WO2022114242A1

WO2022114242A1 - 虚血性血管障害の治療用医薬

Info

Publication number: WO2022114242A1
Application number: PCT/JP2021/044001
Authority: WO
Inventors: 修本望
Original assignee: Nipro Corp; Sapporo Medical University
Current assignee: Nipro Corp; Sapporo Medical University
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2021-11-24
Publication date: 2022-06-02
Anticipated expiration: 2023-05-26
Also published as: JPWO2022114242A1

Abstract

本発明は、間葉系幹細胞を有効成分として含む虚血性血管障害を治療するための医薬組成物であって、閉塞血管の再開通療法の効果が得られない患者に投与され、その治療効果を改善することを特徴とする、虚血性血管障害の治療薬に関する。

Description

虚血性血管障害の治療用医薬

関連出願
　本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０２０−１９５８１６（２０２０年１１月２６日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
技術分野
　本発明は、間葉系幹細胞を含む虚血性血管障害の治療薬に関する。より詳しくは、閉塞血管の再開通療法の効果が得られない患者に投与され、その治療効果を改善することを特徴とする、虚血性血管障害の治療薬に関する。

　急性虚血性脳梗塞の再開通療法は、脳動脈の閉塞または狭窄を有する患者の標準的な治療戦略である。しかし、再開通の成功率が約７０％まで向上したにもかかわらず、患者の５４％は、９０日時点でのｍＲＳ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｒａｎｋｉｎ　Ｓｃｏｒｅ）が３~６点という、好ましくない結果のままである。最近の研究では、脳の微小循環障害が、急性虚血性脳梗塞の大血管再灌流後の転帰不良に大きくかかわる可能性があることが示唆されている。よって、微小血管系の回復による微小循環改善のために、追加の治療方法を開発する必要がある。

　間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）には脳（実質及び血管）の保護作用があることが知られている。脳梗塞後のＭＳＣ投与は、梗塞体積を減らし、行動機能を改善することが、実験的梗塞モデルを用いて確認されている（非特許文献１~３、特許文献１）。また、ＭＳＣの静脈投与による脳梗塞患者の治療も多数実施され、運動機能や損傷部位の改善が報告されている（非特許文献４、特許文献２）。

　発明者らは、閉塞血管の再開通療法と、間葉系幹細胞の静脈内投与を併用することで、脳出血のリスクを低減できることを報告している（特許文献３）。

ＷＯ２００２／０００８４９号ＷＯ２００９／００２５０３号ＷＯ２０１７／１１１１５３号

Ｉｉｈｏｓｈｉ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．２００４；１００７：１−９．Ｎｏｍｕｒａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２００５；１３６：１６１−１６９．Ｈｏｎｍａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００６；１９９：５６−６６．Ｈｏｎｍｏｕ　Ｏ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒａｉｎ．２０１１；１３４：１７９０−１８０７．

　本発明の課題は、虚血性疾患における再開通療法の治療効果が十分得られない患者において、その治療効果を改善することにある。

　発明者らは、同一の行動症状と虚血性脳梗塞量を示す２つの実験モデルを使用して、脳梗塞誘発後に投与されたＭＳＣの治療効果を比較することで、ＭＳＣの静脈内投与が中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）後の再開通療法の治療効果を高めることを確認した。

　すなわち、本発明は以下の（１）~（１１）に関する。
（１）間葉系幹細胞を有効成分として含む虚血性血管障害を治療するための医薬組成物であって、閉塞血管の再開通療法の効果が得られない患者に投与される、医薬組成物。
（２）閉塞血管の再開通療法が、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、及び血液凝固阻害薬の投与、ならびに血栓の物理的除去から選ばれるいずれか１又は２以上を含む、（１）に記載の医薬組成物。
（３）虚血性血管障害が虚血性脳血管障害又は心筋梗塞である、（１）又は（２）に記載の医薬組成物。虚血性脳血管障害としては、脳梗塞や一過性脳虚血発作等が挙げられる。好ましくは、虚血性脳血管障害は脳梗塞である。
（４）急性期から亜急性期の虚血性血管障害に投与される、（１）~（３）のいずれかに記載の医薬組成物。例えば、急性期において閉塞血管の再開通療法を受けた患者において、当該再開通療法の効果が得られない患者に対して、本発明の医薬組成物が投与される。
（５）虚血性血管障害の急性期において閉塞血管の再開通療法を受け、当該再開通療法の効果が得られない患者に対して、虚血性血管障害の急性期から亜急性期において投与される、（１）~（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）虚血性血管障害における再開通療法の治療効果を改善する、（１）~（５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）治療効果の改善が、局所脳血流量の増加、微小血管系の回復、及び行動機能の向上から選ばれる１又は２以上である、（６）に記載の医薬組成物。あるいは、治療効果の改善は脳神経系機能の改善である。
（８）間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、（１）~（７）のいずれかに記載の医薬組成物。好ましくは、間葉系幹細胞は投与を受ける患者自身の骨髄から単離された間葉系幹細胞である。
（９）閉塞血管の再開通療法の効果が得られない患者において、間葉系幹細胞を含む医薬組成物を投与することを特徴とする虚血性血管障害の治療方法。
（１０）虚血性血管障害の治療における再開通療法の効果を改善するための方法であって、閉塞血管の再開通療法の効果が得られない患者に、間葉系幹細胞を含む医薬組成物を投与することを特徴とする、前記方法。
（１１）虚血性血管障害を治療するための医薬組成物の製造における間葉系幹細胞の使用であって、前記医薬組成物が閉塞血管の再開通療法の効果が得られない患者に投与されることを特徴とする、前記使用。

　本発明によれば、虚血性疾患における再開通療法の治療効果が得られない（効果が不十分な）患者において、ＭＳＣを静脈内投与することにより、再開通療法の治療効果を改善させることができる。本発明により、局所脳血流量の増加と微小血管系回復の促進が期待され、これにより再開通療法を受けた患者のより良い臨床転帰がもたらされる。

図１Ａは実験プロトコルの概要を示す。図１Ｂ−１ＤはＭＲＡ画像を示す（Ｂ：無傷のラットのＭＲＡ、Ｃ：ｐＭＣＡＯ誘導後７日目のＭＣＡの完全な閉塞、Ｄ：ｔＭＣＡＯ誘導後７日目の再開通）。図２はトレッドミル負荷試験の結果を示す。グラフは７、８、１１、１４、２１、２８、３５、４２、及び４９日目において、ラットがトレッドミル上を走行できた最大速度を示す（＊＊Ｐ＜０．０１，＊Ｐ＜０．０５）。図３は虚血病変部位のＭＲＩ解析結果を示す。図３Ａは４つのグループの代表的Ｔ２ＷＩを示す。図３Ｂは、推定される虚血性病変体積を示す。図４はＡＳＬ−ＭＲＩ解析の結果を示す。図４Ａは、ＭＣＡＯ誘導７日後及び４９日後における４つのグループの代表的なＡＳＬ画像を示す。図４Ｂは、７、８、１１、１４、２１、２８、３５、４２及び４９日目における各グループのｒＣＢＦ（局所脳血流量）率を示す（＊＊Ｐ＜０．０１，＊Ｐ＜０．０５）。図５は毛細血管の三次元解析結果を示す。図５Ａ−５Ｄは、ＭＣＡＯ誘導４９日後の４つの実験群の代表的な共焦点顕微鏡画像を示す。図５Ｅは、反対側の対照半球に対する虚血半球（同側）の毛細血管容積の比率（同側／対側）を示す（＊＊Ｐ＜０．０１，＊Ｐ＜０．０５）。

１．虚血性血管障害治療薬
　本発明は、閉塞血管の再開通療法（例えば、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、血液凝固阻害薬を含む医薬の投与や血栓の物理的除去）の効果が得られない患者に投与されることを特徴とする、間葉系幹細胞を含む虚血性血管障害を治療するための医薬組成物に関する。

［間葉系幹細胞］
　本発明で使用される間葉系幹細胞とは、間葉系組織の間質細胞の中に微量に存在する多分化能および自己複製能を有する幹細胞であり、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などの結合組織細胞に分化するだけでなく、神経細胞や心筋細胞への分化能を有することが知られている。

　間葉系幹細胞のソースとしては、骨髄、末梢血、臍帯血、胎児胚、脳、歯髄、骨、などが挙げられるが、骨髄由来の間葉系幹細胞（骨髄間葉系幹細胞）、とくにヒト骨髄間葉系幹細胞が好ましい。骨髄由来の間葉系幹細胞は、１）顕著な効果が期待できる、２）副作用の危険性が低い、３）充分なドナー細胞の供給が期待できる、４）非侵襲的な治療であり自家移植が可能であるので、５）感染症のリスクが低い、６）免疫拒絶反応の心配がない、７）倫理的問題がない、８）社会的に受け入れられやすい、９）一般的な医療として広く定着しやすいなどの利点がある。さらに、骨髄移植療法は既に臨床の現場で用いられている治療であり、安全性も確認されている。また、骨髄由来の幹細胞は遊走性が高く、局所への移植ばかりか、静脈内投与によっても目的の損傷組織へ到達し、治療効果が期待できる。

　細胞はＥＳ細胞や誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞等）から分化誘導した細胞であっても、株化された細胞であっても、生体から単離・増殖させた細胞であってもよい。細胞は、他家細胞由来でも自家細胞由来であってもよいが、自家細胞由来（患者自身の細胞に由来する）間葉系幹細胞が好ましい。

　本発明で使用される間葉系幹細胞は未分化な状態であることが好ましい。未分化な状態の細胞は増殖率および生体内導入後の生存率が高いからである。発明者らは、そのような細胞の取得方法も開発しており、その詳細はＷＯ２００９／００２５０３号に記載されている。

　発明者らが開発した前記方法では、骨髄液等から抗凝固剤（ヘパリン等）と実質的に接触しない条件で分離した細胞を、ヒト血清（好ましくは、自家血清）を含み、かつ、抗凝固剤（ヘパリン等）を含まないかあるいは極めて低濃度で含む培地を用いて増殖させる。

　培地における細胞の密度は、細胞の性質および分化の方向性に影響を与える。間葉系幹細胞の場合、培地中の細胞密度が８，５００個／ｃｍ^２を超えると、細胞の性質が変化してしまうため、最大でも８，５００個／ｃｍ^２以下で継代培養させることが好ましく、より好ましくは、５，５００個／ｃｍ^２以上になった時点で継代培養させる。

　発明者らが開発した前記方法ではヒト血清含有培地を使用するため、血清ドナーの負担を考慮して、培地交換はなるべく少ない回数であることが望ましく、例えば、少なくとも週１回、より好ましくは週１~２回の培地交換を行う。

　培養は、細胞の総数が１０^８個以上になるまで継代培養を繰り返し行う。必要とされる細胞数は、使用目的に応じて変化し得るが、例えば、脳梗塞などの虚血性脳疾患の治療のための移植に必要とされる間葉系幹細胞の数は、１０^７個以上と考えられている。発明者らが開発した方法によれば、１２日間程度で１０^７個の間葉系幹細胞を得ることができる。

　増殖したＭＳＣは、必要に応じて、使用されるまで凍結保存などの手法で（例えば、−１５２℃のディープフリーザーにて）保存してもよい。凍結保存には、血清（好ましくはヒト血清、より好ましくは自家血清）、デキストラン、ＤＭＳＯを含む培地（ＲＰＭＩ等の哺乳動物細胞用の培地）を凍結保存液として使用する。例えば、通常の濾過滅菌したＲＰＭＩ２０．５ｍＬと、患者から採取した自己血清２０．５ｍＬ、デキストラン５ｍＬ、ＤＭＳＯ　５ｍＬを含む凍結保存液に細胞を懸濁して−１５０℃で凍結保存することができる。例えば、ＤＭＳＯとしては、ニプロ株式会社製の凍害保護液（ＤＭＳＯ）、デキストランは大塚製薬製の低分子デキストランＬ注を使用できるが、これらに限定されない。

　本発明の医薬に含まれるＭＳＣの細胞数は多い程好ましいが、対象への投与時期や、培養に要する時間を勘案すると、効果を示す最小量であることが実用的である。したがって、本発明の医薬の好ましい態様において、間葉系幹細胞の細胞数は、１０^７個以上、好ましくは５×１０^７個以上、より好ましくは１０^８個以上、さらに好ましくは５×１０^８個以上である。

　本発明の医薬は、好ましくは非経口投与製剤、より好ましくは非経口全身投与製剤、特に静脈内投与製剤である。非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤等の注射剤や移植片などが挙げられる。非経口投与製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であり、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、培地（とくに、ＲＰＭＩ等の哺乳動物細胞の培養に用いられる培地）、ＰＢＳなどの生理緩衝液、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤等を適宜組み合わせて、適切な単位投与形態に製剤化される。

　注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、培地、ＰＢＳなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールや非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等と併用してもよい。

［虚血性血管障害］
　本発明の医薬は虚血性血管障害を治療するために使用される。虚血性血管障害とは、動脈血流の減少により、局所的な血管障害（例えば、変性、閉塞）を呈する状態を言い、例えば、虚血性脳血管障害や虚血性心疾患を挙げることができる。

　虚血性脳血管障害：
　本発明の医薬は虚血性脳血管障害を治療するために使用される。前述のとおり、ＭＳＣには脳（実質及び血管）の保護作用があることが知られており、既に静脈投与による脳梗塞等の虚血性脳血管障害の治療にも使用されている。

　虚血性脳血管障害としては、例えば、脳梗塞（例えば、アテローム血栓性脳梗塞、脳血栓、脳塞栓、ラクナ梗塞、ＢＡＤ（Ｂｒａｎｃｈ　Ａｔｈｅｒｏｍａｔｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｔｒｏｕｓｓｅａｕ症候群、血液凝固異常、動脈解離、静脈梗塞、血管炎、抗リン脂質抗体症候群）、及び一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）等が挙げられる。

　虚血性心疾患：
　本発明の医薬は心筋梗塞等の虚血性心疾患を治療するためにも使用される。心筋梗塞は心臓に酸素や栄養を供給する冠動脈血管に閉塞や狭窄が起きて血液の流量が下がり、心筋が虚血状態になり壊死する状態を言う。

［閉塞血管の再開通療法］
　本発明の医薬は、虚血性血管障害を有する患者のうち、閉塞血管の再開通療法の効果が得られない患者に投与される。前述のとおり、再開通療法は、虚血性血管障害の標準的な治療戦略であり、再開通直後から劇的に症状が改善される患者もいるが、効果が得られない患者もいる。本発明において、「閉塞血管の再開通療法の効果が得られない」とは、効果が全くないという意味ではなく、臨床症状の回復が不十分な患者を意味する。例えば、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｒａｎｋｉｎ　Ｓｃａｌｅ（ｍＲＳ）という日常生活動作の指標、あるいはＮＩＨ　ｓｔｒｏｋｅ　ｓｃａｌｅのような神経症状のスケールで評価した場合の再開通療法後の改善率が不十分な患者を対象とする。本発明の医薬組成物は、そのような再開通療法の効果が得られない患者に対して使用され、再開通療法の効果を向上させる。

　閉塞血管の再開通療法は、とくに限定されず、例えば、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、血液凝固阻害薬を含む医薬の投与や血栓の物理的除去が挙げられる。

　血栓溶解剤：
　虚血性血管障害（とくに急性期又は超急性期の虚血性脳血管障害や心筋梗塞）では、虚血による壊死を防止するため、血栓溶解あるいは血栓の物理的除去等による閉塞血管の再開通が治療の第一選択となる。血栓溶解剤としては、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔｉｓｓｕｅ−Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ｔ−ＰＡ）、ナサルプラーゼ、ストレプトキナーゼ等が挙げられる。

　血小板凝集阻害薬（抗血小板薬）：
　血小板凝集阻害薬（抗血小板薬）は、血小板の凝集を阻害することで血栓形成を予防することができる。血小板凝集阻害薬としては、例えば、アスピリン、クロピドグレル、シロスタゾール、チクロピジン等が挙げられるが、これらに限定されない。

　血液凝固阻害薬（抗凝固剤）：
　血液凝固阻害薬（抗凝固剤）は、凝固因子の機能を阻害することで血栓形成を予防することができる。血液凝固阻害薬としては、例えば、ヘパリン、低分子ヘパリン、アルガトロバン、ダナパロイドナトリウム、ダルテパリン、ナドロパリン、ベミパリン、フォンダパリヌクス、アルガトロバン等のアンチトロンビン剤等が挙げられるが、これらに限定されない。

　血栓の物理的除去：
　血栓の物理的除去方法は、血管内手術等による機械的血栓回収療法や頚動脈内膜剥離術などが挙げられるが、これらに限定されない。また、バイパス手術、ステント治療、バルーン治療、吸引治療、超音波等による破砕等、による血流再開等でも良い。

　本発明の医薬の投与時期は、閉塞血管の再開通療法後であればとくに限定されないが、急性期又は亜急性期、好ましくは急性期から亜急性期の虚血性血管障害の患者に投与される。典型的には、虚血性血管障害の急性期に閉塞血管の再開通療法を受け、その後、急性期から亜急性期において、当該再開通療法の効果が得られない場合に、ＭＳＣを含む本発明の医薬組成物が投与されることが好ましい。

　本発明の医薬は、閉塞血管の再開通療法の効果が得られない患者に使用されることで、再開通療法の治療効果を改善することができる。例えば、ＭＳＣを投与することで、局所脳血流量の増加、微小血管系の回復、及び／又は行動機能の向上が促進される。虚血性血管障害の患者においては、再開通療法を受けても脳神経系機能が回復しないことが多数あることが臨床上の問題である。ＭＳＣの投与は、この脳神経系機能を改善させ、閉塞血管の再開通療法（例えば、大血管閉塞のために血管内血栓摘出術）を受けた患者のより良い臨床転帰を可能にする。

２．虚血性血管障害の治療方法
　本発明は、閉塞血管の再開通療法（血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、血液凝固阻害薬を含む医薬の投与や血栓の物理的除去等）の効果が得られない患者に、ＭＳＣを含む医薬組成物を投与することを特徴とする虚血性血管障害の治療方法を提供する。

　発明者らは、ＭＳＣの投与は、血管内皮を保護し、内皮障害を抑制することで、脳出血のリスクを低減させ、安全な閉塞血管の再開通療法（例えば、血栓溶解療法や血栓の物理的除去）を実現させることを既に確認している。本発明においては、再開通療法の効果が得られない患者において、ＭＳＣの静脈内投与は、微小循環の改善作用を助け、局所脳血流量の増加、微小血管系の回復をもたらすことを確認した。前記効果は、ＭＳＣの有する組織再生・修復効果と相俟って、運動機能障害を改善し、梗塞病変部位の治癒を促進させ、より効果的な虚血性血管障害の治療を可能にする。

１．概要
　以下の、ＭＳＣの静脈内投与がラットの中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）後の再開通療法の治療効果を高めるという仮説を検証した。再開通療法の有無にかかわらず、同一の行動症状及び虚血性脳梗塞体積を示した２つの実験モデルを使用して、脳梗塞誘発７日後にＭＳＣを投与し、治療効果を比較した。

［試験群］
（１）ｐＭＣＡＯ（ｐＭＣＡＯ）＋ビヒクル投与
（２）ｔＭＣＡＯ（ｔＭＣＡＯ）＋ビヒクル投与
（３）ｐＭＣＡＯ＋ＭＳＣ投与
（４）ｔＭＣＡＯ＋ＭＳＣ投与
−ｐＭＣＡＯ（永久中大脳動脈閉塞）
−ｔＭＣＡＯ（一過性中大脳動脈閉塞）：中大脳動脈を１１０分間閉塞

［評価項目］
　行動機能、虚血体積、及び局所脳血流量（ｒＣＢＦ）を実験中記録した。微小血管系の組織学的評価も実施した。

２．材料及び方法
［ラット骨髄からのＭＳＣの調製］
　ＭＳＣは、既報に基づいて準備した（Ｎａｋａｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　４０８：３６１−３７７，２０１９）。すなわち、成体Ｗｉｓｔａｒラット（６~８週齢）の大腿骨から得た骨髄を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で希釈して１５ｍｌとし、１０％熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭ　ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを加え、５％ＣＯ_２を含む加湿雰囲気中３７℃で３日間インキュベートした。培養物がほぼコンフルエントに達したときに、接着細胞をトリプシン−エチレンジアミン四酢酸溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｓｉｇｍａ）を用いて剥離し、１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ　ｍｅｄｉｕｍで継代培養した。本実験では、３継代後の培養ＭＳＣを使用した。表面抗原の表現型解析を行い、ＭＳＣがＣＤ４５⁻、ＣＤ７３^＋、ＣＤ９０^＋、及びＣＤ１０６⁻であることを確認した。

［脳虚血モデル］
　既報にしたがい、永久中大脳動脈閉塞（ｐＭＣＡＯ）及び一過性中大脳動脈閉塞（ｔＭＣＡＯ）を誘発した。成体雄ＳＤラット（２８０−３３０ｇ；ｎ＝７２）に、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射で麻酔をかけた。本研究では、縫合糸による閉塞／再開通モデルを採用した。ｐＭＣＡＯの場合、長さ２０．０~２４．０ｍｍの３−０外科用ＭＯＮＯＳＯＦ縫合糸（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）を、火炎で先端を丸め、ＭＣＡの起点をブロックするまで、外頸動脈から内頸動脈の内腔に挿入した（Ｎａｇａｈａｍａ　ｅｔ　ａｌ，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　１６９５：３７−４４，２０１８、Ｎａｍｉｏｋａ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ：１−８，２０１８）。ｔＭＣＡＯの場合、火炎で先端を丸めた同じ外科用ＭＯＮＯＳＯＦ縫合糸（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）を、ＭＣＡの起点を１１０分間ブロックするまで外頸動脈から内頸動脈の内腔に挿入した。ＭＣＡＯから１１０分後、縫合糸を抜くことにより再開通を行った。生理学的変数（直腸温、血液ｐＨ、ｐＯ_２、ｐＣＯ_２、及び血圧）は、すべての動物で手術中正常範囲内に維持され、グループ間で統計的に差異はなかった。

［実験プロトコル（図１Ａ）］
　ｐＭＣＡＯ及びｔＭＣＡＯ確立７日後、Ｔ２強調画像（Ｔ２ＷＩ）を取得し、初期梗塞体積を評価した。このＭＳＣ又はビヒクル投与直前である７日目の初期梗塞体積が基準（３００±６０ｍｍ^３）に満たない動物は実験から除外した（包含率は約４０％）。ｐＭＣＡＯ及びｔＭＣＡＯを受けたラットを、４つのグループにランダム化した。グループ１（ｎ＝１８）では、ｐＭＣＡＯラットにビヒクル（１ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ、細胞なし）を静脈内投与した。グループ２（ｎ＝１９）では、ｔＭＣＡＯラットにビヒクル（１ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ、細胞なし）を静脈内投与した。グループ３（ｎ＝１８）では、ｐＭＣＡＯラットにＭＳＣ（各１．０×１０^６細胞）を含む１ｍｌのＤＭＥＭを静脈内投与した。グループ４（ｎ＝１７）では、ｔＭＣＡＯラットにＭＳＣ（各１．０×１０^６細胞）を含む１ｍｌのＤＭＥＭを静脈内投与した。静脈内投与は左大腿静脈から送達した。すべてのラットにシクロスポリンＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）を毎日投与した。すべてのラットは、トレッドミル負荷試験とＭＲＩを使用した梗塞体積の測定を受けた。各グループから選択したラットについて、ＡＳＬ−ＭＲＩを使用したｒＣＢＦの測定、及び毛細血管の３次元解析による組織学的評価を実施した。

［トレッドミル負荷試験］
　トレッドミル負荷試験は、既報にしたがって実施した（Ｎａｇａｈａｍａ　ｅｔ　ａｌ．２０１８、及び
Ｎａｋａｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ　１２７：９１７−９２６，２０１７）。すなわち、ラットは、ｐＭＣＡＯ又はｔＭＣＡＯ誘導前に、速度２０ｍ／ｍｉｎ、傾斜２０°に設定したトレッドミル（Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ　Ｉｎｃ．）上を、週２日、１日２０分走らせた。７０ｍ／ｍｉｎで走れなかったラットは除外した。ｐＭＣＡＯ又はｔＭＣＡＯ誘発後、１８０秒のカットオフ時間で３回の試行を実施した。ラットがトレッドミル上を走行できる最大速度を、ｐＭＣＡＯ又はｔＭＣＡＯ誘導後７日目（ＭＳＣ又はビヒクル投与直前）、並びに８、１１、１４、２１、２８、３５、４２、及び４９日目（それぞれ、ＭＳＣ又はビヒクル投与後１、４、７、１４、２１、２８、３５、及び４２日後）に記録した。

［ＭＲＩ研究］
　ＭＲＩ測定は、７−Ｔ　ＭＲＩスキャナー（７０／１６　ＰｈａｒｍａＳｃａｎ、Ｂｒｕｋｅｒ　Ｂｉｏｓｐｉｎ　ＭＲＩ　ＧｍｂＨ、ドイツ、エットリンゲン）を使用して行った。ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与でラットを麻酔した。

　三次元飛行時間型磁気共鳴血管造影（ＭＲＡ）画像を取得し、ｐＭＣＡＯ又はｔＭＣＡＯ誘導後７日目（ＭＳＣ又はビヒクル投与直前）にｐＭＣＡＯのＭＣＡの完全な閉塞（図１Ｃ）及びｔＭＣＡＯの再開通（図１Ｄ）を確認した。図１Ｂに無傷の動物のＭＲＡを示す。

　梗塞体積の測定のためにＴ２ＷＩを取得した。既報に従い、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．５２、ＮＩＨ）を使用してＴ２ＷＩから虚血量を計算した（前掲Ｎａｇａｈａｍａ　ｅｔ　ａｌ　２０１８）。次いで、高信号領域を合計し、スライス厚とスライス間のギャップを掛けて、病変体積を計算した。ＭＲ画像はｐＭＣＡＯ又はｔＭＣＡＯ誘導後７日目（ＭＳＣ又はビヒクル投与直前）、並びに８、１１、１４、２１、２８、３５、４２、及び４９日目（それぞれ、ＭＳＣ又はビヒクル投与後１、４、７、１４、２１、２８、３５、及び４２日後）に取得した。

［ＡＳＬ］
　ＣＢＦ画像は、ｓｉｎｇｌｅ−ｓｈｏｔ　ｓｐｉｎ−ｅｃｈｏ　ｅｃｈｏ−ｐｌａｎｅｒ　ｉｍａｇｉｎｇ（ＥＰＩ）により連続ＡＳＬを使用して取得した。ＣＢＦマップは、Ｍａｔｌａｂ（Ｔｈｅ　Ｍａｔｈ　Ｗｏｒｋｓ　Ｉｎｃ．）のｉｎ−ｈｏｕｓｅコードを用いて計算した。ＣＢＦは、バクストンの一般的な動的開通モデルを使用してｍＬ／１００ｇ／ｍｉｎで計算した。既報にしたがい、脳血流の定量化のために、ブレグマ−０．４ｍｍの冠状スライスを選択した（前掲Ｎａｋａｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．２０１７）。関心領域（ＲＯＩ）は、虚血性皮質及び梗塞が生じていない半球に配置した。各ＲＯＩのＡＳＬ由来のｒＣＢＦは、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して定量化した。ｒＣＢＦ率は、虚血性皮質のｒＣＢＦを非梗塞半球のｒＣＢＦで割った値に基づいて計算した。

［毛細血管の三次元解析］
　微小血管系の回復は、既報を若干修正して解析した（Ｋｏｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　１３３４：８４−９２，２０１０）。ラットに麻酔をかけ、ＦＩＴＣ−レクチン（１．６ｍｇ／ｋｇ、ミリポアシグマ）を静脈内灌流した。脳をすみやかに摘出し、４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で４８時間固定した。冠状ビブラトーム切片（１００μｍ）は、レーザー走査型共焦点イメージングシステム（ＬＳＭ７８０　ＥＬＹＲＡ　Ｓ．１システム、Ｚｅｉｓｓ、）を使用して解析した。切片（嗅脳溝のすぐ下、正中線から３ｍｍ右、皮質表面から０．５ｍｍの深さ）は、共焦点顕微鏡を用いてスキャンした。血管容積は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して３次元で測定した。毛細血管容積は、反対側の対照半球に対する虚血半球（同側）の比率で表す。

［統計解析］
　すべての統計解析は、Ｒ（Ｔｈｅ　Ｒ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）のグラフィカルユーザーインターフェイスであるＥＺＲ（埼玉医療センター、自治医科大学）を使用して実施した。多重比較には、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定とＳｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ事後検定を使用した。データは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表す。差は、ｐ＜０．０５で統計的に有意と見なした。

３．結果
［行動機能］
　ラットがトレッドミル上を走ることができる最大速度を記録した。ＭＣＡＯの７日後、ＭＳＣ又はビヒクルの投与前に得られた最大速度により、４つのグループ間に差がないことを確認した（ｐ＝０．４７５：図２）。グループ４（ｔＭＣＡＯ＋ＭＳＣ：ｎ＝１７）の最大速度は、ｐＭＣＡＯ又はｔＭＣＡＯ誘導後１、４、２１、２８、３５、４２、及び４９日目におけるグループ３（ｐＭＣＡＯ＋ＭＳＣ；ｎ＝１８）の最大速度よりも高かった。これらのデータは、投与されたＭＳＣが脳虚血における再開通療法の治療効果を向上させることを示す。

　ＭＳＣは、ｔＭＣＡＯ（グループ４）後のトレッドミル負荷試験でも、１４、２１、２８、３５、４２、及び４９日目におけるビヒクル処置（グループ２：ｎ＝１９）と比較して、治療効果が認められた。ｐＭＣＡＯモデルでは、ＭＳＣ投与（グループ３）は、ＭＣＡＯ誘導後３５、４２、及び４９日目におけるビヒクル投与（グループ１：ｎ＝１８）よりも高い有効性を示した。データを図２にまとめて示す。以上のとおり、ＭＳＣはｔＭＣＡＯモデルとｐＭＣＡＯモデルの両方で有効であったが、ｔＭＣＡＯモデルでより大きな効果が認められた。

［ＭＲＩで測定された虚血性病変体積］
　行動試験で使用した動物と同じ動物のｉｎ　ｖｉｖｏ　ＭＲＩを使用して４つのグループについて虚血性病変体積を推定した。９つの時点（ＭＣＡＯ誘導後７、８、１１、１４、２１、２８、３５、４２、及び４９日目；ＭＳＣ又はビヒクル投与後１、４、７、１４、２１、２８、３５、及び４２日目）における、４つのグループの代表的Ｔ２ＷＩを図３Ａに示す。ＭＣＡＯ誘発７日後、ＭＳＣ又はビヒクルの投与前に取得したＴ２ＷＩより、初期１回拍出量にグループ間で差がないことを確認した（ｐ＝０．７０５）。すべてのグループで、推定病変体積はＭＣＡＯ誘導後の４９日間（ＭＳＣ又はビヒクル投与後４２日間）の過程で徐々に減少した（図３Ｂ）。推定虚血量にグループ間で有意差はなかった。

［動脈スピンラベル（ＡＳＬ）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）］
　ｒＣＢＦを評価するために、ＡＳＬから得られたＣＢＦマップにより、虚血脳における血行動態の定量分析を実施した（方法と図４を参照）。ＭＣＡＯ誘導７日後及び４９日後における４つのグループの代表的なＡＳＬ画像を図４Ａに示す。

　ＭＣＡＯ誘導の７日後（ＭＳＣ又はビヒクルの注射の直前）、一過性閉塞グループ（グループ２：ｔＭＣＡＯ＋ビヒクル；ｎ＝１１、及びグループ４：ｔＭＣＡＯ＋ＭＳＣ；ｎ＝１１）のｒＣＢＦ率はより高かった。永久閉塞グループのｒＣＢＦ率（グループ１：ｐＭＣＡＯ＋ビヒクル；ｎ＝９、及びグループ３：ｐＭＣＡＯ＋ＭＳＣ；ｎ＝９）。しかし、４９日目に、一過性閉塞を受けたグループ２のｒＣＢＦ率は大幅に低下し、永久閉塞とＭＳＣ治療を受けたグループ３と同レベルに達した。したがって、一過性閉塞後のｒＣＢＦ率は、ＭＳＣ投与なしでは大幅に減少する（グループ２）。

　２つのモデル（ｐＭＣＡＯ及びｔＭＣＡＯ）の局所脳血流の比は、７日目において実質的に同じであった（グループ１とグループ２はほぼ同じ、グループ３とグループ４はほぼ同じ）。しかしながら、ＭＳＣ投与群のｒＣＢＦ率は、ｐＭＣＡＯ又はｔＭＣＡＯの誘導後４２日目及び４９日目におけるビヒクル群のｒＣＢＦ率よりも高かった（グループ１＜グループ３＜グループ２＜グループ４）。グループ４のｒＣＢＦ率も、ｐＭＣＡＯ又はｔＭＣＡＯ誘導後４２日目と４９日目におけるグループ３のｒＣＢＦ率よりも高かった。まとめると、病変誘発の７日後にＭＳＣを静脈内投与した一過性閉塞（グループ４）は、実験群の中で最大の治療効果を示した。データを図４Ｂに示す。

［毛細血管の三次元解析］
　病変部の毛細血管の三次元解析を行い、微小血管系の範囲を決定した。ＭＣＡＯ誘導４９日後の４つの実験群の代表的な共焦点顕微鏡画像を図５Ａ−５Ｄに示す。ＭＳＣ投与群は、ｔＭＣＡＯ（グループ４；Ｎ＝７対グループ２；Ｎ＝９）及びｐＭＣＡＯ（グループ３；Ｎ＝６対グループ１；Ｎ＝５）の両方において、ＭＣＡＯ誘導後４９日目により高い比（同側／対側）を示した。グループ４における比は、グループ３の比よりも大きかった。グループ２の比はグループ３の比と統計的に差異はなかった。これは、再開通後７日目において効果が得られていないラットにおいては、ＭＳＣ投与なしで微小血管系を維持するには、再開通のみでは不十分であることを示唆する。まとめると、ＭＳＣ治療を受けた一過性閉塞（グループ４）は、４つのグループ中最大の微小血管系の回復を示した。結果を図５Ｅに示す。

４．考察
　本実験により、ＭＳＣの静脈内投与が再開通脳梗塞治療の治療効果を高めることが示された。トレッドミル負荷試験による行動機能スコア、ＡＳＬにより評価したｒＣＢＦ、及びＦＩＴＣ^＋毛細血管の３次元解析を使用した微小血管系の回復は、ｐＭＣＡＯ後のＭＳＣ治療よりもｔＭＣＡＯ後のＭＳＣ治療の方が高かった。評価した虚血量には、４つのグループの間で有意差は認められなかった。したがって、ＭＳＣ投与は、ＭＣＡＯの再開通療法の治療効果を促進し得る。

　血管内血栓摘出術の最近の進歩は、大血管閉塞によって引き起こされる急性脳虚血のほとんどの患者に臨床的利益をもたらすが、効果が不十分な患者も存在する。本実験では、ｐＭＣＡＯとｔＭＣＡＯ（閉塞期間：１１０分）において、虚血後の試験期間（７日から４９日）中において、同様の状態を呈するモデルシステムを用いてＭＳＣ投与の効果について解析を行った。なお、同様の状態は、ｐＭＣＡＯとｔＭＣＡＯのビヒクルグループ間の虚血性一回拍出量と行動機能の評価に基づく。ｐＭＣＡＯ又はｔＭＣＡＯ誘導７日後に、ＭＳＣ又はビヒクルを各グループに投与しているため、本実験は、亜急性期のｐＭＣＡＯとｔＭＣＡＯに対するＭＳＣ投与の治療効果を比較するものと言える。ｔＭＣＡＯ＋ＭＳＣグループのｒＣＢＦと微小血管系の回復の程度は、いずれも、ｐＭＣＡＯ＋ＭＳＣグループよりも大きかった。ＭＳＣ投与はｐＭＣＡＯとｔＭＣＡＯのいずれに対しても治療効果を示すが、再開通とＭＳＣ投与の組み合わせがより良い結果をもたらし得る。本実験の結果により、再開通療法の不十分な（再開通７日目においてｐＭＣＡＯと状態が変わらない）治療効果を、ＭＳＣ投与によって向上させ得ることが確認された。

　ＭＳＣを使用した細胞治療は、脳梗塞を含む多くの神経疾患に対して検討されている。血管内血栓摘出術は現在、確立された脳梗塞治療である。急性再開通療法を受けた患者は、将来、臨床現場でＭＳＣ投与を受ける可能性がある。ｒＣＢＦの増加と微小血管系回復の両方が促進されたことは、血管閉塞のために血管内血栓摘出術を受けた患者のより良い臨床転帰に貢献する可能性がある。

　本発明によれば、閉塞血管の再開通療法（例えば、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、血液凝固阻害薬を含む医薬の投与や血栓の物理的除去）の治療効果を改善し、患者のより良い臨床転帰がもたらされる。

　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

Claims

　間葉系幹細胞を有効成分として含む虚血性血管障害を治療するための医薬組成物であって、閉塞血管の再開通療法の効果が得られない患者に投与される、医薬組成物。
　閉塞血管の再開通療法が、血栓溶解剤、血小板凝集阻害薬、及び血液凝固阻害薬の投与、ならびに血栓の物理的除去から選ばれるいずれか１又は２以上を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
　虚血性血管障害が虚血性脳血管障害又は心筋梗塞である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
　急性期から亜急性期の虚血性血管障害に投与される、請求項１~３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
　虚血性血管障害の急性期において閉塞血管の再開通療法を受け、当該再開通療法の効果が得られない患者に対して、虚血性血管障害の急性期又は亜急性期において投与される、請求項１~４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
　虚血性血管障害における再開通療法の治療効果を改善する、請求項１~５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
　治療効果の改善が、局所脳血流量の増加、微小血管系の回復、及び行動機能の向上から選ばれる１又は２以上である、請求項６に記載の医薬組成物。
　間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項１~７のいずれか１項に記載の医薬組成物。