron clones produciendo isoformas cantidad mayor de moléculas de ácido siálico e método. La manipulación genética con 0.2,3-liltransferasa dio como resultado clones con lico y un pl más bajo. mplo 7 Análisis de las uniones de ácido siáli ,C6.

Se separaron FSH Per.C6 purificada de un clo in sialiltransferasa adicional) , un clon liltransferasa después de manipulación genética 2 , 6 -sialiltransferasa después de manipulació ilizando técnicas estándar SDS-PAGE. Se utiliz ombinante disponible comercialmente (Gonal-f, Se estándar.

Se analizó el ácido siálico utilizando e erenciación de Glicano DIG (Cat. Nro. 11 210 che) de acuerdo con las instrucciones de el cciones positivas con Sawbucus nigra agglutí icaron al ácido siálico unido terminalmen cciones positivas con Maackia amurensis aggl A) : indicaron al ácido siálico . unido terminalmen En resumen, el clon parental 005 contenía baj to de ácido siálico «2,3- como de a2,6-, L pués de la manipulación genética co ricas de Hámsters Chinos (CHO) (Kagawa et euchi et al, 1988, Svensson et al., 1990).

En conclusión, la manipulación genética de Per.C6 con a2,3- o OÍ2 , 6-sialiltransferasa tosamente la cantidad de moléculas de ácid jugado con la FSH en la muestra. mplo 8a Cuantificación del ácido siálico total.

El cido siálico es una proteína unida al ca siderada como un mono-sacárido y se pr binación con otros mono-sacaridos como la osa, glucosamina, galactosamina y fucosa.

Se midió el ácido siálico total sobre la rFSH emplo 11) utilizando un kit de cuantificación lico enzimático de acuerdo con el protocol boradores. (Sigma, Sialic-Q) . Para resumir, el tilneuraminico aldolasa cataliza el ácido siál Se midió el contenido total de ácido siáli .C6 y se encontró que era mayor de 6 mol/mol. mplo 8b Cuantificación de cantidades relativas lico a2 3 , <x2 , 6 y a2 , 8.

Se midieron las cantidades de porcentaje re do siálico a2,3, 0.2,6 .y a2 , 8 sobre la rFSH emplo 11) utilizando técnicas conocidas.

. Se inmovilizaron cada una de las muestras d oque, de gel) , se lavaron, se redujeron, se so uilación y se digirieron con PNGase F durante go se extrajeron los N-glicanos y se procesaro canos para análisis NP-HPLC y WAX-HPLC se etiqu fluoroforo 2AB como se detalla en Royle e rieron los N-glicanos sobre una fase normal re una columna amida TSK (como se detalla en Ro tiempos de retención expresados en unidades analizaron las muestras mediante NP-HPLC, para p paración de la muestra no digerida con aquell NANl y aquella digerida con ABS. La comparaci s rastros de NP-HPLC (no digeridos, digeridos eridos con ABS) muestra que la digestión con A distintos resultados. Esto indica que las muest dos siálicos con uniones 2,3, a2,6 y c¿2,8. Se porcentajes relativos de estructuras present mulados de glicano no digeridos y se encontró la escala de 65%-85% (por ej . 77.75%) para la s ,3; 15 a 35% (por e.j. 21.46%) para la sialilaci a 3% para la sialilación a2,8. mplo 8c Cuantificación de cantidades reí ructuras en forma de antena mono, di, tri liladas.

Se midieron las cantidades de porcentaje re el fluoroforo 2AB como se detalla en Royle et Se realizó un intercambio de anión leve (WAX). arar los N-glicanos mediante carga (Ejemplo 8b ecifica en Royle et al, con un etuin N-glican o referencia. Se eluyeron los glicanos de acue tidad d ácidos siálicos que contenían. Todas la luían estructuras mono (1S) , di(2S), tri(3S) y liladas. Se encontró que las cantidades rel I ructuras sialiladas estaban en los siguiente :2S:4S:4S): 9-15%: 27-30%: 30-36%: 25-29 % (p 24:28.65:35.49:25.62) . mplo 9 Determinación de los índices de e abólicos de la rFSH.

Para determinar el índice de eliminación i R) . de las muestras de FSH Per.C6, se inyectaro bra conscientes (3 animales por clon) en la v coproteínas desialiladas (galactosa-termina alofetuina (ASF) . (Pricer and Ashwell, 1971.

Ashwell, 1972) . El receptor ASGP y la gli ialilada unida se internan dentro de la célula eptor se recicla y el ligando se degrada (J?egroe 8, Steer and Ashwell, 1980) .

Para investigar si el material FSH Per.C6 FSH través de este mecanismo, sé saturó el A alofetuina. El índice de eliminación metab erial parental, a2,6 o GÍ2 , 3 -sialiltransferasa ipulación genética se determinó como se describe inistración de un mínimo de 7500 -veces el exces alofetuina para saturar el ASGP-R durante 1-2 ho El material producido mediante los clones par Per.C6 ' contenía más material MCR pero un vado se eliminó rápidamente (Figura 7) . En dicha stran los índices de eliminación metabólicos- d 6-sialiltransferasa demostraron sialilación in gura 5) no hubo mejora en el MCR (Figura 7) .

ASGR restableció el MCR del material cx2,6 a ándar demostrando que aún con uniones a2 , 6 inc material se elimina rápidamente (Figura 8). ura 8 se muestran índices de eliminación meta 6-sialiltransferasa de muestras de FSH Per.C6 s ipulación genética en la que se inyectaron males por clon) en la vena de la cola al moment bolo de rFSH (1-10 /xg/rata) . Se recogieron m I gre con el tiempo para análisis sobre el conten iante ELISA. La manipulación genética c liltransferasa dio por resultado clones con MCR estándar (Figura 9) . En la Figura 9 se mué ices de eliminación metabólicos de oc2 , 6-sialilt muestras de FSH Per.C6 sometidas a manipulació co-administración de un exceso de 7500 -veces mplo 10 Ensayo Steelman-Pohley in vivo.

Para demostrar el contenido incrementado lico en los resultados de FSH en un efecto entado, se examinó el aumento de peso ovárico iante FSH altamente sialilada como ser la produ mplo 5. ^ Se analizó el aumento de peso ovárico deb nes de la rFSH Per.C6 de acuerdo con el método d Pohley (1953) . Se cuantificó la rFSH Per.C6 d medio celular filtrado mediante ELISA (DRG, EIA lizaron las muestras (Per,C6 rFSH) y estándare H) en cinco dosis diferentes (3 animales/d ificó Gonal-f a 50, 100, 200, 400, y 800 n cularon las dosis de muestra utilizando sus v ativos a Gonal-f, normalmente 0.05 - 10 µg/rata.

En conclusión, el material sub-sialilado pro clones FSH parental Per.C6 (Figura 11) no r o (Figura 12) . En la Figura 12 se muestra el o ovárico de acuerdo con el método de Steelman 53). Se analizaron a2 , 6-sialiltransferasa s ipulación genética rFSH Per.C6 y estándares H) en dosis diferentes J3 ratas/dosis). No ones a2,3- adicionales mejoraron significativ encia (Figura 13) y las dos preparaci ombinantes (Per.C6 y derivada CHO) despliegan pe ilares en este ensayo. En la Figura 13 se m entó de peso ovárico de acuerdo con el método d Pohley (1953). Se analizaron rFSH Per.C6 paren liltransferasa sometida a manipulación gené .C6 y estándares (Gonal-f rFSH) en cinco dosis ratas/dosis) . mplo 11 Visión General de la Producción y Purifi Se desarrolló un procedimiento para produci eas celulares a un medio libre de suero, es dec (JRH Biosciences) . Primero se cultivaron las cé mar una monocapa confluente de 70%- 90% en un tivo T80. Al pasar se re-suspendieron las célu io libre de suero, Excell 525 + 4 wM L-Glutam densidad celular de 0.3xl06 células/ml. Se c pensión de 25 mi en un frasco agitador de 25 tó a 100 rpm a 37°C a 5% C02. Después de al sidad celular de > lxlO6 células/ml, se sub-cult ulas hasta una densidad celular de 0.2 ulas/ml y asimismo se cultivaron en frascos de a C, 5% C02 y 100 rpm.

Para la producción de FSH, se transfirieron l n medio de producción libre de suero, es decir, sciences) , que soporta el crecimiento de célu ta densidades celulares muy altas (usualmen ulas/ml en un cultivo en lote) . Primero se cult centrifugaron las células durante 5 min a 1000 lizó el sobrenadante líquido para la cuantif ificación de la FSH. Se determinó la concentrac lizando ELISA (DRG EIA 1288) .

De ahí en adelante, se realizó la purificación lizando una modificación del método descrito po (1976), Esto se logró mediante cromatogra ulosa DEAE, filtración de gel sobre Sepha matografía de adsorción sobre hidroxiap ctroforesis de poliacrilamida preparativa.

Durante todos los procedimientos cromatográ firmó la presencia de FSH inmunoreactiva mediant 1288) y IEF (Ejemplo 6) . erencias ersen CY, Westergaard LG, y van ely . (2 form composítion of commercial gonadotrophin pre neglected aspect? [Composición de la isoform paraciones de gonadotrofina comercial: un cuidado?] Reprod Biomed Online. 9(2) , 231-236. y BJ, Stevis PE, Deecher DC, Shen ES, Frail ar A, y López FJ. (1997) Induction of prom tein coupling of the follicle-sti ulating hor eptor: a novel mechanism for transducing p ions of FSH isoforms . [Inducción de proteína G ciando el receptor de la hormona estimuladora de H) : un mecanismo nuevo para inducir acciones ple las isoformas FSH] Mol Endocrinol. 11(5) , 517-52 nziger JU y Green ED. (1988) . Pituitary gl mone oligosaccharides : structure, synthesis an the asparagine-linked oligosacchárides on a folitropina, FSH recombinante humana] Rep ine. 10(2), 169-177. ián-Matsumura P, Zaga V, Maldonado A, Sánchez -He ossi C, y Ulloa-Aguirre A . (1999) . Oestrogen tuitary alpha2, 3-sialyltransferase messenger r d levéis in the female rat. [Los estrógenos r eles de alfa 2, 3 -sialiltransferasa pituit sajero del ácido ribonucleico en la rata hemb ocrinol. 23 (2), 153-165. ntonio M-. , Borrelli F. , Datóla A., Bucci R. , letta P., Piscitelli D. , y Papoian R. (1999) racterization of recombinant human follicle s mone isoforms. [Caracterización biológica de is mona estimuladora de folículo humana rec roducción Humana] Human Reproduction 14_, 1160-11 pathado DS, Irungu J, Go EP, Butnev VY, sfield GR, y Desaire H. (2006) . Co parative gl . des, J. C.< y Goodman, H. M. (1979) Isolation, c uence analysis of the cDNA for the alpha-subuni rionic gonadotropin. Nature, [Aislación, cí lisis de secuencia del cADN para la subunidad adotropina coriónica humana. Naturaleza] 281, 35 ck, M.R., Bennet, A.P., Froehlich, J. Anasti, JN (1994) . Increased biological activity due for s in recombinant human follicle-stimulatin duced in a human cell Une. [Actividad biológica ido a isoformas básicas en hormona estimu ículo humana recombinante producida en una lín ana] J. Clin. Endocrinol . Metab. , 79_, 756-760.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una FSH recombinante (rFSH) caracteriza luye sialilación OÍ2,3- y OÍ2,6-. 2. La FSH recombinante de acuerdo con la reiv caracterizada porque tiene un contenido de áci resado en términos de una proporción de moles lico a moles de proteína de 6 mol/mol o mayor. 3. La FSH recombinante de acuerdo con la reiv o la reivindicación 2, caracterizada porque tenido de cido siálico de entre "6 mol/mol y 15 4. La FSH recombinante de acuerdo con vindicación precedente, caracterizada porque el la sialilación total es sialilación a2,3-; 5. La FSH recombinante de acuerdo con vindicación . precedente, caracterizada porqu lilación. a2,3- en una cantidad de 65 a 8 8. La FSH recombinante de acuerdo con vindicación precedente, caracterizada porque inc lilación en una cantidad de 15 a 35% de la s al . 9. La FSH recombinante de acuerdo con vindicación precedente, caracterizada porqu lilación 2,6- en una cantidad de 20 a 30% de s al. 10. La FSH recombinante de acuerdo con vindicación precedente, caracterizada porqu bién sialilación a2,8-. 11. La FSH recombinante de acuerdo con vindicación precedente, caracterizada porque el ácido siálico es 6% o mayor por masa. 12. La FSH recombinante de acuerdo con vindicación precedente, caracterizada porque se resa en una línea celular humana. vindicaciones 12 a 14, caracterizada porqu ones de 0.2,6-ácidos siálicos (sialilaci porcionada mediante actividad transferasa ógena. 16. Una FSH recombinante caracterizada resada en una línea celular humana. 17. La FSH recombinante de acuerdo con la reiv , caracterizada porque 10% o más de la sialilació lilación OÍ2,3-. 18. La FSH recombinante de acuerdo con la reiv o 17, caracterizada porque incluye sialilación cantidad de 65 a 85% de la sialilación total. 19. La FSH recombinante de acuerdo a cualqui vindicaciones 16 a 18, caracterizada porque el 5 la sialilación total es sialilación a2 , 6- . 20. La FSH recombinante de acuerdo con cualqui vindicaciones 16 a 19, caracterizada porqu vindicación 16 o 21, caracterizada porqu lilación a2,3- y sialilación «2,6-. 23. Una preparación de FSH recom inante qu lilación a2,3- y 2,6-. 24. La preparación de acuerdo con la reivind acterizada porque la preparación es una p macéu ica. 25. La preparación de acuerdo con la reivindic , caracterizada porque tiene un contenido de áci presado en términos de una proporción de moles lico a moles de proteína] de 6 mol/mol o mayor. 26. La preparación de acuerdo con las reivin a 25, caracterizada porque el 10% o más de la s al es sialilación 2,3-. 27. La preparación de acuerdo con cualquie vindicaciones 23 a 26, caracterizada porque inc lilación en una cantidad de 65 a 85% de la s 30. La preparación de acuerdo con cualquie vindicaciones 23 a 29, caracterizada porque pr resa en una línea celular humana. 31. Una composición farmacéutica caracteriz prende la rFSH qué incluye sialilación a2,3- y s ,6-. 32. La composición farmacéutica de acuerd vindicación 31, caracterizada porque el 10% o lilación total es sialilación 2,3-. 33. La composición farmacéutica de acuerdo vindicaciones 31 o 32, caracterizada porqu lilación 2,3- en una cantidad de 65 a 8 lilación total. 34. La composición farmacéutica de acu lquiera de las reivindicaciones 31 a 33, car que el 50% o menos de la sialilación total es s ,6. 37. La composición farmacéutica de acu lquiera de las reivindicaciones 31 a 36, car que también comprende hCG y/o LH. 38. La composición farmacéutica de acu lquiera de las reivindicaciones 31 a 37 para tamiento de la infertilidad. 39. Un método de tratamiento de inferti prende una etapa de administración a un suje posición que comprende la rFSH de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 22 y/o una preparación cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30 posición farmacéutica de acuerdo con cualquie vindicaciones 31 a 37. 40. Uso de la rFSH de acuerdo con cualquie vindicaciones 1 a 22 y/o una preparación de l erdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 boración de un medicamento para el tratamie