JP2010512782A

JP2010512782A - Ｈｉｖのｎｃ蛋白質発現用ベクター及びこれを利用したｎｃ蛋白質の生産方法

Info

Publication number: JP2010512782A
Application number: JP2009542650A
Authority: JP
Inventors: ジチャンユウ，
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-12-20
Filing date: 2007-12-20
Publication date: 2010-04-30
Also published as: GB0912575D0; GB2458419A; US20100047865A1; WO2008075911A1; US9738905B2; GB2458419B

Abstract

本発明はＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクター及びこれを利用したＮＣ蛋白質の生産方法に関する。より詳細には、本発明はイントロン配列、ＮＣ遺伝子、その下流にｍＲＮＡ安定化因子を順次連結させたことを特徴とするＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクター及びこれを利用したＮＣ蛋白質の生産方法に関する。本発明のイントロン配列、ＮＣ遺伝子、その下流にｍＲＮＡ安定化因子を順次連結させたことを特徴とするＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクターは、動物細胞において天然型のＮＣ蛋白質を発現させることができ、その発現効率が従来技術に比べて向上されるという効果を有する。

Description

本発明はＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクター及びこれを利用したＮＣ蛋白質の生産方法に関する。より詳細には、本発明はＮＣ遺伝子の上流にイントロン配列を、ＮＣ遺伝子の下流にｍＲＮＡ安定化因子（ｍＲＮＡｓｔａｂｉｌｉｔｙｅｌｅｍｅｎｔ）を順次連結させたことを特徴とするＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクター及びこれを利用したＮＣ蛋白質の生産方法に関する。

ＨＩＶ（ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ）のヌクレオキャプシド蛋白質（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ，以下、“ＮＣ”と命名する）は、ウィルス集合（ｖｉｒｕｓａｓｓｅｍｂｌｙ）の構造的役割、およびウィルスの生活周期（ｖｉｒａｌｌｉｆｅｃｙｃｌｅ）において機能的に重要な役割をする。これについて以下に述べる。第１に、ＮＣ蛋白質はウィルスのゲノムのカプシド形成（ｇｅｎｏｍｉｃｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）に関与する。このような機能は独特なＣｙｓ−Ｘ２−Ｃｙｓ−Ｘ４−Ｈｉｓ−Ｘ４−Ｃｙｓモチーフ（ＣＣＨＣモチーフ）からなる２個のジンクフィンガードメインに起因する。前記ドメインは全てのレトロウィルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）において高い保存性を示し、ＨＩＶＲＮＡパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）と感染性ウィルス生産に必須的なものとして知られている。第２に、ＮＣ蛋白質はウィルスの逆転写反応（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ＲＴ）の間、ｔＲＮＡプライマーアニリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）と鎖転移（ｓｔｒａｎｄｔｒａｎｓｆｅｒ）を促進することが知られている。これよりＮＣ蛋白質がウィルス複製（ｖｉｒａｌｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に重要な機能をすると言うことが分かる。第３に、ＮＣ蛋白質はウィルスの生活周期に必要な核酸シャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）活性を有する。最近ではウィルスＤＮＡが宿主細胞染色体に挿入される時にも、ＮＣ蛋白質が所定の役割を担当するとして報告されている。従って、このようなＮＣ蛋白質に対する研究は、ＨＩＶ生活周期においてＮＣ蛋白質が有する生物学的機能の解明ばかりでなく、核心的なＨＩＶ蛋白質に対する効果的な抗ウィルス剤を開発する面においても極めて重要であると言える。

生体内でのＮＣ蛋白質の生物学的機能を理解する為に欠くことのできないことは、動物細胞中にＮＣ蛋白質を効果的に発現させる方法を開発することである。しかしながら、ウィルスのコドン活用（ｃｏｄｏｎｕｓａｇｅ）が動物細胞のコドン活用と異なるか、またはウィルス遺伝子内に阻害配列（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＩＮＳ）を含むとの理由から、動物細胞内におけるＨＩＶの他の構造蛋白質の発現が制限される場合がある。ＮＣ蛋白質の場合には、ＨＩＶの他の構造蛋白質とは異なり、ＩＮＳを含まないにも拘らず、動物細胞における発現が著しく低いと言う問題点があった。従って、大部分のＮＣ蛋白質に対する研究等が大腸菌より発現させた組替えＮＣ蛋白質を利用するか、又は遺伝子分析を利用して行なわれてきた。

一方、宿主において、まれなコドンを宿主が選好するコドンに変化（コドン−最適化（ｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ）させ、異種発現の水準が増進された例が多くある。例えば、ＢＰＶ（牛パビロマウィルス）の後期遺伝子であるＬ１及びＬ２は、哺乳動物コドン利用度パターンに対して、コドン最適化がなされ、これにより哺乳動物（Ｃｏｓ−１）細胞培養液で野生型ＨＰＶ配列より増加した水準で発現されたことが報告されている（Ｚｈｏｕｅｔａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７３, ４９７２−４９８２, １９９９）。前記技術では哺乳動物におけるより、ＢＰＶで出現頻度が２倍を越える全てのＢＰＶコドン（利用率＞２）、及び利用率が１．５を超過する大部分のコドンを、哺乳動物において優勢して使用されるコドンに保存的に置換した。さらに、ＷＯ９７／３１１１５号、ＷＯ９７／４８３７０号及びＷＯ９８／３４６４０号（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ）において、ＨＩＶ遺伝子又はその断片のコドン最適化は蛋白質発現の増加を招き、最適化操作の対象である宿主哺乳動物において、ＤＮＡワクチンとしてコドン最適化配列を使用した場合に、免疫原性が向上されたことが開示されている。

本発明者等はこのような点に着目して、前記提示された問題点を克服できるＨＩＶＮＣ蛋白質の生産方法を研究し、コドン最適化のみによっては天然型のＮＣ蛋白質を発現させることはできず、ＮＣ遺伝子の上流にイントロン配列を、ＮＣ遺伝子の下流にｍＲＮＡ安定化因子（ｍＲＮＡｓｔａｂｉｌｉｔｙｅｌｅｍｅｎｔ）をそれぞれ追加的に連結させることにより、天然型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）のＮＣ蛋白質を発現させることができ、その発現効率が顕著に向上することを見出し、本発明を完成した。

ＷＯ９７／３１１１５号ＷＯ９７／４８３７０号ＷＯ９８／３４６４０号

Ｚｈｏｕｅｔａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７３, ４９７２−４９８２, １９９９

従って、本発明の目的はＮＣ遺伝子の上流にイントロン配列を、ＮＣ遺伝子の下流にｍＲＮＡ安定化因子をそれぞれ追加的に連結させたことを特徴とする、ＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクター及びこれを利用したＮＣ蛋白質の生産方法を提供することである。

前記のような目的を達成する為に、本発明はＮＣ遺伝子の上流にイントロン配列を、ＮＣ遺伝子の下流にｍＲＮＡ安定化因子をそれぞれ追加的に連結させたことを特徴とするＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクターを提供する。
さらに、本発明は前記ベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
さらに、本発明は前記ベクターを利用するＨＩＶのＮＣ蛋白質の生産方法を提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。
ＨＩＶヌクレオキャプシド（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ，ＮＣ）蛋白質の生産は、効果的な抗ウィルス剤の開発に極めて重要とは言えるものの、今まで動物細胞において、ＨＩＶＮＣ蛋白質を発現させることは極めて困難であった。本発明者等はこれを改善する為に、研究を重ねていく中で、本イントロン配列、ＮＣ遺伝子、およびその下流にｍＲＮＡ安定化因子を追加的に連結させたＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクターを利用すると、ＨＩＶＮＣ蛋白質の発現が著しく改善される効果があることを見出した。

従って、本発明はイントロン配列、ＨＩＶＮＣ遺伝子及びｍＲＮＡ安定化因子が順次連結されたことを特徴とするＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターを提供する。

より具体的には、ａ）ＳＶ４０１９ｓｍＲＮＡイントロン配列、変性された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＳＶ４０１６ＳｍＲＮＡイントロン配列及びβ−グロビンイントロン配列からなる群より選ばれたいずれか一つの配列、）ＨＩＶＮＣ遺伝子；及びｃ）ｍＲＮＡ安定化因子が、順次連結されたことを特徴とするＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターを提供する。

用語“ＨＩＶのＮＣ蛋白質”とはＡＩＤＳ（ａｃｑｕｉｒｅｄＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ，後天性免疫不全症候群）を引起こす病原体であるＨＩＶのヌクレオキャプシド蛋白質を意味し、前記蛋白質はウィルスゲノムＲＮＡに強く結合して、リボ核酸蛋白質コア複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｃｏｒｅｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する。本発明の一実施例で発現されるＨＩＶＮＣ蛋白質配列はＡＲＶ２／ＳＦ系統由来であり、ＧｅｎｅＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｐ０３３４９の３８０番目−４３４番目アミノ酸配列として開示されている。一方、本発明の一実施例で使用したＮＣ遺伝子配列は、ｐＪＣ１ベクターから由来する（ＨＩＶＮｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄＰｒｏｔｅｉｎ；ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１６５１９−１６５２７．１９９３）。

本発明で用語“発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）”とは、細胞中での蛋白質又は核酸の生成を意味する。

本発明で用語“発現用ベクター”とは、適当な宿主細胞において目的蛋白質又は目的ＲＮＡを発現できるベクターにして、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された本質的な調節要素を含む遺伝子構造物を言う。

本発明の発現用ベクターにおいてＨＩＶＮＣ蛋白質の発現の為に、本発明のイントロン配列、ＨＩＶＮＣ遺伝子及びｍＲＮＡ安定化因子が順次連結された構造遺伝子にプロモーターが作動可能に連結される。前記“プロモーター”とは、特定した宿主細胞で作動可能に連結された核酸配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味し、全ての時間帯に常時的に目的遺伝子の発現を誘導するプロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）又は特定した位置、時期に目的遺伝子の発現を誘導するプロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｍｏｔｅｒ)を使用できる。

本発明で用語“作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）”とは、一般的機能を遂行するように核酸発現調節配列と、目的とする蛋白質又はＲＮＡをコーディングする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｉｎｋａｇｅ）されていることを言う。例えば、プロモーターと、蛋白質又はＲＮＡをコーディングする核酸配列とが作動可能に連結され、コーディングする核酸配列の発現に影響を及ぼす。組替えベクターとの作動可能な連結は当該技術分野で公知の遺伝子組替え技術を利用して組み替えることができ、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術分野で一般的に公知の制限酵素等を使用する。

本発明のベクターの例としてはプラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクター及びウィルスベクター等があげられるが、これらには制限されない。好ましい発現ベクターとしてはプロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル及びインハンサのような発現調節エレメント等があげられる、目的に応じて多様なベクターが製造できる。好ましくは、本発明のベクターは図２又は図４に記載されたｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＮＣ／ＲＲＥベクター、又はｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＯｐｔｉＮＣ／ＲＲＥベクターであることができる。

本発明において前記イントロン配列としては、当業界に公知のものを使用することができ、例えば、ＳＶ４０１９ｓｍＲＮＡイントロン配列、変性されたＳＶ４０１６ＳｍＲＮＡイントロン配列及びβ−グロビンイントロン配列等がある。好ましくは、配列番号８で表示されるＳＶ４０１９ｓｍＲＮＡイントロン配列、配列番号９で表示される変性されたＳＶ４０１６ＳｍＲＮＡイントロン配列及び配列番号１０で表示されるβ−グロビンイントロン(β− ｇｌｏｂｉｎｉｎｔｒｏｎ)配列を使用できる。

本発明の一実施例で使用したイントロン配列は、ｐＣＭＶ−ＨＡ（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）ベクターのイントロン配列（ＳＶ４０スプライスドナー／スプライスアクセプター（ｓｐｌｉｃｅｄｏｎｏｒ／ｓｐｌｉｃｅａｃｃｅｐｔｏｒ）；以下、“ＳＶ４０ＳＤ／ＳＡ”と表示する）から由来したものである。前記ベクターの６７２−７０２番目はＳＶ４０１９ＳｍＲＮＡイントロン配列であり、６７２−７６８番目は変性されたＳＶ４０１６ＳｍＲＮＡイントロン配列である。

一方、本発明においては、配列番号４のアミノ酸配列を有するＨＩＶのＮＣ蛋白質を発現することができる限り、ＨＩＶのＮＣ蛋白質をコーディングするすべてのＨＩＶＮＣ遺伝子を使用することができ、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７からなる群から選択される任意のヌクレオチド配列を有するか、又は野生型のＨＩＶＮＣ遺伝子でもあり得る。好ましくは本発明のＨＩＶＮＣ遺伝子は、哺乳動物細胞において高発現されるようにコドン−最適化させたものである。より具体的には、遺伝子は配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７からなる群より選ばれた、いずれか一つのヌクレオチド配列を有する。

本発明で用語“コドン−最適化”とは、各種宿主の形質転換の為の核酸分子のコーディング領域又は遺伝子に関し、ＤＮＡによりエンコードされたポリペプチドを変化させずに、宿主生命体の典型的なコドン活用を反映するように前記核酸分子のコーディング領域、又は遺伝子内のコドンを変化させることをいう。本発明の文脈から遺伝子及びＤＮＡコーディング領域を、表１及び表２を利用して哺乳動物細胞における最適の発現の為、コドン−最適化させる。

コドン−最適化はＤＮＡ全部（又は一部分）を合成して、転写されたｍＲＮＡに存在することもあり得る、２次構造の全ての脱安全化配列又は領域を除去することもでき、ＤＮＡ全部（又は一部分）を合成して、宿主細胞において塩基組成をより好ましい物に変化させることもできる。

本発明では、Ｕｐｇｅｎｅ：ＡＷｅｂ−ＢａｓｅｄＤＮＡＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＡｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＷｅｎｔａｏＧａｏ，ＡｌｅｘｉｓＲｚｅｗｓｋｉ，ＨｕｉｊｉｅＳｕｎ，ＰａｕｌＤ．ＲｏｂｂｉｎｓａｎｄＡｎｄｒｅａＧａｍｂｏｔｔｏ）と、ＧｅｎＳｅｒｉｐｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）のコドン頻度表を利用してＮＣコドンを最適化し、これを介して配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７で表示される哺乳動物細胞において、高発現するようにコドン−最適化させたＨＩＶＮＣポリヌクレオチド配列を得ることができた（実施例１参照）。

前記「ｍＲＮＡ安定化因子」とは、ｍＲＮＡの３′末端に結合して安定性を増加させる安定化因子（ｓｔａｂｉｌｉｔｙｅｌｅｍｅｎｔ）を言い、好ましくは、ＲＲＥ（Ｒｅｖｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ）、ＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔ）、ベータ−アクチン３′−ＵＴＲ(未翻訳領域)（β−ａｃｔｉｎ３′−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｓ）及びＲＳＶ安定化因子（ＲｏｕｓＳａｒｃｏｍａＶｉｒｕｓｓｔａｂｉｌｉｔｙｅｌｅｍｅｎｔ）群から選ばれたいずれか一つであることができる。

前記ｍＲＮＡ安定化因子の内、ＲＲＥはＲｅｖ反応因子をいう。ＲＲＥはＨＩＶ−１ＲＮＡのｅｎｖ遺伝子内に存在するシス−アクティングエレメント（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ）であり、Ｒｅｖ蛋白質と直接結合する。ＷＰＲＥはウッドチャック感染ウィルス由来の“ポスト−転写調節要素（ＰＲＥ）”をいい、ポスト−転写水準（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌ）でシス（ｃｉｓ）として作用し、細胞核から細胞質への輸送を調節して細胞質内に遺伝子転写物の蓄積を増加させるウィルス配列をいう。最後にベータアクチン３′−ＵＴＲ及びＲＳＶ安定化因子は両方とも、細胞核で細胞質への輸送を調節するか又は分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を防いで細胞質内に遺伝子転写物の蓄積を増加させる配列である。

本発明の一実施例では、ｍＲＮＡ安定化因子としてＲＲＥ塩基配列を使用した。前記ＲＲＥはＨＩＶＨＸＢ２系統（ｓｔｒａｉｎ）から由来し、ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｋ０３４５５として知られる。前記配列の内、ＲＲＥに該当する７７６９番−８００２番配列を配列番号１１で示した。一方、アッドチャック感染ウィルスＷＨＶ８系統から由来した配列（ＪｏｕｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙＡｐｒ．１９９９，ｐ．２８８６−２８９２）をＷＰＲＥとして使用した。前記の配列の内、ＷＰＲＥに該当する１０９３−１６８４部分を配列番号１２で示した。さらに、ベータ−アクチン３′−ＵＴＲ及びＲＳＶ安定化因子としては、下記文献に記載されている配列を使用できる。（Ｔｈｅ３′−ｅｎｄｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｂｅｔａ−ａｃｔｉｎｇｅｎｅｅｎｈａｎｃｅｓａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｂｅｔａ−ａｃｔｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｉｍｐｒｏｖｅｄｖｅｃｔｏｒ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ＆ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ．３６（１）：６３−７２，１９９７；Ａ３′−ＵＴＲｓｅｑｕｅｎｃｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｓｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃｏｄｏｎｓｉｎｔｈｅｕｎｓｐｌｉｃｅｄＲＮＡｏｆＲｏｕｓｓａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓ．，ＲＮＡ−ＡＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＲＮＡＳｏｃｉｅｔｙ．，１２（１）：１０２−１０，２００６．）。

さらに、本発明の一実施例では、ＳＶ４０ＳＤ／ＳＡイントロン配列、ＨＩＶＮＣ遺伝子及びＲＲＥが順次連結されたＨＩＶＮＣ蛋白質を発現するためのベクターが構築され、前記ベクターで形質転換された形質転換体において、ＮＣ蛋白質が高度に発現されることを確認した（実施例＜３−２＞参照）。

本発明で使用される標準組替えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該分野で広く公知されており、下記文献に記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；ｂｙＳｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）；ａｎｄｂｙＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｂｙＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃ．ａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７））。

本発明はさらに、前記ＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクターで形質転換された細胞を提供する。

ＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターのトランスフェクションは、通常のトランスフェクション方法、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カルシウムホスフェート法、マイクロインジェクション法、ＤＮＡ−含有リポソーム法、リポペクタミン−ＤＮＡ複合体法等の当該技術分野で公知のトランスフェクション方法により行うことができる（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）。

本発明のベクターで形質転換された細胞は、特に限定はされないものの、好ましくはＣＯＳ−７細胞、２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ，ＣＨＯ及びＨｅＬａ等であり、より好ましくはＣＯＳ−７細胞、２９３Ｔ細胞である。

本発明はさらに、前記ベクターで形質転換された細胞を培養する段階を含むＨＩＶＮＣ蛋白質の生産方法を提供する。

本発明の一実施例では、本発明のＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクターで形質転換された２９３Ｔ細胞を、当該技術分野において公知の方法で培養する。その結果、天然型のＨＩＶＮＣ蛋白質が発現されることを確認した（実施例＜３−２＞参照）。

形質転換体において発現された蛋白質は種々の一般的な方法で精製することができ、例えば、塩析（例えば、硫酸アンモニウム沈澱、リン酸ナトリウム沈澱）、溶媒沈澱（アセトン、エタノール等を利用した蛋白質分画沈澱）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー及び限外濾過等の技法を単独又は組合わせで適用して、本発明のＨＩＶＮＣ蛋白質を精製することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．，ＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）。

本発明は哺乳動物細胞において、高度に発現されるようにコドン−最適化させた、ＨＩＶＮＣ蛋白質をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。より具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号３，配列番号５，配列番号６及び配列番号７からなる群より選ばれたいずれか一つの塩基配列からなる。

本発明のイントロン配列、ＮＣ遺伝子、その下流にｍＲＮＡ安定化因子を順次連結させたことを特徴とするＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクターは、動物細胞において天然型のＮＣ蛋白質を発現させることができ、その発現効率が従来技術に比べて向上されるという効果を有する。

図１はＨＩＶＮＣポリヌクレオチドをコドン最適化させる以前と以後の各コドン頻度をグラフで示したものである。図２は本発明に伴うＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＮＣ／ＲＲＥの製造プロセスを示した図である。図３は本発明に伴うＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣの製造プロセスを示した図である。図４は本発明に伴うＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣ／ＲＲＥの製造プロセスを示した図である。図５のＡ及びＣは本発明に伴うＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターで形質転換された細胞において、ＮＣ蛋白質発現量を比較する為のウェスタンブロットした結果であり、図５のＢ及びＤはこれら発現量を数値で定量化した図表である。図６は本発明に伴うＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターの内、βグロビンイントロン（β−ｇｌｏｂｉｎｉｎｔｒｏｎ）を有するベクターによるＮＣ蛋白質発現量をウェスタンブロットで測定した結果である。

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記の実施例は本発明の例示するのみであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
ＯｐｔｉＮＣポリヌクレオチドの合成
哺乳動物細胞において、ＨＩＶＮＣ蛋白質の発現を増加させる為に、ＲＮＡ２次構造、ＧＣ含量及び反復コドン（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｃｏｄｏｎ）が最適化された。本実施例ではＵｐｇｅｎｅ：ＡＷｅｂ−ＢａｓｅｄＤＮＡＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＡｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＷｅｎｔａｏＧａｏ，ＡｌｅｘｉｓＲｚｅｗｓｋｉ，ＨｕｉｊｉｅＳｕｎ，ＰａｕｌＤ．ＲｏｂｂｉｎｓａｎｄＡｎｄｒｅａＧａｍｂｏｔｔｏ）と、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）のコドン頻度表を利用してＮＣコドンを最適化した。

先ず、ＨＩＶ−１ＮＣオリジナル塩基配列を下記表１に開示したＵｐｇｅｎｅと、ＧｅｎＳｅｒｉｐｔのコドン使用頻度アルゴリズムを利用してコドン−最適化し、それぞれの確率スコア（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙｓｃｏｒｅ）をＵｐｇｅｎｅのスコアに換算してこれを下記表２に示した。表１と表２を参照して４個のコドン−最適化された、ＮＣポリヌクレオチド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ０１，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ０２，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ０３，Ｕｐｇｅｎｅ）を導出し、この内、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ０１の最適化されたＮＣポリヌクレオチド配列を選択してＧｅｎＳｃｒｉｐｔで合成した。合成されたコドン−最適化させたＮＣポリヌクレオチドの５′末端と、３′末端には、クローニングの為のＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩ制限部位を追加的に挿入した（配列番号１３）。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのコドン使用頻度アルゴリズムを利用して、コドン−最適化されたＮＣポリヌクレオチドであるＧｅｎＳｃｒｉｐｔ０１を配列番号３で、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ０２を配列番号６で、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ０３を配列番号７で示し、Ｕｐｇｅｎｅのコドン使用頻度アルゴリズムを利用してコドン−最適化されたＮＣポリヌクレオチドを配列番号５で示した。

前記にて合成したＨＩＶＮＣポリヌクレオチド（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ０１）のコドン最適化させる以前（図１のＡ）と以後（図１のＢ）各コドン使用頻度を図１に示した。前記図１は自然型ＮＣ及び哺乳動物細胞で使用されるコドン使用頻度によって、コドン最適化されたＮＣ配列において実際に使用されたコドンを百分率で示したものである。

＜実施例２＞
ＨＩＶＮＣ発現用ベクターの製作
＜２−１＞ｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＮＣ／ＲＲＥベクターの構築
ＳＶ４０ＳＤ／ＳＡイントロン配列、ＨＩＶＮＣ遺伝子及びＲＲＥが順次連結されたＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターを構築した。

ベクターの構築過程は図２に示した。先ず、ＲＲＥを増幅させる為に、ｐＬＰ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を鋳型にして正方向プライマー（５′−ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧ−３′；配列番号１）と逆方向プライマー（５′−ＴＡＡＧＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＴＣＣＴＴＴＡ−３′；配列番号２）を使用してＰＣＲした。前記正方向プライマーおよび逆方向プライマー配列内にはＸｈｏＩとＫｐｎＩの制限酵素の部位が存在するように製作した。ＲＲＥを増幅した後、ＸｈｏＩとＫｐｎＩで処理した。前記制限酵素処理された断片を、先に用意しておいたＸｈｏＩとＫｐｎＩで処理されたｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＮＣベクター（韓国登録特許第０５５３１５４号）にクローニングし、これをｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＮＣ／ＲＲＥと命名した。

＜２−２＞ｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣベクターの構築
ＳＶ４０ＳＤ／ＳＡイントロン配列及びコドン最適化されたＨＩＶＮＣ遺伝子が順次連結されたＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターを構築した。

ベクターの構築過程は図３に図示した。前記実施例１で合成されたＯｐｔｉＮＣ遺伝子（配列番号５）をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで制限酵素処理した後、前記制限酵素で処理された断片を、先に用意しておいたＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで処理されたｐＵＣ５７ベクター（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社）にクローニングし、これをｐＵＣ５７／ＯｐｔｉＮＣと命名した。前記ｐＵＣ５７／ＯｐｔｉＮＣとｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＩで切断して、ライゲーションし、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ＯｐｔｉＮＣを製作した。前記ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ＯｐｔｉＮＣをＨｉｎｄIIIとＮｏｔＩで処理した後、切断されたＤＮＡをクリナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で処理した。ｐＣＭＶ（−ＨＡ）ベクター（ＣｌｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）もＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで処理した後、切断されたＤＮＡをクリナウ断片で処理した。前記クリナウ断片で、処理された二つの断片をライゲーションし、これをｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣと命名した。

＜２−３＞ｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＯｐｔｉＮＣ／ＲＲＥベクターの構築
ＳＶ４０ＳＤ／ＳＡイントロン配列、コドン最適化されたＨＩＶＮＣ遺伝子及びＲＲＥが順次連結されたＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターを構築した。ベクターの構築過程は図４に図示した。
先ず、ｐＬＰ／ＯｐｔｉＮＣベクターは下記の通り製造した。ｐＬＰ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、ＰｍｌＩ／ＡｖｒII／ＢｓｐＥＩを処理してＧＡＧ−ＰＯＬ遺伝子を切断した。ＯｐｔｉＮＣ遺伝子は、前記実施例２−２で製造したｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣベクターにおいてＸｍａＩ／ＥｃｏＲＩ処理して収得した。前記ｐＬＰ１ベクターと収得したＯｐｔｉＮＣ遺伝子をクリナウ断片で処理して平滑末端ライゲーション（Ｂｌｕｎｔｅｎｄｌｉｇａｔｉｏｎ）し、これをｐＬＰＯｐｔｉＮＣ／ＲＲＥベクターと命名した。

前記収得されたｐＬＰＯｐｔｉＮＣ／ＲＲＥベクターを、ＸｍａＩ／ＳａｃIIで処理し、ＯｐｔｉＮＣとＲＲＥが連結された遺伝子断片を収得した後、前記収得された断片を先に用意しておいた、ＸｍａＩ／ＳａｃＩＩで処理されたｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣベクターにクローニングし、これをｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＯｐｔｉＮＣ／ＲＲＥと命名した。

＜２−４＞ｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＦＬＡＧＮＣベクターの構築
ｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＦＬＡＧＮＣベクターは下記の通り製造された。ｐＪＣ１（ＨＩＶＮｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄＰｒｏｔｅｉｎ；ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥ．ｃｏｌｉ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１６５１９−１６５２７，１９９３）に制限酵素ＢｇｌｌとＰｓｔｌで処理して収得したＮＣ遺伝子断片を、ＢａｍＨｌとＰｓｔｌで処理したｐＣＭＶＴａｇ２Ｂベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＵＳＡ）に挿入し、ｐＣＭＶＦＬＡＧＮＣベクターを製造した。その後、ｐＣＭＶ（−ＨＡ）ベクターと、ｐＣＭＶＦＬＡＧＮＣベクターに制限酵素ＳａｌI，クリナウ断片、Ｘｈｏｌで順に処理して得たＦＬＡＧＮＣ遺伝子断片を接合させてｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＦＬＡＧＮＣベクターを製造した。

＜実施例３＞
ＨＩＶＮＣ蛋白質の発現
＜３−１＞細胞の形質転換
２３９Ｔ細胞を１％ストレプトマイシン／ペニシリンと、１０％（ｖ／ｖ）牛胚芽血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ（ＤｕｌｂｅｃｃｏＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ′ｓＭｅｄｉｕｍ）培養液で培養した。形質転換１日前に、培養した細胞を１２ウェルプレートにウェル当り１×１０^６個の密度でインキュベートし、６０〜８０％程度の稠密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を呈するように培養した。一方、前記実施例２で製造したｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＮＣ／ＲＲＥ，ｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣ及びｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＯｐｔｉＮＣ／ＲＲＥを１μｇずつ採り、それぞれ２μｌのＪｅｔＰＥＩ製剤（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＩｎｃ）と混合した後、２００μｌの無血清培養液と共に、室温で２０分間反応させた。引続き形質転換させる細胞が入っているウェルを３つの群に分け、細胞培養培地を１ｍｌの無血清培地で交換した。前記無血清培地中の培養細胞に、前記のベクターとＪｅｔＰＥＩ製剤の混合液をそれぞれ添加して、二酸化炭素インキュベータ中で４時間さらに培養した。培養後に細胞培地を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換後、さらに２日間培養して細胞を収得した。

＜３−２＞ＮＣ蛋白質発現確認の為のウェスタンブロット
前記形質転換された細胞からＮＣ蛋白質が発現されるか否かを確認する為に、ウェスタンブロットを行った。先ず、収得された細胞から蛋白質を抽出する為に、各細胞をｌｙｓｉｓ溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１％ソジウムデオキシクロレート（ｓｏｄｉｕｍｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ），１％ＳＤＳ，プロテーゼインヒビターカクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ）で溶解し、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄液を収得した後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。以降、Ａｎｔｉ−ＮＣモノクロナール抗体を利用してウェスタンブロットを行い、その発現量を数値で示した（図５）。

その結果、図５に示した通り、ｍＲＮＡ安定化因子を含むｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＮＣ／ＲＲＥベクターで形質転換された細胞では、１１６．２８ＩＯＤ、最適化ＮＣ蛋白質をコーディングする配列を含むｐＣＭＶ（−ＨＡ）／ＯｐｔｉＮＣベクターに形質転換された細胞では、２６７．８８ＩＯＤ、ｍＲＮＡ安定化因子及び最適化ＮＣ蛋白質をコーディングする配列を同時に含むｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＯｐｔｉＮＣ／ＲＲＥベクターに形質転換された細胞では、５５７．６６ＩＯＤの蛋白質発現量を示した。これは天然型のＮＣ遺伝子が挿入されたｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＮＣに比べて、コドン最適化されたＮＣ遺伝子が挿入されたｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＯｐｔｉＮＣにおいて、その発現量がはるかに向上したことを示したものにして（＃３９３図５Ｃのレーン２及びレーン３），天然型のＮＣ遺伝子をコドン最適化されたＮＣポリヌクレオチドに置換した場合、ＮＣ蛋白質が高い歩溜りで発現できることが確認できた。一方、イントロン下流にＲＲＥ配列が挿入されていないｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＮＣに比べて、ｍＲＮＡ安定化因子を含むｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＯｐｔｉＮＣ／ＲＲＥが遥かに向上されることが確認された（＃３９３図５Ｃのレーン２及４）。さらにＲＲＥ配列がＮＣ蛋白質発現に影響を及ぼし、これはイントロン配列下流にＯｐｔｉＮＣとＲＲＥ配列を共に組合わせて連結する場合、ＮＣ蛋白質の発現量が向上されることを示した。

さらに、本発明のベクターを使用するにことにより、ＮＣポリヌクレオチド上流にＦＬＡＧ遺伝子を追加して連結された（ｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＦｌａｇＮＣ）と類似する天然型のＮＣ蛋白質を発現させ得ることが確認できた。

＜実施例４＞
ｐＬＰＯｐｔｉＮＣ／ＲＲＥベクターを利用したＮＣ蛋白質の生産
イントロン配列としてＳＶ４０１９ｓｍＲＮＡイントロン配列及び変性されたＳＶ４０１６ＳｍＲＮＡイントロン配列の他にも、β−グロビンイントロンを使用した場合にも、ＮＣ蛋白質の発現効率が向上される効果があるか否かを確認する為に、前記実施例＜２−３＞で製造したｐＬＰＯｐｔｉＮＣ／ＲＲＥベクターで、前記実施例＜３−１＞と同一な方法で２９３Ｔ細胞に形質転換させ培養した。ついでＮＣ蛋白質発現可否を確認する為に、前記実施例＜３−２＞と同一な方法によりウェスタンブロットを行った。

実験結果は、図６に示した通り、β−グロビンイントロン配列を使用した場合にも天然型のＮＣ蛋白質を発現させ得ることが確認でき、ＮＣ蛋白質発現量は、ＮＣポリヌクレオチド上流にＦＬＡＧ遺伝子を追加して連結されたもの（ｐＣＭＶ（−ＨＡ）ＦｌａｇＮＣ）と同等であった（図６レーン３及びレーン５）。

前記の通り、イントロン配列、ＮＣ遺伝子、その下流にｍＲＮＡ安定化因子を順次連結させたことを特徴とするＨＩＶのＮＣ蛋白質発現用ベクターは、動物細胞において天然型のＮＣ蛋白質を発現させることができ、その発現効率が従来技術に比べて向上されるという効果を奏する。

Claims

ａ）ＳＶ４０１９ｓイントロン配列、変性されたＳＶ４０１６ＳｍＲＮＡイントロン配列及びβ−グロビンイントロン配列からなる群より選ばれた、いずれか一つの配列、ｂ）配列番号４のＨＩＶＮＣ蛋白質をコーディングする遺伝子；及びｃ）ｍＲＮＡ安定化因子が順次連結されたことを特徴とするＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクター。
前記ＳＶ４０１９ｓｍＲＮＡイントロン配列は、配列番号８からなるヌクレオチド配列を有し、変性されたＳＶ４０１６ＳｍＲＮＡイントロン配列は配列番号９からなさるヌクレオチド配列を有し、β−グロビンイントロン配列は配列番号１０からなるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１記載のＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクター。
前記遺伝子は配列番号３，配列番号５，配列番号６及び配列番号７からなる群より選ばれた一つのヌクレオチド配列配列を有することを特徴とする請求項１記載のＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクター。
前記ｍＲＮＡ安定化因子はＲＲＥ，ＷＰＲＥ，ベータアクチン３′−ＵＴＲ、及びＲＳＶ安定化因子からなる群より選ばれたいずれか一つであることを特徴とする請求項１記載のＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクター。
前記ＨＩＶＮＣ蛋白質発現用ベクターは図２又は図４に開示された切断地図を有することを特徴とする請求項１記載のベクター。
請求項１乃至５のいずれか１項記載のベクターで形質転換された細胞。
前記細胞がＣＯＳ−７又は２３９Ｔ細胞であることを特徴とする請求項６記載の形質転換された細胞。
請求項６に記載の形質転換された細胞を培養する段階を含むＨＩＶＮＣ蛋白質の生産方法。
配列番号３，配列番号５，配列番号６及び配列番号７からなる群より選ばれた、いずれか一つで表示されるヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞において、高発現されるようにコドン最適化させたＨＩＶＮＣポリヌクレオチド。