CN101437846A

CN101437846A - 蛋白、核酸和药物

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Publication number: CN101437846A
Application number: CNA2007800163435A
Authority: CN
Inventors: 马克·威廉·詹姆斯·弗格森; 菲利普·梅勒; 修·杰勒德·莱弗蒂; 尼克·奥克莱斯顿; 沙伦·奥凯恩; 爱玛·阿特金森
Original assignee: Renovo Ltd
Current assignee: Renovo Ltd
Priority date: 2006-03-11
Filing date: 2007-03-12
Publication date: 2009-05-20
Also published as: EP2001904A2; NO20084189L; US20110105396A1; US20090105146A1; CA2645344A1; WO2007104945A2; BRPI0708785A2; AR063947A1; SG170109A1; JP2009543542A; RU2008140119A; WO2007104945A3; KR20080106450A; IL193699A0; US7947264B2; MX2008011705A; GB0604938D0; AU2007226345A1

Abstract

本发明提供了TGF－β3或其片段或其衍生物，其中在全长野生型TGF－β3的氨基酸残基(58)和(67)之间的α螺旋形成结构域包括至少一个稳固α螺旋的置换。本发明还提供了TGF－β3或其片段或其衍生物，其中在全长野生型TGF－β3的位置(63)上的甘氨酸残基被脯氨酸替换。并且更进一步，本发明提供了TGF－β3或其片段或其衍生物，其包括在全长的野生型TGF－β3的位置(12)上谷氨酸残基的置换和/或全长的野生型TGF－β3的位置(52)上精氨酸残基的置换。本发明还提供了使用这种TGF－β3的药物和治疗方法。

Description

蛋白、核酸和药物

本发明涉及衍生自TGF-β3的蛋白、这种蛋白的生物活性片段和编码所述蛋白的核酸。本发明也提供了所述蛋白或生物活性片段的衍生物。本发明还提供了包括本发明的蛋白、片段、衍生物或核酸的药物，以及利用本发明的蛋白、片段、衍生物或核酸的治疗方法。

转化生长因子β(TGF-β)是参与调节很多细胞过程的生长因子的超家族的部分，所述细胞过程包括增殖、迁移、细胞凋亡、粘连、分化、炎症、免疫抑制和胞外蛋白的表达。

TGF-β有3种哺乳动物同工型，称为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β是由广泛类型的细胞产生的，所述广泛类型的细胞包括上皮细胞、内皮细胞、造血细胞、神经元细胞和结缔组织细胞。

TGF-β在多种不同的治疗环境有功效，并且TGF-β3同工型尤其有许多有利的治疗用途。由于TGF-β3的治疗潜力，其药学应用受到很多关注。全长的野生型TGF-β3的氨基酸序列以序列ID号1提出，编码该TGF-β3的cDNA以序列ID号2提出。

已知TGF-β3在调节伤口愈合反应中起关键作用。TGF-β3的活性可能影响伤口愈合的速度和愈合引起的瘢痕形成程度。

TGF-β3还可用于治疗纤维化症状，肺纤维化、肝硬化、硬皮病；血管生成病症，再狭窄、粘连、子宫内膜异位、缺血性疾病、骨和软骨诱导、体外受精、口腔粘膜炎、肾病、预防、减少或抑制瘢痕形成、促进外周和中枢神经系统神经元重连接、预防、减少或抑制眼外科手术(例如LASIK或PRK手术)并发症或眼后部瘢痕形成(例如增殖性玻璃体视网膜病变)。

TGF-β3自身具备的治疗用途已经建立了对生物活性TGF-β3蛋白来源的公认需求，已经做出很多尝试来通过重组方法产生这种有价值的蛋白。然而，现有的产生TGF-β3的方法被严重限制了，这是由于为了获得生物活性分子而必须再折叠这种复杂的蛋白质。

TGF-β以包含两个112个氨基酸的亚基的同型二聚体蛋白形式天然存在。这些TGF-β3亚基的每一个在活性肽片段的第58个和第67个残基间都含有α螺旋形成结构域。除了残基58和67之间的α螺旋外，每一个TGF-β3亚基还含有许多亚基内部键，所述键包含盐桥和二硫键。

TGF-β3是以100-kDa的潜在的无活性前体分子(LTGF-β3)形式分泌的。所述LTGF-β3分子由以下成分组成：

i)C末端25kDa二聚体信号肽(活性片段)；以及

ii)潜在相关肽(LAP)。

LTGF-β是通过LAP从活性片段解离而被激活的。LTGF-β的裂解可通过酶如内肽酶(弗林蛋白酶、纤溶酶和凝血酶)的作用来介导，或通过酸化细胞外周空间来介导。活性TGF-β二聚体片段通过疏水和离子相互作用来稳定，所述相互作用通过亚基间的二硫键进一步加强。每个单体包括通过4个内部二硫键中的3个连锁的几个延伸的β链，并形成已知为“半胱氨酸结”的紧密结构。

由于生物活性TGF-β3分子(如上文已显示的，其是含有8个链内二硫键和1个链间二硫键的同型二聚体蛋白)的复杂性，它们最初是在真核生物中表达。然而，使用真核生物表达系统可能实现的相对低的表达水平以及这种方法的高成本，意味着为了提高TGF-β3生产的商业效率要对使用微生物宿主进行考察。

用微生物宿主如大肠杆菌(E.coli)表达重组分子(如包含多个二硫键的TGF-β3)的不利因素在于，产生的蛋白通常没有正确折叠并且经常形成不可溶的包涵体。这些包涵体需要增溶，然后复性以使蛋白再折叠成其天然的生物活性构象。为有效复性TGF-β3同型二聚体，需要再产生正确取向的共价二硫键。假设有9个二硫键，允许34,459,245种可能的二硫键组合，则通过随机的二硫键形成方法来形成正确的TGF-β3同型二聚体的可能性很低。因此就不惊讶于重组产生的TGF-β3的再折叠严重影响了它的生产，因为这种折叠可能需要达144小时，并且通常仅获得20％左右的再折叠效率。

本发明的目的之一是排除或减少现有技术存在的一些问题。本发明某些方面的目的之一是提供TGF-β3(或其片段或衍生物)，所述TGF-β3(或其片段或衍生物)与野生型TGF-β3相比具有提高的再折叠效率。本发明某些方面的另一个目的是提供具有TGF-β3活性的不同于野生型TGF-β3的药剂。所述药剂提供了对于天然产生的TGF-β3的有价值的供选方案。

在本发明的第一个方面，提供了TGF-β3或其片段或衍生物，其中在全长的野生型TGF-β3的氨基酸残基58和67之间的α螺旋形成区包括至少一个稳固α螺旋的置换。根据本发明的第一个方面，本发明也提供了编码TGF-β3或其片段或衍生物的核酸。

本发明的发明人惊奇的发现，在本发明的第一个方面公开的新的TGF-β3与天然形成的TGF-β3有相同的生物活性，并且与野生型TGF-β3相比有显著改善的蛋白再折叠的效率。这种增加的蛋白再折叠的效率构成显著重要的优势，因为其简化了用于生产生物活性TGF-β3的再折叠的条件，又极大的增加了所述蛋白(或所述蛋白的片段或衍生物)的产率，所述蛋白可通过使用原核蛋白表达系统来生产。

不希望受到任何假设的限制，本发明的发明人相信，将稳固α螺旋的置换引入α螺旋形成区可有益降低此区域形成的α螺旋的灵活性。该降低的灵活性有助于提高本发明第一个方面的TGF-β3的正确再折叠，以生产生物活性蛋白质(或其片段或衍生物)。α螺旋的稳固(通过稳固α螺旋的置换)赋予的降低的灵活性足以增加正确再折叠的TGF-β3的产率(尤其是再折叠的TGF-β3二聚体)，然而令人惊奇的是，本发明的发明人发现所述置换不会改变本发明第一个方面的TGF-β3的生物活性，并且所述TGF-β3的生物和治疗效力也不会降低。

除了上下文另有要求外，本说明书中氨基酸残基的编号是基于TGF-β3活性肽部分的氨基酸序列。例如，对“全长的野生型TGF-β3”的提及，通常用来指显示在序列ID号1中活性肽的氨基酸序列，而对在氨基酸残基58和67之间的α螺旋形成区也是作相应的解释。

一个稳固α螺旋的置换可优选包括在全长的野生型TGF-β3的63位置上的甘氨酸残基的置换。然而，合适的置换可另外的或做为选择的包括例如，全长的野生型TGF-β3的60或67位置上的一个或两个苏氨酸的置换，或者全长的野生型TGF-β3在66位置上的天冬酰胺的置换。优选的是，本发明使用的稳固α螺旋的置换不包括缬氨酸61的置换。

本发明的“稳固α螺旋的置换”应理解为如下置换：其中存在于野生型TGF-β3中一个指定的氨基酸残基被更倾向于形成α螺旋的残基替换。因此引入稳固α螺旋的置换的替换氨基酸残基不必需是其本身容易稳定整合到α螺旋上的氨基酸残基，而只需比被置换的氨基酸残基有更多的稳定整合倾向性。然而，通常优选的是，作为稳固α螺旋的置换的部分而引入的替换氨基酸残基是确实有利于整合入α螺旋的氨基酸残基。

本发明的发明人发现可以引入本发明第一个方面的稳固α螺旋的置换中的优选替代氨基酸残基可以是选自下述组的任一个氨基酸或氨基酸的组合：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，甲硫氨酸和苯丙氨酸组成。这些优选的替换氨基酸残基都被认为是适用于全长的野生型TGF-β3的63位置上甘氨酸残基的稳固α螺旋的置换。也就是说，选自所述组的替换氨基酸残基可在58和67氨基酸残基间α螺旋形成区中的任意位置置换，在所述位置所述替换氨基酸残基可提供稳固α螺旋的置换。

尽管上述列举的氨基酸残基代表了用于稳固α螺旋的置换的优选残基，也应该可以理解：有一些可选择的定性和定量系统可以测定促成α螺旋形成的氨基酸残基的倾向性(和用于稳固α螺旋的置换的残基的适合性)，合适的用于稳固α螺旋的置换的氨基酸残基可参考任何这些系统并结合TGF-β3序列的知识进行选择。

作为例子，Chou和Fasman说明的定性系统鉴定了基于它们形成α螺旋的倾向性的5种不同分类的氨基酸残基。它们依次是：

强螺旋形成型；

弱螺旋形成型；

中性形式；

弱螺旋破坏型；以及

强螺旋破坏型。

针对本发明说明书，氨基酸残基谷氨酸、组氨酸、色氨酸、赖氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺和苯丙氨酸可被认为是螺旋形成型，其中谷氨酰胺、甲硫氨酸、丙氨酸和亮氨酸构成强螺旋形成型。相反，天冬酰胺、甘氨酸和脯氨酸可被认为构成螺旋破坏型，其中甘氨酸和脯氨酸是强螺旋破坏型。

因此，如果是参考该定性等级评价α螺旋形成的倾向性，那应该认可的是，尽管稳固α螺旋的置换可优选氨基酸残基被螺旋形成型替换的置换，但适合的稳固α螺旋的置换可选择地利用中性形成型或甚至螺旋破坏型，这取决于待替换的氨基酸残基的性质。例如，在中性形式的氨基酸残基是稳固α螺旋的置换的对象的情况下，适合的替换氨基酸残基可以是强螺旋形成型或弱螺旋形成型。在强螺旋破坏型是稳固α螺旋的置换的对象的情况下，替换氨基酸残基可以是强螺旋形成型、弱螺旋形成型、中性形式氨基酸或弱螺旋破坏型。

相应的，本发明的稳固α螺旋的置换可包括强螺旋破坏型被弱螺旋破坏型、或中性形式、或弱螺旋形成型或强螺旋形成型置换。可选择的或另外的，适合的稳固α螺旋的置换可包括弱螺旋破坏型被中性形式、弱螺旋形成型或强螺旋形成型置换。可选择的或另外的，适合的稳固α螺旋的置换可包括中性形式氨基酸被弱螺旋形成型或强螺旋形成型置换。可选择的或另外的，适合的稳固α螺旋的置换可包括弱螺旋形成型被强螺旋形成型置换。

氨基酸残基形成α螺旋的倾向性、以及因此其用作稳固α螺旋的置换部分的适合性的一种可选择的评价是基于本领域技术人员所知的任何定量等级数。

这种用于确定氨基酸残基用于稳固α螺旋的置换的适合性的定量等级的例子示于表1。该表提供了以kcal/mol标度的值，反映了氨基酸促成α螺旋的倾向性。表1中的高值伴随形成α螺旋的低的倾向性。

如此，依照本发明第一个方面的要求，当使用定量等级(如表1所显示的)评价氨基酸残基用于稳固α螺旋的置换的适合性时，适合的稳固α螺旋的置换是其中氨基酸残基被比被替换残基有更大的螺旋形成倾向性(表1中显示的更低的kcal/mol值)的氨基酸残基替换。

依照本发明可被利用的适合的置换包括引入人工的替换氨基酸的那些置换。可有益用于稳固α螺旋的人工氨基酸的适合的例子包括具有烷基和羟基侧链的氨基酸残基。

丙氨酸代表了特别优选的适合用于稳固α螺旋的置换的替换氨基酸残基。最优选的是，本发明的第一个方面的TGF-β3或其片段或衍生物包括在全长的野生型TGF-β3的63位置上的甘氨酸被丙氨酸替换。

优选的本发明第一个方面的TGF-β3的氨基酸序列以序列ID号3显示(Gly-63Ala)，编码该TGF-β3的DNA以序列ID号4显示。含有在全长的野生型TGF-β3的63位置上的丙氨酸的置换的序列ID号3的TGF-β3的片段或衍生物，代表了优选的本发明第一个方面的TGF-β3的片段或衍生物。

适合的置换可以是其中全长的野生型TGF-β3中58和67之间的一个或多个氨基酸残基被一个或多个天然的或人工的氨基酸残基替换的置换。作为进一步说明，适合的置换可包括单个的氨基酸残基被一个或多个替换残基置换，或者多于一个的氨基酸残基被一个或多个替换残基置换。优选的置换可以是其中氨基酸残基数是保守的置换，即其中被置换的氨基酸残基数与引入的替换氨基酸残基数是相同的置换。

还应该理解的是，优选的待替换的氨基酸残基(或多个残基)可参考如上讨论的定性或定量等级来选择。因此，适合作为稳固α螺旋的置换的对象的氨基酸可以是分类为螺旋破坏型、或优选强螺旋破坏型，参考如上讨论的定性等级。参考表1显示的定量等级，适合作为稳固α螺旋的置换的对象的氨基酸可以优选螺旋倾向性值大于或等于0.50、更优选螺旋倾向性值大于或等于0.60和最优选螺旋倾向性值是1.00的氨基酸。

本发明的发明人相信，本发明的第一个方面的TGF-β3、或其生物活性片段或其衍生物可用于其中希望利用野生型TGF-β3的生物活性的所有环境中。这些环境具体包括但不限于治疗用途。与所述治疗用途一致，本发明也提供了依据本发明的第一个方面的TGF-β3、或其片段或衍生物作为药物的用途。

应该可以理解，尽管可能优选的是本发明第一个方面的TGF-β3的片段或衍生物包括含有稳固α螺旋的置换的全长的α螺旋形成区，但这种需要不是必须的情况。适合的片段或衍生物可包括截短的α螺旋形成区，只要所述截短的α螺旋形成区包含至少一个稳固α螺旋的置换即可。

在本发明的第二方面提供了其中在全长的野生型TGF-β3的63位置上的甘氨酸残基被脯氨酸替换的TGF-β3或其片段或衍生物。本发明也提供了编码本发明的第二方面的TGF-β3或其片段或衍生物的核酸。

本发明的发明人惊奇的发现，本发明的第二方面的蛋白(或其片段或衍生物)具有与野生型TGF-β3相当的生物活性。这个发现是意想不到的，因为认为脯氨酸在通常与α螺旋形成有关的TGF-β3区域中的出现将干扰此种蛋白的二级结构，从而削弱其生物功能。尽管本发明的第二方面的TGF-β3的再折叠效率低于野生型TGF-β3，但预期的功能削弱惊奇地没有发生。

因此本发明的第二方面的蛋白(或其片段或衍生物)给本领域提供了有价值的贡献，因为它们扩展了对于技术人员有用的能够发挥TGF-β3活性的化合物的所有组成成分。所述化合物可以例如用于其中需要治疗性地使用TGF-β3活性的环境。

优选的本发明的第二方面的优选TGF-β3的氨基酸序列以序列ID号5显示(Gly-63Pro)，编码所述TGF-β3的DNA以序列ID号6显示。含有在全长的野生型TGF-β3中63位置上脯氨酸的置换的序列ID号5的TGF-β3的片段或其衍生物，代表了优选的本发明的第二方面的TGF-β3的片段或其衍生物。

若本发明的第二方面TGF-β3或其片段或衍生物可被应用于其中需要治疗性地利用野生型TGF-β3生物活性的环境，则应该可以理解也提供了本发明的第二方面的TGF-β3或其片段或衍生物作为药物的用途。本发明的发明人相信所述药物可用于其中已知利用TGF-β3的生物活性的全部临床环境。

在本发明的第三方面，提供了包括全长的野生型TGF-β3中12位置上谷氨酸残基的置换和/或全长的野生型TGF-β3中52位置上精氨酸残基的置换的TGF-β3或其片段或衍生物。本发明也提供了本发明的第三方面的编码TGF-β3或其片段或衍生物的核酸。

应该可以理解，本发明第三方面因此包括其中全长的野生型TGF-β3中12位置上的谷氨酸被置换但是保留了全长的野生型TGF-β3中52位置的精氨酸的TGF-β3。本发明第三方面也包括其中保留了全长的野生型TGF-β3中12位置上的谷氨酸但是全长的野生型TGF-β3中52位置的精氨酸被置换的TGF-β3。

然而，优选的是，本发明第三方面的TGF-β3包括全长的野生型TGF-β3中12位置上的谷氨酸残基的置换和全长的野生型TGF-β3中52位置的精氨酸残基的置换。

本发明的发明人惊奇的发现本发明第三方面的蛋白也具有与野生型TGF-β3的生物活性相当的生物活性。这个发现是预料不到的，因为置换一个或两个全长的野生型TGF-β3中12位置上的谷氨酸残基和/或全长的野生型TGF-β3中52位置的精氨酸残基，破坏了通常在野生型TGF-β3中存在的亚基内部的盐桥的形成。不能完成正确的盐桥形成的这种失败，可以预期降低本发明的第三方面的TGF-β3的生物活性，因为蛋白质如TGF-β3的生物活性通常被认为是依赖于它们的构象。

此外，本发明的发明人还发现本发明第二方面的TGF-β3显示了成功再折叠的效率，所述效率与野生型TGF-β3所观察到的一样高。这个发现非常令人惊讶，因为本领域技术人员认为的是，本发明第二方面的TGF-β3中必然发生的亚基内部盐桥形成的缺失会有害地影响再折叠发生率，因而会降低生物活性TGF-β3的产率。

因此本发明的第三方面的蛋白服务于扩展了对于技术人员有用的能够发挥TGF-β3活性的化合物的所有组成成分。如上文记录的，所述化合物的可用性在其中需要治疗性地利用TGF-β3活性的环境中是重要的。

本发明的发明人发现，全长的野生型TGF-β3中12位置上的谷氨酸或全长的野生型TGF-β3中52位置的精氨酸中不管哪一个都可被选自下述组的任一个氨基酸残基(或氨基酸残基的任何组合)置换：丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸。

优选的是，丝氨酸作为替换氨基酸残基用于本发明的第三方面的TGF-β3或其片段或衍生物。丝氨酸可被用来替换全长的野生型TGF-β3中12位置上的谷氨酸或全长的野生型TGF-β3中52位置的精氨酸。最优选地，丝氨酸既用于替换全长的野生型TGF-β3中12位置上的谷氨酸，又用于替换全长的野生型TGF-β3中52位置的精氨酸。

优选的本发明第三方面的TGF-β3的第一个例子以序列ID号7显示。本发明包含序列ID号7的生物活性片段或衍生物，所述序列ID号7包括Glu12-Ser置换。编码所述优选TGF-β3的cDNA在序列ID号8中显示。

优选的本发明第三方面的TGF-β3的第二个例子以序列ID号9显示。包括Arg52-Ser置换的序列ID号9的生物活性片段或衍生物也构成了优选的本发明的片段或衍生物。编码所述优选TGF-β3的cDNA以序列ID号10显示。

优选的本发明第三方面的TGF-β3的第三个例子以序列ID号11显示。包括Glu12-Ser置换和Arg52-Ser置换的序列ID号11的生物活性片段或衍生物也构成了优选的本发明的片段或衍生物。编码所述优选TGF-β3的cDNA以序列ID号12显示。

本发明的发明人相信，本发明第三方面的TGF-β3或其生物活性片段或其衍生物可用于其中可能希望利用野生型TGF-β3生物活性的全部环境。这些环境包括但不限于TGF-β3的治疗用途。相应的，本发明也提供了本发明第三方面的TGF-β3或其片段或衍生物作为药物的用途。

本发明的TGF-β3或其生物活性片段或其衍生物可用于治疗伤口(包含慢性伤口例如溃疡)。它们尤其可用于通过预防、减少或抑制瘢痕形成来促进加速伤口愈合，和/或促进伤口的上皮再生。本发明的TGF-β3还可用于实现预防或治疗纤维化疾病，所述疾病可独立的选自包括肺纤维化、肝硬化、硬皮病和肾小球肾炎、肺纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、肌肉纤维化、放射性纤维化、肾脏纤维化、增殖性玻璃体视网膜病变和子宫纤维化的组。

本发明的TGF-β3可用于治疗硬皮病、血管生成病症、再狭窄、粘连、子宫内膜异位、缺血性疾病、骨和软骨的诱导、体外受精、口腔粘膜炎和肾病。作为例子，野生型二聚体TGF-β3在动物模型和临床中的局部应用已经显示能够加速慢性、非愈合的压迫性溃疡的愈合速度；降低了口腔粘膜炎的发病率、严重度和持续时间；并降低了放射性胃肠道综合征的不良副作用，所述综合征是由癌症治疗中的放疗和化疗导致干细胞损伤而形成的。本发明的发明人相信本发明的TGF-β3或其片段或衍生物可有益地用于全部的这些适应症。

本发明的TGF-β3可与天然存在的TGF-β3相同的方式用于例如治疗可以例如独立选自下述的状态：纤维化疾病、硬皮病、血管生成病症、再狭窄、粘连、子宫内膜异位、缺血性疾病、骨和软骨的诱导、体外受精、口腔粘膜炎、肾病，预防、减少或抑制瘢痕形成，促进外周和中枢神经系统神经元重连接和预防、减少或抑制眼外科手术(如LASIK或PRK手术)并发症。本发明的TGF-β3可用于治疗唇和腭裂(例如与这种状态的手术修补相结合)，和减少或抑制瘢痕形成和促进腱的愈合。本发明公开的TGF-β3的突变型能够以与天然存在的TGF-β3相同的方式促进加速的伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。它们也可以促进上皮细胞的损伤部位的上皮再生。

“本发明的TGF-β3”包括本发明的第一、第二或第三方面中任何方面的任何的突变型TGF-β3。应该可以理解本发明的TGF-β3不包含TGF-β1或TGF-β2。TGF-β3的身份可参考它的序列或优选参考它的生物活性来确定。因此，可基于能够减少施用了TGF-β3的伤口处的瘢痕形成来将TGF-β3与TGF-β1或TGF-β2区分。本发明的TGF-β3可优选是非天然TGF-β3。

本发明任何方面的TGF-β3都可用于制备用于治疗其中可能希望利用TGF-β3的任何状态的药物。这种用途包括但不限于，治疗任何本说明书中考虑到的任何状态。可以优选的是，本发明的TGF-β3用于制备用于促进加速伤口愈合，和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的药剂。所述瘢痕形成可能与伤口和/或纤维化疾病有关。用本发明TGF-β3生产的药物可优选用于皮肤，或眼(例如加速皮肤或眼的愈合，或预防、减少或抑制皮肤或眼的瘢痕形成)。

本发明的TGF-β3可以是潜在的TGF-β3或有活性的TGF-β3(例如有或没有潜在相关肽)。

除上下文另有要求外，所有对本发明的TGF-β3的提及都应认为包括所述TGF-β3的片段或其衍生物，其中所述片段或衍生物的特征是它们包括使它们与野生型TGF-β3的片段或其衍生物(其氨基酸序列在本发明意图中用序列ID号1代表)相区别的置换(适当地与本发明的第一、第二或第三方面一致)。本发明的第一、第二或第三方面的适合的TGF-β3的片段或其衍生物可包括至少10个氨基酸残基，优选至少40个氨基酸残基，更优选至少70个氨基酸残基，最优选至少100个氨基酸残基。

除了上下文另有要求，本发明说明书中对TGF-β3和TGF-β3的片段的提及也包括这种蛋白或片段的衍生物。

不受限制的，适合形式的衍生物的适合的例子可选自：本发明TGF-β3(或其片段)的治疗有效肽衍生物、包括或基于本发明TGF-β3(或其片段)药效基团的治疗有效片段或衍生物、本发明TGF-β3(或其片段)的治疗有效类肽衍生物、本发明TGF-β3(或其片段)的治疗有效D-氨基酸衍生物、基于本发明TGF-β3(或其片段)的治疗有效肽模拟物、本发明TGF-β3(或其片段)的治疗有效肽类似物、基于本发明TGF-β3(或其片段)的治疗有效假肽、基于本发明TGF-β3(或其片段)的治疗有效逆反式肽、基于本发明TGF-β3(或其片段)的治疗有效缩酚酸肽衍生物、基于本发明TGF-β3(或其片段)的治疗有效β-肽衍生物和基于本发明TGF-β3(或其片段)的治疗有效逆类肽衍生物。

应该可以理解，为本发明目的，“TGF-β3”可以包括单体和二聚体形式的TGF-β3。本发明的发明人惊奇的发现本发明的TGF-β3以单体和二聚体形式都能发挥其生物效应。这惊奇地与现有技术之前报道的不同，现有技术通常认为TGF-β例如TGF-β3只可在二聚体形式下才能发挥生物活性。本发明人有关本发明的TGF-β3可以单体形式使用的发现提供了巨大的优点，因为所述单体形式可通过相对简单的折叠技术(如后面进一步讨论的例子)就能生产，因此提高了生物活性分子生产的速度，同时也降低了与所述分子生产相关的费用。

优选的是，本发明的单体TGF-β3是以序列ID号3、5、7、9或11显示的TGF-β3，或其片段或衍生物。

“本发明的药物”包括本发明TGF-β3的任何药物。本发明的药物可另外或可选择的是包括编码本发明TGF-β3的核酸的药物。所述药物既包含药物本身(即，不考虑药物的用途)，又包括用于具体治疗应用(例如治疗或改善本发明说明书中考虑到的状态)的药物。本发明的药物预期应被理解为包括包含适合的本发明TGF-β3的片段或其衍生物，或编码所述片段或衍生物的核酸的药物。

“本发明的治疗方法”(或“本发明的方法”)被认为包括任何治疗方法，所述治疗方法利用了治疗有效量的本发明的TGF-β3，或编码所述TGF-β3的核酸。本发明治疗方法还预期应被理解为包括利用了适合的本发明的TGF-β3的片段或其衍生物，或编码所述片段或衍生物的核酸的治疗方法。

包括本发明TGF-β3或其生物活性片段或衍生物的药物可用于治疗伤口(包含慢性伤口如溃疡)。它们尤其可用于通过预防、减少或抑制瘢痕形成来促进加速伤口愈合，和/或促进伤口处上皮再形成。本发明TGF-β3可用于实现纤维化疾病的预防或治疗，所述纤维化疾病例如肺纤维化、肝硬化和纤维化、硬皮病、肾小球肾炎、皮肤纤维化、放射性纤维化、肾脏纤维化、增殖性玻璃体视网膜病变或子宫纤维化。

本发明TGF-β3可用于治疗独立选自下述的状态：硬皮病、血管生成病症、再狭窄、粘连、子宫内膜异位、缺血性疾病、骨和软骨的诱导、体外受精、口腔粘膜炎、肾病、肺纤维化、肝硬化和纤维化、肾小球肾炎、皮肤纤维化、放射性纤维化、肾脏纤维化和子宫纤维化。作为例子，野生型、二聚体TGF-β3在动物模型和临床中的局部应用已经显示能够加速慢性、非愈合的压迫性溃疡的愈合速度；降低口腔粘膜炎的发病率、严重度和持续时间；降低放射性胃肠道综合征的不良副作用，所述综合征是由癌症治疗中的放疗和化疗导致的干细胞损伤而形成的。本发明的发明人相信本发明的TGF-β3或其片段或衍生物可有益的用于全部的这些适应症。

本发明TGF-β3或其片段或衍生物显示的生物活性可优选TGF-β3的抗瘢痕形成活性，所述抗瘢痕形成活性可优选体内研究的。

本发明的治疗有效量的TGF-β3或其片段或衍生物是足以引起下述需要的量：

i)加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成；或

ii)促进上皮再生；或

iii)预防和/或治疗纤维化疾病。

加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成的程度或者可能需要的上皮再生对于例如负责照料患者的临床医生是显然的，或实际可容易地由其决定。加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成或促进上皮再生的程度的适合的评定可由临床医生决定，可参考这里描述测量的建议方法。

适合的本发明的TGF-β3以及这种TGF-β3的优选片段或衍生物，可参考本文描述的任何或全部考虑进行选择。

参考治疗的伤口显示的特性，本发明TGF-β3加速伤口愈合的能力易于理解和/或测量。出于当前目的，“治疗的伤口”可认为是暴露于治疗有效量的本发明药物的伤口或已依据本发明方法接受治疗的伤口。

治疗的伤口愈合的加速可由与对照伤口相比上皮形成增加的速率表示。这样，本发明的方法和药物与其他方式相比，促进伤口面积上方的功能性上皮层更快地重建。

可选择地或另外，治疗的伤口愈合的加速可由与对照伤口相比对应时间点上减小的宽度表示。应理解的是，这种伤口宽度的减小确保了伤口闭合的相对较快的速率(由于待闭合的伤口宽度更小)，预示这些药物加速愈合反应的能力。较窄的伤口可导致美学上优于较宽瘢痕的较窄瘢痕。

因此，本发明上下文中的加速的伤口愈合应被采用来包括，与对照治疗或未治疗伤口中发生的愈合速率相比，任何治疗的伤口愈合速率的提高。优选地，伤口愈合的加速可从治疗和对照伤口中得到的上皮再形成速率比较方面，或治疗和对照伤口在对应时间点上相对宽度的比较方面进行评定。更优选地，加速的伤口愈合可定义为包含与对照伤口相比上皮再形成提高的速率和伤口宽度在对应时间点的减小。

优选地，促进伤口愈合加速可产生的伤口愈合速率比对照或未治疗伤口中发生的愈合速率高至少5％、10％、20％或30％。更优选地，促进伤口愈合加速可产生的愈合速率比对照伤口的愈合高至少40％、50％或60％。甚至更加优选地，促进伤口愈合加速可产生的愈合速率比对照伤口中发生的高至少70％、80％或90％，最优选地，促进伤口愈合加速可产生的愈合速率比对照伤口中发生的速率高至少100％。

存在范围广泛的伤口愈合疾病，其特征为或至少部分特征为正常伤口愈合反应的不当的失效、延迟或障碍。因此，本发明某些方法和药物促进加速伤口愈合的能力在预防或治疗这些疾病中是有用的。

由于本发明的某些方法和药物能通过促进上皮再形成反应的激活(因此提高了伤口闭合的速率)而引起伤口愈合的加速，因此可理解地，本发明的这些方法和药物尤其有利于有上皮再形成缺陷、延迟或其他方式损伤倾向的患者伤口的治疗。例如，众所周知老年人的皮肤伤口表现出比年轻个体的皮肤伤口更弱的上皮再形成反应。也有很多其它的状态或疾病，在这些状态或疾病中，伤口愈合与延迟或其他方式损伤的上皮再形成相关。例如，患糖尿病的患者、复方用药的患者(例如由于老龄)、绝经期后的妇女、易于压迫受伤的患者(例如截瘫患者)、静脉疾病患者、临床肥胖患者、接受化疗的患者、接受放疗的患者、接受类固醇治疗的患者或免疫功能低下的患者可能都会经受损伤上皮再形成的伤口愈合。在很多这样的情况下，缺乏适当的上皮再形成反应促成了伤口部位感染的发生，这可能又促成慢性伤口例如溃疡的形成。因此，可理解的是，这些患者尤其可能从本发明适合的方法或药物中受益。

慢性伤口可能是与延迟伤口愈合反应相关的疾病的最重要的实例。如果受到适当(常规)治疗处理时，伤口在形成八周内没有表现出任何愈合倾向，就被定义为慢性。慢性伤口众所周知的实例包括静脉性溃疡、糖尿病性溃疡和褥疮，但是慢性伤口可在任意时间由另外的正常急性损伤引发。通常，慢性伤口可由伤口部位的感染、不当的伤口治疗引发，或作为静脉、动脉或代谢血管疾病、压迫、放射损伤或肿瘤造成的进展性组织衰竭的结果。

可理解的是，能加速伤口愈合的本发明的方法和药物可应用于现有慢性伤口的治疗，旨在促进它们的愈合。这些方法和药物可促进慢性伤口的上皮再形成，从而使得疾病治愈和终止。本发明优选的方法和药物(例如那些利用包含序列ID号3、5、7、9或11的TGF-β3的方法和药物)还可抑制与伤口愈合相关的瘢痕形成。由于慢性伤口可典型地在患者身体相对大的部分延伸，这些情况中瘢痕形成的预防尤其有利。

可选择地或除了在现有慢性伤口治疗中的应用之外，本发明适合的方法和药物可用于预防患者的急性伤口，所述患者具有受损的伤口愈合发展成慢性伤口的倾向。由于本发明适合的方法和药物能促进上皮对损伤部位的覆盖，因此它们能减小治疗的伤口发生感染的可能性。同样地，对上皮再形成的这种促进可能有利于由其它状态例如糖尿病或静脉疾病引发的慢性伤口的治疗。

可以从本发明方法和药物中得到特别益处的另一组患者是那些免疫系统低下的患者(例如经受化疗或放疗或患有HIV感染的患者)。广为承认的是免疫低下患者可能不能在伤口产生后发生正常的炎症反应，其伤口倾向于与较差的愈合结果相关。这些患者可从本发明适合的方法和药物治疗中受益。

本发明的TGF-β3(诸如包含序列ID号3、5、7、9或11的那些)促进加速的伤口愈合，同时预防、减少或抑制瘢痕形成的能力在更多普遍的临床背景中也有用处。这些更多益处的实例可参考下面描述的初级、二级或三级愈合的伤口愈合进行判断。

出于本发明的目的，初级愈合治疗可认为涉及利用外科手段对伤口对立边缘的闭合(例如缝合、粘合带或钉)。初级愈合治疗典型地用于手术切口或其它清洁伤口的治疗，且与最低水平的组织缺失相关。技术人员认识到由于本发明的TGF-β3(例如包含序列ID号3、5、7、9或11的那些)能减小伤口宽度，因此它们也有利于伤口对立边缘的接合，这样可能有益于为初级愈合的伤口愈合。而且，这些方法或药物(正如下面进一步描述的)导致预防、减少或抑制这种愈合可能另外发生的瘢痕形成。本发明人认为这种方式的治疗可对治疗的伤口形成瘢痕的肉眼和显微镜下的外观产生影响；肉眼下瘢痕可能更不引人注意并与周围的皮肤融合，显微镜下瘢痕可表现出更多正常的皮肤结构的再生。

出于本发明的目的，二级愈合治疗可认为包括伤口愈合过程中，非直接手术干预的伤口闭合。有待二级愈合治疗的伤口可经过持续地护理(例如伤口的包扎和再包扎以及施用适合的药物)，但是它是肉芽组织形成和上皮再形成的、产生伤口闭合的天然过程。可理解的是由于本发明的TGF-β3(例如包含序列ID号3、5、7、9或11的那些)与对照伤口中所发生的相比，能提高上皮再形成的速率，因此它们在促进二级愈合的伤口愈合中有用处。

三级愈合治疗可认为包含先前开着的伤口的手术闭合，允许至少部分肉芽组织形成和上皮再形成。使之适合初级或二级愈合治疗应用的本发明优选方法和药物的特性也有益于促进三级愈合治疗伤口方面。

本发明TGF-β3(例如序列ID号3、5、7、9或11)促进上皮再形成(作为它们促进伤口愈合加速的一部分)同时抑制瘢痕形成的应用也在与移植过程相关的伤口治疗中尤其有效。用本发明这些方法和药物的治疗有益于移植供体部位(在此部位其能辅助功能性上皮层的重建同时预防、减少或抑制瘢痕形成)和移植受体部位(在此部位治疗的抗瘢痕形成作用抑制了瘢痕形成，同时加速的愈合促进了移植组织的整合)。本发明人认为本发明的方法和药物在用皮肤、人造皮肤或皮肤取代物移植的方面中提供了优势。

本发明人发现利用TGF-β3(包含序列ID号3、5、7、9或11)的本发明的方法和药物，在伤口产生前或者伤口已经形成时施用，能促进加速的伤口愈合且抑制瘢痕形成。

本发明人发现利用TGF-β3(例如包含序列ID号3、5、7、9或11的那些)的本发明的方法或药物能促进上皮再生。在本发明上下文中的促进上皮再生可理解为，包括与对照治疗或未治疗的上皮发生的再生相比，任何上皮再生速率的提高。

可容易地将使用本发明的适合的方法或药物得到的上皮再生速率与对照治疗或未治疗的上皮获得的速率相比，这可用本领域已知的任何适宜的上皮再生模型进行。例如，具有已知面积的实验上皮损伤部位的再生速率可用公知的小鼠、大鼠、兔子或猪体内模型进行比较，例如在Tomlinson&Ferguson(2003)、Davidson等(1991)和Paddock等(2003)中描述的那些。

本发明人不希望被任何假说限制，认为通过本发明的TGF-β3实现的上皮再生的促进由上皮细胞迁移的促进作用介导。上皮细胞(其迁移已被促进)因此能够比未治疗的上皮更快速地重建和再生损伤的上皮。

可理解地，利用本发明的TGF-β3促进上皮再生可用于诱导有效的上皮再形成，其处于上皮再形成反应被损伤、抑制、延迟或具有其他缺陷的情况中。上皮再生的促进也可有效地加快经受上皮损伤患者的具有缺陷的或正常上皮再生反应的速率。

在很多情况中，机体上皮再形成反应可能是具有缺陷的。例如，皮肤上皮再形成的缺陷可能与状态相关，所述病状态如天疱疮、Hailey-Hailey病(家族性良性天疱疮)、中毒性表皮坏死松解症(TEN)/Lyell′s综合症、大疱性表皮松解症、皮肤利什曼病和光化性角化病。肺上皮再形成的缺陷可能与原发性肺纤维化(IPF)或肺间质性疾病相关。眼上皮再形成的缺陷可能与状态相关，所述状态例如部分角膜缘干细胞缺失或角膜糜烂。胃肠道或结肠的上皮再形成的缺陷可能与状态相关，所述状态例如慢性肛裂(肛(门)裂)、溃疡性结肠炎或克罗恩病(Crohn’s disease)和其他炎症性肠病。

正如上文所陈述的，本发明的TGF-β3可用于预防、减少或以其他方式抑制瘢痕形成。瘢痕形成的这种抑制能在任意机体部位和任意组织或器官，包括皮肤、眼睛、神经、肌腱、韧带、肌肉和口腔(包括嘴唇和上腭)，以及内部器官(例如肝脏、心脏、大脑、腹腔、骨盆腔、胸腔、肠和生殖组织)实现。皮肤中，治疗可改善瘢痕肉眼下和显微镜下的外观；肉眼下瘢痕可能更不明显并且与周围的皮肤融合，显微镜下瘢痕里的胶原纤维可具有与周围皮肤的形态和组织更相似的形态和组织。本发明上下文中的预防、减少或抑制瘢痕形成应被理解为与对照治疗或未治疗伤口(如说明书其他地方定义)产生的瘢痕形成的水平相比，包括任何程度的预防、减少或抑制瘢痕形成。除了上下文另外需要参考的地方，瘢痕形成的“预防”、“减少”或“抑制”可被作为抗瘢痕活性中全部被证实的等效机制。

使用本发明的方法和药物实现的皮肤瘢痕形成的预防、减少或抑制，可根据治疗的瘢痕的显微镜下或优选肉眼下的外观与未治疗瘢痕的外观比较来进行评定和/或测量。更优选地，瘢痕形成的预防、减少或抑制可根据治疗的瘢痕的显微镜下和肉眼下的外观进行评定。出于本发明的目的，“治疗的瘢痕”可被定义为在治疗的伤口愈合时形成的瘢痕，而“未治疗的瘢痕”可被定义为未治疗的伤口、或用安慰剂治疗或标准护理治疗的伤口愈合时形成的瘢痕。适合的瘢痕比较可优选地根据瘢痕年龄、部位、尺寸和患者，与治疗的瘢痕进行匹配。

在考虑治疗伤口产生的瘢痕肉眼下外观时，瘢痕的程度和由此的任何瘢痕形成预防、减少或抑制的量级可根据以下很多参数中的任一项进行评定。

肉眼下瘢痕评定的适合参数可包括：

i)瘢痕的颜色。正如上文提到的，瘢痕典型地可相对于周围皮肤而色素沉着减少或色素沉着过度。当治疗的瘢痕的色素沉着比未治疗瘢痕的色素沉着更接近无瘢痕皮肤时，表明瘢痕的抑制或减少。同样地，瘢痕可能比周围皮肤更红。在这种情况下，当治疗的瘢痕的红色与未治疗瘢痕比较，更早褪色、褪色更完全或更类似周围皮肤的外观时，表明瘢痕形成的抑制或减少。

ii)瘢痕的高度。瘢痕与周围皮肤比较可典型地升高或降低。当治疗的瘢痕的高度比未治疗瘢痕的高度更接近无瘢痕皮肤(即无升高和降低)时，表明瘢痕形成的抑制或减少。

iii)瘢痕的表面肌理。瘢痕比周围皮肤可能具有相对更光滑的表面(瘢痕产生“有光泽的”外观)或比周围皮肤更粗糙。当治疗的瘢痕的表面肌理比未治疗瘢痕的表面肌理更接近无瘢痕皮肤时，表明瘢痕形成的抑制或减少。

iv)瘢痕的硬度。瘢痕异常的成分和结构意味着它们通常比瘢痕周围未损伤的皮肤更硬。在这种情况下，当治疗的瘢痕的硬度比未治疗瘢痕的硬度更接近无瘢痕皮肤时，表明瘢痕形成的抑制或减少。

优选地，当根据上文所述肉眼下评定的至少一项参数进行评定时，治疗的瘢痕将表明瘢痕形成的预防、抑制或减少。更优选地，根据这些参数中至少两项参数，甚至更加优选地至少三项参数和最优选地全部四项参数，治疗的瘢痕将表明瘢痕形成的预防、抑制或减少。瘢痕形成的全面评定可利用，例如视觉模拟评分(Visual Analogue Scale)或数字评定等级来进行。

显微镜下瘢痕评定的适合参数可包括：

i)胞外基质(ECM)纤维的厚度。瘢痕典型地比周围皮肤包含较细的ECM纤维。这个特性在瘢痕瘤和肥厚性瘢痕的情况下甚至更明显。当治疗的瘢痕的ECM纤维厚度比未治疗瘢痕的ECM纤维厚度更接近无瘢痕皮肤的ECM纤维厚度时，表明瘢痕形成的抑制或减少。

ii)ECM纤维的定向。瘢痕中发现的ECM纤维比无瘢痕皮肤发现的那些(经常具有随机的定向，称为“篮网状”)倾向于表现出互相之间更高程度的排列。病理性瘢痕，例如瘢痕瘤和肥厚性瘢痕的ECM可表现出更加不规则的定向，经常形成ECM分子的大的“涡旋”或“囊”。因此，当治疗的瘢痕的ECM纤维定向比未治疗瘢痕中的ECM纤维定向更接近无瘢痕皮肤中发现的ECM纤维定向时，表明瘢痕形成的抑制或减少。

iii)瘢痕的ECM成分。瘢痕中存在ECM分子的成分表现出与其在正常皮肤中发现的成分的差异，瘢痕的ECM存在的弹性蛋白数量有所减少。因此，当治疗的瘢痕真皮的ECM纤维成分比未治疗瘢痕中发现的成分更接近无瘢痕皮肤中发现的这种纤维成分时，表明瘢痕形成的抑制或减少。

iv)瘢痕的细胞结构。瘢痕倾向于比无瘢痕皮肤包含相对少的细胞。因此可理解当治疗的瘢痕的细胞结构比未治疗瘢痕的细胞结构更接近无瘢痕皮肤的细胞结构时，表明瘢痕形成的抑制或减少。

优选地，当根据上文所述的显微镜下评定的至少一项参数进行评定时，治疗的瘢痕将表明瘢痕形成的预防、抑制或减少。更优选地，根据这些参数中的至少两项参数，甚至更加优选地至少三项参数，最优选地全部四项参数进行评定，治疗的瘢痕将表明瘢痕形成的预防、抑制或减少。

治疗的伤口的瘢痕形成预防、抑制或减少可进一步根据以下使用的适合参数进行评定：

i)瘢痕肉眼下的临床评定，尤其是对个体瘢痕的评定；

ii)瘢痕照片图像的评定；

iii)有机硅模具或由瘢痕的有机硅模具制作的阳性石膏模型进行评定；和

iv)瘢痕的显微镜下评定，例如瘢痕显微结构的组织学分析。

可理解地，治疗伤口的瘢痕形成的预防、抑制或减少可通过改善这些适合参数的一项或多项来显示，在根据大量参数评定预防、抑制或减少的情况下，可根据不同的评定方案将这些参数结合(例如肉眼评定中使用的至少一项参数和显微镜下评定中使用的至少一项参数的减少、抑制或改善)。

可通过一项或多项参数的改善表明瘢痕形成的预防、减少或抑制，这显示根据所选的参数，治疗的瘢痕比未治疗或对照瘢痕更接近无瘢痕皮肤。

瘢痕临床测量和评定的适合参数可基于多种测量或评定进行选择，包括由Beausang等(1998)和van Zuijlen等(2002)描述的那些。

典型地，适合的参数可包括：

1.根据视觉模拟评分(VAS)瘢痕分数的评定。

当与对照瘢痕比较时，由治疗的瘢痕的VAS分数的减少，表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。在瘢痕评定中使用的适合的VAS可基于Beausang等人(1998)所述方法进行。

2.瘢痕的高度、瘢痕的宽度、瘢痕的周长、瘢痕的面积或瘢痕的体积。

瘢痕的高度和宽度可直接从个体测量，例如通过利用手工测量装置例如卡钳。瘢痕的宽度、周长和面积可直接从个体测量或从瘢痕的照片图像分析进行测量。本领域技术人员也知道其他非损伤的方法和装置，所述方法和装置可用于研究适合的参数，包括有机硅制模、超声波、光学三维剖析图和高分辨率核磁共振图像。

通过与未治疗瘢痕比较，治疗的瘢痕的高度、宽度、面积或体积以及其任意组合的减少，表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。

3.与周围无瘢痕皮肤比较瘢痕的外观和/或颜色。

治疗的瘢痕的外观或颜色可与周围无瘢痕皮肤的外观或颜色进行比较，将其差异(如果有)与未治疗瘢痕的外观和颜色和无瘢痕皮肤的外观和颜色之间的差异进行比较。这种比较可在各自的瘢痕和无瘢痕皮肤的视觉评定的基础上进行。瘢痕的外观可根据瘢痕是否比无瘢痕皮肤更亮或更暗，来与无瘢痕皮肤比较。瘢痕和皮肤各自的颜色可完美地互相匹配、轻微错配、明显错配或显著错配。

对于视觉评定可选择地或另外地，有大量非损伤比色装置，其能够提供关于瘢痕和无瘢痕皮肤的色素沉着以及皮肤的红色(可作为瘢痕或皮肤中存在的血管分布程度的指示)的数据。这些装置的实例包括MinoltaChronameter CR-200/300；Labscan 600；Dr.Lange Micro Colour；皮肤分光计(Derma Spectrometer)、激光-多普勒流速计(laser-Doppler flow meter)和皮内分析分光光度法(SIA)。

治疗的瘢痕的外观或颜色和无瘢痕皮肤之间差异的量级比未治疗瘢痕和无瘢痕皮肤之间差异更小时，表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。

4.瘢痕的变形和机械性能

瘢痕的变形可通过瘢痕和无瘢痕皮肤的视觉比较进行评定。适合的比较可将所选的瘢痕分类为无变形、轻微变形、中等变形或严重变形。

瘢痕的机械性能可利用大量基于吸力、压力、扭转力、张力和声学的非损伤的方法和装置进行评定。适合的实例包括能用于评定瘢痕机械性能的已知装置，包括直读压痕硬度计、皮肤弹性仪、Reviscometer、粘弹性皮肤分析仪、Dermaflex、硬度计、皮肤扭力计和弹力计。

当与未治疗瘢痕造成的变形比较时，由治疗的瘢痕造成的变形的减少，表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。还可理解地，由治疗的瘢痕的机械性能比未治疗瘢痕更类似于无瘢痕皮肤的机械性能，可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。

5.瘢痕的轮廓和瘢痕的肌理

瘢痕的轮廓可通过视觉评定的方式进行研究。这种评定中考虑的适合参数包括瘢痕和周围的皮肤是否为齐平、轻微隆起、轻微锯齿状、肥厚性瘢痕或瘢痕瘤。瘢痕的肌理可根据瘢痕的外观进行评定，这也可通过当与无瘢痕皮肤比较时，瘢痕例如是否无光泽或有光泽发亮或具有粗糙或光滑外观的视觉评定来进行。

另外，瘢痕的肌理可根据瘢痕是否具有与无瘢痕皮肤同样的肌理(正常肌理)，与无瘢痕皮肤比较，是否可触摸到、结实或坚硬来进行评定。瘢痕的肌理也可根据汉密尔顿量表(Hamilton scale)(Crowe等描述，1998)进行评定。

除了上文所述的技术外，有大量的使用光学或机械的方法评定瘢痕的轮廓和/或肌理的非损伤剖析图装置。这种评定可在个体的身体上进行，或例如在瘢痕的有机硅模具印模，或由这种印模做出的阳性石膏模型上进行。

如果治疗的瘢痕具有的轮廓和肌理比未治疗瘢痕更与无瘢痕皮肤相当，则表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。

照片评定

独立外行的小组(Independent lay panel)

治疗和未治疗瘢痕的照片评定可由独立外行的评定者小组用标准化和校准的瘢痕照片来进行。瘢痕可由独立外行的小组进行评定以提供分类的评分数据(例如特定治疗的瘢痕与未治疗瘢痕比较是“较好”、“较差”或“无差异”)和使用基于Beausang等(1998)描述方法的视觉模拟评分(VAS)获得定量的数据。这些数据的取得可利用在申请人共同待决的的专利申请中描述的适合软件和/或电子系统。

专家小组

可选择地或另外地，治疗的和未治疗瘢痕的照片评定可由专家评定者小组用待评定的瘢痕的被标准化和校准的照片来进行。优选地，专家小组由适合的本领域技术人员，例如整形外科医生和适合背景的科学家组成。

这种评定可提供分类的数据，如上文所述的或根据所选治疗和未治疗瘢痕的一段时间过程的图像比较。

所进行的适合的评定可包括：

出于本发明的目的，最好的瘢痕的鉴别被认为是最类似于周围皮肤的瘢痕。一旦鉴别出最好的瘢痕，瘢痕间差异的量级可认为是，例如瘢痕之间的轻微或明显的差异。所考虑的进一步的参数包括瘢痕形成后检测到瘢痕间差异的最早时间，形成后瘢痕间差异最明显的时间(或可选择地在最后评定时间点继续发现差异)，以及考虑较好的瘢痕是否一贯地保持更好。

也要考虑一个瘢痕是否会一贯地比另外一个的更红和红色是否会在所认定的时间点后褪色(或在最后时间点后继续)以及如果是这样，则在瘢痕形成后的什么时间出现。专家小组也可考虑在形成后的什么时间红色的任何差异变得可觉察，以及形成后的什么时间红色差异最明显。

专家小组也可考虑治疗或未治疗的一个瘢痕是否一贯地比另一个更白或比无瘢痕皮肤更白。如果白色的差异可觉察，则考虑瘢痕形成后差异可被检测的时间，差异最明显的时间和差异消失的时间。

专家小组可评定的进一步参数是治疗和未治疗瘢痕的肌理。在治疗和未治疗瘢痕的比较中，专家小组可考虑哪个瘢痕具有最好的皮肤肌理，瘢痕形成后所存在的任何差异可被检测的最早时间，形成后任何差异最明显的时间和任何差异消失的时间。

治疗和未治疗瘢痕的比较可进一步评定哪个瘢痕是最窄的和哪个瘢痕是最短的。也可考虑瘢痕的形状和区别于周围皮肤的瘢痕边缘的比例。正如与前文所述，还可考虑视觉评定，和色素沉着过度的存在、程度和位置的颜色评定。

如上所述，治疗和未治疗瘢痕性质比较的一种方法是通过显微镜评定进行。瘢痕性质的显微镜评定可典型地用瘢痕的组织学切片进行。显微镜评定和测量瘢痕的过程可考虑基于以下适合参数的分类数据：

1.表皮重建。特别关注网脊(rete ridge)的恢复程度和恢复表皮的厚度。

2.血管形成和炎症。可考虑存在血管的数量、存在血管的尺寸和炎症的迹象，包括评定存在的任何水平的炎症。

3.胶原组织。在评定胶原组织时，可参考瘢痕中存在的胶原纤维的定向、这些纤维的密度和乳突状及网状真皮中胶原纤维的厚度。

4.乳突状真皮和网状真皮的胶原组织的视觉模拟评分(VAS)评定也可提供有用的瘢痕性质指标。

5.评定瘢痕的显微镜下性质时可考虑其他特征，包括相对于周围无瘢痕皮肤的瘢痕的升高或降低和正常真皮界面的瘢痕的突出或明显度。

6.可以看出，与对照、未治疗或其他适合比较的瘢痕比较，上文描述的评定产生了能提供关于治疗的瘢痕是否更好、更差或无差别的指示的瘢痕评分数据。

除了分类数据外，可将图像分析与适合的可视技术结合使用来产生定量数据(优选与上文参数有关的)。可用于评定瘢痕性质的适合可视技术的实例是特异的组织学染色或免疫标记，其中呈现的染色或标记程度可通过图像分析定量测定。

可有效和容易地产生与下列参数有关的定量数据：

1.瘢痕的宽度、高度、升高、体积和面积。

2.上皮的厚度和范围(例如瘢痕中存在的表皮的面积或具有表皮覆盖伤口的比例)。

3.血管的数量、尺寸、面积(即横截面)和位置。

4.炎症的程度、存在的发炎细胞的数量、位置和种群/类型。

5.胶原的组织、胶原纤维的厚度和胶原纤维的密度。

通过上文考虑的任何一项参数的变化，可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制，以至于治疗的瘢痕比对照或未治疗瘢痕(或其他适合的比较物)更类似于无瘢痕皮肤。

所讨论的评定和参数适合于在动物或人中比较肽与对照、安慰剂或标准护理治疗的效果。为了研究结果的显著性，适当的统计学检验可用于分析产生自不同治疗的数据组。

优选地，根据一项以上参数可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。更优选地，根据临床(即观察个体)参数和照片参数可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。甚至更加优选地，根据临床参数、照片参数和显微镜下评定参数(例如组织学参数)可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。最优选地，根据临床VAS分数、外行小组VAS分数以及网状真皮的评分(来自照片图像)和显微镜下的VAS分数可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。

使用本发明适合方法和药物能使接受如此治疗的损伤区域的美观表征快速改善。美观考虑在大量临床情况中，尤其是当伤口在身体显著的部位例如脸、颈和手上形成时是重要的。因此，在这些期望改善所形成的瘢痕美观表征的部位抑制瘢痕形成(优选地与加速伤口愈合相结合)代表了本发明的优选实施方案。

除了它的美观效果外，皮肤瘢痕形成导致了大量使经受这种瘢痕形成的患者痛苦的不良后果。例如，皮肤瘢痕形成与身体和机械的功能减弱有关，尤其是在收缩性瘢痕(例如肥厚性瘢痕)的情况下和/或跨越关节形成瘢痕的情况时。在这些情况下，对照于无瘢痕皮肤，瘢痕形成皮肤改变的机械性质和瘢痕收缩的效果使受到如此影响的关节(关节连接)运动受到很大限制。因此，优选的实施方案是使用本发明适合的药物和方法来预防、减少或抑制覆盖机体关节的伤口的瘢痕形成(优选地也加速这些伤口的愈合)。另一个优选的实施方案是，使用本发明适合的药物和方法促进伤口的加速愈合，和/或预防、减少或抑制具有增加的形成收缩瘢痕危险的伤口瘢痕形成。

瘢痕形成的程度，由此由瘢痕造成的美观或其他损伤的程度也会受到很多因素，例如伤口形成部位的张力的影响。例如，已知相对高张力下的皮肤(例如遍布胸或与张力线有关的)倾向于比机体其他部位形成更严重的瘢痕。这样在优选的实施方案中，使用本发明适合的药物和方法促进伤口的加速愈合和/或预防、减少或抑制位于高皮肤张力部位的伤口瘢痕形成。很多外科方法可用于瘢痕修复以使伤口和瘢痕重排，以至于减少它们经受的张力。大概这些中最熟知的是“Z字成形术”，其中调换两个V形的皮肤薄片组织以使张力线旋转。这样在更优选的实施方案中，使用本发明这样的药物和方法促进伤口的加速愈合和/或预防、减少或抑制外科修复毁容瘢痕过程中伤口的瘢痕形成。

病理瘢痕形成比相对严重的正常瘢痕形成具有更显著的不良后果。病理瘢痕普遍的实例包括肥厚性瘢痕和瘢痕瘤。可认识到某些类型的伤口或某些个体倾向于形成病理瘢痕。例如加勒比黑人、日本人或蒙古人种，或那些具有病理瘢痕家族史的个体可能被认为具有增加的形成肥厚性瘢痕或瘢痕瘤的风险。儿童的伤口，尤其是儿童烧伤也与增加的肥厚性瘢痕形成有关。因此，本发明优选的实施方案是使用适合的药物和方法来促进伤口的加速愈合和/或预防、减少或抑制具有增加的病理瘢痕形成风险的伤口的瘢痕形成。

尽管已经经历了病理瘢痕形成的个体会经受另外过多的瘢痕形成的倾向，但是通常临床上必须外科修复肥厚性瘢痕或瘢痕瘤，其伴随有随后形成病理瘢痕形成的风险。因而，本发明进一步的优选实施方案是使用适合的药物和方法来促进加速伤口的愈合和/或预防、减少或抑制由外科修复病理瘢痕产生的伤口瘢痕形成。

可认识到，烧伤造成的伤口(出于本发明的目的，也可包括涉及热的液体或气体的烫伤)会在受到如此痛苦的个体上大面积扩展。因此，烧伤可产生覆盖患者机体上大部分的瘢痕形成，从而增加了形成的瘢痕覆盖具有高的美观重要性的区域(例如脸、颈、臂或手)或机械重要性区域(尤其是覆盖或围绕关节的区域)的风险。儿童经常遭受热的液体造成的烧伤(例如打翻的锅、壶或类似的)并且由于儿童相对小的身体尺寸，尤其可能造成覆盖身体大部分的大面积损伤。本发明进一步的优选实施方案是使用适合的药物和方法来促进伤口的加速愈合和/或预防、减少或抑制烧伤产生的伤口瘢痕形成。

如上所述，响应于烧伤的伤口愈合经常与不利的瘢痕形成结果有关，例如形成肥厚性瘢痕。相对大尺寸的烧伤的进一步后果是它们尤其易发生并发症，例如感染和由于缺乏功能性的上皮层造成的脱水。根据上文，可理解的是，本发明适合的药物和方法可用于烧伤的治疗，以减少由伤口产生的瘢痕形成的水平和/或加速功能性的上皮屏障的重建。

本发明人已发现，利用本发明的TGF-β3的本发明的药物和方法能促进上皮再形成。因此这些方法和药物在涉及上皮层损伤的所有损伤的治疗中尤其有效。这些损伤示例有，但不限于上皮受到损伤的皮肤损伤。但是可理解的是，本发明的这样的方法和药物也可用于其他类型的上皮受到损伤的伤口，例如涉及呼吸道上皮、消化道上皮或围绕内部组织或器官的上皮(例如腹膜上皮)的损伤。

涉及腹膜(覆盖内部器官和/或体腔内部的上皮)的伤口愈合经常引发粘连。这种粘连是涉及妇科或肠组织手术的普通结果。本发明人相信，本发明方法和药物(例如包含序列ID号3、5、7、9或11所列TGF-β3的那些)加速腹膜再生而减少瘢痕形成的能力，可减少腹膜各部分互相之间不当连接的发生，因而减少了粘连的发生。因此，使用本发明这样的方法和药物预防肠或妇科粘连形成了代表本发明的优选的实施方案。事实上，在涉及腹膜的任何伤口愈合中使用本发明这些方法和药物是优选的实施方案。

本发明的方法或药物可用于预防，例如在无伤口存在但以其他方式会产生瘢痕的伤口或形成慢性伤口的部位。通过实施例，可将本发明的药物施用到遭受选择性操作(例如手术)造成的伤口的部位，或被认为具有提高的创伤风险的部位。优选地，本发明的药物可在大约创伤时或在伤口形成前(例如创伤前直到6小时期间)立即施用到部位，或药物可在创伤前更早的时间施用(例如伤口形成前直到48小时内)。技术人员理解的是，伤口形成前施用的最优选时间将根据大量因素来决定，所述因素包括所选药物的制剂和施用途径、施用药物的剂量、伤口形成的尺寸和性质以及患者的生物学状况(根据例如患者的年龄、健康和发生愈合并发症或不利瘢痕形成倾向等来确定)。本发明的方法和药物的预防性应用是本发明优选的实施方案，在外科伤口的情况下，特别优选用于促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。

如果在伤口形成后施用本发明的方法和药物，也能促进伤口加速愈合和/或抑制瘢痕形成。优选地，这种施用应在伤口形成后尽可能早地进行，但是本发明的药剂能在直到愈合过程完成前的任何时间(即甚至如果伤口已经部分愈合，本发明的方法和药物也可用于剩下的未愈合部分的加速伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成)促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。可理解地，可使用本发明方法和药物促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的“窗口”，取决于所讨论的伤口的性质(包括发生损伤的程度、损伤区域的尺寸)。因此在大的损伤的情况下，本发明的方法和药物在愈合反应中的施用可相对晚一些，但是仍然能促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。优选地，本发明的方法和药物可例如在伤口形成后的第一个24小时内施用，但如果伤口发生后十天或更长时间内施用，仍然可促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。

为了促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成，本发明的方法和药物根据需要可施用一或多次。例如治疗有效量的药物可根据需要经常给伤口施用，直到完成愈合过程。通过实例，本发明的药物可在伤口形成后至少前三天给伤口一天一次或一天两次施用。

最优选地，本发明的方法和药物可在伤口形成前后都施用。发明人已发现，本发明药物在伤口形成前立即施用，接着在创伤后的时间内每天施用这些药剂，可特别有效的促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。

出于本说明书的目的，“药剂”或“本发明药剂”是指具生物学或治疗活性的本发明的TGF-β3；和/或具生物学或治疗活性的本发明的TGF-β3片段；和/或具生物学或治疗活性的本发明的TGF-β3衍生物。本发明的药剂还可包括编码本发明TGF-β3(或其片段或衍生物)的核酸。可理解地，所有这些药剂可根据本发明掺合到药物里，可用于本发明的方法或应用。

可理解地，本发明药物应用于伤口的量依赖于大量因素，例如药物中存在的药剂的生物活性和生物利用率，在其他因素中还依赖于药剂的性质和药物施用的模式。决定药物的适合治疗量的其他因素可包括：

A)药剂在受治疗个体体内的半衰期。

B)待治疗的特定状态(例如急性或慢性伤口)。

C)个体的年龄。

施用的频率也受到上文提及的因素，尤其是在受治疗个体体内所选药剂的半衰期的影响。

一般地，当将本发明的药物用于治疗现存的伤口时，药物应在伤口一发生(或在伤口未立刻显现的情况下，例如在机体内部部位的那样，伤口一经诊断出就施用)时就施用。用本发明的方法或药物进行治疗应持续到愈合过程已经被加速和/或瘢痕形成已经被预防、减少或抑制，直到临床医生满意为止。

施用频率依赖于使用药剂的生物半衰期。典型地，应将含有本发明药剂的乳膏或软膏施用到靶组织，以使药剂在伤口上的浓度保持在适合产生治疗效果的水平。这需要每天一次或甚至每天几次施用。

本发明的药物可通过能达到期望的促进伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成效果的任何途径施用，但是优选药物在伤口部位局部施用。

本发明人已发现，促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成可通过在伤口部位注射施用本发明的药剂实现。例如，在真皮伤口的情况下，本发明的药剂可通过真皮内注射的方式施用。因此本发明的优选药物包含本发明药剂的可注射溶液(例如在上皮损伤部位或可能损伤部位边缘的周围注射)。本发明实施方案中使用的适合的制剂在下文考虑。

可选择地或另外地，本发明的药物也可通过局部的形式施用以促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。这样施用可作为伤口区域的初期和/或后续护理后的一部分起作用。

发明人发现通过本发明药剂对伤口的局部施用(或在对形成伤口的组织或部位预防性施用的情况下)尤其改善了促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。

含有本发明药剂的组合物或药物可采取很多不同的形式，尤其依赖于它们被使用的方式。因此，例如它们可以为液体、软膏、乳剂、凝胶、水凝胶、粉末或气溶胶的形式。所有这些组合物适合对伤口局部施用，是对需要治疗的个体(人或动物)施用本发明药剂的优选方式。

本发明的药剂可以由无菌敷料或贴片的形式提供，其可用于覆盖伤口或所治疗上皮损伤的其他部位。

可理解地，包含本发明药剂的组合物的赋形剂应被患者很好地耐受，使得药剂对伤口释放。这种赋形剂优选是生物可降解、生物可溶解、生物可吸收和/或非炎性的。

包含本发明药剂的药物和组合物可以很多方式使用。因此，例如为了促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成，组合物可应用于伤口内部和/或周围。如果组合物应用于“现存的”伤口，那么药剂学可接受的赋形剂将是相对“温和的”，即赋形剂是生物可相容的、生物可溶解和非炎性的。

本发明的药剂，或编码这种药剂的核酸(下文进一步考虑)，可掺入缓释或延迟释放的装置。这些装置可例如放在或插入皮下，药剂或核酸可在数天、数周或甚至数月内释放。这种装置对于需要长期促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的患者(例如经受慢性伤口的那些)尤其有用。当用于通常要求频繁施用(例如通过其他途径至少每天施用)的药剂或核酸施用时，该装置尤其有利。

本发明药剂的每日剂量可以单次施用(例如局部制剂的每日应用或每日注射)。可选择地，本发明的药剂一天内可能需要施用两次或多次。进一步可选择地，缓释装置可用于对不需要施用重复剂量的患者提供本发明药剂的最佳剂量。

在一个实施方案中，用于本发明药剂施用的药学赋形剂可为液体，适合的药学组合物将采取溶液的形式。在另一个实施方案中，药学可接受的赋形剂是固体，适合的组合物采取粉末或片剂的形式。在进一步的实施方案中，本发明药剂可配制成为药学可接受的经皮贴片的一部分。

固体赋形剂可包括可作为调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、压缩辅助剂、粘合剂或片剂崩解剂的一种或多种物质；也可是包囊材料。在粉末中，赋形剂是细碎的固体，所述固体与细碎的本发明的药剂混合。在片剂中，本发明药剂以适合比例与具有必要压缩特性的赋形剂混合，以期望的形状和尺寸压制。优选地，粉末和片剂含有达到99％的本发明药剂。适合的固体赋形剂包括，例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。

液体赋形剂可用于制备溶液、悬浮液、乳剂、糖浆剂、酏剂和加压的组合物。本发明的药剂可在药学可接受的液体赋形剂，例如水、有机溶剂、药学可接受的油或脂肪或其混合物中溶解或悬浮。液体赋形剂可含有其他适合的药学添加剂例如增溶剂、乳化剂、缓冲液、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、色素、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。口服和肠胃施用的液体赋形剂的适合实例包括水(部分包含上文的添加剂，例如纤维素衍生物、优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括单羟基醇和多羟基醇，例如乙二醇)和它们的衍生物以及油(例如分馏的椰子油和花生油)。对于肠胃外施用，赋形剂也可为油酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体赋形剂在用于肠胃外使用的无菌液体形式组合物中是有利的。加压组合物的液体赋形剂可为卤代烃或其它药学可接受的推进剂。

液体药学组合物的无菌溶液或悬浮液可以例如以肌内、鞘内、硬膜外、腹腔内、皮内、基质内(角膜)或皮下注射的方式使用。无菌溶液也可静脉施用。本发明药剂可制备成无菌固体组合物，可在施用时用无菌水、盐水或其它适合的无菌可注射介质溶解或悬浮。赋形剂倾向于包括必要和惰性的粘合剂、悬浮剂、润滑剂和防腐剂。

在期望以口服摄取的方式施用本发明药剂的情况下，可理解地，所选的药剂将优选为具有提高程度的抵抗降解的药剂。例如，本发明药剂可被保护(例如用上文所述的技术)，以便降低其在消化道中的降解速率。

本发明药剂的组合物适合用于促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制角膜内的瘢痕形成。角膜伤口可由意外伤害(如上文考虑的)或外科手术(例如角膜的激光手术)造成的眼外伤引起。在这种情况下本发明优选的药物是滴眼剂的形式。

本发明药剂可应用于一系列“内部的”伤口(即伤口发生在机体内，而不是在外表面上)。因此，例如可配制本发明的药物供吸入用于肺或其它呼吸道上皮产生的伤口。

已知的，例如那些药学领域常规使用的方法(例如在体内实验、临床试验等中)，可用于建立包括本发明药剂的组合物的特殊制剂和这些组合物施用的精确治疗方案(例如活性药剂的每日剂量和施用的频率)。

本发明的药剂能促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的适合的每日剂量，依赖于一系列因素包括(但不限于)伤口组织的性质、治疗伤口的面积和/或深度、伤口的严重性和形成病理性瘢痕或慢性伤口的诱病因素的存在或缺乏。

通过例子，可以通过局部注射施用到伤口或上皮损伤部位的活性剂总量优选为每厘米线性伤口或上皮损伤区域约50ng/100μL。这种剂量可一天给予一次延续三天，因而提供的总剂量是150ng/厘米线性伤口或上皮损伤。

在局部应用到急性伤口或上皮损伤部位的情况下，活性剂的适合量可优选为约100ng/cm²。这种剂量可一天给予一次延续三天，因而提供的总剂量是300ng/cm²伤口或上皮损伤。

通过进一步的实例，每日施用给伤口或上皮损伤部位的活性剂的优选量可为约50ng/cm线性伤口或上皮损伤(如果注射施用)或约100ng/cm²伤口或上皮损伤(如果局部施用)。

通过进一步的例子，在单次发病治疗中可施用给伤口或上皮损伤部位的活性剂的量可优选为约50-200ng/cm线性伤口或上皮损伤(如果注射施用)，或约100-300ng/cm²伤口或上皮损伤(如果局部施用)。

治疗伤口或其它上皮损伤部位需要的本发明的药剂量典型地为每24小时每厘米线性伤口或上皮损伤施用1pg到1mg药剂，尽管这个数字可根据上文概括的因素向上或向下修正。药剂可优选地以1pg/100μL-1mg/100μL的药剂溶液的形式提供，24小时期间每厘米线性伤口或上皮损伤施用100μL这种溶液。

更优选地，药剂以10pg/100μL-100μg/100μL的溶液施用，24小时期间每厘米线性伤口或上皮损伤施用100μL这种溶液。

最优选地，药剂以1ng/100μL-1000ng/100μL的溶液施用，24小时期间每厘米线性伤口或上皮损伤施用100μL这种溶液。

一般地，包括本发明药剂的组合物应被配制使得当给伤口施用时药剂浓度达到每厘米线性伤口或上皮损伤0.79pM至0.79mM。优选地，药剂以每厘米7.9pM至0.079mM的浓度提供。

本发明药剂的(例如序列ID号3至8的肽)施用浓度可为0.79pM至0.79mM。优选地，本发明药剂的施用浓度可为7.9pM至0.079mM。最优选地，本发明药剂的施用浓度可为0.79nM至0.79μM。

纯粹通过实例，当皮内注射施用并以100μL每厘米线性伤口边缘给药，含有浓度为10pg/100μL至100μg/100μL的本发明药剂(例如序列ID号3、5、7、9或11的TGF-β3)的可注射溶液适合于用来促进真皮伤口加速愈合和/或抑制瘢痕形成。

在序列ID号3的TGF-β3的情况下，施用给伤口的优选剂量为约1ng/100μL-1000ng/100μL，每cm线性伤口边缘施用约100μL的这种溶液。

在序列ID号5的TGF-β3的情况下，施用给伤口的优选剂量为约1ng/100μL-1000ng/100μL，每cm线性伤口边缘施用约100μL的这种溶液。

在序列ID号7的TGF-β3的情况下，施用给伤口的优选剂量为约1ng/100μL-1000ng/100μL，每cm线性伤口边缘施用约100μL的这种溶液。

在序列ID号9的TGF-β3的情况下，施用给伤口的优选剂量为约1ng/100μL-1000ng/100μL，每cm线性伤口边缘施用约100μL的这种溶液。

在序列ID号11的TGF-β3的情况下，施用给伤口的优选剂量为约1ng/100μL-1000ng/100μL，每cm线性伤口边缘施用约100μL的这种溶液。

本发明的药剂可作为单一疗法(例如通过单独使用本发明的药物)用于促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。可选择地，本发明的药物或方法可用于与其它促进伤口愈合或抑制瘢痕的化合物或治疗结合。可用于作为这些组合疗法的部分的适合治疗为本领域技术人员熟知。

本发明人发现，本发明的TGF-β3可在糖存在时有利地配制。这种糖可为还原或非还原糖和/或其磷酸酯或其磷酸酯衍生物。这些糖的实例可选自，但不限于选自由麦芽糖、甘露糖、海藻糖、阿拉伯醣、甘露醇、蔗糖、果糖、右旋糖和葡萄糖组成的组的那些。优选的糖可选自由麦芽糖和海藻糖组成的组。

可理解地，通过包括编码这些分子的核酸序列的细胞表达技术，包含本发明TGF-β3的肽可代表有利的施用药剂。这些细胞表达的方法尤其适合医疗应用，其中需要长期的肽的治疗效果，例如在期望其长时间增强有缺陷的伤口愈合反应的情况下。尤其优选的是，通过细胞表达施用的TGF-β3包括序列ID号3、5、7、9或11定义的那些肽或其片段或衍生物。编码这些肽的核酸在序列ID号4、6、8、10或12中列出。

给组织例如伤口施用本发明肽药剂的很多已知方法具有如下缺点：由于肽药剂在体内的半衰期短，即使几天的过程也很难达到本发明药剂在治疗部位上的持续水平。药剂的半衰期短出于很多原因，包括：

(i)被蛋白酶和类似物的降解。

(ii)被结合蛋白的清除。

(iii)被胞外基质分子结合和抑制药剂活性。

而且，用于促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的药剂需要在适合的赋形剂内施用，并且经常以包含药剂和赋形剂的组合物的形式提供。正如所讨论的，优选地这些赋形剂是非炎性、生物可相容的、生物可吸收的并且必须不能使药剂降解或失活(贮存或使用中)。然而，经常难以提供令人满意的赋形剂以将药剂递送到具有待治疗伤口的组织。

排除或减轻这些问题的便利方法是，通过基因治疗的方式提供治疗有效量的本发明药剂到待治疗的区域。

本发明第四方面提供了用于基因治疗技术的递送系统，所述递送系统包括编码选自下述组的肽的DNA分子：序列ID号3、序列ID号5、序列ID号7、序列ID号9和序列ID号11，所述DNA分子可被转录导致被选择肽的表达。

本发明第五方面提供了前段定义的递送系统用于生产应用于促进加速伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的药物的用途。

本发明第六方面提供了上述定义的递送系统用于生产应用于促进上皮再生的药物的用途。

本发明第七方面提供了促进加速伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的方法，所述方法包括施用给需要这种治疗的患者治疗有效量的由本发明第九方面定义的递送系统。

本发明第八方面提供了促进上皮再生的方法，所述方法包括施用给需要这种治疗的患者治疗有效量的由本发明第九方面定义的递送系统。

由于遗传密码简并性，显然编码适合本发明应用的药剂的核酸序列是可不同的或可变的，并且基本上不会影响被编码产物的序列，以提供其功能变体。可用于编码由序列ID号3、5、7、9或11定义的肽的可能的核酸的序列对技术人员是明显的，技术人员可参考由分别作为序列ID号4、6、8、10或12而提供的例子。

本发明的递送系统非常适合于在比大多数传统递送系统可能的时段更长的时段内在伤口处获得持久水平的本发明的药剂。适合促进加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成的本发明药剂可从伤口部位的细胞持续表达，所述细胞经过由本发明第四方面公开的DNA分子转化。因此，即使本发明的药剂在体内有非常短的半衰期，治疗有效量的药剂仍可从被治疗组织持续表达。

此外，本发明递送系统可用于提供DNA分子(和由此的本发明的药剂)而不需要使用传统的药物赋形剂，例如在接触伤口的软膏或乳剂中所需要的那些赋形剂。

本发明的递送系统优选使DNA分子能够表达(当递送系统施用患者时)产生由序列ID号3、5、7、9或11组成的组定义的肽或这些肽的片段或衍生物。DNA分子可被包含在适合载体内以形成重组载体。载体可例如是质粒、粘粒或噬菌体。所述重组载体非常适合于用DNA分子转化细胞的本发明的递送系统。

重组载体也可包括其它功能性元件。例如，重组载体可被设计以使载体在细胞核内自主复制。在这种情况下，诱导DNA复制的元件在重组载体内是必需的。可选择地，重组载体可这样设计以将载体和重组DNA分子整合进细胞的基因组。在这种情况下，利于靶向整合的(例如通过同源重组)DNA序列是期望的。重组载体也可含有编码用作克隆过程中可选择标记物的基因的DNA。

重组载体也可进一步根据需要包含控制基因表达的启动子或调节子。

DNA分子可(但不必须)整合进受治疗个体细胞的DNA内。未分化细胞可被稳定地转化，引起遗传改变的子细胞的产生。在这种情况下，需要对受治疗个体的表达进行调控，例如用特异的转录因子、基因激活子或更优选地用可诱导的启动子，其可转录响应于在伤口中发现的特异信号的基因。可选择地，递送系统可设计为利于受治疗个体未分化细胞的不稳定或瞬时转化。在这种情况下，因为当转化细胞死亡或停止表达蛋白时(理想地当实现促进伤口加速愈合并减少瘢痕形成时)DNA分子的表达将终止，所以表达调控的重要性变小。

递送系统可给个体提供没有整合进载体的DNA分子。例如，DNA分子可整合进脂质体或病毒颗粒。可选择地，“裸”DNA分子可通过适合的方式例如直接内吞摄取插入个体的细胞。

DNA分子可通过转染、感染、微注射、细胞融合、原生质体融合或基因枪轰击的方式转移到个体的细胞内。例如，转移可通过用包被的金颗粒、包含DNA分子的脂质体、病毒载体(例如腺病毒)的基因枪转染和通过直接应用质粒DNA到局部伤口或注射来直接提供DNA摄取(例如内吞)的方式进行。

本发明药剂的细胞表达可以是通过伤口周围无损伤区域的边缘的细胞，或可选择地通过治疗性引入伤口的细胞(例如培养的与伤口愈合反应有关的内源或外源细胞)。

可理解地，被治疗性诱导促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的细胞可体外操作，以使它们可表达增加水平的本发明药剂，接着引入伤口区域。优选地，这些细胞是体外培养用于制备或制造在促进伤口愈合中使用的人造皮肤或皮肤取代物的细胞。更优选地，细胞是自体同源的细胞，尽管可理解地任何适合细胞都可用。

因此，本发明第九方面中提供了包含被诱导表达本发明药剂的细胞的药物。

本发明药剂细胞表达的诱导可通过将核酸整合进细胞的方式实现，所述核酸可使本发明适合使用的药剂表达。

现在，本发明将通过实施例进一步描述，参考以下实验方案和研究以及附图，其中：

表1显示指示在α螺旋结构中涉及的氨基酸残基倾向性的值；

表2显示提及本发明突变体TGF-β3时所使用名称的详细内容；

表3显示野生型TGF-β3和本发明TGF-β3再折叠效率；

表4对比了野生型TGF-β3和Gly63-Ala(一种本发明的TGF-β3蛋白)的生物活性，通过细胞生长抑制测定评价；

表5显示体内伤口愈合研究中使用的反应物浓度；

表6显示体内伤口愈合研究中使用的反应物浓度；

图1显示TGF-β3‘野生型’在苯基-琼脂糖凝胶柱的层析图；

图2显示TGF-β3‘野生型’单体和二聚体在UNO-S1柱中的层析图；

图3显示通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE比较TGF-β3突变蛋白和‘野生型’TGF-β3(请注意更换Gly63-Ala和Gly63-Pro突变体蛋白的缓冲液会导致一些样品损失，因此加入凝胶中的实际浓度会比所陈述的3μg少一些)；

图4显示用于切口创伤的模板；

图5显示用野生型TGF-β3或本发明TGF-β3治疗切入性伤口(A和B)第3天的平均肉眼评定分数，其中“*”表明与未治疗伤口相比显著增强的愈合(p<0.05)；

图6是用‘野生型’和突变型TGF-β3蛋白治疗切口创伤(C和D)第3天的显微镜下平均伤口宽度；

图7显示用于切入性创伤的模板；

图8说明了用‘野生型’TGF-β3、Gly63-Ala和Gly63-Pro治疗伤口的肉眼瘢痕评分(第70天)；

图9说明了用‘野生型’TGF-β3、Gly63-Ala和Gly63-Pro治疗伤口的肉眼瘢痕图像(第70天)；

图10说明了用‘野生型’TGF-β3、Glu12-Ser和双丝氨酸突变体(Glu12-Ser和Arg52-Ser)治疗伤口的肉眼瘢痕评分(第70天)，其中“+”表明与安慰剂治疗伤口相比显著降低的瘢痕形成(p<0.05)。

图11说明了用‘野生型’TGF-β3、Glu12-Ser和双丝氨酸突变体(Glu12-Ser和Arg52-Ser)治疗伤口的肉眼瘢痕图像(第70天)；

图12说明了用‘野生型’TGF-β3、Gly63-Pro和Gly63-Ala突变蛋白治疗伤口的代表性显微镜瘢痕图像(创伤后70天)；以及

图13说明了用Glu12-Ser和双丝氨酸突变体(Glu12-Ser和Arg52-Ser)在创伤后70天治疗伤口的代表性显微镜瘢痕图像。

特别感兴趣的序列的详细内容在“序列信息”部分提供。

实验方案和结果

1.本发明第一和第二方面的TGF-β3的产生、生产、再折叠和纯化。

1.1 cDNA的产生

源于人切入性伤口的总RNA(创伤后第5天取样)用DNA-Free(Ambion)处理以除去任何污染性DNA。用总RNA作为模板，TGF-β3的cDNA通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)产生。RT-PCR的反应混合物是由

QRT-PCR Core Reagent Kit，一步法(Stratagene)制备的。将1微克RNA加入到50μL的溶液，所述溶液含有：一步QRT-PCR缓冲液、0.2mMdNTP、3.5mM MgCl₂、1μL StrataScript逆转录酶、2.5单位Taq聚合酶、0.4μM有义引物(5′GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACTGC3′)和0.4μM有义引物(5′-CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCTACA TTT ACA AGA C 3′)。反应在热循环器(Hybaid PCR Expresses)中发生，并且按照下列条件进行：45℃30分钟，95℃10分钟，然后是40个循环的95℃ 30秒、65℃ 1分钟和72℃ 1分钟。最后的步骤是72℃ 10分钟。PCR样品用2％(w/w)琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，并用Wizard PCR PrepKit(Promega)纯化。

1.2 质粒的构建

pET-3d载体来自pBR322载体，并且包含LacUV5控制的T7启动子和氨苄西林抗性标志物基因。TGF-β3的cDNA片段(3.2部分中产生的)被亚克隆进pET-3d的Nco I和Bam HI位点(分别是5′-3′)。产生的连接接着被转化进XL10Gold细胞(Stratagene)并进行菌落PCR分析来定位包含插入物的克隆。使最后的克隆生长并用Qiaprep

Spin小量制备试剂盒(Qiagen)将质粒DNA提取进水中。质粒用T7启动子引物(5′-TAA TAC GAC TCACTA TAG GG-3′)和T7终止子引物(5′-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3′)测序和验证。

1.3 定向诱变

从1.2部分获得的‘野生型’TGF-β3构建体经过定向诱变产生两种编码TGF-β3突变蛋白的突变构建体。构建体/突变体的名称和核酸序列变化总结于表2。经过诱变的核苷酸位置在序列信息部分显示。

体外定向诱变方法是基于Stratagene′s Quick

定向诱变试剂盒。100ng质粒(来自1.2部分)加入到溶液中，所述溶液含有：2.5μL 10 xQuick

多反应缓冲液、Quick溶液、100ng的诱变引物、1mL dNTP混合液、Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)，用双蒸馏水补充到2.5mL终体积。反应在热循环器(Hybaid PCR Expresses)中发生，并且在下列条件下进行：95℃ 1分钟，30个循环的95℃ 1分钟、55℃ 1分钟，最后一步是65℃ 2分钟。一旦热循环结束，将反应物在冰上放置2分钟以使温度降到37℃以下。1μL DpnI限制性酶(10U/μL)加入到每个反应中彻底混匀。对反应混合物进行离心(用Sorvall Biofuge，10,000rpm/min)，然后在37℃温育消化双亲的双链DNA。每个诱变反应中1-5μL DpnI处理的DNA加入45μL活化的XLI-Blue大肠杆菌(Stratagene)和2μL β-ME混合液(Stratagene)。将所述混悬液混合并且在冰上温育30分钟。所述混悬液用42℃水浴加热30秒。所述混合物在冰上再温育2分钟。0.5mL预加热(42℃)的NZY+肉汤加入到每一个细胞悬液中。转化肉汤在225-250rpm条件下振动孵育1小时。每个诱变反应的转化肉汤中取出1μL、10μL和100μL涂布到LB琼脂平板上，并在37℃温育18小时，所述LB琼脂平板含有100μg/mL的氨苄西林(Sigma)、80μg/mL的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal，Stratagene)和20mM的异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，Sigma)。蓝色菌落含有突变的质粒。从琼脂挑出每种突变型的单菌落，然后接种到10mL含有100μg/mL氨苄西林的LB培养基上。用

Spin小量制备试剂盒(Qiagen)分离质粒。使用pQE for和pQE Rev引物测序质粒并验证正确的突变。

1.4 转化和克隆

10μL(50ng/μl)质粒DNA(来自1.2和1.3部分)加入到1mL冷的(4℃)感受态的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS Singles^TM细胞(Novagen)。20分钟后将所述细胞在42℃水浴温育30秒热激。100μL的Psi培养基加入到细胞/质粒混合液中并在37℃振荡90分钟。50μL和100μL等分试样涂布到含有100μg/mL的氨苄西林(Sigma)LB琼脂平板上并在37℃温育18小时。单菌落被培养，并产生细胞冻存物，在-80℃条件保存。分析细胞冻存物的质粒DNA从，以验证正确的转化。

1.5 表达

复苏冻存的转化的大肠杆菌细胞(来自1.4部分)的安瓿，接种到含有100mL LB培养基和100μg/mL氨苄西林的封口的Erlenmeyer烧瓶里。烧瓶振荡温育，37℃过夜。将5mL这种过夜的培养物加入到2升的Erlenmeyer烧瓶(500mL LB培养基/和100μg/mL氨苄西林)并在37℃振荡温育。每小时取2mL肉汤样品，追踪其生长和TGF-β3“野生型”和突变型蛋白的表达(诱导后)。生长由分光光度计测量在波长600nm的吸收来确定。当测得的吸收是0.6Abs时，通过加入异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，Sigma)至终浓度1mM来诱导细胞表达“野生型”和突变型TGF-β3蛋白。培养物再多温育4小时。0.5mL肉汤样品离心沉淀(Sorvall Biofuge10,000rpm离心10min)，弃去上清液。沉淀在50μL十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)样品缓冲液中重悬浮，并在95℃水浴中加热10分钟。将10μL样品加到SDS-PAGE上。SDS-PAGE和考马斯蓝染色(如A.T Andrews(1986)描述的)用

Mighty Small SE 245 Dual Gel Caster(Amersham)进行。凝胶厚度是1mm，含有15％(v/v)聚丙烯酰胺凝胶。

1.6 细胞收集和包涵体的分离

来自1.5部分的细胞通过在带有4315转头的Hettich Rotina 46R离心机中，以5000g离心10分钟而沉淀。于4℃进行细胞破碎和不溶性(包涵体)TGF-β3蛋白的回收。细胞在pH 8.3的50mL 100mM Tris/HCl(Sigma)和10mM EDTA(Sigma)中悬浮，用Sanjo Soniprep 150超声破碎。加入0.2％(w/w)Triton X-100(Sigma)，将悬浮液搅拌1小时。悬浮液15,000g离心40分钟。沉淀在以12,000g离心40分钟之前，于pH 8.3的50mL 100mMTris/HCl和10mM EDTA中重悬浮。

1.7 包涵体的溶解

来自1.6部分的沉淀在40mL 8M尿素1％(w/w)DL-二硫苏糖醇(DTT)中重悬浮，并在Heidolph Diax 900匀浆机中破碎。悬浮液加盖并搅拌1小时以溶解包涵体，将TGF-β3“野生型”和突变型蛋白还原成它们的单体形式。接着悬浮液以15,000g离心30分钟。将上清液透析以使缓冲液从8M尿素(ICN Biomedical)换成10％(v/v)醋酸。当缓冲液交换到10％(v/v)醋酸时，溶于8M尿素的E.coli蛋白从溶液沉淀出来。将1％(w/w)DTT(Sigma)加入悬浮液中，加盖并搅拌30分钟以便还原缓冲液交换过程中TGF-β3单体间形成的任何二硫键。以12,000g离心悬浮液40分钟以便分离可溶和不溶的蛋白。尿素溶解和缓冲液交换步骤取出的样品(醋酸可溶和不溶物质)，接着用SDS-PAGE分析。

1.8 超滤

来自1.7部分的10％(v/v)醋酸可溶物质用10kDa膜在Vivoflow50(Vivascience)中进行超滤。这样做的目的是减少10％(v/v)醋酸悬浮液的体积到3mL，以及除去低分子量的蛋白(<10kDa)。

1.9 凝胶过滤

来自1.7部分的样品用Hiprep 26/60 Sephacryl S-100高分辨柱(Amersham，320mL)在10％(v/v)醋酸1.5mL/min流速下层析分离。包含单体的变性的TGF-β3部分(在100至140分钟之间洗脱)被收集。

1.10 冷冻干燥

包含变性单体TGF-β3的收集部分用IEC Lyoprep-3000冷冻干燥器冷冻干燥，以从样品中除去醋酸和水。

1.11 再折叠

来自1.10部分的冻干的单体TGF-β3在含有10mM DTT的8M尿素中溶解，直到达到10mg/mL的TGF-β3终浓度。在搅拌的同时，将TGF-β3溶液逐滴加入再折叠溶液(1M 3-(-吡啶并)-1-丙烷磺酸盐(NDSB-201)、20％(v/v)二甲基亚砜(DMSO，Sigma)、2％(w/v)3-(3-胆酰胺丙基)二甲铵基-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、1M NaCl(Sigma)、1％(w/v)还原型谷胱甘肽(GSH，Sigma)和0.05M

Base(Sigma)pH 9.3)直到0.2mg/mL的TGF-β3终浓度。重要的是用浓NaOH/HCl将pH保持在9.2-9.4的范围内。溶液用石蜡封口膜(Parafilm)封口，石蜡封口膜上打孔以允许单体TGF-β3氧化，并在8℃搅拌。144小时后将溶液15,000g离心40分钟，去除形成的沉淀，pH用冰醋酸调整为pH 3.5。上清液含有二硫化物连接的二聚体TGF-β3，其通过SDS-PAGE(非还原的)和Western印迹进行测定。SDS-PAGE如2.1部分中所描述的进行。

至于Western印迹，样品被加载到1mm厚、15％(v/v)的聚丙烯酰胺凝胶中。一旦电泳结束，使用TE22Western印迹装置(Pharmacia)将凝胶内的蛋白电泳转移到硝化纤维膜(Sigma)上，按其指导手册说明的。硝化纤维膜上非特异结合位点被封闭缓冲液(5％(w/v)脱脂奶粉，1％(v/v)聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween20，Sigma)，于磷酸盐缓冲盐水(Invitrogen)中)封闭。然后所述硝酸纤维素膜用洗涤缓冲液(PBS，0.1％ Tween 20)洗涤。然后将所述硝化纤维膜用一抗(MAB643(R&D体系))温育1小时，所述一抗是用含0.1％(v/v)Tween 20的PBS以1:500稀释。所述硝化纤维膜经再次洗涤，然后与山羊抗鼠抗体(Abcam)的二抗温育1小时，所述二抗是用含0.1％(v/v)Tween 20的PBS以1:3000稀释。将所述硝化纤维膜最后洗涤一遍，然后加入ECL试剂(Amersham)使抗原-抗体复合物显影。在暗室中所述硝化纤维膜在浸于显影剂、固定剂和终止液前用X射线胶片曝光。然后使所述硝化纤维膜干燥。再折叠的TGF-β3‘野生型’和突变型单体蛋白显示了不同水平的二聚体形成。从其他非正确再折叠或非二聚体TGF-β3蛋白回收正确折叠的二聚体的百分比在表3中显示。

有趣的是，TGF-β3蛋白的α螺旋内的氨基酸置换对再折叠产率(二聚体形成)产生最大影响。用精氨酸置换甘氨酸稳固α螺旋会使再折叠产率从20％增加到50％。相反，用脯氨酸置换甘氨酸α螺旋破坏，会导致低得多的二聚体形成百分比。这说明α螺旋在形成正确再折叠TGF-β3分子中起重要作用。置换参与‘盐桥’形成的氨基酸，不影响再折叠产率。

1.12 疏水相互作用色谱

1.11 部分的复性溶液用在Vivoflow50(Vivascience)上10kDa(分子量截留)膜超滤浓缩到50mL。所述复性溶液用含有2M硫酸胺(Sigma)和10％(v/v)醋酸的溶液1:1稀释。填充有苯基-琼脂糖凝胶快流速(Amersham)的2ml Biorad柱用缓冲液A(1.0M硫酸胺和10％(v/v)醋酸)平衡。20mL稀释的复性溶液以1mL/min的流速(整个过程都使用这个流速)加到所述柱中。然后用缓冲液A洗柱直到280nm的吸光度读数达到基线水平(10mL)。然后加入100％缓冲液B(10％(v/v)醋酸30％(v/v)异丙醇)到柱中。收集第一个峰，所述峰含有TGF-β3蛋白的单体和二聚体形式(见图1)。

1.13 阳离子交换色谱

阳离子交换色谱用来把二聚体TGF-β3蛋白从单体中分离出来。2mLUNO-S1柱(Biorad)用缓冲液A(含有10％(v/v)醋酸，30％(v/v)异丙醇)平衡。从3.12部分收集的部分以1mL/min的流速加到UNO-S1柱上。然后用缓冲液A洗柱直到280nm的吸光度读数达到基线水平(5分钟)。线性梯度运行5分钟，以60％缓冲液A和40％缓冲液B(10％(v/v)醋酸、30％(v/v)异丙醇和1M NaCl)的混合液结束。所述缓冲液混合液的加入要再维持15分钟。单体TGF-β3在样品注入10分钟后从柱中洗脱出来。再使用第二个线性梯度运行5分钟，用100％缓冲液B维持10分钟结束。二聚体TGF-β3在样品注入后30分钟从柱中洗脱出来(见图2)。

1.14 超滤/渗滤

1.13 部分中含有纯化的单体和二聚体TGF-β3分子的部分经过超滤/渗滤来把缓冲液更换为20mM醋酸、20％(v/v)异丙醇，然后浓缩样品到约10mg/mL(TGF-β3浓度由紫外分光光度计测定)。带有10kDa截留的Vivoflow50(Vivascience)用来更换缓冲液和浓缩样品。

2.本发明TGF-β3的体外特性

2.1 SDS-PAGE分析纯化的本发明TGF-β3

纯化的TGF-β3突变蛋白(来自1.14部分)用SDS-PAGE评价确定纯度和分子量。由于来自3.14部分TGF-β3突变样品的低pH，缓冲液用蛋白质脱盐洗脱柱(Pierce)更换成SDS-PAGE样品缓冲液。3μg纯化的TGF-β3突变蛋白(还原的或非还原的样品)、3μg‘野生型’TGF-β3阳性对照(还原的和非还原的)和10μL Invitrogen Mark 12分子量标准品加到聚丙烯酰胺凝胶中(10％-20％(v/v)梯度的丙烯酰胺)。一旦电泳结束，凝胶就用考马斯蓝染色。

如所预料的‘野生型’TGF-β3和Gly63-Ala突变蛋白跑到了凝胶的相同位置(对于还原的样品为约13kDa，对于非还原样品为约25kDa)。有趣的是没有Gly63-Pro突变蛋白条带在非还原胶中检测出来但是在还原胶中检测出来。由于Gly63-Pro再折叠效率非常低(<1％)，可能会产生低于考马斯的检测水平(>1μg)的多种再折叠种类。然而当这些种类被还原后，还原的Gly63-Pro单体浓度就高于1μg的考马斯染色检测限，因此Gly63-Pro能在还原胶中看到。还原的Gly63-Pro蛋白条带位置比‘野生型’TGF-β3条带位置稍高。这正是所预期的，因为63位置上甘氨酸用脯氨酸的置换使得Gly63-Pro突变蛋白的分子比‘野生型’TGF-β3大(见图3)。

2.2 对比本发明的TGF-β3和野生型TGF-β3的生物活性的细胞生长抑制测定

细胞生长抑制测定(A Meager，1991)是一种TGF-β分子体外生物活性测验。比色测定是基于TGF-β分子对水貂肺上皮细胞(Mink Lung Epithelialcells)(MLEC)的生长抑制作用。将包含下述物质的100μL的细胞混悬液加入到96孔组织培养板中的每一孔：1 x 10⁴MLEC细胞/mL和完全培养基(DMEM(Invitrogen)，0.01M Hepes缓冲液(Invitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、L-精氨酸(Invitrogen)、L-天冬酰胺(Invitrogen)，100单位/mL青霉素(Invitrogen)，50μg/mL链霉素(Invitrogen)和5％胎牛血清(Invitrogen))。经过37℃、5％ CO₂过夜温育后，100μL系列稀释(10pg/mL到500pg/mL)的二聚体TGF-β3突变样品(来自3.14部分)加入到所述板中。对照孔加入200μL完全培养基和10％(v/v)0.25M麦芽糖。所述板再温育120小时，50μL的2mg/mL3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑鎓：噻唑兰(MTT，Sigma)加入到每孔中。所述板再温育4小时然后除去培养基。100μL的0.05M HCl(BDH)、无水异丙醇(BDH)加入到每孔中，然后对得到的溶解的甲月替(formazan)用全自动定量绘图酶标仪(Victor² 1420)在570nm定量测定。

Gly63-Ala、本发明的TGF-β3在浓度范围0-500pg/mL时对MLEC细胞有抑制效果。从表4可以看出，Gly63-Ala突变蛋白的IC₅₀为34pg/mL，对比于‘野生型’TGF-β3的IC₅₀为26pg/mL。

2.3 氨基酸序列分析

来自3.14部分50微升纯化的‘野生型’和突变型TGF-β3样品被真空干燥然后用20μL含有50mM NH₄HCO₃和10％(v/v)乙腈的溶液重悬。20μg测序级胰蛋白酶(Promega)用10μL试剂盒提供的重悬缓冲液(Promega)重悬，使胰蛋白酶浓度是2μg/μL。然后将所得物用50mM NH₄HCO₃和10％(v/v)乙腈稀释到胰蛋白酶终浓度是0.2μg/μL。通过加入与野生型’和突变型TGF-β3蛋白比率是1:20(w/w)的胰蛋白酶来消化过夜。通过加入蚁酸(Fluka)到终浓度0.1％(v/v)来结束消化。然后将样品稀释到1pmole/μL。肽通过nano-flow RPLC-MS方法分析(临界系统，Dionex联机到Q-ToF2，微量)。层析是在75μm C18柱(LC填料)利用45分钟梯度从5％(v/v)乙腈到55％(v/v)乙腈进行的。MS分析采用的是数据依赖型分析的形式，其中仪器测量了从LC中洗脱的肽离子的m/z并且选择适合的离子用于MS-MS分析，其中采用碰撞引发的分解以使肽离子片段化，以提供序列信息。

3 本发明TGF-β3的体内特性

在成年雄鼠中考察了再折叠活性‘野生型’和突变型TGF-β3蛋白对切入性伤口和切口创伤愈合(创伤后3天)和瘢痕形成(创伤后70天)的生物效应。

3.1 野生型TGF-β3和本发明TGF-β3的伤口愈合效果对比

雄鼠(Sprague Dawley)用氟烷麻醉并且削去背毛。伤口位置使用标准模板和皮肤标记墨水如图4所示进行标记。样品用含有0.25M麦芽糖(Sigma)、0.002％(v/v)醋酸和0.33％(v/v)异丙醇的无菌赋形剂缓冲液稀释到表4说明的浓度。所有样品都无菌过滤并且不含内毒素。4只鼠用于每一个治疗组。来自每个治疗组的(表4)100μL样品皮内注射到标记伤口的位置A和B(不接受治疗的(未实验的)鼠除外)。伤口位置A和B进行钻取活组织检查。所有动物都单独笼养。24小时后所述动物接受二次剂量的样品。3天后伤口被拍照并使用肉眼视觉模拟评分系统(Visual Analogue Scoringsystem)(修改自Beausang，E等1998)分析。数据的统计分析用Mann WhitneyU/Student T检验进行。p<0.05的值被认为是显著的。

3.2 使用肉眼视觉模拟评分法评估用野生型TGF-β3或本发明TGF-β3治疗的第3天切入性伤口的伤口愈合

切入性伤口在3天后使用肉眼视觉模拟评分法(VAS)检查。在这个10分制中，0分代表良好愈合的伤口，10分代表很差愈合的伤口。数据显示：

与未治疗的相比(未实验的对照)，用50ng/100μL或100ng/100μL的野生型TGF-β3治疗会降低VAS分数(即，改善了伤口的肉眼外观)。与未治疗的相比(未实验的对照)，用100ng/100μL的剂量治疗明显改善了(p<0.05)伤口的外观，即加速愈合。

与未治疗的相比(未实验的对照)，用50ng/100μL或100ng/100μL的Gly63-Ala突变型治疗会降低VAS分数，并且比得上用野生型TGF-β3治疗的伤口，即没有削弱愈合。

与未治疗的相比(未实验的对照)，用50ng/100μL或100ng/100μL的Gly63-Pro突变型治疗会降低VAS分数，并且与用野生型TGF-β3治疗的伤口相当，即，没有削弱愈合。

3.3 用野生型和突变型TGF-β3蛋白治疗的切口创伤第3天的伤口宽度显微镜评估

切口创伤宽度在3天后显微镜评估。所有用TGF-β3的野生型和突变型蛋白治疗的伤口都显示了与安慰剂和未治疗(未实验)对照相当的伤口宽度，证明TGF-β3突变蛋白在愈合方面没有不良作用(图6)。

3.4‘野生型’和突变型TGF-β3蛋白在伤口瘢痕形成方面的效果(创伤第70天)

雄鼠(Sprague Dawley)用氟烷麻醉并且削去背毛。伤口位置用标准模板和皮肤标记墨水如图7所示的进行标记。样品用含有0.25M麦芽糖(Sigma)、0.002％(v/v)醋酸和0.33％(v/v)异丙醇的无菌载体缓冲液稀释到表5说明的浓度。所有样品都无菌的、无内毒素的和无热原的。4只鼠用于每一个治疗组。来自每个治疗组的(表6)100μL样品皮内注射到标记伤口的位置A和B(不接受治疗的(未实验的)鼠除外)。在伤口位置A和B用11号手术刀片做出总深度1cm长的切口。所有动物都单独笼养。24小时后所述动物接受二次剂量的样品。70天后瘢痕形成被拍照并使用肉眼视觉模拟评分系统(修改自Beausang，E等1998)分析。伤口处被切除并在处理成蜡块前放置在10％缓冲盐水中。所述蜡块被切成5μm连续切片并放置在载玻片上。所述载玻片用Masson三色法(Massons Trichrome)染色和分析。数据的统计分析用Mann Whitney U/Student T检验进行。p<0.05的值被认为是显著的。

3.5 使用肉眼VAS对第70天切入性伤口的评估

切入性伤口在70天后使用肉眼VAS系统进行检查。10分说明很坏的瘢痕，0分是正常皮肤(图8)。第70天伤口的VAS分析显示：

‘野生型’TGF-β3(以50ng/100μL和100ng/100μL剂量)与用安慰剂治疗的和未治疗的伤口相比，减少了瘢痕形成。与用安慰剂治疗的伤口相比这两种剂量瘢痕形成的减少是统计学上显著的(p<0.05)。

Gly63-Ala突变型(以50ng/100μL和100ng/100μL剂量)与用安慰剂治疗的和未治疗的伤口相比，减少了瘢痕形成。与用安慰剂治疗的伤口相比用50ng/100μL剂量的瘢痕形成的减少是统计学上显著的(p<0.05)。

Gly63-Pro突变型(以50ng/100μL和100ng/100μL剂量)与用安慰剂治疗的和未治疗的伤口相比，减少了瘢痕形成。

Glu12-Ser突变型(以50ng/100μL和100ng/100μL剂量)与用安慰剂治疗的和未治疗的伤口相比，减少了瘢痕形成。与用安慰剂治疗的伤口相比用50ng/100μL剂量的瘢痕形成的减少是统计学上显著的(p<0.05)。

双丝氨酸突变型(Glu12-Ser和Arg52-Ser)以50ng/100μL和100ng/100μL剂量，与用安慰剂治疗的和未治疗的伤口相比减少了瘢痕形成。

3.6 第70天切入性伤口的显微镜评估

使用VAS评分系统记录的肉眼效果用组织学分析来确认。组织切片代表性的例子在图12和13中显示。所述的组织显微照片显示本发明TGF-β3蛋白的加入引发了与“野生型”TGF-β3中所见到的相似的改善。本发明的蛋白诱导瘢痕中的胶原纤维具有与周围正常皮肤相似的形态和组织。

4.结论

α螺旋(在氨基酸残基58-67之间)的灵活性影响再折叠过程中有功能的、正确再折叠的二聚体TGF-β3的形成。通过用丙氨酸置换63位的甘氨酸来稳固α螺旋极大改善再折叠效率，而用脯氨酸置换63位的甘氨酸来去稳定α螺旋则有相反的效果。

与‘野生型’TGF-β3相比，用丙氨酸或脯氨酸置换63位的甘氨酸没有改变伤口愈合。

与用安慰剂治疗的和未治疗的伤口相比，Gly63-Ala和Gly63-Pro减少了瘢痕形成。

‘盐桥’的形成(在Arg52和Glu12之间)没有改变TGF-β3再折叠效率。

与用安慰剂治疗的和未治疗的伤口相比，Glu12-Ser型和双丝氨酸突变型减少了瘢痕形成。

5.生产本发明单体或二聚体TGF-β3的优选实验方案

产生本发明正确再折叠的单体TGF-β3的优选条件如下：

0.7M 2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、2mM还原型谷胱甘肽、0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3，pH 9.5、2-8℃。

30mM牛磺脱氧胆酸盐、0.7M CHES、2mM GSH、0.4mM GSSG、0.12mg/mL TGF-β3，pH 9.5、2-8℃。

1M NDSB-201、2mM还原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3，pH 9.5、2-8℃。

0.7M CHES、2mM还原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3，pH 9.5、2-8℃。

30mM牛磺脱氧胆酸盐加上1M NDSB-221、2mM还原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3，pH 9.5、2-8℃。

30mM牛磺脱氧胆酸盐加上0.7M CHES、2mM还原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3，pH 9.5、2-8℃。

30mM牛磺脱氧胆酸盐、0.7M CHES、2mM GSH、2mM GSSG、0.12mg/mL TGF-β3，pH 9.5、2-8℃。

总体来讲本发明的TGF-β3可通过一种方法折叠成二聚体生物活性形式，所述方法包括：

将溶解的、未折叠的单体TGF-β3加入到一种溶液中，所述溶液包含：

(i)2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)或其功能类似物；以及

(ii)低分子量的巯基/二硫化物氧化还原系统；以及

在所述溶液中孵育生长因子直到二聚体生物活性TGF-β3形成。

产生本发明正确再折叠二聚体TGF-β3的优选条件如下：

优选的实验条件

5.1 载体克隆和宿主细胞转化

pET-24d载体来自pBR322载体，和包含一个LacUV5控制的T7启动子和一个抗卡那霉素标记基因。

编码本发明TGF-β3的DNA可用0.75μL Nco1(New England Biolabs)和0.75μL BamH1(New England Biolabs)与1×BamH1缓冲液(New EnglandBiolabs)在15μL反应液(Nuclease Free Water，Novagen)中37℃消化4小时。1微升pET-24d质粒(Novagen)用同样的方法消化。消化的cDNA和大的质粒片段经琼脂糖凝胶纯化，并用SpinPrep Gel DNA提取试剂盒(Novagen)回收。

纯化的cDNA和质粒片段用T4连接酶试剂盒(Novagen)连接。连接的cDNA/质粒转化进HMS 174(DE3)(Novagen HMS 174(DE3)转化试剂盒)。转化体通过在含有50μg/mL卡那霉素(Invitrogen)的Luria肉汤(LB)琼脂平板上涂布来选择。选择适合的克隆进行限制性消化和/或表达。

5.2 用于产物表达的克隆筛选

将克隆在1/2浓度的“Terrific Broth”(6g/L植物蛋白胨(BectonDickinson)、12g/L酵母提取物(Becton Dickinson)、2g/L的甘油(JT Baker)、1.16g/L磷酸二氢钾(JT Baker)、6.25g/L磷酸氢二钾(JT Baker)，蒸馏水适量至1升)的摇瓶培养基中培养且在指数生长期OD₆₀₀为0.65-0.85时用1mM的异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。在加入IPTG 3小时后取诱导后的样品并用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析产物的诱导和表达。来自适合克隆的样品在

Novex 12％ Bis-TrisGel，1.0mm(Invitrogen)中，于120毫安和200伏下跑胶约40-50分钟，然后用考马斯蓝染色。由此，本发明的TGF-β3的表达在这些培养物中被诱导出来。

5.3 细胞冻存物

将克隆在1/2浓度的Terrific Broth的摇瓶中生长到OD₆₀₀约为1且通过加入甘油到20％(v/v)而以甘油储存液的形式保存。1.2ml的肉汤等分至12×2ml的冷冻管(其含0.3mL的甘油)，然后在-70℃储存。

5.4 TGF-β3基因序列确认

用于细胞冻存物的培养物样品在加入甘油前获得并被用于使用Qiagen MiniPrep Kit进行质粒分离。对分离的质粒进行测序，并用T7启动子引物(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’)和T7终止子引物(5’-GCTAGT TAT TGC TCA GCG G-3’)验证。

5.5 种子培养物

将选择的合适克隆接种到2升封口的(baffled)Erlenmeyer烧瓶，该烧瓶含有500mL HySoy培养基(12g/L蛋白胨(Quest International)、24g/L酵母提取液(Becton Dickinson)、10g/L NaCl(Sigma)和10g/L甘油(Sigma)及50μg/mL卡那霉素。烧瓶37℃、200rpm振荡温育，周期性取样测OD₅₅₀。当培养物的OD达到3.21U/mL(7小时后)时，细胞肉汤用于接种150L发酵罐(100L工作体积)。

5.6 发酵

900毫升的细胞肉汤(来自3.6部分)用于接种150L发酵罐(WHE)，所述发酵罐含90L分批培养基(0.6g/L K₂HPO₄、0.4g/L KH₂HPO₄、1.25g/LNH₄SO₄、12g/L蛋白胨、24g/L酵母提取物和10g/L甘油)。发酵的运行参数控制如下：温度设定值37℃；pH设定值7.0(用4N的氢氧化铵和4N的磷酸维持)且溶解氧(DO)最初校准到100％。容器排出压力为7psi，搅拌速度和空气流速分别为200-400rpm和每分钟每体积培养基1体积的空气(vvm或slpm)。以下列优先顺序通过调节发酵设定的参数将DO保持于20％以上：搅拌速度(最大400rpm)、通风量(最大1.5vvm)、吸氧量(最大33.3Ipm)和背压(最大12psi)。用Pluronic L-61(25％v/v)控制起泡沫。当培养物的OD到10U/mL时，以45mL/分钟的起始流速补充甘油(50％v/v)。当OD值到40U/mL，加入IPTG至终浓度为0.2mM进行细胞诱导。

5.7 收集

诱导后4小时，将发酵罐冷却到10℃且气流和搅拌速率分别降到0.3vvm和100rpm。结束对泡沫和pH的控制且背压调整到3psi。通过用Westfalia CSA8连续离心机在10℃连续离心收集培养物。离心机运行速度为15,000rpm，流速为每分钟3升并收集细胞浆液。

5.8 细胞裂解和IB回收

发酵细胞体(来自5.7部分)用裂解缓冲液(6.1g/L TrizmaBase(Tris)、3.7g/L乙二胺四乙酸(EDTA)、58.44g/L NaCl和10g/L Triton X-100，pH 8.0)以1:5比例稀释，并用手提式匀浆器重悬。重悬的细胞体经高压匀浆器两次(参数：压力10,000psig；流速450mL/分；温度15℃)。然后将匀浆的细胞裂解液在5,000xg于4℃离心(桶式离心机，固定角转头)20分钟。去掉上清液，留下不溶(包涵体)的TGF-β3。包涵体(IB)沉淀用手提式匀浆器在洗涤缓冲液(6.1g/L Tris和3.72g/L EDTA，pH 8.0)中重悬后离心(4℃，5,000xg20分钟)。

5.9 包涵体溶解

来自5.8部分的沉淀用溶解缓冲液(6.1g/L Tris，15.4g/L DL-二硫苏糖醇(DTT)和360.4g/L尿素，pH 8.0)以1:10比例稀释并用手提式匀浆器重悬。悬浮液加盖并于室温搅拌60-75分钟以溶解包涵体并将TGF-β3还原为单体形式。在第二次温育60-75分钟时间之前，用NaOH/醋酸将重悬沉淀的pH调至pH 9.4-9.6。

5.10 净化/超滤和渗滤

来自5.9部分的溶解的材料在切向流过滤(TFF)系统(Millipore)中被净化、浓缩和渗滤。初期的净化和浓缩用预处理的净化TFF膜(MilliporePellicon 1000kDa，再生纤维素，筛网V)完成。净化的TGF-β3在透过液中收集。换到超滤/渗滤(UF/DF)膜(Millipore Pellicon 5kDa，再生纤维素，筛网C)，接着TGF-β3在6置换体积(diavolume)溶解缓冲液(6.1g/L Tris、15.4g/L DTT和360.4g/L尿素，pH 9.5)中清洗。

5.11 超滤/疏水相互作用色谱

选择的再折叠溶液用超滤(膜为平板微孔Pellicon 5kDa，0.1m²，再生纤维素，筛网)浓缩5倍。在稀释缓冲液(2.72g/L醋酸钠、264.28g/L硫酸铵、100g/L醋酸和210.7g/L盐酸精氨酸，pH 3.3)里1:1稀释之前，浓缩的再折叠物质的pH用冰醋酸调节到pH 2.5-2.8。丁基琼脂糖凝胶4快流速柱(Amersham，床高16cm)用四柱体积的缓冲液A(2.72g/L醋酸钠、132.14g/L硫酸铵和100g/L醋酸，pH 3.3)平衡。在以100cm/hr的流速(整个过程都用这个流速)加样到丁基琼脂糖凝胶柱之前，再折叠物质经0.22μM膜(微孔Millipak过滤器)过滤。然后柱子用四柱体积的缓冲液A清洗。TGF-β3蛋白用缓冲液B(2.72g/L醋酸钠、100g/L醋酸和300g/L乙醇，pH 3.3)洗脱离柱。在分离单体和二聚体蛋白之前，包含TGF-β3蛋白单体和二聚体形式的第一个峰被收集。

序列信息

TGF-β3(序列ID号1)

ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADT

THSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS

突变型TGF-β3＂Gly63-Ala＂(序列ID号3)

ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADT

THSTVLALYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS

突变型TGF-β3＂Gly63-Pro＂(序列ID号5)

ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADT

THSTVLPLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS

突变型TGF-β3＂Glu12-Ser＂(序列ID号7)

ALDTNYCFRNLSENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADT

THSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS

突变型TGF-β3＂Arg52-Ser＂(序列ID号9)

ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLSSADT

THSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS

突变型TGF-β3＂Glu12-Ser/Arg52-Ser＂(序列ID号11)

ALDTNYCFRNLSENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLSSADT

THSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS

序列ID号2-编码野生型人类TGF-β3的DNA

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT GTG CGC

CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCT

AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA

GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA

TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC

TAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT

TGT AAA TGT AGC

序列ID号4-编码Gly63-Ala突变型的DNA

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT GTG CGC

CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCT

AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA

GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GCA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA

TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC

TAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT

TGT AAA TGT AGC

序列ID号6-编码Gly63-Pro突变型的DNA

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT GTG CGC

CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCT

AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA

GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG CCA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA

TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC

TAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT

TGT AAA TGT AGC

序列ID号8-编码Glu12-Ser突变型的DNA

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG TCG GAG AAC TGC TGT GTG CGC

CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCT

AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA

GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA

TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC

TAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT

TGT AAA TGT AGC

序列ID号10-编码Arg52-Ser突变型的DNA

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT GTG CGC

CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCT

AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC AGC AGT GCA

GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA

TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC

TAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT

TGT AAA TGT AGC

序列ID号12-编码Glu12-Ser/Arg52-Ser突变型的DNA

GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG TCG GAG AAC TGC TGT GTG CGC

CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCT

AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC AGC AGT GCA

GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA

TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC

TAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT

TGT AAA TGT AGC

表1 基于蛋白和肽的实验研究的α螺旋倾向性等级

表2

突变型名称	氨基酸置换	对结构的影响
突变型名称	氨基酸置换	对结构的影响	Gly63-Ala	63位甘氨酸被丙氨酸替换	稳固α螺旋
Gly63-Pro	63位甘氨酸被脯氨酸替换	去稳定α螺旋	Gly63-Ala	63位甘氨酸被丙氨酸替换	稳固α螺旋
Gly63-Pro	63位甘氨酸被脯氨酸替换	去稳定α螺旋	Glu12-Ser	12位谷氨酸被丝氨酸替换	阻止盐桥形成
Arg52-Ser	52位精氨酸被丝氨酸替换	阻止盐桥形成	Glu12-Ser	12位谷氨酸被丝氨酸替换	阻止盐桥形成
Arg52-Ser	52位精氨酸被丝氨酸替换	阻止盐桥形成	Glu12-Ser和Arg52-Ser	双置换，其中12位谷氨酸被丝氨酸替换和52位精氨酸被丝氨酸替换	阻止盐桥形成

表3 野生型TGF-β3和本发明TGF-β3再折叠效率

突变型TGF-β3	正确折叠二聚体的百分比
突变型TGF-β3	正确折叠二聚体的百分比	Gly63-Ala	50
“野生型”TGF-β3	20	Gly63-Ala	50
“野生型”TGF-β3	20	Gly63-Pro	1
Glu12-Ser	20	Gly63-Pro	1
Glu12-Ser	20	Glu12-Ser和Arg52-Ser	20

表4 用细胞生长抑制测定评估野生型TGF-β3和Gly63-Ala(一种本发明的TGF-β3蛋白)的生物活性

蛋白	IC₅₀
蛋白	IC₅₀	“野生型”TGF-β3	26pg/mL
Gly63-Ala	34pg/mL	“野生型”TGF-β3	26pg/mL

表5 伤口部位治疗

组	治疗/样品	浓度(ng/100μL)
组	治疗/样品	浓度(ng/100μL)	A	“野生型”TGF-β3	50
B	“野生型”TGF-β3	100	A	“野生型”TGF-β3	50
B	“野生型”TGF-β3	100	C	Gly63-Ala	50
D	Gly63-Ala	100	C	Gly63-Ala	50
D	Gly63-Ala	100	E	Gly63-Pro	50
F	Gly63-Pro	100	E	Gly63-Pro	50
F	Gly63-Pro	100	G	0.25M麦芽糖(安慰剂对照)	N/A
H	未治疗(未实验的对照)	N/A	G	0.25M麦芽糖(安慰剂对照)	N/A

表6 伤口部位治疗

组	治疗/样品	浓度(ng/100/μL)
组	治疗/样品	浓度(ng/100/μL)	A	“野生型”TGF-β3	50
B	“野生型”TGF-β3	100	A	“野生型”TGF-β3	50
B	“野生型”TGF-β3	100	C	Gly63-Ala	50
D	Gly63-Ala	100	C	Gly63-Ala	50
D	Gly63-Ala	100	E	Gly63-Pro	50
F	Gly63-Pro	100	E	Gly63-Pro	50
F	Gly63-Pro	100	G	Glu12-Ser	50
H	Glu12-Ser	100	G	Glu12-Ser	50
H	Glu12-Ser	100	I	Glu12-Ser和Arg52-Ser	50
J	Glu12-Ser和Arg52-Ser	100	I	Glu12-Ser和Arg52-Ser	50
J	Glu12-Ser和Arg52-Ser	100	K	0.25M麦芽糖(安慰剂)	N/A
L	未实验的	N/A	K	0.25M麦芽糖(安慰剂)	N/A

Claims

1.TGF-β3或其片段或衍生物，其中在全长的野生型TGF-β3的氨基酸残基58和67之间的α螺旋形成结构域包括至少一个稳固α螺旋的置换。

2.根据权利要求1所述的TGF-β3或其片段或衍生物，其中在全长的野生型TGF-β3的63位置上的甘氨酸残基被稳固α螺旋的氨基酸残基替换。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的TGF-β3或其片段或衍生物，其中所述稳固α螺旋的置换包括引入选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸的残基。

4.根据权利要求3所述的TGF-β3或其片段或衍生物，其中在全长的野生型TGF-β3的63位置上的甘氨酸残基被丙氨酸替换。

5.根据权利要求4所述的TGF-β3，其包括序列ID号3或其片段或衍生物。

6.根据任一项前述权利要求所述的TGF-β3或其片段或衍生物，其不包括在全长的野生型TGF-β3的61位置上缬氨酸残基的置换。

7.TGF-β3或其片段或衍生物，其中在全长的野生型TGF-β3的63位置上的甘氨酸残基被脯氨酸替换。

8.根据权利要求7所述的TGF-β3，其包括序列ID号5或其片段或衍生物。

9.TGF-β3或其片段或衍生物，其包括在全长的野生型TGF-β3的12位置上谷氨酸残基的置换和/或在全长的野生型TGF-β3的52位置上精氨酸残基的置换。

10.根据权利要求9所述的TGF-β3或其片段或衍生物，其中所述的一个或多个置换是使用选自下述的氨基酸残基：丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸。

11.根据权利要求9或权利要求10所述的TGF-β3或其片段或衍生物，其中在全长的野生型TGF-β3的12位置上的谷氨酸残基被丝氨酸置换。

12.根据权利要求9至11任一项所述的TGF-β3或其片段或衍生物，其中在全长的野生型TGF-β3的52位置上的精氨酸残基被丝氨酸置换。

13.TGF-β3或其片段或衍生物，所述TGF-β3选自：序列ID号7、序列ID号9和序列ID号11。

14.根据权利要求1至13任一项所述的单体TGF-β3或其片段或衍生物。

15.根据权利要求1至13任一项所述的二聚体TGF-β3或其片段或衍生物。

16.根据任一项前述权利要求所述的TGF-β3或TGF-β3的片段或TGF-β3的衍生物作为药物的用途。

17.根据权利要求1至15任一项所述的TGF-β3或其片段或衍生物在制备用于加速伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的药物中的用途。

18.根据权利要求1至15任一项所述的TGF-β3或其片段或衍生物在制备用于促进上皮再生的药物中的用途。

19.根据权利要求17或权利要求18所述的用途，其中所述药物用于皮肤。

20.根据权利要求17或权利要求18所述的用途，其中所述药物用于眼。

21.根据权利要求1至15任一项所述的TGF-β3或其片段或衍生物在制备用于预防和/或治疗纤维化疾病的药物中的用途。

22.根据权利要求22所述的用途，其中所述纤维化疾病选自：肺纤维化、肝纤维化、硬皮病、皮肤纤维化、肌肉纤维化、放射性纤维化、肾脏纤维化、增殖性玻璃体视网膜病变和子宫纤维化。

23.根据权利要求1至15任一项所述的TGF-β3或其片段或衍生物在制备用于治疗血管生成病症、再狭窄、粘连、子宫内膜异位、缺血性疾病、口腔粘膜炎和肾病的药物中的用途。

24.根据权利要求1至15任一项所述的TGF-β3或其片段或衍生物在制备用于诱导骨和软骨或体外受精的药物中的用途。

25.编码权利要求1至15任一项所述的TGF-β3或其片段或衍生物的核酸。

26.加速伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的方法，所述方法包括向有相应需要的患者提供治疗有效量的权利要求1至13任一项所述的TGF-β3或其片段或衍生物。

27.预防和/或治疗纤维化疾病的方法，所述方法包括向需要这种预防和/或治疗的患者提供治疗有效量的权利要求1至13任一项所述的TGF-β3或其片段或衍生物。

28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中所述的TGF-β3或其片段或衍生物被提供至患者的皮肤。

29.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中所述的TGF-β3或其片段或衍生物被提供至患者的眼。