MX2008011705A

MX2008011705A - Proteinas, acidos nucleicos y medicamentos.

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Publication number: MX2008011705A
Application number: MX2008011705A
Authority: MX
Inventors: Sharon O'kane; Nick Occleston; Mark William James Ferguson; Phillip Mellor; Hugh Gerard Laverthy; Emma Atkinson
Original assignee: Renovo Ltd
Priority date: 2006-03-11
Filing date: 2007-03-12
Publication date: 2008-09-26
Also published as: GB0604938D0; BRPI0708785A2; RU2008140119A; WO2007104945A2; JP2009543542A; WO2007104945A3; AU2007226345A1; AR063947A1; US20110105396A1; US20090105146A1; KR20080106450A; CA2645344A1; NO20084189L; US7947264B2; SG170109A1; IL193699A0; CN101437846A; EP2001904A2

Abstract

La invención proporciona TGF-TGF-(3, o fragmentos o derivados de este, en donde el dominio formador de alfa-hélice entre los residuos de aminoácidos (58) y (67) de TGF-TGF-(3 de tipo salvaje de longitud completa comprende al menos una sustitución para estabilizar la alfa hélice; la invención también proporciona los TGF-TGF-(3, o fragmentos o derivados de este, en donde el residuo glicina de la posición (63) de los TGF-TGF-(3 de tipo salvaje de longitud completa está reemplazado con prolina; Aún más la invención proporciona los TGF-TGF-(3, o fragmentos o derivados de este, que comprende una sustitución de residuo de ácido glutámico de la posición (12) del TGF-TGF-(3 de tipo salvaje de longitud completa y/o el residuo de arginina de la posición (52) del de TGF-TGF-(3 de tipo salvaje de longitud completa; la invención también proporciona medicamentos y métodos de tratamiento mediante dichos de TGF-TGF-(3.

Description

PROTEINAS, ACIDOS NUCLEICOS Y MEDICAMENTOS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención a proteínas derivadas de TGF-P3, a fragmentos biológicamente activos de dichas proteinas, y también a dichos ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas. La invención también proporciona derivados de dicha proteínas o fragmentos biológicamente activos. La invención además proporciona medicamentos que comprenden las proteínas, fragmentos, derivados de ácidos nucleicos de la invención, así como métodos de tratamiento que utilizan las proteínas, fragmentos, derivados o ácidos nucleicos. La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-ß) de los factores de crecimiento está involucrada en la regulación de muchos procesos celulares que incluye proliferación, migración, apoptosis, adhesión, diferenciación, inflamación, inmunosupresión y expresión de proteínas extracelulares. Existen tres isoformas de mamíferos de TGF-ß, denominadas TGF-ß? , TGF-ß y TGF^3. Las TGF-ß son producidas prácticamente por todos los tipos celulares que incluyen células de tejido epitelial, endotelial, hematopoyético, neuronal, y conectivo. Los TGF-ß tienen utilidad en muchos contextos terapéuticos diferentes y la isoformun TGF-ßß en particular tiene muchos usos terapéuticos ventajosos. Como resultado del potencial terapéutico de los TGF-P3 existe mucho interés en la sus aplicaciones farmacéuticas. La secuencia de aminoácidos de TGF-P3 de tipo salvaje de longitud completa se expone en la SEQ ID NO: 1 , y el ADNc que codifica este TGF-p3 se expone en la SEQ ID NO: 2. TGF-P3 es conocido por cumplir una función crucial en la regulación de la respuesta de curación de heridas. La actividad de TGF-P3 puede influir la tasa de curación de heridas así como el grado de formación de cicatrices que ocurre como resultado de la curación. TGF~p3 también se puede usar en el tratamiento de los trastornos fibróticos, fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, escleroderma, trastornos de angiogénesis, restenosis, adhesiones, endometriosis, enfermedad isquémica, inducción de cartílago y hueso, fertilización in vitro, mucositis oral, enfermedad renal, prevención, reducción o inhibición de formación de cicatrices, mejora de la reconexión neuronal en el sistema nervioso periférico y central, prevención, reducción o inhibición de complicaciones de la cirugía ocular (tal como cirugía LASIK o PRK) o formación de cicatrices en el fondo de ojo (tal como la formación de cicatrices asociada con vitreorretinopatía proliferativa). Los usos terapéuticos en los que se usun TGF-P3 por si mismo han establecido una bien reconocida necesidad de fuentes de proteínas TGF-ß3 biológicamente activas, y se han realizado numerosos intentos para producir esta valiosa proteína por métodos recombinantes. Sin embargo, los procesos existentes para la producción de TGF-P3 están muy limitados debido a la necesidad de replegar la proteína del complejo con el fin de obtener moléculas biológicamente activas. Los TGF-ß existen naturalmente como proteínas homodimérícas compuestas de 112 subunidades de aminoácidos. Cada uno de estas subunidades de TGF- 3 contiene un dominio formador de alfa hélice entre los residuos 58 o y 67v0 del fragmento del péptido activo. Además de la alfa hélice entre los residuos 58 y 67, cada subunidad de TGF- 3 también contiene numerosos uniones entre intra-subunidades que incluye puentes salinos y enlaces disulfuros. El TGF- 3 se secreta como moléculas precursoras inactivas latentes de 100 kDa (LTGF-p3). La molécula LTGF- 3 consiste en: i) péptido señal dimérico de C-terminal de 25 kDa (fragmento activo) y ii) péptido asociado latente (LAP). LTGF-p3 se activa por la disociación de LAP del fragmento activo. La escisión de LTGF-P3 puede estar mediada por las endopeptidasas tales como furina, plasmina, trombina y la acidificación del especio perícelular. El fragmento dimérico activo de TGF-P3 liberado se estabiliza por interacciones hidrofóbicas, que además están reforzadas por un puente disulfuro entre las subunidades. Además cada monómero comprende varias cadenas beta extendidas entrelazadas por tres o cuatro enlaces intra-disulfuro y forma una estructura apretada conocida como "nudo de cisteina".

Debido a la complejidad de las moléculas de TGF- 3 biológicamente activas (que son como se describió anteriormente, proteínas homodiméricas con 8 enlaces disulfuro intracatenarios y un enlace disulfuro entre cadenas), ellas se expresaron originalmente en organismos eucarióticos. Sin embargo, debido a los niveles de expresión de expresión relativamente bajos que se pueden obtener en los sistemas de expresión eucarióticosm, en combinación con los altos costos de dichos procesos, se investigó el uso de huéspedes microbianos con el fin de intentar mejorar la eficiencia comercial de la producción de TGF- 3. La desventaja de usar huésped microbianos tales como E.coli para expresar moléculas recombinantes, tales como TGF-P3, que contiene múltiples enlaces disulfuro es que las proteínas producidas normalmente se pliegan incorrectamente y con frecuencia forman cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión requieren la solubilización seguida por la renaturalización para permitir que la proteína se repliegue en su conformación nativa biológicamente activa. Para renaturalizar efectivamente el homodímero de TGF-33, se necesita regenerar los enlaces disulfuro covalentes en la orientación correcta. La probabilidad de formar el homodímero de TGF-p3 correcto a partir del proceso de formación de enlaces disulfuro aleatorios es baja dado que existen nueve puentes disulfuro que permiten 34,459,245 combinaciones posibles de enlaces disulfuro. En consecuencia no sorprende que el replegamiento de TGF-P3 producido en forma recombinante puede impactar gravemente en su fabricación, ya que este replegamiento puede llevar hasta 144 horas, y normalmente se obtiene solo eficiencias de replegamiento en la región del 20%. Es un objetivo de la presente invención obviar a aliviar al menos algunos de los problemas asociados con el arte previo. Es un objetivo de la de ciertos aspectos de la presente invención proporcionar TGF-P3 (o fragmentos o derivados de este) que tienen mejor eficiencia de replegamiento en comparación con el TGF-p3 de tipo salvaje. Es otro objetivo de ciertos aspectos de la presente invención proporcionar agentes diferentes que los TGF-P3 de tipo salvaje que tengan actividad de TGF- 3. Dichos agentes pueden proporcionar alternativas valiosas los TGF-P3 naturales. En un primer aspecto de la presente invención proporciona un TGF-P3, o un fragmento o derivado de este, en donde el dominio formador de doble hélice entre los residuos de aminoácidos 58 y 67 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa comprende al menos una sustitución para estabilizar la alfa hélice. La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica un TGF- 3, o fragmento o derivado de este, de acuerdo con el primer aspecto de la invención. Los inventores han hallado en forma sorprendente que los nuevos TGF-P3 descriptos en el primer aspecto de la invención comparten la misma actividad biológica que TGF- 3 natural, y mejor eficiencia de replegamiento en comparación con el TGF^3 tipo salvaje. Esta eficiencia de replegamiento aumentada constituye una destacada e importante ventaja ya que simiplifica las condiciones de replegamiento que se pueden usar para produir TGF-33 biológicamente activos y también aumenta mucho el rendimiento de dichas proteínas (o fragmentos o derivados de dichas proteínas) que se pueden producir usando sistemas de expresión procarióticos. Sin desear estar ligado a ninguna hipótesis, los inventores consideran que la introducción de una sustitución para estabilizar la alfa hélices en el dominio formador de doble hélice disminuye ventajosamente la flexibilidad de la alfa hélice formada por este dominio. Esta flexibilidad disminuida ayuda a promover el replegamiento apropiado de los TGF- 3 de acuerdo con el primer aspecto de la invención para producir proteínas biológicamente activas (o fragmentos o derivados de estas). La flexibilidad disminuida impartida por la estabilización de la alfa hélice a través de la sustitución para estabilizar alfa hélices es suficiente para aumentar los rendimientos de los TGF-P3 replegados correctamente (en particular TGF-P3 dimérico replegado), pero de modo sorprendente, los inventores hallaron que dichas sustituciones no alteran la actividad biológica de los TGF-P3 de acuerdo con el primer aspecto de la invención, ni estos disminuyen su efectividad biológica y terapéutica. Excepto sonde el contexto requiera lo contrario, la numeración de residuos de aminoácidos en la presente memoria descriptiva se basa en la secuencia de aminoácidos de las porciones peptídicas activas de los TGF-p3. Por ejemplo, las referencias a "TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa" en general se refieren a la secuencia de aminoácidos del péptido activo que se muestra en la SEQ ID NO: 1 , y las referencias al dominio formador de doble hélice entre los residuos de aminoácidos 58 y 67 se deben interpretar conforme a ello. Una sustitución para estabilizar la alfa hélice con preferencia puede comprender una sustitución del residuo glicina de la posición 63 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa. Sin embargo, las sustituciones adecuadas en forma alternativa o adicional pueden comprender sustituciones de, por ejemplo, uno o ambas treoninas de las posiciones 60 o 67 del TGF^3 de tipo salvaje de longitud completa, o of the Asparagine de la posición 66 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa. Se puede preferir que la sustitución para estabilizar la alfa hélices para uso de acuerdo con la invención no comprenda la sustitución de valina 61. Se debe entender que una "sustitución para estabilizar la alfa hélice" de acuerdo con la presente invención es una sustitución en al que un residuo de aminoácido dado presente en TGF-P3 tipo salvaje está sustituido con un residuo de reemplazo que tiene una mayor propensión a la formación de alfa hélice. En consecuencia el residuo de reemplazo del aminoácido introducido en una sustitución para estabilizar la alfa hélice no debe ser necesariamente uno que por si mismos este predispuesto a la integración estable en alfa-hélices estables, sino que solo necesita tener una mayor propensión a la integración estable que el aminoácido sustituido. Sin embargo, en general se puede preferir que un aminoácido de reemplazo introducido como parte de una sustitución para estabilizar la alfa hélice sea un residuo de aminoácido que favorece la integración en una alfa hélice. Los inventores han hallado que los residuos de aminoácidos de reemplazo preferidos que se pueden introducir en la sustitución para estabilizar la alfa hélices de acuerdo con el primer aspecto de la invención puede ser uno o una combinación de aminoácidos seleccionados del grupo que comprende: alanina, serina, treonina, valina, leucina, isoleucina; metionina y fenilalanina. Estos residuos de aminoácidos de reemplazo preferidos son todos los que se consideran adecuados para usar en la sustitución para estabilizar la alfa hélices del residuo glicina de la posición 63 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa. Es decir, los residuos de aminoácidos de reemplazo seleccionados de este grupo pueden sustituir alguna posición del dominio formador de doble hélice entre los residuos de aminoácidos 58 y 67 en que estos pueden proporcionar una sustitución para estabilizar la alfa hélice. Si bien los residuos de aminoácidos enumerados anteriormente representan los residuos preferidos para usar en la sustitución para estabilizar la alfa hélices, se apreciará que existen numerosos sistemas cualitativos y cuantitativos alternativos por los cuales se puede medir la propensión de un residuo de aminoácido a contribuir la formación de alfa hélice (y en consecuencia la adecuación del residuo para uso en una sustitución para estabilizar la alfa hélice) y que los residuos de aminoácidos adecuados para uso en la sustitución para estabilizar la alfa hélices se pueden seleccionar con referencia a cualquiera de los sistemas en combinación con conocimiento de la secuencia de TGF^3. A modo de ejemplo, un sistema cualitativo descripto por Chou y Fasman identifica cinco clasificaciones diferentes de residuos de aminoácidos sobre la base de su propensión a la formación de alfa hélice. En orden, estos son: Formadores de hélices fuertes, Formadores de hélices débiles; Formas indiferentes; disruptores de hélice débiles; y disruptores de hélice fuertes. Para los fines de la presente memoria descriptiva, los residuos de aminoácidos ácido glutámico, histidina, trisptofano, lisina, alanina, metionina, valina, isoleucina, leucina, glutamina y fenilalanina se pueden considerar formadores de hélice, con glutamina, metionina, alanina y leucina que constituyen los formadores de hélice fuertes. En contraste, asparagina, glicina y prolina se pueden considerar disruptores de hélice, con glicina y prolina como los disruptores de hélice fuertes. De este modo, si la propensión a la formación de alfa hélice se evalúa con referencia a esta escala cualitativa, se reconocerá que, si bien una sustitución para estabilizar la alfa hélice con preferencia puede ser una en la que un residuo de aminoácido se reemplaza con un formador de hélice, la sustitución adecuada para estabilizar las alfa hélices pueden usar en forma alternativa formas indiferentes o incluso disruptores de hélice, lo que depende de la naturaleza del residuo de aminoácido que se reemplaza. Por ejemplo, en el caso que un residuo de aminoácido de forma indiferente sea el sujeto de una sustitución para estabilizar la alfa hélice, un residuo de aminoácido de reemplazo adecuado puede ser un formador de hélice fuerte o un formador de hélice débil. En el caso que un formador de hélice fuerte sea sujeto de una sustitución para estabilizar la alfa hélice, residuo de aminoácido de reemplazo adecuado puede ser un formador de hélice fuerte, un formador de hélice débil, un aminoácido de forma indiferente o un disruptor de hélice débil. Por consiguiente, una sustitución para estabilizar la alfa hélice de acuerdo con la presente invención puede comprender la sustitución de un disruptor de hélice fuerte con un disruptor de hélice débil, o un residuo de aminoácido de forma indiferente, o un formador de hélice débil, o un formador de hélice fuerte. En forma alternativa o adicional, una sustitución adecuada para estabilizar la alfa hélice puede comprender la sustitución de un disruptor de hélice débil con una forma indiferente, un formador de hélice débil, o un formador de hélice fuerte. En forma alternativa o adicional, una sustitución adecuada para estabilizar la alfa hélice puede comprender sustitución de un aminoácido de forma indiferente con un formador de hélice débil o un formador de hélice fuerte. En forma alternativa o adicional, una sustitución adecuada para estabilizar la alfa hélice puede comprender la sustitución de un formador de hélice débil con un formador de hélice fuerte. 1 Una evaluación alternativa de la propensión de un residuo de aminoácido para la formación de alfa hélice, y en consecuencia su adecuación para utilizarlo como parte de una sustitución para estabilizar la alfa hélice, se puede basar en alguna de las numerosas escalas cuantitativas conocidas por los expertos en el arte. Un ejemplo de dicha escala cuantitativa que se puede usar para determinar la adecuación de un residuo de aminoácido para el uso en una sustitución para estabilizar la alfa hélice se expone en el cuadro 1. Este cuadro proporciona valores, calibrados en kcal/mol, que reflejan la propensión de los aminoácidos a contribuir en la formación de alfa hélice. UN alto valor en el cuadro 1 se asocia con una baja tendencia a la formación de alfa hélice. En consecuencia, cuando se evalúa la adecuación de un residuo de aminoácido para usar en una sustitución para estabilizar la alfa hélice, como se requiere en el primer aspecto de la invención usando una escala cuantitativa, tal como la que es expone en el cuadro 1 , una sustitución adecuada para estabilizar la alfa hélice es una en que un residuo de aminoácido está sustituido con un residuo de aminoácido de reemplazo que tiene una propensión a formar hélices mayor (indicado en el cuadro 1 por valor de kcal/mol menor) que el residuo que se reemplaza. Las sustituciones adecuadas que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen las que introducen aminoácidos de reemplazo artificiales. Los ejemplos adecuados de aminoácidos artificiales que se pueden usar beneficiosamente para estabilizar las alfa-hélices incluyen los residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales de alquilo e hidroxilo. Alanina representa un residuo de aminoácido de reemplazo particularmente preferido adecuado para usar en la sustitución para estabilizar la alfa hélices. Es de máxima preferencia que un TGF-P3 o fragmento o derivado de este, de acuerdo con el primer aspecto de la invención comprenda el reemplazo de glicina de la posición 63 del TGF-P3 de tipo salvaje de longitud completa con alanina. La secuencia de aminoácidos de un TGF- 3 preferido de acuerdo con el primer aspecto de la invención se expone en la SEQ ID NO: 3 (Gly-63Ala), y ADN que codifica este TGF- 3 se expone en la SEQ ID NO: 4. Los fragmentos o derivados del TGF- 3 de la SEQ ID NO. 3 que contienen la sustitución de alanina de la posición 63 del TGF-p3 de tipo salvaje de longitud completa representan los fragmentos de TGF-P3 o derivados preferidos de acuerdo con el primer aspecto de la invención. Una sustitución adecuada puede ser una en que uno o más residuos de aminoácidos ubicados entre 58 y 67 del TGF-P3 de tipo salvaje de longitud completa se reemplazan con uno o más residuos de aminoácidos naturales o artificiales. A modo de clarificación adicional, las sustituciones adecuadas pueden involucrar la sustitución de un residuo de aminoácido único con uno o más residuos de reemplazo, o la sustitución de más de un residuo de aminoácidos con uno o más residuos de reemplazo. Una sustitución preferida puede ser una en que el número de residuos está conservado, es decir, uno en que el número de residuos de aminoácidos sustituido es el mismo que el número de residuos de aminoácidos de reemplazo introducidos. También se apreciará que el residuo de aminoácido (o residuos) preferido para reemplazar se pueden seleccionar con referencia a las escalas cualitativas o cuantitativas descriptas anteriormente. En consecuencia un aminoácido adecuado es el sujeto de una sustitución para estabilizar la alfa hélice puede ser uno clasificado como disruptor de hélice, o con preferencia un disruptor de hélice fuerte, seleccionar con referencia a la escala cualitativa descripta anteriormente. Con referencia a la escala cuantitativa expuesta en el cuadro 1 , un aminoácido adecuado es el sujeto de una estabilización de alfa hélice con preferencia puede ser uno con un valor de propensión a hélice mayor o igual a 0.50, con más preferencia con un valor de propensión a hélice mayor o igual a 0.60, y con máxima preferencia con un valor de propensión a hélice de 1.00. Los inventores consideran que los TGF- 3, o sus fragmentos biológicamente activos o derivados, de acuerdo con el primer aspecto de la invención se pueden usar en todos los contextos en que se desee usar las actividades biológicas de TGF- 3 tipo salvaje. Estas incluyen en particular, pero sin limitación, usos terapéuticos. De acuerdo con este uso terapéutico, la invención también proporciona el uso de un TGF- 3, o un fragmento o derivado de este, de acuerdo con el primer aspecto de la invención como un medicamento.

Se apreciará que, si bien se prefiere que un fragmento o derivado de un TGF- 3 de acuerdo con el primer aspecto de la invención comprenda el dominio formador de alfa hélice de longitud completa que contiene una sustitución para estabilizar la alfa hélice, esto no debe ser necesariamente el caso. Un fragmento o derivado adecuado puede comprender un dominio formador de alfa hélice truncado siempre que este dominio formador de alfa hélice comprenda al menos una sustitución para estabilizar la alfa hélice. En un segundo aspecto la invención proporciona un TGF- 3, o un fragmento o derivado de este, en donde el residuo glicina de la posición 63 de TGF- 3 tipo salvaje de longitud completa está reemplazado con prolina. La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un TGF- 3, o un fragmento o derivado de este, de acuerdo con el segundo aspecto de la invención. Los inventores hallaron en forma sorprendente que las proteínas de acuerdo con el segundo aspecto de la invención (o sus fragmentos o derivados) tienen actividad biológica comparable a la del TGF-P3 tipo salvaje. Este hallazgo es inesperado, ya que se puede pensar que la presencia de prolina en una región de TGF-P3 normalmente asociada con la formación de alfa hélice debería interferir en la estructura secundaria de dichas proteínas y de este modo alterar su función biológica. Si bien la eficiencia de replegamiento de los TGF- 3 de acuerdo con el segundo aspecto de la invención es menor que la de TGF-p3 tipo salvaje, el deterioro previsto de la función sorprendentemente no se produce. En consecuencia, las proteínas de acuerdo con el segundo aspecto de la invención (o sus fragmentos o derivados) proporcionan una valiosa contribución al arte ya que expanden el repertorio de compuestos capaces de ejercer la actividad de TGF-P3 que están disponibles para los expertos. Dichos compuestos, por ejemplo, se pueden usar en contextos en que se desea usar la actividad de TGF-p3 en forma terapéutica. La secuencia de aminoácidos de un TGF-P3 preferido de acuerdo con el segundo aspecto de la invención se expone en la SEQ ID NO: 5 (Gly-63Pro), y ADN que codifica este TGF-p3 se expone en la SEQ ID NO: 6. Los fragmentos o derivados del TGF- 3 de la SEQ ID NO: 5 que contiene la sustitución de prolina de la posición 63 de TGF- 3 tipo salvaje de longitud completa representan el fragmento de TGF-P3 o derivados preferidos de acuerdo con el segundo aspecto de la invención. Dado que los TGF- 3, o sus fragmentos o derivados, de acuerdo con el segundo aspecto de la invención se pueden usar en contextos en los que se desea utilizar la actividad biológica terapéutica de TGF- 3 tipo salvaje se apreciará que también se proporciona el uso de los TGF- 3, o sus fragmentos o derivados, de acuerdo con el segundo aspecto de la invención como medicamentos. Los inventores consideran que dichos medicamentos se pueden usar en todos los contextos clínicos en los que es conocido el empleo de la actividad biológica de TGF- 3.

En un tercer aspecto de la invención se proporciona un TGF-p3, o un fragmento o derivado de este, que comprende una sustitución del residuo de ácido glutámico de la posición 12 TGF-P3 tipo salvaje de longitud completa y/o el residuo de arginina de la posición 52 del TGF- 3 tipo salvaje de longitud completa. La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un TGF- 3, o un fragmento o derivado de este, de acuerdo con el tercer aspecto de la invención. Se apreciará que el tercer aspecto de la invención en consecuencia abarca los TGF-P3 en los que el ácido glutámico de la posición 12 del TGF-P3 de tipo salvaje de longitud completa está sustituido pero la arginina de la posición 52 del TGF-P3 de tipo salvaje de longitud completa está retenido. El tercer aspecto de la invención también abarca los TGF- 3 en los que el ácido glutámico de la posición 12 de TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa está retenido pero la arginina de la posición 52 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa está sustituida. Sin embargo, se prefiere que los TGF- 3 de acuerdo con el tercer aspecto de la invención comprendan sustituciones tanto del residuo de ácido glutámico de la posición 12 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa como del residuo arginina de la posición 52 del TGF-33 de tipo salvaje de longitud completa. Los inventores hallaron en forma sorprendente que las proteínas de acuerdo con el tercer aspecto de la invención también tienen actividad biológica comparable a la del TGF-P3 de tipo salvaje. Este hallazgo es inesperado, ya qua la sustitución de uno o ambos residuos de ácido glutámico de la posición 12 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa y/o el residuo de arginina de la posición 52 del TGF-33 de tipo salvaje de longitud completa altera la formación de uno de los puentes salinos intra-subunidades hallados normalmente en TGF- 3 tipo salvaje. Se puede esperar que esta falla para completar la formación del puente salino apropiado reduzca la actividad biológica de los TGF- 3 de acuerdo con el tercer aspecto de la invención debido a que generalmente se considera que la actividad biológica de las proteínas tales como los TGF-P3 es dependiente de su conformación. Además, los inventores también han hallado que los TGF-P3 de acuerdo con el segundo aspecto de la invención exhiben una eficiencia de replegamiento exitosa que es exactamente tan alta como la observada para TGF-p3 tipo salvaje. Este hallazgo es muy sorprendente, debido a que los expertos en el arte esperarían que la falta de formación del puente salino intra-subunidades que debe ocurrir en los TGF- 3 de acuerdo con el segundo aspecto de la invención debiera impactar en forma deletérea en los casos de replegamiento y en consecuencia disminuye el rendimiento de un TGF- 3 biológicamente activo. En consecuencia las proteínas de acuerdo con el tercer aspecto de la invención sirven expandir el repertorio de compuestos capaces de ejercer la actividad de TGF-p3 que están disponibles para los expertos. Como se indicó anteriormente, esta disponibilidad de dichos compuestos es de importancia en contextos en los que se desea usar la actividad de TGF- 3 en forma terapéutica. Los inventores hallaron que uno u otro del ácido glutámico de la posición 12 del TGF-p3 de tipo salvaje de longitud completa o la arginina de la posición 52 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa se puede sustituir con algún un residuo de aminoácido (o cualquier combinación de residuos de aminoácidos) seleccionado del grupo que comprende serina, alanina, treonina, valina, isoleucina, metionina, fenilalanina y leucina. Se prefiere que la serina se use como un residuo de aminoácido de reemplazo en los TGF-p3, o sus fragmentos o derivados, de acuerdo con el tercer aspecto de la invención. La serina se puede usar como reemplazo para el ácido glutámico de la posición 12 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa o la arginina de la posición 52 del TGF-P3 de tipo salvaje de longitud completa. Con máxima preferencia la serina se usa para reemplazar tanto el ácido glutámico de la posición 12 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa como la arginina de la posición 52 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa. Un primer ejemplo del TGF-P3 preferido de acuerdo con el tercer aspecto de la invención se expone en la SEQ ID NO: 7. La invención abarca fragmentos biológicamente activos o derivados de la SEQ ID NO: 7 que comprenden la sustitución Glul2-Ser. El ADNc que codifica este TGF- 3 preferido se expone en la SEQ ID NO: 8.

Un segundo ejemplo de un TGF-P3 preferido de acuerdo con el tercer aspecto de la invención se expone en la SEQ ID NO: 9. Los fragmentos biológicamente activos o derivados de la SEQ ID NO: 9 que comprenden la sustitución Arg52-Ser también constituyen los fragmentos o derivados preferidos de acuerdo con la invención. El ADNc que codifica este TGF-P3 preferido se expone en la SEQ ID NO: 0. Un tercer ejemplo de un TGF-p3 preferido de acuerdo con el tercer aspecto de la invención se expone en la SEQ ID NO: 1 1 . Los fragmentos biológicamente activos o derivados de la SEQ ID NO: 1 1 que comprende tanto la sustitución Glul2-Ser y la sustitución Arg52-Ser también constituyen los fragmentos o derivados preferidos de acuerdo con la invención. El ADNc que codifica este TGF-P3 preferido se expone en la SEQ ID NO: 12. Los inventores consideran que los TGF-P3, o sus fragmentos o derivados biológicamente activos, de acuerdo con el tercer aspecto de la invención se pueden usar en todos los contextos en los que se puede hacer uso de las actividades biológicas del TGF-P3 tipo salvaje. Estas incluyen, pero sin limitación, usos terapéutico de TGF-P3. Por consiguiente la invención también proporciona el uso de un TGF-p3 o fragmento o derivado de este, de acuerdo con el tercer aspecto de la invención como medicamento. Los TGF-P3 de la invención, o fragmentos o derivados biológicamente activos, se pueden usar en el tratamiento de heridas (que incluyen heridas crónicas tale como úlceras). Estos se pueden usar en particular para promover la curación de heridas acelerada con prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices, y/o promover la reepitelización de heridas. Los TGF- 3 de la invención también se pueden usar para la prevención o tratamiento de de trastornos fibróticos, que se pueden seleccionar de modo independiente del grupo que comprende fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, escleroderma y glomerulonefritis, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar, fibrosis cutánea, fibrosis muscular, fibrosis por radiación, fibrosis renal, vitrorretinopatía proliferativa y fibrosis uterina. Los TGF- 3 de la invención se pueden usar en el tratamiento de escleroderma, trastornos de angiogénesis, restenosis, adhesiones, endometriosis, enfermedad isquémica, inducción de cartílago y hueso, fertilización in vitro, mucositis oral y enfermedad renal. A modo de ejemplo, se ha demostrado en modelos animales y en la clínica que la aplicación tópica de TGF-P3 dimérico de tipo salvaje acelera la tasa de curación de las úlceras por presión que no curan, crónicas; reducen la incidencia, gravedad y duración de la mucositis oral; y reducen los efectos adversos del síndrome gastrointestinal por radiación resultante del daño a las células madre causado por la radioterapia o quimioterapia durante el tratamiento del cáncer. Los inventores consideran que los TGF-P3 de la invención, o sus fragmentos o derivados, se pueden usar en forma benficiosa en todas estas indicaciones. Los TGF-P3 de la invención se pueden usar de la misma manera que el TGF- 3 natural, por ejemplo para el tratamiento de las patologías, por ejemplo, que se pueden seleccionar de modo independiente del grupo que comprende trastornos fibróticos, fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, escleroderma, trastornos de angiogénesis, restenosis, adhesiones, endometriosis, enfermedad isquémica, inducción de cartílago y hueso, fertilización in vitro, mucositis oral, enfermedad renal, prevención, reducción o inhibición de formación de cicatrices, mejora de la reconexión neuronal en el sistema nervioso periférico y central y para la prevención, reducción o inhibición de complicaciones de la cirugía ocular (tal como cirugía LASIK o PRK).Los TGF- 3 de la invención también se pueden usar en el tratamiento de labio y paladar figurado (por ejemplo, en conjunto con la reparación quirúrgica de dicha patología) y en la reducción o inhibición de la formación de cicatrices y curación acelerada de tendones. Las formas mutantes de TGF- 3 descriptas en la presente invención pueden promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices de la misma manera que el TGF-P3 natural. Estos también pueden promover la regeneración epitelial en sitios de daño epitelial. Se considera que un "TGF-p3 de la invención" abarca cualquier mutante de TGF- 3 de acuerdo con alguno del primer, segundo o tercer aspecto de la presente invención. Se apreciará que los TGF-p3 de la invención no abarcan TGF-ß? o TGF-P2. La identidad de un TGF- 3 se puede determinar con referencia a su secuencia, o con preferencia con referencia a su actividad biológica. En consecuencia un TGF-P3 se puede diferenciar de TGF-ß? o TGF-P2 sobre la base de que es capaz de reducir la formación de cicatrices en una herida en la que se administra TGF-P3. Los TGF-P3 de acuerdo con la presente invención con preferencia pueden ser TGF- 3 no naturales. Un TGF- 3 de acuerdo con cualquier aspecto de la invención se puede usar en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cualquier patología en la que se desea utilizar TGF- 3. Dichos usos incluyen, pero sin limitación, el tratamiento de cualquiera de las patologías consideradas en la presente memoria descriptiva. Se puede preferir que los TGF-B3 de acuerdo con la presente invención se usan en la preparación de medicamentos para promover la cura de heridas acelerada y/o la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices. Dicha formación de cicatrices se puede asociar con heridas y/o con trastornos fibróticos. Los medicamentos fabricados que usan los TGF-33 de la invención con preferencia se pueden usar en la piel o en el ojo (por ejemplo en la aceleración de la curación de la piel o el ojo, o para la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices en la piel o el ojo). Los TGF-B3 de acuerdo con la invención pueden ser TGF-B3 latentes o activos (es decir, con o sin, el péptido asociado a latencia). Excepto cuando el contexto requiera otra cosa, las referencias a los TGF-P3 de acuerdo con la invención también abarcan los fragmentos o derivados de dichos TGF-P3, en donde dichos fragmentos o derivados se caracterizan porque comprenden substituciones (de acuerdo con el primer, segundo o tercer aspecto de la invención, según corresponda) que los diferencian de los fragmentos o derivados derivables de del TGF- 3 tipo salvaje (las secuencias de aminoácidos de las que se toman para los presentes propósitos están representadas por la SEQ ID NO: 1 ). Los fragmentos o derivados adecuados de los TGF-P3 de acuerdo con el primer, segundo o tercer aspecto de la invención puede comprender al menos 10 residuos de aminoácidos, con preferencia al menos 40 residuos de aminoácidos, con más preferencia al menos 70 residuos de aminoácidos, y con máxima referencia al menos 100 residuos de aminoácidos. Las referencias en la presente memoria descriptiva a los o TGF-ß3 y los fragmentos de TGF-P3 también abarcan los derivados de dichas proteínas o fragmentos, excepto cuando el contexto requiera lo contrario. Sin limitación, los ejemplos adecuados de las formas adecuadas de los derivados se pueden seleccionar del grupo que consiste: derivados de péptidos terapéuticamente efectivos de los TGF- 3 de la invención (o sus fragmentos); fragmentos o derivados terapéuticamente efectivos que comprenden o se basa en el farmacóforo de los TGF- 3 de la invención (o sus fragmentos); derivados de peptoide terapéuticamente efectivos de los TGF- 3 de la invención (o sus fragmentos); derivados de D-aminoácidos terapéuticamente efectivos de los TGF-P3 de la invención (o sus fragmentos); peptidomiméticos terapéuticamente efectivos basados en los TGF-P3 de la invención (o sus fragmentos); análogos de péptidos terapéuticamente efectivos de los TGF- 3 de la invención (o sus fragmentos); pseudopéptidos terapéuticamente efectivos basados en los TGF- 3 de la invención (o sus fragmentos); péptidos retro-inversos terapéuticamente efectivos basados en los TGF^3 de la invención (o sus fragmentos), derivados de depsipéptidos terapéuticamente efectivos basados en los TGF^3 de la invención (o sus fragmentos); derivados de péptidos ß terapéuticamente efectivos basados en los TGF- 3 de la invención (o sus fragmentos); y derivados retropeptoides terapéuticamente efectivos basados en los TGF-p3 de la invención (o sus fragmentos). Se apreciará que, para los fines de la presente invención se puede tomar que "un TGF-P3" abarca las monoméricas y diméricas del TGF-ß3. Los inventores hallaron en forma sorprendente que los TGF-P3 de acuerdo con la presente invención pueden ejercer sus efectos biológicos tanto en formas monoméricas como diméricas. Esto contrasta en forma sorprendente con lo que se ha informado previamente en el arte previo, donde generalmente se considera que los TGF-ß tales como TGF^3 solo pueden tener actividad biológica en la forma dimérica. El hallazgo de los inventores de que los TGF^3 de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar en forma monomérica proporciona grandes ventajas ya que dichas formas monoméricas se pueden generar mediante técnicas de plegamiento relativamente simples (cuyos ejemplos se describen a continuación) de este modo aumenta la velocidad con la que se pueden generar las moléculas biológicamente activas, mientras que también se reducen los costos asociados con la generación de dichas moléculas.

Se puede preferir que un TGF- 3 monomérico de la invención sea un TGF-P3 que se expone en las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 1 1 , o un fragmento o derivado de este. Se considera que un "medicamento de la invención" comprende cualquier medicamento que comprende un TGF-p3 de acuerdo con la invención. Un medicamento de la invención en forma adicional o alternativa puede ser un medicamento que comprende un ácido nucleico que codifica un TGF- 3 de acuerdo con la invención. Este abarca tanto los medicamentos per se (es decir, sin tener cuenta el uso para que se pone el medicamento), y los medicamentos para uso en aplicaciones terapéuticas específicas (por ejemplo, en el tratamiento de mejora de las patologías consideradas en la presente memoria descriptiva). También se entiende que los medicamentos de la invención abarcan los medicamentos que comprenden fragmentos o derivados adecuados de TGF-P3 de la invención, o ácidos nucleicos que codifican dichos fragmentos o derivados. Un "método de tratamiento de la invención" (o "método de la invención") comprende cualquier método de tratamiento que utiliza una cantidad terapéuticamente efectiva de un TGF-P3 de acuerdo con la invención, o un ácido nucleico que codifica dicho TGF-P3. También se entiende que los métodos de tratamiento de la invención abarcan métodos de tratamiento que utilizan fragmentos o derivados adecuados de los TGF-P3 de la invención, o ácidos nucleicos que codifican dichos fragmentos o derivados.

Los medicamentos que comprenden los TGF- 3 de la invención, o sus fragmentos o derivados biológicamente activos se pueden usar en el tratamiento de heridas (que incluyen heridas crónicas tales como úlceras). Estos se pueden usar en particular para promover la curación de heridas acelerada con prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices, y/o promover la reepitelización de heridas. Los TGF- 3 de la invención también se pueden usar para efectuar la prevención o tratamiento de los trastornos fibróticos, que se pueden seleccionar de modo independiente del grupo que comprende fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, escleroderma y glomerulonefritis, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar, fibrosis cutánea, fibrosis muscular, fibrosis por radiación, fibrosis renal, vitrorretinopatía proliferativa y fibrosis uterinas. Los TGF-p3 de la invención se pueden usar en el tratamiento de las patologías seleccionada de modo independiente del grupo que consiste en: escleroderma, trastornos de angiogénesis, restenosis, adhesiones, endometriosis, enfermedad isquémica, inducción de cartílago y hueso, fertilización in vitro, mucositis oral, enfermedad renal, fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, glomerulonefritis, fibrosis cutánea, fibrosis por radiación, fibrosis renal y fibrosis uterina. A modo de ejemplo, se ha demostrado en modelos animales y en la clínica que la aplicación tópica de TGF-p3 dimérico de tipo salvaje acelera la tasa de curación de las úlceras por presión que no curan, crónicas; reducen la incidencia, gravedad y duración de la mucositis oral; y reducen los efectos adversos del síndrome gastrointestinal por radiación resultante del daño a las células madre causado por la radioterapia o quimioterapia durante el tratamiento del cáncer. Los inventores consideran que los TGF-P3 de la invención, o sus fragmentos o derivados, se pueden usar en forma beneficiosa en todas estas indicaciones. La actividad biológica exhibida por un TGF-p3, o fragmento o derivado de este, de acuerdo con la presente invención con preferencia puede ser actividad anti-formación de cicatrices de TGF- 3, y esta con preferencia se puede investigar in vivo. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un TGF^3, o un fragmento o derivado de este, de acuerdo con la presente invención es una cantidad suficiente para producir un efecto requerido: i) aceleración de la curación de heridas y/o inhibición de la formación de cicatrices; o ii) promoción de la regeneración epitelial; o iii) prevención y/o tratamiento de un trastorno fibrótico. El grado de aceleración de la curación de heridas y/o inhibición de la formación de cicatrices, o regeneración epitelial, o prevención o reducción de fibrosis que se puede necesitar será evidente, y efectivamente fácilmente determinado, por ejemplo, por un médico responsable de la atención del paciente. Una evaluación adecuada del grado de aceleración de la curación de heridas y/o la inhibición de la formación de cicatrices, o promoción de la regeneración epitelial, o la prevención o reducción de la fibrosis puede ser determinada por el clínico, y puede ser con referencia a los métodos de medición sugeridos descriptos en la presente. Los TGF- 3 adecuados para el uso de acuerdo con la invención, así como los fragmentos o derivados preferidos de dichos TGF- 3 se pueden seleccionar con referencia a alguna o todas las consideraciones descriptas en la presente. La capacidad de los TGF- 3 de la invención para acelerar la curación de heridas puede la curación de heridas puede ser fácilmente apreciada y/o medida con referencia a las propiedades exhibidas por las heridas tratadas. Para los presentes propósitos una "herida tratada" se puede considerar a una herida expuesta a una cantidad terapéuticamente efectiva de un medicamento de la invención, o que ha recibido tratamiento de acuerdo con los métodos de la invención. La aceleración de la curación de las heridas tratadas se puede ilustrar por un aumento en la tasa epitelización en comparación con las heridas control. En consecuencia los métodos y medicamentos de la invención promocionan una reconstitución más rápida de una capa epitelial funcional sobre un área herida que lo sería de otro modo. En forma alternativa o adicional, la curación acelerada de las heridas tratadas se puede ilustrar por un ancho de herida disminuido en comparación con las heridas de control en puntos de tiempo comparables. Se apreciará que esta reducción del ancho de la herida asegura que exista una tasa de cierre de la herida relativamente más rápido (ya que existe menos ancho de la herida por cerrar) y es indicativo de la capacidad de dichos medicamentos para acelerar la respuesta de curación. Las heridas más angostas pueden producir cicatrices más angostas que son estéticamente preferibles que las cicatrices más anchas. Por consiguiente, se debe considerar que la curación de heridas acelerada en el contexto de la presente invención abarca cualquier aumento de la tasa de curación de una herida tratada en comparación con la tasa de curación que se produce en heridas tratadas control o heridas no tratadas. Con preferencia la aceleración de la curación de heridas se puede evaluar con respecto a la comparación de la tasa de reepitelización obtenida en heridas tratadas y control, o la comparación de la del ancho relativo de las heridas tratadas y control en puntos de tiempo comparables. Con más preferencia la curación de heridas acelerada se puede definir como que comprende tanto una tasa de reepitelización aumentada como una reducción del ancho de la herida en comparación con las heridas de control en puntos de tiempo comparables. Con preferencia la promoción de la curación de heridas acelerada puede dar origen a una tasa de curación de heridas que es al menos 5%, 10%, 20% o 30% mayor que la tasa de curación que ocurre en una herida control o no tratada. Con más preferencia la promoción de la curación de heridas acelerada puede dar origen a una tasa de curación de heridas que es al menos 40%, 50% o 60% mayor que la curación en una herida control. Aun es más preferido que la promoción de curación de heridas acelerada puede dar origen a una tasa de curación de heridas que es al menos 70%, 80%, o 90% mayor que la que ocurre en las heridas control, y con máxima preferencia la promoción de la curación de heridas acelerada puede dar origen a una tasa de curación de heridas que es al menos 100% mayor que la tasa que se produce en las heridas control. Existe un amplio rango de trastornos de la curación de heridas que se caracterizan, o al menos se caracterizan parcialmente por el fracaso, retraso o retardación inapropiados de la respuesta normal de curación de heridas. La capacidad de ciertos métodos y medicamentos de la invención para promover la curación de heridas acelerada en consecuencia es de utilidad en la prevención o tratamiento de dichos trastornos. Debido a que métodos y medicamentos de la invención pueden provocar la aceleración de la curación de heridas mediante la promoción de una respuesta de reepitelización estimulada (de este modo aumenta la velocidad en que se cierra la herida) se apreciará que estos métodos y medicamentos de la invención son particularmente ventajosos para el tratamiento de heridas de pacientes que de otro modo están propensos a la reepitelización defectuosa, retrasada o alterada de otro modo. Por ejemplo, es bien sabido que las heridas dérmicas de la persona de edad avanzada exhiben una respuesta de reepitelización menos vigorosa que la de los individuos más jóvenes. También existen otras patologías o trastornos en los que la curación de heridas está asociada con reepitelización retrasada o alterada de otro modo. Por ejemplo, los pacientes que sufren de diabetes, pacientes con polifarmacia (por ejemplo, como resultado de una edad avanzada), mujeres posmenopásicas, pacientes susceptibles a lesiones por presión (por ejemplo parapléjicos), pacientes con enfermedad venosa, pacientes clínicamente obesos, pacientes que reciben quimioterapia, pacientes que reciben radioterapia, pacientes que reciben tratamientos de esteroides o pacientes inmunocomprometidos puede sufrir de curación de heridas con reepitelización alterada. En muchos casos la falta de una respuesta de reepitelización apropiada contribuye al desarrollo de las infecciones en el sitio de la herida, que puede a su vez contribuir a la formación de heridas crónicas tales como úlceras. Por consiguiente se apreciará que dichos pacientes probablemente se beneficiarán particularmente con los métodos o medicamentos adecuados de la invención. Las heridas crónicas son quizás el ejemplo más importante de los trastornos asociados con una respuesta de curación de heridas retrasada. Una herida se puede definir como crónica si no muestra ninguna tendencia de curación dentro de las ocho semanas de la formación cuando está sometida al tratamiento terapéutico apropiado (convencional). Los ejemplos bien conocidos de heridas crónicas incluyen úlceras venosas, úlceras diabéticas y úlceras decúbito, sin embargo las heridas crónicas pueden surgir en algún momento de otro modo de lesiones agudas normales. Típicamente las heridas crónicas pueden surgir como resultado de infección del sitio de la herida, tratamiento de herida inadecuado, o como una consecuencia de una ruptura de tejido progresiva causada por enfermedad vascular venosa, arterial, o metabólica, presión, daño por radiación o tumor. Se apreciará que los métodos y medicamentos de la invención capaces de acelerar la curación de heridas se pueden utilizar en el tratamiento de heridas crónicas existentes con el fin de promover su curación. Dichos métodos y medicamentos pueden promover la reepitelización de las heridas crónicas, de este modo producen la curación y cierre del trastorno. Los métodos y medicamentos de la invención preferidos (tales como los que utilizan TGF- 3 que comprenden las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 1 1 ) también pueden inhibir la formación de cicatrices asociada con la curación de heridas. La prevención de la formación de cicatrices en dichos contexto puede ser particularmente ventajoso ya qua las heridas crónicas normalmente se extienden sobre otras porciones relativamente grandes del cuerpo de un paciente. Además o alternativamente, para su uso en el tratamiento de las heridas crónicas existentes, los métodos y medicamentos de la invención adecuados se pueden usar para prevenir heridas agudas de pacientes predispuestos a la curación de heridas alterada que se convierten en heridas crónicas. Debido a que los métodos y medicamentos adecuados de la invención pueden promover la cobertura epitelial del sitio dañado, ellos pueden reducir la probabilidad de que una herida tratada se infecte. De modo similar, esta promoción de reepitelización puede ser beneficiosa en el tratamiento de las heridas crónicas que surgen como resultado de otras patologías tales como diabetes o enfermedad venosa. Un grupo adicional de pacientes que puede obtener beneficio particular de los métodos y medicamentos de la invención son aquellos en los que el sistema inmune está comprometido (por ejemplo, pacientes que se someten a quimioterapia o radioterapia o los que sufren de infección con HIV).

Está bien reconocido que las heridas de los inmunocomprometidos, que no pueden desarrollar una respuesta inflamatoria normal después de la herida, tienden a asociarse con malos resultados de curación. Dichos pacientes se pueden beneficiar por el tratamiento con los métodos y medicamentos adecuados de la invención. La capacidad de los TGF- 3 de la invención, tales como los que comprenden las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 1 1 para promover la curación de heridas acelerada a la vez que prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices también se usa en contextos clínicos más generales. Los ejemplos de estos otros beneficios se pueden considerar en referencia con la curación de heridas por intención primaria, secundaria o terciaria, como se describe a continuación. Para los fines de la presente invención, se puede considerar que la curación por intención primaria involucra el cierre por medios quirúrgicos (tal como suturas, tiras adhesivas o grapas) de los márgenes opuestos de una herida. La curación por intención primaria se emplea normalmente en el tratamiento de incisiones quirúrgicas u otras heridas limpias, y se asocia con niveles mínimos de pérdida de tejido. Los expertos reconocerán debido a que los TGF- 3 de la invención (tal como los que comprenden las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 1 1) son capaces de reducir el ancho de la herida, también facilitan la unión de los bordes opuesto de la herida, y en consecuencia pueden ser beneficiosos para la curación de heridas por intención primaria. Además, dichos métodos o medicamentos may (como se describen a continuación) producen la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices que de otro modo pueden ocurrir en dicha curación. Los inventores consideran que el tratamiento de esta manera puede tener impacto en la apariencia tanto macroscópica como microscópica de las cicatrices que se forman a partir de las heridas tratadas; microscópicamente las cicatrices pueden ser menos perceptibles y combinarse con la piel circundante, microscópicamente las cicatrices pueden exhibir una regeneración de una estructura de piel más normal. Para los fines de la presente invención, se considera que la curación por intención secundaria constituye el cierre de las heridas por la curación del proceso de las heridas, sin intervención quirúrgica directa. Las heridas curadas por intención secundaria se pueden someter a cuidado continuo (por ejemplo el vendaje y re-vendaje de la herida así como la aplicación de los medicamentos adecuados), pero es el proceso natural de formación del tejido de granulación y la reepitelización los que causan el cierre de la herida. Se apreciará que debido a que los TGF-P3 de la invención (tal como los que comprenden las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 1 1 ) pueden aumentar la velocidad de reepitelización y disminuir la posterior formación de cicatrices en comparación con lo que ocurre en las heridas control estos tienen utilidad en la promoción de la curación de heridas por intención secundaria. La curación por intención terciaria se puede considerar que comprende el cierre quirúrgico de una herida que previamente se ha dejado abierta para permitir al menos formación del tejido de granulación y la reepitelización parciales. Las propiedades de los métodos y medicamentos de la invención preferidos los hacen adecuados para el uso en la curación por intención primaria o secundaria son también beneficiosos en el contexto de la promoción de la curación de heridas por intención terciaria. El uso de los TGF-P3 de la invención tales como las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 1 1 3 para estimular la reepitelización (como parte de su promoción de la curación de heridas acelerada) mientras que inhibe la formación de cicatrices también es particularmente efectivo en el tratamiento de las heridas asociadas con procedimientos de injerto. El tratamiento mediante estos métodos y medicamentos de la invención es beneficioso tanto en un sitio dador del injerto (donde puede ayudar en el restablecimiento de una capa epitelial funcional a la vez que previene, reduce o inhibe la formación de cicatrices), y como en los sitios receptores del injerto (donde los efectos anti-formación de cicatrices del tratamiento inhibe la formación de cicatrices, a la vez que curación acelerada promueve la integración del tejido injertado). Los inventores consideran que los métodos y medicamentos de la invención confieren ventajas en los contextos de los injertos que utilizan piel, piel artificial o sustitutos de piel. Los inventores han hallado que los métodos y medicamentos de la invención que utilizan TGF- 3 que comprenden las SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9 o 1 1 pueden promover la curación de heridas acelerada con inhibición de la formación de cicatrices cuando se administran antes de la herida, o una vez que la herida ya se ha formado. Los inventores han hallado que los o medicamentos de la invención que utiliza TGF- 3, tal como los que comprenden las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 1 1 , son capaces de promover la regeneración epitelial. La promoción de la regeneración epitelial dentro del contexto de la presente invención se puede considerar que abarca cualquier aumento de la regeneración epitelial en comparación con la regeneración que ocurre en el epitelio control tratado o no tratado. La velocidad de regeneración epitelial obtenida usando los métodos o medicamentos adecuados de acuerdo con la invención se pueden comparar fácilmente con el que tiene lugar en los epitelios control tratados o no tratados usando cualquier modelo de regeneración epitelial conocido en el arte. Por ejemplo, se puede comparar la velocidad en la que se regeneran los sitios de daño epitelial experimental que tienen áreas conocidas usando modelos in vivo bien conocidos en ratones, ratas, conejos o cerdos tales como los descriptos en Tomlinson y Ferguson (2003), Davidson et al. (1991 ) y Paddock et al. (2003).

Sin desear estar ligado a ninguna hipótesis los inventores consideran que la promoción de la regeneración epitelial obtenida por los TGF- 3 de la invención es mediada por la promoción de los monómeros de la migración de las células epiteliales. Las células epiteliales (cuya migración se ha promovido) en consecuencia son capaces de repoblar y regenerar el epitelio dañado más rápidamente que los que ocurre en ausencia de tratamiento. Se apreciará que la promoción de la regeneración epitelial usando los TGF- 3 de la invención puede ser útil para inducir la reepitelización efectiva en contextos en que la respuesta de reepitelización está alterada, inhibida, retardada o defectuosa de algún otro modo. La promoción de la regeneración epitelial también se puede efectuar para acelerar la tasa de respuestas de regeneración epitelial normal o defectuosa de los pacientes que sufren de daño epitelial Existen muchos contextos en los que la respuesta de reepitelización del cuerpo puede ser defectuosa. Por ejemplo, la reepitelización defectuosa de la piel es asocia con patologías tales como pénfigo, enfermedad de Hailey-Hailey (pénfigo benigno familiar), necrólisis epidérmica tóxica (TEN)/sindrome de Lyell, epidermolisis hullosa, leishmaniasis cutánea y queratosis actínica. La reepitelización defectuosa de los pulmones se puede asociar con fibrosis pulmonar ¡diomática (EPF) o enfermedad pulmonar intersticial. La reepitelización defectuosa del ojo se puede asociar con patologías tales como deficiencia parcial de células madre límbicas o erosiones corneanas. La reepitelización defectuosa del aparato gastrointestinal o colon se puede asociar con patologías tales como fisuras anales crónicas (fisura de ano), colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn, y otros trastornos intestinales inflamatorios. Tal como se estableció anteriormente, los TGF^3 de la presente invención se pueden usar para prevenir, reducir o inhibir de otro modo la formación de cicatrices. Esta inhibición de la formación de cicatrices se puede efectuar en cualquier sitios del cuerpo y cualquier tejido u órgano, que incluye piel, ojo, nervios, tendones, ligamentos, músculo y cavidad oral (que incluye los labios y el paladar), así como órganos internos (tal como hígado, corazón, cerebro, cavidad abdominal, cavidad pélvica, cavidad torácica, intestinos y tejido reproductor). En la piel, el tratamiento puede mejorar el aspecto macroscópico y microscópico de las cicatrices; desde el punto de vista macroscópico las cicatrices pueden ser menos visibles y combinarse con la piel circundante, desde el punto de vista microscópico las fibras de colágeno de la cicatriz pueden tener una morfología y organización que es más similar que la de la piel circundante. Se debe entender que la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices dentro del contexto de la presente invención abarca cualquier grado de prevención, reducción o inhibición in formación de cicatrices en comparación con el nivel de formación de cicatrices que ocurre en la herida control tratada y no tratada (definida en otra parte de la memoria descriptiva). Excepto cuando el contexto lo requiera lo contrario las referencias a "prevención", "reducción" o "inhibición" de la formación de cicatrices se pueden toma como mecanismos equivalentes que se manifiestan en la actividad de anti-formación de cicatrices. La prevención, reducción o inhibición de formación de cicatrices dérmicas obtenida usando métodos y medicamentos de la invención se puede evaluar y/o medir con referencia al aspecto microscópico o, con preferencia, macroscópico de una cicatriz tratada en comparación con el aspecto de una cicatriz no tratada. Con más preferencia al prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede evaluar con referencia al aspecto tanto macroscópico como microscópico de un cicatriz tratada. Para los presentes fines una "cicatriz tratada" se puede definir como una cicatriz formada por la curación de una herida tratada, mientras que una "cicatriz no tratada" se puede definir como una cicatriz formada por la curación de una herida no tratada, o una herida tratada con placebo o atención estándar. Las cicatrices de comparación adecuadas con preferencia se pueden emparejar con la cicatriz tratada con respecto a edad, sitio, tamaño de la cicatriz y el paciente. Al considerar el aspecto macroscópico de una cicatriz resultante de una herida tratada, se puede evaluar el grado de formación de cicatrices, y en consecuencia la magnitud de cualquier prevención, inhibición o reducción de la formación de cicatrices obtenida con referencia a algunos de muchos parámetros. Los parámetros adecuados para la evaluación macroscópica de cicatrices pueden incluir: i) Color de la cicatriz. Como se indicó anteriormente, las cicatrices normalmente pueden ser hipopigmentada o hiperpigmentada con respecto a la piel circundante. La inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la pigmentación de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la de piel sin cicatrices que la pigmentación de una cicatriz no tratada. De modo similar, las cicatrices pueden ser más rojas que la piel circundante. En este caso la inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando el enrojecimiento de una cicatriz tratada se atenúa más temprano o más completamente, o se asemeja más estrechamente al aspecto de la piel circundante, en comparación con una cicatriz no tratada. ii) Altura de la cicatriz. Las cicatrices normalmente pueden estar elevadas o hundidas en comparación con la piel circundante. La inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la altura de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la de una piel sin cicatrices (es decir, ni levantada ni hundida) que a la altura de una cicatriz no tratada. iii) Textura superficial de la cicatriz. Las cicatrices pueden tener superficies que son relativamente más suaves que la piel circundante (que genera una cicatriz con un aspecto "brillante") o que son más rugosas que la piel circundante. La inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la textura de superficie de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la de una piel sin cicatrices que a la textura de superficie de una cicatriz no tratada. iv) Rigidez de la cicatriz. La composición y estructura anormales de las cicatrices hacen que estas sean normalmente más rígidas que la piel no dañada que rodea la cicatriz. En este caso, la inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la rigidez de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la de una piel. Una cicatriz tratada con preferencia demostrará prevención, inhibición o reducción de la formación de cicatrices evaluada con referencia a al menos uno de los parámetros de evaluación macroscópica expuestos anteriormente. Con más preferencia, una cicatriz tratada puede demostrar una formación de cicatrices prevenida, reducida o inhibida con al menos dos de los parámetros, aun con más preferencia al menos tres de los parámetros, y con máxima preferencia con los cuatro parámetros. Se puede realizar una evaluación global de la formación de cicatrices usando, por ejemplo, una escala visual analógica o una escala de evaluación digital. Los parámetros adecuados para la evaluación microscópica de las cicatrices pueden incluir: i) Espesor de fibras de la matriz extracelular (ECM). Las cicatrices normalmente contienen fibras de la ECM más delgadas que las halladas en la piel circundante. Esta propiedad es aún más pronunciada en el caso las cicatrices queloides e hipertróficas. La inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando el espesor de las fibras de ECM de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente al espesor de las fibras de ECM halladas en la piel sin cicatrices que al espesor de las fibras halladas en una cicatriz no tratada. ii) Orientación de Las fibras de ECM. Las fibras de ECM halladas en las cicatrices tienden a exhibir un mayor grado de alineamiento entre sí que las halladas en la piel sin cicatrices (que tienen una orientación al azar frecuentemente denominada como "tejido de canasta"). La ECM de las cicatrices patológicas tales como cicatrices queloides e hipertróficas pueden exhibir orientaciones aún más anómalas, con frecuencia forman grandes "espirales" o "cápsulas" moléculas de ECM. Por consiguiente, la inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la orientación de las fibras de ECM en una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la orientación de las fibras de ECM halladas en la piel sin cicatrices que a la orientación de dicha fibras en una cicatriz no tratada. iii) Composición de ECM de la cicatriz. La composición de las moléculas de ECM presentes en las cicatrices muestra diferencias de las halladas en la piel normal con una reducción de la cantidad de elastina presente en la ECM de las cicatrices. En consecuencia la inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la composición de las fibras de ECM de la dermis de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la composición de dichas fibras halladas en la piel sin cicatrices que a la composición hallada en una cicatriz no tratada. iv) Celularidad de la cicatriz. Las cicatrices tienden a contener relativamente menos células que la piel sin cicatrices. En consecuencia se apreciará que la inhibición o reducción de la formación de cicatrices se puede demostrar cuando la celularidad de una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la celularidad de la piel sin cicatrices que a la celularidad de una cicatriz no tratada. Una cicatriz tratada con preferencia demostrará la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices evaluada con referencia a al menos uno de los parámetros de la evaluación microscópica expuesta anteriormente. Con más preferencia a cicatriz tratada, se puede demostrar la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices con referencia a al menos dos de los parámetros, aun con más preferencia al menos tres de los parámetros, y con máxima preferencia a cuatro de estos parámetros. La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices de una herida tratada se puede evaluar adicionalmente con referencia a parámetros adecuados en: i) evaluación clínica macroscópica de las cicatrices, en particular la evaluación de las cicatrices en un sujeto; ¡i) evaluación de imágenes fotográficas de las cicatrices; iii) evaluación de moldes de silicona o moldes de plástico positivos hechos de molde de silicona de las cicatrices; y iv) evaluación microscópica de las cicatrices, por ejemplo por análisis histológico de la estructura microscópica de las cicatrices.

Se apreciará que la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices de una herida tratada puede estar indicada por la mejora de uno o más de dichos parámetros adecuado, y que en el caso de la prevención, reducción o inhibición evaluada con referencia a diversos parámetros, que estos parámetros se pueden combinar en diferentes esquemas de evaluación (por ej., reducción, inhibición o mejora de al menos un parámetro usado en la evaluación macroscópica y al menos un parámetro usado en la evaluación microscópica). La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por una mejora de uno o más de los parámetros que indican que una cicatriz tratada se aproxima más estrechamente a la piel sin cicatrices con referencia a los parámetros seleccionados que una cicatriz no tratada o control. Los parámetros adecuados para la medición y evaluación clínica de las cicatrices se pueden seleccionar sobre la base de una variedad de medidas o evaluaciones que incluyen las descriptas por Beausang et al ( 998) y van Zuijlen et al (2002). Normalmente, los parámetros adecuados pueden incluir: 1 . Evaluación con respecto a la escala visual analógica (VAS) de clasificación de cicatriz La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por una reducción en el puntaje de la VAS de una cicatriz tratada cuando se compara con una cicatriz control. Una VAS adecuada para usar en la evaluación de las cicatrices se puede basar en el método descripto por Beausang et al (1998). 2. Altura de la cicatriz, ancho de la cicatriz, perímetro de cicatriz, área de cicatriz o volumen de cicatriz a altura y el ancho de las cicatrices se pueden medir directamente en el sujeto, por ejemplo, por el uso de dispositivos de medición manual tales como calibres. El ancho, el perímetro y el área de la cicatriz se pueden medir directamente en el sujeto o por análisis de imagen de las fotografías de la cicatriz. Los expertos conocerán los métodos y dispositivos no invasivos que se pueden usar para investigar parámetros adecuados, que incluyen moldeado en silicona, ultrasonido, perfilometría óptica tridimensional e imágenes de resonancia magnética de alta resolución. La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por una reducción de altura, ancho, área o volumen, o cualquiera de sus combinaciones de una cicatriz tratada en comparación con una cicatriz no tratada. 3. Aspecto y/o color de la cicatriz comparada con la piel circundante sin cicatrices El aspecto o color de una cicatriz tratada se puede comparar con el de la piel circundante sin cicatrices, y las diferencias (si existen) se compararon con la diferencia entre el aspecto y el color de las cicatrices no tratadas y la piel sin cicatrices. Dicha comparación se puede realizar sobre la base de una evaluación visual de las cicatrices respectivas y la piel sin cicatrices. El aspecto de una cicatriz se puede comparar con la piel sin cicatrices con referencia a si la cicatriz es más clara o más oscura que la piel sin cicatrices. Los colores respectivos de las cicatrices y la piel pueden estar perfectamente emparejados entre sí, relativamente mal emparejados, obviamente mal emparejados o extremadamente mal emparejados. En forma alternativa o adicional a la evaluación visual, existen numerosos dispositivos colorimétricos no invasivos que pueden proporcionar datos con respecto a la pigmentación de las cicatrices y piel sin cicatrices, así como del enrojecimiento de la piel (que puede ser un indicador del grado de vascularización presente en la cicatriz o la piel). Los ejemplos de dichos dispositivos incluyen Minolta Chronameter CR-200/300; Labscan 600; Dr. Lange Micro Colour; Derma Spectrometer; medidor de flujo láser-Doppler; y análisis espectrofotómetrico intracutáneo (SIA). La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por una menor magnitud de diferencia entre el aspecto o el color de las cicatrices tratadas y la piel sin cicatrices que entre las cicatrices no tratadas y la piel sin cicatrices. 4. Distorsión de la cicatriz y desempeño mecánico La distorsión de la cicatriz se puede evaluar por la comparación visual de una cicatriz y la piel sin cicatrices. Una comparación adecuada puede clasificar una cicatriz seleccionada como que no causa distorsión, distorsión leve, distorsión moderada o distorsión severa. El desempeño mecánico de las cicatrices se puede evaluar usando varios métodos y dispositivos no invasivos basados en succión, presión, torsión, tensión y acústica. Los ejemplos adecuados que incluyen los dispositivos conocidos que se pueden usar en la evaluación del desempeño mecánico de las cicatrices incluyen el indentómetro, cutómetro, reviscómetro, analizas viscoelástico de la piel, Dermaflex, durómetro, medido de torque térmico, elastómetro. La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por una reducción de la distorsión causada por las cicatrices tratadas en comparación con la causada por las cicatrices no tratadas. Se apreciará que la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por el desempeño mecánico de la piel sin cicatrices que es más similar al de las cicatrices tratadas que al de las cicatrices no tratadas. 5. Contorno de la cicatriz y textura de la cicatriz El contorno de la cicatriz se puede investigar por medio de la evaluación visual. Los parámetros adecuados para considerar en dicha evaluación incluye si una cicatriz está nivelada o no con la piel circundante, ligeramente sobresalientes, ligeramente hendida, hipertrófica o queloide. La textura de una cicatriz se puede evaluar con referencia a aspecto de la cicatriz, y esto se puede realizar por una evaluación visual respecto de si la cicatriz, por ejemplo, es mate o brillante o tiene aspecto rugoso o liso en comparación con la piel sin cicatrices. La textura de la cicatriz se puede evaluar adicionalmente con referencia a si la cicatriz tiene la misma textura que la piel sin cicatrices (textura normal), es solo palpable, firme o dura en comparación con la piel sin cicatrices. La textura de las cicatrices también se puede evaluar con referencia a la escala de Hamilton (descripta en Crowe et al, 1998). Además de las técnicas expuestas anteriormente, existen numerosos dispositivos perfilométricos no invasivos que usan métodos ópticos o mecánicos para la evaluación del contorno y/o la textura de la cicatriz. Dichas evaluaciones se pueden llevar a cabo en el cuerpo del sujeto o, por ejemplo, en impresiones de molde de silicona de las cicatrices, o en moldes positivos hechos con estas impresiones. La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar en el caso de que las cicatrices tratadas tengan perfiles y textura de cicatriz más comparables con la piel sin cicatrices que las cicatrices no tratadas.

Evaluaciones fotográficas Panel de posición independiente La evaluación fotográfica de las cicatrices tratadas y no tratadas puede ser realizada por un panel de asesores de posición independiente y las fotografías estandarizadas y calibradas de las cicatrices. Las cicatrices pueden ser evaluadas por un panel de posición independiente para proporcionar datos de clasificación en categorías (por ej., que una cicatriz tratada dada "mejor", "peor" o "no diferente" cuando se compara con una cicatriz no tratada) y datos cuantitativos usando una escala visual analógica (VAS) basada en el método descrípto por Beausang et al (1998). La captura de estos datos pueden utilizar programas de computación y/o sistemas electrónicos adecuados descriptos en la solicitud de patente en trámite de los solicitantes.

Panel de expertos La evaluación fotográfica de las cicatrices tratadas y no tratadas puede ser realizada en forma alternativa por un panel de asesores expertos fotografías estandarizadas y calibradas de las cicatrices por evaluar. El panel de expertos con preferencia consiste en experto en el arte tales como cirujanos plásticos y científicos de antecedentes adecuados.

Dicha evaluación puede proporcionar datos de categorización, como se describió antes o con respecto a la comparación de imágenes con el transcurso del tiempo de cicatrices tratadas y no tratadas seleccionadas. Las evaluaciones adecuadas realizadas pueden incluir: La identificación de la mejor cicatriz, que a los fines de la presente invención se puede considerar que es la cicatriz que se asemeja más estrechamente a la piel circundante. Una vez que la mejor cicatriz ha sido identificada se puede considerar la magnitud de diferencia entre las cicatrices, por ejemplo es la diferencia entre las cicatrices leves u obvias. Otros parámetros que se pueden considerar incluyen el tiempo más inmediato después la formación de cicatriz en el que se pueden detectar diferencias entre las cicatrices, el tiempo después de la formación en que la diferencia entre las cicatrices es más obvia (o alternativamente el hallazgo de que la diferencia continúa después del último punto de tiempo evaluado), asi como considerar si la cicatriz mejor permanece o no en forma constante mejor. También se toma en consideración si una cicatriz es o no proporcionalmente más roja que la otra, y si el enrojecimiento se atenúa en los tiempo de tiempo considerados (o continúa después del último punto de tiempo) y si es asi, a qué tiempo después de la formación de la cicatriz. Un panel experto también puede considerar en qué tiempo después de la formación se hace detectable cualquier diferencia de enrojecimiento, asi como el tiempo después de la formación en que la diferencia de enrojecimiento es más obvia.

Un panel experto también puede considerar si una cicatriz tratada o no tratada es o no proporcionalmente más blanca que la piel sin cicatrices. En el caso que sea detectable una diferencia en la blancura se puede tomar en consideración el tiempo después de la formación de la cicatriz en que se puede detectar la diferencia, el tiempo en que la diferencia es más obvia y el tiempo en que la diferencia desaparece. Otro parámetro que puede ser evaluado por un panel de expertos es la textura de cicatrices tratadas y no tratadas. En la comparación de cicatrices tratadas y no tratadas panel de expertos puede considerar cual de las cicatrices tiene la mejor textura de piel, el tiempo más inmediato después de la formación de la cicatriz en que se puede detectar cualquier diferencia presente, el tiempo posterior a la formación en que cualquier diferencia es más obvia, y el tiempo en que cualquier diferencia desaparece. La comparación de cicatrices tratadas y no tratadas puede evaluar adicionalmente, cuál de las cicatrices es más angosta, y cuál de las cicatrices es más corta. También se puede tomar en consideración la forma de la cicatriz y la proporción del margen de la cicatriz que se puede distinguir de la piel circundante. Como se describió previamente también se pueden considerar las evaluaciones visuales y las evaluaciones de color, presencia, grado y ubicación de la hiperpigmentación. Como se indicó anteriormente, una de las maneras en que se puede comparar la calidad de las cicatrices tratadas y no tratadas es por la evaluación microscópica. La evaluación microscópica de la calidad de la cicatriz normalmente se puede llevar a cabo usando secciones histológicas de las cicatrices. El proceso de la evaluación y medición microscópica de las cicatrices puede tomar en consideración los datos de categorización basados en los siguientes parámetros adecuados: 1. Restitución epidérmica. Se debe prestar atención particular al grado de restauración de las crestas interpapilares y el espesor de la epidermis restaurada. 2. Angiogénesis e inflamación. Se puede tomar en consideración el número de vasos sanguíneos presentes, el tamaño de los vasos sanguíneos presentes y la evidencia de inflamación, que incluye una evaluación de cualquier nivel de inflamación presente. 3. Organización del colágeno. En la evaluación de la organización del colágeno se puede hacer referencia de las fibras de colágeno presentes en la cicatriz, la densidad de dichas fibras y el grosor de la fibra de colágeno en la dermis papila y reticular. 4. La evaluación de la escala visual analógica (VAS) de la organización del colágeno para la dermis papilar y para la dermis reticular también puede proporcionar un índice de la calidad de la cicatriz. 5. Otros rasgos que se pueden tomar en cuenta para evaluar la calidad microscópica de las cicatrices incluyen la elevación o depresión de la cicatriz respecto de la piel circundante sin cicatrices y la prominencia o visibilidad de la cicatriz en la interfaz dérmica normal. 6. Se observará que las evaluaciones descriptas anteriormente permiten la generación de datos de clasificación de cicatrices que permiten proporcionar una indicación respecto de si una cicatriz tratada es mejor, peor o no diferente comparada con una cicatriz control, no tratada u otro comparador adecuado. Además de los datos de categorización, se pueden generar datos cuantitativos (con preferencia relacionados con los parámetros anteriores) usando análisis de imagen en combinación con técnicas de visualización adecuadas. Los ejemplos de técnicas de visualización adecuadas que se pueden emplear en la evaluación de la calidad de la cicatriz son tinturas histológicas o de ¡nmunomarcación específicas, en donde se puede determinar cuantitativamente el grado de tinción o marcación por análisis de imagen. Los datos cuantitativos se pueden producir en forma útil y fácil en relación con los siguientes parámetros: 1. Ancho, altura, elevación, volumen y área de la cicatriz. 2. Espesor epitelial y área de cobertura (por ejemplo, el área de epidermis presente en una cicatriz o la proporción de una herida con cobertura epidérmica). 3. Número, tamaño, área (es decir, transversal) y ubicación de los vasos sanguíneos. 4. Grado de inflamación, número, ubicación y poblaciones/tipos de células inflamatorias presentes. 5. Organización del colágeno, espesor de la fibra de colágeno, densidad de la fibra de colágeno. La prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar por un cambio en cualquiera de los parámetros considerados anteriormente, de modo que una cicatriz tratada se asemeje más estrechamente a una piel sin cicatrices que una cicatriz control o no tratada (u otro comparador adecuado). Las evaluaciones y parámetros descriptos son adecuados para las comparaciones de los efectos de los péptidos o medicamentos de la invención en comparación con el tratamiento control, placebo o atención estándar en animales o humanos. Se pueden usar pruebas estadísticas apropiadas para analizar los conjuntos de datos generados a partir de diferentes tratamientos a fin de investigar la significación de los resultados. Con preferencia la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar con referencia a más de un parámetro. Con más preferencia, la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar con referencia a un parámetro clínico (es decir, observado en el sujeto) y un parámetro fotográfico. Aun con más preferencia la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar con referencia a un parámetro clínico, un parámetro fotográfico y también un parámetro de evaluación microscópica (por ejemplo un parámetro histológico). Con máxima preferencia, la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede demostrar con referencia a un puntaje de VAS clínico, puntaje VAS de panel de posición externa y clasificación (a partir de imágenes fotográficas) y puntaje VAS microscópico de la dermis reticular. El uso de métodos y medicamentos de la invención adecuados permite producir una rápida mejora del aspecto cosmético de un área lesionada así tratada. Las consideraciones cosméticas son importantes en varios contextos clínicos, en particular cuando las heridas se forman en sitios del cuerpo importantes tales como cara, cuello y manos. En consecuencia la inhibición de la formación de cicatrices (que con preferencia puede estar en combinación con la curación de heridas acelerada) en dichos sitios donde se desea mejorar el aspecto cosmético de la cicatriz formada representa una modalidad preferida de la invención. Además de su impacto cosmético la formación de cicatrices de la piel es responsable de una cantidad de efecto deletéreos que afectan a los sufren de dicha formación de cicatrices. Por ejemplo, la formación de cicatrices en la piel se puede asociar con reducción de la función física y mecánica, en particular en el caso de las cicatrices contráctiles (tales como las cicatrices hipertróficas) y/o situaciones en las que las cicatrices se forman en las articulaciones. En estos casos, las propiedades mecánicas alteradas de la piel con cicatrices, en contraste con la piel sin cicatrices, y los efectos de la contracción de la cicatriz pueden llevar al movimiento drásticamente restringido de una unión (articulación) efectuada de este modo. Por consiguiente se prefiere una modalidad en que los medicamentos y métodos de la invención adecuados sean usados para prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices e heridas que cubren las articulaciones del cuerpo (con preferencia que también aceleren la curación de dichas heridas). En otra modalidad preferida, los medicamentos y métodos de la invención adecuados se pueden usar para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices de heridas con alto riesgo de formar una cicatriz contráctil. El grado de formación de la cicatriz, y en consecuencia el grado de deterioro cosmético u otro que puede ser causado por la cicatriz, también puede estar influido por factores tales como la tensión del sitio en que se forma la herida. Por ejemplo, se sabe que la piel bajo tensión relativamente alta (tal como la que se extiende sobre el tórax, o asociada con lineas de tensión) puede estar predispuesta a la formación de cicatrices más graves que en otros sitios corporales. En consecuencia, en una modalidad preferida los medicamentos y métodos de la invención adecuados se pueden usar para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices de heridas ubicadas en sitios de alta tensión cutánea. Existen muchos procedimientos quirúrgicos que se pueden usar en la corrección de la cicatriz para permitir el realineamiento de las heridas y las cicatrices de modo que estas sean sujeto para la tensión reducida. Probablemente el más conocido de estos es la "plastia en Z" en la que dos colgajos en forma de V de la piel se transponen para permitir la rotación de una línea de tensión. En consecuencia en una modalidad más preferida dichos medicamentos y métodos de la invención se usan para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices de heridas durante la corrección quirúrgica de las cicatrices desfigurantes. La formación de cicatrices patológicas puede tener efectos deletéreos más pronunciados que se originan como resultado de la formación normal de cicatrices relativamente severas. Los ejemplos comunes de cicatrices patológicas incluyen cicatrices hipertróficas y queloides. Se reconoce que ciertos tipos de heridas o ciertos individuos pueden estar predispuestos a la formación de cicatrices patológicas. Por ejemplo, se puede considerar que los individuos de herencia afrocaribeña, japonesa o mongoloide, o los que tienen antecedentes familiares de formación de cicatrices patológicas tienen riesgo aumentado de formación de cicatriz hipertrófico o queloide. Las heridas de niños, y en particular las heridas de quemaduras de niños, también se asocian con aumento de la formación de cicatrices hipertróficas. Por consiguiente se prefiere una modalidad de la invención en que los medicamentos y métodos adecuados se usen para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices de las heridas en las que hay un riesgo aumentado de formación de cicatrices patológicas. Si bien los individuos ya sujeto de la formación de cicatrices patológicas sufren de una predisposición para la formación de cicatriz adicional excesiva a menudo es clínicamente necesario corregir quirúrgicamente las cicatrices hipertróficas o queloides, con un riesgo acompañante de la consecuente formación de cicatrices patológicas. En consecuencia, en una modalidad preferida de la invención, los medicamentos y métodos adecuados se usan para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices de heridas producidas por la corrección quirúrgica de cicatrices patológicas. Se reconoce que las heridas resultantes de las lesiones por quemaduras (que para los fines de la presente invención también abarcan las lesiones por escaldadura que involucran los gases o líquidos calientes) se pueden extender en grandes áreas de un individual afectado de este modo. Por consiguiente, las quemaduras puede originar la formación de la cicatriz que cubre una gran proporción del cuerpo de un paciente, de este modo aumenta el riesgo de que la cicatriz formada cubra área de importancia cosmética elevada (tal como cara, cuello, brazos o manos) o de importancia mecánica (en particular las regiones que cubren o rodean a las articulaciones). Las lesiones por quemaduras causadas por líquidos calientes con frecuencia son sufridas por los niños (por ejemplo como resultado del volcado de sartenes, pavas o o similares) y, debido al tamaño corporal relativamente más pequeño de los niños, es particularmente probable que estas lesiones causen daño extenso en una alta proporción del área corporal. En otra modalidad preferida de la invención los medicamentos y métodos adecuados se usan para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices de heridas producidas por lesiones por quemaduras. Como se indicó anteriormente, la curación de heridas como respuesta a las lesiones por quemaduras con frecuencia se asocia con los resultados adversos de la formación de cicatrices, tal como la formación de las cicatrices hipertróficas. Otra consecuencia del tamaño relativamente grande de las lesiones por quemaduras es que estas son particularmente sensibles a las complicaciones tales como infección y desecación que se originan debido a la carencia de una capa epitelial funcional. A la luz de lo anterior se apreciará que los métodos y medicamentos de la invención adecuados se pueden usar en el tratamiento de las lesiones por quemaduras para reducir el nivel de formación de cicatrices producidas como resultado de la herida y/o acelerar la reconstitución de una barrera epitelial funcional. Los inventores han hallado que los métodos y medicamentos de la invención que utilizan los TGF-P3 de la invención son capaces de promover la re-epitelización. Por consiguiente dichos métodos y medicamentos son particularmente efectivos en tratamiento de todas las lesiones que involucran el daño a una capa epitelial. Dichas lesiones se ejemplifica, sin limitación por lesiones en la piel, en que se daña la epidermis. Sin embargo se apreciará que dichos métodos y medicamentos de la invención también son aplicables a otros tipos de heridas en las que se dañan los epitelios, tales como lesiones que involucran los epitelios respiratorios, epitelios digestivos o epitelios circundantes de los tejidos u órganos internos (tales como los epitelios del peritoneo). La curación de las heridas que involucran el peritoneo (el revestimiento epitelial de los órganos internos, y/o el interior de la cavidad corporal) con frecuencia puede originar adhesiones. Dichas adhesiones con una consecuencia común de la cirugía que involucra tejidos ginecológicos o intestinales. Los inventores consideran que la capacidad de los métodos y medicamentos de la invención (tales como los que comprenden los TGF- 3 expuestos en las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 1 1 ) para acelerar la regeneración del peritoneo a la vez que reducir la formación de cicatrices puede reducir la incidencia de fijación inapropiada de porciones del peritoneo entre si, y de este modo se reduce la aparición de adhesiones. Por consiguiente, el uso de dichos métodos y medicamentos de la invención para prevenir la formación de adhesiones intestinales o ginecológicas representa una modalidad preferida de la invención. En efecto el uso de dichos métodos o medicamentos de la invención en la curación de cualquier herida que involucre al peritoneo es una modalidad preferida. Los métodos y medicamentos de la invención se pueden usar profilácticamente, por ejemplo en sitios donde no existe herida pero donde de otro modo se podría originar una cicatriz o formarse una herida crónica. A modo de ejemplo los medicamentos de acuerdo con la invención se pueden administrar en sitios que experimentarán herida como resultado de procedimientos elegidos (tales como cirugía), o en sitios que se consideran de alto riesgo de herida. Se puede preferir que los medicamentos de la invención se administren en el sitio alrededor del momento de la herida, o inmediatamente antes de la formación de una herida (por ejemplo en periodo de hasta seis horas antes de la herida) o los medicamentos se pueden administrar en un tiempo inmediatamente antes de la herida (por ejemplo hasta 48 antes de la formación de la herida). Los expertos apreciarán que los momentos de máxima preferencia de administración antes de la formación de una herida se determinarán con referencia a diversos factores, que incluyen la formulación y vía de administración del medicamento seleccionado, la dosis del medicamento administrado, el tamaño y naturaleza de la herida que se forma y el estado biológico del paciente (que se puede determinar con referencia a factores tales como edad, salud y predisposición a las complicaciones de curación o formación de cicatrices adversas del paciente). El uso profiláctico de los métodos y medicamentos de acuerdo con la invención es una modalidad preferida de la invención, y es particularmente preferida para la promoción de la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices en el contexto de las heridas quirúrgicas. Los métodos y medicamentos de la invención también pueden promover la curación de heridas acelerada y/o la formación de cicatrices inhibida si se administra después de que se ha formado una herida. Se prefiere que dicha administración debería ocurrir tan temprano como sea posible después de la formación de la herida, pero los agentes de la invención pueden promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices en cualquier momento hasta que se haya completado el proceso de curación (es decir, incluso en el caso de una herida ya se haya curado parcialmente, los métodos y medicamentos de la invención se pueden usar para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices respecto de la porción no curada restante). Se apreciará que la "ventana" en que se pueden usar los métodos y medicamentos de la invención para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices depende de la naturaleza de la herida en cuestión (que incluye el grado de daño que ha producido y el tamaño del área herida). De este modo en el caso de una herida grande los métodos y medicamentos de la invención se pueden administrar relativamente tarde en la respuesta de curación, ya que aún pueden promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices. Los métodos y medicamentos de la invención, por ejemplo, con preferencia se pueden administrar dentro de las primeras 24 horas después de que se forma una herida, pero aún pueden promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices si se administran hasta diez, o más días después de la herida.

Los métodos y medicamentos de la invención se pueden administrar en una o más ocasiones, según corresponda, a fin de promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices. Por ejemplo, se pueden administrar cantidades terapéuticamente efectivas de los medicamentos a una herida tan frecuentemente como se requiera hasta completar el proceso de curación. A modo de ejemplo, los medicamentos de la invención se pueden administrar diariamente o dos veces por día a una herida durante al menos los primeros tres días posteriores a la formación de la herida. Con máxima preferencia los métodos y medicamentos de la invención se pueden administrar tanto antes como después de la formación de una herida. Los inventores han hallado que la administración de los medicamentos de la invención inmediatamente antes de la formación de una herida, seguido por la administración diaria de dichos agentes en los dais posteriores a la herida, es particularmente efectivo para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices. Para los fines de la presente memoria descriptiva por "agente" o "agente de la invención" se entiende TGF- 3 de la invención biológica o terapéuticamente activo, los fragmentos biológica o terapéuticamente activos de los TGF- 3 de la invención; y/o los derivados activos biológica o terapéuticamente activos de los de la invención. Los agentes de la invención también pueden incluir lo ácidos nucleicos que codifican los TGF-P3 de la invención (o fragmentos o derivados de este). Se apreciará que todos estos agentes se pueden incorporar en los medicamentos de acuerdo con la invención, y se pueden usar en los métodos o usos de la invención. Se apreciará que la cantidad de un medicamento de la invención que se debe aplicar a una herida depende varios factores tales como la actividad biológica y biodisponibilidad del agente presente en el medicamento, que a su vez depende, entro otros factores, de la naturaleza del agente y el modo de administración del medicamento. Otros factores para determinar una cantidad terapéutica adecuada de un medicamento pueden incluir. A) La vida media del agente en el sujeto tratado. B) La patología especifica tratada (por ej., herida aguda o heridas crónicas). C) La edad del sujeto. La frecuencia de administración también estará influida por los factores mencionados anteriormente y en particular la vida media del agente elegido dentro del sujeto tratado. En general cuando se usan los medicamentos de acuerdo con la invención para tratar heridas existentes, el medicamento se debería administrar tan pronto como se produzca la herida (o en el caso de las heridas que no sean inmediatamente evidentes, tales como las de los sitios corporales internos, tan pronto como la herida ha sido diagnosticada). La terapia con los métodos o medicamentos de acuerdo con la invención debería continuar hasta que el proceso de curación sea acelerado y/o prevenido, reducido o inhibido la formación de cicatrices hasta la satisfacción del médico.

La frecuencia de administración dependerá de la vida media biológica del agente usado. Normalmente se debería administrar una crema o ungüento que contiene un agente de la invención a un tejido blanco de modo que la concentración del agente en una herida se mantenga en un nivel adecuado para tener un efecto terapéutico. Esto puede requerir la administración diaria o incluso varias veces por día. Los medicamentos de la invención, se pueden administrar por cualquier vía adecuada capaz de obtener el efecto deseado de promover la curación de heridas y/o prevenir, reducir o inhibir la formación de cicatrices, pero se prefiere que los medicamentos se administren en forma local en un sitio de la herida. Los inventores han hallado que la promoción de la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se puede efectuar por la administración de un agente de la invención por inyección en el sitio de la herida. Por ejemplo, en el caso de las heridas dérmicas, los agentes de la invención se pueden administrar por medio de inyección intradérmica. En consecuencia un medicamento preferido de acuerdo con la invención comprende una solución inyectable de un agente de la invención (por ej., para la inyección alrededor de los márgenes de un sitio de daño epitelial o un sitio con probabilidades de daño). Las formulaciones adecuadas para usar en esta modalidad de la invención se consideran a continuación. En forma alternativa o adicional, los medicamentos de la invención también se pueden administrar en forma tópica para promover la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices. Dicha administración se puede efectuar como parte de la atención inicial y/o de seguimiento del área herida. Los inventores hallan que la promoción de la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices está particularmente mejorada por la aplicación tópica de un agente de la invención a una herida (o, en el caso de la aplicación profiláctica a un tejido o sitio donde se forma una herida). Las composiciones o los medicamentos que contienen los agentes de la invención pueden adoptar muchas formas diferentes que dependen en particular de la manera en que estos se usan. En consecuencia, por ejemplo, estos pueden estar en forma de un liquido, ungüento, crema, gel, hidrogel, polvo o aerosol. Todas estas composiciones son adecuadas para la aplicación tópica a una herida, que es un medio de administración preferido de los agentes de la invención a un sujeto (persona o animal) que necesita el tratamiento. Los agentes de la invención se pueden proporcionar en un vendaje o parche esmeril, que se puede usar para cubrir una herida u otro sitio de daño epitelial tratado. Se apreciará que el vehículo de una composición que comprende los agentes de la invención deber uno que sea bien tolerado por el paciente y que permita la liberación del agente a la herida. Dicho vehículo con preferencia es biodegradable, bioresolvible, bioresorbible y/o no inflamatorio.

Los medicamentos y las composiciones que comprenden los agentes de la invención se pueden usar de varias maneras. En consecuencia, por ejemplo, una composición se puede aplicaren la herida y/o alrededor de ella a fin de promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices. Si la composición se aplica a una herida "existente", entonces el vehículo aceptable para uso farmacéutico será uno que sea relativamente "moderado", es decir, un vehículo que es biocompatible, biodegradable, bioresolvible y no inflamatorio. Un agente de la invención, o un ácido nucleico que codifica dicho agente (como se considera también a continuación), se puede incorporar en un dispositivo de liberación lenta o retardada. Dichos dispositivos, por ejemplo, se pueden colocar sobre la piel o insertar debajo de ella y el agente o ácido nucleico se puede liberar durante días, semanas o aun meses. Dicho dispositivo puede ser particularmente útil para los pacientes (tal como los que sufren de heridas crónicas) que requieren la promoción de la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices a largo plazo. Los dispositivos pueden ser particularmente ventajosos cuando se usan para la administración de agente o ácido nucleico que normalmente requeriría administración frecuente (por ej., al menos administración diaria por otras vías). Las dosis diarias de un agente de la invención se pueden dar como administración única (por ej., una aplicación diaria de una formulación tópica o una inyección diaria). Alternativamente, el agente de la invención puede requerir administración dos veces o más durante un día. En otra alternativa, se puede usar un dispositivo de liberación lenta para proveer dosis óptimas de un agente de la invención a un paciente sin la necesidad de administrar dosis repetidas. En una modalidad un vehículo farmacéutico para la administración de un agente de la invención puede ser un líquido y una composición farmacéutica adecuada en forma de solución. En otra modalidad, vehículo aceptable para uso farmacéutico es un sólido y una composición adecuada está en forma de un polvo o comprimido. En una modalidad adicional el agente de la invención se puede formular como parte de un parche transdérmico aceptable para uso farmacéutico. Un vehículo sólido puede incluir una o mas sustancias que también pueden actuar como agentes saborizantes lubricantes, solubilizantes, agentes de suspensión, rellenos, deslizantes, auxiliares de compresión, aglutinantes o agentes de desintegración de comprimidos; también puede ser un material de encapsulado. En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que está en una mezcla con el agente de la invención finamente dividido. En los comprimidos, el agente de la invención se mezcla con un vehículo que tiene las propiedades de compresión necesarias en proporciones adecuadas y se compactan en la forma y tamaño deseados. Los polvos y comprimidos con preferencia contienen hasta 99% del agente de la invención. Los vehículos sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de fusión baja y resinas de intercambio iónico. Los vehículos líquidos se pueden usar para preparar soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas. El agente de la invención se puede disolver o suspender en un vehículo líquido aceptable para uso farmacéutico tal como agua, un solvente orgánico, una mezcla de ambos o aceites o grasas aceptables para uso farmacéutico. El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados tales como solubilizantes, emulsionantes, buffer, conservantes, edulcorantes, agentes saborizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, colorantes, bufferes de viscosidad, estabilizantes o bufferes osmóticos. Los ejemplos adecuados de los vehículos líquidos para la administración oral y parenteral incluyen agua (que parcialmente contienen aditivos como anteriores por ej., derivados de celulosa, con preferencia solución de carboximetilcelulosa sódica), alcoholes (que incluyen alcoholes monohídricos y alcoholes polihidricos, por ej., glicoles) y sus derivados, y aceites (por ej., aceite de coco fraccionado y aceite de maní). Para la administración parenteral, el vehículo también puede ser un éster oleoso tal como oleato de etilo y miristato de isopropilo. Los vehículos líquidos adecuados son útiles en las composiciones forma líquida estéril para la administración parenteral. El vehículo líquido para las composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propelente aceptable para uso farmacéutico.

Las composiciones farmacéuticas liquidas que son soluciones o suspensiones estériles se pueden utilizar por ejemplo, para inyección intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal, intradérmica, intraestromal (córnea) o subcutánea. Las soluciones estériles también se pueden administrar por vía intravenosa. El agente de la invención se puede preparar como una composición sólida estéril que se puede disolver o suspender en el momento de la administración usando agua estéril, solución salina u otro medio inyectable estéril apropiado. Los vehículos deben incluir aglutinantes, agentes de suspensión, lubricantes y conservantes inertes y necesarios. En la situación en que se desea administrar un agente de la invención por medio de ingestión oral, se apreciará que el agente elegido con preferencia será un agente que tenga un grado elevado de resistencia a la degradación. Por ejemplo, el agente de la invención se puede proteger (por ejemplo usando las técnicas descriptas anteriormente) de modo que se reduce su velocidad de degradación en el aparato digestivo. Las composiciones de los agentes de la invención son adecuados para usar para promover la curación de heridas acelerada y/o inhibir la formación de cicatrices en la córnea. Las heridas en la córnea pueden provenir del trauma en el ojo que surge como resultado de la lesión accidental (considerada anteriormente) o como resultado de las operaciones quirúrgicas (por ej., cirugía láser en la córnea). En este caso un medicamento de la invención preferido puede estar en forma de una gota ocular.

Los agentes de la invención se pueden usar en una variedad de heridas "internas" (es decir, heridas que aparecen dentro del cuerpo, más que en una superficie externa). En consecuencia por ejemplo, los medicamentos de acuerdo con la invención se pueden formular para la inhalación para el uso en las heridas que se originan en los pulmones u otros epitelios respiratorios. Los procedimientos conocidos, tales como los que se emplean convencionalmente en la industria farmacéutica (por ej., en experimentación in vivo, ensayos clínicos, etc), se pueden usar para establecer formulaciones especificas de las composiciones que comprenden los agentes de la invención y regímenes terapéuticos precisos para la administración de dichas composiciones (tales como dosis diarias del agente activo y la frecuencia de administración). Una dosis diaria adecuada de un agente de acuerdo con la invención puede promover la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices depende de una variedad de factores que incluyen (pero sin limitación) la naturaleza del tejido herido, área y/o profundidad de la herida tratada, la gravedad de la herida, y la presencia o ausencia de factores predisponentes a la formación de cicatrices patológicas o heridas crónicas. A modo de ejemplo, la cantidad de total un agente activo que se puede administrar a una por inyección local a una herida o sitio de daño epitelial con preferencia puede estar en la región de 50ng/100pL por centímetro lineal de herida o cm2 de daño epitelial. Dicha dosis se puede dar una vez por día hasta tres días, de este modo se proporciona una dosis total de 150 ng/centímetro lineal de herida de daño epitelial. En el caso de la aplicación tópica en herida agudas o sitios de daño epitelial, una cantidad adecuada de un agente activo puede estar con preferencia en la región de 100 ng/cm2. Dicha dosis se puede dar una vez por día hasta 3 días, de este modo se proporciona una dosis total de 300 ng/cm2 de herida o daño epitelial. A modo de ejemplo adicional, la cantidad preferida de un agente activo administrada en forma diaria a una herida o sitio de daño epitelial puede estar en la región de 50 ng/centímetro lineal de herida o daño epitelial (si se administra por inyección), o 100 ng/cm de herida o daño epitelial (si se administra en forma tópica). A modo de otro ejemplo adicional, la cantidad de un agente activo que se puede administrar a una herida o sitio de daño epitelial en una sola incidencia de tratamiento con preferencia puede estar en la región de 50-200 ng/centímetro lineal de herida o daño epitelial (si se administra por inyección), o 100-300 ng/cm2 de herida o daño epitelial (si se administra en forma tópica). La cantidad de un agente de acuerdo con la invención necesaria para el tratamiento de las heridas u otros sitios de daño epitelial normalmente estarán estará en el rango de 1 pg a 1 mg del agente administrado por centímetro lineal de herida o daño epitelial durante 24 horas, si bien esta figura se puede modificar hacia arriba o hacia abajo en respuesta a los factores descriptos anteriormente. El agente con preferencia se puede proporcionar en la forma de una solución 1 pg/100 µ?_ - 1 mg/100 µ?_ del agente, y 100 pl_ de dicha solución administrada por centímetro lineal de herida o daño epitelial durante un período de 24 horas. El agente con más preferencia se puede administrar como una solución 10 pg/100 µ?_ - 100 pg/100 µ?. con 100 µ?_ de dicha solución administrada por centímetro lineal de herida o daño epitelial durante un periodo de 24 horas. Con máxima preferencia el agente se puede administrar como una solución de 1 ng/100 µ?_ - 1000 ng/100 µ?_ con 100 µ?_ de dicha solución administrada por centímetro lineal de herida o daño epitelial durante un período de 24 horas. En general, las composiciones que comprenden los agentes de la invención se deberían formular de modo que cuando se administran a una herida se obtenga una concentración del agente entre 0.79 pM y 0.79 mM por centímetro lineal de herida o daño epitelial. Con preferencia el agente se puede proporcionar a concentraciones de entre 7.9 pM y 0.079 mM por centímetro lineal. Un agente de la invención (tal como los péptidos de las SEQ ID NO: 3 a 8) se puede administrar a una concentración de entre 0.79 pM y 0.79 mM. Con preferencia un agente de la invención se puede administrar a una concentración de entre 7.9 pM y 0.079 mM. Con máxima preferencia un agente de la invención se puede administrar a una concentración de entre 0.79 nM y 0.79 µ?. Solo a modo de ejemplo una solución inyectable que contiene entre 10 pg/100 pL y 100 pg/100 pL de un agente de la invención (tal como un TGF-P3 de las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 1 1 ) es adecuada para la aplicación para promover la curación acelerada de heridas dérmicas y/o inhibición de la formación de cicatrices cuando se administra como una inyección intradérmica y se dosifica con 100 pL por centímetro lineal de margen de herida. En el caso de un TGF-33 de la SEQ ID NO: 3, las dosis preferidas para la administración en una herida pueden ser 1 ng/ 00 pL-1000 ng/100 pL, y 100 pL de dicha solución administrada por centímetro lineal de margen de herida. En el caso de un TGF- 3 de la SEQ ID NO: 5, las dosis preferidas para la administración en una herida pueden ser 1 ng/100 pL-1000 ng/100 pL, y 100 pL de dicha solución administrada por centímetro lineal de margen de herida. En el caso de un TGF-p3 de la SEQ ID NO: 7, las dosis preferidas para la administración en una herida pueden ser 1 ng/100 pL-1000 ng/100 pL, y 100 pL de dicha solución administrada por centímetro lineal de margen de herida. En el caso de un TGF- 3 de la SEQ ID NO: 9, las dosis preferidas para la administración en una herida pueden ser 1 ng/100 pL- 000 ng/100 µ!_, y 100 µ? de dicha solución administrada por centímetro lineal de margen de herida. En el caso de un TGF- 3 de la SEQ ID NO: 1 1 , las dosis preferidas para la administración en una herida pueden ser 1 ng/100 µ?_-1000 ng/100 µ?_, y 100 pL de dicha solución administrada por centímetro lineal de margen de herida. Los agentes de la invención se pueden usar para promover la curación de heridas acelerada y/o prevenir, reducir o inhibir formación de cicatrices como monoterapia (por ej., mediante el uso de medicamentos de la invención solos). Alternativamente los métodos y medicamentos de la invención se pueden usar en combinación con otros compuestos o tratamientos para la promoción de la curación de heridas o inhibición de formación de cicatrices. Los expertos en el arte conocerán tratamientos adecuados que se pueden usar como partes de dichas terapias de combinación. Los inventores han hallado que los TGF- 3 de acuerdo con la presente invención se pueden formular ventajosamente en presencia de un azúcar. Este azúcar pueden ser un azúcar reductor o no reductor y/o aun fosfato o fosfonato derivado de este. Los ejemplos de dichos azúcares se pueden seleccionar, pero sin limitación, del grupo que comprende maltosa, mañosa, trehalosa, arabinosa, manitol, sacarosa, fructosa, dextrosa y glucosa. Los azúcares preferidos se pueden seleccionar del grupo que consiste en maltosa y trehalosa.

Se apreciará que los péptidos que comprenden los TGF- 3 de la invención pueden representar agentes favorables administrados por técnicas que involucran la expresión celular de secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichas moléculas. Dichos métodos de expresión celular son particularmente adecuados para uso médico en que se requieren efectos terapéuticos de los péptidos durante un período prolongado, por ejemplo en contextos donde se desea aumentar durante período de tiempo una respuesta defectuosa de curación de heridas. Es particularmente preferido que los TGF-ß3 se administren por medio de expresión celular que comprende los péptidos definidos por las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 1 1 , o fragmentos o derivados de este. Los ácidos nucleicos que codifican estos péptidos se exponen en las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 o 12. Muchos métodos conocidos de administrar agentes peptídicos de la invención a los tejidos tales como heridas tienen la desventaja de que pueden dificultar la obtención de niveles sostenidos del agente de la invención en el sitio de tratamiento durante el curso de incluso pocos días debido a que los agentes peptídicos pueden tener vida media corta in vivo. La vida media de los agentes puede ser corta por numerosas razones que incluyen: (i) Degradación por proteasas y similares. (ii) Depuración por proteínas de unión. (iii) Unión e inhibición de la actividad del agente por moléculas de la matriz extracelular.

Además, los agentes usados para promover la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices necesitan administrarse en un vehículo adecuado y con frecuencia se proporcionan como una composición que comprende el agente y el vehículo. Tal como se describió, dichos vehículos con preferencia son no inflamatorios, biocompatibles, bioresorbibles y no deben degrada o inactivar el agente (en el almacenamiento o el uso). Sin embargo, con frecuencia puede ser difícil proporcionar un vehículo satisfactorio para administrar agentes a un tejido con una herida para tratar. Una manera conveniente de obviar o atenuar estos problemas es proporcionar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de la invención en un área tratada por medio de terapia génica. De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención se proporciona a sistema de administración para usar en una técnica de terapia génica, dicho sistema de administración que comprende un Molécula de ADN que codifica un péptido seleccionado del grupo que consiste en los definidos por las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11 , dicha molécula de ADN es capaz de transcribirse para producir la expresión del péptido elegido. De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención se proporciona el uso de un sistema de administración definido en el párrafo precedente para usar en la fabricación de un medicamento para usar en la promoción de la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices. En un sexto aspecto de la presente invención se proporciona el uso de un sistema de administración definido anteriormente para usar en la fabricación de un medicamento para usar en la promoción de la regeneración epitelial De acuerdo con un séptimo aspecto de la presente invención se proporciona un método de promover la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices formación de cicatrices, el método que comprende administrar a un paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de un sistema de administración definido en el noveno aspecto de la invención. De acuerdo con un octavo aspecto de la presente invención se proporciona un método de promover la regeneración epitelial, el método comprende administrar a un paciente que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de a sistema de administración definido en el noveno aspecto de la invención. Debido a la degeneración del código genético, es claro que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican agentes adecuados para el uso de acuerdo con la invención se pueden variar o cambiar sin afectar sustancialmente la secuencia del producto codificado de este modo, para proporcionar una variante funcional de este. Las secuencias de los ácidos nucleicos posibles que se pueden usar codifican péptidos definidos por las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 11 serán evidentes para los expertos y los expertos en arte harán referencia a los ejemplos provistos por SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 o 12 respectivamente. Los sistemas de administración de terapia génica son muy adecuados para alcanzar los niveles sostenidos de un agente de la invención en una herida durante un período más largo del que es posible para la mayoría de los sistemas de administración convencionales. Los agentes de la invención adecuados para promover la curación de heridas acelerada y/o inhibir la formación de cicatrices se pueden expresar en forma continua en las células en un sitio de la herida que ha sido transformado con la molécula de ADN descripta en el cuarto aspecto de la invención. En consecuencia, aun cuando el agente de la invención tenga una vida media muy corta in vivo, se pueden expresar en forma continua cantidades terapéuticamente efectivas del agente a partir del tejido tratado. Además, los sistemas de administración de la invención se pueden usar para proporcionar la molécula de ADN (y de este modo el agente de la invención) sin la necesidad de usar vehículos farmacéuticos convencionales tales como los que se requieren en ungüentos o cremas que se ponen en contacto con la herida. El sistema de administración de la presente invención es con preferencia de modo tal que una molécula de ADN es capaz de expresarse (cuando el sistema de administración se administra a un paciente) para producir un péptido definido por el grupo que comprende las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 o 1 1 , o un fragmento o derivado de dichos péptidos. La molécula de ADN se puede combinar dentro de un vector adecuado para formar un vector recombinante. El vector recombinante por ejemplo puede ser un plásmido, cósmido o fago. Dichos vectores recombinantes son muy útiles en los sistemas de administración de terapia génica de la invención para transformar células con moléculas de ADN adecuadas. Los vectores recombinantes también pueden incluir otros elementos funcionales. Por ejemplo, los vectores recombinantes se pueden diseñar de modo que el vector se replicará autónomamente en el núcleo de la célula. En este caso, los elementos que inducen la replicación de ADN pueden ser necesarios en el vector recombinante. Alternativamente el vector recombinante se puede diseñar de modo que el vector y la molécula de ADN recombinante se integran en el genoma de una célula. En este caso las secuencias de ADN que favorecen la integración especifica (por ej. , por recombinación homologa) son deseables. Los vectores recombinantes también pueden tener ADN que codifica los genes que se pueden usar como marcadores seleccionabas en el proceso de clonación. El vector recombinante también puede comprender un promotor o buffer para controlar la expresión del ge, según corresponda. La molécula de ADN puede (pero no necesariamente) incorporarse en el ADN de las células del sujeto tratado. Las células no diferenciadas se pueden transformar en forma estable lo que lleva a la producción de células hija modificadas genéticamente. En este caso, se puede requerir la regulación de la expresión en el sujeto por ej., con factores de transcripción específicos, activadores del gen o con más preferencia con promotores inducibles que transcriben el gen en respuesta a una señal que se halla específicamente en una herida. En forma alternativa, se puede diseñar el sistema de administración para favorecer la transformación estable o transitoria de células diferenciadas en el sujeto tratado. En este caso, la regulación de la expresión puede ser menos importante debido a que la expresión de la molécula de ADN se detendrá cuando las células transformadas mueran o detengan la expresión de la proteina (idealmente cuando se ha efectuado la promoción de la curación de heridas acelerada con reducción de la formación de cicatrices). El sistema de administración puede proporcionar la molécula de ADN a un sujeto sin incorporarse al vector. Por ejemplo, la molécula de ADN se puede incorporar dentro de un liposoma o partícula viral. Alternativamente la molécula de ADN "desnudo" se puede insertar en las células del sujeto por un medio adecuado, por ej., captación endocitótica directa. La molécula de ADN se puede transferir a las células de un sujeto tratado por transfección, infección, microinyección, fusión celular, fusión de protoplasto o bombardeo balístico. Por ejemplo, la transferencia puede ser por bombardeo balístico con partículas de oro recubiertas, liposomas que contienen la molécula de ADN, vectores virales (por ej., adenovirus) y medios de provisión de de captación directa de ADN (por ej., endocitosis) por la aplicación de ADN de plásmido directamente en una herida en forma tópica o por inyección. La expresión celular del agente de la invención puede ser por células del borde del área no dañada circundante de la herida o en forma alternativa puede ser por células introducidas terapéuticamente en la herida (por ejemplo células endógenas o exógenas cultivadas involucradas en la respuesta de curación de heridas). Se apreciará que las células que se introducen en forma terapéutica para promover la curación de heridas acelerada y/o prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices se pueden manipular ex vivo de modo que ellas expresen niveles aumentados de un agente de la invención, y luego se introducen en el área herida. Dichas células con preferencia pueden ser células cultivadas ex vivo para usar en la preparación o fabricación de piel artificial o sustitutos de piel que se usan en la promoción de la curación de heridas. Las células con más preferencia pueden ser células autólogas, si bien se apreciará que se pueden usar cualquier célula adecuada. Por consiguiente, en un noveno aspecto de la invención, se proporciona un medicamento que comprende células inducidas para expresar un agente de la presente invención. La inducción de la expresión celular de un agente de la invención se puede efectuar por medio de la incorporación en las células de ácidos nucleicos que producen la expresión de agentes adecuados para el uso de acuerdo con la invención.

La invención se describirá adicionalmente por medio de ejemplos con referencia a los siguientes protocolos y estudios experimental, y las Figuras acompañante en las que: El cuadro 1 muestra valores indicadores de la propensión de los residuos de aminoácidos a participar en la formación de alfa hélice; El cuadro 2 expone detalles de la nomenclatura usada en referencia con las mutantes de TGF-P3 de la invención; El cuadro 3 expone la eficiencia de replegamiento de los TGF-P3 tipo salvaje y TGF- 3 de la invención; El cuadro 4 compara la actividad biológica del TGF-33 tipo salvaje y Gly63-Ala (una proteína de TGF- 3 de la invención) evaluada por ensayo de de inhibición de crecimiento celular;} El cuadro 5 expone concentraciones de reactivos usados en estudios de curación de heridas in vivo; El cuadro 6 expone concentraciones de reactivos usados en estudios de curación de heridas in vivo; La Figura 1 muestra un cromatograma de TGF-Beta 3 tipo salvaje en una columna de Fenil-Sefarosa; La Figura 2 muestra un cromatograma de TGF-Beta 3 tipo salvaje monomérico y dimérico en una columna UNO-S1 ; La Figura 3 y Cuadro A muestran una comparación de proteínas mutantes de TGF-Beta 3 y TGF-Beta 3 tipo salvaje por SDS-PAGE teñido con azul Coomassie (por favor advertir que el intercambio de buffer de las proteínas mutantes de Gly63-Ala y Gly63-Pro produjeron alguna pérdida de muestra, en consecuencia se la concentración real que se agregó era menos que los 3 pg indicados); en donde CUADRO A * el buffer de intercambio de las proteínas mutantes de G1y63-Ala y G1y63-Pro produjeron pérdida de algunas muestras, por lo que la concentración agregada al gel será menor de los 3 pg indicados. La Figura 4 muestra el molde usado para la herida excisional; La Figura 5 muestra los puntajes promedio de evaluación macroscópica del día 3 para las heridas incisionales (A y B) tratadas con TGF-Beta 3 tipo salvaje o los TGF-ß de la invención, donde "*" indica curación significativamente aumentada en comparación con las heridas sin tratamiento (P<0.05); La Figura 6 muestra ancho de herida promedio microscópica el Día 3 para heridas excisional (C y D) tratadas con las proteínas de TGF-Beta 3 tipo salvaje y TGF-Beta 3 muíante; La Figura 7 muestra el molde usado para la herida incisional; La Figura 8 ilustra puntajes macroscópicos de cicatriz (día 70) para heridas tratadas con TGF-Beta 3 tipo salvaje, Gly63-Ala y Gly63-Pro; La Figura 9 ilustra imágenes macroscópicas de cicatriz (día 70) para heridas tratadas con TGF-Beta 3 tipo salvaje, Gly63-Ala y Gly63-Pro; La Figura 10 ilustra puntajes macroscópicos de cicatriz (día 70) para heridas tratadas con TGF-Beta 3 tipo salvaje, Glul2-Ser y mutante de serina doble (Glul2-Ser & Arg52-ser), donde "+" indica formación de cicatrices significativamente disminuida en comparación con las heridas tratadas con placebo (p<0.05); La Figura 1 1 ilustra imágenes macroscópicas de cicatriz (día 70) para heridas tratadas con TGF-Beta 3 tipo salvaje, Glul2-Ser y mutante de serina doble (Glul2-Ser & Arg52-Ser); La Figura 12 ilustra imágenes macroscópicas de cicatriz representativas de heridas tratadas con TGF-Beta 3 tipo salvaje, proteínas mutantes Gly63-Pro y Gly63-Ala (70 días después de la herida); y La Figura 13 ilustra imágenes microscópicas de cicatriz representativas de heridas tratadas con Glul2-Ser y mutante de serina doble (Glul2-Ser y Arg 52-Ser) después de 70 días de la herida). Los detalles de las secuencias de interés particular se proporcionan en la sección "Información de secuencia".

Protocolo experimental y resultados 1. Generación, producción, repleqamiento, y purificación de los TGF-P3 de acuerdo con el primer y segundo aspectos de la invención 1.1. Generación de ADNc El ARN total de un herida incisional humana (tomado el día 5 pos-herida) se trató con ADN libre (Ambion) para eliminar cualquier ADN contaminante. Usando ARN total como templado, se generó ADNc para TGFBeta-3 por la reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa reversa (RT-PCR). Se preparó la mezcla maestra de RT-PCR a partir del kit de QRT-PCR Core Reagent 1 -paso Brilliant® (Stratagene). Se agregó un microgramo de ARN a 50 µ? de una solución que contiene: buffer QRT-PCR de 1 paso, 0.2 mM de dNTP, 3.5 mM de MgCI2, 1 pL de transcriptasa reversas StrataScript, 2.5 unidades de Taq Polymerasa, 0.4 µ? de cebador de sentido (5* GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACT GC 3'), ,4 µ? de cebador de sentido (5'-CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT ACA TTT ACA AGA C 3'). La reacción se colocó en un ciclador térmico (Hybaid PCR Express) y se corrió en las siguientes condiciones: 30 min a 45°C, 10 min a 95°C, luego 40 ciclos de 95°C durante 30 seg, 65°C durante 1 min y 72°C durante 1 min. La etapa final fue de 72°C durante 10 min. Las muestras de PCR se corrieron en gel de agarosa 2% (p/p) para verificar el tamaño de banda y se purificó usando el kit Wizard PCR Prep (Promega). 1.2. Construcción de plásmido El vector pET-3d se deriva del vector pBR322 y contiene un promotor T7 bajo control de /_acUV5 control y un gen marcador resistente a ampicilina. Los fragmentos de ADNc del TGF-Beta 3 (generados en la Sección 3.2) se subclonaron en los vectores pET-3d en los sitios Neo I y Bam Hl (5'-3' respectivamente). Los ligamiento resultantes luego se transformaron en células XL10 Gold (Stratagene) y se realizó el análisis de de PCR de colonia para ubicar los clones que contienen un inserto. Los clones finales se cultivaron y sus ADN del plásmidos se extrajeron en agua usando Qiaprep®Spin Miniprep Kit (Qiagen). Los plásmidos se secuenciaron y verificaron usando el cebador del promotor T7 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3') y un cebador del terminador T7 (5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3'). 1 .3. Mutaqénesis dirigida al sitio El constructo de TGF-Beta 3 tipo salvaje de la Sección 1 .2 se sometió a mutagénesis dirigida al sitio para generar dos contractos mutados que codifican las proteínas de TGF-Beta 3 mutantes. La nomenclatura constructo/mutante y el cambio de secuencia de nucleótidos se sintetizan en el cuadro 2. Las posiciones de nucleótidos que se sometieron a mutagénesis se muestran en la sección de Información de secuencia. La metodología de mutagénesis dirigida al sitio in vitro se basó en el kit Stratagene's Quick Change® Site directed Mutagenesis. Se agregaron 100 ng de plásmido (de la Sección 1.2) a una solución que contiene: 2.5 uL de buffer de reacción 10 x Quick Change® Multi, solución de Quick, 100 ng de cebador mutagénico, 1 mi de mezcla de dNTP, ADN polimerasa Pfu Turbo (Stratagene), a un volumen final de 2.5 mi con agua destilada doble. La reacción se colocó en un ciclador térmico (Hybaid PCR Expresses) y se corrió en las siguientes condiciones: 1 min a 95°C, 30 ciclos de 1 min a 95°C, 55°C durante 1 min y un paso final de 65°C durante 2 min. Una vez que terminó el ciclado térmico, las reacciones se colocaron en hielo durante 2 min para reducir la temperatura por debajo de 37°C. Se agregó 1 uL de enzima de restricción Dpnl (10 U/uL) a cada reacción y se mezclaron por completo. La mezcla de reacción se centrifugó (1 min, 10,000 rpm en una Sorvall Biofuge) luego se incubó a 37°C para digerir el ADNds progenitor. 1 -5 uL de ADN tratado con Dpnl de cada reacción de mutagénesis reacción se agregaron a 45 uL de XLI-Blue E.coli resucitado (Stratagene y 2 uL de mezcla P-ME (Stratagene). La suspensión se mezcló e incubó en hielo durantes 30 minutes. La suspensión se calentó a 42°C en un baño de agua durante 30 segundos. La mezcla se incubó en hielo durante 2 min más. Se agregaron 0.5 mL de caldo (42°C) NZY+ precalentado a cada suspensión celular. El caldo de transformación se incubó durante 1 hora con agitación a 225-250 rpm. Se sembraron 1 uL, 10 uL y 100 uL del caldo de transformación de cada reacción de mutagénesis en placas de agar LB que contienen 100 pg/mL de ampicilina (Sigma), 80 ug/ml de 5-bromo-4-cloro-3-inodlil-P-D-galactopiranósido (X-ga1 , Stratagene), 20 mM de P-D-Tiogalctopiranósito de isopropilo (IPTG, Sigma) y se incubó durante 18 horas a 37°C. Las colonias azules contenían el plásmído mutado. Se seleccionó una colonia única de cada tipo de mutante de agar y se usó para inocular 10 mi de medio LB que contiene 100 ug/mL de Ampicilina. Se aisló el plásmído usando el kít QIAprep® Spin Miniprep (Qiagen). Los plásmidos se secuenciaron y se verificó la mutación correcta usando los cebadores pQE y pQE Rev. 1.4. Transformación y clonación 10 pL (50 ng por pl) de ADN de plásmído (de la Sección 1.2 y 1.3) se agregaron a 1 mi de células E.colí BL21 (DE3) pLysS SinglesTM (Novagen) competentes en frío (4°C). Después de 20 min las células se sometieron a shock térmico por la incubación durante 30 segundos a 42°C en baño de agua. Se agregaron 100 pL de medio Psi a la mezcla de células/plásmido y se agitaron a 37°C durante 90 min. Se sembraron alícuotas de 50 pL y I00 pL en placas de agar LB que contienen 100 pg/ml de ampicilina (Sigma) y se incubaron durante 18 horas a 37°C. Se cultivaron colonias únicas y se congelaron patrones de las células generadas y se almacenaron a -80°C. El plásmido de ADN se analizó a partir de las células patrón para verificar la transformación. 1.5. Expresión Las ampollas de las células de E.coli congeladas (de la Sección 1.4) se recuperaron y se inocularon en matraces erlenmeyer con tabique, que contiene 100 mi de medio LB y 100 pg/100 pg/ml de ampicilina. Los matraces se incubaron con agitación a 37°C toda la noche. Se agregaron 5 mi de este cultivo de la noche a matraces Erlenmeyer de 2 litros (500 mi de medio LB/amp) y se incubaron con agitación a 37°C. Se tomaron muestra de 2 mi de caldo por hora para rastrear el crecimiento y la expresión (pos-inducción) de TGF-Beta 3 tipo salvaje y proteína mutante. El crecimiento se determinó por la medición de absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Cuando la absorbancia se midió a 0.6 de Abs las células se indujeron a expresar las las proteínas de TGF-Beta 3 tipo salvaje y mutantepor la adición de R-D-Tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG, Sigma) a una concentración final de 1 mM. Los cultivos se incubaron durante 4 horas adicionales. Las muestras de caldo de 0.5 mi se sedimentaron por centrifugación (10 min, 10,000 rpm en Sorvall Biofuge) y se descartó el sobrenadante. El pellet se resuspendió en 50 µ? de buffer de muestra electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) en dodecilsulfato de sodio (SDS) y se calentó durante 10 minutos en baño de agua a 95°C. Se cargaron 10 pL de muestras en SDS-PAGE. Se realizaron SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie (como se describe en A.T Andrews, 1986) usando un Hoefer®Mighty Small SE 245 Dual Gel Caster (Amersham). Los geles eran de 1 mm de espesor y contenían 15% (v/v) de gel de poliacrilamida. 1.6. Recolección de células y aislamiento de cuerpos de inclusión Las células de Sección 1.5 se sedimentaron por centrifugación a 5000 g durante 0 min a 4°C en un centrífuga Hettich Rotina 46R con un rotor 4315. La ruptura celular y la recuperación de cada una de las isoformas de TGF-ß insolubles insoluble (cuerpos de inclusión) se llevaron a cabo a 4°C. Las células se suspendieron en 50 mi de 100 mM de Tris/HCI (Sigma), 10 mM de EDTA (Sigma) pH 8.3 y se disgregaron por sonicación usando un Sanjo Soniprep 150. Se agregó 0.2% (p/p) de Tritón X-100 (Sigma) y la suspensión y se agitó durante una hora. La suspensión se centrifugó a 12,000 g durante 40 min. Los pellet se resuspendieron en 50 mi de 100 mM de Tris/HCI, 10 mM de EDTA pH 8,3 a temperatura ambiente antes de centrifugar durante 40 min a 12,000g. 1.7. Solubilización de los cuerpos de inclusión El sedimento de la Sección 1.6 se resuspendieron en 40 mi de urea 8 M, 1 % (p/p) DL-ditiotreitol (DTT) y se disgregaron en un homogenizador Heidolph Diax 900. La suspensiónse cubrió y dejó agitar durante 1 hora para solubilizar los cuerpos de inclusión y reducir el TGF-Beta 3 tipo salvaje y las proteínas mutantes a sus formas monoméricas desnaturalizadas. Luego las suspensiones se centrifugaron a 15,000 g durante 30 min a 4°C. Los sobrenadantes se dializaron para intercambiar el buffer de 8 M de urea (ICN Biomedical) a 10% (v/v) de ácido acético. Las proteínas de E.coli que fueron solubles en urea 8 M precipitaron fuera de la solución cuando se intercambió el buffer a 10% (v/v) de ácido acético. Se agregó 1 % (p/v) de DTT (Sigma) a las suspensiones, se cubrieron y dejaron agitar durante 30 min para reducir los puentes disulfuro que se pueden haber formado entre los monómeros de TGF-ß durante el intercambio del buffer. Las suspensiones se centrifugaron a 12,000g por 40 min para separar las proteínas solubles y las proteínas no solubles. Se tomaron muestras de la solubilizacíón de urea y las etapas de intercambio de buffer (material de ácido acético soluble y no soluble), y luego se analizó mediante SDS-PAGE. 1.8. Ultrafiltración El material de 10% (v/v) de ácido acético de la Sección 1 .7 se sometió a ultrafiltración con una membrana de 10 kDa en una Vivoflow50 (Vivascience). El fin de esto fue reducir el volumen de la suspensión de 10% (v/v) de ácido acético a 3 mi y eliminar las proteínas de bajo peso molecular (<10 kDa). 1.9. Filtración en qel La muestra de la Sección 1.7 se cromatografió en una columna de Hiprep 26/60 Sephacryl S-100 de alta resolución (Amersham, 320 mL) en 10% (v/v) de ácido acético con una velocidad de flujo de 1.5 ml/min. Las fracciones que contienen TGF-Beta 3 monomérico desnaturalizado (que eluyeron entre 100 min y 140 min) se mezclaron. 1 .10. Liofilización Las fracciones combinadas que contienen TGF-Beta 3 monomérico desnaturalizado se liofilizaron usando un secador por congelación TEC Lyoprep-3000 para eliminar ácido acético y agua de la muestra. 1.11. Repleqamiento Los TGF-Beta 3 monomérico liofilizados de la Sección 1.10 se solubilizaron en urea 8 M que contenia 10 mM de DTT hasta obtener un una concentración final de 10 mg/ml. La solución de TGF-Beta 3 se agregó gota a gota, mientras se agitaba la solución de replegamiento (1 M de sulfonato de 3-(-piridino)-l-propano (NDSB-201 ), 20% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma), 2% (p/v) de 3-(3-colamidopropil)dimetilamonio-l-propanosulfonato (CHAPS), 1 M de NaCI (Sigma), 1 % (p/v) de glutatión reducido (GSH, Sigma), 0.05 M de Trizma®Base (Sigma) pH 9.3) hasta alcanzar las concentraciones finales de 0.2 mg/ml de TGF-Beta 3. Es importante que el pH se mantenga dentro de un rango de 9,2-9,4 usando NaOH/HCI concentrado. La solución se cubrió con Parafilm, que se perforó para permitir la oxidación de TGF-Beta 3 monomérica y se dejó agitar a 8°C. Después de 144 horas la solución se centrifugó a 15.000g durante 40 minutos para eliminar el precipitado formado y el pH se ajustó a pH 3.5 con ácido acético glacial. El sobrenadante contenía TGF-Beta 3 dimérico unido a disulfuro, que se determió por SDS-PAGE (no reducido) y transferencia Western. El SDS-PAGE se llevó a cabo como se describe en la sección 2.1.

Para la transferencia Western, las muestras se cargaron en un gel de 1 mm de espesor, 15% de (v/v). Una vez que terminó la electroforesis las proteínas se transfirieron electroforéticamente a un papel de nitrocelulosa (Sigma) usando un aparato TE22 Western-Blotting (Pharmacia), como se describe en el manual de instrucciones. Los sitios de unión inespecífica sobre la nitrocelulosa luego se bloquearon con buffer de bloqueo (5% (p/v) de leche leche en polvo descremada, 1 % (v/v) de monolaurato de polioxietilensorbitano (Tween 20; Sigma) en solución buffer salina (PBS). La nitrocelulosa se lavó en buffer de lavado (PBS, 0.1 % (v/v) Tween 20). La nitrocelulosa se incubó durante 1 hora en anticuerpo primario (MAB643 (sistemas R&D) diluido 1 :500 en PBS y 0.1 (v/v) de Tween 20). La nitrocelulosa se lavó de nuevo antes de la incubación durante 1 hora con el anticuerpo secundario (IgG anti-ratón de cabra conjugada con fosfatasa alcalina (Abeam) diluida 1 :3000 con PBS, 0.1 % (v/v) de Tween 20). La nitrocelulosa recibió un lavado final antes de la adición del reactivo ECL (Amersham) para visualizar los complejos antígeno-anticuerpo. En una habitación oscura se expuso una película de rayos X la nitrocelulosa antes de sumergirse en una solución del desarrollado^ fijador y detención. Luego la nitrocelulosa se dejó secar. El replegamiento de TGF-Beta 3 tipo salvaje y las proteínas monoméricas mutantes mostraron variados niveles de formación de dímeros. El porcentaje de recuperación de los dímeros correctramente replegados de otros replegados incorrectamente o las proteínas de TGF-Beta 3 no diméricas se muestran en el cuadro 3.

De modo interesante las sustituciones de aminoácidos dentro de la alfa-hélice de las proteínas de TGF-Beta 3 que causaron mayor impacto en el rendimiento de replegamiento (formación de dímeros). La estabilización de la alfa hélice por la sustitución de glicina con arginina aumentó los rendimientos de replegamiento de 20% a 50%. A la inversa la disrupción de la alfa hélice por la sustitución de glicina con prolina produjo mucho menor porcentaje de formación de dímeros. Esto indica que el alfa hélice cumple un papel importante en el replegamiento correcto de la molécula de TGF-Beta 3. La sustitución de aminoácidos involucrados en la formación de 'puente salino' no efectuó rendimientos de replegamiento. 1.12. Cromatografía de interacción hidrofóbica La solución de renaturalización de la Sección 1.1 1 se concentró a 50 mL por ultrafiltración con una membrana de 10 kDa (peso molecular límite) en una Vivoflow50 (Vivascience). La solución de renaturalización se diluyó 1 :1 con una solución que contiene 2 M de sulfato de amonio (Sigma) y 10% (v/v) de ácido acético. Se equilibró una columna de 2 mi Biorad llena con flujo rápido de Butilsefarosa 4 (Amersham) con Buffer A (1.0M de sulfato de amonio y 10% (v/v) de ácido acético). 20 mi de la solución de renaturalización diluida se aplicó a esta columna a una velocidad de flujo de 1 ml/min (esta velocidad de flujo se usó en todo el procedimiento). La columna luego se lavó en Buffer A hasta que la lectura de absorbancia a 280 nm alcanzó el nivel basal (10 mi). Se aplicó a la columna 100% de Buffer B (10%(v/v) de ácido acético, 30% (v/v) de isopropanol). Se mezcló el primer pico, que contiene proteínas TGF- 3 en formas monoméricas y diméricas (ver, Figura 1 ). 1.13. Cromatografía de intercambio catiónico Se usó cromatografía de intercambio catiónico para aislar las proteínas de TGF-Beta 3 diméricas de los monómeros. Se equilibró una columna de 2 mi UNO-SI Biorad llena con Buffer A que contiene 10% (v/v) de ácido acético, 30% (v/v) de isopropanol). Las fracciones combinadas de la Seción 3.12 se aplicaron a una velocidad de flujo de 1 ml/min en una columna UNO-SI. Luego la columna luego se lavó en Buffer A hasta que la lectura de absorbancia a 280 nm alcanzó el nivel basal (5 min). Se corrió en un gradiente lineal durante 5 finalizando con una mezcla de 60% de Buffer A y 40% de Buffer B (10% (v/v) de ácido acético, 30% (v/v) de isopropanol y 1 M de NaCI). La aplicación de esta mezcla de buffer se mantuvo durante 15 minutos adicionales. El TGF-Beta 3 monomérico eluyó de la columna después 10 minutos posteriores a la inyección de la muestra. Se aplicó un segundo gradiente lineal durante 5 minutos finalizando con 100% de Buffer B y mantenido durante 10 minutos. El TGF-Beta 3 dimérico se eluyó de la columna 30 minutos después de la inyección de la muestra (ver Figura 2). 1.14Ultrafiltración/diafiltración Las fracciones que contienen moléculas de TGF-Beta 3 monomérico y dimérico de la Sección 1.13 se sometieron a ultrafiltración/diafiltración para intercambiar el buffer a 20 mM de ácido acético, 20% (v/v) de isopropanol y concentrar la muestra a -10 mg/ml (se determinó la concentración de TGF-Beta 3 por espectrometría U.V). Se usó una Vivoflow50 (Vivascience) con un limite de 10 kDa, con un buffer de intercambio y se concentraron las muestras. 2 Caracterización in vitro de los TGF-33 de la invención. 2.1 Análisis SDS-PAGE de los TGF-33 purificados de la invención Las proteínas mutantes de TGF-Beta 3 purificadas (de la Sección 1.14) se evaluaron por SDS-PAGE para determinar la pureza y peso molecular. Debido al pH bajo las muestras de TGF-Beta 3 muíante de la Sección 3.14 se intercambió el buffer usando columnas de de giro de desalinización de proteína (Pierce) en buffer de muestra de SDS-PAGE. Se cargaron 3 pg de las proteínas mutantes de TGF-Beta 3 (muestras reducidas y no reducidas), 3 pg de TGF-Beta 3 tipo salvaje control positivo (reducido y no reducido) y 10 pL de estándares de peso molecular Invitrogen Mark 12 en un gel de poliacrilamida (10%-20% (v/v) de gradiente de acrilamida). Una vez que la electroforesis finalizó el gel se tiñó con azul Coomassie. Como se esperaba el TGF-Beta 3 tipo salvaje y la proteína muíante Gly63-Ala corrieron en posiciones idénticas en el gel (-13 kDa para las muesíra reducidas y 25 kDa para las no reducidas). De modo interesante no se detectaron bandas de proteína mutante Gly63-Pro en el gel no reducido pero se detectaron en gel reducido. Como la eficiencia de replegamiento de Gly63-Pro fue muy baja (<1 %) es probable que se produjeran múltiples especies de replegamiento, las que estuvieron por debajo de los niveles detectables por Coomassie (> 1 ug). Sin embargo, cuando estas especies se redujeron la concentración del monómero de Gly63-Pro reducido fue superior a 1 ug de del límite de detección del colorante de Coomassie y en consecuencia se puede observar Gly63-Pro en el gel reducido. La posición de la banda proteica de Gly63-Pro reducida fue ligeramente superior que la banda para el TGF-Beta 3 tipo salvaje. Esto fue los esperado ya que la sustitución de glicina 63 con una prolina hizo a la proteina mutante Gly63-Pro una molécula más grande que TGF-Beta 3 tipo salvaje (ver Figura 3). 2.2 Ensayo de inhibición de crecimiento celular para comparar la actividad biológica de los TGF-33 de la invención con los TGF-33 tipo salvaje En ensayo de inhibición de crecimiento celular (A Meager, 1991 ) es una prueba de actividad biológica in-vitro para las moléculas de TGF-Beta. El ensayo colorimétrico se basa en el efecto inhibitorio de las moléculas de TGF-Beta sobre el crecimiento de ensayo colorimétrico se basa en el efecto inhibitorio de las moléculas de TGFBeta sobre el crecimiento de las células epiteliales de pulmón Mink (MLEC). Se agregaron 100 µ?_ de medio de suspensión celular que contiene : 1 x 104 de células MLEC/ml y se agregó medio completo (DMEM(lnvitrogen), 0.01 M de buffer Hepes (Invítrogen), 2 mM de L-Glutamina (Invitrogen), L-arginina (Invitrogen), L-Asparagina (Invitrogen), 100 unidades/ml mde penicilina (Invitrogen), 50pg/ml de estreptomicina (Invitrogen) y 5% de suero fetal de carnero (Invitrogen)) a cada pocilio de una placa de 96 pocilios. Después de la incubación toda la noche a 37°C, 5% de CO2, se agregaron diluciones seriada (10 pg/mL a 500 pg/mL) de muestras de TGF-Beta 3 diméricas mutantes (de la Sección 3.14) a la placa(s). Los pocilios control recibieron 200 uL de medio completo y 0% (v/v) de 0.25 M de maltosa. Las placas se incubaron durante 120 hr y se agregaron 50 uL de 2 mg/mL de bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazonil-2-il]-2,5-difeniltetrazolio: azul de fiazolilo (MTT; Sigma) a cada pocilio. Las placas se incubaron durante 4 horas adicionales y luego se extrajo el medio. Se agregaron 100 uL de 0.05 M de HCI (BDH), isopropanol absoluto (BDH) a cada pocilio y el formazan resultante solubilizado se cuantificó a 570 nm usando un lector de microplaca (Víctor2 1420). Gly63-Ala, un TGF-P3 de la invención, presentó un efecto inhibitorio sobre las células MLEC en un rango de concentración de 0-500 pg/mL. Como se puede observar en el cuadro 4, la proteína mutante Gly63-Ala tuvo una IC50 de 34 pg/mL en comparación con TGF-Beta 3 tipo salvaje que tiene una IC50 de 26 pg/mL. 2.3 Análisis de secuencia de aminoácidos Se secaron al vacío 50 microlitros de muestras de TGF-Beta 3 tipo salvaje y mutante de la Sección 3.14 y luego se resuspendieron en 20 µ? de una solución que contiene 50 mM de NH4HCO3 y 10% (v/v) de acetonitrilo. Se resuspendieron 20 pg de tripsina de calidad de secuenciación (Promega) en 10 µ? de buffer de resuspensión provisto por el kit (Promega) para dar una concentración de tripsina de 2 pg/µ?. Esto luego se diluyó en 50 mM de NH4HCO3 y 10% (v/v) de acetonitrilo para dar una concentración final de tripsina de 0.2 pg/µ?. La digestión se realizó durante la noche por la adición de tripsina en una relación de 1 :20 (p/p) de las proteínas de TGF-Beta 3 tipo salvaje y mutante. La digestión se inactivo por la adición de ácido fórmico (Fluka) a una concentración final de 0.1% (v/v). Las muestras luego se diluyeron a 1 pmol/µ? de péptidos y luego se analizaron por un proceso de nanoflujo RPLCMS (sistema Ultímate. Dionex en línea con un Q-ToF2, Micromass). Se realizó la cromatografía en una columna de 75 pm C18 (empacamiento LC) que utiliza un gradiente de 45 min desde 5% de acetonitrilo a 55% de acetonitrilo (Romil). El análisis MS adoptó la forma de análisis dependiente datos donde el instrumento midió la m/z de los iones peptídicos que eluyen de la LC y se seleccionaron los iones apropiados por análisis MS-MS donde se empleó la descomposición inducida por colisión para obtener la información de secuencia de los iones peptídicos fragmentados. 3. Caracterización in vivo de los TGF-33 de la invención Los efectos biológicos de las proteínas de TGF-Beta 3 tipo salvaje y mutantes activas replegadas se investigaron sobre la curación de heridas incisionales y excisionales (3 días después de la herida) y formación de cicatrices (70 días después de la herida) en ratas macho adultas. 3.1 Comparación de los efectos de TGF-33 tipo salvaje y TGF-B3 de la invención sobre la curación de heridas Las ratas macho (Sprague Dawley) se anestesiaron con halotano y se afeitaron sus lomos. Se marcaron las posiciones de las heridas usando un molde patentado con tinta marcadora de la piel como se muestra en la Figura 4. Las muestras se diluyeron en buffer de vehículo estéril que contiene 0.25 M de Maltosa (Sígma), 0.002% (v/v) de ácido acético y 0.33% (v/v) de alcohol isopropilíco a las concentraciones descriptas en el cuadro 4. Todas las muestras se esterilizaron con filtración y eran libres de endotoxina. Se usaron cuatro ratas por cada grupo de tratamiento. Se inyectaron por vía intradérmica 100 L de muestra de cada grupo de tratamiento (cuadro 4) en las posiciones de heridas marcadas A y B (excepto en las ratas que no recibieron tratamiento - "naive"). En las posiciones A y B se tomaron muestras de biopsias. Todos los animales se alojaron en jaulas separadas. Después de 24 horas los animales recibieron una segunda dosis de muestra. Después de 3 días se fotografiaron las heridas y analizaron usando un sistema de clasificación analógico visual macroscópico (modificado de Beausang, E et al. 1998). Se realizó el análisis estadístico de los datos usando las pruebas de Mann Whitney U/T de Student. Un valor de p<0,05 se consideró significativo. 3.2. Evaluación de heridas incisionales al día 3 tratadas con TGF-P3 tipo salvaje o TGF-133 de la invención sobre la curación de heridas usando una escala visual analógica macroscópica Se examinaron las heridas incisionales después de 3 días usando un sistema analógico visual (VAS) macroscópico. En esta escala de 10 puntos un puntaje de 0 representa una herida bien curada y un puntaje de 10 representa una herida muy mal curada. Los datos muestran que: El tratamiento con 50 ng/100 pi_ o 100 ng/100 pL de TGF-Beta 3 de tipo salvaje disminuye el puntaje de VAS (es decir, mejora el aspecto macroscópico de las heridas) en comparación con no tratamiento (control sin tratamiento). El tratamiento con la dosis de 100 ng/100 pl_ mejoró significativamente (p<0.05) el aspecto de las heridas en comparación con no tratamiento (control sin tratamiento), es decir curación acelerada. El tratamiento con 50 ng/100 pL o 100 ng/100 µ?_ de Gly63-Ala mutante disminuye el puntaje VAS en comparación con no tratamiento (control sin tratamiento) y son comparables a las heridas tratadas con TGF-Beta 3 tipo salvaje es decir, no empeora la curación. El tratamiento con 50 ng/100 pL o 100 ng/100 pL de Gly63~Pro mutante disminuye el puntaje VAS en comparación con no tratamiento (control sin tratamiento) y son comparables a las heridas tratadas con TGF-Beta 3 tipo salvaje es decir, no empeora la curación. 3.3 Evaluación microscópica de ancho de herida para heridas excisionales del día 3 tratada con proteínas de TGF-Beta 3 tipo salvaje y mutante Se evaluó microscópicamente el ancho de la herida excisional después de 3 días. Todas las heridas tratadas con proteínas de TGF-Beta 3 tipo salvaje y mutantes mostraron ancho de la herida comparables con el control de placebo y no tratamiento (naive), lo que confirma que las proteínas de TGF-Beta 3 mutantes no tienen efectos adversos sobre la curación (Figura 6). 3.4 El efecto de las proteínas de TGF-Beta 3 de tipo salvaje y mutante sobre la Las ratas macho (Sprague Dawley) se anestesiaron con halotano y se afeitaron sus lomos. Se marcaron las posiciones de las heridas usando un molde estandarizado con tinta marcadora de la piel como se muestra en la Figura 7. Las muestras se diluyeron en buffer de vehículo estéril que contiene 0.25 M de Maltosa (Sigma), 0.002% (v/v) de ácido acético y 0.33% (v/v) de alcohol ¡sopropílico a las concentraciones descriptas en el cuadro 5. Todas las muestras se esterilizaron con filtración y eran libres de endotoxína. Se usaron cuatro ratas por cada grupo de tratamiento. Se inyectaron por vía intradérmica 00 pL de muestra de cada grupo de tratamiento (cuadro 6) en las posiciones de heridas marcadas A y B (excepto en las ratas que no recibieron tratamiento - "naive"). En las posiciones A y B se realizaron incisiones larga de 1 cm de grosor completo con una hoja de escalpelo No. 1 1 . Todos los animales se alojaron en jaulas separadas. Después de 24 horas los animales recibieron una segunda dosis de muestra. Después de 70 días se fotografiaron las cicatrices y analizaron usando un sistema de clasificación analógico visual macroscópico (modificado de Beausang, E et al. 1998). Las heridas se extirparon y colocaron en solución salina buferizada 10% antes de procesarlas para la evaluación histológica en bloques de cera. Los bloques de cera se cortaron en secciones seriadas de 5 µ? y se colocaron en portaobjetos. Los portaobjetos se tiñeron con Massons Tricrómico y se analizaron. Se realizó el análisis estadístico de los datos usando las pruebas de Mann Whitney U T de Student. Un valor de p<0,05 se consideró significativo. 3.5 Evaluación de las heridas incisionales al día 70 usando VAS macroscópico Las heridas incisionales se examinaron después de 70 días usando un sistema VAS macroscópico. Un puntaje 10 indica una mala cicatriz y un puntaje de 0 es piel normal (Figura 8). Los resultados del análisis VAS de las heridas el día 70 muestran que: El TGF-Beta 3 tipo salvaje (en dosis de 50 ng/100 pL y 100 ng/100 pL) redujo la formación de cicatrices en comparación con las heridas tratadas con placebo y sin tratamiento. Para ambas dosis esta reducción es estadísticamente significativa en comparación con las heridas tratadas con placebo (p<0.05).

El Gly63-Ala mutante (en dosis de 50 ng/100 pL y 100 ng/IO0 µ?_) redujo la formación de cicatrices en comparación con las heridas tratadas con placebo y sin tratamiento. Para la dosis de 50 ng/100 µ?_ esta reducción es estadísticamente significativa en comparación con las heridas tratadas con placebo (p<0.05). Gly63-Pro mutante (en dosis de 50 ng/100 pL y 100 ng/100 pL) redujo la formación de cicatrices en comparación con las heridas tratadas con placebo y sin tratamiento. Glul2-Ser mutante (en dosis de 50 ng/100 pL y 100 ng/100 pL) redujo la formación de cicatrices en comparación con las heridas tratadas con placebo y sin tratamiento. Para la dosis de 50 ng/100 pL esta reducción es estadísticamente significativa en comparación con las heridas tratadas con placebo (p<0.05). La mutante de serina doble (Glul2-Ser & Arg52-Ser) en dosis de 50 ng/100 pL y 100 ng/100 pL redujo la formación de cicatrices en comparación con las heridas tratadas con placebo y sin tratamiento. 3.6 Evaluación microscópica de las heridas incisionales al día 70 Los efectos macroscópicos indicados usando el sistema de puntuación VAS se confirmaron por análisis histológico. Losa ejemplos representativos de los portaobjetos histológicos se muestran en las Figuras 12 y 13. Las microfotog rafias histológicas muestran que la adición de proteínas de TGF- 3 de acuerdo con la invención induce una mejora similar a la que se observa con TGF-p3 tipo salvaje. Las proteínas de la invención inducen las fibras de colágeno dentro de la cicatriz a adoptar morfología y organización similar a la de la piel normal circundante. 4. Conclusiones La flexibilidad de la alfa hélice (entre los residuos de aminoácidos 58-67) impacta sobre la formación de TGF-Beta 3 dimérico correctamente replegado funcional durante el replegamiento. La estabilización de la alfa hélice por la sustitución de glicina 63 con alanina mejora mucho la eficiencia de replegamiento ya que la desestabilización de la alfa hélice por la sustitución de glicina 63 con prolina tiene un efecto opuesto. La sustitución de glicina 63 con alanina o prolina no altera la curación de herida en comparación con TGF-Beta 3 tipo salvaje. Gly63-Ala y Gly63-Pro reducen la formación de cicatrices en comparación con las heridas tratadas con placebo y no tratadas. La formación del 'puente salino' (entre Arg52 y Glul2) no altera la eficiencia de replegamiento de TGF-Beta 3. Glul2-Ser y la muíante de serina doble reducen la formación de cicatrices en comparación con las heridas tratadas con placebo y no tratadas. 5. Protocolos preferidos para la producción TGF-63 monoméricas y diméricas de acuerdo con la presente invención Las condiciones preferidas para generación de TGF-Beta 3 monoméricos correctamente replegados de acuerdo con la presente invención son las siguientes: 0.7 M de ácido 2-(ciclohexilamino)etansulfónico (CHES), 2 mM de glutatión reducido (GSH), 0.4 mM de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C. 30 mM de taurodeoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C. 1 M de NDSB-201 , 2 mM de glutatión reducido (GSH), 2 mM de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C. 0.7 M de CHES, 2 mM de glutatión reducido (GSH), 2 mM de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C. 30 mM de taurodeoxicolato más 1 M de NDSB-221 , 2 mM de glutatión reducido (GSH), 2 mM de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8X. 30 mM de taurodeoxicolato más 0.7 M de CHES, 2 mM de glutatión reducido (GSH), 2 mM de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C. 30 mM de taurodeoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 2mM GSSG, 0.12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C.

En general un TGF-P3 de acuerdo con la presente invención se puede plegar en una forma dimérica biológicamente activa por un método que comprende agregar TGF-ßß monomérico no plegado solubilizado a una solución que contiene: (i) ácido 2-(ciclohexilamino)etansulfónico (CHES) o un análogo funcional de este; y (ii) un sistema redox sulfhidrilo/disulfuro de bajo pesos molecular; e incubar el factor de crecimiento en la solución hasta que se forma el TGF-P3 dimérico biológicamente activo. Las condiciones preferidas para la generación TGF-Beta 3 diméricos correctamente replegados de acuerdo con la presente invención son los siguientes: 0.7 M de ácido 2-(ciclohexilamino)etansulfónico (CHES), 2 mM de glutatión reducido (GSH), 0.4 mM de glutatión oxidado (GSSG), 0.12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C. 30 mM de taurodeoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 0.4 mM de GSSG, 0.12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C. 30 mM de taurodeoxicolato, 0.7 M de CHES, 2 mM de GSH, 2mM GSSG, 0.12 mg/mL de TGF-Beta 3, pH 9.5 a 2-8°C.

Condiciones experimentales preferidas: 5.1 Clonación del vector y transformación en célula huésped El vector pET-24d deriva del vector pBR322 y contiene un promotor T7 bajo el control de LacUVS y un gen marcador resistente a kanamicina. El ADNc que codifica los TGF-P3 de la invención se pueden digerir con 0.75 µ? de Nco1 (New England Biolabs) y 0.75 µ? de BamHI (New England Biolabs) con buffer BamHI 1X (New England Biolabs) en una reacción de 15 µ?_ (agua libre de nucleasa, Novagen) a 37°C durante 4 horas. Se digirió un microlitro de plásmido pET-24d (Novagen) de la misma manera. El ADNc digerido y el fragmento del plásmido mayor se purificaron en gel de agarosa y se recuperaron usando el kit de extracción de ADN en gel SpinPrep (Novagen). El ADNc y los fragmentos de plásmido purificados se ligaron usando un kit de T4 ligasa (Novagen). El ADNc/plásmido ligado se transformó en HMS174 (DE3), (kit de transformación Novagen HMS174 (DE3)). Se seleccionaron los transformantes por sembrado en placas de agar con caldo Luria (LB) que contienen 50 pg/ml de kanamicina (Invitrogen). Se seleccionaron los clones adecuados para la digestión por restricción y/o expresión. 5.2. Selección del clon para la expresión del producto Los clones se cultivaron en cultivos en matraces de agitación de "caldo Terrific" de concentración media (6 g/L de peptona de fitona (Becton Dickinson), 12 g/L de extracto de levadura (Becton Dickinson), 2 g/L de glicerol (IT Baker), 1.16 g/L de fosfato de potasio monobásico (JT Baker), 6.25 g/L de fosfato de potasio dibásico (IT Baker), con es a 1 litro de agua destilada) y se induce una fase exponencial a una ??ß?? entre 0.65 y 0.85 con 1 mM de beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG). Se tomaron las muestras pos-inducción 3 horas después de la adición de IPTG y se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) para la inducción y expresión del producto. Se corrieron muestras de los clones en un gel NuPAGE® Novex 12% de Bis-Tis, 1 .0 mm (Invitrogen) durante aproximadamente 40-50 minutos a 120 miliAmp y 200 voltios y luego se tiñeron con azul de Coomassie. La expresión de los TGF^3 de acuerdo con la invención en consecuencia se puede inducir en estos cultivos. 5.3 Patrón de células congeladas Los clones se cultivaron en un matraces de agitación en caldo Terrific de concentración media a una DO6oo de aproximadamente 1 y se conservaron como patrones de glicerol por la adición de glicerol a 20% (v/v). Se alicuotaron 1.2 mi de caldo en crioviales de 12 x 2 mi (que contenían 0.3 mi de glicerol) y luego se conservaron a -70X. 5.4. Confirmación de secuencia del gen de TGF-Beta 3 Se tomaron muestras de los cultivos usados para los patrones de células congeladas antes de la adición de glicerol y se usaron para el aislamiento del plásmido usando un kit Qiagen MiniPrep. El plásmido aislado se secuenció y verificó usando un cebador promotor T7 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3') y y un cebador terminador 17 (5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3'). 5.5. Cultivo de semilla Un clon adecuado seleccionado se inoculó en un matraz erlenmeyer con tabique de 2 litros, que contiene 500 mi de medio HySoy (12 g/L de Hy-Soy (Quest International), 24 g/L de extracto de levaduras (Becton Dickinson), 10 g/L de NaCI (Sigma) y 10 g/L de glicerol (Sigma) y 50 pg/ml de kanamicina. El matraz se incubó con agitación a 37°C y 200 rpm y se muestreó periódicamente para medir la DO550. Cuando la DO del cultivo alcanzó 3.21 U/ml (después de 7 horas) se usó el caldo de células para sembrar un fermentador de 150 L (volumen de trabajo de 100 L. 5.6. Fermentación Se usaron novecientos mililitros de caldo celular (de la Sección 3.6) para inocular un fermentador de 150 L (WHE) que contiene 90 L de medio de cultivo en lote (0.6 g/L de K2HPO4, 0.4 g/L de KH2P04, 1 .25 g/L de NH4SQ4, 12 g/L de HY-Soy, 24 g/L de extracto de levaduras y 10 g/L de glicerol). Los parámetros operativos de la fermentación se controlaron de la siguiente manera: punto de ajuste de temperatura 37°C; punto de ajuste de pH, 7.0 (mantenido usando 4 N de hidróxido de amonio y 4 N de ácido fosfórico), y oxígeno disuelto (DO) calibrado inicialmente a 100%. La presión del cabezal del recipiente fue 7 psi, y la agitación y flujo de aire fueron de 200-400 rpm con un volumen de aire por volumen de medio por minuto (vvm o slpm), respectivamente. El DO se mantuvo por encima de 20% por el ajuste de los parámetros de ajuste con la siguiente prioridad: agitación (máx. 400 rpm), aeración (máx. 1.5 vvm), suplemento de oxígeno (máx. 33.3 Ipm), y presión trasera (máx 12 psi). La formación de espuma se controló con Pluronic L-61 (25% v/v). Cuando la DO del cultivo alcanza 10 U/ml se inicia una alimentación de glicerol (50% v/v) con una velocidad de flujo de 45 ml/min. Cuando la DO alcanza 40 U/ml, las células se inducen con la adición de IPTG hasta una concentración final de 0.2 mM. 5.7. Recolección Después de 4 horas pos-inducción, el termentador se refrigera a 10°C y se reducen el flujo de aire y la agitación a 0.3 vvm y 100 rpm respectivamente. Los controles de espuma y pH terminan y se ajusta la presión trasera a 3 psi. Se recolecta el cultivo por centrifugación continua con una centrífuga continua Westfalia CSA8 a 10°C. La centrífuga operó a 5,000 rpm y una velocidad de flujo de 3 litros por minutos y se recolectaron las suspensiones celulares. 5.8. Lisis celular y recuperación de IB La pasta de células de fermentación (de la Sección 5.7) se diluyó 1 :5 con buffer de lisis (6.1 g/L de TrizmaBase (Tris), 3.7 g/L de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 58.44 g/L de NaCI y 10 g/L de Tritón X-100, pH 8.0) y se resuspendió usando un homogenizador manual. La pasta celular resuspendida se pasó dos veces a través de un homogenizador de alta presión (parámetros: presión, 10,000 psig; velocidad de flujo, 450 ml/min; y temperatura, 15°C). El lisado celular homogenizado luego se centrifugó (centrifuga de cabezal, rotor de ángulo fijo) a 5,000 xg durante 20 minutos a 4°C. Se descartó el sobrenadante dejando el TGF-Beta 3 insoluble (cuerpos de inclusión). El pellet de cuerpos de inclusión (IB) se resuspendió en buffer de lavado (6.1 g/L de Tris y 3.72 g/L de EDTA, pH 8.0) usando un homogenizador manual y se centrifugó (5,000 xg durante 20 minutos a 4°C). 5.9. Solubilización de cuerpos de inclusión El sedimento de la Sección 5.8 se diluyó 1 :10 con el buffer de solubilización (6.1 g/L de Tris, 15.4 g/L de DL-ditiotreitol (DTT) y 360.4 g/L de urea, pH 8.0) y re-suspendió en un homogenizador manual. La suspensión se cubrió y dejó agitar durante 60-75 minutos, a temperatura ambiente para solubilizar los cuerpos de inclusión y reducir el TGF- 3 a sus forma monomérica. El pH del pellet resuspendido se ajustó a pH 9.4-9.6 con NaOH/ácido acético antes de la incubación durante un segundo tiempo de 60-75 minutos. 5. 0. Clarificación/ultrafiltración y diafiltración El material solubilizado de la Sección 5.9 se clarificó, concentró y diafiltró en un sistema de flujo tangencial (TFF) (Millipore). La clarificación y concentración iniciales se obtuvo con una membrana de clarificación TFF preacondicionada (Millipore Pellicon 1000 kDa, celulosa regenerada, prueba V). El TGF-Beta 3 clarificado se recolectó en el permeato. Luego se cambia a una membrana de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) (Millipore Pellicon 5kDa, celulosa regenerada, prueba C), el TGF-Beta 3 luego se lava en 6 volúmenes de diafiltración del buffer de solubilización (6.1 g/L de Tris, 15.4 g/L de DTT y 360.4 g/L de urea, pH 9.5). 5- 1 Ultrafiltración/Cromatografía de interacción hidrofóbica. La solución replegada seleccionada se concentró 5 veces por ultrafiltración (la membrana fue una lámina plana Millipore Pellicon 5 kDa, 0.1 m2, prueba de celulosa regenerada). El pH del material replegado concentrado luego se ajustó a un pH de 2.5-2.8 usando ácido acético glacial antes de diluir 1 : 1 en buffer de dilución (2.72 g/L de acetato de sodio, 264.28 g/L de sulfato de amonio, 100 g/L de ácido acético, y 210.7 g/L de clorhidrato de arginina de pH 3.3). Se equilibró una columna de flujo rápido de Butilsefarosa 4 (Amersham, 16 cm de altura de lecho) con cuatro volúmenes de columna de Buffer A (2.72 g/L de acetato de sodio, 132.14 g/L de sulfato de amonio y 100 g/L de ácido acético a pH 3.3). El material replegado se filtró a través de una membrana de 0.22 µ? (filtro Millipore Millipak) antes de cargarse en una columna de butilsefarosa a una velocidad de flujo de 100 cm/hora (esta velocidad de flujo se usó en todo el procedimiento). La columna luego se lavó en Buffer A para cuatro volúmenes de columna. Las proteínas de TGF-Beta 3 se eluyeron de la columna usando Buffer B (2.72 g/L de acetato de sodio, 100 g/L de ácido acético y 300 g/L de etanol, pH 3.3). El primer pico, que contiene las proteínas de TGF-Beta 3 en ambas formas monoméricas y diméricas se mezcló antes de la separación de las proteínas monoméricas y diméricas.

Información de secuencia TGF-/p3 (SEQ ID NO: 1) AI .D7N YCFRNII F.RNCCVRPLYI D F RQ D L G W KWYH EPKCY WS ' CliG PCPYL SA.D? THSTVLGLYN L PEASASFCCVPQDLEPLTZLYYV TPKV~.QTiSHMWKSCKCS Mutante de TGF- 3 "Gly63-Ala" (SEQ ID NO: 3) ALDTNYC DFRQ DLGWKWVHEPKGY YAN FCSG PCFYLRSAD ^H5TVLALY ]:LNP^ñ^SPCCV?QDL£?LTILYYVGRTFKVEQLS MvVKSC CS Mutante de TGF- 3 "Gly63-Pro" (Secuencia ID No.5) ALDT YCFR LEEKCCVRPLYTDFRQDLGWKWVHrpKG^ AKFCSGPCPYLRSAIjT THSTV:,PL·Yl TLNP?ASAS CC\ Q?I,EPLT:LYYVGRT?K FQ[.S^t KSCK G Mutante de TGF- 3 "Glul2-Ser" (SEQ ID NO: 7) AL TNYCrRNLSEr-lCCVRPLYIDFRQDTiG íK.i^/EEFKGYY .N?C3GPC?YL?.SACT TH 5 TVLGL YNC'LN PEAS S PCCVFQULKF] .G !! LYYVGRTFKVZQLSWMVV CK S Mutante de TGF- 3 TGF-/33 "Arg52-Ser" (SEQ ID NO: 9) ALPTM YGr'RNIjEEMCCVRPL I DFRQDLGWKWVHZ PKG Y A>! FC SG PC PY'LSS AD'I T H S T V L G 1 Y M T T ,N P E A 5 A 3 P C C V F'Q D L 1- T I L Y Y V GR? F K V E QL, S l\ M W K S C KC S Mutante de TGF-p3 "GII2-Ser/Arg52-Ser" (SEQ ID NO: 11) ALDT YCFR i .SE CV PLY T OFR DI. W ' JlÉP CiY YAKF F'CFYLSSAü J THSTVLGLy Tr.NFF SASPC V QYJ :; G1,??? ? YVGRT? EQLS MVV 3C CS SEQ ID NO: 2 - ADN que codifica TGF-p3tipo salvaje humana i I G GAC ACC AAC AC Y "?Z GGG AAC G GAC AAC TGC TGT GTG TAC ATT GAC T C GG GAC CTG "···· CTG GAT CAA TAC CAT GCC AAf "GC CCA GGG 'i TGC GAC GGG AGJ' GAC ALA ACC GAC ACO ACG :~ G n CCG CC" .CJ CC TCG ce ']·:.-:_ GV'G GCC CAT GTT GGG AGG CCG ¡¦Jü i - ÍG G C CAG CCG .¾0 ACG í-'iG GC'G ¾¾·: SEQ ID NO: 4 - ADN que codifica Gly63-Ala mutante uCT TGG GAC ACAT T.'-C CGC 1 G CGC A.AG ¦G?·-» C AAC 'l'GG TGT G G GCC CCG CGC TAC ATT GAC TTC GGA CAG G T GTG GGG. 'TGG G JGÜ GAT GAA.

A C GCC CAC TA.G GCC A .G TTG TGG TGA ¦:",··:" CCT TGG A TAC GGG GGG AGT C^- GAG ACA ACC GAG ACC AC^1 G G-.1 CTG GCA CTG TAC AAC " CTG AAC CCT GAA G 'A.

T TCC G GCCCC TTCCGG C CCCTT G GGGGG ) '''y¦i:!.: ! G 7 G GGG GAG GAC C erTeC GAG G C G A C C. ATC CTG TAC TA"' GTT' CCG .AGG A.CC GGG AAA GTG SA.G CAG CTC G ATG GTG GTG AAC1 TGT l'GG AAA. TGT SEQ ID NO: 6 - ADN que codifica Gly63-Pro mutante GCT GTG GAG ACC AA.T TAC TGG TTG . CG' AAC TTG GAG G G A. AG TGC \~.. C CGC CCG GTG GAG ATT GAG T'i'G GGA GAC C J c GGG GGG AA.G TGG CTC CAT G.AA CCG AAG GGG TAC TAT GCC A C T C TGC ICA GCC GCT TGG 'GGA TAC CTC CGC AGT GCA.

GAC ACA ACC CAG ACG ACG GTG CC CCA c p c T C A;..; .···;·; CTC ¦Ti ?.>~° CCT GAA f- " GGG GCC TCG GG'T TGG TGG G C CGC CAG GA CGG GAG CCG C'l G ACG AGC CTT GAT GTT GGG "'.G-'"" ACC AAA TC GAG CTC TGC JiAC ATG G GO AAG "."·' G SEQ ID NO: 8 - ADN que codifica Glul2-Ser mutante GCJ TTG GAG ACC AA.T C'AC '-'GC :GG CGC AAG TTG TCG G G AAC 'CGC ??·; GTG GGG GC G GGG TAC ATT GAG TTG CCA CAG C.A'I CCG GGC TGG AAG GGG GJ C GAT CAA GCT AAG GGG TAC TA'l' GGG AAC TIC TGC TGA CGC CG'I TGC GAG GGG CGC AGT GGA GAC ACA ACC CAí: C ACG GTG GTG GGA CTG TAC AAC C" GTG AAC CCc AAA GGA. TGC GCC TGG G C 'l'GG TGG GTG CCG CAG GAC CTG G AG GGC GTG ACG AGC GGG TAC TA GTT GGG AGG AGG GGG AAA GTG CAG CAG CTG TGC AAC AGG CTG GGG AAC TCT TGT AAA GGT /-J._- SEQ ID NO: 10 - ADN que codifica Arg52-Ser mutante GGT TTG G C ACC AA.T TAC TGG TTC CGC AAC GAG G G AAG TGG TG !' GGG GGC GGG CGG TAC A T G C TTG CAG G " GGG T G A G, TGG GGG GAG GAA GGT AAG GGC 'J'AC TAT GGC AAG TC l ·' ; TGA GGC CCT CGC GCA TAC CGG AGC AGT GAC ACA ACC GAG A GC' ACC GTG GGA. CTC C AAC ACG CTG AAC GCT GAA GGA ·.' ."! GCC: TGG CCT TGC TGC GGG G G G A G GAG GTG GAG CGC CTG ACC AGC Gl'G ? 7--.G TAC GTT GGG AGG ACC CCG AAA GTG GAG G AG CT G TGG AAC ATG G G GTG AAG 'CCT GGT AAA TCT AGG SEQ ID NO: 12 - ADN que codifica Glul2-Ser/Arg52-Ser mutante ¦?'. G TAC ¦IG<: TTC AAC TCG TCG GAG TGC •rc.r í :7Ü CGC A V G GA<; 1'··.' i i CAC- GA7 CTG G ¦TGG -AA.G J GG CCG CA.T GAA CCT (_-' C AA:~; rrc T3C TCA GCC CC7 TGC C .¾ TAC CTC AGC AGT GCA A C G'I'C CTG GGA CTG A¾C P. T CTG AAG CCT GAA GCA GG7 TC-C TGC "G ccc C O GAC (.·"<;¦ GAC G C Z C'I'G ACC ATC CTG '•'ñC GGG ACC ??? C-TS GAC CAG CTC AC A l'G GT GTG AAG '.l'G': TGT \GC CUADRO 1 Escala de propensión de hélice basado en los estudios experimentales de proteínas y péptidos Propensión de hélice hécIHelix Aminoácido (kcal/mol) Ala 0.00 Glu° 0.16 Leu 0.21 Met 0.24 Arg* 0.21 Lys* 0.26 Gin 0.39 Glu 0.40 He 0.41 Aspu 0.43 Ser 0.50 Trp 0.49 Tyr 0.53 Phe 0.54 Val 0.61 Tlir 0.66 Hisu 0.56 His* 0.66 Cys 0.68 Asn 0.65 Asp" 0.69 Gly 1.00 Pro 3.16 CUADRO 2 CUADRO 3 Eficiencia de replegamiento de TGF-P3 tipo salvaje y TGF-P3 de la invención.

CUADRO 4 Actividad biológica de TGF-fi3 tipo salvaje y Gly63-Ala (proteína de TGF-P3 de la invención) evaluada por el ensayo de inhibición de crecimiento celular CUADRO 5 Tratamiento del sitio de herida CUADRQ6 Tratamiento del sitio de herida

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un TGF-33, o un fragmento o derivado de este, en donde el dominio formador de doble hélice entre residuos de aminoácidos 58 y 67 del TGF-P3 de tipo salvaje de longitud completa comprende al menos una sustitución para estabilizar la alfa hélice.

2. - El TGF- 3, o fragmento o derivado de este, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el residuo glicina de la posición 63 de TGF-p3 de tipo salvaje de longitud completa se reemplaza con un residuo de aminoácido que estabiliza la alfa hélice.

3. - El TGF- 3, o fragmento o derivado de este, de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado además porque la sustitución para estabilizar la alfa hélice comprende la introducción de residuo seleccionado del grupo que consiste en alanina, serina, treonina, valina, leucina, isoleucina; metionina y fenilalanina.

4. - El TGF-P3, o un fragmento o derivado de este, de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el residuo glicina de la posición 63 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa se reemplaza con alanina.

5. - El TGF- 3 de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende la SEQ ID NO: 3, o un fragmento o derivado de este.

6. - El TGF- 3, o un fragmento o derivado de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque no comprende una sustitución del residuo valina de la posición 61 de TGF- 3 tipo salvaje de longitud completa.

7. - Un TGF-P3, o un fragmento o derivado de este, en donde el residuo glicina de la posición 63 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa se reemplaza con prolina.

8. - El TGF-P3 de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende la SEQ ID NO: 5, o un fragmento o derivado de este.

9. - Un TGF- 3, o un fragmento o derivado de este, que comprende una sustitución del residuo de ácido glutámico de la posición 12 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa y/o el residuo de arginina de la posición 52 del TGF-P3 de tipo salvaje de longitud completa.

10. - El TGF- 3, o un fragmento o derivado de este, de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la sustitución, o substituciones, es con un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste: serina; alanina; treonina; valina; isoleucina; metionina; fenilalanina; y leucina. 1 1 . - El TGF- 3, o un fragmento o derivado de este, de conformidad con la reivindicación 9 o reivindicación 10, caracterizado además porque el residuo de ácido glutámico de la posición 12 del TGF-33 de tipo salvaje de longitud completa está sustituido con serina 12. - El TGF-P3, o un fragmento o derivado de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 1 , caracterizado además porque el residuo de arginina de la posición 52 del TGF- 3 de tipo salvaje de longitud completa está sustituido con serina. 13. - Un TGF- 3 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11 , o un fragmento o derivado de este. 14. - Un TGF- 3 monomérico, o un fragmento o derivado de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13. 15.- Un TGF- 3 dimérico o un fragmento o derivado de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13. 16.- Un TGF- 3, o fragmento de TGF- 3, o un derivado de TGF-ß3, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso como un medicamento. 17.- El uso de un TGF- 3, o fragmento o derivado de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la preparación de un medicamento útil para aceleración de la curación de heridas y/o la prevención, reducción o inhibición de la formación de cicatrices. 18. - El uso de un TGF-p3, o fragmento o derivado de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la preparación de un medicamento útil para la promoción de regeneración epitelial. 19. - El uso como se reclama en la reivindicación 17 o reivindicación 18, en donde el medicamento es adaptado para ser administrable en la piel. 20.- El uso como se reclama en la reivindicación 17 o reivindicación 18, en donde el medicamento es adaptado para ser administrable en el ojo. 21 .- El uso de un TGF-P3, o fragmento o derivado de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la preparación de un medicamento útil en la prevención y/o tratamiento de un trastorno fibrótico. 22. - El uso como se reclama en la reivindicación 21 , en donde donde el trastorno fibrótico se selecciona del grupo que consiste en fibrosis pulmonar, fibrosis hepática, escleroderma, fibrosis cutánea, fibrosis muscular, fibrosis por radiación, fibrosis renal, vitrorretinopatía proliferativa y fibrosis uterina. 23. - El uso de un TGF- 3, o un fragmento o derivado de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de trastornos angiogénicos, restenosis, adhesiones, endometriosis, enfermedad isquémica, mucositis oral y enfermedad renal. 24. - El uso de un TGF-p3, o un fragmento o derivado de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la preparación de un medicamento útil en la inducción del hueso y cartílago, o en fertilización in vitro. 25. - Un ácido nucleico que codifica un TGF- 3, o fragmento o derivado de este, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15