MX2007010008A - Vectores lentivirales y su uso. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a los vectores lentivirales para terapia genica, tratamiento contra cancer, para producir proteinas recombinantes, como anticuerpos y vacunas, y otros propositos terapeuticos. Se describen los vectores lentivirales novedosos, por ejemplo, que contienen las secuencias cooperadoras en orientaciones contrarias y/o secuencias LTR minimamente funcionales, los cuales puede utilizarse para preparar vectores de transduccion de alta eficiencia. Los vectores tambien estan disenados para expresar RNA silenciador y polinucleotidos antisentido.

Description

VECTORES LENTIVIRALES Y SU USO Esta solicitud reclama el beneficio ante la Solicitud Provisional US Nos. 60/653,386, presentada el 16 de febrero de 2005; 60/660,310, presentada el 10 de marzo de 2005; 60/682,059, presentada el 18 de mayo de 2005 y la 60/623,768, presentada el 5 de octubre de 2005, las cuales se incorporan por este medio para referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama esquemático de un vector cooperador para un sistema de dos plásmidos que contienen vsv-g y gag-pol en orientaciones contrarias.

La Figura 2 es un diagrama esquemático de un vector de transferencia que expresa la proteina verde fluorescente (GFP) .

La Figura 3 es un diagrama esquemático de una expresión para Tat y Rev utilizado en un sistema de tres plásmidos, donde la envoltura y las secuencias gag-pol están en otro plástico.

La Figura 4 es un ejemplo de un vector de transferencia modular de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona vectores lentivirales, vectores de transducción, sistemas lentivirales y los métodos para su uso en genómica funcional, descubrimiento de fármacos, validación diana, producción de proteínas (por ejemplo proteínas terapéuticas, vacunas, anticuerpos monoclonales) , terapia génica y tratamientos terapéuticos. Cualquiera de los métodos descritos en la presente se pueden llevar a cabo con los vectores novedosos proporcionados por la presente invención, o con vectores y sistemas lentivirales que son conocidos en la técnica, como puede ser los vectores movilizadores (por ejemplo las Patentes US Nos. 5,885,806 o 6,114,141) o vectores no movilizadores o autoinactivadores (Patentes US Nos. 5,994,136 ó 6,428,953) .

Vectores lentivirales de transducción La presente invención se refiere a los vectores lentivirales de transducción y las construcciones para su fabricación, los cuales pueden ser utilizados para introducir secuencias de polinucleótidos expresable que interesen en células hospederas. Un vector lentiviral de transducción es una partícula virión con envoltura que contiene una secuencia polinucleótida expresable, y que es capaz de penetrar una célula hospedera diana, llevando con ello la secuencia expresable a la célula. La partícula envuelta preferentemente es pseudoclasificada con una proteína de envoltura viral manipulada o nativa a partir de otras especies virales, incluidas no lentivirus, que altera el rango hospedero y la infectividad del lentivirus nativo. Como se describe con mayor detalle las adelante, los vectores de transducción pueden ser utilizados en un amplio intervalo de aplicaciones que incluye, por ejemplo, para la producción de proteína (incluida la producción de vacuna), para terapia génica, para suministro de polipéptidos terapéuticos, suministro de siRNA, ribozimas, polinucleótidos antisentido y otros polinucleótidos funcionales, etcétera. Tales vectores de transducción tienen la capacidad para llevar genes sencillos o dobles y para incluir secuencias inhibidoras (por ejemplo RNAi o antisentido) . En algunas modalidades, el vector de transducción también lleva un ácido nucleico que contiene una 3' LTR modificada que tiene actividad transcripcional reducida, pero no ausente.

Construcciones cooperadoras lentivirales La presente invención proporciona construcciones cooperadoras lentivirales (por ejemplo plásmidos o ácidos nucleicos aislados) . Estas construcciones contienen los elementos que son útiles para producir un vector de transducción lentiviral funcional en una célula hospedera compatible, y empacar en esta una secuencia heteróloga expresable. Estos elementos incluyen las proteínas estructurales (por ejemplo el precursor gag), proteínas de procesamiento (por ejemplo el precursor pol) , como pueden ser las proteasas, las proteínas de envoltura y la expresión y señales reguladoras necesarias para fabricar las proteínas en células hospederas y ensamblar partículas virales, funcionales. Aunque la modalidad descrita más adelante contiene la envoltura y el precursor gag-pol en el mismo plásmido, estos pueden ser colocados en plásmidos separados, si se desea, incluidos los plásmidos separados para cada uno de las proteínas gag, pol y envoltura.

Un plásmido cooperador lentiviral de la presente invención puede contener uno o más de los siguientes elementos en cualquier orden o posición apropiado, por ejemplo, (a) 5' LTR de lentivirus que comprende un promotor nativo funcional ligado de manera operante a una secuencia de polinucleótidos que codifica para gag y pol de lentivirus (por ejemplo un precursor gag-pol de lentivirus) ; y (b) el promotor heterólogo ligado de manera operante a una secuencia codificadora de la envoltura. La 5' LTR de lentivirus puede opcionalmente contener secuencias ejoradotas heterólogas ubicadas corriente arriba o hacia 5' desde la secuencia nativa.

Cualquier 5' LTR lentiviral apropiada puede ser utilizada de acuerdo con la presente invención, incluida una LTR obtenida a partir de cualquiera de las especies de lentivirus, subespecies, cepas o grupos taxonómicos. Esto incluye lentivirus de primate y no primate. Los ejemplos específicos de las especies, etcétera, incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, HIV-1 (incluidas las subespecies, grupos taxonómicos o cepas, como pueden ser los virus A, B, C, D, E, F y G, R5 y R5X4, etcétera) , HIV-2 (incluidas las subespecies, grupos taxonómicos o cepas, como pueden ser los virus R5 y R5X4, etcétera), el virus de inmunodeficiencia de simio (SIV) , el virus de inmunodeficiencia de simio/humano (SHIV) , el virus de inmunodeficiencia felina (FIV) , el virus de inmunodeficiencia bovina (BIV) , el virus de artritis-encefalitis caprina, el virus de la enfermedad de Jembrana, el lentivirus bovino, el virus visna, y el virus de la anemia infecciosa equina. La secuencia genomita para estos virus está ampliamente disponible, por ejemplo HIV-1 (NC_001802), HIV-2 (NC_001722), SIV (NC_001549), SIV-2 (NC_004455) , virus de artritis-encefalitis caprina (NC_001463) , virus de inmunodeficiencia Simian-humana (NC_001870) , FIV (NC_001482), virus de la enfermedad de Jembrana (NC_001654), lentivirus bovino (NC_001511), virus visna (NC_001452), virus de la anemia infecciosa equina (NC_001450), y BIV (NC_001413) .

La 5' LTR lentiviral contiene señales que se utilizan en la expresión génica, incluidos el mejorador, promotor, iniciación de la transcripción (formación de la caperuza) , terminador de la transcripción y poliadenilación. Estos normalmente están descritos con regiones U3, R y U5. La región U3 de la LTR contiene señales mejoradoras, promotoras y reguladoras de la transcripción, incluidos los motivos RBEIII, NF-kB, Spl, AP-1 y/o GABP. La caja TATA se ubica aproximadamente 25 pares de bases a partir del comienzo de la secuencia R, dependiendo de las especies y cepa a partir de la cual se obtiene la 5' LTR. Una 5' LTR completamente intacta puede ser utilizada, o puede utilizarse una copia modificada. Las modificaciones preferentemente incluyen la región R, donde una secuencia TAR es sustituida (ver más adelante) y/o deleción de todo o parte de una región U5. La 5' LTR modificada preferentemente contiene actividad promotora y mejoradora, por ejemplo, preferentemente U3 nativa, R modificada con una TAR sustituida y U5 nativa.

La 5' LTR puede estar ligada de manera operante a una secuencia de polinucleótidos que codifique para gag y pol de lentivirus. El término "ligado de manera operante" se entiende que la LTR se posiciona en tal forma que puede impulsar la transcripción de las secuencias codificadoras mencionadas. Las secuencias codificadoras gag y pol están organizadas como el precursor gag-pol en lentivirus nativo. La secuencia gag codifica para una proteína precursora Gag de 55 kD, también denominada p55. La p55 se disocia por la proteasa 4 viralmente codificada (un producto del gen pol) durante el proceso de maduración hacia cuatro proteínas más pequeñas denominadas MA (matriz [pl9]), CA (cápside [p24]), NC (nucleocápside [p9] ) , y pd. La proteína precursora pol se disocia de Gag por una proteasa viralmente codificada, y además se digiere para separar las actividades proteasas (plO) , RT (p50) , RNasaH (pl5) e integrasa (p31).

Uno o más sitios donadores de empalme (SD) pueden estar presentes en el plásmido cooperador. Un sitio donador de empalme por lo regular esta presente entre el extremo 3' de la 5' LTR y la secuencia empacadora. Un aceptor de empalme (SA) corriente abajo o hacia 3' también puede estar presente, por ejemplo, en el expresión 3' de las secuencias pol. El sitio SD puede estar presente en múltiples copias en cualquiera de las ubicaciones efectivas en el vector. El SD puede tener una secuencia lentiviral nativa o puede ser una copia mutadas de esta.

Las secuencias Gag-Pol nativas pueden ser utilizadas en el vector cooperador, o pueden hacerse modificaciones. Estas modificaciones (descrias con mayor detalle más adelante) incluyen, Gag-Pol quimérico, donde las secuencias Gag y Pol se obtienen de diferentes virus (por ejemplo diferentes especies, subespecies, cepas, grupos taxonómicos, etcétera y/o donde las secuencias han sido modificadas para mejorar la transcripción y/o traducción y/o reducir la recombinación. En otras modalidades de la presente invención, las secuencias que codifican para los precursores Gag y Pol pueden ser separadas y colocadas en diferentes construcciones de vector, donde cada secuencia tiene sus propias señales de presión.

El genoma RNA del HIV-1 contiene una señal Psi-empaque de aproximadamente 120 nucleótidos que es reconocida por el dominio de la nucleocápside (NC) de la poliproteína Gag durante el ensamble del virus. Las porciones críticas de la señal de empaque es entre el sitio donador de empalme (SD) principal y el codón de iniciación gag si el provirus HIV, aproximadamente distal a la región U5 de la 5' LTR. La señal de empaque es funcionalmente ausente del plásmido cooperador para evitar el empaque del precursor gag-pol funcionalmente activo hacia el vector de transducción viral. Por ejemplo la Patente US No. 5,981,276 (Sodroski y col) la cual describe vectores que contienen gaga, pero que carecen de la señal de empaquetamiento.

Secuencias promotoras y mejoradoras adicionales pueden ser colocadas corriente arriba o hacia 5' de la 5' LTR para aumentar, mejorar, intensificar, etcétera, la transcripción del precursor gag-pol. Los ejemplos de los promotores útiles pueden ser promotores mamíferos (por ejemplo constitutivo, inducible, específico del tejido), CMV, SRV, LTR de otras especies lentivirales, y otros promotores como se menciona antes y más adelante .

Además, el plásmido puede contener señales de terminación de la transcripción, como una señal poli A que sea eficaz para terminar la transcripción impulsada por la secuencia promotora. Cualquier secuencia poli A apropiada puede ser utilizada, por ejemplo, secuencias a partir de betaglobina (mamífero, humana, de conejo, etcétera) timidina cinasa, hormona de crecimiento, SV40 y muchas otras.

La construcción cooperadora además puede tener un modulo de envoltura que contenga un promotor heterólogo ligado de manera operante a una secuencia codificadora de la envoltura. El polipéptido de la envoltura se presenta en la superficie viral y esta involucrado en el reconocimiento e infección de las células hospederas por una partícula de virus. El intervalo hospedero y la especificidad pueden ser cambiados modificando o sustituyendo el polipéptido de la envoltura, por ejemplo, con una envoltura expresada por una especie viral diferente (heteróloga) o la cual haya sido modificada de otro modo. Esto se denomina pseudotipificación. Ver, por ejemplo, Yee y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 9564-9568, 1994. La proteína G del virus de estomatitis vesicular (VSV) (VSV G) ha sido utilizada extensamente por su amplio tropismo de especie y tejido y su capacidad para conferir estabilidad física y elevada infectividad a las partículas vectores. Ver, por ejemplo, Yee y col., Methods Cell Biol., (1994) 43: 99-112.

Un polipéptido de envoltura puede ser utilizado sin limitación e incluye, por ejemplo HIV gpl20 (incluidas las formas nativa y modificada) , el virus de leucemia murina de Maloney (MoMuLV o MMLV) , virus de sarcoma murino de Harvey (HaMuSV o HSV) , virus de tumor mamario murino (MuMTV o MMTV) , virus de leucemia de mono gibbon (GaLV o GALV) , virus del sarcoma de Rous (RSV) , los virus de hepatitis, los virus de influenza (VSV-G) , Molota, Rabias, filovirus (por ejemplo Ebola y Marburg, como puede ser la envoltura GP1/GP2, incluido NP_066246 y Q05320) , anfotrópico, alfavirus, etcétera. Otros ejemplos incluyen, por ejemplo, proteínas de envoltura de Togaviridae, Rhabdoviridae, Retroviridae, Poxviridae, Paramyxoviridae, y otras familias de virus de envoltura. Otras envolturas ejemplares son de virus enlistados en la siguiente base de datos localizada en la red mundial en ncbi .nlm.nih.gov/genomes/VIRUSES/virases .htmL.

Además, una proteína de envoltura viral puede ser modificada o manipulada para contener secuencias polipéptidas que permitan al vector de transducción elegir e infectar células hospederas fuera de su intervalo normal o más específicamente limitar la transducción a una célula o tipo de tejido. Por ejemplo, la proteína de envoltura puede ser unida en marco con secuencias dirigidas, como ligando receptores, anticuerpos (Utilizando una porción de unión al antígeno de un anticuerpo o una molécula recombinante tipo anticuerpo, como puede ser un anticuerpo monocatenario) , y porciones polipéptido o modificaciones de estos (por ejemplo, donde esta presente un sitio de glucosilación en la secuencia dirigida) que, cuando se presenta sobre la capa del vector de transducción, facilita el suministro dirigido de las partículas viriones a una célula diana de interés. Además, las proteínas de envoltura pueden además tener secuencias que modulen funciones celulares. La modulación de la función celular con un vector de transducción puede aumentar o disminuir la eficiencia de la transducción para ciertos tipos de células en una población mixta de células. Por ejemplo, las células madre podrían ser transducidas más específicamente con secuencias de envoltura que contengan ligandos o contra partes de unión que se unan específicamente a las células madre, en lugar de a otros tipos de células que se encuentren en la sangre o médula ósea. Estos ligando son conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitativos son el factor de la célula madre (SCF) y el ligando Flt-3. Otros ejemplos incluyen por ejemplo anticuerpos (por ejemplo anticuerpos onocatenarios que sean específicos para un tipo de célula) y esencialmente cualquier antígeno (incluidos los receptores) que sea específico para tales tejidos como pulmón, hígado, páncreas, corazón, endotelial, liso, mama, próstata, epitelial, cáncer vascular, etcétera.

Cualquier promotor heterólogo puede ser utilizado para dirigir la expresión de la secuencia codificadora de la envoltura viral cuando se liga de manera operante a esta. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, CMV, E1F alfa, el promotor híbrido E1F alfa-HTLV-1, promotores de ferritina, promotores inducibles, promotores constitutivos y otros promotores mencionados en la presente, etcétera.

En una modalidad preferida de la presente invención, las secuencias gag y pol se colocan en orientaciones transcripcionales contrarias a partir de las secuencias de la envoltura. Por lo último se entiende que la dirección de la transcripción es contraria o inversa. Esto puede ser logrado colocando los promotores correspondientes en direcciones contrarias (es decir, uno frente al otro) o utilizando promotores bidireccionales (por ejemplo Trinklein y col., Genome Research 14: 62-66, 2004). Este arreglo puede ser utilizado para propósitos de seguridad, por ejemplo, para reducir el riesgo de recombinación y/o la producción de genomas HIV recombinantes, funcionales. La seguridad se aumenta contra los vectores cuando no hay posibilidad que la lectura transcripcional resulte en un RNA que contenga las secuencias gag-pol y de envoltura funcional. La interferencia transcripcional se puede evitar utilizando secuencias de poliadenilación fuertes que terminen la transcripción. Los ejemplos de secuencias de terminación de transcripción fuertes son conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, la señal de poliadenilación de betaglobina de conejo (Lanoix y Acheson, EMBO J. 1988 Aug; 7 (8): 2515-22), ver también Plant, y col., Molecular and Cellular Biology, Abril 2005, p. 3276-3285, Vol. 25, No. 8. Además otros elementos pueden ser insertados entre las secuencias codificadoras gag-pol y de envoltura para facilitar la terminación transcripcional, como puede ser una ribozima de acción cis, o una secuencia RNAi que sea dirigida a cualquier secuencia putativa de ultralectura. Del mismo modo, secuencias de inestabilidad, secuencias de terminación y sitios de pausa pueden ser colocados entre las secuencias codificadoras.

El plásmido cooperador además puede tener un elemento TAR que se obtenga a partir de una especie lentiviral diferente, grupo, subespecie, subgrupo, cepa o grupo taxonómico que la 5' LTR y/o las secuencias gag y pol que estén presentes en esta, es decir, que sea heterólogo para otros elementos lentivirales presentes en la construcción del plásmido. La TAR preferentemente estar presente en la 5' LTR en su localización normal, por ejemplo, entre los elementos U3 y U5 de la LTR, por ejemplo, donde la R nativa se sustituye por R' de una especie lentiviral heteróloga [CONFIRM sí] . Los ejemplos de algunas especies lentivirales se enlistan antes a partir de las cuales se pueden derivar elementos TAR heterólogos.

El elemento TAR es una región de respuesta de transactivación o elemento de respuesta que se ubica en la 5' LTR (por ejemplo R) del DNA viral y en el extremo 5' del RNA correspondiente. Cuando está presente en el RNA lentiviral, el trans-activador transcripcional, Tat, se une éste, activando la transcripción desde el HIVLTR múltiple. Tat es una proteína de unión al RNA que se une a una estructura de bucle de tallo corto formado por el elemento TAR.

Cuando se utiliza un elemento TAR heterólogo, la 5' LTR puede ser modificada rutinariamente sustituyendo su TAR nativo por una secuencia TAR de otra especie. Los ejemplos de las regiones TAR se conocen ampliamente. Ver, por ejemplo, De Areliano y col., AIDS Res. Human Retro., 21: 949-954, 2005. Una 5' LTR lentiviral modificada como esta puede tener regiones U3 y U5 intactas, de modo que la LTR sea completamente funcional. La región TAR o todo el R puede ser sustituido [CONFIRM] .

Como ya se mencionó, el polipéptido Tat se une a la secuencia TAR. La secuencia codificadora para Tat puede estar presente en el plásmido cooperador, o puede estar en otro elemento en el sistema de empaquetamiento. Por ejemplo, puede estar integrado en el genoma de la línea celular utilizada para producir el vector de transcripción viral o presente en otro plásmido o construcción vector introducido en la línea celular. Cualquier polipéptido Tat puede ser utilizado siempre que sea capaz de unirse a TAR y activar la transcripción del RNA. Esto incluye las secuencias Tat nativas que se obtienen a partir de especies iguales o diferentes como el elemento TAr cognado, así como secuencias Tat manipuladas y modificadas.

El plásmido cooperador además puede tener un elemento RRE, incluido un elemento RRE el cual se obtenga a partir de una especie lentiviral diferente que la 5' LTR o las secuencias gag y pol. El elemento RRE es el sitio de unión para el polipéptido rev que es una proteína de unión al RNA específica de la secuencia de 13 kD. Las construcciones que contienen la secuencia RRE dependen del polipéptido rev para la expresión eficiente. Rev se une a una región de 240 bases de la estructura secundaria de RNA compleja del elemento de respuesta rev ("RRE") que se ubica dentro del segundo intrón de HIV, distal a las secuencias codificadoras pol y gag. La unión del rev a RRE facilita la exportación de los RNA virales no empalmados o incompletamente empalmados desde el núcleo hasta el citoplasma, regulando con ello la expresión de las proteínas del HIV. El elemento REE puede estar en cualquier posición apropiada en la construcción, preferentemente luego del precursor Gag-Pol en su posición nativa aproximada. Del mismo modo para el polipéptido Tat, cualquier polipéptido rev apropiado pueden ser utilizados a condición de que conserve la capacidad para unirse a RRE. La secuencia codificadora para rev puede estar presente en el plásmido cooperador, transferir el plásmido, sobre un plásmido separado, o integrando en la línea celular hospedera utilizada para la fabricación del vector de transducción. Del mismo modo, las secuencias codificadoras para tat pueden estar presentes en el plásmido cooperador, el plásmido de transferencia, sobre un plásmido separado o integrando en la línea celular hospedera utilizada para la fabricación del vector de transducción.

Cualquiera de las secuencias que este presente en las construcciones de la presente invención puede ser modificada desde su forma nativa, por ejemplo, para mejorar la transcripción, para mejorar la traducción, para reducir o alterar la estructura del RNA secundaria y/o para disminuir la recombinación. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, adición, deleción, sustitución y reemplazos de nucleótidos. Por ejemplo, las secuencias codificadoras para gag, pol, rev y tat pueden ser modificadas sustituyendo codones que se encuentran en estado natural con codones que no se encuentran en el estado natural, por ejemplo, para mejorar la traducción en una célula hospedera sustituyéndolos con codones que sean traducidos más eficazmente en la célula hospedera. La célula hospedera puede ser mencionada como una célula compatible, por ejemplo, para indicar que la modificación de la secuencia tiene su efecto cuando la secuencia se expresa a un tipo de célula hospedera específico. Además, las secuencias pueden ser modificadas para remover elementos reguladores, como pueden ser la secuencia de empaquetamiento. Las secuencias también pueden ser alteradas para eliminar los sitios de recombinación. Los ejemplos de lugares específicos para recombinación son, por ejemplo, descritos en Zhuang y col., J. Virol., 76: 1273-11282, 2002.

Otras modalidades incluyen el desarrollo de sistemas cooperadores para la producción de vectores lentivirales y líneas de células de empaquetamiento que puedan entonces ser desarrolladas hacia líneas celulares productoras para cualquier construcción vector determinado. Una modalidad como esta es el uso de proteínas celulares para aumentar la producción del vector lentiviral. Sam68 pertenece a una familia de proteínas que contiene dominios KH. Algunas proteína KH son reguladores de la traducción, mientras que otras según se piensa median el empalme alternativo. Sam68 se une al elemento de respuesta Rev (RRE) del HIV-1 in vi tro e in vi vo y puede sustituir y/o sinergizar funcionalmente con Rev del HIV-1 en la expresión génica mediada por RRE y la replicación del virus (Modem y col., Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, 873-879) . Además, también se demostró que el Sam68 mejora las actividades de las proteínas tipo Rev de otros retrovirus complejos. En fechas recientes se ha demostrado que Sam68 mejora el procesamiento del extremo 3 prime de los RNA del HIV-1 no empalmados que han de ser exportados al citoplasma. Las proteínas KH diferentes de Sam68 (es decir, SLM-1, SLM-2, QKI-5, QKI-6 y QKI-7) también mejoran la expresión génica mediada por Rev/RRE. Sin embargo, entre las proteínas KH probadas, solo Sam68 fue capaz de activar la expresión génica del gag mediada por el elemento del transporte constitutivo (CTE) en células humanas. Cuando se expresa en presencia de Rev, Sam68 sinergiza con Rev para aumentar considerablemente la exportación de los RNA que contienen Rev desde el núcleo. Las sobreexpresión de Sam68 en ausencia de Rev también facilita la exportación nuclear de los mRNA que contienen RRE. Por tanto, para aumentar la producción de los vectores lentivirales basados en HIV a partir de las células productoras Sam68 puede ser expresado a partir de la construcción cooperadora para facilitar la exportación de RNA vector lentiviral hacia el citoplasma y aumentar la producción de las partículas del vector lentiviral. Sam68 puede ser expresado a partir de construcciones cooperadoras que dependen de rev o independientes de rev. La invención no se limita a Sam68 y podría elegir otras proteínas asociadas con el RNA del HIV como puede ser SF2/ASF, hRIP, hRNP Al, p54nrb/PSF y RRE BP49. Por el contrario, un RNAi dirigido a Sam68 o estas otras proteínas podrían ser insertadas en un vector lentiviral para inhibir la exportación de los RNA de HIV tipo nativo como una forma de terapia génica contra infección de HIV. Ver, más adelante para made detalles sobre tratamientos contra HIV.

Vector lentiviral de transferencia La presente invención también proporciona los vectores lentivirales de transferencia. Un vector de transferencia es una construcción que contiene las secuencias de polinucleótidos que se empacan en el vector lentiviral de transducción. El vector de transferencia, cuando comprende 5' LTR y 3' LTR, puede utilizarse para la producción de vectores de transducción que sean capaces de integrarse en el genoma hospedero. Tal integración puede ser impedida, por ejemplo, por la mutación de la molécula integrada que esta presenten el plásmido cooperador en la secuencia pol. Sin embargo, los vectores integradores preferentemente son para suministro génico a largo plazo.

Un vector plásmido lentiviral de transferencia de la presente invención puede tener uno o más de los siguientes componentes: (a) secuencia polinucleótida 5' LTR de lentivirus; (b) secuencia de empaquetamiento (psi) distal para la 5' LTR; y (c) 3' LTR de lentivirus, modificada que comprende la secuencia de la caja TAT, pero esta carente de secuencias 3' U3, 5' para las secuencias de la caja TAT. Al menos una secuencia polinucleótida heteróloga, expresable puede ser insertada en el vector de transferencia, por ejemplo, entre la secuencia de empaquetamiento y la región U5 de la 3' LTR.

Cualquier secuencia 5' LTR lentiviral apropiado puede ser colocada en el vector de transferencia. Tal secuencia puede ser intacta o completamente nativa o puede ser modificada como ya se describió, por ejemplo, sustituyendo la secuencia TAR con una secuencia TAR heteróloga (R) , o sustituyendo los nucleótidos en esta con nucleótidos que no se encuentren en estado natural para llevar al mínimo los episodios de recombinación. La 5' LTR como se describe antes tiene regiones U3, R y U5 que estén presentes, pero pueden ser modificadas en tal forma que esta conserven sus propiedades funcionales.

Una secuencia de empaquetamiento (psi) distal para la 5' LTR también puede estar presente en el vector de transferencia. Esta secuencia (aproximadamente 110 nucleótidos) la cual es reconocida por el dominio NC del Gag, se utiliza en cis para facilitar la encapsulación de la secuencia heteróloga que interesa en el vector transductor. Ver, por ejemplo, Lever y col., J. Virol. (1989), 63: 4085-4087; Amarashinghe y col., J. Mol. Bio. (2001), 314: (5): 961-970. La secuencia de empaquetamiento psi es relativamente autónoma de las secuencias vecinas. Su posición en el vector de transferencia puede ser determinada de manera habitual. Ver, por ejemplo, Man y Baltimore, J Virol., 54(2): 401-407, 1985, que utiliza un gen indicador para optimizar el posicionamiento de la secuencia de empaquetamiento.

El vector de transferencia también puede incluir una 3' LTR lentiviral. La 3' LTR tiene regiones U3, R y U5 que están flanqueadas por secuencias PPT y PBS, respectivamente. La 3' LTR puede ser intacta y nativa, pero preferentemente esta modificada. Las modificaciones preferentemente incluyen aquellas que producen una LTR que conserva una cantidad mínima de actividad funcional, por ejemplo, la actividad funcional transcripcional (promotor-mejorador) .

Actividad transcripcional como esta puede ser determinada de manera habitual, por ejemplo, utilizando un gen informador. Los ejemplos de las modificaciones que producen las LTR con actividad funcional reducida (en comparación con la 3' LTR nativa) y mínima incluyen, por ejemplo, deleciones que sean 5' (corriente arriba) de la caja TAT en la región U3. Tales deleciones pueden incluir, por ejemplo, deleciones o modificaciones de uno o más de los sitios reguladores de la transcripción siguiente, como puede ser RBEIII, NF-kB, y/o Spl, así como el sitio PPT. Un ejemplo de una 3' LTR con actividad transcripcional mínima incluye una 3' LTR de lentivirus, modificada que contiene secuencia de la caja TATA, pero es carente de las secuencias 3' U3, 5' para las secuencias de la caja TATA o en las cuales las secuencias 5' están modificadas (deleción, sustitución, adición) de modo que estas no sean funcionalmente activas. Por ejemplo, los sitios NF-Kb y Spl pueden ser mutagenizadas hasta el punto donde estas sean inactivas y/o no puedan unirse a las proteínas reguladoras. Las deleciones de la región 5' corriente arriba incluye, desde aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, etcétera nucleótidos a partir del nucleótido T de la caja TATA.

La cantidad de actividad transcripcional que permanece (si se compara a la LTR nativa) puede ser, por ejemplo, desde cerca de 0.1-1%, 0.1-2%, 0.1-5%, 0.1-10%, 0.1-20%, 0.1-25%, 0.5-5%, 0.5-10%, 0.5-20%, 0.5-25%, aproximadamente 0.1%; aproximadamente 0.5%, aproximadamente 1%; aproximadamente 2%; aproximadamente 5%; aproximadamente 7%, aproximadamente 10%, etcétera.

El extremo 5' de la región U3 es necesario para la integración (dinucleótido terminal + secuencia att) . Así pues, el dinucleótido terminal y la secuencia att pueden representar el lindero 5' de las secuencias U3 que pueden ser delecionadas . Además, el vector de transferencia puede contener la secuencia RRE que puede ser ubicada corriente arriba o corriente abajo de una secuencia tract poli-purina central. La RRE o la secuencia tract poli purina central pueden ser derivadas a partir de las secuencias vector lentiviral nativas o no nativas (heterólogas) .

Las regiones 5' (por ejemplo U3) de la 3' LTR pueden ser funcionalmente disgregadas por la inserción de las secuencias heterólogas, incluidas las secuencias codificadoras expresables, como pueden ser las secuencias shRNA, ribozimas, antisentido, micro RNA' s y aptámero expresables . Estas secuencias pueden ser expresadas a partir de promotores pol II y pol III (por ejemplo U6 humano, U6 de ratón y Hl humano, 7SK) y pueden estar ubicados en el genoma vector en la 3' LTR o corriente arriba a partir de la LTR y corriente abajo a partir de la 5' LTR. Para los promotores ver, por ejemplo, Werner, T. (1999) . Models for prediction and recognition of eukaryotic promotors. Mammalian Genome 10, 168-175.

Sin embargo una 3' LTR modificada puede conservar secuencias fuera de la región U3 manipulada, por ejemplo, PPT, R, y U5. Al igual que para la 5' LTR, el elemento TAR de la región R puede ser sustituido con una secuencia TAR heteróloga a partir de una especie o subespecie lentiviral diferente.

Puesto que la transcripción viral comienza en el extremo 3' de la región U3 de la 5' LTR, estas secuencias no son parte del mRNA viral, y una copia de esta desde la 3' LTR actúa como modelo para la generación de las LTR en el provirus integrado. Si la copia 3' LTR de la región U3 se altera en una construcción vector, el RNA vector todavía se produce a partir de la 5' LTR intacta en las células productoras, pero no puede ser regenerado en las células diana. La transducción de un vector como este da como resultado la inactivación de las LTR en el virus progenie. Así pues, el retrovirus es autoinactivador (SIN) y tales vectores son conocidos vectores de transferencia SIN. Ver, por ejemplo, Mitta y col., Nucí.

Acid, Res., 30 (21): ell3, 2002; Zufferey y col., J. Virol., 72: 9873-9880, 1998; Patente US No. 6,428,953 (Naldini y col) .

Una secuencia de polinucleótido heteróloga, expresable, puede ser insertada en el vector de transferencia, por ejemplo, entre la secuencia de empaquetamiento y la 3' LTR. La secuencia expresable es la secuencia la cual se encapsula en el vector transductor viral, y la cual es prácticamente su carga útil, cualquier secuencia heteróloga que interese puede ser insertada en el vector de transferencia sin limitación, incluidas las secuencias codificadoras para proteínas, enzimas y anticuerpos terapéuticos, etcétera; siRNA; antisentido; micro RNA, aptámeros; ribositas, cualquier secuencia inhibitoria del gen o silente; y cualquier secuencia la cual sea suministrada a una célula hospedera a través de un vector transductor lentiviral.

El término "expresable" indica que la secuencia polinucleótida es capaz de ser transcrita y traducida en la célula. Las secuencias que confieren expresibilidad incluyen, por ejemplo, mejoradores, promotores, sitios de unión a la polimerasa, sitios de unión al ribosoma, sitios de donadores y aceptores de empalme, señales de poliadenilación, secuencias de iniciación y terminación de la transcripción, etcétera.

Cualquiera de los promotores antes mencionados puede ser utilizado para impulsar la expresión de la secuencia heteróloga cuando se liga de manera operante a ésta. Cuando un vector de la presente invención codifica un polipéptido citotóxico o citostático (es decir, un gen que exprese un producto deletéreo para una célula hospedera) , un sistema promotor inducible preferentemente se liga de manera operante a su secuencia codificadora de modo que la expresión de esta pueda ser regulada para llevar al mínimo la toxicidad del hospedero cuando no se necesita la expresión génica. Por ejemplo, el sistema de expresión génica regulable por tetraciclina (Gossen y Bujard, Proc . Nati . Acad. Sci . , 89: 5547-5551, 1992) puede emplearse para proporcionar expresión inducible de un gen cuando se retira la tetraciclina de la célula transferida.

Otros sistemas que pueden ser utilizados para controlar indeciblemente la expresión génica son los sistemas que utilizan elementos de respuesta que contienen promotor. En tal sistema, el promotor es inactivo cuando se une por un elemento que contiene promotor. Un ligando inductor activa el promotor, por ejemplo, en una forma cuantitativa, donde elevadas concentraciones del inductor se asocian con mayor actividad transcripcional. Por ejemplo, el sistema de regulación del gen RheoS itch® tiene tres componentes principales: un receptor de proteína RheoCept® propietario que se une a la región promotora del gen diana, el gen diana que va a ser regulado y un inductor ligando molécula orgánica pequeña propietaria. El promotor contiene un elemento de respuesta único al cual el receptor se une, y la expresión del gen diana se activa solamente cuando el inductor se une al receptor y activa la transcripción. Ver, por ejemplo, Kumar y col, J. Biol. Chem., Vol. 279, Emisión 26, 27211-27218, 25 de junio de 2004, "Highiy Flexible Ligand Binding Pocket of Ecdysone Receptor: A Single amino acid change leads to discrimination between two groups of nonsteroidal ecdysone agonists") . Los sistemas inducibles también pueden ser utilizados para aumentar la seguridad de los vectores integrando un gen que puede matar células transducidas con vector. En esta aplicación, un promotor inducible expresa un segundo gen el cual regula la expresión de un segundo promotor inducible que entonces expresaría el gen "suicida" o de seguridad que con la activación resultaría en la aniquilación de las células transducidas. La ventaja de un "switch" regulador doble es que el gen suicida o de seguridad no se expresa hasta que primero se induce, y por tanto, si es inmunogénico, no se expresaría hasta que por lo menos un profármaco fuera adicionado para estimular la expresión de uno de los genes inducibles. La otra ventaja de un switch regulatorio doble es que la expresión de fondo en ausencia del profármaco sería mucho menos que si se empleará un solo swtich. Se necesitaría por lo menos un segundo profármaco para realmente matar las células con la expresión del gen suicida o de seguridad. Un ejemplo no limitativo es la expresión de una proteína reguladora transcripcional a partir del primer promotor inducible que luego se une y potencia el segundo sistema inducible, el cual a su vez expresa cualquier gen que interese, el cual preferentemente es un gen suicida o de seguridad. Este ejemplo no limitativo no se entiende para limitar el uso de un solo sistema promotor inducible para la expresión de genes suicidas o de seguridad, los cuales por sí mismos son activados por la adición de un profármaco. También el ejemplo establecido antes no se entiende para limitar el uso de genes de seguridad o suicidas, pero algún gen o secuencia que interese puede ser expresado a partir de un sistema de expresión inducible doble como éste.

Para aumentar la flexibilidad del vector de transferencia y crear un sistema vector modular, múltiples sitios de clonación (MCS) pueden además ser incorporados en el vector que facilite la inserción de una secuencia heteróloga que interese. Estos MCS facilitan la introducción de cualquier promotor, un gen único, dos genes y opcionalmente una secuencia inhibitoria del gen, como puede ser un antisentido, ribozima, shR-NA, RNAi, micro RNA, aptámero, proteína mutante transdominante o similares. Una modalidad preferida es la expresión de un gen que interese que haya sido modificado para que su secuencia de nucleótidos sea codón regenerado con respecto al gen endógeno en una célula, y además, el mismo vector exprese secuencias inhibitorias o silenciadoras del gen capaces de inhibir o silenciar el gen nativo que interese, este enfoque tiene enorme utilidad en la compresión de la función de diferentes dominios de proteínas expresando la proteína que interesa que haya sido modificada en estos dominios, y al mismo tiempo expresa una secuencia inhibitoria o silenciadora del gen que reprime o silencia la expresión del gen no modificado, nativo que interesa. Esta aplicación también puede ser utilizada en enfoques de terapéutica génica para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, un vector lentiviral que exprese un RNAi dirigido a beta-hemoglobina puede reprimir o silenciar la hemoglobina de drepanocitos en pacientes con anemia drepanocítica . El mismo vector lentiviral también puede expresar una molécula de hemoglobina normal que haya sido degenerada del codón en el sitio elegido por el RNAi. En esta forma, las células eritroides que expresan sickle-globina pueden reprimir la expresión de cickle-globina, expresando al mismo tiempo hemoglobina nativa y corregir la anormalidad genética. El vector lentiviral sería suministrado en una población de células madre que daría origen a células eritroides expresando hemoglobina que finalmente se volverían células rojas. Este enfoque puede ser utilizado para tratar una amplia variedad de enfermedades, incluido el cáncer, enfermedad genética y enfermedades infecciosas.

El vector de transferencia además puede contener otros elementos adicionales, por ejemplo, arreglado en el siguiente orden (con los elementos ya descritos) : 5' LTR, PBS, secuencia de empaquetamiento, donador de empalme (SD) , origen de replicación, opcionalmente un tractopolipurina central (PPT) , RRE, MCS, aceptor de empalme (SA) , y 3' LTR mínimamente funcional, modificada. La secuencia polinucleótida heteróloga expresable puede ser insertada entre el sitio donador de empalme y la región U5 de la 3' LTR. El vector de transferencia también puede contener uno o más sitios SD (que se encuentren en estado natural o modificado) como esta descrito antes para el vector cooperador.

El origen de replicación puede ser utilizado para aumentar el número de copias de la construcción cuando se presenta en una célula hospedera. Para este propósito se utiliza comúnmente SV40 ori, por ejemplo, en células que produzcan antígeno T grande de SV40, como pueden ser las células HEK293-T.

Otros elementos que pueden ser proporcionados en el vector de transferencia y que son 3' LTR para los MCS incluyen, por ejemplo, un intrón sintético u otras secuencias utilizadas para la estabilidad del mRNA, sitios de entrada de ribozima interno (IRES) para facilitar la traducción de dos marcos de lectura abiertos a partir de un mRNA único marcadores selectivos y señales de terminación de la transcripción (por ejemplo sitio de poliadenilación) .

Otros elementos pueden ser utilizados para facilitar la expresión de dos marcos de lectura abiertos. Un ejemplo es la secuencia de péptido 2A/2B facilita la disociación o clivaje de un polipéptido en un sitio predeterminado (Szymczak y col., Nature Biotechnology 22: 58594, 2004) . En esta forma, dos secuencias de polinucleótido que se separan por autodisociación de la secuencia 2A pueden ser producidos a partir de un vector lentiviral desde un marco de lectura abierto único. Otro ejemplo es utilizar los elementos Secuencias de Iniciación Ribozima Interno o IRES como aquellos de Picornavirus o el virus de la enfermedad de pies y boca son dos ejemplos no limitativos. Ver, también Donnelly y col., J. Gen. Virol. 82: 1013-1025, 2001.

La presente invención también proporciona una construcción de vector de transferencia que contiene: por ejemplo, a) 5' LTR de lentivirus que contiene un promotor nativo funcional ligado de manera operante a una secuencia de polinucleótidos que codifica para un gag y pol de lentivirus nativo (o fragmento de estos), y una señal poli A heteróloga que sea efectiva para terminar la transcripción impulsada por el promotor nativo, en donde la señal de terminación de la traducción esta presente corriente abajo del inicio de la secuencia gag-pol, y b) el promotor heterólogo ligado de manera operante a una secuencia polinucleótido heterólogo ubicado corriente debajo de la secuencia gag-pol.

La presente invención también proporciona las construcciones de expresión, que comprenden: a) 5' LTR de lentivirus que contiene un promotor nativo funcional ligado de manera operante a una secuencia de polinucleótido que codifique para un gag y pol de lentivirus nativo (y fragmentos de este) y una señal poli A heteróloga que es efectiva para terminar la transcripción impulsada por el promotor nativo, en donde una señal de terminación de la traducción esta presente corriente abajo del inicio de la secuencia gag-pol, b) un sitio aceptor de empalme ubicado corriente abajo de las secuencias gag-pol y c) una secuencia polinucleótida heteróloga ubicada corriente abajo a la secuencia gag-pol que esta ligada de manera operante al promotor 5' LTR.

El vector de transferencia puede comprender cualquier de los elementos antes descritos para vector de transferencia y/o que normalmente contiene un vector de transferencia lentiviral. La secuencia gag-pol puede ser considerablemente completa, con la inserción de un terminador de la transcripción como ya se describió, pero también fragmentos parciales de este pueden ser utilizados, por ejemplo, fragmentos que contienen la secuencia de empaquetamiento. La señal de terminación puede ser colocada en cualquier parte en las secuencias codificadoras gag-pol, pero preferentemente en una posición donde solo se produzca una copia incompleta de la secuencia codificadora gag y donde no se produzca una secuencia codificadora pol. La secuencia polinucleótida heteróloga puede estar ubicada corriente abajo del codón de iniciación de la secuencia gag-pol y en una posición que este ligada de manera operante al promotor 5' LTR. Una posición como esta puede determinarse en forma habitual, por ejemplo, utilizando genes informadores para determinar que posiciones facilitan en enlace operable. La secuencia heteróloga puede ser insertada en una secuencia codificadora gag-pol completa, corriente abajo desde el terminador de la transcripción. En otra versión, la secuencia gag-pol puede ser una secuencia parcial, y la secuencia heteróloga puede seguir la secuencia parcial y el terminador de la transcripción 3' .

Un formato optativo para la expresión del vector de los micro RNA, shRNA y otras secuencias heterólogas, es un vector que contiene secuencias gag-pol intactas pero no funcionales modificando la secuencia gag-pol corriente abajo de la 5' LTR. Esta modificación da como resultado un codón de terminación que esta corriente abajo del sitio de inicio ATG del polipéptido gag-pol, pero no interfiere con los elementos de actuación cis para el empaquetamiento. [Debe haber una cláusula sobre esto]. La secuencia RNAi, micro RNA se inserta corriente abajo de la secuencia gag-pol. Incluidos los elementos cis adicionales estabilizará el vector que origina títulos aumentados y producción de secuencias efectoras funcionales. En otra modalidad, un vector como este expresa RNAi, micro RNA o shRNA (antisentido, etcétera) que esta dirigido a sitios múltiples para aumentar la probabilidad que un solo RNAi efector inhiba efectivamente la expresión de la secuencia diana. [Debe haber una cláusula sobre esto también] .

Para inactivar la traducción o transcripción de las secuencias pol, los polinucleótidos pueden también ser insertados entre las secuencias codificadoras gag y pol, por ejemplo, casetes de expresión heterólogos de las secuencias heterólogas (por ejemplo promotor, secuencia codificadora y poli A) , siRNA, antisentido, secuencias de terminación de la traducción (por ejemplo un codón de terminación) y/o de la transcripción. La terminación de la síntesis de proteínas o traducción ocurre en los ribosomas como una respuesta a un codón de terminación. Los ejemplos de los codones de terminación incluyen, por ejemplo, UAG, UAA y UGA. Ver, también, Cassan y Rousset, "UAG Readthrough in mammalian cells: Effect of upstream and downstream stop codon contexts reveal different signáis", BMC Molecular Biology 2001, 2:3.

Sistema de empaquetamiento lentiviral La presente invención también proporciona sistemas de empaquetamiento lentiviral para producir vectores de transducción lentiviral. Un sistema de empaquetamiento se refiere a una pluralidad de construcciones que son útiles para fabricar vectores de transducción lentiviral completamente envueltos y funcionales. Estos incluyen, por ejemplo, una construcción cooperadora lentiviral y construcción de transferencia (por ejemplo en la forma de plásmidos) como esta descrito con detalle antes (es decir, sistemas de dos plásmidos, tres plásmidos o múltiples plásmidos) . La construcción cooperadora preferentemente contiene el precursor gag-pol y la proteína de envoltura, pero cada una también puede estar presente en una construcción diferente. En un caso como este, ambas construcciones cooperadoras serían incluidas en el sistema.

Más aún, el sistema además puede incluir construcciones para expresar polipéptidos que actúen en trans para mejorar la producción del vector de transducción. Estos incluyen, preferentemente plásmidos que contienen polipéptidos rev y tat expresables para interaccionar con las secuencias RRE y TAR, respectivamente. Una vez más estas pueden estar presentes sobre el mismo plásmido, por ejemplo, donde cada uno tiene su propia señal de terminación de la transcripción, o donde las secuencias codificadoras están separadas por una secuencia IRES para lograr la traducción utilizando el mismo RNA mensajero. Por ejemplo, el sistema puede comprender tres plásmidos o construcciones incluido un plásmido cooperador, plásmido de transferencia y un plásmido para expresar los polipéptidos rev y/o tat.

Otros polipéptidos normalmente presentes en lentivirus, como pueden ser las proteínas accesorias nef, vif, vpr y vpu, preferentemente no se expresan sobre cualquier construcción presente en el sistema de transducción. Como una opción, la proteína vpx de SIV podría ser expresada a partir el plásmido vector, el cooperador o uno de los plásmidos cooperadores, o expresada a partir de un plásmido que individualmente o en combinación con otra secuencia. La proteína vpx puede facilitar un aumento en la eficiencia de la transducción del HIV u otros vectores basados lentivirales.

Las construcciones de la presente invención también pueden comprender orígenes de replicación (por ejemplo pUC para merecer replicación con alto número de copias y mantenimiento en E. coli), marcadores selectivos y otras secuencias, por ejemplo, para producir las construcciones cooperadoras y de transferencia en bacterias. Además, los marcadores pueden ser utilizados para ensayar la presencia del vector, y así, para confirmar la infección e integración. La presencia de un gen marcador también garantiza la selección y crecimiento de solo aquellas células hospederas que expresan las inserciones. Los genes de selección comunes codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras sustancias tóxicas, por ejemplo, histidinol, puromicina, higromicina, neomicina, metotrexato, etc., y marcadores de la superficie celular.

Los vectores cooperadores y de transferencia de la presente invención pueden incluir los vectores y uno o más elementos de estos que están descritos o reclamados en, por ejemplo, las Patentes US Nos. 5,994,136, 6,165,782, y 6,428,953 (Naldini) ; la Patente US No. 6,013,516 (Verma) ; las Patentes US Nos. 5,665,577 y 5,981,276 (Sodroski); la Patente US No. 5,817,491, (Yee) ; la Patente US No. 6,555,107; la Patente US No. 6,627,442; la Patente US No. 6,051,427 (Finer y col., ); la Patente US No. 6,924,123 (Kingsman y col.); la Patente US No. 5,591,264 (Barber y col.).

Construcción vector Además se proporciona un mecanismo para aumentar la seguridad de un vector lentiviral incluyendo las secuencias cooperadoras en la construcción del vector lentiviral. Se sabe que los retrovirus que contienen repeticiones directas son inestables y que el nivel de inestabilidad es directamente proporcional a la longitud de la secuencia de repetición directa. Las secuencias de repetición directa mayores de 200 bases son escindidas muy eficientemente de un retrovirus humano, como puede ser un lentivirus humano. Al proporcionar una secuencia cooperadora desde una construcción cooperadora no deseada corriente abajo de un sitio posible de recombinación entre las secuencias vector y cooperadora, la seguridad del vector lentiviral puede mejorar. Por ejemplo, no será deseable que una secuencia VS-VG se incorpore en el vector lentiviral. Una modalidad preferida es colocar 500-1000 bases de la región 3' o distal de vsv-g (preferentemente no incluyendo el sitio poli A) en el vector ubicado corriente arriba de un sitio de recombinación potencial (por ejemplo, solo distal al sitio de empaquetamiento del vector lentiviral) . Si hubiera recombinación entre las secuencias VSV-G del cooperador y el vector, entonces se formaría una secuencia de repetición directa, dando como resultado inestabilidad, y su subsiguiente deleción del vector durante la transcripción inversa.

Otras modalidades son sistemas de producción inducibles que contienen los mRNA de la proteína diana que son estabilizados con secuencias de RNA en una forma inducible. Por ejemplo, la región no traducida 3' nov (UTR) puede estabilizar los RNA diana que expresan proteínas tóxicas u otras proteínas que interesan en respuesta al suero. Otro ejemplo es ligar la región 3' no traducida eotaxin al gen diana que interesa, lo cual normalmente tiene una vida media baja, pero se estabiliza con la adición de TNF-alfa e IL-4 a las células. En otra versión, las secuencias contenidas en la secuencia 16-mero en la región codificadora 5' del mRNA de CYP2E1 y CYP2B1 desestabiliza los RNA diana en presencia de insulina. Con la remoción de la insulina los RNA diana se estabilizan y las proteínas pueden ser expresadas (Trong y col., Biochem. J. 2004 Dec 23). La invención preferida es utilizar tales secuencias de desestabilización para producir una línea de células de empaquetamiento que puedan producir proteínas tóxicas tipo VSV-G en una forma inducible. Mediante el enlace de las secuencias de desestabilización, con VSV-G u otra proteína y la adición o remoción del factor de estabilización, se puede lograr la expresión inducible del VSV-G u otra proteína. Las modalidades preferidas son constructor cooperadores que expresan proteínas tóxicas que contienen secuencias de RNA que desestabilizan el mRNA que codifica la proteína tóxica, pero se estabilizan en respuesta a algún factor estabilizador. Otras modalidades preferidas son vectores lentivirales que codifican un gen de proteína que interesa ligado a una secuencia de inestabilidad del RNA que puede ser expresada de manera estable tras la adición de algún factor que estabilice el mRNA.

Otra modalidad es una línea de células de empaquetamiento del vector lentiviral que expresa un RNAi dirigido a la proteína VSV-G bajo un sistema promotor inducible. Durante la selección de una línea de células, el RNAi anti VSV-G es activo y entonces se induce para ^interrumpir' para iniciar la producción del vector lentiviral. Tales promotores inducibles son conocidos en la técnica y también están descritos en esta solicitud (Grossen, M., y Bujard, H., Tight Control of Gene Expression in Mammalian Cells by Tetracycline-responsive Pro otors", Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89: 5547-5551) . Otros han utilizado el sistema inducible para inducir la expresión de VSV-G en líneas de células de empaquetamiento (Yang y col., Patente US 5,750,396; Ver a Patente US 6,218,181). Sin embargo, un método alternativo para regular la expresión de las proteínas tóxicas tipo VSV-G mediante la colocación de un inhibidor de la expresión génica se dirija a la proteína tóxica bajo el control de un promotor inducible, como puede ser el promotor sensible a tetraciclina, pero este sistema inducible particular no es una limitación y podrían utilizarse otros sistemas inducibles. El inhibidor de la expresión génica puede ser un antisentido, un RAi (del cual existen algunas variantes, como se describe antes) , una ribosita o una proteína mutante transdominante que por sí misma no sea tóxica. Una modalidad preferida es la expresión inducible de ddRNAi para la inhibición de la expresión de VSV-G durante el mantenimiento de la línea de células que entonces es "switched-off" durante el tiempo de producción del vector. El mismo método podría utilizarse para inducir la expresión de una amplia variedad de proteínas durante las fases específicas del crecimiento celular y para aplicaciones que no sean la producción de vectores. Por ejemplo, la expresión del RNAi podría ser sincronizada con la expresión de un inhibidor del ciclo celular o un segundo RNAi dirigido a un gen que favorezca el ciclado celular o división celular. Otras secuencias que podrían ser dirigidas son genes involucrados en la muerte, división, metabolismo celular, síntesis y metabolismo de proteínas, ciclado de células, síntesis y metabolismo de ácidos nucleicos y diferenciación celular, entre otros genes diana potenciales. Esto sería llevado a cabo ligando de manera operante el RNAi que sea dirigido a la proteína toxica o no deseada con un gen utilizando una Secuencia de Entrada Ribosomal Interna (IRES, por sus siglas en inglés) o una secuencia semejante que sea conocida en la técnica. El RNAi también podría ser ligado con un segundo RNAi simplemente separando las dos secuencias de RNAi con una secuencia amortiguadora. Las secuencias amortiguadoras son conocidas en la técnica y estas son cualquier secuencia que no interfiera con la función de la secuencia del RNAi.

El método anterior puede utilizarse en la producción de sistemas vectores cooperadores más seguros para la producción vectores lentivirales donde el RNAi o una secuencia de inestabilidad del RNA se utiliza para prevenir recombinantes tóxicos o no deseados del vector lentiviral. El RNAi puede ser dirigido a regiones individuales o múltiples de ultra lectura potencial entre los marcos de lectura abiertos del constructo cooperador. La secuencia de inestabilidad del RNA (también conocida como elementos desestabilizadores del mRNA y de proteína, por ejemplo, secuencias PEST, Pl, P2 cUb y Ub, 1, 2 ó 4 copias de nonámero UUAUUUAUU (SÉC ID NO: 1) (NI, N2 y N , respectivamente), elementos ricos en AU (ARE) del 3' -UTR de c-fos y c-myc . Las modalidades preferidas son constructor con doble desestabilización que consisten en por lo menos un elementos desestabilizador del RNA y por lo menos un elemento de desestabilizador de proteínas) puede ser insertada en regiones entre los genes donde sería no deseado tener ultralectura. Por ejemplo, sería no deseado tener una envoltura VSV-G y la proteína Gag o Pol en el mismo mRNA, y por tanto, un RNAi dirigido a regiones individuales o múltiples entre (o áreas putativas de recombinación) del VSV-G y los marcos de lectura abiertos de Gag o Pol en el constructo cooperador sería una modalidad preferida para la invención, una modalidad preferida es el uso de un shRNAi o un ddRNAi dirigido a una región sobre el constructo cooperador que potencialmente de cómo resultado una secuencia de RNA que contenga Gag y/o Pol, y las proteínas de envoltura VSV-G debe ocurrir ultralectura [sic] . Las secuencias de inestabilidad o degradación del RNA o la proteína podrían ser utilizados para prevenir un transcrito ultra leído o una secuencia de proteína ultra leída insertando tales elementos de inestabilidad o secuencias de degradación entre secuencias codificadoras donde sería no deseable que ocurran secuencias de RNA y/o proteínas ultra-leídas. Las secuencias de degradación podrían ser lugares en todos los marcos de lectura abiertos y por tanto pueden ser repetidos por lo menos tres veces; como el marco de lectura real que se utilizaría no es necesariamente conocido a priori al episodio de ultralectura o recombinación. Así mismo se proporciona un método para prevenir que los marcos de lectura abiertos de la envoltura y gag-pol produzcan una poliproteína ultra-leída garantizando que la gag-pol y vsv-g están en diferentes fases de la secuencia del codón triplete. Preferentemente, la vsv-g esta corriente abajo de la gag-pol y en fase-1 para la secuencia triplete del codón gag-pol.

En otra modalidad, la seguridad del vector lentiviral puede ser aumentada por la inserción de una secuencia RNAi o antisentido inducible que sea dirigida para cualquier secuencia considerada adversa si esta se recombina con el vector. Por ejemplo, una secuencia anti-vsv-g (es decir, una secuencia polinucleótida antienvoltura, como puede ser RNAi o antisentido) podría ser insertada corriente arriba del sitio aceptor del empalme principal de modo que se exprese comúnmente tarde durante la producción del vector y solo en el RNA vector genómico. En este sentido, no se afectaría significativamente el titulo del vector. Sin embargo, si ha de sobrevenir un episodio de recombinación, entonces la secuencia RNAi o antisentido se uniría a la secuencia VSV y destruiría el recombinante. Así pues, un cooperador (o vector de transferencia) puede además comprender un polinucleótido antisentido que sea eficaz para inhibir la traducción de la secuencia codificadora de la envoltura. El diseño del antisentido es bien conocido en la técnica, y puede comprender la secuencia antisentido completa insertada en el vector o una secuencia parcial de este que sea suficiente para hibridar al RNA sentido de la envoltura e inhibir su traducción.

Otra modalidad es la presencia de la siguientes secuencias peptídicas en los vectores lentivirales o constructor de expresión cooperadoras, KETWETWWTE (SEC ID NO: 2). Esta secuencia peptídico es un inhibidor poderoso de la dimerización de la transcriptasa inversa. El péptido puede utilizarse en dos formatos: para la producción de vectores lentivirales más seguros a partir de sistemas de empaquetamiento, o para terapia génica de HIV/AIDS. Para la producción de sistemas de empaquetamiento más seguros, el péptido se inserta entre las secuencias codificadoras gag-pol yi de envoltura (por ejemplo VSV-G) y se expresa solamente con ultralectura entre los dos marcos de lectura abiertos. El péptido entonces se produce para inhibir la viabilidad del vector por la inhibición de la dimerización de la transcriptasa inversa y el empaquetamiento en el virión. En el segundo formato este se expresa a partir del vector lentiviral basado en el HIV para el tratamiento de HIV/AIDS. El vector que contiene células que expresan el péptido produce partículas defectuosas sin transcriptasa inversa dimerizada tras la infección con wt-HIV. Esto permite la estimulación de la respuesta inmunitaria con los epítopes que están presentes en el cuerpo sin que se produzca virus infeccioso. En un tercer formato, el péptido puede expresarse a partir de un vector lentiviral como un segundo gen para impedir que el vector haga alguna otra movilización después de la transducción inicial. La secuencia del péptido o múltiplos de la secuencia solamente serían expresados en la célula diana y no durante la producción en vista de que el péptido sería disociado de su secuencia promotora en el vector durante la producción, pero donde el péptido sería producido en la célula diana como resultado de una secuencia de repetición directa intervinente reasociando el promotor con la secuencia peptídica para ser expresada. El mismo método podría utilizarse para expresar proteínas tóxicas en lugar del péptido que inhibe la dimerización de la transcriptasa inversa. Temporalmente el vector se organiza como sigue: una 5' LTR derivadas de un lentivirus, una secuencia de empaquetamiento, un promotor interno, una secuencia de no menos de 500 bases (preferentemente pero no limitando) que contiene un sitio donador de empalme en su limite 5' y un sitio aceptor de empalme fuerte, una secuencia intervinente, la misma secuencia de no menos de 500 bases sin el sitio donador de empalme pero con un sitio aceptor de empalme mutado uni o multipuntual que sea más débil que el sitio aceptor fuerte, una secuencia de iniciación del codón, la secuencia de codificación del péptido (o proteína tóxica) , una secuencia de terminación del codón, una poli A y un 3' LTR derivado de un lentivirus.

En fechas recientes, el gen LM02 ha sido implicado en el desarrollo de leucemias, pero parece ser que este gen no es esencial durante el desarrollo de las células T (McCor ack MP, Forster A, Drynan L., Panell R, Rabbitts TH Mol Cell Biol. 2003 Dec; 23 (24): 9003-13). Una modalidad preferida es un vector lentiviral que expresa un antisentido, ribozima, RNAi o un inhibidor de la expresión del gen LM02 para aumentar la seguridad de los vectores lentivirales o vectores retrovirales durante la terapia génica humana de enfermedades donde la CD34 o un tipo de células hematológica se transluce con un vector lentiviral o retroviral, donde el vector lentiviral o retroviral se integra en el cromosoma de la célula.

Además de LM02, se ha demostrado el aumento regulado o descenso regulado de otros genes cuando se translucen con vectores HIV (Zhao y col., Gene Therapy 12: 311-319, 2005) . Por ejemplo, EEF1 alfa tiene aumento regulador lOx en células endotelias de la vena umbilical humana, mientras que Clusterin tiene un aumento regulador 3x. Para prevenir cualquiera de los efectos adversos debido a la sobre expresión de estos genes, un vector lentiviral puede ser construido que exprese un RNAi para los genes sobre expresados y uno podría codificar y expresar los genes que se subexpresan. En esta forma podría aumentarse la seguridad de los vectores lentivirales.

Además, se proporcionan especificaciones para un vector lentiviral donde todos los sitios de iniciación del codón han sido delecionados utilizando una deleción puntal, deleciones de dos bases, deleciones de tres bases o deleción de más de tres bases e incluyendo la secuencia de iniciación del codón para las proteínas lentivirales. En esta forma, el vector conserva secuencias de activación cis requeridas para la encapsidación máxima, pero no tiene la habilidad para producir un lentivirus tipo silvestre. Además, los sitios de iniciación del codón crípticos también se delecionan. En una modalidad preferida, secuencias suficientes de deleción arrodeando los sitios de iniciación del codón para crear espacio para la inserción de los genes anteriores o RNAi para aumentar la potencia del efecto terapéutico del vector o el efecto no terapéutico deseado —por ejemplo, la producción aumentada de la proteína en las líneas celulares.

Las ventajas de esto es que las proteínas celulares son no inmunogénicas para que su sobreexpresión no de origen a una respuesta inmunitaria contra células que contienen el vector pero todavía no infectado con un lentiviral tipo silvestre.

Además se proporcionan los vectores anteriores que expresan una pluralidad de genes o RNAi que dan como resultado (1) la activación de la célula y la producción aumentada de las partículas vectores defectuosas desde la célula; (2) la estimulación de la respuesta inmunitaria; (3) la producción aumentada de las partículas defectuosas; y/o (4) la producción disminuida de las partículas lentivirus infecciosas. Estos genes o RNAi están antes descritos.

Fabricación del vector de transducción La presente invención también proporciona vectores de transducción y los métodos para producirlos. Las modalidades particulares antes descritas pueden utilizarse en forma transitoria en células hospederas para producir vectores de transducción. Los ejemplos de las células hospederas que pueden utilizarse para producir los vectores incluyen cualquier línea de células de mamífero o humano o células primarias. Los ejemplos no limitativos incluyen, por ejemplo, células 293, HT1080, Jurkat y SupTl . Otros ejemplos son CHO, 293, Hela, VERO, L929, BHK, NIH 3T3, MRC-5, BAE-1, HPE-G2, NSO, U937, Namalwa, HL60, WEHI 231, YAC 1, U 266B1, SH-SY5Y, CHO por ejemplo, CHO-Kl, (CCL-61), 293 (por ejemplo CRL-1573) .

La presente invención proporciona los métodos para producir un vector de transducción de lentivirus, que comprende, por ejemplo, a) la transfección de una célula hospedera con un plásmido cooperador de lentivirus y el plásmido de transferencia para producir una línea de células productoras; y el cultivo de la célula producto transformada bajo condiciones efectivas para producir un vector de transducción lentiviral. Cualquiera de los métodos de transfección apropiados puede utilizarse en el proceso de fabricación del vector incluida la electroporación, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por el polímero PEÍ, Fecturin o los métodos de transfección basados en lípidos. El vector de transducción preferentemente se secreta en el medio de cultivo de células donde puede ser recuperado y opcionalmente enriquecido o purificado.

La línea de células utilizado para fabricar el vector de transducción puede ser modificada en cualquiera de las formas que se mencionan más adelante para mejorar la producción de las proteínas del vector, por ejemplo, por la introducción del RNAi o antisentido a genes knock-out que reduzcan la expresión de los genes que limiten la producción del vector, o por la introducción de secuencias que mejoren la producción del vector. Las secuencias que codifican para mejoradores celulares o virales también pueden ser manipuladas en líneas de células (por ejemplo utilizando vectores plásmidos adicionales), como puede ser el herpes virus, virus de hepatitis B, los cuales actúan en las LTR del HIV para mejorar el nivel del producto virus, o proteínas transactivadoras celulares. Las proteínas de la transactivación celular pueden ser, por ejemplo, NF-kB factores de respuesta a la luz UV y factores de activación de células T.

Las líneas de células pueden ser transformadas habitualmente con DNA constructo, por ejemplo, utilizando electroporación, fosfato de calcio, liposomas, etcétera, para introducir el DNA en las células. Las células pueden ser co-transformadas (es decir, utilizando vectores cooperadores y de transferencia) o pueden ser transformadas en pasos separados, donde cada paso incluye la introducción de un vector diferente.

Las células se cultivan en condiciones eficaces para producir vectores de transducción. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, el medio particular necesario para obtener la producción de la proteína. Un medio como este puede ser, por ejemplo, soluciones amortiguadoras apropiadas, agentes oxidantes, agentes reductores, pH, cofactores, temperatura, concentraciones iónicas, la edad apropiada y/o la etapa de la célula (como puede ser, en particular parte del ciclo celular, o en una etapa particular donde se estén expresando genes particulares) donde se están utilizando las células, las condiciones de cultivo (incluidos los medios celulares, sustratos, oxígeno, bióxido de carbono, glucosa y otros sustratos de azúcar, suero, factores de crecimiento y otros) .

Eficacia de la transducción Además de las modificaciones de la envoltura antes descritas, la estimulación de las células para la transducción aumentada no se limita a la expresión de los ligandos sobre la superficie de las células. La eficacia de la transducción puede además aumentarse in vi tro o in vivo mediante la transducción de las células con por lo menos dos tipos de vectores. El primer vector se denomina un "vector facilitador" donde el vector produce proteínas o ligandos que estimulen a las células diana para que sean más receptivas para incorporar el vector transductor que expresa la secuencia terapéutica u otra secuencia que interese. El vector facilitador además puede comprender un gen de seguridad o suicida además de la proteína, ligando o factor que se utiliza para estimular las células diana para transducción de alta eficiencia mediada por el vector. En esta forma, el vector facilitador puede expresar las proteínas, ligandos de superficie o factores necesarios para la transducción de alta eficiencia por el vector de transducción, y luego ser delecionado de la mezcla diana de células, una vez que el vector de transducción haya mediado la transducción de alta eficiencia de la población diana de células. Este método puede ser utilizado para la transducción de células madre, donde por lo menos un vector facilitador puede expresar una combinación de ligandos SCF, TPO y Flt-3, con lo cual cada vector facilitador contiene un gen o genes de seguridad o suicida que eliminará las células de la población una vez que se adiciona el profármaco a la población de células. Los genes de seguridad o suicidas son conocidos en la técnica y están descritos con mayor detalle más adelante en esta solicitud. Como una opción, el vector facilitador puede expresar la proteína, factores o ligandos de un promotor inducible que podría ser utilizado solamente o en combinación con el gen o los genes de seguridad o suicida. La estratificación de un sistema inducible en concierto con un gen o genes de seguridad o suicidas puede utilizarse para aumentar la sensibilidad y especificidad (los sistemas inducibles pueden prepararse para que sean específicos del tejido) de la producción de proteína/factor/ligando/RNAi/antisentido, etcétera, y la expresión del gen o los genes de seguridad o suicida. La expresión de la proteína/factor/ligando/RNAi a partir del vector facilitador puede opcionalmente ser expresada a partir de un promotor específico del tejido, para limitar la expresión de las secuencias en el vector facilitador a los tipos de células específicos. En una modalidad preferida, el vector facilitador es adicionado a una población de células con estimulación mínima de modo que células no diana sean preferentemente transducidas para expresar los factores estimuladores de células diana y todavía marcados con el gen de seguridad o suicida de modo que estos puedan ser delecionados en una fecha posterior. Después de un periodo de tiempo (por lo menos una hora y hasta varias semanas después de la adición del vector facilitador, pero preferentemente el siguiente día) , el vector transductor es adicionado a la célula para la transducción mediada de alta eficiencia.

Líneas de células La presente invención también permite el desarrollo de líneas de células que tengan propiedades de crecimiento mejoradas, dependencia reducida en factores costosos que estén presentes en los medios, para producir mayores rendimientos de proteínas y producir mayores títulos de partículas vectores. Por ejemplo, en fechas recientes se ha documentado que las células HEK 293 tienen una expresión aumentada específica de receptores celulares y por la adición de los ligandos específicos al medio de las células, estas demostraron potencial de proliferación aumentado (Allison y col., Bioprocess International 3:1, 38-45, 2005). Una modalidad preferida es una pluralidad de vectores lentivirales que expresan una combinación optimizada de proteínas ligando que son de importancia para las células HEK 293 después de las cuales las células son entonces clasificadas por métodos de alto rendimiento para aislar un clon de células HEK 293 que contiene múltiples copias de vectores lentivirales. Estas células contienen una combinación de vectores HIV que expresan diferente pero también múltiples copias de los genes ligandos que están contenidos en los vectores de HIV. Los genes ligandos podrían ser optimizados en el codón o adicionadas mutaciones para aumentar más su expresión. Una combinación preferida es tener múltiples copias de las proteínas ligando expresadas en la célula clonal aislada final que podría entonces tener múltiples usos. Estas podrían ser utilizadas para la producción de proteínas o anticuerpos (incluidos los monoclonales, humanizados, monocatenarios) . También podría utilizarse para la producción de un vector como un vector lentiviral, pero no limitado a un vector lentiviral. Otros vectores como los vectores adeno y adenoasociados, vectores retrovirales murinos, vectores SV40 y otros vectores podrían solo fácilmente ser producidos a partir de esta línea de células ahora optimizada. Una lista de los receptores y sus ligandos que muestran expresión/actividad aumentada en células HEK 293 incluye, por ejemplo, el receptor AXL (gas6) ; el receptor EGF (EGF) , el receptor de quimiocina (fractalina) ; el receptor de PDGF, beta (PDGF); IL-15R-alfa; IL-2R-alf ; el receptor de quimiocina 2 (MCP1) ; IL-2R, gama; IL-1R-1; el receptor de CSF-1; el receptor de oncostatina; IL-4R; el receptor de la vitamina D3, neuropilin 1 (VEGF) ; el receptor estimulante de macrófagos 1 (MSP) ; NGF-R; el receptor de PDGFR-alfa; IL-ll-R, por ejemplo alfa; IL-10-r, por ejemplo, beta; FGF-R-4 (aFGF); receptor de BMP, por ejemplo tipo II (BMP-2); TGF-R por ejemplo el receptor beta II (TGFbeta) ; FGF-R-1 (bFGF) ; receptor de quimiocina 4 (SFD la); el receptor de interferón gama 1 y 2. Ver, Bio Process International, enero 2005. Tabla 1, "Receptores del factor de crecimiento/citoquina expresados por HEK-293. Estas células tendrán mayor potencial de producción de proteína y vector y será menos dependiente de la presencia de los factores ligandos para estar presentes en el medio puesto que las propias células serán productoras de los factores y los secretaran hacia el medio.

Para otros tipos de células, como las células CHO, pueden ser importantes otras combinaciones receptor-ligando. Por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento de insulina I, el factor de crecimiento de insulina e insulina, según se piensa, tienen una actividad anti-apoptótica en las células. Una pluralidad de vectores lentivirales podrían ser construidos para que el receptor del factor de crecimiento de insulina (I ó II), el factor de crecimiento de insulina (I ó II), la insulina y la proteína diana para la producción estén todos contenidos en el vector para la transducción de las células de producción, como pueden ser las células CHO, y un clon apropiado seleccionado, preferentemente utilizando los métodos de alto rendimiento, para seleccionar el clon que muestre muy elevada producción de la proteína diana. El clon óptimo puede no ser una célula que exprese altamente todos los genes manipulados o inhibidores de la expresión génica, en lugar de un nivel de expresión óptima de cada uno de los genes, los cuales para algunos pueden ser un bajo nivel de expresión. El valor del sistema del vector lentiviral y utilizando una pluralidad de vectores lentivirales para manipular tales líneas de células es que existe una distribución aleatoria o estocástica de cada número de copias del vector en la población de células transducidas con la mezcla de vectores lentivirales, y por tanto, modificando la cantidad de cada vector en la mezcla, el número de copias de cada segundo gen individual o secuencia inhibitoria puede ser optimizado. Una combinación preferida de vectores y gen secundario o secuencias inhibitorias de gen es que cada vector lentiviral expresa la proteína que interesa para la producción y opcionalmente además, por lo menos un RNAi o gen que además promueve el rendimiento de la proteína, o rendimiento del vector, directamente o indirectamente afectando la viabilidad o algún aspecto de la célula productora. Sin embargo, también puede ser benéfico tener por lo menos un vector lentiviral que solo exprese los genes secundarios o inhibidores de la expresión génica para aumentar el efecto de estas secuencias secundarias.

Otros genes (o inhibidores de estos genes) que pueden ser manipulados en vectores lentivirales para efectuar positivamente la vía del receptor del factor de crecimiento de insulina, el crecimiento celular y la viabilidad son: los miembros de la familia del gen Akt (Akt 1, Akt 2, Akt 3), pl3K Ras, Raf, MEK, MAPK p42, MAPK p44, proteína 14-3-3, Bad, y Grb/SOS. Para estimular las vías pertinentes, los ligandos que se unen a los receptores apropiados de estas vías podrían ser expresados a partir de vectores lentivirales para proporcionar la señal apropiada para la célula para afectar positivamente la producción de proteína, vector (no limitado a los vectores lentivirales) o vacuna a partir de la célula. En algunos casos puede ser preferido que el vector lentiviral exprese el receptor y el ligando para estimular una vía particular. Los receptores quiméricos también pueden ser construidos para producir estimulación específica de las vías específicas. Esto también puede reducir el número de ligandos que necesitan ser producidos en la célula en vista de que un ligando puede estimular una pluralidad de vías a través de receptores quiméricos que tengan el mismo dominio de unión al ligando pero diferentes dominios de señalización intracelular. Por el contrario, los receptores quiméricos que contienen diferentes dominios de unión y el mismo dominio de señalización también podrían utilizarse para diseñar los tipos de vías que son estimuladas. Los receptores quiméricos son conocidos en la técnica y la invención puede no solo ser utilizadas para la producción de proteína, vacuna o vector, sino también para terapia génica. Otros genes que pueden afectar positivamente la producción de proteína, vacuna o vector en células tipo CHO o células 293 (ejemplos no limitativos) después de su sobre expresión (o inhibición por RNAi, anti-sentido, ribozima o similar) a partir de vectores lentivirales son la proteína-2 morfogénica de hueso, PACEsol, fosfolipasa D PI3K (fosfoinositido 3-cinasa) , p70S6K (p70 S6 sinasa) y ERK (cinasa regulada por la señal extracelular) , CDKN1, CCNB1, CDC20, CDK20, CDK4 , CDKN3, CCNC, BMP1, MADH4, GA , RCA, ATPS, HAT4, GAPDH, SP3, TCEBIL, TFAP2B, SMARCA4, EIF4E, RAB2, DIS155E, SS-1, WT1, MYC, TSG101, SHC3, PHB, TCF12, NFIX, E2F4, TAF3C, STAT6, BCL2, NERF-2, POU2F1, NFKB1, EIF4E, BMI1, MYBL2, PIM1, KRAS2, RPA1A, JUNB, ABL1, TIM, SAS, AKT1, CSF3R, BCR, MX11, TNFAIP6, AIP1, ILK, PTK2, CSK, CSNK2B, GK, PRKCA, MADH2, LIMK1, PIK3CA, PRKCd, PPP6C, PrP celular y otros tipos de proteínas que están involucradas en el crecimiento, metabolismo, ciclo celular y desarrollo. Una modalidad preferida es la expresión de un RNAi dirigido a la proteína prión celular (PrP) , BSE u otro agente adverso que podría contaminar las líneas de células, en células de empaquetamiento o productos del vector lentiviral. Otras modalidades preferidas son un constructo cooperador o línea de célula de empaquetamiento que expresen, como un ejemplo no limitativo, un inhibidor para PrP celular, como un RNAi anti-PrP. Por el contrario, la proteína descrita podría ser sobre-expresada o inhibida por RNAi, o similar, para uso en terapia génica para enfermedades como enfermedades genéticas, HIV/AIDS o cáncer. Las composiciones de vectores lentivirales preferidas para uso terapéutico son la expresión de un anticuerpo monoclonal o una proteína (o una pluralidad de proteínas) y por lo menos un segundo gen (o inhibidor de un gen, como puede ser un RNAi) que afecte positivamente la producción de la proteína en el cuerpo, el segundo gen o inhibidor del gen no se limita a las proteínas ultracelulares para la producción in vivo de la proteína, pero podría ser una proteína que afecte la respuesta inmunitaria, el metabolismo del cuerpo, la producción de hormonas o citosina. El segundo gen (por lo menos un segundo gen) o inhibidor del gen (por lo menos un segundo inhibidor del gen) podría ser producido en respuesta a los sistemas promotores inducibles o algún factor presente en el cuerpo, como puede ser una proteína, virus o factor que se produzca durante la enfermedad. En esta forma, la producción de la primera proteína o anticuerpo (por ejemplo monoclonal, humanizado, monocatenario) puede ser regulada por la producción del segundo gen. Las proteínas involucradas en la glucosilación correcta de las proteínas humanas también podrían ser expresadas a partir de un vector lentiviral en tándem para la proteína deseada para su producción. La glucosilación a partir de ciertas especies puede provocar efectos no deseados sobre las proteínas como los anticuerpos monoclonales y por tanto la expresión de un inhibidor para estas enzimas que producen estos modelos de glucosilación específica aumentaría la seguridad y eficacia del producto proteína recombinante. Por ejemplo, la glucosilación de líneas de células derivadas de ratón y otros mamíferos es muy semejante a la glucosilación humana. Sin embargo, algunas diferencias significativas podrían afectar la calidad del producto así como la bioactividad. La mayor parte de las líneas de células derivadas de ratón (por ejemplo las células NSO) contienen una enzima de glucosilación adicional. La enzima se conoce como alfa 1, 3-galactosiltransferasa; esta media la transferencia de residuos Gal a partir de UDPGal en configuración alfa para los residuos Gal internos y/o expuestos. Los humanos tienen anticuerpos contra los epítopes alfa-Gal. Si bien ninguna evidencia en la literatura sugiere que la presencia de epítopes alfa-Gal en rlgG es inmunogénica para humanos, las agencias regulativas podrían expresar preocupación sobre las proteínas terapéuticas que contiene residuo alfa-Gal. Por tanto, para mejorar la glucosilación más óptima de las proteínas que se utilizan para uso humano, un RNAi (o inhibidor similar) dirigido a la alfa 1, 3-galactosil transferasa de ratón puede ser insertado en un vector lentiviral para generar líneas de células que estén desprovistas o tengan niveles reducidos de la proteína alfa 1, 3-galactosil transferesa de ratón de modo que el residuo alfa-Gal no este presente en las glucoproteínas terapéuticas. Otro ejemplo es la ácido CMP-N-acetilneuromínico hidroxilasa que esta presente en células de roedor, como pueden ser las células CHO. Esta enzima no se expresa en una forma activa en el hombre y la evidencia sugiere que la presencia de Neu5Gc en las glucoproteínas terapéuticas recombinantes puede desencadenar una respuesta inmunitaria. Por tanto, los vectores lentivirales podrían ser manipulados para contener el gen de la proteína que interesa y reducir la actividad de la CMP-NeU5Ac hidroxilasa en una línea de células de Ovario de Hámster Chino (CHO) , y así el contenido Neu5Gc de los gluco-conjugados resultantes, también conteniendo un RNAi o secuencia RNA anti-sentido dirigido a la enzima. Los dos ejemplos no se entienden como limitativos, otras enzimas involucradas en la glucosilación u otros procesos regulares también pueden ser dirigidas —por la inhibición de enzimas/factores no deseados o por la sobre expresión de las enzimas deseadas para mejorar u optimizar las características de la proteína o factor deseados que han de producirse.

El RNAi podría también ser preparado para virus no deseados o adventicios potenciales o cualquier virus o bacteria que no se desee que se replique en la línea de células utilizada para la fabricación del vector, proteína, factor o vacuna. Por ejemplo, el micoplasma ribosomal o RNA mensajero podría se dirigido por la tecnología del RNAi para impedir la replicación y contaminación del micoplasma. Este método de inhibición de la replicación de virus o bacterias adventicios en células podría ser extendido para uso en la producción de otros vectores virales (por ejemplo como los vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados, vectores virales de herpes, vectores basados en polioma, vectores retrovirales y vectores lentivirales) o vacunas (por ejemplo como influenza, viruela, rubéola, évola, vaccinia. Una serie completa de virus que podrían las dianas de estos métodos se encuentra en ncbi .nlm.nih.gov/genomes/VIRUSES/viruses .htmL. La expresión de los cDNA y RNAi en los sistemas de producción del vector puede utilizarse para aumentar más la producción del vector HIV. Por ejemplo, los genes que estimulan el crecimiento celular podrían aumentar la biosíntesis celular y por tanto dar como resultado mayor producción de los vectores HIV a partir de líneas de células y por tanto dar como resultado vectores en mayor titulo. Los genes que podrían sobre expresarse son aquellos que aumentan el metabolismo de carbohidratos, el metabolismo de energía, las proteínas involucradas en la biodegradación de los xenobióticos, el metabolismo de ácido nucleico y aminoácidos, la transcripción del mRNA o la traducción de proteínas o genes que activan la división y crecimiento celular como BcL-2, como un ejemplo. Además, la tecnología del RNAi puede utilizarse para aumentar la producción del vector mediante la inhibición de los genes que hacen lento o bloquean el crecimiento celular, o genes que inhiben la producción de las partículas vectores HIV. Por ejemplo, un RNAi que sea dirigido a las proteínas que funcionan por la inhibición de la división celular, crecimiento celular, metabolismo celular, metabolismo del ácido nucleico y aminoácidos, la transcripción del mRNA o traducción de proteínas que por tanto aumenta la producción de las partículas vectores HIV. Una lista completa de estos genes y sus vías conocidas pueden encontrarse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/. Algunos métodos para aumentar la producción de los vectores lentivirales a partir de líneas celulares pueden emplearse. Primero, una biblioteca de los cDNA de organismo humano u otro pueden ser co-transfectadas con constructor de empaquetamiento o insertados en un vector HIV para la transducción en células de empaquetamiento que contengan los genes necesarios para la producción de las partículas vectores HIV. Cada paso del método puede hacerse en un formato multipozos y automatizado para aumentar más la capacidad del sistema.

Otra modalidad, es la inclusión de un inhibidor de un gen, como puede ser un RNAi dirigido al gen de proteasa sobre el vector lentiviral además del gen que interesa para ser expresado, o en un vector lentiviral diferente pero adicionado como una mezcla a las células para que las células sean transducidas con el vector que contiene el gen que interesa y el vector que expresa el RNAi, preferentemente para un gen de proteasea u otro gen que sea no deseado. La proteasa que va a ser dirigida puede ser cualquiera o una combinación de proteasas que puede afectar de manera adversa la producción o purificación de la proteína deseada o el factor deseado que interesa. Las familias de proteínas y los ejemplos no limitativos específicos están descritos: cisteína proteasas como caspasas, catepsinas; zinc proteasas (metaloproteasas) como carboxipeptidasas, diversas metaboliproteasas de matriz; serina proteasas como tripsina, quimotripsina y elastasa. La vía de la ubiquitina también puede ser una diana útil durante la fase de producción de la proteína en una línea celular. El RNAi podría ser insertado en los vectores lentivirales que eligen ubiquitina, la enzima activadora de ubiquitina (El), la enzima de conjugación de ubiquitina (E2) y/o la ubiquitina-proteína ligasa (E3) . Preferentemente, el RNAi que dirige la vía de la ubiquitina se expresa a partir de un promotor inducible de modo que la inhibición de la ubiquitinación solo cura durante el tiempo especificado. La inducción del RNAi dirigido a ubiquitina no es una limitación de la invención y sería deseable que un vector lentiviral exprese constitutivamente el RNAi que sea dirigido a las proteasas, preferentemente proteasas que están involucradas en la muerte celular. Estas proteasas incluyen, más no se limitan a, cisteína proteasas específicas de aspartato (las ASCP) , serina proteasas como 0mi/HtrA2, capasas, la familia ICE de tiol proteasas, como puede ser ICE/CED-3 proteasas, granzima B. En otra versión, el vector puede expresar genes que inhiban la apoptosis como las proteínas IAP. Tales métodos para la modulación del fenotipo celular no son limitados a la producción de proteínas en las células, pero pueden también ser utilizados en la generación de animales transgénicos, y para propósitos de vacunas y terapéuticos. Una modalidad preferida para estas aplicaciones es expresar el segundo gen o secuencia inhibitoria del gen a partir de un promotor específico del tejido.

Otra modalidad preferida para cualquier gen secundario presente en un vector lentiviral es marcar o etiquetar la proteína con una secuencia de aminoácidos que permita la rápida separación de la proteína secundaria a partir de la mezcla de proteínas que contiene la proteína deseada para purificación. En esta forma, cualquier combinación de proteínas secundarias puede separarse rápidamente mediante el uso de una sola etiqueta de secuencia de aminoácidos común, permitiendo la rápida purificación de la proteína diana. La proteína diana puede tener una etiqueta diferente o puede no tener una etiqueta, lo cual es preferible si el objetivo es producir y purificar la proteína nativa. Por el contrario, la proteína que interesa puede estar solamente etiquetada. Por sí mismo, tales vectores pueden utilizarse in vivo para terapia génica humana y la generación de ratones transgénicos; y no se limitan al uso para sistemas in vi tro .

Métodos de fabricación de polipéptidos La presente invención también proporciona los métodos de fabricación de polipéptidos utilizando vectores de transducción lentivirales, como pueden ser los vectores de transducción descritos en la presente, y los productos de estos métodos. Los métodos pueden comprender uno o más de los siguientes pasos, por ejemplo, la transducción de una célula hospedera con un vector de transducción de lentivirus para formar una célula hospedera transducidas, en donde el vector comprende un polinucleótido heterólgo expresable que codifica para un polipéptido heterólogo que interese; el cultivo de la célula hospedera transducida en condiciones eficaces para producir el polipéptido que interesa; el aislamiento del polipéptido del hospedero, por ejemplo, del medio de cultivo cuando se secreta un polipéptido hacia el medio de cultivo. La secuencia polinucleótida heteróloga que codifica el polipéptido puede comprender cualquier otra secuencia necesaria para la transcripción, traducción y/o secreción hacia el medio (por ejemplo secuencias secretoras) . Cualquiera de las líneas celulares puede ser transducida de acuerdo con la presente invención, incluida cualquiera de las líneas de células mencionadas en la presente, en especial, por ejemplo, CHO (como puede ser CHO DG44) y HEK 293 (como puede ser HEK 293 F) .

Los vectores de transducción pueden prepararse de manera habitual, incluida de acuerdo con los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, una línea de células productora puede ser transformada con un plásmido cooperador (que contenga una envoltura apropiada y precursor gag/pol) y un vector de transferencia que contenga la secuencia codificadora heteróloga en condiciones efectivas para producir vectores de transducción funcionales. La proteína de envoltura "puede ser seleccionada para su capacidad para transducir una célula hospedera diana en la que ha de fabricarse el polipéptido. Para fabricar vacunas contra influenza se prefieren las siguientes líneas de células y las proteínas de envoltura correspondientes, por ejemplo, 293 o CHO; VSV-G, ampho, Mokola y Paramyxoviridae (por ejemplo, ver en la red ncbi .nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/fs_param-htm) .

Los ejemplos de las células hospederas incluyen, por ejemplo, células de mamífero, células humanas, como el melanoma A2058, C3 hígado, G-402 riñon, células T C8166, Caco-2 colon, y K562 médula ósea; CHO; 293F, 293 FT, etcétera, incluidas otras líneas de células mencionadas antes y después, y presentes en el sitio Web ATCC (www.atcc.org) y otras fuentes de células.

Cualquier secuencia heteróloga apropiada o deseada puede ser expresada, incluido por ejemplo, vacunas, interferones (alfa, beta, gama, épsilon), eritropoyetina, el factor VIII, factores de coagulación, anticuerpos y fragmentos de estos (por ejemplo incluidos monocatenario, Fab y humanizados), insulina, quimiocinas, citocinas, factores de crecimiento, factores moduladores de la angiogénesis, factores moduladores de la apoptosis, etcétera. Anticuerpos monocatenarios (por ejemplo fragmentos variables monocatenarios o "scFv") pueden prepararse de manera habitual.

En algunas modalidades de la presente invención, los vectores de transducción lentivirales pueden ser utilizados para preparar preparados antigénicos que se utilicen como vacunas. Cualquier antígeno o antígenos apropiados pueden ser preparados de acuerdo con la presente invención, incluidos los antígenos que se obtienen de priones, virus, micobacterias, protozoarios (por ejemplo el Plasmodium falciparum (malaria) ) , tripanosomas, bacterias (por ejemplo estreptococos, Neisseria, etc.), etcétera.

Las células hospederas pueden ser transducidas con un solo vector lentiviral que contenga una o más secuencias polinucleótidas heterólogas, o con una pluralidad de vectores lentivirales, donde cada vector contiene la misma secuencia o diferentes secuencias de polinucleótidos heterólogos. Por ejemplo, un antígeno multisubunitario (incluidos los componentes multisubunitarios intracelulares y de superficie celular) pueden prepararse por la expresión de las subunidades individuales en vectores separados, pero infectando la misma célula hospedera con todos los vectores, para que el ensamble ocurra dentro de la célula hospedera.

Las vacunas muchas veces contienen una pluralidad de componentes antígenos, por ejemplo, derivados de diferentes proteínas y/o de diferentes regiones epitópicas de la misma proteína. Por ejemplo, una vacuna contra una enfermedad viral puede comprender una o más secuencias de polipéptidos obtenidas del virus las cuales, cuando se administran a un hospedero, desencadenan una respuesta inmunogénica o protectora para el desafío viral.

Como se menciona, la presente invención también puede utilizarse para preparar multímeros de polipéptidos, por ejemplo, donde una preparación antigénica se produce la cual esta compuesta de más de un polipéptido. Por ejemplo, las cápsides virales pueden prepararse de más de una subunidad polipeptídica. Mediante la transducción de una célula hospedera con vectores que lleven diferentes secuencias de envoltura viral, las proteínas, cuando se expresan en la célula, pueden autoensamblarse en estructuras tridimensionales que contienen más de una subunidad de proteína (por ejemplo en su configuración nativa) . Las estructuras pueden poseer actividad funcional, incluida la actividad antigénica, actividad enzimática, actividad de unión a las células, etcétera. Además, cuando se expresan en una línea de células apropiada, estas pueden ser secretadas hacia el medio de cultivo celular, facilitando la purificación. Por ejemplo, cuando las proteínas de la cápside N y H de influenza, y como una opción la proteína M (ver más adelante) , se introducen en una línea de células de producción utilizando vectores de transducción lentivirales, cápsides vacías o partículas tipo viral (VLP) pueden ser formadas en la célula, y luego secretadas hacia el medio de cultivo. Estas VLP pueden aislarse de manera rutinaria y purificarse y luego administrarse como vacuna contra influenza. Una VLP es, por ejemplo, una cápside autoensamblada que no contiene cantidades considerables (por ejemplo, esta vacía) de RNA viral. Una VLP preferentemente puede desencadenar una respuesta inmunitaria que sea eficaz para proporcionar por lo menos algún grado de protección contra un desafío de partículas virales infecciosas nativas, o por lo menos de producir anticuerpos para ésta.

En la actualidad hay múltiples vacunas virales disponibles, incluidas las vacunas para enfermedades tales como sarampión, paperas, hepatitis (A y B) , rubéola, influenza, polio, viruela, varicela, adenovirus, encefalitis japonesa, rabia, ébola, etcétera. La presente invención puede utilizarse para preparar vacunas contra cualquiera de las enfermedades antes mencionadas.

Los sistemas de transducción de lentivirus son de interés especial porque estos acortan el tiempo para desarrollar y producir vacunas influenza, efectivas, permitiendo al sector de salud pública responder más rápidamente a los modelos desafiantes de la enfermedad de influenza. En la actualidad, los virus influenza, especialmente las cepas tipo A y B, son una causa principal de enfermedad seria y muerte alrededor del mundo. En Estados Unidos, la influenza es la séptima entre todas las causas de muerte, y da como resultado elevados números de hospitalizaciones (200 000) , días de trabajo perdidos (70 millones) y días de actividad limita (346 millones) causando un efecto económico importante. Ver, por ejemplo, dhhs.gov/nvpo/influenza_vaccines.htmL. Los virus influenza A sufren cambios frecuentes en sus antígenos de superficie, mientras que los virus influenza tipo B cambian con menos frecuencia. La inmunidad luego de la infección por una cepa puede no proteger completamente contra variantes antigénicas subsiguientes. Como consecuencia, nuevas vacunas contra influenza deben ser diseñadas cada año para igualar las cepas circulantes que con mayor probabilidad causaran la siguiente epidemia. La Organización Mundial de la Salud ha establecido una Global Influenza Surveillance Network (Red Global De Encuesta Sobre Influenza) que hace recomendaciones anuales sobre la composición de la vacuna contra influenza. El sistema de transducción lentiviral de la presente invención reduce significativamente el tiempo necesario para producir una vacuna eficaz en comparación con la tecnología de huevo de pollo normal actualmente en uso, por ejemplo, la cual puede tardar hasta ocho meses en comparación con, por ejemplo, cinco semanas o menos utilizando los procesos descritos en la presente.

Los ejemplos de los virus para los cuales las vacunas pueden ser producidas de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, ortomixovirus, virus influenza A (incluidas todas las cepas que varían en sus proteínas HA y NA, como puede ser (ejemplos no limitativos) H1N1, H1N2, H2N2, H3N3, H7N7 y H3N8); influenza B, influenza C, virus togota (incluido Dhori, virus Batken, SiA-R 126) e isavirus (por ejemplo el virus infeccioso de anemia de salmón) . Estos incluyen influenza aislada o transmitida a partir de todos los tipos de especies, incluidos los aislados de invertebrados, vertebrados, mamíferos, humanos, primates no humanos, monos, cerdos, vacas y otro ganado, aves, aves domésticas como pavos, pollos, ardillas y patos, aves silvestres (incluidas las aves acuáticas y terrestres) , reptiles, etcétera. Estas también incluyen las cepas existentes que han cambiado, por ejemplo, por mutación, variaciones antigénicas menores, variaciones antigénicas mayores, recombinación, etcétera, especialmente cepas que han aumentado la virulencia y/o la transmisión entre especies (por ejemplo de humano a humano) .

De interés particular son los virus influenza que son panzoóticos y/o los cuales cruzan especies porque tienen un amplio rango de hospederos, o por la recombinación en el hospedero infectado y/o porque se encuentran en estado natural o por mutación dirigida. Por ejemplo, H5N1 (con referencia a los subtipos de antígenos de superficie presentes en el virus, hemaglutinina tipo 5 y neuraminadasa tipo 1) es un subtipo de influenza A aviar, el cual ocasiono un brote de influenza en aves domésticas en Asia. En noviembre de 2005, más de 120 millones de aves murieron de infección o fueron aniquiladas para prevenir la propagación de la infección.

Este virus también se ha dispersado en hospederos humanos ("influenza aviar") donde se asocia con elevada letalidad.

Una preparación antigénica contra influenza (como puede ser una vacuna) puede contener uno o más polipéptidos que se encuentren en el estado natural en un virión influenza. No obstante, preferentemente no contiene todos los genes de polipéptidos que darían origen al virus patógeno nativo. Estos incluyen, por ejemplo, hemaglutinina (codificada por el gen HA) , neuroaminidasa (codificada por el gen NA) , núcleo proteína (codificada por el gen NA) , proteínas de matriz (Ml) (codificada por el gen M) , M2 (codificado por el gen M) , proteínas no estructurales (codificadas por el gen NS) , y polimerasas. El virión que se encuentra en el estado natural esta recubierto en una bicapa lipídica que esta "enclavijada" con proteínas integrales H y N ("capa de la cápside") . Las proteínas de matriz (Ml) forman una capa proteínica ("capa matriz") por debajo de la membrana viral, y están involucradas en el ensamble, estabilidad e integridad viral. Ver, por ejemplo, Harris y col., Virol. 289: 34-44, 2001. La proteína M2 es un canal de iones de la proteína de membrana. Una VLP de la presente invención puede comprender H, N y opcionalmente proteínas Ml y M2. Las secuencias para tales proteínas son conocidas en la técnica y/o se pueden identificar en GenBank. Ver, por ejemplo, Widjaja y col., J. Virol. 78: 8771-8779m 2004 para la secuencias Ml y M2.

Estas pueden ser clonadas en vectores de transferencia, en forma individual o en el mismo plásmido, y utilizadas para producir vectores de transducción. En una modalidad de la presente invención, es posible preparar una pluralidad de vectores de transducción, cada uno de los cuales contiene una secuencia del gen influenza única (por ejemplo que codifica para H, para M y para Ml para dar como resultado tres vectores de transducción diferentes). Cuando tales vectores se co-expresan en la misma célula hospedera (por ejemplo CHO ó 293) se produce una VLP de autoensamble que puede ser secretada hacia el medio, cosechada por centrifugación y luego administrada como vacuna.

Influenza A H5. Por lo menos nueve subtipos de H5 se han identificado. Las infecciones de H5, como pueden ser los virus HPA y H5N1 actualmente circulando en Asia y Europa, han sido documentadas entre humanos y pueden provocar enfermedad grave o muerte.

Influenza A H7. Por lo menos nuevo subtipos de H7 han identificados. La infección de H7 en humanos es poco común pero puede ocurrir entre personas que tienen contacto directo con aves infectadas. Los síntomas pueden ser conjuntivitis y/o síntomas respiratorios superiores. Los virus H7 incluyen, por ejemplo, H8N2, H7N7 y H7N3) y han ocasionado enfermedad leve a grave y fatal en humanos. Los subtipos H son más importantes desde el punto de vista epidemiológico, en vista de que estos regulan la habilidad de virus para unirse a y entrar en la célula, donde entonces se lleva a cabo la multiplicación del virus. Los subtipos N regulan la liberación de virus recién formados desde las células.

Influenza A H9. Al menos nueve subtipos de H9 han sido identificados. Influenza A H9 en muy pocas ocasiones ha sido documentada por infectar humanos. No obstante, hay informes de niños que presentan síndromes tipo influenza cuando fueron infectados con cepas H9.

La presente invención proporciona vacunas contra todos los subtipos de influenza aviar (por ejemplo los subtipos H y N) , incluidos los subtipos existentes, derivados de estos y recombinantes de estos, como pueden ser los subtipos y recombinantes que tienen la capacidad para propagarse de humano a humano. Se han caracterizado diferentes aislados, especialmente para subtipos H5. Ver, por ejemplo, Sturm-Ramirez, J. Virol., 2004, 78, 4892-4901; Guan y col., Proc. Nati. Acad. Sci., 2004, 101, 8156-8161.

Los vectores de transducción de la presente invención pueden dar como resultado elevados niveles de producción de proteína heteróloga, por ejemplo, desde cerca de 0.1 a 0.3 mg/mL a aproximadamente 5-10 mg/mL o más, de proteína heteróloga recombinante por mL de medio de cultivo no procesado, cuando tales proteínas son secretadas hacia el medio de cultivo. La presente invención también proporciona los métodos de producción de anticuerpos. Por ejemplo, se proporciona los métodos para producir anticuerpos monoclonales (por ejemplo humano, ratón y otros tipos de mamíferos) sin la necesidad de hibridomas o modelos animales. En un ejemplo no limitativo, los vectores lentivirales que expresan proteínas oncogénicas se transducen en células B de sangre periférica a partir de ratones previamente estimulados con el antígeno. Estos vectores transducen eficientemente las células de ratón para prepararlas en células productoras de anticuerpos. En un segundo ejemplo no limitativo, dos vectores lentivirales se manipulan, uno expresando la cadena de anticuerpo pesada y el segundo vector la cadena ligera del anticuerpo. Las áreas constantes de los genes se derivan del gen de inmunoglobulina humana (u otras especies si se desea) (por ejemplo IgG, IgM, u otro tipo de Ig) . Las áreas variables de los genes se modifican o degeneran para crear diversidad. La secuencia degenerada puede ser obtenida por cualquiera de las técnicas apropiadas que son conocidas en la materia y clonados en el vector lentiviral para crear una biblioteca de vectores lentivirales que expresen las moléculas de inmunoglobulina pesada o ligera. Los anticuerpos pueden ser producidos mediante la transducción de células con ambos vectores para producir anticuerpos funcionales que contengan cadenas pesada y ligera. Las células transducidas y de expresión pueden ser seleccionadas y cribadas para la unión al antígeno, y luego los clones positivos pueden ser aislados y sometidos a múltiples rondas de maduración por afinidad.

Una ventaja de este método es que los anticuerpos se producen en un método no sesgado. Otros métodos, como las tecnologías del hibridoma y xenoratón tradicionales dependen de las células B que han sufrido selección y deleción clonal de clones de anticuerpos particulares puesto que estos son reactivos a tejido endógeno, por ejemplo, de ratón. Algunos de estos clones delecionados pueden ser valiosos como anticuerpos en vista de que estos podrían reaccionar cruzado con antígenos humanos. La ventaja de el método descrito es que no hay deleción de los clones del anticuerpo molecular y estos se analizan todos en un método no sesgado y todavía son moléculas de anticuerpo completamente humanizados (si se desea la humanización) . Otra ventaja de los vectores lentivirales es que los genes pueden ser transducidos en células en alta multiplicidad para producir una variedad de tipo de anticuerpo en una célula. Esto reduce el número de células que necesitan ser producidas para crear una biblioteca que contenga sitios de unión antigénicos muy diversos. Una segunda ventaja es la colocación de los genes pesado y ligero en diferentes vectores lentivirales para que se pueda generar diversidad adicional transduciendo células con mayor multiplicidad de infección que 1. Por ejemplo, si un MOI de 10 se utiliza para la transducción de células con cada vector lentiviral que expresa la cadena pesada y ligera, entonces el número de combinaciones de anticuerpos producidos en cada célula es 100. Por -tanto, en una placa de 96 pozos, donde hay aproximadamente 10,000 células en un solo pozo, el número de variantes posibles que puede generarse con este método es 1,000,000 en un solo pozo de una placa de 96 pozos. Por tanto, con la escala, con este método es posible generar un gran número de variantes de anticuerpos. El método no se limita al uso de MOI de 10 para cada constructo por célula, también es posible utilizar MOI superiores, según sea necesario. Por ejemplo, si se utiliza un MOI de 100 entonces cada célula puede producir 10,000 anticuerpos variantes y cada pozo de una placa de 96 pozos puede producir 10,000,000,000 de variantes. Por tanto, cada placa de 96 pozos puede producir 1 x 10l moléculas de anticuerpos variantes que se pueden utilizar para el cribado contra un antígeno diana, para el cual hay múltiples métodos conocidos en la técnica (por ejemplo ELISA) . Una vez que un pozo específico ha sido identificado que produce la reacción de anticuerpos deseada, entonces las células pueden ser clonadas por limitación de la dilución para encontrar el clon de la célula que exprese el anticuerpo correcto. Una vez que se ha identificado este clon, entonces se puede utilizar la PCR para clonar los vectores que expresan las cadenas del anticuerpo pesada y ligera. El DNA vector puede entonces ser transfectado con constructo (s) cooperador para producir el vector. En otra versión, este clon de células puede ser transfectado directamente con el constructo (s) cooperador (PEÍ, fosfato de calcio, lipotransfección u otro método de transfección conocida en la técnica) , para producir los vectores lentivirales variantes. Los vectores que se producen pueden entonces ser titulados y luego transducidos en células a un menor MOI, pero un número más grande de células, para aislar un clon que produzca el anticuerpo que interesa. Una vez que se aisla el clon de la célula, entonces el anticuerpo puede ser producido a mayores títulos mediante la transducción de células con mayor multiplicidad de infección. El mismo método no se limita a moléculas de anticuerpo enteras pero puede también ser aplicado a anticuerpos monocatenarios, fragmentos de anticuerpos, presentación de fagos y otras moléculas tipo anticuerpo, todas conocidas en la técnica. Además de expresar el anticuerpo el vector puede expresar otros genes para aumentar la producción del anticuerpo monoclonal, o para aumentar su rendimiento. Estos genes pueden ser oncogenes como pueden ser ras y myc, pero también se pueden utilizar otros genes, como puede ser los genes anti-apoptóticos como Bcl-2. Además, tales vectores pueden ser utilizados para crear anticuerpos monoclonales a partir de células B en la sangre de animales que hayan sido expuestos al antígeno. Por ejemplo, las células B de ratón, expuestas al antígeno pueden ser transformadas en células de mieloma utilizando una combinación de oncogenes o RNA silenciador del gen. Tales genes consisten en, por ejemplo, factores de crecimiento, incluido, por ejemplo, anfiregulina, estimulador de linfocitos B, interleucina 16 (L16), timopoyetina, TRAIL, Apo-2, factor mejorador de colonia de células Pre B, factor 1 relacionado con la diferenciación endotelial (EDF1), polipéptido activador de monocitos endoteliales II, factor inhibidor de la migración de macrofágos MIF, factor mejorador de la célula asesina natural (NKEFA) , proteína morfogenética de hueso 8 (proteína osteogénica 2) , proteína morfogénica de hueso 6, factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) , CGI-149 (factor de diferenciación neuroendócrina) , citosina A3 (proteína inflamatoria macrofágo 1-alfa) , proteína relacionada con la diferenciación de células de glialblastoma (GBDR1), factor de crecimiento derivado de hepatoma, precursor de neuromedin U-25, cualquier gen de tumor, encogen, proto oncongen o gen modulador de células (el cual puede encontrarse en condor.bcm.tmc.edu/oncogene), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento endotelial vascular B (VEGF-B) , precursor RANTES específico de células T, factor derivado de células dendríticas químicas 1; receptores como el receptor de A, receptor de la secuencia de la señal beta tipo II (ACVR2) (SSR2), receptor de LPS de monolitos CD14, CD36 (tipo colágeno 1/receptor de tromboespondina) -like 2, CD44R (Hermes antigen gp90 homing receptor) , receptor acoplado a la proteína G9, receptor beta del factor estimulador de colonias 2 (CSF2RB) , FLT-3 receptor tirosina cinasa, precursor del potencial C del receptor similar a transitorio, subfamilia B del receptor tipo lectina de células asesinas, gen del receptor de lipoproteína de densidad baja, receptor IIC del Fc-gama de baja afinidad, receptor de MCP-1, receptor de la proteína 1 quimioatrayente de monolitos (CCR2), subfamilia 4 del receptor nuclear, grupo A, miembro 1, receptor acoplado de la proteína G huérfana GPRC5D, receptor gama activado por el proliferador de peroxisoma, receptor relacionado con pheromore (rat) , receptor putativo movilizador de calcio activado por vasopresina, receptor retinóico X, receptor tipo toll 6, activador de transmembrana e interactor CAML (TACI), péptido de la maduración de células B (BCMA) , receptor de CSF-1, receptor 1 del interferón (a, ß y gama) (IDNAR1), las vías que pueden ser moduladas para aumentar la producción de anticuerpos incluye, por ejemplo, ubiquitina/proteosomas; telomerasa; FGFR3; y Mcl-1. Otros genes que pueden ser dirigidos para aumentar la producción de anticuerpos incluyen los enlistados en las siguientes tablas: Expresión diferencial entre líneas de células de mieloma y no mieloma (Claudio et al., Blood, vol. 100, Publicación 6, 2175- 2186, 15 de septiembre de 2002) Clone ideiUifitati n Qsp&''cl-??-e match Kan-r Ui.fge.-e Up-regn.a.ed PCU 920 C(u o-.o-fe8\-lats-. pfi..íei--s 5- kD-- ( GC:357S) - Hs.289101 PC.-083-. Genop-i-. DN? si-.---, ( ion-osoms 2 clone RP11-21SL--2) 2 -.'CL2440 ---ST firom cDNA clone - AGE: i 69 7<5- 3H 3 Hs.-3 -23 MYK4362 Get- mic ON? clone (cJj?wt.oson.e 14 BAC R-214 I) 4 PCL1712 Progcsterottc receptor (t.wp-?r---.c co-np ncnt-2 (PGR C2) 5 -Is.9071 PCL2089 Hyp<?tJ.-.iicf-l proteir» FLJ22332 (c2h2 type, ainc finger) <í Hs.J J 1092 PCL .63.1 üenom-c DNA cione (BAC CTO-2022G l S from 7) 7 PCt-08<-<. Mu¡t.ple myelo a opcogeps-I (MUMl (IRF4) 8 .-«..82132 PC 1492 Myeloma EST JPCU 492 9 YE 007 BUP proteja 10 Hs.35660 BCMA B ceU m¡U«ratiüi? proiein ÍBC A) 11 Hs.2556 IK.-..14.4 Tumor rejectíßn anttgen- ! (TRA í ) 12 Hs.82689 PCLJ515 eakly sip-ilar to mucin 2 preatfsor 13 Hs.20183 K.Í-0308 lToteaso e (subiir.it, a type, 2) (PSMA2) 14 Hs.18-309 i PC1.0940 Se-er-oproteir. T 15 Hs.8148 MVB2868 Myc-o-nt- EST MYE2868 16 MYE2693 Sigiial recogpil?on pi-rt le - 4 kt> (SUP : 4) 17 Hs.180394 PC1-5267 -vfye-oma EST PC1-5267 18 YÍÍ3-.69-. -.-.yetoro-i KSTMYE3869-- i9 KX329S Similar to bram-specific -mgiogencsis in ibito»! (BAH) 20 PC-L1662 Si íí-ir tü ehr m s mal protein f?r n-itüfic spit-d.-- ttiscrub-y 21 H- Ó773 POLOIOS CD138syndeca}--l(SDC. 22 Hs.S2l09 MYE452I ?nnej-in A2, -ípocortin 11- cnlpaciii- i 23 Hs.217493 PC---4099 Gei- micDNA clone (B?C CTA-227L24, 7q21-l-q21.2> 24 -PCI..1657 Hypo-hetíea- proteín FUI 1200 25 Hs.107381 MYH2821 Ribosoma- protein L4 (RP 4) 26 Hs.286 MYE4493 DNA-biiutípg prote-n CPBP 27 Hs-285'313 PCU222 Myßloma 1-ST PC 3222 28 -VTY?-..78a Hypothe-ieal protein U10O550-i-nils.r tu prote-i- vríLh WD 29 Hs.9398 repcat) MYE-Ü20 Heat shock 70 kDfi prote-t.5 30 Hs.75410 MYE4932 X-JJOX-bindi-ig roíei-.-! (XBJ>1) 3£ Hs.149923 PCL3824 P?M-2 32 Hs-80205 PCI.4079 Geno-níc DNA clone (d-rcmo-ioinc 5 dona CTC-504A5) 33 PCl .4441 Carbón yl redactase-] (CBR . ) 34 Hs,S8778 owii-reg iated P M897 L--p-!j.;n recßptor-1 (<37 kD. ribosomal proíein SA) 1 H 8Í3S7 PCL5225 Myeloms EST PCL5225 VCÍJB639 Myeloma EST PCL0639 -v)YE325-.a RtTwsoora- protón S2 (RJPS2) 4 Hs.J 82426 PC 467S Nue)c pl-o*-t?in 5 lls.9614 PCI-SOIS MyeiomaESTPC 2í>?5 <5 PCÍ,37?? ymphocy te cytosolie prate.n-1 (Upíastin) 7 Hs.76506 PC 3287 Tumor proteip- transißtionaüy «ontrolled-l (TPT1) 8 Hs.279860 PCL 214 rotcin plwsphatBse-2, regul-ítot suí.u?-U B (PPP2R A) 9 Hs.179574 |j MYESÜ79 R.bosomalp?fltemS2< PÍ.2) lü Hs.182426 ;! PCLÍMS Hi^mob-l.tyer< pprote----](H Gl) il Hs.337757 j MYK2310 Glycerald--iyde-3-phosp--atedehydroget?a--e<O?PD) 12 Hs.169476 " PC 3027 Myeloma EST ?O-3027 -3 MYE3019 Ribuso- !proíc¡--L31(Kí>L31) 14 Hs.18401 PCt-1701 Act-n.T {AClGl) 15 Hs.I437> MYE10I2 Myeío?-?ai?STMYB10t2 16 PCI-222S Riboso al protón LIO (RP 10) 17 Hs.29797 MYE2056 t usomal proteip LS (R-PL5) 18 Hs.180946 Clone Secsuetice. JToowiogy ío toio r- protetn or c -R-ai? Accession no.

YB4005 522 SH2 dü-na-P-c<-nt-.<n»t»g adeptor N _T3--S55.i MYE3305 52? DI?AD b x í-Iicases AAC27435.1 MVE6227 56 Tt-reißßand -crait-A AACS1733.1 i PCL15-5 25 i eakly s-mif ar to irn-cín A 3932 PC1-.5298 272 Síi?-ilar to brai---s edf~ic at?giogen---.is ip íbitor-1 PCL1662 160 Similar ío ci-rop-osomai Broteí-i for mi-otie suindle S4IQ44 PCL2089 239 Novel c21.2 type afe fit-gt. BC09890I.1 MYE-378 410 S i-ilar to Trp Asp (WD) repeat nrufein XJ .08266,3 PCL12-5 310 ggsr I íra-i;. posase wwm PC 1 52 233 Testes deveíopmeRt-reiatetl NYD-SPi» ?AK.SáÜZ i FCL20&3 112 Pm5 protein NM.014287 PO-2220 19 í DE-.-s2p?8-D0222 sro-ílar to C7rP-b-?-di--g proteit- PC1.2520 ..89 Axi yrin cto-nait- 270310. ¡ PC--2-.3S 132 v-rs. avían retic losft(!otheiio..is viral oncoaene XM .1--.000.2 ¡ PCL2 9 320 APOBF.C1 (apolipoprotei.. B e it-ng -Otein} ft2^0 • PCU405 401 Ganadoitopífi i?idt?cibletía criptioa repressor-2 KMJU6264? !f MYE4184 365 Q±l*-bmdi..g pwtár. sift-ilarto RAY/ AB1C (RAYL) Xf.íJ)G-K>5<..t } PCL.3139 37 S ZNF i <10-lí pro» th AE15565<$ PC??.758 2Í)4 $i ?l-?rtoKr?A0790¡52%) MYE1302 410 PA P doti in eontuiníng ptotói« t>-j--ífZ?$<S<íD24<U fíABS9S&-U MYE2885 183 Mvpfti--.i-t.cal proreitt DKPZ 434H 132 X ..007645.3 YH554Ó 347 -H <catti<-> giucose-inyeed geni. (HS1119D91) XM 0t)9498.1 YB6872 220 Hypotíietícal prote-n $-t--i.-.r ta transcript m reguiaior A 17513 MYE5259 ?i 8 Hypüiho?ic-íi µrcue-p DKPZP564C18*5 simHar to Rad4 MYB6738 333 S1--3 domain-ccmtaitt-ng prc-ein BC008374.Í PC Ü791 235 Plekstrfa homology and FYVE 7i>.c finger dotnattis XM ) 16836.1 MYE4229» 310 FL20273 protein eonJatning R. recogpitíon raotif NM 019027.1 MYB 22 * 310 FL2Q273 pra--».. coataining RNA recognition ?toíiP „0J9027..

Ciu-Uer 707 Nove; pixítein disui-íd* iso-nerase BBafti-13-9.1 PCU 850 215 Protetn eontami-ig MyMike DNA-bíndtpß domain NM...022365.1 PCL2185 138 FLJ 13660 similar to COKS activator-bmdirtg protein XM )17042.1 C 4352 376 FUU021 simíl-tr ? spücing factor arai-?i ../--&.. Kt- XM U6227.1 rich-4 YB4I84 365 (jlT-bi?-dip proteitt sim iar tc. R?Y/R?BIC {RAY ) XM_00 -)S<-.1 PCL5805 2?0 ?iH3 -io-??pin contaiftidg protein XM_002214.1 MYE44S2 271 MMTV receptor v-triant-2 (Mtvr2) ?F052151.1 -Y--Y1ÍS .50 132 Similar to progesteto-te rcceptor-p-ssociatcd p4S XM. 0100 i 1.4 K. 1756 340 Transicnt receptor potei.-i-ü C precursor (GíP-like P3695I proteip) PCL1178 286 SAM domain-centa-r-ing proteia FU2161U XM 015753.1 Métodos de fabricación de los vectores de transducción lentivirales La presente invención también proporciona los métodos para concentrar y purificar un vector lentiviral utilizando ultracentrifugación de flujo pasante y centrifugación de alta velocidad, y filtración de flujo tangencial. La ultracentrifugación de flujo pasante ha sido utilizada en el pasado para la purificación de los virus de tumor de RNA (Toplin y col., Applied Microbiology 15: 582-589, 1967; Burger y col., Journal of the National Cáncer Institute 45: 499-503, 1970) . La presente invención propone el uso de ultracentrifugación de flujo pasante para la purificación de vectores lentivirales. Este método puede comprender uno o más de los siguientes pasos. Por ejemplo, un vector lentiviral puede ser producido a partir de células que utilizan una fábrica de células o sistema bio-reactor. Un sistema de transfección transitoria (ver en lo anterior) puede utilizarse o empaquetamiento o lineas de células productoras también puede del mismo modo utilizarse. Un paso de pre-clarificación antes de cargar el material en la ultracentrifuga podria utilizarse si se desea. La ultracentrifugación de flujo pasante puede hacerse utilizando flujo continuo o sedimentación en lotes. Los materiales que se utilizan para la sedimentación son, por ejemplo, cloruro de cesio, tartrato de potasio y bromuro de potasio, los cuales crean altas densidades con baja viscosidad aunque todos estos son corrosivos. El CsCl se utiliza frecuentemente para desarrollar procesos en vista de que un elevado grado de pureza puede lograrse debido al amplio gradiente de densidad que puede ser creado (1.0 a 1.9 g/cm3). El bromuro de potasio puede utilizarse a densidades altas, pero solo a temperaturas elevadas, es decir, 25°C, lo cual puede ser incompatible con la estabilidad de algunas proteinas. La sacarosa se utiliza ampliamente debido a que es no costosa, no tóxica y puede formar un gradiente apropiado para la separación de la mayor parte de las proteinas, tracciones subcelulares y células completas. Por lo regular, la densidad máxima es alrededor de 1.3 g/cm3 el potencial osmótico de la sacarosa puede ser tóxico para las células, en cuyo caso puede utilizarse un material gradiente complejo, por ejemplo, Nycodenz. Puede utilizarse un gradiente con uno o más pasos en el gradiente. Una modalidad preferida es utilizar un paso de gradiente de sacarosa. El volumen de material preferentemente puede ser desde 0.5 litros a más de 200 litros por corrida. La velocidad de flujo preferentemente es desde 5 a más de 25 litros por hora. La velocidad operativa preferida es entre 25,00 y 40,500 rpm produciendo una fuerza de hasta 122,000 x g. El rotor puede ser descargado estáticamente en fracciones de volumen deseadas. Una modalidad preferida es descargar el material centrifugado en fracciones de 100 mL. La fracción aislada que contiene el vector lentiviral purificado y concentrado entonces se puede intercambiar en una solución amortiguadora deseada utilizando filtración en gel o cromatografía de exclusión de tamaño. La cromatografía de intercambio aniónico o catiónico también podria utilizarse como un método alterno o adicional para el intercambio de la solución amortiguadora o mayor purificación. Además, la filtración de flujo tangencial también puede utilizarse para intercambiar solución amortiguadora y la formulación final si se requiere. La filtración de flujo tangencial (TFF) también puede utilizarse como un paso alternativo para centrifugación de ultra o alta velocidad, donde podria ponerse en práctica un procedimiento TFF de dos pasos. El primer paso reducirla el volumen del sobrenadante vectorial, mientras que el segundo paso se utilizarla para el intercambio de la solución amortiguadora, formulación final y alguna concentración adicional del material. La membrana TFF tendría un tamaño de membrana entre 100 y 500 kilodaltons, donde el primer paso TFF tendría un tamaño de membrana preferible de 500 kilodaltons, mientras que el segundo TFF tendría un tamaño de membrana preferible de entre 300 a 500 kilodaltons. La solución amortiguadora final contendría materiales que permitan al vector ser almacenado durante largo tiempo.

La presente invención también proporciona los métodos para la concentración y purificación de vectores lentivirales. El método utiliza fábricas de células que contienen células adherentes, o un bio-reactor que contiene células en suspensión que son transfectadas o transducidas con el vector y constructos cooperadores para producir el vector lentiviral. Los ejemplos no limitativos o bio-reactores incluyen un sistema birreactor ave y los birreactores Xcellerex. Ambos sistemas son desechables. No obstante, sistemas no desechables también pueden utilizarse. Los constructos pueden ser los descritos en la presente, asi como otros vectores de transducción lentivirales. De otro modo, la linea de células puede ser manipulada para producir vector lentiviral sin la necesidad de transducción o transfección. Después de la transfección, el vector lentiviral puede ser recolectado y filtrado para eliminar particulados y luego centrifugado utilizando velocidad alta de flujo continuo o ultracentrifugación. Una modalidad preferida es utilizar un dispositivo de flujo continuo y alta velocidad como el rotor de flujo continuo y zonal JCF-A con una centrifuga de alta velocidad. También preferible es el uso de centrifuga Centrifuge Stratus para producción del vector lentiviral a escala media. También preferentemente es cualquier centrifuga de flujo continuo donde la velocidad es de centrifugaciones mayor que 5000 xg RCF y menos de 26,000 x g RCF. Preferentemente, la fuerza centrifuga de flujo continuo es alrededor de 10,500 x g a 23,500 x g RCF con un tiempo de centrifugación de entre 20 horas y 4 horas, con tiempos de centrifugación más prolongados utilizados con fuerza centrifuga más lenta. El vector lentiviral puede ser centrifugado en un cojin de material más denso (un ejemplo no limitativo es la sacarosa pero pueden utilizarse otros reactivos para formar el cojin y estos son bien conocidos en la técnica) de modo que el vector lentiviral no forme agregados que no sean filtrables, como es el problema con la centrifugación directa del vector que da como resultado un sedimento del vector viral. La centrifugación de flujo continuo sobre el cojin permite al vector evitar formación de agregados grandes, pero permite al vector ser concentrado a niveles altos a partir de volúmenes grandes de material transfectado que produce el vector lentiviral. Además, puede utilizarse una segunda capa menos densa de sacarosa para franjear o marcar la preparación del vector lentiviral. La velocidad de flujo para la centrifuga de flujo continuo preferentemente es entre 1 y 100 mL por minuto, pero es posible utilizar también velocidades de flujo mayores y menores. La velocidad de flujo se ajusta para proporcionar suficiente tiempo para que el vector entre al núcleo de la centrifuga sin cantidades significativas del vector perdidas debido a la velocidad de flujo alta. Si se desea una mayor velocidad de flujo, entonces el material que fluye afuera de la centrifuga de flujo continuo puede ser recirculado y pasado a través de la centrifuga una segunda vez. Después de que el virus se concentra utilizando centrifugación de flujo continuo, el vector puede ser concentrado más utilizando filtración de flujo tangencial (TFF) o el sistema TFF puede ser simplemente utilizado para el intercambio del buffer. Un ejemplo no limitativo de un sistema TFF es el sistema de cartucho Xampler que produce GE-Healthcare . Los cartuchos preferidos son aquellos con un corte de MW de 500,000 MW o menos. Preferentemente se utiliza un cartucho con un corte de MW de 300,000 MW. También es posible utilizar un cartucho de 100,000 MW de corte. Para volúmenes más grandes, puede utilizarse cartuchos más grandes y será fácil para los expertos en la técnica encontrar el sistema TFF correcto para este intercambio de buffer final y/o paso de concentración previo al llenado final de la preparación del vector. La preparación del llenado final puede contener factores que estabilizan el vector-Ios azúcares generalmente se utilizan y son conocidos en la técnica.

Vacunas y terapia HIV Se sabe que las células de tumor expresan antigenos específicos del tumor sobre la superficie celular. Estos antigenos son considerados pobremente inmunogénicos, en gran medida porque representan productos génicos de oncogenes u otros genes celulares que normalmente están presentes en el hospedero y por tanto no se reconocen claramente como no propios. Si bien muchos investigadores han intentado dirigir las respuestas inmunitarias contra epitopes de diferentes antigenos específicos de tumor, ninguno ha sido exitoso en desencadenar inmunidad adecuada de tumor in vivo. Durante los últimos 30 años, literalmente miles de pacientes han sido administrados antigenos de células de tumor como preparaciones de vacuna, pero los resultados de estas pruebas han demostrado que la inmunización de células de tumor ha fallado en proporcionar una base racional para el diseño o construcción de vacunas efectivas. Incluso donde los pacientes expresan anticuerpos específicos del tumor o células T citotóxicas, esta respuesta inmunitaria no se correlaciona con una supresión de la enfermedad asociada. Esta falla del sistema inmunitario para proteger al hospedero puede deberse a la expresión de antigenos de tumor que son deficientemente inmunogénicos o a la expresión heteróloga de antigenos específicos mediante diferente células de tumor. La presentación apropiada de los antigenos de tumor para desencandenar una respuesta inmunitaria efectiva para inhibir el crecimiento de tumor sigue siendo un problema central en el desarrollo de una vacuna efectiva contra el cáncer. Asimismo, la cantidad y duración de la expresión del antigeno también es importante donde vectores no lentivirales tienden a no optimizar esta expresión. Sigue siendo muy necesario un método para presentar antigenos de tumor, los cuales son conocidos por ser deficientemente inmunogénicos, "auto" antigenos para el sistema inmunitario de un individuo en una forma que desencadena una respuesta inmunitaria bastante poderosa para inhibir el crecimiento de las células de tumor en el individuo. Esta invención supera las limitaciones previas e inconvenientes en la técnica proporcionando una proteina de fusión que contiene una quimiocina y un antigeno de tumor los cuales pueden producir una respuesta inmunitaria in vivo, dando como resultado la inhibición de las células tumorales. Esta invención también supera los inconvenientes anteriores en el campo del desarrollo de la vacuna HIV proporcionando una proteina de fusión que contiene una quimiocina y un antigeno de HIV que es eficaz como vacuna para tratar o prevenir infección por HIV. También se proporcionan los métodos para construir vectores lentivirales más seguros, los métodos para la purificación de los vectores lentivirales y los métodos novedosos para los vectores lentivirales utilizados para la detección de interacciones proteina-proteina.

La presente invención también proporciona los métodos de tratamiento o prevención de infección de HIV en un individuo, que consiste en administrar al individuo cualquier combinación de los siguientes péptidos derivados de las siguientes proteinas: quimiocina, gen suicida, proteina HIV, citocina, proteina de la superficie celular, antigeno de tumor o cualquier gen celular que afecte la producción de HIV a partir de la célula (mediante la sobre expresión del gen celular o la inhibición de su expresión por el RNAi, o similar) todos proporcionados y expresados a partir de un vector lentiviral .

Otra modalidad preferida es un vector lentiviral para uso terapéutico es aquel que expresa un polipéptido nativo o de fusión que comprende cualquier combinación o individual de una quimiocina humana y un antigeno viral o bacteriano (por ejemplo HIV, antigeno de la toxina diftérica), una quimiocina (por ejemplo IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1, RANTES, SDF-1, MIG y/o MDC) o una proteina pro-apoptótica, una proteina del gen suicida o una proteina que favorezca la respuesta inflamatoria.

Además, la presente invención proporciona un método de producción de una respuesta inmunitaria en un individuo, que consiste en administrar al individuo alguno de los polipéptidos individuales o de fusión de esta invención, que comprende una quimiocina y un antigeno de virus de imunodeficiencia humana (HIV) , o una quimiocina, o un gen pro-apoptótico, un gen suicida y un antigeno de tumor, como una proteina o un ácido nucleico que codifique el polipéptido individual o de fusión expresado a partir de un vector lentiviral. También se proporciona un método para el tratamiento de un cáncer en un individuo que consiste en administrar al individuo un vector lentiviral que exprese cualquiera de los polipéptidos individuales o de fusión de esta invención, que comprende una quimiocina y un antigeno de tumor, como una proteina o un ácido nucleico que codifique el polipéptido de fusión.

Además se proporciona un método de tratamiento o prevención de infección de HIV en un individuo, que consiste en administrar al individuo cualquier combinación de los siguientes péptidos derivados de las siguientes proteinas: quimiocina, gen suicida, proteina HIV, citocina, proteina de la superficie celular, antigeno de tumor o cualquier gen celular que afecte la producción del HIV a partir de la célula (por sobre expresión del gen celular o la inhibición de su expresión por el RNAi o similar) todos proporcionados y expresado a partir de un vector lentiviral.

La presente invención también proporciona un vector HIV es capaz de producir partículas HIV cuando las células del vector HIV se infectan con una particula HIV infecciosa o defectuosa encontrada en el cuerpo de un individuo infectado con HIV. El vector contiene una secuencia que inhibe o sobre expresa la siguiente versión nativa o una mutante de los factores hospederos celulares que dan como resultado una particula viral que es menos patógena o preferentemente no patógena, que la particula HIV tipo nativo. Estos incluyen, por ejemplo, los miembros de la familia APOBEC, (APOBEC 1, 2, 3A, 3B, 3C, 3D, 3F, CEM15/Apobec-3G) , AID, ACF, TsglOl, Vps 4, Vps 28, Vps 37, Vps 32, ESCRT-1, ESCRT-2, ESCRT-3, TRBP-1, Sam68, proteinas que contienen dominios KH, proteinas celulares involucradas en la dimerización y maduración de las partículas virales, Hck, moléculas de adhesión de células intercelulares (ICAM) como puede ser ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, ICAM-4 e ICAM-5; antigeno-1 asociado con la función de leucocitos (LFA-1) y el antigeno 1 de macrófago (Mac-1), Trim 5-alfa, Trim 1, CRM1 humana, proteina prion celular (PrP) , E2F-4, ciclofilina A, los miembros o la via JAK/STAT, TIP30, proteina de interacción de Rev humano (hRIP) , proteinas ancladas al glicosil-fosfatidilinositol (GPI), CD4, CD36, PrP4, HSP27, HSP70, p38 MAPK, cualquier miembro de la súper familia de la proteina activada por mitógeno (MAP) cinasa, TipllO, TGFbeta-1, MCP-1, factores reguladores del interferón (los IRF) , IRF-1, IRF-2, IRF-3, IRF-4, IRF-5, IRF-6, IRF-7; RA5, SDF-1 alfa, CCR5, CXCR4, súper familia de receptores de TNF (TNFRSF) , ligando CD40 (CD40L, también denominado CD154 o TNFSF5) , IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, TNF-alfa, eritropoyetina, trombopoyetina, factor de células madre, ligando flk2/flt3 y ribonucleoproteina A2 heterogénea. El vector lentiviral puede incluir cualquier combinación de genes o inhibidores de la expresión génica descrita en otra parte de esta solicitud de patente provisional. Una combinación preferida de genes expresados en el vector lentiviral es IFN-alfa e IFN-beta. Otra combinación preferida es un vector lentiviral que expresa un IFN-alfa e IFN-beta separados por un elemento IRES o mutación con cambio, desplazamiento o desfaso del marco de lectura que se encarga de la traducción de ambos genes del mismo mRNA.

Métodos de eliminación de células La presente invención también propone los métodos de eliminación (por ejemplo purga) de células (por ejemplo in vivo o in vi tro) utilizando vectores lentivirales. Vectores lentivirales como estos pueden comprender genes citotóxicos, citoestáticos o suicidas que, cuando se expresan en una célula diana, dan origen a la muerte celular. Por ejemplo, la presente invención proporciona un vector lentiviral que infecta selectivamente y se integra en las células tumorales en lugar de las células normales, particularmente las células madre hematopoyéticas que son muy difíciles de transducir con cualquier vector, incluido un vector lentiviral. De hecho, la transducción eficiente de células madre hematopoyéticas ha un eficiencia mayor de 85% podria solamente ser lograda con múltiple transducción en presencia de factores de células madre específicos (Davis y col., Blood 2004). Una transducción mayor de 90% de las células T solo se lograrla después de la estimulación de las células T con factores específicos (Humeau y col., 2004). Por tanto, la invención utiliza vectores lentivirales para entregar selectivamente genes en células tumorales en lugar de células normales para purgar injertos de células hematopoyéticas (y otras células) de las células de tumor, disminuyendo la probabilidad de enfermedad recurrente. El gen puede ser un "gen suicida", un gen que induzca la apoptosis celular o un gen que estimule la respuesta inmunitaria. De otro modo, el gen o secuencia codificadora puede ser seleccionado cuyos productos ofrezcan un mecanismo de aniquilación condicional para células en división. En esta forma, la expresión de una proteina particular seguida por el tratamiento ulterior es eficaz para aniquilar las células neoplásticas. El tratamiento subsiguiente comprende los tratamientos químicos y físicos. Los agentes para los tratamientos químicos comprenden el uso de enzimas u otros compuestos que reaccionan con el producto génico para matar la célula hospedera. Los tratamientos físicos comprenden el sometimiento de las células a radiación, luz UV y similares. El método utiliza especificamente un vector lentiviral que expresa un gen que interesa que es capaz de purgar o estimular una respuesta inmunitaria contra células contaminantes (incluida sin restricción, células o un tumor o tipo de célula maligna, premaligna, proto-oncogénica, oncogénica o cualquier tipo de célula anormal que pueda estar contaminando la preparación o tenga el potencial de proporcionar un episodio adverso (mediante el cual el método consiste en: (1) adicionar el vector a la preparación celular que va a ser purgada de las células contaminantes durante un tiempo que de cómo resultado más o menos 99% de las células contaminantes siendo transducidas con el vector lentiviral, donde las células normales del injerto se transducen con el vector lentiviral a una frecuencia que es menor que la de las células contaminantes, y (2) administrar la preparación celular en un paciente que requiera la preparación celular. Las células pueden ser lavadas alternativamente para eliminar el vector en exceso, pero esto no es necesario. El vector además puede expresar el "gen purga de interés" (GOI) que este contenido en el vector lentiviral bajo un promotor que se exprese más especificamente en células tumorales o con secuencias de acción cis que favorezcan la estabilidad del mRNA del GOI en células oncogénicas en lugar de células normales, o secuencias de acción cis que favorezcan la inestabilidad del mRNA del GOI en células normales en lugar de en células oncogénicas. Otros sistemas promotores también pueden utilizarse en tándem, como puede ser los sistemas promotores inducibles. Un ejemplo de esto es el sistema promotor inducible de tetracilina [sic] .

Hay algunos tipos de genes que pueden utilizarse para la invención anterior. Por ejemplo, el virus de herpes simple tipo I (HSV-1), el gen de timidina cinasa (TK) ofrece tal mecanismo de aniquilación condicional para células en división. La ventaja selectiva de utilizar HSV-l-TK derivado del hecho que la enzima tiene mayor afinidad para ciertos análogos de nucleósido, como puede ser aciclovir, tanciclovir y FIAU, que TK de mamifero (McLaren y col., In: Herpes Virus Chemotherapy, R. Kono, ed., pp . 57-61, Ámsterdam, Elsevier (1985)).

Estos fármacos se convierten en precursores tipo nucleótido y se incorporan en el DNA de células replicantes, rompiendo asi la integridad del genoma, y finalmente dando origen a la muerte celular. Diversos estudios han hecho uso satisfactorio de la toxicidad condicional de TK en estudios de desarrollo de ratones transgénicos (Borrelli y col., Nature 339: 538-541 (1983); Heyman y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2698-2702 (1989)), un marcador selectivo contra episodios de recombinación no homólogos en células cultivadas (Capecchi, M. R., Trenes in Genetics 5 (3): 70-76 (1989)), para células asesinas que albergan virus de herpes tipo silvestre (Corey y Spear, N. Engl. J. Med. 314: 686-691 (1986); Corey y Spear, N. Engl. J. Med. 314: 749-756 (1986)), y en la selección de mutantes de virus herpes carentes de actividad TK (Coen y col., Science 234: 53-59 (1986)). Otros "genes suicidas" están disponibles (por ejemplo http://www.zgene.net/technology.html) y el uso de TK no se entiende como el ejemplo limitativo. Los genes apoptóticos también pueden ser utilizados en combinación o en forma individual. Los ejemplos pueden ser: la familia de ligandos TNF: LTA (TNF-b), LTB (LT-b) , TNF (TNF-a), TNFSF4 (0X40 Ligand), TNFSF5 (CD40 Ligand), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 Ligand), TNFSF8 (CD30 Ligand), TNFSF9 (4-1BB Ligand), TNFSF10 (TRAIL) , TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (Apo3L) , TNFSF13 (APRIL), TNFSF14 (HVEM-L) . TNF Receptores Family: LTBR, TNFRSF1A (TNFR1) , TNFRSF1B (TNFR2), TNFRSF4 (OX40), TNFRSF5 (CD40), TNFRSF6 (Fas), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB), TNFRSF10A (DR4), TNFRSF10B (DR5) , TNFRSF10C (DcRl), TNFRSF10D (DcR2), TNFRSF12 (DR3), TNFRSF14 (HVEM.)Bcl-2 Family: BAD, BAK1, BAX, BCL2, BCL2A1 (bfl-1), BCL2L1 (bcl-x) , BCL2L11 (bim-like protein), BCL2L2 (bcl-w) , BIK, BLK, BNIP3 (nip3), BOK (Mtd), HRK, MCL-lCaspase Familya: CASP1, CASP2, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP7, CASP8, CASP9, CASPIO, CASP13, CASP14. Familia IAP : BIRC1 (NIAP) , BIRC2 (IAP2), BIRC3 (IAP1), BIRC4 (XIAP) , BIRC5 (Survivin), BIRC6 (Bruce). Familia TRAF: TANK (1-TRAF), TRAF1, TRAF2, TRAF3 (CRAF1), TRAF4 , TRAF5, TRAF6, TRIP.

Familia CARD: APAF1, ASC, BCL10 (HuElO), NOD1 (CARD4), NOL3 (Nop30), RIPK2 (CARDIAC) . Death Domain Family: CRADD5 DAPK2, FADD, MYD88, RIPK1. Death Effector Domain Family: CASP8AP2 (FLASH), CFLAR (CASPER), FADD, LOC51283 (BAR) . CIDE Domain Family: CIDEA, CIDEB, DFFA5 DFFB. p53 y ATM Pathway: ATM5 CHEKl (chkl), CHEK2 (chk2, Rad53) , GADD45A, MDM2, P63, RPA3, TP53 (p53) .

Los genes inmunogénicos o citocina también pueden utilizarse en forma individual o en combinación con genes suicidas o apoptóticos. Los ejemplos de estos genes son: FADD, IRAK1, IRAK2, MYD88, NCK2, TNFAIP3, TRADD, TRAF1 , TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6. Cell Surface Receptors: ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRL1, CD285 CD3E, CD3G, CD3Z, CD69, CD80, CD86, CNR1, CTLA4, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, FCGR3A, GPR44, HAVCR2, 0PRD1, P2RX7, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7 , TLR8, TLR9, TLR10. Chemokine & Receptors: BLR1, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCRl, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL15 CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCR4, GPR2, SCYE1, SDF2, XCL1, XCL2, XCR1. Cytokine & Receptors: AMH, AMHR2, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, C19orfl0 (IL27w), CER1, CSF1, CSF2, CSF3, DKFZp451J0118, FGF2, GF11, IFNA1, IFNB1, IFNG, IGF1, IL1A, IL1B, IL1R1, IL1R2, IL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL8, IL8RA, IL8RB, IL95 IL9R, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17R, IL18, IL18R1, IL19, IL20, KITLG, LEP, LTA, LTB, LTB4R, LTB4R2, LTBR, MIF, NPPB, PDGFB, TBX21, TDGF1, TGFA, TGFB1, TGFB1I1, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, TNF, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF11A, TNFRSF21, TNFSF4, TNFSF5, TNFSF6, TNFSF11, VEGF, ZFPM2, RNFllO (ZNF144) . Signal Transduction Proteins: CABIN1, CALM1, CALM2, CALM3, CAMK2B, CAMK4, CDC25A, CDKN1A, CDKN2B, CHUK, CSNK2A1, CSNK2B, ENG, EV11, GSK3A, GSK3B, IKBKB, IKBKE, IKBKG, IL18BP, ITK, JAK1, JAK2 , JAK3, KPNA5, KPNB3, LAG3, LAT, MADH1, MADH2, MADH3, MADH4, MADH5, MADH6, MADH7, MADH9, MAP2K4, MAP2K7, MAP3K1, MAP3K2, MAP3K7, MAP3K7IP1, MAP3K14, MAPK3, MAPK8, MAPK9, MAPK10, MAPK 14, MHC2TA, NAP4, NBL1, NMA, NUP214, PAK1, PLAU, PPP3CB, PPP3CC, PPP3R1, PTPRC, RIPKl, SERPINE1, SLA, SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS7, TBK1, TIMP1, TRPV6, TSC22, TYK2, VAVl, VAV2, VA V3, XP05. Responsive Genes and Other Related Genes: AGT, BAD, BCL2, BCL3, BF, C3, CHRD, CKTSF1B1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, FST, HRAS, ICAM1, ICAM2, ICAM3, ICAM4, ICAM5, IGFBP3, IGSF6, ITGB5, ITGB7, IVL, MGC27165, MYF5, NCAM1, NOS2A, ORM1, PIN1, RFXl, RFX2, RFX3, RFX4, RFX5, RFXANK, RFXAP, RFXDC1, SAA1 , SELE, SELL, SELPLG, SFN, TGIF, VCAM1. Transcription Factors: ATF2, CEBPB, CREB1, CREBBP, EGR1, EGR2, EGR3, ELK1, ELK3, EP300, FKBP1B, FLJ14639 (NIP45) , FOS, FOSL1, FOSL2, FOXP3, GATA3, GATA4, GRLF1, ICOS, IRF1, JUN, JUNB, JUND, MAF, MAX, MEF2A, MEF2B, MEF2D, MYC, NFAT5, NFATC1, NFATC2, NFATC3, NFATC4, NFKB1, NFKB2, NFKBIA, NFKBIB, NFKBIE, NFKBIL1, NFKBIL2, NFRKB, RAF1, REL, RELA, RELB, RUNX1, RUNX2, SPI, SP3, SRF, STAT1, STAT4, STAT6, TFCP2, YY1.

La terapia del gen suicida también se conoce como terapia del gen por activación de profármaco la cual puede utilizarse para aumentar la sensibilidad de las células diana para apoptosis inducida por profármacos. La introducción de un gen suicida utilizando un vector lentiviral proporciona a la célula tumoral la capacidad de activación de profármaco localizada, restringiendo la producción del metabolito del fármaco tóxico para el tejido elegido. Los sistemas de terapia de gen suicida incluyen, por ejemplo, HSV-tk en combinación con el profármaco antiviral ganciclovir y la citocina desaminasa del gen bacteriano en combinación con el profármaco 5-fluorocitocina. También es posible utilizar las enzimas del citocromo P-450, las cuales pueden estar combinadas con una variedad de profármacos anticáncer, como ciclofosfamida y su isómero y fosfamida.

En el paso ha habido un intento de utilizar vectores para el tratamiento de la enfermedad injerto contra huésped ("GVH"), la cual es un efecto colateral del transplante halogénico con elevada mortalidad. Estos han fallado porque la elevada eficiencia de la transducción de los linfocitos donadores no podria lograrse, o las células responsables de la enfermedad del injerto contra huésped no podrían ser efectivamente dirigidas. Esta invención propone el uso de vectores lentivirales de transducción para afrontar ambas deficiencias. La presente invención proporciona una nueva estrategia para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) durante el transplante halogénico. En la actualidad, el transplante halogénico da como resultado una elevad tasa de mortalidad debido a la enfermedad injerto contra huésped donde los linfocitos del donador reconocen el huésped como extraño y comienzan destruyendo el tejido huésped normal. Si bien los linfocitos del donador pueden destruir las células tumorales efectivamente, los efectos colaterales de la GVHD impiden el transplante halogénico y donante no relacionado [sic] como medio para tratar diferentes formas de cáncer. El presente emplea vectores lentivirales para el tratamiento o prevención de la enfermedad injerto contra huésped. El método utiliza un vector lentiviral que expresa un gen suicida que se utiliza para transducir poblaciones de linfocitos donantes.

Otras estrategias incluyen la expresión de genes apoptóticos o RNAi para factores de sobrevida que se expresan a partir de promotores inducibles. Las cargas útiles descritas son ejemplos no limitativos y cualquier gen o secuencias silicenciadoras del gen pueden utilizarse para modular la función de las células T halogénicas, en lugar de simplemente matar las células en algún punto en el futuro. El método estimula los linfocitos donadores con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (u otros estimulantes como mitógenos, citocinas, otros factores) antes o durante la transducción con el vector lentiviral que expresa el gen suicida o el gen de muerte celular inducible o RNAi. La estimulación permitirá elevada e incluso completa transducción de las poblaciones de linfocitos con el vector lentiviral. Por tanto, una vez que las células transducidas sean infundidas en el paciente, entonces si el aloinjerto causa GVHD, entonces la GVHD puede ser tratada con un profármaco para inducir muerte celular de los linfocitos que están mediando GVHD. El nivel del profármaco también puede reducir la GVHD en una forma dependiente de la dosis de modo que se pueda mantener el efecto injerto contra tumor .

Puesto que las células T alorreactivas son los mediadores de GVHD, un método preferido para tratar el linfocito o la población de células de sangre periférica es dirigir más especificamente estas células con el vector. Como sabe que los vectores lentivirales transducen más efectivamente las células que son más activamente las células que son más activadas, las células T alorreactivas serán más eficientemente transducidas con vectores lentivirales si estos se activan selectivamente sobre aquellas células T que no son alorreactivas. La activación especifica de las células T alorreactivas puede lograrse mezclando linfocitos donadores (o leucocitos, o células T CD4) con células del receptor (leucocitos, células rojas u otras célula receptoras; las células pueden ser irradiadas o tratadas para matar o prevenir el crecimiento celular) o un extracto de las células del receptor, y simultáneamente adicionar vector a la población en una MOI (multiplicidad de infección) apropiada que transduce selectivamente las células aloreactivas y no las células no aloreactivas que no se estimulan por el mezclado de las células. Un método preferido es mezclar las células sanguíneas rojas del receptor con los linfocitos donadores en vista de que estas células expresan antigenos MHC, incluidos los antigenos MHC menores (Zimring y col., Blood. 2006, Jan 1; 107 (1): 187-9) y estas no son células que se translucirán establemente con el vector cuando estas sean enucleadas. Estas MOI pueden ser determinadas fácilmente por los que estén familiarizados en la técnica donde un vector que expresa un informador puede ser utilizado para determinar cuales células han sido transducidas. Después del mezclado de las células sanguíneas rojas con los linfocitos donadores y la transducción con el vector lentiviral, los linfocitos se lavan y preferentemente se aislan de las células sanguíneas rojas antes de la infusión en el paciente. La separación de las células sanguíneas rojas de los linfocitos se puede lograr por diversas técnicas que incluyen la separación de perlas o centrifugación en gradiente ficoll y se conoce comúnmente en la técnica. La ventaja de utilizar células sanguíneas rojas aisladas sobre otros tipos de células para la estimulación es: (1) estas son fácilmente disponibles, (2) se remueven fácilmente después de la estimulación, (3) estas no crecen y por tanto no contribuyen a la estimulación sostenida de los linfocitos donadores, y (4) no se transducen con el vector. Las células alorreactivas transducidas se pueden destruir in vi tro antes de la infusión, o después de la infusión en el paciente. Las células también pueden alternativamente ser estimuladas con un extracto celular o péptidos que sean específicos del paciente y derivados de los genes del complejo de histocompatibilidad menor o mayor (MHC) particulares del pacientes. La preparación del extracto o péptidos/proteinas que expresan un gen de MHC especifico se conoce en la técnica. Preferentemente, el extracto se deriva de tejidos no tumor de modo que las células aloespecificas se transduscan mas especificamente que las células que son especificas para antigenos que están relacionados con la enfermedad. El extracto o péptido/proteinas son pulsados sobre las células donadores para estimular las células alorreactivas para permitir la transducción eficiente mediante el vector lentiviral. Después de la transducción con el vector, las células pueden ser lavadas y luego están listas para congelación o infusión en el paciente. Puede ser preferible cultivar las células en IL-2 durante un tiempo corto antes de la infusión en el paciente.

Un método alternativo para la transducción de células T emplea el uso de CD3 soluble, IL-2 (o una combinación de dos factores solubles, o una combinación de un factor o ligando soluble y uno inmovilizado) en una población de linfocitos mixtos. Se adiciona un vector lentiviral a una población de linfocitos, y especificamente no a una población de células T CD4 purificadas, en presencia de CD3 soluble e IL-2. En otra versión, CD3 soluble e IL-2 pueden ser expresados a partir de un vector facilitador, como se describe en otra parte de esta solicitud. El entorno de linfocitos mixtos actúa para estimular las células además de CD3 e IL-2 permitiendo transducción de alta eficiencia por un vector lentiviral cuando este se adiciona a las células. Este método de transducción de células T por el vector lentiviral puede ser ampliamente utilizado para una amplia variedad de aplicaciones que incluye, pero no se limita al tratamiento de enfermedades genéticas, infecciosas y oncogénicas.

Más aún, el método de incorporar opcionalmente gen o genes suicidas o de seguridad en células tiene amplias aplicaciones. Una aplicación no limitativa es la combinación de la expresión mediada por el vector lentiviral de receptores de células T nativos o quiméricos que se dirijan a las células enfermas en combinación con genes suicidas. Estas células genéticamente modificadas (que pueden ser antologas o derivadas de células inmortalizadas) pueden albergar a las células enfermas, como pueden ser células cancerosas o células infectadas con un patógeno, y luego el paciente puede ser tratado con un profármaco para eliminar las células T y con un efecto circunstante, matar el cáncer, las células infectadas por las células enfermas. Un enfoque como este puede utilizarse solamente o en combinación con alguno de los otros enfoques descritos en esta solicitud.

Un ejemplo no limitativo del método emplea el uso de un vector lentiviral que contiene un gen que puede matar o destruir la célula transducida del vector lentiviral. Preferentemente, el gen se expresa en una forma inducible y/o es gen que es únicamente activado en presencia de un profármaco. Existen múltiples promotores inducibles disponibles —los ejemplos no limitativos son el promotor inducible por tetraciclina promotores específicos de los tejidos. Hay múltiples genes suicidas disponibles que incluyen el gen de timidina cinasa de herpes virus y el gen de Dm-dNK de drosofila, los cuales sensibilizan las células transducidas con estos genes para un profármaco o inducir muerte celular después de que el fármaco es introducido in vi tro o in vivo . Las secuencias silenciadoras del gen inducible del promotor también pueden utilizarse para inducir muerte celular.

La presente invención también proporciona los métodos para el tratamiento de enfermedades de la sangre mediante expresión especifica del promotor de genes suicidas. Existen múltiples genes suicidas disponibles que incluyen el gen de timidina cinasa del virus herpes y el gen de Dm-dNK de drosofila los cuales sintetizan células transducidas con estos genes para un profármaco para inducir la muerte celular después de que el fármaco es introducido in vi tro o in vivo. Nuevos métodos de genómica funcional han identificado genes que tienen actividad transcripcional aumentada o supervivencia del mRNA post transcripcional en células enfermas. Estos atributos únicos de las células enfermas pueden utilizarse para desarrollar estrategias del vector lentiviral para el tratamiento de estas enfermedades, el método emplea el uso de un vector lentiviral que expresa un gen suicida en una forma especifica del tejido. Un ejemplo no limitativo es un vector lentiviral que puede expresar el gen de Dm-dNK de drosofila bajo el control del promotor especifico de la célula B CD19 para el tratamiento de leucemias y linfomas relacionados con las células B. Este vector lentiviral es suministrado a las células madre mediante transplante de médula ósea. Tras el desarrollo de la enfermedad leucémica recurrente, el paciente recibe el profármaco y todas las células que expresan CD19 (todas las células B) serán aniquiladas. En un paciente que tenga cáncer agresivo, la pérdida de linfocitos B funcionales es tolerada y el paciente puede ser suplementado con inmunoglobulinas por via intravenosa. Mediante la aniquilación de las células de tumor relacionadas con células B recurrentes, se salva la vida del paciente. Esta estrategia se puede hacer más especifica para el tipo de células de tumor mediante el uso de un elemento promotor o postranscripcional que se encuentra solamente en el tumor y no en las células B normales .

La eliminación de las células diana también se puede lograr utilizando vectores lentivirales que transducen casetes génicos en células que comprenden promotores específicos del tejido ligados de manera operante a genes suicidas, citotóxicos y citoestáticos . Por ejemplo, las células hematopoyéticas pueden ser transducidas con un gen suicida que se exprese especificamente a partir de un promotor de células endoteliales. Cuando algunas de las células madre se diferencian en células endoteliales, estas células pueden ser especificamente aniquiladas por un profármaco que active el gen suicida. En fechas recientes se describió que durante el transplante de médula ósea para el tratamiento de cáncer, el endotelio vascular de las células cancerosas se deriva a partir de las células de médula ósea. Asi pues, marcándolas como un caballo de troya, es posible matar los tumores del endotelio que necesitan crecer y formar metástasis. Del mismo modo, cuando las células madre se utilizan terapéuticamente (por ejemplo, para regenerar tejidos de corazón, páncreas, higado, neurales, vasculares, etcétera) , los episodios de transdiferenciación no deseados pueden ser controlados transduciendo las células madre con casetes génicos que, cuando se expresan en el tipo de célula no deseada, dan como resultado su muerte.

Uso de vectores lentivirales Los vectores lentivirales, particularmente los vectores de HIV, pueden materializar el potencial de tales sistemas para crear una biblioteca de células con fenotipos variables para probar especificamente la especificidad y seguridad de diversos fármacos y productos biológicos.

Se proporcionan los métodos, y las composiciones para uso en estos, para medir de manera directa, rápida e inequívoca en un entorno de alto rendimiento, la función de ácidos núcleos de muestra de función desconocida, utilizando el vector HIV, un plásmido de empaquetamiento o una linea de células de empaquetamiento. El método incluye los pasos de construir un vector en forma de plásmido mediante la inserción de una serie de cDNA, DNA, EST, genes, oligonucleótidos sintéticos, shRNAi, ddRNAi o una biblioteca de ácidos nucleicos en los plásmidos del vector HIV que estén desprovistos de genes HIV que se expresen como proteinas HIV funcionales, mediante la cotransfección del plásmido del vector HIV con plásmido o plásmidos cooperadores en una linea de células o linea de células de empaquetamiento que tengan componentes de complementación necesarios para la replicación y empaquetamiento del vector HIV. El resultado es producir una serie o biblioteca de vectores HIV recombinantes preferentemente en un entorno miniaturizado, de alto rendimiento, que incluye pero no se limita a formatos de 96 y 384 pozos, arreglos, vectores de impresión sobre cubre objetos y métodos similares. Para identificar y asignar la función al producto o los productos codificados por los ácidos nucleicos muestra, un huésped o célula hospedera se transduce en un entorno de alto rendimiento con vectores HIV recombinantes que expresan el producto o los productos de los ácidos nucleicos muestra y con ello alteran un fenotipo de un hospedero.

Una modalidad preferida es un vector HIV que contiene una biblioteca de cDNA o RNAi que se transfecta o transduce en una célula o linea de células de empaquetamiento donde el cooperador expresa un gen de la envoltura que permite a la particula vector empacada infectar o transducir células vecinas para la amplificación del vector. Dado que cada vector inicialmente transfectado o transducido en las células de empaquetamiento o lineas de células de empaquetamiento son idénticos, estos vectores que son producidos más eficientemente amplificarán más rápidamente que aquellos vectores que se producen no tan eficientemente. El titulo del vector en cada muestra puede entonces ser ensayado por numerosos métodos. Un método como este es un ensayo ELISA, un ensayo bien conocido en la técnica, donde la proteina que se esta ensayando es el antigeno p24 del HIV en el medio de las células. Otros ensayos que pueden utilizarse para determinar cuales clones están produciendo vectores HIV más eficientemente es el uso de métodos fluorométricos como el de la proteina verde fluorescente que es codificada en el vector. Una modalidad preferida para uso de las proteinas fluorescentes es expresar el cDNA y la proteina fluorescente fuera del mismo promotor y dentro del mismo mRNA, separado por una secuencia de iniciación de la traducción para iniciar la traducción del segundo producto génico. Tales secuencias de iniciación de la traducción son conocidas en la técnica. Por ejemplo, la secuencia Infernal Ribosome Entry Site (IRES) es una que se utiliza comúnmente. En general, la expresión del gen corriente debajo de la IRES no es tan eficiente como desde el gen corriente arriba. Si el nivel de expresión del gen corriente abajo es menor que aceptable, entonces un elemento regulador postranscripcional (PER) puede insertarse distalmente del gen corriente abajo para aumentar su expresión. El método puede ser modificado para generar proteinas de la envoltura del vector con tropismos modificados debido a la molécula transcriptasa inversa propensa alrededor en el HIV y la capacidad del HIV para recombinarse. Durante cada ronda de amplificación el vector HIV crea un error en su genoma y por tanto puede modificar las secuencias de la envoltura contenidas en este y por tanto cambia la afinidad de unión y posiblemente el tropismo del vector viral. Mediante el uso de una célula diana como la linea de células de empaquetamiento (por ejemplo, un tipo particular de célula cancerosa) que contiene componentes cooperadores, los vectores con tropismo aumentado para la linea de células y serán preferentemente seleccionados para durante cada ronda de replicación, contrario a aquellos vectores que tienen tropismo disminuido o son defectuosos para la replicación. Después de la selección, las envolturas modificadas pueden ser aisladas por PCR utilizando cebadores específicos del vector ubicados 5' y 3' para la secuencia de la envoltura, y caracterizadas. La secuencia de la envoltura no necesita iniciar con la secuencia de la envoltura nativa, pero puede consistir en una biblioteca de variantes de la proteina de la envoltura que pueden ser generadas por diversas técnicas conocidas en la materia. El procedimiento de selección no necesita ser limitado al cultivo celular.

Animales transgénicos pueden ser creados con componentes de empaquetamiento para la selección del animal entero de vectores HIV en el animal. El componente de empaquetamiento puede necesitar ser diseñado para ser especifico de la especie; por ejemplo, para las replicaciones monos, los genes de empaquetamiento SIV (por ejemplo genes de gag, pol, regulatorios o accesorio) pueden ser preferidos a los genes de empaquetamiento HIV, mientras que no obstante el uso de un genoma HIV como el vector de transferencia (por ejemplo, la 5'-HIV-LTR hasta una parte de la porción no codificadora del HIV gag que contiene la secuencia de empaquetamiento, opcionalmente el elemento rre y su secuencia aceptora de empalme, el gen de la envoltura y la 3'-HIV-LTR) bajo un promotor especifico del tejido, el gen de la envoltura puede entonces ser expresado en un órgano o tejido especifico tras la administración del vector en el animal. En esta forma, utilizando animales transgénicos que contengan ciertos genes de empaquetamiento para el empaquetamiento y movilización del vector pueden crear vectores dirigidos altamente específicos.

Otra modalidad es la automatización del proceso cuando se determina la función de los genes utilizando un vector lentiviral. Para determinar la función de los genes, se inserta una serie de cDNA o RNAi en un vector HIV para crear una biblioteca de vectores HIV, cada uno expresando un cDNA, un RNAi o un cDNA y un RNAi, dos cDNA, dos cDNA y un RNAi, un cDNA y dos RNAi o por lo menos RNAi dirigidos a genes particulares que interesen. Cada paso del método puede hacerse en un formato de múltiples pozos y automatizado para aumentar más la capacidad del sistema. Este sistema de alto rendimiento facilita el análisis de la expresión de un gran número de ácidos nucleicos muestra a partir de organismos humanos y otros in vi tro e in vivo y es un mejoramiento significativo sobre otras técnicas disponibles en el campo. La presente invención utiliza la generación de alto rendimiento de bibliotecas de vectores HIV recombinantes que contienen uno o más ácidos nucleicos muestra seguido por el tamizaje de alto rendimiento de las bibliotecas de los vectores adenovirales en un huésped para alterar el fenotipo de un huésped como un medio de asignación de una función al producto o los productos de la expresión de los ácidos nucleicos muestra. Las bibliotecas de los vectores HIV se generan en un entorno de alto rendimiento utilizando constructor de ácido nucleico y células de empaquetamiento complementarias. Las bibliotecas de ácido nucleico muestra pueden ser una serie de secuencias distintas definidas e indefinidas o puede ser una mezcla de secuencias no definidas o definidas. El primer constructo de ácido nucleico es plásmido adaptador relativamente pequeño y fácil de manipular y un cásete de expresión con los ácidos nucleicos muestra. El segundo constructo de ácido nucleico contiene una o más moléculas de ácido nucleico que se súper ponen parcialmente entre si y/o con las secuencias del primer constructo y contiene por lo menos todas las secuencias del vector HIV necesarias para la replicación y empaquetamiento de un HV recombinange no provisto por el plásmido adaptador o constructos de empaquetamiento o células. La co-transfección del primero y segundo constructor de ácido nucleico en las células de empaquetamiento conduce a la recombinación homologa entre secuencias traslapantes en el primero y segundo constructos de ácido nucleico y entre los segundos constructos de ácido nucleico cuando este se constituye de más de una molécula de ácido nucleico. La biblioteca del vector HIV se introduce en un hospedero en un entorno de alto rendimiento el cual es crecido para permitir suficiente expresión del producto o los productos codificados por los ácido nucleicos muestra para permitir la detección y análisis de su actividad biológica. El hospedero puede ser células cultivadas in vi tro o un animal o un modelo de planta. Suficiente expresión del producto o los productos codificados por los ácidos nucleicos muestra altera el fenotipo del huésped. Mediante el uso de cualquiera de una variedad de ensayos in vi tro y/o in vivo para la actividad biológica, el fenotipo alterado se identifica y analiza y la función y la función es con ello asignada al producto o los productos de los ácidos nucleicos muestra.

Existen diversas ventajas para la presente invención sobre las técnicas actualmente disponibles. El proceso entero conduce por si mismo a la automatización especialmente cuando se ponen en práctica en un formato de 96 pozos u otro formato de múltiples pozos. El cribado de alto rendimiento utilizando un número de diferentes ensayos in vi tro proporciona un medio para obtener eficientemente información de la función en un tiempo relativamente corto. El miembro o los miembros de las bibliotecas del vector HIV recombinante que exhiben o inducen un fenotipo deseado en un hospedero in vi tro o in si tu se identifican para colapsar las bibliotecas a un número manejable de vectores adenovirus recombinante o clones que puedan ser analizados in vi tro en un modelo animal. Otra ventaja diferente de la presente invención es que los métodos producen bibliotecas de adenovirus libres de Lentivirus Competente de replicación (RCL) . La contaminación RCL a lo largo de las bibliotecas seria un obstáculo importante especialmente si las bibliotecas se amplifican continuamente para uso en múltiples programas de cribado.

Otra modalidad es un vector lentiviral que expresa el gen de glutaminas sintetasa (GS) con el gen de la proteina recombinante o anticuerpo monoclonal compuesto. Se sabe que la GS es un metabolito muy importante y da como resultado fuerte selección de células que muestran alta expresión de la proteina recombinante o anticuerpo monoclonal. El vector HIV contendría el gen de la proteina recombinante y el gen de GS en el mismo vector. En otra versión, una pluralidad de vectores que contienen la proteina recombinante, GS u otro gen que favorezca el rendimiento de la proteina reco binante también es una modalidad preferida de la invención. Otros métodos de selección pueden ser utilizados, incluido pero no limitado a la expresión del gen marcador de superficie, puromicina y otros métodos.

La presente invención también describe un método para aislar genes para aumentar los rendimientos de la producción de una proteina, una vacuna o un anticuerpo monoclonal utilizando métodos de alto rendimiento antes descritos. Una biblioteca de vectores lentivirales o HIV que expresan los cDNA ó RNAi se construye con la proteina recombinante o anticuerpo monoclonal expresado en un vector lentiviral o HIV separado o el vector que contiene la biblioteca de los cDNA o RNAi (incluidos los shRNAi y ddRNAi u otros inhibidores de la expresión génica como los ribositas, antisentido, aptámeros, proteinas mutantes transdominantes y similares) . El vector se produce y adiciona a las células utilizadas para fabricar la proteina y células individuales clonadas que expresan la proteina recombinante utilizando un formato de alto rendimiento antes descrito. La cantidad de producción de proteina puede medirse por los métodos conocidos en la técnica y los clones que expresan elevados niveles de proteina pueden ser identificados. El cDNA o RNAi especifico de la biblioteca puede ser amplificado utilizando cebadores específicos del vector como antes se describió y se caracteriza la secuencia. Este cDNA o RNAi entonces puede utilizarse para aumentar la producción de otras proteinas o anticuerpos monoclonales incluyéndolo en cada constructo de vector HIV, o mediante la construcción de lineas de células que ahora expresen constitutivamente el cDNA o RNAi identificado.

Otro aspecto de la presente invención es un vector lentiviral que expresa un RNAi dirigido a un gen de proteasa, con la proteina recombinante, gen de anticuerpo monoclonal o vacuna propuestos. Se sabe que las profesas disminuyen significativamente el rendimiento de la proteina recombinante o anticuerpo monoclonal propuesto durante el proceso de purificación. El vector HIV contendría el gen de la proteina recombinante y un RNAi para uno o más genes de proteasas en el mismo vector. En otra versión, una pluralidad de vectores que contienen la proteina recombinante, un RNAi anti-proteasa u otro gen que favorezca el rendimiento de la proteina recombinante durante el proceso de purificación también es una modalidad preferida de la invención.

La presente invención también proporciona los métodos para aislar genes para aumentar los rendimientos de la producción de la proteina o anticuerpo monoclonal durante el proceso de purificación corriente abajo inhibiendo las proteinas que afectan el rendimiento durante su purificación. Este método es muy manejable frente a los métodos de alto rendimiento antes descritos.

Por lo menos una sola biblioteca de vectores lentivirales o HIV que expresan cDNA o RNAi se construye con la proteina recombinante o anticuerpo monoclonal expresado en un vector lentiviral o HIV o el vector que contiene la biblioteca de los cDNA o RNAi. El vector se produce y adiciona a las células utilizadas para aplicar la proteina y células individuales clonadas que expresan la proteina recombinante utilizando un formato de alto rendimiento antes descrito. La proteina recombinante o anticuerpo monoclonal entonces se purificada y se mide el rendimiento mediante los métodos conocidos en la técnica. Se identifican los clones de células especificas que contienen proteina o anticuerpo monoclonal de alto rendimiento. El cDNA o RNAi especifico de la biblioteca puede ser amplificado utilizando cebadores específicos del vector como ya se describió y se caracteriza la secuencia. Este cDNA o RNAi entonces puede utilizarse para aumentar la producción de otras proteinas o anticuerpos monoclonales incluyéndolo en cada constructo de vector HIV o construyendo lineas de células que ahora expresen constitutivamente el cDNA o RNAi identificado.

Una modalidad es también un vector lentiviral que expresaun cDNA o un RNAi que inhibe un contaminante viral, prion o bacteriano potencial de la linea de células que esta produciendo el anticuerpo monoclonal, proteina o vacuna, un ejemplo no limitativo es un RNAi que es expresado en el vector lentiviral de expresión de la proteina y esta dirigido al agente de Encefalopatía Espongiforme Bovina, o el agente de la Enfermedad de Creutzfeld-Jacob (CJD) , un contaminante potencial de las preparaciones durante la fabricación de productos biológicos. La expresión del RNAi anti-BSE o anti-CJD llevar al minimo el riesgo de contaminación de la preparación mediante el agente BSE o CJD, y por tanto, aumentará la seguridad de tales preparaciones biológicas manipuladas. El vector HIV contendría el gen de la proteina recombinante y un RNAi para uno o más agentes que sean de interés para la contaminación. En otra versión, una pluralidad de vectores que contengan la proteina recombinante, un RNAi anti-agente u otro gen que inhiba la replicación del agente también es una modalidad preferida de la invención. La invención también puede modificarse para incluir un gen o RNAi para llevar al minimo la producción de algún gen que sea considerado perjudicial o adverso para la producción y calidad del producto recombinante.

Los vectores lentivirales también pueden utilizarse para generar una biblioteca de lineas de células que difiere en la sobre expresión o inhibición de uno o una pluralidad de genes. Una pluralidad de vectores que expresen genes se adiciona a las células para obtener una célula deseada con un fenotipo especifico. Los genes pueden ser clonados corriente arriba a partir de un gen marcador fluorescente utilizando elementos como el elemento IRES, antes descrito como un ejemplo, de modo que el marcador y el gen de interés pueda ser traducido a partir del mismo mRNA. Las células son clonadas, preferentemente por métodos de alto rendimiento antes descritos, y las células con la combinación correcta de genes sobre expresada y otros genes con regulación descendente por inhibición mediada por el RNAi . Uno de los genes proferidos podria ser un gen que inmortalice las células, si el material inicial es una célula primaria, como puede ser la expresión de la transcriptasa inversa telomerasa (TERT) u otros métodos como se describe en las patentes (US6886159 ó 6358739) . Sin embargo, cualquier célula, incluidas las lineas de células existente pueden utilizarse como material inicial.

Otra modalidad ejemplar es la modificación genéticas de las células con una pluralidad de vectores lentivirales que comprende los genes expresados de interés y/o inhibidores de la expresión génica, y luego los clones de células se aislan utilizando métodos de rendimiento para aislar un clon de células con un genotipo y/o fenotipo deseado.

La presente invención también proporciona los métodos de identificación de un compuesto de prueba como afectando selectivamente un gen que interesa o sus productos de expresión o genes corriente abajo o proteinas en su via que consiste en cultivar una pluralidad de vectores lentivirales con células para modificarlas genéticamente para mantener un gen que sobre exprese un gen que interese y; sobre expresar por lo menos un segundo gen, o por lo menos una secuencia inhibidora para un segundo gen que interese, en donde la pluralidad de células entonces se aisla por los métodos de alto rendimiento para aislar un clon de células con un genotipo y/o fenotipo deseado.

La presente invención también proporciona los métodos de identificación de un agente que altera el nivel de proteina o expresión génica en una célula de mamifero donde el método consiste en modificar genéticamente una población de células con una pluralidad de vectores lentivirales con células para modificarlas genéticamente para contener un gen que sobre exprese un gen que interese y; sobre expresar por lo menos un segundo gen, o por lo menos una secuencia inhibidora para un segundo gen que interese, en donde la pluralidad de células entonces se clona para aislar un clon de células con un genotipo o fenotipo deseado; y luego incubar las células en presencia de un agente candidato y determinar los efectos del agente candidato sobre las células.

Otro aspecto de la presente invención es un vector lentiviral que expresa un cDNA o un RNAi que estimula la respuesta inmune. Una modalidad preferida es un vector HIV que expresa GM-CSF, CD40L y/o cualquier citocina o estimulante de la respuesta inmune. El vector puede ser uno que movilice o un vector que no movilice, dependiendo de la intención deseada para el tratamiento o vacunación. Además, del gen de citocina, un gen suicida puede ser insertado en el vector para inducir apoptósis en células que contengan el vector después de la administración de un profármaco.

Otra modalidad es el uso de un vector lentiviral para el descubrimiento de interacciones novedosas proteina-proteina en células de mamifero utilizando la tecnología de dos híbridos. Un ejemplo es proporcionado por Promega Corporation (www.promega.com). Los sistemas de dos híbridos son métodos extremadamente poderosos para detectar interacciones proteina: proteina in vivo. La base de los sistemas de dos híbridos es el dominio molecular encontrado en algunos factores de transcripción. En el sistema de dos híbridos de mamifero CheckMate™, el vector pBIND contiene el dominio de unión GAL4 DNA de levadura corriente arriba de una región de clonación múltiple, y el vector pACT que contiene el dominio de activación VP16 de virus herpes simple corriente arriba de una región de clonación múltiple. Además, el vector pBIND expresa la Renilla reniformes luciferasa, la cual permite al usuario normalizar la eficiencia de la transfección. Los dos genes que codifican las dos proteinas potencialmente interactivas que interesan se clonan en vectores pBIND y pACT para generar proteinas de fusión con el dominio de unión del DNA de GAL4 y el dominio de activación de VP16, respectivamente. El vector pG51uc contiene cinco sitios de unión GAL4 corriente arriba de la caja TATA minima, que a su vez esta corriente arriba del gen de luciferasa de luciérnaga (luc+) . Los constructos de fusión pGAL4 y pVPlß se transfectan junto con el vector pG51uc en células de mamifero. Dos a tres dias después de la transfección, las células son usadas, y las cantidades de Renilla luciferasa y luciferasa de luciérnaga se cuantifican utilizando el sistema de ensayo Dual-Luciferase® Repórter Assay System. La interacción entre las dos proteinas de prueba, como los constructos de fusión GAL4 y VP16, da como resultado un aumento en la expresión de la luciferasa de luciérnaga sobre los controles negativos. Un sistema de dos híbridos como tal podria fácilmente ser adaptado en un vector lentiviral para tamizaje directo de las interacciones proteina-proteina en células de mamifero.

Los encabezados de los temas establecidos antes se entienden como guias donde cierta información puede encontrarse en la solicitud, pero no están destinados a ser la única fuente en la solicitud donde puede encontrarse información sobre tales temas . Toda la descripción de todas las solicitudes, patentes y publicaciones antes mencionadas se incorporan por este medio para referencia en su totalidad. Las Solicitudes Provisionales US Nos. 60/653,386, presentada el 16 de febrero de 2005; 60/660,310, presentada el 10 de marzo de 2005; 60/682,059, presentada el 18 de mayo de 2005 y 60/723,768, presentada el 5 de octubre de 2005, se incorporan por este medio como referencia en su totalidad.

Claims (44)

REIVINDICACIONES

1. Un plásmido cooperador lentiviral que comprende: a) 5' LTR de lentivirus que comprenden un promotor nativo funcional ligado de manera operante a una secuencia polinucleotidica que codifica para gag y pol de lentivirus, y una señal poli A heteróloga que es efectiva para terminar la transcripción inducida por el promotor nativo; b) promotor heterólogo ligado de manera operante a una secuencia codificadora de la envoltura, y una señal poli A heteróloga que es eficaz para terminar la transcripción inducida por el promotor heterólogo. en donde los promotores nativo y heterólogo están presentes en el plásmido en orientaciones transcripcionales contrarias, y el plásmido está carente de una secuencia de empaquetamiento funcional.

2. El plásmido cooperador lentiviral de la reivindicación 1, caracterizado porque el plásmido comprende un elemento TAR que se obtiene a partir de una especie lentiviral diferente que la 5' LTR y comprende un elemento RRE que se obtiene a partir de una especie lentiviral diferente que la 5' LTR.

3. El plásmido cooperador lentiviral de la reivindicación 1, caracterizado porque la 5' LTR es nativa .

4. El plásmido cooperador lentiviral de la reivindicación 1, caracterizado porque el plásmido además comprende una secuencia polmucleotídica expresable que codifica para el polipéptido Tat o el polipéptido Rev que esta ligado de manera operante a un promotor.

5. El plásmido cooperador lentiviral de la reivindicación 1, caracterizado porque la 5' LTR es HIV-1 o HIV-2,

6. El plásmido cooperador lentiviral de la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia polmucleotídica que codifica para gag y pol lentiviral es gag y pol de HIV-1 o gag y pol de HIV-2.

7. El plásmido cooperador lentiviral de la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia polmucleotídica que codifica para gag y pol comprende por lo menos un codón que no se encuentra en estado natural para mejorar la traducción de la secuencia codificadora cuando se expresa en un hospedero compatible.

8. El plásmido cooperador lentiviral de la reivindicación 1, caracterizado porque una secuencia polmucleotídica esta presente entre las secuencias pol y codificada de la envoltura, el cual es un codón de terminación, o, una secuencia codificadora KETWETWWTE de p7.

9. El plásmido cooperador lentiviral de la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia que codifica la envoltura es para la envoltura VSV-G o una envoltura de filovirus.

10. El plásmido cooperador lentiviral de la reivindicación 1, además comprende un polmucleótido antisentido que es eficaz para inhibir la traducción de la secuencia que codifica la envoltura.

11. Un vector lentiviral de transferencia que comprende: a) 5' LTR de lentivirus b) secuencia lentiviral de empaquetamiento distal para la 5' LTR. c) 3' LTR modificada de lentivirus que comprende la secuencia de la caja TATA, pero esta carente de las secuencias 3' U3 5' para las secuencias de la caja TATA, en donde la 3' LTR tiene reducida actividad de transcripción.

12. El vector lentiviral de transferencia de la reivindicación 1, además comprende d) el promotor heterólogo ligado de manera operante a una secuencia polinucleotídica heteróloga.

13. El vector lentiviral de transferencia de la reivindicación 12, caracterizado porque las secuencias 3' U3 carentes son 5' para dentro de 20 nucleótidos de las secuencias de la caja TATA.

14. El vector lentiviral de transferencia de la reivindicación 12, caracterizado porque la 3' LTR además comprende un segundo promotor heterólogo ligado de manera operante a una segunda secuencia polinucleotídica heteróloga, caracterizado porque el promotor y la secuencia polinucleotídica heteróloga están insertados en la 3' LTR en una posición que es eficaz para reducir la actividad de transcripción de la 3' LTR.

15. El vector lentiviral de transferencia de la reivindicación 12, además comprende un segundo promotor heterólogo ligado de manera operante a una secuencia heteróloga que codifica para un segundo gen que interesa .

16. El vector lentiviral de transferencia de la reivindicación 16, caracterizado porque la primera y segunda secuencias codificadoras heteróloga están separadas por un sitio de entrada del ribosoma interno.

17. El vector lentiviral de transferencia de la reivindicación 16, caracterizado porque cada una de las secuencias codificadoras heterólogas además comprenden una señal poli A heteróloga que es eficaz para terminar la transcripción inducida por los promotores.

18. Un sistema de empaquetamiento de lentivirus para producir un vector transductor de lentivirus que comprende a) un plásmido cooperador lentiviral de la reivindicación 1, b) un vector lentiviral de transferencia de la reivindicación 12, y c) un plásmido que comprende una secuencia codificadora para un polipéptido rev ligado de manera operante a un promotor heterólogo, y una secuencia codificadora para un polipéptido tat ligado de manera operante a un promotor heterólogo.

19. Una célula aislada comprende el vector cooperador de la reivindicación 1.

20. Una célula aislada que comprende el vector de transferencia de la reivindicación 12.

21. Una célula aislada que comprende el sistema de empaquetamiento de lentivirus de la reivindicación 19.

22. Un método para producir un vector lentiviral de transducción, que comprende: la co-expresión de los plásmidos que comprenden el sistema de empaquetamiento de la reivindicación 19 en una célula hospedera en condiciones eficaces para producir un vector de transducción.

23. Un método para fabricar un polinucleótido que interese en una célula hospedera, que consiste en: transducir una célula hospedera con un vector de transducción de lentivirus para formar una célula hospedera transducida, en donde el vector comprende un polinucleótido heterólogo expresable que codifica para un polipéptido heterólogo secretado que interese .

24. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque la célula hospedera una célula CHO o una 293.

25. El método de la reivindicación 24, además comprende el cultivo de la célula hospedera transducida en condiciones eficaces para producir el polipéptido de interés .

26. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque la célula hospedera se transduce con una pluralidad de vectores de transducción de lentivirus, en donde cada vector comprende un polinucleótido heterólogo diferente que codifica para un polipéptido diferente.

27. El método de la reivindicación 27, caracterizado porque cada polinucleótido heterólogo codifica para al menos un polipéptido de cápside de una cápside de virus, el cual cuando se expresa en la célula hospedera, se autoensambla en la cápside viral .

28. El método de la reivindicación 28, caracterizado porque por lo menos un polinucleótido codifica para un polipéptido hemaglutinina o una neuranimidasa de un virus de influenza.

29. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque la célula hospedera se transduce con polinucleótidos que codifican para hemaglutinina, neuranimidasa y polipéptidos de matriz. (Ml) .

30. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque cada polinucleótido esta presente en un vector de transducción viral diferente.

31. Un producto de la reivindicación 30.

32. Un método para identificar polipéptidos o genes que mejorar la fabricación de polipéptidos en células hospederas, que consiste en: producir una pluralidad de células hospederas transducidas, cada célula siendo transducida con al menos dos transducción de lentivirus diferentes que comprenden polinucleótidos heterólogos expresables que difieren entre sí en su secuencia, y el cribado de las células hospederas para una actividad de funcionalidad asociado con la secuencia heteróloga .

33. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque la secuencia heteróloga es una secuencia RNAi, una secuencia codificadora para un polipéptido o un antisentido para un gen que interese 30. En un vector de transducción lentiviral, el mejoramiento comprende un polinucleótido heterólogo insertado en una 3' LTR, donde cada inserción da como resultado una 30 LTR con actividad transcripcional mínima.

34. Un método de tratamiento de enfermedad GVHD asociada con trasplante de linfocitos donadores en un hospedero, que comprende: transducir linfocitos donadores con un vector de transducción lentiviral que comprende una secuencia polinucleotídica expresable o selectivamente expresable que codifica un elemento citostático o citotóxico. como una opción, transducir las células en presencia de polipéptidos o células receptores, y e infundir los linfocitos transducidos en el hospedero .

35. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque el gen selectivamente expresable esta ligado de manera operante a un promotor inducible o un promotor que se activa en presencia de un químico exógenamente inducido .

36. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque el selectivamente expresable codifica para un RNAi o polipéptido pro apoptótico.

37. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque el elemento citotóxico es una secuencia codificadora para el gen de timidina cinasa de herpes o una cinasa multisustrato .

38. El método de la reivindicación 38, además comprende la administración de una cantidad eficaz de ganciclovir, AZT, florada® o aciclovir, en donde la cantidad es eficaz para dar como resultado la muerte celular de la célula huésped transducida.

39. El método de la reivindicación 35, además comprende poner en contacto las células donadoras con una cantidad eficaz de un auto antígeno hospedero al mismo tiempo o antes de translucir las células donadoras.

40. Un vector de expresión que comprende: a) 5' LTR de lentivirus que comprende un promotor nativo funcional ligado de manera operante a una secuencia polinucleotídica que codifica para una gag y pol de lentivirus, nativa, y una señal poli A heteróloga que es eficaz para terminar la transcripción inducida por el promotor nativo, en donde una señal de terminación de la transducción esta presente corriente abajo del inicio de la secuencia gag-pol, b) un sitio aceptor de empalme ubicado corriente abajo de las secuencias gag-pol, y c) una secuencia polinucleotídica heteróloga ubicada corriente abajo para la secuencia gag-pol que esta ligada de manera operante al promotor 5' LTR.

41. Un vector lentiviral de transducción que comprende un receptor de células T y un elemento citotóxico.

42. Una línea de células de empaquetamiento o productora del vector lentiviral que expresa una secuencia inhibitoria o silenciadora del gen inducible dirigida a VSV-G.

43. Un método de transducción de una población de linfocitos de sangre periférica con un vector lentiviral, en donde la población de linfocitos no esta purificada en subpoblaciones antes de la transducción con el vector lentiviral .

44. Un método para tratar cáncer utilizando vectores lentivirales, donde las células madre son tratadas con un vector lentiviral que expresa un elemento citotóxico que esta ligado de manera operante a un promotor específico endotelial, y donde las células madre son infundidas en un paciente con cáncer.