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WO2026004868A1 - タバコ属植物体由来のたばこ材料、たばこ製品、タバコ属植物体、およびたばこ製品に冷涼感を付与する方法 - Google Patents

タバコ属植物体由来のたばこ材料、たばこ製品、タバコ属植物体、およびたばこ製品に冷涼感を付与する方法

Info

Publication number
WO2026004868A1
WO2026004868A1 PCT/JP2025/022751 JP2025022751W WO2026004868A1 WO 2026004868 A1 WO2026004868 A1 WO 2026004868A1 JP 2025022751 W JP2025022751 W JP 2025022751W WO 2026004868 A1 WO2026004868 A1 WO 2026004868A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nicotiana
tobacco
gene
amino acid
endogenous gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/022751
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
貴規 竹内
洋 真籠
一平 下村
久史 宇田川
田中　正起
誠人 吉崎
翔 加藤
俊造 小林
清 大山
宗史朗 宮田
萌子 佐藤
正 朱
由光 高倉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Tobacco Inc
Original Assignee
Japan Tobacco Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Tobacco Inc filed Critical Japan Tobacco Inc
Publication of WO2026004868A1 publication Critical patent/WO2026004868A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Definitions

  • tobacco products have been designed to provide a desired taste or aroma (hereinafter sometimes referred to as "smoking flavor”) by adding flavorings and other ingredients to tobacco materials derived from Nicotiana plants.
  • desired taste or aroma hereinafter sometimes referred to as "smoking flavor”
  • Jasmonic acid is a plant hormone that contributes to defense responses against insect pests or diseases.
  • JA-Ile jasmonate-isoleucine
  • JA and JA-Ile are reversibly converted.
  • JA and JA-Ile are converted to the inactive forms 12-hydroxy-jasmonic acid (12-OH-JA) and 12-hydroxy-jasmonate-isoleucine (12-OH-JA-Ile) by the metabolic enzymes JOX (JAO) and CYP94B1/B3, respectively. It has been reported that suppressing the function of the JOX gene or CYP94B gene increases the accumulation of JAs in Arabidopsis (Non-Patent Documents 1-3) and wild tobacco (Non-Patent Document 4).
  • a tobacco material derived from a Nicotiana plant comprising: (a) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; (b) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide that encodes a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6; and (c) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide that encodes a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:9.
  • a tobacco material is provided in which a mutation that specifically causes functional inhibition has been introduced into the endogenous gene in the genome, and the tobacco material has cold receptor TRPM8 activity.
  • a tobacco material according to the above aspect which contains a TRPM8 agonist.
  • a tobacco material according to any of the above aspects, wherein the cold receptor TRPM8 activity of the tobacco material is at least twice as high as the cold receptor TRPM8 activity of tobacco material derived from a wild-type Nicotiana plant.
  • a tobacco material according to any of the above aspects, which is a dry material.
  • a tobacco material according to any of the above aspects, which is a powder of dry material.
  • an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
  • an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6; and
  • an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • the present invention provides a Nicotiana plant in which a mutation that specifically causes functional inhibition has been introduced into the endogenous gene in the genome.
  • a Nicotiana plant according to the above aspect, wherein the Nicotiana plant is any one of Nicotiana tabacum, Nicotiana sylvestris, and Nicotiana rustica.
  • the present invention provides a Nicotiana plant according to any of the above aspects, in which a mutation that specifically causes the functional suppression has been introduced by mutagen treatment, genome editing, or gene knockout.
  • Nicotiana plant according to any of the above aspects, in which the mutation that specifically causes the functional suppression specifically causes an enhanced response to jasmonic acid.
  • the tobacco product comprises tobacco material derived from a Nicotiana plant
  • the Nicotiana plant is (a) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; (b) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6; and (c) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, wherein a mutation that specifically causes functional inhibition has been introduced into the endogenous gene in the genome;
  • the tobacco material is substantially free of cooling flavor
  • FIG. 10 is a diagram showing the measurement results of Evaluation Example 1-1.
  • FIG. 1 shows the results of ⁇ -CBT analysis in the first year of the field test in Evaluation Example 1-3.
  • FIG. 1 shows the results of ⁇ -CBT analysis in the second year of the field test in Evaluation Example 1-3.
  • FIG. 1 shows the results of the first assay of components in cigarette smoke in Evaluation Example 1-5.
  • FIG. 1 shows the results of the second assay of components in cigarette smoke in Evaluation Example 1-5.
  • FIG. 1 shows the results of the first assay of components contained in JOX mutant leaves in Evaluation Example 1-5.
  • FIG. 1 shows the results of the second assay of components in JOX mutant leaves in Evaluation Example 1-5.
  • FIG. 1 shows the results of the second assay of components in JOX mutant leaves in Evaluation Example 1-5.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of ⁇ -CBT analysis when immature leaves were air-dried in Evaluation Example 2-1. This is a diagram showing the results of ⁇ -CBT analysis when ripe leaves were dried to a yellow color in Evaluation Example 2-1.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of solavetivone analysis when immature leaves were air-dried in Evaluation Example 2-1. This is a diagram showing the results of solavetivone analysis when ripe leaves were dried to a yellow color in Evaluation Example 2-1.
  • a to B means greater than or equal to A and less than or equal to B, unless otherwise specified.
  • a tobacco material according to one embodiment of the present invention is derived from a Nicotiana plant into which a mutation that causes functional suppression of the endogenous JOX gene has been introduced.
  • Examples of the plant part include leaves, midribs separated from leaves, stem remains, and flowers.
  • the tobacco material according to one embodiment of the present invention has cold receptor TRPM8 activity.
  • JOX gene The JOX (jasmonate-induced oxygenase) gene is a gene encoding JOX.
  • the JOX gene is also known as the JAO (jasmonic acid oxidase) gene.
  • JAO jasmonic acid oxidase
  • JOX gene encompasses both the JOX gene and the JAO gene.
  • JOX is an enzyme involved in the metabolism of jasmonic acid (JA).
  • the Nicotiana plant is (a) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; (b) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6; and (c) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, a mutation that specifically causes functional inhibition has been introduced into the endogenous gene in the genome.
  • CDS coding sequence
  • JOX genes include the JOX-S1 gene, the JOX-S2 gene, and the JOX-T2 gene.
  • SEQ ID NO: 1 is the genomic sequence of the JOX-S1 gene (sometimes referred to as "NtJOX-S1") encoded by the S genome of Nicotiana tabacum.
  • SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence of the CDS of the JOX-S1 gene.
  • SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the JOX-S1 protein.
  • SEQ ID NO: 4 is the genomic sequence of the JOX-S2 gene (sometimes referred to as "NtJOX-S2”) encoded by the S genome of Nicotiana tabacum.
  • Nicotiana tabacum is an amphidiploid and has a genome derived from its parent plant, Nicotiana sylvestris (also referred to as the "S genome”) and a genome derived from Nicotiana tomentosiformis (also referred to as the "T genome”).
  • Nicotiana plant When the Nicotiana plant is Nicotiana tabacum, it has cold receptor TRPM8 activity by specifically suppressing the function of at least one JOX gene (i.e., at least one of the JOX-S1 gene, JOX-S2 gene, or JOX-T2 gene) present in either the S genome or the T genome.
  • a tobacco material according to one embodiment of the present invention may be tobacco material derived from a Nicotiana plant in which the functions of the JOX-S1 gene and the JOX-S2 gene, the JOX-S1 gene and the JOX-T2 gene, or the JOX-S2 gene and the JOX-T2 gene are specifically suppressed. Furthermore, a tobacco material according to one embodiment of the present invention may be tobacco material derived from a Nicotiana plant in which the functions of the JOX-S1 gene, the JOX-S2 gene, and the JOX-T2 gene are specifically suppressed.
  • TRPM8 Transient receptor potential cation channel melastatin 8
  • TRPM8 is a receptor closely related to the sensation of cold.
  • TRPM8 is a type of TRP channel and has been confirmed to be expressed on human sensory neurons.
  • Known methods for activating TRPM8 include applying a temperature stimulus below 28°C or administering cooling substances (e.g., Menthol, WS-5, and WS-3).
  • Activation of TRPM8 induces the influx of cations into cells. This induction depolarizes neurons, transmitting the cold sensation signal.
  • a tobacco material according to one embodiment of the present invention has TRPM8 activity. Furthermore, the smoke from combustion of the tobacco material according to one embodiment of the present invention also has TRPM8 activity, and tobacco products containing the tobacco material can provide a cooling sensation to the user.
  • the tobacco material according to one embodiment of the present invention may also contain a TRPM8 agonist. Examples of such TRPM8 agonists include substances newly produced by functional suppression of an endogenous JOX gene, or substances whose expression or activation, or accumulation, is increased compared to that of a wild-type Nicotiana plant due to functional suppression of an endogenous JOX gene.
  • Whether or not a tobacco material has TRPM8 activity can be evaluated, for example, by the following procedure.
  • the tobacco material is pulverized, and a solvent (e.g., hexane, ethanol, ethyl acetate, acetonitrile, etc.) is added to the resulting pulverized sample, followed by shaking and centrifuging to obtain a supernatant containing the components of the tobacco material; The supernatant is evaporated to dryness; DMSO is added to the dried product to dissolve it, and then the solution is diluted with HBSS solution to obtain a composition for measurement; contacting the measuring composition with TRPM8-expressing cells (e.g., HEK293T cells transformed to express TRPM8), and measuring the fluorescence intensity by fluorescent calcium imaging; The maximum fluorescence intensity obtained after contacting the composition for measurement is taken as the activity of the TRPM8-expressing cells induced by the tobacco material; The maximum fluorescence intensity is compared with the control maximum fluorescence intensity obtained when the measurement composition is contacted with cells that do not express TRPM8 (e.g., hexane,
  • a cigarette containing a tobacco material is burned under ISO 3308:2012 conditions, and mainstream smoke produced by burning the cigarette is collected using a glass fiber filter;
  • the components in the mainstream smoke captured by the glass fiber filter are extracted with a solvent (e.g., ethanol, methanol, ethyl acetate) by shaking, and then filtered through a PVDF (polyvinylidene fluoride) filter to obtain an extract;
  • the filtered extract is diluted with HBSS solution to obtain a composition for measurement;
  • TRPM8-expressing cells e.g., HEK293T cells transformed to express TRPM8
  • the maximum fluorescence intensity obtained after contacting the composition for measurement is taken as the activity of the TRPM8-expressing cells induced by the tobacco material;
  • the maximum fluorescence intensity is compared with the control maximum fluorescence intensity obtained when the measurement composition is contacted with cells that do not express TRPM8 (
  • the tobacco material preferably has TRPM8 activity that is at least twice as high as the cold receptor TRPM8 activity of tobacco material derived from a wild-type Nicotiana plant, more preferably at least five times as high as the cold receptor TRPM8 activity of tobacco material derived from a wild-type Nicotiana plant, and even more preferably at least ten times as high as the cold receptor TRPM8 activity of tobacco material derived from a wild-type Nicotiana plant.
  • a tobacco material according to one embodiment of the present invention is leaf tobacco harvested from the above-mentioned Nicotiana plant. More preferably, a tobacco material according to one embodiment of the present invention is dried leaf tobacco harvested from the above-mentioned Nicotiana plant.
  • leaf tobacco is synonymous with “leaf” and refers to "fresh leaf” that has not undergone the drying process described below.
  • a tobacco material according to one embodiment of the present invention may be obtained by processing dried leaf using any method. Examples of such processing methods include drying, aging, extraction, harmonizing, flavoring, high-temperature and high-pressure treatment, distillation, crushing, and shredding the dried leaf.
  • the obtained tobacco material may be in any form, such as cut filler, powder, sheet, granules, and extract. These forms of tobacco material are preferred from the perspective of applying the dried material to tobacco products.
  • Cured leaves are obtained by drying tobacco leaves. Any drying method can be used, including but not limited to yellow drying, air drying, warm air drying, and hot air drying.
  • a method for producing dried leaves according to one embodiment of the present invention may include a drying step of drying tobacco leaves harvested from the Nicotiana plant. Yellow drying or air drying is preferred for this drying step, with air drying being more preferred, as this further enhances the cool feeling imparted to the tobacco material.
  • yellow drying is a heat-based drying method used for flue-cured tobacco, which results in a yellow color for the tobacco leaves.
  • Air drying is a drying method that utilizes natural temperature, humidity, and ventilation conditions.
  • the tobacco leaves used in the drying process be unripe or ripe, with unripe tobacco being more preferable.
  • immature leaf tobacco refers to leaf tobacco harvested several days after stemming.
  • ripe leaf tobacco refers to leaf tobacco harvested at the optimum ripeness period.
  • the method for producing tobacco material according to one embodiment of the present invention includes a drying step in which immature tobacco leaves harvested from the Nicotiana plant are air-dried.
  • a tobacco product according to one embodiment of the present invention includes the tobacco material described above.
  • the tobacco product may be in any form, including cut tobacco products, cigars, pipe tobacco products, cigarettes (cigarettes), electronic cigarettes, smokeless tobacco products (including snus and snuff), and waterpipe tobacco products.
  • the tobacco product may be any of electronic cigarettes, cigarettes, and smokeless tobacco products.
  • Examples of electronic cigarette products include non-combustion high-temperature heated tobacco products that use aerosol generated by heating a tobacco portion containing tobacco material as an aerosol source; non-combustion low-temperature heated tobacco products that have an atomization portion separate from the tobacco portion that atomizes the aerosol source, and inhale the tobacco flavor entrained by the aerosol generated by heating the atomization portion as it passes through the tobacco portion; and unheated tobacco products that inhale the flavor without heating the tobacco portion.
  • the tobacco product is preferably a cigarette or an electronic cigarette, as these products provide a more perceptible cooling sensation.
  • a Nicotiana plant according to one embodiment of the present invention is a Nicotiana plant into which a mutation that causes functional suppression of the JOX gene has been introduced.
  • an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3;
  • an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6;
  • a mutation that specifically causes functional inhibition has been introduced into at least one endogenous gene in the genome, the endogenous gene containing, as its coding region, a polynucleotide that encodes a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • mutant has the meaning commonly understood in the technical field to which the present application belongs, and refers to, for example, any change (e.g., substitution, deletion, insertion, addition, duplication, inversion, or translocation) in a base on a wild-type genome or an amino acid residue in a wild-type polypeptide.
  • mutantation of an endogenous gene refers to a mutation of a gene that prevents the production of an original functional polypeptide (including a mutation that produces a polypeptide with reduced function or no function), a mutation of a gene that produces a polypeptide but reduces the amount produced, a mutation of a gene that produces a polypeptide but reduces the stability of the polypeptide, loss of a gene (a genomic DNA sequence including a coding region or an untranslated region), or a mutation that suppresses transcription from a gene (such as deletion of a transcriptional regulatory region or a transcription initiation region).
  • the mutation may be present in at least one of the promoter sequence (including a sequence located upstream (5') from the coding region), the terminator sequence (including a sequence located downstream (3') from the coding region), the 5' untranslated region and the 3' untranslated region, the conserved sequences at both ends of an intron (e.g., GT at the 5' end and AG at the 3' end), and the coding region.
  • the mutation may be present in the coding region of the endogenous JOX gene.
  • the mutation may be any one of substitution, deletion, insertion, addition, duplication, inversion, and translocation.
  • the function of an endogenous gene may be suppressed if the coding region contains an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of a JOX polypeptide, and if the coding region contains a polynucleotide encoding a polypeptide having the activity of catalyzing the hydroxylation of jasmonic acid.
  • the number of amino acids deleted, substituted, or added in each amino acid sequence is, for example, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, or 1.
  • a Nicotiana plant may have a mutation introduced outside the coding region of the endogenous JOX gene that causes functional suppression of the endogenous JOX gene.
  • the mutation may be the insertion of a polynucleotide that expresses an antisense RNA molecule, an RNAi molecule, or a co-suppression molecule that promotes degradation of mRNA transcribed from the endogenous JOX gene.
  • the substitution may occur in at least one of the promoter sequence, terminator sequence, 5' untranslated region and 3' untranslated region, conserved sequences at both ends of an intron, and the coding region.
  • substitutions in nucleotide sequences important for regulating gene expression, located in the promoter sequence, 5' untranslated region, and 3' untranslated region of a gene result in a decrease in the transcriptional activity of the gene or a decrease in the stability of the transcript from the gene. Both of these decreases can result in a decrease in the translation product, along with a decrease in the transcript from the gene.
  • Substitutions in the above-mentioned conserved sequences of introns splice mutations
  • cause abnormal splicing of mRNA resulting in abnormal mRNA in which unnecessary introns have been added or inserted.
  • Abnormal mRNAs can produce abnormal translation products, for example, due to frameshifts, or translation does not terminate.
  • nucleotide substitution in the coding region is a missense mutation (resulting in a reduced abundance of the wild-type polypeptide)
  • substitution will result in an amino acid that is different from the original amino acid, which may result in a polypeptide with reduced or no original function.
  • substitutions in the coding region can result in incomplete translation products or translation products that do not maintain their original function.
  • Incomplete translation products arise due to the conversion of a codon encoding an amino acid to a stop codon (nonsense mutation).
  • Incomplete translation products lack one or more consecutive amino acid residues, including the C-terminal amino acid residue, compared to the original translation product.
  • the nonsense mutation occurs in any codon upstream of the original stop codon, preferably one or more codons upstream from the original stop codon. Therefore, translation products from genes containing nonsense mutations are incomplete. Translation products that lack their original function are generated by amino acid substitutions.
  • the amount of transcript may be equivalent to that of a wild-type Nicotiana plant (hereinafter sometimes abbreviated as "wild-type plant”).
  • the translation product exhibits a change in three-dimensional structure or a reduction in its function as a functional domain.
  • One preferred embodiment of the mutation of the present invention is an amino acid substitution that results in a translation product that lacks its original function.
  • the amino acid substitutions are preferably non-conservative substitutions, which have a high potential for altering the function of the translation product.
  • Non-conservative substitutions include substitutions for amino acids with different charge or hydrophobicity (e.g., substitutions of a basic amino acid with an acidic amino acid, a basic or acidic amino acid with a neutral amino acid, a neutral amino acid with a basic or acidic amino acid, or a polar amino acid with a non-polar amino acid), as well as substitutions for amino acids with side chains with different bulk (steric size).
  • nonsense-mediated mRNA decay (Brogna and Wen (2009) Nat. Structural Mol. Biol. 16: 107-113) can occur. Because nonsense-mediated mRNA decay causes the degradation of transcripts, nonsense mutations can result in a decrease in the amount of transcripts.
  • the JOX gene contains at least one exon containing a nonsense mutation.
  • a preferred embodiment of a nonsense mutation that causes nonsense-mediated mRNA decay is that at least one nonsense mutation is present in the first or second exon of the JOX gene.
  • Mutations other than substitutions (such as deletions and insertions) occurring within the promoter sequence, 5' untranslated region, and/or 3' untranslated region can result in a reduction in the amount of transcript and polypeptide due to a decrease in transcriptional activity or stability, similar to substitutions. Mutations other than substitutions into conserved intron sequences can also result in the translation of polypeptides with amino acid sequences that differ from the original, similar to substitutions. Mutations other than substitutions into coding regions can also result in the translation of polypeptides with amino acid sequences that differ from the original due to the deletion or insertion of amino acid residues (caused by the deletion or insertion of a multiple of three consecutive bases) or a frameshift. Furthermore, large deletions that include the entire gene or the insertion of a large fragment into the gene can result in the loss of expression of the gene itself.
  • the mutation that specifically causes the above-mentioned functional suppression may be one that has been introduced by mutagen treatment, genome editing, or gene knockout.
  • the mutation may be one that has been introduced by mutagen treatment.
  • the mutation that specifically causes the functional suppression specifically causes an enhanced response to jasmonic acid.
  • Mutagen treatment of the above gene can be carried out by artificially applying the mutagen to a Nicotiana plant (and, if necessary, in combination with suppression of gene repair function).
  • Mutagens can be chemical agents such as ethylmethanesulfonate (EMS), sodium azide, ethidium bromide, and nitrous acid, but are not limited to these as long as they cause mutations in the genomic DNA of Nicotiana plants.
  • Mutagens can also be gamma rays, heavy ion beams, X-rays, neutron rays, or UV rays, but are not limited to these as long as they are radiation that causes mutations in the genomic DNA of Nicotiana plants.
  • EMS is preferred as a mutagen.
  • Recombination of the above gene can be carried out by homologously recombining part or all of the target gene with a recombinant sequence according to known genetic engineering techniques.
  • Genome editing of the above genes can be performed using known techniques (e.g., zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the CRISPR/Cas9 system).
  • ZFNs zinc-finger nucleases
  • TALENs transcription activator-like effector nucleases
  • Gene knockout can be performed by inserting known transposons (mobile genetic elements) or T-DNA.
  • Nucleotide substitutions in the JOX gene by EMS treatment can result in, for example, (I) frameshift mutations, (II) truncation mutations (in which the N-terminal amino acid residue is essentially deleted), (III) splice mutations, or (IV) nonsense mutations. This is because EMS treatment tends to introduce specific nucleotide changes (C ⁇ T substitutions and G ⁇ A substitutions) into DNA.
  • Genome editing is possible when the guide RNA and Cas9 protein are present in the CRISPR/Cas9 system, or when the fusion protein (fused with a DNA-binding domain and a nuclease) is present in the TALEN and ZFN systems, within the target cells. Therefore, the guide RNA, Cas9 protein, and fusion protein can all be directly introduced into target cells. Methods for directly introducing these into target cells include the PEG method, electroporation, and particle bombardment. Alternatively, a vector containing an inserted construct (containing a polynucleotide encoding the guide RNA and Cas9 protein, as well as an optional promoter and/or terminator) can be introduced into target cells or tissues via Agrobacterium or other vectors.
  • the complementary nucleotide sequence immediately upstream of the XGG on the genome forms base pairs with part of the guide RNA, and the double-stranded genomic DNA is cut by Cas9 within that nucleotide sequence.
  • each of the pair of DNA-binding domains of the dimer-forming artificial nuclease binds to a nucleotide sequence present on either end of the FokI cleavage domain, via a spacer of 5 to 20 bases.
  • the nucleotide sequences are present on one strand and the other strand of double-stranded genomic DNA, and therefore one of the pair of DNA-binding domains binds to one strand, and the other binds to the other strand.
  • the DNA-binding domain is composed of a repeating unit (module) of 33 to 34 amino acid residues, with the number of modules corresponding to the number of bases to be bound.
  • a pair of DNA-binding domains of an artificial nuclease that forms a dimer binds to nucleotide sequences present on both ends of the FokI cleavage domain via a 5-20 base spacer.
  • the DNA-binding domain is composed of multiple zinc finger modules.
  • the mutations introduced into Nicotiana plants according to one embodiment of the present invention have been described as artificially induced mutations, but are not limited to this.
  • mutations or disruptions in the JOX gene may occur through spontaneous mutation.
  • Spontaneous mutations in genes generally occur due to replication errors and genetic damage. Such damage can be caused by exposure to known naturally occurring mutagens (e.g., radiation or ultraviolet light).
  • Gene mutations or disruption can be determined by detecting the presence or absence of mutations in the gene.
  • Methods for detecting gene mutations include: (1) a method in which the DNA sequence containing the mutation is amplified by PCR or other methods, and then the DNA base sequence is directly decoded using a commercially available sequencer; (2) a method in which sequence differences are detected by differences in electrophoretic distance using the SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) method; (3) a method in which SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) are detected using the Cycle PCR method; (4) a method in which the presence or absence of mutations is detected by cleaving mismatch sites using T7 Endonuclease I or other methods; and (5) a method in which the presence or absence of mutations can be determined by the presence or absence of cleavage by restriction enzyme treatment using CAPS (Cleaved Amplification Sequence Sequences).
  • the derived CAPS (dCAPS) method which uses a primer set intentionally containing mismatches to determine the presence or absence of a mutation based on the presence or absence of restriction enzyme cleavage
  • the dCAPS (derived CAPS) method which uses a primer set intentionally containing mismatches to determine the presence or absence of a mutation based on the presence or absence of restriction enzyme cleavage
  • a method of determining the presence or absence of a mutation by using a probe that specifically hybridizes to the mutant sequence and detecting whether the probe has hybridized PCR using a TaqMan probe
  • (8) a method of performing single-base extension using a primer adjacent to the mutation and detecting the presence or absence of a mutation based on the difference in mass of the incorporated base MassARRAY analysis
  • (9) in the case of deletions or insertions a method of detecting mutations based on differences in electrophoretic mobility.
  • gene mutations or disruption can be determined by comparing the size and expression level of the protein resulting from the gene modification with those of the wild-type protein. Specifically, such comparisons can be made by, for example, Western blotting.
  • Suppression of the expression of the gene includes suppression of transcription from the gene to mRNA, suppression of translation from the gene to a polypeptide via mRNA (e.g., degradation of the mRNA), and suppression of the function of the translated polypeptide.
  • mRNA degradation can result from the nonsense-mediated mRNA decay.
  • Suppression of transcription can be achieved by inhibiting transcription factors that promote transcription from the gene and by preventing access of transcription initiation factors to the gene.
  • Suppression of translation can be achieved using antisense RNA molecules, RNAi molecules, or co-inhibitory molecules.
  • Suppression of polypeptide function can be achieved by molecules that inhibit the function of a functional polypeptide by binding to it (e.g., decoy nucleic acids, ribozymes, antibodies, and inhibitory peptides).
  • the vectors used to transform Nicotiana plants for the purpose of suppressing gene expression or introducing mutations into genes are not particularly limited, as long as they are capable of expressing a polynucleotide inserted into the vector within plant cells.
  • Suitable vectors include, for example, pBI-, pPZP-, and pSMA-based vectors, which can introduce a polynucleotide of interest into plant cells via Agrobacterium.
  • Binary vector-based plasmids (such as pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, and pPZP202) are particularly preferred.
  • RNAi When gene expression is suppressed by RNAi, a trigger sequence used to suppress target gene expression by RNAi is inserted as a mutation into the vector.
  • the trigger sequence is, for example, a polynucleotide (sense RNA portion) represented by a base sequence of at least 21 to 30 consecutive bases (e.g., 21 or more, 22 or more, 23 or more, 24 or more, 25 or more, 26 or more, 27 or more, 28 or more, 29 or more, or 30 or more bases) that is part of a polynucleotide (which may have 0.1 to 1% substitutions) encoding a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2, and also a polynucleotide (antisense RNA portion) represented by a base sequence complementary to the polynucleotide.
  • a polynucleotide sense RNA portion represented by a base sequence of at least 21 to 30 consecutive bases (e.g., 21 or more, 22 or
  • the above-mentioned suppression (of transcription, translation, or polypeptide function) can be achieved, for example, by directly introducing a molecule for achieving the suppression into the plant, or by introducing a nucleic acid molecule encoding the molecule into the plant (transformation of the plant).
  • the nucleic acid molecule is integrated into one or more arbitrary regions in the genome of the plant.
  • Nicotiana tabacum which is an amphidiploid plant of the genus Nicotiana
  • the nucleic acid molecule does not need to be integrated into both the S genome and the T genome as a result of the transformation of the plant.
  • suppressing function refers to suppressing only the function of a target gene without suppressing the function of other genes. For example, it is desirable to avoid simultaneous suppression of the function of multiple genes under the control of the same transcription factor by suppressing the function of the JOX gene, which could lead to metabolic disorders.
  • the functional inhibition in a Nicotiana plant may be a reduction in the abundance of the original functional polypeptide translated from the coding region of the endogenous JOX gene, compared to a wild-type plant.
  • “Decreased abundance” of a polypeptide means that the abundance of the polypeptide is 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 1% or less of the abundance of the wild-type polypeptide.
  • the abundance of the polypeptide relative to the abundance of the wild-type polypeptide can be appropriately selected from the values described above so as to bring about the above-mentioned functional inhibition in Nicotiana plants.
  • a Nicotiana plant according to one embodiment of the present invention is genetically stably inherited in cultured cells, callus, protoplasts, seeds, and progeny obtained from the Nicotiana plant. Therefore, a Nicotiana plant according to one embodiment of the present invention may be an individual developed from cultured cells, callus, protoplasts, seeds, and progeny produced through artificial manipulation, and these materials used to obtain the individual are included within the scope of the present invention.
  • Functional inhibition may be a reduction in translation of the original functional polypeptide as compared to a wild-type plant.
  • Polypeptide translation occurs due to a reduction in mRNA (due to factors such as instability of the mRNA itself, increased mRNA degradation, or reduced mRNA transcription), or a reduction in the amount of translation from mRNA (due to factors such as a lack of translation components (tRNA and ribosomes), inhibition of recruitment, or functional deficiency).
  • the functional inhibition may be a reduction in the amount of mRNA transcribed from the JOX gene compared to a wild-type plant.
  • the reduction in the amount of mRNA transcription occurs, for example, by suppressing transcription from an endogenous gene to mRNA.
  • Transcription inhibition can be achieved by, for example, inhibiting the access of transcription initiation factors to the endogenous gene as a result of introducing a mutation into the endogenous gene.
  • the functional inhibition may be the promotion of the degradation of mRNA transcribed from the endogenous gene.
  • mRNA degradation can be caused by the production of abnormal mRNA (causing nonsense-mediated mRNA decay), the presence of exogenous factors that degrade mRNA, the activation of endogenous components that degrade mRNA, or the presence of a degradation-promoting sequence in the mRNA.
  • Promotion of the degradation of mRNA transcribed from the endogenous gene results in a decrease in the amount of mRNA in the Nicotiana plant.
  • the functional inhibition may be a decrease in the amount of mRNA transcribed from the endogenous gene compared to a wild-type plant.
  • a decrease in the amount of mRNA transcribed from an endogenous gene refers to the presence of 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 1% or less of the transcript of the endogenous gene, based on the amount of the transcript of the endogenous gene in a wild-type plant.
  • Another example is a hybridization solution containing 25% formamide, or, under more stringent conditions, 50% formamide, 4x SSC (sodium chloride/sodium citrate), 50 mM Hepes pH 7.0, 10x Denhardt's solution, and 20 ⁇ g/ml denatured salmon sperm DNA, where prehybridization is performed overnight at 42°C, followed by addition of a labeled probe and incubation at 42°C overnight.
  • 4x SSC sodium chloride/sodium citrate
  • 50 mM Hepes pH 7.0 50 mM Hepes pH 7.0
  • 10x Denhardt's solution 10x Denhardt's solution
  • 20 ⁇ g/ml denatured salmon sperm DNA where prehybridization is performed overnight at 42°C, followed by addition of a labeled probe and incubation at 42°C overnight.
  • Nicotiana rotundifolia Nicotiana rustica ana rustica (Mulberry tobacco), Nicotiana setcherlii, Nicotiana simulans, Nicotiana solanifolia, Nicotiana spegauinii, Nicotiana stocktonii, Nicotiana suaveolens, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana circumflexus
  • suitable Nicotiana plants include Nicotiana thyrsiflora, Nicotiana tomentosa, Nicotiana tomentosiformis, Nicotiana trigonophylla, Nicotiana umbratica, Nicotiana undulata, Nicotiana velutina, Nicotiana wigandioides, and hybrids of Nicotiana plants.
  • Nicotiana tabacum and Nicotiana rustica which are used as raw materials for tobacco leaf production, are particularly preferred. Nicotiana sylvestris can also be preferably used.
  • the Nicotiana plant according to one embodiment of the present invention may particularly belong to Nicotiana tabacum, Nicotiana sylvestris, or Nicotiana rustica.
  • Nicotiana tabacum is an amphidiploid and possesses both a genome derived from its parent plant, Nicotiana sylvestris (also referred to as the "S genome” or “S subgenome”), and a genome derived from Nicotiana tomentosiformis (also referred to as the "T genome” or “T subgenome”).
  • Nicotiana tabacum genes with the same name are almost always present in both the S genome and the T genome.
  • the mutant may have the above mutation in either the S genome or the T genome.
  • the mutation causing a loss of function may be a single mutation or multiple mutations in a single gene, and the type of mutation is not important.
  • any or all of the four alleles, two of which are present in each of the S genome and the T genome may have mutations, and if mutations are present in multiple alleles, these mutations may be the same or different.
  • a Nicotiana plant is preferably an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 62%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and further comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having the activity of catalyzing the hydroxylation of jasmonic acid, wherein a mutation that specifically causes functional suppression has been introduced into the endogenous gene in a genome; and/or an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 62%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity to the amino acid sequence
  • a mutation that specifically causes functional suppression has been introduced into the endogenous gene in a genome that contains, as its coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having the activity of catalyzing the hydroxylation of jasmonic acid.
  • a Nicotiana plant according to one embodiment of the present invention may also encompass breeding progeny obtained by crossing.
  • Mutant breeding has been conducted for many plant species, including rice, wheat, barley, and soybean.
  • mutants isolated from a mutant population treated with a mutagen contain numerous mutations in addition to the target gene. Therefore, backcrossing is generally performed to remove excess mutations.
  • the mutant traits can be introduced into the cultivar, resulting in a cultivar with higher added value.
  • backcrossing requires the selection of individuals with mutations. The fewer mutations that result in the target trait (in this case, cold receptor TRPM8 activity), the fewer mutations need to be considered, reducing the effort required for backcrossing.
  • Efficient backcrossing requires a simple method for detecting the presence or absence of mutations and whether the mutations are homozygous or heterozygous. This method can be performed using the mutation detection method described below.
  • MAS Marker Assisted Selection
  • background markers that show polymorphism between mutants and cultivars
  • SNPs and SSRs Simple Sequence Repeats
  • a method for producing a Nicotiana plant according to one embodiment of the present invention comprises the step of introducing a mutation that specifically causes functional suppression of at least one of the endogenous genes (a) to (c) into the endogenous gene in the genome of the Nicotiana plant. Details of the mutation introduced into Nicotiana plants and the like are described in the section entitled "Nicotiana plants.”
  • the introducing step may include a step of introducing the mutation into the coding region of at least one of the endogenous genes (a) to (c). Furthermore, the introducing step may be carried out by mutagen treatment, genome editing, or gene knockout. In particular, the introducing step may be a mutagen treatment.
  • individuals exhibiting the desired phenotype may be further selected from a mutant population of plants containing mutations.
  • selecting individuals the following describes the procedure for selecting desired individuals from a mutant population (panel) obtained by treatment with a mutagen.
  • Function-defective tobacco mutants with homozygous mutations in genes present in the S genome and T genome can be obtained, for example, by the following method.
  • a method for obtaining function-defective tobacco mutants with homozygous mutations in both one gene on the S genome and one gene on the T genome As described above, tobacco plants are treated with a mutagen to create a panel of tobacco mutants with mutations throughout the entire tobacco genome, and genomic DNA is extracted. Using gene-specific primers for the S genome and the T genome, target genes (polynucleotides) are amplified from the panel's genomic DNA, the nucleotide sequence of the product is determined, and lines with homozygous mutations are selected.
  • lines (M2) with homozygous mutations in both the S genome and the T genome are obtained, and these are crossed to create an F1. Furthermore, the self-bred progeny (F2) are cultivated, and from these, lines with homozygous mutations in both the S and T genomes are obtained (probability of 1/16 due to bifactorial recessiveness).
  • loss-of-function tobacco mutants with homozygous mutations in two genes on the S genome and one gene on the T genome can be obtained, for example, using the following method.
  • a line with homozygous mutations in both the S and T genomes obtained as described above is crossed with a line with a homozygous mutation in the other allele on the S genome to produce an F1.
  • the resulting self-pollinated progeny (F2) are then cultivated, and a line with homozygous mutations in both genes on the S genome and one gene on the T genome is obtained from among them (due to triple-factor recessiveness, the probability of obtaining this is 1 in 64).
  • Individuals exhibiting a desired phenotype may be selected by measuring the activity of the cold receptor TRPM8.
  • the method for producing a Nicotiana plant may further include one or more of the following steps. - Creating a panel of tobacco mutants in which mutations are introduced throughout the tobacco genome; - Extracting genomic DNA from the strains included in the panel; - determining the base sequence of the JOX gene in genomic DNA; - selecting lines carrying homozygous mutations from the panel; and - confirming the cold receptor TRPM8 activity in the lines.
  • the above strain can be crossed with a strain that has not been subjected to the mutation treatment at any time before the step of confirming the activity of the cold receptor TRPM8 is performed. Crossing allows for the elimination of mutations that may exist in genes other than the JOX gene.
  • the above strain carrying a mutation in the JOX gene can be backcrossed multiple times with a strain that has not been subjected to the mutation treatment (the original strain used to create the above panel).
  • Genomic DNA from tobacco mutants can be extracted using known methods, or commercially available extraction kits.
  • the genomic DNA may be crudely purified or may be a purified product that has undergone several purification steps.
  • Polynucleotide amplification can be carried out, for example, by PCR, but may also be carried out by other known gene amplification methods, such as LCR (ligase chain reaction) or LAMP (loop-mediated isothermal amplification).
  • LCR ligase chain reaction
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • Primer sequences for amplifying each polynucleotide can be designed, for example, from the base sequence. For example, regions specific to each JOX gene (JOX-S1 gene, JOX-S2 gene, or JOX-T2 gene) are identified from the results of homology analysis with the base sequence of each JOX gene.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 is the genomic sequence of the JOX-S1 gene
  • the base sequence of SEQ ID NO: 4 is the genomic sequence of the JOX-S2 gene
  • SEQ ID NO: 7 is the genomic sequence of the JOX-T2 gene.
  • the sites to be designed can be selected from regions specific to each gene, but are preferably introns, 5' untranslated regions, or 3' untranslated regions.
  • primers may be designed based on regions specific to each gene, or primers may be designed based on specific regions common to multiple genes present on each genome, such as S-type or T-type.
  • the length of the primer is preferably 15 to 30 bases, and particularly preferably 17 to 25 bases.
  • the primer sequence may be designed based on the sequence of a region specific to the base sequence or a region common to both base sequences. Furthermore, as long as it can function as a primer for amplifying a sequence of a predetermined number of bases including a mutation site, the sequence may contain one or more substitutions, deletions, and/or additions. Furthermore, the primer may be labeled with a fluorescent substance or radioactive substance, if necessary.
  • each polynucleotide to be amplified is not particularly limited as long as it is a length that can be used for the various detection methods described below, but it is, for example, 20 to 5,000 bases, more preferably 50 to 2,000 bases, even more preferably 100 to 700 bases, and even more preferably 100 to 500 bases.
  • Another aspect of the present invention is a method for imparting a cooling sensation to a tobacco product containing the tobacco material derived from a Nicotiana plant. Because the tobacco material has cold receptor TRPM8 activity and exhibits a cooling sensation, the tobacco product is substantially free of a cooling flavoring that imparts a cooling sensation. Examples of cooling flavorings include menthol, WS-5 (ethyl-2-(p-menthane-3-carboxamide) acetate), and WS-3 (N-ethyl-p-menthane-3-carboxamide).
  • One aspect of the present invention provides a method for determining whether a Nicotiana plant has cold receptor TRPM8 activity, comprising the steps of: obtaining a sample by harvesting a portion of a Nicotiana plant; A step of detecting a mutation that specifically causes functional suppression of the endogenous JOX gene on the genome contained in the sample; and a step of determining that the Nicotiana plant in which the mutation is detected is a Nicotiana plant having cold receptor TRPM8 activity.
  • the functional inhibition confers cold receptor TRPM8 activity to the tobacco leaves or cured leaves of the Nicotiana plants.
  • the above determination method can be used in methods for producing Nicotiana plants having cold receptor TRPM8 activity.
  • a tobacco material derived from a Nicotiana plant wherein the Nicotiana plant is (a) an endogenous gene having, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more, preferably 62% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 91% or more, even more preferably 92% or more, even more preferably 93% or more, even more preferably 94% or more, even more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, and even more preferably 100% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and having the activity of catalyzing the hydroxylation of jasmonic acid; (b) an endogenous gene having, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more,
  • a tobacco material derived from a Nicotiana plant wherein the Nicotiana plant is (a) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; (b) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6; and (c) A tobacco material having cold receptor TRPM8 activity, in which a mutation that specifically causes functional inhibition has been introduced into at least one endogenous gene in the genome, the endogenous gene containing as its coding region a polynucleotide that encodes a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • (A8) The tobacco material according to (A6) or (A7), wherein the dried material is dried tobacco leaves harvested from the Nicotiana plant.
  • (A9) The tobacco material according to any one of (A6) to (A8), wherein the dried material is dried leaves obtained by air-drying tobacco leaves harvested from the Nicotiana plant.
  • A14 A tobacco material according to any one of (A1) to (A11), in which a mutation that specifically causes functional suppression has been introduced into all of the endogenous gene according to (a), the endogenous gene according to (b), and the endogenous gene according to (c).
  • (B1) A tobacco product containing the tobacco material described in any one of (A1) to (A14).
  • (C1) (a) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3; (b) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6; and (c) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • a Nicotiana plant in which a mutation that specifically causes functional inhibition has been introduced into the endogenous gene in the genome.
  • C2 (a) an endogenous gene having, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more, preferably 62% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 91% or more, even more preferably 92% or more, even more preferably 93% or more, even more preferably 94% or more, even more preferably 95% or more, even more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, and even more preferably 100% sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and having the activity of catalyzing the hydroxylation of jasmonic acid; (b) an endogenous gene having, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide having 60% or more, preferably 62% or more, more preferably 70% or more, even more preferably 80% or
  • (C3) (a) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; (b) an endogenous gene comprising, as a coding region, a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6; and (c) A Nicotiana plant in which a mutation that specifically causes functional suppression has been introduced into at least one of its endogenous genes in the genome, the endogenous gene containing as its coding region a polynucleotide that encodes a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • (C4) The Nicotiana plant according to any one of (C1) to (C3), wherein the Nicotiana plant is any one of Nicotiana tabacum, Nicotiana sylvestris, and Nicotiana rustica.
  • (C5) The Nicotiana plant according to any one of (C1) to (C4), wherein the Nicotiana plant belongs to Nicotiana tabacum.
  • (C6) A Nicotiana plant according to any one of (C1) to (C5), in which a mutation that specifically causes functional suppression has been introduced into both the endogenous gene according to (a) and the endogenous gene according to (c).
  • (C7) A Nicotiana plant according to any one of (C1) to (C5), in which a mutation that specifically causes functional suppression has been introduced into both the endogenous gene according to (b) and the endogenous gene according to (c).
  • (C8) A Nicotiana plant according to any one of (C1) to (C5), in which a mutation that specifically causes functional suppression has been introduced into all of the endogenous genes according to (a), (b), and (c).
  • NtJOX2-T we found the NtJOX-T2-1 line, which had a nonsense mutation in exon 1 due to a substitution of C at position 1196 in the genomic sequence shown in SEQ ID NO: 7 with T.
  • NtJOX-T2-2 line which had a splicing mutation on the 5' side of the second intron due to a substitution of G at position 2677 in the genomic sequence shown in SEQ ID NO: 7 with A.
  • NtJOX-T2-3 line which had a nonsense mutation in exon 1 due to a substitution of C at position 1322 in the genomic sequence shown in SEQ ID NO: 7 with T.
  • DNA was extracted from each individual of the M2 generation of the lineage discovered above. PCR was performed using this DNA as a template and the primers shown in Table 1. The sequence of the amplified product was determined by sequence analysis, and individuals homozygous for the mutation were selected. KOD One (registered trademark) PCR Master Mix (TOYOBO Corporation) was used for PCR.
  • the NtJOX-S1-1 line was crossed with the NtJOX-T2-1 line to obtain the F1 generation (NtJOX1-F1-1 line).
  • the NtJOX-S1-2 line was crossed with the NtJOX-T2-2 line to obtain the F1 generation (NtJOX1-F1-2 line).
  • the NtJOX-S2-1 line was crossed with the NtJOX-T2-1 line to obtain the F1 generation (NtJOX2-F1-1 line).
  • the NtJOX-S2-2 line was crossed with the NtJOX-T2-2 line to obtain the F1 generation (NtJOX2-F1-2 line).
  • Each F1 generation was cultivated and self-fertilized to obtain the F2 generation (NtJOX1-F2-1 line, NtJOX1-F2-2 line, NtJOX2-F2-1 line, NtJOX2-F2-2 line).
  • DNA was extracted from each individual in the F2 generation. Using this DNA as a template, PCR was performed with the primers shown in Table 1 to amplify the sequence surrounding the mutation, yielding an amplified product.
  • PCR was performed to add an adapter sequence for analysis (5' end - P7 sequence, or P5 sequence - barcode sequence for each individual - sequence primer binding sequence - overhang sequence above - 3' end) to the amplified product, and a library for sequence analysis was prepared. The library was then subjected to sequence analysis using iSeq 100 (Illumina), the sequence information was determined, and individuals homozygous for the mutation were selected.
  • Evaluation Example 1-1 Measurement of the number of glandular trichomes in tobacco JOX mutants.
  • Four JOX mutant lines (F3 generation of joxs1joxt2-1, joxs1joxt2-2, joxs2joxt2-1, and joxs2joxt2-2) obtained in Example 1 and a control, Tsukuba No. 1, were grown in a greenhouse. Thirteen weeks after sowing, each line was observed under a stereomicroscope, and the number of glandular trichomes present within a 1-cm margin of the leaf (the fifth expanded leaf counting from the top) was counted at four locations per leaf, and the average was calculated. The results revealed that the number of glandular trichomes secreting leaf surface resin components was significantly increased (at the 1% level by Tukey-Kramer test) in all four JOX mutant lines ( Figure 1).
  • Evaluation Example 1-2 Measurement of the amount of leaf surface resin components in tobacco JOX mutants Steam distillation is a commonly used method for collecting aroma components contained in plants. By steam distilling tobacco leaves, essential oils containing many leaf surface resin components can be obtained. The amount of essential oil containing leaf surface resin components is one indicator of the amount of flavor and aroma components in tobacco leaves. Therefore, the amount of leaf surface resin components in each tobacco JOX mutant obtained in Example 1 was measured by steam distillation.
  • the plant materials used were the JOX mutant joxs1joxt2-1 line, cultivated in a conventional field, and Tsukuba 1 as a control.
  • Essential oils were obtained by steam distillation using 5 kg of mid- to upper-middle-aged leaves (fresh leaves) from joxs1joxt2-1 and Tsukuba 1 at the harvesting stage. Specifically, 35 L of tap water was placed in a distillation pot and brought to a boil at 100°C using a boiler. After boiling, the boiler was stopped, and a basket containing 5 kg of fresh leaves was placed in the distillation pot. The basket was secured in a position where it would not be submerged in water. The lid of the distillation pot was closed, the boiler was restarted, and distillation was continued for 2 hours.
  • the chiller was set to 20°C.
  • the steam-distilled water obtained after 2 hours of distillation was collected and 20% (w/w) sodium chloride was added.
  • 1 L of ethyl acetate was added to the treated steam-distilled water, and the mixture was then transferred to a separatory funnel for liquid-liquid transfer.
  • the ethyl acetate layer was collected and concentrated using a rotary evaporator to obtain a dry product.
  • the essential oil yield was approximately 30 mg/kg for joxs1joxt2-1 and approximately 12 mg/kg for Tsukuba 1, confirming a more than two-fold increase in the JOX mutant.
  • steam distillation was performed on 300g of dried leaves of joxs1joxt2-1 and Tsukuba 1, which had been harvested at the appropriate time and then dried to a yellow color, to obtain essential oil. More specifically, 4L of tap water was placed in a stockpot and brought to a boil at 100°C using an induction heater. After boiling, the heating was stopped and 300g of harvested leaves were placed in the stockpot. The harvested leaves were secured in a position so that they were not submerged in the water. The lid of the stockpot was then closed, the boiler was restarted, and distillation was carried out for 2 hours. A tap was connected to the condenser, and tap water was passed through it to act as a chiller.
  • the steam-distilled water obtained after 100 minutes of distillation was collected and 20% (w/w) salt was added.
  • 1L of ethyl acetate was added to the steam-distilled water after the treatment, and the liquid was transferred to a separatory funnel.
  • the ethyl acetate layer was collected and concentrated using a rotary evaporator to obtain a dry solid.
  • the amount of essential oil obtained was approximately 670 mg/kg for joxs1joxt2-1 and approximately 380 mg/kg for Tsukuba 1. In other words, it was revealed that the amount of essential oil increased by approximately two-fold in the JOX mutant, even in dry leaves.
  • leaf surface resin components were obtained using the following method, which is different from steam distillation.
  • the leaf surface resin components obtained were approximately 576 mg for joxs1joxt2-1 and 367 mg for Tsukuba 1 when using ethanol solvent, and approximately 180 mg for joxs1joxt2-1 and 158 mg for Tsukuba 1 when using hexane solvent. These results therefore confirm that leaf surface resin components are increased in joxs1joxt2-1.
  • Evaluation Example 1-3 Analysis of tobacco JOX mutant components ⁇ -cembratrienediol (hereinafter also referred to as ⁇ -CBT), a representative component of leaf surface resin, was analyzed by GC-MS.
  • ⁇ -CBT ⁇ -cembratrienediol
  • the JOX mutant joxs1joxt2-1 line obtained in Example 1, which had been cultivated in a field by conventional methods, and Tsukuba No. 1 were used as controls. Field cultivation was carried out twice, in the first and second years.
  • the middle and upper leaves were harvested at the appropriate time and allowed to yellow and dry. Approximately four dried yellow leaves per plant were bulked from three plants, for a total of approximately 12 leaves per replicate. For joxs1joxt2-1, three replicates were made for field-grown samples in the first year, and five replicates were made for field-grown samples in the second year, while for Tsukuba 1, three replicates were made for each year. The deboned laminae were crushed and analyzed for ⁇ -CBT.
  • ⁇ joxs1joxt2-1_yellow-dried_ripe A sample of ripe leaves of joxs1joxt2-1, dried to a yellow color.
  • ⁇ joxs1joxt2-1_air-dried_immature A sample of immature leaves of joxs1joxt2-1, air-dried.
  • ⁇ joxs1joxt2-1_air-dried_ripe A sample of ripe leaves of joxs1joxt2-1, air-dried.
  • a finely ground sample was prepared from the yellow dried leaves and spread on an unflavored cigarette. Specifically, yellow dried leaves of JOXS1 and JOXT2-1 were finely pulverized. Propylene glycol was added to the resulting finely pulverized sample in an amount three times the weight of the finely pulverized sample, and mixed to produce a finely powdered sample. The finely pulverized sample was then spread at a concentration of 3% by weight on 0.7 g of unflavored cigarette shredded tobacco to produce a tobacco product sample (i.e., a cigarette spread with JOXS1 and JOXT2-1).
  • Tsukuba No. 1 yellow dried leaves of Tsukuba No. 1 were finely pulverized.
  • Propylene glycol was added to the resulting finely pulverized sample in an amount three times the weight of the finely pulverized sample and mixed to produce a finely powdered sample.
  • the finely powdered sample was then spread at a rate of 3% by weight onto 0.7 g of unflavored cigarette shredded tobacco to produce a tobacco product sample (i.e., a cigarette with Tsukuba No. 1 spread on it).
  • A-E Five trained panelists (A-E) evaluated the degree of favorable change in smoking taste of cigarettes with various samples applied compared to unflavored cigarettes without any samples applied, on a three-point scale (0: not good, 1: good, 2: very good), and also described the smoking taste characteristics.
  • Finely ground samples were prepared from "yellow dried Tsukuba No. 1 leaves,” “dried leaves obtained by yellowing mature joxs1joxt2-1 leaves,” “dried leaves obtained by air-drying immature jox1sjox2t-1 leaves,” and “dried leaves obtained by air-drying mature jox1sjox2t-1 leaves,” all of which were produced in the second year of field cultivation. These samples were then spread on unflavored cigarettes. Seven trained panelists (A-G) subjectively evaluated the intensity of "cooling sensation” on a six-point scale (0: no cooling sensation, 1-5: if a cooling sensation was felt, higher numbers were used for stronger cooling sensations).
  • leaf surface resin components of dried leaves extracted with ethanol and hexane in Evaluation Example 1-2 were spread on unflavored cigarettes. Regardless of the leaf surface resin components of dried leaves extracted with either solvent, none of the five evaluation panel members recognized a "refreshing” or “cooling sensation” for Tsukuba No. 1, but did recognize a "refreshing” or “cooling sensation” for the joxs1joxt2-1 mutant.
  • TRPM8 Transient receptor potential cation channel melastatin 8
  • TRPM8 is one of the TRP channels confirmed to be strongly expressed in human sensory neurons and is known to be involved in the perception of cold.
  • TRPM8 is activated by temperature stimulation below 28°C or by the administration of cold-sensing substances such as menthol or icillin.
  • Activated TRPM8 induces an influx of cations into cells, depolarizing the neurons and thereby transmitting cold-sensing signals. Taking advantage of this property, TRPM8 is also being used to identify novel cold-sensing substances. The following procedure was used to investigate whether components contained in JOX mutants activate the human cold receptor (TRPM8).
  • TRPM8-expressing cells were constructed by inserting a human TRPM8 expression gene (NCBI Reference Sequence: NM_024080.5) into the multiple cloning site of the pF5A CMV-neo Flexi vector (Promega). The TRPM8 expression vector was then transfected into the human embryonic stem cell line HEK293T (ECACC) using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). The resulting transformed cells were cultured at 37°C under 5 % CO2 for 3 days, after which the medium was replaced with selective medium containing 200 ⁇ g/mL Geneticin (Thermo Fisher Scientific) and further cultured for 10 days to obtain stable TRPM8-expressing cells.
  • a TRPM8 expression vector was constructed by inserting a human TRPM8 expression gene (NCBI Reference Sequence: NM_024080.5) into the multiple cloning site of the pF5A CMV-neo Flexi vector (Promega). The TRPM8 expression vector was then transfected into the human embryo
  • test samples used were unflavored cigarettes (control cigarettes) and control cigarettes coated with finely ground yellow dried leaves of the JOXS1JOXT2-1 variety, developed in the first year of field cultivation in Evaluation Example 1-3 (JOX cigarettes).
  • the cigarettes were burned under ISO 3308:2012 conditions using a linear smoking device (Cerulean SM410), and the combustion smoke of 10 cigarettes (each sample) was collected using a Cambridge filter. The Cambridge filter was then shaken for 30 minutes after adding 10 mL of ethanol and filtered through a 0.45 ⁇ m PVDF filter. The filtered ethanol eluate was diluted with HBSS solution to a final concentration of 0.3%.
  • TRPM8 activity of each sample was calculated as follows. First, the maximum fluorescence intensity of each sample for TRPM8(+) and TRPM8(-) was standardized by dividing it by the maximum fluorescence intensity of the negative control (a solution without captured smoke). The standardized TRPM8(+) value was then divided by the standardized TRPM8(-) value, and the value obtained by subtracting 1 (TRPM8(+)/TRPM8(-)-1) was used as the TRPM8 activity intensity.
  • test samples used were the second-year field-grown samples from Evaluation Example 1-3, JOXS1JOXT2-1_Yellow-Dried_Ripe, JOXS1JOXT2-1_Air-Dried_Immatured, and Tsukuba No. 1 as a control.
  • the deboned lamina was crushed to prepare a crushed sample. 1 g of the crushed sample was transferred to a 15 mL centrifuge tube and 10 mL of hexane was added. After shaking at room temperature for 1 hour, the tube was centrifuged and the supernatant was transferred to a recovery flask.
  • the assay was performed twice, with one test performed using the above procedure counting as one repetition.
  • the results of the first repetition (Test #1) assay are shown in Figure 6, and the results of the second repetition (Test #2) assay are shown in Figure 7.
  • the joxs1joxt2-1_yellow-dried_ripe sample and the joxs1joxt2-1_air-dried_immature sample exhibited higher TRPM8 activity than the control, Tsukuba No. 1.
  • Tables 3 to 5 also show the predicted amino acid sequences encoded by the nucleotide sequences of each gene, as well as the accession of the predicted amino acid sequences, the sequence identity (Per. Identity) for each query sequence (predicted amino acid sequence), the expected value (E value), and the query sequence coverage (Query Cover) (calculated using the genetic information processing software GENETYX (Japan Server Co., Ltd.)).
  • sequences used for phylogenetic analysis are as follows: - Deduced amino acid sequences of NtJOX-S1, NtJOX-S2, and NtJOX-T2. - Deduced amino acid sequences of N. tabacum, N. sylvestris, N. tomentosiformis, and N. attenuata, included in Tables 3 to 5. - Deduced amino acid sequences of AtJOX1, 2, 3, and 4 in Arabidopsis thaliana (Caarls et al., 2017; Smirnova et al., 2017).
  • the Arabidopsis AT1G05010.1 sequence was used as an outgroup.
  • the AT1G05010.1 sequence belongs to the same 2-oxoglutarate (2OG) Fe(II)-dependent oxygenase family as AtJOX1, 2, 3, and 4, but its amino acid sequence is classified into a different clade from JOX (Caarls et al., 2017).
  • the phylogenetic tree created is shown in Figure 8.
  • the sequences used in the phylogenetic analysis were aligned with reference to MAFFT (a multiple sequence alignment program (cbrc.jp), Ver. 7, Katoh et al., 2019).
  • MAFFT multiple sequence alignment program
  • the phylogenetic tree was created using the maximum likelihood method (Bootstrap: 1000) using Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) (Ver. 11.0.13, https://www.megasoftware.net/, Kumar et al., 2018).
  • MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis
  • Example 2 Creation of a JOX triple mutant
  • the JOX mutant joxs1joxt2-1 line and the JOX mutant joxs2joxt2-1 line obtained in Example 1 were crossed to obtain an F1 generation.
  • the F1 generation was then cultivated and self-fertilized to obtain an F2 generation.
  • Individuals of the F2 generation homozygous for the mutation were identified by Sanger sequencing. Specifically, DNA was extracted from each individual in the F2 generation, and the sequence surrounding the mutation was amplified by PCR using the primers listed in Table 1 and Tks Gflex TM DNA Polymerase (Takara Bio Inc.). The sequence of the amplified product was determined by Sanger sequencing using the primers used in PCR.
  • an individual joxs1joxs2joxt2 (hereafter referred to as the JOX triple mutant) was found to have homozygous mutations in all three genes, NtJOX-S1, NtJOX-S2, and NtJOX-T2.
  • the JOX triple mutant individual was selfed to obtain the F3 generation.
  • the F3 generation of the JOX triple mutant, along with Tsukuba No. 1 as a control, were cultivated in the field according to conventional methods to obtain field-grown samples.
  • Evaluation Example 2-1 Analysis of Components of the Tobacco JOX Triple Mutant
  • Solavetivone is a phytoalexin (antibacterial substance) found in tobacco. It is known to increase in Nicotiana plants in response to environmental stresses, such as pests and diseases. Therefore, the solavetivone content in JOX mutant plants can be used as an evaluation index for the enhancement of jasmonic acid responses due to mutations that suppress JOX gene function.
  • Solavetivone itself is also known as a flavor component in Nicotiana plants and their dried tobacco materials. Therefore, tobacco materials containing solavetivone are useful for improving the flavor and taste of tobacco products. Therefore, we analyzed solavetivone and ⁇ -CBT in the JOX triple mutant obtained in Example 2.
  • ⁇ -CBT is the same component analyzed in Evaluation Example 1-3.
  • Dried leaf samples were prepared for the field-grown samples of Tsukuba No. 1 and JOXS1JOXS2JOXT2 lines obtained in Example 2, with reference to the dried leaf sample preparation method in Evaluation Examples 1-3.
  • several levels of dried leaf sample preparation were established depending on the drying method and harvest time. Two drying methods were established: samples subjected to yellow drying and samples subjected to air drying. Furthermore, two harvest times were established: immature middle- and upper-middle leaves harvested on the third day after stemming, and mature middle- and upper-middle leaves harvested at the appropriate time. These levels were combined, resulting in a total of two levels for analysis.
  • joxs1joxs2joxt2 are abbreviated as "joxs1s2t2.”
  • joxs1s2t2 When immature leaves were air-dried, the ⁇ -CBT content in joxs1joxs2joxt2 was 4.1 times that of the control, Tsukuba 1 ( Figure 9).
  • ripe leaves were yellow-dried the ⁇ -CBT content in joxs1joxs2joxt2 was 2.0 times that of the control, Tsukuba 1 ( Figure 10).
  • Evaluation Example 2-2 Sensory evaluation of the JOX triple mutant As in Evaluation Example 2-1, immature leaves of joxs1joxs2joxt2 were air-dried to prepare dried leaf samples. Sensory evaluation was carried out using these dried leaf samples.
  • JOXS1, JOXS2, and JOXT2 were finely ground.
  • Propylene glycol was added to the resulting finely ground sample in an amount three times the weight of the finely ground sample and mixed to produce a finely powdered sample (hereinafter also referred to as a JOX tobacco material sample).
  • the finely powdered sample was then spread at a rate of 3% by weight onto 0.7 g of unflavored cigarette shredded tobacco to produce a tobacco product sample (hereinafter also referred to as a JOX spread sample).
  • An unflavored cigarette (hereinafter also referred to as the unspread sample) was used as a control.
  • the unspread sample did not have any JOX tobacco material sample spread on it.
  • Example 3 Example using JOX mutants
  • Evaluation Example 3 Sensory evaluation of JOX mutants at different chopped blend ratios From the above-mentioned evaluation examples 1-4, the ⁇ immature leaf/air-dried leaf sample of the joxs1joxt2-1 line'' was selected as a sample that expressed a ⁇ refreshing sensation'' or ⁇ cool sensation'' and used for sensory evaluation.
  • the above-mentioned dried leaf sample was shredded to produce tobacco material in the form of cut filler (hereinafter also referred to as "JOX tobacco shreds").
  • Standard shredded tobacco and JOX shredded tobacco were mixed to create five levels of blended materials using the following procedure. Before creating the blended materials, the JOX shredded tobacco and standard shredded tobacco were left to stand in open air at 60% RH and 25°C for 24 hours to condition the moisture content to 10%.
  • Level 1 (hereinafter also referred to as "0% blend”) used 20 g of standard shredded tobacco.
  • the blending ratio of JOX shredded tobacco in Level 1 was 0% by weight on a wet weight basis.
  • Level 2 (hereinafter also referred to as “5% blend”), 1g of JOX tobacco shreds was mixed with 19g of standard shredded tobacco to create a blended material.
  • the blend ratio of JOX tobacco shreds in Level 2 was 5% by weight on a wet weight basis.
  • Level 3 (hereinafter referred to as "10% blend”), 2g of JOX tobacco shreds was mixed with 18g of standard shredded tobacco to create a blended material.
  • the blend ratio of JOX tobacco shreds in Level 3 was 10% by weight on a wet weight basis.
  • Level 4 (hereinafter referred to as “15% blend”), 3g of JOX tobacco shreds was mixed with 17g of standard shredded tobacco to create a blended material.
  • the blend ratio of JOX tobacco shreds in Level 4 was 15% by weight on a wet weight basis.
  • Level 5 (hereinafter also referred to as "20% blend”), 4g of JOX shredded tobacco was mixed with 16g of standard shredded tobacco to create a blended material.
  • the blend ratio of JOX shredded tobacco in Level 5 was 20% by weight on a wet weight basis.
  • the average scores for the "intensity of refreshing/cool sensation" evaluated by five panelists for each cigarette level were 0 points (0% blend), 0.6 points (5% blend), 1.3 points (10% blend), 1.9 points (15% blend), and 1.5 points (20% blend) (Table 7). This suggests that tobacco products using dried leaves of the JOX mutant joxs1joxt2-1 line as tobacco material in cut filler form also exhibit a "refreshing/cool sensation.”
  • the present invention can be used in tobacco products.

Landscapes

  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

たばこ材料自体が冷涼感を発現したたばこ製品の実現。本開示のタバコ属植物体由来のたばこ材料は、内在性JOX遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が導入されたタバコ属植物体由来のたばこ材料である。当該たばこ材料は、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する。

Description

タバコ属植物体由来のたばこ材料、たばこ製品、タバコ属植物体、およびたばこ製品に冷涼感を付与する方法
　本発明は、タバコ属植物体由来のたばこ材料、たばこ製品、タバコ属植物体、およびたばこ製品に冷涼感を付与する方法に関する。
　従来、たばこ製品は、タバコ属植物体由来のたばこ材料に香料などを添加することによって、所望の味または香り（以下、「香喫味」と示す場合がある）を提供するよう、設計されている。一方で、製造効率または品質安定性などの観点から、たばこ製品の原料となる、たばこ葉自体の香喫味を改善することが求められている。
　ジャスモン酸（JA）は虫害または病害に対する防御応答に寄与する植物ホルモンである。JAには種々の類縁体が知られている。植物体内における活性型は、JAおよびアミノ酸の一種であるイソロイシンが結合したジャスモン酸イソロイシン（JA-Ile）である。JAおよびJA-Ileは可逆的に変換される。また、JAおよびJA-Ileは、それぞれの代謝酵素であるJOX（JAO）およびCYP94B1/B3により、不活性型である12-ヒドロキシ-ジャスモン酸（12-OH-JA）および12-ヒドロキシ-ジャスモン酸イソロイシン（12-OH-JA-Ile）に変換される。これまでに、JOX遺伝子またはCYP94B遺伝子の機能抑制により、JA類の蓄積量が増加することがシロイヌナズナ（非特許文献１～３）および野生タバコ（非特許文献４）で報告されている。
　たばこ材料の香喫味成分への寄与因子としてのJAの効果としては、葉の表面に存在する器官glandular trichomeから分泌される葉面樹脂主成分の一つであるセンブラトリエンジオール（CBT）の合成亢進が非特許文献５で報告されている。非特許文献５には、JAの類縁体である、ジャスモン酸メチルをタバコに外生投与することで、CBTが増加することが開示されている。また、非特許文献６には、ジャスモン酸メチルを収穫直前の葉に外生投与することで、葉たばこの内容成分である複数のフェニルアラニン由来香気成分の増加とともに、葉たばこの香喫味が向上したことが開示されている。
中国特許公開公報ＣＮ１１２０９４８５５Ａ
Smirnova et al., Molecular Plant 10, 1159-1173, 2017 Caarls et al., PNAS, vol.114, No.24, 6388-6393, 2017 Heitz et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 9, pp. 6296-6306, 2012 Tang et al., Plant Diversity 42, 111-119, 2020 Sui et al., Molecules, 23, 2511, 2018 Xu et al., The effects of exogenous methyl jasmonate on volatile compounds, key enzymes, and sensory quality in tobacco (a model plant), https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-3902707/v1
　JOX遺伝子を機能抑制することにより、JA類が植物体に蓄積することは報告されている一方、JOX遺伝子の機能抑制により、たばこ材料の香喫味が改善すること、特に冷涼感を発現することは報告されていない。
　本発明の一態様は、たばこ材料自体が冷涼感を発現したたばこ製品を提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するために、以下の手段が提供される。　
　本発明の一つの側面によれば、タバコ属植物体由来のたばこ材料であって、上記タバコ属植物体は、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくともいずれか１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されており、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する、たばこ材料が提供される。
　本発明の別の側面によれば、ＴＲＰＭ８アゴニストを含む、上記側面に係るたばこ材料が提供される。
　本発明の更に別の側面によれば、上記たばこ材料の上記冷感受容体ＴＲＰＭ８活性が、野生型のタバコ属植物体由来のたばこ材料の冷感受容体ＴＲＰＭ８活性の２倍以上である、上記側面の何れかに係るたばこ材料が提供される。
　本発明の更に別の側面によれば、乾燥材料である、上記側面の何れかに係るたばこ材料が提供される。
　本発明の更に別の側面によれば、乾燥材料の粉末である、上記側面の何れかに係るたばこ材料が提供される。
　本発明の更に別の側面によれば、上記側面の何れかに係るたばこ材料を含む、たばこ製品が提供される。
　本発明の更に別の側面によれば、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくともいずれか１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている、タバコ属植物体が提供される。
　本発明の更に別の側面によれば、上記タバコ属植物体が、ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・シルベストリス、またはニコチアナ・ルスチカの、いずれか一つである、上記側面に係るタバコ属植物体が提供される。
　本発明の更に別の側面によれば、上記機能抑制を特異的に引き起こす変異が、変異原処理、ゲノム編集、または遺伝子ノックアウトによって導入されている、上記側面の何れかに係るタバコ属植物体が提供される。
　本発明の更に別の側面によれば、上記機能抑制を特異的に引き起こす変異が、ジャスモン酸への応答亢進を、特異的に引き起こす、上記側面の何れかに係るタバコ属植物体が提供される。
　本発明の更に別の側面によれば、たばこ製品に冷涼感を付与する方法であって、
　上記たばこ製品はタバコ属植物体由来のたばこ材料を含み、
　上記タバコ属植物体は、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくともいずれか１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されており、
　上記たばこ材料は冷感香料を実質的に含まず、
　上記たばこ材料は冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する、方法が提供される。
　本発明の一態様によれば、たばこ材料自体が冷涼感を発現したたばこ製品を実現することができる。
評価例１－１の測定結果を示す図である。 評価例１－３における圃場試験１年目のα-CBT分析結果を示す図である。 評価例１－３における圃場試験２年目のα-CBT分析結果を示す図である。 評価例１－５におけるシガレット煙中成分のアッセイ（１回目）の結果を示す図である。 評価例１－５におけるシガレット煙中成分のアッセイ（２回目）の結果を示す図である。 評価例１－５におけるJOX変異体葉の内容成分のアッセイ（１回目）の結果を示す図である。 評価例１－５におけるJOX変異体葉の内容成分のアッセイ（２回目）の結果を示す図である。 タバコ（Nicotiana）属JOXのアミノ酸配列の分子系統樹を示す図である。 評価例２－１において未熟葉を空気乾燥した場合のα-CBT分析結果を示す図である。 評価例２－１において適熟葉を黄色乾燥した場合のα-CBT分析結果を示す図である。 評価例２－１において未熟葉を空気乾燥した場合のソラベチボン分析結果を示す図である。 評価例２－１において適熟葉を黄色乾燥した場合のソラベチボン分析結果を示す図である。
　本発明の一態様について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。また、実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態および実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　以下に説明する実施形態および実施例は、上記側面の何れかをより具体化したものである。以下に記載する事項は、単独で又は複数を組み合わせて、上記側面の各々に組み入れることができる。
　また、本明細書において「Ａ～Ｂ」とは、特に指定しない限りＡ以上Ｂ以下であることを示している。
　〔たばこ材料〕
　本発明の一態様に係るたばこ材料は、内在性JOX遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が導入されているタバコ属植物体由来の材料である。植物体の一部としては、葉、葉から分離された中骨、残幹、花、などを挙げることができる。本発明の一態様に係るたばこ材料は、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する。
　（JOX遺伝子）
　JOX（jasmonate-induced oxygenase）遺伝子は、JOXをコードしている遺伝子である。JOX遺伝子は、別名として、JAO（jasmonic acid oxidase）遺伝子と記載される場合があり、本明細書において、「JOX遺伝子」は、JOX遺伝子およびJAO遺伝子を包含する。JOXは、ジャスモン酸（JA）の代謝に関与する酵素である。
　上記タバコ属植物体は、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の、少なくとも１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている。
　本明細書において、上記内在性遺伝子に存在する、ポリペプチドをコードする領域を、コード領域（ＣＤＳ）と記載する。また、本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、実質的に同一の意味を有しており、交換可能に使用され得る。
　本明細書において、「配列同一性」は、基準となる配列（ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、など）に対して、言及されている配列が一致している割合を意味する。ここで、配列の一致していない部分は、置換、付加、欠失または挿入が存在している部分である。
　JOX遺伝子には、JOX-S1遺伝子、JOX-S2遺伝子およびJOX-T2遺伝子が含まれる。配列番号１は、ニコチアナ・タバカムのＳゲノムにコードされるJOX-S1（「NtJOX-S1」と示す場合がある）の遺伝子のゲノム配列である。配列番号２は、JOX-S1遺伝子のＣＤＳのヌクレオチド配列である。配列番号３は、JOX-S1タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号４は、ニコチアナ・タバカムのＳゲノムにコードされるJOX-S2（「NtJOX-S2」と示す場合がある）の遺伝子のゲノム配列である。配列番号５は、JOX-S2遺伝子のＣＤＳのヌクレオチド配列である。配列番号６は、JOX-S2タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号７は、ニコチアナ・タバカムのＴゲノムにコードされるJOX-T2（「NtJOX-T2」と示す場合がある）の遺伝子のゲノム配列である。配列番号８は、JOX-T2遺伝子のＣＤＳのヌクレオチド配列である。配列番号９は、JOX-T2タンパク質のアミノ酸配列である。
　以下で記載するように、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）は、複二倍体であり、親植物であるニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）由来のゲノム（「Ｓゲノム」ともいう）およびニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）由来のゲノム（「Ｔゲノム」ともいう）を有する。タバコ属植物がニコチアナ・タバカムである場合、Ｓゲノム、またはＴゲノムのいずれかに存在する、少なくとも１つのJOX遺伝子（すなわち、JOX-S1遺伝子、JOX-S2遺伝子、またはJOX-T2遺伝子のうち、少なくとも１つ）の機能を特異的に抑制することによって、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する。
　本発明の一態様に係るたばこ材料は、JOX-S1遺伝子およびJOX-S2遺伝子、JOX-S1遺伝子およびJOX-T2遺伝子、または、JOX-S2遺伝子およびJOX-T2遺伝子の機能が特異的に機能抑制されているタバコ属植物体由来のたばこ材料であってもよい。また、本発明の一態様に係るたばこ材料は、JOX-S1遺伝子、JOX-S2遺伝子およびJOX-T2遺伝子の機能が特異的に機能抑制されているタバコ属植物体由来のたばこ材料であってもよい。
　JOX遺伝子の機能抑制および変異などについては、後述の〔タバコ属植物体〕の欄で詳細に説明する。
　（冷感受容体ＴＲＰＭ８活性）
　Transient receptor potential cation channel melastatin 8（ＴＲＰＭ８）は、冷涼感の近くに関与する受容体である。ＴＲＰＭ８は、TRPチャネルの一つであり、ヒトの感覚神経上で発現することが確認されている。ＴＲＰＭ８を活性化する方法として、28℃以下の温度刺激を与える方法、または冷感物質（例えば、Menthol、WS-5およびWS-3等）を投与する方法が知られている。ＴＲＰＭ８の活性化により、細胞内への陽イオン流入が誘導される。当該誘導によって、神経細胞が脱分極し、冷感情報が伝達される。
　本発明の一態様に係るたばこ材料は、ＴＲＰＭ８活性を有する。また、本発明の一態様に係るたばこ材料の燃焼煙もＴＲＰＭ８活性を有し、当該たばこ材料を含むたばこ製品は、使用者に冷涼感を付与することができる。本発明の一態様に係るたばこ材料は、ＴＲＰＭ８アゴニストを含んでいてもよい。当該ＴＲＰＭ８アゴニストの例として、内在性JOX遺伝子の機能抑制により新たに生じた物質、または内在性JOX遺伝子の機能抑制により野生型のタバコ属植物体と比較して発現が上昇した、もしくは活性化された物質、蓄積量が増加した物質などが、挙げられる。
　たばこ材料がＴＲＰＭ８活性を有するか否かは、例えば、以下の手順により評価することができる。
　（たばこ材料のＴＲＰＭ８活性を評価する場合）
　たばこ材料を粉砕し、得られた粉砕試料に溶媒（例えば、ヘキサン、エタノール、酢酸エチル、アセトニトリルなど）を加えて振とう後、遠心分離によって、たばこ材料の内容成分を含む上清を得る；
　上清をエバポレーションし、乾固物を得る；
　乾固物にＤＭＳＯを加えて溶解後、ＨＢＳＳ溶液で希釈し、測定用組成物を得る；
　測定用組成物をＴＲＰＭ８発現細胞（例えば、ＴＲＰＭ８を発現するように形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞）に接触させ、蛍光カルシウムイメージングによって蛍光強度を測定する；
　測定用組成物を接触後に得られた、最大蛍光強度を、たばこ材料によるＴＲＰＭ８発現細胞の活性として取得する；
　測定用組成物を、ＴＲＰＭ８を発現しない細胞（例えば、非形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を接触させたときの対照最大蛍光強度と、上記最大蛍光強度と、を比較し、上記最大蛍光強度が、対照最大蛍光強度より上昇したとき、たばこ材料がＴＲＰＭ８活性を有すると評価する。
　（たばこ材料の燃焼煙のＴＲＰＭ８活性を評価する場合）
　たばこ材料を含むシガレットを、ISO 3308:2012条件で燃焼し、シガレットを燃焼生成して得た主流煙を、ガラス繊維フィルターで捕集する；
　ガラス繊維フィルターで捕集した主流煙中成分を、溶媒（例えば、エタノール、メタノール、酢酸エチル）で振とう抽出し、ＰＶＤＦ（polyvinylidene fluoride）フィルターでろ過し、抽出液を得る；
　濾過後の抽出液に、HBSS溶液を加えて希釈し、測定用組成物を得る；
　測定用組成物をＴＲＰＭ８発現細胞（例えば、ＴＲＰＭ８を発現するように形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞）に接触させ、蛍光カルシウムイメージングによって蛍光強度を測定する；
　測定用組成物を接触後に得られた、最大蛍光強度を、たばこ材料によるＴＲＰＭ８発現細胞の活性として取得する；
　測定用組成物を、ＴＲＰＭ８を発現しない細胞（例えば、非形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を接触させたときの対照最大蛍光強度と、上記最大蛍光強度と、を比較し、上記最大蛍光強度が、対照最大蛍光強度より上昇したとき、たばこ材料がＴＲＰＭ８活性を有すると評価する。
　本発明の一態様に係るたばこ材料は、好ましくは、ＴＲＰＭ８活性が、野生型のタバコ属植物体由来のたばこ材料の冷感受容体ＴＲＰＭ８活性の２倍以上であり、より好ましくは野生型のタバコ属植物体由来のたばこ材料の冷感受容体ＴＲＰＭ８活性の５倍以上であり、さらに好ましくは、野生型のタバコ属植物体由来のたばこ材料の冷感受容体ＴＲＰＭ８活性の１０倍以上である。
　本発明の一態様に係るたばこ材料は、上記タバコ属植物体から収穫された、葉たばこである。より好ましくは、本発明の一態様に係るたばこ材料は、上記タバコ属植物体から収穫された葉たばこの乾燥葉である。本明細書において、「葉たばこ」は「葉」と同義であり、後述の乾燥工程を行っていない、「生葉」である。また、本発明の一態様に係るたばこ材料は、乾燥葉を任意の方法で、処理することによって、得られてもよい。任意の処理方法は、例えば、乾燥葉を、乾燥、熟成、抽出、調和、加香、高温高圧処理、蒸留、粉砕、および裁刻である。得られたたばこ材料は、任意の形態であり得、例として、カットフィラー、粉末、シート、顆粒、および抽出物であってもよい。たばこ材料がこれらの形態であることは、乾燥材料をたばこ製品に適用する観点から好ましい。
　乾燥葉は、葉たばこを乾燥することによって得られる。乾燥方法としては、任意の方法を用いることができ、例としては黄色乾燥、空気乾燥、温風乾燥、熱風乾燥などが挙げられるが、これらに限定されない。
　〔乾燥葉の製造方法〕
　本発明の一態様に係る乾燥葉の製造方法は、上記タバコ属植物体から収穫された葉たばこを乾燥させる乾燥工程を含んでいてもよい。タバコ材料に付与される冷涼感がより向上する点で、当該乾燥工程は、黄色乾燥または空気乾燥が好ましく、空気乾燥がより好ましい。本明細書において、黄色乾燥は黄色種タバコに用いられる加熱式の乾燥法であり、葉たばこを黄色に仕上げる乾燥である。空気乾燥は、自然の温湿度、通気条件を利用して行う乾燥法である。
　乾燥葉が発現する冷涼感が、より向上する点で、上記乾燥工程において、葉たばこは未熟または適熟の葉たばこであることが好ましく、未熟の葉たばこであることがより好ましい。
　本明細書において、未熟の葉たばことは、心止め数日後に収穫された葉たばこを指す。また、適熟の葉たばことは、タバコ葉の適熟期に収穫された葉たばこを指す。
　乾燥葉の発現する冷涼感が、より向上する点で、本発明の一態様に係るたばこ材料の製造方法は、上記タバコ属植物体から収穫された未熟の葉たばこを空気乾燥させる乾燥工程を含むことがさらに好ましい。
　〔たばこ製品〕
　本発明の一態様に係るたばこ製品は、上記たばこ材料を含む。たばこ製品は任意の形態であり得、例として、刻みたばこ製品、葉巻きたばこ製品、パイプたばこ製品、シガレット（紙巻きたばこ製品）、電子たばこ製品、無煙たばこ製品（スヌース、スナッフを含む）、水たばこ製品などが挙げられる。特にたばこ製品は、電子たばこ製品、シガレットおよび無煙たばこ製品のいずれかであってもよい。電子たばこ製品としては、たばこ材料を含むたばこ部を加熱し発生するエアロゾルを、エアロゾル源として用いる非燃焼高温加熱型たばこ製品、たばこ部とは別体の、エアロゾル源を霧化する霧化部を有し、霧化部を加熱し発生したエアロゾルが、たばこ部を通過する際に同伴するたばこの香味を吸引する非燃焼低温加熱型たばこ製品、たばこ部を加熱せずにその香味を吸引する非加熱型たばこ製品などが挙げられるが、これらに限定されない。
　冷涼感を知覚し易い点で、たばこ製品は、シガレット、もしくは、電子たばこ製品であることが好ましい。
　〔タバコ属植物体〕
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、JOX遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が導入されているタバコ属植物体である。当該タバコ属植物体は、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および、
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の、少なくとも１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている。
　（変異）
　本明細書に使用される場合、「変異」は、本願の属する技術分野において通常に理解される意味を有しており、例えば、野生型のゲノム上にある塩基、または野生型ポリペプチドにあるアミノ酸残基の、任意の変化（例えば、置換、欠失、挿入、付加、重複、逆位または転座など）を意味する。したがって、「内在性遺伝子の変異」は、本来の機能的なポリペプチドが生成されない遺伝子の変異（機能の低下または欠損しているポリペプチドが生成される変異を含む）、ポリペプチドが生成されるものの、生成される量が低下する遺伝子の変異、ポリペプチドが生成されるものの、ポリペプチドの安定性が低下する遺伝子の変異、遺伝子（コード領域、または非翻訳領域を含んでいるゲノムＤＮＡ配列）の喪失、または遺伝子からの転写が抑制される変異（転写制御領域または転写開始領域の欠失など）などを意味している。
　変異は、プロモーター配列（コード領域を基準にして上流（５’側）にある配列が挙げられる）、およびターミネーター配列（コード領域を基準にして下流（３’側）にある配列が挙げられる）、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域、イントロンの両端にある保存配列（例えば５’末端のＧＴおよび３’末端のＡＧ）、ならびにコード領域の少なくとも１つに存在するものであってもよい。特に変異は内在性JOX遺伝子のコード領域内に存在するものであってもよい。プロモーター配列、ターミネーター配列、およびコード領域の少なくとも１つに変異が存在する場合、当該変異は、置換、欠失、挿入、付加、重複、逆位および転座のいずれか１つであってもよい。特に、JOXのポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる内在性遺伝子の機能が抑制されていてもよい。ここで、それぞれのアミノ酸配列において欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は、例えば、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個である。
　また、本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、内在性JOX遺伝子のコード領域外に、上記内在性JOX遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が導入されていてもよい。変異が内在性JOX遺伝子のコード領域外に導入されている場合、当該変異は、上記内在性JOX遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進するアンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子を発現するポリヌクレオチドの挿入であってもよい。
　置換によって機能を欠損させる場合、プロモーター配列、およびターミネーター配列、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域、イントロンの両端にある保存配列、ならびにコード領域の少なくとも１つに、当該置換が存在し得る。
　例えば、ある遺伝子のプロモーター配列、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域にある、遺伝子発現調節に重要なヌクレオチド配列における置換は、当該遺伝子の転写活性の低下または当該遺伝子からの転写産物の安定性の低下を生じる。これらの低下はいずれも、上記遺伝子からの転写産物の減少にともなって、翻訳産物の減少を生じ得る。イントロンの上記保存配列における置換（スプライス変異）は、ｍＲＮＡのスプライシング異常を引き起こすことによって、不要なイントロンが付加または挿入されている異常なｍＲＮＡを生じる。異常なｍＲＮＡは、例えばフレームシフトによって、異常な翻訳産物を生じさせるか、または翻訳終結しない。
　コード領域にあるヌクレオチド置換がミスセンス変異である（野生型ポリペプチドの存在量の低下を生じる）場合、当該置換により本来のアミノ酸と異なるアミノ酸が生じるため、本来の機能が低下または欠損したポリペプチドを生じ得る。
　また、コード領域にある置換は、不完全長の翻訳産物または本来の機能を維持していない翻訳産物を生じ得る。不完全長の翻訳産物は、アミノ酸をコードしているコドンのストップコドンへの、当該置換による変換（ナンセンス変異）に起因して生じる。不完全長の翻訳産物は、本来の翻訳産物と比べて、Ｃ末端のアミノ酸残基を含んでいる連続する１アミノ酸残基以上を欠失している。ナンセンス変異は、本来のストップコドンの上流にある任意のコドンに生じており、本来のストップコドンから、１コドン以上を挟んだ上流にあることが好ましい。したがって、ナンセンス変異を有する遺伝子からの翻訳産物は不完全長である。本来の機能を損なっている翻訳産物は、アミノ酸置換によって生じる。この場合、転写物の量は野生型のタバコ属植物体（以下、「野生型植物体」と略記する場合がある）と比較して同等であってもよい。当該翻訳産物は、立体構造の変化、または機能ドメインとしての機能の低下などを起こしている。本発明の変異の好ましい態様の一つは、このような本来の機能を損なう翻訳産物を生じるアミノ酸置換である。上記アミノ酸置換は、翻訳産物の機能を変化させる高い可能性を有している非保存的置換であることが好ましい。非保存的置換は、電荷または疎水性が異なるアミノ酸への置換（例えば、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸、塩基性または酸性アミノ酸から中性アミノ酸、中性アミノ酸から塩基性または酸性アミノ酸、極性アミノ酸から非極性アミノ酸への置換）、ならびにかさ（立体的な大きさ）の異なる側鎖を有しているアミノ酸への置換などが挙げられる。
　ナンセンス変異によって生じる現象の他の例として、JOX遺伝子のタンパク質コード領域にナンセンス変異を有している場合、nonsense-mediated mRNA decay（Brogna and Wen (2009) Nat. Structural Mol. Biol. 16: 107-113）が生じ得る。nonsense－mediated mRNA decayは、転写物の分解を引き起こすため、ナンセンス変異は、転写物量の低下を生じさせることがある。nonsense－mediated mRNA decayを生じるには、ナンセンス変異を有しているエキソンが、JOX遺伝子に少なくとも１つ存在することが好ましい。nonsense-mediated mRNA decayを生じるナンセンス変異の好ましい態様は、少なくとも１つのナンセンス変異が、JOX遺伝子の第１エキソンまたは第２エキソンに存在することである。
　置換以外の変異（欠失および挿入など）が、プロモーター配列、５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域内に生じていると、置換と同様に、転写活性または安定性の低下による転写産物量の低減、およびポリペプチドの量の低減が、結果として起こり得る。イントロンの保存配列への置換以外の変異はまた、置換と同様に、本来と異なるアミノ酸配列を有しているポリペプチドの翻訳を生じさせ得る。コード領域への置換以外の変異はまた、アミノ酸残基の欠失もしくは挿入（３の倍数の、連続する塩基の欠失または挿入によって生じる）、またはフレームシフトによって本来と異なるアミノ酸配列を有しているポリペプチドの翻訳を生じさせ得る。また、その遺伝子全体を含んでいる大きな欠失または当該遺伝子への大きな断片の挿入は、当該遺伝子の発現自体を喪失させ得る。
　上記の機能抑制を特異的に引き起こす変異は、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されているものであってもよい。特に、変異は、上記変異原処理によって導入されているものであってもよい。本発明の一態様に係るタバコ属植物体において、当該機能抑制を特異的に引き起こす変異は、ジャスモン酸への応答亢進を、特異的に引き起こす。
　上記遺伝子の変異原処理は、上記変異原をタバコ属植物体に対して人為的に作用させること（および必要に応じて遺伝子修復機能の抑制との組合せ）によって、実施され得る。変異原の種類として、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、アジ化ナトリウム、エチジウムブロマイド、および亜硝酸などの化学薬剤を用いることができるが、タバコ属植物体のゲノムＤＮＡに変異を生じさせる化学薬剤であればこれらに限定されない。また、変異原として、例えば、γ線、重イオンビーム、Ｘ線、中性子線、またはＵＶなどが挙げられるが、タバコ属植物体のゲノムＤＮＡに変異を生じさせる放射線などであれば、これらに限定されない。変異原として、好ましくはＥＭＳである。これらの手法は、対象植物に外在性の因子を加える必要がないという観点から好ましい。上記遺伝子の組換えは、公知の遺伝子組換え手法にしたがって、標的遺伝子の一部または全部を組換え配列によって相同的に組み換えることによって実施され得る。上記遺伝子のゲノム編集は、公知の技術（例えば、zinc－finger nucleases：ＺＦＮ、transcription activator－like effector nucleases：ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍなど）によって実施され得る。上記遺伝子ノックアウトは、公知のトランスポゾン（可動性遺伝因子）、またはＴ－ＤＮＡの挿入などによって、実施され得る。
　JOX遺伝子におけるヌクレオチドの、ＥＭＳ処理による置換は、例えば、（Ｉ）フレームシフト変異、（ＩＩ）トランケーション変異（Ｎ末端アミノ酸残基が必須に欠失する）、（ＩＩＩ）スプライス変異または（ＩＶ）ナンセンス変異を生じる。ＥＭＳ処理は、特定のヌクレオチド変化（Ｃ→Ｔ置換およびＧ→Ａ置換）をＤＮＡに生じさせる傾向を有しているからである。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍでは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質が、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮでは、融合タンパク質（ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼが融合されている）が、標的細胞内に存在すれば、ゲノム編集可能である。したがって、上記ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質、ならびに上記融合タンパク質はいずれも、標的細胞に直接的に導入され得る。これらを標的細胞に直接的に導入する方法としては、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、およびパーティクルボンバードメント法などが挙げられる。また、コンストラクト（ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびに任意のプロモーターおよび／またはターミネーターを含む）が挿入されているベクターを、アグロバクテリウムなどを介して、標的細胞および組織に導入してもよい。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍでは、ゲノム上のＸＧＧのすぐ上流にあるヌクレオチド配列の相補的な配列が、ガイドＲＮＡの一部と塩基対を形成し、当該ヌクレオチド配列内において２本鎖のゲノムＤＮＡがＣａｓ９によって切断を受ける。
　ＴＡＬＥＮでは、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５～２０塩基のスペーサを介して存在するヌクレオチド配列と結合する。当該ヌクレオチド配列は、２本鎖ゲノムＤＮＡの一方の鎖および他方の鎖に存在し、したがって、上記一対のＤＮＡ結合ドメインの一方は当該一方の鎖に、他方は、当該他方の鎖に結合する。上記ＤＮＡ結合ドメインは、３３～３４アミノ酸残基を繰り返し単位（モジュール）として、結合する塩基数と対応する数のモジュールから構成されている。
　ＺＦＮでは、ＴＡＬＥＮと同様に、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に５～２０塩基のスペーサを介して存在するヌクレオチド配列と結合する。当該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のジンクフィンガーモジュールから構成されている。
　上記のように、本発明の一態様に係るタバコ属植物体に導入された変異について、人為的に引き起こした変異について説明したがこれに限定されない。例えば、JOX遺伝子の変異または破壊は、自然突然変異によって生じてもよい。遺伝子の自然突然変異は、複製エラーおよび遺伝子の損傷によって一般的に生じる。当該損傷の原因は、天然に存在する公知の変異原（例えば、放射線または紫外線など）への曝露などである。
　遺伝子の変異または破壊は、当該遺伝子における変異の有無の検出によって決定され得る。遺伝子における変異を検出する方法としては、（１）当該変異を含むＤＮＡ配列をＰＣＲなどによって増幅後に、市販のシーケンサーなどを利用して、ＤＮＡ塩基配列を直接解読する方法、（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法を用いて配列の違いを電気泳動の距離の違いで検出する方法、（３）ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ法を用いて、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）を検出する方法、（４）Ｔ７　ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＩなどを用いてミスマッチ部位を切断することにより変異の有無を検出する方法、（５）制限酵素処理による切断の有無から変異の有無が判別できるＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法、（６）意図的にミスマッチを含むプライマーセットを用いることにより、制限酵素による切断の有無から変異の有無が判別できるｄＣＡＰＳ（derived CAPS）法、（７）変異配列に特異的にハイブリダイズするプローブを用いてプローブがハイブリダイズされたか否かを検出することにより変異の有無を判別する方法（ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲ法）、（８）変異に隣接するプライマーを用いて一塩基伸長を行い、取り込まれた塩基の質量差によって変異の有無を検出する方法（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ解析法）、（９）欠失や挿入の場合には、電気泳動の移動度の差から変異を検出する方法などがあるが、変異の有無が判別できる方法であればよい。代替的に、遺伝子の変異または破壊は、遺伝子の改変の結果として生じるタンパク質のサイズや発現量を、野生型タンパク質のそれらと比較することによって決定され得る。具体的には、例えばウェスタンブロット法を行うことにより、このような比較を行うことができる。
　上記遺伝子の発現抑制は、当該遺伝子からｍＲＮＡへの転写の抑制、当該遺伝子からｍＲＮＡを介したポリペプチドへの翻訳の抑制（例えば、当該ｍＲＮＡの分解）、および翻訳されたポリペプチドの機能の抑制を包含している。ｍＲＮＡの分解は、上記nonsense-mediated mRNA decayから生じ得る。転写の抑制は、上記遺伝子からの転写を促進する転写因子の阻害、および転写開始因子の上記遺伝子へのアクセス阻害などによって実現され得る。翻訳の抑制は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子、または共抑制分子を用いて実現され得る。ポリペプチドの機能の抑制は、機能的なポリペプチドとの結合によって当該ポリペプチドの機能を阻害する分子（例えば、デコイ核酸、リボザイム、抗体および阻害ペプチド）によって実現され得る。
　遺伝子の発現抑制または遺伝子への変異の導入を目的としたタバコ属植物体の形質転換に使用されるベクターとしては、ベクター内に挿入されたポリヌクレオチドを植物細胞内で発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。当該ベクターとしては、例えば、アグロバクテリウムを介して植物細胞に目的のポリヌクレオチドを導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、およびｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特に、バイナリーベクター系（ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、およびｐＰＺＰ２０２など）のプラスミドが好ましい。
　遺伝子の発現抑制をＲＮＡｉによって実現する場合、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制するために使用されるトリガー配列が変異として、上記ベクターに挿入される。当該トリガー配列は、例えば、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）の一部である、連続する少なくとも２１～３０塩基（例えば、２１塩基以上、２２塩基以上、２３塩基以上、２４塩基以上、２５塩基以上、２６塩基以上、２７塩基以上、２８塩基以上、２９塩基以上、および３０塩基以上）の塩基配列に示されるポリヌクレオチド（センスＲＮＡ部分）、ならびに当該ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列に示されるポリヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ部分）である。上述の「連続する少なくとも２１～３０塩基」の塩基配列は、より詳細には、連続する２１塩基以上、２３塩基以上、２５塩基以上、３０塩基以上、３５塩基以上、４０塩基以上、４５塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上、８０塩基以上、９０塩基以上、または１００塩基以上の塩基配列を意味する。
　上記（転写、翻訳またはポリペプチドの機能の）抑制は、例えば、当該抑制を実現するための分子を植物体に直接に導入すること、または当該分子をコードする核酸分子を植物体に導入すること（植物体の形質転換）によって、実現され得る。ここで、植物体の形質転換の結果として、上記核酸分子は、当該植物体のゲノムにおける１つ以上の任意の領域に組み込まれる。タバコ属植物体が複二倍体であるニコチアナ・タバカムの場合、上記抑制が実現される限り、植物体の形質転換の結果として、上記核酸分子が、ＳゲノムおよびＴゲノムの両方に組み込まれている必要はない。
　（機能抑制）
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、JOX遺伝子のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる内在性遺伝子の機能が抑制されている。本明細書において使用する用語「内在性遺伝子の機能抑制」は、ゲノム上にある遺伝子が本来の機能を発揮しない状態を意味する。したがって、「内在性遺伝子の機能抑制」は、「内在性遺伝子の変異」、「内在性遺伝子の破壊」、および当該内在性遺伝子以外（外来遺伝子を包含する）による当該「内在性遺伝子の発現抑制」を包含する用語である。また、機能抑制を特異的に引き起こすとは、目的遺伝子以外の機能を抑制することなく目的遺伝子の機能のみを抑制することをいう。例えば、JOX遺伝子の機能抑制によって、同一の転写因子の制御下にある複数の遺伝子も同時に機能抑制し、代謝異常を引き起こすことなどは回避することが望ましい。
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体において、上記機能抑制は、野生型植物体と比べたときの、上記内在性JOX遺伝子のコード領域から翻訳される本来の機能的なポリペプチドの存在量の減少であってもよい。
　ポリペプチドの「存在量の減少」は、野生型ポリペプチドの存在量を基準にして、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の当該ポリペプチドの存在を意味する。上記野生型ポリペプチドの存在量を基準にした上記ポリペプチドの存在量は、タバコ属植物体において上記機能抑制がもたらされるように、上述の値から、適宜選択され得る。
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体における上述のポリペプチドの存在量の減少は、当該タバコ属植物体から得られる、培養細胞、カルス、プロトプラスト、種子、および子孫において、遺伝的に安定して受け継がれていることが好ましい。したがって、本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、人為的な操作を介して生成された培養細胞、カルス、プロトプラスト、種子、および子孫から発生した個体であり得、当該個体を得るためのこれらの材料は、本発明の範囲に包含される。
　機能抑制は、野生型植物体と比べたときの、本来の機能的な上記ポリペプチドの翻訳の減少であってもよい。ポリペプチドの翻訳は、ｍＲＮＡの減少（ｍＲＮＡ自身の不安定性、ｍＲＮＡの分解促進もしくはｍＲＮＡの転写の抑制などのｍＲＮＡの存在量などに起因する）またはｍＲＮＡからの翻訳量の減少（翻訳構成要素（ｔＲＮＡおよびリボソーム）の欠乏、リクルートの阻害、または機能的な欠損などに起因する）に基づいて生じる。
　上記機能抑制は、野生型植物体と比べたときの、上記JOX遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在量の減少であってもよい。ｍＲＮＡの転写量の減少は、例えば、内在性遺伝子からのｍＲＮＡへの転写の抑制によって生じる。転写の抑制は、上記内在性遺伝子に対する変異の導入の結果として生じる、転写開始因子の当該内在性遺伝子へのアクセス阻害などによって実現され得る。
　上記機能抑制は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進であってもよい。ｍＲＮＡの分解は、異常なｍＲＮＡの生成（nonsense-mediated mRNA decayを起こす）、ｍＲＮＡを分解する外来因子の存在、ｍＲＮＡを分解する内因性の構成要素の活性化、またはｍＲＮＡにおける分解促進配列の存在などによって引き起こされ得る。上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解が促進されると、上記タバコ属植物体内の上記ｍＲＮＡは減少することになる。すなわち、上記タバコ属植物体において、上記機能抑制は、野生型植物体と比べたときの、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量の減少であってもよい。ここで「内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在量の減少」は、野生型植物体における当該内在性遺伝子の転写物の存在量を基準にして、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の当該転写物の存在を意味する。
　上記タバコ属植物体において、上記変異は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記内在性遺伝子の存在する領域外への挿入であってもよい。上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子であってもよい。
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、内在性JOX遺伝子をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる内在性遺伝子の機能が抑制されている。
　ストリンジェントな条件は、いわゆるヌクレオチド配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドは形成されるが、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドの形成が著しく抑制される条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士のハイブリッド、例えばプローブと完全一致した２本鎖ポリヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件を挙げることができる。一例を示すと、０．２５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，７%ＳＤＳ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６～２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，１%ＳＤＳ，１ｍＭ　ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。例えば、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）などを参照することにより、こうした遺伝子を容易に取得することができる。
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、タバコ（Nicotiana）属に属する植物体であれば特に限定されず、例えば、ニコチアナ・アカウリス（Nicotiana acaulis）、ニコチアナ・アカミナタ（Nicotiana acuminata）、ニコチアナ・アカミナタ・ヴァリエーション・ムルツユロラ（Nicotiana acuminata var. multzjlora）、ニコチアナ・アフリカナ（Nicotiana africana）、ニコチアナ・アラタ（Nicotiana alata）、ニコチアナ・アンプレクシカウリス（Nicotiana amplexicaulis）、ニコチアナ・アレンツィイ（Nicotiana arentsii）、ニコチアナ・アテヌアタ（Nicotiana attenuata）、ニコチアナ・ベナビデシイ（Nicotiana benavidesii）、ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）、ニコチアナ・ビゲロビイ（Nicotiana bigelovii）、ニコチアナ・ボナリエンシス（Nicotiana bonariensis）、ニコチアナ・カビコラ（Nicotiana cavicola）、ニコチアナ・クレベランディイ（Nicotiana clevelandii）、ニコチアナ・コルディフォリア（Nicotiana cordifolia）、ニコチアナ・コリンボサ（Nicotiana corymbosa）、ニコチアナ・デブネイ（Nicotiana debneyi）、ニコチアナ・エクセルシオール（Nicotiana excelsior）、ニコチアナ・フォゲッチアナ（Nicotiana forgetiana）、ニコチアナ・フラグランス（Nicotiana fragrans）、ニコチアナ・グラウカ（Nicotiana glauca）、ニコチアナ・グルチノサ（Nicotiana glutinosa），ニコチアナ・グッドスピーディイ（Nicotiana goodspeedii）、ニコチアナ・ゴセイ（Nicotiana gossei）、ニコチアナ・イングルバ（Nicotiana ingulba）、ニコチアナ・カワカミイ（Nicotiana kawakamii）、ニコチアナ・ナイチアナ（Nicotiana knightiana）、ニコチアナ・ラングスドルフィ（Nicotiana langsdorfi）、ニコチアナ・リニアリス（Nicotiana linearis）、ニコチアナ・ロンギフロラ（Nicotiana longiflora）、ニコチアナ・マリチマ（Nicotiana maritima）、ニコチアナ・メガロシフォン（Nicotiana megalosiphon）、ニコチアナ・ミエルシイ（Nicotiana miersii）、ニコチアナ・ノクチフロラ（Nicotiana noctiflora）、ニコチアナ・ヌディカウリス（Nicotiana nudicaulis）、ニコチアナ・オブツシフォリア（Nicotiana obtusifolia）、ニコチアナ・オクシデンタリス（Nicotiana occidentalis）、ニコチアナ・オクシデンタリス・サブスピーシーズ・ヘスペリス（Nicotiana occidentalis subsp. Hesperis）、ニコチアナ・オトフォラ（Nicotiana otophora）、ニコチアナ・パニクラタ（Nicotiana paniculata）、ニコチアナ・パウクツユロラ（Nicotiana pauczjlora）、ニコチアナ・ペチュニオイデス（Nicotiana petunioides）、ニコチアナ・プランバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）、ニコチアナ・クアドリヴァルヴィス（Nicotiana quadrivalvis）、ニコチアナ・レイモンディイ（Nicotiana raimondii）、ニコチアナ・レパンダ（Nicotiana repanda）、ニコチアナ・ロズラタ（Nicotiana rosulata）、ニコチアナ・ロズラタ・サブスピーシーズ・イングルバ（Nicotiana rosulata subsp. Ingulba）、ニコチアナ・ロツンディフォリア（Nicotiana rotundifolia）、ニコチアナ・ルスチカ（Nicotiana rustica）（マルバタバコ）、ニコチアナ・セッチェルリイ（Nicotiana setchellii）、ニコチアナ・シムランス（Nicotiana simulans），ニコチアナ・ソラニフォリア（Nicotiana solanifolia）、ニコチアナ・スペガウイニイ（Nicotiana spegauinii）、ニコチアナ・ストックトニイ（Nicotiana stocktonii）、ニコチアナ・スアヴェオレンス（Nicotiana suaveolens）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・チルシフロラ（Nicotiana thyrsiflora）、ニコチアナ・トメントサ（Nicotiana tomentosa）、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）、ニコチアナ・トリゴノフィラ（Nicotiana trigonophylla）、ニコチアナ・アンブラティカ（Nicotiana umbratica）、ニコチアナ・アンドゥラタ（Nicotiana undulata）、ニコチアナ・ベルンチナ（Nicotiana velutina）、ニコチアナ・ウィガンディオイデス（Nicotiana wigandioides）、およびタバコ属植物体のハイブリッドなどが挙げられる。中でも葉たばこ生産の原料として用いられるニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・ルスチカが特に好ましい。また、ニコチアナ・シルベストリスも好ましく用いることができる。本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、特にニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・シルベストリスまたはニコチアナ・ルスチカに属してもよい。
　上記遺伝子の変異または破壊の結果として生じた個体は、本明細書においてタバコ属植物体の変異体（単に変異体とも記載する）と呼ばれる。タバコ属植物体のうち、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）は、複二倍体であり、親植物であるニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）由来のゲノム（「Ｓゲノム」または「Ｓサブゲノム」ともいう）およびニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）由来のゲノム（「Ｔゲノム」または「Ｔサブゲノム」ともいう）の両方を有する。ニコチアナ・タバカムにおいて、同一の名称によって表される遺伝子は、ほとんどの場合、ＳゲノムおよびＴゲノムのそれぞれに存在している。ニコチアナ・タバカムの場合、上記変異体は、ＳゲノムおよびＴゲノムのいずれかに上述の変異を有し得る。ＳゲノムおよびＴゲノムの両方に上述の変異を有していてもよい。なお、機能を欠損させるための変異は１遺伝子に１種の変異を有しても良いし、複数の変異を有していても良く、変異の種類は問わない。ニコチアナ・タバカムの場合、ＳゲノムおよびＴゲノムのそれぞれに２つずつある計４つの対立遺伝子のいずれかまたはすべてに変異を有してもよく、複数の対立遺伝子に変異が存在する場合、これらの変異は、同じでもよいし、異なっていてもよい。
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、好ましくは、
　配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６２％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子であって、さらにジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいるゲノム中の当該内在性遺伝子に機能抑制を特異的に引き起こす変異が導入されている、および／または、
　配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６２％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子であって、さらにジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいるゲノム中の当該内在性遺伝子に機能抑制を特異的に引き起こす変異が導入されている、および／または、
　配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６２％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子であって、さらにジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいるゲノム中の当該内在性遺伝子に機能抑制を特異的に引き起こす変異が導入されている。
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、交配によって得られた育種後代をさらに包含し得る。イネ、コムギ、オオムギ、ダイズをはじめ、多くの植物種で変異体を用いた育種が行われている。例えば、変異原で処理した変異体集団から単離した変異体の場合、目的の遺伝子以外にも多数の変異を有している。そのため一般的には、余分な変異を除くために戻し交雑を行う。この時、優良形質を持つ栽培品種と交配することにより、変異体の持つ形質を栽培品種に導入することで、より高付加価値を持つ栽培品種を得ることができる。変異体の持つ形質は変異に由来するため、戻し交雑を進めるためには、変異を持つ個体を選抜することが必要である。その際、目的形質（本発明においては冷感受容体ＴＲＰＭ８活性）をもたらす変異の数が少なければ少ないほど、着目すべき変異の数が減るので、戻し交雑に係る労力は軽減される。効率的な戻し交雑を進めるためには、変異の有無と変異がホモ接合型かヘテロ接合型かを簡便に検出する方法が必要である。この方法は後述する変異を検出する方法を用いて行うことができる。加えて、変異体と栽培品種間で多型を示すバックグラウンドマーカーを用いてＭＡＳ（Marker Assisted Selection）を行うことにより、栽培品種への戻り率が高い系統を少ない交雑回数で効率的に得ることができる。多型マーカーとしては、タバコで公知のＳＮＰ、ＳＳＲ（Simple Sequence Repeat）を利用することができる。必要であれば、用いるタバコのゲノム配列を解読して塩基配列の違い、反復配列数の違いを特定することにより、新たに多型マーカーを獲得、利用できる。
　〔タバコ属植物体の製造方法〕
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体の製造方法は、上記（ａ）～（ｃ）の少なくとも１つの内在性遺伝子の機能抑制を特異的に引き起こす変異を、タバコ属植物体のゲノム中の当該内在性遺伝子に導入する工程を含む。タバコ属植物体などに導入される変異の詳細は、〔タバコ属植物体〕の欄に記載されている。
　上記導入する工程は、上記（ａ）～（ｃ）の少なくとも１つの内在性遺伝子のコード領域内に上記変異を導入する工程を含んでもよい。さらに、当該導入する工程は、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施されていてもよい。特に導入する工程は変異原処理であってもよい。
　上記製造方法において、変異を有している植物体の変異体集団から、所望の表現型を示す個体をさらに選抜してもよい。個体を選抜することの例として、変異原を用いて処理した場合に得られる変異体集団（パネル）から所望の個体を選抜する手順を説明する。
　ＳゲノムおよびＴゲノムに存在する遺伝子にホモ接合型の変異を有した機能欠損したタバコ変異体は、例えば、以下の方法で獲得できる。以下では、Ｓゲノム上の１遺伝子およびＴゲノム上の１遺伝子の両方に、ホモ接合型の変異を有した機能欠損したタバコ変異体を取得する方法を、例示する。上述のようにタバコを変異原で処理し、タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコの変異体集団（パネル）を作製し、ゲノムＤＮＡを抽出する。Ｓゲノム、Ｔゲノムそれぞれの遺伝子特異的プライマーを利用して、パネルのゲノムＤＮＡから標的遺伝子（ポリヌクレオチド）を増幅し、その産物のヌクレオチド配列を決定し、ホモ接合型の変異を有する系統を選抜する。まず、Ｓゲノム、Ｔゲノムそれぞれにホモ接合型変異を有する系統（Ｍ２）を取得し、それらを交配したＦ１を作製する。さらにその自殖後代（Ｆ２）を育成し、その中からＳ、Ｔ両ゲノムともホモ接合型の変異を有する系統を取得する（二因子劣性のため１／１６の確率で得られる）。
　さらに、Ｓゲノム上の２つの遺伝子およびＴゲノム上の１つの遺伝子にホモ接合型の変異を有した機能欠損したタバコ変異体は、例えば、以下の方法で獲得できる。上述のように取得したＳ、Ｔ両ゲノムともホモ接合型の変異を有する系統に、Ｓゲノム上のもう一つの対立遺伝子にホモ接合型変異を有する系統を交配し、Ｆ１を作製する。さらにその自殖後代（Ｆ２）を育成し、その中からＳゲノム上の２遺伝子およびＴゲノム上の１遺伝子ともホモ接合型の変異を有する系統を取得する（３因子劣性のため１／６４の確率で得られる。）
　所望の表現型を示す個体の選抜は、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性の測定によって行ってもよい。
　したがって、本発明の一態様に係るタバコ属植物体の製造方法は、以下の１つ以上の工程を、さらに含んでいてもよい。
・タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコ変異体集団（パネル）を作製する工程、
・上記パネルに含まれている系統からゲノムＤＮＡを抽出する工程、
・ゲノムＤＮＡにおけるJOX遺伝子の塩基配列を決定する工程、
・ホモ接合型の変異の入った系統を、上記パネルから選抜する工程、および
・上記系統における冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を確認する工程。
　上記系統は、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を確認する工程を実施する前の任意の時点に、変異処理を施されていない系統と交配され得る。交配は、JOX遺伝子以外に存在し得る変異の排除を可能にする。特定の実施形態において、JOX遺伝子に変異を有している上記系統は、変異処理を施されていない系統（上記パネルを作製するために用いた元の系統）と、複数回戻し交配され得る。
　タバコ変異体からのゲノムＤＮＡの抽出は、公知の方法に基づいて行えばよく、市販の抽出キットを用いてもよい。また、ゲノムＤＮＡは、粗精製物であってもよいし、いくつかの精製工程を経た精製品であってもよい。
　ポリヌクレオチドの増幅は、例えばＰＣＲ法によって行うことができるが、他の公知の遺伝子増幅方法、例えば、ＬＣＲ（ligase chain reaction）法またはＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法などによって行ってもよい。
　各ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー配列は、例えば塩基配列から設計することが可能である。例えば、各JOX遺伝子（JOX-S1遺伝子、JOX-S2遺伝子またはJOX-T2遺伝子）の塩基配列との相同性解析結果から、各JOX遺伝子に特異的な領域を見つける。配列番号１の塩基配列がJOX-S1遺伝子のゲノム配列であり、配列番号４の塩基配列がJOX-S2遺伝子のゲノム配列であり、配列番号７がJOX-T2遺伝子のゲノム配列である。その領域にプライマーを設計することで、抽出されたゲノムＤＮＡから、所望のJOX遺伝子を特異的に増幅することができる。設計する部位としては、それぞれの遺伝子に特異的な領域から選択することができるが、好ましくはイントロン、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域である。
　JOX-S1遺伝子、JOX-S2遺伝子またはJOX-T2遺伝子と同様の遺伝子が、ＳゲノムまたはＴゲノム上に複数存在する場合、個々の遺伝子に特異的な領域に基づきプライマーを設計してもよく、Ｓ型またはＴ型など、各ゲノム上に存在する複数の遺伝子に共通する特異的な領域に基づきプライマー設計をしてもよい。
　プライマーの長さは、好ましくは１５塩基～３０塩基、特に好ましくは１７塩基～２５塩基である。プライマー配列は、塩基配列に特異的な領域、または両塩基配列に共通する領域の配列に基づき設計してもよい。また、変異箇所を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１またはそれ以上の置換、欠失、および／または付加を含んでいてもよい。また、プライマーは必要に応じて蛍光物質または放射性物質などで標識されていてもよい。
　増幅する各ポリヌクレオチドの長さは、後述する各種検出方法が利用可能な長さであれば特に限定されないが、例えば、２０塩基～５０００塩基、より好ましくは５０塩基～２０００塩基、さらに好ましくは１００塩基～７００塩基、よりさらに好ましくは１００塩基～５００塩基である。
　〔たばこ製品に冷涼感を付与する方法〕
　上記タバコ属植物体由来のたばこ材料を含むたばこ製品に冷涼感を付与する方法も本発明の一態様に含まれる。当該たばこ材料が冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有し、冷涼感が発現しているため、当該たばこ製品は冷涼感を付与する冷感香料を実質的に含まない。冷感香料としては、例えば、メンソール、ＷＳ－５（エチル－２－（ｐ－メンタン－３－カルボキサミド）アセテート）、ＷＳ－３（Ｎ－エチル－ｐ－メンタン－３－カルボアミド）などが挙げられる。
　〔その他の態様〕
　本発明の一態様は、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有するタバコ属植物体の決定方法を提供する。当該決定方法は以下の工程を包含する：
　タバコ属植物体の一部を採取することによって、サンプルを入手する工程；
　当該サンプルに含まれているゲノム上にある上記内在性JOX遺伝子の機能抑制を特異的に引き起こす変異を検出する工程；および
　上記変異が検出されたタバコ属植物体を、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有するタバコ属植物体として決定する工程。
　冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有するタバコ属植物体の決定方法において、当該機能抑制は、タバコ属植物体の葉たばこまたは乾燥葉に冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を付与する。つまり、上記決定方法は、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有するタバコ属植物体の製造方法などに利用される。
　本発明の一態様は、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有するタバコ属植物体の育種方法を提供する。当該方法は、上記冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有するタバコ属植物体の決定方法によって決定された、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有するタバコ属植物体を交配させる工程を包含する。
　多くの植物種において変異体を用いた育種が行われている。例えば、変異原を用いて処理した変異体集団から単離した変異体は、対象とする遺伝子以外に多数の変異を有している。そのため一般的には、余分な変異を除くために戻し交雑を行う。この交雑において、優良な形質を保有している栽培品種と、上記変異体を交配させることによって、当該変異体の有している所望の形質を、既存の栽培品種に導入することができる。このようにして得られた育種後代は、既存の栽培品種に高い付加価値を付与した品種であり得る。その際、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性をもたらす目的変異の数が少なければ少ないほど、着目すべき変異の数が減るので、戻し交雑に係る労力は軽減される。
　〔まとめ〕
　以上の各実施形態をまとめると、本発明は、以下のように要約され得る。
　（Ａ１）タバコ属植物体由来のたばこ材料であって、上記タバコ属植物体は、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および、
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくともいずれか１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されており、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する、たばこ材料。
　（Ａ２）タバコ属植物体由来のたばこ材料であって、上記タバコ属植物体は、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、６０％以上、好ましくは６２％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９１％以上、更に好ましくは９２％以上、更に好ましくは９３％以上、更に好ましくは９４％以上、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、更に好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは１００％の配列同一性を有し、かつジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して、６０％以上、好ましくは６２％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９１％以上、更に好ましくは９２％以上、更に好ましくは９３％以上、更に好ましくは９４％以上、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、更に好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは１００％の配列同一性を有し、かつジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および、
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して、６０％以上、好ましくは６２％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９１％以上、更に好ましくは９２％以上、更に好ましくは９３％以上、更に好ましくは９４％以上、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、更に好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは１００％の配列同一性を有し、かつジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくともいずれか１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されており、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する、たばこ材料。
　（Ａ３）タバコ属植物体由来のたばこ材料であって、上記タバコ属植物体は、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および、
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくともいずれか１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されており、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する、たばこ材料。
　（Ａ４）ＴＲＰＭ８アゴニストを含む、（Ａ１）～（Ａ３）のいずれか１つに記載のたばこ材料。
　（Ａ５）上記たばこ材料の上記冷感受容体ＴＲＰＭ８活性が、野生型のタバコ属植物体由来のたばこ材料の冷感受容体ＴＲＰＭ８活性の２倍以上である、（Ａ１）～（Ａ４）のいずれか１つに記載のたばこ材料。
　（Ａ６）乾燥材料である、（Ａ１）～（Ａ５）のいずれか１つに記載のたばこ材料。
　（Ａ７）乾燥材料の粉末である、（Ａ１）～（Ａ６）のいずれか１つに記載のたばこ材料。
　（Ａ８）上記乾燥材料が、上記タバコ属植物体から収穫された葉たばこの乾燥葉である、（Ａ６）または（Ａ７）に記載のたばこ材料。
　（Ａ９）上記乾燥材料が、上記タバコ属植物体から収穫された葉たばこを空気乾燥させることにより得られた乾燥葉である、（Ａ６）～（Ａ８）のいずれか１つに記載のたばこ材料。
　（Ａ１０）上記タバコ属植物体が、ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・シルベストリス、またはニコチアナ・ルスチカに属する、（Ａ１）～（Ａ９）のいずれか１つに記載のたばこ材料。
　（Ａ１１）上記タバコ属植物体が、ニコチアナ・タバカムに属する、（Ａ１）～（Ａ１０）のいずれか１つに記載のたばこ材料。
　（Ａ１２）（ａ）に記載の内在性遺伝子および（ｃ）に記載の内在性遺伝子の両方に、機能抑制を特異的に引き起こす変異が導入されている、（Ａ１）～（Ａ１１）のいずれか１つに記載のたばこ材料。
　（Ａ１３）（ｂ）に記載の内在性遺伝子および（ｃ）に記載の内在性遺伝子の両方に、機能抑制を特異的に引き起こす変異が導入されている、（Ａ１）～（Ａ１１）のいずれか１つに記載のたばこ材料。
　（Ａ１４）（ａ）に記載の内在性遺伝子、（ｂ）に記載の内在性遺伝子、および（ｃ）に記載の内在性遺伝子の全てに、機能抑制を特異的に引き起こす変異が導入されている、（Ａ１）～（Ａ１１）のいずれか１つに記載のたばこ材料。
　（Ｂ１）（Ａ１）～（Ａ１４）のいずれか１つに記載のたばこ材料を含む、たばこ製品。
　（Ｃ１）（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくともいずれか１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている、タバコ属植物体。
　（Ｃ２）（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、６０％以上、好ましくは６２％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９１％以上、更に好ましくは９２％以上、更に好ましくは９３％以上、更に好ましくは９４％以上、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、更に好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは１００％の配列同一性を有し、かつジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して、６０％以上、好ましくは６２％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９１％以上、更に好ましくは９２％以上、更に好ましくは９３％以上、更に好ましくは９４％以上、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、更に好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは１００％の配列同一性を有し、かつジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および、
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して、６０％以上、好ましくは６２％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９１％以上、更に好ましくは９２％以上、更に好ましくは９３％以上、更に好ましくは９４％以上、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、更に好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは１００％の配列同一性を有し、かつジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくともいずれか１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている、タバコ属植物体。
　（Ｃ３）（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および、
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくともいずれか１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている、タバコ属植物体。
　（Ｃ４）上記タバコ属植物体が、ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・シルベストリス、またはニコチアナ・ルスチカの、いずれか一つである、（Ｃ１）～（Ｃ３）のいずれか１つに記載の、タバコ属植物体。
　（Ｃ５）上記タバコ属植物体が、ニコチアナ・タバカムに属する、（Ｃ１）～（Ｃ４）のいずれか１つに記載のタバコ属植物体。
　（Ｃ６）（ａ）に記載の内在性遺伝子および（ｃ）に記載の内在性遺伝子の両方に、機能抑制を特異的に引き起こす変異が導入されている、（Ｃ１）～（Ｃ５）のいずれか１つに記載のタバコ属植物体。
　（Ｃ７）（ｂ）に記載の内在性遺伝子および（ｃ）に記載の内在性遺伝子の両方に、機能抑制を特異的に引き起こす変異が導入されている、（Ｃ１）～（Ｃ５）のいずれか１つに記載のタバコ属植物体。
　（Ｃ８）（ａ）に記載の内在性遺伝子、（ｂ）に記載の内在性遺伝子、および（ｃ）に記載の内在性遺伝子の全てに、機能抑制を特異的に引き起こす変異が導入されている、（Ｃ１）～（Ｃ５）のいずれか１つに記載のタバコ属植物体。
　（Ｃ９）上記機能抑制を特異的に引き起こす変異が、変異原処理、ゲノム編集、または遺伝子ノックアウトによって導入されている、（Ｃ１）～（Ｃ８）のいずれか１つに記載のタバコ属植物体。
　（Ｃ１０）上記機能抑制を特異的に引き起こす変異が、ジャスモン酸への応答亢進を、特異的に引き起こす、（Ｃ１）～（Ｃ９）のいずれか１つに記載のタバコ属植物体。
　（Ｄ１）たばこ製品に清涼感または冷涼感を付与する方法であって、上記たばこ製品はタバコ属植物体由来のたばこ材料を含み、上記タバコ属植物体は、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくとも１つの内在性遺伝子に、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されており、上記たばこ材料は冷感香料を実質的に含まず、冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する、方法。
　（Ｄ２）たばこ製品に清涼感または冷涼感を付与する方法であって、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる内在性遺伝子、
の少なくとも１つの内在性遺伝子の機能抑制を特異的に引き起こす変異を、タバコ属植物体に導入して、前記タバコ属植物体の変異体を製造する工程と、
　前記変異体に由来するたばこ材料をたばこ製品に組み込む工程と
を含み、上記たばこ材料は冷感香料を実質的に含まず、上記たばこ材料は冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する、方法。
　（Ｄ３）上記少なくとも１つの内在性遺伝子が、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、６０％以上、好ましくは６２％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９１％以上、更に好ましくは９２％以上、更に好ましくは９３％以上、更に好ましくは９４％以上、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、更に好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは１００％の配列同一性を有し、かつジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して、６０％以上、好ましくは６２％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９１％以上、更に好ましくは９２％以上、更に好ましくは９３％以上、更に好ましくは９４％以上、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、更に好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは１００％の配列同一性を有し、かつジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および、
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対して、６０％以上、好ましくは６２％以上、より好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９１％以上、更に好ましくは９２％以上、更に好ましくは９３％以上、更に好ましくは９４％以上、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９６％以上、更に好ましくは９７％以上、更に好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは１００％の配列同一性を有し、かつジャスモン酸の水酸化反応を触媒する活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくとも１つである、（Ｄ１）または（Ｄ２）に記載の方法。
　（Ｄ４）上記少なくとも１つの内在性遺伝子が、
　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および、
　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子
の少なくとも１つである、（Ｄ１）または（Ｄ２）に記載の方法。
　（Ｄ５）上記たばこ材料が乾燥材料である、（Ｄ１）～（Ｄ４）のいずれか１つに記載の方法。
　（Ｄ６）上記たばこ材料が乾燥材料の粉末である、（Ｄ１）～（Ｄ５）のいずれか１つに記載の方法。
　（Ｄ７）上記乾燥材料が、上記タバコ属植物体から収穫された葉たばこの乾燥葉である、（Ｄ５）または（Ｄ６）に記載の方法。
　（Ｄ８）上記乾燥材料が、上記タバコ属植物体から収穫された葉たばこを空気乾燥させることにより得られた乾燥葉である、（Ｄ５）～（Ｄ７）のいずれか１つに記載の方法。
　（Ｄ９）上記タバコ属植物体が、ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・シルベストリス、またはニコチアナ・ルスチカに属する、（Ｄ１）～（Ｄ８）のいずれか１つに記載の方法。
　（Ｄ１０）上記タバコ属植物体が、ニコチアナ・タバカムに属する、（Ｄ１）～（Ｄ９）のいずれか１つに記載の方法。
　（Ｄ１１）上記少なくとも１つの内在性遺伝子が、（ａ）に記載の内在性遺伝子および（ｃ）に記載の内在性遺伝子の両方である、（Ｄ１）～（Ｄ１０）のいずれか１つに記載の方法。
　（Ｄ１２）上記少なくとも１つの内在性遺伝子が、（ｂ）に記載の内在性遺伝子および（ｃ）に記載の内在性遺伝子の両方である、（Ｄ１）～（Ｄ１０）のいずれか１つに記載の方法。
　（Ｄ１３）上記少なくとも１つの内在性遺伝子が、（ａ）に記載の内在性遺伝子、（ｂ）に記載の内在性遺伝子、および（ｃ）に記載の内在性遺伝子の全てである、（Ｄ１）～（Ｄ１０）のいずれか１つに記載の方法。
　〔実施例１〕タバコJOX変異体の作出
　タバコ（Nicotiana tabacum）品種「つくば１号」のゲノム配列を解析し、Sサブゲノムに由来すると考えられるNtJOX-S1（ゲノム配列：配列番号１、CDS配列：配列番号２、推定アミノ酸配列：配列番号３）およびNtJOX-S2（ゲノム配列：配列番号４、CDS配列：配列番号５、推定アミノ酸配列：配列番号６）、Ｔサブゲノムに由来すると考えられるNtJOX-T2（ゲノム配列：配列番号７、CDS配列：配列番号８、推定アミノ酸配列：配列番号９）を同定した。EMS処理により作出したタバコ品種「つくば１号」の変異体集団を解析した。そして、NtJOX-S1、NtJOX-S2またはNtJOX-T2に変異を有するタバコ変異体を、各遺伝子につき3系統を見出した。
　より詳細には、NtJOX-S1については配列番号１に示すゲノム配列の2427番目のCがTに置換することにより第２エキソンにナンセンス変異が生じたNtJOX-S1-1系統を見出した。また、配列番号１に示すゲノム配列の2378番目のGがAに置換することにより第２エキソンにナンセンス変異が生じたNtJOX-S1-2系統を見出した。また、配列番号１に示すゲノム配列の2337番目のCがTに置換することにより第２エキソンにナンセンス変異が生じたNtJOX-S1-3系統を見出した。NtJOX-S2については、配列番号４に示すゲノム配列の1258番目のGがAに置換することにより第１エキソンにナンセンス変異が生じたNtJOX-S2-1系統を見出した。また、配列番号４に示すゲノム配列の2335番目のCがTに置換することにより第２エキソンにナンセンス変異が生じたNtJOX-S2-2系統を見出した。また、NtJOX-S2-1と同様に、配列番号４に示すゲノム配列の1258番目のGがAに置換することにより第１エキソンにナンセンス変異が生じたNtJOX-S2-3系統を見出した。NtJOX2-Tについては、配列番号７に示すゲノム配列の1196番目のCがTに置換することにより第１エキソンにナンセンス変異が生じたNtJOX-T2-1系統を見出した。また、配列番号７に示すゲノム配列の2677番目のGがAに置換することにより第２イントロンの５’側にスプライシング変異が生じたNtJOX-T2-2系統を見出した。また、配列番号７に示すゲノム配列の1322番目のCがTに置換することにより第１エキソンにナンセンス変異が生じたNtJOX-T2-3系統を見出した。
　上述で見出した系統のM2世代について個体ごとにDNAを抽出した。このDNAを鋳型として表１に示すプライマーを用いてPCRを行い、シークエンス解析により増幅産物の配列を決定し、変異をホモ接合で有する個体を選抜した。PCRにはKOD One（登録商標）PCR Masteｒ Mix（TOYOBO社）を使用した。
　NtJOX-S1-1系統とNtJOX-T2-1系統とを交配しF1世代を得た（NtJOX1-F1-1系統）。NtJOX-S1-2系統とNtJOX-T2-2系統とを交配しF1世代を得た（NtJOX1-F1-2系統）。NtJOX-S2-1系統とNtJOX-T2-１系統とを交配しF1世代を得た（NtJOX2-F1-1系統）。NtJOX-S2-2系統とNtJOX-T2-2系統とを交配しF1世代を得た（NtJOX2-F1-2系統）。各F1世代を育成して自殖しF2世代を得た（NtJOX1-F2-1系統, NtJOX1-F2-2系統, NtJOX2-F2-1系統, NtJOX2-F2-2系統）。
　上記F2世代について、変異をホモ接合で有する個体を、ｉＳｅｑ　１００（イルミナ社）を用いたシークエンス解析によって選抜した。シークエンス解析およびシークエンス解析用のライブラリ調整（2-step tailed PCR法）は、以下に記載の手順で実施した。
　上記F2世代について、個体ごとにDNAを抽出した。このＤＮＡを鋳型として、表１に示すプライマーを用いてPCRを実施し、変異周辺の配列を増幅し、増幅産物を得た。ｉＳｅｑ　１００（イルミナ社）を用いたシークエンス解析に供試するため、当該増幅産物に、さらに解析用のアダプター配列（5’末端側―P7配列、またはP5配列―個体ごとのバーコード配列―シークエンスプライマー結合配列―上記オーバーハング配列―3’末端側）を付加するPCRを行い、シークエンス解析用のライブラリを調整した。次に、上記ライブラリを、ｉＳｅｑ　１００（イルミナ社）を用いたシークエンス解析に供し、配列情報を決定し、変異をホモ接合で有する個体を選抜した。
　その結果、NtJOX-S1およびNtJOX-T2の両遺伝子に変異をホモ接合で有する個体joxs1joxt2-1およびjoxs1joxt2-2を見出した。また、NtJOX-S2およびNtJOX-T2の両遺伝子に変異をホモ接合で有する個体joxs2joxt2-1およびjoxs2joxt2-2を見出した。これらの個体について自殖してF3種子を得た。
　〔評価例１－１〕タバコＪＯＸ変異体のglandular trichome数の測定
　実施例１で得られたJOX変異体4系統（joxs1joxt2-1, joxs1joxt2-2, joxs2joxt2-1, joxs2joxt2-2のF3世代）、および対照としてつくば１号、を温室で栽培した。播種後１３週目の各系統について、実体顕微鏡で観察し、葉（上から数えて５枚目の展開葉）の周縁1cmに存在するglandular trichomeの数を、葉１枚につき４か所カウントし、その平均値を得た。その結果、4系統のJOX変異体は、いずれも葉面樹脂成分を分泌するgrandular trichomeの数が、有意に増加している（Tukey-kramer検定で1%水準）ことが明らかとなった（図１）。
　〔評価例１－２〕タバコJOX変異体の葉面樹脂成分量の測定
　植物に含まれる香気成分を収集する方法として、水蒸気蒸留法が一般に用いられる。たばこ葉を水蒸気蒸留することにより、多くの葉面樹脂成分が含まれる精油を取得できる。葉面樹脂成分を含む精油量は、たばこ葉の香喫味成分量の指標の一つとなる。そこで、水蒸気蒸留法によって、実施例１で得られた各タバコJOX変異体の葉面樹脂成分量を測定した。
　植物材料として、慣行法に従い圃場で栽培したJOX変異体joxs1joxt2-1系統、および対照としてつくば１号を用いた。joxs1joxt2-1、およびつくば１号について、収穫適期の中上位葉の5kg（生葉）を用いて、水蒸気蒸留を実施し、精油を取得した。より詳細には、蒸留釜に35Lの水道水を入れ、ボイラーを用い100度に沸騰させた。沸騰後、一度ボイラーを停止し、生葉5kgが入ったカゴを蒸留釜へ入れた。この時、生葉の入ったカゴが水に浸からない位置に固定した。蒸留釜の蓋を閉め、ボイラーの運転を再開し、2時間の間蒸留作業を行った。チラーは20度に設定した。2時間の蒸留により得られた水蒸気蒸留水を捕集し20% (w/w)の食塩を添加した。処理後の水蒸気蒸留水に1L酢酸エチルを添加し、分液漏斗を用い液液転溶した。酢酸エチル層を捕集し、ロータリーエバポレータを用い濃縮し、乾固物を得た。得られた精油は、joxs1joxt2-1で約30mg/kg、つくば１号で約12mg/kgであり、JOX変異体において、2倍以上の増加が確認された。
　また、joxs1joxt2-1およびつくば１号について、適期収穫後に黄色乾燥を実施した乾葉300gを用いて、水蒸気蒸留を実施し、精油を取得した。より詳細には、寸胴鍋に4Lの水道水を入れ、IHヒーターを用い100度に沸騰させた。沸騰後、一度加熱を停止し、収穫葉300gを鍋に投入した。この時、収穫葉は水に浸からない位置に固定した。寸胴鍋の蓋を閉め、ボイラーの運転を再開し、2時間の間、蒸留作業を行った。コンデンサーには水道をつなぎ、水道水を通すことで、チラーとした。100分間の蒸留により得られた水蒸気蒸留水を捕集し、20% (w/w)の食塩を添加した。処理後の水蒸気蒸留水に1L酢酸エチルを添加し、分液漏斗を用い液液転溶した。酢酸エチル層を捕集し、ロータリーエバポレータを用い濃縮し、乾固物を得た。得られた精油はjoxs1joxt2-1が約670mg/kg、つくば１号が約380mg/kgであった。すなわち、乾葉においてもJOX変異体では精油が2倍程度増加していることが明らかとなった。
　さらに、水蒸気蒸留法とは異なる、以下の方法により葉面樹脂成分の取得を試みた。joxs1joxt2-1、およびつくば１号について、黄色乾燥葉20gを400mlのエタノール、またはヘキサンに、常温で5分間漬浸した。溶液をろ過後、エバポレーションを行って、乾固物を得た。得られた葉面樹脂成分は、エタノール溶媒の場合、joxs1joxt2-1が約576mg、つくば１号が367mg、ヘキサン溶媒の場合joxs1joxt2-1が約180mg、つくば１号が158mgであった。すなわち、joxs1joxt2-1において葉面樹脂成分が増加していることを裏付ける結果となった。
　〔評価例１－３〕タバコJOX変異体の成分分析
　葉面樹脂成分の代表的な成分として、α-センブラトリエンジオール（以下、α-CBTとも記載する）の分析をGC-MSにより行った。材料として、慣行法により圃場栽培を行った、実施例１で得られたJOX変異体joxs1joxt2-1系統、および対照としてつくば１号を用いた。圃場栽培は、1年目、および2年目の2回実施した。
　適期に収穫を行った中上位葉の黄色乾燥を実施した。1個体あたり4枚程度の黄色乾燥葉を3個体分バルクにし、計12枚程度を1反復とした。joxs1joxt2-1は、1年目の圃場栽培サンプルは3反復、または2年目の圃場栽培サンプルは5反復、つくば１号は、各年とも3反復、作出した。除骨後のラミナを粉砕し、α-CBTの分析を行った。
　1年目の圃場栽培サンプルでは、対照のつくば１号に対し、joxs1joxt2-1は有意な増加を示した（t検定で1%水準）（図２）。また、同様に分析を行ったアメリカ産黄色乾燥葉（FCV/US）およびブラジル産黄色乾燥葉（FCV/BR）よりも高い値を示した。
　また、2年目の圃場栽培サンプルでは、乾燥方法、および収穫期による、葉面樹脂成分量への影響を検討した。joxs1joxt2-1は、乾燥方法として、黄色乾燥を実施したサンプルと、空気乾燥を実施したサンプル、の2水準を設けた。また、joxs1joxt2-1は、中上位葉を用い、収穫期として、心止め数日後に収穫を実施した未熟葉、および適期に収穫した適熟葉の2水準を設けた。つまり、joxs1joxt2-1は、乾燥方法について2水準、収穫期について2水準をそれぞれ組合せ、計3水準を供試した。供試したjoxs1joxt2-1の3水準は、以下の通りである。
・joxs1joxt2-1_黄色乾燥_適熟：joxs1joxt2-1の適熟葉を、黄色乾燥したサンプル
・joxs1joxt2-1_空気乾燥_未熟：joxs1joxt2-1の未熟葉を、空気乾燥したサンプル
・joxs1joxt2-1_空気乾燥_適熟：joxs1joxt2-1の適熟葉を、空気乾燥したサンプル
　それぞれの水準について、反復は設けなかった。除骨後のラミナを粉砕し、α-CBTの分析を行った。その結果、対照であるつくば１号の黄色乾燥葉およびjoxs1joxt2-1の黄色乾燥葉に対し、jox1sjox2t-1の空気乾燥葉では未熟葉および適熟葉ともに大幅に増加していた。つくば１号の黄色乾燥葉と比較した場合、joxs1joxt2-1の空気乾燥葉では未熟葉では約7倍、適熟葉では約4倍であった（図３）。
　〔評価例１－４〕タバコJOX変異体の官能評価
　1年目の圃場栽培で作出したjoxs1joxt2-1の黄色乾燥葉、およびつくば１号の黄色乾燥葉を用いて、官能評価を実施した。
　黄色乾燥葉から微粉砕試料を作製し、未加香のシガレットに展着した。　
　具体的には、joxs1joxt2-1の黄色乾燥葉を微粉砕した。得られた微粉砕試料に、プロピレングリコールを微粉砕試料の重量に対し３倍の重量となるよう添加混合し、微粉末試料を作製した。微粉末試料を、未加香のシガレットのたばこ刻み0.7gに対し３重量％の添加量で展着し、たばこ製品サンプル（すなわち、joxs1joxt2-1を展着したシガレット）を作製した。
　同様に、つくば１号の黄色乾燥葉を微粉砕した。得られた微粉砕試料に、プロピレングリコールを微粉砕試料の重量に対し３倍の重量となるよう添加混合し、微粉末試料を作製した。微粉末試料を、未加香のシガレットのたばこ刻み0.7gに対し３重量％の添加量で展着し、たばこ製品サンプル（すなわち、つくば１号を展着したシガレット）を作製した。
　5名の訓練されたパネリスト（A-E）が、サンプルを展着していない未加香のシガレットに対して、各種サンプルを展着した後のシガレットの、好ましい喫味変化の程度を、3段階（0: not good, 1: good, 2: very good）で評価し、さらにその喫味特徴を記述した。
　その結果、つくば１号（すなわち、JOX遺伝子に機能抑制を伴う変異を有さない野生型）を展着したシガレットでは、パネル全員の評価が「０」であった。一方で、joxs1joxt2-1を展着したシガレットでは、「１」が３名、「２」が２名であり、joxs1joxt2-1を展着したシガレットは、好ましい香喫味を有していることが分かった。さらに、joxs1joxt2-1を展着したシガレットの喫味特徴として、５名中４名が、「冷涼感」または「清涼感」が感じられる、と記述した。
　2年目の圃場栽培で作出した「つくば１号の黄色乾燥葉」、「joxs1joxt2-1の適熟葉を黄色乾燥して得た乾燥葉」、「jox1sjox2t-1の未熟葉を空気乾燥して得た乾燥葉」、および「jox1sjox2t-1の適熟葉を空気乾燥して得た乾燥葉」から微粉砕試料を作製し、未加香のシガレットに展着した。７名の訓練されたパネリスト（A-G）が、「清涼感・冷涼感」の強さを６段階（０：清涼感なし、１～５：清涼感を感じた場合は強いほど大きい数字を付ける）で、それぞれ主観的に評価した。その結果、パネル全員が、つくば１号を展着したシガレットでは「清涼感」または「冷涼感」を認識しなかった一方で、いずれのＪＯＸ変異体サンプルを展着したシガレットにおいては、「清涼感」または「冷涼感」を認識した。また、ＪＯＸ変異体を展着したシガレットにおける「清涼感」または「冷涼感」は、黄色乾燥葉よりも空気乾燥葉で強く、適熟葉よりも未熟葉で強かった（表２）。
　さらに、評価例１－２のエタノールおよびヘキサン抽出した乾燥葉の葉面樹脂成分を、未加香のシガレットに展着した。いずれの溶媒で抽出した乾燥葉の葉面樹脂成分においても、５名の評価パネル全員が、つくば１号では「清涼感」または「冷涼感」を認識せず、joxs1joxt2-1変異体では「清涼感」または「冷涼感」を認識した。
　〔評価例１－５〕タバコJOX変異体の冷感受容体TRPM8アッセイ
　Transient receptor potential cation channel melastatin 8（TRPM8）はヒトの感覚神経上で強く発現することが確認されているTRPチャネルの一つであり、冷感の知覚に関わることが知られている。TRPM8は28℃以下の温度刺激、またはMentholもしくはIcillinをはじめとした冷感物質の投与により活性化される。活性化したTRPM8は、細胞内への陽イオン流入を引き起こし、神経細胞が脱分極することにより冷感情報を伝達する。この特性を生かし、TRPM8は新規冷感物質の同定にも活用されている。JOX変異体に含まれる成分がヒト冷感受容体（TRPM8）を活性化するか否かを以下の手順により調査した。
　まず、TRPM8安定発現細胞の構築を行った。詳細には、TRPM8発現ベクターはpF5A CMV-neo Flexi vector（Promega）のマルチクローニングサイトにヒトTRPM8発現遺伝子（NCBI Reference Sequence：NM_024080.5）を挿入することで作製した。続いて、作成したTRPM8発現ベクターをLipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）を用いてヒト胎児新細胞株HEK293T（ECACC）に導入した。得られた形質転換細胞を37℃, 5%CO2下で3日間培養後、培地を200μg/mL ジェネティシン（Thermo Fisher Scientific）を含む選択培地に置換してさらに10日間培養し、TRPM8安定発現細胞を得た。
　上記TRPM8安定発現細胞を96ウェル黒色プレート（Corning）に30000 cell/wellで播種した。37℃、5%CO2下で24時間培養後、カルシウム感受性色素Fluo-8 AM （AAT Bioquest）をTRPM8安定発現細胞に導入した。続いて、Ex/Em=480nm/520nmにおける蛍光強度変化をFDSS/μCELL（浜松ホトニクス）を用いて測定した。試験物質はHBSS（Thermo Fisher Scientific）を用いて適宜希釈し、測定開始後30秒時点で細胞上清に添加した。試験物質添加後の最大蛍光強度をTRPM8発現細胞の活性として取得した。
　（JOX変異体微粉砕試料を添加したシガレット煙中成分のアッセイ）
　供試サンプルには、未加香のシガレット（対照シガレット）と、対照シガレットに評価例１－３の１年目圃場栽培において作出したjoxs1joxt2-1の黄色乾燥葉の微粉砕試料を展着したサンプル（JOXシガレット）とを用いた。リニア型喫煙器（Cerulean社製SM410）を用いてISO 3308:2012条件で燃焼させ、各サンプル計10本の燃焼煙をケンブリッジフィルターで捕集した。ケンブリッジフィルターに10mLのエタノールを加えて30分間振とうし、0.45μm PVDFフィルターでろ過した。ろ過後のエタノール溶出液をHBSS溶液に終濃度0.3%となるよう希釈した。
　各サンプルのTRPM8活性を以下の通り算出した。まず、TRPM8(+)およびTRPM8(-)における各サンプルの最大蛍光強度を、Negative Control（捕集煙を含まない溶液）の最大蛍光強度で除することで標準化した。その後、標準化後のTRPM8(+)の値を標準化後のTRPM8(-)の値で除した値から1を引いた値（TRPM8(+)/TRPM8(-)-1）を、TRPM8活性強度とした。
　上述の手順による試験を1反復として、アッセイは2反復実施した。１反復目（Test#1）のアッセイの結果を図４に、２反復目（Test#2）のアッセイの結果を図５に示す。図４および図５において、対照シガレットはControlと表記し、JOXシガレットはCig-JOXと表記する。Test#1では、JOXシガレットのTRPM8活性は、対照シガレットのTRPM8活性の2.01倍であった。また、Test#2では、対照シガレットに対するJOXシガレットのTRPM8活性は、Test#1の時よりも大きい値を示した。
　（JOX変異体葉の内容成分のアッセイ）
　供試サンプルには、評価例１－３の２年目圃場栽培サンプルのうち、joxs1joxt2-1_黄色乾燥_適熟、joxs1joxt2-1_空気乾燥_未熟、および対照としてつくば１号を用いた。各サンプルについて、除骨後のラミナを粉砕し、粉砕試料を作製した。粉砕試料1gを15mL遠沈管に移し、ヘキサンを10mL加えた。室温で1時間振とう後、遠沈管を遠心分離して上清をナスフラスコに移した。上清を、エバポレーション（最小圧力200m bar, 湯浴35℃）し、乾固物を得た。乾固物10mgにDMSOを200μl加えて溶解後、HBSS溶液で希釈し、最終濃度が50μg/mlになるように調整した。TRPM8活性は、煙中成分のアッセイの場合と同様に算出した。
　上述の手順による試験を1反復として、アッセイは2反復実施した。１反復目（Test#1）のアッセイの結果を図６に、２反復目（Test#2）のアッセイの結果を図７に示す。Test#1およびTest#2ともに、joxs1joxt2-1_黄色乾燥_適熟サンプル、joxs1joxt2-1_空気乾燥_未熟サンプルは、対照であるつくば1号を上回るTRPM8活性を示した。
　〔評価例１－６〕タバコ属植物におけるJOX遺伝子の探索
　タバコ属植物におけるJOX遺伝子の探索のために、NCBI上でblastn ((https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome))を実施した。query配列は、NtJOX-S1, Nt-JOX-S2, NtJOX-T2のCDS配列を使用した。DatabaseはNucleotide collection (nr/nt)を使用し、対象生物種（Organisms）は、Nicotiana (taxid:4085)を選択した。
　blastnの結果得られた、JOX遺伝子と想定される遺伝子のヌクレオチド配列の一覧を、表３(query: NtJOX-S1)、表４(query: NtJOX-S2)、表５(query: NtJOX-T2)に示す。
　また、各遺伝子のヌクレオチド配列がコードする推定アミノ酸配列についても、推定アミノ酸配列のAccession、およびそれぞれのquery配列（推定アミノ酸配列）に対する配列同一性（Per. Identity）、期待値（E value）、クエリー配列のカバー率（Query Cover）（遺伝情報処理ソフトウェア GENETYX（株式会社 日本サーバ）を用いて計算した）も表３～５に示す。
　表３～５に示す配列が、JOX遺伝子であることを、アミノ酸配列を用いた系統解析により確認した。
　系統解析に使用した配列は、以下のとおりである。
　・NtJOX-S1, NtJOX-S2, NtJOX-T2の推定アミノ酸配列
　・表３～５に含まれる、ニコチアナ・タバカム（N. tabacum）、ニコチアナ・シルベストリス（N. sylvestris）、ニコチアナ・トメントシフォルミス（N. tomentosiformis）、ニコチアナ・アテヌアタ(N. attenuate)の推定アミノ酸配列
　・シロイヌナズナ（Arabidopios thaliana）におけるAtJOX1,2,3,4（Caarls et al., 2017; Smirnova et al., 2017）の推定アミノ酸配列
　シロイヌナズナにおけるAT1G05010.1配列をアウトグループに使用した。AT1G05010.1配列は、AtJOX1,2,3,4と同じ2-oxoglutarate (2OG) Fe(II)-dependent oxygenase familyに属するが、JOXと異なるクレードに分類されるアミノ酸配列である（Caarls et al., 2017）。
　作成した系統樹を図８に示す。MAFFT (a multiple sequence alignment program (cbrc.jp), Ver.7, Katoh et al., 2019)を参照の上、前記系統解析に使用した配列をアライメントした。また、Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) (Ver. 11.0.13, https://www.megasoftware.net/, Kumar et al., 2018)を利用し、最尤法（Bootstrap: 1000）で系統樹を作成した。なお、ニコチアナ・アテヌアタ(N. attenuate)の推定アミノ酸配列については、Tang et al., 2020におけるNaJOX-like-1,2,3,4との対応関係を示した。
　系統解析により、表３～５に含まれるニコチアナ・タバカム（N. tabacum）、ニコチアナ・シルベストリス（N. sylvestris）、ニコチアナ・トメントシフォルミス（N. tomentosiformis）、ニコチアナ・アテヌアタ(N. attenuate)の遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、JOX遺伝子およびそれにコードされるアミノ酸配列と推定された。
　以上より、Nicotiana属におけるJOX遺伝子は、NtJOX-S1、NtJOX-S2およびNtJOX-T2それぞれについて、アミノ酸配列で62%以上の配列同一性（Per. Identity）を有する遺伝子であることが分かった。
　〔実施例２〕JOX三重変異体の作出
　実施例１で得た、JOX変異体joxs1joxt2-1系統およびJOX変異体joxs2joxt2-1系統を交配しF1世代を得た。さらにF1世代を育成して自殖しF2世代を得た。上記F2世代について、変異をホモ接合で有する個体をサンガーシークエンスにより確認した。詳細には、F2世代の個体ごとに、DNAを抽出し、表１に示したプライマーを使用し、Tks GflexTM DNA Polymerase（タカラバイオ社）を用いたPCRにより、変異周辺の配列を増幅した。PCRに使用したプライマーを利用したサンガーシークエンスにより、増幅産物の配列を決定した。
　その結果、NtJOX-S1、NtJOX-S2およびNtJOX-T2の3遺伝子すべてに変異をホモ接合で有する個体joxs1joxs2joxt2（以下、JOX三重変異体ともいう）を見出した。JOX三重変異体の個体を自殖してF3世代を得た。JOX三重変異体のF3世代、および対照としてつくば1号を用い、慣行法に従い圃場で栽培し、圃場栽培サンプルを得た。
　〔評価例２－１〕タバコＪＯＸ三重変異体の成分分析
　ソラベチボンは、タバコにおけるファイトアレキシン（抗菌性物質）の一つであり、病虫害などの環境ストレスに応答し、タバコ属植物体中で増加することが知られている。そのため、JOX変異体系統の植物体中でのソラベチボン含有量は、JOX遺伝子の機能抑制を伴う変異によるジャスモン酸応答の亢進の評価指標とすることができる。また、ソラベチボンは、それ自身もタバコ属植物ならびにその乾燥物であるたばこ材料における、香味成分の一つとして知られている。すなわち、ソラベチボンを含有するたばこ材料は、たばこ製品の香喫味改善の観点でも有用である。そこで、実施例２で得られたJOX三重変異体において、ソラベチボンの分析およびα-CBTの分析を行った。α-CBTは、評価例１－３で分析した成分と同じである。
　実施例２で得た、つくば1号およびjoxs1joxs2joxt2系統の圃場栽培サンプルについて、評価例１－３の乾燥葉サンプル作製方法を参照し、乾燥葉サンプルを作製した。乾燥葉サンプルの作製水準として、評価例１－３と同様に、乾燥方法および収穫期により、複数の水準を設けた。乾燥方法として、黄色乾燥を実施したサンプル、および空気乾燥を実施したサンプル、の2水準を設けた。また、収穫期として、心止め3日目に収穫した中上位の未熟葉、および適期に収穫した中上位の適熟葉、の2水準を設けた。これらの水準をそれぞれ組合せ、計２水準を分析に供した。供試した2水準は、以下の通りである。
・joxs1joxs2joxt2および対照のつくば1号、それぞれの適熟葉を、黄色乾燥したサンプル
・joxs1joxs2joxt2および対照のつくば1号、それぞれの未熟葉を、空気乾燥したサンプル
　それぞれの水準について、反復は設けなかった。除骨後のラミナを粉砕し、評価例１－３と同様にGC-MSにより、ソラベチボンおよびα-CBTの分析を行った。
　GC-MS分析の結果を図９～１２に示す。図９～１２において、joxs1joxs2joxt2は「joxs1s2t2」と表記する。未熟葉を空気乾燥した水準の場合、joxs1joxs2joxt2では、対照のつくば1号に対し、α-CBT含有量が４．１倍であった（図９）。適熟葉を黄色乾燥した水準の場合、joxs1joxs2joxt2では、対照のつくば1号に対し、α-CBT含有量が２．０倍であった（図１０）。また、対照のつくば１号では、ソラベチボンはいずれの水準においても検出限界以下であったのに対し、joxs1joxs2joxt2では、いずれの水準においてもソラベチボンが検出され、joxs1joxs2joxt2において、ソラベチボン含有量が増加したことが明らかになった（図１１及び図１２）。すなわち、JOX三重変異体では、ジャスモン酸応答が亢進すると共に、香喫味改善に寄与し得る香味成分の含有量が向上したことが示唆された。
　〔評価例２－２〕JOX三重変異体の官能評価
　評価例２－１と同様、joxs1joxs2joxt2の未熟葉を空気乾燥した乾燥葉サンプルを作製した。この乾燥葉サンプルを用いて、官能評価を実施した。
　まず、joxs1joxs2joxt2の乾燥葉サンプルを微粉砕した。得られた微粉砕試料に、プロピレングリコールを微粉砕試料の重量に対し３倍の重量となるよう添加混合し、微粉末試料（以下、JOXたばこ材料サンプルとも記載する）を作製した。微粉末試料を、未加香のシガレットのたばこ刻み0.7gに対し３重量％の添加量で展着し、たばこ製品サンプル（以下、JOX展着サンプルとも記載する）を作製した。
　対照として、未加香のシガレット（以下、未展着サンプルとも記載する）を用いた。未展着サンプルには、JOXたばこ材料サンプルは展着されていない。
　34名の訓練されたパネリストが、未展着サンプルと比較して、JOX展着サンプルの「清涼感または冷涼感の強さ」を５段階（0点：清涼感なし、1点～4点：清涼感を感じた場合は強いほど大きい点数を付ける）で評価し、さらにその喫味特徴を記述した。
　JOX展着サンプルでは、「０点」が3名、「１点」が15名、「２点」が8名、「３点」が6名、「４点」が2名であり、joxs1joxs2joxt2を展着したシガレットは、「清涼感」または「冷涼感」を有していることが分かった。なお、「清涼感・冷涼感の強さ」の平均点は1.7点であった（表６）。さらに、JOX展着サンプルの喫味特徴として、パネリスト34名中18名が「清涼感」または「冷涼感」を感じた、と記述していた。
　〔実施例３〕JOX変異体を用いた例
　〔評価例３〕JOX変異体の異なる刻み配合率での官能評価
　上述した評価例１－４から、「清涼感」または「冷涼感」を発現したサンプルとして「joxs1joxt2-1系統の未熟葉・空気乾燥水準の乾燥葉サンプル」を選択し、官能評価に用いた。
　まず、上記の乾燥葉サンプルを裁刻し、カットフィラー形態のたばこ材料（以下、「JOXたばこ刻み」とも記載する）を作製した。
　標準的なたばこ刻みと、JOXたばこ刻みを混合し、以下の手順で、5水準の混合材料を作製した。JOXたばこ刻みおよび標準的なたばこ刻みは、混合材料を作製する前に、60RH％, 25℃にて、開放条件で24時間静置し、水分量が10％となるよう調和を行った。
　水準1（以下、「0%配合」とも記載する）は、標準的なたばこ刻み20gを用いた。水準1における、JOXたばこ刻みの配合割合は、湿潤重量基準で0重量％であった。
　水準2（以下、「5%配合」とも記載する）は、標準的なたばこ刻み19gに対し、JOXたばこ刻みを1g混合し、混合材料を作製した。水準2における、JOXたばこ刻みの配合割合は、湿潤重量基準で5重量％であった。
　水準3（以下、「10%配合」とも記載する）は、標準的なたばこ刻み18ｇに対し、JOXたばこ刻みを2g混合し、混合材料を作製した。水準3における、JOXたばこ刻みの配合割合は、湿潤重量基準で10重量％であった。
　水準4（以下、「15%配合」とも記載する）は、標準的なたばこ刻み17gに対し、JOXたばこ刻みを3g混合し、混合材料を作製した。水準4における、JOXたばこ刻みの配合割合は、湿潤重量基準で15重量％であった。
　水準5（以下、「20%配合」とも記載する）は、標準的なたばこ刻み16gに対し、JOXたばこ刻みを4g混合し、混合材料を作製した。水準5における、JOXたばこ刻みの配合割合は、湿潤重量基準で20重量％であった。
　各水準の混合材料を0.7g分取し、たばこセグメントおよびフィルタセグメントを備える燃焼型喫煙物品のたばこセグメントに充填し、シガレットサンプル5水準を作製した。
　５名の訓練されたパネリストが、各シガレット水準に対し、「清涼感・冷涼感の強さ」を、６段階（0点：清涼感なし、1点～5点：清涼感を感じた場合は強いほど大きい点数を付ける）で評価した。
　その結果、5名のパネリストが各シガレット水準について評価した「清涼感・冷涼感の強さ」の平均点は、０点（０％配合）、０．６点（５％配合）、１．３点（１０％配合）、１．９点（１５％配合）、１．５点（２０％配合）であった（表７）。すなわち、JOX変異体joxs1joxt2-1系統の乾燥葉を、カットフィラー形態のたばこ材料として用いたたばこ製品も、「清涼感・冷涼感」が発現することが示唆された。
　本発明は、たばこ製品に利用することができる。

Claims (11)

  1. 　タバコ属植物体由来のたばこ材料であって、
    　上記タバコ属植物体は、
    　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
    　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
    　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
    の少なくとも１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されており、
    　冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する、たばこ材料。
  2. 　ＴＲＰＭ８アゴニストを含む、請求項１に記載のたばこ材料。
  3. 　上記たばこ材料の上記冷感受容体ＴＲＰＭ８活性が、野生型のタバコ属植物体由来のたばこ材料の冷感受容体ＴＲＰＭ８活性の２倍以上である、請求項１または２に記載のたばこ材料。
  4. 　乾燥材料である、請求項１～３のいずれか１項に記載のたばこ材料。
  5. 　乾燥材料の粉末である、請求項１～３のいずれか１項に記載のたばこ材料。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のたばこ材料を含む、たばこ製品。
  7. 　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
    　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
    　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる内在性遺伝子、
    の少なくとも１つに、機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている、タバコ属植物体。
  8. 　上記タバコ属植物体が、ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・シルベストリス、またはニコチアナ・ルスチカの、いずれか一つである、請求項７に記載のタバコ属植物体。
  9. 　上記機能抑制を特異的に引き起こす変異が、変異原処理、ゲノム編集、または遺伝子ノックアウトによって導入されている、請求項７または８に記載のタバコ属植物体。
  10. 　上記機能抑制を特異的に引き起こす変異が、ジャスモン酸への応答亢進を、特異的に引き起こす、請求項７～９のいずれか１項に記載のタバコ属植物体。
  11. 　たばこ製品に冷涼感を付与する方法であって、
    　上記たばこ製品はタバコ属植物体由来のたばこ材料を含み、
    　上記タバコ属植物体は、
    　（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、
    　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
    　（ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する６０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる内在性遺伝子、
    の少なくとも１つに機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されており、
    　上記たばこ材料は冷感香料を実質的に含まず、
    　上記たばこ材料は冷感受容体ＴＲＰＭ８活性を有する、方法。
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