TW201444872A

TW201444872A - 抗Ｃ－ＭＥＴ串聯Ｆｃ雙特異性抗體

Info

Publication number: TW201444872A
Application number: TW103107787A
Authority: TW
Inventors: Brian Harms; Neeraj Kohli; Alexey Lugovskoy; Melissa Geddie; Eric Mark Krauland; William George Roach; Stephen Su; Adnan Abu-Yousif
Original assignee: Merrimack Pharmaceuticals Inc; Adimab Llc
Priority date: 2013-03-06
Filing date: 2014-03-06
Publication date: 2014-12-01
Also published as: US9458245B2; EA201591652A1; CA2902505A1; SG11201506451UA; WO2014138449A1; HK1220465A1; EP2964676A1; BR112015021462A2; US20170081421A1; IL240594A0; KR20150143458A; CN105705519A; US20140302035A1; JP2016510755A; MX2015011712A; AU2014225661A1

Abstract

本文提供串聯Fc及串聯Fc抗體(「TFcA」)，例如串聯Fc雙特異性抗體(「TFcBA」)，其包含一個或至少兩個特異性結合於一或多種細胞表面受體之結合位點。該等結合位點經由TFc連接，該TFc包含第一Fc區及第二Fc區，其中該第一Fc區與該第二Fc區經由TFc連接子連接形成連續多肽，且二聚化形成Fc二聚體。例示性TFcBA結合於細胞表面受體c-Met及EpCam且抑制經由對該TFcBA之結合位點具特異性之細胞表面受體進行之信號轉導。

Description

抗C-MET串聯Fc雙特異性抗體

相關申請案之交叉參考

本申請案主張2013年3月6日申請之美國序列號61/773,764及2013年3月6日申請之美國序列號61/773,788之權益，前述申請案全部以引用之方式整體併入本文中。

已經確定，腫瘤細胞表現刺激細胞增殖之生長因子及細胞因子的受體，且另外，針對該等受體(例如酪胺酸激酶受體)之抗體可有效阻斷由生長因子及細胞因子介導之細胞增殖刺激作用，從而抑制腫瘤細胞生長。市售的靶向癌細胞上之受體的治療性抗體包括例如用於治療乳癌之曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin®)，其靶向HER2受體(又稱ErbB2)；及用於治療結腸直腸癌及頭頸癌之西妥昔單抗(cetuximab)(Erbitux®)，其靶向表皮生長因子受體(EGFR，又稱HER1或FrbB1)。

儘管已顯示，該投與僅包含單一治療性單株抗體之治療劑的方法(當在不投與另一治療性抗體情況下投藥時)在癌症治療方面相當成功，但有許多因素會導致該治療之失敗或初始抑制之後腫瘤生長之復發。舉例而言，某些腫瘤依賴於超過一個生長因子介導之細胞轉導路徑供細胞增殖且因此，靶向單一路徑可能證實不足以顯著影響腫瘤細胞生長。或者，即使在一條路徑為唯一或佔優勢之生長刺激路徑的情況下，某些腫瘤細胞亦能夠在最初路徑由抗體阻斷(對治療之先天抗性)時活化另一條信號傳導路徑來刺激生長。另外，一些腫瘤最初對抗體單藥療法展現反應性，但隨後藉由轉換成使用另一信號傳導路徑而發展對治療之抗性(對治療之後天抗性)。此外，一些受體，諸如c-Met受體，受習知抗體(例如IgG抗體)刺激而將信號轉導至表現其之細胞中。不希望受任何特定操作理論之束縛，咸信此現象係由同一細胞上由抗體(諸如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)上存在之配對的、一般一致之抗原結合位點引起之兩個受體交聯配對所致。此刺激作用可能對產生治療益處者具有相反作用，即，例如細胞生長及複製可能藉由該抗c-Met抗體而上調，而非抑制。

因此，需要克服了抗體單藥療法之侷限且提供其他益處的用於癌症治療之其他治療方法。

本文提供工程改造之抗體，諸如串聯Fc抗體(「TFcA」)。例示性TFcA為串聯Fc雙特異性抗體(TFcBA)，諸如2011年8月26日申請之美國臨時申請案第61/527,802號及2012年8月27日申請之同在申請的PCT國際申請案第PCT/US2012/052490號中所描述者。TFcBA包含串聯Fc，其為包含第一Fc區及第二Fc區之多肽部分，該第一Fc區及第二Fc區各自具有C末端及N末端；該第一Fc區及該第二Fc區經由具有C末端及N末端之TFc連接子連接為單一多肽鏈之形式(亦即，該第一Fc區之C末端藉由肽鍵連接至TFc連接子之N末端，該TFc連接子之C末端又藉由肽鍵連接至該第二Fc區之N末端)。TFcBA可包含至少兩個結合位點(至少一個第一結合位點及一個第二結合位點)。該結合位點各自特異性結合至細胞表面受體之特定部分。例示性細胞表面受體為由癌細胞表現或過表現之受體。例示性結合位點包括抗體來源之結合位點，其免疫特異性結合至細胞表面受體之細胞外結構域。TFcA或 TFcBA之第一或第二結合位點可特異性結合至人類受體蛋白，該人類受體蛋白選自由以下組成之群：ErbB2、ErbB3(例如，US 7,846,440中所述之結合位點)、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、c-Met、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α及β)、c-Kit、EPCAM及EphA2。一般而言，該受體將為受體酪胺酸激酶。通常，該結合將對受體蛋白之細胞外部分具有特異性。在本文所揭示之某些實施例中，TFcBA所包含之至少兩個結合位點中的一個為c-Met特異性結合位點，例如抗c-Met Fab或抗cMet scFv。在某些例示性實施例中，提供一種TFcBA，其包含單一抗c-Met結合位點及至少一個不結合c-Met之第二結合位點，例如ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α及β)、c-Kit、EPCAM及EphA2特異性結合位點，其中該抗c-Met結合位點及該第二結合位點經由TFc連接以形成連續多肽。提供的TFcBA結合至單一受體上之兩個抗原決定基(例如細胞外抗原決定基)或兩個不同細胞表面受體且在該結合後，其強烈抑制通常由至少一個結合於TFcBA之細胞表面受體之同源配位體所刺激的信號轉導。舉例而言，抗c-Met+抗EGFR TFcBA可抑制由HGF(肝細胞生長因子，C-met之同源配位體)及EGF(表皮生長因子，EGFR之同源配位體)中任一者或兩者所誘導的信號轉導，或抗c-Kit+抗RON TFcBA可抑制由巨噬細胞刺激蛋白(RON之同源配位體)及幹細胞因子(c-Kit之同源配位體)中之任一者或兩者所誘導的信號轉導，或抗c-Met+抗EPCAM TFcBA可抑制由HGF誘導之信號轉導且可抑制在不存在HGF情況下由c-Met受體進行之信號傳導(例如，非配位體依賴性之c-Met信號傳導)；如由配位體誘導(或在不存在HGF情況下進行之c-Met信號傳導的情形中，非配位體依賴性)之受體磷酸化(其為受TFcBA抑制之信號轉導)的抑制所指示，該抑制作用各自具有10nM或低於10nM，或者1nM或低於1nM，或者100pM或低於100pM的IC₅₀ 值，或具有至少70%或至少80%或至少90%之最大抑制百分比。在許多實施例中，本文提供的包含抗c-Met之TFcBA對表現c-Met之細胞基本上不產生刺激作用。在其他實施例中，本文提供的包含抗c-Met之TFcBA誘導表現c-Met之細胞上之c-Met受體下調或降解。在其他實施例中，本文提供之抗EPCAM TFcBA在表現低EPCAM含量(低至每個細胞100,000個+/- 5% EPCAM分子)或極低EPCAM含量(低至每個細胞24,000個+/- 5% EPCAM分子)之細胞中產生大部分(例如60%、70%、80%、90%或超過95%)其信號傳導抑制作用。在某些實施例中，細胞中TFcBA之表現產生(i)相對於結合至相同受體但不包含TFc之多價抗體之表現，更多(亦即，較大百分含量)的準確形成之TFcAB分子，或(ii)如例如藉由尺寸排阻層析法(SEC)所測定的超過80%之準確形成的TFcAB分子。

本文亦提供Ab，其為TFcBA，其中該等TFcBA包含第一結合位點及第二結合位點，其中該第一結合位點結合至第一靶且該第二結合位點結合至第二靶，且其中(i)該第一及第二結合位點經由TFc連接；(ii)該TFc包含第一Fc區及第二Fc區，該第一Fc區及該第二Fc區各自具有C末端及N末端；(iii)該第一Fc區及該第二Fc區經由具有C末端及N末端之TFc連接子連接形成連續多肽；(iv)該第一與該第二Fc區締合(結合)形成Fc二聚體；且(v)該第一及該第二Fc區中任一者或兩者包含一或多個使該第一與該第二Fc區之間的結合增強或穩定的胺基酸(aa)修飾。TFcBA可抑制經由該第一及該第二靶中之任一者或兩者進行之信號轉導。在某些實施例中，宿主細胞中TFcBA之表現產生(i)相對於具有結合至相同受體但不包含TFc之多價抗體的相配之宿主細胞之表現，更多的準確形成之TFcAB分子，或(ii)如例如藉由SEC所測定的超過80%之準確形成的TFcAB分子。

本文另外提供單價串聯FC抗體(TFcA)。單價TFcA可包含結合至靶之單一結合位點，其中該結合位點連接至包含第一Fc區及第二Fc區之TFc，該第一Fc區及該第二Fc區各自具有C末端及N末端；且其中(i)該第一Fc區及該第二Fc區經由具有C末端及N末端之TFc連接子連接形成連續多肽；(ii)該第一與該第二Fc區締合形成Fc二聚體；且(iii)該第一與該第二Fc區中任一者或兩者包含一或多個使該第一與該第二Fc區之間之結合增強或穩定的aa修飾。該單價TFcA可抑制經由該靶進行之信號轉導。在某些實施例中，宿主細胞中單價TFcA之表現產生(i)相對於具有不包含TFc之抗體的相配之宿主細胞之表現，更多的準確形成之TFcA分子，或(ii)如例如藉由SEC所測定的超過80%之準確形成的TFcA分子。

TFcA(諸如TFcBA)所包含之TFc的第一Fc區及第二Fc區可分別包含第一及第二CH3結構域，該CH3結構域各自具有C末端及N末端。TFcA所包含之TFc的第一及第二Fc區可分別包含第一及第二CH2結構域，該CH2結構域各自具有C末端及N末端。TFcA所包含之TFc的第一及第二Fc區可分別包含第一及第二鉸鏈區，該第一鉸鏈區及該第二鉸鏈區各自具有C末端及N末端。在某些實施例中，該第二鉸鏈區不包含上游鉸鏈亞結構域。TFcA中所包含之TFc以胺基至羧基末端次序可包含：第一CH2結構域、第一CH3結構域、TFc連接子、第二CH2結構域及第二CH3結構域。TFcA中所包含之TFc以胺基至羧基末端次序可包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、TFc連接子、第二CH2結構域及第二CH3結構域。TFcA中所包含之TFc以胺基至羧基末端次序可包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、TFc連接子、第二鉸鏈區、第二CH2結構域及第二CH3結構域。第一鉸鏈區可包含上游鉸鏈亞結構域、核心鉸鏈亞結構域及下游鉸鏈亞結構域，且第二鉸鏈區可包含核心鉸鏈亞結構域及下游鉸鏈亞結構域，但不包含上游鉸鏈亞結構域，該鉸鏈亞結構域各自具有C末端及N末端。TFcA所包含之TFc以胺基至羧基末端次序可包含：第一鉸鏈區，其在其C末端處連接至第一CH2結構域之N末端，該第一CH2結構域在其C末端處連接至第一CH3結構域之N末端，該第一CH3結構域在其C末端處連接至TFc連接子之N末端，該TFc連接子在其C末端處連接至第二鉸鏈區之C末端，該第二鉸鏈區在其C末端處連接至第二CH2結構域之N末端，該第二CH2結構域在其C末端處連接至第二CH3結構域之N末端。

TFcA所包含之TFc的TFc連接子可包含20-50個aa。TFc連接子可為Gly-Ser連接子，諸如(Gly₄ Scr)_n ，其中n為4、5、6、7或8。TFc連接子亦可包含與具有Gly-Scr連接子之aa序列至少約70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致或與其差異在於至多20、15、10、5、4、3、2或1個aa添加、缺失或取代的aa序列。

TFcA之TFc可為IgG1 TFc。TFc可為雜交體TFc，例如IgG1/IgG4雜交體TFc。TFcA之TFc可為IgG1 TFc且以胺基至羧基末端次序可包含：第一IgG1鉸鏈區、第一IgG1 CH2結構域、第一IgG1 CH3結構域、TFc連接子、第二IgG1鉸鏈區、第二IgG1 CH2結構域及第二IgG1 CH3結構域。雜交體TFc以胺基至羧基末端次序可包含：第一IgG1/IgG4鉸鏈區、第一IgG4 CH2結構域、第一IgG1 CH3結構域、TFc連接子、第二IgG4鉸鏈區、第二IgG4 CH2結構域及第二IgG1 CH3結構域。

TFc之第一CH3結構域及第二CH3結構域中任一者或兩者可包含一或多個使第一與第二Fc區之間之結合增強或穩定的aa修飾，如例如藉由非變性SDS-Page凝膠上基本上均一之產物(或譜帶)所證實的。TFc之第一CH3結構域及第二CH3結構域各自可包含胺基酸修飾，該修飾為增強第一CH3結構域與第二CH3結構域之締合的締合增強性修飾(「AEM」)。AEM可包含在選自由AEM模組1、AME模組2、AEM模組3及AEM模組4組成之群之模組內。TFc之第一Fc區及第二Fc區中任一者或兩者可包含添加半胱胺酸作為插入或置換之aa修飾，該半胱胺酸與另一Fc區中之半胱胺酸形成二硫鍵(「DiS」修飾)。TFc之第一及第二Fc區中任一者或兩者可在鉸鏈區中包含DiS修飾。在某些實施例中，第一及第二Fc區中任一者或兩者在CH3結構域中包含DiS修飾。DiS模組1或DiS模組2可包含DiS修飾。TFc之第一CH3結構域及第二CH3結構域各自可包含一或多個AEM修飾及一或多個DiS修飾。

TFc之第一及第二CH3結構域中任一者或兩者可包含與本文提供之例如選自由SEQ ID NO：27-98組成之群的CH3結構域之aa序列至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致，或與其差異在於至多30、25、20、15、10、5、4、3、2或1個aa添加、缺失或取代的aa序列。在某些實施例中，若CH3結構域之aa序列與選自序列SEQ ID NO：27-98之群之序列不一致，則該CH3結構域之aa序列仍然包含與其類似之序列的特定AEM及/或DiS。TFc之第一CH3結構域或第二CH3結構域可包含本文提供的例如選自由SEQ ID NO：27-98組成之群之aa序列。TFc之第一CH3及第二CH3結構域一起可包含一對兩個不同之成員，每個成員為CH3 aa序列，每一對選自由以下組成之序列對之群：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55 及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98，每個成員aa序列與該序列對中每一者之每一序列至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致，或與其差異在於至多30、25、20、15、10、5、4、3、2或1個aa添加、缺失或取代，其中該第一CH3結構域包含與第二CH3結構域所包含之序列對不同的序列對成員。TFc之第一及第二CH3結構域可各自包含與選自由以下組成之群之CH3 aa序列對成員的aa序列一致的aa序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98。

TFc之第一鉸鏈區可包含與本文提供的例如選自由SEQ ID NO：4、18、19、20、21、22、263-265及267-273組成之群之鉸鏈區aa序列差異在於至多3、2或1個aa缺失、添加或取代的aa序列。TFc之第一鉸鏈區可包含這樣一種aa序列，該aa序列為選自由SEQ ID NO：4、18、19、20、21、22、263-265及267-273組成之群的aa序列。TFc之第二鉸鏈區可包含與本文提供的例如選自由SEQ ID NO：23、24、263-265及267-273組成之群之鉸鏈區aa序列差異在於至多3、2或1個aa缺失、添加或取代的aa序列。第二鉸鏈區可包含這樣一種aa序列，該aa 序列為選自由SEQ ID NO：23、24、263-265及267-273組成之群的aa序列。

TFc之CH2結構域可包含與本文提供的例如SEQ ID NO：25、26、261或262之CH2結構域之aa序列至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致，或與其差異在於至多30、25、20、15、10、5、4、3、2或1個aa缺失、添加或取代的aa序列。

TFc以胺基至羧基末端次序可包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、第二鉸鏈區、第二CH2結構域及第二CH3結構域，其中(i)該第一鉸鏈區包含選自由SEQ ID NO：4、18、19、263-265及267-273組成之群之aa序列；(ii)該第一CH2結構域為非糖基化的且包含如SEQ ID NO：25所陳述之aa序列；(iii)該第一CH3結構域包含這樣一種aa序列，其為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對之任一序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98；(iv)該第二鉸鏈區包含由選自由SEQ ID NO：23、263-265及267-273組成之群之序列組成的aa序列；(v)該第二CH2結構域為非糖基化的且包含SEQ ID NO：25中所陳述之序列；且(vi)該第二CH3結構域包含這樣一種aa序列，其為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對之任一序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41 及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98，其中若該第一CH3結構域包含序列對之第一序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第二序列；且若該第一CH3結構域包含序列對之第二序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第一序列。

TFc以胺基至羧基末端次序可包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、第二鉸鏈區、第二CH2結構域及第二CH3結構域，其中(i)該第一鉸鏈區包含選自由SEQ ID NO：20、21、22、263-265及267-273組成之群之aa序列；(ii)該第一CH2結構域為非糖基化的且包含如SEQ ID NO：26所陳述之aa序列；(iii)該第一CH3結構域包含這樣一種aa序列，其為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對之任一序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98；(iv)該第二鉸鏈區包含由SEQ ID NO：24、263-265及267-273組成之aa序列；(v)該第二CH2結構域為非糖基化的且包含SEQ ID NO：26中所陳述之序列；且(vi)該第二CH3結構域包含這樣一種aa序列，其為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對之任一序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98，其中若該第一CH3結構域包含序列對之第一序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第二序列；且若該第一CH3結構域包含序列對之第二序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第一序列。

TFc之第一及第二Fc區可包含與本文提供的例如選自由SEQ ID NO：99-166組成之群之Fc之aa序列至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致，或與其差異在於至多50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1個aa缺失、添加或取代的aa序列。第一及第二Fc區包含選自由SEQ ID NO：99-166組成之群之aa序列。第一及第二Fc區可包含與選自由以下組成之群之aa序列對中之一個aa序列至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致，或與其差異在於至多50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1個aa缺失、添加或取代的aa序列：SEQ ID NO：99及100；SEQ ID NO：101及102；SEQ ID NO：103及104；SEQ ID NO：105及106；SEQ ID NO：107及108；SEQ ID NO：109及110；SEQ ID NO：111及112；SEQ ID NO：113及114；SEQ ID NO：115及116；SEQ ID NO：117及118；SEQ ID NO：119及120；SEQ ID NO：121及122；SEQ ID NO：123及124；SEQ ID NO：125及126；SEQ ID NO：127及128；SEQ ID NO：129及130；SEQ ID NO：131及 132；SEQ ID NO：133及134；SEQ ID NO：135及136；SEQ ID NO：137及138；SEQ ID NO：139及140；SEQ ID NO：141及142；SEQ ID NO：143及144；SEQ ID NO：145及146；SEQ ID NO：147及148；SEQ ID NO：149及150；SEQ ID NO：151及152；SEQ ID NO：153及154；SEQ ID NO：155及156；SEQ ID NO：157及158；SEQ ID NO：159及160；SEQ ID NO：161及162；SEQ ID NO：163及164；以及SEQ ID NO：165及166，且其中該第一Fc區包含與第二Fc區所包含不同的序列對成員。第一Fc區及第二Fc區一起可包含一對兩個不同成員，每個成員為Fc aa序列，其中每一對係選自由以下組成之序列對之群：SEQ ID NO：99及100；SEQ ID NO：101及102；SEQ ID NO：103及104；SEQ ID NO：105及106；SEQ ID NO：107及108；SEQ ID NO：109及110；SEQ ID NO：111及112；SEQ ID NO：113及114；SEQ ID NO：115及116；SEQ ID NO：117及118；SEQ ID NO：119及120；SEQ ID NO：121及122；SEQ ID NO：123及124；SEQ ID NO：125及126；SEQ ID NO：127及128；SEQ ID NO：129及130；SEQ ID NO：131及132；SEQ ID NO：133及134；SEQ ID NO：135及136；SEQ ID NO：137及138；SEQ ID NO：139及140；SEQ ID NO：141及142；SEQ ID NO：143及144；SEQ ID NO：145及146；SEQ ID NO：147及148；SEQ ID NO：149及150；SEQ ID NO：151及152；SEQ ID NO：153及154；SEQ ID NO：155及156；SEQ ID NO：157及158；SEQ ID NO：159及160；SEQ ID NO：161及162；SEQ ID NO：163及164；以及SEQ ID NO：165及166，每個成員aa序列與該序列對中每一者之每一序列至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致，或與其差異在於至多50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1個aa添加、缺失或取代，其中該第一Fc區包含與第二Fc區所包含不同的序列對成員。

TFc可包含與本文提供的例如選自由以下組成之群之TFc之aa序列至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致，或與其差異在於至多30、25、20、15、10、5、4、3、2或1個aa添加、缺失或取代的aa序列：SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219及221。TFc可包含選自由以下組成之群之aa序列：SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219及221。

TFcA，例如TFcBA，例如抗c-Met+抗EGFR TFcBA，或抗c-Kit+抗RON TFcBA，或抗FGFR2+抗EPCAM TFcBA，可包含重鏈，該重鏈以胺基至羧基末端次序包含：第一重鏈可變(VH)結構域、TFc、連接性連接子及第二VH結構域。該重鏈以胺基至羧基末端次序可包含：第一VH結構域、CH1結構域、TFc、連接性連接子及第二VH結構域。該重鏈以胺基至羧基末端次序可包含：第一VH結構域、CH1結構域、TFc、連接性連接子、第二VH結構域、scFv連接子及第二輕鏈可變(VL)結構域，其中該第二VH及VL結構域締合形成第二結合位點。TFcA可包含輕鏈，該輕鏈包含第一VL結構域，該第一VL結構域與第一VH結構域形成二聚體，從而形成第一結合位點。輕鏈可包含輕鏈恆定(CL)結構域，該結構域連接至VL結構域之羧基末端。該第一結合位點可為抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰島素受體、抗RON、抗EGFR、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFR α、抗PDGFR β、抗EPCAM或抗EphA2結合位點，且該第二結合位點可為抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰島素受體、抗RON、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFR α、抗PDGFR β、抗EphA2或抗EGFR結合位點。若TFcA為單價TFcA，則該結合位點可為抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰島素受體、抗RON、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFR α、抗PDGFR β、抗EPCAM、抗EphA2或抗EGFR結合位點。一個例示性抗c-Met結合位點可包含VH結構域，其包含以下任一者或兩者：a)SEQ ID NO：223或287中之VH互補決定區(CDR)3(VHCDR3)的aa序列；及b)包含SEQ ID NO：231或289中之VLCDR3之aa序列的VLCDR3。另一例示性抗c-Met結合位點可包含VH結構域，其包含一組三個VH CDR，包含VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3，其中VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3包含SEQ ID NO：223或231中之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3之aa序列；及VL結構域，其包含一組三個VLCDR，包含VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3，其中VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3分別包含SEQ ID NO：287或289中之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3之aa序列。例示性抗EGFR結合位點可包含以下任一者或兩者：a)包含SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中之VHCDR3之aa序列的VHCDR3；及b)包含SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中之VLCDR3之aa序列的VLCDR3。一個例示性抗EGFR結合位點可包含VH結構域，其包含一組三個VHCDR，包含VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3，其中VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3包含SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3之aa序列；及VL結構域，其包含一組三個VLCDR，包含VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3，其中VLCDR1、 VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3之aa序列。抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰島素受體、抗RON、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFR α、抗PDGFR β、抗EPCAM、抗EphA2或抗EGFR結合位點可包含重鏈之N末端部分及輕鏈之N末端部分。抗EGFR、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰島素受體、抗RON、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFR α、抗PDGFR β、抗EPCAM、抗EphA2或抗c-Met結合位點可包含在C末端scFv內，該scFv完全包含在重鏈內以形成連續多肽。

VH結構域及VL結構域中任一者或兩者可包含TFcA(例如TFcBA)之抗c-Met結合位點，其中該VH結構域包含與例如SEQ ID NO：223、231、287或289中所陳述之抗c-Met結合位點之VH結構域至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致，或與其差異在於至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個aa缺失、添加或取代的aa序列；且該VL結構域包含與例如SEQ ID NO：223、231、287或289中所陳述的本文提供之抗c-Met結合位點之VL結構域至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致，或與其差異在於至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個aa缺失、添加或取代的aa序列。

VH結構域及VL結構域中任一者或兩者可包含TFcA(例如TFcBA)之抗EGFR結合位點，其中該VH結構域包含與例如SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中所陳述的本文提供之抗EGFR結合位點之VH結構域至少70%、80%、90%、95%、 97%、98%或99%一致，或與其差異在於至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個aa缺失、添加或取代的aa序列；且該VL結構域包含與例如SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中所陳述的本文提供之抗EGFR結合位點之VL結構域至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致，或與其差異在於至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個aa缺失、添加或取代的aa序列。

TFcA或TFcBA可為電荷互補配對之TFcA或TFcBA，例如，其中：電荷互補配對之TFcA或TFcBA為包含一對帶電胺基酸之TFcA或TFcBA，該對帶電胺基酸包含一個選自A組之胺基酸及一個選自B組之胺基酸(電荷互補對)；其中A組包含pI大於7之所有天然胺基酸，且B組包含pI小於7之所有天然胺基酸，或視情況其中A組包含His、Lys及Arg，且B組包含Asp、Glu、Asn、Phe、Gln、Tyr、Ser、Met、Thr、Ile、Gly、Val、Trp、Leu、Ala及Pro；且該電荷互補對由第一胺基酸殘基及第二胺基酸殘基組成，且該電荷互補對為297位之電荷互補對或299位之電荷互補對，其中297位之電荷互補對為該第一胺基酸殘基位於該第一Fc區之EU位置297處且該第二胺基酸殘基位於該第二Fc區之EU位置297處的電荷互補對，且299位之電荷互補對為該第一胺基酸殘基位於該第一Fc區之EU位置299處且該第二胺基酸殘基位於該第二Fc區之EU位置299處的電荷互補對。電荷互補配對之TFcA或TFcBA可同時包含297位之電荷互補對及299位之電荷互補對，其中該297位之電荷互補對之第一及第二胺基酸殘基與該299位之電荷互補對之第一及第二胺基酸殘基相同或不同。電荷互補配對之TFcA或TFcBA可包含297位之電荷互補對，且其中與不為電荷互補配對之TFcA或TFcBA，但除對應於第一及第二胺基酸殘基之胺基酸殘基係由帶相同電荷之胺基酸組成之兩個殘基外其餘與電荷互補配對之TFcA或TFcBA一致的TFcA或TFcBA相比較，該電荷互補配對之TFcA 或TFcBA更穩定，該帶相同電荷之胺基酸為該電荷互補配對之TFcA或TFcBA中297位之電荷互補對之胺基酸中的一者。電荷互補配對之TFcA或TFcBA可包含299位之電荷互補對，且其中與不為電荷互補配對之TFcA或TFcBA，但除對應於第一及第二胺基酸殘基之胺基酸殘基係由帶相同電荷之胺基酸組成之兩個殘基外其餘與電荷互補配對之TFcA或TFcBA一致的TFcA或TFcBA相比較，該電荷互補配對之TFcA或TFcBA更穩定，該帶相同電荷之胺基酸為該電荷互補配對之TFcA或TFcBA中299位之電荷互補對之胺基酸中的一者。

TFcA或TFcBA之第一或第二結合位點可特異性結合至人類受體蛋白，該人類受體蛋白選自由以下組成之群：ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、c-Met、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α及β)、c-Kit、EPCAM及EphA2。

本文另外提供醫藥組合物，其包含TFcA或TFcBA及醫藥學上可接受之載劑。亦提供例如包含至少一個編碼序列之核酸分子，該至少一個編碼序列編碼TFcA或TFcBA之重鏈或輕鏈。核酸分子可包含至少兩個編碼序列，其中一個編碼序列編碼TFcA或TFcBA之重鏈且第二編碼序列編碼TFcBA之輕鏈。亦提供載體，其例如包含一或多個本文提供之核酸分子。另外提供包含一或多個本文提供之載體及/或核酸分子之細胞，例如宿主細胞或分離之細胞。細胞可包含編碼TFcA或TFcBA之重鏈的核酸分子及編碼TFcA或TFcBA之輕鏈的核酸分子。

本文亦涵蓋產生TFcA或TFcBA之方法，該方法包含在表現該等核酸之條件下培養本文所述之宿主細胞，及分離該TFcA或TFcBA。用於產生TFcA或TFcBA之方法可包含在適於表現該 TFcA或TFcBA之條件下培養本文所述之細胞。

本文亦提供治療患有癌症之個體的方法，該方法包含向個體投與治療有效量的本文所述之TFcA或TFcBA、核酸分子或載體。

例示性實施例包括(但不限於)結合可主張之主題的以下各項。

1. 一種抗體，其為串聯Fc雙特異性抗體(「TFcBA」)，其中該TFcBA包含作為單一抗c-Met結合位點之第一結合位點及至少一個特異性結合至除c-Met外之細胞表面受體的第二結合位點；視情況細胞表面受體選自ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、PDGFR α、PDGFR β、c-Kit、AXL、ALK、CEA、CD44、EPCAM及EphA2，其中該抗c-Met結合位點與該第二結合位點經由串聯Fc(「TFc」)連接；該TFc包含第一Fc區及第二Fc區，該第一Fc區及該第二Fc區各自具有C末端及N末端，該第一Fc區與該第二Fc區經由具有C末端及N末端之TFc連接子連接形成連續多肽；且該第一Fc區及該第二Fc區締合形成Fc二聚體。

2. 如實施例1之TFcBA，其中a. 該TFcBA抑制由HGF及該至少一個第二結合位點特異性結合之受體的同源配位體中之任一者或兩者所誘導的信號轉導，如由c-Met及該至少一個第二結合位點特異性結合之受體中任一者或兩者之磷酸化的抑制所指示，其IC50為10nM或低於10nM，或者1nM或低於1nM，或者100pM或低於100pM，或最大抑制百分比為至少70%或至少80%或至少90%；或b. 細胞中該TFcBA之表現產生(i)相對於不包含TFc之多價抗體之表現，更多的準確形成之TFcAB分子；或(ii)如藉由尺寸排阻層析法(SEC)所測定的超過80%之準確形成之TFcAB。

3. 如實施例1或2之TFcBA，其中該第一Fc區及該第二Fc區分別包含第一及第二CH3結構域，該CH3結構域各自具有C末端及N末端。

4. 如實施例1至3中任一項之TFcBA，其中該第一及該第二Fc區分別包含第一及第二CH2結構域，該CH2結構域各自具有C末端及N末端。

5. 如實施例1至4中任一項之TFcBA，其中該第一及該第二Fc區分別包含第一及第二鉸鏈區，該第一鉸鏈區及該第二鉸鏈區各自具有C末端及N末端。

6. 如實施例1至5中任一項之TFcBA，其中該第二鉸鏈區不包含上游鉸鏈亞結構域。

7. 如實施例6之TFcBA，其中該TFcBA中所包含之TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一CH2結構域、第一CH3結構域、TFc連接子、第二CH2結構域及第二CH3結構域。

8. 如實施例6之TFcBA，其中該TFcBA中所包含之TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、TFc連接子、第二CH2結構域及第二CH3結構域。

9. 如實施例6之TFcBA，其中該TFcBA中所包含之TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、TFc連接子、第二鉸鏈區、第二CH2結構域及第二CH3結構域。

10. 如實施例9之TFcBA，其中該第一鉸鏈區包含上游鉸鏈亞結構域、核心鉸鏈亞結構域及下游鉸鏈亞結構域，且該第二鉸鏈區包含核心鉸鏈亞結構域及下游鉸鏈亞結構域，但不包含上游鉸鏈亞結構域，該鉸鏈亞結構域各自具有C末端及N末端。

11. 如實施例1至10中任一項之TFcBA，其中該TFcBA中所包含之TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一鉸鏈區，其在其C末端處連接至第一CH2結構域之N末端，該第一CH2結構域在其C末端處連接至第一CH3結構域之N末端，該第一CH3結構域在其C末端處連接至TFc連接子之N末端，該TFc連接子在其C末端處連接至第二鉸鏈區之C末端，該第二鉸鏈區在其C末端處連接至第二CH2結構域之N末端，該第二CH2結構域在其C末端處連接至第二CH3結構域之N末端。

12. 如實施例1至11中任一項之TFcBA，其中該TFc連接子包含20-50個aa。

13. 如實施例12之TFcBA，其中該TFc連接子為Gly-Ser連接子。

14. 如實施例13之TFcBA，其中該TFc連接子包含(Gly₄ Ser)_n ，其中n為4、5、6、7或8。

15. 如實施例1至14中任一項之TFcBA，其中該TFc為IgG1 TFc。

16. 如實施例1至14中任一項之TFcBA，其中該TFc為雜交體TFc。

17. 如實施例16之TFcBA，其中該TFc為IgG1/IgG4 TFc。

18. 如實施例15之TFcBA，其中該TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一IgG1鉸鏈區、第一IgG1 CH2結構域、第一IgG1 CH3結構域、TFc連接子、第二IgG1鉸鏈區、第二IgG1 CH2結構域及第二IgG1 CH3結構域。

19. 如實施例17之TFcBA，其中該雜交體TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一IgG1/IgG4鉸鏈區、第一IgG4 CH2結構域、第一IgG1 CH3結構域、TFc連接子、第二IgG4鉸鏈區、第二IgG4 CH2結構域及第二IgG1 CH3結構域。

20. 如實施例1至19中任一項之TFcBA，其中該第一CH3結構域及該第二CH3結構域中任一者或兩者包含一或多個使該第一與該第二Fc區之間之結合增強或穩定的aa修飾。

21. 如實施例20之TFcBA，其中該第一CH3結構域及該第二CH3結構域各自包含胺基酸修飾，該修飾為增強該第一CH3結構域與該第二CH3結構域之締合的締合增強性修飾(「AEM」)。

22. 如實施例21之TFcBA，其中該AEM係包含在選自由AEM模組1、AME模組2、AEM模組3及AEM模組4組成之群之模組內。

23. 如實施例1至22中任一項之TFcBA，其中該第一Fc區及該第二Fc區中任一者或兩者包含添加半胱胺酸作為插入或置換之aa修飾，該半胱胺酸與另一Fc區中之半胱胺酸形成二硫鍵(「DiS」修飾)。

24. 如實施例23之TFcBA，其中該第一及該第二Fc區中任一者或兩者在鉸鏈區中包含DiS修飾。

25. 如實施例23之TFcBA，其中該第一及該第二Fc區中任一者或兩者在CH3結構域中包含DiS修飾。

26. 如實施例23至25中任一項之TFcBA，其中該DiS修飾包含在DiS模組1或DiS模組2內。

27. 如實施例1至26中任一項之TFcBA，其中該第一CH3結構域及該第二CH3結構域各自包含一或多個AEM修飾及一或多個DiS修飾。

28. 如實施例1至27中任一項之TFcBA，其中該第一及該第二CH3結構域中任一者或兩者包含與選自由SEQ ID NO：27-98組成之群之aa序列至少70%一致或與其差異在於至多30個aa添加、缺失或取代的aa序列。

29. 如實施例28之TFcBA，其中該第一CH3結構域或該第二CH3結構域包含選自由SEQ ID NO：27-98組成之群的aa序列。

30. 如實施例1至28中任一項之TFcBA，其中該第一CH3及該第二CH3結構域一起包含一對兩個不同之成員，每個成員為CH3 aa序列，每一對選自由以下組成之序列對之群：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98，每個成員aa序列與該序列對中每一者之每一序列至少70%一致，或與其差異在於至多30個aa添加、缺失或取代，其中該第一CH3結構域包含與該第二CH3結構域所包含之序列對不同的序列對成員。

31. 如實施例30之TFcBA，其中該第一及該第二CH3結構域各自包含與選自由以下組成之群之CH3 aa序列對成員的aa序列一致的aa序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98。

32. 如實施例1至31中任一項之TFcBA，其中該第一鉸鏈區包含與選自由SEQ ID NO：4、18、19、20、21、22、263-265及267-273組成之群的aa序列差異在於至多3個aa缺失、添加或取代的aa序列。

33. 如實施例32之TFcBA，其中該第一鉸鏈區包含作為選自由 SEQ ID NO：4、18、19、20、21、22、263-265及267-273組成之群之aa序列的aa序列。

34. 如實施例1至33中任一項之TFcBA，其中該第二鉸鏈區包含與選自由SEQ ID NO：23、24、263-265及267-273組成之群的aa序列差異在於至多3個aa缺失、添加或取代的aa序列。

35. 如實施例34之TFcBA，其中該第二鉸鏈區包含作為選自由SEQ ID NO：23、24、263-265及267-273組成之群之aa序列的aa序列。

36. 如實施例1至35中任一項之TFcBA，其包含CH2結構域，該CH2結構域包含與SEQ ID NO：25、26、261或262至少70%一致或與其差異在於至多30個aa缺失、添加或取代的aa序列。

37. 如實施例1至36中任一項之TFcBA，其中該TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、第二鉸鏈區、第二CH2結構域及第二CH3結構域，其中a. 該第一鉸鏈區包含選自由SEQ ID NO：4、18、19、263-265及267-273組成之群的aa序列；b. 該第一CH2結構域為非糖基化的且包含如SEQ ID NO：25所陳述之aa序列；c. 該第一CH3結構域包含作為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對中之任一序列的aa序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91 及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98；d. 該第二鉸鏈區包含由選自由SEQ ID NO：23、263-265及267-273組成之群之序列組成的aa序列；e. 該第二CH2結構域為非糖基化的且包含SEQ ID NO：25所陳述之aa序列；且f. 該第二CH3結構域包含作為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對中之任一序列的aa序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98，其中若該第一CH3結構域包含序列對之第一序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第二序列；且若該第一CH3結構域包含序列對之第二序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第一序列。

38. 如實施例1至36中任一項之TFcBA，其中該TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、第二鉸鏈區、第二CH2結構域及第二CH3結構域，其中a. 該第一鉸鏈區包含選自由SEQ ID NO：20、21、22、263-265及267-273組成之群的aa序列；b. 該第一CH2結構域為非糖基化的且包含SEQ ID NO：26中所陳述之aa序列；c. 該第一CH3結構域包含作為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對中之任一序列的aa序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98；d. 該第二鉸鏈區包含由SEQ ID NO：24、263-265及267-273組成之aa序列；e. 該第二CH2結構域為非糖基化的且包含SEQ ID NO：26中所陳述之aa序列；且f. 該第二CH3結構域包含作為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對中之任一序列的aa序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98，其中若該第一CH3結構域包含序列對之第一序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第二序列；且若該第一CH3結構域包含序列對之第二序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第一序列。

39. 如實施例1至38中任一項之TFcBA，其中該第一或該第二Fc區包含與選自由SEQ ID NO：99-166組成之群之aa序列至少70%一致或與其差異在於至多50個aa缺失、添加或取代的aa序列。

40. 如實施例39之TFcBA，其中該第一或該第二Fc區包含選自由SEQ ID NO：99-166組成之群的aa序列。

41. 如實施例39之TFcBA，其中該第一及該第二Fc區中任一者或兩者包含與選自由以下組成之群之aa序列對中之一個aa序列至少70%一致，或與其相差至多50個aa缺失、添加或取代的aa序列：SEQ ID NO：99及100；SEQ ID NO：101及102；SEQ ID NO：103及104；SEQ ID NO：105及106；SEQ ID NO：107及108；SEQ ID NO：109及110；SEQ ID NO：111及112；SEQ ID NO：113及114；SEQ ID NO：115及116；SEQ ID NO：117及118；SEQ ID NO：119及120；SEQ ID NO：121及122；SEQ ID NO：123及124；SEQ ID NO：125及126；SEQ ID NO：127及128；SEQ ID NO：129及130；SEQ ID NO：131及132；SEQ ID NO：133及134；SEQ ID NO：135及136；SEQ ID NO：137及138；SEQ ID NO：139及140；SEQ ID NO：141及142；SEQ ID NO：143及144；SEQ ID NO：145及146；SEQ ID NO：147及148；SEQ ID NO：149及150；SEQ ID NO：151及152；SEQ ID NO：153及154；SEQ ID NO：155及156；SEQ ID NO：157及158；SEQ ID NO：159及160；SEQ ID NO：161及162；SEQ ID NO：163及164；以及SEQ ID NO：165及166，且其中該第一Fc區包含與該第二Fc區所包含不同的序列對成員。

42. 如實施例40之TFcBA，其中該第一Fc區及該第二Fc區一起包含一對兩個不同成員，每個成員為Fc aa序列，其中每一對係選自由以下組成之序列對之群：SEQ ID NO：99及100；SEQ ID NO：101及102；SEQ ID NO：103及104；SEQ ID NO：105及106；SEQ ID NO：107及108；SEQ ID NO：109及110；SEQ ID NO：111及112；SEQ ID NO：113及114；SEQ ID NO：115及116；SEQ ID NO：117及118；SEQ ID NO：119及120；SEQ ID NO：121及122；SEQ ID NO：123及124；SEQ ID NO：125及126；SEQ ID NO：127及128；SEQ ID NO：129及130；SEQ ID NO：131及132；SEQ ID NO：133及134；SEQ ID NO：135及136；SEQ ID NO：137及138；SEQ ID NO：139及140；SEQ ID NO：141及142；SEQ ID NO：143及144；SEQ ID NO：145及146；SEQ ID NO：147及148；SEQ ID NO：149及150；SEQ ID NO：151及152；SEQ ID NO：153及154；SEQ ID NO：155及156；SEQ ID NO：157及158；SEQ ID NO：159及160；SEQ ID NO：161及162；SEQ ID NO：163及164；以及SEQ ID NO：165及166，每個成員aa序列與該序列對中每一者之每一序列至少70%一致，或與其差異在於至多30個aa添加、缺失或取代，其中該第一Fc區包含與該第二Fc區所包含不同的序列對成員。

43. 如實施例1至42中任一項之TFcBA，其包含包括與選自由以下組成之群之aa序列至少70%一致，或與其差異在於至多30個aa添加、缺失或取代之aa序列的TFc：SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219及221。

44. 如實施例43之TFcBA，其包含包括選自由以下組成之群之aa序列的TFc：SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219及221。

45. 如實施例1至44中任一項之TFcBA，其包含重鏈，該重鏈以胺基至羧基末端次序包含：第一重鏈可變(VH)結構域、TFc、連接性連接子及第二VH結構域。

46. 如實施例45之TFcBA，其中該重鏈以胺基至羧基末端次序包含：第一VH結構域、CH1結構域、TFc、連接性連接子及第二VH結構域。

47. 如實施例46之TFcBA，其中該重鏈以胺基至羧基末端次序可包含：第一VH結構域、CH1結構域、TFc、連接性連接子、第二VH結構域、scFv連接子及第二輕鏈可變(VL)結構域，其中該第二VH及VL結構域締合形成第二結合位點。

48. 如實施例47之TFcBA，其包含輕鏈，該輕鏈包含第一VL結構域，該第一VL結構域與該第一VH結構域形成二聚體，從而形成第一結合位點。

49. 如實施例48之TFcBA，其中該輕鏈包含輕鏈恆定(CL)結構域，該結構域連接至該VL結構域之羧基末端。

50. 如實施例1至49中任一項之TFcBA，其中該第一結合位點為N末端結合位點且該第二結合位點為C末端結合位點。

51. 如實施例1至50中任一項之TFcBA，其中該抗c-Met結合位點包含VH，其包含以下任一者或兩者：a)SEQ ID NO：223或287中之VH互補決定區(CDR)3(VHCDR3)的aa序列；及b)包含SEQ ID NO：231或289中之VLCDR3之aa序列的VLCDR3。

52. 如實施例1至51中任一項之TFcBA，其中該c-Met結合位點包含VH結構域，其包含一組三個VH互補決定區(CDR)，包含VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3，其中VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3包含SEQ ID NO：223或231中之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3的aa序列；及VL結構域，其包含一組三個VLCDR，包含VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3，其中VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3分別包含SEQ ID NO：287或289中之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3的aa序列。

53. 如實施例1至52中任一項之TFcBA，其中該第二結合位點為抗EGFR結合位點，其包含以下任一者或兩者：a)包含SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中之VHCDR3之aa序列的VHCDR3；及b)包含SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中之VLCDR3之aa序列的VLCDR3。

54. 如實施例1至53中任一項之TFcBA，其中該第二結合位點為抗EGFR結合位點，該EGFR結合位點包含VH結構域，其包含一組三個VHCDR，包含VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3，其中VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3包含SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3的aa序列；及VL結構域，其包含一組三個VLCDR，包含VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3，其中VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3的aa序列。

55. 如實施例1至54中任一項之TFcBA，其中該抗c-Met結合位點包含該重鏈之N末端部分及該輕鏈之N末端部分。

56. 如實施例1至55中任一項之TFcBA，其中該第二結合位點包含在scFv之C末端內，該scFv之C末端完全包含在該重鏈內。

57. 如實施例1至56中任一項之TFcBA，其中該抗c-Met結合位點包含在VH結構域及VL結構域中任一者或兩者內，其中該VH結構域包含與SEQ ID NO：223、231、287或289中陳述之VH結構域至少70%一致，或與其差異在於至多10個aa缺失、添加或取代的aa序列，且該VL結構域包含與SEQ ID NO：223、231、287或289中陳述之VL結構域至少70%一致或與其差異在於至多10個aa缺失、添加或取代的aa序列。

58. 如實施例1至57中任一項之TFcBA，其中該第二結合位點為抗EGFR結合位點，其包含在VH結構域及VL結構域中任一者或兩者內，其中該VH結構域包含與SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中陳述之VH結構域至少70%一致，或與其差異在於至多10個aa缺失、添加或取代的aa序列，且該VL結構域包含與SEQ ID NO：233、237、258、275、277或279中陳述之VL結構域至少70%一致或與其差異在於至多10個aa缺失、添加或取代的aa序列。

59. 一種作為TFcBA之Ab，其中該TFcBA包含第一結合位點及第二結合位點，其中該第一結合位點結合至第一靶且該第二結合位點結合至第二靶，且其中該第一與該第二結合位點經由TFc連接；該TFc包含第一Fc區及第二Fc區，該第一Fc區及該第二Fc區各自具有C末端及N末端；該第一Fc區與該第二Fc區經由具有C末端及N末端之TFc連接子連接形成連續多肽；該第一及該第二Fc區締合形成Fc二聚體；且該第一及該第二Fc區中任一者或兩者包含一或多個使該第一與該第二Fc區之間之結合增強或穩定的aa修飾。

60. 如實施例59之TFcBA，其中a. 該TFcBA抑制經由該第一及該第二靶中之任一者或兩者進行之信號轉導；或b. 細胞中該TFcBA之表現產生(i)相對於不包含TFc之多價抗體之表現，更多的準確形成之TFcAB分子；或(ii)如藉由尺寸排阻層析法(SEC)所測定的超過80%之準確形成之TFcAB。

61. 如實施例59或60之TFcBA，其中該第一Fc區及該第二Fc區分別包含第一及第二CH3結構域，該CH3結構域各自具有C末端及N末端。

62. 如實施例59至61中任一項之TFcBA，其中該第一及該第二Fc區分別包含第一及第二CH2結構域，該CH2結構域各自具有C末端及N末端。

63. 如實施例59至62中任一項之TFcBA，其中該第一及該第二Fc區分別包含第一及第二鉸鏈區，該第一鉸鏈區及該第二鉸鏈區各自具有C末端及N末端。

64. 如實施例59至63中任一項之TFcBA，其中該第二鉸鏈區不包含上游鉸鏈亞結構域。

65. 如實施例64之TFcBA，其中該TFcBA中所包含之TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一CH2結構域、第一CH3結構域、TFc連接子、第二CH2結構域及第二CH3結構域。

66. 如實施例64之TFcBA，其中該TFcBA中所包含之TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、TFc連接子、第二CH2結構域及第二CH3結構域。

67. 如實施例64之TFcBA，其中該TFcBA中所包含之TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、TFc連接子、第二鉸鏈區、第二CH2結構域及第二CH3結構域。

68. 如實施例67之TFcBA，其中該第一鉸鏈區包含上游鉸鏈亞結構域、核心鉸鏈亞結構域及下游鉸鏈亞結構域，且該第二鉸鏈區包含核心鉸鏈亞結構域及下游鉸鏈亞結構域，但不包含上游鉸鏈亞結構域，該鉸鏈亞結構域各自具有C末端及N末端。

69. 如實施例59至68中任一項之TFcBA，其中該TFcBA中所包含之TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一鉸鏈區，其在其C末端處連接至第一CH2結構域之N末端，該第一CH2結構域在其C末端處連接至第一CH3結構域之N末端，該第一CH3結構域在其C末端處連接至TFc連接子之N末端，該TFc連接子在其C末端處連接至第二鉸鏈區之C末端，該第二鉸鏈區在其C末端處連接至第二CH2結構域之N末端，該第二CH2結構域在其C末端處連接至第二CH3結構域之N末端。

70. 如實施例59至69中任一項之TFcBA，其中該TFc連接子包含20-50個aa。

71. 如實施例70之TFcBA，其中該TFc連接子為Gly-Ser連接子。

72. 如實施例71之TFcBA，其中該TFc連接子包含(Gly₄ Ser)_n ，其中n為4、5、6、7或8。

73. 如實施例59至72中任一項之TFcBA，其中該TFc為IgG1 TFc。

74. 如實施例59至72中任一項之TFcBA，其中該TFc為雜交體TFc。

75. 如實施例74之TFcBA，其中該TFc為IgG1/IgG4 TFc。

76. 如實施例73之TFcBA，其中該TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一IgG1鉸鏈區、第一IgG1 CH2結構域、第一IgG1 CH3結構域、TFc連接子、第二IgG1鉸鏈區、第二IgG1 CH2結構域及第二IgG1 CH3結構域。

77. 如實施例75之TFcBA，其中該雜交體TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一IgG1/IgG4鉸鏈區、第一IgG4 CH2結構域、第一IgG1 CH3結構域、TFc連接子、第二IgG4鉸鏈區、第二IgG4 CH2結構域及第二IgG1 CH3結構域。

78. 如實施例59至77中任一項之TFcBA，其中該第一CH3結構域及該第二CH3結構域中任一者或兩者包含一或多個使該第一與該第二Fc區之間之結合增強或穩定的aa修飾。

79. 如實施例78之TFcBA，其中該第一CH3結構域及該第二CH3 結構域各自包含胺基酸修飾，該修飾為增強該第一CH3結構域與該第二CH3結構域之締合的締合增強性修飾(「AEM」)。

80. 如實施例79之TFcBA，其中該AEM係包含在選自由AEM模組1、AME模組2、AEM模組3及AEM模組4組成之群之模組內。

81. 如實施例1至80之TFcBA，其中該第一Fc區及該第二Fc區中任一者或兩者包含添加半胱胺酸作為插入或置換之aa修飾，該半胱胺酸與另一Fc區中之半胱胺酸形成二硫鍵(「DiS」修飾)。

82. 如實施例81之TFcBA，其中該第一Fc區及該第二Fc區中任一者或兩者在鉸鏈區中包含DiS修飾。

83. 如實施例81之TFcBA，其中該第一Fc區及該第二Fc區中任一者或兩者在CH3結構域中包含DiS修飾。

84. 如實施例80至83中任一項之TFcBA，其中該DiS修飾包含在DiS模組1或DiS模組2內。

85. 如實施例59至84中任一項之TFcBA，其中該第一CH3結構域及該第二CH3結構域各自包含一或多個AEM修飾及一或多個DiS修飾。

86. 如實施例1至85中任一項之TFcBA，其中該第一及該第二CH3結構域中任一者或兩者包含與選自由SEQ ID NO：27-98組成之群之aa序列至少70%一致或與其差異在於至多30個aa添加、缺失或取代的aa序列。

87. 如實施例28之TFcBA，其中該第一CH3結構域或該第二CH3結構域包含選自由SEQ ID NO：27-98組成之群的aa序列。

88. 如實施例1至86中任一項之TFcBA，其中該第一CH3及該第二CH3結構域一起包含一對兩個不同之成員，每個成員為 CH3 aa序列，每一對選自由以下組成之序列對之群：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98，每個成員aa序列與該序列對中每一者之每一序列至少70%一致，或與其差異在於至多30個aa添加、缺失或取代，其中該第一CH3結構域包含與該第二CH3結構域所包含之序列對不同的序列對成員。

89. 如實施例88之TFcBA，其中該第一及該第二CH3結構域各自包含與選自由以下組成之群之CH3 aa序列對成員的aa序列一致的aa序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98。

90. 如實施例59至89中任一項之TFcBA，其中該第一鉸鏈區包含與選自由SEQ ID NO：4、18、19、20、21、22、263-265及267-273組成之群的aa序列差異在於至多3個aa缺失、添加或取代的aa序列。

91. 如實施例90之TFcBA，其中該第一鉸鏈區包含作為選自由SEQ ID NO：4、18、19、20、21、22、263-265及267-273組成之群之 aa序列的aa序列。

92. 如實施例59至91中任一項之TFcBA，其中該第二鉸鏈區包含與選自由SEQ ID NO：23、24、263-265及267-273組成之群的aa序列差異在於至多3個aa缺失、添加或取代的aa序列。

93. 如實施例92之TFcBA，其中該第二鉸鏈區包含作為選自由SEQ ID NO：23、24、263-265及267-273組成之群之aa序列的aa序列。

94. 如實施例59至93中任一項之TFcBA，其包含CH2結構域，該CH2結構域包含與SEQ ID NO：25、26、261或262至少70%一致或與其差異在於至多30個aa缺失、添加或取代的aa序列。

95. 如實施例1至94中任一項之TFcBA，其中該TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、第二鉸鏈區、第二CH2結構域及第二CH3結構域，其中a. 該第一鉸鏈區包含選自由SEQ ID NO：4、18、19、263-265及267-273組成之群的aa序列；b. 該第一CH2結構域為非糖基化的且包含如SEQ ID NO：25所陳述之aa序列；c. 該第一CH3結構域包含作為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對中之任一序列的aa序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98；d. 該第二鉸鏈區包含由選自由SEQ ID NO：23、263-265及267-273組成之群之序列組成的aa序列；e. 該第二CH2結構域為非糖基化的且包含SEQ ID NO：25中所陳述之aa序列；且f. 該第二CH3結構域包含作為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對中之任一序列的aa序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98，其中若該第一CH3結構域包含序列對之第一序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第二序列；且若該第一CH3結構域包含序列對之第二序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第一序列。

96. 如實施例59至94中任一項之TFcBA，其中該TFc以胺基至羧基末端次序包含：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、第二鉸鏈區、第二CH2結構域及第二CH3結構域，其中a. 該第一鉸鏈區包含選自由SEQ ID NO：20、21、22、263-265及267-273組成之群的aa序列；b. 該第一CH2結構域為非糖基化的且包含SEQ ID NO：26中所陳述之aa序列；c. 該第一CH3結構域包含作為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對中之任一序列的aa序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98；d. 該第二鉸鏈區包含由SEQ ID NO：24、263-265及267-273組成之aa序列；e. 該第二CH2結構域為非糖基化的且包含SEQ ID NO：26中所陳述之aa序列；且f. 該第二CH3結構域包含作為選自由以下組成之CH3結構域序列對之群的序列對中之任一序列的aa序列：SEQ ID NO：31及35；SEQ ID NO：33及37；SEQ ID NO：39及43；SEQ ID NO：41及45；SEQ ID NO：47及51；SEQ ID NO：49及53；SEQ ID NO：55及59；SEQ ID NO：57及61；SEQ ID NO：63及67；SEQ ID NO：65及69；SEQ ID NO：71及73；SEQ ID NO：72及74；SEQ ID NO：75及79；SEQ ID NO：77及81；SEQ ID NO：83及85；SEQ ID NO：84及86；SEQ ID NO：87及89；SEQ ID NO：88及90；SEQ ID NO：91及93；SEQ ID NO：92及94；SEQ ID NO：95及97；以及SEQ ID NO：96及98，其中若該第一CH3結構域包含序列對之第一序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第二序列；且若該第一CH3結構域包含序列對之第二序列，則該第二CH3結構域包含該序列對之第一序列。

97. 如實施例59至96中任一項之TFcBA，其中該第一或該第二Fc區包含與選自由SEQ ID NO：99-166組成之群之aa序列至少 70%一致或與其差異在於至多50個aa缺失、添加或取代的aa序列。

98. 如實施例97之TFcBA，其中該第一或該第二Fc區包含選自由SEQ ID NO：99-166組成之群的aa序列。

99. 如實施例97之TFcBA，其中該第一及該第二Fc區中任一者或兩者包含與選自由以下組成之群之aa序列對中之一個aa序列至少70%一致，或與其相差至多50個aa缺失、添加或取代的aa序列：SEQ ID NO：99及100；SEQ ID NO：101及102；SEQ ID NO：103及104；SEQ ID NO：105及106；SEQ ID NO：107及108；SEQ ID NO：109及110；SEQ ID NO：111及112；SEQ ID NO：113及114；SEQ ID NO：115及116；SEQ ID NO：117及118；SEQ ID NO：119及120；SEQ ID NO：121及122；SEQ ID NO：123及124；SEQ ID NO：125及126；SEQ ID NO：127及128；SEQ ID NO：129及130；SEQ ID NO：131及132；SEQ ID NO：133及134；SEQ ID NO：135及136；SEQ ID NO：137及138；SEQ ID NO：139及140；SEQ ID NO：141及142；SEQ ID NO：143及144；SEQ ID NO：145及146；SEQ ID NO：147及148；SEQ ID NO：149及150；SEQ ID NO：151及152；SEQ ID NO：153及154；SEQ ID NO：155及156；SEQ ID NO：157及158；SEQ ID NO：159及160；SEQ ID NO：161及162；SEQ ID NO：163及164；以及SEQ ID NO：165及166，且其中該第一Fc區包含與該第二Fc區所包含不同的序列對成員。

100. 如實施例99之TFcBA，其中該第一Fc區及該第二Fc區一起包含一對兩個不同成員，每個成員為Fcaa序列，其中每一對係選自由以下組成之序列對之群：SEQ ID NO：99及100；SEQ ID NO：101及102；SEQ ID NO：103及104；SEQ ID NO：105及106；SEQ ID NO：107及108；SEQ ID NO：109及110；SEQ ID NO：111及112；SEQ ID NO：113及114；SEQ ID NO：115及116；SEQ ID NO：117及118；SEQ ID NO：119及120；SEQ ID NO：121及122；SEQ ID NO：123及124；SEQ ID NO：125及126；SEQ ID NO：127及128；SEQ ID NO：129及130；SEQ ID NO：131及132；SEQ ID NO：133及134；SEQ ID NO：135及136；SEQ ID NO：137及138；SEQ ID NO：139及140；SEQ ID NO：141及142；SEQ ID NO：143及144；SEQ ID NO：145及146；SEQ ID NO：147及148；SEQ ID NO：149及150；SEQ ID NO：151及152；SEQ ID NO：153及154；SEQ ID NO：155及156；SEQ ID NO：157及158；SEQ ID NO：159及160；SEQ ID NO：161及162；SEQ ID NO：163及164；以及SEQ ID NO：165及166，每個成員aa序列與該序列對中每一者之每一序列至少70%一致，或與其差異在於至多30個aa添加、缺失或取代，其中該第一Fc區包含與該第二Fc區所包含不同的序列對成員。

101. 如實施例59至100中任一項之TFcBA，其包含包括與選自由以下組成之群之aa序列至少70%一致，或與其差異在於至多30個aa添加、缺失或取代之aa序列的TFc：SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219及221。

102. 如實施例101之TFcBA，其包含包括選自由以下組成之群之aa序列的TFc：SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219及221。

103. 如實施例59至102中任一項之TFcBA，其包含重鏈，該重鏈以胺基至羧基末端次序包含：第一重鏈可變(VH)結構域、TFc、連接性連接子及第二VH結構域。

104. 如實施例103之TFcBA，其中該重鏈以胺基至羧基末端次序包含：第一VH結構域、CH1結構域、TFc、連接性連接子及第二VH結構域。

105. 如實施例104之TFcBA，其中該重鏈以胺基至羧基末端次序可包含：第一VH結構域、CH1結構域、TFc、連接性連接子、第二VH結構域、scFv連接子及第二輕鏈可變(VL)結構域，其中該第二VH及VL結構域締合形成第二結合位點。

106. 如實施例105之TFcBA，其包含輕鏈，該輕鏈包含第一VL結構域，該第一VL結構域與該第一VH結構域形成二聚體，從而形成第一結合位點。

107. 如實施例106之TFcBA，其中該輕鏈包含輕鏈恆定(CL)結構域，該結構域連接至該VL結構域之羧基末端。

108. 如實施例59至107中任一項之TFcBA，其中該第一結合位點為抗c-Met結合位點且該第二結合位點為抗EGFR結合位點。

109. 一種單價TFcA，其包含連接至TFc之結合位點，該TFc包含經由TFc連接子連接之第一Fc區及第二Fc區，其中該第一及該第二Fc區締合形成Fc，且其中該第一及該第二Fc區中任一者或兩者包含一或多個使該第一與該第二Fc區之間之結合增強或穩定的aa修飾。

110. 如實施例1至109中任一項之TFcA或TFcBA，其為電荷互補配對之TFcA或TFcBA，其中電荷互補配對之TFcA或TFcBA為包含一對帶電胺基酸之TFcA或TFcBA，該對帶電胺基酸包含選自A組之胺基酸及選自B組之胺基酸(電荷互補對)

其中A組包含pI大於7之所有天然胺基酸且B組包含pI小於7之所有天然胺基酸，或視情況其中A組包含His、Lys及Arg，且B組包含Asp、Glu、Asn、Phe、Gln、Tyr、Ser、Met、Thr、Ile、Gly、Val、Trp、Leu、Ala及Pro；且該電荷互補對由第一胺基酸殘基及第二胺基酸殘基支持，且該電荷互補對為297位之電荷互補對或299位之電荷互補對，其中297位之電荷互補對為該第一胺基酸殘基位於該第一Fc區之EU位置297處且該第二胺基酸殘基位於該第二Fc區之EU位置297處的電荷互補對，且299位之電荷互補對為該第一胺基酸殘基位於該第一Fc區之EU位置299處且該第二胺基酸殘基位於該第二Fc區之EU位置299處的電荷互補對。

111. 如實施例110之電荷互補配對之TFcA或TFcBA，其中該電荷互補配對之TFcA或TFcBA包含297位之電荷互補對及299位之電荷互補對，其中該297位之電荷互補對的第一及第二胺基酸殘基與該299位之電荷互補對的第一及第二胺基酸殘基相同或不同。

112. 如實施例110或111之電荷互補配對之TFcA或TFcBA，其中該電荷互補配對之TFcA或TFcBA包含297位之電荷互補對且其中與不為電荷互補配對之TFcA或TFcBA但除對應於該第一及股第二胺基酸殘基之胺基酸殘基係由帶相同電荷之胺基酸組成之兩個殘基外其餘與該電荷互補配對之TFcA或TFcBA一致的TFcA或TFcBA相比較，該電荷互補配對之TFcA或TFcBA更穩定，該帶相同電荷之胺基酸為該電荷互補配對之TFcA或TFcBA中該297位之電荷互補對之胺基酸中的一者。

113. 如實施例110、111或112之電荷互補配對之TFcA或TFcBA，其中該電荷互補配對之TFcA或TFcBA包含299位之電荷互補對且其中與不為電荷互補配對之TFcA或TFcBA但除對應於該第一及股第二胺基酸殘基之胺基酸殘基係由帶相同電荷之胺基酸組成之兩個殘基外其餘與該電荷互補配對之TFcA或TFcBA一致的TFcA或TFcBA相比較，該電荷互補配對之TFcA或TFcBA 更穩定，該帶相同電荷之胺基酸為該電荷互補配對之TFcA或TFcBA中該299位之電荷互補對之胺基酸中的一者。

114. 如實施例59至113中任一項之TFcA或TFcBA，其中該第一或該第二結合位點特異性結合至人類受體蛋白，該人類受體蛋白選自由以下組成之群：ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、Ron、c-Met、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、PDGFR α、PDGFR β、c-Kit、EPCAM及EphA2。

115. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至114中任一項之TFcA或TFcBA及醫藥學上可接受的載劑。

116. 一種包含至少一個編碼序列之核酸分子，該至少一個編碼序列編碼如實施例1至114中任一項之TFcA或TFcBA之重鏈或輕鏈。

117. 一種包含至少兩個編碼序列之核酸分子，其中一個編碼序列編碼如實施例1至114中任一項之TFcA或TFcBA之重鏈且第二編碼序列編碼該TFcBA之輕鏈。

118. 一種載體，其包含一或多個如實施例116或117之核酸分子。

119. 一種細胞，其包含一或多個如實施例118之載體或如實施例116或117之核酸分子。

120. 一種細胞，其包含編碼如實施例1至114中任一項之TFcA或TFcBA之重鏈的核酸分子及編碼該TFcA或TFcBA之輕鏈的核酸分子。

121. 一種產生TFcA或TFcBA之方法，其包含在表現該等核酸之條件下培養如實施例119或120之宿主細胞，及分離該TFcA或TFcBA。

122. 一種用於產生TFcA或TFcBA之方法，其包含在適於表現該 TFcA或TFcBA之條件下培養如實施例119或120之細胞。

123. 一種治療患有癌症之個體的方法，該方法包含向個體投與治療有效量的如實施例1至120中任一項之TFcA或TFcBA、核酸分子或載體。

其他例示性實施例包括(但不限於)結合可實施之主題內容的以下各項。

A1'. 一種串聯Fc雙特異性抗體(「TFcBA」)，其包含兩個多肽鏈，即，一個大鏈及一個Fab輕鏈，每條鏈具有C末端及N末端，該TFcBA包含由Fab部分所包含之第一結合位點，該Fab部分包含Fab輕鏈及Fab重鏈，該Fab重鏈係在該大鏈之N末端處，該Fab部分特異性結合至cMET，且該TFcBA進一步包含由在該大鏈之C末端的單鏈Fv(scFV)部分所包含之第二結合位點，該scFV部分特異性結合至EpCAM，其中(a)該Fab重鏈與該scFv部分係經由串聯Fc(「TFc」)連接；(b)該TFc包含在該大鏈內且具有第一Fc區及第二Fc區，該等Fc區經由TFc連接子連接形成連續多肽；且(c)該第一Fc區與該第二Fc區締合形成Fc二聚體，且另外其中(d)該Fab輕鏈包含包括SEQ ID NO：400中存在之三個輕鏈CDR的胺基酸序列；且(e)該Fab重鏈包含包括SEQ ID NO：423中存在之三個重鏈CDR的胺基酸序列。

A2'. 如實施例A1'之TFcBA，其中該scFV部分包含胺基酸序列SEQ ID NO：488。

A3'. 如實施例A1'或實施例A2'之TFcBA，其中該TFcBA大鏈以N末端至C末端次序包含： (i)Fab重鏈可變區IgG1 CH1結構域；(ii)含有IgG1上游鉸鏈區以及IgG4中間及下游鉸鏈區之雜交鉸鏈區；(iii)包含T299K突變之第一IgG4 CH2結構域；(iv)包含T366S、L368A及Y407V突變之第一IgG1 CH3結構域；(v)第一個二硫橋基元(KSCDKT)；(vi)串聯Fc連接子，視情況為包含aa序列(G₄ S)₈ 之連接子；(vii)IgG4中間及下游鉸鏈區；(viii)包含T299D突變之第二IgG4 CH2結構域；(ix)包含T366W突變之第二IgG1 CH3結構域；(x)第二個二硫橋基元(GEC)；(xi)連接性連接子，以及(xii)該scFv。

A4'. 如實施例A1'至A3'中任一項之TFcBA，其中該TFcBA結合cMET之Kd小於約10e-8、10e-9、10e-10、10e-11、10e-12或10e-13M。

A5'. 如實施例A4'之TFcBA，其中該TFcBA結合cMET之Kd為3.0×10e-8至2.5×10e-9M。

A6'. 如實施例A1'至A3'中任一項之TFcBA，其中該TFcBA結合EpCAM之Kd小於約10e-7或10e-8，或視情況為10e-9M。

A7'. 如實施例A6'之TFcBA，其中該TFcBA結合cMET之Kd為10e-8至10e-11M。

A8'. 如實施例A1'至A3'中任一項之TFcBA，其中TFc連接子序列包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列。

A9'. 如實施例A1'至A3'中任一項之TFcBA，其中該TFc包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：173、 SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：193及SEQ ID NO：195。

A10'. 一種TFcBA分子，其包含大鏈，該大鏈包括胺基酸序列SEQ ID NO 489。

A11'. 一種治療癌症患者之方法，該方法包含向該患者投與治療有效量的如前述實施例中任一項之TFcBA，且視情況其中該治療有效量為每公斤患者體重100ng至每公斤患者體重15mg，且另外視情況其中該治療有效量為每公斤患者體重1mg至每公斤患者體重25mg。

A12'. 如實施例A11'之方法，其中該癌症為本文所揭示之癌症類型，且視情況其中該治療有效量為每公斤患者體重1mg至每公斤患者體重10mg。

A13'. 一種抑制癌症患者體內腫瘤生長之方法，該方法包含向該患者投與治療有效量的如實施例A1'至A10'中任一項之TFcBA，視情況其中該治療有效量為每公斤患者體重100ng至每公斤患者體重15mg、每公斤患者體重1mg至每公斤患者體重10mg，或每公斤患者體重1mg至每公斤患者體重25mg。

A14'. 一種抑制腫瘤細胞增殖之方法，該方法包含使腫瘤細胞與包含一定濃度如實施例A1'至A10'中任一項之TFcBA的流體接觸，該TFcBA之濃度有效抑制該等腫瘤細胞之增殖。

A15'. 一種醫藥調配物，其包含如實施例A1'至A10'中任一項之TFcBA及醫藥載劑。

A16'. 如實施例A15'之醫藥調配物，其中該調配物為適於注射、靜脈內注射及/或輸注之無菌調配物。

A17'. 如實施例A15'或實施例A16'之醫藥調配物，其中該調配物係包裝在醫藥學上可接受之容器中。

A18'. 一種核酸分子，其編碼如實施例A1'至A10'中任一項之蛋白質胺基酸序列。

A19'. 一種載體，其包含如實施例A18'之核酸分子。

A20'. 一種宿主細胞，其包含載體，該載體包含如實施例A18'之核酸分子。

A21'. 如實施例A20'之宿主細胞，其中該宿主細胞表現該所編碼之蛋白質。

圖1： 例示性抗c-Met/抗EGFR串聯Fc雙特異性抗體(「TFcBA」)(圖1A)及該串聯Fc(「TFc」)之每一結構域中之例示性突變(圖1B)的圖解。

圖1A： 例示性抗c-Met/抗EGFR TFcBA之圖解：以胺基至羧基末端次序，其包含：1)由抗c-Met結合位點組成之第一模組；2)由TFc組成之第二模組；及3)由抗EGFR結合位點組成之第三模組。在例示性TFcBA中，該第一模組為抗c-Met Fab且該第三模組為抗EGFR scFv。該TFc包含經由TFc連接子連接之兩個Fc區。在例示性TFcBA中，該第一Fc區包含全長IgG1/IgG4雜交鉸鏈區、IgG4 CH2結構域及IgG1 CH3結構域，且該第二Fc區包含IgG4之核心及下游鉸鏈區(但不包含上游鉸鏈區)、IgG4 CH2結構域及IgG1 CH3結構域。在例示性TFcBA中，該CH3結構域包含一或多個締合增強性修飾(「AEM」)，該等修飾使兩個CH3結構域或兩個Fc區之間之締合增強。TFcBA亦可包含一或多個二硫鍵形成性修飾(「DiS」)，該等修飾引入半胱胺酸，從而允許兩個Fc區之間形成二硫鍵。

圖1B： TFc之結構的圖解，以胺基至羧基末端次序，其顯示：第一鉸鏈區、第一CH2結構域、第一CH3結構域、TFc連接子、第二鉸鏈區、第二CH2結構域及第二CH3結構域。該等結構域各自之例示性序列及結構域修飾顯示於以下圖解中。每個AEM或DiS中第一或第二CH3修飾之名稱係以在該修飾之名稱之後的括號指示，其中在「AEM」或「DiS」之後的第一個數字分別係指該AEM或DiS之模組編號，且第二個數字係指該兩個CH3結構域中之第一個或第二個。舉例而言，「AEM 1.1」係在取代「T366S/L368A/Y407V」之後指示，該等取代為AEM模組1中具有一對修飾之兩個CH3結構域之一中取代的組合。TFc可包含該等結構域中每一者之任何組合，其限制條件為，當該TFc之一個CH3結構域包含AEM及/或DiS兩種修飾之一時，另一CH3結構域包含該AEM及/或DiS之另一(亦即，相容性)修飾。舉例而言，若TFc之一個CH3結構域包含AEM 1.1，則另一CH3結構域包含AEM 1.2。「C-term.Cys」係指藉由用圖中所示者取代CH3結構域之最後三個aa，將C末端半胱胺酸添加至該CH3結構域的一種修飾。本圖及其他圖中之aa殘基編號係根據Kabat中EU索引的完整抗體重鏈中之編號。

圖2 ：野生型與變體鉸鏈區之aa序列的比對。一個位置處之虛線「-」表示在該位置處之aa與該圖之第一條線中之aa相同。A)全長(SEQ ID NO：4、18及19)或部分(SEQ ID NO：1、2、3、16、17、23及263-265)IgG1鉸鏈區之aa序列，其為野生型的(SEQ ID NO：1-4及23)或經修飾的(SEQ ID NO：16-19及263-265)。B)全長(SEQ ID NO：20、21及22)或部分(SEQ ID NO：1、13、14及24)IgG1/IgG4雜交鉸鏈區之aa序列，其為野生型的(SEQ ID NO：1、13、14、20及24)或經修飾的(SEQ ID NO：21及22)。C)全長野生型mIgG1鉸鏈區(SEQ ID NO：266)及雜交mIgG1/mIgG2A鉸鏈區(SEQ ID NO：267)之aa序列。D)全長野生型hIgG2鉸鏈區(SEQ ID NO：7)及經修飾hIgG2鉸鏈區(SEQ ID NO：268及269)之aa序列。E)全長野生型hIgA2鉸鏈區(SEQ ID NO：270)及經修飾hIgA2鉸鏈區(SEQ ID NO：271-273)之aa序列。

圖3 ：存在或不存在各種aa修飾之IgG1 CH3 aa序列的比對。每條線為不同CH3結構域之aa序列。一個位置處之虛線「-」表示在該位置處之aa與該圖之第一條線中之aa相同。CH3修飾係根據其模組來組織，例如AEM模組1。每個模組分成用兩個數字標記之兩組：例如，AEM模組1分成群組「AEM 11」及「AEM 12」，其中AEM 11表示對模組AEM 1之一個CH3結構域(結構域「1」)之修飾，且AEM 12表示對該模組之第二個CH3結構域(結構域「2」)之修飾。模組內之每條線表示具有該模組之修飾且存在或不存在其他修飾之CH3結構域。一個模組內之CH3 aa序列彼此不同，例如，存在或不存在羧基末端離胺酸及/或存在取代D356E及L358M。

圖4 ：例示性IgG1 Fc區之比對。每條線為不同Fc區之aa序列。一個位置處之虛線「-」表示在該位置處之aa與該圖之第一條線中之aa相同。每個Fc區包含鉸鏈區(第一個序列中之粗體)、CH2及CH3結構域(該CH3結構域在第一個序列中帶下劃線)。本圖中每個Fc之鉸鏈區、CH2及CH3序列的SEQ ID NO提供於表8中。Fc係成對組織的，其藉由線條與其他對分開，且其中每一對表示相容性Fc，亦即，可彼此締合形成Fc二聚體之Fc。

圖5 ：例示性IgG1/IgG4雜交Fc區之比對。每條線為不同Fc區之aa序列。一個位置處之虛線「-」表示在該位置處之aa與該圖之第一條線中之aa相同。每個Fc區包含鉸鏈區(第一個序列中之粗體)、CH2及CH3結構域(該CH3結構域在第一個序列中帶下劃線)。本圖中每個Fc之鉸鏈區、CH2及CH3序列的SEQ ID NO提供於表9中。Fc係成對組織的，其藉由線條與其他對分開，且其中每一對表示相容性Fc，亦即，可彼此締合形成Fc二聚體之Fc。

圖6 ：以下IgG1 TFc之aa序列：23(SEQ ID NO：171)；23A(SEQ ID NO：173)；23B(SEQ ID NO：175)；23C(SEQ ID NO：177)；23D(SEQ ID NO：179)；23E(SEQ ID NO：181)；23F(SEQ ID NO：183)；23E(35L)(SEQ ID NO：185)；23E(35L反向)(SEQ ID NO：187)；23E(30L)(SEQ ID NO：189)；23E(25L)(SEQ ID NO：191)；23I(SEQ ID NO：193)：及23J(SEQ ID NO：195)。該等序列各自由以下結構域組成(以胺基至羧基末端次序)：第一IgG1鉸鏈區(雙下劃線)、IgG1 CH2結構域、IgG1 CH3結構域(下劃線)、(G4S)n連接子(斜體)、第二IgG1鉸鏈區(雙下劃線，且僅由核心及下游鉸鏈區組成)、第二IgG1 CH2結構域及第二IgG1 CH3結構域(下劃線)。該等分子各自之特定aa改變係以粗體顯示，且在該序列上方命名。

圖7 ：以下IgG1/IgG4雜交TFc之aa序列：39(SEQ ID NO：197)；39A(SEQ ID NO：199)；39B(SEQ ID NO：201)；39C(SEQ ID NO：203)；39D(SEQ ID NO：205)；39E(SEQ ID NO：207)；39F(SEQ ID NO：209)；39E(35L)(SEQ ID NO：211)；39 E(35L反向)(SEQ ID NO：213)；39E(30L)(SEQ ID NO：215)；39E(25L)(SEQ ID NO：217)；39I(SEQ ID NO：219)；39J(SEQ ID NO：221)。該等序列各自由以下結構域組成(以胺基至羧基末端次序)：由IgG1上游鉸鏈區以及IgG4核心及下游鉸鏈區組成之第一IgG1/IgG4雜交鉸鏈區(雙下劃線)、IgG4 CH2結構域、IgG1 CH3結構域(下劃線)、(G4S)n連接子(斜體)、第二IgG4鉸鏈區(雙下劃線，且僅有核心及下游鉸鏈區組成)、第二IgG4 CH2結構域及第二IgG1 CH3結構域(下劃線)。IgG1序列係大寫字母且IgG4序列係小寫字母。該等分子各自之特定aa改變係以粗體顯示，且在該序列上方命名。

圖8 ：在4-12% SDS-PAGE凝膠上於A)非還原或B)還原條件下分離的TFc 23A、23B、23D、23E、39B及39G之樣品。泳道1之分子量標記物(Biorad Precision Plus Marker)之分子量(以千道爾頓單位)顯示於凝膠之左側上。

圖9 ：以下例示性抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的aa序列：包含人類化5D5 VH結構域及抗EGFR scFv之TFcBA，該scFv包含以下之VH及VL結構域的aa序列：A)、B)、C)、D)、E)、L)及M)帕尼單抗(panimumumab)(SEQ ID NO：235)；F)2224(SEQ ID NO：239)；G)西妥昔單抗H1L1(SEQ ID NO：260)；H)西妥昔單抗H1L2(SEQ ID NO：281)；I)西妥昔單抗H2L1(SEQ ID NO：283)；及J)西妥昔單抗H2L2(SEQ ID NO：285)。K)包含抗c-Met結合位點2之VH結構域及人類化抗EGFR西妥昔單抗scFv H1L1的抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈之aa序列。出於人類化目的引入西妥昔單抗VH結構域中的aa係以小寫字母指示。抗c-Met Fab之CDR以帶虛線之下劃線指示。CH1結構域係以帶波形線之下劃線指示。鉸鏈區帶雙下劃線。TFc連接子係以斜體指示。CH3結構域係以下劃線指示。CH3結構域中之AEM及DiS修飾係以粗體指示。scFv連接子係以斜體及下劃線指示。連接性連接子係以斜體及雙下劃線指示。

圖10 ：編碼圖中及說明書中所陳述之aa序列的核苷酸序列。

圖11： 實例1及2中所使用之TFc的核苷酸及aa序列。該等aa序列各自由以下結構域組成(以胺基至羧基末端次序)：信號肽(帶下劃線及粗體)、第一IgG1鉸鏈區(雙下劃線)、IgG1 CH2結構域、IgG1 CH3結構域(下劃線)、TFc連接子(斜體)、第二IgG1鉸鏈區(雙下劃線，且僅由核心及下游鉸鏈區組成)、第二IgG1 CH2結構域及第二IgG1 CH3結構域(下劃線)。IgG1 aa係以大寫字母表示且IgG4係以小寫字母表示。該等分子各自之特定aa改變，例如AEM及DiS修飾，係以粗體顯示，且在該序列上方命名。

圖12A： 奧妥珠單抗(onartuzumab)(OTZM)單株細胞株之選擇：泳道1=尺寸標準品；泳道2-12 ；2=OTZM泳道1，3=OTZM泳道2，4=OTZM泳道3，5=OTZM泳道4，6=OTZM泳道5，7=OTZM泳道6，8=OTZM泳道7，9=OTZM泳道8，10=OTZM泳道9，11=OTZM泳道10，12=OTZM泳道11。

圖12B： 奧妥珠單抗(OTZM)單株細胞株之選擇：泳道1=尺寸標準品；泳道2-9 ；2=OTZM泳道12，3=OTZM泳道13，4=OTZM泳道14，5=OTZM泳道15，6=OTZM泳道16，7=OTZM泳道17，8=OTZM泳道18，9=OTZM泳道19。

圖13A： 帶電之糖基化突變體的非還原性SDS-PAGE：泳道1=尺寸標準品，泳道2-8 ；2=glyco分子量，3=glyco 1，4=glyco 2，5=glyco 3，6=glyco 4，7=glyco 5，8=glyco 6。

圖13B： 帶電之糖基化突變體的還原性SDS-PAGE：泳道1=尺寸標準品，泳道2-8 ；2=glyco分子量，3=glyco 1，4=glyco 2，5=glyco 3，6=glyco 4，7=glyco 5，8=glyco 6。

圖14 ：例示性TFcBA之核苷酸及aa序列。

圖15 ：顯示與TFcBA之cMet-Fc及EGFR-his之結合的曲線圖，該等TFcBA包含39E糖型4主鏈、奧妥珠單抗以及2224或帕尼單抗。

圖16： 顯示TFc對pMet之抑制作用的曲線圖，該TFc包含奧妥珠單抗及各種主鏈，包括23、23E、39、39E糖型4主鏈，且圖中包括了包含39E糖型4主鏈及2224、西妥昔單抗或帕尼單抗之TFcBA。

圖17： 表23中所陳述之例示性TFcBA之糖基化突變體的核苷酸及aa序列。

圖A1： 例示性抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體(「TFcBA」)之圖解。在一個實施例中，CH2結構域可包含靜電互補性區。

圖A2： 顯示抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#1-Ab#13之結構特徵的表。

圖A3： 抗體OA-5D5(IgG)之變體的SDS凝膠。

圖A4： 抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#5、Ab#7及Ab#13之SDS凝膠。

圖A5： 用抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#5、Ab#7及Ab#13獲得的雙特異性結合分析資料。

圖A6： 藉由與單價抗c-Met抗體(OA-5D5)、二價抗c-Met抗體HGF或僅培養基對照培育所誘導的Met磷酸化之比較。

圖A7： 藉由將A549細胞與單價抗c-Met抗體(OA-5D5)、二價抗c-Met抗體HGF、抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#5、Ab#7或Ab#13，或僅培養基對照一起培育所誘導之Met磷酸化的比較。

圖A8A： 藉由將A549細胞與HGF、胎牛血清(FBS)及抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#5、Ab#7或Ab#13一起培育所誘導之增殖的比較。

圖A8B： 藉由將A441細胞與HGF、胎牛血清(FBS)及抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#5、Ab#7或Ab#13一起培育所誘導之增殖的比較。

圖A8C： 藉由將HCC827細胞與HGF、胎牛血清(FBS)及抗c-Met/ 抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#5、Ab#7或Ab#13一起培育所誘導之增殖的比較。

圖A9： 在A549細胞及NCI-H2170細胞中單價抗c-Met抗體OA-5D5與抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#5、Ab#7及Ab#13對HGF誘導之磷酸化之抑制作用的比較。

圖A10： 在U-87 MG細胞及H441細胞中單價抗c-Met抗體OA-5D5與抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#5對HGF誘導之增殖之抑制作用的比較。

圖A11： 在A549細胞及H441細胞中單價抗c-Met抗體OA-5D5與抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#7對HGF誘導之增殖之抑制作用的比較。

圖A12： 在A549細胞及H2170細胞中抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體AB#5引起cMet含量下調，而非單價抗c-Met抗體OA-5D5則不然。

圖A13A： 鼠類藥物動力學-抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#5之終末半衰期。

圖A13B： 鼠類藥物動力學-抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#7之終末半衰期。

圖A13C： 鼠類藥物動力學-抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#13之終末半衰期。

圖A14： 抗c-Met/抗EpCam串聯Fc雙特異性抗體Ab#7降低裸小鼠中U87 MG細胞異種移植腫瘤生長且引起腫瘤消退，而單價抗c-Met抗體OA-5D則不然。

圖A15為顯示如藉由植入後腫瘤體積所量測的抗體針對植入裸小鼠中之U-87 MG腫瘤之活性的劑量-反應分析之結果的曲線圖。U-87 MG腫瘤係經皮下植入且該小鼠每週用PBS對照或者1 mg/kg、4mg/kg、12mg/kg或24mg/kg之Ab#7處理。結果顯示，AB#7以一種劑量反應相關之方式引起腫瘤體積減小：Ab#7劑量增加引起腫瘤體積減小之程度增加。

圖A16為顯示由腫瘤細胞分泌之HGF之定量結果的柱形圖。HGF係在來自U-87 MG細胞、NCI-H358細胞(「親本」)、偽轉染之NCI-H358細胞及經HGF轉染之NCI-H358細胞之上清液中量測且針對總蛋白質校正。

圖A17為顯示如藉由植入後腫瘤體積所量測的抗體針對植入裸小鼠中之HGF配位體依賴性HCC827-HGF腫瘤之活性的劑量-反應分析之結果的曲線圖。腫瘤生長後，小鼠每週用PBS對照；1mg/kg、4mg/kg、12mg/kg(與10mg/kg OA-5D5等莫耳數)或25mg/kg之Ab#7；或10mg/kg OA-5D5處理。結果顯示，Ab#7引起之腫瘤體積減小程度大於等莫耳量之OA-5D5。

圖A18為顯示如藉由植入後腫瘤體積所量測的抗體針對植入裸小鼠中之HGF配位體依賴性H358-HGF腫瘤之活性之結果的曲線圖。腫瘤生長後，小鼠每週用PBS對照、12mg/kg(與10mg/kg OA-5D5等莫耳數)之Ab#7；或10mg/kg OA-5D5處理。結果顯示，Ab#7引起之腫瘤體積減小程度大於等莫耳量之OA-5D5。

圖19提供五個曲線圖，顯示了對在用雙特異性抗體處理後細胞溶解產物中c-Met及EpCAM之降解進行免疫墨點分析之後的蛋白質定量。蛋白質係在用單獨培養基、200nM OA-5D5及200nM Ab#7處理之細胞中量測的。圖A19A顯示了A549細胞中c-Met之定量；在本實驗中EpCAM在此細胞中不可偵測。圖A19B顯示了NCI-H441細胞中c-Met之定量，且A19D顯示了NCI-H441細胞中EpCAM之定量。圖A19C顯示了NCI-H2170細胞中c-Met之定量，且A19E顯示了NCI-H2170細胞中EpCAM之定量。結果顯示，Ab#7誘導NCI-H441及NCI-H2170細胞中而非A549細胞中總c-Met降解，而OA-5D5則不然，同時該等抗體皆不誘導該等細胞株之任一者中EPCAM含量之降低。

序列之簡要說明

本文提及且列於序列表中之胺基酸(「aa」)序列標識如下。

SEQ ID NO：1、2及3分別為野生型IgG1上游、中間(或核心)及下游鉸鏈區之aa序列(參看表2)。

SEQ ID NO：4為完整野生型IgG1鉸鏈區之aa序列，由SEQ ID NO：1、2及3按胺基至羧基末端次序之連續序列組成(參看表2)。

SEQ ID NO：5及6分別為野生型IgG2上游及下游鉸鏈區之aa序列(參看表2)。IgG2中間鉸鏈區與IgG1相同，亦即，SEQ ID NO：2。

SEQ ID NO：7為完整野生型IgG2鉸鏈區之aa序列，由SEQ ID NO：5、2及6按胺基至羧基末端次序之連續序列組成(參看表2)。

SEQ ID NO：8、9及10分別為野生型IgG3上游、中間及下游鉸鏈區之aa序列(參看表2)。

SEQ ID NO：11為完整野生型IgG3鉸鏈區之aa序列，由SEQ ID NO：8、9及10按胺基至羧基末端次序之連續序列組成(參看表2)。

SEQ ID NO：12、13及14分別為IgG4上游、中間及下游鉸鏈區之aa序列(參看表2)。

SEQ ID NO：15為全長IgG4鉸鏈區之aa序列，由SEQ ID NO：12、13及14按胺基至羧基末端次序之連續序列組成(參看表2)。

SEQ ID NO：16為包含aa取代H224C及T225C之IgG1上游鉸鏈區(SEQ ID NO：1)的aa序列(參看表4及圖2)。

SEQ ID NO：17為包含aa取代T223C之IgG1上游鉸鏈區(SEQ ID NO：1)的aa序列(參看表4及圖2)。

SEQ ID NO：18為包含aa取代H224C及T225C之全長IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO：4)的aa序列(參看表4及圖2)。

SEQ ID NO：19為包含aa取代T223C之全長IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO：4)的aa序列(參看表4及圖2)。

SEQ ID NO：20為全長雜交IgG1/IgG4鉸鏈區之aa序列，其由IgG1之上游鉸鏈區(SEQ ID NO：1)以及IgG4之中間及下游鉸鏈區(分別為SEQ ID NO：13及14；參看表4及圖2)組成。

SEQ ID NO：21為全長雜交IgG1/IgG4鉸鏈區之aa序列，其由包含aa取代H224C及T225C之IgG1之上游鉸鏈區(SEQ ID NO：16)以及IgG4之中間及下游鉸鏈區(分別為SEQ ID NO：13及14；參看表4及圖2)組成。

SEQ ID NO：22為全長雜交IgG1/IgG4鉸鏈區之aa序列，其由包含aa取代T223C之IgG1之上游鉸鏈區(SEQ ID NO：17)以及IgG4之中間及下游鉸鏈區(分別為SEQ ID NO：13及14；參看表4及圖2)組成。

SEQ ID NO：23為包含中間及下游IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO：2及3)但不包含上游鉸鏈區之部分IgG1鉸鏈區的aa序列(參看表4及圖2)。

SEQ ID NO：24為包含中間及下游IgG4鉸鏈區(SEQ ID NO：13及14)但不包含上游鉸鏈區之部分IgG4鉸鏈區的aa序列(參看表4及圖2)。

SEQ ID NO：25為在aa 297處具有減少糖基化之aa取代N297Q的全長IgG1 CH2結構域之aa序列。

SEQ ID NO：26為在aa 297處具有減少糖基化之aa取代T299K的全長野生型IgG4 CH2結構域之aa序列。

SEQ ID NO：27為全長野生型人類IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：28為具有SEQ ID NO：27但缺乏C末端離胺酸之野生型 IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：29為具有SEQ ID NO：27且具有取代D356E及L358M的IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：30為具有SEQ ID NO：29且缺乏C末端離胺酸之IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：31為具有SEQ ID NO：27且具有取代T366S、L368A及Y470V從而產生「空穴」(締合增強性修飾或「AEM」1.1)的IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：32為具有SEQ ID NO：31且缺乏C末端離胺酸之IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：33為具有SEQ ID NO：29且具有取代T366S、L368A及Y470V從而產生「空穴」(AEM 1.1)的IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：34為具有SEQ ID NO：33且缺乏C末端離胺酸之IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：35為具有SEQ ID NO：27且具有取代T366W從而產生「凸起」或「突出」(AEM 1.2)的IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：36為具有SEQ ID NO：35且缺乏C末端離胺酸之IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：37為具有SEQ ID NO：29且具有取代T366W從而產生「凸起」或「突出」(AEM 1.2)的IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：38為具有SEQ ID NO：37且缺乏C末端離胺酸之IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：39-98為相對於具有SEQ ID NO：27、28、29或30 之IgG1 CH3，具有一或多個AEM及/或二硫鍵形成性(「DiS」)修飾的IgG1 CH3結構域之aa序列(參看表6及圖3)。

SEQ ID NO：99-132為以連續胺基至羧基末端次序包含以下各物之例示性IgG1 Fc區的aa序列：(a)選自由IgG1鉸鏈區、包含一或多個aa取代之IgG1鉸鏈區及部分IgG1鉸鏈區組成之群的鉸鏈區；(b)具有N297Q之IgG1 CH2結構域(SEQ ID NO：25)；及(c)選自由SEQ ID NO：29及包含一或多個AEM及/或DiS修飾之SEQ ID NO：29組成之群的IgG1 CH3結構域(圖4)。鉸鏈區、CH2及CH3結構域係在無插入序列情況下共價連接。SEQ ID NO：99-132之每一結構域的SEQ ID NO陳述於表8中。

SEQ ID NO：133-166為以連續胺基至羧基末端次序包含以下各物之例示性IgG1/IgG4雜交Fc區的aa序列：(a)選自由IgG1/IgG4雜交鉸鏈區、包含一或多個aa取代之IgG1/IgG4雜交鉸鏈區及部分IgG4鉸鏈區組成之群的鉸鏈區；(b)具有T299K之IgG4 CH2結構域(SEQ ID NO：26)；及(c)選自由SEQ ID NO：29及包含一或多個AEM及/或DiS修飾之SEQ ID NO：29組成之群的IgG1 CH3結構域。鉸鏈區、CH2及CH3結構域係在無插入序列情況下共價連接。SEQ ID NO：133-166之每一結構域的SEQ ID NO陳述於表9中。

SEQ ID NO：167為KSCDKT，其為引入了半胱胺酸之IgG1 CH3結構域的例示性經修飾羧基末端部分。

SEQ ID NO：168為GEC，其為引入了半胱胺酸之IgG1 CH3結構域的例示性經修飾羧基末端部分。

SEQ ID NO：169為例示性非Gly-Ser TFc連接子之aa序列。

SEQ ID NO：170-195為例示性IgG1 TFc之核苷酸序列(偶數)及aa序列(奇數)，其陳述於圖6中。構成該等IgG1 TFc中每一者之結構域的SEQ ID NO陳述於表12中。

SEQ ID NO：196-221為包含雜交IgG1/IgG4 Fc區之例示性TFc之核苷酸序列(偶數)及aa序列(奇數)，其陳述於圖7中。構成該等雜交TFc中每一者之結構域的SEQ ID NO陳述於表13中。

SEQ ID NO：222-223分別為不含信號肽之抗c-Met Ab 5D5之重鏈Fab結構域的核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：224-225分別為包含抗c-Met 5D5 VH結構域、IgG1 TFc(具有AEM 1)及帕尼單抗scFv之IgG1 TFcBA之重鏈的核苷酸及aa序列(圖9)。

SEQ ID NO：226-227分別為包含抗c-Met 5D5 VH結構域、IgG1/IgG4雜交TFc(具有AEM 1)及帕尼單抗scFv之IgG1/IgG4雜交TFcBA之重鏈的核苷酸及aa序列(圖9)。

SEQ ID NO：228-229分別為包含抗c-Met 5D5 VH結構域、IgG1/IgG4雜交TFc(具有AEM 1)及帕尼單抗scFv之IgG1/IgG4雜交TFcBA之重鏈的核苷酸及aa序列(圖9)。

SEQ ID NO：230及231分別為與例如包含人類化5D5抗c-Met VH結構域之重鏈(例如，包含SEQ ID NO：225、227、229、244或343之重鏈)一起使用的包含人類化5D5抗c-Met VL結構域及CL結構域之輕鏈的核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：232及233為包含帕尼單抗(VECTIBIX)之可變區之抗EGFR scFv的核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：234及235分別為抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的核苷酸及aa序列(分別示於圖9及10中)，該TFcBA包含(a)來自人類化5D5之抗c-Met可變結構域；(b)具有AEM 1及DiS 2之TFc(SEQ ID NO：181)；及(c)包含帕尼單抗(VECTIBIX)之可變區之抗EGFR scFv(SEQ ID NO：233)。

SEQ ID NO：236及237分別為包含Ab 2224之可變區之抗 EGFR scFv的核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：238及239分別為抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的核苷酸及aa序列(分別示於圖9及10中)，該TFcBA包含(a)來自人類化5D5之抗c-Met可變結構域；(b)具有AEM 1及DiS 2之TFc(SEQ ID NO：181)；及(c)包含Ab 2224之可變區之抗EGFR scFv(SEQ ID NO：237)。

SEQ ID NO：240及241分別為例示性信號肽之核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：242及243分別為例示性信號肽之核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：244及245分別為含具有SEQ ID NO：241之信號肽的5D5之抗c-Met VH結構域及CL結構域之核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：246及247為含具有SEQ ID NO：243之信號肽的具有SEQ ID NO：231之輕鏈之核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：248-254為本說明書中所描述之變體鉸鏈區之aa序列。

SEQ ID NO：255及256分別為具有由SEQ ID NO：241組成之信號肽且顯示於實例3中之抗c-Met結合位點2之重鏈Fab區(SEQ ID NO：287)的核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：257及258分別為包含人類化西妥昔單抗H1L1之可變區之抗EGFR scFv的核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：259及260分別為抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的核苷酸及aa序列(示於圖9及10中)，該TFcBA包含(a)來自人類化5D5之抗c-Met可變結構域；(b)具有AEM 1及DiS 2之TFc(SEQ ID NO：181)；及(c)包含人類化西妥昔單抗H1L1之可變區之抗EGFR scFv(SEQ ID NO：258)。

SEQ ID NO：261為全長野生型IgG1 CH2結構域之aa序列。

SEQ ID NO：262為全長野生型IgG4 CH2結構域之aa序列。

SEQ ID NO：263、264及265為變體hIgG1鉸鏈區之aa序列(圖2)。

SEQ ID NO：266為野生型小鼠IgG1鉸鏈區之aa序列(圖2)。

SEQ ID NO：267為小鼠IgG1/IgG2A雜交鉸鏈區之aa序列(圖2)。

SEQ ID NO：268及269為變體hIgG2鉸鏈區之aa序列(圖2)。

SEQ ID NO：270為野生型hIgA2鉸鏈區之aa序列(圖2)。

SEQ ID NO：271-273為變體hIgA2鉸鏈區之aa序列(圖2)。

SEQ ID NO：274-279為包含人類化西妥昔單抗Ab H1L2、H2L1及H2L2(其描述於實例3中)之可變結構域之scFv的核苷酸(偶數)及aa(奇數)序列。

SEQ ID NO：280-285為抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的核苷酸(偶數)及aa(奇數)序列，該TFcBA包含(a)來自人類化5D5之抗c-Met可變結構域；(b)包含人類化西妥昔單抗Ab H1L2、H2L1及H2L2(分別為SEQ ID NO：275、277或279)之可變區的抗EGFR scFv；及(c)具有AEM 1及DiS 2之TFc(SEQ ID NO：181)(圖9)。

SEQ ID NO：286及287分別為抗c-Met結合位點2(描述於實例3中)之重鏈Fab結構域的核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：288及289分別為抗c-Met結合位點2(描述於實例3中)之輕鏈Fab結構域的核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：290及291分別為抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的核苷酸及aa序列(示於圖9及10中)，該TFcBA包含(a)來自抗c-Met結合位點2之抗c-Met重鏈Fab結構域(SEQ ID NO：287)；(b)具有AEM 1及DiS 2之TFc(SEQ ID NO：181)；及(c)包含人類化西妥昔單抗H1L1之可變區之抗EGFR scFv(SEQ ID NO：258)(圖9)。SEQ ID NO：291之aa序列與具有SEQ ID NO：260之序列相同，其中該抗c-Met結合結構域已經抗c-Met結合位點2之結合結構域置換。

SEQ ID NO：292-341為實例1及2中所使用且示於圖11中之TFc的核苷酸(偶數)及aa(奇數)序列。

SEQ ID NO：342及343分別為包含抗c-Met 5D5 VH結構域、IgG1 TFc(具有AEM 1及DiS反向)及帕尼單抗scFv之IgG1 TFcBA之重鏈的核苷酸及aa序列(圖9)。

SEQ ID NO：344及345分別為具有由SEQ ID NO：243組成之信號肽且顯示於實例3中之抗c-Met結合位點2之輕鏈(SEQ ID NO：289)的核苷酸及aa序列。

SEQ ID NO：346及347分別為具有人類化5D5抗c-Met以及抗EGFR帕尼單抗scFv及IgG1 TFc(具有AEM 1及具有SEQ ID NO：169之40個aa之TFc連接子)的抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的核苷酸及aa序列(圖9)。

SEQ ID NO：348及349分別為具有人類化5D5抗c-Met以及抗EGFR帕尼單抗scFv及IgG1/IgG4雜交TFc(具有AEM 1及具有SEQ ID NO：169之40個aa之TFc連接子)的抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的核苷酸及aa序列(圖9)。

SEQ ID NO：350為包含抗RON重鏈Fab結構域、抗EGFR scFv 2224及TFc 23E(SEQ ID NO：303)之抗RON/抗EGFR TFcBA之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：351為包含抗RON重鏈Fab結構域、抗EGFR scFv 2224及TFc 39Egy4(39E糖型4)(SEQ ID NO：394)之抗RON/抗EGFR TFcBA之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：352為包含抗RON重鏈Fab結構域、抗CEA scFv及Tfc 23E(SEQ ID NO：303)之抗RON/抗CEA TFcBA之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：353為包含抗RON重鏈Fab結構域、抗CEA scFv及TFc 39Egy4(SEQ ID NO：394)之抗RON/抗CEA TFcBA之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：354為包含抗CEA重鏈Fab結構域、抗cMet scFv及TFc 23E(SEQ ID NO：303)之抗CEA/抗cMet TFcBA之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：355為包含抗CEA重鏈Fab結構域、抗RON scFv及TFc 23E(SEQ ID NO：303)之抗CEA/抗RON TFcBA之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：356為包含抗CEA重鏈Fab結構域、抗cMet scFv及TFc 39Egy4(SEQ ID NO：394)之抗CEA/抗scMet TFcBA之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO 357-358為TFc野生型CH2序列之aa序列及核苷酸序列；且CH3結構域中T366S/L368A/Y407V/CH3 C末端半胱胺酸KSCDKT：：T366W/CH3 C末端半胱胺酸GEC；圖17。

SEQ ID NO：359為包含抗cMet重鏈Fab結構域、抗CEA scFv及TFc 23E(SEQ ID NO：303)之抗cMet/抗CEA TFcBA之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：360為包含抗cMet重鏈Fab結構域、抗CEA scFv及TFc 39Egy4(SEQ ID NO：394)之抗cMet/抗CEA TFcBA之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：361為包含抗cMet重鏈Fab、抗CD44 scFv及TFc 39Egy4(SEQ ID NO：394)之抗cMet/抗CEA CD44之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：362為包含抗cMet重鏈Fab結構域、抗CD44 scFv及TFc 23E(SEQ ID NO：303)之抗cMet/抗CEA CD44之重鏈的 aa序列；圖14。

SEQ ID NO：363為包含抗cMet重鏈Fab結構域、抗CD44 scFv及TFc 23E(SEQ ID NO：303)之抗cMet/抗CEA CD44之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：364為包含抗cMet重鏈Fab結構域、抗CD44 scFv及TFc 39Egy4(SEQ ID NO：394)之抗cMet/抗CEA CD44之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：365為包含抗CD44重鏈Fab結構域、抗cMet scFv及TFc 23E(SEQ ID NO：303)之抗CD44/抗cMet之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：366為包含抗CD44重鏈Fab結構域、抗cMet scFv及TFc 39Egy4(SEQ ID NO：394)之抗CD44/抗cMet之重鏈的aa序列；圖14。

SEQ ID NO：367為抗CD44 ARH60-16-2輕鏈之aa序列。

SEQ ID NO 368-369為抗cMet抗體奧妥珠單抗及TFc 23輕鏈之aa序列及核苷酸序列；圖14。

SEQ ID NO 370-371為抗cMet抗體奧妥珠單抗及TFc 39重鏈之aa序列及核苷酸序列；圖14。

SEQ ID NO 372-373為抗cMet抗體奧妥珠單抗及TFc 23E重鏈之aa序列及核苷酸序列；圖14。

SEQ ID NO 374-375為抗cMet抗體奧妥珠單抗及TFc 39Egy4重鏈之aa序列及核苷酸序列；圖14。

SEQ ID NO 376-377為包含抗cMet重鏈Fab結構域、西妥昔單抗抗EGFR scFv及TFc 23E(SEQ ID NO：303)之抗cMet/抗EGFR的aa序列及核苷酸序列；圖14。

SEQ ID NO 378-379為包含抗cMet重鏈Fab結構域、帕尼單抗抗EGFR scFv及TFc 23E(SEQ ID NO：303)之抗cMet/抗EGFR的aa序列及核苷酸序列；圖14。

SEQ ID NO 380-381為包含抗cMet重鏈Fab結構域、2224抗EGFR scFv及TFc 23E(SEQ ID NO：303)之抗cMet/抗EGFR的aa序列及核苷酸序列；圖14。

SEQ ID NO 382-383為包含抗cMet重鏈Fab結構域、西妥昔單抗抗EGFR scFv及TFc 39Egy4(SEQ ID NO：394)之抗cMet/抗EGFR的aa序列及核苷酸序列；圖14。

SEQ ID NO 384-385為包含抗cMet重鏈Fab結構域、帕尼單抗抗EGFR scFv及TFc 39Egy4(SEQ ID NO：394)之抗cMet/抗EGFR的aa序列及核苷酸序列；圖14。

SEQ ID NO 386-387為包含抗cMet重鏈Fab結構域、2224抗EGFR scFv及TFc 39Egy4(SEQ ID NO：394)之抗cMet/抗EGFR的aa序列及核苷酸序列；圖14。

對於圖17中所揭示之序列，雙下劃線為鉸鏈區，單下劃線為CH3結構域，第二雙下劃線為第二鉸鏈區，第二下劃線為第二CH3。

SEQ ID NO 388-389為糖基化突變體1之aa序列及核苷酸序列，該糖基化突變體包含CH2結構域中之N297D/T299S：：N297D/T299S胺基酸變化(帶下劃線，粗體)，及CH3結構域中之T366S/L368A/Y407V/CH3 C末端半胱胺酸KSCDKT：：T366W/CH3 C末端半胱胺酸GEC；圖17SEQ ID NO 390-391為糖基化突變體2之aa序列及核苷酸序列，該糖基化突變體2包含CH2結構域中之T299K：：N297D/T299S胺基酸變化(帶下劃線，粗體)，及CH3結構域中之T366S/L368A/Y407V/CH3 C末端半胱胺酸KSCDKT：：T366W/CH3 C末端半胱胺酸GEC；圖17。

SEQ ID NO 392-393為糖基化突變體3之aa序列及核苷酸序列，該突變體3包含CH2結構域中之N297D/T299S：：T299K胺基酸變化(帶下劃線，粗體)，及CH3結構域中之T366S/L368A/Y407V/CH3 C末端半胱胺酸KSCDKT：：T366W/CH3 C末端半胱胺酸GEC；圖17。

SEQ ID NO 394-395為糖基化突變體4之aa序列及核苷酸序列，該突變體4包含CH2結構域中之T299K：：T299D胺基酸變化(帶下劃線，粗體)，及CH3結構域中之T366S/L368A/Y407V/CH3 C末端半胱胺酸KSCDKT：：T366W/CH3 C末端半胱胺酸GEC；圖17。

SEQ ID NO 396-397為糖基化突變體5之aa序列及核苷酸序列，該突變體5包含CH2結構域中之T299D：：T299K胺基酸變化(帶下劃線，粗體)，及CH3結構域中之T366S/L368A/Y407V/CH3 C末端半胱胺酸KSCDKT：：T366W/CH3 C末端半胱胺酸GEC；圖17。

SEQ ID NO 398-399為糖基化突變體6之aa序列及核苷酸序列，該突變體6包含CH2結構域中之T299D：：T299D胺基酸變化(帶下劃線，粗體)，及CH3結構域中之T366S/L368A/Y407V/CH3 C末端半胱胺酸KSCDKT：：T366W/CH3 C末端半胱胺酸GEC；圖17。

SEQ ID NO 400-489描述於下文。

本文提供串聯Fc抗體(「TFcA」)，例如串聯Fc雙特異性抗體(「TFcBA」)。該等分子可用於治療細胞增殖性病症，例如癌症。

定義

為便利起見，本說明書、實例及所附申請專利範圍中所用某些術語及短語之含義提供於下。

「aa修飾」或「aa變化」係指對於胺基酸(aa)序列之一或多個aa缺失、添加或取代。Aa序列插入包括長度在一個殘基至含有數百或更多個殘基之多肽範圍內的胺基末端及/或羧基末端融合，以及單個或多個aa殘基之序列內插入。序列內插入一般可在約1個至10個殘基 (例如1至5，例如1至3)範圍內。

「AEM」或「締合增強性修飾」係指對CH3結構域造成的可使其與另一CH3結構域之締合增強的aa修飾。AEM可在TFc之一個或兩個Fc中包含一或多個aa取代、缺失或添加。AEM係以模組分類，例如模組1(「AEM 1」)，其中對兩個CH3結構域之一的修飾稱為AEM 1.1，且對另一CH3結構域之修飾稱為AEM 1.2。舉例而言，AEM 1.1由取代T366S/L368A及Y407V之組合組成，且AEM 1.2由aa取代T366W組成。當一個CH3結構域包含兩個或兩個以上aa修飾(例如aa取代)時，該等修飾藉由「/」彼此隔開。當提及兩個CH3結構域中之修飾時，每一CH3結構域中之修飾係以「：：」隔開。

「抗c-Met結合位點」係指特異性結合至人類c-Met之結合位點。

「抗EGFR結合位點」係指特異性結合至人類EGFR之結合位點。

「抗原結合位點」係指包含抗體之VH及/或VL結構域，或其至少一個CDR之結合位點，只要該抗原結合位點特異性結合至其靶抗原即可。舉例而言，抗原結合位點可包含單獨VHCDR3或VHCDR3與VHCDR2及視情況使用之VHCDR1，基本上由其組成或由其組成。在某些實施例中，抗原結合位點包含VH結構域及VL結構域，其可存在於相同多肽上或兩個不同多肽上，例如VH結構域存在於重鏈上且VL結構域存在於輕鏈上。

抗體之「抗原結合部分」係指抗體中保持特異性結合至抗原(例如c-met或EGFR)之能力的一或多個片段。經顯示，全長抗體之片段可保持抗體之抗原結合功能。術語抗體之「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段的實例包括(i)Fab片段，一種由 VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')₂ 片段，一種包含在鉸鏈區處藉由二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單一臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；(v)dAb片段，其由VH結構域組成；以及(vi)分離之互補決定區(「CDR」)。此外，儘管VL及VH為Fv片段之兩個結構域，但VL及VH係由單獨基因編碼，其可使用重組方法，藉由合成連接子接合，該合成連接子使其成為單一蛋白質鏈，其中VL區與VH區配對形成單價蛋白質，稱為單鏈Fv(scFv)(參看例如美國專利第5,892,019號)。預期此等單鏈抗體亦涵蓋於術語抗體之「抗原結合片段」內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL結構域係在單一多肽鏈上表現，但使用的連接子太短而無法使同一鏈上之兩個結構域之間配對，由此迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點。

「結合親和力」係指結合相互作用之強度且包括實際結合親和力以及表觀結合親和力。實際結合親和力為締合速率與解離速率之比率。表觀親和力可包括例如由多價相互作用產生之親合力。解離常數(Kd)通常為結合親和力之倒數，且可便利地使用表面電漿子共振分析法(例如，如使用ForteBio® Octet®平台(Pall ForteBio Corp.)或BIACORE 3000儀器(GE Healthcare)，例如使用重組c-Met作為分析物且抗c-Met抗體作為配位體所測定)或細胞結合分析法來量測，該等分析法之實例描述於美國專利第7,846,440號之實例3中。

「結合部分」、「結合結構域」或「結合位點」係指結合多肽，或當具體指明時其重鏈或輕鏈中直接涉及介導抗體與靶分子(亦即，抗原)之特異性結合的部分、區域或位點。例示性結合結構域包括抗原結合位點、配位體之受體結合結構域、受體之配位體結合結構域或酶結構域。在較佳實施例中，結合結構域包含抗原結合位點(例如，包含置放於替代性構架區(例如，視情況包含一或多個aa取代之人類構架區)中的來自抗體之可變重(VH)鏈序列及可變輕(VL)鏈序列或六個CDR)或由其組成。在某些實施例中，結合位點可基本上僅由VH或VL鏈序列構成。結合位點可完全來自一個物種，例如其僅具有來源於一個物種之生殖系序列的序列。舉例而言，結合位點可為人類(亦即，來源於人類物種)、小鼠或大鼠的。結合位點亦可為人類化的，亦即，CDR係來自一個物種且構架(FR)係來自另一物種。舉例而言，結合位點可具有來源於小鼠抗體之CDR及來自人類物種之FR。某些人類化結合位點在一或多個CDR中包含突變以使該等CDR看起來更類似供體抗體之CDR。某些人類化抗體亦可在一或多個FR中包含突變。一般而言，結合位點中之突變可增強結合位點與其靶抗原之結合親和力，及/或其可使結合位點穩定，例如以延長其半衰期。

術語「CDR」或「互補決定區」係指重鏈多肽與輕鏈多肽之可變區內可見之非相鄰抗原組合位點。該等特定區域已描述於Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)，及Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest.(1991)，以及Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)及MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)中，其中當彼此相比較時，該等定義包括aa殘基之重疊或亞組。涵蓋如以上引用之每一參考文獻所定義之CDR的aa殘基係出於比較而陳述。如本文所使用且若未另作具體說明，則「CDR」係如Kabat所定義。當在本文之較大序列內描述CDR(例如VH或VL CDR)時，其始終以N末端至C末端次序佈置為CDR1、CDR2、CDR3，且藉由構架胺基酸序列隔開。

¹ 殘基編號遵循Kabat等人，1991，同上文之命名法

² 殘基編號遵循Chothia等人，同上文之命名法

³ 殘基編號遵循MacCallum等人，同上文之命名法

「CH1結構域」係指位於VH結構域與鉸鏈區之間的重鏈免疫球蛋白恆定結構域。其橫跨EU位置118-215。CH1結構域可為天然存在之CH1結構域，或一或多個胺基酸(「aa」)已經取代、添加或缺失(只要該CH1結構域具有所需之生物特性)的天然存在之CH1結構域。所需生物活性可為天然生物活性、增強之生物活性或減弱之生物活性(相對於天然存在之序列)。

「CH2結構域」係指位於鉸鏈區與CH3結構域之間的重鏈免疫球蛋白恆定結構域。如此處所定義，其橫跨EU位置237-340。CH2結構域可為天然存在之CH2結構域，或一或多個aa已經取代、添加或缺失(只要該CH2結構域具有所需之生物特性)的天然存在之CH2結構域。所需生物活性可為天然生物活性、增強之生物活性或減弱之生物活性(相對於天然存在之結構域的生物活性)。

「CH3結構域」係指位於CH2結構域之C末端且橫跨CH2結構域N末端約110個殘基，例如大致位置341-446b(EU編號系統)的重鏈免疫球蛋白恆定結構域。CH3結構域可為天然存在之CH3結構域，或一或多個aa已經取代、添加或缺失(只要該CH3結構域具有所需之生物特性)的天然存在之CH3結構域。所需生物活性可為天然生物活性、增強之生物活性或減弱之生物活性(相對於天然存在之結構域的生物活性)。CH3結構域可包含或可不包含C末端離胺酸。「CH4結構域」係指在IgM及IgE抗體中位於CH3結構域之C末端的重鏈免疫球蛋白恆定結構域。CH4結構域可為天然存在之CH4結構域，或一或多個aa已經取代、添加或缺失(只要該CH4結構域具有所需之生物特性)的天然存在之CH4結構域。所需生物活性可為天然生物活性、增強之生物活性或減弱之生物活性(相對於天然存在之結構域的生物活性)。

「CL結構域」係指位於VL結構域之C末端的輕鏈免疫球蛋白恆定結構域。其橫跨大致Kabat位置107A-216。CL結構域可為天然存在之CL結構域，或一或多個aa已經取代、添加或缺失(只要該CL結構域具有所需之生物特性)的天然存在之CL結構域。所需生物活性可為天然生物活性、增強之生物活性或減弱之生物活性(相對於天然存在之結構域的生物活性)。CL結構域可包含或可不包含C末端離胺酸。

「c-Met」或「c-MET」係指間葉細胞-上皮細胞轉變(MET)因子，又稱肝細胞生長因子受體(HGFR)、離散因子(Scatter Factor，SF)受體、AUTS9、RCCP2，對應於基因ID 4233，且具有酪胺酸激酶活性。初級單鏈前驅蛋白經翻譯後裂解而產生α及β次單元，其經二硫鍵連接形成成熟受體。已發現此基因之編碼不同之同功異型物的兩種轉錄變體。HGF為c-Met之唯一已知的配位體。提供的人類c-Met同功異型物a前驅物之aa序列係為Genbank寄存編號NP_001120972.1處，且提供的同功異型物b前驅物係為Genbank寄存編號NP_000236.2。

免疫球蛋白之輕鏈「恆定區」或結構域與「CL」、「輕鏈恆定區結構域」、「CL區」或「CL結構域」可互換提及。免疫球蛋白之重鏈上的恆定結構域(例如鉸鏈區、CH1、CH2或CH3結構域)與「CH」、「重鏈恆定結構域」、「CH」區或「CH結構域」可互換提及。免疫球蛋白輕鏈上之可變結構域與「VL」、「輕鏈可變結構域」、「VL區」或「VL結構域」可互換提及。免疫球蛋白重鏈上之可變結構域與「VH」、「重鏈可變結構域」、「VH區」或「VH結構域」可互換提及。

「DiS」係指導致添加半胱胺酸之結構域(例如鉸鏈區或CH3結構域)之修飾，該半胱胺酸可與另一半胱胺酸形成二硫鍵。DiS可在TFc之一個或兩個Fc中包含一或多個aa取代、缺失或添加。DiS係以模組分類，例如模組1(「Dis 1」)，其中對兩個Fc之一的修飾稱為DiS 1.1，且對另一Fc之修飾稱為DiS 1.2。舉例而言，DiS 1.1由取代Y349C組成且DiS 1.2由取代S354C組成。

「結構域」一般係指重鏈或輕鏈多肽中可包含能例如藉由β蛋白質摺疊片構象及/或鏈內二硫鍵而穩定之肽環(例如1至4個肽環)的區域，例如獨立摺疊之球形區域或非球形區域(例如連接子結構域)。免疫球蛋白重鏈及輕鏈之恆定區及可變區通常摺疊成結構域。特定言之，CH1、CH2、CH3、CH4、CL、VH及VL結構域中每一者通常形成環結構域。

「EC₅₀ 」或「EC50」係指對特定系統(諸如結合分析法或信號轉導路徑)上之蛋白質提供50%之最大作用的分子(例如TFcA)濃度。

「EGFR」係指表皮生長因子受體，其又稱ErbB1、HER-1、mENA及PIG61。已知EGFR可結合配位體，包括表皮生長因子(EGF)、轉型生長因子α(TGf-α)、雙調蛋白、肝素結合EGF(hb-EGF)、β細胞調節素(betacellulin)、表皮調節素(epiregulin)，且具有基因ID 1956(Herbst,R.S.及Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593- 1611；Mendelsohn,J.及Baselga,J.,Oncogene 19(2000)6550-6565)。EGFR為跨膜醣蛋白，其為經由酪氨酸激酶介導之信號轉導路徑調控多個細胞過程之蛋白質激酶超家族之成員，該等細胞過程包括(但不限於)控制細胞增殖、分化、細胞存活、細胞凋亡、血管生成、有絲分裂發生及轉移之信號轉導路徑的活化(Atalay,G.等人，Ann.Oncology 14(2003)1346-1363；Tsao,A.S.及Herbst,R.S.,Signal 4(2003)4-9；Herbst,R.S.及Shin,D.M.,Cancer 94(2002)1593-1611；Modjtahedi,H.等人，Br.J.Cancer 73(1996)228-235)。配位體與EGFR之結合將誘導受體二聚化及酪胺酸自體磷酸化，由此導致細胞增殖。已發現此基因之編碼不同蛋白質同功異型物之多個交替剪接之轉錄物變體。提供的人類EGFR同功異型物a-d前驅物之aa序列係為Genbank寄存編號NP_005219.2、NP_958439.1、NP_958440.1及NP_958441.1。

「EpCAM」係指表皮細胞黏附分子，一種在人體中由EPCAM基因編碼之蛋白質。EpCAM亦已稱為TACSTD1(腫瘤相關性鈣信號轉導子1)、CD326(分化抗原叢集326)及17-1A抗原。EpCAM為由大多數癌瘤表現之泛上皮分化抗原。

「ErbB2」或「HER2」係指類似於EGF受體之推定的酪胺酸激酶生長因子受體EGFR2，p185 HER2/NEU抗原。提供的ErbB2同功異型物之aa序列係為Genbank寄存編號NP_004439.2及NP_001005862.1，且核苷酸序列具有基因ID 2064。

「ErbB3」或「HER3」係指由人類ERBB3基因編碼之受體酪胺酸蛋白激酶，且在蛋白質胺基酸磷酸化中具有作用。提供的ErbB3同功異型物之aa序列係為Genbank寄存編號NP001973.2及NP_001005915.1，且核苷酸序列具有基因ID 2065。

「ErbB4」或「HER4」在調控細胞增殖及分化之受體酪胺酸激酶信號轉導中起到作用。提供的ErbB4同功異型物之aa序列係為Genbank寄存編號NP001973.2及NP_001005915.1，且核苷酸序列具有基因ID 2066。

ERBB2、ERBB3及ERBB4基因編碼調節素(heregulin)/神經調節素受體，即，EGFR相關性I型受體酪胺酸激酶超家族之成員。編碼之蛋白質形成同二聚體及異二聚體，其牽涉到功能之分配。ERBB2同二聚體不結合調節素，而ERBB2/ERBB3異二聚體則結合。Herstatin為細胞外結構域之經分泌的替代性ERBB2產物，其結合至p185ERBB2，破壞ERBB2二聚體，減少p185磷酸化且抑制生長。人類ERBB2基因位於17p12-21處。HER-2之過表現與乳癌預後不良有關。

「IGF1R」係指類胰島素生長因子1受體。例示性人類IGF1R核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：3480及GenBank寄存編號：NP_000866.1中。

「IGF2R」係指類胰島素生長因子2受體。例示性人類IGF2R核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：3482及GenBank寄存編號：NP_000867.2中。

「胰島素受體」係指胰島素之細胞受體。例示性人類胰島素受體核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：3643及GenBank寄存編號：NP_000199.2中。

「RON」係指巨噬細胞刺激性蛋白質受體之受體。例示性人類RON核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：4486及GenBank寄存編號：NP_002438.2中。

「c-Kit」係指v-kit哈迪-朱克曼4貓肉瘤(Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma)病毒癌基因同系物。例示性人類c-Kit核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：3815及GenBank寄存編號：NP_001087241.1中。

「VEGFR1」係指血管內皮生長因子1。例示性人類VEGFR1核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：2321及GenBank寄存編號：NP_002010.2中。

「VEGFR2」係指血管內皮生長因子2。例示性人類VEGFR2核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：3791及GenBank寄存編號：NP_002244.1中。

「TNFR」係指腫瘤壞死因子受體。例示性人類TNFR核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：7132及GenBank寄存編號：NP_001056.1中。

「FGFR1」係指纖維母細胞生長因子受體1。例示性人類FGFR1核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：2260及GenBank寄存編號：NP_001167537.1中。

「FGFR2」係指纖維母細胞生長因子受體2。例示性人類FGFR2核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：2263及GenBank寄存編號：NP_001138390.1中。

「FGFR3」係指纖維母細胞生長因子受體3。例示性人類FGFR3核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：2261及GenBank寄存編號：NP_000133.1中。

「FGFR4」係指纖維母細胞生長因子受體4。例示性人類FGFR4核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：2264及GenBank寄存編號：NP_075252.2中。

「PDGFR-α」係指血小板源性生長因子受體α。例示性人類PDGFR-α核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：5156及GenBank寄存編號：NP_006197.1中。

「PDGFR-β」係指血小板源性生長因子受體β。例示性人類PDGFR-β核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID： 5159及GenBank寄存編號：NP_002600.1中。

「EpCAM」係指上皮細胞黏附分子。例示性人類EpCAM核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：4072及GenBank寄存編號：NP_002345.2中。

「EphA2」係指EPH受體A2。例示性人類EphA2核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：1969及GenBank寄存編號：NP_004422.2中。

「CEA」係指癌胚抗原相關性細胞黏附分子5。例示性人類CEA核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：1048及GenBank寄存編號：NP_004354.2中。

「CD44」係指細胞表面醣蛋白CD44。例示性人類CD44核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：960及GenBank寄存編號：NP_001189486.1中。

「ALK」係指未分化淋巴瘤受體酪胺酸激酶。例示性人類ALK核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：238及GenBank寄存編號：NP_004295.2中。

「AXL」係指AXL受體酪胺酸激酶。例示性人類AXL核酸及蛋白質序列分別陳述於RefSeqGene基因ID：558及GenBank寄存編號：NP_068713.2中。

「EU」指示重鏈恆定區中之aa位置，包括CH1、鉸鏈區、CH2及CH3結構域中之aa位置，在本文中根據EU索引編號系統編號(參看Kabat等人，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,U.S.Dept.Health and Human Services，第5版，1991)。

「Fab」係指抗體之抗原結合部分，包含兩條鏈：包含VH結構域及CH1結構域之第一鏈，及包含VL結構域及CL結構域之第二鏈。儘管Fab通常描述為抗體之中經木瓜蛋白酶處理且包含鉸鏈區之一部分的N末端片段，但其在本文中亦稱為結合結構域，其中該重鏈不包含鉸鏈區之一部分。

「Fc區」係指單鏈免疫球蛋白重鏈中以剛好在木瓜蛋白酶裂解位點(亦即，IgG中之殘基216，重鏈恆定區之第一個殘基指定為114)上游之鉸鏈區開始且在抗體之C末端結束的部分。因此，完整的Fc區至少包含鉸鏈區、CH2結構域及CH3結構域。二聚化之兩個Fc區稱為「Fc」或「Fc二聚體」。Fc區可為天然存在之Fc區，或一或多個aa已經取代、添加或缺失(只要Fc區具有所需之生物特性)的天然存在之Fc區。所需生物活性可為天然生物活性、增強之生物活性或減弱之生物活性(相對於天然存在之結構域的生物活性)。

「構架區」或「FR」或「FR區」包括作為可變區之一部分但不為CDR(例如，使用Kabat之CDR定義)之一部分的aa殘基。因此，可變區構架在約100-120個aa長度之間，但僅包括在CDR外之aa。對於重鏈可變區之具體實例且對於如Kabat等人，1991(同前)所定義之CDR，構架區1對應於可變區中涵蓋aa1-30之結構域；構架區2對應於可變區中涵蓋aa 36-49之結構域；構架區3對應於可變區中涵蓋aa 66-94之結構域；且構架區4對應於可變區中自aa 103至可變區結束之結構域。輕鏈之構架區類似地由每一輕鏈可變區CDR隔開。類似地，使用如Chothia等人或McCallum等人之定義，構架區邊界由如上文所述之各別CDR末端隔開。在較佳實施例中，CDR如Kabat所定義。

「全長抗體」或「全長Ab」為包含一或多個重鏈及一或多個輕鏈之抗體(「Ab」)，該一或多個重鏈與該一或多個輕鏈視情況可連接。每一重鏈包含重鏈可變區(本文縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域CH1、CH2及CH3，及視情況存在之第四結構域CH4。每一輕鏈包含輕鏈可變區(本文縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域，即CL。VH及VL區可進一步細分成稱為互補決定區(CDR)之高可變性區，其中散佈有更為保守之區域，稱為構架區(FR)。VH及VL各自通常係由自胺基末端至羧基末端按以下次序佈置之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。免疫球蛋白可屬於任何類型或類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)或亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。

「Gly-Ser連接子」或「Gly-Ser肽」係指由甘胺酸及絲胺酸殘基組成之肽。例示性Gly-Ser肽包含aa序列(Gly4 Ser)n，其中n=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。在某些實施例中，n為介於1與5之間之數字，n為介於6與10之間之數字，n為介於11與15之間之數字，n為介於16與20之間之數字，n為介於21與25之間之數字，或n為介於26與30之間之數字。

「鉸鏈」或「鉸鏈區」或「鉸鏈結構域」係指重鏈位於CH1結構域與CH2結構域之間的可撓性部分。其為約25個aa長，且分成「上游鉸鏈區」、「中間鉸鏈區」或「核心鉸鏈區」及「下游鉸鏈區」。鉸鏈區可為天然存在之鉸鏈區，或一或多個aa已經取代、添加或缺失(只要該鉸鏈區具有所需之生物特性)的天然存在之鉸鏈區。所需生物活性可為天然生物活性、增強之生物活性或減弱之生物活性(相對於天然存在之序列)。

「鉸鏈亞結構域」係指上游鉸鏈區、中間(或核心)鉸鏈區或下游鉸鏈區。IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之鉸鏈亞結構域之aa序列陳述於表2中。

完整鉸鏈區由上游鉸鏈亞結構域、中間鉸鏈亞結構域及下游鉸鏈亞結構域(以胺基至羧基末端次序)組成且無插入序列。

「IC₅₀ 」或「IC50」係指使最大活性(例如，對刺激物之反應或組成性活性)受到50%抑制時的分子(例如TFcA)濃度，亦即，使該活性降低至介於最大活性與基線之間之中間程度時的濃度。IC₅₀ 值可使用例如程-普魯索夫方程(Cheng-Prusoff equation)換算成絕對抑制常數(Ki)。在由結合劑(諸如抗體或本文提供之TFcA)抑制之系統中，IC50與EC50可能無法區分。

結合蛋白對生物活性之「抑制作用」係指由該結合蛋白所介導的任何可再現地可偵測到的生物活性降低。在一些實施例中，抑制作用提供在統計學上顯著降低之生物活性，例如相對於在不存在結合蛋白情況下之生物活性，生物活性降低約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。

與指定免疫球蛋白aa序列位置關連之「Kabat」係指示輕鏈恆定區(例如CL結構域)中之胺基酸位置係根據Kabat索引編號系統編號(參見前文引用Kabat等人，1991之文獻)。

在上下文中，「連接至」係指胺基酸或核苷酸之直接或間接鍵聯或連接。「間接鍵聯」係指經由包含例如一或多個aa或核苷酸之連接子或結構域介導之鍵聯。當提及兩個多肽區段時，「直接鍵聯」或「直接連接」係指在該兩個多肽區段之間存在共價鍵，例如，該兩個多肽區段係在無插入序列情況下連續接合。

「連接子」係指將兩個結構域或區域連在一起的一或多個aa。連接子可為可撓性，以允許結構域經連接子連接形成適當三維結構，從而允許其具有所需之生物活性。連接scFv之VH及VL的連接子在本文中稱為「scFv連接子」。將VH結構域之N末端或CH3結構域之C末端連接至第二VH或VL結構域(例如scFv之VH或VL結構域)的連接子稱為「連接性連接子」。

「模組」係指TFcA之結構及/或功能不同之部分，諸如結合位點(例如scFv結構域或Fab結構域)及TFc。本文提供之模組可以於許多種組合中與其他模組進行重排(藉由重組核酸或藉由完全或部分重新合成新的聚核苷酸來重新組合其編碼序列)以產生多種TFcA，例如，如本文所揭示。「模組」亦用於指AEM或DiS修飾之類型。在此上下文中且如本文進一步描述的，「模組」為兩個或兩個以上aa取代、添加或缺失中之一者或組合，其可增強或有利於包含該等修飾之Fc區之締合或二聚化。

「一致性%」係指當將兩個序列對準以達到最大對應性並進行比較時，兩個或兩個以上核酸或多肽序列或子序列為相同(100%一致)或具有指定百分比之相同核苷酸或aa殘基。為了對準達到最大對應性，可將空格引入所比較之序列之一中。接著對在對應位置處之aa殘基或核苷酸進行比較並定量。當佔據第一序列中某一位置的殘基與第二序列中的相應位置相同時，則該等序列在該位置處一致。兩個序列之間的一致性百分比隨著該等序列所共有之一致位置的數量而變化(例如：一致性%=一致位置的數量/位置總數(例如重疊位置)×100)。在某些實施例中，兩個序列的長度相同。一個序列與另一序列之經量測一致性%的測定可使用數學演算法來測定。用於該兩個序列之比較之數學演算法的非限制性實例係合併於ALIGN程式(2.0版)中，其為GCG序列比對套裝軟體之一部分。當利用ALIGN程式例如比較aa序列時，可使用PAM120權重殘基表、空格長度罰分12及空格罰分4。用於序列分析之其他演算法為此項技術中熟知的且許多可在線獲得。

參考部分之「部分」或「片段」(例如結構域之「部分」或「片段」)係指整個參考部分(例如結構域，例如天然存在之結構域)內佔該參考部分之尺寸至少或至多10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的不連續部分。

「scFv連接子」係指插入scFv之VL與VH結構域之間的肽或多肽結構域。scFv連接子較佳允許VL及VH結構域以抗原結合構型取向。在一個實施例中，scFv連接子包含了僅包含甘胺酸及絲胺酸之肽或多肽連接子或由其組成(「Gly-Ser連接子」)。在某些實施例中，scFv連接子包含二硫鍵。

當提及結合位點與其靶抗原決定基或結合位點之組合與其靶抗原決定基之之結合時，「特異性結合(Specific binding)」、「特異性地結合(specifically binds)」、「選擇性結合(selective binding)」及「選擇性地結合(selectively binds)」以及「特異性地結合(binds specifically)」、「選擇性地結合(binds selectively)」意謂結合位點展現與靶抗原決定基之免疫特異性結合。特異性結合至抗原決定基之結合位點對靶抗原決定基展現明顯的親和力且一般不展現與其他抗原決定基之交叉反應性，因為其不展現對任何不相關之抗原決定基之明顯親和力且較佳對任何不相關之抗原決定基不展現低於對靶抗原決定基之親和力兩個數量級、超過兩個數量級或在兩個數量級內的親和力。「明顯的」或較佳的結合包括解離常數(Kd)為10^-8 、10^-9 M、10^-10 M、10^-11 M、10^-12 M、10^-13 M或甚至更低Kd值的結合。Kd值亦可指示為10e-8M、10e-9M等。應注意，較低之Kd(解離常數)值指示較高之結合親和力，因此Kd值為10^-7 係比Kd值為10^-8 高的Kd值，但指示結合親和力低於Kd值為10^-8 。值為約10^-7 M且甚至低至約10^-8 M之解離常數係適於治療性抗體之解離常數的最高值。結合親和力可由一系列解離常數指示，例如10^-6 至10^-12 M、10^-7 至10^-12 M、10^-8 至10^-12 M或更高(亦即，或更低解離常數值)。在納莫耳濃度(10^-9 M)至皮莫耳濃度(10^-12 M)範圍內或更低之解離常數通常最適用於治療性抗體。適合解離常數為50nM或更低之Kd(亦即，結合親和力為50nM或更高-例如，Kd為45nM)，或40nM、30nM、20nM、10nM、1nM、100pM、10pM或1pM，或更低之Kd。特異性或選擇性結合可根據測定此結合之任何技術公認之手段，包括例如根據史卡查分析(Scatchard analysis)及/或競爭性結合分析法來測定。

「TFc」或「串聯Fc」係指以胺基至羧基末端次序包含以下各物之實體：第一Fc區在其C末端處連接至TFc連接子之N末端，該TFc連接子在其C末端處連接至第二Fc區之N末端，其中該第一及該第二Fc區締合形成Fc。

「TFcA」係指串聯Fc抗體。TFcA可為單價或單特異性TFcA，例如其包含單一結合位點。TFcA亦可為雙特異性TFcA，其在本文中稱為TFcBA。TFcA可為單株的。

「TFcBA」係指串聯Fc雙特異性抗體，一種包含至少兩個不同結合部分或結構域且因此包含至少兩個不同結合位點(例如，兩個不同抗體結合位點)之人工雜交蛋白，其中該複數個結合位點中之一或多者係例如經由肽鍵彼此共價連接的。例示性本文描述之TFcBA為抗c-Met+抗EGFR TFcBA，其為多價雙特異性抗體，包含特異性結合至c-Met蛋白(例如人類c-Met蛋白)之第一結合位點，及特異性結合至EGFR蛋白(例如人類EGFR蛋白)之一或多個第二結合位點。當TFcBA名稱包含由加號(+)隔開的兩個抗原時，此指示針對該兩個抗原之結合位點可在該分子中按任一相關胺基至羧基取向，而當TFcBA名稱包含由斜線(/)隔開的兩個抗原結合位點名稱時，該斜線左側之抗原結合位點係胺基末端至該斜線右側之抗原結合位點。TFcBA可為二價結合蛋白、三價結合蛋白、四價結合蛋白或具有超過4個結合位點之結合蛋白。例示性TFcBA為二價雙特異性抗體，亦即，具有2個結合位點之抗體，該等結合位點各自結合至不同抗原或抗原決定基。在某些實施例中，TFcBA之N末端結合位點為Fab且C末端結合位點為scFv。

串聯Fc Ab

本文提供串聯Fc抗體(「TFcA」)，其可為單價或多價的，例如二價、三價或四價的。多價TFcA可為單特異性、雙特異性(「串聯Fc雙特異性Ab」或「TFcBA」)、三特異性或四特異性TFcBA。當TFcBA為多特異性時，其對於一或多種特異性可為單價的。

在某些實施例中，TFcA為TFcBA。例示性TFcBA經由TFcBA所靶向之一個或兩個受體來抑制配位體誘導之信號轉導且由此可抑制腫瘤細胞增殖或腫瘤生長。TFcBA亦可誘導受體下調或阻斷受體二聚化。例示性抗c-Met/抗EGFR TFcBA包含單一抗c-Met結合位點(對於抗c-Met為單價的)及一或多個抗EGFR結合位點(對於抗EGFR為單價或多價的)。TFc通常包含經由TFc連接子連接至第二Fc區之第一Fc區，其中該第一與該第二Fc區形成二聚體，從而形成Fc。

圖1顯示例示性TFcBA之圖解，顯示了該分子之各種成分。如該圖中所示，TFcBA包含第一結合位點(例如抗c-Met Fab)、第二結合位點(例如抗EGFR scFv)及將該第一與該第二結合位點連接在一起之串聯Fc(「TFc」)。TFcBA可描述為含有三個模組，其中第一模組包含第一結合位點，第二模組包含TFc且第三模組包含第二結合位點。TFc一般在連續aa序列中包含第一Fc區、TFc連接子及第二Fc區，其中該TFc連接子將第一Fc區連接至第二Fc區且使該兩個Fc區締合。如圖1中之例示性TFcBA中所說明的，TFc之兩個Fc區各自可包含鉸鏈區、CH2結構域及CH3結構域。該等區域各自可來自相同免疫球蛋白同型或來自不同之同型。舉例而言，鉸鏈區、CH2及CH3結構域可全部來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或其某些結構域或部分可來自一種免疫球蛋白同型且另一結構域或部分可來自另一免疫球蛋白同型。舉例而言，圖1中所繪製的TFcBA包含之所有結構域均來自IgG1，或另外，其可包含IgG1/IgG4雜交鉸鏈區、IgG4 CH2結構域及IgG1 CH3結構域。Fc區較佳包含人類Fc結構域，然而，亦可使用來自其他哺乳動物或動物之序列，只要TFcBA保持其生物活性且較佳在人類個體中無顯著免疫原性即可。

在較佳實施例中，第一及/或第二Fc區包含一或多個增強其締合及/或使該締合穩定之修飾。在某些實施例中，TFcA之第一及/或第二CH3結構域包含一或多個增強CH3結構域或包含其之Fc之締合的修飾。該等修飾在本文中稱為締合增強性修飾或「AEM」。例示性修飾包括在兩個CH3結構域中之增強其相互作用之修飾，例如突出/空穴突變。

在某些實施例中，第一及/或第二Fc區包含使得添加一或多個半胱胺酸至Fc區，以藉此與該TFc之另一Fc區形成二硫鍵的aa修飾。該等修飾在本文中稱為二硫鍵形成性修飾或「DiS」修飾。DiS修飾可存在於鉸鏈區、CH2及/或CH3結構域中。

TFc可包含一或多個AEM及/或一或多個DiS修飾。圖1B顯示了可對CH3區或鉸鏈區進行之例示性修飾。Fc區亦可包含其他修飾，例如調節經由Fc區介導之生物活性(諸如ADCC)的修飾。

儘管一般而言，第一及第二Fc區包含鉸鏈區、CH2結構域及CH3結構域，但在某些實施例中，Fc區可包含CH3結構域及CH2結構域，但無鉸鏈區。在其他實施例中，Fc區包含CH3結構域及鉸鏈區，但不包含CH2結構域。在其他實施例中，Fc區可包含CH3結構域及CH4結構域，但不包含CH2結構域及鉸鏈區。在其他實施例中，Fc區可包含CH3結構域、CH4結構域、CH2結構域，但不包含鉸鏈區。在其他實施例中，Fc區可包含CH3結構域、CH4結構域、鉸鏈區，但不包含CH2結構域。在某些實施例中，不存在一或多個結構域之一部分。

在某些實施例中，第一Fc區包含因一或多個aa添加、缺失或取代而不同於第二Fc區之aa序列(「異二聚體Fc」)。AEM及DiS修飾通常為此情形，該等修飾通常將不同修飾引入第一及第二Fc區中。在其他實施例中，第一Fc區包含與第二Fc區相同之aa序列(「同二聚體Fc」)。

在某些實施例中，Fc結構域(鉸鏈區、CH2或CH3結構域)係直接連接至另一Fc結構域。舉例而言，鉸鏈區可直接連接至CH2結構域及/或CH2結構域可直接連接至CH3結構域。在其他實施例中，Fc結構域經由連接子連接至另一Fc結構域，該連接子可為一或多個aa長度，只要包含該等結構域之TFcA具有所需生物活性及穩定性以及任何其他所需特徵即可。

在某些實施例中，結合位點為抗原結合位點，其包含例如重鏈可變(VH)結構域及輕鏈可變(VL)結構域。VH及VL結構域一般各自含有3個互補決定區(CDR)，不過在某些實施例中，少於6個CDR可足以提供與抗原之特異性結合。在某些實施例中，VH結構域為Fab之一部分，在此情況下，VH結構域一般以自然次序連接至CH1結構域，亦即，VH結構域係連接至CH1之N末端。當抗原結合位點為Fab之一部分時，VL結構域一般可以自然次序連接至輕鏈恆定(CL)結構域，亦即，VL結構域係連接至CL結構域之N末端。

可變結構域(VH及VL)可直接或間接(例如經由連接子)連接至恆定結構域(CH1及CL)，該連接子可為一或多個aa長度，只要包含該等結構域之TFcA具有所需生物活性及穩定性以及任何其他所需特徵即可。

在某些實施例中，VH結構域為scFv之一部分，在此情況下，VH結構域經由scFv連接子連接至VL結構域，且scFv連接至TFc之N末端及/或C末端。當結合位點為scFv時，可變區一般不連接至CH1或CL結構域。

在某些實施例中，TFcA為單價及單特異性的。單價TFcA可在TFc之胺基末端處或C末端處包含結合位點。單價TFcA之結合位點可為Fab或scFv。單價TFcA之例示性重鏈以胺基至羧基末端次序包含：i)VH結構域及TFc；ii)VH結構域、CH1結構域及TFc；iii)VH結構域、scFv連接子、VL結構域及TFc；iv)TFc、連接性連接子及VH結構域；v)TFc、連接性連接子、VH結構域及CH1結構域；及vi)TFc、連接性連接子、VH結構域、scFv連接子及VL結構域。

當TFcA包含Fab時，TFcA亦包含了含Fab之VL結構域及視情況存在之CL結構域的輕鏈。

在某些實施例中，TFcA為TFcBA。TFcBA可包含特異性結合至第一抗原之一個Fab及特異性結合至第二抗原之第二Fab。TFcBA亦可包含特異性結合至第一抗原之第一scFv及特異性結合至第二抗原之第二scFv。TFcBA亦可包含特異性結合至第一抗原之Fab及特異性結合至第二抗原之scFv。在某些實施例中，TFc之胺基末端係連接至Fab且TFc之羧基末端係連接至scFv。或者，TFc之胺基末端係連接至scFv且TFc之羧基末端係連接至Fab。例示性分子具有以下格式：Fab-TFc-scFv；Fab-TFc-Fab；scFv-TFc-scFv；及scFv-TFc-Fab。

在一個實施例中，TFcBA包含重鏈，該重鏈以胺基至羧基末端次序包含：(i)第一VH結構域、TFc、連接性連接子及第二VH結構域；(ii)第一VH結構域、CH1結構域、TFc、連接性連接子及第二VH結構域；(iii)第一VH結構域、CH1結構域、TFc、連接性連接子、第二VH結構域、scFv連接子及第二VL結構域，其中該第二VH結構域與該第二VL結構域締合形成第二結合位點；(iv)第一VH結構域、TFc、連接性連接子、第二VH結構域及CH1結構域；(v)第一VH結構域、第一CH1結構域、TFc、連接性連接子、第二VH結構域及第二CH1結構域；(vi)第一VH結構域、第一scFv連接子、第一VL結構域、TFc、連接性連接子及第二VH結構域，其中該第一VL結構域與該第一VH結構域締合形成第一結合位點；(vii)第一VH結構域、第一scFv連接子、第一VL結構域、 TFc、連接性連接子、第二VH結構域及CH1結構域，其中該第一VL結構域與該第一VH結構域締合形成第一結合位點；及(viii)第一VH結構域、第一scFv連接子、第一VL結構域、TFc、連接性連接子、第二VH結構域、第二scFv連接子及第二VL結構域，其中該第一VH結構域與該第一VL結構域形成第一結合位點且該第二VH結構域與該第二VL結構域形成第二結合位點。

(i)-(v)之TFcBA可另外包含包括第一VL結構域及位於VL結構域C末端之視情況存在之CL結構域的輕鏈，其中該第一VH結構域與該第一VL結構域締合形成第一結合位點。(i)、(ii)、(iv)-(vii)之TFcBA可包含包括第二VL結構域及位於VL結構域C末端之視情況存在之CL結構域的輕鏈，其中該第二VH結構域與VL結構域締合形成第二結合位點。

在某些實施例中，重鏈包含第一VH結構域，其在其C末端處連接至TFc之N末端，該TFc在其C末端處連接至連接性連接子之N末端，該連接性連接子在其C末端處連接至第二VH結構域之N末端。在某些實施例中，重鏈包含第一VH結構域，其在其C末端處連接至CH1結構域之N末端，該CH1結構域在其C末端處連接至TFc之N末端，該TFc在其C末端處連接至連接性連接子之N末端，該連接性連接子在其C末端處連接至第二VH結構域之N末端。在某些實施例中，重鏈包含第一VH結構域，其在其C末端處連接至CH1結構域之N末端，該CH1結構域在其C末端處連接至TFc之N末端，該TFc在其C末端處連接至連接性連接子之N末端，該連接性連接子在其C末端處連接至第二VH結構域之N末端，該第二VH結構域在其C末端處連接至scFv連接子之N末端，該scFv連接子在其C末端處連接至第二VL結構域之N末端，其中該第二VH結構域與該第二VL結構域締合形成第二結合位點。在某些實施例中，重鏈包含第一VH結構域，其在其C末端處連接至TFc 之N末端，該TFc在其C末端處連接至連接性連接子之N末端，該連接性連接子在其C末端處連接至第二VH結構域之N末端，該第二VH結構域在其C末端處連接至CH1結構域之N末端。在某些實施例中，重鏈包含第一VH結構域，其在其C末端處連接至第一CH1結構域之N末端，該第一CH1結構域在其C末端處連接至TFc之N末端，該TFc在其C末端處連接至連接性連接子之N末端，該連接性連接子在其C末端處連接至第二VH結構域之N末端，該第二VH結構域在其C末端處連接至第二CH1結構域之N末端。在某些實施例中，重鏈包含第一VH結構域，其在其C末端處連接至第一scFv連接子之N末端，該第一scFv連接子在其C末端處連接至第一VL結構域之N末端，該第一VL結構域在其C末端處連接至TFc之N末端，該TFc在其C末端處連接至連接性連接子之N末端，該連接性連接子在其C末端處連接至第二VH結構域之N末端，其中該第一VH結構域與該第一VL結構域締合形成第一結合位點。在某些實施例中，重鏈包含第一VH結構域，其在其C末端處連接至第一scFv連接子之N末端，該第一scFv連接子在其C末端處連接至第一VL結構域之N末端，該第一VL結構域在其C末端處連接至TFc之N末端，該TFc在其C末端處連接至連接性連接子之N末端，該連接性連接子在其C末端處連接至第二VH結構域之N末端，該第二VH結構域在其C末端處連接至CH1結構域之N末端，其中該第一VH結構域與該第一VL結構域締合形成第一結合位點。在某些實施例中，重鏈包含第一VH結構域，其在其C末端處連接至第一scFv連接子之N末端，該第一scFv連接子在其C末端處連接至第一VL結構域之N末端，該第一VL結構域在其C末端處連接至TFc之N末端，該TFc在其C末端處連接至連接性連接子之N末端，該連接性連接子在其C末端處連接至第二VH結構域之N末端，該第二VH結構域在其C末端處連接至第二scFv連接子之N末端，該第二scFv連接子在其C末端處連接至第二VL結構域之N末端，其中該第一VH結構域與該第一VL結構域形成第一結合位點且該第二VH結構域與該第二VL結構域形成第二結合位點。

在某些實施例中，在以上構築體中，VL結構域取代VH結構域且VH結構域取代VL結構域。

當重鏈不包含第一或第二VL結構域時，VL結構域可由輕鏈提供。輕鏈可包含第一或第二VL結構域及視情況存在之CL結構域。舉例而言，scFv以胺基至羧基末端次序可包含VL結構域、scFv連接子及VH結構域。

在某些實施例中，TFcBA包含特異性結合至第一受體之第一抗原結合位點及特異性結合至第二受體之第二抗原結合位點。在某些實施例中，特異性結合至第一受體之第一抗原結合位點為Fab且特異性結合至第二受體之第二抗原結合位點為scFv。結合位點之例示性組合陳述於表3 中，其中「是」指示可能之組合且使用了抗c-Met+抗EGFRTFcBA來說明該等可能之組合：

在某些實施例中，TFcBA包含超過2個結合位點。TFcBA可包含3、4、5、6或更多個結合位點。其他結合位點可連接至例如TFcA或TFcBA之N末端及/或C末端。舉例而言，重鏈可包含一或多個連接至TFc之胺基或羧基末端的Fab及/或scFv。

TFcBA之例示性結構域進一步描述於下。

例示性鉸鏈區

在一個實施例中，TFcA(例如TFcBA)之第一及/或第二Fc區包含IgG上游鉸鏈區、IgG中間鉸鏈區及/或IgG下游鉸鏈區。舉例而言，Fc區可包含一或多個IgG1上游、中間及下游鉸鏈區，例如分別陳述於SEQ ID NO：1、2及3中(參看表2)。Fc區亦可包含IgG2上游、中間及下游鉸鏈區中之一或多者，例如分別陳述於SEQ ID NO：5、2及6中(IgG1及IgG2之中間鉸鏈區具有相同aa序列/參看表2)。Fc區亦可包含IgG3上游、中間及下游鉸鏈區中之一或多者，例如分別陳述於SEQ ID NO：8、9及10中(參看表2)。Fc區亦可包含IgG4上游、中間及下游鉸鏈區中之一或多者，例如分別陳述於SEQ ID NO：12、13及14中(參看表2)。Fc區亦可包含一或多個小鼠Ig序列或者IgA1或IgA2序列。

TFcA之第一及/或第二Fc區亦可包含具有與天然存在之序列不同之aa序列的上游、中間或下游鉸鏈區之aa序列，諸如包含至多1、2、3、4或5個aa修飾(例如aa取代、缺失或添加)的本文中陳述之aa序列(例如SEQ ID NO：1-14)。舉例而言，可使用以下IgG1上游鉸鏈區：EPKSCDKTCC (SEQ ID NO：16；對應於具有aa取代H224C及T225C(帶下劃線)之SEQ ID NO：1)及EPKSCDKC HT(SEQ ID NO：17；對應於具有aa取代T223C(帶下劃線)之SEQ ID NO：1)。

本文中提及之鉸鏈區殘基的胺基酸編號係根據其在全長抗體中之編號(EU編號；參看圖2)。

在一個實施例中，TFcA之第一及/或第二鉸鏈區為包含以下aa序列之全長野生型IgG1鉸鏈區： EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：4)。

TFcBA之第一及/或第二鉸鏈區亦可由相對於SEQ ID NO：4而包含至多1、2、3、4或5個aa修飾(例如aa取代、缺失或添加)之IgG1鉸鏈區組成。舉例而言，可使用以下IgG1鉸鏈區：EPKSCDKTCC CPPCPAPELLG(SEQ ID NO：18；對應於具有aa取代H224C及T225C之SEQ ID NO：4)；及EPKSCDKC HTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO：19；對應於具有aa取代T223C之SEQ ID NO：4)。

在一個實施例中，TFcA之第一及/或第二鉸鏈區為雜交鉸鏈區，亦即，包含來自不同IgG亞類之部分的鉸鏈區。在一個實施例中，鉸鏈區包含來自IgG1之上游鉸鏈區及來自IgG4之下游鉸鏈區，且可例如由以下aa序列組成：EPKSCDKTHTcpscpapeflg(SEQ ID NO：20；大寫字母殘基表示IgG1序列且小寫字母殘基表示IgG4序列)。

TFcBA之第一及/或第二鉸鏈區亦可為包含SEQ ID NO：20中陳述之aa序列的雜交鉸鏈區，該aa序列包含至多1、2、3、4或5個aa修飾，例如aa取代、缺失或添加。舉例而言，可使用以下IgG1/IgG4雜交鉸鏈區：EPKSCDKTCC cpscpapeflg(SEQ ID NO：21；對應於具有aa取代H224C及T225C之SEQ ID NO：20；大寫字母殘基表示IgG1序列且小寫字母殘基表示IgG4序列)；及EPKSCDKC HTcpscpapeflg(SEQ ID NO：22；對應於具有aa取代T223C之SEQ ID NO：20)。

在某些實施例中，第一及/或第二Fc區包含一部分鉸鏈區而非全長鉸鏈區。舉例而言，TFcBA之第一及/或第二Fc區可包含不含上游、中間及/或下游鉸鏈區之鉸鏈區。在某些實施例中，Fc區包含中間及下游鉸鏈區，但不包含上游鉸鏈區。IgG1中間及下游鉸鏈區之例示性aa序列如下：CPPCPAPELLG(SEQ ID NO：23)。

IgG4中間及下游鉸鏈區之例示性aa序列如下：CPSCPAPEFLG(SEQ ID NO：24)。

以上提供的鉸鏈區及其部分之aa編號之概述陳述於表4 中。IgG1及IgG1/IgG4雜交鉸鏈區之比對陳述於圖2中。

亦可在鉸鏈區中除T223、H224及T225以外的位置，例如藉由取代K222C(如WO2010/064090中所述)引入半胱胺酸。

可用於TFcA中之其他鉸鏈區包括hIgG1鉸鏈區變體，其包含以下aa序列之一(圖2)：PPPPCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：263；hIgG1額外脯胺酸v1)

EPKSCPPPCPPCP(SEQ ID NO：264；hIgG1額外脯胺酸v2)

EPKSCPPCPCPPCP(SEQ ID NO：265；類hIgG1之雙核心)

可用於TFcA中之鉸鏈區亦可包括小鼠鉸鏈區序列，例如mIgG1及mIgG2序列，及其雜交體。例示性mIgG1/mIgG2A鉸鏈區包含以下aa序列

VPRDCTIKPCPPCP(SEQ ID NO：267)。

可用於TFcA中之其他鉸鏈區包含IgG2鉸鏈區或其變體，諸如包含以下胺基酸序列之一之變體(圖2)：ERKPCVECPPCP(SEQ ID NO：268；hIgG2 C232P)

ERKCPVECPPCP(SEQ ID NO：269；hIgG2 C233P)。

在某些實施例中，TFcA包含IgA(例如IgA2)鉸鏈區或其變體。例示性IgA2鉸鏈區變體包括含以下aa序列之一之變體(圖2)：EPKSCPCPPPPPCCP(SEQ ID NO：271；hIgA2之經修飾v1)

EPKSCPCPPPPCCP(SEQ ID NO：272；hIgA2之經修飾v2)

EPKSCPVPPPPPCCP(SEQ ID NO：273；hIgA2之經修飾v3)。

其他變異，例如aa修飾，亦可引入鉸鏈區中。舉例而言，可在IgG4之中間鉸鏈區中進行取代S228P以使包含IgG4中間鉸鏈區之兩個Fc區之間的相互作用穩定。

在Fab結構域中包含IgG2序列之TFcA可在Fab結構域之重鏈部分中包含突變C129S，該突變為通常將重鏈連接至輕鏈之半胱胺酸的突變。此類突變將促使在輕鏈半胱胺酸與重鏈中之C232之間形成二硫橋，且C233將與相鄰鉸鏈區之C233配對(除CPPCP基元中之兩個二硫鍵外)。

在某些實施例中，使用以下變體鉸鏈區：PRDCGCKPCICT(SEQ ID NO：248)、PKSCGCKPCICT(SEQ ID NO：249)、PKSCGCKPCICP(SEQ ID NO：250)、PRDCGCKPCPPCP(SEQ ID NO：251)、PRDCGCHTCPPCP(SEQ ID NO：252)、PKSCDCHCPPCP(SEQ ID NO：253)及RKCCVECPPCP(SEQ ID NO：254)。

在某些實施例中，TFcBA不包含第一或第二鉸鏈區。舉例而言，TFcBA可包含將第一結合位點連接至第一CH2結構域之連接性連接子來代替第一鉸鏈區。此類連接子可為Gly-Ser連接子，如本文在TFc連接子情形中進一步描述。在某些實施例中，連接性連接子包含(G₄ S)₂ 或(G₄ S)₃ 或(G₄ S)₄ 序列。亦可使用其他肽序列作為連接性連接子，只要其提供該連接子之某些部分所需之可撓性及剛性即可。在某些實施例中，TFcBA不包含第二鉸鏈區，而是包含連接性連接子，其可為Gly-Ser連接子，類似於TFc連接子。

例示性CH2結構域

在某些實施例中，Fc區包含CH2結構域。CH2結構域可來自人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或來自其組合(「雜交」CH2結構域)。例示性全長野生型IgG1 CH2結構域由以下aa序列組成： (SEQ ID NO：261)。

具有N297Q取代以減少在該殘基處之糖基化，以致該變體在哺乳動物細胞中表現時實質上為非糖基化的例示性全長IgG1 CH2結構域由以下胺基酸序列組成： (SEQ ID NO：25)。

例示性全長野生型IgG4 CH2結構域包含以下aa序列： (SEQ ID NO：262)。

具有T299K取代以減少在殘基297處之糖基化，以致該變體在哺乳動物細胞中表現時實質上為非糖基化的例示性全長IgG4 CH2結構域由以下胺基酸序列組成： (SEQ ID NO：26)。

CH2結構域亦可包含因一或多個aa修飾(例如aa缺失、添加或取代)而不同於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之aa序列的aa序列。在某些實施例中，CH2結構域包含與天然存在(或野生型)之CH2結構域之胺基酸序列(例如SEQ ID NO：261及262)或與SEQ ID NO：25或26有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個aa不同的aa序列。在某些實施例中，CH2結構域包含與天然存在之CH2結構域(例如SEQ ID NO：261及262)或SEQ ID NO：25或26至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致或類似的aa序列。例示性修飾包括減少或移除在aa 297處之糖基化的其他修飾。修飾一般可包含在EU位置297-299(aa基元NXT)之任一者中的胺基酸取代，由此使得該變體當在哺乳動物細胞中表現時為實質上非糖基化的。除T299K外，可在aa 299處進行之減少aa 297處之糖基化的其他取代包括T299S、T299A、T299N、T299G、T299Y、T299C、T299H、T299E、T299D、T299R、T299G、T299I、T299L、T299M、T299F、T299P、T299W及T299V，如例如WO/2005/018572中所述。

其他aa變化可影響抗體效應子功能，例如ADCC及CDC，或穩定性，或其他所需抗體特徵。舉例而言，FcγRI結合至IgG1 Fc區可藉由修飾Leu235及/或Gly237來進行調節。結合至C1q以提供CDC可藉由Ala330及/或Pro331之取代來調節。可對CH2結構域進行以調節效應子功能的其他修飾包括在位置234至238、253、279、310、318、320及322處之一或多個aa處的取代。

例示性CH3結構域

在某些實施例中，TFcA(例如TFcBA)之第一及/或第二Fc區包含CH3結構域。CH3結構域可來自人類免疫球蛋白，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或來自其組合(「雜交」CH3結構域)。例示性全長野生型IgG1 CH3結構域包含以下aa序列： (SEQ ID NO：27)。

在某些實施例中，可使用SEQ ID NO：27之變體。舉例而言，可缺失CH3結構域之C末端離胺酸(參看圖3中之SEQ ID NO：28)。在其他實施例中，CH3結構域包含aa取代D356E及L358M且C末端離胺酸可存在或不存在(分別為SEQ ID No：29及30；且顯示於圖3中)。

在某些實施例中，TFcA之第一及/或第二CH3結構域分別經修飾成增強包含第一及第二CH3結構域之第一與第二Fc之締合。該等CH3修飾在本文中稱為締合增強性修飾(「AEM」)。如實例中進一步描述的，已意外地發現添加TFc連接子來接合Ab之兩個Fc區使具有AEM之Ab適當組裝之能力進一步增強且增加其穩定性。

可使用之例示性AEM修飾為產生「突出插入空穴中(knobs-into-holes)」之修飾，且其描述於例如美國專利第7,183,076號中。在此策略中，CH3結構域經工程改造成使一個為突起之「突出」或「凸起」且另一個為互補之「空穴」，從而有利於CH3結構域之締合。產生「空穴」的針對CH3結構域之例示性aa修飾為aa取代T366S、L368A及Y407V之組合(例如，在SEQ ID NO：31-34中；圖3)。此類具有「空穴」之CH3結構域將有利地與具有「突出」或「凸起」之CH3結構域，例如包含胺基酸取代T366W(例如在SEQ ID NO：35-38中；圖3)之CH3結構域形成二聚體。該突出/空穴突變對在本文中稱為「AEM模組1」或「AEM 1」，其中第一及第二CH3結構域分別稱為「AEM 1.1」及「AEM 1.2」。

在另一實施例中，TFcA之兩個CH3結構域之一包含由取代 Y407T(例如，在SEQ ID NO：39-42中；圖3)產生之空穴且另一CH3結構域包含由取代T366Y(例如，在SEQ ID NO：43-46中；圖3)產生之突出。該第二突出/空穴突變對在本文中稱為「AEM模組2」或「AEM 2」，其中第一及第二CH3結構域分別稱為「AEM 2.1」及「AEM 2.2」。

兩個CH3結構域之間締合亦可藉由除產生典型突出/空穴外之機制，例如藉由靜電修飾來增強。在一個實施例中，TFcA之兩個CH3結構域之一包含取代S364H及F405A之組合(例如，在SEQ ID NO：47-50中；圖3)且另一CH3結構域包含取代Y349T及T394F之組合(例如，在SEQ ID NO：51-54中；圖3)。該第三對修飾在本文中稱為「AEM模組3」或「AEM 3」，其中第一及第二CH3結構域分別稱為「AEM 3.1」及「AEM 3.2」。

在一個實施例中，TFcA之兩個CH3結構域之一包含取代K370D、K392D及K409D之組合(例如，在SEQ ID NO：55-58中；圖3)且另一CH3結構域包含取代E(或D)356K、E357K及D399K之組合(例如，在SEQ ID NO：59-62中；圖3)。該第四對修飾在本文中稱為「AEM模組4」或「AEM 4」，其中第一及第二CH3結構域分別稱為「AEM 4.1」及「AEM 4.2」。取決於所使用之序列，在356位之aa可為E或D，且因此該位置處之取代稱為「E(或D)356」。

在某些實施例中，TFcA之第一及/或第二CH3結構域包含使得添加一或多個半胱胺酸以允許在兩個CH3或Fc結構域之間形成一或多個二硫鍵的一或多個修飾。在一個實施例中，TFcA之兩個CH3結構域之一包含取代Y349C(例如，在SEQ ID NO：63-66中；圖3)且另一CH3結構域包含取代S354C(例如，在SEQ ID NO：67-70中；圖3)。該對二硫鍵形成性修飾在本文中稱為「DiS模組1」或「DiS 1」，其中第一及第二CH3結構域分別稱為「DiS 1.1」及「DiS 1.2」。

在其他實施例中，將半胱胺酸添加至TFcA之兩個CH3結構域各自之C末端，由此在兩個CH3結構域之間形成二硫鍵。舉例而言，該兩個CH3結構域之一可包含羧基末端aa「PGK」經「KSCDKT」取代(例如，在SEQ ID NO：71-72中；圖3)且另一CH3結構域可包含羧基末端aa「PGK」經「GEC」取代(例如，在SEQ ID NO：73-74中；圖3)。

在某些實施例中，CH3結構域包含兩個或兩個以上aa變化之組合。舉例而言，一或多個AEM可與一或多個DiS修飾組合。在一例示性實施例中，CH3結構域包含空穴突變T366S、L368A、Y407V及產生二硫鍵之突變Y349C(AEM 1.1+DiS 1.1)。此類CH3結構域可在TFc中與包含突出突變T366W及產生二硫鍵之突變S354C(AEM 1.2+DiS 1.2)之CH3結構域組合。包含此取代組合之例示性aa序列包括SEQ ID NO：75-82(圖3)。

在CH3結構域中產生的有利於CH3結構域或包含其之Fc區之締合的AEM與DiS之例示性組合陳述於表5 中，其中「是」指示可使用之組合。

* 相對於在356位具有E之序列(例如SEQ ID NO：29及30)，此突變為E356K。

具有AEM及/或DiS之例示性IgG1 CH3結構域之aa序列包含SEQ ID NO：31-98。該等aa序列之比對提供於圖3中，且該等序列之說明提供於表6中。表6及圖3中之CH3結構域係根據其AEM模組(編號1、2、3或4)及其DiS模組(編號1或2)來組織。相容性CH3結構域以在「1」及「2」之前加模組編號來列出。

可用於TFcA中之其他CH3 AEM包括以下aa修飾對，其中一對AEM修飾中第一及第二成員之取代係以「及」隔開：

1)F405A及T394F；S364D及Y349K；S364E及L368K；S364E Y349K；S364F及K370G；S364H及Y349K；S364H及Y349T；S364Y及K370G；T411K及K370E；V397S/F405A及 T394F；K370R/T411K及K370E/T411E；L351E/S364D及Y349K/L351K；L351E/S364E及Y349K/L351K；L351E/T366D及L351K/T366K；P395T/V397S/F405A及T394F；S364D/K370G及S364Y/K370R；S364D/T394F及Y349K/F405A；S364E/F405A及Y349K/T394F；S364E/F405S及Y349K/T394Y；S364E/T411E及Y349K/D401K；S364H/D401K及Y349T/T411E；S364H/T394F及Y349T/F405A；Y349C/S364E及Y349K/S354C；L351E/S364D/F405A及Y349K/L351K/T394F；L351K/S364H/D401K及Y349T/L351E/T411E；S364E/T411E/F405A及Y349K/T394F/D401K；S364H/D401K/F405A及Y349T/T394F/T411E；S364H/F405A/T411E及Y349T/T394F/D401K(WO2011/028952)。

2)T366W及Y407A；T366W及T366S；L368A及Y407Y；K409E及D399K；K409E及D399R；及K409D及D399K；K409D及D399R；K392E及D399R；K392E及D399K；K392D及D399R；及K392D及D399R(WO2009/089004)。

3)T366W及Y407A；F405A及T394W；Y407T及T366Y；T366Y/F405A及T394W/Y407T；T366W/F405W及T394S/Y407A；F405W/Y407A及T366W/T394S；及F405W及T394S(美國專利第7,642,228號)。

一般而言，此項技術中所述之任何其他AEM或Dis均可使用。

CH3結構域亦可包含與本文提供之CH3 aa序列(例如SEQ ID NO：27-98)存在至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30個aa不同的aa序列。在某些實施例中，CH3結構域包含與本文提供之CH3 aa序列(例如SEQ ID NO：27-98)至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的aa序列。由於若干抗體效應子功能，例如ADCC及CDC，至少部分經由CH3結構域中之區域介導，故可對CH3結構域進行之aa變化包括影響Fc區之效應子功能的變化。可對CH3結構域進行之例示性修飾於本文中進一步描述。

例示性Fc區

TFcA之Fc區包含鉸鏈區、CH2結構域、CH3結構域及CH4結構域中之一或多者，其可為或不為全長的且其可為野生型或具有aa修飾的。Fc結構域可來自人類免疫球蛋白(「Ig」)或非人類Ig，例如小鼠Ig，且可來自任何類型或同型之Ig，諸如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)或IgA(例如IgA1及IgA2)。

在某些實施例中，TFcA包含了包含來自人類免疫球蛋白(例如IgG1)之第一及/或第二Fc區之TFc。Fc區較佳以連續胺基至羧基末端次序包含：IgG1鉸鏈區或其部分(例如核心及下游鉸鏈區)、IgG1 CH2結構域及IgG1 CH3結構域。Fc區可包含本文所陳述之IgG1鉸鏈區(或其部分)、IgG1 CH2結構域及IgG1 CH3結構域之任何組合，只要TFcA具有所需活性及穩定性即可。

在某些實施例中，TFc包含作為雜交Fc區之第一及/或第二Fc區。雜交Fc區可包含來自兩個或兩個以上IgG亞類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之Fc結構域。在一個實施例中，雜交Fc區以連續胺基至羧基末端次序包含：IgG1上游鉸鏈區、IgG4中間及下游鉸鏈區、IgG4 CH2結構域及IgG1 CH3結構域。例示性IgG1/IgG4雜交Fc區可包含本文所陳述之IgG1上游鉸鏈區、IgG4核心鉸鏈區、IgG4下游鉸鏈區、IgG4 CH2結構域及IgG1 CH3結構域之任何組合，只要包含TFc之TFcA具有所需活性及穩定性即可。

在某些實施例中，Fc區不包含全長鉸鏈區。舉例而言，TFcBA可包含包括全長鉸鏈區之第一Fc區及包括由核心及/或下游鉸鏈區組成且不包含上游鉸鏈區之鉸鏈區的第二Fc區。

在某些實施例中，TFc包含之鉸鏈區已修飾成包含半胱胺酸以與另一Fc區中之另一半胱胺酸形成二硫鍵，藉此使TFc穩定。在一個實施例中，IgG1鉸鏈區包含取代H224C及T225C(例如SEQ ID NO：18；圖2)。在另一實施例中，鉸鏈區包含取代T223C(例如SEQ IDNO：19；圖2)。

在一個實施例中，TFcA包含IgG1 TFc，其以胺基至羧基末端次序包含：i)選自由SEQ ID NO：4(全長IgG1鉸鏈區)、SEQ ID NO：18(具有H224C/T225C之SEQ ID NO：4)、SEQ ID NO：19(具有T223C之SEQ ID NO：4)及SEQ ID NO：23(僅中間及下游IgG1鉸鏈區)中陳述之aa序列組成之鉸鏈區之群的IgG1鉸鏈區；ii)包含SEQ ID NO：261或25之IgG1 CH2結構域；及iii)包含選自由SEQ ID NO：31-98中陳述之aa序列組成之CH3結構域之群之aa序列的CH3結構域(圖3)。在另一實施例中，TFcA包含IgG1/IgG4雜交TFc，其以胺基至羧基末端次序包含：i)選自由SEQ ID NO：20(IgG1上游鉸鏈區及IgG4核心及下游鉸鏈區)、SEQ ID NO：21(具有H224C/T225C之SEQ ID NO：20)、SEQ ID NO：22(具有T223C之SEQ ID NO：20)及SEQ ID NO：24(僅中間及下游IgG4鉸鏈區)中陳述之aa序列組成之鉸鏈區之群的鉸鏈區；ii)包含SEQ ID NO：262或26之IgG4 CH2結構域；及iii)包含選自由aa序列SEQ ID NO：31-98組成之CH3結構域之群之aa序列的CH3結構域(圖3)。鉸鏈區及CH3結構域之例示性組合陳述於表7 中，其中「是」指示可使用之組合，且其中相容性修飾藉由空白行彼此隔開。

在一個實施例中，TFcA包含一種包含IgG1 Fc區之TFc，該IgG1 Fc區包含了含SEQ ID NO：4之鉸鏈區、含SEQ ID NO：25之CH2結構域及含SEQ ID NO：29之CH3結構域，且其可形成例如包含SEQ ID NO：99之IgG1 Fc區(參看表8及圖4)。IgG1鉸鏈區、IgG1 CH2結構域及IgG1 CH3結構域之其他組合及由該等組合產生之例示性IgG1 Fc提供於表8 中。表8中所列之例示性IgG1 Fc的aa序列(SEQ ID NO：99-132)提供於圖4中。表8 中之相容性IgG1 Fc係藉由空白行與其他IgG1 Fc隔開。

在一個實施例中，TFcA包含一種包含IgG1/IgG4 Fc區之TFc，該IgG1/IgG4 Fc區包含了含SEQ ID NO：20之鉸鏈區、含SEQ ID NO：26之CH2結構域及含SEQ ID NO：29之CH3結構域，且其可形成例如包含SEQ ID NO：133之IgG1/IgG4雜交Fc區(參看表9 及圖4)。IgG1/IgG4鉸鏈區、IgG4 CH2結構域及IgG1 CH3結構域之其他組合及由該等組合產生之例示性IgG1/IgG4雜交Fc提供於表9 中。表9 中所列之例示性IgG1/IgG4雜交Fc的aa序列(SEQ ID NO：133-166)提供於圖5中。表9 中之相容性IgG1 Fc係藉由空白行與其他IgG1 Fc隔開。

用於TFcA中之Fc區亦可包含因一或多個aa修飾(例如aa缺失、添加或取代)而不同於本文所述者(例如SEQ ID NO：99-166)的aa序列。在某些實施例中，Fc區包含與本文陳述之序列，例如與選自由SEQ ID NO：99-166組成之群之序列有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50個aa不同的aa序列。在某些實施例中，Fc區包含與本文陳述之序列，例如選自由SEQ ID NO：99-166組成之群之序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的aa序列。舉例而言，由選自由SEQ ID NO：99-166組成之群之aa序列組成的Fc區之CH3結構域可包含C末端離胺酸及/或E356D及/或M358L之缺失。由於若干抗體效應子功能，例如ADCC及CDC，係經由Fc區介導，故可對Fc區進行之aa變化包括影響Fc區之效應子功能的變化。該等結構域之例示性突變陳述於本文中。該等aa修飾中任一者均為容許的，只要Fc區保持所需特性，例如生物活性、穩定性及低免疫原性。

影響效應子活性之例示性Fc修飾

TFcA可包含包括影響Fc區之效應子活性之aa修飾的TFc。例示性aa修飾陳述於下。

Fc部分中改變抗體效應子功能之aa殘基置換為此項技術中已知的(參看例如美國專利第5,648,260號及第5,624,821號)。抗體之Fc部分介導若干重要之效應子功能，例如細胞因子誘導、抗體依賴性細胞之細胞毒性(「ADCC」)、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性(「CDC」)及抗體與抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。取決於治療目標，在一些情形中，該等效應子功能為治療性抗體所需的，但在其他情形中可能並非必需的或甚至是有害的。某些人類IgG同型，特別是IgG1及IgG3，分別經由結合至FcγR及補體CIq來介導ADCC及CDC。新生Fc受體(FcRn)為決定抗體之循環半衰期之關鍵組分。

在一個實施例中，TFcA保持以下一或多種且較佳全部屬性：ADCC及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)，其在人體中係藉由與活化之FcγRI、FcγRIIa/c、FcγRIIIa及抑制性FcγRIIb受體相互作用來決定；CDC，其係由抗體結合至補體系統之組分所引起；及長半衰期，其係經由新生Fc受體(FcRn)引起之活性再循環所介導。必要時，該等功能皆可調諧成優化抗癌療法之功效。

可對免疫球蛋白恆定區進行某些aa修飾，例如一或多個aa之添加、缺失及/或取代，以降低或增加恆定結構域之天然生物活性，諸如以上陳述者。

在某些實施例中，TFcA(例如TFcBA)在Fc區中包含改變結構域之一或多種不依賴於抗原之效應子功能(例如，包含該結構域之蛋白質的循環半衰期)的aa修飾(例如，aa取代、添加或缺失)。當與缺乏此類aa變化之抗體相比較時，例示性抗體展現與FcRn之結合增加或減少，且因此在血清中分別具有增加或減少的半衰期。預期包含對FcRn之親和力改良之Fc變體的抗體具有較長血清半衰期，而包含具有降低之FcRn結合親和力之Fc變體的抗體預期具有較短半衰期。在一個實施例中，具有改變之FcRn結合之TFcA包含至少一個在Fc區之「FcRn結合環」內具有一或多個aa變化的Fc區。FcRn結合環係包含在野生型全長Fc之aa殘基280-299(EU)內。在某些實施例中，具有改變之FcRn結合親和力之TFcA包含至少一個在15Å FcRn「接觸區」內具有一或多個aa取代的Fc區。術語15Å FcRn「接觸區」包括在野生型全長Fc結構域之以下位置處的殘基：243-261、275-280、282-293、 302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424-440(EU)。在某些實施例中，具有改變之FcRn結合親和力之TFcA包含至少一個在對應於以下任一EU位置之aa位置處具有一或多個aa變化之Fc區(例如一個或兩個Fc部分)：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如N434A或N434K)及438。改變FcRn結合活性之例示性aa變化揭示於國際PCT公開案第WO05/047327號中。

增強FcRn結合之其他Fc修飾包括在259、308、428及434位置處之取代，例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y、434M、428L/434S、259I/308F及259I/308F/428L。增加Fc與FcRn之結合的其他變體包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，2004,J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216；Hinton等人，2006 Journal of Immunology 176：346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal of Biological Chemistry,2001,276(9)：6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等人，Journal of Immunology,2002,169：5171-5180；Dall'Acqua等人，2006,Journal of Biological Chemistry 281：23514-23524)。用於調節FcRn結合之其他修飾描述於Yeung等人，2010,J Immunol,182：7663-7671中。

在一些實施例中，TFcA包含Fc變體，該Fc變體包含例如與野生型Fc區相比較，改變多肽之抗原依賴性效應子功能，特別是ADCC或補體活化的aa變化。在例示性實施例中，該等抗體展現與Fc γ受體(例如CD16)之結合的改變。當與野生型多肽相比較時，該等抗體展現與FcγR之結合增加或減少，且因此分別介導效應子功能之增強或減弱。預期對FcγR之親和力改良之Fc變體可增強效應子功能，且該等蛋白質可在治療需要破壞靶分子之哺乳動物之方法方面，例如在腫瘤療法方面具有有用之應用。相比之下，預期具有降低之FcγR結合親和力之Fc變體可降低效應子功能。在一個實施例中，如與包含野生型Fc區之TFcA相比較，TFcA包含至少一種選自由以下組成之群的改變之抗原依賴性效應子功能：調理作用、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性、抗原依賴性細胞之細胞毒性(ADCC)或效應細胞調節。

在某些實施例中，TFcA展現與活化之FcγR(例如FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)之結合的改變。在某些實施例中，TFcA展現與抑制性FcγR(例如FcγRIIb)之結合親和力之改變。在其他實施例中，具有增加之FcγR結合親和力(例如增加之FcγRIIIa結合親和力)之TFcA包含至少一個在對應於以下一或多個位置之aa位置處具有aa變化的Fc結構域：239、268、298、332、334及378(EU)。在某些實施例中，具有降低之FcγR結合親和力(例如降低之FcγRI、FcγRII或FcγRIIIa結合親和力)之TFcA包含至少一個在對應於以下一或多個位置之aa位置處具有aa取代的Fc結構域：234、236、239、241、251、252、261、265、268、293、294、296、298、299、301、326、328、332、334、338、376、378及435(EU)。

在某些實施例中，具有增加之補體結合親和力(例如增加之C1q結合親和力)之TFcA包含在對應於以下一或多個位置之aa位置處具有aa變化的Fc結構域：251、334、378及435(EU)。在某些實施例中，具有降低之補體結合親和力(例如降低之C1q結合親和力)之TFcA包含在對應於以下一或多個位置之aa位置處具有aa取代的Fc結構域： 239、294、296、301、328、333及376(EU)。改變FcγR或補體結合活性之例示性aa變化揭示於國際PCT公開案第WO05/063815號中。在某些實施例中，TFcA可包含以下一或多個特定Fc區取代：S239D、S239E、M252T、H268D、H268E、I332D、I332E、N434A及N434K(EU)。

減少與FcγR及/或補體之結合的其他Fc變體包括了包含以下一或多個aa取代之變體：34G、235G、236R、237K、267R、269R、325L、328R、236R/328R、297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P及234V。移除297位之糖基化(參看下文)亦減少與FcyR之結合。

改良與FcγR及/或補體之結合的Fc修飾包括了包含以下一或多個aa取代之變體：236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D及332E。較佳之變體包括(但不限於)239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T及267E/268F/324T。用於增強FcγR及補體相互作用之其他修飾包括(但不限於)取代298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I及396L。

改良與FcγRllb之結合的變體包括了包含以下一或多個aa取代之變體：234D、234E、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y及332E、235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E及267E/328F。

調節Fc之Fc修飾描述於Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology 20：685-691中。

TFcA亦可包含改變TFcA之糖基化的aa取代。舉例而言，TFcA之免疫球蛋白恆定區可包含具有導致糖基化(例如，N連接或O連接之糖基化)減少之突變的Fc結構域，或可包含野生型Fc結構域之糖型之改變(例如，低海藻糖或無海藻糖之聚糖)。「經工程改造之糖型」係指共價附接至Fc區之碳水化合物組合物，其中該碳水化合物組合物在化學上不同於母體Fc區。經工程改造之糖型可用於多種目的，包括(但不限於)增強或減弱效應子功能。經工程改造之糖型可由此項技術中已知之多種方法產生(US 6,602,684；美國專利公開案第2010-0255013號；美國專利公開案第2003-0003097號；WO 00/61739A1；WO 01/29246A1；WO 02/31140A1；WO 02/30954A1)；(Potelligent^TM 技術(Biowa,Inc.,Princeton,NJ)及GlycoMAb^TM 糖基化工程改造技術(Glycart Biotechnology AG,Zurich,Switzerland)。該等技術中有許多係基於例如藉由在經工程改造或其他方式處理之各種生物體或細胞株(例如Lec-13 CHO細胞或大鼠融合瘤YB2/0細胞)中表現Fc多肽，藉由調控糖基化路徑中所涉及之酶(例如，FUT8[a1,6-海藻糖基轉移酶]及/或(31-4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III[GnTIll])，或藉由在Fc多肽得以表現之後對碳水化合物進行修飾來控制海藻糖化程度及/或對分共價附接至Fc區之寡糖。

在例示性實施例中，aa變化，例如aa取代，產生包含通常在aa位置297(EU)處所發現之N連接聚糖之糖基化減少的Fc區。Fc區亦可包含在aa位置297(EU)處具有低海藻糖或無海藻糖之聚糖。在某些實施例中，TFcA在含有aa序列NXT或NXS之糖基化基元(例如N連接之糖基化基元)附近或內部具有aa取代。在一特定實施例中，TFcA在對應於Fc之297或299(EU)之aa位置處包含aa取代，如本文進一步描述的。減少或改變糖基化之例示性aa取代揭示於國際PCT公開案第 WO05/018572號及美國專利公開案第2007/0111281號中。

在其他實施例中，TFcA包含具有一或多個位於溶劑暴露之表面處的經工程改造之半胱胺酸殘基或其類似物的至少一個Fc結構域。較佳該經工程改造之半胱胺酸殘基或其類似物不干擾TFcA之所需生物活性。舉例而言，理想的情形是，該改變不會干擾Fc結合至Fc受體(例如，FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或補體蛋白(例如C1q)，或引發免疫效應子功能(例如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或CDC)的能力。在某些實施例中，TFcA包含一種Fc結構域，該Fc結構域包含至少一個工程改造之游離半胱胺酸殘基或其類似物，其實質上不與第二半胱胺酸殘基形成二硫鍵。TFcA可包含在CH3結構域中之以下一或多個位置處具有工程改造之半胱胺酸殘基或其類似物的Fc區：349-371、390、392、394-423、441-446及446b(EU)，且更特定地位置350、355、359、360、361、389、413、415、418、422、441、443及EU位置446b。

所需效應子功能亦可藉由自特定免疫球蛋白種類或亞類中選擇Fc，或藉由將來自特定免疫球蛋白種類或亞類(例如IgG1、IgG2等)之特定區域組合來獲得。舉例而言，由於ADCC及CDC(分別經由IgG與FcγR及C1q結合)由位於鉸鏈區及CH2結構域中之殘基介導，且由於IgG4基本上沒有效應子功能，故藉由將IgG4之鉸鏈區及CH2結構域與IgG1之CH3結構域組合來構建的Fc具有低得多的效應子功能。IgG1/IgG3雜交變體可藉由用IgG3中兩種同型不同之位置處的胺基酸取代IgG1 CH2及/或CH3區中之位置來構建。因此，構建的雜交變體IgG抗體可包含以下一或多個取代：274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R及436F。在某些實施例中，IgG1/IgG2 雜交變體可藉由用IgG1中兩種同型不同之位置處的胺基酸取代IgG2CH2及/或CH3區中之位置來構建。因此，構建的雜交變體IgG抗體可包含以下一或多個胺基酸取代：233E、234L、235L、-236G(稱為在236位處之甘胺酸插入)及327A。

例示性TFc連接子

TFcA可包含一種TFc，其包含經由TFc連接子連接至第二Fc區之第一Fc區。多種連接子均可使用，只要其可撓性足以允許TFc及包含TFc之TFcA適當摺疊即可。在某些實施例中，連接子為生物惰性的，例如在很大程度上不能誘導生物反應，例如免疫反應。

TFc連接子可為1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或至少90-100個aa長。TFc連接子之尺寸可取決於第二Fc區包含鉸鏈區、其一部分抑或完全無鉸鏈區。舉例而言，當第二Fc區包含鉸鏈區時，使用的TFc連接子可比當第二Fc區不包含鉸鏈區時的短。舉例而言，當第二Fc區不包含鉸鏈區時，TFc連接子可長出對應於鉸鏈區長度之aa數量。當第二Fc區不包含上游鉸鏈區時，TFc連接子可長出對應於上游鉸鏈區長度之aa數量。在一較佳實施例中，TFcA，例如包含由中間及下游鉸鏈區組成之第二鉸鏈區的TFcA，包含的TFc連接子包含35至45個aa，諸如37至43個aa，諸如38至42個aa，諸如39至41個aa，且更特定地40個aa。

TFc連接子可包含Gly-Ser連接子。「Gly-Ser連接子」係指由甘胺酸及絲胺酸殘基組成之肽。例示性Gly-Ser連接子包含具有式(Gly₄ Ser)_n 之aa序列，其中n為正整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)。舉例而言，在某些實施例中，TFc連接子包含或由以下組成：(Gly₄ Ser)₃ ，或(Gly₄ Ser)₄ ，或(Gly₄ Ser)₅ ，或(Gly₄ Ser)₆ ，或(Gly₄ Ser)₇ ，或(Gly₄ Ser)₈ 。在一較佳實施例中，TFc連接子為(Gly₄ Ser)₈ 。

可使用之其他連接子包括了包含Gly及Ser但不呈(G4S)n結構之連接子。舉例而言，連接子可包含(Gly-Gly-Ser)n或(Gly-Ser-Gly-Ser)n，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更高。其他連接子可包含Pro或Thr。適合連接子可見於http：//partsregistry.org/Protein_domains/Linker之Registry of Standard Biological Parts(亦參看例如，Crasto CJ及Feng JA.LINKER：a program to generate linker sequences for fusion proteins.Protein Eng 2000年5月；13(5)309-12；及George RA及Heringa J.Ananalysis of protein domain linkers：their classification and role in protein folding.Protein Eng 2002年11月；15(11)871-9)。

在某些實施例中，TFc連接子可包含以下aa序列：TRPAPPSTATTAGSTPQPESASPSGKEPAASSPSSTNTGS(SEQ ID NO：169)。

亦可使用包含與SEQ ID NO：169或與(G4S)n序列有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個aa不同之aa序列的TFc連接子。

TFc連接子亦可為非肽連接子，諸如非肽聚合物。術語「非肽聚合物」係指包括藉由除肽鍵外之共價鍵相互連接之兩個或兩個以上重複單元的生物相容性聚合物。非肽聚合物之實例包括聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯醚、生物可降解聚合物(諸如PLA(聚(乳酸)及PLGA(聚(乳酸-乙醇酸))、脂質聚合物、幾丁質及玻尿酸。最佳為聚(乙二醇)(PEG)。

例示性TFc

TFcA可包含一種TFc，其包含經由TFc連接子連接至第二Fc區之第一Fc區。在某些實施例中，TFc包含彼此相同之第一與第二Fc區。在其他實施例中，該第一Fc區與該第二Fc區因至少一個aa而彼此不同(「異二聚體TFc」)。第一Fc區及第二Fc區可為本文所揭示之任何Fc區或其變體。舉例而言，TFc可包含包括全長鉸鏈區(例如全長IgG1或IgG1/IgG4雜交鉸鏈區)之第一Fc區，及包括部分鉸鏈區(例如，無上游鉸鏈區之鉸鏈區)之第二Fc區。

第一Fc區及第二Fc區可與本文所述之任何TFc連接子組合。如上文所陳述，TFc連接子之長度一般可取決於第二Fc區包含鉸鏈區、其一部分抑或完全無鉸鏈區。

在某些實施例中，IgG1 TFc包含了含SEQ ID NO：99之第一Fc區及含SEQ ID NO：100之第二Fc區。可用於IgG1 TFc中之第一Fc區與第二Fc區之組合陳述於表10 中。

在某些實施例中，IgG1/IgG4雜交TFc包含了含SEQ ID NO：133之第一Fc區及含SEQ ID NO：134之第二Fc區。可用於IgG1/IgG4雜交TFc中之第一Fc區與第二Fc區之組合陳述於表11 中。

TFc可包含表10或11中所陳述之兩個Fc之組合，該兩個Fc係經由TFc連接子連接在一起形成連續多肽，該多肽以胺基至羧基末端次序包含：第一Fc區，其在其C末端連接至TFc連接子之N末端，該TFc連接子在其C末端連接至第二Fc區之N末端。該TFc連接子可包含20到50個胺基酸長度或由其組成。

例示性TFc可包含：i)第一Fc區，其包含了含SEQ ID NO：4 之鉸鏈區、含SEQ ID NO：25之CH2結構、含SEQ ID NO：33之CH3結構域；ii)TFc連接子，其包含(G₄ S)₈ ；及iii)包含了含SEQ ID NO：23之鉸鏈區、含SEQ ID NO：25之CH2結構域及含SEQ ID NO：37之CH3結構域的第二Fc區。包含該組成分之例示性IgG1 TFc為包含SEQ ID NO：171之TFc。形成IgG1及IgG1/IgG4雜交TFc之結構域或元件之其他組分分別提供於表12及13 中。表12及13 中之元件或結構域各自以其SEQ ID NO及其所包含之特定AEM及/或DiS來提及。表12及13 中之結構域或元件各自可直接或間接連接。

表12 中所列每一TFc之aa序列(SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193及195)提供於圖6中。表13中所列每一TFc之aa序列(SEQ ID NO：197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219及221)提供於圖7中。表12及13 中之第一欄列出了包含該表之對應行中所列之成分的例示性TFc之名稱及SEQ ID NO。

在某些實施例中，TFc包含與本文所述之TFc之aa序列，諸如選自由SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219及221組成之群之aa序列有至多10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或300個aa不同的aa序列，只要該TFc具有所需生物活性，諸如效應子功能或其缺乏、適當摺疊、足夠穩定性及溶解性即可。差異可為一或多個aa插入、缺失及/或取代。在某些實施例中，TFc可包含與本文所述之TFc之aa序列，例如選自由SEQ ID NO：171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219及221組成之群之aa序列至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的aa序列，只要包含該TFc之TFcA具有所需生物活性，諸如效應子功能或其缺乏、適當摺疊、足夠穩定性及/或足夠溶解性即可。

例示性結合位點

TFcA可為包含單一結合位點之單價TFcA。該單一結合位點可位於TFc之胺基末端或羧基末端。該單一結合位點可為Fab或scFv。當該單一結合位點為Fab時，單價TFcA包含了含VH結構域及視情況存在之CH1結構域之重鏈及含VL結構域及視情況存在之CL結構域之輕鏈。

TFcA亦可為包含兩個結合位點之TFcBA，例如其中每個結合位點結合至相同或不同之抗原決定基或抗原(二價單特異性或雙特異性TFcA)。TFcBA之結合位點可屬於相同類型或不同類型。舉例而言，兩個結合位點可為TFc，兩個結合位點可為Fab，一個結合位點可為Fab且另一結合位點可為scFv。亦可使用單結構域結合位點。Fab一般將包含VH結構域，其可連接至TFcBA之重鏈上之CH1結構域；及VL結構域，其可連接至該分子之輕鏈上之CL結構域。scFv一般將包含連接至scFv連接子之VH結構域，該scFv連接子連接至VL結構域。

scFv可藉由連接性連接子連接至TFc。連接性連接子可為約1-5、1-10、1-15、1-20個aa長或更長。連接性連接子較佳為化學惰性的、非免疫原性的且具有所需可撓性及剛性以允許包含該scFv之TFcBA之適當構型。在一個實施例中，連接性連接子包含Gly-Ser序列，例如aa序列(G₄ S)_n ，其中n為1、2、3、4或5或更多。在一個實施例中，連接性連接子包含(G₄ S)₂ (參看例如，圖9)。

scFv包含scFv連接子，其將VH及VL結構域連接在一起。scFv連接子可為15-30或20-25個aa長。scFv連接子較佳為化學惰性的、非免疫原性的且具有所需可撓性及剛性以允許包含該scFv之TFcBA之適當構型。在一個實施例中，scFv連接子包含Gly-Ser序列，例如aa序列(G₄ S)_n ，其中n為1、2、3、4或5或更多。然而，亦可使用其他序列。在某些實施例中，scFv連接子可包含單獨或與其他aa(諸如(G₄ S)_n 序列)組合之一部分鉸鏈區或全長鉸鏈區。在某些實施例中，scFv連接子在肽連接子(諸如Gly-Ser連接子，例如(G₄ S)₄ )上游包含序列「AST」(CH1結構域之前3個aa)(參看例如圖9)。

在某些實施例中，TFcA不包含第一及/或第二鉸鏈區。TFcA可包含連接性連接子代替鉸鏈區。此類連接子可為Gly-Ser連接子，如本文在TFc連接子情形中進一步描述。例示性連接性連接子可短於TFc連接子。在某些實施例中，連接性連接子包含(G₄ S)₃ 或(G₄ S)₄ 序列。在某些實施例中，連接性連接子包含鉸鏈區之一部分，例如上游鉸鏈區、中間鉸鏈區、下游鉸鏈區或其組合；或該等及另一肽序列之一的一部分，諸如(G₄ S)_n 序列，其中n為1、2、3、4或5。亦可使用其他肽序列作為連接性連接子，只要其提供該連接子之某些部分所需之可撓性及剛性即可。

在某些實施例中，結合位點為抗原結合位點，諸如Fab、scFv或單一結構域。例示性TFcA包含一或多個VH及/或VL CDR，諸如來自本文提供之一或多個可變區者。在某些實施例中，抗c-Met結合位點包含圖9中陳述之VHCDR3及/或VLCDR3序列，諸如人類化抗體5D5之可變結構域者(US2006/0134104)或抗c-Met結合位點2(參看實例3)。在某些實施例中，抗c-Met結合位點包含圖9中陳述之VH結構域之一的1、2或3個CDR，及/或圖9中陳述之VL結構域之1、2或3個CDR。在某些實施例中，抗EGFR結合位點包含圖9中陳述之VHCDR3及/或VLCDR3序列。在某些實施例中，抗EGFR結合位點包含圖9中陳述之VH結構域之一的1、2或3個CDR，及/或圖9中陳述之VL結構域之1、2或3個CDR。結合位點亦可包含圖9中陳述之一或多個CDR，其中1、2或3個aa已變化，例如經取代、添加或缺失，只要該等結合位點仍能夠特異性結合至其靶即可。

在某些實施例中，TFcA包含圖9中陳述之一或多個可變結構域。舉例而言，抗c-Met結合位點可包含圖9中陳述之VH及/或VL序列，諸如人類化抗體5D5之可變結構域(US2006/0134104)或抗c-Met結合位點2。例示性抗EGFR結合位點包含圖9中陳述之VH及/或VL序列，諸如帕尼單抗、2224、西妥昔單抗或人類化西妥昔單抗H1L1、H1L2、H2L1或H2L2之序列(參看實例3)。

在某些實施例中，抗c-Met/抗EGFR TFcA包含抗c-Met Fab及抗EGFR scFv。表14 顯示了以下可用於形成TFcA之抗c-Met及抗EGFR aa序列各自之CDR或可變結構域的組合。該表提供了SEQ ID NO(若在本文中提供該序列)，或「是」(若一個組合可能)，但所得aa序列未具體提供。熟習此項技術者無需過多實驗即能夠基於該等蛋白質及其編碼核苷酸序列之所有成分已提供於本文中的事實來產生此類分子。

可與表14中之重鏈一起使用之輕鏈為TFcA中所用特定抗c-Met Fab之輕鏈。舉例而言，包含來自人類化5D5之VH結構域之TFcA，例如包含SEQ ID NO：225、227、229、235、239、260、281、283、285及342中任一者之TFcA，可與包含人類化5D5之VL結構域之輕鏈(亦即SEQ ID NO：231)一起使用。包含來自抗c-Met結合位點2之VH結構域的TFcA，例如包含SEQ ID NO：291之TFcA，可與包含抗c-Met結合位點2之VH結構域之輕鏈一起使用，例如SEQ ID NO：289之VL結構域。

抗原結合位點(例如本文所述者)可工程改造成使穩定性增強、異質性降低、表現增強、溶解性增強或其他所需特徵。用於工程改造抗體片段(諸如scFv、VH、VL及Fab)以使其具有增強之穩定性及增加之表現的方法描述於例如US 2006/0127893、US 2009/0048122及其中之參考文獻中。

可變結構域可與本文陳述者有或有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、100個aa不同，只要具有經修飾之可變區之結合位點保持其特異性結合至其靶抗原，例如選自以下之人類抗原的能力即可：c-MET、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α及β)、c-Kit、EPCAM及EphA2。用於TFcA(例如TFcBA)中之可變結構域亦可包含與圖9中陳述之VH或VLaa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的VH或VL aa序列，只要具有經修飾之可變結構域之結合位點保持其特異性結合至其靶抗原之能力即可。

抗c-MET及/或抗EGFR TFcBA亦可包含結合至人類c-Met或人類EGFR上與本文提供之結合位點(諸如具有圖9中陳述之序列者)相同之抗原決定基的結合位點。涵蓋於本文中之結合位點亦可競爭性阻斷本文所述之結合位點(諸如具有圖9中陳述之序列者)之結合或與其競爭。包含與本文所述之結合位點競爭與靶抗原或抗原決定基之結合之結合位點的TFcA包括例如當在參考結合位點之後添加於ELISA中時能夠替代參考結合位點(例如，如本文所述)之結合位點，以及當在參考結合位點之後將結合位點添加至ELISA中時防止參考結合位點結合的結合位點。

TFcA亦可包含來自此項技術中已知之抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰島素受體、抗RON、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFR α、抗PDGFR β、抗EPCAM、抗EphA2或抗EGFR抗體的可變結構域。已知之抗c-Met抗體陳述於美國專利第5,686,292號、美國專利第7,476,724號、WO 2004/072117、WO 2004/108766、WO 2005/016382、WO 2005/063816、WO 2006/015371、WO 2006/104911、WO 2007/126799及WO 2009/007427中。例示性已知抗EGFR抗體包括(Abgenix)(Yang,X.D.等人，Crit.Rev.Oncol./Hematol.38(2001)17-23)及人類化ICR62(WO 2006/082515)。例示性抗c-Kit抗體陳述於US 7915391及EP 0586445B1中。例示性抗ErbB2抗體陳述於US 5821337及US 7560111中。例示性抗ErbB3抗體陳述於US 7705130、US 7846440及WO 2011/136911中。例示性抗ErbB4抗體陳述於US 7332579及US 2010/0190964中。例示性抗IGF1R抗體陳述於US 7871611及US 7700742中。例示性抗胰島素受體抗體陳述於Bhaskar V.等人，Diabetes.2012 May；61(5)：1263-71中。例示性抗RON抗體陳述於WO 2012/006341、US 2009/0226442及US 7947811中。例示性抗VEGFR1抗體陳述於WO 2005/037235中。例示性抗VEGFR2抗體陳述於US 8057791及US 6344339中。例示性抗TNFR1抗體陳述於EP 1972637B1及US 2008/0008713中。例示性抗FGFR1抗體陳述於RoncaR等人，Mol Cancer Ther；9(12)；3244-53,2010；及WO 2005/037235中。例示性抗FGFR2抗體陳述於WO 2011/143318中。例示性抗FGFR3抗體陳述於WO 2010/002862及EP 1423428B1中。例示性抗FGFR4抗體陳述於WO 03/063893、WO 2008/052796及US 2010/0169992中。例示性抗PDGFR α抗體陳述於US 8128929及WO 1995/000659中。例示性抗PDGFR β抗體陳述於US 7740850中。例示性抗EPCAM抗體陳述於US 7976842、US 2003/0157054及WO 2001/007082中。例示性抗EphA2抗體陳述於EP 1575509B1、US 7402298及US 7776328中。例示性CD-44m抗體陳述於US 8071072、WO 2008/079246、US 6972324中。例示性CEA抗體陳述於US 7626011中。例示性ALK抗體陳述於US 6696548、US 7902340及WO 2008/131575中。例示性AXL抗體陳述於US 2010/0330095、US 2012/0121587及WO 2011/159980中。

在另一實施例中，結合位點為結合肽。c-Met結合肽係自例如Matzke,A.等人，Cancer Res 65(14)(2005)6105-10；及Tam,Eric,M.等人，J.Mol.Biol.385(2009)79-90獲知。

結合位點較佳以10^-6 、10^-7 、10^-8 、10^-9 M或10^-10 M之Kd，或甚至更低Kd值(如例如藉由表面電漿子共振，例如使用BIAcore系統所量測)特異性結合至其靶。

TFcA可特異性結合至任何靶蛋白，例如可溶性或膜人類靶蛋白。例示性靶蛋白包括選自由以下組成之群之人類受體蛋白：ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α及β)、c-Kit、c-Met、EPCAM及EphA2。

例示性重鏈及輕鏈

在一個實施例中，TFcA包含重鏈及輕鏈。在一個實施例中，抗c-Met/抗EGFR TFcBA包含了含圖9中所陳述之aa序列的重鏈及/或含實例3中所陳述之aa序列的輕鏈。

TFcBA亦可包含包括與圖9中陳述之aa序列有或有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、100、200或300個aa不同之aa序列的重鏈及/或輕鏈，只要該TFcBA具有所需生物特徵(如本文進一步描述)即可。TFcBA亦可包含包括與圖9中之重鏈或輕鏈之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列的重鏈及/或輕鏈，其中該TFcBA具有所需生物特徵。

TFcBA亦可包含超過2個結合位點，在此情況下，重鏈將包含1、2、3、4或更多VH結構域，其可連接至以下任一分子之N末端及/或C末端：Fab-TFc-scFv；Fab-TFc-Fab；scFv-TFc-scFv；及scFv-TFc-Fab。其他結合位點可為Fab或scFv。

TFcA之生物活性

在某些實施例中，結合至一或多個靶蛋白之TFcA(例如TFcBA)抑制由該一或多個靶蛋白所介導之信號轉導。舉例而言，抗c-Met+抗EGFR TFcBA可抑制經由c-Met及GFR中任一者或兩者介導的信號轉導。信號轉導之抑制可例如藉由EGFR及ERK之磷酸化之抑制來證明。在某些實施例中，當例如在實驗結束時測定時，例如，如實例中所陳述，相對於在不存在TFcA情況下之磷酸化，TFcA將c-Met、EGFR及/或ERK之磷酸化抑制至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高。較佳TFcA使c-Met及/或EGFR信號轉導幾乎完全(例如，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%)受到抑制，例如藉由c-Met及EGFR之磷酸化之抑制所量測。

儘管本節中所述之生物特徵主要係在抗c-Met/抗EGFR TFcBA之情形中描述，但該說明亦適用於其他TFcBA，以及單價TFcA。

a)配位體介導之c-Met磷酸化及b)配位體介導之EGFR磷酸化的抑制可藉由TFcBA可再現地降低a)由HGF家族配位體誘導之c-Met、b)由EGFR配位體(例如EGF)誘導之EGFR，或c)由c-Met配位體或EGFR配位體誘導之ERK的磷酸化程度(各自相對於未與TFcBA接觸之對照細胞的磷酸化而言)之能力證實。表現c-Met及/或EGFR之細胞可為天然存在之細胞或細胞株之細胞，或可藉由將編碼c-Met及/或EGFR之核酸引入宿主細胞中來重組產生。在某些實施例中，如例如藉由ELISA所測定且如實例中所陳述進行計算，TFcBA將HGF家族配位體介導之c-Met磷酸化抑制至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在某些實施例中，如例如藉由ELISA所測定且如實例中所陳述進行計算，TFcBA將EGF介導之EGFR磷酸化抑制至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在某些實施例中，如例如藉由ELISA所測定且如實例中所陳述進行計算，TFcBA將EGF及/或c-Met介導之ERK磷酸化抑制至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。

TFcBA可將配位體誘導之c-Met磷酸化抑制至少70%或80%，配位體誘導之EGFR磷酸化抑制至少85%、90%或95%且視情況將配位體誘導之ERK磷酸化抑制至少5%或10%。TFcBA亦可將配位體誘導之c-Met磷酸化抑制至少85%，配位體誘導之EGFR磷酸化抑制至少85%且視情況將配位體誘導之ERK磷酸化抑制至少5%。在某些實施例中，TFcBA亦可將配位體誘導之c-Met磷酸化抑制至少50%，配位體誘導之EGFR磷酸化抑制至少90%且視情況將配位體誘導之ERK磷酸化抑制至少5%。

TFcBA亦可由其抑制c-Met、EGFR及ERK中一或多者之磷酸化的EC50(亦即，獲得最大抑制作用之50%的TFcBA濃度)來定義，該等EC50可如本文進一步描述來測定。舉例而言，本文揭示之TFcBA可以10^-8 M、10^-9 M、10^-10 M或更低EC50值抑制c- Met磷酸化。其可以10^-8 M、10^-9 M、10^-10 M或更低EC50值抑制EGFR磷酸化。其可以10^-7 M、10^-8 M、10^-9 M、10^-10 M或更低EC50值抑制ERK磷酸化。本文揭示的一些TFcBA以10^-8 M、10^-9 M、10^-10 M或更低EC50值將c-Met之磷酸化抑制至少80%或85%；以10^-8 M、10^-9 M、10^-10 M或更低EC50值將EGFR之磷酸化抑制至少80%或85%；且視情況以10^-7 M、10^-8 M、10^-9 M、10^-10 M或更低EC50值將ERK之磷酸化抑制至少5%。在一些情形中，用本文揭示之TFcBA將能獲得c-Met之磷酸化及EGFR之磷酸化中任一者或兩者的基本上完全阻斷。

在某些實施例中，包含濃度為0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15mg/ml或更高(或介於任何該等兩個數字之間之濃度範圍)之TFcA的溶液包含超過70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%呈未聚集形式之TFcBA(在此上下文中稱為單體)，如例如藉由尺寸排阻層析法(SEC)，例如遵循如以下所述之穩定性測試所測定。單體之百分比可在以下一種穩定性測試之後於溶液中測定：a)在4℃下培育1、2、3、4、5或6天，或1、2、3或更多週；b)在室溫下培育1、2、3、4、5或6天，或1、2、3或更多週；c)在37℃下培育1、2、3、4、5或6天，或1、2、3或更多週；d)1、2、3、4或5個冷凍/解凍循環；及e)在室溫下於迴旋振盪器上攪動(例如輕柔攪動)例如1、2、3、4、5或更多小時。

在某些實施例中，在血清中於37℃下培育1、2、3、4或5天之後，相對於在第0天時之穩定性，TFcA展現至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之穩定性，其中蛋白質之穩定性係藉由例如SEC或藉由在培育之後量測其結合至其一或多種靶抗原之能力來測定。

在某些實施例中，如例如藉由差示掃描熱量測定法(DSF)所測定，TFcA之熔點(Tm)為至少50℃、55℃、58℃或60℃，如實例中所述。

TFcA可具有本文所陳述之兩個或兩個以上特徵之組合。舉例而言，TFcBA可將配位體誘導之c-Met磷酸化抑制至少70%且將配位體誘導之EGFR磷酸化抑制至少70%，且亦展現以下一或多個特徵：(i)如藉由DSF所測定，Tm為至少55℃或60℃；及(ii)在室溫下5天或更長時間、在4℃下2週後、一或多個冷凍-解凍循環之後或輕柔攪動後，以10mg/mL在PBS中為至少70%、80%或90%呈單體的。在某些實施例中，TFcBA具有至少60℃之Tm及在室溫下、4℃或37℃下至少90%之穩定性(在該等條件下培育之後相對於初始單體濃度之單體濃度)。

在某些實施例中，TFcA組合物包含以下一或多個特徵：1)在蛋白質A上進行純化之後，至少50%、60%、70%、80%、90%或更多蛋白質在SDS PAGE上可見；2)在SDS-PAGE凝膠上所觀測之至少50%、60%、70%、80%、90%或更多試樣具有準確之分子量；3)如藉由差示掃描熱量測定法所量測，熱穩定性曲線不顯示熔融球行為；4)如藉由SEC所觀察，不包含超過50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%或更多單體；及5)如藉由pEGFR抑制所量測，抑制超過95%的藉由添加外源EGF配位體所活化之EGF受體信號傳導。

標準分析法可用於測定TFcA(諸如TFcBA)之生物活性及特徵。例示性分析法提供於實例中。

核酸、表現載體及宿主細胞

本文提供編碼本文所述之多肽的核酸，例如DNA及RNA。本文提供之例示性核苷酸序列為編碼圖式中所陳述之aa序列的核苷酸序列。在某些實施例中，編碼TFcA之重鏈或輕鏈之核苷酸序列係連接至增強或促進該核苷酸序列在細胞中之表現以產生蛋白質的序列。該等核酸可涵蓋於載體(例如表現載體)內。

出於進行分泌之目的，TFcA之重鏈及/或輕鏈較佳包含信號序列，其通常在分泌之後被切除以提供成熟多肽。可使用以下信號序列：MGFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO：241)：用於例如表現重鏈中；及MGTPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：243)：用於例如表現輕鏈中。

編碼SEQ ID NO：241之例示性核苷酸序列為atgggcttcggactgtcgtggctttttctggtggcgattcttaagggggtccagtgc(SEQ ID NO：240)，且編碼SEQ ID NO：243之例示性核苷酸序列為atgggcacccccgcacagctcttgttcttgctgcttctttggctccctgacacaactggt(SEQ ID NO：242)。

本文中亦涵蓋包含與編碼本文所述之多肽之核苷酸序列或本文中陳述之核苷酸序列至少約70%、75%、80%、90%、95%、97%、98%或99%一致且編碼TFcA之重鏈或輕鏈或者其部分之核苷酸序列的核酸(例如DNA)，如本文進一步描述的。該等核苷酸序列可編碼本文所陳述之蛋白質或可編碼與本文所陳述之蛋白質或其一部分(例如一個結構域)，諸如任一圖式中所陳述之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的蛋白質。

本文中亦涵蓋包含本文提供之核酸或載體之細胞，例如宿主細胞。

本文所述之TFcA可藉由重組方式產生。用於重組產生之方法為現有技術狀態中廣泛所知的且包含在原核及真核細胞中進行蛋白質表現，隨後分離抗體及通常純化至醫藥學上可接受之純度。對於在宿主細胞中表現TFcA，將編碼各別多肽(例如輕鏈及重鏈)之核酸藉由標準方法插入表現載體中。表現係在如CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌細胞之適當原核或真核宿主細胞中進行的，且將TFcA自細胞(上清液或溶解之後之細胞)移出。用於重組產生抗體之通用方法為現有技術狀態眾所周知的且描述於例如以下評述文章中：Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif 17 183-202(1999)；Geisse,S.等人，Protein Expr.Purif.8 271-282(1996)；Kaufman,R.J.,MoI.Biotechnol.16 151-161(2000)；Werner,R.G.,Drug Res.48 870-880(1998)。

TFcA可藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如蛋白質A-瓊脂糖凝膠(Sepharose)、羥磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法，適合地自培養基分離。編碼TFcA之DNA及RNA易於使用習知程序分離並測序。融合瘤細胞可用作該DNA及RNA之來源。一旦分離，即可將DNA插入表現載體中，接著轉染至不另外產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞)中，以在該等宿主細胞中合成重組TFcA。

TFcA之aa序列變體(或突變體)可藉由將適當核苷酸變化引入TFcA DNA中，或藉由核苷酸合成來製備。

「宿主細胞」表示可工程改造成產生本文所述之TFcA的任一類細胞系統。在一個實施例中，使用HEK293細胞及CHO細胞作為宿主細胞。在NSO細胞中之表現描述於例如Barnes,L.M.等人，Cytotechnology 32 109-123(2000)；Barnes,L.M.等人，Biotech.Bioeng.73 261-270(2001)中。短暫表現描述於例如Durocher,Y.等人，Nucl.Acids.Res.30 E9(2002)中。可變結構域之選殖描述於Orlandi,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 3833-3837(1989)；Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 4285-4289(1992)；及Norderhaug,L.等人，J.Immunol.Methods 204 77-87(1997)中。例示性短暫表現系統(HEK 293)描述於Schlaeger,E.-J.及Christensen,K.,Cytotechnology 30 71-83(1999)以及Schlaeger,E.-J.,J.Immunol.Methods 194 191-199(1996)中。

適用於例如原核細胞之控制序列包括啟動子、視情況存在之操縱子序列，及核糖體結合位點。已知真核細胞可利用啟動子、增強子及聚腺苷酸化信號。

當一個核酸與另一核酸序列呈功能關係時，其為「可操作地連接」的。舉例而言，若前序列(pre-sequence)或分泌性前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前體蛋白質，則其可操作地連接於該多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則其可操作地連接至該序列；或若核糖體結合位點經定位以有助於轉譯，則其可操作地連接至編碼序列。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之DNA為連續的，且在分泌性前導序列情況下為連續的且在閱讀框中。然而，增強子無需為連續的。連接係藉由在適宜限制性位點處連接來實現。若該等位點不存在，則根據慣例使用合成寡核苷酸適體或連接子。

TFcA之純化可藉由標準技術，包括鹼性/SDS處理、CsCl譜帶、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他方法進行，以消除細胞組分或其他污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質。參看Ausubel,F.等人編，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。已建立完善之不同方法且廣泛用於蛋白質純化，諸如利用微生物蛋白質進行之親和層析法(例如，蛋白質A或蛋白質G親和層析法)、離子交換層析法(例如，陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(胺基乙基樹脂)及混合模式交換)、嗜硫吸附(例如，利用β-巰基乙醇及其他SH配位體)、疏水相互作用或芳族吸附層析法(例如，利用苯基-瓊脂糖凝膠、親氮雜芳基樹脂或間胺基苯基酸)、金屬螯合劑親和層析法(例如，利用Ni(II)-及Cu(II)-親和材料)、尺寸排阻層析法及電泳法(諸如凝膠電泳法、毛細電泳法)(Vijayalakshmi,M.A.Appl.Biochem.Biotech.75 93-102(1998))。

使用TFcA之方法

本文提供使用TFcA(例如TFcBA)之方法。TFcBA可用於治療與受體依賴性信號傳導相關之疾病或病症(包括多種癌症)。

在一個實施例中，提供一種用於抑制表現TFcA之靶(例如c-Met、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α及β)、c-Kit、EPCAM及/或EphA2)之腫瘤細胞之增殖的方法。一種方法可包含使腫瘤細胞與TFcA接觸，由此抑制、減慢或停止腫瘤細胞之增殖，或由此使腫瘤細胞死亡。

本文提供用於治療與TFcBA之靶(例如c-Met、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α及β)、c-Kit、EPCAM及/或EphA2)之信號傳導路徑有關之疾病或病症的方法，其係藉由向患者投與有效治療該疾病或病症之量的TFcBA來實現。適合疾病或病症包括例如多種癌症，包括(但不限於)乳癌及下文陳述者。在一個實施例中，用於治療患有增生性疾病(諸如癌症)之個體的方法包含向有需要之個體投與治療有效量之一或多種TFcA。

亦提供一種用於治療患者的表現TFcA(例如TFcBA)之靶(例如c-Met、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α及β)、c-Kit、EPCAM、EphA2及/或EGFR)之腫瘤(或用於此用途之 TFcA，例如藥劑)的方法，該方法包含投與有效減慢或停止腫瘤生長，停止或收縮腫瘤，或減緩或停止腫瘤侵襲或腫瘤轉移之量的TFcA。所治療的表現c-Met、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰島素受體、RON、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α及β)、c-Kit、EPCAM、EphA2及/或EGFR之腫瘤科包括以下癌症之腫瘤：胃癌、食道癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、前列腺癌、腎癌及甲狀腺癌、肝細胞癌、神經膠質瘤/神經膠母細胞瘤，及乳癌(基底細胞型/三陰性及HER2+乳癌)。

治療腫瘤或具有腫瘤之個體的方法可進一步包括投與第二抗癌劑與TFcA之組合。因此，涵蓋包含TFcA與第二抗癌劑(通常為生物試劑)及至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的新穎組合物。

亦提供包含一或多種TFcA之套組。該套組可包括指示該套組內含物之預定用途的標記，且視情況包括有關使用該套組治療與TFcA之靶之依賴性信號傳導(例如EGFR及/或c-Met依賴性信號傳導)有關之疾病或病症的說明書。術語標記包括提供於該套組上或與該套組一起提供，或以其他方式附於該套組的任何書面、宣傳材料或記錄之材料。

醫藥組合物

在另一態樣中，提供一種用於治療患者之腫瘤的組合物，例如醫藥組合物，以及使用每一此類組合物治療患者之腫瘤的方法。本文提供之組合物含有與醫藥學上可接受之載劑一起調配之一或多種本文揭示之抗體，例如TFcA。如本文所使用，「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上相容的任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑，及其類似物。較佳地，該載劑適於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊柱或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。取決於投藥途徑，該抗體可包覆在防止其受酸及可能使蛋白質失活之其他自然條件作用的材料中。

醫藥組合物可單獨或以組合療法(亦即，與其他藥劑組合)投與。舉例而言，該組合療法可包括本發明之抗體與至少一種其他治療劑(諸如抗癌劑)。醫藥組合物亦可結合另一抗癌治療方式(諸如放射療法及/或手術)一起投與。

本發明之組合物可藉由此項技術中已知之多種方法投與。如熟習此項技術者將理解的，投藥途徑及/或模式將取決於所需結果而變化。

為藉由某些投藥途徑投與本文提供之組合物，可能有必要或需要用防止其失活之材料包覆該抗體，或將該抗體與防止其失活之材料共投與。舉例而言，該抗體可以適當載體，例如以脂質體，或稀釋劑投與患者。醫藥學上可接受之稀釋劑包括生理食鹽水及水性緩衝溶液。脂質體包括水包油包水CGF乳液以及習知脂質體。

醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液，及用於現場製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。用於醫藥活性物質之該等介質及試劑的用法為此項技術中已知。除非任何賦形劑、稀釋劑或試劑與活性化合物不相容，否則其用法均涵蓋在本文提供之醫藥組合物中。補充性活性化合物(例如，其他抗癌劑)亦可併入該等組合物中。

治療性組合物通常必須為無菌且在製造及儲存條件下穩定。該組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適於高藥物濃度之其他有序結構的形式。載劑可為含有例如：水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇，及其類似物)及其合適混合物的溶劑或分散介質。亦可採用生理食鹽水溶液以及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其是用於注射液。必要時，該組合物亦可含有少量潤濕劑或增溶劑、穩定劑、防腐劑或pH緩衝劑。在許多情況下，適用於在該組合物中包括等滲劑，例如氯化鈉、糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇、甘油、丙二醇及液態聚乙二醇)。可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來延長注射用組合物之吸收性。

實例

以下實例不應解釋為限制本發明之範疇。

在整個實例中，除非另作規定，否則將使用以下材料與方法。一般而言，除非另作指示，否則本發明之技術操作法將採用習知化學、分子生物學、重組DNA技術、免疫學(尤其是例如抗體技術)、藥理學、製藥學及標準多肽製備技術。

實例1：穩定串聯Fc結構之鑑別

本實例描述穩定多價Ab型式之鑑別。在本實例及實例2中，使用不含結合位點之蛋白質構築體。對若干型式進行比較，且該等型式各自來源於以下兩種串聯Fc構築體中之任一者：1)TFc「23」或「IgG1 TFc」，其包含之IgG1 TFc含有IgG1鉸鏈區；含取代N297Q之IgG1 CH2結構域；含取代T366S/L368A/Y407V之IgG1 CH3結構域；由(G4S)8組成之TFc連接子；不包含上游鉸鏈區之IgG1鉸鏈區；含取代N297Q之IgG1 CH2結構域；及含取代T366W之IgG1 CH3結構域。此構築體包含如SEQ ID NO：293所陳述之aa序列(參看圖11)；及2)TFc「39」或「IgG1/IgG4 TFc」，其包含之IgG1/IgG4串聯TFc含有包含IgG1上游鉸鏈區及核心及下游IgG4鉸鏈區之雜交IgG1/IgG4鉸鏈區；含取代T299K之IgG4 CH2結構域；含取代T366S/L368A/Y407V之IgG1 CH3結構域；由(G4S)8組成之TFc連接子；不含上游鉸鏈區之IgG4鉸鏈區；含取代T299K之IgG4 CH2結構域；及含取代T366W之IgG1 CH3結構域。此構築體包含如SEQ IDNO：319所陳述之aa序列(參看圖11)。

產生TFc 23及39之六種經修飾型式，且其列於表15中。簡言之，第一種修飾係在突出或空穴附近添加二硫鍵(TFc 23A)。另一種修飾係將23A之突出空穴變為較小的突出/空穴(TFc 23B)。另一種修飾在第一鉸鏈區之上游鉸鏈區中引入1或2個半胱胺酸，以在TFc內產生二硫橋(分別為TFc 23 D及C)。另一種修飾在CH3結構域中引入C末端半胱胺酸(TFc 23E)。TFc中之另一種修飾係由將TFc連接子之長度減少20個aa組成(TFc 23F，又稱為「23G」)。該等新修飾之TFc的aa序列(顯示於表15 中)與圖6及7中陳述之序列相同，但在本實例中使用之TFc不包含上游鉸鏈區部分(亦即，aa EPKSC)，且包含信號肽。該等TFc之核苷酸及aa序列顯示於圖11中，且該等TFc之每個結構域或元件的身分陳述於表12及13中，其中唯一差異在於第一鉸鏈區在其N末端不包含EPKSC。

* 23G含有與在其他地方稱為「23F」者相同的TFc。

將不同核酸(具有SEQ ID NO：292、294、296、298、300、302、304、318、320、322、324、326或328)短暫轉染至Freestyle 293F細胞(Invitrogen)中且用基本上如下所述之單步驟蛋白質A純化法進行純化。使用標準重組DNA技術將該等核酸編碼之蛋白質作為單一蛋白質選殖至表現質體中。所用表現載體為pCEP4(Invitrogen)。使用聚乙烯亞胺(2.5μg/ml培養物)及DNA(1μg/ml細胞培養物)轉染表現質體。在37℃、5% CO₂ 下將轉染之細胞培育六天且接著採集。所有蛋白質均根據製造商之說明書，使用蛋白質A親和性方案純化。使用蛋白質A親和性步驟選擇性且有效地結合除所採集之細胞培養液(HCCF)外的融合蛋白質。此在單一步驟中以高產率及高通量移除>95%之產物雜質。在此步驟之後融合蛋白之所需分子形式部分在60%至98%範圍內。來自GE之MABSELECT用作蛋白質A親和性樹脂。經純化之物質經濃縮且透析至PBS中。

A)單體百分比

在初始溶液中或在4℃、37℃下培育之後、在冷凍-解凍之後或在室溫下於迴旋振盪器上輕柔攪動之後，藉由尺寸排阻層析法(SEC)對TFc溶液中存在之單體百分比進行測定。SEC係基本上如下進行。SEC係使用Agilent 1100系列HPLC系統進行的。將50μg每個分子注射於TSK Super SW3000凝膠管柱(Tosoh Biosciences,P/N 18675)上。PBS用作運行及平衡緩衝劑，流速為0.35ml/min。

表16 提供了在指定濃度之初始溶液中例示性TFc之單體百分比。

在另一實驗中，在基本上如上文所述濃縮分子之後，測定初始溶液中之單體百分比。表17 提供了結果。

表16與17之彙編顯示於下表18中。

表19 顯示了如在暴露於各種條件之後所測定的溶液中TFc 39E及23C之單體百分比。

結果指示，TFc在第0天及在所測試之各種條件下於溶液中具有極為不同之穩定性。39E及23G看來具有比其他更好的穩定性。

B)SDS PAGE分析

使TFc在4-12% SDS-PAGE凝膠上於非變性條件下跑膠，且藉由考馬斯染色(Coomassie stain)進行觀察。結果顯示於圖8中。

實例2：第二代TFc之合成

為了進一步改良TFc分子之特徵，對其進行進一步修飾。該等修飾包括(i)改變TFc連接子(「23E(35L)」、「39E(35L)」、「23E(30L)」、「39E(30L)」、「23E(25L)」及「39E(25L)」)之長度；(ii)改變在兩個CH3結構域之每一個內AEM及C末端半胱胺酸修飾之組合(「23E(35L)反向」及(「39E(35L)反向」)；及(iii)改變增強CH3締合之突變(「23I」、「39I」、「23J」及「39J」)。該等修飾概述於表20 中。該等新修飾之TFc的aa序列陳述於圖11中且該等結構域或元件各自之身分陳述於表12及13中。

第二代TFc之表現及純化基本上如實例1中所述。

A)單體百分比

在初始溶液中或在4℃下7天之後藉由SEC對TFc溶液中存在之單體百分比進行測定。SEC係基本上如實例1中所述進行。

表21 提供了在初始溶液中及在4℃下7天之後例示性第二代TFc之單體百分比。

結果指示，40個aa之連接子(例如在分子23E及39E中)使TFc比較短連接子更穩定。

實例3：例示性抗c-Met/抗EGFR TFcBA A)例示性抗c-Met結合位點

TFcBA可包含抗c-Met結合位點，該結合位點包含人類化5D5 Ab(美國專利第7,476,724號)之結合位點或由其組成。重鏈可包含以下Fab結構域或其VH結構域：

1)無信號肽：

(SEQ ID NO：223；CDR標有帶虛線之下劃線，且CH1結構域帶下劃線)

2)包括由以下SEQ ID NO組成之例示性信號肽：241(帶下劃線)：

(SEQ ID NO：245；信號肽帶下劃線且為粗體，CDR標有帶虛線之下劃線且CH1結構域帶下劃線)

輕鏈可包含以下Fab結構域或其VH結構域：

1)無信號肽：

(SEQ ID NO：231；CDR標有帶虛線之下劃線，且CL結構域帶下劃線)

2)包括由SEQ ID NO：243組成之例示性信號肽：

(SEQ ID NO：247；信號肽帶下劃線且為粗體，CDR標有帶虛線之下劃線且CL結構域帶下劃線)

TFcBA亦可包含抗c-Met結合位點，該結合位點包含以下重鏈及輕鏈部分或由其組成，且在本文中稱為「抗c-Met結合位點2」。重鏈可包含以下Fab結構域或其VH結構域：

1)無信號肽：

(SEQ ID NO：287；CDR標有帶虛線之下劃線，且CH1結構域帶下劃線)

2)包括由以下SEQ ID NO組成之例示性信號肽：241(帶下劃線)：

(SEQ ID NO：256；信號肽帶下劃線且為粗體，CDR標有帶虛線之下劃線且CH1結構域帶下劃線)

輕鏈可包含以下Fab結構域或其VH結構域：

1)無信號肽：

(SEQ ID NO：289；CDR標有帶虛線之下劃線，且CL結構域帶下劃線)

2)包括由SEQ ID NO：243組成之例示性信號肽：

(SEQ ID NO：345；信號肽帶下劃線且為粗體，CDR標有帶虛線之下劃線且CL結構域帶下劃線)

例示性成熟TFcBA之重鏈的aa序列係以SEQ ID NO：235(圖9)陳述，該成熟TFcBA以胺基至羧基末端次序包含：i)抗c-Met結合位點5D5之Fab結構域(SEQ ID NO：223)；ii)包含AEM 1及DiS 2之TFc(SEQ ID NO：181)；及iii)具有SEQ ID NO：233之帕尼單抗抗-EGFR scFv H1L1(參看下文)。例示性成熟TFcBA之重鏈的aa序列係以SEQ ID NO：291(圖9)陳述，該成熟TFcBA以胺基至羧基末端次序包含：i)抗c-Met結合位點2之Fab結構域(SEQ ID NO：287)；ii)包含AEM 1及DiS 2之TFc(SEQ ID NO：181)；及iii)具有SEQ ID NO：258之西妥昔單抗抗-EGFR scFv H1L1(參看下文)。一般而言，此處提供之例示性抗c-Met Fab重鏈序列可連接至本文所揭示之任何TFc，或包含TFc之構築體。該等蛋白質可表現成具有信號序列，其可為由SEQ ID NO：241組成之信號序列。

B)例示性抗EGFR scFv

TFcBA可包含以下抗EGFR scFv(或其可變結構域或CDR)中任一者：

1)帕尼單抗(VECTIBIX)scFv

帕尼單抗之VH及VL結構域的aa序列提供於美國專利第6,235,883號中且組裝成具有以下aa序列之scFv：

(SEQ ID NO：233；scFv連接子呈斜體且VH及VL CDR標有帶虛線之下劃線)

2)2224 scFv

Ab 2224之VH及VL結構域的aa序列提供於美國專利公開案第2010/0009390號中且組裝成具有以下aa序列之scFv：

(SEQ ID NO：237；scFv連接子呈斜體且VH及VL CDR標有帶虛線之下劃線)

3)人類化西妥昔單抗scFv

西妥昔單抗之可變區經人類化且用於構建以下scFv，其中CDR標有帶虛線之下劃線，scFv連接子為斜體且由人類化引起之aa修飾係呈小寫字母：

3.1)西妥昔單抗scFv H1 L1

(SEQ ID NO：258)

3.2)西妥昔單抗scFv H1 L2

(SEQ ID NO：275)

3.3)西妥昔單抗scFv H2 L1

(SEQ ID NO：277)

3.4)西妥昔單抗scFv H2 L2

(SEQ ID NO：279)

人類化西妥昔單抗Ab之VH及VL結構域可用於任何其他型式之Ab中，例如具有包含兩個重鏈及兩個輕鏈之天然存在之結構的Ab。

抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的aa序列係以SEQ ID NO：235(圖9)陳述，該TFcBA包含i)人類化5D5抗c-Met VH結構域(SEQ ID NO：223)；ii)包含AEM 1及DiS 2之TFc(SEQ ID NO：181)；及iii)具有SEQ ID NO：233之帕尼單抗抗-EGFR scFv。包含與SEQ ID NO：235中相同之結合位點但包含不同TFc的抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的aa序列陳述於SEQ ID NO：343、225、227及229(圖9)中。抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的aa序列係以SEQ ID NO：239(圖9)陳述，該TFcBA包含i)人類化5D5抗c-Met VH結構域(SEQ ID NO：223)；ii)包含AEM 1及DiS 2之TFc(SEQ ID NO：181)；及iii)具有SEQ ID NO：237之2224抗-EGFR scFv。抗c-Met/抗EGFR TFcBA之重鏈的aa序列係分別以SEQ ID NO：260、281、283及285(圖9)陳述，該TFcBA包含i)人類化5D5抗c-Met VH結構域(SEQ ID NO：223)；ii)包含AEM 1及DiS 2之TFc(SEQ ID NO：181)；及iii)由SEQ ID NO：258、275、277或279組成之西妥昔單抗抗-EGFR scFv。一般而言，本文所揭示之任何抗EGFR scFv，或其可變序列或CDR序列，均可連接至本文所揭示之任何 TFc，或包含TFc之構築體。

編碼Fab結構域、scFv及TFcBA之核苷酸序列提供於圖10中。

其他例示性抗c-Met/抗EGFR TFcBA陳述於表21 中，其中每一序列可在無插入序列情況下以胺基至羧基末端次序連接至相鄰序列。

實例4：用於製備或表徵TFcA或TFc之方法 A)蛋白質表現及純化

穩定轉染 ：使用1：1(：1)之質體比率，將核酸轉染至CHO-K1細胞(中國倉鼠卵巢細胞；ATCC®目錄號CCL-61^TM )中，且用單步驟蛋白質A純化法，例如根據以下方案進行純化。使用標準重組DNA技術將該等核酸編碼之TFcA或TFc作為單一蛋白質選殖至表現質體中。所用例示性表現載體為pMP 10K(SELEXIS)。使表現質體線性化，使用QIAquick®純化套組(QIAGEN)進行純化，且使用Lipofectamine® LTX(Invitrogen)共轉染至CHO-K1細胞中。用含有10% FBS之漢氏F12培養基(Ham's F12 medium)(Gibco®)在無選擇壓力情況下保持2天，接著在有選擇壓力情況下保持4天來回收經轉染細胞。4天後，將其更換為含有麩醯胺酸且具有選擇壓力之無血清培養基(Hyclone®)。一週後，檢查細胞之表現且按比例放大至所需體積。所有蛋白質均根據製造商之說明書，使用蛋白質A親和性方案進行純化。使用蛋白質A親和性步驟選擇性且有效地結合除所採集之細胞培養液(HCCF)外的TFcA或TFc。此在單一步驟中以高產率及高通量移除>95%之產物雜質。在此步驟之後TFcA或TFc之所需分子形式部分預期在60%至98%範圍內。來自GE之MABSELECT用作蛋白質A親和性樹脂。經純化之物質經濃縮且透析至PBS中。

短暫轉染：將核酸短暫轉染至Freestyle^TM 293F細胞(Invitrogen)中且用基本上如下所述之單步驟蛋白質A純化進行純化。使用標準重組DNA技術將該等核酸編碼之蛋白質作為單一蛋白質選殖至表現質體中。所用例示性表現載體為pCEP4(Life Technologies目錄號R790-07)。使用聚乙烯亞胺(2.5μg/ml培養物)及DNA(1μg/ml細胞培養物)轉染表現質體。在37℃、5% CO₂ 下將轉染之細胞培育六天且接著採集。所有蛋白質均根據製造商之說明書，使用蛋白質A親和性方案純化。使用蛋白質A親和性步驟選擇性且有效地結合除所採集之細胞培養液(HCCF)外的融合蛋白質。此在單一步驟中以高產率及高通量移除>95%之產物雜質。來自GE之MABSELECT用作蛋白質A親和性樹脂。經純化之物質經濃縮且透析至PBS中。

B)SDS-PAGE分析

使TFcBA或TFc在4-12% SDS-PAGE凝膠上於非變性條件下跑膠，且藉由考馬斯染色進行觀察。此方法可用於確定TFcA或TFc是否適當形成或組裝。

C)藉由DSF進行之熱穩定性量測

使TFcA或TFc展開之溫度係藉由基本上如下所述之差示掃描熱量測定法(DSF)測定。DSF分析法係在IQ5實時偵測系統(Bio-Rad)中進行的。將15μM TFcA或TFc、1x Sypro Orange(Invitrogen Life Technologies)及1x PBS之20μl溶液添加至96孔盤各孔中。以1℃/min之加熱速率將該盤自20℃加熱至90℃。將資料轉移至GraphPad Prism®進行分析。

D)pEGFR抑制

藉由TFcBA抑制經由EGFR進行之信號轉導(例如配位體誘導之信號轉導)可藉由量測特定TFcA對EGFR之磷酸化的影響來測定。

使用以下方案來量測EGFR之抑制。將細胞(例如A431細胞(ATCC®目錄號CRL-1555^TM )或NCI-H322M(National Cancer Institute))維持在補充有10%胎牛血清、青黴素/鏈黴素(Penicillin/Streptomycin) 及L-麩醯胺酸之DMEM培養基中。對於信號傳導實驗，將3.5×10⁴ 個細胞接種於96孔組織培養盤中之完全培養基中。次日，用無血清培養基更換完全培養基，且細胞在37℃下培育隔夜。將細胞處理2小時，其中起始濃度為300nM且按3倍遞減滴定分別得到TFcA或TFc之11種濃度劑量，且接著用8nM EGF(人類重組EGF；目錄號AF-100-15；PeproTech,Inc.)刺激10分鐘。用PBS洗滌細胞且在補充有蛋白酶及磷酸酶抑制劑(以EASY包裝提供之cOmplete^TM 蛋白酶抑制劑混合錠，目錄號4693124001，Roche Diagnostics Corp；PhosSTOP®磷酸酶抑制劑混合錠，目錄號4906837001，Roche Diagnostics Corp)之MPER緩衝液(目錄號PI78505，VWR International)溶解。針對磷酸化EGFR(pEGFR)之ELISA係根據製造商之方案(pEGFR ELISA R&D套組(目錄號：DYC1095-C))進行，但捕獲Ab為EGFR Ab-11，純系：199.12(Fisher Scientific目錄號MS396P1ABX)。添加SuperSignal® ELISA Pico化學發光受質(目錄號PI37069,VWR International)且在PerkinElmer Envision讀盤器上讀取盤。針對TFcA或TFc在最低濃度下所觀測之信號進行校正之後，對發光值進行作圖。對於資料分析，對兩個重複樣品求平均值且使用誤差條來表示兩個複本之間之標準偏差。使用GraphPad Prism®軟體(GraphPad Software,Inc.)，經由在4參數邏輯斯諦方程(4 parameter logistic equation)中進行資料回歸來計算抑制曲線及相應IC50值。為計算抑制%，最大(『max』)及最小(『min』)抑制劑效力之回歸值可利用如下：曲線跨距 =max-min；基線跨距 =max；抑制% =100 *曲線跨距/基線跨距。

E)pERK抑制

藉由TFcA抑制經由c-Met及/或EGFR進行之信號轉導(例如配位體誘導之信號轉導)可藉由量測特定TFcA對ERK之磷酸化的影響來測定。可使用以下方案來量測pERK之抑制。第1天：將處於對數中期(約80%匯合)的正在活躍生長之細胞(例如A431細胞)分至DMEM(+10% FBS+L/麩醯胺酸+青黴素/鏈黴素)培養基中。以每孔約35,000個細胞接種於96孔盤中。第2天：將培養基自10% FBS更換為無血清培養基-0.5% FBS(+L/麩醯胺酸+青黴素/鏈黴素)培養基。第3天：將抑制劑/抗體稀釋至適當體積之血清培養基中。每孔添加100μL之每種濃度之各抑制劑。使抑制劑在37℃下培育2小時。2小時之時間段結束時，將最終濃度為8nM之EGF(人類重組EGF；目錄號AF-100-15；PeproTech,Inc.)添加至每一抑制劑及每種濃度抑制劑中，保持10分鐘。用冷PBS洗滌細胞2次，且稍後溶解於每孔40μL SureFire®溶解緩衝液(儲備液與水之1：5稀釋液)中。通常在溶解之後5分鐘內將溶解產物置於-80℃下。第4天：有關進行SureFire® pERK 1/2 ELISA之方案可見於Perkin Elmer網站(ALPHASCREEN PROTEIN A 10K PTS PerkinElmer Life Sciences,Inc.目錄號：6760617M；TGR Surefire ERK1 384 Kit for 10,000 Ass；PerkinElmer Life Sciences,Inc.目錄號TGRES10K)中。-80℃溶解產物基本上係在室溫下解凍。同時，製備反應緩衝液，其中根據方案混合活化緩衝液與反應緩衝液。最後將蛋白質A偵測套組試劑添加至反應緩衝液中，隨後添加至384孔盤上。將4μL解凍之溶解產物轉移至ProxiPlate®白色不透明384孔盤(來自Perkin Elmer；目錄號6008280)中。添加蛋白質A偵測套組試劑之後，將7μL最終反應緩衝液轉移至每個孔(其中已具有4μL溶解產物)中。用鋁製密封件緊密地密封該等盤。在艾本多夫台式離心機(Eppendorf table top centrifuge)中以1800rpm將該盤短暫離心1分鐘。在室溫下輕輕地振盪該等盤2小時。接著在Perkin Elmer Envision®讀取器上讀取盤。發光資料之校正及IC50之計算係如關於pEGFR所述進行。

實例5：用於量測基於ELISA盤之抗體結合的方案 雙特異性抗體與可溶性cMet-Fc及EGFR-his之結合

用50μL cMet-Fc(2μg/mL於PBS中)塗覆Reacti-bind®盤(96孔)且在4℃下培育隔夜。次日，用PBS-T(PBS+0.05% Tween-20)洗滌該等盤，在室溫下用100μL阻斷緩衝液阻斷1小時，且再次用PBS-T洗滌。在室溫下，在50μL雙特異性抗體存在下培育盤2小時，且接著用PBS-T洗滌。抗體濃度起初為500nM(於PBS-T中)，且包括十份另外的兩倍稀釋液及一份空白液(僅PBS-T)。接著，在室溫下，在50μL EGFR-his(1μg/ml於PBS-T中)存在下培育盤一小時。用PBS-T洗滌該等盤，且接著在室溫下，在1：10,000稀釋於PBS-T中之抗his-HRP抗體存在下培育1小時，並再次用PBS-T洗滌。室溫下，在100μL TMB受質存在下培育該等盤5-10分鐘，且藉由添加100μL停止溶液來停止反應。在450nm下量測吸光度且使用GraphPad Prism®分析所得資料。

在上述方法中使用TFcBA得到之例示性結果可見於圖15中，其顯示了奧妥珠單抗-39Egy-2224(正方形)及奧妥珠單抗-39Egy4-帕尼單抗(圓形)之結合親和力。

實例6：當前用於不對稱Fc結構域之技術引起分子量異質性 CHO-K1細胞之穩定轉染

使懸浮適應之CHO-K1細胞在補充有8mM L-麩醯胺酸之Hyclone®培養基中生長至每毫升2百萬個的密度。轉染當天，將細胞以80,000個細胞/毫升之密度再懸浮於無血清培養基(Opti-MEM® I)中。接著，使用2.75μL Lipofectamine®，在24孔盤中用1μg總DNA(包括10ng pNeo載體，一種帶有遺傳黴素(geneticin)選擇標記物之內部載體)轉染細胞(500μL)。3小時之後，添加1mL恢復培養基(HAMS-F12+10% FBS)，且使轉染之細胞恢復48小時。接著，使細胞在96孔盤中擴增，且將選擇標記物遺傳黴素以500μg/ml添加至恢復培養基中。又4天之後，用無血清Hyclone培養基(補充有L-麩醯胺酸)更換培養基，且使轉染之細胞適應。一週後，所選細胞形成集落，且用由上清液得到之西方墨點對該等孔之所需特徵進行測試。使所需純系在24孔盤中擴增，接著轉移至T-25燒瓶中，且最終轉移至振盪燒瓶中。用SDS-PAGE確定所需純系，且按比例放大至所需體積。當活力降至80%以下時，藉由離心(6000g，30分鐘)採集細胞，且使用0.22μm過濾器過濾上清液。

如上文所述對細胞進行轉染且如下進行分析。結果示於下表22中。

A)西方墨點方案

使表現奧妥珠單抗之細胞上清液在4-12% SDS-PAGE凝膠上於非變性條件下進行跑膠。使用Invitrogen iBlot®將蛋白質轉移至硝基纖維素紙上。用PBS-T洗滌墨點且接著在結合至IRD700之抗人類FC存在下培育一小時。用PBS-T洗滌墨點三次且接著使用Li-Cor® Odyssey®獲取圖像。結果顯示於圖12中。

B)單體百分比

藉由SEC在初始溶液中對TFc溶液存在之單體百分比進行測定。SEC係基本上如實例1中所述進行。

表22提供了在初始溶液中例示性第二代TFc之單體百分比。

實例7：帶電非糖基化突變體之製備及分析

穩定多價Ab型式之鑑別描述於下。所用蛋白質構築體不含結合位點。如表23 及圖17中所示對若干型式進行比較。

將核酸(具有SEQ ID NO：357，及389-399(奇數))短暫轉染至Freestyle^TM 293F細胞中且利用單步驟蛋白質A純化隨後基本上如實例4中所述之DSF進行純化。

B)SDS PAGE分析

使TFc在4-12% SDS-PAGE凝膠上於變性條件下跑膠，且藉由考馬斯染色進行觀察。結果顯示與圖13A(非還原性)及圖13B(還原性)中。

C)藉由DSF進行之熱穩定性量測

使TFcA或TFc展開之溫度係藉由基本上如下所述之差示掃描熱量測定法(DSF)測定。DSF分析法係在IQ5實時偵測系統(Bio-Rad)中進行的。將15μM TFcA或TFc、1x Sypro® Orange(Invitrogen Life Technologies)及1x PBS之20μl溶液添加至96孔盤各孔中。以1℃/min之加熱速率將該盤自20℃加熱至90℃。將資料轉移至GraphPad Prism®進行分析。藉由DSF得到之糖基化位點突變體之熱穩定性測定的例示性結果示於表25中。

實例8：主鏈變體之DSF分析 藉由DSF進行之熱穩定性量測

使TFcA或TFc展開之溫度係藉由基本上如上所述之差示掃描熱量測定法(DSF)測定。結果示於下表26中。該等資料顯示，諸如添加二硫橋及糖基化突變之主鏈修飾可改良熱穩定性。

實例9：使用奧妥珠單抗結合位點產生並分析單價及雙特異性tFc分子 使用尺寸排阻層析法測定單體百分比

使用20mM磷酸鈉(+300mM NaCl)作為操作緩衝液將50μg樣品注射於TSKgel SuperSW3000管柱(4.6mm ID×30cm)上。所有量測均在Agilent 1100 HPLC上進行，其裝備有自動進樣器、二元泵及二極體陣列偵測器。藉由在Chemstation軟體中分析資料來測定單體百分比。通常，所有樣品為僅經蛋白質A純化的且在1X PBS中濃度為5mg/mL。

Fortebio結合方案 所需材料：

96孔，黑色，圓形平底聚丙烯微孔盤(Greiner Bio-one # 655209)。

Octet儀器及軟體(3.0版)。

蛋白質A感測器尖端(Fortebio,#18-5010)

1X PBS，抗原(his標記之cMET)，抗體

方案：

將所有試劑平衡且使樣品達到室溫。使蛋白質A感測器尖端(Fortebio,#18-5010)在1X PBS中水合10分鐘。使用Octet®軟體及程序，按照製造商之說明書執行動力學分析。分析步驟通常包括：在1X PBS中平衡1-2分鐘；4分鐘抗體裝載(濃度：50μg/mL於1X PBS中)；1-2分鐘基線穩定化；4分鐘抗體：抗原締合；及4分鐘抗體：抗原解離。使用1X PBS作為基質通量。資料用Octet®資料分析軟體分析，處理且擬合至使用1：1結合模型得到之曲線以測定動力學參數(K_d 、K_on 及K_off )。

實例10：藉由奧妥珠單抗及雙特異性變體抑制信號傳導

為了測試表28中之構築體抑制pMet之能力，如下在HGF誘導之SW620細胞(ATCC®目錄號：CCL-227^TM )中測試TFc變體：第1天，將處於對數中期(約80%匯合)的正在活躍生長之細胞(例如SW620細胞)分至RPMI(+10% FBS+L/麩醯胺酸(2mM)+青黴素/鏈黴素)培養基中。以每孔約20,000個細胞接種於96孔盤中。第2天，將培養基自10% FBS更換為無血清培養基-RPMI+0.5% FBS(+L/麩醯胺酸+青黴素/鏈黴素)培養基。第3天，將HGF(經刺激對照)及各種抑制劑/抗體稀釋至適當體積之無血清培養基中。每孔添加100μL之每種濃度之各抑制劑。使抑制劑在37℃下培育2小時。接著用冷PBS洗滌細胞2次，且稍後在每孔50μL MPER(目錄號PI78505，VWR International)+150mM NaCl+蛋白酶及磷酸酶抑制劑緩衝液(以EASY包提供之cOmplete^TM 蛋白酶抑制劑混合錠，目錄號4693124001，Roche Diagnostics Corp；PhosSTOP®磷酸酶抑制劑混合錠，目錄號4906837001，Roche Diagnostics Corp)中溶解。通常在溶解之後5分鐘內將溶解產物置於-80℃下。

為量測pMet信號，使用ELISA套組(人類磷酸化HGF R/c-MET DuoSet IC Economy Pack，目錄號DYC2480E，R&D Systems)。用在PBS緩衝液中最終濃度為每孔4μg/mL的來自R&D Systems之捕獲抗MET抗體塗覆來自Corning®之384孔高度結合黑色固體盤。將該等盤在室溫下置放隔夜。第4天，-80℃溶解產物在室溫下解凍。在BIOTEK盤洗滌器中用PBST(含0.05%Tween-20®之PBS)以每孔50μl洗滌盤3次。在室溫下，用每孔50μL 2% BSA/PBS阻斷384孔盤1小時。將兩個重複溶解產物彙集至一個孔中且在2% BSA/0.1%Tween-20/25%MPER/PBS中進行2倍稀釋。藉由在2% BSA/0.1%Tween-20®/25%MPER/PBS中製備10份2倍連續稀釋液來製備重組標準曲線。用0.05% Tween-20/PBS洗滌ELISA盤。一式四份，將20μL溶解產物自96孔盤轉移至384孔盤中。在室溫下培育盤2小時且用0.05% Tween- 20/PBS洗滌3次。以1：1000稀釋將20μL一次偵測抗磷酸酪胺酸抗體4G10(目錄號05-321,Millipore/Upstate)添加至ELISA盤中且在室溫下培育1小時。按照製造商之說明書，添加20μL SuperSignal® ELISA Pico化學發光受質(目錄號PI37069，VWR International)且在Envision®讀盤器(Perkin Elmer)上讀取。對於資料分析，對兩個重複樣品求平均值且使用誤差條來表示兩個複本之間之標準偏差。使用GraphPad Prism®軟體(GraphPad Software,Inc.)，經由在4參數邏輯斯諦方程中進行資料回歸來計算抑制曲線及相應IC50值。

如圖16中所示，所測試之所有分子以類似方式抑制pMet信號傳導，而與TFc核心區之身分無關。二價奧妥珠單抗_39Egy4_2224、奧妥珠單抗_39Egy4_帕尼單抗、奧妥珠單抗_39Egy4_西妥昔單抗變體以與單價奧妥珠單抗_39Egy4變體類似的程度進行抑制。

等效物

熟習此項技術者將認識到，或能夠僅使用常規實驗確定並實施本文所述具體實施例之許多等效物。預期該等等效物也涵蓋在以下申請專利範圍中。預期附屬請求項中所揭示之實施例的任何組合在本發明之範疇內。

以引用之方式併入

本文提及的每一個美國及外國專利及未決專利申請案及公開案係以全文引用之方式特定地併入本文中。

其他實例：第A-1部分

以下實例不應解釋為限制本發明之範疇。

在整個實例中，除非另作規定，否則將使用以下材料與方法。一般而言，除非另作指示，否則本發明之技術實踐將採用習知化學、分子生物學、重組DNA技術、免疫學(尤其是例如抗體技術)、藥理學、製藥學及標準多肽製備技術。

如該等實例及圖式中所使用，「HGF」係指肝細胞生長因子(有時稱為離散因子)，例如Preprotech目錄號100-39。

下述技術及實例中所使用之人類細胞株可如所指示自美國典型培養物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)獲得。實例中使用之細胞株為：A549細胞(ATCC® CCL-185^TM )；NCI-H441(ATCC® HTB-174^TM )；HCC827(ATCC® CRL-2868^TM )；NCI-H2170(ATCC® CRL-5928^TM )；及U-87 MG(ATCC® HTB-14^TM )。

如美國專利8,361,744中所揭示的具有SEQ ID NO：45(重鏈)及SEQ ID NO：46(輕鏈)及來自美國專利公開案第20110300146號的具有SEQ ID NO：196(突出)的人類化抗人類c-Met單株抗體OA-5D5係用作抗c-Met抗體對照。在一些實施例中，抗c-Met重鏈及突出序列各自具有單點突變SEQ ID NO：45及SEQ ID NO：196以移除CH2糖基化位點。例如參看美國專利7,476,724。

本發明中所述之抗體係以下列方式進行縮寫：例如，抗體#1為Ab#1，抗體#2為Ab#2，抗體#13為Ab#13等。

實例A-1：串聯Fc雙特異性抗體型式

本文所揭示之雙特異性抗體的一般結構包含具有針對c-Met之單一Fab、「串聯Fc」(TFc)主鏈結構(描述於共同未決之PCT申請案號PCT/US2012/52490中，例如SEQ ID NO：394及395)及針對EpCAM之單一scFv抗體片段的二價抗體。該雙特異性抗體之重鏈包含了含以下結構域(N末端至C末端)之單一多肽：

(i)c-Met Fab之重鏈

(ii)含有IgG1上游鉸鏈區以及IgG4中間及下游鉸鏈區之雜交鉸鏈區；

(iii)具有T299K突變之IgG4 CH2結構域#1

(iv)具有T366S/L368A/Y407V突變之IgG1 CH3結構域#1

(v)二硫橋基元#1(KSCDKT)

(vi)(G₄ S)₈ 多肽連接子

(vii)IgG4之中間及下游鉸鏈區

(viii)具有T299D突變之IgG4 CH2結構域#2

(ix)具有T366W突變之IgG1 CH3結構域#2

(x)二硫橋基元#2(GEC)

(xi)連接性多肽連接子

(xii)抗EpCAM scFv

抗體結構與結構之示意圖可見於圖A1中。

實例A-2：抗EpCAM scFv之人類化

採用結構指導之方法來產生一組13個來源於鼠類母序列之人類化抗EpCAM scFv變體(SEQ ID NO：486及487)。藉由MolIDE，使用VH及VL結構域之獨立零空格模板來建立scFv之初始同系物模型且使用SCWRL進行能量精化。MolIDE及SCWRL之評述揭示於例如Nature Protocols 3 ：1832-1847(2008)中。藉由使用PyMOL進行目測檢查，或使用Eris計算能量差異來得出候選突變對穩定性之潛在影響。將該等scFv變體併入13種雙特異性抗體(Ab#1、Ab#2、Ab#3、Ab#4、Ab#5、Ab#6、Ab#7、Ab#8、Ab#9、Ab#10、Ab#11、Ab#12及Ab#13)中。所用置換包括三個不同抗體構架、CDR序列中脫醯胺或氧化位點之移除、VH/VL序列取向、二硫橋添加及scFv內蛋白質連接子序列。所測試之設計置換的綜述顯示於圖2中。

實例A-3：抗體之蛋白質表現及純化 A)短暫轉染

使用短暫轉染方案，利用Freestyle^TM 293F細胞(Invitrogen)來表現抗體。使用標準重組DNA技術將該等核酸編碼之蛋白質作為單一蛋白質選殖至表現質體中。所用例示性表現載體為pCEP4(Life Technologies目錄號R790-07)。將抗體之重鏈及輕鏈序列選殖至單獨載體中。使用聚乙烯亞胺(每毫升細胞培養物2.5μg)及DNA(1：1比率之重鏈與輕鏈，每毫升細胞培養物總計有1μg DNA)轉染表現質體。經轉染細胞在37℃、5% CO₂ 下培育六天，且接著藉由以6000g離心30分鐘，隨後進行上清液之0.2μM過濾來採集。

B)穩定轉染

基本上如下所述，經由穩定轉染至懸浮適應之CKO-K1細胞(中國倉鼠卵巢細胞；ATCC®目錄號CCL-61^TM )中來表現抗體。使用標準重組DNA技術將該等核酸編碼之抗體作為單一蛋白質選殖至表現質體中。所用例示性表現載體為pMP 10K(SELEXIS)。將抗體之重鏈及輕鏈序列選殖至單獨載體中。將重鏈及輕鏈表現質體線性化，使用QIAquick®純化套組(QIAGEN)進行純化且如下以1：1比率進行共轉染。

使懸浮適應之CHO-K1細胞在補充有8mM L-麩醯胺酸(Life Technologies，目錄號25030-081)之Hyclone® SFM4CHO®培養基(Fisher Scientific，目錄號SH30548.02)中生長至每毫升2百萬個細胞的密度。轉染當天，將細胞以80,000個細胞/毫升之密度再懸浮於Opti-MEM®無血清培養基(Gibco®，目錄號31985-062)中。接著，使用2.75μL Lipofectamine®(Life Technologies，目錄號15338-100)，在24孔盤中用1μg總線性化之DNA(包括10ng pNeo載體，一種帶有遺傳黴素選擇標記物之內部載體)轉染細胞(500μL)。3小時之後，添加1mL恢復培養基(HAMS-F12(Gibco®)+10% FBS)，且使轉染之細胞恢復48小時。接著，使細胞在96孔盤中擴增，且將選擇標記物遺傳黴素以 500μg/ml添加至恢復培養基中。又4天之後，用無血清Hyclone® SFM4CHO®培養基(補充有L-麩醯胺酸)更換培養基，且使轉染之細胞適應。一週後，所選細胞形成集落，且用來自上清液之西方墨點對含有單個集落之孔的所需特徵進行測試。使所需純系在24孔盤中擴增，接著轉移至T-25燒瓶中，且最終轉移至125ml振盪燒瓶中。用SDS-PAGE確定所需純系對抗體之表現，且按比例放大至所需體積。當活力降至80%以下時，藉由離心(6000g，30分鐘)採集細胞，且使用0.22μm過濾器過濾上清液。使用台盼藍拒染分析法對細胞活力進行評估且使用Vi-CELL細胞活力分析儀(Beckmann Coulter)自動量測。

C)純化

所有蛋白質均根據製造商之說明書，使用MabSelect®(GE Healthcare)作為蛋白質A親和樹脂，在AKTA Explorer 100 FPLC(GE Healthcare)上使用蛋白質A親和層析方案進行純化。使用蛋白質A親和性步驟選擇性且有效地結合除所採集之細胞培養液外的抗體。此在單一步驟中以高產率及高通量移除>95%之產物雜質。使用Vivaspin®離心濃縮器(GE Healthcare)對純化之物質進行濃縮，且使用Slide-A-Lyzer G2透析盒(Pierce)透析至PBS中，兩者均根據製造商之說明書進行。

實例A-4：表現之抗體的生物物理表徵 A)SDS-PAGE分析

使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來評估所表現之抗體的分子量，且確定抗體是否適當形成或組裝。在4-12% SDS-PAGE凝膠上以非還原或還原條件對抗體(各2μg)進行跑膠，且藉由考馬斯亮藍染色(Coomassie® brilliant blue stain)進行觀察。

使用穩定轉染來表現OA-5D5並如上文所述進行純化，且使用SDS-PAGE觀察。圖3描繪了來源於5個不同純系之OA-5D5在還原及非還原條件下的結果。在非還原條件下，觀測到所有OA-5D5純系均具有分子量為約100千道爾頓(100 kilodalton)之譜帶，對應於適當締合之單價抗體。OA-5D5純系亦在約25千道爾頓處顯示譜帶，可能對應於過量的輕鏈或Fc結構域。在還原條件下，所有OA-5D5純系均呈現約25千道爾頓及50千道爾頓之兩個譜帶，可能對應於OA-5D5輕鏈及Fc結構域(25kDa)及重鏈(50kDa)。

使用穩定轉染來表現Ab#5、Ab#7及Ab#13並如上文所述進行純化，且使用SDS-PAGE觀察。圖4描繪了Ab#5、Ab#7及Ab#13在還原及非還原條件下之結果。對於兩種條件，觀測到Ab#5、Ab#7及Ab#13跑膠至預期分子量處。在非還原條件下，觀測到Ab#5、Ab#7及Ab#13主要具有分子量為約125千道爾頓之單一譜帶，對應於適當締合之抗體輕鏈及重鏈。在非還原條件下，觀測到約25千道爾頓及100千道爾頓之兩條譜帶，對應於抗體輕鏈及重鏈。

B)使用尺寸排阻層析法測定單體百分比

可使用尺寸排阻層析法，藉由表徵聚集體或抗體片段之存在來評估所表現之抗體的純度。為了評估抗體之單體百分比，使用20mM磷酸鈉+300mM氯化鈉作為操作緩衝液，將50μg樣品注射於TSKgel® SuperSW3000管柱(4.6mm ID×30cm；Tosoh Bioscience)上。所有量測均在Agilent® 1100 HPLC上進行，其裝備有自動進樣器、二元泵及二極體陣列偵測器。藉由在Agilent ChemStation®軟體中分析資料來測定單體百分比。通常，樣品為僅經蛋白質A純化的且在1X PBS中濃度為5mg/mL。

使用短暫轉染來表現Ab#1、Ab#2、Ab#3、Ab#4、Ab#5、Ab#6、Ab#7、Ab#8、Ab#9、Ab#10、Ab#11、Ab#12及Ab#13且如上所述進行純化，且使用穩定轉染來表現OA-5D5並如上文所述進行純化。所有分子均經由尺寸排阻層析法分析。有關蛋白質A純化之抗體的近似單體百分比特性的資料顯示於下表1中。

實例5：抗體與重組c-Met及EpCAM之結合親和力

用以量測締合速率、解離速率及抗體對例如分子靶c-Met及EpCAM之結合親和力的動力學分析可按照製造商之說明書，使用Octet®平台(ForteBio®)量測。所需材料如下：

-96孔黑色平底聚丙烯微孔盤(Greiner Bio-one # 655209)。

-Octet儀器及軟體(3.0版)。

-蛋白質A感測器尖端(Fortebio®,#18-5010)

-1X PBS

-重組聚組胺酸標記之c-Met

-重組聚組胺酸標記之EpCAM-Fc

對於Octet分析，使所有試劑及樣品達到室溫。使蛋白質A感測器尖端(Fortebio®,#18-5010)在1X PBS中水合10分鐘。分析步驟包括：在1X PBS中平衡1-2分鐘；4分鐘抗體裝載(濃度：50μg/mL於1X PBS中)；1-2分鐘基線穩定化；4分鐘抗體：抗原締合；及4分鐘抗體：抗原解離。使用1X PBS作為基質通量。資料用Octet®資料分析軟體分析，處理且擬合至1：1結合模型以測定動力學參數(K_d 、K_on 及K_diss )。

表A-2描述了所測定的Ab#1、Ab#2、Ab#3、Ab#4、Ab#5、Ab#6、Ab#7、Ab#8、Ab#9、Ab#10、Ab#11、Ab#12及Ab#13之近似EpCAM結合親和力及解離速率。

表A-3描述了Ab#5、Ab#7及Ab#13之重複分析。對於重複實驗，Ab#5、Ab#7及Ab#13之K_d 及k_diss 實質上等於在初始實驗中關於Ab#5、Ab#7及Ab#13所測定者。

表A-4描述了所測定的Ab#5及Ab#7之近似c-Met結合親和力及解離速率。

實例A-6：基於盤之雙特異性抗體結合分析法

本文所揭示之抗體被設計成同時結合EpCAM及c-Met兩者。可使用基於盤之夾層型分析法來證實抗體之共結合。該分析法係如下進行。用50μL含2μg/ml cMet-Fc(Merrimack Pharmaceuticals)之PBS塗覆Reacti-Bind® 96孔盤(Pierce，目錄號15041)且在4℃下培育隔夜。次日，用PBS-T(PBS+0.05% Tween-20)洗滌該等盤，在室溫下用100μL無蛋白質阻斷緩衝液(Pierce，目錄號37572)阻斷1小時，且再次用PBS-T洗滌。接下來，在室溫下在100μL含抗體之PBS-T+10% FBS(最高抗體濃度為500nM，且10份連續三倍稀釋液，及一份空白孔用於減去背景值)存在下培育盤2小時。用PBS-T洗滌該等盤，且在室溫下添加50μl含1μg/ml EpCAM-Fc-His(Merrimack Pharmaceuticals)之PBS-T，保持1小時。用PBS-T洗滌盤且添加50μl抗His-HRP(Abcam，目錄號ab1187；1：20,000於PBS-T中)且在室溫下培育(覆蓋)1小時。再用PBS-T洗滌盤，隨後添加100μl 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB；Cell Signaling，目錄號7004)且在室溫下培育5-15分鐘。用100μl停止緩衝液(Cell Signaling，目錄號7002)停止受質反應。在450nm下，使用Envision®讀盤器(PerkinElmer)量測孔吸光度，且使用GraphPad Prism®(GraphPad Software,Inc.)分析所得資料並作圖。

使用以上方法，評估OA-5D5、Ab#5、Ab#7及Ab#13同時結合c-Met及EpCAM兩者的能力。該分析法之代表性結果顯示於圖A5中。所測試之三種雙特異性抗體均展現吸光度之劑量依賴性增加，確定了同時結合重組c-Met及EpCAM之能力，而單特異性對照抗體在該分析法中未顯示顯著信號。

實例A-7：針對c-Met及EpCAM之細胞表面表現的定量流動式細胞測量術評估

為量測例如c-Met及EpCAM之細胞表面表現量，使用Quantum^TM Simply Cellular®套組(Bangs Laboratories)進行定量流動式細胞測量術。

使用含有10% FBS之標準細胞培養基使細胞在指數期生長，且在實驗開始之前至少傳代兩次。實驗當日，在顯微鏡下目測評估細胞以確定60%與80%之間之匯合度。藉由添加20μl胰蛋白酶使細胞自培養盤分離，且一旦大多數細胞分離(如藉由顯微鏡目測評估)，則使用含有10% FBS之細胞培養基使胰蛋白酶鈍化。以500g離心細胞，將其再懸浮於流動式細胞測量術緩衝液(含2% FBS+0.1%疊氮化鈉之PBS)中且以每孔50,000個細胞之密度接種於96孔盤(BD Biosciences，目錄號62406-015)中。

在單獨96孔盤中，每孔添加2滴Quantum^TM Simply Cellular®抗小鼠IgG塗覆之珠粒(Bangs Laboratories，目錄號815)或抗人類IgG塗覆之珠粒(Bangs Laboratories，目錄號816)。每個珠粒套組含有5個珠粒群(1個空白及4個具有遞增量之Fc特異性捕獲抗體的珠粒)。每個經塗覆群結合一定數量的適當物種之單株抗體(「ABC」值)，且因此用作標準曲線以在珠粒標記為經相同單株抗體飽和時進行定量，該單株抗體係用於標記細胞表面蛋白。

向該等細胞及珠粒(在80μl流動式細胞測量術緩衝液中之200nM 抗體濃度)添加與APC結合之抗cMet人類抗體(h224G11-TH7純系)或抗EpCAM鼠類抗體(BD Biosciences，目錄號347200)。使抗體在4℃下培育30分鐘。對該等盤進行離心且用100μL冰冷的流動式細胞測量術緩衝液洗滌兩次。最後一次洗滌後，對細胞及珠粒進行離心且將其再懸浮於100μL冰冷的流動式細胞測量術緩衝液中且使用適當螢光濾光器在流動式細胞測量儀(BD FACSCanto^TM )上讀取。珠粒群之通道值記錄於Quantum^TM Simply Cellular®套組中提供之珠粒批號特異性QuickCal®模板上。進行有關珠粒之ABC值之螢光信號的回歸。使用此標準曲線將ABC值指定為經染色之細胞樣品。若假定單價抗體-細胞表面受體結合，則ABC值等於表面受體之數量。

表5列出了使用上述方案量測的細胞株中EpCAM及c-Met細胞表面表現量。U-87 MG及A549細胞具有低EpCAM表現量，而NCI-H441、HCC827及NCI-H2170細胞具有高EpCAM表現量。

實例A-8：基底c-Met路徑活化之評估 A)抗體誘導的c-Met介導之細胞信號傳導之活化

c-Met路徑信號傳導之活化係針對c-Met之二價抗體的一個可觀測之特徵。抗體活化c-Met介導之信號轉導之能力可使用基本上如下所述之磷酸化c-Met(「pMet」)酶連接免疫吸附劑分析法(ELISA)進行評估。

實驗第1天，使用含有10% FBS且補充有青黴素/鏈黴素及2 mM 1-麩醯胺酸之RPMI培養基，以每孔約20,000個細胞將在對數中期活躍生長(60-80%匯合)之A549細胞接種於96孔盤中。第2天，抽吸出培養基且用含有0.5% FBS且補充有青黴素/鏈黴素及1-麩醯胺酸之低血清RPMI培養基更換，且細胞培育隔夜。第3天，使用低血清培養基製備HGF(用作正對照，且起始濃度為40nM，以3倍連續稀釋)及抗體(起始濃度為300nM，以3倍連續稀釋)之連續稀釋液。接著，將100μL每一濃度連續稀釋液添加至盤孔中，且使細胞在37℃下培育10分鐘。接著用冷PBS洗滌細胞2次，且在每孔50μL M-PER溶液(目錄號PI78505，VWR International)+150mM NaCl+蛋白酶及磷酸酶抑制劑(以EASY包提供之cOmplete^TM 蛋白酶抑制劑混合錠，目錄號4693124001，Roche Diagnostics Corp；PhosSTOP®磷酸酶抑制劑混合錠，目錄號4906837001，Roche Diagnostics Corp)中溶解。在溶解之後約5分鐘內將細胞溶解產物儲存於-80℃下。

為量測pMet信號，使用ELISA套組(人類磷酸化HGF R/c-MET DuoSet IC Economy Pack，目錄號DYC2480E，R&D Systems)。第3天，用在每孔20μl PBS中最終濃度為4μg/ml之捕獲抗c-Met抗體塗覆384孔高度結合黑色固體盤(Corning®)。將該等盤在室溫下置放隔夜。第4天，-80℃溶解產物在室溫下解凍。在室溫下，用每孔50μL 2% BSA於PBS中之溶液阻斷384孔盤1小時。將兩個重複溶解產物彙集至一個孔中且在2% BSA/0.1%Tween-20®/25%M-PER/PBS溶液中進行2倍稀釋。藉由在2% BSA/0.1%Tween-20®/25%M-PER/PBS中製備一系列十份2倍連續稀釋液(起始濃度40nM)來製備重組pMet之標準曲線。使用僅含緩衝液之孔作為該盤上背景信號之對照。用0.05% Tween-20®於PBS中之溶液洗滌ELISA盤，且一式兩份，將20μL溶解產物或重組標準曲線自96孔盤轉移至384孔盤中。在室溫下培育盤2小時且用0.05% Tween-20®於PBS中之溶液洗滌。接下來，按每孔20μL 與辣根過氧化物酶結合之一次偵測抗體添加至ELISA盤中且在室溫下培育2小時。按照製造商之指導，添加SuperSignal® ELISA Pico化學發光受質(目錄號PI37069，VWR International)且在Envision®讀盤器(Perkin Elmer)上讀取。對於資料分析，對兩個重複樣品求平均值且使用誤差條來表示兩個複本之間之標準偏差。資料減去背景值且針對重組標準曲線進行回歸。隨後，使用GraphPad Prism®軟體(GraphPad Software,Inc.)，經由在4參數邏輯斯諦方程中進行資料回歸來計算Met刺激曲線及相應EC50值。

使用以上方案，針對二價IgG測試抗體誘導之Met活化得到磷酸化Met(pMet)。此實驗之結果顯示於圖6中。如所預期的，用HGF處理產生強pMet信號。二價IgG處理亦引起c-Met磷酸化，其程度約為天然c-Met配位體HGF之一半。相比之下，單價抗OA-5D5不引起c-Met磷酸化。

隨後，在以上分析法中測試Ab#5、Ab#7、Ab#13及OA-5D5引起c-Met磷酸化之能力。此實驗之結果顯示於圖7中。HGF之處理再次引起強pMet劑量-反應信號，而單價抗體OA-5D5不引起c-Met磷酸化。用雙特異性抗體處理不引起c-Met磷酸化。

B)抗體誘導的細胞增殖之活化

靶向c-Met受體之抗體通常能夠刺激DNA合成及細胞增殖，此對於靶向人類惡性疾病之藥物的開發係不利的。此特性可如下進行評估。

為測定抗體誘導細胞增殖之能力，首先使用50μl含0.5% FBS之RPMI培養基1640(Gibco®)將細胞接種於384孔盤中。以每孔800個細胞接種A549細胞，以每孔2500個細胞接種NCI-H441細胞且以每孔1500個細胞接種HCC827細胞。將該盤培育隔夜之後，抽吸出培養基且用50μl含0.5% FBS及單獨2.5nM HGF(作為正對照)或500nM所關注抗體之RPMI培養基1640進行更換。接著該盤在37℃下培育，且使用Incucyte^TM 實時成像系統(Essen Bioscience)監測細胞生長。每六小時使用相差顯微術記錄盤孔之圖像，持續四天，且根據製造商之軟體計算細胞匯合(以百分比報導)。將匯合資料輸出至GraphPad Prism®軟體(GraphPad Software,Inc.)，用於作圖及觀察。

使用上述實驗方案，在A549、NCI-H441及HCC827細胞中測試Ab#5、Ab#7及Ab#13。來自該等實驗之資料繪製於圖8A(A549細胞)、圖8B(NCI-H441細胞)及圖8C(HCC827細胞)中。所示每一資料點表示在四個重複盤孔中細胞之平均匯合度。對於全部三個細胞株，HGF刺激使得細胞匯合度相對於低血清對照增加，對應於細胞增殖之增加。在NCI-H441及HCC827細胞中，所測試之雙特異性抗體均未引起比高於低血清對照之細胞匯合。在A549細胞中，Ab#7及Ab#13未顯示細胞匯合增加超過低血清對照，而Ab#5使細胞匯合略微增加超過低血清對照。

實例A-9：HGF誘導之c-Met路徑活化之抑制的評估 A)有體介導的HGF誘導之細胞信號傳導之抑制

抗體抑制HGF誘導的c-Met介導之信號轉導的能力可在A549及NCI-H2170細胞中使用磷酸化AKT(「pAKT」)ELISA評估。

實驗第1天，使用含有RPMI培養基(+10% FBS+2mM L-麩醯胺酸+青黴素/鏈黴素)，以每孔約20,000個細胞將在對數中期活躍生長(60-80%匯合)之細胞接種於96孔盤中。第2天，抽吸出培養基且用低血清RPMI培養基(+0.5% FBS+L-麩醯胺酸+青黴素/鏈黴素)更換，且培育細胞隔夜。第3天，使用低血清培養基製備抗體之連續稀釋液(起始濃度為300nM，以3倍連續稀釋)。接著，將100μL每一濃度連續稀釋液添加至盤孔中，且使細胞在37℃下培育2小時。接下來，抽吸出含抗體之培養基且用100μL另外含1nM HGF之含抗體培養基更換。在37℃下，將細胞用含HGF之培養基培育10分鐘。接著用冷PBS洗滌細胞2次，且在每孔50μL M-PER溶液(目錄號PI78505，VWR International)+150mM NaCl+蛋白酶及磷酸酶抑制劑(以EASY包提供之cOmplete^TM 蛋白酶抑制劑混合錠，目錄號4693124001，Roche Diagnostics Corp；PhosSTOP®磷酸酶抑制劑混合錠，目錄號4906837001，Roche Diagnostics Corp)中溶解。在溶解之後約5分鐘內將細胞溶解產物儲存於-80℃下。

為量測pAKT信號，使用ELISA分析法。用在每孔20μl PBS中最終濃度為4μg/ml之捕獲抗AKT抗體(Millipore，目錄號05-591M)塗覆384孔高度結合黑色固體盤(Corning®)。將該等盤在室溫下置放隔夜。第4天，-80℃溶解產物在室溫下解凍。在室溫下，用每孔50μL 2% BSA於PBS中之溶液阻斷384孔盤1小時。將兩個重複溶解產物彙集至一個孔中且在2% BSA/0.1%Tween-20®/25%M-PER/PBS溶液中進行2倍稀釋。藉由在2% BSA/0.1%Tween-20®/25%M-PER/PBS中製備一系列十份2倍連續稀釋液(起始濃度60nM)來製備重組pAKT(Millipore，目錄號14-276)之標準曲線。使用僅含緩衝液之孔作為該盤上背景信號之對照。用0.05% Tween-20®於PBS中之溶液洗滌ELISA盤，且一式兩份，將20μL溶解產物或重組標準曲線自96孔盤轉移至384孔盤中。在室溫下培育盤2小時且用0.05% Tween-20®於PBS中之溶液洗滌。接下來，將每孔20μL的1：1000稀釋之生物素化二次抗體(Cell Signaling Technology，目錄號5102)添加至ELISA盤中且在室溫下培育1小時。接著用0.05% Tween-20®於PBS中之溶液洗滌ELISA盤。將20μL與HRP(R&D Systems，目錄號DY998)結合之經稀釋抗生蛋白鏈菌素添加至ELISA盤中且在室溫下培育30分鐘。按照製造商之指導，添加SuperSignal® ELISA Pico化學發光受質(目錄號PI37069，VWR International)且在Envision®讀盤器(Perkin Elmer)上讀取。對於資料分析，對兩個重複樣品求平均值且使用誤差條來表示兩個複本之間之標準偏差。資料減去背景值且針對重組標準曲線進行回歸。隨後，使用GraphPad Prism®軟體(GraphPad Software,Inc.)，經由在4參數邏輯斯諦方程中進行資料回歸來計算pAKT抑制曲線及相應IC₅₀ 值。

使用上述方案，在A549及NCI-H2170細胞中測試Ab#5、Ab#7、Ab#13及OA-5D5抑制HGF刺激之pAKT的能力。該等實驗之典型結果顯示於圖9中。在具有低EpCAM表現之A549細胞中，Ab#5、Ab#7及Ab#13相對於OA-5D5具有實質上相當之抑制效力。在具有高EpCAM表現之NCI-H2170細胞中，Ab#5、Ab#7及Ab#13在pAKT IC50中展現相對於OA-5D5達約10倍至20倍之改良。

B)抗體介導的HGF誘導之細胞增殖之抑制

抗體抑制HGF誘導的c-Met介導之細胞增殖的能力可如下例如在U-87 MG、A549及NCI-H441細胞中評估。

為測定抗體抑制HGF誘導的、c-Met介導之細胞增殖的能力，首先使用50μl含0.5% FBS之RPMI培養基1640(Gibco®)將細胞接種於384孔盤中。以每孔800個細胞接種A549細胞，以每孔1500個細胞接種U-87 MG細胞且以每孔3000個細胞接種NCI-H441細胞。

對於A549及NCI-H441細胞，在該盤隔夜培育之後，抽吸出培養基且用50μl僅含0.5% FBS(負對照)、含0.5% FBS加0.625nM HGF(正對照)或含0.5% FBS加0.625nM HGF及500nM所關注抗體之RPMI培養基1640更換。

對於分泌自分泌HGF之U-87 MG細胞，在該盤培育隔夜之後，抽吸出培養基且用50μl僅含0.5% FBS(負對照)或含0.5% FBS加500nM 所關注抗體之RPMI培養基1640更換。

接著該盤在37℃下培育，且使用Incucyte^TM 實時成像系統(Essen Bioscience)監測細胞生長。每六小時使用相差顯微術記錄盤孔之圖像，持續四天，且根據製造商之軟體計算細胞匯合(以百分比報導)。將匯合資料輸出至GraphPad Prism®軟體(GraphPad Software,Inc.)，用於作圖及觀察。

使用上述實驗方案，使用U-87 MG及NCI-H441細胞測試Ab#5及OA-5D5。由代表性實驗得到之結果繪製於圖10中。所示每一資料點表示在四個重複盤孔中細胞之平均匯合度。在具有低EpCAM表現之U-87 MG細胞中，Ab#5及OA-5D5實質上相當地能夠降低細胞匯合度。在具有高EpCAM表現之NCI-H441細胞中，Ab#5展現降低HGF誘導之細胞匯合至低於基底0.5%血清條件的能力，而OA-5D5則不然。

使用上述實驗方案，使用A549及NCI-H441細胞測試Ab#7及OA-5D5。由代表性實驗得到之結果繪製於圖11中。所示每一資料點表示在四個重複盤孔中細胞之平均匯合度。在具有低EpCAM表現之A549細胞中，Ab#7及OA-5D5均能夠抑制HGF誘導之細胞匯合度至0.5%血清對照之程度。在具有高EpCAM表現之NCI-H441細胞中，Ab#5使細胞匯合度幾乎降低至基底0.5%血清對照，而OA-5D5顯示較低的抑制細胞匯合之能力。

實例A-10：抗體誘導之c-Met降解的評估

為評估抗體誘導c-Met受體降解的能力，使用含10% FBS且補充有青黴素/鏈黴素及1-麩醯胺酸之RPMI培養基將7,000個A549或15,000個NCI-H2170細胞接種於96孔平底盤中。次日，用100μl含0.5% FBS且補充有青黴素/鏈黴素及1-麩醯胺酸之RPMI 1640培養基(Gibco®)更換培養基。培育隔夜之後，抽吸出低血清培養基且用另外含所關注抗體之低血清培養基更換。細胞在37℃、5% CO2下培育24小時。24小時培育結束後，用PBS洗滌細胞兩次且接著用含蛋白酶及磷酸酶抑制劑(cOmplete,Mini，以EASY包提供之無EDTA蛋白酶抑制劑混合錠，目錄號04693159001，Roche Diagnostics Corp；PhosSTOP®磷酸酶抑制劑混合錠，目錄號4906837001，Roche Diagnostics Corp)之M-PER®(哺乳動物蛋白質提取試劑；Pierce，目錄號78505)。

一式兩份，根據製造商之說明書，藉由總c-Met ELISA(Invitrogen，目錄號KHO0251)評價細胞溶解產物。使用Envision®讀盤器(Perkin Elmer)偵測信號。對於每一細胞株，針對在無抑制劑培養基對照中所偵測之量對總c-Met表現進行校正以允許在所有細胞株間進行比較。

使用上述方法，在A549及H2170細胞中測試OA-5D5及Ab#5降解c-Met受體之能力。所得資料顯示於圖12中。在低EpCAM A549細胞中，OA-5D5及Ab#5均不誘導超過20% c-Met降解。在高EpCAM NCI-H2170細胞中，OA-5D5使c-Met表現降低約30%，而Ab#5使c-Met表現降低約65%。

實例A-11：在小鼠中抗體之藥物動力學特性

為了測定抗體之終末消除半衰期，藉由靜脈內快速注射抗體向Nu/Nu小鼠(Charles River Laboratories)給藥，且在0.25、1、4、8、24、48、72、96、144、192、240及288小時的時候抽血。每一時間點對三隻小鼠抽血(使用隱靜脈或末端抽血)且自個別動物收集血清(介於10-200μl之間)。對於血清樣品分析，用50μl含1μg/ml山羊抗Fc抗體(Abcam，目錄號ab98616)之PBS塗覆Reacti-Bind® 96孔盤(Pierce)且在4℃下培育隔夜。次日，用PBS-T(PBS+0.05% Tween-20®)洗滌該等盤，在室溫下用100μl無蛋白質阻斷緩衝液(Pierce，目錄號37572)阻斷1小時，且再次用PBS-T洗滌。接著，在室溫下在100μL樣品及標準曲線存在下培育盤2小時。對於標準曲線，將所關注抗體稀釋至在PBS-T中初始濃度為12μg/ml及10份另外的3倍稀釋液且最後一個孔為空白。在PBS-T中以1：50稀釋血清樣品，及10份另外的3倍稀釋液及最後一個孔為空白。用PBS-T洗滌盤且添加100μl抗Fc-HRP抗體(Abcam，目錄號ab99759；1：20,000於PBS-T中)且在室溫下培育(覆蓋)1小時。再用PBS-T洗滌盤，隨後添加100μl 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB；Cell Signaling，目錄號7004)且在室溫下培育5-15分鐘。用100μl停止緩衝液(Cell Signaling，目錄號7002)停止受質反應。在450nm下使用Envision®讀盤器(PerkinElmer)量測孔吸光度，且使用SoftMax Pro®產生反算值。在MATLAB®(The Mathworks)中，使用以下二室雙指數模型之非線性回歸分析來進行藥物動力學曲線擬合：濃度=Ae ^-αt +Be ^-βt

對於非線性回歸，假定資料係遵循比例誤差模型，且因此對於該回歸，使用資料量值之倒數對模型及資料進行加權。終末消除半衰期計算如下：

使用上述方法評價Ab#5、Ab#7及Ab#13，且所得平均值及標準偏差(每個時間點之6個資料點表示3隻小鼠且每隻小鼠2個重複孔)繪製於圖13A(Ab#5)、圖13B(Ab#7)及圖13C(Ab#13)中。模型與資料之擬合係以實線顯示。終末半衰期資料提供於下表6中。

實例A-12：有關抗體針對植入裸小鼠中之U-87 MG腫瘤之活性的評價

Ab#7及OA-5D5之活體內活性評價如下。使用200μl PBS之注射液體積，向六至七週齡之雌性Nu/Nu小鼠(Charles River Laboratories)皮下注射5×10⁶ 個U-87 MG細胞/小鼠(ATCC®)。注射後七天，使用下式量測初始腫瘤體積：(π/6)*L*W² 。將小鼠分成具有10隻之數組，且隨後用PBS對照、雙特異性抗體或OA-5D5藉由每3天腹膜內注射進行處理。該雙特異性抗體之劑量以體重計對應於約30mg/kg，而OA-5D5給藥劑量為約24mg/kg(等莫耳數量)。在整個研究中，每週兩次測定腫瘤量測值。作圖之腫瘤尺寸資料表示每一量測值之平均值及平均值之標準偏差。

由使用上述方案進行代表性實驗得到的資料顯示於圖14中。Ab#7及OA-5D5能夠使皮下植入之U-87 MG腫瘤消退達到類似程度。

實例A-13：有關其他實施例之序列資訊 胺基酸(aa)及核苷酸(nt)序列

下劃線：CDR

粗體序列：穩定突變

>抗c-Met-LC aa(SEQ ID NO：400)(SEQ ID NO：403-415之輕鏈)

>保留的序列(SEQ ID NO：401)

XXXX

>抗c-Met-LC nt(SEQ ID NO：402)(SEQ ID NO：403-415之輕鏈)

>Ab#1-HC-aa(SEQ ID NO：403)

>Ab#2-HC-aa(SEQ ID NO：404)

>Ab#3-HC-aa(SEQ ID NO：405)

>Ab#4-HC-aa(SEQ ID NO：406)

>Ab#5-HC-aa(SEQ ID NO：407)

>Ab#5-HC-nt(SEQ ID NO：408)

>Ab#6-HC-aa(SEQ ID NO：409)

>Ab#7-HC-aa(SEQ ID NO：410)

>Ab#7-HC-nt(SEQ ID NO：411)

>Ab#8-HC-aa(SEQ ID NO：412)

>Ab#9-HC-aa(SEQ ID NO：413)

>Ab#10-HC-aa(SEQ ID NO：414)

>Ab#11-HC-aa(SEQ ID NO：415)

>Ab#12-HC-aa(SEQ ID NO：416)

>Ab#13-HC-aa(SEQ ID NO：417)

>Ab #13-HC-nt(SEQ ID NO：418)

cMet-his(信號序列呈粗體)(SEQ ID NO：419)

人類EpCAM-Fc-經his標記(信號序列呈粗體)(SEQ ID NO：420)

抗c-Met-OA-5D5-HC-aa(SEQ ID NO：421)

抗c-Met-OA-5D5-LC-aa(SEQ ID NO：422)

保留：SEQ ID NO：423、SEQ ID NO：424

>Ab#X1-OA-5D5(SEQ ID NO：425)

>Ab#X2-OA-5D5(SEQ ID NO：426)

>Ab#X3-OA-5D5(SEQ ID NO：427)

>Ab#X4-OA-5D5(SEQ ID NO：428)

>Ab#X5-OA-5D5(SEQ ID NO：429)

>Ab#X6-OA-5D5(SEQ ID NO：430)

>Ab#X7-OA-5D5(SEQ ID NO：431)

>Ab#X8-OA-5D5(SEQ ID NO：432)

>Ab#X9-OA-5D5(SEQ ID NO：433)

>Ab#X10-OA-5D5(SEQ ID NO：434)

>Ab#X11-OA-5D5(SEQ ID NO：435)

>Ab#X12-OA-5D5(SEQ ID NO：436)

>Ab#X13-OA-5D5(SEQ ID NO：437)

>抗EpCAM-HC1 aa(SEQ ID NO：438)

>抗EpCAM-HC1 nt(SEQ ID NO：439)

>抗EpCAM-HC2 aa(SEQ ID NO：440)

>抗EpCAM-HC2 nt(SEQ ID NO：441)

>抗EpCAM-HC3 aa(SEQ ID NO：442)

>抗EpCAM-HC3 nt(SEQ ID NO：443)

>抗EpCAM-HC4 aa(SEQ ID NO：444)

>抗EpCAM-HC4 nt(SEQ ID NO：445)

>抗EpCAM-HC5 aa(SEQ ID NO：446)

>抗EpCAM-HC5 nt(SEQ ID NO：447)

>抗EpCAM-HC6 aa(SEQ ID NO：448)

>抗EpCAM-HC6 nt(SEQ ID NO：449)

>抗EpCAM-HC7 aa(SEQ ID NO：450)

>抗EpCAM-HC7 nt(SEQ ID NO：451)

>抗EpCAM-LC1 aa(SEQ ID NO：452)

>抗EpCAM-LC1 nt(SEQ ID NO：453)

>抗EpCAM-LC2 aa(SEQ ID NO：454)

>抗EpCAM-LC2 nt(SEQ ID NO：455)

>抗EpCAM-LC3 aa(SEQ ID NO：456)

>抗EpCAM-LC3 nt(SEQ ID NO：457)

>抗EpCAM-LC4 aa(SEQ ID NO：458)

>抗EpCAM-LC4 NT(SEQ ID NO：459)

>抗EpCAM scFv-v1 aa(SEQ ID NO：460)

>抗EpCAM scFv-v1 nt(SEQ ID NO：461)

>抗EpCAM scFv-v2 aa(SEQ ID NO：462)

>抗EpCAM scFv-v2 nt(SEQ ID NO：463)

>抗EpCAM scFv-v3 aa(SEQ ID NO：464)

>抗EpCAM scFv-v3 nt(SEQ ID NO：465)

>抗EpCAM scFv-v4 aa(SEQ ID NO：466)

>抗EpCAM scFv-v4 nt(SEQ ID NO：467)

>抗EpCAM scFv-v5 aa(SEQ ID NO：468)

>抗EpCAM scFv-v5 nt(SEQ ID NO：469)

>抗EpCAM scFv-v6 aa(SEQ ID NO：470)

>抗EpCAM scFv-v6 nt(SEQ ID NO：471)

>抗EpCAM scFv-v7 aa(SEQ ID NO：472)

>抗EpCAM scFv-v7 nt(SEQ ID NO：473)

>抗EpCAM scFv-v8 aa(SEQ ID NO：474)

>抗EpCAM scFv-v8 nt(SEQ ID NO：475)

>抗EpCAM scFv-v9 aa(SEQ ID NO：476)

>抗EpCAM scFv-v9 nt(SEQ ID NO：477)

>抗EpCAM scFv-v10 aa(SEQ ID NO：478)

>抗EpCAM scFv-v10 nt(SEQ ID NO：479)

>抗EpCAM scFv-v11 aa(SEQ ID NO：480)

>抗EpCAM scFv-v11 nt(SEQ ID NO：481)

>抗EpCAM scFv-v12 aa(SEQ ID NO：482)

>抗EpCAM scFv-v12 nt(SEQ ID NO：483)

>抗EpCAM scFv-v13 aa(SEQ ID NO：484)

>抗EpCAM scFv-v13 nt(SEQ ID NO：485)

>鼠類抗epCAM-LC(SEQ ID NO：486)

>鼠類抗epCAM-HC(SEQ ID NO：487)

>來自WO 2000/061635之人類化MOC31(SEQ ID NO：488)

>TFcBA完整大鏈(SEQ ID NO：489)

實例A-14：TFcBA

在某些實施例中，提供雙特異性抗體(抗cMet/抗EpCAM)。在該等實施例中，該等雙特異性抗體包含Fab部分，其中存在對c-Met具有特異性之結合位點；及scFv部分，其中存在對EpCAM具有特異性之結合位點。

在一特定實施例中，在scFv中引入了某些穩定性特徵：(1)自CDRL1移除潛在脫醯胺(NG)位點且將其用DG代替；(2)自CDRL2移除潛在甲硫胺酸氧化位點且將其用白胺酸代替；(3)引入二硫橋以使VH-VL界面更穩定。

其他實例：第B部分 實例B-1：雙特異性抗體抗原之細胞表面表現的定量流動式細胞測量術評估

為量測例如cMet、ErbB1、ErbB2、EpCAM、CD44及CEA之細胞表面表現量，使用Quantum^TM Simply Cellular®套組(Bangs Laboratories)進行定量流動式細胞測量術。

使用含有10% FBS之標準細胞培養基使細胞在指數期生長，且在實驗開始之前至少傳代兩次。實驗當日，在顯微鏡下目測評估細胞以確定60%與80%之間之匯合度。藉由添加0.05%胰蛋白酶-EDTA(Gibco®)使細胞自培養盤分離，且一旦大多數細胞分離(如藉由顯微鏡目測評估)，則使用含有10% FBS之細胞培養基使胰蛋白酶鈍化。以500g離心細胞，將其再懸浮於流動式細胞測量術緩衝液(含2% FBS+0.1%疊氮化鈉之PBS)中且以每孔50,000個細胞之密度接種於96孔盤(BD Biosciences，目錄號62406-015)中。

針對細胞表面靶之抗體提供於表B-1中。對針對c-Met、ErbB1、ErbB2及CEA之抗體而言，根據製造商之說明書，使其與Alexa Fluor® 647(Life Technologies，目錄號A-20006)結合。可用的針對EpCAM及CD44之抗體係與APC預先結合。

將結合適當螢光團之抗體添加至細胞及珠粒(在80μl流動式細胞測量術緩衝液中之200nM抗體濃度)中。使抗體在4℃下培育30分鐘。對該等盤進行離心且用100μL冰冷的流動式細胞測量術緩衝液洗滌兩次。最後一次洗滌後，對細胞及珠粒進行離心且將其再懸浮於100μL冰冷的流動式細胞測量術緩衝液中且使用適當螢光濾光器在流動式細胞測量儀(BD FACSCanto^TM )上讀取。珠粒群之通道值記錄於Quantum^TM Simply Cellular®套組中提供之珠粒批號特異性QuickCal®模板上。進行有關珠粒之ABC值之螢光信號的回歸。使用此標準曲線將ABC值指定為經染色之細胞樣品。若假定單價抗體-細胞表面受體結合，則ABC值等於表面受體之數量。

表B-2列出了使用上述方案量測的來源於結腸直腸癌、卵巢癌、肺癌、乳癌、腦癌、胃癌、前列腺癌及胰臟癌之一組細胞株中的細胞表面表現量。表B-3列出了各種細胞表面靶與c-Met之間之表現量比率。可看出，相對於c-Met，EpCAM在任何所量測之靶中具有最高中值表現量，且亦具有最高中值表現比率，支持了選擇EpCAM作為靶向性部分以使雙特異性抗體有效結合c-Met。

在以下2個表中，腫瘤類型指示如下：1=結腸直腸癌，2=卵巢癌，3=非小細胞肺癌，4=腎癌，5=乳癌，6=神經膠質瘤，7=三陰性乳癌，8=胃癌，9=表皮樣癌，10=前列腺癌及11=胰臟癌。所指示之細胞株均可自例如ATCC商購。

實例B-2：有關抗體針對植入裸小鼠中之U-87 MG腫瘤之活性的劑量-反應分析

可在U-87自分泌HGF模型中，經由實驗測試U-87 MG腫瘤對不同劑量抗體之反應來進一步探索Ab#7之活體內活性。可根據實例A-12中所述之方案進行劑量-反應評價，但藥物為每七天給藥。以下各組經處理：

(1)PBS對照

(2)Ab#7，以個別小鼠體重計約24mg/kg

(3)Ab#7，約12mg/kg

(4)Ab#7，約4mg/kg

(5)Ab#7，約1mg/kg

由使用上述方案進行代表性實驗得到的資料顯示於圖A15中。用Ab#7進行處理以1mg/kg給藥量使皮下植入之U-87 MG腫瘤生長停滯，且以4mg/kg、12mg/kg及24mg/kg給藥量使腫瘤消退。每七天給與等於或高於12mg/kg之給藥量在本實驗中具有最大抗腫瘤活性。

實例B-3：分泌人類HGF之NCI-H358細胞株(H358-HGF細胞)的產生

可使用慢病毒粒子(GeneCopoeia^TM 目錄號LP-A0820_Lv105-0200)，根據以下方案將人類HGF轉基因轉染至NCI-H358肺癌細胞(ATCC® CRL-5807^TM )中。將使用補充有10%胎牛血清(FBS)之標準細胞培養基生長之NCI-H358細胞用胰蛋白酶處理，進行計數且使用100μl最終體積以每孔10,000個細胞之密度接種於96孔盤中。每孔添加三微升慢病毒粒子。在37℃下在離心機中以2000rpm對該盤離心2小時，且接著自離心機中取出並置放於37℃恆溫箱中，保持4天。4天之後，抽吸出培養基且用不含慢病毒之新鮮生長培養基更換。再培育24小時之後，將細胞用胰蛋白酶處理且轉移至24孔盤中。生長至80%匯合之後，細胞再用胰蛋白酶處理且轉移至6孔盤中。生長至80%匯合之後，抽吸出培養基且用含最終濃度為1μg/ml之嘌呤黴素選擇抗生素的培養基更換。使細胞在選擇培養基中再生長直至80%匯合，此後，該等細胞用胰蛋白酶處理且彙集用於擴增及以後使用。

實例B-4：H358-HGF細胞株中HGF分泌之基於Luminex的定量

可使用偶合至抗HGF抗體(R&D Systems，目錄號DY294)的基於珠粒之夾層免疫分析系統(Luminex®)量測細胞株中人類HGF之分泌，如下文所述。珠粒之製備可如下進行。將Bio-Plex® COOH珠粒(Bio-Rad，目錄號171-506052)渦旋30秒，隨後再進行基於浸浴之音波處理30秒。將100μl珠粒置放於艾本多夫管中且以12,000RPM離心4分鐘。移除上清液之後，添加100μl珠粒洗滌緩衝液(Bio-Rad Bio-Plex®胺偶合套組，目錄號171-406001)。渦旋且音波處理艾本多夫管各10秒，隨後再以12,000RPM離心4分鐘。移除上清液之後，使珠粒糰粒再懸浮於80μl珠粒活化緩衝液(Bio-Rad Bio-Plex®胺偶合套組，目錄號171-406001)中。渦旋且音波處理艾本多夫管各30秒。

在即將使用之前，製備EDC羧基/胺交聯劑(Thermo Scientific，目錄號22980)及磺基NHS酯轉化劑(Thermo Scientific，目錄號24510)之50mg/ml溶液。將10μl EDC溶液添加至艾本多夫管中，隨後添加10μl磺基NHS溶液。渦旋艾本多夫管30秒，用鋁箔覆蓋該管以避光，且在室溫下，在旋轉器中攪動該等珠粒20分鐘。添加150μl PBS，渦旋活化之珠粒10秒，且接著以12,000RPM離心4分鐘。移除上清液且用500μl PBS洗滌兩次。將活化之珠粒再懸浮於100μl抗體(1mg/ml)中，隨後在室溫下避光旋轉2小時。使用磁鐵來使珠粒聚結，由此可在不破壞珠粒之情況下小心地移除緩衝液。接下來，將珠粒再懸浮於1ml PBS-TBN(PBS，0.1% BSA，0.02% Tween®-20，0.05%疊氮化物，pH 7.4)中，由此其可在4℃下於暗處儲存待用。

在珠粒使用之前，以12,000rpm離心4分鐘。移除並丟棄上清液且用PBS洗滌一次，並用250μl阻斷緩衝液(含1% BSA之PBS)代替上清液。輕柔地渦旋珠粒15秒，且接著在室溫下使用旋轉器避光攪動30分鐘。使用以5ng/ml起始的重組蛋白質(R&D Systems，目錄號DY294)之兩倍連續稀釋液製備HGF標準品。添加重組標準溶液及細胞株上清液至珠粒中且在振盪器上在4℃下避光培育隔夜。在含抗生蛋白鏈菌素-PE之PBS+1% BSA中稀釋偵測抗體(R&D Systems，目錄號DY294)以得到0.001mg/ml之工作溶液。在4℃下使珠粒在磁性板上沈澱5分鐘。將含有樣品之板牢固地固持在磁鐵上且將該板在水槽中倒轉且輕輕地吸乾以移除過量水分。對該板短暫離心且向每個孔中添加200μl含1% BSA之PBS。在避光情況下，使珠粒在磁鐵上聚結1-2分鐘。重複上述洗滌步驟，該等步驟係藉由將該板牢固地固持在磁鐵上且在水槽中倒轉，並添加含1% BSA之PBS進行，總計洗滌三次。添加每孔100μl製備之偵測抗體之工作溶液。避光下，輕輕地振盪1小時。在與偵測抗體一起培育完成後，使用含1% BSA之PBS重複洗滌步驟總計三次。將該等樣品再懸浮於100μl含1% BSA之PBS中且在Luminex® FlexMAP3D®讀盤器上讀取。所有資料均針對使用重組蛋白質生成之標準曲線進行回歸且接著基於用於產生細胞培養物上清液之細胞的蛋白質含量進行校正。所有細胞之蛋白質濃度均可按照製造商之推薦，使用Thermo Scientific^TM Pierce^TM BCA蛋白質分析(目錄號23225)進行。

使用上述方案，量測H358-HGF及U-87 MG細胞之細胞培養基上清液中HGF之濃度且隨後針對細胞之蛋白質濃度進行校正。相對於天然表現自分泌HGF之U-87 MG細胞(圖A16)，H358-HGF細胞呈現高HGF分泌量，而親本及偽轉染之H358細胞不表現可偵測之HGF。

實例B-5：在植入裸小鼠中之EpCAM表現之腫瘤細胞株中雙特異性抗體的活性

為了探索腫瘤EpCAM表現在促進Ab#7之活體內活性方面的作用，可在EpCAM表現量顯著高於c-Met之c-Met驅動之腫瘤模型中評價該分子。對於HGF配位體依賴性腫瘤模型，細胞株需要人類HGF之自分泌式分泌，因為已知小鼠HGF不使人類c-Met活化。

經人類HGF(HCC827-HGF細胞)轉染之HCC827細胞，以及偽轉染之HCC827細胞係自Jeffrey A.Engelman博士獲得且根據Okamoto等人，Mol.Cancer Ther.9(10)：2785-92中描述之方案產生。經人類HGF轉染之NCI-H358細胞(H358-HGF細胞)及偽轉染之對照細胞係遵照實例B-3之方案產生。

針對HCC827細胞株變體之定量流動式細胞測量術量測值顯示，HGF轉染之細胞中c-Met之量相對於偽轉染之親本細胞有所降低(1.2×10⁵ /個細胞對3.8×10⁵ /個細胞)，但EpCAM之量不受影響(2.2×10⁶ /個細胞對2.2×10⁶ /個細胞)。

針對H358細胞株變體之定量流動式細胞測量術量測值顯示，HGF轉染之細胞中c-Met之量相對於偽轉染之親本細胞保持恆定(4.6×10⁵ /個細胞對4.5×10⁵ /個細胞)，但EpCAM之量有所升高(4.9×10⁷ /個細胞對3.4×10⁷ /個細胞)。

對於活體內研究，在含5% CO₂ 之潮濕氛圍下，在37℃下將細胞培養於T75燒瓶中的補充有10%胎牛血清(FBS)之RPMI 1640培養基(Sigma,St.Louis,MO)中。藉由暴露於0.25%胰蛋白酶來採集細胞。在磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中洗滌細胞兩次，且將其再懸浮於PBS中1：1比率之生長因子減少之Matrigel®(BD Biosciences)中。接著，用台盼藍(Life Technologies，目錄號15250-061)對細胞計數，且若活力<90%，則不對小鼠進行植入。

在該等腫瘤模型中Ab#7及OA-5D5之活體內活性可基本上如下所述進行評價。使用200μl PBS之注射液體積，向六至七週齡之雌性Nu/Nu小鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)皮下注射5×10⁶ 個H358-HGF細胞/小鼠或5×10⁶ 個HCC827-HGF細胞/小鼠。在注射後獲取腫瘤之後，使用下式量測初始腫瘤體積：(π/6)*L*W² 。根據重量對小鼠進行分選以將在200±50mm³ 範圍內之初始腫瘤體積隨機分組，此時將該等動物分選至治療組中，每組八隻動物。用PBS對照、雙特異性抗體或OA-5D5，藉由每7天腹膜內注射來處理小鼠。

雙特異性抗體之劑量對應於以體重計約1mg/kg、4mg/kg、12mg/kg及24mg/kg，而OA-5D5之劑量為約10mg/kg(與12mg/kg雙特異性抗體劑量等莫耳數量)。在整個研究中，每週兩次測定腫瘤量測值及體重。藉由用精細測徑規在兩個方向上進行量測來測定腫瘤體積且使用下式計算：腫瘤體積 =((π/6)*L*W² )。作圖之腫瘤尺寸資料表示每一量測值之平均值及平均值之標準偏差。研究完成之後，對小鼠實施安樂死且切除所有動物之腫瘤，急速冷凍於液氮中且儲存於-80℃冷凍器中。

在上述方案中由使用配位體依賴性HCC827-HGF細胞進行之代表性實驗得到的資料顯示於圖A17中。在分別為10mg/kg及12mg/kg OA-5D5及Ab#7之等莫耳給藥量下，該雙特異性抗體相對於OA-5D5具有改良之活性。此外，Ab#7之劑量-反應關係顯示，等於或高於12mg/kg之劑量在本實驗中具有最大抗腫瘤活性。該結果符合在實例B-2中所述之U-87 MG模型中所觀測的結果。

在上述方案中由使用配位體依賴性H358-HGF細胞進行之代表性實驗得到的資料顯示於圖A18中。在分別為10mg/kg及12mg/kg OA-5D5及Ab#7之等莫耳給藥量下，該雙特異性抗體引起腫瘤消退，而OA-5D5相對於對照未明顯減慢腫瘤生長。

實例B-6：在細胞溶解產物中由雙特異性抗體介導之c-Met及EpCAM降解的免疫墨點分析

抗體引起細胞c-Met及EpCAM降解之能力可使用如下所述之免疫墨點法在細胞溶解產物樣品中進行評估。在12孔盤中，使A549、NCI-H441及NCI-H2170細胞在含有10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals，目錄號101H1)、2mM L-麩醯胺酸(GIBCO®，目錄號25030-081)及青黴素/鏈黴素(CellGro，目錄號30-002-CI)之RPMI培養基(GIBCO®，目錄號1187-085)中生長至70-80%匯合。

接著，在37℃、5% CO₂ 下，將細胞與100nM OA-5D5或Ab#7一起培育24小時。培育完成後，用冷PBS洗滌細胞2次，且在每孔200μL M-PER溶液(VWR International，目錄號PI78505)+150mM NaCl+蛋白酶及磷酸酶抑制劑(以EASY包提供之cOmplete^TM 蛋白酶抑制劑混合錠，Roche Diagnostics Corp，目錄號4693124001；PhosSTOP®磷酸酶抑制劑混合錠，Roche Diagnostics Corp，目錄號4906837001)中溶解。

使用Thermo Scientific^TM Pierce^TM BCA蛋白質分析(目錄號23225)，遵循推薦之方案估計蛋白質濃度。簡言之，在37℃下，將等體積之蛋白質標準品及細胞溶解產物以1：20比率培育30分鐘，接著在562nm下量測吸光度。藉由使用細胞溶解產物之連續稀釋液之線性擬合及線性對標準品進行回歸來估計蛋白質濃度。

對於西方墨點分析，經由SDS-PAGE，使用10%凝膠對於每個細胞株及每種條件分離10μg蛋白質。接著，將蛋白質轉移至PVDF膜且使用總c-Met抗體(Cell Signaling，目錄號8198，1：100稀釋)、EpCAM抗體(Cell Signaling，目錄號2929，1：100稀釋)或β-肌動蛋白抗體(Cell Signaling，目錄號4970，1：100稀釋)進行墨點分析，全部根據製造商之推薦使用。山羊抗小鼠IRDye® 680及山羊抗兔IRDye® 800(LI-COR Biosciences)用作二次抗體。使用Odyssey®圖像器(LI-COR Biosciences)獲取免疫墨點圖像且定量蛋白質含量，並針對β-肌動蛋白進行校正。

如圖A19中所示，使A549細胞(圖A19A)、NCI-H441(圖A19B及A19D)及NCI-H2170細胞(圖A19C及A19E)生長並如上文所述與100nM OA-5D5或Ab#7一起培育，並量測c-Met(圖A19A-C)或EpCAM(圖D-E)之相對蛋白質濃度。在本分析法中，在A549細胞中不能偵測到EpCAM。如可在圖19B及19C中看出，與Ab#7一起培育引起NCI-H441及HCI-H2170細胞中c-Met降解，而與OA-5D5一起培育則不然。不管抗體處理如何，NCI-H441或NCI-H2170細胞中都未發生EpCAM降解。

實例B-7：在異種移植腫瘤中由雙特異性抗體介導之c-Met及EpCAM 降解的免疫墨點分析

抗體引起細胞c-Met及EpCAM降解之能力可使用免疫墨點法在異種移植腫瘤樣品中進行評估。為此，手術獲得實例B-3中所述實驗之研究結束腫瘤的腫瘤樣品且根據製造商之說明書，使用CryoPrep^TM 系統(Covaris)，藉由將樣品置放於組織管粉碎帶中，使用液氮急速冷凍且以衝擊程度3乾法粉碎來進行粉碎。取決於組織尺寸，冷凍及粉碎步驟重複3-5次。將組織袋中之粉碎樣品倒轉，且輕敲轉移至低溫冷凍小瓶(Corning®)中，接著稱重，每份樣品最終腫瘤重量為約1-2mg。接著，在冰上於補充有新鮮蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合錠(ROCHE)之組織蛋白質提取試劑TPER®(Thermo Scientific)中將稱取之樣品溶解10分鐘，每份樣品最終濃度為約200mg/ml。在4℃下藉由使用QIAshredder®(QIAGEN)進一步進行預澄清離心(14,000rpm持續10分鐘)。移除離心之上清液且使用Thermo scientific^TM Pierce^TM BCA蛋白質分析(目錄號23225)，按照製造商之推薦估計其總蛋白質濃度。簡言之，在37℃下，將等體積之蛋白質標準品及細胞溶解產物以1：20比率培育30分鐘，接著在562nm下量測吸光度。藉由使用細胞溶解產物之連續稀釋液之線性擬合及線性對標準品進行回歸來估計蛋白質濃度。

對於每個免疫墨點，自個別腫瘤溶解產物樣品獲得等量總蛋白質且合併於其各別處理組中，總蛋白質量為30mg，將其裝載於NuPAGE 4-12% Bis-Tris 10-12 well gel®(Life Technology)上之1x XT MES®操作緩衝液(BIO-RAD)中並跑膠。使用iBlot®凝膠轉移系統(Invitrogen)將凝膠上之蛋白質樣品轉移至硝基纖維素膜。在室溫下將該膜阻斷1小時，用各種一次抗體探測隔夜且用各種二次抗體探測一小時。接著，用Tris緩衝之含Tween® 20之生理食鹽水(TTBS®,Cell Signaling)洗滌所有免疫墨點3次。使用Odyssey®圖像器(LI-COR Biosciences)獲取免疫墨點圖像且定量蛋白質含量，並針對β-肌動蛋白進行校正。

該等研究中使用之抗體包括：c-Met(D1C2)XP^® 兔mAb #8198、EpCAM(D1B3)兔mAb #2626、β-肌動蛋白(13E5)兔mAb #4970(全部來自Cell Signaling)，全部係根據製造商之推薦使用。山羊抗小鼠IRDye® 680及山羊抗兔IRDye® 800(LI-COR Biosciences)用作二次抗體。

類似於以上在實例B-7中描述之活體內實驗的結果，來自用Ab #7處理之小鼠的腫瘤將顯示c-Met降解增加，而來自用OA-5D5處理之小鼠之腫瘤則不然。類似地，在來自用Ab#7或OA-5D5處理之小鼠的腫瘤中未觀測到EpCAM降解。

有關以引用之方式併入及變化之其他陳述

本申請案通篇引用之所有參考文獻，例如專利文獻(包括頒予或授權之專利或等效物)；專利申請公開案；及非專利文獻或其他材料，均藉此以全文引用之方式併入本文中，就如同個別地以引用之方式併入一般。

當本文中使用組分或項目之馬庫西組(Markush group)或其他分組時，該組之所有個別成員及該組之所有可能組合及子組合預期均獨立地包括在本發明中。

除非上下文另作清楚規定，否則如本文中使用之單數形式「一個(種)(a/an)」及「該(該等)」包括複數個提及物。因此，例如提及「一個細胞」包括複數個該等細胞及熟習此項技術者已知的其等效物等。又，術語「一個(種)(a/an)」、「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換地使用。亦應注意，術語「包含」、「包括」及「含有」可互換地使用。表述「請求項XX-YY中任一項之」(其中XX及YY係指請求項編號)意欲以替代形式提供多附屬請求項(multiple dependent claim)，且在一些實施例中，該表述可與表述「如請求項XX-YY中任一項之」互換。

在本說明書中給定值之範圍，例如溫度範圍、時間範圍，或組成、濃度或其他值範圍時，所給範圍中所包括之所有中間範圍及子範圍，以及所有個別值均意欲包括在本發明中。如本文中所使用，範圍特別包括被提供作為範圍之端點值的值。舉例而言，1至100之範圍特定地包括端點值1及100。應瞭解，在本文之說明中所包括的範圍或子範圍之任何子範圍或個別值均可排除在本文之申請專利範圍外。

如本文中所使用，「包含」與「包括」、「含有」或「特徵在於」同義，且為包容性或開放式的(open-ended)且不排除其他、未敍述之要素或方法步驟。如本文中所使用，「由…組成」排除所主張要素中未具體指明的任何要素、步驟或成份。如本文中所使用，「基本上由…組成」不排除本質上不影響請求項之基本及新穎特性的材料或步驟。在本文之每一情形中，術語「包含」、「基本上由…組成」及「由…組成」中任一者可視情況經其他兩個術語替換，由此描述主題範疇之替代性態樣。本文中說明性描述的本發明可適當地在缺乏任何本文並未特定揭示的任一個或多個要素、任一個或多個限制狀況下實行。

熟習此項技術者應理解，除具體例示說明外的起始物質、生物材料及化學材料、生物試劑及化學試劑、合成方法、純化方法、分析方法、分析法及生物方法無需向過度實驗而可用於實踐本發明。任何此等材料及方法之所有技術中已知之功能等效物意欲包括在本發明中。

本文中已使用之術語及表述用作描述術語且並非限制，且在使用此等術語及表述的過程中不存在排除所顯示及描述之特徵或其部分之任何等效物的意圖，而應認識到，在所主張的本發明之範疇內，各種修改係可能的。因此，應瞭解，儘管已藉由各種實施例(其可包括較佳實施例、例示性實施例及視情況存在之特徵)具體地揭示本發明之態樣，但熟習此項技術者仍可藉助本文所揭示之概念的修改及變化。該等修改及變化被視為在如所描述且如可藉由所附申請專利範圍所界定的本發明之實施例之範疇內。

<110> 美商莫瑞麥克製藥公司

<120> 抗C-MET串聯Fc雙特異性抗體

<130> 555039(MMV-002CIP-PCT)

<140> PCT/US2014/021341

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<150> 61/773,788

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<150> 61/773,764

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<170> PatentIn version 3.5

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<213> 人工序列

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<400> 447

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<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

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<212> PRT

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<400> 471

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<400> 475

<210> 476

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<400> 477

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 478

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<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 479

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 483

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

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<400> 488

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> /註解=「人工序列的說明：合成多肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (21)..(40)

<223> /替代=「」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> /註解=「本序列可涵蓋4至8個『'Gly Gly Gly Gly Ser』重複單元，其中有些位置可能不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> /註解=「該序列中指定之變體殘基對於有關變體位置之註釋中之該等殘基不具有優先性」

<220>

<221> source

<223> /註解=「參看所提交之說明書中有關取代及較佳實施例之詳細說明」

<400> 490

<210> 491

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成多肽」

<400> 491

<210> 492

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成肽」

<400> 492

<210> 493

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成多肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(100)

<223> /替代=「」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(100)

<223> /註解=「本序列可涵蓋1至20個『'Gly Gly Gly Gly Ser』重複單元，其中有些位置可能不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(100)

<220>

<221> source

<400> 493

<210> 494

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成肽」

<400> 494

<210> 495

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成肽」

<400> 495

<210> 496

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成肽」

<400> 496

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<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成肽」

<400> 497

<210> 498

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成多肽」

<400> 498

<210> 499

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成多肽」

<400> 499

<210> 500

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成多肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(45)

<223> /替代=「」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223> /註解=「本序列可涵蓋1至15個『Gly Gly Ser』重複單元，其中有些位置可能不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<220>

<221> source

<400> 500

<210> 501

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成多肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (5)..(60)

<223> /替代=「」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(60)

<223> /註解=「本序列可涵蓋1至5個『Gly Gly Gly Gly Ser』重複單元，其中有些位置可能不存在」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(60)

<220>

<221> source

<400> 501

<210> 502

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /註解=「人工序列的說明：合成肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(25)

<223> /替代=「」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<220>

<221> source

<400> 502

Claims

一種串聯Fc雙特異性抗體(「TFcBA」)，其包含兩個多肽鏈：一個大鏈及一個Fab輕鏈，每條鏈具有C末端及N末端，該TFcBA包含由Fab部分所包含之第一結合位點，該Fab部分包含該Fab輕鏈及Fab重鏈，該Fab重鏈係在該大鏈之N末端處，該Fab部分特異性結合至cMET，且該TFcBA進一步包含由在該大鏈之C末端處的單鏈Fv(scFV)部分所包含之第二結合位點，該scFV部分特異性結合至EpCAM，其中：(a)該Fab重鏈與該scFv部分係經由串聯Fc(「TFc」)連接；(b)該TFc包含在該大鏈內且具有第一Fc區及第二Fc區，該等Fc區經由TFc連接子連接形成連續多肽；且(c)該第一Fc區與該第二Fc區締合形成Fc二聚體，且另外其中(d)該Fab輕鏈包含包括出現在SEQ ID NO：400中之三個輕鏈CDR的胺基酸序列；且(e)該Fab重鏈包含包括出現在SEQ ID NO：423中之三個重鏈CDR的胺基酸序列。
如請求項1之TFcBA，其中該scFV部分包含胺基酸序列SEQ ID NO：488。
如請求項1或請求項2之TFcBA，其中該TFcBA大鏈以N末端至C末端次序包含：(i)Fab重鏈可變區IgG1 CH1結構域；(ii)含有IgG1上游鉸鏈區以及IgG4中間及下游鉸鏈區之雜交鉸鏈區；(iii)包含T299K突變之第一IgG4 CH2結構域；(iv)包含T366S、L368A及Y407V突變之第一IgG1 CH3結構域；(v)第一個二硫橋基元(KSCDKT)；(vi)串聯Fc連接子，視情況為包含aa序列(G₄ S)₈ 之連接子；(vii)IgG4中間及下游鉸鏈區；(viii)包含T299D突變之第二IgG4 CH2結構域；(ix)包含T366W突變之第二IgG1 CH3結構域；(x)第二個二硫橋基元(GEC)；(xi)連接性連接子，以及(xii)該scFv。
如請求項1至3中任一項之TFcBA，其中該TFcBA結合cMET之Kd小於約10e-8、10e-9、10e-10、10e-11、10e-12或10e-13M。
如請求項4之TFcBA，其中該TFcBA結合cMET之Kd為3.0×10e-8至2.5×10e-9M。
如請求項1至3中任一項之TFcBA，其中該TFcBA結合EpCAM之Kd小於約10e-7或10e-8M，或視情況為10e-9M。
如請求項6之TFcBA，其中該TFcBA結合cMET之Kd為10e-8至10e-11M。
如請求項1至3中任一項之TFcBA，其中TFc連接子序列包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項之TFcBA，其中該TFc包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：193及SEQ ID NO：195。
一種TFcBA分子，其包含大鏈，該大鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO 489。
一種治療癌症患者之方法，該方法包括向該患者投與治療有效量的如前述請求項中任一項之TFcBA，且視情況其中該治療有效量為每公斤患者體重100ng至每公斤患者體重15mg，且另外視情況其中該治療有效量為每公斤患者體重1mg至每公斤患者體重25mg。
如請求項11之方法，其中該癌症為本文所揭示之癌症類型，且視情況其中該治療有效量為每公斤患者體重1mg至每公斤患者體重10mg。
一種抑制癌症患者體內腫瘤生長之方法，該方法包括向該患者投與治療有效量的如請求項1至10中任一項之TFcBA，視情況其中該治療有效量為每公斤患者體重100ng至每公斤患者體重15mg、每公斤患者體重1mg至每公斤患者體重10mg，或每公斤患者體重1mg至每公斤患者體重25mg。
一種抑制腫瘤細胞增殖之方法，該方法包括使腫瘤細胞與包含一定濃度如請求項1至10中任一項之TFcBA的流體接觸，該TFcBA之濃度可有效抑制該等腫瘤細胞之增殖。
一種醫藥調配物，其包含如請求項1至10中任一項之TFcBA及醫藥載劑。
如請求項15之醫藥調配物，其中該調配物為適於注射、靜脈內注射及/或輸注之無菌調配物。
如請求項15或16之醫藥調配物，其中該調配物係包裝在醫藥學上可接受之容器中。
一種核酸分子，其編碼如請求項1至10中任一項之蛋白質胺基酸序列。
一種載體，其包含如請求項18之核酸分子。
一種宿主細胞，其包含載體，該載體包含如請求項18之核酸分子。
如請求項20之宿主細胞，其中該宿主細胞表現所編碼之蛋白質。
如請求項1至10中任一項之TFcBA，其中當使該TFcBA與同時表現細胞表面c-Met及細胞表面PCAM之細胞接觸時，接觸後在該等細胞中所量測之總c-Met的量低於接觸之前在相對應細胞中所量測之總c-Met的量。
如請求項22之TFcBA，其中當使該TFcBA與同時表現細胞表面c-Met及細胞表面EPCAM之細胞接觸時，在該等細胞中所量測之總EPCAM之量基本上不變。