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WO2021215465A1 - タバコ植物体とその製造方法 - Google Patents

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WO2021215465A1
WO2021215465A1 PCT/JP2021/016145 JP2021016145W WO2021215465A1 WO 2021215465 A1 WO2021215465 A1 WO 2021215465A1 JP 2021016145 W JP2021016145 W JP 2021016145W WO 2021215465 A1 WO2021215465 A1 WO 2021215465A1
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WO
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tobacco
ccd4
plant
polynucleotide
endogenous gene
Prior art date
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PCT/JP2021/016145
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English (en)
French (fr)
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洋 真籠
雅雄 新井
大山　清
高倉　由光
遼 西口
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Japan Tobacco Inc
Original Assignee
Japan Tobacco Inc
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Publication date
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Priority to JP2022517067A priority patent/JPWO2021215465A1/ja
Priority to BR112022021375A priority patent/BR112022021375A2/pt
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    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)

Definitions

  • the present invention relates to a tobacco plant that improves the quality of leaf tobacco, a method for producing the tobacco plant, and a harvested product from the tobacco plant and a processed product of the harvested product.
  • Carotenoid is a general term for biological pigments that exhibit red, yellow, or orange, and plant carotenoids include ⁇ -carotene and lutein. Degradation products of carotenoids are collectively called apocarotenoids. Apocarotenoids, which are degradation products of carotenoids, contain aroma components such as ⁇ -damascenone, ⁇ -ionone and megastigma trienone.
  • Carotenoids are attracting attention as beneficial substances (vitamin A precursors as nutrients and antioxidants) that maintain normal biological functions. For this reason, various crops in which the amount of carotenoid accumulated has been increased by gene recombination technology (GM technology) have been produced for the purpose of commercial use and improvement of stress tolerance of plants.
  • GM technology gene recombination technology
  • Patent Document 1 As an example of increasing the accumulation amount of carotenoid in Bemisia tabaci, it is known that a gene involved in drug administration to a plant and carotenoid biosynthesis or metabolism is overexpressed by GM technology (Patent Document 1). However, the elimination of drugs from plants and products is a problem for drug administration. Also, when GM technology is used to introduce an extrinsic gene into a plant, the position at which it is inserted into the genome cannot be controlled.
  • Carotenoid oxidative cleavage enzyme CCD is an oxidase that cleaves carotenoids as a substrate to produce apocarotenoids. Based on their sequence homology, it is known that nine types of CCD genes (some of which are referred to as NCED by numbering) are widely conserved in higher plants. Of these, CCD1 and CCD4 have been reported to be involved in the regulation of carotenoid levels and / or the production of apocarotenoids in multiple plant species.
  • Non-Patent Document 1 reports on the existence of three CCD4 genes in tobacco and the expression of the three CCD4 genes in tobacco plants.
  • the flavor and taste of tobacco products is a complex quality that appeals to human senses, and it is thought that it is based on the balance of various components contained in the leaf tobacco, which is the material. Since there are multiple genes having similar functions in plants, it is very difficult to control various components as intended.
  • One aspect of the present invention is to realize a tobacco plant that can improve the quality of tobacco products.
  • the present inventors complete the present invention as a result of detailed analysis of the components in a tobacco plant in which a specific endogenous gene is suppressed and actually confirming the quality of a tobacco product. It came to.
  • the tobacco plant according to one aspect of the present invention is a poly encoding a polypeptide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • An endogenous gene containing a nucleotide as a coding region, and a polynucleotide encoding a polypeptide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are included as a coding region.
  • a mutation that causes the suppression of the function has been introduced into the genome.
  • the method for producing a tobacco plant encodes a polynucleotide encoding a polypeptide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • An endogenous gene containing as a region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a coding region.
  • And inhibition of the function of at least one of the endogenous genes comprising a polynucleotide encoding a polypeptide having 80% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 as a coding region.
  • the quality of leaf tobacco harvested from Bemisia tabacum can be improved.
  • One embodiment of the present invention comprises an endogenous gene, which comprises, as a coding region, a polynucleotide encoding a polynucleotide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a mutation that causes suppression of the function of at least one of the endogenous genes containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 80% or more sequence identity to the sequence as a coding region has been introduced into the genome. Providing tobacco plants.
  • the above-mentioned tobacco plant has a change (increase and decrease) in the content of carotenoid and / or apocarotenoid as compared with the wild-type plant.
  • the tobacco plant has a change (increase and decrease) in the content of carotenoids and / or apocarotenoids in its leaves (raw leaves and dry leaves). Therefore, the balance of various components contained in the tobacco plant has changed as compared with the conventional tobacco plant, and the balance is the flavor (quality) of the tobacco product obtained from the tobacco plant.
  • the tobacco product with improved flavor (quality) may be any of cigarettes, cigars, heat-not-burn tobacco (non-combustible tobacco flavor aspirator), and smokeless tobacco.
  • the processed leaf tobacco product obtained from the tobacco plant can also be used as a flavor source for electronic cigarettes and the like.
  • the content of individual carotenoids and apocarotenoids in the tobacco plant may be increased or decreased.
  • the tobacco plant capable of producing an improved flavored tobacco product, the tobacco plant has an increased total carotenoid content as compared to a wild-type tobacco plant.
  • total carotenoid content refers to the content of all carotenoids in a plant of the genus Tobacco, as quantified using absorptiometry.
  • the total carotenoid content of the tobacco plant is, for example, 1.2 times or more, 1.5 times or more, 1.7 times or more, 1.8 times or more of the total carotenoid content of the wild-type plant of the genus Nicotiana. It is 1.9 times or more, preferably 2 times or more, 2.5 times or more, and more preferably 3 times or more.
  • the tobacco plant preferably has an increased content of at least one of lutein, ⁇ -carotene and zeaxanthin as compared to the wild-type tobacco plant.
  • the content of these carotenoids in the above-mentioned tobacco plant is, for example, 1.2 times or more, 1.5 times or more, 1.7 times or more, 1.8 times or more of the corresponding carotenoid content in the wild-type plant of the genus Nicotiana. It is fold or more, 1.9 times or more, preferably 2 times or more, 2.5 times or more, and more preferably 3 times or more.
  • the amount of these carotenoids can be quantified by using a known method such as high performance liquid chromatography.
  • the tobacco plant preferably has an increased content of at least one of ⁇ -ionone and dihydroactinidiolide (both apocarotenoids) as compared to the wild-type tobacco plant.
  • ⁇ -ionone and dihydroactinidiolide both apocarotenoids
  • these apocarotenoids are known as floral aroma components.
  • Apocarotenoids whose content is partially tolerated include, for example, apocarotenoids known as aroma components ( ⁇ -damascenone, megastigmatrienone (structural isomers) and 3-hydroxy- ⁇ -damascenone).
  • the apocarotenoid can be ⁇ -damascenone, megastigma trienone (structural isomer) and 3-hydroxy- ⁇ -damascenone.
  • the leaf tobacco or its processed product obtained from the tobacco plant has a different color from the leaf tobacco or its processed product obtained from the tobacco plant in which at least one of the endogenous genes is not suppressed in function depending on the carotenoid content. Can exhibit (especially yellow or orange). In particular, smokeless tobacco has many opportunities for the user to directly see the leaf tobacco or its processed product. Therefore, the leaf tobacco or a processed product thereof having the above-mentioned different colors can give the user a visually different impression without being colored.
  • the tobacco plant having an increased content of lutein, ⁇ -carotene or zeaxanthin as compared to wild-type plants can be a source of leaf tobacco and tobacco products with reduced TSNA production.
  • Lutein, ⁇ -carotene and zeaxanthin are known as antioxidants.
  • Antioxidants suppress the production of tobacco-specific nitrosamines (TSNAs).
  • TSNA tobacco-specific nitrosamines
  • NNN N'-nitrosonornicotine
  • NAT N'-nitrosonatabine
  • NAB N'-nitrosonabasine
  • the non-enzymatic reaction nitrogenation of nornicotine, anatabine, anabasin or nicotine with nitrite and the like.
  • the reaction can be inhibited by carotenoids, a type of antioxidant. That is, lutein, ⁇ -carotene or zeaxanthin can reduce the amount of TSNA produced from leaf tobacco and tobacco products.
  • the tobacco product with a reduced TSNA content may be any of cigarettes, cigars, heat-not-burn tobacco (non-combustible tobacco flavor aspirator), and smokeless tobacco.
  • tobacco plant and “tobacco” are whole individuals (eg, adults, seedlings and seeds), tissues (eg, leaves, stems, flowers, roots, reproductive organs, embryos and these. (Some of them, etc.), and these dried products are included.
  • sequence identity of amino acid sequence
  • mismatched portion of the sequence is the portion where substitutions, additions, deletions or insertions (of amino acid residues) are present.
  • polypeptide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in for specifying the polypeptide using the amino acid sequence described in the sequence listing means a wild-type polypeptide. do.
  • the wild-type polypeptide means a polypeptide normally present in the plants of the genus Nicotiana described below.
  • the wild-type polypeptide is, for example, a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2 or 3, or a homologous molecular species of the protein in a plant of the genus Tobacco.
  • polypeptide and “protein” have substantially the same meaning and can be used interchangeably.
  • endogenous gene means a gene that is inherently present on the genome of a plant belonging to the genus Nicotiana. That is, the endogenous gene is not a foreign gene present in plants other than the genus Nicotiana.
  • the polypeptide whose abundance is reduced in the tobacco plant may be a polypeptide having 80% or more sequence identity with each amino acid sequence shown in the sequence listing, and the sequence identity is sufficient.
  • sequence identity is sufficient.
  • higher proportions eg, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more.
  • each gene corresponding to the endogenous gene whose function is suppressed by the mutation has high sequence identity and is highly conserved. That is, the polypeptide encoded by each of the above genes (orthologue of the polypeptide encoded by the above endogenous gene in a plant of the genus Nicotiana has the above-mentioned sequence identity. Examples of sequence identity of genes in homologous molecular species in plants of the genus Nicotiana and other plants are summarized in Table 1.
  • Table 1 shows tobacco CCD4-S protein (SEQ ID NO: 1), tobacco CCD4-.
  • the sequence identity of the homologous molecular species possessed by each plant is shown.
  • the "wild-type tobacco plant” does not have a factor that suppresses the expression of the tobacco CCD4-S gene, the tobacco CCD4-T1 gene, and the tobacco CCD4-T2 gene, and has mutations in these genes. It may be a plant that has not.
  • the "decrease in abundance" of a polypeptide is 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less based on the abundance of wild-type polypeptide. It means the presence of 5% or less, or 1% or less of the polypeptide.
  • the abundance of the polypeptide based on the abundance of the wild-type polypeptide can be appropriately selected from the above-mentioned values that change the content of at least one or more carotenoids or apocarotenoids in tobacco plants.
  • the decrease in the abundance of the above-mentioned polypeptide in the above-mentioned tobacco plant is genetically stable and inherited in the cultured cells, callus, protoplasts, seeds, and progeny obtained from the tobacco plant.
  • the tobacco plant can be an individual generated from cultured cells, callus, protoplasts, seeds or offspring generated through artificial manipulation, and these materials for obtaining the individual can be obtained from the present invention. Included in the range.
  • the tobacco plant can further include the breeding progeny obtained by mating.
  • Many plant species, including rice, wheat, barley, and soybean, are bred using mutants.
  • a mutant isolated from a mutant population treated with a mutagen has a large number of mutations in addition to the gene of interest. Therefore, backcrossing is generally performed to remove extra mutations.
  • the desired trait possessed by the mutant can be introduced into existing cultivars.
  • the breeding progeny thus obtained can be a variety that gives high added value to an existing cultivar.
  • the desired trait of the above mutant is derived from a mutation introduced into a plurality of positions (for example, a plurality of genes) on the genome. Therefore, it is essential for efficient backcrossing to select individuals with the mutation in advance. For individual selection, it is advantageous if the presence or absence of the above-mentioned mutation in an individual and whether the mutation is homozygous or heterozygous can be easily detected.
  • the detection can be performed according to the method described below for detecting a mutation in a gene. Apart from the above viewpoints, it is preferable to obtain a line having a high return rate to the cultivar (the ratio of the genome region derived from the cultivar to the entire genome region) with a smaller number of crosses.
  • MAS Marker Assisted Selection
  • a background marker showing a polymorphism between the above-mentioned mutant and existing cultivars can be mentioned.
  • SNP or SSR Simple Sequence Repeat
  • Nicotiana tabacum (N. tabacum), which is the reference in the following description, is a diploid and has both a genome derived from the ancestral species Nicotiana sylvestris (S genome) and a genome derived from Nicotiana tomentosiformis (T genome). ..
  • S genome the ancestral species Nicotiana sylvestris
  • T genome Nicotiana tomentosiformis
  • CCD4-S gene The three endogenous genes subject to the above-mentioned functional suppression are described as one in the S genome (hereinafter referred to as CCD4-S gene) and two in the T genome (hereinafter referred to as CCD4-T1 gene and CCD4-T2 gene, respectively). Is known to exist.
  • nucleotide sequence in the coding region of some (but not all) genes encoding polypeptides that perform substantially the same function between species is 1 to several% between cultivars. There can be up to about 10% difference between varieties and closely related wild species.
  • the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is encoded by, for example, a polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 (coding region (CDS) of the CCD4-S gene). Has been done.
  • the polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is encoded by, for example, a polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 (coding region (CDS) of the CCD4-T1 gene). Has been done.
  • polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is encoded by, for example, a polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 (coding region (CDS) of the CCD4-T2 gene). Has been done.
  • CCD4-S homologous genes can be easily isolated from various plants.
  • a person skilled in the art who has come into contact with the above description can easily isolate the homologous gene of the CCD4-T1 gene based on (a part of) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, and the homologous gene of the CCD4-T2 gene. Can be easily isolated based on (part of) SEQ ID NO: 6.
  • the stringent condition refers to a condition in which a double-stranded polynucleotide specific to a so-called nucleotide sequence is formed, but the formation of a non-specific double-stranded polynucleotide is significantly suppressed.
  • Tm value melting temperature
  • a condition for hybridization in a general hybridization buffer solution at 68 ° C. for 20 hours can be mentioned.
  • the temperature is 60 to 68 ° C., preferably 65 ° C., more preferably 68 ° C. in a buffer solution consisting of 0.25M Na2HPO4, pH7.2,7% SDS, 1 mM EDTA, 1 ⁇ Denhardt solution.
  • the condition that the washing for 15 minutes is performed twice can be mentioned.
  • Other examples include 25% formamide, under more severe conditions 50% formamide, 4 ⁇ SSC (sodium chloride / sodium citrate), 50 mM Hepes pH 7.0, 10 ⁇ Denhardt solution, 20 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA. After prehybridization in a hybridization solution at 42 ° C. overnight, a labeled probe is added and the mixture is kept warm at 42 ° C. overnight for hybridization.
  • the cleaning liquid and temperature conditions in the subsequent cleaning are about "1 x SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”, and the stricter conditions are about "0.5 x SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”.
  • At least one of the endogenous genes means any of the following 1 to 7.
  • one or more of the following 1 to 3 are functionally suppressed, and in the preferred embodiment, at least one of the following 4 to 6 is functionally suppressed.
  • the following 7 functions are suppressed.
  • suppression of (intrinsic) gene function means a state in which a gene that is inherent in the genome does not exert its original function. Therefore, “suppression of (intrinsic) gene function” means “disruption of (intrinsic) gene", “mutation of (intrinsic) gene” and the said by other than the (endogenous) gene (including foreign genes). It is a term that includes “suppression of (endogenous) gene expression”.
  • Destruction of (intrinsic) gene means that the original gene does not exist on the genome or that a transcript is not produced from the gene on the genome.
  • “Mutation of (intrinsic) gene” is a mutation (decreased or deleted) of a gene in which the original functional polypeptide is not produced, or a functional polypeptide is produced, but the amount produced is reduced. It means a mutation in a gene, or a mutation in a gene in which a functional polypeptide is produced but the stability of the polypeptide is reduced.
  • “Suppression of (endogenous) gene expression” does not cause any change in the base of the (endogenous) gene, but the transcription or translation function of the gene (from transcription to mRNA to subsequent translation into polypeptide).
  • mutant has the meaning commonly understood in the art to which this application belongs, eg, in a base on the wild-type genome, or in a wild-type polypeptide. It means any change in an amino acid residue (eg, substitution, deletion, insertion, addition, duplication, inversion or translocation, etc.). Therefore, “mutation of (intrinsic) gene” means mutation of a gene that does not produce the original functional polypeptide (including mutation that produces a polypeptide with reduced or defective function), and a polypeptide is produced.
  • genes genes that produce less, but mutations in genes that produce polypeptides but reduce the stability of the polypeptide, genes (genome DNA sequences containing coding or untranslated regions) It means a loss of a gene, or a mutation in which transcription from a gene is suppressed (such as a deletion of a transcription control region or a transcription initiation region).
  • the promoter sequence (including the sequence upstream (5'side) with respect to the coding region) and the downstream (3'side) sequence), 5'untranslated.
  • the substitution may be present in the region and the 3'untranslated region, the conserved sequences at both ends of the intron (GT at the 5'end and the AG at the 3'end), and at least one of the coding regions.
  • substitutions in the promoter sequence of a gene, the nucleotide sequences important for gene expression regulation in the 5'untranslated region and the 3'untranslated region reduce the transcriptional activity of the gene or stabilize the transcript from the gene. causess a decrease in sex. Any of these reductions can result in a reduction in translation products with a reduction in transcripts from the above genes.
  • Substitutions (splice mutations) in the above conserved sequences of introns cause abnormal splicing of mRNA, resulting in abnormal mRNA with unwanted introns added or inserted. Abnormal mRNAs either give rise to abnormal translation products or do not terminate translation, for example by frameshifting.
  • the substitution in the coding region is a missense mutation
  • the substitution produces an amino acid different from the original amino acid, which may result in a polypeptide having a reduced or deleted original function.
  • substitutions in the code area can result in incomplete length translations or translations that do not maintain their original function. Incomplete-length translations result from the conversion of amino acid-encoding codons to stop codons (nonsense mutations) by the substitution.
  • the incomplete length translation product lacks one or more consecutive amino acid residues containing the C-terminal amino acid residue as compared to the original translation product.
  • the nonsense mutation occurs at an arbitrary codon upstream of the original stop codon, and is preferably upstream of one or more codons. Therefore, translation products from genes with nonsense mutations are incompletely long. Translation products that impair their original function are produced by amino acid substitutions. In this case, the amount of transcript may be comparable to that of wild-type plants.
  • the translation product has a change in three-dimensional structure or a decrease in function as a functional domain.
  • One preferred embodiment of the mutation of the present invention is an amino acid substitution that results in a translation product that impairs such original function.
  • the amino acid substitutions are preferably non-conservative substitutions that have a high potential to alter the function of the translation product.
  • Non-conservative substitutions are substitutions with amino acids of different charge or hydrophobicity (eg, basic amino acids to acidic amino acids, basic or acidic amino acids to neutral amino acids, neutral amino acids to basic or acidic amino acids, polar amino acids to non-polar amino acids. Substitution with polar amino acids) and substitution with amino acids having side chains with different bulks (three-dimensional size).
  • nonsense-mediated mRNA decay (Brogna and Wen (2009) Nat. Structural Mol. Biol. 16: 107- 113) can occur.
  • Nonsense-mediated mRNA decay causes transcription degradation, so nonsense mutations can result in reduced transcript volume.
  • the target gene consists of a plurality of exons, it is preferable that at least one exon having a nonsense mutation is present in order to generate a nonsense-mediated mRNA decay, and the exon having the nonsense mutation is the target. It is more preferable that it is not the most downstream (3'side) exon constituting the gene.
  • the wild-type Bemisia tabacum CCD4 gene has two exons and one intron.
  • a preferred embodiment of a nonsense mutation that results in a nonsense-mediated mRNA decay is that at least one nonsense mutation is present in the first exon.
  • mutations other than substitutions occur within the promoter sequence, the 5'untranslated region and / or the 3'untranslated region, transcription due to reduced transcriptional activity or stability, similar to substitution. A reduction in product volume and a reduction in the amount of polypeptide can occur as a result. Mutations other than substitutions of introns on conserved sequences can also result in translation of polypeptides having a different amino acid sequence than the original, as well as substitutions. Mutations other than substitutions in the coding region also have different amino acid sequences due to deletions or insertions of amino acid residues (caused by deletions or insertions of successive bases in multiples of 3), or frameshifts. It can result in a translation of the polypeptide that is present. Also, a large deletion containing the entire gene or insertion of a large fragment into the gene can result in loss of expression of the gene itself.
  • the mutation for deleting the function may have one type of mutation in one gene, or may have a plurality of mutations, and the type of mutation does not matter.
  • the above mutant is preferably in any of the states (i) to (iii).
  • at least one endogenous gene is substantially impaired in function, as demonstrated in the Examples described below, and the mutation or disruption described above. (Production of tobacco plants with changes (increases and decreases) in carotenoid and / or apocarotenoid content compared to wild-type plants) can be adequately and reliably achieved.
  • Suppression of the expression of the endogenous gene includes suppression of transcription from the endogenous gene to mRNA, suppression of translation of the endogenous gene into mRNA via mRNA (eg, degradation of the mRNA), and translation. It includes suppression of the function of the polypeptide. Degradation of mRNA can occur due to the nonsense-mediated mRNA decay described above. Suppression of transcription can be realized by inhibition of a transcription factor that promotes transcription from the endogenous gene, inhibition of access of the transcription initiation factor to the endogenous gene, and the like. Translational repression can be achieved using antisense RNA molecules, RNAi molecules, or co-suppressive molecules. Suppression of the function of a polypeptide can be achieved by molecules that inhibit the function of the polypeptide by binding to a functional polypeptide (eg, decoy nucleic acids, ribozymes, antibodies and inhibitory peptides).
  • a functional polypeptide eg, decoy nucleic acids, ribozy
  • the above-mentioned inhibition is, for example, the direct introduction of a molecule for achieving the inhibition into a plant, or the introduction of a nucleic acid molecule encoding the molecule into a plant. It can be realized by (transformation of plant body).
  • the nucleic acid molecule is integrated into one or more arbitrary regions in the plant's genome. As long as the suppression is achieved, the nucleic acid molecule need not be integrated into both the S and T genomes as a result of plant transformation.
  • the functional suppression is preferably a decrease in the abundance of the polypeptide which is an expression product of the endogenous gene as compared with the wild-type plant. Specifically, the abundance is reduced through mutations that cause suppression of the function of the endogenous gene encoding the wild-type polypeptide.
  • a polypeptide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2 or 3 is a polypeptide (or a variant thereof) present in a wild-type plant. Therefore, the tobacco plant is inferior to the function possessed by the wild-type plant because the abundance of the polypeptide is reduced as compared with the wild-type plant.
  • the function is, for example, a function of decomposing one or more carotenoids.
  • the functional suppression is preferably a decrease in the translation amount of the polypeptide which is an expression product of the endogenous gene as compared with the wild-type plant.
  • Translation of a polypeptide is due to a decrease in mRNA (due to the instability of the mRNA itself, the abundance of mRNA such as accelerated degradation of mRNA or suppression of mRNA transcription) or a decrease in the amount of translation from mRNA (translation component (translation component)). It is caused by deficiency of tRNA and ribosome), inhibition of recruitment, functional deficiency, etc.).
  • the functional suppression is preferably a decrease in the abundance of mRNA transcribed from the endogenous gene as compared with the wild-type plant.
  • the decrease in mRNA abundance is caused, for example, by suppression of transcription from genes into mRNA. Suppression of transcription can be realized by inhibition of access of the transcription initiation factor to the endogenous gene, which occurs as a result of introduction of a mutation into the endogenous gene.
  • the suppression of function preferably promotes the degradation of mRNA transcribed from the endogenous gene.
  • Degradation of mRNA is the presence of nonsense mutations that result in nonsense-mediated mRNA decay in endogenous genes, the presence of foreign factors that degrade mRNA, activation of endogenous components that degrade mRNA, or degradation-promoting sequences in mRNA. Can be caused by the presence of.
  • the degradation of mRNA transcribed from the endogenous gene is promoted in the plant of the genus Nicotiana, the amount of the mRNA in the plant of the genus Nicotiana is reduced.
  • the suppression of function may be a decrease in the amount of mRNA transcribed from the endogenous gene as compared with the wild-type plant.
  • “decrease in the abundance of mRNA transcribed from an endogenous gene” is 70% or less, 60% or less, 50% or less, based on the abundance of a transcript of the endogenous gene in a wild-type plant. It means the presence of 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 1% or less of the transcript.
  • the mutation may be the insertion of a polynucleotide expressing a factor that promotes the degradation of mRNA transcribed from the endogenous gene outside the region where the endogenous gene is present.
  • the above factors are preferably antisense RNA molecules, RNAi molecules or co-suppression molecules.
  • mutation or disruption of the endogenous gene occurs as a result of, for example, spontaneous mutation, mutagen treatment, gene recombination, genome editing or gene knockout.
  • Spontaneous mutations of the endogenous genes are commonly caused by replication errors and gene damage.
  • the cause of the damage is exposure to naturally occurring known mutagens (eg, radiation, ultraviolet rays, etc.).
  • the mutagen treatment of the endogenous gene can be carried out by artificially acting the mutagen on a tobacco plant (and optionally in combination with suppression of gene repair function).
  • mutagen for example, chemical agents such as ethylmethanesulfonic acid (EMS), sodium azide, ethidium bromide, and nitrite can be used, but chemical agents that cause mutations in the genomic DNA of plants of the genus Tobacco. If so, it is not limited to these.
  • mutagens include, for example, ⁇ -rays, heavy ion beams, X-rays, neutron rays, UVs, etc., but are not limited to these as long as they are radiations that cause mutations in the genomic DNA of plants of the genus Tobacco. ..
  • the mutagen is preferably EMS.
  • the recombination of the endogenous gene can be carried out by homologously recombining a part or all of the target gene with a recombination sequence according to a known gene recombination method.
  • Genome editing of the above genes can be performed by known techniques (eg, zinc-finger nucleases: ZFN, transcription activator-like effector nucleases: TALEN, and CRISPR / Cas9 system).
  • the above gene knockout can be performed by inserting a known transposon (mobility genetic factor), T-DNA, or the like.
  • SEQ ID NO: 18 indicates the nucleotide sequence of the CCD4-S gene on the genome of Nicotiana tabacum (Tsukuba No. 1).
  • SEQ ID NO: 19 shows the nucleotide sequence of the CCD4-T1 gene on the genome of Nicotiana tabacum (Tsukuba No. 1).
  • SEQ ID NO: 20 shows the nucleotide sequence of the CCD4-T2 gene on the genome of Nicotiana tabacum (Tsukuba No. 1).
  • SEQ ID NO: 21 shows the nucleotide sequence of the CCD4 gene on the Nicotiana sylvestris genome.
  • SEQ ID NOs: 18-21 include a 5'untranslated region and a 3'untranslated region (about 1 kb each).
  • the above-mentioned tobacco plant is not particularly limited as long as it is a plant of the genus Tobacco, and the genus of tobacco is not particularly limited as long as it is a plant belonging to the genus Tobacco (Nicotiana). ⁇ Akaminata (Nicotiana acuminata), Nicotiana acuminata variation multzjlora (Nicotiana acuminata var. ⁇ Arentsii, Nicotiana attenuata, Nicotiana benavidesii, Nicotiana benthamiana, Nicotiana benthamiana, Nicotiana bigerobii, Nicotiana bigerobii, Nicotiana bigerobii (Nicotiana cavicola), Nicotiana clevelandii, Nicotiana cordifolia, Nicotiana cordifolia, Nicotiana corymbosa, Nicotiana debneyi, Nicotiana excelsior ⁇ Fogetiana forgetiana, Nicotiana fragrans, Nicotiana glauca, Nicotiana glutinosa
  • Difolia Naturalfolia (Nicotiana rotundifolia), Nicotiana rustica (Marva Tobacco), Nicotiana setchellii, Nicotiana simulans, Nicotiana solanifoli a), Nicotiana spegauinii, Nicotiana stocktonii, Nicotiana suaveolens, Nicotiana sylvestris, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana tabacum thyrsiflora), Nicotiana tomentosa, Nicotiana tomentosifomis, Nicotiana trigonophylla, Nicotiana umbratica, Nicotiana umbratica, Nicotiana umbratica, Nicotiana umbratica Nicotiana velutina), Nicotiana wigandioides, and hybrids of the genus Tobacco.
  • Nicotiana benthamiana, Nicotiana rustica and Nicotiana tabacum are more preferable, and Nicotiana rustica and Nicotiana tabacum used
  • One embodiment of the present invention comprises an endogenous gene, which comprises, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 80% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a mutation in a tobacco plant that causes suppression of the function of at least one of the endogenous genes containing a polynucleotide encoding a polypeptide having 80% or more sequence identity to the sequence as a coding region.
  • a method for producing a tobacco plant which comprises a step of introducing into the genome.
  • the introduction step changes the content of carotenoids and / or apocarotenoids in the tobacco plant through suppression of the function of the endogenous gene.
  • An overview of varying the content of carotenoids and / or apocarotenoids is as described above. Therefore, as a specific example for carrying out the above step, introduction of a mutation into the above-mentioned endogenous gene using genome editing technology will be described below.
  • Available genome editing techniques include CRISPR / Cas9 system, TALEN and ZFN.
  • the guide RNA and Cas9 protein can be edited, and in TALEN and ZFN, the fusion protein (where the DNA binding domain and nuclease are fused) is present in the target cell, and the genome can be edited. Therefore, the guide RNA and Cas9 protein, as well as the fusion protein, can all be introduced directly into the target cell. Examples of methods for directly introducing these into target cells include a PEG method, an electroporation method, and a particle bombardment method.
  • a vector into which a construct (including a polynucleotide encoding a guide RNA and Cas9 protein, and an arbitrary promoter and / or terminator) is inserted is introduced into target cells and tissues via Agrobacterium or the like. May be good.
  • the complementary sequence of the nucleotide sequence immediately upstream of XGG on the genome forms a base pair with a part of the guide RNA, and the double-stranded genomic DNA is generated by Cas9 in the nucleotide sequence. Get disconnected.
  • the nucleotide sequence may be, for example, a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2 or 3 (which may have a 0.1-1% substitution), or SEQ ID NO: 4.
  • polynucleotides having 5, or 6 which can have 0.1-1% substitution
  • 10 or more consecutive bases eg, 15 or more bases, preferably 15 or more immediately upstream of XGG. Is 17 bases or more, more preferably 18 bases or more, even more preferably 19 bases or more, and most preferably 20 bases or more).
  • each of the pair of DNA-binding domains of the artificial nuclease that forms a dimer binds to a nucleotide sequence that exists at both ends of the FokI cleavage domain via a spacer of 5 to 20 bases.
  • the nucleotide sequence resides on one strand and the other strand of double-stranded genomic DNA, so that one of the pair of DNA-binding domains binds to that one strand and the other to that other strand.
  • the DNA binding domain is composed of a number of modules corresponding to the number of bases to be bound, with 33 to 34 amino acid residues as a repeating unit (module).
  • the nucleotide sequence bound by the DNA binding domain is a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2 or 3 (which may have a 0.1-1% substitution).
  • the FokI cleavage domain it is 10 or more consecutive, preferably 14 or more bases, and more preferably 18 or more bases, each of which is present at both ends of the above via a spacer of 5 to 20 bases.
  • each of the pair of DNA-binding domains of artificial nucleases that form dimers binds to nucleotide sequences that are present at both ends of the FokI cleavage domain via spacers of 5 to 20 bases.
  • the DNA binding domain is composed of a plurality of zinc finger modules.
  • the nucleotide sequence is a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2 or 3 (possibly having a substitution of 0.1 to 1%), or SEQ ID NOs: 4, 5 Alternatively, among the polynucleotide having 6 (which may have a substitution of 0.1 to 1%) and a part of the polynucleotide forming a complementary strand with the polynucleotide, 5 to 5 to both ends of the FokI cleavage domain. It is 9 or more consecutive consecutive bases, preferably 12 or more bases, and more preferably 18 or more bases, which are present via a spacer of 20 bases.
  • CRISPR / Cas9 system TALEN and ZFN, and RNAi described later is a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 2 or 3 according to the description of all items. It can be read as a polypeptide of a homologous molecular species present in other species contained in the genus Tobacco, which has 80% or more sequence identity with the peptide.
  • the description in the preceding paragraph includes a polynucleotide having SEQ ID NO: 4, 5 or 6 in the genus Tobacco, which has 80% or more sequence identity with the polynucleotide. It can be read as a polynucleotide of a homologous gene present in other species.
  • the mutation introduced into the tobacco plant which causes the suppression of the function of the endogenous gene, is inherited genetically.
  • exogenous polynucleotides introduced into a tobacco plant for genome editing are preferably eliminated from the tobacco plant after confirming that the desired mutation has been introduced into the tobacco plant.
  • the desired trait change in carotenoid and / or apocarotenoid content
  • the desired trait is lost due to the introduction (continuation) of unwanted mutations. Is.
  • the introduction of a mutation into the above-mentioned endogenous gene of a tobacco plant, or the disruption of the endogenous gene can be carried out by another bioengineering method (for example, a method using a transposon or Agrobacterium).
  • a specific example of this method is the method of introducing the retrotransposon tnt1 of tobacco or the transposon in other plants, or T-DNA in Ti plasmid of Agrobacterium into a tobacco plant.
  • the above introduction or destruction can be carried out by another method (mutagen treatment of Bemisia tabaci).
  • sources of mutation are small molecule compounds (eg, ethyl methanesulfonic acid (EMS), N-ethyl-N-nitrosourea (ENU), sodium azide, etc.), and radiation (eg, ⁇ -rays, heavy ions). Beams, X-rays, neutrons, ultraviolet rays, etc.).
  • the mutation can be introduced into any renewable tobacco plant.
  • tobacco plants are seeds, roots, leaves, flowers, reproductive organs or embryos, preferably seeds.
  • What can be obtained by the above method can be a mutant population of plants having (or not having) various mutations. Therefore, individuals exhibiting the desired phenotype can be further selected from the mutant population.
  • selecting individuals a procedure for selecting a desired individual from a mutant population (panel) obtained when treated with a mutagen will be described.
  • a functionally deficient tobacco mutant having mutations in a total of four alleles of both the T genome and the S genome can be obtained by the following method.
  • tobacco is treated with a mutagen to prepare a mutant population (panel) of tobacco in which the entire tobacco genome is mutated, and genomic DNA is extracted.
  • the target gene polynucleotide
  • the target gene is amplified from the genomic DNA of the panel, the nucleotide sequence of the product is determined, and strains with homozygous mutations are selected. do.
  • a strain (M2) having a homozygous mutation in each of the S genome and the T genome is obtained, and F1 is produced by crossing them.
  • the self-fertilized progeny (F2) is bred, and a strain having homozygous mutations in both the S and T genomes is obtained from the progeny (obtained with a probability of 1/16 due to two-factor recessiveness).
  • a functionally deficient tobacco mutant having mutations in a total of 6 alleles at two loci on the T genome and one locus on the S genome can be obtained by, for example, the following method.
  • F1 is prepared by crossing a line having a homozygous mutation in both the S and T genomes obtained as described above with a line having a homozygous mutation in another allele on the T genome.
  • the self-fertilized progeny (F2) is bred, and a strain having a homozygous mutation in S, T, and another T is obtained from the strain (obtained with a probability of 1/64 due to three-factor recessive). ..
  • any vector capable of expressing the polynucleotide inserted in the vector in plant cells can be used.
  • the vector for example, pBI-based, pPZP-based, and pSMA-based vectors capable of introducing the desired polynucleotide into plant cells via Agrobacterium are preferably used.
  • plasmids of binary vector systems pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, pBI221, pPZP202, etc. are preferred.
  • the trigger sequence used to suppress the expression of the target gene by RNAi is inserted into the above vector.
  • the trigger sequence may be, for example, part of a polynucleotide (which may have a 0.1-1% substitution) encoding a polynucleotide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, 2 or 3. Consecutive at least 21-30 bases (eg, 21 or more bases, 22 bases) that are part of a polynucleotide having SEQ ID NO: 4, 5 or 6 (which may have a 0.1-1% substitution).
  • the suppression of the expression of the endogenous gene in the tobacco plant is preferably inherited genetically. Therefore, it is preferable that the trigger sequence is integrated into the genome of the tobacco plant.
  • Mutation or disruption of the endogenous gene can be determined by detection of the presence or absence of mutation in the endogenous gene.
  • a method for detecting a mutation in an endogenous gene (1) a commercially available DNA sequence containing the mutation is amplified by PCR or the like, and then the DNA nucleotide sequence is directly decoded using a sequencer or the like, and (2) SCSP.
  • Method of determining the presence or absence of mutation by detecting whether or not it has been soyed (PCR method using TaqMan probe, MassARRAY analysis method), (8) Difference in mobility of electrophoresis in the case of deletion or insertion
  • PCR method using TaqMan probe, MassARRAY analysis method (8) Difference in mobility of electrophoresis in the case of deletion or insertion
  • gene mutations can be determined by comparing the size and expression of polypeptides resulting from genetic modification with those of wild-type proteins. Specifically, such a comparison can be made, for example, by performing Western blotting.
  • Another aspect of the invention provides a method for regulating the content of apocarotenoids in tobacco plants.
  • the method includes the following steps (a) to (c).
  • a step of regulating the expression or activity of the carotenoid oxidative cleavage enzyme in the tobacco plant which comprises the following (i) to (iii): (I) Consisting of, or essentially consisting of, a sequence having at least 80% sequence identity with the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4, 5 or 6 encoding the carotenoid oxidative cleavage enzyme (consisting of). essentially consisting of) polynucleotide, (Ii) The polypeptide encoded by the polynucleotide represented by (i), or (iii) SEQ ID NO: 1, 2 or 3 with at least 80% sequence identity or SEQ ID NO: 7 with at least 80% sequence identity. Carotenoid oxidative cleavage enzyme containing a polypeptide having.
  • step (B) A step of measuring the apocarotenoid content in the mutant, non-natural or transgenic plant obtained in step (a) or at least a part thereof or in an aerosol generated during combustion or heating thereof.
  • the apocarotenoid can be ⁇ -ionone and dihydroactinidiolide, and the adjustment of the content can be an increase in the content.
  • the apocarotenoids can be ⁇ -damascenone, megastigma trienone (structural isomer) and 3-hydroxy- ⁇ -damascenone, and the adjustment of the content can be a reduction of the content.
  • One embodiment of the present invention provides leaf tobacco of the plant of the genus Nicotiana, and dried leaves (dried tobacco) obtained from the leaf tobacco. Dried leaves are obtained by drying leaf tobacco. Any method can be used as the drying method, and examples thereof include, but are not limited to, natural drying, hot air drying, and hot air drying.
  • the dried leaf includes a cut filler, a powder, a sheet, a middle bone, a granule, and an extract obtained from the dried leaf.
  • Tobacco products can be in any form, such as chopped tobacco, cigarettes, pipe tobacco, cigarettes, electronic tobacco, water tobacco, snuff (including snooze and snuff), and aerosol generated by heating tobacco. Examples include, but are not limited to, non-combustion-heated tobacco products used as a source, non-heated tobacco products that suck the flavor of tobacco without heating it, and the like.
  • An endogenous gene containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a coding region An endogenous gene containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a coding region, and an amino acid shown in SEQ ID NO: 3. Mutations that cause suppression of the function of at least one of the endogenous genes containing a polynucleotide encoding a polypeptide having 80% or more sequence identity to the sequence as a coding region have been introduced into the genome. There is a tobacco plant.
  • a method for producing a tobacco plant An endogenous gene containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a coding region.
  • a method for producing a tobacco plant which comprises the steps of introducing into the genome.
  • the introduction step comprises inserting a polynucleotide expressing a factor that promotes the degradation of mRNA transcribed from the endogenous gene outside the region where the endogenous gene is present. 12) The production method according to any one of (15).
  • An endogenous gene containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a coding region An endogenous gene containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 as a coding region, and an amino acid shown in SEQ ID NO: 3. Mutations that cause suppression of the function of at least one of the endogenous genes containing a polynucleotide encoding a polypeptide having 80% or more sequence identity to the sequence as a coding region have been introduced into the genome. There is a tobacco genus plant.
  • a method for producing a tobacco plant which comprises the steps of introducing into the genome.
  • the introduction step comprises inserting a polynucleotide expressing a factor that promotes the degradation of mRNA transcribed from the endogenous gene outside the region where the endogenous gene is present, (12) to The production method according to any one of (15).
  • a mutation that causes suppression of the function of at least one of the endogenous genes containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 80% or more sequence identity to the sequence as a coding region has been introduced into the genome.
  • Nicotiana tabacum leaf tobacco which has a higher total carotenoid content than wild-type Nicotiana tabacum leaf tobacco.
  • a mutation that causes suppression of the function of at least one of the endogenous genes containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 80% or more sequence identity to the sequence as a coding region has been introduced into the genome. Ori, Dried leaves of the genus Tobacco, which have a higher total carotenoid content than the dried leaves of the wild-type genus Tobacco.
  • a recombinant in which the expression of the CCD4 gene was suppressed (hereinafter, simply referred to as a recombinant) was prepared, and changes appearing in tobacco plants due to the suppression of the expression of the CCD4 gene were identified.
  • RNAi trigger sequence for suppressing the expression of all three CCD4 genes (CCD4-S gene, CCD4-T1 gene and CCD4-T2 gene) in Nicotiana tabacum, regions with high identity in SEQ ID NOs: 4 to 6 (CCD4-6) 323bp) was selected.
  • the region was amplified by PCR using the cDNA of the CCD4-T2 gene as a template and PrimeSTAR (registered trademark) Max DNA Polymerase (Takara Bio).
  • the PCR conditions and primers are as follows. A CACC that does not match SEQ ID NOs: 4 to 6 is added to the 5'end of SEQ ID NO: 9.
  • the obtained PCR product was cloned into a pENTR TM / D-TOPO TM vector (Thermo Fisher Scientific Inc.), and after confirming the nucleotide sequence of the RNAi trigger sequence (SEQ ID NO: 11), Gateway TM
  • the RNAi trigger sequence was introduced into the pSP231 vector using LR Cloning TM II Enzyme Mix (Thermo Fisher Scientific Inc.).
  • the RNAi trigger sequence introduced into the pSP231 vector was individually amplified by PCR for each of the sense strand and the antisense strand, and each nucleotide sequence was confirmed.
  • the pSP231 vector has a GFP (Green fluorescent protein gene) expression cassette inserted at the SacI site of (i) pHellsgate12 (see: Wesley et al., 2001, Plant J., 27, 581-590), and (ii). )
  • the inverted repeat sequence of the trigger sequence is arranged between pdk / cat introns
  • (iii) RNAi trigger sequence is a binary vector capable of expressing the RNAi trigger sequence with the cauliflower mosaic virus 35SRNA gene promoter.
  • Agrobacterium tumefaciens LBA4404 was transformed by electroporation using a pSP231 vector containing an RNAi trigger sequence. In the obtained transformed Agrobacterium, the presence of the RNAi trigger sequence was confirmed by PCR, and then the Agrobacterium was used for transformation of tobacco.
  • Tobacco transformation was carried out by the following general methods using four varieties of Nicotiana tabacum (Petit Havana SR-1, Tsukuba No. 1, K326 and Coker319).
  • Redifferentiated individuals resistant to kanamycin were obtained from callus obtained by infecting a section of tobacco leaf with the transformed Agrobacterium and culturing in Linsmaier and Skoog medium containing kanamycin (50 ⁇ g / ml). From these redifferentiated individuals, individuals in which GFP fluorescence was confirmed in the entire leaf were selected.
  • the selected individuals (T0 individuals) were transplanted to No. 3 pot and cultivated under certain conditions in a closed greenhouse at 23 to 25 ° C.
  • the expression of the CCD4 gene is reduced to about 20% compared to the non-transformant (original cultivar Petit Havana SR-1, Tsukuba 1, K326 or Coker319).
  • the strain was selected as a recombinant.
  • the recombinants prepared from each of the above four varieties showed a phenotype different from that of the original varieties (lower leaves were clearly yellowed).
  • the amount of lutein contained per dry weight was calculated by the calibration curve method using the peak area value of the absorption spectrum detected at the optical wavelength of 455 nm.
  • Calibration curve prepared based on the results of analysis of 1, 5, 10 and 20 ⁇ g / mL lutein standard solutions by liquid chromatograph (shows linearity in the range of 1 to 20 ⁇ g / mL with a correlation coefficient of 0.9999). )It was used. The results are shown in Table 2. As shown in Table 2, the above three strains (RNAi-1-3, 1-8, 1-15) have about three times as much lutein (major carotenoids) as the original varieties of the two individuals (controls 1 and 2). ) was included.
  • Strains with mutations in the CCD4-S gene or CCD4-T1 gene were selected from the EMS mutant population (M2 generation, about 2000 strains) of tobacco cultivars (Tsukuba No. 1) according to sequencing by amplicon sequence. ..
  • M2 generation about 2000 strains
  • tobacco cultivars Tsukuba No. 1
  • one nonsense mutation the codon encoding the 72nd glutamine (Q) of the CCD4-S protein is changed to a stop codon by nucleotide substitution
  • CCD4-s-1 (0844 strain) occurring in the homo was obtained.
  • CCD4-t1-1 As strains having mutations in the CCD4-T1 gene, two strains (CCD4-t1-1: 0283 strains and CCD4-t1-2: 0135 strains) in which one nonsense mutation is homozygous to the CCD4-T1 gene were obtained.
  • rice field In CCD4-t1-1, the codon encoding the 46th glutamine (Q) of the CCD4T1 protein is changed to a stop codon by nucleotide substitution.
  • CCD4-t1-2 the codon encoding arginine (R) at position 187 of the CCD4T1 protein is changed to a stop codon by nucleotide substitution.
  • a tobacco plant (double mutant) having mutations in two CCD4 genes was prepared as follows. F1 plants obtained by crossing CCD4-s-1 and CCD4-t1-1 through artificial pollination were self-fertilized to obtain an F2 generation population. From the F2 generation population, strains with homozygous mutations in each of the two CCD4 genes (CCD4-st1-1) and strains in which the two CCD4 genes are homozygous according to sequencing by amplicon sequence. (WT1) was selected. F1 plants obtained by crossing CCD4-s-1 and CCD4-t1-2 via artificial pollination were self-fertilized to obtain an F2 generation population.
  • a isolate (CCD4-st1-2) homozygous for each of the two CCD4 genes and two CCD4 genes are homozygous and wild-type according to sequencing by amplicon sequence.
  • the strain (WT2) was selected.
  • the strains (WT1 and WT2) in which the two CCD4 genes, which are controls for the double mutant, are homo wild type are hereinafter referred to as "homo wild type”.
  • Strains having a mutation in the CCD4 gene were selected from the EMS mutant population (M2 generation, about 4000 strains) of wild tobacco species (Nicotiana sylvestris) according to sequencing by amplicon sequence. Nicotiana sylvestris has only one CCD4 gene on its genome. As strains having mutations in the CCD4 gene, two strains (08N-465 strain and 06N-7039 strain) in which one nonsense mutation was homozygously generated in the CCD4 gene were obtained. In the 08N-465 strain, the codon encoding the 72nd glutamine (Q) of the CCD4 protein has been changed to a stop codon by nucleotide substitution. In the 06N-7039 strain, the codon encoding the 150th arginine (R) of the CCD4 protein is changed to a stop codon by nucleotide substitution.
  • Tobacco CCD4-S Forward Primer TCATCTTCTCCTTCTCTTAAA (SEQ ID NO: 12)
  • Tobacco CCD4-S Reverse Primer CGGAGAATACATTTGGCAA (SEQ ID NO: 13)
  • Tobacco CCD4-T1 Forward Primer TCATCTTCTCTTGCTCTTAAG (SEQ ID NO: 14)
  • Tobacco CCD4-T1 Reverse Primer CAGAGAATACATTTGGGAT (SEQ ID NO: 15) Nicotiana sylvestris CCD4 forward primer: CCTTTCTACATTATCACAACACCCTA (SEQ ID NO: 16) Nicotiana sylvestris CCD4 reverse primer: TCACCATCTGGGGCTAATTT (SEQ ID NO: 17).
  • CCD4-st1-1 and CCD4-st1-2 grown in the greenhouse have phenotypes not found in CCD4-s-1, CCD4-t1-1, CCD4-t1-2, WT1 and WT2 (lower ranks). Leaf yellowing) was shown.
  • the phenotype was very similar to the phenotype exhibited by the recombinant of Example 1.
  • the 08N-465 and 06N-7039 strains showed the above phenotype (yellowing of lower leaves) not found in the wild-type Nicotiana sylvestris.
  • FIG. 1 summarizes the results received from the Japan Food Research Laboratories.
  • E 1% 1 cm 2550, absorption wavelength: 455 nm, solvent: ethanol
  • CCD4-st1-1 and CCD4-st1-2 are 1.4 to 2.1 times more lutein, 1.4 to 2.7 times more ⁇ -carotene, and 2.5 to 4.0 times more zeaxanthin than the homo wild type. Also contained a major carotenoid). In addition, CCD4-st1-1 and CCD4-st1-2 showed 1.7 to 2.5 times the total carotenoid amount as compared with the homo wild type. No ⁇ -carotene or lycopene was detected.
  • 08N-465 contained 1.4 times more lutein, 1.3 times more ⁇ -carotene, and 3.3 times more zeaxanthin than WT. In addition, 08N-465 showed 1.7 to 1.8 times the total carotenoid amount as compared with WT. No ⁇ -carotene or lycopene was detected.
  • the extract solution was filtered through a PTFE filter (pore size 0.45 ⁇ m) and subjected to liquid chromatograph tandem mass spectrometer (LC-MS / MS) analysis with a photodiode array detector (PDA).
  • LC-MS / MS liquid chromatograph tandem mass spectrometer
  • PDA photodiode array detector
  • the combination of precursor ion and product ion (SRM transition) of each carotenoid analyzed in SRM was set as shown in Table 3.
  • the residence time of each compound is 42 msec, and the cell acceleration voltage is 3 V.
  • Each carotenoid component was identified by comparing the retention time of the peak detected by PDA and SRM analysis with the standard substance.
  • the content of each carotenoid is semi-quantified relative to the area value of the absorption spectrum detected at the light wavelength of 325 nm of trans-retinol, which is an internal standard substance, with respect to the area value of the absorption spectrum detected at the light wavelength of 450 nm of each carotenoid. Calculated as a value.
  • the amount of each carotenoid contained in each strain is summarized in FIG. In FIG. 3, the amount of one carotenoid in one line is shown as an average value representing the content of carotenoid in three samples obtained from three plots of the field. As shown in FIG.
  • CCD4-st1-1 and CCD4-st1-2 have 2.0 times or more lutein and 2.1 times or more ⁇ -carotene, as compared with the control 3 strains (WT1, WT2, and Tsukuba No. 1). It contained 3.8 times more zeaxanthin.
  • TIC was analyzed in the range of m / z: 30-500.
  • the combination of semi-quantitative ion and qualitative ion (SIM parameter) of each apocarotenoid analyzed in SIM was set as shown in Table 4.
  • SIM parameter semi-quantitative ion and qualitative ion
  • Each apocarotenoid component was identified by collating the full mass spectrum obtained in TIC mode with the literature information and the information in the database at the retention time when semi-quantitative ions and qualitative ions were detected in SIM mode.
  • the content of each apocarotenoid is the relative value of the area value of the chromatogram of the semi-quantitative ion of each apocarotenoid to the area value of the chromatogram of the semi-quantitative ion of 1,3-dimethoxybenzene, which is an internal standard substance.
  • Table 5 summarizes the amount of each carotenoid contained in each strain.
  • (4b) Sensory evaluation test on a finely pulverized sample
  • the dry leaves obtained in (4a) were pulverized, further pulverized, and then dispersed in polyethylene glycol (three times the mass of the pulverized dry leaves). It was made into a finely ground sample.
  • Sensory evaluation (comparison of test specimens with controls) was performed by three skilled panelists (trained and more experienced than the panelists mentioned above).
  • the control product is an unscented product of Mevius TM
  • the test product is a sample obtained by spreading each finely ground sample on an unscented product of Mevius TM. Panelists were asked to smoke the controls and the test and respond to differences in the flavor and taste of the test compared to the controls.
  • Table 7 shows the results of scoring each test sample, with 1 point being the answer from the experienced subjects that "improvement in floral flavor” was observed and 0 points being the answer that "improvement in floral flavor was not observed”. Summarize. As shown in Table 7, CCD4-st1-1 showed improvement in floral flavor in all panelists, and CCD4-st1-2 showed improvement in floral flavor in 2 out of 3 people. rice field. The above results indicate that the dried true leaves harvested from the double mutant can add a good flavor to conventional tobacco products.
  • CCD4-t2-1 had a nonsense mutation (nucleotide substitution in which the codon encoding the 190th arginine (R) is changed to the stop codon) in the CCD4-T2 gene.
  • CCD4-t2-2 had a splice mutation (the base G at the 5'end in the first intron was replaced with A) in the CCD4-T2 gene.
  • CCD4-t2-3 had a splice mutation (CCD4-t2-3 had the base G at the 3'end of the first intron replaced with A) in the CCD4-T2 gene.
  • Stage 1 Preparation of CCD4-st1-2 (having homozygous mutations in each of the CCD4-S and CCD4-T1 genes) by mating CCD4-s-1 and CCD4-t1-2 (Example 2)
  • Stage 2 Preparation of preliminary mutant strains by mating CCD4-st1-2 and CCD4-t2-3 (having heterozygous mutations in each of the CCD4-S, CCD4-T1 and CCD4-T2 genes)
  • Self-propagation Preparation of CCD4-058 (confirmed genotype will be described later) by self-fertilization of the above mutant strain.
  • CCD4-st1, CCD4-st2 and CCD4-t1t2 were grown in a greenhouse, and the color of the matured (aged) lower leaves was visually observed. bottom.
  • CCD4-st2 and CCD4-tm the color was orange to yellow, but the color intensity was different between strains according to the CCD4 genotype.
  • the colors were stronger in the order of (i) CCD4-tm, (ii) CCD4-st1, and (iii) CCD4-st2 and CCD4-t1t2 (similar).
  • the numerical values shown in Table 8 are the average of the measured values output for 18 measurement points per line (3 fresh leaves).
  • the breakdown of the measurement points is 6 points on the surface of one fresh leaf (upper, middle and lower parts of each leaf when the leaf is divided into left and right with the main vein as the axis of symmetry) x 3 sheets.
  • Negative values in a * represent the strength of green, and positive values represent the strength of red / magenta.
  • b * a negative value represents the intensity of blue and a positive value represents the intensity of yellow.
  • the value at L * represents (height of) lightness.
  • the triple mutant showed stronger yellowing (orange to yellow coloration) than the double mutant.
  • the strongest yellowing was observed in the strain (CCD4-st1) having a mutation in the CCD4-S and CCD4-T1 genes.
  • CCD4-st1 the strain having a mutation in the CCD4-S and CCD4-T1 genes.
  • slightly weak yellowing stronger than the target Tsukuba No. 1 was observed.
  • the seedlings for transplantation of each line used in (6a) were grown in a greenhouse. General leaf tobacco cultivation conditions were adopted for field transplantation, growth and management up to harvest. On the 16th day after the heartbeat, 5 leaves per plant were harvested and subjected to normal yellow drying treatment using a hot air dryer. In the visual observation, the same tendency as the observation of the fresh leaves in Example 5 was observed in the dry leaves.
  • the double mutant and the triple mutant showed a higher carotenoid content than Tsukuba No. 1.
  • the degree of increase in carotenoid content varied according to genotype (with or without mutations in the CCD4-S, -T1 and T2 genes).
  • the tendency for genotypic differences was similar for each component (total carotenoids, lutein, zeaxanthin and ⁇ -carotene).
  • the lutein content is in the order of CCD4-tm (3.4-4.0 times), CCD4-st1 (2.1-2.8 times), CCD4-st2 (1.6-1.8 times), CCD4-t1t2 (1.2-1.7 times). it was high.
  • the magnification in parentheses is the magnification when the component content of Tsukuba No. 1 is 1.
  • the result of the semi-quantitative analysis was consistent with the result of FIG.
  • the lutein content was higher in the order of CCD4-tm (5.5 to 5.7 times), CCD4-st1 (3.1 to 3.8 times), CCD4-st2 (2.2 to 2.4 times), and CCD4-t1t2 (2.0 times).
  • the magnification in parentheses is the magnification when the component content of Tsukuba No. 1 is 1.
  • the triple mutant produced the most remarkable change in the amount of apocarotenoid based on Tsukuba No. 1.
  • ⁇ -ionone and dihydroactinidiolide showed an increase in common with the mutants as in Example 3.
  • the amount of ⁇ -ionone magnification in parentheses is 1 for Tsukuba No. 1 is 3.5 to 3.6 times for CCD4-tm, 2.3 to 2.9 times for CCD4-st1, and 1.2 times for CCD4-st2.
  • CCD4-t1t2 was 1.2 to 1.9 times higher.
  • the amount of dihydroactinidiolide was 4.8 to 5.4 times for CCD4-tm, 2.5 to 2.7 times for CCD4-st1, 1.4 to 1.6 times for CCD4-st2, and 1.4 to 1.9 times for CCD4-t1t2.
  • many apocarotenoids were reduced to about 1/3 to 1/10 as compared with Tsukuba No. 1.
  • the present invention can be used to improve the quality of tobacco products.

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Abstract

発明の一実施形態は、たばこ製品の品質を向上させることを目的とする。本発明は、特定の内在性遺伝子の機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されているタバコ植物体に関する。

Description

タバコ植物体とその製造方法
　本発明は、葉たばこの品質を向上させるタバコ植物体、当該タバコ植物体を製造する方法、ならびに当該タバコ植物体からの収穫物および当該収穫物の加工物に関する。
　カロテノイドは、赤、黄または橙を呈する生物色素の総称であり、植物カロテノイドとして、β－カロテンおよびルテインが挙げられる。カロテノイドの分解物は、アポカロテノイドと総称される。カロテノイドの分解物であるアポカロテノイドは、香気成分（β－ダマセノン、β－イオノンおよびメガスティグマトリエノンなど）を包含している。
　カロテノイドは、生体機能を正常に保つ有益な物質（栄養素としてのビタミンＡ前駆体および抗酸化物質）として着目されている。このため、遺伝子組換え技術（ＧＭ技術）によってカロテノイドの蓄積量を増大させた種々の作物が、商業的な利用および植物体のストレス耐性の向上を目的として作出されている。
　タバコ植物においてカロテノイドの蓄積量を増大させる例として、植物体への薬剤投与、およびカロテノイドの生合成または代謝に関与する遺伝子をＧＭ技術によって過剰発現させることが知られている（特許文献１）。しかし、薬剤投与には植物体および製品からの薬剤の排除が問題としてある。またＧＭ技術を用いて、外在性の遺伝子を植物に導入する場合、それがゲノム上に挿入される位置をコントロールすることができない。
　カロテノイド酸化開裂酵素ＣＣＤは、カロテノイドを基質として切断し、アポカロテノイドを生成する酸化酵素である。それらの配列相同性に基づいて、９種類（ナンバリングによってＮＣＥＤと表記されるものもある）のＣＣＤ遺伝子が、高等植物に広く保存されていることが知られている。これらのうちＣＣＤ１およびＣＣＤ４は、複数の植物種においてカロテノイド量の調節および／またはアポカロテノイドの生成に関与すると報告されている。
　例えば、ナス科植物（タバコを含む）では、ペチュニアＣＣＤ１、トマトＣＣＤ１、およびジャガイモＣＣＤ４に関する報告がある。ペチュニアおよびトマトでは、ＣＣＤ１遺伝子の発現抑制が、花におけるβ－イオノンを減少させ、ジャガイモでは、ＣＣＤ４遺伝子の機能抑制が、花および塊茎にカロテノイドを蓄積させると報告されている。ナス科植物以外でも、ＣＣＤ４遺伝子の発現抑制が、カロテノイドを植物体の一部に蓄積させると報告されている。
　タバコでは、ホモロジー検索を用いた全ゲノム情報の網羅的な解析によって、タバコにおけるＣＣＤ遺伝子ファミリーについて調べた報告がある（非特許文献１）。非特許文献１には、タバコには、３つのＣＣＤ４遺伝子が存在すること、および３つのＣＣＤ４遺伝子のタバコ植物における発現について、報告されている。
米国特許公開第ＵＳ２０１４／０２８９９０１号明細書
Zhou et al (2019) Carotenoid Cleavage Dioxygenases: Identification, Expression, and Evolutionary Analysis of This Gene Family in Tobacco, International Journal of Molecular Sciences, vol. 20, no. 22. Article number 5796
　たばこ製品の香喫味は、人間の感覚器に訴える複雑な品質であり、材料である葉たばこに含まれている種々の成分のバランスの上に成り立っていると考えられる。植物には、類似の機能を担う複数の遺伝子が存在するため、種々の成分を目的通りに制御することが非常に困難である。
　本発明の一態様は、たばこ製品の品質を向上し得るタバコ植物体を実現することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題に鑑みて、特定の内在性遺伝子を機能抑制したタバコ植物体における成分を詳細に分析し、かつたばこ製品の品質を実際に確認した結果として、本発明を完成するに至った。
　上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係るタバコ植物体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されている。
　また、本発明の一局面に係るタバコ植物体の製造方法は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異を、タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含している。
　本発明の一態様によれば、タバコ植物体から収穫される葉たばこの品質を向上させることができる。
実施例で作製した植物体におけるカロテノイドの含有量を比較した結果を示す図である。 実施例で作製したニコチアナ・シルベストリス植物体におけるカロテノイドの含有量を比較した結果を示す図である。 実施例で作製した植物体の乾葉におけるカロテノイドの含有量を比較した結果を示す図である。 温室栽培した他の変異体植物におけるカロテノイドの含有量を比較した結果を示す図である。 圃場栽培した上記他の変異体植物の乾葉におけるカロテノイドの含有量を比較した結果を示す図である。
　〔１．タバコ植物体〕
　本発明の一実施形態は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されている、タバコ植物体を提供する。
　上記タバコ植物体は、野生型植物と比べて、カロテノイドおよび／またはアポカロテノイドの含有量に変化（増加および減少）を生じている。上記タバコ植物体は、後述の実施例に示す通り、その葉（生葉および乾葉）におけるカロテノイドおよび／またはアポカロテノイドの含有量に変化（増加および減少）を生じている。したがって、当該タバコ植物体に含まれている種々の成分のバランスが、従来のタバコ植物体と比べて変化しており、当該バランスは、当該タバコ植物体から得られるたばこ製品の香喫味（品質）を向上させている。ここで、香喫味（品質）が向上するたばこ製品は、シガレット、葉巻、加熱式たばこ（非燃焼型たばこ香味吸引器）、および無煙たばこのいずれかであってよい。また、当該タバコ植物体から得られる葉たばこの加工品は、電子シガレット等の香味源として使用することもできる。
　上記タバコ植物体から生産されるたばこ製品の香喫味（品質）を向上させる限り、当該タバコ植物体では、個々のカロテノイドおよびアポカロテノイドの含有量は、増加しても、減少してもよい。香喫味の向上しているたばこ製品を生産可能なタバコ植物体の好ましい実施形態において、当該タバコ植物体は、野生型タバコ植物体と比べて、増加した総カロテノイド含有量を有している。本明細書において使用される用語「総カロテノイド含有量」は、吸光光度法を用いて定量された、タバコ属植物体中の全てのカロテノイドの含有量を指す。上記タバコ植物体の総カロテノイド含有量は、野生型タバコ属植物体における総カロテノイド含有量の、例えば、１．２倍以上、１．５倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上であり、好ましくは２倍以上、２．５倍以上、さらに好ましくは３倍以上である。
　上記好ましい実施形態において、上記タバコ植物体は、ルテイン、β－カロテンおよびゼアキサンチンのうち少なくとも１つの、野生型タバコ植物体と比べて増加した含有量を有することがより好ましい。上記タバコ植物体におけるこれらのカロテノイド含有量は、野生型のタバコ属植物体における該当するカロテノイド含有量の、例えば、１．２倍以上、１．５倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上であり、好ましくは２倍以上、２．５倍以上、さらに好ましくは３倍以上である。これらのカロテノイド量は、高速液体クロマトグラフ法など公知の手法を用いて定量可能である。
　上記好ましい実施形態において、上記タバコ植物体は、β－イオノンおよびジヒドロアクチニジオリド（いずれもアポカロテノイド）の少なくとも一方の、野生型タバコ植物体と比べて増加した含有量を有することがより好ましい。これらのアポカロテノイドはフローラルな香気成分として知られている。
　含有量の減少が部分的に許容されるアポカロテノイドは、例えば、香気成分として知られているアポカロテノイド（β－ダマセノン、メガスティグマトリエノン（の構造異性体）および３－ヒドロキシ－β－ダマスコン）であり得る。なかでも、当該アポカロテノイドは、β－ダマセノン、メガスティグマトリエノン（の構造異性体）および３－ヒドロキシ－β－ダマスコンであり得る。
　上記タバコ植物体から得られる葉たばこまたはその加工品は、カロテノイドの含有量にしたがって、上記内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制が生じていないタバコ植物体から得られる葉たばこまたはその加工品と異なる色（特に黄色または橙色）を呈し得る。特に無煙たばこは、葉たばこまたはその加工品をユーザによって直接に視認される機会を多く有している。したがって、上記異なる色を有している葉たばこまたはその加工品は、着色されることなく、視覚的に従来と異なる印象をユーザに与え得る。
　一実施形態において、野生型植物と比べて増加した含有量の、ルテイン、β－カロテンまたはゼアキサンチンを有している上記タバコ植物体は、ＴＳＮＡの生成量を抑えた葉たばこおよびたばこ製品の原料になり得る。ルテイン、β－カロテンおよびゼアキサンチンは、抗酸化物質として知られている。抗酸化物質は、タバコ特有ニトロソアミン（Ｔｏｂａｃｃｏ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓ：ＴＳＮＡｓ）の生成を抑制する。ＴＳＮＡ［Ｎ’－ｎｉｔｒｏｓｏｎｏｒｎｉｃｏｔｉｎｅ（ＮＮＮ）、Ｎ’－ｎｉｔｒｏｓｏａｎａｔａｂｉｎｅ（ＮＡＴ）、Ｎ’－ｎｉｔｒｏｓｏａｎａｂａｓｉｎｅ（ＮＡＢ）、４－（ｍｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｏ）－１－（３－ｐｙｒｉｄｙｌ）－１－ｂｕｔａｎｏｎｅ（ＮＮＫ）など]は、ノルニコチン、アナタビン、アナバシンまたはニコチンの、亜硝酸等との非酵素的な反応（ニトロソ化）によって生成する。当該反応は、抗酸化物質の一種であるカロテノイドによって阻害され得る。つまり、ルテイン、β－カロテンまたはゼアキサンチンは、葉たばこおよびたばこ製品から生成されるＴＳＮＡ量を低減し得る。ここで、ＴＳＮＡ量が低減されたたばこ製品は、シガレット、葉巻、加熱式たばこ（非燃焼型たばこ香味吸引器）、および無煙たばこのいずれかであってよい。
　本明細書に使用される場合、「タバコ植物体」および「タバコ」は、個体全体（例えば、成体、苗および種子）、組織（例えば、葉、茎、花、根、生殖器官、胚およびこれらの一部など）、およびこれらの乾燥物を包含している。
　本明細書に使用される場合、「（アミノ酸配列の）配列同一性」は、基準となる（アミノ酸）配列に対して、言及されている（アミノ酸）配列が一致している割合を意味する。ここで、配列の一致していない部分は、（アミノ酸残基の）置換、付加、欠失または挿入が存在している部分である。
　ここで、配列表に記載したアミノ酸配列を用いてポリペプチドを特定する記載「～に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド」は、野生型ポリペプチドを意味する。当該野生型ポリペプチドは、後述のタバコ属植物に通常存在しているポリペプチドを意味する。野生型ポリペプチドは、例えば、配列番号１、２もしくは３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または当該タンパク質の、タバコ属植物における相同分子種である。本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、実質的に同一の意味を有しており、交換可能に使用され得る。
　本明細書に使用される場合、「内在性遺伝子」は、タバコ属植物のゲノム上に本来的に存在する遺伝子を意味する。つまり、内在性遺伝子は、タバコ属植物以外の植物に存在する外来遺伝子ではない。
　したがって、タバコ植物体において存在量の減少しているポリペプチドは、配列表に示したそれぞれのアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドであればよく、当該配列同一性は、より高い割合（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上）であることが好ましい。
　タバコ属植物では、上記変異によって機能抑制を受ける上記内在性遺伝子に相当する各遺伝子は、高い配列同一性を有して、高度に保存されている。つまり、上記各遺伝子がコードしているポリペプチド（上記内在性遺伝子がコードするポリペプチドの、タバコ属植物における相同分子種（orthologue）は、上述の配列同一性を有している。上記内在性遺伝子の、タバコ属植物およびそれ以外の植物における相同分子種が有している配列同一性の例を表１にまとめる。表１には、タバコＣＣＤ４－Ｓタンパク質（配列番号１）、タバコＣＣＤ４－Ｔ１タンパク質（配列番号２）およびタバコＣＣＤ４－Ｔ２タンパク質（配列番号３）を基準に、各植物が有している相同分子種の配列同一性を示している。限定されるものではないが、本明細書において「野生型タバコ植物」は、タバコＣＣＤ４－Ｓ遺伝子、タバコＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子およびタバコＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子の発現を抑制させる因子が導入されておらず、かつ、これらの遺伝子に変異を有していない植物であってよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ポリペプチドの「存在量の減少」は、野生型ポリペプチドの存在量を基準にして、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の当該ポリペプチドの存在を意味する。上記野生型ポリペプチドの存在量を基準にした上記ポリペプチドの存在量は、少なくとも１つ以上のカロテノイドまたはアポカロテノイドの、タバコ植物体における含有量を変化させる上述の値から、適宜選択され得る。
　なお、上記タバコ植物体における上述のポリペプチドの存在量の減少は、当該タバコ植物体から得られる、培養細胞、カルス、プロトプラスト、種子、および子孫において、遺伝的に安定して受け継がれていることが好ましい。したがって、上記タバコ植物体は、人為的な操作を介して生成された培養細胞、カルス、プロトプラスト、種子または子孫から発生した個体であり得、当該個体を得るためのこれらの材料は、本発明の範囲に包含される。
　上記タバコ植物体は、交配によって得られた育種後代をさらに包含し得る。イネ、コムギ、オオムギ、ダイズをはじめ多くの植物種において変異体を用いた育種が行われている。例えば、変異原を用いて処理した変異体集団から単離した変異体は、対象とする遺伝子以外に多数の変異を有している。そのため一般的には、余分な変異を除くために戻し交雑を行う。この交雑において、優良な形質を保有している栽培品種と、上記変異体を交配させることによって、当該変異体の有している所望の形質（変更されたカロテノイドおよび／またはアポカロテノイドの含有量）を、既存の栽培品種に導入することができる。このようにして得られた育種後代は、既存の栽培品種に高い付加価値を付与した品種であり得る。
　ここで、上記変異体の所望の形質は、ゲノム上の複数の位置（例えば、複数の遺伝子）に導入された変異に由来する。したがって、当該変異を有している個体の選抜をあらかじめ行っておくことが、効率的な戻し交雑に必須である。個体の選抜には、個体における上記変異の有無、および当該変異がホモ接合型またはヘテロ接合型であることを簡便に検出可能であれば、有利である。当該検出は、遺伝子における変異を検出するための、後述する方法にしたがって実施可能である。以上の観点とは別に、栽培品種への戻り率（ゲノム全領域に占める栽培品種由来のゲノム領域の割合）の高い系統を、より少ない交雑回数によって得ることが好ましい。より少ない交雑回数を実現する手法としては、上記変異体および既存の栽培品種の間において多型を示すバックグラウンドマーカーを用いたＭＡＳ（Marker Assisted Selection）が挙げられる。多型を示すバックグラウンドマーカーとして、タバコにおいて知られているＳＮＰまたはＳＳＲ（Simple Sequence Repeat）を利用し得る。既存のマーカーの他に、交雑に用いる変異体および既存の栽培品種のゲノム配列を決定し、かつ比較することによって、ヌクレオチド配列の差異、およびゲノム上にある反復配列の数の差異を特定できれば、これらの差異を、新たなマーカーとして利用可能である。
　以下の説明において、内在性遺伝子およびゲノムに関して、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）を基準にして説明する。以下の説明における基準であるＮｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）は、複二倍体であり、祖先種であるＮｉｃｏｔｉａｎａ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ由来のゲノム（Ｓゲノム）およびＮｉｃｏｔｉａｎａ　ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノム（Ｔゲノム）の両方を有する。上述の機能抑制を受ける３つの内在性遺伝子は、Ｓゲノムに１つ（以下ではＣＣＤ４－Ｓ遺伝子と記載する）、Ｔゲノムに２つ（以下ではそれぞれＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子およびＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子と記載する）存在することが知られている。
　なお、タバコ植物体について、種間において実質的に同じ機能を果たすポリペプチドをコードする遺伝子の一部（すべてではない）の、コード領域におけるヌクレオチド配列は、栽培品種間に１～数％、栽培品種および近縁野生種の間に約１０％以下の差異を有し得る。
　配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号４に示されているヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチド（ＣＣＤ４－Ｓ遺伝子のコード領域（ＣＤＳ））によってコードされている。配列番号２に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号５に示されているヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチド（ＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子のコード領域（ＣＤＳ））によってコードされている。配列番号３に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号６に示されているヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチド（ＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子のコード領域（ＣＤＳ））によってコードされている。
　ここで、相同遺伝子を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988）が挙げられる。したがって、当業者は、例えば、配列番号４に示されているヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチドもしくはその一部をプローブとしてか、または当該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の植物からＣＣＤ４－Ｓの相同遺伝子を容易に単離し得る。以上の説明に接した当業者であれば、ＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子の相同遺伝子を、配列番号５のヌクレオチド配列（の一部）に基づいて、容易に単離し得るし、ＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子の相同遺伝子を、配列番号６（の一部）に基づいて、容易に単離し得る。
　ここで、ストリンジェントな条件は、いわゆるヌクレオチド配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドは形成されるが、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドの形成が著しく抑制される条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士のハイブリッド、例えばプローブと完全一致した２本鎖ポリヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件を挙げることができる。一例を示すと、０．２５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，７%ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６～２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，１%ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。例えば、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、こうした遺伝子を容易に取得することができる。
　内在性遺伝子を特定する言及として、本明細書に使用される場合、「（１つ目）・・・内在性遺伝子、（２つ目）・・・内在性遺伝子、および（３つ目）・・・内在性遺伝子の少なくともいずれか」は、以下の１～７のいずれかを意味している。実施例に証明されている通り、一実施形態において、下記１～３の１つ以上が機能抑制されており、好ましい実施形態において、下記４～６の少なくともいずれかが機能抑制されており、より好ましい実施形態において、下記７が機能抑制されている。
　１．（１つ目）の内在性遺伝子（ＣＣＤ４－Ｓ遺伝子）；
　２．（２つ目）の内在性遺伝子（ＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子）；
　３．（３つ目）の内在性遺伝子（ＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子）；
　４．（１つ目）の内在性遺伝子および（２つ目）の内在性遺伝子；
　５．（１つ目）の内在性遺伝子および（３つ目）の内在性遺伝子；
　６．（２つ目）の内在性遺伝子および（３つ目）の内在性遺伝子；ならびに
　７．（１つ目）の内在性遺伝子、（２つ目）の内在性遺伝子および（３つ目）の内在性遺伝子の組合せ。
　本明細書に使用される場合、「（内在性）遺伝子の機能抑制」は、ゲノム上に本来ある遺伝子が本来の機能を発揮しない状態を意味する。したがって、「（内在性）遺伝子の機能抑制」は、「（内在性）遺伝子の破壊」、「（内在性）遺伝子の変異」および当該（内在性）遺伝子以外（外来遺伝子を包含する）による当該「（内在性）遺伝子の発現抑制」を包含する用語である。
　「（内在性）遺伝子の破壊」は、ゲノム上に本来ある遺伝子が存在しないこと、またはゲノム上にある遺伝子から転写産物が生成されないことを意味する。「（内在性）遺伝子の変異」は、本来の機能的なポリペプチドが生成されない遺伝子の変異（機能の低下もしくは欠損）、機能的なポリペプチドが生成されるものの、生成される量が低下する遺伝子の変異、または機能的なポリペプチドが生成されるものの、当該ポリペプチドの安定性が低下する遺伝子の変異などを意味している。「（内在性）遺伝子の発現抑制」は、当該（内在性）遺伝子の塩基には変化を生じていないが、遺伝子の転写もしくは翻訳機能（ｍＲＮＡへの転写からそれに続くポリペプチドへの翻訳まで）が他の因子を介して修飾されて、ポリペプチドの生成量が低下しているか、またはポリペプチドの生成が生じていない状態などを意味する。「（内在性）遺伝子の発現抑制」は、例えば、当該（内在性）遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解によって生じ得る。
　本明細書に使用される場合、「変異」は、本願の属する技術分野において通常に理解される意味を有しており、例えば、野生型のゲノム上にある塩基、または野生型ポリペプチドにあるアミノ酸残基の、任意の変化（例えば、置換、欠失、挿入、付加、重複、逆位または転座など）を意味する。したがって、「（内在性）遺伝子の変異」は、本来の機能的なポリペプチドが生成されない遺伝子の変異（機能が低下もしくは欠損したポリペプチドが生成される変異を含む）、ポリペプチドが生成されるものの、生成される量が低下する遺伝子の変異、ポリペプチドが生成されるものの、ポリペプチドの安定性が低下する遺伝子の変異、遺伝子（コード領域、または非翻訳領域を含んでいるゲノムＤＮＡ配列）の喪失、または遺伝子からの転写が抑制される変異（転写制御領域または転写開始領域の欠失など）などを意味している。
　置換によって機能を欠損させる場合、プロモーター配列（コード領域を基準にして上流（５’側）にある配列が挙げられる）、および下流（３’側）にある配列が挙げられる）、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域、イントロンの両端にある保存配列（５’末端のＧＴおよび３’末端のＡＧ）、ならびにコード領域の少なくとも１つに、当該置換が存在し得る。
　例えば、ある遺伝子のプロモーター配列、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域にある、遺伝子発現調節に重要なヌクレオチド配列における置換は、当該遺伝子の転写活性の低下または当該遺伝子からの転写産物の安定性の低下を生じる。これらの低下はいずれも、上記遺伝子からの転写産物の減少にともなって、翻訳産物の減少を生じ得る。イントロンの上記保存配列における置換（スプライス変異）は、ｍＲＮＡのスプライシング異常を引き起こすことによって、不要なイントロンが付加または挿入されている異常なｍＲＮＡを生じる。異常なｍＲＮＡは、例えばフレームシフトによって、異常な翻訳産物を生じさせるか、または翻訳終結しない。
　コード領域にあるヌクレオチド置換がミスセンス変異である場合、当該置換により本来のアミノ酸と異なるアミノ酸が生じるため、本来の機能が低下または欠損したポリペプチドを生じ得る。
　また、コード領域にある置換は、不完全長の翻訳産物または本来の機能を維持していない翻訳産物を生じ得る。不完全長の翻訳産物は、アミノ酸をコードしているコドンのストップコドンへの、当該置換による変換（ナンセンス変異）に起因して生じる。不完全長の翻訳産物は、本来の翻訳産物と比べて、Ｃ末端のアミノ酸残基を含んでいる連続する１アミノ酸残基以上を欠失している。ナンセンス変異は、本来のストップコドンの上流にある任意のコドンに生じており、本来のストップコドンから、１コドン以上を挟んだ上流にあることが好ましい。したがって、ナンセンス変異を有する遺伝子からの翻訳産物は不完全長である。本来の機能を損なっている翻訳産物は、アミノ酸置換によって生じる。この場合、転写物の量は野生型植物と比較して同等であってもよい。当該翻訳産物は、立体構造の変化、または機能ドメインとしての機能の低下などを起こしている。本発明の変異の好ましい態様の一つは、このような本来の機能を損なう翻訳産物を生じるアミノ酸置換である。上記アミノ酸置換は、翻訳産物の機能を変化させる高い可能性を有している非保存的置換であることが好ましい。非保存的置換は、電荷または疎水性が異なるアミノ酸への置換（例えば、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸、塩基性または酸性アミノ酸から中性アミノ酸、中性アミノ酸から塩基性または酸性アミノ酸、極性アミノ酸から非極性アミノ酸への置換）、ならびにかさ（立体的な大きさ）の異なる側鎖を有しているアミノ酸への置換などが挙げられる。
　ナンセンス変異によって生じる現象の他の例として、ＣＣＤ４遺伝子のタンパク質コード領域にナンセンス変異を有している場合、nonsense-mediated mRNA decay（Brogna and Wen (2009) Nat. Structural Mol. Biol. 16: 107-113）が生じ得る。nonsense-mediated mRNA decayは、転写物の分解を引き起こすため、ナンセンス変異は、転写物量の低下を生じさせることがある。対象遺伝子が複数のエキソンからなる場合、nonsense-mediated mRNA decayを生じるには、ナンセンス変異を有しているエキソンが少なくとも１つ存在することが好ましく、当該ナンセンス変異を有しているエキソンが、対象遺伝子を構成する最も下流（３’側）のエキソンでないことがより好ましい。野生型のタバコ属植物のＣＣＤ４遺伝子は、２つのエキソンと１つのイントロンを有している。nonsense-mediated mRNA decayを生じるナンセンス変異の好ましい実施形態は、少なくとも１つのナンセンス変異が、第１エキソンに存在することである。
　置換以外の変異（欠失および挿入など）が、プロモーター配列、５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域内に生じていると、置換と同様に、転写活性または安定性の低下による転写産物量の低減、およびポリペプチドの量の低減が、結果として起こり得る。イントロンの保存配列への置換以外の変異はまた、置換と同様に、本来と異なるアミノ酸配列を有しているポリペプチドの翻訳を生じさせ得る。コード領域への置換以外の変異はまた、アミノ酸残基の欠失もしくは挿入（３の倍数の、連続する塩基の欠失または挿入によって生じる）、またはフレームシフトによって本来と異なるアミノ酸配列を有しているポリペプチドの翻訳を生じさせ得る。また、その遺伝子全体を含んでいる大きな欠失または当該遺伝子への大きな断片の挿入は、当該遺伝子の発現自体を喪失させ得る。
　上記内在性遺伝子の変異または破壊の結果として生じた個体は、本明細書においてタバコ植物体の変異体（単に変異体と記載する）と呼ばれる。なお、機能を欠損させるための変異は１遺伝子に１種の変異を有しても良いし、複数の変異を有していても良く、変異の種類は問わない。
　上記変異体は、状態（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかにあることが好ましい。状態（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかにある変異体では、少なくとも１つの内在性遺伝子は、後述する実施例に証明されている通り、機能を実質的に喪失しており、上記変異または破壊の目的（野生型植物と比べて、カロテノイドおよび／またはアポカロテノイドの含有量に変化（増加および減少）を生じているタバコ植物体の生成）が十分かつ確実に達成され得る。
　（ｉ）少なくとも１つの上記内在性遺伝子にとっての２対立遺伝子が上記変異（同じまたは異なる）を有している；
　（ｉｉ）当該２対立遺伝子が破壊されている；および
　（ｉｉｉ）当該２対立遺伝子のうち一方が変異を有しており、かつ他方が破壊されている。
　上記内在性遺伝子の発現抑制は、当該内在性遺伝子からｍＲＮＡへの転写の抑制、当該内在性遺伝子からｍＲＮＡを介したポリペプチドへの翻訳の抑制（例えば、当該ｍＲＮＡの分解）、および翻訳されたポリペプチドの機能の抑制を包含している。ｍＲＮＡの分解は、上記nonsense-mediated mRNA decayに起因して生じ得る。転写の抑制は、上記内在性遺伝子からの転写を促進する転写因子の阻害、および転写開始因子の上記内在性遺伝子へのアクセス阻害などによって実現され得る。翻訳の抑制は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子、または共抑制分子を用いて実現され得る。ポリペプチドの機能の抑制は、機能的なポリペプチドとの結合によって当該ポリペプチドの機能を阻害する分子（例えば、デコイ核酸、リボザイム、抗体および阻害ペプチド）によって実現され得る。
　上記（転写、翻訳またはポリペプチドの機能の）抑制は、例えば、当該抑制を実現するための分子を植物体に直接に導入すること、または当該分子をコードする核酸分子を植物体に導入すること（植物体の形質転換）によって、実現され得る。ここで、植物体の形質転換の結果として、上記核酸分子は、当該植物体のゲノムにおける１つ以上の任意の領域に組み込まれる。上記抑制が実現される限り、植物体の形質転換の結果として、上記核酸分子が、ＳゲノムおよびＴゲノムの両方に組み込まれている必要はない。
　上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子の発現産物であるポリペプチドの存在量の減少であることが好ましい。詳細には、当該存在量は、上記野生型ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を介して減少している。
　配列番号１、２または３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドは、野生型植物に存在するポリペプチド（またはそのバリアント）である。したがって、上記タバコ植物体は、上記ポリペプチドの存在量が野生型植物と比べて減少しているので、野生型植物の有している上記機能と比べて劣っている。当該機能は、例えば、１つ以上のカロテノイドを分解する機能である。
　上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子の発現産物であるポリペプチドの翻訳量の減少であることが好ましい。ポリペプチドの翻訳は、ｍＲＮＡの減少（ｍＲＮＡ自身の不安定性、ｍＲＮＡの分解促進もしくはｍＲＮＡの転写の抑制などのｍＲＮＡの存在量などに起因する）またはｍＲＮＡからの翻訳量の減少（翻訳構成要素（ｔＲＮＡおよびリボソーム）の欠乏、リクルートの阻害、または機能的な欠損などに起因する）に基づいて生じる。
　上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在量の減少であることが好ましい。ｍＲＮＡの存在量の減少は、例えば、遺伝子からのｍＲＮＡへの転写の抑制によって生じる。転写の抑制は、上記内在性遺伝子に対する変異の導入の結果として生じる、転写開始因子の当該内在性遺伝子へのアクセス阻害などによって実現され得る。
　上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進であることが好ましい。ｍＲＮＡの分解は、nonsense-mediated mRNA decayを生じるナンセンス変異の、内在性遺伝子における存在、ｍＲＮＡを分解する外来因子の存在、ｍＲＮＡを分解する内因性の構成要素の活性化、またはｍＲＮＡにおける分解促進配列の存在などによって引き起こされ得る。タバコ属植物体において、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解が促進されると、上記タバコ属植物体内の上記ｍＲＮＡは減少することになる。すなわち、上記タバコ属植物体において、上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量の減少であってもよい。ここで「内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在量の減少」は、野生型植物における当該内在性遺伝子の転写物の存在量を基準にして、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の当該転写物の存在を意味する。
　上記タバコ植物体において、上記変異は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記内在性遺伝子の存在する領域外への挿入であり得る。
　上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制（co-suppression）分子であることが好ましい。
　上記タバコ植物体において、上記内在性遺伝子の変異または破壊は、例えば、自然突然変異、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトの結果として生じている。上記内在性遺伝子の自然突然変異は、複製エラーおよび遺伝子の損傷によって一般的に生じる。当該損傷の原因は、天然に存在する公知の変異原など（例えば、放射線や紫外線など）への暴露などである。上記内在性遺伝子の変異原処理は、上記変異原をタバコ植物体に対して人為的に作用させること（および必要に応じて遺伝子修復機能の抑制との組合せ）によって、実施され得る。変異原の種類として、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、アジ化ナトリウム、エチジウムブロマイド、および亜硝酸等の化学薬剤を用いることができるが、タバコ属植物のゲノムＤＮＡに変異を生じさせる化学薬剤であればこれらに限定されない。また、変異原として、例えば、γ線、重イオンビーム、Ｘ線、中性子線、またはＵＶ等が挙げられるが、タバコ属植物のゲノムＤＮＡに変異を生じさせる放射線等であれば、これらに限定されない。変異原として、好ましくはＥＭＳである。これらの手法は、対象植物に外在性の因子を加える必要がないという観点から好ましい。これらの手法は、対象植物に外在性の因子を加える必要がないという観点から好ましい。上記内在性遺伝子の組換えは、公知の遺伝子組換え手法にしたがって、標的遺伝子の一部または全部を組換え配列によって相同的に組み換えることによって実施され得る。上記遺伝子のゲノム編集は、公知の技術（例えば、zinc-finger nucleases：ＺＦＮ、transcription activator-like effector nucleases：ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍなど）によって実施され得る。上記遺伝子ノックアウトは、公知のトランスポゾン（可動性遺伝因子）、またはＴ－ＤＮＡの挿入などによって、実施され得る。
　以上において説明した種々の変異は、例えば配列番号１８～２１に示す各遺伝子のゲノム配列を参照した当業者によって、タバコ植物体に対して容易に導入され得る。すなわち、これらの配列情報に基づいて、本発明の概念に包含される種々のタバコ植物体のゲノムに存在する、変異を導入すべき領域が適宜決定され得る。なお、配列番号１８は、ニコチアナ・タバカム（つくば１号）のゲノム上にあるＣＣＤ４－Ｓ遺伝子のヌクレオチド配列を示している。配列番号１９は、ニコチアナ・タバカム（つくば１号）のゲノム上にあるＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子のヌクレオチド配列を示している。配列番号２０は、ニコチアナ・タバカム（つくば１号）のゲノム上にあるＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子のヌクレオチド配列を示している。配列番号２１は、ニコチアナ・シルベストリスのゲノム上にあるＣＣＤ４遺伝子のヌクレオチド配列を示している。配列番号１８～２１は、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域（それぞれ約１ｋｂ）を含んでいる。
　上記タバコ植物体は、タバコ属植物であれば特に限定されず、タバコ属植物としては、タバコ（Nicotiana）属に属する植物であれば特に限定されず、例えば、ニコチアナ・アカウリス（Nicotiana acaulis）、ニコチアナ・アカミナタ（Nicotiana acuminata）、ニコチアナ・アカミナタ・ヴァリエーション・ムルツユロラ（Nicotiana acuminata var. multzjlora）、ニコチアナ・アフリカナ（Nicotiana africana）、ニコチアナ・アラタ（Nicotiana alata）、ニコチアナ・アンプレクシカウリス（Nicotiana amplexicaulis）、ニコチアナ・アレンツィイ（Nicotiana arentsii）、ニコチアナ・アテヌアタ（Nicotiana attenuata）、ニコチアナ・ベナビデシイ（Nicotiana benavidesii）、ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）、ニコチアナ・ビゲロビイ（Nicotiana bigelovii）、ニコチアナ・ボナリエンシス（Nicotiana bonariensis）、ニコチアナ・カビコラ（Nicotiana cavicola）、ニコチアナ・クレベランディイ（Nicotiana clevelandii）、ニコチアナ・コルディフォリア（Nicotiana cordifolia）、ニコチアナ・コリンボサ（Nicotiana corymbosa）、ニコチアナ・デブネイ（Nicotiana debneyi）、ニコチアナ・エクセルシオール（Nicotiana excelsior）、ニコチアナ・フォゲッチアナ（Nicotiana forgetiana）、ニコチアナ・フラグランス（Nicotiana fragrans）、ニコチアナ・グラウカ（Nicotiana glauca）、ニコチアナ・グルチノサ（Nicotiana glutinosa），ニコチアナ・グッドスピーディイ（Nicotiana goodspeedii）、ニコチアナ・ゴセイ（Nicotiana gossei）、ニコチアナ・イングルバ（Nicotiana ingulba）、ニコチアナ・カワカミイ（Nicotiana kawakamii）、ニコチアナ・ナイチアナ（Nicotiana knightiana）、ニコチアナ・ラングスドルフィ（Nicotiana langsdorfi）、ニコチアナ・リニアリス（Nicotiana linearis）、ニコチアナ・ロンギフロラ（Nicotiana longiflora）、ニコチアナ・マリチマ（Nicotiana maritima）、ニコチアナ・メガロシフォン（Nicotiana megalosiphon）、ニコチアナ・ミエルシイ（Nicotiana miersii）、ニコチアナ・ノクチフロラ（Nicotiana noctiflora）、ニコチアナ・ヌディカウリス（Nicotiana nudicaulis）、ニコチアナ・オブツシフォリア（Nicotiana obtusifolia）、ニコチアナ・オクシデンタリス（Nicotiana occidentalis）、ニコチアナ・オクシデンタリス・サブスピーシーズ・ヘスペリス（Nicotiana occidentalis subsp. Hesperis）、ニコチアナ・オトフォラ（Nicotiana otophora）、ニコチアナ・パニクラタ（Nicotiana paniculata）、ニコチアナ・パウクツユロラ（Nicotiana pauczjlora）、ニコチアナ・ペチュニオイデス（Nicotiana petunioides）、ニコチアナ・プランバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）、ニコチアナ・クアドリヴァルヴィス（Nicotiana quadrivalvis）、ニコチアナ・レイモンディイ（Nicotiana raimondii）、ニコチアナ・レパンダ（Nicotiana repanda）、ニコチアナ・ロズラタ（Nicotiana rosulata）、ニコチアナ・ロズラタ・サブスピーシーズ・イングルバ（Nicotiana rosulata subsp. Ingulba）、ニコチアナ・ロツンディフォリア（Nicotiana rotundifolia）、ニコチアナ・ルスチカ（Nicotiana rustica）（マルバタバコ）、ニコチアナ・セッチェルリイ（Nicotiana setchellii）、ニコチアナ・シムランス（Nicotiana simulans），ニコチアナ・ソラニフォリア（Nicotiana solanifolia）、ニコチアナ・スペガウイニイ（Nicotiana spegauinii）、ニコチアナ・ストックトニイ（Nicotiana stocktonii）、ニコチアナ・スアヴェオレンス（Nicotiana suaveolens）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・チルシフロラ（Nicotiana thyrsiflora）、ニコチアナ・トメントサ（Nicotiana tomentosa）、ニコチアナ・トメントシフォミス（Nicotiana tomentosifomis）、ニコチアナ・トリゴノフィラ（Nicotiana trigonophylla）、ニコチアナ・アンブラティカ（Nicotiana umbratica）、ニコチアナ・アンドゥラタ（Nicotiana undulata）、ニコチアナ・ベルンチナ（Nicotiana velutina）、ニコチアナ・ウィガンディオイデス（Nicotiana wigandioides）、およびタバコ属植物のハイブリッドなどが挙げられる。中でもニコチアナ・ベンサミアナ、ニコチアナ・ルスチカおよびニコチアナ・タバカムがより好ましく、葉たばこ生産の原料として用いられるニコチアナ・ルスチカおよびニコチアナ・タバカムが特に好ましい。
　〔２．タバコ植物体の製造方法〕
　本発明の一実施形態は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異を、タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含している、タバコ植物体の製造方法を提供する。
　上記導入するステップは結果として、上記内在性遺伝子の機能抑制を介して、上記タバコ植物体におけるカロテノイドおよび／またはアポカロテノイドの含有量を変化させる。カロテノイドおよび／またはアポカロテノイドの含有量を変化させることの概要については、上述の通りである。よって、上記ステップを実施するための具体例として、ゲノム編集技術を用いた、上記内在性遺伝子への変異の導入を挙げて以下に説明する。利用可能なゲノム編集技術としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍでは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質が、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮでは、融合タンパク質（ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼが融合されている）が、標的細胞内に存在すれば、ゲノム編集可能である。したがって、上記ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質、ならびに上記融合タンパク質はいずれも、標的細胞に直接的に導入され得る。これらを標的細胞に直接的に導入する方法としては、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、およびパーティクルボンバードメント法などが挙げられる。また、コンストラクト（ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびに任意のプロモーターおよび／またはターミネーターを含む）が挿入されているベクターを、アグロバクテリウム等を介して、標的細胞および組織に導入してもよい。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍでは、ゲノム上のＸＧＧのすぐ上流にあるヌクレオチド配列の相補的な配列が、ガイドＲＮＡの一部と塩基対を形成し、当該ヌクレオチド配列内において２本鎖のゲノムＤＮＡがＣａｓ９によって切断を受ける。当該ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１、２もしくは３に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）、または配列番号４、５もしくは６を有しているポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）の一部のうち、ＸＧＧのすぐ上流にある連続する１０塩基以上（例えば、１５塩基以上、好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１８塩基以上、より一層好ましくは１９塩基以上、最も好ましくは２０塩基以上）である。
　ＴＡＬＥＮでは、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５～２０塩基のスペーサを介して存在するヌクレオチド配列と結合する。当該ヌクレオチド配列は、２本鎖ゲノムＤＮＡの一方の鎖および他方の鎖に存在し、したがって、上記一対のＤＮＡ結合ドメインの一方は当該一方の鎖に、他方は、当該他方の鎖に結合する。上記ＤＮＡ結合ドメインは、３３～３４アミノ酸残基を繰り返し単位（モジュール）として、結合する塩基数と対応する数のモジュールから構成されている。ＤＮＡ結合ドメインによって結合されるヌクレオチド配列は、配列番号１、２もしくは３に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）、または配列番号４、５もしくは６を有しているポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）ならびに当該ポリヌクレオチドと相補鎖を形成するポリヌクレオチドの一部のうち、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５～２０塩基のスペーサを介して存在する、それぞれ連続する１０塩基以上、好ましくは１４塩基以上、より好ましくは１８塩基以上である。
　ＺＦＮでは、ＴＡＬＥＮと同様に、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に５～２０塩基のスペーサを介して存在するヌクレオチド配列と結合する。当該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のジンクフィンガーモジュールから構成されている。当該ヌクレオチド配列は、配列番号１、２もしくは３に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）、または配列番号４、５もしくは６を有しているポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）ならびに当該ポリヌクレオチドと相補鎖を形成するポリヌクレオチドの一部のうち、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５～２０塩基のスペーサを介して存在する、それぞれ連続する９塩基以上、好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１８塩基以上である。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍ、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮ、ならびに後述するＲＮＡｉについての説明のそれぞれは、全項目の記載にしたがって、配列番号１、２もしくは３に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドを、当該ポリペプチドと８０％以上の配列同一性を有している、タバコ属に含まれている他の種に存在する相同分子種のポリペプチドと読み替え可能である。また、同様にして、前段落の記載は、配列番号４、５もしくは６を有しているポリヌクレオチドを、当該ポリヌクレオチドと８０％以上の配列同一性を有している、タバコ属に含まれている他の種に存在する相同遺伝子のポリヌクレオチドと読み替え可能である。
　上述の通り、上記内在性遺伝子の機能抑制を引き起こす、上記タバコ植物体に導入されている変異は、遺伝的に受け継がれていることが好ましい。しかし、ゲノム編集のためにタバコ植物体に導入された外因性のポリヌクレオチドは、所望の変異がタバコ植物体に導入されたことを確認した後に当該タバコ植物体から排除されることが好ましい。上記外因性のポリヌクレオチドがタバコ植物体に維持されていると、所望されない変異が導入され（続け）ることによって、所望の形質（カロテノイドおよび／またはアポカロテノイドの含有量の変化）が失われるためである。
　タバコ植物体の上記内在性遺伝子に対する変異の導入、または当該内在性遺伝子の破壊は、他の生物工学的な手法（例えば、トランスポゾンまたはアグロバクテリウムを利用した手法）によって実施され得る。当該手法の具体例は、タバコのレトロトランスポゾンｔｎｔ１もしくは他の植物におけるトランスポゾン、またはアグロバクテリウムのＴｉプラスミドにおけるＴ－ＤＮＡをタバコ植物体に導入する方法である。
　代替的に、上記導入または破壊は、他の手法（タバコ植物体の変異原処理）によって実施され得る。変異源の例としては、小分子の化合物（例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、N-エチル-N-ニトロソウレア（ＥＮＵ）、アジ化ナトリウムなど）、および放射線（例えば、γ線、重イオンビーム、Ｘ線、中性子線、紫外線など）が挙げられる。
　変異は、再生可能な任意のタバコ植物体に導入され得る。当該タバコ植物体の例は、種子、根、葉、花、生殖器官または胚であり、好ましくは種子である。
　以上の手法によって得られるのは、種々の変異を有している（または変異を有していない）植物体の変異体集団であり得る。したがって、当該変異体集団から、所望の表現型を示す個体がさらに選抜され得る。個体を選抜することの例として、変異原を用いて処理した場合に得られる変異体集団（パネル）から所望の個体を選抜する手順を説明する。
　Ｔゲノム、Ｓゲノム両方の合計４つの対立遺伝子に変異を有した機能欠損したタバコ変異体は、例えば、以下の方法で獲得できる。上述のようにタバコを変異原で処理し、タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコの変異体集団（パネル）を作製し、ゲノムＤＮＡを抽出する。Ｓゲノム、Ｔゲノムそれぞれの遺伝子特異的プライマーを利用して、パネルのゲノムＤＮＡから標的遺伝子（ポリヌクレオチド）を増幅し、その産物のヌクレオチド配列を決定し、ホモ接合型の変異を有する系統を選抜する。まず、Ｓゲノム、Ｔゲノムそれぞれにホモ接合型変異を有する系統（Ｍ２）を取得し、それらを交配したＦ１を作製する。さらにその自殖後代（Ｆ２）を育成し、その中からＳ、Ｔ両ゲノムともホモ接合型の変異を有する系統を取得する（二因子劣性のため１／１６の確率で得られる）。
　さらに、Ｔゲノム上の２つの遺伝子座、Ｓゲノム上の１つの遺伝子座に計６つの対立遺伝子に変異を有した機能欠損したタバコ変異体は、例えば、以下の方法で獲得できる。上述のように取得したＳ、Ｔ両ゲノムともホモ接合型の変異を有する系統に、Ｔゲノム上のもう一つの対立遺伝子にホモ接合型変異を有する系統を交配し、Ｆ１を作製する。さらにその自殖後代（Ｆ２）を育成し、その中からＳ、Ｔ、もう一つのＴともホモ接合型の変異を有する系統を取得する（三因子劣性のため１／６４の確率で得られる）。
　上記導入するステップを実施する他の例として、ベクターを用いたタバコ植物体の形質転換を介した遺伝子の発現抑制および遺伝子への変異の導入が挙げられる。
　遺伝子の発現抑制または遺伝子への変異の導入を目的としたタバコ植物の形質転換に使用されるベクターとしては、ベクター内に挿入されたポリヌクレオチドを植物細胞内で発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。当該ベクターとしては、例えば、アグロバクテリウムを介して植物細胞に目的のポリヌクレオチドを導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、およびｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特に、バイナリーベクター系（ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１、およびｐＰＺＰ２０２など）のプラスミドが好ましい。
　遺伝子の発現抑制をＲＮＡｉによって実現する場合、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制するために使用されるトリガー配列が、上記ベクターに挿入される。当該トリガー配列は、例えば、配列番号１、２もしくは３に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）の一部、または配列番号４、５もしくは６を有しているポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）の一部である、連続する少なくとも２１～３０塩基（例えば、２１塩基以上、２２塩基以上、２３塩基以上、２４塩基以上、２５塩基以上、２６塩基以上、２７塩基以上、２８塩基以上、２９塩基以上、および３０塩基以上）のヌクレオチド配列に示されるポリヌクレオチド（センスＲＮＡ部分）、ならびに当該ポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列に示されるポリヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ部分）である。上述の「連続する少なくとも２１～３０塩基」のヌクレオチド配列は、より詳細には、連続する２１塩基以上、２３塩基以上、２５塩基以上、３０塩基以上、３５塩基以上、４０塩基以上、４５塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上、８０塩基以上、９０塩基以上、または１００塩基以上のヌクレオチド配列を意味する。
　上述の通り、上記タバコ植物体における内在性遺伝子の発現抑制は、遺伝的に受け継がれていることが好ましい。したがって、上記トリガー配列は、上記タバコ植物体のゲノムに組み込まれていることが好ましい。
　異なる内在性遺伝子が発現抑制されている２つのタバコ植物体を交配することによって、同時に複数の内在性遺伝子が発現抑制されているタバコ植物体を入手し得る。また、複数の異なる内在性遺伝子を同時に発現抑制し得る形質転換を実施した後に、複数の異なる内在性遺伝子が同時に発現抑制されているタバコ植物体を選抜することによって、複数の内在性遺伝子が同時に発現抑制されているタバコ植物体を入手し得る。
　なお、交配を利用して複数の内在性遺伝子が機能抑制されているタバコ植物体を入手する場合、交配させる一方のタバコ植物体は、内在性遺伝子の変異または破壊によって、他方のタバコ植物体は、形質転換による内在性遺伝子の発現抑制によって作製され得る。
　上記内在性遺伝子の変異または破壊は、当該内在性遺伝子における変異の有無の検出によって決定され得る。内在性遺伝子における変異を検出する方法としては、（１）市販の当該変異を含むＤＮＡ配列をＰＣＲ等によって増幅後に、シーケンサー等を利用して、ＤＮＡヌクレオチド配列を直接解読する方法、（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法を用いて配列の違いを電気泳動の距離の違いで検出する方法、（３）ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ法を用いて、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）を検出する方法、（４）Ｔ７　ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＩなどを用いてミスマッチ部位を切断することにより変異の有無を検出する方法、（５）制限酵素処理による切断の有無から変異の有無が判別できるＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法、（６）意図的にミスマッチを含むプライマーセットを用いることにより、制限酵素による切断の有無から変異の有無が判別できるｄＣＡＰＳ（derived CAPS）法、（７）変異配列に特異的にハイブリダイズするプローブを用いてプローブがハイブリダイズされたか否かを検出することにより変異の有無を判別する方法（ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲ法、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ解析法）、（８）欠失や挿入の場合には、電気泳動の移動度の差から変異を検出する方法などがあるが、変異の有無が判別できる方法であればよい。代替的に、遺伝子の変異は、遺伝子の改変の結果として生じるポリペプチドのサイズや発現量を、野生型タンパク質のそれらと比較することによって決定され得る。具体的には、例えばウェスタンブロット法を行うことにより、このような比較を行うことができる。
　〔３．その他〕
　本発明の他の局面は、タバコ植物体におけるアポカロテノイドの含有量を調節するための方法を提供する。当該方法は、以下のステップ（ａ）～（ｃ）を含んでいる。
　（ａ）以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、上記タバコ植物におけるカロテノイド酸化開裂酵素の発現または活性を調節するステップ：
　　（ｉ）カロテノイド酸化開裂酵素をコードする配列番号４、５もしくは６によって示されるポリヌクレオチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、それからなる（consisting of）、もしくは本質的にそれからなる（essentially consisting of）ポリヌクレオチド、
　　（ｉｉ）（ｉ）で示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、または
　　（ｉｉｉ）配列番号１、２もしくは３と少なくとも８０％の配列同一性もしくは配列番号７と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むカロテノイド酸化開裂酵素。
　（ｂ）ステップ（ａ）で得られた突然変異、非天然型もしくはトランスジェニック植物の少なくとも一部またはその燃焼時もしくは加熱時に生じるエアロゾル中の、アポカロテノイド含有量を測定するステップ。
　（ｃ）カロテノイド酸化開裂酵素の発現または活性が調節されていない対照植物と比較して、アポカロテノイド含有量が変化した、突然変異、非天然型またはトランスジェニック植物を同定するステップ。
　上記方法において、上記アポカロテノイドは、β－イオノンおよびジヒドロアクチニジオリドであり得、含有量の調節は、含有量の増加であり得る。上記方法において、上記アポカロテノイドは、β－ダマセノン、メガスティグマトリエノン（の構造異性体）および３－ヒドロキシ－β－ダマスコンであり得、含有量の調節は、含有量の減少であり得る。
　本発明の一実施形態は、上記タバコ属植物体の葉たばこ、上記葉たばこから得られた乾燥葉（乾燥たばこ）を提供する。乾燥葉は、葉たばこを乾燥することによって得られる。乾燥方法としては、任意の方法を用いることができ、例としては自然乾燥、温風乾燥、熱風乾燥などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、本明細書において、乾燥葉は、乾燥葉から得られるカットフィラー、粉末、シート、中骨、顆粒、および抽出物を含む。
　本発明の一実施形態は、上記乾燥葉を使用したたばこ製品を提供する。たばこ製品は、任意の形態であり得、例としては、刻みたばこ、葉巻たばこ、パイプたばこ、紙巻きたばこ、電子たばこ、水たばこ、嗅ぎたばこ（スヌース、スナッフを含む）、たばこを加熱し発生するエアロゾルをエアロゾル源として用いた非燃焼加熱型たばこ製品、たばこを加熱せずにその香味を吸引する非加熱型たばこ製品、などが挙げられるが、これらに限定されない。
　（まとめ）
　以上の各実施形態をまとめると、本発明は、以下のように要約され得る。
　（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されている、タバコ植物体。
　（２）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、（１）に記載のタバコ植物体。
　（３）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、（２）に記載のタバコ植物体。
　（４）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少である、（２）に記載のタバコ植物体。
　（５）上記機能抑制は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進である、（２）に記載のタバコ植物体。
　（６）上記変異は、上記内在性遺伝子に導入されている、（１）～（５）のいずれかに記載のタバコ植物体。
　（７）上記変異は、自然突然変異、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されている、（６）に記載のタバコ植物体。
　（８）上記変異は、上記ｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記内在性遺伝子の存在する領域外への挿入である、（５）に記載のタバコ植物体。
　（９）上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、（８）に記載のタバコ植物体。
　（１０）ニコチアナ・タバカムまたはニコチアナ・ルスチカに属する、（１）～（９）のいずれかに記載のタバコ植物体。
　（１１）タバコ植物体の製造方法であって、
　配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異を、タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含している、タバコ植物体の製造方法。
　（１２）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、（１１）に記載の製造方法。
　（１３）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、（１２）に記載の製造方法。
　（１４）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少である、（１２）に記載の製造方法。
　（１５）上記機能抑制は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進である、（１２）に記載の製造方法。
　（１６）上記導入するステップが、上記内在性遺伝子に上記変異を導入することを含んでいる、（１２）～（１５）のいずれかに記載の製造方法。
　（１７）上記導入するステップが、自然突然変異、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施される、（１６）に記載の製造方法。
　（１８）上記導入するステップが、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドを、当該内在性遺伝子の存在する領域外に挿入することを含んでいる、（１２）～（１５）のいずれかに記載の製造方法。
　（１９）上記因子が、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、（１８）に記載の製造方法。
　（２０）（１）～（１０）のいずれかに記載のタバコ植物体、または（１１）～（１９）のいずれかに記載の製造方法によって得られたタバコ植物体の、子孫または当該タバコ植物体の交配によって得られた育種後代。
　（２１）（１）～（１０）のいずれかに記載のタバコ植物体、（１１）～（１９）のいずれかに記載の製造方法によって得られたタバコ植物体、または（２０）に記載の子孫もしくは育種後代から収穫された、葉たばこ。
　（２２）（２１）に記載の葉たばこから生成された、乾燥葉。
　（２３）（２２）に記載の乾燥葉を含んでいる、たばこ製品。
　以上の各実施形態は、代替的に以下のようにも要約され得る。
　（１）
　配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されている、タバコ属植物体。
　（２）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在量の減少である、（１）に記載のタバコ属植物体。
　（３）
　上記機能抑制は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進である、（１）または（２）に記載のタバコ属植物体。
　（４）
　上記変異は、上記内在性遺伝子に導入されている、（１）～（３）のいずれかに記載のタバコ属植物体。
　（５）
　上記変異は、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されている、（４）に記載のタバコ属植物体。
　（６）
　上記変異は、上記変異原処理によって導入されている、（５）に記載のタバコ属植物体。
　（７）
　上記変異は、上記ｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記内在性遺伝子の存在する領域外への挿入である、（３）に記載のタバコ属植物体。
　（８）
　上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、（７）に記載のタバコ属植物体。
　（９）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、本来の機能的な上記ポリペプチドの存在量の減少である、（１）～（８）のいずれかに記載のタバコ属植物体。
　（１０）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、本来の機能的な上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、（９）に記載のタバコ属植物体。
　（１１）
　ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・ルスチカまたはニコチアナ・シルベストリスに属する、（１）～（１０）のいずれかに記載のタバコ属植物体。
　（１２）
　タバコ植物体の製造方法であって、
　配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異を、タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含している、タバコ植物体の製造方法。
　（１３）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在量の減少である、（１２）に記載の製造方法。
　（１４）
　上記機能抑制は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進である、（１２）または（１３）に記載の製造方法。
　（１５）
　上記導入するステップが、上記内在性遺伝子に上記変異を導入することを含んでいる、（１２）～（１４）のいずれかに記載の製造方法。
　（１６）
　上記導入するステップが、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施される、（１５）に記載の製造方法。
　（１７）
　上記変異は、上記変異原処理によって導入されている、（１６）に記載の製造方法。
　（１８）
　上記導入するステップが、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドを、当該内在性遺伝子の存在する領域外に挿入することを含んでいる、（１２）～（１５）のいずれかに記載の製造方法。
　（１９）
　上記因子が、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、（１８）に記載の製造方法。
　（２０）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、本来の機能的な上記ポリペプチドの存在量の減少である、（１２）～（１９）のいずれかに記載の製造方法。
　（２１）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、本来の機能的な上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、（２０）に記載の製造方法。
　（２２）
　（１）～（１１）のいずれかに記載のタバコ属植物体、または（１２）～（２１）のいずれかに記載の製造方法によって得られたタバコ属植物体の、子孫または当該タバコ属植物体の交配によって得られた育種後代。
　（２３）
　配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されており、
　野生型のタバコ属植物体の葉たばこより高い総カロテノイド含有量を有している、タバコ属植物体の葉たばこ。
　（２４）
　配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されており、
　野生型のタバコ属植物体の乾燥葉より高い総カロテノイド含有量を有している、タバコ属植物体の乾燥葉。
　（２５）
　（２４）に記載の乾燥葉を含んでいる、たばこ製品。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
　〔１．ＣＣＤ４遺伝子の発現抑制によってタバコ植物に現れる変化〕
　ＣＣＤ４遺伝子の発現が抑制された組換え体（以下、単に組換え体と記載する）を作製し、ＣＣＤ４遺伝子の発現抑制によってタバコ植物に現れる変化を同定した。
　（１ａ）形質転換の準備
　組換え体の作製のために、まず形質転換用のベクターを、以下のように準備した。
　ニコチアナ・タバカムにある３つのＣＣＤ４遺伝子（ＣＣＤ４－Ｓ遺伝子、ＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子およびＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子）の発現をすべて抑制するためのＲＮＡｉトリガー配列として、配列番号４～６において同一性の高い領域（３２３ｂｐ）を選択した。当該領域を、ＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子のｃＤＮＡを鋳型にして、PrimeSTAR（登録商標） Max DNA Polymerase（タカラバイオ）を用いたＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲの条件およびプライマーは、以下の通りである。なお、配列番号９の５’末端には、配列番号４～６と一致しないCACCが付加されている。
　（ＰＣＲ条件）
９４℃で３０秒
９８℃で１０秒、５５℃で５秒、および７２℃で１０秒を１サイクルとして、３０～４０サイクル
７２℃で１０秒
　（プライマーセット）
フォワードプライマーNtCCD4-F1：5'-CACCGCGTACATCCGAAATGGCCC-3'（配列番号９）
リバースプライマーNtCCD4-R1：5'-AGTTTGCCTCCGAATAAAGC-3'（配列番号１０）。
　得られたＰＣＲ産物を、pENTR（商標）/D-TOPO（商標）ベクター（Thermo Fisher Scientific Inc.）にクローニングし、ＲＮＡｉトリガー配列のヌクレオチド配列（配列番号１１）を確認した後に、Gateway（商標） LR Clonase（商標） II Enzyme Mix（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて、ＲＮＡｉトリガー配列をpSP231ベクターに導入した。導入された配列を確認するために、pSP231ベクターに導入したＲＮＡｉトリガー配列を、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれを個別にＰＣＲによって増幅し、各ヌクレオチド配列を確認した。pSP231ベクターは、（ｉ）pHellsgate12（文献：Wesley et al., 2001, Plant J., 27, 581-590参照）のＳａｃＩ部位にＧＦＰ（Green fluorescent protein遺伝子）発現カセットが挿入されており、（ｉｉ）トリガー配列の逆位反復配列がｐｄｋ/ｃａｔイントロンに挟まれて配置されており、（ｉｉｉ）ＲＮＡｉトリガー配列をカリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡ遺伝子プロモーターで発現可能な、バイナリーベクターである。ＲＮＡｉトリガー配列を含むpSP231ベクターを用いて、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens） LBA4404をエレクトロポレーションによって形質転換した。得られた形質転換アグロバクテリウムにおいて、ＲＮＡｉトリガー配列の存在をＰＣＲによって確認した後に、当該アグロバクテリウムをタバコの形質転換に使用した。
　（１ｂ）組換え体の作製
　ニコチアナ・タバカムの４つの品種（Petit Havana SR-1、つくば1号、K326およびCoker319）を用いて、以下の通り一般的な方法によってタバコの形質転換を行った。形質転換された上記アグロバクテリウムをタバコ葉の切片に感染させ、カナマイシン（50μg/ml）を含むLinsmaier and Skoog培地において培養することによって得られたカルスからカナマイシン耐性の再分化個体を得た。これらの再分化個体から、葉全体におけるＧＦＰ蛍光が確認された個体を選抜した。選抜した個体（Ｔ０個体）を、３号鉢に移植し、２３～２５℃の閉鎖系温室において一定条件のもとに栽培した。リアルタイムRT-PCR発現解析の結果に基づいて、ＣＣＤ４遺伝子の発現が非形質転換体（元の品種Petit Havana SR-1、つくば1号、K326またはCoker319）と比べて約２０％に低下している系統を、組換え体として選抜した。上記４つの品種からそれぞれ作製された当該組換え体は、元の品種と異なる表現型（下位葉が明らかに黄化する）を示した。
　（１ｃ）カロテノイドの定量分析
　Petit Havana SR-1から作製された上記組換え体（Ｔ０世代）のうち、３系統（RNAi-1-3、1-8、1-15）、および２個体の元の品種のそれぞれから収穫した５～６枚ずつの下位葉を凍結乾燥させ、粉砕した試料を、ルテイン（カロテノイド）分析に供した。30mLねじ口ガラス遠沈管に、上記試料1.0gに続いて、抽出液（アセトン：エタノール＝１：１）10mLを入れ、スクリューキャップでふたをした後に30分間の超音波抽出を行った。超音波抽出後に、遠沈管を20分間静置し、遠心分離機にかけた（3000rpm、10min）。上清を、PTFEフィルター（孔径0.45μm）でろ過し、液体クロマトグラフ分析に供した。分析に用いた装置、器具および条件は以下の通り。
・高速液体クロマトグラフ：LC-2000Plus（日本分光株式会社、東京）
・PDA検出器：MD-2010 Plus（日本分光株式会社、東京）
・カラム：Develosil（登録商標）（ODS-HG-5、内径4.6mm、長さ250mm、野村化学株式会社、愛知)
・カラムオーブン温度：40℃
・溶離液流速：1.0mL/min
・溶離液A：メタノール
・溶離液B：テトラヒドロフラン（安定剤不含）
・溶離条件：単一組成溶媒溶出（溶離液A:溶離液B＝9:1）
・注入量：10μL
・PDA検出波長：455nm。
　乾燥重量当たりに含まれているルテインの量を、455nmの光波長で検出した吸収スペクトルのピーク面積値を用いた検量線法によって、算出した。1、5、10および20μg/mLのルテイン標準品溶液を液体クロマトグラフによって分析した結果に基づいて作成した検量線（0.9999の相関係数をともなって1～20μg/mLの範囲で直線性を示す）を使用した。結果を表２に示す。表２に示す通り、上記３系統（RNAi-1-3、1-8、1-15）は、２個体の元の品種（対照１および２）の約３倍に当たる量のルテイン（主要なカロテノイド）を含んでいた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　以上の通り、タバコ植物におけるＣＣＤ４遺伝子の発現抑制は、葉におけるカロテノイドの蓄積を示した。なお、他のナス科植物であるジャガイモでは、葉にＣＣＤ４遺伝子が高発現しているにもかかわらず、ＣＣＤ４遺伝子発現の下方制御が、葉におけるカロテノイドの蓄積に影響しないとの報告がある（Campbell et al., Plant Physiology, 2010, Vol. 154, pp. 656-664）。
　〔２．ＣＣＤ４遺伝子に変異を有しているタバコ植物体の作製〕
　上述の変化を生じる他のタバコ植物体を得るために、ＣＣＤ４遺伝子に変異を有しているタバコ植物体を作製した。
　ＣＣＤ４－Ｓ遺伝子またはＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子に変異を有する系統を、タバコ栽培品種（つくば１号）のＥＭＳ変異体集団（Ｍ２世代、約2000系統）から、アンプリコンシークエンスによる配列決定にしたがって、選抜した。ＣＣＤ４－Ｓ遺伝子に変異を有する系統として、１つのナンセンス変異（ＣＣＤ４－Ｓタンパク質の７２番目のグルタミン（Q）をコードしているコドンが、ヌクレオチド置換によって終止コドンに変化）をＣＣＤ４－Ｓ遺伝子にホモに生じているCCD4-s-1（0844系統）が得られた。ＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子に変異を有する系統として、１つのナンセンス変異をＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子にホモに生じている２系統（CCD4-t1-1：0283系統およびCCD4-t1-2：0135系統）が得られた。CCD4-t1-1では、ＣＣＤ４Ｔ１タンパク質の４６番目のグルタミン（Q）をコードしているコドンが、ヌクレオチド置換によって終止コドンに変化している。CCD4-t1-2では、ＣＣＤ４Ｔ１タンパク質の１８７番目のアルギニン（R）をコードしているコドンが、ヌクレオチド置換によって終止コドンに変化している。
　上述の３系統を用いて、２つのＣＣＤ４遺伝子に変異を有しているタバコ植物（二重変異体）を次のように作製した。CCD4-s-1とCCD4-t1-1との、人工授粉を介した交配によって得たＦ１植物を自殖させて、Ｆ２世代集団を得た。Ｆ２世代集団から、アンプリコンシークエンスによる配列決定にしたがって、２つのＣＣＤ４遺伝子のそれぞれにホモに変異を有している系統（CCD4-st1-1）および２つのＣＣＤ４遺伝子がホモに野生型である系統（WT1）を選抜した。CCD4-s-1とCCD4-t1-2との、人工授粉を介した交配によって得たＦ１植物を自殖させて、Ｆ２世代集団を得た。Ｆ２世代集団から、アンプリコンシークエンスによる配列決定にしたがって、２つのＣＣＤ４遺伝子のそれぞれにホモに変異を有している分離系統（CCD4-st1-2）および２つのＣＣＤ４遺伝子がホモに野生型である系統（WT2）を選抜した。なお、二重変異体にとっての対照物である２つのＣＣＤ４遺伝子がホモに野生型である系統（WT1およびWT2）を、以下では「ホモ野生型」と記載する。
　ＣＣＤ４遺伝子に変異を有している系統を、タバコ野生種（ニコチアナ・シルベストリス）のＥＭＳ変異体集団（Ｍ２世代、約4000系統）から、アンプリコンシークエンスによる配列決定にしたがって、選抜した。なお、ニコチアナ・シルベストリスは、ゲノム上に１つのＣＣＤ４遺伝子のみを有している。ＣＣＤ４遺伝子に変異を有する系統として、１つのナンセンス変異をＣＣＤ４遺伝子にホモに生じている２系統（08N-465系統および06N-7039系統）が得られた。08N-465系統では、ＣＣＤ４タンパク質の７２番目のグルタミン（Q）をコードしているコドンが、ヌクレオチド置換によって終止コドンに変化している。06N-7039系統では、ＣＣＤ４タンパク質の１５０番目のアルギニン（R）をコードしているコドンが、ヌクレオチド置換によって終止コドンに変化している。
　上記アンプリコンシークエンスに使用したプライマーを以下に示す。
タバコＣＣＤ４－Ｓ　フォワードプライマー：TCATCTTCTCCTTCTCTTAAA（配列番号１２）
タバコＣＣＤ４－Ｓ　リバースプライマー：CGGAGAATACATTTGGCAA（配列番号１３）
タバコＣＣＤ４－Ｔ１　フォワードプライマー：TCATCTTCTCTTGCTCTTAAG（配列番号１４）
タバコＣＣＤ４－Ｔ１　リバースプライマー：CAGAGAATACATTTGGGAT（配列番号１５）
ニコチアナ・シルベストリスＣＣＤ４　フォワードプライマー：CCTTTCTACATTATCACAACACCCTA（配列番号１６）
ニコチアナ・シルベストリスＣＣＤ４　リバースプライマー：TCACCATCTGGGGCTAATTT（配列番号１７）。
　なお、温室内で育成したCCD4-st1-1およびCCD4-st1-2は、CCD4-s-1、CCD4-t1-1、CCD4-t1-2、WT1およびWT2には見られない表現型（下位葉の黄化）を示した。当該表現型は、実施例１の組換え体が示す表現型と非常に類似していた。また、08N-465系統および06N-7039系統は、野生型のニコチアナ・シルベストリスには見られない上記表現型（下位葉の黄化）を示した。
　〔３．カロテノイドおよびアポカロテノイドの定量分析〕
　（３ａ）温室栽培した二重変異体における主要なカロテノイド量
　実施例２で得られた２系統の二重変異体（CCD4-st1-1およびCCD4-st1-2）および２系統のホモ野生型（WT1およびWT2）の２個体ずつを、２３～２５℃の温室内で栽培した。心止めから7～17日後に、１株から4-5枚ずつ収穫した下位葉（１系統につき８～１０枚）を、液体窒素で凍結させ、-80℃で保管した。下位葉をさらに凍結乾燥および粉砕した後に、同じ系統の２個体分の混合物を、１試料として使用した。各試料に含まれている主要なカロテノイド量の分析を、一般財団法人日本食品分析センターに依頼した。一般財団法人日本食品分析センターから受け取った結果を図１にまとめる。図１の「Total carotenoids」は、吸光光度法（ルテインの吸光係数：Ｅ1％１ｃｍ＝２５５０、吸光波長：４５５ｎｍ、溶媒：エタノール）による、上記試料における総カロテノイド量の実測値に基づいている。図１の「zenoxitantin」、「lutein」、「α-carotene」、「β-carotene」および「lycopene」は、ゼアキサンチン、ルテイン、α－カロテン、β-カロテン、リコペン、の上記試料における各含有量の、高速液体クロマトグラフィー法による実測値に基づいている。
　図１に示す通り、CCD4-st1-1およびCCD4-st1-2は、ホモ野生型と比べて1.4～2.1倍のルテイン、1.4～2.7倍のβ-カロテン、および2.5～4.0倍のゼアキサンチン（いずれも主要なカロテノイド）を含んでいた。また、CCD4-st1-1およびCCD4-st1-2は、ホモ野生型と比べて1.7～2.5倍の総カロテノイド量を示した。α－カロテンおよびリコペンは検出されなかった。
　（３ｂ）圃場栽培したニコチアナ・シルベストリスのＣＣＤ４変異体における主要なカロテノイド量
　実施例２で得られた08N-465系統およびその野生型系統（WT）の移植用苗を、ハウス温室内で生育させた。圃場へ移植後は、生育および収穫までの管理を、葉たばこの一般的な栽培条件のもとに実施した。心止めから約一か月後に、各系統の約１５株のそれぞれから2～3枚ずつ収穫した下位葉を、凍結乾燥し、粉砕し、試料にした。各試料に含まれている主要なカロテノイド量の分析を、一般財団法人日本食品分析センターに依頼した。一般財団法人日本食品分析センターから受け取った結果を図２にまとめる。
　図２に示すように、08N-465は、WTと比べて1.4倍のルテイン、1.3倍のβ-カロテン、および3.3倍のゼアキサンチンを含んでいた。また、08N-465は、WTと比べて1.7～1.8倍の総カロテノイド量を示した。α－カロテンおよびリコペンは検出されなかった。
　（３ｃ）圃場栽培した二重変異体の乾葉におけるカロテノイド量
　実施例２で得られた２系統の二重変異体（CCD4-st1-1およびCCD4-st1-2）、２系統のホモ野生型（WT1およびWT2）、および元の品種（つくば１号）の移植用苗をハウス温室内で生育させた。圃場へ移植後は葉たばこの一般的な栽培条件のもとに実施した。心止めから25日目に１株から5枚ずつ収穫した合葉に、熱風乾燥機を用いた通常の黄色乾燥処理を施した。得られた乾葉の中骨部分を除去し、ラミナ部分を粉砕処理し、粉砕試料にした。14mLねじ口ガラス遠沈管に、粉砕試料0.1g、抽出液（抗酸化物質である2,6-ジ-tert-ブチルヒドロキシベンゼン（0.1%）を加えたアセトン：エタノール＝１：１）5.0mL、内部標準物質であるtrans-レチノール5μgを入れ、スクリューキャップでふたをした後に、中型恒温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） BR-43FH・MR（TAITEC Corp.）を用いて振とう抽出（250ｒｐｍ、25℃、1時間）を行った。抽出溶液を、PTFEフィルター（孔径0.45μm）でろ過し、フォトダイオードアレイ検出器（PDA）付き液体クロマトグラフタンデム質量分析計（LC-MS/MS）分析に供した。分析に用いた装置、器具および条件は以下の通り。
　（クロマトグラフ）
・高速液体クロマトグラフ：1260 infinity （アジレント・テクノロジー株式会社、東京）
・PDA検出器：1260 infinity Diode Array Detector（アジレント・テクノロジー株式会社、東京）
・カラム：ACQUITY UPLC（登録商標） BEH 130Å C18 (内径 2.1mm、長さ 100mm、粒子径 ・1.7μm；日本ウォーターズ株式会社、東京)
・カラム温度：35℃
・溶離液A：アセトニトリル：メタノール=７:3（v/v）
・溶離液B：超純水
・溶離条件：
　（１）0～4分：溶離液Aおよび溶離液B（85:15の混合液を4分間）
　（２）4～6分：溶離液Aおよび溶離液B（85:15～100：0の直線的な濃度勾配の混合液を２分間）
　（３）6～28.2分：溶離液Aのみ（22.2分間）
・流速：0.2mL/min
・注入量：2.0μL
・PDA検出波長：325nm（trans-レチノール）、450nm（カロテノイド）
　（質量分析）
・質量分析装置：6470 Triple Quad LC/MS（アジレント・テクノロジー株式会社、東京）
・イオン源パラメーター
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化（ESI）
ネブライザーガス：窒素
ネブライザーガス温度：300℃
ネブライザーガス流量：10Ｌ/min
ネブライザー圧力：35 psi
シースガス：400℃
シースガス流量：12Ｌ/min
キャピラリー電圧：3500V
・質量分析計パラメーター
イオン極性：正
衝突ガス：窒素
測定モード：選択反応モニタリング（SRM）。
　ＳＲＭにおいて分析する各カロテノイドのプリカーサーイオンおよびプロダクトイオンの組み合わせ（ＳＲＭトランジション）を、表３の通りに設定した。表３において、各化合物の滞留時間は42msecであり、セル加速電圧は3Vである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　各カロテノイド成分を、PDAおよびSRM分析で検出されたピークの保持時間を標準物質と比較することによって同定した。各カロテノイドの含有量を、内部標準物質であるtrans-レチノールの325nmの光波長で検出した吸収スペクトルの面積値に対する各カロテノイドの450nmの光波長で検出した吸収スペクトルの面積値の相対値を半定量値として、算出した。各系統に含まれている各カロテノイド量を図３にまとめた。図３では、１系統における１つのカロテノイド量は、圃場の３区画から得られた３試料におけるカロテノイドの含有量を表す値の平均値として示されている。図３に示すように、CCD4-st1-1およびCCD4-st1-2は、対照3系統（WT1、WT2、およびつくば1号）と比べて2.0倍以上のルテイン、2.1倍以上のβ-カロテン、3.8倍以上のゼアキサンチンを含んでいた。
　（３ｄ）圃場栽培した二重変異体の乾葉におけるアポカロテノイド量
　以下の通り、（３ｃ）に記載の粉砕試料における17種のアポカロテノイド量を調べた。14mLのねじ口ガラス遠沈管に、粉砕試料0.1g、抽出液（内部標準物質である1,3-ジメトキシベンゼン（5.4 μg/mL）を加えたメタノール）6.0 mLを入れ、スクリューキャップでふたをした後に、中型恒温振とう培養機バイオシェーカー（登録商標） BR-43FH・MR（TAITEC Corp.）を用いて振とう抽出（250ｒｐｍ、70℃、1時間）を行った。抽出溶液を、孔径0.45μmのPTFEフィルターでろ過し、ガスクロマトグラム質量分析計（GC/MS）分析に供した。分析に用いた装置、器具および条件は以下の通り。
・ガスクロマトグラム質量分析計：GC/MS 5977A MSD（アジレント・テクノロジー株式会社、東京）
・カラム：HP-1ms (内径0.25mm、長さ30m、膜厚0.25 μm；アジレント・テクノロジー株式会社、東京)
・インサートライナー：不活性ガラスウール入りスプリットレス用ライナ（アジレント・テクノロジー株式会社、東京）
・ヘリウム流速：1.0 mL/min
・注入量：1.0 μL
・インジェクションモード：スプリットレス
・インサート温度：280℃
・AUX温度：280℃
・カラム昇温条件：
　（１）50℃に1 min保持
　（２）50℃から100℃に10℃/minで昇温
　（３）100℃から200℃に2℃/minで昇温
　（４）200℃から300℃に20℃/minで昇温
　（５）300℃に19 min保持
・分析モード：TIC/SIMモード。
　TICをm/z:30-500の範囲で分析した。SIMにおいて分析する各アポカロテノイドの半定量イオンおよび定性イオンの組み合わせ（SIMパラメーター）を表４の通りに設定した。表４において、括弧付きの数字が末尾に示されている化合物は、構造異性体を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　各アポカロテノイド成分を、SIMモードで半定量イオンおよび定性イオンが検出された保持時間における、TICモードで得られるフルマススペクトルを文献情報およびデータベース内の情報と照合させることによって、同定した。各アポカロテノイドの含有量を、内部標準物質である1,3-ジメトキシベンゼンの半定量イオンのクロマトグラムの面積値に対する各アポカロテノイドの半定量イオンのクロマトグラムの面積値の相対値を半定量値として、算出した。各系統に含まれている各カロテノイド量を表５にまとめた。表５では、１系統における１つのカロテノイド量は、圃場の３区画から得られた３試料におけるカロテノイドの含有量を表す値の平均値として示されており、「ND」はNot detectedを表している。表５に示すように、CCD4-st1-1およびCCD4-st1-2は、対照3系統（WT1、WT2、およびつくば1号）と比べて約2～3倍に増加したβ-イオノンおよびジヒドロアクチニジオリド（１～２行目の化合物）、約1/2～1/3に減少したアポカロテノイド（３～８行目の化合物）、および大きな変化のないアポカロテノイド（９～１７行目の化合物）を含んでいた。増加を示したアポカロテノイド（β-イオノンおよびジヒドロアクチニジオリド）、および減少を示したアポカロテノイド（３～８行目の化合物）はいずれも、香気アポカロテノイドとして知られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　〔４．乾葉の官能評価試験〕
　（４ａ）紙巻たばこに対する官能評価試験
　圃場で栽培した２系統の二重変異体（CCD4-st1-1およびCCD4-st1-2）、３系統の一重変異体（CCD4-s-1、CCD4-t1-1およびCCD4-t1-2）、および３系統の対照植物体（WT1、WT2およびつくば1号）から収穫した本葉の乾葉を用いて紙巻き器で紙巻たばこを作製した。これらの紙巻たばこの香喫味を、訓練された１０名のパネラーによる官能評価から、採点した。パネラーには、対照植物体の紙巻たばこの喫煙によって感じた官能性を基準に、二重変異体および一重変異体の紙巻たばこの喫煙によって感じた官能性を回答させた。回答の種類は、（対照と比べて）「良」、「やや良」、「違い無し」、「やや悪い」および「悪い」である。「良」には２点、「やや良」には１点、「違い無し」、「やや悪い」および「悪い」には０点を付け、各紙巻たばこの香喫味を採点した。点数を集計した結果を表６に示す。表６に示すように、CCD4-st1-1およびCCD4-st1-2の香喫味を、１０名のうち７名が「良」または「やや良」と評価した。CCD4-st1-1およびCCD4-st1-2の合計点数は、CCD4-s-1、CCD4-t1-1およびCCD4-t1-2のいずれよりも高かった。以上の結果は、上記二重変異体から収穫した本葉の乾葉は、一重変異体および対照植物体から収穫した本葉の乾葉と比べて、人間の感覚器に心地よい刺激を与えることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（４ｂ）微粉砕試料に対する官能評価試験
　（４ａ）で得られた乾葉を、粉砕し、さらに微粉砕処理した後に、ポリエチレングリコール（微粉砕処理した乾葉の３倍の質量）に分散させ、微粉砕試料にした。熟練した３名の熟練パネラー（上述のパネラーより訓練され、さらに多くの経験を有している）による官能評価（対照物に対する試験物の比較）を実施した。対照物はメビウス（商標）の未加香品であり、試験物は、各微粉砕試料を、メビウス（商標）の未加香品に展着させたものである。パネラーに、対照物および試験物を喫煙させ、対照物に対する試験物の香喫味の差異について回答させた。熟練被験者による「フローラルな香喫味の向上を認める」との回答を１点、「フローラルな香喫味の向上を認めない」との回答を０点として、各試験物を採点した結果を表７にまとめる。表７に示すように、CCD4-st1-1には、パネラーの全員がフローラルな香喫味の向上を認め、CCD4-st1-2には３名のうち２名がフローラルな香喫味の向上を認めた。以上の結果は、二重変異体から収穫した本葉の乾葉が、従来のタバコ製品に対して良好な香喫味を付加できることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　〔５．CCD4遺伝子の単独変異体（CCD4-t2）、二重変異体（CCD4-st2およびCCD4-t1t2）および三重変異体（CCD4-tm）のさらなる作製〕
　ＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子に変異を有する以下の３系統を、タバコ（つくば１号）のＥＭＳ変異体集団（Ｍ２世代、約2000系統）のＤＮＡ配列を解析し、アンプリコンシークエンスによる配列決定を行って、選抜した。
系統名：1795系統（以下、CCD4-t2-1と表記）
系統名：0799系統（以下、CCD4-t2-2と表記）
系統名：1352系統（以下、CCD4-t2-3と表記）。
　CCD4-t2-1は、ナンセンス変異（190番目のアルギニン（R）をコードするコドンが終止コドンに変わるヌクレオチド置換）をＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子に有していた。CCD4-t2-2は、スプライス変異（第一イントロンにおける５'末端の塩基GがAに置換されている）をＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子に有していた。CCD4-t2-3は、スプライス変異（CCD4-t2-3は第一イントロンの３'末端の塩基GがAに置換されている）をＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子に有していた。選抜した上記３系統を生育させたところ、いずれの系統にも、成熟（老化）した下位葉に黄化は観察されなかった。CCD4-t2-3を、ＣＣＤ４遺伝子の三重変異体の作製に用いた。
　次いで、２段階の交配、および自殖を経て、目的の変異をホモ接合型に有しているＣＣＤ４遺伝子の二重変異体および三重変異体を作製した。
１段階：CCD4-s-1およびCCD4-t1-2（実施例２）の交配によるCCD4-st1-2（ホモ接合型の変異を、ＣＣＤ４－ＳおよびＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子のそれぞれに有する）の作製
２段階：CCD4-st1-2およびCCD4-t2-3の交配による予備的な変異体系統（ヘテロ接合型の変異を、ＣＣＤ４－Ｓ、ＣＣＤ４－Ｔ１およびＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子のそれぞれに有する）の作製
自殖：上記変異体系統の自殖によるCCD4-058（確認された遺伝子型を後述する）の作製
　系統CCD4-058の種子から育成された３６０個体の苗のゲノムに存在するＣＣＤ４遺伝子の変異を、配列決定によって、同定した。同定によって、系統CCD4-058の後代３６０個体中には、２つのＣＣＤ４遺伝子にホモ接合型変異を有している二重変異体（CCD4-st1、CCD4-st2およびCCD4-t1t2）および３つのＣＣＤ４遺伝子にホモ接合型変異を有している三重変異体（CCD4-tm）が、存在することを確認した（これらの変異体から自殖後代の種子を得た）。なお、ＣＣＤ４－Ｔ２遺伝子における変異を含む領域を、以下のプライマーを用いて増幅した。
バコＣＣＤ４－Ｔ2　フォワードプライマー：CAAACTCCAGCGGAGATA（配列番号２２）
タバコＣＣＤ４－Ｔ2　リバースプライマー：GGCACGCCACTATGCAAT（配列番号２３）。
　得られた二重変異体（CCD4-st1、CCD4-st2およびCCD4-t1t2）および三重変異体（CCD4-tm）を、温室内で育成し、成熟（老化）した下位葉の色を目視で観察した。CCD4-st2、CCD4-t1t2およびCCD4-tmにおいて、当該色はオレンジ色～黄色であったが、色彩の強さには、ＣＣＤ４遺伝子型にしたがって系統間に差異があった。色彩は、(i)CCD4-tmは、(ii)CCD4-st1、ならびに(iii)CCD4-st2およびCCD4-t1t2（同程度）の順に強かった。
　〔６．CCD4二重変異体および三重変異体における成熟（老化）した葉の葉色の色彩分析〕
　（６ａ）生葉の色彩分析
　６系統（３遺伝子型×２系統）の二重変異体（CCD4-st1-a、CCD4-st1-2（実施例３および４を参照）、CCD4-st2-a、CCD4-st2-c、CCD4-t1t2-aおよびCCD4-t1t2-c）、２系統の三重変異体（CCD4-tm-aおよびCCD4-tm-c）、および１系統の対照植物（つくば1号）を、２３～２５℃下の温室で栽培した。播種から94日目（心止めから8日目）に、成熟（老化）した下位葉の生葉（１系統につき、３個体から１枚ずつ）を採取し、その色彩を色彩色差計CR-20（コニカミノルタジャパン株式会社、東京）を用いて測定した。色彩の数値化には、国際照明委員会（Commission internationale de l'eclairage）およびJISによって採用されているL*a*b*系を用いた。色彩色差計CR-20は、L*a*b*系（国際照明委員会（Commission internationale de l'eclairage）およびJISが採用）を構成する値を出力する。色彩分析の結果を、表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８に示されている数値は、１系統（３枚の生葉）につき１８の測定点について出力された測定値の平均である。測定点の内訳は、１枚の生葉における表面の６点（主脈を対称軸として葉を左右に分けたときの、それぞれの上部、中部および下部）×３枚である。a*における、負の値は緑色の強さを、正の値は赤／マゼンタの強さを表す。b*における、負の値は青色の強度を、正の値は黄色の強度を表す。L*における値は明度（の高さ）を表す。
　表８に示すように、三重変異体では、二重変異体より強い黄化（オレンジ～黄の呈色）が認められた。二重変異体のなかでは、ＣＣＤ４－ＳおよびＣＣＤ４－Ｔ１遺伝子に変異を有している系統（CCD4-st1）に最も強い黄化が認められた。それ以外の系統（CCD4-st2およびCCD4-t1t2）では、やや弱い黄化（対象であるつくば1号より強い）が認められた。これらの結果は、上述した目視による観察と一致していた。
　（６ｂ）乾葉の色彩分析
　（６ａ）で使用した各系統の移植用苗をハウス温室内で生育させた。圃場への移植、生育および収穫までの管理には、一般的な葉たばこの栽培条件を採用した。心止めから16日目に１株あたり５枚ずつ収穫した合葉に、熱風乾燥機を用いて通常の黄色乾燥処理を施した。目視による観察では、実施例５における生葉の観察と同様の傾向が、乾葉にも認められた。
　測定点の位置および数を除いて（６ａ）と同様に、乾葉の色彩分析を実施した。１系統あたりの測定点は２４（１系統につき４枚（４つの試験区から１枚ずつ葉が採取されている）の乾葉を分析に供した）である。色彩分析の結果を表９に示す。表８および９から明らかな通り、生葉および乾葉（二重変異体および三重変異体から得られた）は、黄化について同じ傾向を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　〔７．CCD4二重変異体および三重変異体のカロテノイドおよびアポカロテノイドの定量分析〕
　（７ａ）温室栽培した二重変異体および三重変異体における主要なカロテノイド量
　下記９系統（括弧内に記載の系統を１つずつ）：
st1に変異を有する二重変異体（CCD4-st1-aおよびCCD4-st1-2）
st2に変異を有する二重変異体（CCD4-st2-aおよびCCD4-st2-c）
t1t2に変異を有する二重変異体（CCD4-t1t2-aおよびCCD4-t1t2-c）
三重変異体（CCD4-tm-aおよびCCD4-tm-c）、および
コントロール（つくば1号）
を２３～２５℃下の温室で栽培した。心止めから8～10日目に収穫した４～５枚の下位葉を、液体窒素で凍結させ、-80℃で保管した。さらに処理（凍結乾燥および粉砕）した下位葉を、主要カロテノイド分析に供した。分析を一般財団法人日本食品センターに依頼した。分析結果を図４に示す。図４におけるバーは、下部に示されている成分の含有量の平均値（３個体分）を表している。CCD4-tm-aのバーは１個体の含有量、CCD4-st2-cのバーは２個体分の含有量の平均値を表している。
　図４に示す通り、二重変異体および三重変異体は、つくば１号より高いカロテノイド含有量を示した。カロテノイド含有量の上昇の程度は、遺伝型（ＣＣＤ４－Ｓ、－Ｔ１およびＴ２遺伝子における変異の有無）にしたがって異なっていた。遺伝型にしたがう程度の違いの傾向は、各成分（総カロテノイド、ルテイン、ゼアキサンチンおよびβ－カロテン）に関して同様であった。一例として、ルテインの含有量は、CCD4-tm（3.4～4.0倍）、CCD4-st1（2.1～2.8倍）、CCD4-st2（1.6～1.8倍）、CCD4-t1t2（1.2～1.7倍）の順に高かった。括弧内の倍率は、つくば１号の成分含有量を１としたときの倍率である。
　（７ｂ）圃場栽培した二重変異体および三重変異体の乾葉におけるカロテノイド量
　（７ａ）と同じ９系統をハウス温室内で生育させた。圃場への移植、生育および収穫までの管理には、一般的な葉たばこの栽培条件を採用した。心止めから16日目に１株あたり５枚ずつ収穫した合葉着位に、熱風乾燥機を用いて通常の黄色乾燥処理を施した。得られた乾葉の中骨を除去した残りのラミナ部分を、粉砕処理し、半定量分析の試料として用いた。カロテノイドの半定量分析を、（３ｃ）に記載にしたがって実施した。結果を図５に示す。図５におけるバーは、下部に示されている成分の含有量の平均値（３個体分）を表している。
　図５に示す通り、半定量分析の結果は、図４の結果と整合していた。一例として、ルテインの含有量は、CCD4-tm（5.5～5.7倍）、CCD4-st1（3.1～3.8倍）、CCD4-st2（2.2～2.4倍）、CCD4-t1t2（2.0倍）の順に高かった。括弧内の倍率は、つくば１号の成分含有量を１としたときの倍率である。
　（７ｃ）圃場栽培した二重変異体および三重変異体の乾葉におけるアポカロテノイド量　乾葉試料における１７種のアポカロテノイドを、半定量分析した。乾葉試料の調製方法は（７ｂ）に、分析は（３ｃ）にしたがう。半定量分析の結果を表１０に示す。表１０に示されている数値は、１系統（３個体）についての平均値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表１０に示す通り、三重変異体は、アポカロテノイド量に、つくば１号を基準にして最も顕著な変化を生じた。β－イオノンおよびジヒドロアクチニジオリドは、実施例３と同様に変異体に共通して増加を示した。詳細には、β－イオノンの量（括弧内の倍率はつくば１号を１とする）は、CCD4-tmで3.5～3.6倍、CCD4-st1で2.3～2.9倍、CCD4-st2で1.2倍、CCD4-t1t2で1.2～1.9倍であった。ジヒドロアクチニジオリドの量は、CCD4-tmで4.8～5.4倍、CCD4-st1で2.5～2.7倍、CCD4-st2で1.4～1.6倍、CCD4-t1t2で1.4～1.9倍であった。一方で、三重変異体の乾葉において、多くのアポカロテノイドは、つくば１号と比べて、約1/3～1/10に減少していた。
　本発明は、タバコ製品の品質向上に利用できる。

Claims (25)

  1. 　配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
    　配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
    　配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されている、タバコ属植物体。
  2. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在量の減少である、請求項１に記載のタバコ属植物体。
  3. 　上記機能抑制は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進である、請求項１または２に記載のタバコ属植物体。
  4. 　上記変異は、上記内在性遺伝子に導入されている、請求項１～３のいずれか１項に記載のタバコ属植物体。
  5. 　上記変異は、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されている、請求項４に記載のタバコ属植物体。
  6. 　上記変異は、上記変異原処理によって導入されている、請求項５に記載のタバコ属植物体。
  7. 　上記変異は、上記ｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記内在性遺伝子の存在する領域外への挿入である、請求項３に記載のタバコ属植物体。
  8. 　上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、請求項７に記載のタバコ属植物体。
  9. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、本来の機能的な上記ポリペプチドの存在量の減少である、請求項１～８のいずれか１項に記載のタバコ属植物体。
  10. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、本来の機能的な上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、請求項９に記載のタバコ属植物体。
  11. 　ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・ルスチカまたはニコチアナ・シルベストリスに属する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のタバコ属植物体。
  12. 　タバコ植物体の製造方法であって、
    　配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
    　配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
    　配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異を、タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含している、タバコ植物体の製造方法。
  13. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在量の減少である、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 　上記機能抑制は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進である、請求項１２または１３に記載の製造方法。
  15. 　上記導入するステップが、上記内在性遺伝子に上記変異を導入することを含んでいる、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
  16. 　上記導入するステップが、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施される、請求項１５に記載の製造方法。
  17. 　上記変異は、上記変異原処理によって導入されている、請求項１６に記載の製造方法。
  18. 　上記導入するステップが、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドを、当該内在性遺伝子の存在する領域外に挿入することを含んでいる、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の製造方法。
  19. 　上記因子が、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、請求項１８に記載の製造方法。
  20. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、本来の機能的な上記ポリペプチドの存在量の減少である、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の製造方法。
  21. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、本来の機能的な上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、請求項２０に記載の製造方法。
  22. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載のタバコ属植物体、または請求項１２～２１のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたタバコ属植物体の、子孫または当該タバコ属植物体の交配によって得られた育種後代。
  23. 　配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
    　配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
    　配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されており、
    　野生型のタバコ属植物体の葉たばこより高い総カロテノイド含有量を有している、タバコ属植物体の葉たばこ。
  24. 　配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
    　配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
    　配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する８０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくともいずれかの機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されており、
    　野生型のタバコ属植物体の乾燥葉より高い総カロテノイド含有量を有している、タバコ属植物体の乾燥葉。
  25. 　請求項２４に記載の乾燥葉を含んでいる、たばこ製品。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115426874A (zh) * 2020-04-21 2022-12-02 日本烟草产业株式会社 烟草植物体及其制备方法
JPWO2023127723A1 (ja) * 2021-12-27 2023-07-06
JPWO2023162949A1 (ja) * 2022-02-22 2023-08-31
US20240125743A1 (en) * 2023-04-18 2024-04-18 Yunnan Academy Of Tobacco Agricultural Sciences METHOD FOR DETERMINING TOBACCO-SPECIFIC NITROSAMINES (TSNAs) IN CIGARETTE SMOKE USING ONE-STEP CLEAN-UP COUPLED WITH LIQUID CHROMATOGRAPHY-TANDEM MASS SPECTROMETRY (LC-MS/MS)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140289901A1 (en) 2011-10-31 2014-09-25 Philip Morris Products S.A. Modulating beta-damascenone in plants
CN104152475A (zh) * 2014-08-18 2014-11-19 中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草ε-番茄红素环化酶基因及其应用
CN107502614A (zh) * 2017-03-22 2017-12-22 中国医学科学院药用植物研究所 一种参与栀子西红花苷合成的类胡萝卜素裂解双加氧酶编码基因的筛选及功能验证
KR20200057244A (ko) * 2018-11-16 2020-05-26 경희대학교 산학협력단 카로티노이드 함량이 증진된 기능성 식물체 및 이의 제조 방법

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8252977B2 (en) * 2005-09-02 2012-08-28 Nestec S. A. Polynucleotides encoding carotenoid and apocartenoid biosynthetic pathway enzymes in coffee
CN103205405B (zh) * 2013-04-11 2014-06-11 中国农业大学 蛋白IbGGPS及编码基因与在调控植物类胡萝卜素含量中的应用
CN104152473B (zh) * 2014-08-18 2019-07-12 中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草类胡萝卜素异构酶基因及其应用
CN105154411A (zh) * 2015-07-31 2015-12-16 郑州轻工业学院 微生物双加氧酶粗酶液及β-紫罗兰酮的制备方法
CN105368850A (zh) * 2015-11-25 2016-03-02 天津大学 产生β-紫罗酮香气物质的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及应用
CN116058286A (zh) * 2016-03-30 2023-05-05 日本烟草产业株式会社 烟草植物体及其制备方法
CN117143951A (zh) * 2017-02-24 2023-12-01 新加坡科技研究局 类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素的生产
EP4136964A4 (en) * 2020-04-17 2024-05-22 Japan Tobacco Inc. PLANT BODY OF THE GENRE NICOTIANA WITH LOW ALKALOID CONTENT AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME
WO2021215465A1 (ja) * 2020-04-21 2021-10-28 日本たばこ産業株式会社 タバコ植物体とその製造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140289901A1 (en) 2011-10-31 2014-09-25 Philip Morris Products S.A. Modulating beta-damascenone in plants
JP2015505666A (ja) * 2011-10-31 2015-02-26 フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム 植物におけるβ−ダマセノンの調節
CN104152475A (zh) * 2014-08-18 2014-11-19 中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草ε-番茄红素环化酶基因及其应用
CN107502614A (zh) * 2017-03-22 2017-12-22 中国医学科学院药用植物研究所 一种参与栀子西红花苷合成的类胡萝卜素裂解双加氧酶编码基因的筛选及功能验证
KR20200057244A (ko) * 2018-11-16 2020-05-26 경희대학교 산학협력단 카로티노이드 함량이 증진된 기능성 식물체 및 이의 제조 방법

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROGNAWEN, NAT. STRUCTURAL MOL. BIOL., vol. 16, 2009, pages 107 - 113
CAMPBELL ET AL., PLANT PHYSIOLOGY, vol. 154, 2010, pages 656 - 664
DATABASE Nucleotide 27 June 2011 (2011-06-27), GAO, J. P . ET AL., XP055868228, retrieved from ncbi Database accession no. JF947192.1 *
SAIKI, R. K. ET AL., SCIENCE, vol. 230, 1985, pages 1350 - 1354
SAIKI, R. K. ET AL., SCIENCE, vol. 239, 1988, pages 487 - 491
SAMBROOK, J. ET AL.: "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
SOUTHERN, E. M., JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 98, no. 503, pages 1975
WATANABE K. ET AL.: "Alteration of flower colour in Ipomoea nil through CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of carotenoid cleavage dioxygenase 4", TRANSGENIC RES, vol. 27, 2018, pages 25 - 38, XP036439449, DOI: 10.1007/s11248-017-0051-0 *
WESLEY ET AL., PLANT J., vol. 27, 2001, pages 581 - 590
ZHOU ET AL.: "Carotenoid Cleavage Dioxygenases: Identification, Expression, and Evolutionary Analysis of This Gene Family in Tobacco", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, vol. 20, no. 22, 2019
ZHOU QINQIAN, QINGCHANG LI 2 , PENG LI 1 , SONGTAO ZHANG 1 , CHE LIU 1 , JINGJING JIN 2 , PEIJIAN CAO 2 AND YONGXIA YANG: "Carotenoid cleavage dioxygenases: identification, expression, and evolutionary analysis of this gene family in tobacco", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, 1 January 2019 (2019-01-01), XP055868230, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6888377/pdf/ijms-20-05796.pdf> [retrieved on 20211201] *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115426874A (zh) * 2020-04-21 2022-12-02 日本烟草产业株式会社 烟草植物体及其制备方法
JPWO2023127723A1 (ja) * 2021-12-27 2023-07-06
JP7756726B2 (ja) 2021-12-27 2025-10-20 日本たばこ産業株式会社 タバコ植物
JPWO2023162949A1 (ja) * 2022-02-22 2023-08-31
US20240125743A1 (en) * 2023-04-18 2024-04-18 Yunnan Academy Of Tobacco Agricultural Sciences METHOD FOR DETERMINING TOBACCO-SPECIFIC NITROSAMINES (TSNAs) IN CIGARETTE SMOKE USING ONE-STEP CLEAN-UP COUPLED WITH LIQUID CHROMATOGRAPHY-TANDEM MASS SPECTROMETRY (LC-MS/MS)

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