CN117003834B

CN117003834B - 用于转导nk细胞假型化慢病毒载体的包膜糖蛋白及其应用

Info

Publication number: CN117003834B
Application number: CN202310680091.7A
Authority: CN
Inventors: 马丽雅; 谢海涛; 黄璟
Original assignee: Shenzhen Xiankangda Life Science Co ltd
Current assignee: Shenzhen Xiankangda Life Science Co ltd
Priority date: 2023-06-09
Filing date: 2023-06-09
Publication date: 2025-02-11
Anticipated expiration: 2043-06-09
Also published as: WO2024250481A1; CN119161426A; CN119161425A; CN117003834A

Description

用于转导NK细胞假型化慢病毒载体的包膜糖蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及免疫细胞生物制剂制备领域，尤其涉及一种转导NK细胞假型化慢病毒载体包膜糖蛋白及其应用。

背景技术

自然杀伤细胞(NK细胞)于30年前在外周血中被发现，NK细胞通常含有大量穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)，当激活的NK细胞遇到靶细胞时，NK细胞释放穿孔素和颗粒酶B攻击靶细胞。NK细胞还可以分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-3等细胞因子，这些细胞因子可以直接作用于靶细胞，也可以通过激活其他种类的免疫细胞攻击靶细胞。

NK细胞是已知最有效的杀伤肿瘤细胞的免疫细胞之一，对抑制肿瘤组织的发生、发展和扩散起着重要的作用。但是由于肿瘤患者体内 NK 细胞数量、质量的下降和肿瘤逃逸机制的存在，其在体内的抗肿瘤功能未能得到充分发挥。

研究发现，通过CAR 修饰 NK 细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。但是，还是存在两个方面的不足：一方面，NK细胞对转导的相对抗性阻碍了NK细胞生物学的研究和基于NK细胞的免疫疗法的发展；另一方面， G糖蛋白(VSV-G)假型化慢病毒载体常用生成嵌合体抗原受体 CAR-T 细胞，但这种细胞不能有效转导NK细胞。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的问题在于提供一种用于提高嵌合抗原受体转导NK细胞的突变型包膜假型化慢病毒载体的包膜糖蛋白以及应用。

本发明的技术方案之一如下：

一种用于包装转导NK细胞假型化慢病毒载体的包膜糖蛋白，所述包膜糖蛋白为内源性逆转录病毒（BaEV）包膜糖蛋白；优选包膜糖蛋白为狒狒内源性逆转录病毒包膜糖蛋白；其中，所述包膜糖蛋白包括胞外区、跨膜区及胞质区，而胞外区、跨膜区、胞质区中各自对应的氨基酸序列或其突变序列如下：

胞外区的氨基酸序列或突变序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；

跨膜区的氨基酸序列或突变序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示；

胞质区的氨基酸序列或突变序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。

上述包膜糖蛋白的表达载体为质粒pcDNA3.1+；其实现过程如下：

将BaEV包膜糖蛋白突变体单独克隆入质粒pcDNA3 .1+后，由该质粒替换传统慢病毒四质粒系统(如，Invitrogen)中的水泡性口炎病毒的G糖蛋白(VSV-G)；其中，VSV-G是融合性外壳蛋白。

本发明还提供一种核酸分子，该核酸分子的编码含有上述包膜糖蛋白。

本发明还提供含有上述包膜糖蛋白或核酸分子的表达盒或表达框。

本发明还提供一种病毒载体，如，慢病毒载体、逆转录病毒载体等，这种病毒载体含有上述包膜糖蛋白、核酸分子或者表达盒等。

上述包膜糖蛋白、核酸分子、病毒载体、表达盒等，可以被制作为生物制剂的添加组分，这种生物制剂被应用于制备预防和/或治疗肿瘤、癌症药物；其中，包膜糖蛋白也可以被用于制备预防和/或治疗肿瘤、癌症药物。

本发明将以BaEV包膜糖蛋白突变体替代VSV-G包装慢病毒假病毒，不仅维持了较高的病毒滴度7.33E+07 TU/mL，且能够有效识别NK细胞并介导病毒进入细胞，从而实现高效转染NK细胞的目的，如，含包膜糖蛋白突变体假型病毒（LV-CAR-BaEV-M）对NK细胞的转导阳性率可高达75.2％，含G糖蛋白病毒（LV-CAR-VSV-G）对NK细胞的转导阳性率仅为8.31％；同时，为慢病毒假型化病毒为基因治疗和细胞转染研究提供新的治疗手段，可应用于大规模的研发及生产中。

附图说明

图1为BaEV包膜糖蛋白结构示意图；

图2为病毒滴度流式检测图；其中，横坐标EGFP- FITC 表示为绿色荧光蛋白-异硫氰酸荧光素，纵坐标SSA表示为三色光；

图3为NK纯度流式检测图；

图4为慢病毒转导NK细胞阳性率流式检测图；其中，横坐标EGFP- FITC 表示为绿色荧光蛋白-异硫氰酸荧光素，纵坐标SSA表示为三色光。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。

本发明用狒狒内源性逆转录病毒（BaEV）包膜糖蛋白突变体假型病毒（LV-BaEV-M）显示特别适合将基因转移至NK细胞中；也就是说，转导NK细胞假型化慢病毒载体包膜糖蛋白为狒狒内源性逆转录病毒包膜糖蛋白，是一种单克隆抗体。这种包膜糖蛋白或其突变体包括胞外区、跨膜区及胞质区，而胞外区、跨膜区、胞质区中各自对应的氨基酸序列或其突变序列如下：

胞外区的氨基酸序列或突变序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；

跨膜区的氨基酸序列或突变序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示；

较好地，包膜糖蛋白的胞外区、跨膜区、胞质区中各自对应的氨基酸序列或突变序列分别为以下任一组：

a）、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5;

b）、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:6;

c）、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:7;

d）、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:8;

e）、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5;

f）、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:6;

g）、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:7;

h）、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:8;

i）、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5;

j）、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:6;

k）、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:7;

l）、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:8;

m）、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5;

n）、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:6;

p）、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:7;

q）、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:8。

上述包膜糖蛋白中，各氨基酸序列或突变序列如下：

1)、如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或突变序列如下：

MGFTTKIIFLYNLVLVYAGFDDPRKAIELVQKRYGRPCDCSGGQVSEPPSDRVSQVTCSGKTAYLMPDQRWKCKSIPKDTSPSGPLQECPCNSYQSSVHSSCYTSYQQCRSGNKTYYTATLLKTQTGGTSDVQVLGSTNKLIQSPCNGIKGQSICWSTTAPIHVSDGGGPLDTTRIKSVQRKLEEIHKALYPELQYHPLAIPKVRDNLMVDAQTLNILNATYNLLLMSNTSLVDDCWLCLKLGPPTPLAIPNFLLSYVTRSSDNISCLIIPPLLVQPMQFSNSSCLFSPSYNSTEEIDLGHVAFSNCTSITNVTGPICAVNGSVFLCGNNMAYTYLPTNWTGLCVLATLLPDIDIIPGDEPVPIPAIDHFIYRPKRAIQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSNQLISDVQILSSTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYVNKSGIVRDKIKTLQEELERRRKDLASNPLWTGLQGLLP；

2)、如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或突变序列如下：

MGFTTKIIFLYNLVLVYAGFDDPRKAIELVQKRYGRPCDCSGGQVSEPPSDRVSQVTCSGKTAYLMPDQRWKCKSIPKDTSPSGPLQECPCNSYQSSVHSSCYTSYQQCRSGNKTYYTATLLKTQTGGTSDVQVLGSTNKLIQSPCNGIKGQSICWSTTAPIHVSDGGGPLDTTRIKSVQRKLEEIHKALYPELQYHPLAIPKVRDNLMVDAQTLNILNATYNLLLMSNTSLVDDCWLCLKLGPPTPLAIPTPSLTYSLADSLANASCQIIPPLLVQPMQFSNSSCLFSPSYNSTEEIDLGHVAFSNCTSITNVTGPICAVNGSVFLCGNNMAYTYLPTNWTGLCVLATLLPDIDIIPGDEPVPIPAIDHFIYRPKRAIQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSNQLISDVQILSSTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYVNKSGIVRDKIKTLQEELERRRKDLASNPLWTGLQGLLP；

3)、如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或突变序列如下：

LISTIMGPLIVLLLILLFGPCIL如下；

4)、如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或突变序列：

YLLPFLGPLLTLLLLLTIGPCIF；

5)、如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或突变序列如下：

NRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPLEYEP；

6)、如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或突变序列如下：

NRLVQFVKDRISVSQNYPIVQQYHQLKPLEYEP；

7)、如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或突变序列如下：

NRLVQFVKDRISVVQGACRAIQYHQLKPLEYEP；

8)、如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或突变序列如下：

NRLVQFVKDRISVVHAMVLAQQYHQLKPLEYEP。

上述包膜糖蛋白为狒狒内源性逆转录病毒（BaEV）包膜糖蛋白突变体假型慢病毒载体（LV-BaEV-M），该假型包膜慢病毒载体显示特别适合将基因转移至NK细胞中，可将转导效率大幅提升。

以下选用四组包膜糖蛋白突变体的氨基酸序列，代表性地通过具体实施例进行详细说明。

实施例1 BaEV-M和VSV-G假性化慢病毒载体制备

1.构建BaEV-M表达质粒

将合成的BaEV-M分子氨基酸序列，选用上述包膜糖蛋白的氨基酸酸序列或突变序列，如，第a)组、第c)组、第f)组及第q)组所示，分别构建至四个pcDNA3.1+ 中并形成四个pBaEV-M质粒,如图1所示。四个质粒分别命名为1# pBaEV-M质粒、2# pBaEV-M质粒、3#pBaEV-M质粒及4# pBaEV-M质粒。

2.慢病毒包装和滴度检测

2.1．BaEV-M慢病毒制备

将本实施例中制得的四个pBaEV-M质粒分别与表达Claudin18.2-CAR 和EGFP的pEF1α-CAR、辅助质粒pMDLg/pRRE(Addgene Plasmid，#12251）和辅助质粒pRSV-Rev(Addgene Plasmid，#12253)等混合，并分别使用Lipofectamine3000转染剂转入四组293T细胞中，制备得到四种慢病毒完整表达载体，分别命名为LV-CAR-BaEV-M（1#）、LV-CAR-BaEV-M（2#）、LV-CAR-BaEV-M（3#）、LV-CAR-BaEV-M（4#）。

2.2. VSV-G慢病毒制备

将慢病毒包膜质粒pMD2.G (Addgene，Plasmid#12259)、表达Claudin 18.2-CAR和EGFP的pEF1α-CAR质粒、辅助质粒pMDLg/pRRE(Addgene Plasmid，#12251）、辅助质粒pRSV-Rev(Addgene Plasmid，#12253)等四个质粒混合，使用Lipofectamine3000转入293T细胞中，制备得到慢病毒完整表达载体，命名为LV-CAR-VSV-G。

分别在48h和72h收集上述LV-CAR-BaEV-M（1#）、LV-CAR-BaEV-M（2#）、LV-CAR-BaEV-M（3#）、LV-CAR-BaEV-M（4#）及LV-CAR-VSV-G）各自对应的五种病毒上清，并对所收集的病毒上清分别进行超速离心浓缩(Merck Millipore)，分别得到五种浓缩病毒，即，LV-CAR-BaEV-M（1#）、LV-CAR-BaEV-M（2#）、LV-CAR-BaEV-M（3#）、LV-CAR-BaEV-M（4#）、LV-CAR-VSV-G。将上述五种浓缩病毒分别转导至293T细胞48h后用流式检测阳性率，从而计算病毒滴度。

病毒滴度计算方式为：

病毒滴度=（转导阳性率-背景阳性率）x细胞数/体积。

病毒滴度计算结果如下：

LV-CAR-VSV-G滴度为2.03E+08 TU/mL,LV-CAR-BaEV-M(1#)滴度为7.33E+07 TU/mL,LV-CAR-BaEV-M(2#)滴度为3.95E+07 TU/mL,LV-CAR-BaEV-M(3#)滴度为5.58E+07 TU/mL,LV-CAR-BaEV-M(4#)滴度为5.03E+07 TU/mL。

如图2所示，病毒滴度流式检测结果为：

空白样本阳性率为1.04%，LV-CAR-VSV-G转导阳性率为41.6%，LV-CAR-BaEV-M(1#)转导阳性率为15.7%,LV-CAR-BaEV-M(2#)转导阳性率为8.94%,LV-CAR-BaEV-M(3#)转导阳性率为12.2%,LV-CAR-BaEV-M(4#)转导阳性率为11.1%。

由病毒滴度计算结果及图2检测结果说明，BaEV-M包装的假型化慢病毒载体相对于VSV-G病毒载体，可维持较高的滴度。

实验例2 NK细胞转染检测

1.NK细胞培养

用淋巴细胞分离液分离人外周血中的单个核细胞，然后用免疫磁珠(DynalNKcellisolation kit)从PBMC中分离NK细胞(CD3-CD56+)，用流式细胞仪检测分离纯度,NK纯度检测结果如图3所示。图3中，NK细胞纯度为85.4%。NK细胞培养，为现有技术，在此不再赘述。

2.NK细胞转导和阳性率检测

将实施例2中的NK细胞培养至第7天，收集NK细胞后对NK细胞计数并接种于24孔板，每孔5×1 0⁴个细胞；以MOI为5分别加入实施例1中制得的五种浓缩后病毒，如，LV-CAR-VSV-G、LV-CAR-BaEV-M（1#）、LV-CAR-BaEV-M（2#）、LV-CAR-BaEV-M（3#）、LV-CAR-BaEV-M（4#），并分别加入聚凝胺(polybrene)转染助转剂至终浓度8μg/mL混合，细胞转染培养液的终体积为500μL。

混合均匀后，五种慢病毒分别转染NK细胞6-8h，随后分别补加500μL新鲜培养液，分别于37℃，5％CO₂培养箱中培养；培养48h后流式细胞检测分析，并获得荧光阳性细胞数，通过与对照比较荧光阳性细胞数判断假病毒的转染效率。流式检测结果如图4所示。

图4中，空白样本阳性率为1.68%、LV-CAR-VSV-G转导阳性率为8.31％，LV-CAR-BaEV-M（1#）转导阳性率为57.9％，LV-CAR-BaEV-M（2#）转导阳性率为75.2％，LV-CAR-BaEV-M（3#）转导阳性率为74.0％，LV-CAR-BaEV-M（4#）转导阳性率为43.6％。附图4说明，BaEV-M假型慢病毒载体相对VSV-G病毒载体，表现出了更强的转导作用；也就是说，假型化慢病毒载体上的BaEV-M包膜糖蛋白可以促进NK细胞转导。

应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种用于包装转导NK细胞假型化慢病毒载体的包膜糖蛋白，其特征在于，该包膜糖蛋白由胞外区、跨膜区及胞质区组成，其中，所述胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示、所述胞质区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的包膜糖蛋白。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒表达权利要求1所述的包膜糖蛋白，或者含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种病毒载体，其特征在于，该病毒载体表达权利要求1所述的包膜糖蛋白，或者含有权利要求2所述的核酸分子，或者含有权利要求3所述的表达盒。

5.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂含有权利要求1所述的包膜糖蛋白，或者含有权利要求2所述的核酸分子，或者含有权利要求3所述的表达盒，或者含有权利要求4所述的病毒载体。