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WO2023238932A1 - 未分化多能性幹細胞の検出方法および検出試薬 - Google Patents

未分化多能性幹細胞の検出方法および検出試薬 Download PDF

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WO2023238932A1
WO2023238932A1 PCT/JP2023/021545 JP2023021545W WO2023238932A1 WO 2023238932 A1 WO2023238932 A1 WO 2023238932A1 JP 2023021545 W JP2023021545 W JP 2023021545W WO 2023238932 A1 WO2023238932 A1 WO 2023238932A1
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WO
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seq
cells
pluripotent stem
stem cells
mir302chg
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PCT/JP2023/021545
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健二 長船
啓 辻本
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Rege Nephro Co Ltd
Kyoto University NUC
Original Assignee
Rege Nephro Co Ltd
Kyoto University NUC
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • renal progenitor cells nephron progenitor cells
  • human pluripotent stem cells such as human iPS cells (iPSCs) and human ES cells
  • iPSCs human iPS cells
  • ES cells iPS cells
  • cell preparations produced from iPS cells have considerable problems with tumorigenicity due to residual iPS cells. Therefore, it is essential to confirm the absence of residual iPS cells and ensure the safety of cell preparations.
  • the cell population is nephron progenitor cells, pancreatic progenitor cells, hepatic progenitor cells, ureteroblasts, interstitial progenitor cells, vascular endothelial cells, chondrocytes, bile duct progenitor cells, and erythropoietin-producing cells induced to differentiate from pluripotent stem cells. , nerve cells, cardiomyocytes, and/or lung cells, or cells obtained at an intermediate stage of differentiation from pluripotent stem cells to any of these cells, the method according to any one of [1] to [11]. .
  • the oligonucleotide primers of (i) are SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: An oligonucleotide primer having one or more combinations of sequences selected from the group of combinations consisting of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31, and SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33.
  • an oligonucleotide primer set or the combination of the primer and probe in (ii) above has a sequence that is a combination of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35; and an oligonucleotide probe comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 36.
  • undifferentiated pluripotent stem cells remaining in a cell population containing nephron progenitor cells induced to differentiate from pluripotent stem cells can be detected. This makes it possible to evaluate the safety of regenerative medicine products (for cell therapy, transplant organ reconstruction, etc.) containing nephron progenitor cells derived from human iPS cells. Furthermore, it is expected that residual undifferentiated pluripotent stem cells can be detected in other differentiated cell culture systems other than nephron progenitor cells.
  • TPM values of three splice variants of MIR302CHG, variant ENST00000510655.1, variant ENST00000509938.1, and variant ENST00000505215.1 in human ESCs or human ESC-derived lung progenitor cells or lung organoids.
  • the cell population includes cells that are in the middle of differentiation into nephron progenitor cells (progenitor cells), and nephron progenitor cells obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells or in the process of differentiation from pluripotent stem cells to nephron progenitor cells. Even more preferred is a cell population comprising cells obtained in a step.
  • methods for inducing differentiation of nephron progenitor cells from pluripotent stem cells include, for example, Tsujimoto, H. et al. (2020), Cell Rep. 31, 107476, WO2020/213734, Morizane, R. et al. (2015) Nat. Biotechnol. 33, 1193-1200, Li, Z. et al. (2016) Cell Stem Cell 19, 516-529, 2016 Methods include: As a method for inducing differentiation of pancreatic progenitor cells from pluripotent stem cells, specifically, for example, the method described in Kimura, A. et al., (2020) Cell Chem. Biol. 27, 1561-1572.e7. can be mentioned.
  • vascular endothelial cells and chondrocytes from pluripotent stem cells for example, Tsujimoto H, et al. Cell Rep. 2020 Apr 7;31(1):107476. doi: 10.1016/j
  • Examples include the method described in .celrep.2020.03.040.
  • a method for inducing differentiation of stromal progenitor cells from pluripotent stem cells for example, WO/2023/017848, Takasato M, et al. Nature. 2015;526: 564-568. doi:10.1038/nature15695 Examples include the method described in .
  • measuring the amount of RNA means measuring the amount of RNA, and even if the measured amount is below the detection limit, it is included in “measuring the amount of RNA”. It will be done.
  • the method for measuring the amount of RNA is not particularly limited as long as it is a method that can measure the amount of RNA contained in a cell population, and any known method can be used. Examples include a measurement method using probe hybridization, a measurement method using nucleic acid amplification, a measurement method using mass spectrometry, and a measurement method using sequencing.
  • Measurement methods using nucleic acid amplification include, for example, a method of confirming amplification by quantitative RT-PCR that combines reverse transcription (RT) reaction and PCR, or a method that combines reverse transcription (RT) reaction and 2-step ddPCR.
  • methods include 2-step (RT) ddPCR to confirm amplification, and one-step ddPCR to directly confirm RNA amplification.
  • the method of measuring the amount of RNA of the present invention preferably includes a method of confirming amplification property by quantitative RT-PCR or a method of confirming amplification property by 2-step (RT) ddPCR.
  • RNA is extracted from a cell population
  • DNA is synthesized from the extracted RNA by reverse transcription reaction, and amplification is confirmed by quantitative PCR, or amplification is confirmed by 2-step ddPCR.
  • this is carried out by
  • RNA extracted from a cell population is preferably subjected to a process to remove DNA.
  • the treatment for removing DNA can be appropriately selected from known treatment methods, and includes, for example, a treatment method in which DNA degrading enzyme (DNase) is added.
  • DNase DNA degrading enzyme
  • a method for confirming amplification by quantitative PCR can be appropriately selected from known methods, such as the SYBR (trademark) Green method, the TaqMan (trademark) method, and the like.
  • SYBR trademark
  • TaqMan trademark
  • the above-mentioned process of synthesizing DNA from RNA by reverse transcription reaction and quantitative PCR, which are performed sequentially or simultaneously, is also referred to as quantitative RT-PCR.
  • RNA complementary sequence examples include SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8 and SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 and SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 and SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 and SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 and SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 and SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8 and SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 and SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 and SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:
  • the method for confirming amplification by 2-step ddPCR is carried out by ddPCR using a combination of oligonucleotide primers and oligonucleotide probes. It is preferable to confirm the amplification of RNA expressed from MIR302CHG by 2-step ddPCR.
  • 2-step ddPCR as an example of an oligonucleotide primer and an oligonucleotide probe for amplifying RNA expressed from MIR302CHG, its DNA complementary sequence, or a part of the RNA complementary sequence, the combination of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 is used. and an oligonucleotide probe having the sequence set forth in SEQ ID NO: 36.
  • DNA containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 36 is used as an oligonucleotide probe, and DNA having a sequence that is a combination of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 is used as an oligonucleotide probe. It is preferable to use it as an oligonucleotide primer set.
  • the amount of RNA expressed from MIR302CHG is evaluated by the absolute amount (copy number), and it is determined that undifferentiated pluripotent stem cells exist when a certain amount or more, for example, 1 copy or more or 10 copies or more is detected. good.
  • the amount of RNA expressed from MIR302CHG is normalized by the expression amount of a housekeeping gene (e.g., TATA-box binding protein (TBP) gene), and the value (relative amount) is evaluated. It may be determined that undifferentiated pluripotent stem cells exist when the
  • Undifferentiated pluripotent stem cell-specific antigens include proteins, glycopeptides, glycoproteins, glycolipids, sugar chains, etc. that are specific to undifferentiated pluripotent stem cells.
  • Cell surface antigens are preferred, and specific examples include TRA-1-60.
  • Examples of mRNA switches targeting undifferentiated pluripotent stem cell-specific nucleotides include miR-302a response switch (Fujita Y et al. Science Advance 2022 Jan 7;8(1): eabj1793.) .
  • Examples of conditions for proliferation and adhesion specific to undifferentiated pluripotent stem cells include the Essential-8/LN521 culture amplification method (Tano et al., PLoS One.
  • undifferentiated pluripotent stem cells can be detected in products that use cell populations that can contain undifferentiated pluripotent stem cells, such as regenerative medicine products using human iPS cell-derived nephron progenitor cells. This makes it possible to evaluate safety.
  • the cell population determined to not contain undifferentiated pluripotent stem cells by the method of the present invention may be further evaluated for tumor formation in vivo.
  • the present invention also relates to a reagent kit for detecting undifferentiated pluripotent stem cells, which includes a reagent for measuring the amount of RNA expressed from MIR302CHG.
  • the reagent kit of the present invention includes (i) an oligonucleotide primer for measuring RNA expressed from MIR302CHG, or (ii) an oligonucleotide primer and an oligonucleotide probe for measuring RNA expressed from MIR302CHG. Including combinations.
  • the oligonucleotide primers (i) are, for example, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25, An oligo having one or more combinations of sequences selected from the group of combinations consisting of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31, and SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33.
  • Human iPS cells (human iPSCs) were used as pluripotent stem cells.
  • Human iPSCs were maintained in feederless culture using Stem Fit AK02N medium (Ajinomoto) or Stem Fit AK03N medium (Ajinomoto) on iMatrix-coated cell culture plates.
  • human iPSCs were passaged every 4 to 5 days using 0.5 mM EDTA/PBS (Thermo Fisher Scientific) and regularly inspected for mycoplasma contamination.
  • Nephron progenitor cells Nephron progenitor cells (NPCs) are described by Tsujimoto, H.; et al. (2020), Cell Rep. It was derived from human iPSCs by the method described in 31, 107476. In addition, cells 4 days after starting differentiation from human iPSCs using the above method were also used for analysis as Day 4 cells (D4C).
  • Renal interstitial progenitor cells Renal interstitial progenitor cells (IPCs) were induced to differentiate from human iPSCs by the method described in WO/2023/017848, specifically by the method described below. Human iPSCs were first enzyme-treated with a 1:1 mixture of TrypLE Select Enzyme (Thermo Fisher Scientific) and 0.5 mM EDTA/PBS for 5 minutes, and washed with PBS(-).
  • basal medium serum-free differentiation medium
  • Basal medium consisting of DMEM/F12 Glutamax (Thermo Fisher Scientific), B27 supplement minus vitamin A (Thermo Fisher Scientific), and 0.5 ⁇ Penicillin/Streptomycin.
  • the cells were cultured for 48 hours using a basal medium containing 5 ⁇ M CHIR99021, 30 ng/mL bFGF, 10 ng/mL activin A, and 30 ⁇ M Y-27632. Then a combination of 1 ⁇ M CHIR99021, 10 ⁇ M SB431542, 100 nM RA, 10 ng/mL IL-1b, 500 nM Smoothened (SMO) agonist (SAG) for 48 hours, then 1 ⁇ M CHIR99021, 10 ⁇ M SB431542, 100 nM The cells were treated with a combination of RA and 500 nM smoothed (SMO) agonist (SAG) for 72 hours and cultured.
  • SMO Smoothened
  • Ureteroblasts Ureteroblasts (ND) were described by Mae, SI, et al. Cell Rep, 32 (2020), 10.1016/j. celrep. It was induced from human iPSCs by the method described in 2020.107963.
  • RNA-Seq data that has already been reported and published in a repository was performed using the following steps.
  • transcripts were quantified using Salmon using Homo sapiens GRCh38 cDNA gene annotation (Ensembl). Output from Salmon was processed using the R/Bioconductor package tximport to obtain gene expression values.
  • DEG analysis was performed using iDEP (version 0.92).
  • iDEP enrichment analysis of the top 1,000 DEGs using the k-means method was performed using the biological process of Gene Ontology (GO).
  • GO Gene Ontology
  • Quantitative RT-PCR was performed using the following procedure. Total RNA was isolated using the RNeasy kit (QIAGEN) according to the manufacturer's recommended protocol. cDNA was synthesized from total RNA by performing a reverse transcription reaction using ReverTra Ace (Toyobo) and oligo dT according to a standard protocol. Quantitative PCR was performed using QuantStudio 3 real-time PCR system (Thermo Fisher Scientific) and TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara Bio). Denaturation was performed at 95°C for 30 seconds, followed by 45 cycles of 95°C for 5 seconds and 60°C for 34 seconds. For data analysis of gene expression levels, quantification was performed using the comparative Ct method, and the values were normalized with TBP, a housekeeping gene. PCR was performed at least three times on each sample. Table 1 shows the primers used for PCR.
  • 2-step ddPCR 2-step ddPCR was performed using the following procedure.
  • Total RNA was isolated using the RNeasy kit (QIAGEN) according to the manufacturer's recommended protocol.
  • cDNA was synthesized from total RNA by performing a reverse transcription reaction using ReverTra Ace (Toyobo) and oligo dT according to a standard protocol.
  • cDNA obtained from total RNA using ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) (Bio-Rad), 900 nM forward and reverse primers, and 250 nM probes labeled with FAM or HEX dye and ZEN-Iowa Black fluorescence quencher. was added to perform ddPCR.
  • Cell enrichment using magnetic beads was performed using MACS (Miltenyi Biotec). Human iPSCs and NPCs were dissociated with Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.), and each cell suspension was centrifuged at 200 g for 7 min at 4°C. After centrifugation, the supernatant was discarded and each cell pellet was resuspended in MACS Rinsing solution (Miltenyi Biotec) supplemented with 0.5% BSA (Wako or Miltenyi Biotec) and 10 ⁇ M Y-27632.
  • the positive fraction was flushed out and collected by gently pressing the syringe at a rate of 2-3 drops per second. After centrifugation at 200 g for 5 minutes, cells from the positive and negative fractions were respectively lysed using RLT buffer (QIAGEN) supplemented with ⁇ -mercaptoethanol and stored at -80°C until analysis.
  • RLT buffer QIAGEN
  • RNA-seq analysis including non-coding RNA and found 26 extremely highly expressed genes (log2FC ⁇ - 10 & FDR ⁇ 10 -5 ) (Fig. 1).
  • MIR302CHG which is related to lncRNA, is more effective than LIN28A, which is conventionally used for detecting residual iPS cells, and CUZD1, which is found to be differentially highly expressed in human iPSCs (data omitted) in the analysis of deposited RNA-seq data. It was also found that each transcript (transcripts per million: TPM value) showed a high value for each transcript per million total transcripts (Fig. 2).
  • the TBP-normalized MIR302CHG expression pattern was better at detecting iPSCs than the CUZD1 and POU5F1 expression patterns when the proportion of iPSCs was low.
  • iPSC contamination approximately 10 -3 % (1 cell in 10 5 cells) in NPC and 10 -1 (1 cell in 10 3 cells) in D4C. It was suggested that it could be done.
  • Example 2 Detection of pluripotent stem cells by cell enrichment and quantitative PCR iPSCs representing 10 -4 % of the total number of cells were mixed with the nephron progenitor cell (NPC) cell population to yield 10 -4 % iPSCs.
  • NPC nephron progenitor cell
  • Cell enrichment of 10 -4 % iPSCs using magnetic beads was performed using TRA-1-60 surface antigen as an indicator, and TRA-1-60 positive fraction (PF) and negative fraction (NF) were collected.
  • MIR302CHG For MIR302CHG, CUZD1, and POU5F1, amplification was confirmed by quantitative RT-PCR in each compartment of NPC, iPSC, 10 ⁇ 4 % iPSC, TRA-1-60 PF, and TRA-1-60 NF.
  • MIR302CHG primers having the combination of SEQ ID NOs: 6 and 7 (corresponding to #2 in Table 1 above) were used. The results are shown in FIG.
  • By a combination of enrichment using magnetic beads and quantitative RT-PCR that measures the amount of RNA expressed from MIR302CHG it is possible to detect contamination of 10 -4 % of NPCs or D4C, that is, one or more iPSCs in every 106 . Conceivable.
  • CUZD1 and POU5F1 it was difficult to detect contamination of more than 1 in 10 6 iPSCs in either NPC or D4C, or both, even with a similar method.
  • RNA expressed from MIR302CHG was higher than that of NPCs when 10 -4 % or more of iPSCs were included, and in particular, it was clearly higher when 10 -2 % or more of iPSCs were included. Therefore, by 2-step ddPCR that measures the amount of RNA expressed from MIR302CHG, it is possible to detect contamination of 10 -4 % to 10 -2 % of NPCs, that is, one or more iPSCs in 10 to 104 . Conceivable.
  • Example 4 Expression of MIR302CHG in human iPSC-derived pancreatic progenitor cells and human iPSC-derived hepatocytes
  • Figure 9 is from Kimura et al (2020), Cell Chem. Biol. 27, 1561-1572.
  • Figure 10 shows human iPSCs or human iPSC-derived pancreatic progenitor cells reported in Kotaka, M. et al., 2017, Sci. Rep. 7, 1-13.
  • Example 5 Expression of MIR302CHG in human iPSC-derived neural progenitor cells and neurons was analyzed the expression of MIR302CHG in human iPSC-derived neural progenitor cells and neurons from publicly available RNA-seq datasets.
  • Figure 11 shows the published RNA of human iPSCs or human iPSC-derived neural progenitor cells and neurons reported in Chen et al., 2013, PLoS One. 2013;8: e75682. doi:10.1371/journal.pone.0075682.
  • Example 8 Expression of MIR302CHG in human iPSC, IVF-ESC, or nt-ESC-derived vascular endothelial cells From publicly available RNA-seq datasets, MIR302CHG in human iPSC, IVF-ESC, or nt-ESC and their derived vascular endothelial cells We analyzed the expression of Figure 14 shows human iPSC, IVF-ESC, nt-ESC or human iPSC, IVF-ESC, nt-ESC-derived cells reported in Zhao et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114: E11111-E11120.
  • TPM values of each transcriptional variant of MIR302CHG analyzed using a publicly available RNA-seq dataset of vascular endothelial cells.
  • High expression of MIR302CHG was observed in iPSCs, but the expression almost disappeared after differentiation. Therefore, even during differentiation into vascular endothelial cells, undifferentiated cells can be detected by MIR302CHG.
  • MIR302CHG by measuring the amount of MIR302CHG, it is possible to detect not only undifferentiated pluripotent stem cells but also cells in the early stages of differentiation such as definitive endoderm and anterior primitive streak, and cells in the foregut, midgut, and hindgut. It was found that it was possible to identify
  • Example 10 Expression of MIR302CHG in Renal Interstitial Progenitor Cells and Ureteroblasts Renal interstitial progenitor cells (IPCs) and ureteroblasts ( ND) were obtained respectively.
  • undifferentiated pluripotent stem cells remaining in a cell population containing nephron progenitor cells induced to differentiate from pluripotent stem cells can be detected. This makes it possible to evaluate the safety of regenerative medicine products (for cell therapy, transplant organ reconstruction, etc.) containing nephron progenitor cells derived from human iPS cells. Furthermore, it is expected that residual undifferentiated pluripotent stem cells can be detected in other differentiated cell culture systems other than nephron progenitor cells.

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Abstract

未分化多能性幹細胞を検出するための方法および、検出するための試薬の提供を課題とし、該課題を、MIR302CHG遺伝子から発現するRNAの量を測定することで、わずかに残存する未分化多能性幹細胞を検出できることにより解決する。

Description

未分化多能性幹細胞の検出方法および検出試薬
　本発明は、未分化多能性幹細胞を検出するための方法および、検出するための試薬に関する。
　ヒトiPS細胞（iPSC）やヒトES細胞などのヒト多能性幹細胞から分化誘導した腎前駆細胞（ネフロン前駆細胞）を腎不全等の腎疾患の治療に使用することが検討されている。しかしながら、臨床利用においてiPS細胞から作製した細胞製剤は残存iPS細胞による造腫瘍性の問題が少なからず存在する。
　そのため、細胞製剤に対して、残存iPS細胞の不在を確認し、安全性を保証することが必須である。しかしながら、大量の細胞製剤に対してわずかな残存iPS細胞を検出し、評価することは非常に困難である。そこで、ネフロン前駆細胞には存在せず、かつ、iPS細胞で大量に存在する物質の同定を用いて検出することが重要となる。
　残存iPS細胞の検出方法として、iPS細胞培養増幅法による検出（非特許文献１および２）、LIN28AのPCRによる検出（非特許文献３など）といった検出方法が報告されている。しかし、iPS細胞培養増幅法に用いる培養条件では、ネフロン前駆細胞も高効率に培養増幅され、iPS細胞のみの培養増幅が不可能である点や、LIN28Aはネフロン前駆細胞、さらには、iPS細胞が分化した膵臓や肝臓オルガノイドでもある程度の発現があり、これらの方法をiPS細胞の検出に用いることが難しい。したがって、ネフロン前駆細胞、膵前駆細胞または肝前駆細胞等で利用可能な新たなiPS細胞の検出方法が必要とされている。
特開2013-158325号公報
Watanabe T. et al., Cryotherapy 2021; 23: 2: 176-183 Tano K. et al., PLOS ONE 2014; 9: 10. Kuroda T. et al., Regenerative Therapy 2015; 2: 17-23.
　本発明は、iPS細胞から分化誘導されたネフロン前駆細胞等を含む細胞集団に存在する残存iPS細胞などの未分化多能性幹細胞を検出する方法およびそのための試薬を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、MIR302CHG遺伝子から発現するRNAの量を測定することで、多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団等にわずかに残存する未分化多能性幹細胞を検出できることを見出し、本発明の完成に至った。
　本発明は以下を提供する。
［１］
　未分化多能性幹細胞を検出するための方法であって、
　（A）未分化多能性幹細胞を含みうる細胞集団において、MIR302CHGから発現するRNAの量を測定する工程を含む、方法。
［２］
　前記多能性幹細胞が、人工多能性幹（iPS）細胞である、［１］に記載の方法。
［３］
　前記MIR302CHGから発現するRNAが、スプライスバリアントENST00000509938.1および／またはスプライスバリアントENST00000505215.1である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
　前記MIR302CHGから発現するRNAが、スプライスバリアントENST00000509938.1である、［３］に記載の方法。
［５］
前記MIR302CHGから発現するRNAが、
(a) 配列番号２もしくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、または
(b) 配列番号２もしくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列と90％以上の相同性を有するヌクレオチド配列
を含むRNAである、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
　前記工程（A）が、定量的PCRにより増幅性を確認する工程または2-step ddPCR（Droplet digital PCR）により増幅性を確認する工程を含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
　前記定量的PCRにより増幅性を確認する工程が、配列番号４および配列番号５、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、配列番号１０および配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１、ならびに配列番号３２および配列番号３３からなる組み合わせの群より選ばれる１対以上の組み合わせの配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いる工程である、［６］に記載の方法。
［８］
　前記2-step ddPCRにより増幅性を確認する工程が、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号３４および配列番号３５の組み合わせである配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットとを用いる工程である、［６］に記載の方法。
［９］
　前記工程（A）において、多能性幹細胞のみで構成された細胞集団におけるRNAの量を１とすると、前記細胞集団におけるRNAの量が０．０００００１以上である、と測定されたとき、前記細胞集団に含まれる前記未分化多能性幹細胞を検出したと判定する工程を含む、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
　前記工程（A）の前に、未分化多能性幹細胞特異的抗原を用いたセルソーティングにより前記未分化多能性幹細胞を含む分画を濃縮する工程を含む、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
　前記未分化多能性幹細胞特異的抗原が、TRA-1-60である、［１０］に記載の方法。
［１２］
　前記細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導されたネフロン前駆細胞、膵前駆細胞、肝前駆細胞、尿管芽細胞、間質前駆細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、胆管前駆細胞、エリスロポエチン産生細胞、神経細胞、心筋細胞、および／もしくは肺細胞、または多能性幹細胞からそれらいずれかの細胞への分化途中段階に得られる細胞を含む、［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］
　前記細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導されたネフロン前駆細胞または多能性幹細胞からネフロン前駆細胞への分化途中段階に得られる細胞を含む、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］
　未分化多能性幹細胞を検出するための試薬キットであって、
　（i）MIR302CHGから発現するRNAの量を測定するためのオリゴヌクレオチドプライマーまたは（ii）オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを含む、試薬キット。
［１５］
　前記（i）のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号４および配列番号５、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、配列番号１０および配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１、ならびに配列番号３２および配列番号３３からなる組み合わせの群より選ばれる１対以上の組み合わせの配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットである、または前記（ii）のプライマー及びプローブの組み合わせが、配列番号３４および配列番号３５の組み合わせである配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットと、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブとの組み合わせである、［１４］に記載の試薬キット。
　本発明によれば、多能性幹細胞から分化誘導されたネフロン前駆細胞を含む細胞集団に残存する未分化多能性幹細胞を検出することができる。これにより、ヒトiPS細胞由来のネフロン前駆細胞を含む再生医療等製品（細胞療法用、移植臓器再構築用等）などの安全性の評価が可能となる。
　また、ネフロン前駆細胞以外の他の分化細胞培養系においても、残存する未分化多能性幹細胞を検出することが期待される。そのため、ヒトiPS細胞由来のネフロン前駆細胞以外の他の分化細胞、例えば、膵前駆細胞、肝前駆細胞、尿管芽細胞、間質前駆細胞（例えば、腎間質前駆細胞）、血管内皮細胞、軟骨細胞、胆管前駆細胞、エリスロポエチン産生細胞、神経細胞、心筋細胞、肺細胞などを用いた再生医療等製品にも応用することができる。
DEGのボルカーノプロット（左図）と、log10(FDR) > 5およびlog2FC(fold change) < -10のヒトiPSCマーカーの候補のリスト（右図）。 ヒトiPSCとネフロン前駆細胞（NPC）におけるMIR302CHG、CUZD1、LIN28AおよびTBPのTPM値を、平均値±SEMで示したグラフ(n=3)。 NPC分化プロトコルの4日目の細胞（D4C）と比較して、ヒトiPSCで極めて高発現を示したマーカー（log2FC < 10 および FDR <10-5）のリスト。 MIR302CHGの3つのスプライスバリアントである、バリアントENST00000510655.1、バリアントENST00000509938.1、およびバリアントENST00000505215.1のヒトiPSCおよびNPCにおけるTPM値を平均値±SEMで示したグラフ（n=3）。 ヒトiPSCとNPCの混合細胞（左図）またはヒトiPSCとD4Cの混合細胞（右図）に対する定量的RT-PCR分析による、MIR302CHG、CUZD1、POU5F1のTBP正規化遺伝子発現の散布図。散布図中央の点および線は、それぞれ実験データおよびデータの平均値を示し、UDはCT値がUndeterminedであったサンプルを示す。 15種類のMIR302CHGプライマーについて、ヒトiPSC（iPSC）と誘導NPC（NPC）のTBP正規化した定量的RT-PCRにおけるdCT値の散布図。UDはCT値がUndeterminedであったサンプルを示す。 NPC（左図）またはD4C（右図）、MACS陰性画分フロースルー（NF）、10-4%iPSC、MACS陽性画分フロースルー（PF）、およびiPSCに対する定量的RT-PCR分析による、MIR302CHG、CUZD1、POU5F1のTBP正規化遺伝子発現の散布図。散布図中央の点および線は、それぞれ実験データおよびその平均値を示す。 RT産物を15％の割合で用いた、Droplet digital PCR (ddPCR)反応によるTBP正規化MIR302CHGのddPCR推定コピー数比の散布図。 ヒトiPSCまたはヒトiPSC由来膵前駆細胞におけるMIR302CHGの3つのスプライスバリアント、バリアントENST00000510655.1、バリアントENST00000509938.1、およびバリアントENST00000505215.1のTPM値の散布図である。 ヒトiPSCまたはヒトiPSC由来肝細胞におけるMIR302CHGの3つのスプライスバリアント、バリアントENST00000510655.1、バリアントENST00000509938.1、およびバリアントENST00000505215.1のTPM値の散布図である。 ヒトiPSCまたはヒトiPSC由来神経前駆細胞および神経細胞におけるMIR302CHGの3つのスプライスバリアント、バリアントENST00000510655.1、バリアントENST00000509938.1、およびバリアントENST00000505215.1のTPM値の散布図である。 ヒトiPSCまたはヒトiPSC由来心筋細胞におけるMIR302CHGの3つのスプライスバリアント、バリアントENST00000510655.1、バリアントENST00000509938.1、およびバリアントENST00000505215.1のTPM値の散布図である。 ヒトESCまたはヒトESC由来肺前駆細胞または肺オルガノイドにおけるMIR302CHGの3つのスプライスバリアント、バリアントENST00000510655.1、バリアントENST00000509938.1、およびバリアントENST00000505215.1のTPM値の散布図である。 ヒトiPSC、IVF-ESC、nt-ESCまたはヒトiPSC、IVF-ESC、nt-ESC由来血管内皮細胞におけるMIR302CHGの3つのスプライスバリアント、バリアントENST00000510655.1、バリアントENST00000509938.1、およびバリアントENST00000505215.1のTPM値の散布図である。 ヒトESC、前方原始線条、胚体内胚葉、前方前腸、後方前腸、中腸/後腸におけるMIR302CHGの3つのスプライスバリアント、バリアントENST00000510655.1、バリアントENST00000509938.1、およびバリアントENST00000505215.1のTPM値の散布図である。 腎間質前駆細胞（IPC）、尿管芽細胞（ND）およびヒトiPSCにおけるMIR302CHGの発現を定量的RT-PCRで解析し、TBPで正規化した（MIR302CHG/TBP）グラフを示す図（IPCはN=4、NDはN=5）。
　以下、本発明を説明する。
　本発明の未分化多能性幹細胞を検出するための方法は、
　未分化多能性幹細胞を含みうる細胞集団において、MIR302CHGから発現するRNAの量を測定する工程を含む。
＜未分化多能性幹細胞＞
　本発明において、多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、ネフロン前駆細胞、膵前駆細胞、肝前駆細胞、尿管芽細胞、間質前駆細胞（例えば、腎間質前駆細胞）、血管内皮細胞、軟骨細胞、胆管前駆細胞、エリスロポエチン産生細胞、神経細胞、心筋細胞、肺細胞等の体細胞に分化誘導される任意の細胞が包含される。
　多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、人工多能性幹（iPS）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（nt-ES）細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、iPS細胞およびES細胞である。多能性幹細胞の由来は霊長類やげっ歯類を含む哺乳動物由来であることが好ましく、霊長類由来であることがより好ましく、ヒト由来であることがさらに好ましい。
　iPS細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することなどによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3Glis1、またはmiR302/367 cluster等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009／117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010／050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D，et al. (2008)，Nat. Biotechnol., 26：795-797、Shi Y，et al. (2008)，Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008)，Nat. Biotechnol. 26: 1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3,568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3: 475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3,132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11: 197-203、R. L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci USA. 106: 8912-8917、Kim JB. et al. (2009), Nature 461: 649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell 5: 491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell 6: 167-74、Han J, et al. (2010), Nature 463: 1096-1100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells 28: 713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature 474: 225-9、Cell Stem Cell. 2011;8: 376-88. doi:10.1016/j.stem.2011.03.001に記載の組み合わせが例示される。
　体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　未分化多能性幹細胞とは、多能性および増殖性等の多能性幹細胞の特徴を有する細胞であり、分化誘導されていない、または分化が進行していない多能性幹細胞を指す。分化が進行していない多能性幹細胞は、例えば、任意の細胞へ分化誘導されたものの、多能性または多能性および増殖能を失わなかった細胞であってよい。すなわち、未分化多能性幹細胞とは、分化誘導されていない、または多能性幹細胞から任意の細胞へ分化誘導された細胞集団において残存した、多能性幹細胞であってもよい。
　よって、未分化多能性幹細胞は、具体的にはES細胞、iPS細胞、nt-ES細胞、GS細胞、EG細胞、Muse細胞などであってよく、多能性幹細胞から任意の細胞へ分化誘導された細胞集団において残存した、ES細胞、iPS細胞、nt-ES細胞、GS細胞、EG細胞、Muse細胞などであってよい。
＜細胞集団＞
　本発明において、未分化多能性幹細胞を含みうる細胞集団は、未分化多能性幹細胞を含む可能性のある細胞集団であれば特に限定されないが、多能性幹細胞を特定の系譜に分化誘導して得られる細胞集団、すなわち、多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団であることが好ましい。
　なお、多能性幹細胞から分化誘導された細胞集団には、未分化多能性幹細胞が残存しうることが知られている。したがって、多能性幹細胞から分化誘導された細胞を含む細胞集団において、未分化多能性幹細胞が残存する場合が挙げられるが、実際には未分化多能性幹細胞が残存していなかったとしても、本発明における「未分化多能性幹細胞を含みうる細胞集団」とみなす。
　未分化多能性幹細胞を含みうる細胞集団は、ネフロン前駆細胞、膵前駆細胞、肝前駆細胞、尿管芽細胞、間質前駆細胞（例えば、腎間質前駆細胞）、血管内皮細胞、軟骨細胞、胆管前駆細胞、エリスロポエチン産生細胞、神経細胞、心筋細胞、および／または肺細胞を含むことが好ましく、ネフロン前駆細胞、尿管芽細胞、および／または間質前駆細胞（例えば、腎間質前駆細胞）を含むことがより好ましく、ネフロン前駆細胞を含むことがさらにより好ましい。
　また、未分化多能性幹細胞を含みうる細胞集団は、多能性幹細胞を分化誘導して得られるネフロン前駆細胞、膵前駆細胞、肝前駆細胞、尿管芽細胞、間質前駆細胞（例えば、腎間質前駆細胞）、血管内皮細胞、軟骨細胞、胆管前駆細胞、エリスロポエチン産生細胞、神経細胞、心筋細胞、および／もしくは肺細胞、または多能性幹細胞からそれらのいずれかの細胞への分化途中段階に生じる細胞（例えば、中胚葉細胞、内胚葉細胞、前腸細胞またはそれら以降に生じる細胞等）を含む細胞集団であることが好ましく、多能性幹細胞を分化誘導して得られるネフロン前駆細胞、尿管芽細胞、および／もしくは間質前駆細胞（例えば、腎間質前駆細胞）または多能性幹細胞からネフロン前駆細胞、尿管芽細胞、および／もしくは間質前駆細胞（例えば、腎間質前駆細胞）への分化途中段階に得られる細胞を含む細胞集団であることがより好ましく、多能性幹細胞を分化誘導して得られるネフロン前駆細胞または多能性幹細胞からネフロン前駆細胞への分化途中段階に得られる細胞を含む細胞集団であることがさらにより好ましい。
　多能性幹細胞からネフロン前駆細胞、膵前駆細胞、肝前駆細胞、尿管芽細胞、間質前駆細胞（例えば、腎間質前駆細胞）、血管内皮細胞、軟骨細胞、胆管前駆細胞、エリスロポエチン産生細胞、神経細胞、心筋細胞、および／または肺細胞を分化誘導する方法は、任意の既知の方法を用いることができ、例えば、培地に適切な分化誘導因子を加えることで分化誘導してもよい。
　多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を分化誘導する方法として、具体的には、例えば、Tsujimoto，H．et al．（2020），Cell Rep．31，107476、WO2020/213734、Morizane, R. et al. (2015) Nat. Biotechnol. 33, 1193-1200、Li, Z. et al. (2016) Cell Stem Cell 19, 516-529, 2016に記載の方法が挙げられる。
　多能性幹細胞から膵前駆細胞を分化誘導する方法として、具体的には、例えば、Kimura, A.et al., (2020) Cell Chem. Biol. 27, 1561-1572.e7.に記載の方法が挙げられる。
　多能性幹細胞から肝前駆細胞を分化誘導する方法として、具体的には、例えば、WO2016/104717、Kotaka, M. et al. (2017) Sci. Rep. 7, 1-13.、Ouchi, R. et al. (2019) Cell Metab. 1-11. doi:10.1016/j.cmet.2019.05.007に記載の方法が挙げられる。
　多能性幹細胞から尿管芽細胞を分化誘導する方法として、具体的には、例えば、Mae, SI, et al. Cell Rep, 32 (2020), 10.1016/j.celrep.2020.107963に記載の方法が挙げられる。
　多能性幹細胞から血管内皮細胞や軟骨細胞を分化誘導する方法として、具体的には、例えば、Tsujimoto H, et al. Cell Rep. 2020 Apr 7;31(1):107476. doi: 10.1016/j.celrep.2020.03.040.に記載の方法が挙げられる。
　多能性幹細胞から間質前駆細胞を分化誘導する方法として、具体的には、例えば、WO/2023/017848、Takasato M, et al. Nature. 2015;526: 564-568. doi:10.1038/nature15695.に記載の方法が挙げられる。
　多能性幹細胞から胆管前駆細胞を分化誘導する方法として、具体的には、例えば、Matsui S, et al. Stem Cell Res. 2019 Mar;35:101400. doi: 10.1016/j.scr.2019.101400.に記載の方法が挙げられる。
　多能性幹細胞からエリスロポエチン産生細胞を分化誘導する方法として、具体的には、例えば、Katagiri N, et al. Sci Rep. 2021 Feb 16;11(1):3936. doi: 10.1038/s41598-021-83431-6.に記載の方法が挙げられる。
　多能性幹細胞から神経細胞を分化誘導する方法として、具体的には、例えば、Chen J, et al. PLoS One. 2013;8: e75682. doi:10.1371/journal.pone.0075682に記載の方法が挙げられる。
　多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導する方法として、具体的には、例えば、Banovich NE, et al. Genome Res. 2018;28: 122-131. doi:10.1101/gr.224436.117に記載の方法が挙げられる。
　多能性幹細胞から肺細胞を分化誘導する方法として、具体的には、例えば、Jacob A, et al. Cell Stem Cell. 2017;21: 472-488.e10. doi:10.1016/j.stem.2017.08.014またはKerschner LJ, et al. J Cell Mol Med. 2020;24: 9853-9870. doi:10.1111/jcmm.15568に記載の方法が挙げられる。
＜MIR302CHG＞
　MIR302CHGは、その遺伝子座にmiRNAであるmiR-302/367をコードするクラスターを含む、タンパク質をコードしない遺伝子として知られている。
　MIR302CHGから発現するRNAには、ENST00000510655.1（バリアント655）、ENST00000509938.1（バリアント938）、およびENST00000505215.1（バリアント215）の３つの長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）バリアントを含むことが知られている。
　すなわち、MIR302CHGから発現するRNAは、上記miRNAおよびその前駆体、ならびに前記lncRNAを含む。
　本発明において測定される、MIR302CHGから発現するRNAは、lncRNAであることが好ましい。さらに、MIR302CHGから発現する上記３つのlncRNAバリアントのうち、１つ以上の任意のバリアントであることが好ましく、バリアント938および／またはバリアント215であることがより好ましく、バリアント938であることがさらにより好ましい。
　バリアント655、バリアント938およびバリアント215のヌクレオチド配列よりポリA配列を除いた配列の具体的な例を、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示す。従って、本発明の方法において測定するRNAは、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３に記載の配列、または配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３に記載の配列と実質的に同一な配列、を含むヌクレオチド配列を有するRNAであってもよい。より好適には、本発明の方法において測定するRNAは、配列番号２に記載の配列、または配列番号２に記載の配列と実質的に同一な配列、を含むヌクレオチド配列を有するRNAである。なお、細胞内で５’－メチル化シトシンのように塩基が修飾を受けていることがあるが、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３に記載の配列、または配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３に記載の配列と実質的に同一な配列において、そのような修飾塩基を含む配列を有するRNAも測定対象に含まれる。本発明の方法においては、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３に記載の配列または配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３に記載の配列と実質的に同一な配列を有するRNAの相補RNAもしくは相補DNAを測定してもよい。
　本発明において「実質的に同一な配列」とは、上記例示したヌクレオチド配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するヌクレオチド配列、または１もしくは数個の位置での１もしくは数個のヌクレオチドが置換、欠失、修飾または挿入されたヌクレオチド配列を指す。
　なお上記「１もしくは数個」とは、具体的には好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
＜RNAの量の測定＞
　本発明において、「RNAの量の測定」とは、RNAの量の測定を行うことを意味し、仮に測定された量が検出限界以下であったとしても、「RNAの量の測定」に含まれる。
　RNAの量を測定する方法は、細胞集団に含まれるRNAの量を測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、プローブのハイブリダイゼーションを利用した測定法、核酸増幅法を利用した測定法、質量分析法を利用した測定法、シークエンシングを利用した測定法などが挙げられる。核酸増幅法を利用した測定法としては、例えば、逆転写（RT）反応とPCRを組み合わせた定量的RT-PCRにより増幅性を確認する方法または逆転写（RT）反応と2-step ddPCRを組み合わせた2-step (RT) ddPCRにより増幅性を確認する方法またはRNAの増幅性を直接確認するOne-step ddPCR等が挙げられる。本発明のRNAの量を測定する方法は、定量的RT-PCRにより増幅性を確認する方法または2-step (RT) ddPCRにより増幅性を確認する方法を含むことが好ましい。
　具体的には、例えば、細胞集団からRNAを抽出し、抽出したRNAから逆転写反応によってDNAを合成し、定量的PCRにより増幅性を確認すること、または2-step ddPCRにより増幅性を確認することで実施されることが好ましい。
　細胞集団からRNAを抽出する方法は、MIR302CHGから発現するRNAを抽出できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択できる。具体的には、例えば、AGPC法が挙げられる。抽出されるRNAは、トータルRNAであってもよく、MIR302CHGから発現するRNAを含む一部のRNAであってもよい。
　また、細胞集団から抽出したRNAは、DNAを除去する処理を行われることが好ましい。DNAを除去する処理は、公知の処理方法から適宜選択でき、例えば、DNA分解酵素（DNase）を添加する処理方法が挙げられる。
　抽出したRNAから逆転写反応によってDNAを合成する工程は、典型的には、逆転写酵素を用いて実施される。逆転写反応によってDNAを合成する方法は、公知の方法から適宜選択できるが、ポリA配列またはランダム配列を標的としたプライマーを用いて、抽出したRNAを鋳型として逆転写酵素により合成されることが好ましく、ポリA配列を標的としたプライマーを用いて、抽出したRNAを鋳型として逆転写酵素により合成されることがより好ましい。逆転写反応は、後述する定量的PCRまたは2-step ddPCRと同時に行われてもよい。
　定量的PCRにより増幅性を確認する方法は、公知の方法から適宜選択でき、例えば、SYBR(商標)Green法、TaqMan(商標)法などが挙げられる。前述した、RNAから逆転写反応によってDNAを合成する工程と定量的PCRを連続的に、または同時に行うことを、定量的RT-PCRともいう。
　定量的PCRにより、少なくとも、MIR302CHGから発現するRNAの増幅性を確認することが好ましい。定量的PCRにおいて、MIR302CHGから発現するRNA、そのDNA相補配列またはRNA相補配列の一部を増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーの一例として、配列番号４および配列番号５、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、配列番号１０および配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１、ならびに配列番号３２および配列番号３３の組み合わせが挙げられる。
　よって、定量的PCRによるRNAの増幅性の確認は、例えば、配列番号４および配列番号５、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、配列番号１０および配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１、ならびに配列番号３２および配列番号３３からなる組み合わせの群から選ばれる１対以上の組み合わせの配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いることが好ましい。
　2-step ddPCRにより増幅性を確認する方法は、オリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブを組み合わせたddPCRにより実施される。
　2-step ddPCRにより、MIR302CHGから発現するRNAの増幅性を確認することが好ましい。2-step ddPCRにおいて、MIR302CHGから発現するRNA、そのDNA相補配列またはRNA相補配列の一部を増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブの一例として、配列番号３４および配列番号３５の組み合わせの配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットと、配列番号３６に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが挙げられる。
　よって、2-step ddPCRによるRNAの増幅性の確認は、例えば、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列を含むDNAをオリゴヌクレオチドプローブとして、配列番号３４および配列番号３５の組み合わせである配列を有するDNAをオリゴヌクレオチドプライマーセットとして用いることが好ましい。
　定量的PCRまたは2-step ddPCRによる増幅等に基づき、RNAの量が測定できる。
　MIR302CHGから発現するRNAの量を絶対量（コピー数）で評価し、一定量以上、例えば、１コピー以上または１０コピー以上が検出されたときに未分化多能性幹細胞が存在すると決定してもよい。
　また、MIR302CHGから発現するRNAの量をハウスキーピング遺伝子（例えば、TATA-box結合タンパク質（TBP）遺伝子）の発現量で正規化し、その値（相対量）で評価し、その値が、一定量以上を示したときに未分化多能性幹細胞が存在すると決定してもよい。
　一方、測定されたRNAの量は、陽性コントロールに対する相対的な値として示されてもよい。具体的には、例えば、多能性幹細胞からなる細胞集団におけるMIR302CHGから発現するRNAの量の測定値を１として、相対的な値で示されてもよい。
　例えば、一定細胞数の、多能性幹細胞からなる細胞集団（第１の細胞集団）におけるMIR302CHGから発現するRNAの量の測定値を１とし、第１の細胞集団と同じ細胞数の、未分化多能性幹細胞を含みうる細胞集団（第２の細胞集団）におけるMIR302CHGから発現するRNAの量の測定値を相対値で表し、その値に基づいて未分化多能性幹細胞の存在の有無を決定することができる。
　例えば、相対値が、０．０００００１以上である、０．００００１以上である、０．０００１以上である、または０．００１以上であると示されたとき、未分化多能性幹細胞が存在する、と決定することができる。
　本発明の方法に使用する細胞集団は、RNAの量を測定する工程の前に精製、濃縮または任意の分画を分取してもよい。具体的には、例えば、未分化多能性幹細胞を含みうる細胞集団を、未分化多能性幹細胞に特異的な抗原を指標として、または未分化多能性幹細胞に特異的なヌクレオチドを標的としたmRNAスイッチを利用して、または未分化多能性幹細胞の増殖や接着に適した培養条件、等を利用して、純化、濃縮、培養増幅等の処理に供し、未分化多能性幹細胞を含みうる分画を濃縮、および／または分取してもよい。未分化多能性幹細胞特異的な抗原としては、未分化多能性幹細胞に特異的なタンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質、糖脂質、糖鎖等が挙げられ、未分化多能性幹細胞に特異的な細胞表面の抗原が好ましく、具体的には、例えば、TRA-1-60が挙げられる。未分化多能性幹細胞特異的なヌクレオチド を標的としたmRNAスイッチとしては、例えば、miR-302a応答スイッチ（Fujita Y et al. Science Advance 2022 Jan 7;8(1):eabj1793.）などが挙げられる。未分化多能性幹細胞特異的な増殖と接着の条件としては、例えば、Essential-8/LN521 培養増幅法（Tano et al., PLoS One. 2014 Oct 27;9(10):e110496）などが挙げられる。また、ネフロン前駆細胞、膵前駆細胞、肝前駆細胞、尿管芽細胞、間質前駆細胞（例えば、腎間質前駆細胞）、血管内皮細胞、軟骨細胞、胆管前駆細胞、エリスロポエチン産生細胞、神経細胞、心筋細胞、肺細胞等の細胞表面抗原を指標としてセルソーティングを行うことにより、これらの細胞を細胞集団から除くことで、未分化多能性幹細胞を濃縮してもよい。セルソーティング方法は、公知の任意の方法を選択できるが、例えば、磁気ビーズによる濃縮を利用した方法が挙げられる。磁気ビーズによる濃縮は、例えば、MACSによって実施できる。
＜安全性の評価＞
　本発明の方法を用いることで、ヒトiPS細胞由来のネフロン前駆細胞による再生医療等製品など、未分化多能性幹細胞を含みうる細胞集団を用いる製品において、未分化多能性幹細胞を検出することができるため、安全性の評価が可能となる。
　本発明の方法により未分化多能性幹細胞を含まないと判定された細胞集団について、さらに、in vivoにおける腫瘍形成を評価してもよい。
＜未分化多能性幹細胞検出のためのキット＞
　本発明はまた、MIR302CHGから発現するRNAの量を測定するための試薬を含む、未分化多能性幹細胞検出のための試薬キットに関する。
　具体的には、本発明の試薬キットは、（i）MIR302CHGから発現するRNAを測定するためのオリゴヌクレオチドプライマーまたは（ii）MIR302CHGから発現するRNAを測定するためのオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを含む。
　前記（i）のオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、配列番号４および配列番号５、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、配列番号１０および配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１、ならびに配列番号３２および配列番号３３からなる組み合わせの群から選ばれる１対以上の組み合わせの配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットであることが好ましい。上述の通り、このような組み合わせのオリゴヌクレオチドプライマーセットは、定量的PCRによるRNAの増幅性の確認に用いられ得る。したがって、さらに、本発明の試薬キットは、定量的PCRのための試薬を含んでもよい。
　前記（ii）のオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせは、例えば、配列番号３４および配列番号３５の組み合わせの配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットと、配列番号３６に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせであってもよい。上述の通り、このような組み合わせは、2-step ddPCRによるRNAの増幅性の確認に用いられ得る。したがって、さらに、本発明の試薬キットは、2-step ddPCRまたはOne step ddPCRのための試薬を含んでもよい。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施態様には限定されない。
　多能性幹細胞
　多能性幹細胞として、ヒトiPS細胞（ヒトiPSC）を用いた。ヒトiPSCは、iMatrixでコーティングした細胞培養プレート上に、Stem Fit AK02N培地（味の素）またはStem Fit AK03N培地（味の素）を用いたフィーダーレス培養で維持した。また、ヒトiPSCは0.5 mM EDTA/PBS (Thermo Fisher Scientific)を用いて４、５日ごとに継代し、マイコプラズマ汚染を定期的に検査した。
　ネフロン前駆細胞
　ネフロン前駆細胞（NPC）は、Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０２０），Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．３１，１０７４７６に記載の方法で、ヒトiPSCから誘導した。また、ヒトiPSCから前記方法で分化開始して４日目の細胞も、Day4細胞（D4C）として解析に用いた。
　腎間質前駆細胞
　腎間質前駆細胞（IPC）は、WO/2023/017848に記載の方法で、具体的には下記の手法で、ヒトiPSCから分化誘導した。
　ヒトiPSCをまずTrypLE Select Enzyme（Thermo Fisher Scientific）と0.5 mM EDTA/PBSの1：1混合液で5分間酵素処理し、PBS(-)で洗浄した。その後、セルスクレーパーを用いて剥離し、穏やかにピペッティングして単細胞に解離させ、分化開始1日前に10 μM Y-27632と2.4 μL/mL iMatrix-511（Matrixome）を添加したStem Fit AK02N（味の素ヘルシーサプライ） 0.5 mLとともに24穴プレート（コーニング）に1.3 × 104細胞/cm2の密度で播種した。24時間後（0日目）、DMEM/F12 Glutamax（Thermo Fisher Scientific）、B27 supplement minus vitamin A（Thermo Fisher Scientific）、0.5 × Penicillin/Streptomycinからなる無血清分化培地（以下、基礎培地という）に5 μM CHIR99021（Wako）、10 nM RA（Sigma）、1 ng/mL BMP4 (Peprotech)および100 ng/mL bFGF (Wako)を添加して培養を開始した。さらに24時間後（1日目）、5 μM CHIR99021、100 ng/mL bFGFおよび1 ng/mL BMP7（R＆D Systems）を含む基礎培地で培養した。2日目に、培地を5 μM CHIR99021、100 nM LDN193189および10 μM A83-01（Wako）を含む基礎培地に切り替えた。3日目に、培地を5 μM CHIR99021、30 ng/mL bFGF、10 ng/mL activin A（R&D Systems）および30 μM Y-27632（Wako）を含む基礎培地に切り替えた。4日目に、細胞をPBS(-)で洗浄し、Accumax（Innovative Cell Technologies）で処理し、穏やかにピペッティングして単細胞に解離し、96ウェル低細胞付着プレート（Thermo Fisher Scientific）に2.0 × 104細胞/wellの密度で播種（3D培養）した。培地は5 μM CHIR99021、30 ng／mL bFGF、10 ng／mL activin A、30 μM Y-27632を含む基礎培地を用いて48時間培養した。その後、1 μM CHIR99021、10 μM SB431542、100 nM RA、10 ng/mL IL-1b、500 nM スムーズンド（SMO）アゴニスト（SAG）を組み合わせて48時間、さらに1 μM CHIR99021、10 μM SB431542、100 nM RA、500 nM スムーズンド（SMO）アゴニスト（SAG）を組み合わせて72時間処理し培養した。
　尿管芽細胞
　尿管芽細胞（ND）は、Ｍａｅ，　ＳＩ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ，　３２　（２０２０），　１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０２０．１０７９６３に記載の方法で、ヒトiPSCから誘導した。
　RNAシーケンス（RNA-Seq）解析
　トータルRNAは、RNeasy Mini kit（QIAGEN）を用いて製造元の推奨プロトコルに従って単離した。次に、TruSeq Stranded Total RNA（Illumina）を用いてシーケンスライブラリーを作製した。このライブラリーを、NovaSeq SP Reagent Kit v1.5 (200 cycles)（Illumina）を用いて101-8-8-101サイクルでシーケンシングした。遺伝子発現の定量は、ENCODEプロジェクト（https://www.encodeproject.org/pipelines/ENCPL002LPE/）で使用されている解析パイプライン（2.3.4）を用いて行った。リファレンス配列はENSEMBL 104におけるGRCh38を用いた。遺伝子の定義はGENCODE 38のGRCh38を用いた。ヒトiPSCとNPCの比較解析は、前述パイプラインにより計算され推定される数（STAR-RSEM）により、二群間解析（DESeq2）を用いて行った。
　既に報告され、レポジトリで公開されたRNA-Seqデータの解析については以下の手順で行った。NPCおよびヒトiPSC（201B7株）については、Homo sapiens GRCh38 cDNA遺伝子アノテーション（Ensembl）を用いて、Salmonを用いて転写物の定量を行った。Salmonからの出力は、R/Bioconductorパッケージのtximportを用いて処理され、遺伝子発現値が得られた。DEG解析はiDEP（バージョン0.92）を使用して実施した。iDEPを用いて、k平均法による上位1,000個のDEGに対するエンリッチメント解析を遺伝子オントロジー（GO）の生物学的プロセスを用いて行った。
　膵前駆細胞、肝オルガノイドのRNA-seqデータからは、GREINを用いて遺伝子レベルの正規化counts per million（CPM）または転写レベルのtranscripts per million（TPM）を取得した。
　定量的RT-PCR
　以下の手順で定量的RT-PCRを行った。
　トータルRNAは、RNeasy kit（QIAGEN）を用いて製造元の推奨プロトコルに従って単離した。トータルRNAから、ReverTra Ace（東洋紡）およびオリゴdTを用いて、標準プロトコルに従って逆転写反応を行いcDNAを合成した。定量的PCRは、QuantStudio 3リアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher Scientific）とTB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)（タカラバイオ）を用いて行った。変性は９５℃で３０秒間行い、その後９５℃で５秒と６０℃で３４秒を４５サイクル行った。遺伝子発現量のデータ解析には比較Ct法による定量を行い、値はハウスキーピング遺伝子であるTBPで正規化した。PCRは、各サンプルで少なくとも３回行った。PCRに用いたプライマーを、表１に示す。
　2-step ddPCR
　以下の手順で2-step ddPCRを行った。
　トータルRNAは、RNeasy kit（QIAGEN）を用いて製造元の推奨プロトコルに従って単離した。トータルRNAから、ReverTra Ace（東洋紡）およびオリゴdTを用いて、標準プロトコルに従って逆転写反応を行いcDNAを合成した。
　ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)（Bio-Rad）、フォワードおよびリバースプライマー 900 nM、並びにFAMまたはHEXダイとZEN-Iowa Black蛍光クエンチャーで標識されたプローブ 250 nMを用い、トータルRNAから得たcDNAを添加してddPCRを行った。まず、液滴をQX200 Droplet Generator（Bio-Rad）またはAutomated Droplet Generator（Bio-Rad）で８ウェルカートリッジ内に、製造元の説明に従って生成した。この油中水型エマルジョンを96ウェルプレートに移し、C1000 Touchサーマルサイクラー（Bio-Rad）を用いてPCRを行った。反応条件は、９５℃での酵素活性化を10分間行い、９４℃での変性３０秒および57.1℃でのアニール／伸長反応６０秒を含むサイクルを４０サイクル行った。PCR増幅後、生成物を98℃で10分間変性させ、蛍光強度を測定するまで4℃で冷却した。サンプルから得た各液滴の蛍光強度は、QX200 Droplet Reader（Bio Rad）を使用して測定した。増幅産物を含む陽性の液滴は、QuantaSoftソフトウェアで蛍光振幅の閾値を適用することで、陰性の液滴と区別し、計数した。閾値は液滴の分布に基づいて手動で決定し、TBPでは4000、MIR302CHGでは7000に設定した。QuantaSoftソフトウェアでは、1マイクロリットルあたりのターゲットのコピー数（copies/μL）として濃度の結果が提供される。TBPのコピー数あたりのターゲット遺伝子のコピー数の比率を算出した。
　磁気ビーズによる細胞濃縮
　磁気ビーズによる細胞濃縮は、MACS（Miltenyi Biotec）により行った。ヒトiPSCおよびNPCをAccumax（Innovative Cell Technologies, Inc.）で解離し、各細胞懸濁液を２００ｇで７分間、４℃で遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、各細胞ペレットを0.5% BSA（WakoまたはMiltenyi Biotec）および10 μM Y-27632が添加されたMACS Rinsing solution（Miltenyi Biotec）に再懸濁した。ヒトiPSCおよびNPCを１：１０６の割合で含む細胞懸濁液を調整し、１０６細胞あたり1μLのAnti-TRA-1-60 MicroBeads, human（Miltenyi Biotec）を加え、４℃で１５分間インキュベートし、５分ごとにタッピングした。次に、前記懸濁液を100μmセルストレーナー（Falcon）を用いてろ過し、MidiMACS separator（Miltenyi Biotec）が取り付けられたLSカラムにアプライした。その後、前記カラムを0.5%BSAが添加されたMACS Rinsing solutionを用いて２回洗浄した。前記標識された細胞のアプライと洗浄は、１秒間に約１滴の速度で落下させるようシリンジを軽く押して行った。陽性画分は１秒当たり２～３滴の速度でシリンジを軽く押すことで流し出し、回収した。２００ｇで５分間遠心分離した後、陽性分画および陰性分画から得た細胞をそれぞれ、β－メルカプトエタノールを添加したRLTバッファー（QIAGEN）を用いて溶解し、解析まで－８０℃で保存した。
（実施例１）
多能性幹細胞の検出
　ヒトiPSCでは高発現しているがNPCでは発現していない遺伝子を同定するため、ノンコーディングRNAを含めたRNA-seq解析を行い、26の極めて高発現の遺伝子（log2FC < - 10 & FDR <10-5）を同定した（図１）。このうちlncRNAに関するMIR302CHGは、従来の残存iPS細胞の検出に用いられるLIN28Aや、寄託されたRNA-seqデータの解析においてもヒトiPSCでの差次的な高発現（データ省略）が認められるCUZD1よりも高い、全転写産物100万個あたりの各転写産物値（transcripts per million：TPM値）を示すことを見出した（図２）。
　また、MIR302CHGは分化後のNPCだけでなく、NPC分化プロトコルの４日目（D4C）の細胞と比較しても、iPSCにおける高度に差次的な高発現が認められた（図３）。さらに、MIR302CHGの３つのスプライシングバリアントENST00000510655.1（バリアント655）、ENST00000509938.1（バリアント938）、およびENST00000505215.1（バリアント215）のいずれにおいても、上記のiPSCにおける高度に差次的な高発現が見られた（図４）。
　MIR302CHGから発現するlncRNAはポリ(A)3'尾部を有するため、オリゴdTを用いた逆転写（RT）反応を行うことができる。そこで、MIR302CHGと、CUZD1および多能性マーカーPOU5F1について、ヒトiPSCとNPCまたは分化４日目細胞（D4C）由来のcDNAを100％～10-5％で10-1刻みで混合したものを用いて、定量的RT-PCRによる解析を行った。なお、MIR302CHGについては、配列番号６および７の組み合わせ（上記表１の＃２にあたる）のプライマーを用いた。結果を図５に示す。TBPで正規化されたMIR302CHGの発現パターンは、iPSCの割合が低い場合、CUZD1およびPOU5F1の発現パターンよりもiPSCの検出に優れていた。MIR302CHGの発現を定量的RT-PCRで解析することにより、NPCでは10-3％（105細胞に1細胞）、D4Cでも10-1（103細胞に1細胞）程度のiPSCの混入を検出しうることが示唆された。
　さらに、MIR302CHGから発現するlncRNAを標的とする、上記表１の各々の組み合わせのプライマーを用いて、それぞれヒトiPSCとNPCで定量的RT-PCRによる解析を行った。結果を図６に示す。いずれの組み合わせのプライマーであっても、iPSCはNPCに比べて顕著に高い比較Ct（dCt）値を示した。
（実施例２）
　細胞濃縮および定量的PCRによる多能性幹細胞の検出
　ネフロン前駆細胞（NPC）の細胞集団に、全細胞数の10-4％にあたるiPSCを混合し、10-4％iPSCとした。
　10-4％iPSCを、TRA-1-60表面抗原を指標として磁気ビーズによる細胞濃縮を行い、TRA-1-60陽性分画（PF）および陰性分画（NF）を回収した。
　MIR302CHGと、CUZD1およびPOU5F1について、NPC、iPSC、10-4％iPSC、TRA-1-60　PFおよびTRA-1-60　NFの各区画において、定量的RT-PCRにより増幅性を確認した。なお、MIR302CHGについては、配列番号６および７の組み合わせ（上記表１の＃２にあたる）のプライマーを用いた。結果を図７に示す。
　磁気ビーズによる濃縮とMIR302CHGから発現するRNAの量を測定する定量的RT-PCRの組み合わせにより、NPCまたはD4Cに混入した10-4％、すなわち106に１個以上のiPSCの混入を検出できると考えられる。一方、CUZD1やPOU5F1では、同様の手法でも、NPCまたはD4Cのいずれか、または両方で106に１個以上のiPSCの混入を検出することは困難であった。
（実施例３）
　2-step ddPCRによる多能性幹細胞の検出
　MIR302CHGについて、ヒトiPSCとNPC由来のcDNAを100％～10-5％で10-1刻みで混合したものを用いて、定量的RT-PCRによる解析を行った。なお、MIR302CHGから発現するバリアント938を標的とする配列番号３４および３５の組み合わせのプライマーおよび配列番号３６のプローブを用いた。結果を図８に示す。
　10-4％以上のiPSCの混入によって、MIR302CHGから発現するRNAの量がNPCより高く、特に、10-2％以上のiPSCの混入においては、明確に高いことが示された。よって、MIR302CHGから発現するRNAの量を測定する2-step ddPCRにより、NPCに混入した10-4％～10-2％、すなわち106～10４に１個以上のiPSCの混入を検出できると考えられる。
（実施例４）
　ヒトiPSC由来膵前駆細胞およびヒトiPSC由来肝細胞におけるMIR302CHGの発現
　一般に公開されているRNA-seqデータセットから、ヒトiPSC由来膵前駆細胞および肝オルガノイドにおけるMIR302CHGの発現を解析した。図９はＫｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ（２０２０），Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２７，１５６１－１５７２で報告されたヒトiPSCまたはヒトiPSC由来膵前駆細胞の、図１０はKotaka, M. et al., 2017, Sci. Rep. 7, 1-13.で報告されたヒトiPSCまたはヒトiPSC由来肝細胞の、各々の公開されているRNA-seqデータセットを用いて解析した、MIR302CHGの各転写バリアントのTPM値である。
　いずれも、NPCとの比較と同様、iPSCでMIR302CHGの高発現が見られたが、分化により発現はほとんど見られなくなった。したがって、膵臓系への分化および肝臓系への分化時にも、MIR302CHGによる未分化細胞の検出が可能である。
（実施例５）
　ヒトiPSC由来神経前駆細胞および神経細胞におけるMIR302CHGの発現
　一般に公開されているRNA-seqデータセットから、ヒトiPSC由来神経前駆細胞および神経細胞におけるMIR302CHGの発現を解析した。図１１はChen et al., 2013, PLoS One. 2013;8: e75682. doi:10.1371/journal.pone.0075682で報告されたヒトiPSCまたはヒトiPSC由来神経前駆細胞および神経細胞の公開されているRNA-seqデータセットを用いて解析した、MIR302CHGの各転写バリアントのTPM値である。
　iPSCではMIR302CHGの高発現が見られたが、分化により発現はほとんど見られなくなった。したがって、神経系への分化時にも、MIR302CHGによる未分化細胞の検出が可能である。
（実施例６）
　ヒトiPSC由来心筋細胞におけるMIR302CHGの発現
　一般に公開されているRNA-seqデータセットから、ヒトiPSC由来心筋細胞におけるMIR302CHGの発現を解析した。図１２はBanovich et. al., 2018., Genome Res. 2018; 28: 122-131. doi:10.1101/gr.224436.117で報告されたヒトiPSCまたはヒトiPSC由来心筋細胞の公開されているRNA-seqデータセットを用いて解析した、MIR302CHGの各転写バリアントのTPM値である。
　iPSCではMIR302CHGの高発現が見られたが、分化により発現はほとんど見られなくなった。したがって、心筋系への分化時にも、MIR302CHGによる未分化細胞の検出が可能である。
（実施例７）
　ヒトES細胞（ESC）由来肺細胞におけるMIR302CHGの発現
　一般に公開されているRNA-seqデータセットから、ヒトESC由来肺前駆細胞または肺オルガノイドにおけるMIR302CHGの発現を解析した。図１３はJacob A et al., Cell Stem Cell. 2017; 21: 472-488.e10. doi:10.1016/j.stem.2017.08.014で報告されたヒトESC、ヒトESC由来肺前駆細胞または肺オルガノイドの公開されているRNA-seqデータセットを用いて解析した、MIR302CHGの各転写バリアントのTPM値である。
　iPSCではMIR302CHGの高発現が見られたが、分化により発現はほとんど見られなくなった。したがって、肺細胞への分化時にも、MIR302CHGによる未分化細胞の検出が可能である。
（実施例８）
　ヒトiPSC、IVF-ESC、nt-ESC由来血管内皮細胞におけるMIR302CHGの発現
　一般に公開されているRNA-seqデータセットから、ヒトiPSC、IVF-ESC、またはnt-ESCおよびそれら由来の血管内皮細胞におけるMIR302CHGの発現を解析した。図１４はZhao et. al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114: E11111-E11120.で報告されたヒトiPSC、IVF-ESC、nt-ESCまたはヒトiPSC、IVF-ESC、nt-ESC由来血管内皮細胞の公開されているRNA-seqデータセットを用いて解析した、MIR302CHGの各転写バリアントのTPM値である。
　iPSCではMIR302CHGの高発現が見られたが、分化により発現はほとんど見られなくなった。したがって、血管内皮細胞への分化時にも、MIR302CHGによる未分化細胞の検出が可能である。
（実施例９）
　ヒトESC、前方原始線条、胚体内胚葉、前方前腸、後方前腸、中腸/後腸におけるMIR302CHGの発現
　ヒトESCおよびそれから誘導された前方原始線条、胚体内胚葉、前方前腸、後方前腸、中腸/後腸においてMIR302CHGの発現を解析した。その結果、図１５に示すように、MIR302CHGはESC、前方原始線条および胚体内胚葉では発現するが、前方前腸、後方前腸、中腸/後腸では発現が低下することが分かった。したがって、MIR302CHGの量を測定することで、未分化多能性幹細胞だけでなく、胚体内胚葉や前方原始線条などの分化初期の細胞も検出でき、前腸、中腸、後腸以降の細胞と識別できることがわかった。
（実施例１０）
　腎間質前駆細胞および尿管芽細胞におけるMIR302CHGの発現
　上記「腎間質前駆細胞」および「尿管芽細胞」の記載に従い、ヒトiPSCから腎間質前駆細胞（IPC）および尿管芽細胞（ND）をそれぞれ得た。当該IPCおよびNDと、ヒトiPSCの区画で、MIR302CHGについて定量的RT-PCRによる解析を行った（IPCはN=4、NDはN=5）。なお、測定値はハウスキーピング遺伝子であるTBPで正規化した（MIR302CHG/TBP）。結果を図１６に示す。
　IPCではMIR302CHGは検出されない程度に発現が低かった。NDにおいてもMIR302CHGは、iPSCと比較して1/10,000程度の極めて低い発現であった。すなわち、iPSCで高発現が見られたMIR302CHGは、腎間質前駆細胞への分化および尿管芽細胞への分化のいずれの分化によっても、発現はほとんど見られなくなった。よって、腎間質前駆細胞への分化および尿管芽細胞への分化時にも、MIR302CHGによる未分化細胞の検出が可能である。
　本発明によれば、多能性幹細胞から分化誘導されたネフロン前駆細胞を含む細胞集団に残存する未分化多能性幹細胞を検出することができる。これにより、ヒトiPS細胞由来のネフロン前駆細胞を含む再生医療等製品（細胞療法用、移植臓器再構築用等）などの安全性の評価が可能となる。
　また、ネフロン前駆細胞以外の他の分化細胞培養系においても、残存する未分化多能性幹細胞を検出することが期待される。そのため、ヒトiPS細胞由来のネフロン前駆細胞以外の他の分化細胞、例えば、膵前駆細胞、肝前駆細胞、尿管芽細胞、間質前駆細胞（例えば、腎間質前駆細胞）、血管内皮細胞、軟骨細胞、胆管前駆細胞、エリスロポエチン産生細胞、神経細胞、心筋細胞、肺細胞などを用いた再生医療等製品にも応用することができる。

Claims (15)

  1. 　未分化多能性幹細胞を検出するための方法であって、
    　（A）未分化多能性幹細胞を含みうる細胞集団において、MIR302CHGから発現するRNAの量を測定する工程を含む、方法。
  2. 　前記多能性幹細胞が、人工多能性幹（iPS）細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記MIR302CHGから発現するRNAが、スプライスバリアントENST00000509938.1および／またはENST00000505215.1である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記MIR302CHGから発現するRNAが、スプライスバリアントENST00000509938.1である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記MIR302CHGから発現するRNAが、
    (a) 配列番号２もしくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列、または
    (b) 配列番号２もしくは配列番号３に記載のヌクレオチド配列と90％以上の相同性を有するヌクレオチド配列
    を含むRNAである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記工程（A）が、定量的PCRにより増幅性を確認する工程または2-step ddPCR（Droplet digital PCR）により増幅性を確認する工程を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記定量的PCRにより増幅性を確認する工程が、配列番号４および配列番号５、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、配列番号１０および配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１、ならびに配列番号３２および配列番号３３からなる組み合わせの群より選ばれる１対以上の組み合わせの配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いる工程である、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記2-step ddPCRにより増幅性を確認する工程が、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号３４および配列番号３５の組み合わせである配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットとを用いる工程である、請求項６に記載の方法。
  9. 　前記工程（A）において、多能性幹細胞のみで構成された細胞集団におけるRNAの量を１とすると、前記細胞集団におけるRNAの量が0.000001以上である、と測定されたとき、前記細胞集団に含まれる前記未分化多能性幹細胞を検出したと判定する工程を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記工程（A）の前に、未分化多能性幹細胞特異的抗原を用いたセルソーティングにより前記未分化多能性幹細胞を含む分画を濃縮する工程を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記未分化多能性幹細胞抗原が、TRA-1-60である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導されたネフロン前駆細胞、膵前駆細胞、肝前駆細胞、尿管芽細胞、間質前駆細胞、血管内皮細胞、軟骨細胞、胆管前駆細胞、エリスロポエチン産生細胞、神経細胞、心筋細胞、および／もしくは肺細胞、または多能性幹細胞からそれらいずれかの細胞への分化途中段階に得られる細胞を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記細胞集団が、多能性幹細胞から分化誘導されたネフロン前駆細胞または多能性幹細胞からネフロン前駆細胞への分化途中段階に得られる細胞を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　未分化多能性幹細胞を検出するための試薬キットであって、
    　（i）MIR302CHGから発現するRNAの量を測定するためのオリゴヌクレオチドプライマーまたは（ii）オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを含む、試薬キット。
  15. 　前記（i）のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号４および配列番号５、配列番号６および配列番号７、配列番号８および配列番号９、配列番号１０および配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５、配列番号２６および配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１、ならびに配列番号３２および配列番号３３からなる組み合わせの群より選ばれる１対以上の組み合わせの配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットである、または前記（ii）のプライマー及びプローブの組み合わせが、配列番号３４および配列番号３５の組み合わせである配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーセットと、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブとの組み合わせである、請求項１４に記載の試薬キット。
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