CN102981002B - 采用标签蛋白人源化嵌合抗体作为阳性对照物的间接免疫检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明“采用标签蛋白人源化嵌合抗体作为阳性对照物的间接免疫检测方法及试剂盒”，属于医学检测领域。其步骤如下：（1）制备用于反应的固相载体，固相载体上包被有重组目标抗原，（2）制备阳性对照，（3）在所述固相载体上进行间接免疫检测反应；所述重组目标抗原指人工重组的带标签蛋白的目标抗原物；所述阳性对照物指抗重组目标抗原物中所带标签蛋白的人源化嵌合抗体。本发明的技术，一方面，能够有效解决检测操作者所面临的健康风险。另一方面，由于无需收集阳性血清样本，使间接免疫检测方法及相应的试剂盒的使用或制造成本降低，更易于推广和使用。
Description
技术领域
本发明涉及诊断试剂的制备，特别是以标签蛋白人源化嵌合抗体作为通用诊断试剂的阳性对照的应用。
背景技术
应用间接法免疫技术，如间接酶联免疫法、化学发光法等测定样品中抗体的浓度是常用的检测方法，该方法的原理是在固相载体上包被抗原蛋白，加入待测样品，待测样品中的抗体与包被抗原反应，再加入酶标记的二抗，即可检测样品中是否有与抗原结合的抗体。在此类试验中，必须设立阳性对照孔，阳性对照多用临床病人的血清或其他形式的人血清。但人源性血制品，很可能含有致病性传染物质，对操作者存在潜在的威胁，同时在配制阳性对照过程中需要大量血清或血浆，而有些病的血清或血浆又比较难得到。因此应用人源血液作为阳性对照，对于制备大量检测试剂盒产品而言，原料受到客观的限制。所以寻求一种阳性对照替代品，应用于间接法检测抗体类的试剂盒成为大家共同的意愿。
蛋白标签的用途，截至目前，主要是用于对表达蛋白进行鉴定与纯化。即通过基因工程的方式，在目标蛋白上加上标签序列，在表达纯化出的蛋白上就会带上标签蛋白序列，常用的标签蛋白有Flag、His、GST、GFP、myc、HA等，其中HIS和GST是最常用的纯化标签分子。
His标签是由6个组氨酸(His-His-His-His-His-His)组成的短肽,专门设计用于重组蛋白质的吸附纯化。其分子量较小，并且较容易分离和纯化，His融合标签与其它标签相比有很多明显优势，是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种。利用His标签可以建立基于融合蛋白的高效检测和纯化系统。而His抗体一般用于检测和His标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测His融合表达蛋白等。
GST标签体系具有蛋白表达产率高、表达产物纯化方便，以及利于GST抗体制备等特点。GST融合蛋白在水溶液中可溶，可从细菌裂解液中提取，在不变性的条件下通过亲和层析得到。GST融合蛋白可被位点特异性蛋白酶裂解从而除去GST蛋白。融合蛋白也是一个非常好的强免疫原，因此，很容易制备抗新蛋白的抗体。正是由于以上的优点，商品化的GST融合蛋白表达体系以及GST标签抗体系统至今仍被广泛应用。
如上所述，由于标签蛋白在蛋白表达及纯化中的巨大作用，标签蛋白被广泛的应用在诊断试剂中，如用于肝炎类、艾滋、梅毒等常见重要传染病及部分癌症疾病的诊断抗原都带有His标签或GST标签。
人源化抗体是指抗体的恒定区部分（即CH和CL区）或全部由人类抗体基因所编码。由于人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应，因此目前主要用作治疗性抗体。是利用DNA重组技术，将异源（动物源）单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样表达的抗体分子中轻重链的可变区V区是异源的，而恒定区C区是人源的，整个抗体分子中近2/3部分都是人源的。将标签蛋白人源化嵌合抗体用作间接免疫检测反应的阳性对照物，到目前未见到报道。而以下本发明将其用作间接免疫检测反应的阳性对照物，并提供相应的反应检测试剂盒，并通过对比试验证明这一新的用途所带来的积极意义和优越效果。
发明内容
本发明提供了标签蛋白人源化嵌合抗体的一种新用途，以及由此产生的免疫检测试剂盒。本发明的技术方案如下：
一种采用标签蛋白人源化嵌合抗体作为阳性对照物的间接免疫检测方法，其步骤如下：
（1）针对要检测的靶标抗体，制备用于反应的包被有重组目标抗原的固相载体，
（2）制备阳性对照，
（3）在所述固相载体上进行间接免疫检测反应；
其特征在于：所述重组目标抗原指人工重组的带标签蛋白的目标抗原物，所述重组目标抗原中的目标抗原指能与所述靶标抗体特异性结合的抗原物；
所述阳性对照物采用抗重组目标抗原中的标签蛋白的人源化嵌合抗体，
所述人源化嵌合抗体是指抗体Fc端由人的抗体基因编码，抗体Fab端则由小鼠抗体的基因编码，即将标签蛋白的单克隆抗体的轻、重链可变区基因插入到含有人源抗体恒定区基因的表达载体中，转入动物细胞中表达得到的标签蛋白的人源化嵌合抗体。
所述标签蛋白的单克隆抗体指Flag、His、GST、GFP、myc或HA的单克隆抗体。
所述标签蛋白人源化嵌合抗体指His人源化嵌合抗体或GST人源化嵌合抗体。
所述阳性对照物溶于阳性对照稀释液中。
还包括用于承载检测反应的固相载体和阳性对照物，其特征在于：
所述固相载体上包被有重组目标抗原，
所述重组目标抗原指人工重组的带标签蛋白的目标抗原物；
所述阳性对照物指抗重组目标抗原物中所带标签蛋白的人源化嵌合抗体，
所述人源化嵌合抗体是指：将标签蛋白的单克隆抗体的轻、重链可变区基因插入到含有人源抗体恒定区基因的表达载体中，转入动物细胞中表达得到的标签蛋白人源化嵌合抗体。
所述标签蛋白的单克隆抗体指Flag、His、GST、GFP、myc或HA的单克隆抗体。
所述标签蛋白人源化嵌合抗体指His人源化嵌合抗体或GST人源化嵌合抗体。
所述阳性对照物溶于阳性对照稀释液中，所述阳性对照稀释液的配方为：每1000ml溶液中含NaH2PO4·2H2O 0.28g，Na2HPO4·12H2O 3.08g，NaCl 8.78g，牛血清白蛋白5～20g Proclin3000.5mL，Tween20 0.5mL，溶剂为纯化水。
所述阳性对照物溶于阳性对照稀释液中，所述阳性对照稀释液的配方为：每1000ml溶液中含NaH2PO4·2H2O 0.28g，Na2HPO4·12H2O 3.08g，NaCl 8.78g，牛血清白蛋白10g Proclin3000.5mL，Tween20 0.5mL，溶剂为纯化水。
固相载体上包被重组目标抗原所用的封闭液为：每1000ml溶液中含有NaH2PO4·2H2O0.60g，Na2HPO4·12H2O 5.80g，牛血清白蛋白BSA 5～20g，Proclin300 1mL，溶剂为纯化水。
本发明提供一种新的间接免疫检测方法，该方法的创新点在于：针对所要检测的靶标抗体--例如患者血清中的针对某一目标抗原（例如丙肝病毒HCV）的抗体，以该目标抗原作为蓝本制备带有标签蛋白的重组目标抗原，以其作为固相载体上的包被物，同时以重组目标抗原所带的标签蛋白的人源化嵌合抗体作为阳性对照物。检测中，人源化嵌合抗体的可变区部分能够与包被抗原（重组目标抗原）的标签蛋白识别结合，其恒定区同时能与酶标记的抗人二抗结合，因此可以代替阳性血清样本。本发明提供的间接免疫检测方法，一方面，能够有效解决检测操作者所面临的健康风险。另一方面，由于无需收集阳性血清样本，使间接免疫检测方法及相应的试剂盒的使用或制造成本降低，更易于推广和使用。
本发明还提供了相应的试剂盒。
本发明的方法和试剂盒中涉及的标签蛋白，如带标签蛋白的重组目标抗原、标签蛋白人源化嵌合抗体中所指的标签蛋白可以是目前常用的lag、His、GST、GFP、myc或HA，这些标签蛋白在现有技术中的用途如背景技术部分所述，主要是用于蛋白表达及纯化。而且人体不会产生对这些标签蛋白的抗体，因此，带有这些标签蛋白的重组目标抗原用作包被物，不会产生交叉反应。
本发明中提到的术语“重组目标抗原”的解释如下：导致人体或动物体产生靶标抗体（间接免疫检测反应中所检测的）的天然物质叫做天然目标抗原，例如各种病原微生物细胞外的种或属或菌株特异拥有的蛋白、或其它物质、或该微生物本身，它们的共同点在于，它们作用（接种或传染）于人体、动物体之后能够导致宿主产生专门识别它们的抗体。本发明中，固相载体上的包被物是以这些天然目标抗原为蓝本人工制备的带标签蛋白的重组目标抗原，重组目标抗原和天然目标抗原具有相同的识别位点，从而能够被靶标抗体所识别。
上述提到的人工制备该重组目标抗原，采用现有技术即可。现有技术中用于间接免疫法的包被抗原蛋白基本都是人工重组表达而得，在制备过程中，为了便于纯化，在表达载体中都插入有标签蛋白基因，因此表达出来的抗原蛋白本身即带有标签蛋白段，抗原蛋白作为包被物时，有些是采用蛋白酶将标签蛋白水解掉的，有些未经水解直接采用,例如本发明采用的北京万域美澜科技有限公司的丙肝病毒HCV重组抗原，本身就含有HIS标签或GST标签)。而本发明中所用包被抗原，采用未经蛋白酶水解的重组抗原蛋白即可。针对包被的重组抗原蛋白上所带的标签蛋白，制备相应的标签蛋白人源化嵌合抗体作物阳性对照物，即可实现本发明的技术效果。
本发明还提供了具体优选的用于上述方法的阳性对照物稀释液及包被固相载体所用的封闭液配方。
如上所述，本发明提供的方法及试剂盒，并不限于用于检测哪种疾病的血清，根据本发明的提供的思路和实施例提供的试验方法，本领域技术人员可以直观地得出：只要是采用标签蛋白人源化嵌合抗体作为阳性对照，检测用的固相载体上包被的抗原蛋白为带标签蛋白的重组抗原蛋白，即属于本发明的要求保护的范围。
具体实施方式
以下通过具体试验说明本发明的操作及效果。
试剂：阳性对照稀释液的配方为：
包被缓冲液的配方为：
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
纯化水 定容至1000mL
封闭液的配方为：
酶稀释液的配方为：
人源化抗标签抗体：
人源化抗HIS标签抗体和抗GST标签抗体（University of California实验室提供，也可商购自诺华维柯生物技术股份有限公司），即抗体的Fc端的基因来源于人，但是Fab端（识别抗原的）则来自小鼠。
HRP-羊抗人IgG:
外购HRP-羊抗人IgG（杭州安华生物技术有限公司）。
用酶稀释液将HRP-羊抗人IgG按照1:10000稀释、混匀。
实施例1应用人源化抗GST标签抗体制备阳性对照
A、阳性对照的制备：
阳性对照稀释液的制备：含0.5%～2%(W/V)牛血清白蛋白（BSA）的20mM pH7.2（7.0～7.6均可使用）的磷酸缓冲液。置于2～8℃保存，备用。
阳性对照的制备：将人源化的抗GST标签抗体用阳性对照稀释液在1:500～1:4000之间进行倍比稀释。
B、包被板的制备：
包被缓冲液的配制：50mM pH9.6的碳酸缓冲液为包被缓冲液。置于2～8℃保存，备用。
封闭液的配制：含0.5%～2%(W/V)BSA的20mM pH7.2（7.0～7.6均可使用）的磷酸缓冲液。置于2～8℃保存，备用。
包被板的制备：采用北京万域美澜科技有限公司的丙肝病毒HCV重组抗原(含有GST标签)用包被缓冲液1:10000稀释，混合制成包被液，按100μl/孔的量加入微孔板中，4℃过夜。甩掉包被液，在吸水纸上拍干。再按120μl/孔的量加入封闭液于微孔板中，4℃过夜。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时后立即进行封袋。置于2-8℃保存，备用。
试剂最佳配制浓度的选择
将人源化抗GST标签抗体用含1%（W/V)BSA的阳性对照缓冲液）按1:500稀释，重复三孔，选择封闭液及酶稀释液的最佳配比。
表1封闭液最佳配制浓度的选择
| BSA含量 | 5g | 10g | 20g |
| 1 | 1.756 | 2.467 | 2.662 |
| 2 | 1.624 | 2.391 | 2.521 |
| 3 | 1.901 | 2.102 | 2.268 |
| 平均值 | 1.760 | 2.320 | 2.484 |
表2酶稀释液最佳配制浓度的选择
| BSA含量 | 5g | 10g | 20g |
| 1 | 2.012 | 2.438 | 2.365 |
| 2 | 1.879 | 2.334 | 2.431 |
| 3 | 1.935 | 2.463 | 2.521 |
| 平均值 | 1.942 | 2.412 | 2.439 |
将人源化的抗GST标签抗体用阳性对照缓冲液按1:500稀释，重复三孔，选择封闭液及酶稀释液（含1/100的BSA）。
表3阳性对照稀释液最佳配制浓度的选择
| BSA含量 | 5g | 10g | 20g |
| 1 | 1.521 | 2.136 | 2.306 |
| 2 | 1.638 | 2.207 | 2.216 |
| 3 | 1.701 | 2.211 | 2.323 |
| 平均值 | 1.620 | 2.185 | 2.282 |
检测人源化的抗GST标签抗体的效价和稳定性。
（1）将人源化的抗GST标签抗体用阳性对照缓冲液按1:500、1:1000、1:2000、1:4000稀释，重复三孔，考察其效价。
表4效价试验
| 稀释比例 | 1:500 | 1:1000 | 1:2000 | 1:4000 |
| OD值1# | 2.572 | 2.197 | 1.672 | 0.924 |
| OD值2# | 2.437 | 2.072 | 1.543 | 0.817 |
| OD值3# | 2.641 | 2.145 | 1.663 | 0.943 |
| OD平均值 | 2.550 | 2.138 | 1.626 | 0.895 |
（2）将人源化抗GST标签抗体用阳性对照缓冲液按1:500、1:1000、1:2000、1:4000稀释，37℃考察其稳定性。
表5稳定性试验
（3）将人源化抗GST标签抗体用阳性对照缓冲液按1:2000稀释，采用间接法，同时带入20例丙肝阳性样本和21例正常人血清样本进行检测。
表6实验布局
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | PC | PC | PC | N1 | N2 | N3 | N4 | N5 | N6 | N7 | N8 | N9 |
| B | N10 | N11 | N12 | N13 | N14 | N15 | N16 | N17 | N18 | N19 | N20 | N21 |
| C | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 |
| D | P13 | P14 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | PCx | PCx | PCx | B |
注：PC代表用阳性对照缓冲液按1:2000稀释人源化抗GST标签抗体制备的阳性对照；
N1-N21代表21例正常人血清样本；P1-P20代表20例丙肝阳性样本；PCx代表用阳性血稀释后的阳性对照；B代表空白孔。
表7实验结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 1.597 | 1.603 | 1.609 | 0.058 | 0.021 | 0.042 | 0.039 | 0.015 | 0.017 | 0.021 | 0.016 | 0.003 |
| B | 0.021 | 0.042 | 0.03 | 0.008 | 0.007 | 0.017 | 0.026 | 0.034 | 0.061 | 0.048 | 0.021 | 0.008 |
| C | 0.379 | 0.543 | 0.632 | 0.736 | 0.443 | 1.036 | 1.547 | 0.681 | 0.761 | 0.845 | 0.914 | 2.036 |
| D | 1.789 | 1.369 | 0.832 | 1.987 | 0.835 | 0.635 | 0.725 | 0.822 | 1.618 | 1.62 | 1.613 | 0.005 |
实施例2应用人源化抗HIS标签抗体制备阳性对照
A、阳性对照的制备：
阳性对照稀释液的制备：含0.5%～2%(W/V)BSA的20mM pH7.2(7.0～7.6均可使用)的磷酸缓冲液。置于2～8℃保存，备用。
阳性对照的制备：将人源化抗HIS标签抗体用阳性对照缓冲液在1:1000～1:8000之间梯度进行倍比稀释。
B、包被板的制备：
包被缓冲液的配制：50mM pH9.6的碳酸缓冲液为包被缓冲液。置于2～8℃保存，备用。
封闭液的配制：含0.5%～2%（W/V）BSA的20mM pH7.2(7.0～7.6均可使用)的磷酸缓冲液。置于2～8℃保存，备用。
包被板的制备：采用北京万域美澜科技有限公司的丙肝病毒HCV重组抗原(含有HIS标签)用包被缓冲液1:15000稀释，混合制成包被液，按100μl/孔的量加入微孔板中，4℃过夜。甩掉包被液，在吸水纸上拍干。再按120μl/孔的量加入封闭液于微孔板中，4℃过夜。
甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时后立即进行封袋。置于2～8℃保存，
备用。
试剂最佳配制浓度的选择
将人源化抗HIS标签抗体用阳性对照缓冲液（含1/100的BSA）按1:1000稀释，重复三孔，选择封闭液及酶稀释液的最佳配比。
表8封闭液最佳配制浓度的选择
| BSA含量 | 5g | 10g | 20g |
| 1 | 1.764 | 2.516 | 2.598 |
| 2 | 1.696 | 2.481 | 2.687 |
| 3 | 1.706 | 2.466 | 2.629 |
| 平均值 | 1.722 | 2.488 | 2.638 |
表9酶稀释液最佳配制浓度的选择
| BSA含量 | 5g | 10g | 20g |
| 1 | 1.987 | 2.432 | 2.569 |
| 2 | 1.869 | 2.501 | 2.621 |
| 3 | 1.872 | 2.524 | 2.703 |
| 平均值 | 1.903 | 2.486 | 2.631 |
将人源化抗HIS标签抗体用阳性对照缓冲液按1:1000稀释，重复三孔，选择封闭液及酶稀释液（含1/100的BSA）。
表10阳性对照稀释液最佳配制浓度的选择
| BSA含量 | 5g | 10g | 20g |
| 1 | 1.769 | 2.369 | 2.632 |
| 2 | 1.821 | 2.287 | 2.314 |
| 3 | 1.816 | 2.342 | 2.487 |
| 平均值 | 1.802 | 2.333 | 2.478 |
检测人源化的抗HIS标签抗体的效价和稳定性。
（1）将人源化抗HIS标签抗体用阳性对照缓冲液按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000稀释，重复三孔，考察其效价。
表11效价试验
| 稀释比例 | 1:1000 | 1:2000 | 1:4000 | 1：8000 |
| OD值1# | 2.641 | 2.324 | 1.632 | 0.842 |
| OD值2# | 2.537 | 2.236 | 1.537 | 0.901 |
| OD值3# | 2.509 | 2.217 | 1.616 | 0.816 |
| OD平均值 | 2.562 | 2.259 | 1.595 | 0.853 |
（2）将人源化抗HIS标签抗体用阳性对照缓冲液按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000稀释，37℃考察其稳定性。
表12稳定性试验
（3）将人源化抗HIS标签抗体用阳性对照缓冲液按1:4000稀释，采用间接法，同时带入20例丙肝阳性样本和21例正常人血清样本进行检测。
表13实验布局
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | PC | PC | PC | N1 | N2 | N3 | N4 | N5 | N6 | N7 | N8 | N9 |
| B | N10 | N11 | N12 | N13 | N14 | N15 | N16 | N17 | N18 | N19 | N20 | N21 |
| C | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 |
| D | P13 | P14 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | PCx | PCx | PCx | B |
注：PC代表用阳性对照缓冲液按1:2000稀释人源化抗GST标签抗体制备的阳性对照；
N1-N21代表21例正常人血清样本；P1-P20代表20例丙肝阳性样本；PCx代表用阳性血稀释后的阳性对照；B代表空白孔。
表14实验结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 1.616 | 1.598 | 1.62 | 0.012 | 0.023 | 0.014 | 0.051 | 0.031 | 0.018 | 0.009 | 0.007 | 0.016 |
| B | 0.021 | 0.05 | 0.026 | 0.011 | 0.016 | 0.008 | 0.019 | 0.041 | 0.053 | 0.039 | 0.03 | 0.012 |
| C | 0.461 | 0.677 | 0.534 | 0.806 | 0.393 | 1.378 | 2.014 | 0.708 | 0.665 | 0.736 | 1.132 | 1.935 |
| D | 2.036 | 1.432 | 0.902 | 1.631 | 0.867 | 0.502 | 0.776 | 0.961 | 1.623 | 1.594 | 1.611 | 0.003 |
从以上实验结果表明，封闭液、酶稀释液、阳性对照稀释液的BSA含量为10g与20g时无太大差异，考虑成本因素，选择10g为最佳。
上述实验证明本发明在人源性检测且含有标签抗体的试剂中应用间接法，可代替阳性样本，用于阳性对照的制备。
本发明相继做了用于检测乙肝抗体、甲肝抗体的试剂盒，检测效果与上述记录一致。
Claims (6)
1.一种采用标签蛋白人源化嵌合抗体作为阳性对照物的间接免疫检测方法，其步骤如下：
(1)针对要检测的靶标抗体，制备用于反应的包被有重组目标抗原的固相载体，
(2)制备阳性对照，
(3)在所述固相载体上进行间接免疫检测反应；
其特征在于：所述重组目标抗原指人工重组的带标签蛋白的目标抗原物，所述重组目标抗原中的目标抗原指能与所述靶标抗体特异性结合的抗原物；
所述阳性对照物采用抗重组目标抗原中的标签蛋白人源化嵌合抗体，
所述人源化嵌合抗体是指抗体Fc端由人的抗体基因编码，抗体Fab端则由小鼠抗体的基因编码，即将标签蛋白的单克隆抗体的轻、重链可变区基因插入到含有人源抗体恒定区基因的表达载体中，转入动物细胞中表达得到的标签蛋白的人源化嵌合抗体，
所述标签蛋白人源化嵌合抗体指His人源化嵌合抗体或GST人源化嵌合抗体。
2.根据权利要求1所述的间接免疫检测方法，其特征在于：所述阳性对照物溶于阳性对照稀释液中。
3.用于权利要求1或2所述的间接免疫检测方法的试剂盒，包括用于承载检测反应的固相载体和阳性对照物，其特征在于：
所述固相载体上包被有重组目标抗原，
所述重组目标抗原指人工重组的带标签蛋白的目标抗原物；
所述阳性对照物指抗重组目标抗原物中所带标签蛋白的人源化嵌合抗体，
所述人源化嵌合抗体是指：将标签蛋白的单克隆抗体的轻、重链可变区基因插入到含有人源抗体恒定区基因的表达载体中，转入动物细胞中表达得到的标签蛋白人源化嵌合抗体，
所述标签蛋白人源化嵌合抗体指His人源化嵌合抗体或GST人源化嵌合抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照物溶于阳性对照稀释液中，所述阳性对照稀释液的配方为：每1000ml溶液中含NaH2PO4·2H2O 0.28g，Na2HPO4·12H2O 3.08g，NaCl 8.78g，牛血清白蛋白5～20g Proclin300 0.5mL，Tween20 0.5mL，溶剂为纯化水。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照物溶于阳性对照稀释液中，所述阳性对照稀释液的配方为：每1000ml溶液中含NaH2PO4·2H2O 0.28g，Na2HPO4·12H2O 3.08g，NaCl 8.78g，牛血清白蛋白10g，Proclin300 0.5mL，Tween20 0.5mL，溶剂为纯化水。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，固相载体上包被重组目标抗原所用的封闭液为：每1000ml溶液中含有NaH2PO4·2H2O 0.60g，Na2HPO4·12H2O 5.80g，牛血清白蛋白BSA 5～20g，Proclin300 1mL，溶剂为纯化水。
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