CN116058286A

CN116058286A - 烟草植物体及其制备方法

Info

Publication number: CN116058286A
Application number: CN202310087243.2A
Authority: CN
Inventors: 铃木庄一; 浜野香织; 佐藤正纪; 新井雅雄; 根岸勇太; 野村绫子; 塚原麻伊
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2023-05-05
Also published as: EP3437465A4; US11578336B2; BR112018070041A2; CN108882689A; WO2017170796A1; US20200392523A1; CO2018011670A2; JPWO2017170796A1; EP3437465A1; JP6386694B2; US10640780B2; US20190218564A1

Abstract

本发明提供适于为了收获烟叶而栽培的烟草植物体。本发明涉及导入了抑制腋芽发育的突变的烟草植物体、以及该烟草植物体的制备方法。

Description

烟草植物体及其制备方法

本申请是申请日为2017年3月29日、申请号为201780021047.8、发明名称为“烟草植物体及其制备方法”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及适于为了收获烟叶而栽培的烟草植物体及其制备方法。

背景技术

种子植物在其生长过程中，种子的胚发育而形成子叶及芽顶端分生组织(shootapical meristem)。通过上述芽顶端分生组织的细胞分裂，逐步形成叶原基(leafprimordium)，在叶原基的近轴侧(adaxial side)形成腋生分生组织(axillarymeristem)。腋生分生组织由此作为芽顶端分生组织而发挥功能，成为腋芽(axillaryBud)。在植物体的营养生长时，腋芽的发育通常暂时处于休眠状态(受到了抑制)。初生茎(primary shoot)的芽顶端分生组织在从营养生长状态转变为生殖生长状态时、或者在死亡时，腋芽的发育从休眠状态苏醒，受到促进。对于腋芽的发育，在茄科植物(例如，番茄及烟草)、其它植物(例如，稻及拟南芥)中有多项研究报道。

作为用于收获叶的栽培植物的烟草植物，在其栽培中，为了提高收获叶的质和量(例如，收获叶的内含成分的积累、成熟及展开)而实施打顶(将带有花的顶端部的茎切除)。实施打顶后，烟草植物从叶的根部(叶腋)等开始旺盛的腋芽发育。腋芽的发育当然需要消耗营养成分，因此供给至收获叶的营养成分相对减少。由此，腋芽的发育及生成会导致收获叶的品质及产量的降低。出于与打顶相同的原因，在从打顶至收获叶的期间，对腋芽进行除去或抑制发育等处理。需要说明的是，至少对于烟草植物而言，抑制即使暂时除去腋芽，腋芽也会从相同的叶的根部反复发育，在用于收获烟叶的烟草植物的栽培中，腋芽的处理是有待解决的重要问题。

作为除去腋芽的方法，可以举出通过手工操作或机械进行摘取。通过手工操作进行摘取存在需要巨大的劳动力(及与此相伴的人工费的增加)、以及效率低的问题。利用机械进行摘取存在操作的准确率比手工操作差而损伤植物体的问题。另外，作为抑制腋芽发育的方法，可以举出使用农药及利用基因修饰进行抑制。农药的使用存在为了保持效果而反复散布、对植物体的生长造成影响、因农药残留而对收获叶造成影响、以及残留农药的检测成本增大的问题。

这里，关于腋芽的发育，在专利文献1、2及非专利文献1～19中有所公开。专利文献1及2公开了用于抑制腋芽的发育的技术。

以下，基于非专利文献1～19，对于与腋芽的原基形成相关的基因进行说明。

作为与腋芽的原基形成相关的基因，有来自除烟草以外的植物的多个基因的报道。作为代表性的基因，可以列举：LATERAL SUPPLESSOR(LS)、Blind(Bl)、REVOLUTA(REV)、CUP-SHAPED COTYLEDON(CUC)。

已经报道了从拟南芥(非专利文献1)、番茄(非专利文献2)、稻(非专利文献3)中分离LS，其是腋芽原基形成的必要基因。在拟南芥的LS基因的突变体中，茎性叶的腋芽是正常的，但除了上部2片以外的莲座叶基本上观察不到腋芽(非专利文献1)。在番茄的LS基因的突变体中，营养生长期(vegetative stage)的腋芽消失，但在生殖生长期(reproductivestage)中形成了上部2个部位的腋芽(非专利文献2)。在稻的LS基因的突变体(moc1)中，在营养生长期(tillering stage)、生殖生长期(heading stage)中均完全观察不到与稻的腋芽相当的分蘖(tiller)(非专利文献3)。对于烟草而言，虽然已经公开了推测为LS直向同源基因(ortholog gene)的cDNA序列(收录号：EU0935581.1)，但尚未在烟草中对该基因的功能进行确认。

Bl的基因从拟南芥(非专利文献4及5)、番茄(非专利文献6)中分离。在番茄中，由于1个基因的突变体，在进行了摘心的情况下，也与叶位无关地基本上不形成腋芽(非专利文献6及7)。在拟南芥中，作为Bl直向同源，报道了至少3个功能重复的基因(REGULATOR OFAXILLARY MERISTEM(RAX)1、2及3)。即使是RAX1单独突变体也观察到了抑制，在3重突变体中，在莲座叶基本上不形成腋芽，茎性叶的腋芽也大幅减少(非专利文献4及5)。在RAX1单独突变体中，即使在切除初生茎之后，也没有观察到从未见到形成腋芽的下部莲座叶生长腋芽(outgrowth)。根据拟南芥的RAX基因序列、以及从葡萄及番茄的基因组序列推测出的推定氨基酸序列的相同性比较，可以推测拟南芥的RAX1的番茄的直向同源基因除了Blind以外还有C基因。但是，C基因不是与腋芽的形成、而是与叶的形成相关的基因(非专利文献8)。在烟草中，没有推测为Bl直向同源基因的cDNA序列的报道，但公开了与番茄Bl的氨基酸序列93％相同的EST序列(收录号：FS402940.1)。然而，烟草中该基因的功能尚未报道。

REV的基因从拟南芥中分离(非专利文献10及11)，REV的突变体在莲座叶及茎性叶两者中腋芽原基的形成减少，未观察到通过摘心(decapitation)而促进腋芽原基形成(非专利文献9、10及12)。在烟草中没有推测为REV直向同源基因的cDNA序列的报道，但公开了在氨基酸水平上与拟南芥REV有79％相同的EST序列(收录号：FG135778.1)。另外，公开了推测为REV直向同源基因的烟草(品种：SR-1)的全长cDNA序列(收录号：JQ686937)。但是，烟草中与REV相同性高的基因的功能尚未报道。

CUC的3个基因(CUC1、2及3)从拟南芥中分离(非专利文献16～18)，CUC1和2均对茎顶端分生组织的调节发挥功能，在功能上重复(非专利文献15)。在CUC3基因单独的突变体中观察到莲座叶的腋芽形成受到抑制，但在CUC2及3的二重突变体中，腋芽抑制程度不大(非专利文献13及14)。在烟草中，尚未报道推测为CUC直向同源基因的cDNA序列，但公开了与作为拟南芥CUC1基因的保守结构域的NAM结构域序列的氨基酸序列81％相同的EST序列(FG644078.1)。另外报道了，在使用了推测为罗布红麻(Apocynum venetum)的CUC3的序列的RNAi重组烟草中，烟草的某个基因(未公开序列)的表达受到抑制，观察到了与拟南芥的CUC突变体类似的叶的形态异常(非专利文献19)。但是，在烟草中，对于与CUC相同性高的基因的功能尚不明确，至少没有对于腋芽的功能的报道。

先行技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第2009/0249518(2009年10月1日公开)

专利文献2：国际公开第2010/081917号小册子(2010年7月22日公开)非专利文献

非专利文献1：Greb T,Clarenz O,Schafer E,Muller D,Herrero R,Schmitz G,Theres K(2003)Molecular analysis of the LATERAL SUPPRESSOR gene inArabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillary meristemformation.Genes Dev.17：1175-1187

非专利文献2：Schumacher K,Schmitt T,Rossberg M,Schmitz G,Theres K(1999)The Lateral suppressor(Ls)gene of tomato encodes a new member of theVHIIDprotein family.Proc Natl Acad Sci USA 96：290-295

非专利文献3：Xueyong L,Qian Q,Zhiming F,Yonghong W,Guosheng X,Dali Z,Xiaoqun W,Xinfang L,Sheng T,Fujimoto H,Ming Y,Da L,Bin H&Jiayang L(2003)Control of tillering in rice.Nature 402(10)：618-621

非专利文献4：Keller,T.,Abbott,J.,Moritz,T.,and Doerner,P(2006)Arabidopsis REGULATOR OF AXILLARY MERISTEMS1 controls a leaf axil stem cellnicheand modulates vegetative development.The Plant Cell 18：598-611

非专利文献5：Muller D,Schmitz G,Theres K(2006)Blind homologous R2R3Myb genes control the pattern of lateral meristem initiation inArabidopsis.The Plant Cell 18：586-597

非专利文献6：Schmitz G,Tillman E,Carriero F,Fiore C,Cellini F,TheresK(2002)The tomato Blind gene encodes a MYB transcription factor thatcontrolsthe formation of lateral meristems.Proc Natl Acad Sci USA 99：1064-1069

非专利文献7：Mapelli SC,Lombardi L(1982)A comparative auxin andcytokinin study in normal and to-2mutant tomato plants.Plant Cell Physiol.23：751-757

非专利文献8：Busch BL,Schmitz G,Rossmann S,Piron F,Ding J,BendahmaneA,Theres K(2011)Shoot branching and leaf dissection in totamto are regulatedbyhomologous gene modules.The Plant Cell 23：3595-3609

非专利文献9：Talbert PB,Adler HT,Parks DW,Comai L(1995)The REVOLUTAgene is necessary for apical meristem development and for limiting celldivisions in the leaves and stems of Arabidopsis thaliana.Development 121：2723-2735.

非专利文献10：Otsuga D,DeGuzman B,Prigge MJ,Drews GN,Clark SE(2001)REVOLUTA regulates meristem initiation at lateral positions.The Plant Journal25：223-236

非专利文献11：Zhong R,Ye ZH(1999)IFL1,a gene regulatinginterfascicular fiber differentiation in Arabiodpsis,encodes ahomeodomain-leucine zipper protein.The Plant Cell 11：2139-2152

非专利文献12：Zhong R,Taylor JJ,Ye ZH(1997)Disruption ofinterfascicular fiber differentiation in an Arabidopsis mutant.The Plant Cell9：2159-2170

非专利文献13：Hibara K,Karim MR,Takada S,Taoka K,Furutani M,Aida M,Tasaka M(2006)Arabidopsis CUP-SHAPED COTYLEDON3 regulates postembryonicshootmeristem and organ boundary formation.The Plant Cell 18：2946-2957

非专利文献14：Raman,S.,Greb,T.,Peaucelle,A.,Blein,T.,Laufs,P.andTheres,K(2008)Interplay of miR164,CUP-SHAPED COTYLEDON genes andLATERALSUPPRESSOR controls axillary meristem formation in Arabidopsisthaliana.The Plant Journal 55：65-76

非专利文献15：Takada,S.,Hibara,K.,Ishida,T.,and Tasaka,M(2001)The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristemformation.Development 128：1127-1135

非专利文献16：Aida M,Ishida T,Fukaki H,Fujisawa H,and Tasaka M(1997)Genes lnvolved in Organ Separation in Arabidopsis：An Analysis of the cup-shaped cotyledon Mutant.The Plant Cell 9：841-857

非专利文献17：Takada S,Hibara K,Ishida T,and Tasaka M(2001)The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristemformation.Development 128：1127-1135

非专利文献18：Vroemen CW,Mordhorst AP,Albrecht C,Kwaaitaal MA,de VriesSC(2003)The CUP-SHAPED COTYLEDON3 gene is required for boundary and shootmeristem formation in Arabidopsis.The Plant Cell 15(7)：1563-77

非专利文献19：Sun J,Jia H,Wang X,Yuan X and Zhao B(2012)Inhibition oftobacco axillary bud differentiation by silencing CUP-SHAPED COTYLEDON3Afr.J.Biotech 11(16)：3929-3927

发明内容

发明要解决的课题

然而，根据上述文献可知，除了烟草植物以外，仅能够减少腋芽。因此，如何获得消除或减轻了腋芽的发育所导致的问题的、用于收获烟叶而栽培的烟草植物尚不明确。

本发明的课题在于提供一种适于为了收获烟叶而栽培的烟草植物体。

解决课题的方法

鉴于上述课题，本发明人等对烟草植物中预想与腋芽发育相关的基因进行鉴定，对于由该基因表达的蛋白质在烟草植物体中存在量减少的情况下可获得的有利影响进行了探索，结果完成了本发明。

即，为了解决上述课题，本发明的烟草植物体在基因组中导入了引起基因的功能抑制的突变，所述基因包含编码以下(1)～(5)的多肽中任一者的多核苷酸作为编码区域，

其中，所述(1)～(5)的多肽为：

(1)相对于序列号1所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号3所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽中的至少一者；

(2)相对于序列号5所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽中的至少一者；

(3)相对于序列号9所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号11所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽中的至少一者；

(4)相对于序列号13所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号15所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽中的至少一者；以及

(5)相对于序列号17所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号19所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽中的至少一者，

所述功能抑制抑制腋芽的发育。

为了解决上述课题，本发明的烟草植物体的制备方法包括导入引起基因的功能抑制的突变的步骤，所述基因包含编码了以下(1)～(5)的多肽中任一者的多核苷酸作为编码区域，

其中，(1)～(5)的多肽为：

所述功能抑制抑制腋芽的发育。

发明的效果

本发明能够选择性抑制腋芽发育，因此起到能够提供适于为了收获烟叶而栽培的烟草植物体的效果。

附图说明

图1是示出了确认本发明的实施例的NtREV基因的表达抑制对腋芽发育的影响的结果的图。

图2是示出了确认本发明的实施例的NtBl1基因的表达抑制对腋芽发育的影响的结果的图。

图3是示出了确认本发明的实施例的NtLS基因的表达抑制对腋芽发育的影响的结果的图。

图4是示出了确认本发明的实施例的#15360基因的表达抑制对腋芽发育的影响的结果的图。

图5是示出了确认本发明的实施例的#07437基因的表达抑制对腋芽发育的影响的结果的图。

图6是示出了确认本发明的实施例的在NtREV基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图7是示出了确认本发明的实施例的在NtLS基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图8是示出了为了利用CRISPR/Cas9 system在NtBl1基因中导入突变而使用的载体的结构的示意图。

图9是示出了确认本发明的实施例的在NtBl1基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图10是示出了确认本发明的实施例的在NtBl1基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图11是示出了确认本发明的实施例的在NtBl1基因或NtLS基因中导入的突变对腋芽的发育位置的影响的图。

图12是示出了确认本发明的实施例的在NtBl1基因中导入的突变对烟草植物的生长的影响的图。

图13是示出了确认本发明的实施例的在NtLS基因中导入的突变对烟草植物的生长的影响的图。

图14是示出了确认在NtREV基因中导入的突变对烟草植物的生长的影响的图。

图15是示出了确认在LS基因中导入的突变对烟草植物的生长的影响的图。

图16是示出了确认在LS基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图17是示出了确认在REV基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图18是示出了确认在LS基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图19是示出了确认在REV基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图20是示出了确认在REV基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图21是示出了确认在#15360中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图22是示出了确认在Bl1基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图23是示出了确认在Bl1基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图24是示出了确认在Bl1基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图25是示出了确认在LS基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

图26是示出了确认在LS基因中导入的突变对腋芽发育的影响的结果的图。

具体实施方式

〔1.烟草植物体〕

在一个方面，本发明提供一种烟草植物体，其在基因组中导入了引起基因的功能抑制的突变，所述基因包含编码了特定多肽的多核苷酸作为编码区域。这里，该功能抑制是抑制腋芽的发育。

特定的上述多肽的具体例子为以下的任一者：相对于序列号1所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号3所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽中的至少一者；相对于序列号5所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽中的至少一者；相对于序列号9所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号11所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽中的至少一者；相对于序列号13所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号15所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽中的至少一者；以及，相对于序列号17所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号19所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽中的至少一者。

如后述的实施例所示，上述烟草植物体在一级腋芽的数量或重量方面没有显示出与野生型的实质性差异，但是除去了一级腋芽之后生出的腋芽(二级腋芽及三级腋芽)的数量或重量显示出大幅减少(例如，野生株植物的1/2以下)，或者在除去了一级腋芽之后不进一步产生腋芽。因此，本发明中从烟草植物体中除去腋芽的操作基本上1次结束，因此与用于收获烟叶的烟草植物体栽培中的现有的腋芽处理相比，只要几分之一以下的劳动力就可以完成。

如上所述，现有技术的文献中仅公开了除烟草植物以外，腋芽的发育整体上受到抑制。但是，从以下所述的原因考虑，整体上抑制腋芽的发育未必只有优点。对于种子植物，腋芽的发育能力是用于保持个体健全的重要功能。例如，在生长中的组织受到损伤的情况下，腋芽代替其开始生长，从而使个体实现自身的生存。因此，必然可以预见全面损害该功能会对个体的健全性带来风险。实际上，在非专利文献9(Fig.1的legend)中提及了使植物体的成长部分衰弱。另外，使腋芽完全消失的个体在因风灾水害等受到损伤时，有很高的死亡风险。因此，考虑到烟叶生产，腋芽的发育根据情况有重要的意义。在生长过程中初生茎损伤的情况下，通过使下位节的腋芽代替初生茎而伸长及发育，可以确保烟叶生产量。

在本说明书中使用的情况下，“烟草植物体”及“烟草”包含个体整体(例如，成体、苗及种子)、组织(例如，叶、茎、花、根、生殖器官、胚及它们的一部分等)、以及这些的干燥物。

在本说明书中使用的情况下，“腋芽(axillary bud)”是指在叶原基(leafprimordium)的叶腋(leaf axil)部形成的腋生分生组织(axillary meristem)所生成的芽(bud)及该芽发育而成的苗两者。腋芽在打顶后按照一级腋芽(primary axillary bud)、二级腋芽(secondary axillary bud)及三级腋芽(tertiary axillary bud)的顺序在相同叶的根部发育。首先，在打顶后一级腋芽发育，除去一级腋芽后，二级腋芽接着发育。腋芽的“发育”是指，停留在由上述腋生分生组织分化而成的状态的腋芽因茎顶的除去等而开始活泼的活动，进行生长及伸长。

腋芽的“数量或重量”是指1个个体中发育的腋芽的数量或采集到的腋芽的总质量(新鲜重量)，也适用于一级腋芽、二级腋芽或三级腋芽。

在本说明书中使用的情况下，“(氨基酸序列的)序列同一性”是指，相对于作为基准的(氨基酸)序列，提及的(氨基酸)序列一致的比例。这里，序列不一致的部分是存在(氨基酸残基的)取代、添加、缺失或插入的部分。

这里，使用序列表中记载的氨基酸序列确定多肽的记载“相对于～所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽”是指野生型多肽。该野生型多肽是指通常存在于后述的烟草属植物中的多肽。

因此，本发明的烟草植物体中存在量减少了的上述特定多肽只要是与序列表所示的各氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽即可，该序列同一性优选为更高的比例(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上)。

多肽的“存在量的减少”是指，以野生型多肽的存在量作为基准，存在70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下或1％以下的该多肽。以上述野生型多肽的存在量作为基准的上述多肽的存在量可以从带来二级腋芽的数量或重量减少的结果的上述值中适当选择。

需要说明的是，本发明的烟草植物体中的上述多肽存在量的减少优选在由该烟草植物体得到的培养细胞、愈伤组织、原生质体、种子及后代中遗传稳定地得到继承。因此，本发明的烟草植物体可以是由借助人工操作生成的培养细胞、愈伤组织、原生质体、种子及后代产生的个体，用于得到该个体的这些材料也包含于本发明的范围。

本发明的烟草植物体可以进一步包含通过交配而得到的育种后代。以稻、小麦、大麦、大豆为代表，在多个植物类种中进行了使用突变体的育种。例如，在从用突变原进行了处理的突变体群中分离出的突变体的情况下，除了目标基因以外，也有多个突变。因此，通常为了除去多余的突变而进行回交。此时，通过与具有优良性状的栽培品种进行交配，将突变体所具有的性状导入栽培品种，由此可以得到具有更高附加值的栽培品种。由于突变体所具有的性状来自于突变，因此为了进行回交，需要对具有突变的个体进行筛选。为了进行高效的回交，需要简便地检测有无突变和突变是纯合型还是杂合型的方法。该方法可以使用后述的检测突变的方法来进行。另外，通过使用在突变体与栽培品种之间显示出多态性的背景标志物进行MAS(Marker Assisted Selection)，可以以较少的杂交次数高效地得到返回栽培品种的比率高的品系。作为多态性标志物，可以利用烟草中公知的SNP、SSR(Simple Sequence Repeat)。如果需要，可以对待使用的烟草的基因组序列进行解读，确定碱基序列的区别、重复序列数的区别，从而获得并利用新的多态性标志物。

在本说明书中使用的情况下，“基因的功能抑制”是指位于基因组上的基因不发挥原本的功能的状态。因此，“基因的功能抑制”是包括“基因的破坏”、“基因的突变”及除该基因以外(包含外来基因)导致的该“基因的表达抑制”的用语。

在以下的说明中，关于基因及基因组，以Nicotiana tabacum(红花烟草、N.tabacum)为基准进行说明。作为以下说明的基准的Nicotiana tabacum(N.tabacum)，是双二倍体，有来自于作为祖先种的Nicotiana sylvestris(林烟草)的基因组(S基因组)及来自于Nicotiana tomentosiformis(绒毛状烟草)的基因组(T基因组)这两者。在N.tabacum中，由同一名称表示的基因在多数情况下是在各基因组中分别存在的二倍体，因此，该基因在S基因组中有2个等位基因，在T基因组中有2个等位基因。即，在N.tabacum的基因组上，多数情况下存在4个由同一名称表示的基因。

需要说明的是，对于烟草植物体，编码在物种之间实质上发挥相同功能的蛋白质的基因的一部分(不是全部)的、编码区域中的碱基序列在栽培品种之间可以有1～数％的差异，在栽培品种及近缘野生种之间可以有约10％以下的差异。

“基因的破坏”是指，基因组上不存在原本具有的基因、或者不能由位于基因组上的基因生成转录产物。“基因的突变”是指，不能生成原本的功能性蛋白质的基因的突变、虽然可生成蛋白质但使生成的量降低的基因的突变、或者虽然可生成蛋白质但使蛋白质的稳定性降低的基因的突变。“基因的表达抑制”是指，虽然该基因中未发生变化，但基因的功能(从转录为mRNA至后续翻译为蛋白质)经由其它因子被修饰而使蛋白质的生成量降低、或者处于不发生蛋白质生成的状态。“基因的表达抑制”例如可以通过由该基因转录的mRNA的分解而产生。

在本说明书中使用的情况下，“突变”具有本申请的技术领域中通常理解的含义，例如是指位于野生型的基因组上的碱基、或者位于野生型蛋白质的氨基酸残基的变化(例如，取代、缺失、插入、添加、重复或倒位等)。位于基因组上的碱基的变化除了以上的例子以外，还包括多个碱基的易位。

相对于序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17或19所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽是存在于野生株植物的多肽(或其变体)。因此，本发明的烟草植物体的上述多肽的存在量比野生株植物有所减少，因此比野生株植物所具有的上述功能更差。该功能例如为野生株植物中形成腋生分生组织的功能、从腋生分生组织分化为腋芽的功能、或者保持或提高腋芽的发育能力的功能。

具有序列号1所示的氨基酸序列的多肽例如由具有序列号2所示的碱基序列的多核苷酸所编码。具有序列号3所示的氨基酸序列的多肽例如由具有序列号4所示的碱基序列的多核苷酸所编码。这些多核苷酸符合后述的实施例所示的NtREV基因的cDNA，序列号2示出了S基因组的NtREV基因的cDNA序列，序列号4示出了T基因组的NtREV基因的cDNA序列。序列号21及22分别示出了NtREV基因的S基因组及T基因组中的碱基序列。序列号54及55分别示出了NtREV基因(包含5’上游及3’下游)的S基因组及T基因组中的碱基序列。

具有序列号5所示的氨基酸序列的多肽例如由具有序列号6所示的碱基序列的多核苷酸所编码。具有序列号7所示的氨基酸序列的多肽例如由具有序列号8所示的碱基序列的多核苷酸所编码。这些多核苷酸符合后述的实施例所示的NtLS基因的cDNA，序列号6示出了S基因组的NtLS基因的cDNA序列，序列号8示出了T基因组的NtLS基因的cDNA序列。序列号23及24分别示出了NtLS基因是S基因组及T基因组中的碱基序列。序列号56及57分别示出了NtLS基因(包含5’上游及3’下游)的S基因组及T基因组中的碱基序列。

具有序列号9所示的氨基酸序列的多肽由例如具有序列号10所示的碱基序列的多核苷酸所编码。具有序列号11所示的氨基酸序列的多肽由例如具有序列号12所示的碱基序列的多核苷酸所编码。这些多核苷酸符合后述的实施例所示的NtBl1基因的cDNA，序列号10示出了S基因组的NtBl1基因的cDNA序列，序列号12示出了T基因组的NtBl1基因的cDNA序列。序列号25及26分别示出了NtBl1基因的S基因组及T基因组中的碱基序列。序列号58～61分别示出了NtBl1基因(包含5’上游及3’下游)的S基因组及T基因组中的碱基序列。

具有序列号13所示的氨基酸序列的多肽由例如具有序列号14所示的碱基序列的多核苷酸所编码。具有序列号15所示的氨基酸序列的多肽由例如具有序列号16所示的碱基序列的多核苷酸所编码。这些多核苷酸符合后述的实施例所示的#15360的cDNA，序列号14示出了S基因组的#15360的cDNA序列，序列号16示出了T基因组的#15360的cDNA序列。序列号27及28分别示出了#15360的S基因组及T基因组中的碱基序列。序列号62及63分别示出了#15360(包含5’上游及3’下游)的S基因组及T基因组中的碱基序列。

具有序列号17所示的氨基酸序列的多肽由例如具有序列号18所示的碱基序列的多核苷酸所编码。具有序列号19所示的氨基酸序列的多肽由例如具有序列号20所示的碱基序列的多核苷酸所编码。这些多核苷酸符合后述的实施例所示的#07437的cDNA，序列号18示出了S基因组的#07437的cDNA序列，序列号20示出了T基因组的#07437的cDNA序列。序列号29及30分别示出了#07437的S基因组及T基因组中的碱基序列。

需要说明的是，上述#07437基因从序列相同性方面可以认为是分类为CUC的基因。CUC基因在拟南芥中已经报道了CUC1～3这3个基因，还已知对于突变体的表型而言，集成了多个突变时比单独的突变显示出更大的影响。作为该家族基因，我们从烟草中除#07437以外还分离了5种基因。由此，可以期待通过将这些家族基因和#07437集成利用而发挥更大的效果。

在本发明的烟草植物体中，优选减少了特定的上述多肽的存在量。具体而言，该存在量通过编码上述野生型多肽的基因的突变或破坏、或者表达抑制而减少。

上述基因的突变或破坏例如作为自然突变、突变原处理、基因组编辑或基因敲除的结果而产生。上述基因的自然突变通常由复制错误及基因损伤而发生。该损伤的原因为暴露于天然存在的、或者人工生成后停留在自然环境中的公知的突变原(例如，放射线、紫外线或诱变物质(例如EMS等))等。上述基因的突变原处理可以通过人为地使上述突变原作用于烟草植物体(以及根据需要与抑制基因修复功能组合)来实施。上述基因的重组可以通过按照公知的基因重组方法，用重组序列对目标基因的一部分或全部进行同源重组来实施。上述基因的基因组编辑可以通过公知的技术(例如，zinc-finger nucleases：ZFN、transcription activator-like effector nucleases：TALEN、以及CRISPR/Cas9 system等)来实施。上述基因敲除可以通过利用了公知的转座酶的基因的转移或T-DNA的插入来实施。

如上所述，烟草植物体大多在T基因组及S基因组中具有2组基因。因此，为了使该基因的功能完全消失，需要使位于T基因组及S基因组的全部基因(4个)的功能缺失。但是，在表现出基因剂量效应(dosage effect)的情况下，即使不使T基因组及S基因组的功能缺失，也能够抑制上述基因的功能。

在通过取代使功能缺失的情况下，该取代可以存在于启动子序列(可以列举以编码区域为基准位于上游(5’侧)的序列、及位于下游(3’侧)的序列)、5’非翻译区域及3’非翻译区域、位于内含子两端的保守序列(5’GT-AG3’)、以及编码区域中的至少1个。可以预想，由于在位于启动子序列、5’非翻译区域及3’非翻译区域的对基因表达活性调节很重要的碱基序列中发生取代，因此由该基因的转录活性、稳定性引起转录产物量降低，蛋白质的量减少。在内含子的保守序列中发生了取代的情况下，不会正常发生剪接，而以添加内含子的形式进行翻译。因此可以预想，通过移码突变，可翻译出具有与原来不同的氨基酸序列的蛋白质。作为在编码区域发生了取代的情况的一例，可以预想，由于取代为不编码氨基酸的终止密码子(无义突变)而翻译出C末端侧变短的不完全长度的蛋白质，从而使功能缺失。无义突变的插入位置只要是无法形成完全长度的蛋白质的位置即可，优选缩短数个以上的氨基酸。

另一方面，可以预想，通过氨基酸序列被取代，蛋白质的功能降低。可以预想，这是由于氨基酸序列的取代，立体结构发生变化、对于活性功能重要的氨基酸变为不具有活性的氨基酸而引起的。非保守性取代(non-conservative substitutions)容易发生功能降低，因此优选作为氨基酸取代。作为非保守性取代，可以列举取代为电荷或疏水性不同的氨基酸(例如，由碱性氨基酸取代为酸性氨基酸、由极性氨基酸取代为非极性氨基酸)、以及取代为氨基酸侧链的位阻(立体上的大小)不同的氨基酸等。

在缺失、插入等除取代以外的突变的情况下，只要在启动子序列、5’非翻译区域及3’非翻译区域内发生，就可以预想与取代同样地因转录活性、稳定性的降低而引起转录产物量的减少、蛋白质的量的减少。即使是内含子的保守序列，也可以预想与取代同样地翻译出具有与原来不同的氨基酸序列的蛋白质。在编码区域发生的情况下，可以预想，由于氨基酸残基的缺失或插入(由3的倍数的连续的碱基缺失或插入而产生)、或者移码突变，翻译出具有与原来不同的氨基酸序列的蛋白质。另外，在包含全部该基因的大的缺失、大片段插入的情况下，可以预想该基因本身的表达会消失。

作为上述基因的突变或破坏的结果而产生的个体，在本说明书中称为烟草植物体的突变体(简单记载为突变体)。上述突变体可以在S基因组及T基因组中的任一者中具有上述的突变，优选在S基因组及T基因组两者中具有上述的突变。需要说明的是，用于使功能缺失的突变可以在1个基因中具有1种突变，也可以具有多个突变，并且突变的种类不受限制。S基因组及T基因组各有2个、总计4个基因的突变可以相同，也可以不同。

上述基因的表达抑制包括从该基因向mRNA转录的抑制、从该基因向介导mRNA的蛋白质的翻译的抑制(例如，该mRNA的分解)、以及翻译出的蛋白质的功能的抑制。转录的抑制可以通过抑制促进从上述基因进行转录的转录因子、以及抑制转录起始因子接近上述基因等来实现。翻译的抑制可以使用反义RNA分子、RNAi分子或共抑制分子来实现。蛋白质功能的抑制可以通过与功能性蛋白质结合而抑制该蛋白质的功能的分子(例如，诱饵(decoy)核酸、核酶、抗体及抑制肽)来实现。

以上说明的各种突变可以由参考了例如以下所示的各基因的公知的基因组序列、以及序列号54～63所示的各基因的基因组序列的本领域技术人员容易地导入烟草植物体。即，基于这些序列信息，可以适当确定本发明的概念所包含的各种烟草植物体的基因组中存在的、应导入突变的区域。

NtREV：(S基因组)Sol Genomics Network(SOL)accession#Ntab-K326_AWOJ-SS17907、及(T基因组)SOL accession#Ntab-K326_AWOJ-SS9429

NtLS：(S基因组)SOL accession#Ntab-K326_AWOJ-SS1238、及(T基因组)SOLaccession#Ntab-K326_AWOJ-SS5309

NtBl1：(S基因组)SOL accession#Ntab-K326_AWOJ-SS18396、及(T基因组)SOLaccession#Ntab-K326_AWOJ-SS12956

#15360：(S基因组)SOL accession#Ntab-K326_AWOJ-SS587及(T基因组)SOLaccession#Ntab-K326_AWOJ-SS20471

#07437：(S基因组)SOL accession#Ntab-K326_AWOJ-SS943、以及(T基因组)GeneBank accession#AYMY01348769.1、AWOK01667329.1及ASAG01052465.1。

上述的抑制(转录、翻译及蛋白质功能)可以通过例如将用于实现该抑制的分子直接导入植物体、或者通过使用插入了目标基因的载体的植物体的转化而使该分子在植物体中表达来实现。在植物体的转化中，用于表达上述分子的目标基因可以导入上述植物体的基因组的任意区域，不必导入S基因组及T基因组两者。

上述烟草植物体只要是烟草属植物即可，没有特别限定，作为烟草属植物，只要是属于烟草(Nicotiana)属的植物即可，没有特别限定，可以例如例如：无茎烟草(Nicotianaacaulis)、渐尖叶烟草(Nicotiana acuminata)、渐尖叶烟草多花型变种(Nicotianaacuminata var.multzjlora)、非洲烟草(Nicotiana africana)、花烟草(Nicotianaalata)、抱茎烟草(Nicotiana amplexicaulis)、阿伦特氏烟草(Nicotiana arentsii)、渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata)、贝纳米特氏烟草(Nicotiana benavidesii)、本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)、毕基劳氏烟草(Nicotiana bigelovii)、博内里烟草(Nicotiana bonariensis)、洞生烟草(Nicotiana cavicola)、克利夫兰式烟草(Nicotianaclevelandii)、心叶烟草(Nicotiana cordifolia)、伞状烟草(Nicotiana corymbosa)、迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)、高烟草(Nicotiana excelsior)、福尔吉特氏烟草(Nicotiana forgetiana)、香烟草(Nicotiana fragrans)、粉蓝烟草(Nicotiana glauca)、粘毛烟草(Nicotiana glutinosa)，古特斯皮德氏烟草(Nicotiana goodspeedii)、哥西氏烟草(Nicotiana gossei)、因古儿巴烟草(Nicotiana ingulba)、川上烟草(Nicotianakawakamii)、奈特氏烟草(Nicotiana knightiana)、蓝格斯多夫烟草(Nicotianalangsdorfi)、狭叶烟草(Nicotiana linearis)、长花烟草(Nicotiana longiflora)、海滨烟草(Nicotiana maritima)、特大管烟草(Nicotiana megalosiphon)、摩西烟草(Nicotiana miersii)、夜花烟草(Nicotiana noctiflora)、裸茎烟草(Nicotiananudicaulis)、欧布特斯烟草(Nicotiana obtusifolia)、西方烟草(Nicotianaoccidentalis)、西方烟草Hesperis亚种(Nicotiana occidentalis subsp.Hesperis)、耳状烟草(Nicotiana otophora)、圆锥烟草(Nicotiana paniculata)、少花烟草(Nicotianapauczjlora)、矮牵牛状烟草(Nicotiana petunioides)、蓝茉莉叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia)、四科烟草(Nicotiana quadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(Nicotianaraimondii)、残波烟草(Nicotiana repanda)、莲座叶烟草(Nicotiana rosulata)、莲座叶烟草因古儿巴亚种(Nicotiana rosulata subsp.Ingulba)、圆叶烟草(Nicotianarotundifolia)、黄花烟草(Nicotiana rustica)(黄花烟)、赛特氏烟草(Nicotianasetchellii)、拟似烟草(Nicotiana simulans)，茄叶烟草(Nicotiana solanifolia)、斯佩格茨烟草(Nicotiana spegauinii)、斯托克通氏烟草(Nicotiana stocktonii)、香甜烟草(Nicotiana suaveolens)、林烟草(Nicotiana sylvestris)、红花烟草(Nicotianatabacum)、蓝烟草(Nicotiana thyrsiflora)、绒毛烟草(Nicotiana tomentosa)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosifomis)、三角叶烟草(Nicotiana trigonophylla)、荫生烟草(Nicotiana umbratica)、波叶烟草(Nicotiana undulata)、颤毛烟草(Nicotianavelutina)、芹叶烟草(Nicotiana wigandioides)、及烟草属植物的杂交种等。其中，更优选为本塞姆氏烟草、黄花烟草及红花烟草，特别优选为作为烟叶生产的原料而使用的黄花烟草及红花烟草。

除了上述的作用以外，本发明的烟草植物体的一级腋芽的位置偏离叶的根部，因此能够不伤害叶而除去该腋芽，这在实际的栽培实践中是有用的。关于该有用性，优选本发明的烟草植物体在基因组中导入了引起基因的功能抑制的突变，所述基因包含编码了以下多肽的多核苷酸作为编码区域，所述多肽为：

相对于序列号5所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽；以及

相对于序列号9所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号11所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽，

上述功能抑制抑制腋芽的发育。另外，如后述的实施例所示，本发明的烟草植物体特别优选为在NtBl1及NtLS中导入了突变而得到的突变体。

〔2.烟草植物体的制备方法〕

在1个方面，本发明提供一种上述的烟草植物体的制备方法。上述制备方法包括：导入引起基因的功能抑制的突变的步骤，所述基因包含编码了上述的特定的多肽中任一者的多核苷酸作为编码区域。

上述的导入步骤的结果是，通过由该突变引起的上述基因的功能抑制，抑制腋芽的发育。关于通过上述基因的功能抑制来抑制腋芽的发育的概要，如上所述。因此，作为用于实施上述步骤的具体例子，以下列举通过使用了载体的烟草植物体的转化进行的基因的表达抑制及对基因导入突变来进行说明。

作为以基因的表达抑制或向基因导入突变作为目的的烟草植物转化所使用的载体，只要是能够使插入载体内的多核苷酸在植物细胞内表达的载体即可，没有特别限定。作为该载体，例如，优选使用能够借助土壤杆菌将目标多核苷酸导入植物细胞的pBI系、pPZP系及pSMA系的载体等。特别优选为双元载体系(pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221及pPZP202等)的质粒。

在通过RNAi实现基因的表达抑制的情况下，用于通过RNAi抑制靶基因的表达所使用的触发器(trigger)序列可插入上述载体。该触发器序列例如为：编码具有序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17或19所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸(可以有0.1～1％的取代)的一部分的、或者具有序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18或20的多核苷酸(可以有0.1～1％的取代)的一部分的、连续至少21～30碱基(例如，21碱基以上、22碱基以上、23碱基以上、24碱基以上、25碱基以上、26碱基以上、27碱基以上、28碱基以上、29碱基以上及30碱基以上)的碱基序列所示的多核苷酸(正义RNA部分)、以及与该多核苷酸互补的碱基序列所示的多核苷酸(反义RNA部分)。上述的“连续至少21～30碱基”的碱基序列更具体是指连续的21碱基以上、23碱基以上、25碱基以上、30碱基以上、35碱基以上、40碱基以上、45碱基以上、50碱基以上、60碱基以上、70碱基以上、80碱基以上、90碱基以上或100碱基以上的碱基序列。

如上所述，本发明的烟草植物体中的基因的表达抑制优选可遗传继承。因此，上述触发器序列优选导入上述烟草植物体的基因组。

对烟草植物体的基因导入突变可以通过公知的基因组编辑技术来实现。作为该基因组编辑技术，可以列举：CRISPR/Cas9 system、TALEN及ZFN。在CRISPR/Cas9 system中，向导RNA及Cas9蛋白质存在于靶细胞内时，可以进行基因组编辑，在TALEN及ZFN中，融合蛋白质(DNA结合结构域及核酸酶发生了融合)存在于靶细胞内时，可以进行基因组编辑。因此，上述向导RNA及Cas9蛋白质、以及上述融合蛋白质均可以直接导入靶细胞。作为将其直接导入靶细胞的方法，可以列举：PEG法、电穿孔法、以及基因枪(particle bombardment)法等。

在CRISPR/Cas9 system中，位于紧邻基因组上的XGG的上游的碱基序列的互补序列与向导RNA的一部分形成碱基对，在该碱基序列内，双链的基因组DNA被Cas9所切断。该碱基序列例如为：编码具有序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17或19所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸(可以有0.1～1％的取代)、或者具有序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18或20的多核苷酸(可以有0.1～1％的取代)的一部分中的、位于紧邻XGG的上游的连续的10碱基以上(例如，15碱基以上、优选为17碱基以上、更优选为18碱基以上、更进一步优选为19碱基以上、最优选为20碱基以上)。

在TALEN中，形成二聚体的人工核酸酶的一对DNA结合结构域分别与经由5～20碱基的间隔物存在于FokI切断结构域两端的碱基序列结合。该碱基序列存在于双链基因组DNA的一条链及另一条链，因此，上述一对DNA结合结构域的一者与上述一条链结合，另一者与另一条链结合。该DNA结合结构域以33～34氨基酸残基作为重复单元(模块)，由与待结合的碱基数对应数量的模块构成。通过DNA结合结构域结合的碱基序列为：编码具有序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17或19所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸(可以有0.1～1％的取代)、或者具有序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18或20的多核苷酸(可以有0.1～1％的取代)及形成与该多核苷酸互补的链的多核苷酸的一部分中的、经由5～20碱基的间隔物存在于FokI切断结构域的两端、且各自连续的6碱基以上、优选为10碱基以上、更优选为18碱基以上。

在ZFN中，与TALEN同样，形成二聚体的人工核酸酶的一对DNA结合结构域分别与经由5～20碱基的间隔物存在于FokI切断结构域两端的碱基序列结合。该DNA结合结构域由多个锌指模块(zinc finger module)构成。该碱基序列为：编码具有序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17或19所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸(可以有0.1～1％的取代)、或者具有序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18或20的多核苷酸(可以有0.1～1％的取代)及形成与该多核苷酸互补的链的多核苷酸的一部分中的、经由5～20碱基的间隔物存在于FokI切断结构域的两端、且各自连续的9碱基以上、优选为12碱基以上、更优选为18碱基以上。

根据所有项目的记载，对于以上的RNAi、CRISPR/Cas9 system、TALEN及ZFN的说明，分别可以将具有序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17或19所示的氨基酸序列的多肽另外表示成，具有与该多肽90％以上序列同一性、且存在于烟草属所包含的其它物种中的相同分子种类的多肽。另外，同样地，可以将前面段落中记载的具有序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18或20的多核苷酸另外表示成，具有与该多核苷酸90％以上序列同一性、且存在于烟草属所包含的其它物种中的同源基因的多核苷酸。

如上所述，导入本发明的烟草植物体的基因突变优选可遗传继承。但是，对于为了基因组编辑而导入烟草植物体的外源性的多核苷酸而言，优选在确认了将希望的突变导入烟草植物体后，从该烟草植物体排除。这是由于，如果上述外源性的多核苷酸保持在烟草植物体中，则因(持续)导入不希望的突变而存在使希望的性状(例如，二级腋芽的抑制)消失、威胁烟草植物体的生存的隐患。

对烟草植物体的基因导入突变可以通过其它生物工程的方法(例如，利用了转座子或土壤杆菌的方法)来实施。该方法的具体例子为将烟草的反转录转座子tnt1或其它植物中的转座子、或者土壤杆菌的T1质粒中的T-DNA导入烟草植物体的方法。

或者，对烟草植物体的基因导入突变可以通过其它方法(烟草植物体的突变原处理)来实施。作为突变源的例子，可以列举小分子的化合物(例如，甲磺酸乙酯(EMS)、N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、叠氮化钠等)、以及放射线(例如，γ射线、重离子束、X射线、中子射线、紫外线等)。

突变可以导入能够再生的任意烟草植物体。该烟草植物体的例子为种子、根、叶、花、生殖器官或胚，优选为种子。

通过以上方法得到的可以是具有各种突变的(或者不具有突变的)植物体的突变体群。因此，可以从该突变体群中进一步挑选显示出希望的表型的个体。作为挑选个体的例子，对于从在使用突变原进行了处理的情况下得到的突变体群(实验对象集合)中挑选希望的个体的步骤进行说明。

在T基因组、S基因组两者总计4个基因中具有突变的功能缺失的烟草突变体例如可以通过以下方法获得。如上所述利用突变原对烟草进行处理，制备在全部烟草基因组中发生了突变的烟草的突变体群(实验对象集合)，提取基因组DNA。利用S基因组、T基因组各自的基因特异性引物，由实验对象集合的基因组DNA扩增靶基因(多核苷酸)，确定其产物的碱基序列，挑选具有纯合型突变的品系。首先，获得在S基因组、T基因组分别具有纯合型突变的品系(M2)，制备将它们交配而成的F1。进而，培育其自身繁殖后代(F2)，从其中获得S、T两个基因组均具有纯合型突变的品系(由于双因子隐性，可以以1/16的概率获得)。

本发明的烟草植物体的制备方法进一步包括如下步骤：从在上述的生成步骤中生成的烟草植物体中，挑选除去一级腋芽后发育的二级腋芽的数量或重量与上述野生株植物相比减少为1/2以下的个体。上述挑选的步骤例如可以基于编码上述的特定多肽的基因的破坏、突变或表达抑制来实施。

基因的突变或破坏可以通过检测该基因中有无突变来确定。作为检测基因中的突变的方法，只要是能够判断有无突变的方法即可，可以是以下方法：(1)利用市售的测序仪等直接解读DNA碱基序列的方法；(2)使用SSCP(Single StrandConformationPolymorphism)法根据电泳距离的不同检测序列中的不同的方法；(3)使用CycleavePCR法检测SNP(Single Nucleotide Polymorphism)的方法；(4)通过使用T7EndonucleaseI等切断错配部位而检测有无突变的方法；(5)根据利用制限酶处理有无切断可以判断有无突变的CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)法；(6)通过使用有意包含错配的引物组，从而根据有无利用制限酶进行的切断来判断有无突变的dCAPS(derived CAPS)法；(7)通过使用对突变序列特异性杂交的探针检测探针是否杂交，从而判断有无突变的方法(使用了TaqMan探针的PCR法、MassARRAY分析法)；(8)在缺失、插入的情况下，根据电泳的移动程度的差别来检测突变的方法等。或者，基因的突变或破坏可以通过作为基因的改变结果而产生的蛋白质或野生型蛋白质的表达量的检测(例如，蛋白质印迹法(western blotting))来确定。

在上述导入突变的步骤之前，为了确定待抑制表达的基因和/或待导入突变的基因，可以根据需要实施以下所示的步骤(1及2)。

1.推测控制腋芽的发育的烟草基因的分离

可能控制腋芽的基因可以从其它植物的现有技术文献(例如，确认了基因与腋芽的关系的非专利文献)中选择，以该基因的碱基序列及氨基酸序列的同一性作为指标，从烟草中获得基因。例如，通过对公知的数据库中收录的序列进行基于blast(Basic LocalAlignment Search Tool)的检索，可以获得公知的烟草基因、或者与烟草亲缘关系接近的植物种的基因(例如，番茄)的碱基序列、氨基酸序列。在公知的序列为部分长度的情况下，可以利用已知的序列信息，通过通常的方法、例如通过Race(Rapid amplification ofcDNA ends)法从cDNA文库中筛选，获得全长cDNA。

新的能够控制腋芽的基因例如可以通过挑选由作为目标的组织、处理所表达的基因而获得。作为目标的组织、处理可以基于以下举出的信息来选择。已知，与腋芽的原基形成相关的基因在腋芽原基形成之前表达，与腋芽原基的保持、生长相关的基因在腋芽原基中表达(例如，LS、Blind基因)。已知与腋芽的休眠、发育相关的基因在休眠、脱离休眠的腋芽中表达增加减少(例如BRANCHED1)。另外，已知若干植物激素与腋芽的控制相关。生长素与顶芽优势相关，独脚金内酯与腋芽的发育抑制相关，细胞分裂素与腋芽的伸长相关，脱落酸与休眠相关。

新挑选能够控制腋芽的发育的基因可以通过利用了表达特异性的通常的方法来实施。作为该方法，可以列举例如：(1)从cDNA的碱基序列获得基因表达分析数据的方法、以及制作在对象组织中表达的基因的cDNA文库并对末端序列进行测序的方法、将限制酶片段串联并进行测序的SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)法等。(2)通过差示杂交获得基因表达分析数据的方法。已知有微阵列(マクロアレイ)、DNA芯片。(3)通过差别显示法可以获得在多个样品之间表达水平不同的基因(Differentially Expressed Genes：DEGs)。可以举出比较PCR扩增片段的量的方法。

分离的基因的扩增

多核苷酸的扩增可以通过PCR(Polymerase Chain Reaction)法进行，也可以通过LCR(Ligase Chain Reaction)法、LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法等进行。

用于扩增多核苷酸的引物只要是能够从S基因组、T基因组的基因混合存在的烟草基因组中特异性地扩增各基因组的目标基因的引物即可。只要能够特异性地扩增目标基因，也可以包含1个或1个以上的取代、缺失、插入、添加。另外，引物可以根据需要用荧光物质、放射线等进行标记。

作为扩增的模板而使用的基因组DNA的提取可以通过公知的方法来进行，可以使用市售的提取试剂盒。可以是基因组DNA经过简易提取而得到的粗纯化物，也可以是经过纯化工序得到的纯化物。

2.推测与腋芽的发育相关的基因的鉴定

制备作为对象的抑制了基因的表达、功能的重组体及突变体，通过在温室、人工气候室、大棚或田地中进行栽培，可以对基因的效果进行确认。通过将产生的腋芽的数量、重量与对照进行比较，可以确认对腋芽的产生、发育的效果。对于腋芽的数量、重量而言，可以不进行打顶，也可以进行打顶，优选通过打顶使其脱离休眠而促进腋芽的发育来进行。腋芽的数量、重量的调查可以在任意一个时期进行1次，也可以进行多次。1次测量中可以对一级腋芽进行评价，但不适于对二级腋芽、三级腋芽的评价，因此优选进行多次。为了确认对于二级腋芽、三级腋芽的效果，优选分别除去一级腋芽、二级腋芽。一级腋芽、二级腋芽的除去可以在各腋芽发育后的任意时间进行，但必须做到没有剩余。优选在确认了腋芽的茎的伸长的时期除去。在多次调查的情况下，优选设置间隔，分为一级腋芽、二级腋芽、三级腋芽进行调查。例如，可以以如下方法进行：每周1次分别对以一级腋芽、二级腋芽、三级腋芽作为对象的腋芽数量进行计数，对其进行采集，并调查重量。

调查可以仅着眼于特定的腋芽(例如二级芽)来进行，也可以仅集中于数量、重量来分别进行。在该情况下，优选以次数、间隔分别适合调查的方法来进行。

〔3.选择性地抑制烟草植物体中的二级腋芽的方法〕

在一个方面，本发明提供一种选择性地抑制烟草植物体中的二级腋芽的方法。二级腋芽的选择性抑制可以通过导入引起烟草植物体中的基因的功能抑制的突变来进行，所述基因包含编码上述特定多肽中任一种的多核苷酸作为编码区域。这里，该功能抑制是抑制腋芽的发育。即，本发明的一个方面的烟草植物体发生了该功能抑制，本发明的另一方面的烟草植物体的制备方法在其制备过程中在烟草植物体中发生该功能抑制。因此，对于在烟草植物体中发生该功能抑制的方法的详细情况，可以参照与烟草植物体及其制备方法有关的前面的项目。

对以上各实施方式进行总结，本发明可以概括如下。

即，一种烟草植物体，其在基因组中导入了引起基因的功能抑制的突变，所述基因包含编码了以下(1)～(5)的多肽中任一者的多核苷酸作为编码区域，其中，

所述功能抑制抑制腋芽的发育，

(1)～(5)的多肽为：

(5)相对于序列号17所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽、及相对于序列号19所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的多肽中的至少一者。

在上述烟草植物体中，优选上述功能抑制抑制上述腋芽中在除去一级腋芽后发育的二级腋芽的发育。

在上述烟草植物体中，优选上述功能抑制使上述二级腋芽的数量或重量与野生株植物相比减少至1/2以下。

在上述烟草植物体中，优选上述功能抑制为与野生株植物相比时上述多肽的存在量减少。

在上述烟草植物体中，优选上述功能抑制为与野生株植物相比时上述多肽的翻译量减少。

在上述烟草植物体中，优选上述功能抑制为与野生株植物相比时来自上述基因的mRNA的转录量减少。

在上述烟草植物体中，优选上述功能抑制为从上述基因转录而成的mRNA的分解的促进。

在上述植物体中，优选在上述基因中导入了上述突变。

在上述烟草植物体中，优选通过自然突变、突变原处理、基因组编辑或基因敲除导入了上述突变。

在上述烟草植物体中，优选上述突变为表达促进上述mRNA分解的因子的多核苷酸插入上述基因存在的区域以外。

在上述烟草植物体中，优选上述因子为反义RNA分子、RNAi分子或共抑制分子。

上述烟草植物体优选属于红花烟草或黄花烟草。

一种烟草植物体的制备方法，该方法包括导入引起基因的功能抑制的突变的步骤，所述基因包含编码了以下(1)～(5)的多肽中任一者的多核苷酸作为编码区域，其中，

上述功能抑制抑制腋芽的发育，

(1)～(5)的多肽为：

在上述制备方法中，优选进一步包括从上述导入的步骤中生成的个体中挑选上述腋芽中在除去一级腋芽后发育的二级腋芽的发育受到抑制的个体的步骤。

在上述制备方法中，优选在上述挑选的步骤中，挑选上述二级腋芽的数量或重量比野生株植物有所减少的个体。

在上述制备方法中，优选上述导入的步骤包括将上述突变导入上述基因。

在上述制备方法中，优选上述导入的步骤通过自然突变、突变原处理、基因组编辑或基因敲除来实施。

在上述制备方法中，优选上述导入的步骤包括将表达促进从上述基因转录而成的mRNA的分解的因子的多核苷酸插入上述基因存在的区域以外。

在上述制备方法中，优选上述因子为反义RNA分子、RNAi分子或共抑制分子。

上述烟草植物体或通过制备方法得到的烟草植物体的后代，或者通过该烟草植物体的交配而得到的育种后代。

从上述烟草植物体、通过上述制备方法得到的烟草植物体、或者上述后代或育种后代收获得到的烟叶。

以下，示出实施例对本发明的实施方式进行详细说明。当然，本发明并不限定于以下的实施例，对于细节部分可以有各种方式。另外，本发明并不限定于上述的实施方式，可以在权力要求所示的范围进行各种变更，将各公开的技术方式适当组合而得到的实施方式也包含于本发明的技术范围。另外，参考并援引本说明书中记载的全部文献。

实施例

〔1.烟草植物中的与腋芽发育相关的候选基因〕

通过Basic Local Alignment Search Tool(blast)分析确定了其它植物中的与腋芽发育相关的多个基因(拟南芥(Arabidopsis thaliana)的Revolutla(REV)、番茄的Lateral suppressor(LS)及番茄的Blind(Bl))的烟草直向同源的候选(以下，简称为候选组A)。另一方面，通过转录组分析确定了烟草植物中与腋芽发育相关的基因的候选(以下，简称为候选组B)。以下，对于各分析及基于分析的结果而得到的基因进行说明。

(1-1.候选组A)

(a)blast分析

以拟南芥的REV基因的氨基酸序列作为查询，在NCBI的网页(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行tblastn，结果是得到了具有80％的高氨基酸序列同一性的番茄的REV同源基因序列。以番茄的REV同源基因的氨基酸序列作为查询，对cDNA文库(来自于Tsukuba(つくば)1号的叶、茎顶端及根的混合物)的EST(ExpressedSequence Tag)分析结果进行tblastn，挑选了烟草的推测REV cDNA克隆组。

与番茄的LS基因具有87％的氨基酸序列同一性的烟草的cDNA序列收录于公开的DB(收录号：EU935581)。另外，与EU935581具有高同一性的烟草EST序列(收录号：AM848584)收录于公开的DB。

以番茄的Bl基因的氨基酸序列作为查询，对cDNA文库(来自于Tsukuba1号的叶、茎顶端及根的混合物)的EST分析结果进行tblastn，挑选了烟草的推测的Bl克隆组。

(b)来自于个体的基因组DNA片段及cDNA(来自于total RNA)的制备

按照简易提取法或CTAB法从烟草(Tsukuba 1号或Petit Havana SR-1(SR-1))的叶中提取了基因组DNA片段。CTAB法是公知的方法，因此省略其详细说明。按照以下步骤进行了简易提取法。使用破碎装置(多珠振荡器(multi-bead shocker)(安井器械)或ShakeMaster Neo(Biomedical Science)等)将放入0.3～0.5ml的提取缓冲液(0.2M的Tris-HClpH8.0、0.4M的NaCl、25mM的EDTA、0.5％的SDS)中的叶片磨碎(2500rpm、1分钟)。从磨碎后的悬浮物中取得上清，通过乙醇沉淀，从上清中纯化了基因组DNA片段。

如下所述提取了total RNA。将烟草的茎顶端、苗及腋芽分别浸渍于RNAlater(Ambion)，进行冷冻保存。然后，使样品融化，在其中添加0.5ml的RTL缓冲液(QIAGEN)，所述RTL缓冲液中加入了20μl的1M DTT。使用多珠振荡器(安井器械)将混合物磨碎(2500rpm、1分钟)。通过对磨碎后的悬浮物进行离心分离(15000rpm、10分钟)而得到上清，使用Magtration(Precision System Science)或RNeasy Kit(QIAGEN)在Dnase存在的条件下从该上清中纯化了total RNA。

使用以下任一种试剂盒，按照各试剂盒中附带的手册从total RNA中纯化了cDNA。

·PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit(Takara Bio)

·PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser(Takara Bio)。

(c)候选组A的基因的生成

通过使用在(b)中得到的cDNA作为模板的RT-PCR对3个基因进行了扩增。在使用了PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio)作为酶的情况下，如下所述设定了反应条件。

94℃下30秒钟

以98℃下10秒钟、55℃下5秒钟及72℃下10秒钟＊作为1个循环，30～40个循环

72℃下10秒钟

＊72℃的延伸反应设定为扩增片段的每1kb长度10秒钟。

在使用了Tks Gflex DNA Polymerase(Takara Bio)作为酶的情况下，如下所述设定了反应条件。

94℃下30秒钟

以98℃下10秒钟、55℃下15秒钟、68℃下60秒钟＊作为1个循环，30～40个循环

68℃下60秒钟

＊68℃的延伸反应设定为扩增片段的每1kb长度60秒钟。

将RT-PCR用的对象基因及引物的组合示于以下。

(第1组：NtLS、T基因组、Tsukuba 1号的苗)

LS_Tom_F1:AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC、及NtLS_qRV1:ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT的组合

LS2_F2:ACACCTAATGCATCATCTAATGTT、及LS_Syl_R1:CAAATAAAGATTAAGTTCAGGATCTG的组合

(第2组：NtLS、S基因组、Tsukuba 1号的苗)

LS_F2_seq:ATTTCCCCTCCTCCATCATTG、及NtLS_qRV1:ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT的组合

LS1_F2:CTTGACACCATCTAATGTTGTTG、及LS_Tom_R1:CAAATAAAGATTAAGTTCAGGATCTG的组合

(第3组：NtREV、T基因组、Tsukuba 1号的苗)

REV_RT_F2:AAGCTGTTTGCAGGGAATATATC、及G053330_RV3:TCTCTGGCTAAATGTTCGAAG的组合

REV_RT_F3:GTAAGTTGTGAGTCTGTGGTAACTAC、及REV_RT_R1:GGAAACAAACATCTGCACTCAA的组合

(第4组：NtBl、S基因组、Tsukuba 1号的苗)

Bl1_F1seq2:GTCCATCTGTCTATATAGGTAGAATG、及Bl1-2_RT_R1:TGAATCTTCTTGGCAACCCCC的组合

(第5组：NtREV、S基因组、SR-1的腋芽)

Ns in0 F1:TTGTTTGGGATTTTGGGGTTTGAGGG、及REV S R1:AATTGTATGGCCAAGTGGCATTATTATCTGA

REV_S_F1:CACTTCCGTTCCTCTTTCACCGCTG、及NtREV_S_RV1:TCCGTTCAACTGTGTTCCTGG

(第6组：NtREV、T基因组、SR-1的腋芽)

REV_RT_F2:AAGCTGTTTGCAGGGAATATATC、及NtREV1_RV1:TCCGTTCAACTGTGTTCCTG

(第7组：NtLS、S基因组、SR-1的腋芽)

LS_Tom_F1:AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC、及LS_Tom_R1:CAAATAAAGATTAAGTTCAGGATCTG的组合

(第8组：NtLS、T基因组、SR-1的腋芽)

LS_Tom_F1:AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC、及LS2-F2comp R:AACATTAGATGATGCATTAGGTGT的组合

LS2-F2:ACACCTAATGCATCATCTAATGTT、及LS_Syl_R1:TTGGCCTCTAATTAAATAGACTGATA的组合。

另外，通过使用了在(b)中得到的基因组DNA片段作为模板的基因组PCR对3个基因进行了扩增。使用的酶及酶所对应的反应条件与上述的RT-PCR相同，因此将对象基因及引物的组合示于以下。

(第1组：NtREV、S基因组、Tsukuba 1号的叶)

REV_F3:TCTCAAAGCTGGCTGTTTTATGTAT、及REV_R14:TACCATTCTCCAGGGTGGTTGTGTAT的组合

Ns_in4_F1:GAAAATTCAGTATTGCCATGTC、及G053330_RV2:GC AAAAACTAGTTCAGAACA的组合

NtREV_TrFW2:CACCGCCTATGTAGCTTCGTCAATG、及

NtREV_RT-R1:GGAAACAAACATCTGCACTCAA的组合

(第2组：NtREV、T基因组、Tsukuba 1号的叶)

Nt_in4_F1:AAAAAAATTCAGTATTGCCACGTGC、及G053330_RV2:GCAAAAACTAGTTCAGAACA的组合

NtREV_TrFW2:CACCGCCTATGTAGCTTCGTCAATG、及NtREV_RT-R1:GGAAACAAACATCTGCACTCAA的组合

(第3组：NtLS、S基因组、Tsukuba 1号的叶)

LS_F1_seq:AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC、及LS_TRV_R3:TCGCTTGATTAGCAGTCAGC的组合

LS_F1_seq:AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC、及NtLS_QPCR_RV1:ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT

LS_TRV_F3:CACCGAAGAAACTGATGATCAACGG、及LS_TRV_R2:GAAGACCTCTTTGTCCTTCACCATGCAG的组合

(第4组：NtLS、T基因组、Tsukuba 1号的叶)

LS_F2_seq:ATTTCCCCTCCTCCATCATTG、及NtLS_QPCR_RV1:ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT的组合

(第5组：NtBl1、S基因组、Tsukuba 1号及SR-1的叶)

Bl1_F1seq2:GTCCATCTGTCTATATAGGTAGAATG、及Bl1_R1seq:CACCATGTTTGATATTAGGCCTTA的组合

Bl1_F3seq2:TGATGAGATTTATGTTGGGAACTG、及Bl1_R2seq:TCTCATCATTGAACACGAACATACT的组合

(第6组：NtBl1、T基因组、Tsukuba 1号及SR-1的叶)

Bl1_F1seq1:CCACTTGTCTATATAGCAAGAAAGA、及Bl1_R1seq:CACCATGTTTGATATTAGGCCTTA的组合

Bl1_F2seq:CTAAGGCCTAATATCAAACATGGT、及Bl1_R2seq:TCTCATCATTGAACACGAACATACT的组合。

(d)得到的基因的序列确定

使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing Kit(LifeTechnology)对将上述3个基因扩增而得到的PCR产物分别进行克隆。需要说明的是，通过将琼脂糖凝胶电泳及MiniElute柱(QIAGEN)组合的通常方法，根据需要在克隆前对该PCR产物进行了纯化。使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(ABI)在毛细管测序仪3730xl DNA Analyzer(ABI)长确定了克隆得到的基因的各碱基序列(序列号21～30)。

(1-2.候选组B)

为了对预想在植物体的叶原基中表达提高的基因进行鉴定，如下所述进行了转录组分析。

(a)RNA提取样品的制备

制作了包埋有从播种起4～5周后的烟草苗(品种：SR-1)中得到的茎顶端部的石蜡块(具体参照Takahashi H,Kamakura H,Sato Y,Shiono K,Abiko T,Tsutsumi N,NagamuraY,Nishizawa NK,Nakazono M.(2010)A method for obtaining high quality RNA fromparaffin sections of plant tissues by laser microdissection.J Plant Res 123:807-813)。使用切片机(RM2125 RTS；Leica)将该石蜡块制成厚度20μm的连续切片。从该连续切片中选择包含了Shoot ApicalMeristem(SAM)的中心部及其附近的切片。使用AppliedBiosystems(注册商标)Arcturus^XT(商标)激光捕获显微切割系统，从该切片中分别将未形成腋芽原基的叶原基的根部(腋芽原基样品)、叶原基及茎顶端分生组织的下部(对照样品)切成直径100～200μm的大小。将腋芽原基样品及对照样品分别回收于CapSure(注册商标)LCM Cap(Applied Biosystems)，转移至RNA提取用的管中，直至RNA提取为止，在-80℃下冷冻保存。

(b)RNA纯化

使用PicoPure RNA isolation Kit(Arcturus)，根据试剂盒附带的手册从(a)的RNA提取样品中纯化了total RNA。使用生物分析仪(Agilent Technologies)推测纯化的RNA溶液的RNA浓度，并确认了品质(RNA的分解程度)。

(c)使用了下一代测序仪(454Genome Sequnecer Titanium、Roche)的碱基序列确定及基因表达量的预测

将在(b)中得到的RNA送至Takara Bio，委托该公司从该RNA制作用于测序仪分析的cDNA文库。将该cDNA文库中含有的cDNA的5’末端部分的碱基序列分析委托给Genaris公司。在碱基序列的确定中，将来自于cDNA文库的植物的每个部分的3/4板的部分进行测序。通过使用了由各部分得到的全部序列信息的从头组装(de novo assembly)分析，得到了组装序列。将从来自于各部分的cDNA文库得到的前导序列与得到的组装序列进行匹配(比对)，对于各部分统计与各基因对应的读取数(リード数)。将统计的读取数在来自于各部分的cDNA文库之间进行标准化，并且基于该读取数对各部分预测了全部基因的表达量。

(d)候选组B的确定

在腋芽原基样品(参照上述的(a))中有200碱基以上的序列数据，选择了腋芽原基样品的读取数为4以上且具有与对照样品相比为10倍以上的表达量的基因作为与腋芽原基形成相关的1次候选基因。可以推测，形成腋芽原基的这样的成为控制器官形成的主开关的基因是控制多个基因表达的转录因子。因此，从根据1次表达特性选择的候选基因中进一步集中于变码转录因子的可能性高的基因，由此挑选了2次候选基因。对这些基因的表达抑制是否抑制烟草中的腋芽的发育进行确认，最终确定了候选组B(2个基因)。

(e)2个基因的全长序列及cDNA序列的生成

根据下一代测序分析的结果，通过组装前导序列得到了共有序列“isogroup15360”及“isogroup07437”。通过使用了这些共有序列的Race、RT-PCR及基因组PCR，生成了上述2个基因的全长序列及cDNA序列。

使用按照1-1.(b)的记载制备的total RNA，并且使用SMARTer RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)，按照试剂盒中附带的手册实施了Race。Race的nested PCR中使用了稀释300倍的1st PCR产物作为模板。在Race中如下所述设定了反应条件。

(1st PCR)

以98℃下10秒钟及72℃下10秒钟作为1个循环，5个循环

以98℃下10秒钟、70℃下5秒钟及72℃下5秒钟作为1个循环，5个循环

以98℃下10秒钟、60℃下5秒钟及72℃下5秒钟作为1个循环，25个循环

(nested PCR)

以98℃下10秒钟、55℃下5秒钟及72℃下5秒钟作为1个循环，25个循环。

作为Race用的引物，使用了试剂盒附带的引物、以及对以下所示的基因的特异性引物。

(1st PCR：#15360、S基因组及T基因组、SR-1的茎顶端)

5’Race1st引物：R-GAACCACCAGGGACTAAACTCTGCAA、及3’Rac e1st引物：F-TTGCAGAGTTTAGTCCCTGGTGGTTC的组合

(nested PCR：#15360、S基因组及T基因组、SR-1的茎顶端)

5’RaceNested引物：R-GAAACGATCACTGATTCTATGCC、及3’Race Nested引物：F-TACAATGTTAGAAGAAGCAATTCAC的组合。

如1-1.(c)所述进行了RT-PCR。使用的引物及对象基因如下所述。

(第1组：#07437、S基因组、SR-1的茎顶端)

正向：TACTTCCCTTTCTCACTTTGGTTTC、及反向：AATATTCCCA TCAATAGATCACAAC的组合

(第2组：#07437、T基因组、Tsukuba 1号的苗)

07437_T_F1:CTACTACATCACTTAATATCATTCATT、及07437_Tom_RT_R1:CAATAGATTGCAACTTTACATTAGTCG的组合

(第3组：#07437、S基因组、Tsukuba 1号的苗)

07437_S_F1:TACTATCACTTAATACCATCATTCATC、及07437_Syl_RT_R1:CCCATCAATAGATCACAACTTTAGT的组合

(第4组：#15360、S基因组、Tsukuba 1号的苗)

15360-2_F2:AAATAGAGGTAATTAGTTGTATCAATGG、及15360-Nt s_R2:ACAACATACCATACTACCACACACTA的组合

(第5组：#15360、T基因组、Tsukuba 1号的苗)

15360-1_F1:TGCATGGACAATCTCCTCTT、及15360-Nts_R2:ACAACATACCATACTACCACACACTA的组合

(第6组：#15360、S基因组、SR-1的腋芽)

15360-2_F1:GCATGGACAATCTCATCTTCTC、及15360-1_R1-2:CAACAGGAGTTGAGTTATTCTCAT的组合

(第7组：#15360、T基因组、SR-1的腋芽)

15360_TrFW1:CACCTTCTTCAAGCAAAATTAATGAC、及15360_Tr RV1:ATTAGAGTCATGAGCCATTAGC的组合。

如1-1.(c)的记载所述进行了基因组PCR。使用的引物及对象基因如下所述。

(第1组：#15360、S基因组、Tsukuba 1号的叶)

15360-2_F1:GCATGGACAATCTCATCTTCTC、及15360-2_R1:CTGG GCAATATTCCACCATT的组合

15360-2_F2:AATGGTGGAATATTGCCCAG、及15360_NtsR2:ACAACATACCATACTACCACACACTA的组合

(第2组：#15360、T基因组、Tsukuba 1号的叶)

15360-1_F1:TGCATGGACAATCTCCTCTT、及15360-1_R1-2:CAACAGGAGTTGAGTTATTCTCAT的组合

15360-1_F2-2:ATGAGAATAACTCAACTCCTGTTG、及15360_NtsR2:ACAACATACCATACTACCACACACTA的组合

(第3组：#07437、S基因组、Tsukuba 1号的叶)

07437-S_F1:TACTATCACTTAATACCATCATTCATC、及07437-S_R1:TCCCTGTACTTTGGGACATGA的组合

07437-S_F2:GTGTACCAGCTAGTTATTATTGCG、及07437-S_R2:CCTGATCCGTTCTGATAGATCG的组合

07427-S_F3:ATTTGTTAAAAAGTTGTAATAAAATTGG、及07437-S_R3:TTTCTTTGAATTGCTAACGAGGA的组合

07437-S_F4:TCCTCGTTAGCAATTCAAAGAAA、及07437-S_R5:AGAATATAAAGAGCAGCCTGAATTAC的组合

07437-S_F1:TACTATCACTTAATACCATCATTCATC、及07437-S_R2:CCTGATCCGTTCTGATAGATCG的组合

07437-S_F2:GTGTACCAGCTAGTTATTATTGCG、及07437-S_R3:TTTCTTTGAATTGCTAACGAGGA的组合

(第4组：#07437、T基因组、Tsukuba 1号的叶)

07437-T_F1:CTACTACATCACTTAATATCATTCATT、及07437-T_R1:TCCCTGTACTTTGGGACATGA的组合

07437-T_F2:TGCATTAACATGAATGCGAC、及07437-T_R2:TCTAAATAGCGAGTAATAAGGATGAGA的组合

07437-T_F3:GTTTGTTAAAAAATTGTAATAAACTTGG、及07437-T_R3:TTTCTTTGAAGTGCAAAAGGAAT的组合

07437-T_F4:ATTCCTTTTGCACTTCAAAGAAA、及07437-T_R4:ATTATGGAAAAACAACTCTTCTATT的组合

07437-T_F1:CTACTACATCACTTAATATCATTCATT、及07437-T_R2:TCTAAATAGCGAGTAATAAGGATGAGA的组合

07437-T_F2:TGCATTAACATGAATGCGAC、及07437-T_R3:TTTCT TTGAAGTGCAAAAGGAAT的组合。

(1-3.基因组上的目标基因的全长序列确定)

按照1-1.(b)中记载得到了基因组DNA片段。通过使用了以该基因组DNA片段作为模板的PCR，使目标基因的5’上游及3’下游分别扩增。PCR的反应条件如1-1.(c)中的记载所述。PCR中使用的引物如下所述。

[表1]

使用Zero Blunt(注册商标)TOPO(注册商标)PCR Cloning Kit(Thermo FisherScientific)，按照其手册所述，利用扩增后的PCR产物分别对大肠杆菌(Mach1(商标)-T1R)进行了转化。在板上接种转化后的大肠杆菌。使用在板上形成的菌落，进行菌落PCR。使用ExoSAP-IT(注册商标)For PCR Product Clean-UP(Affimetrix)按照其手册对菌落PCR的扩增产物进行了纯化，然后用于后述的测序反应的模板。同时，在对菌落进行液体培养后，使用QIAGEN Plasmid Mini Kit(QIAGEN)从培养的菌体中提取出质粒。提取出的质粒也用于后述的测序反应的模板。

使用BigDye(注册商标)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystems)如其手册所述使上述模板进行反应。使用BigDye(注册商标)XTerminator(商标)Purification Kit(Thermo Fisher Scientific)对反应生成物进行纯化。通过毛细管测序仪3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems)确定了纯化后的反应生成物的碱基序列。测序引物根据序列信息适当设计而使用。

通过使用ATGC测序序列组装软件(Genetics)连接确定的碱基序列，确定了目标基因中的非翻译区域的碱基序列。通过进一步连接非翻译区域及结构基因部分，确定了目标基因的完全长度的基因组DNA序列(序列号54～63)。

(1-4.结果)

将确定为候选组A的REV、LS及Bl的烟草直向同源基因分别命名为NtREV、NtLS及NtBl1。另外，根据转录组分析的结果，将确定为候选组B的基因分别命名为#15360及#07437。

〔2.候选物A及B中任一者的表达抑制对于腋芽发育的影响的确认〕

为了研究候选物A及B中任一者的表达抑制对于腋芽发育的影响，对抑制了各基因的表达的重组体(以下，简称为重组体)中腋芽发育的变化进行了确认。

(2-1.重组体的制备)

(a)转化的准备

为了制备重组体，首先，如下所述准备了转化用的载体。

以基于1.的结果的生成的来自于SR-1的cDNA为模板，使用PrimeSTAR Max DNAPolymerase(Takara Bio)通过PCR对用于抑制NtREV、NtBl1、NtLS、#15360及#07437(也统称为对象基因)的表达的RNAi触发器序列进行了扩增。PCR的条件及引物如下所述。

(PCR条件)

94℃下30秒钟

以98℃下10秒钟、55℃下5秒钟、及72℃下10秒钟作为1个循环，30～40循环

72℃下10秒钟

(#15360用引物)

15360_TrFW1:CACCTTCTTCAAGCAAAATTAATGAC、及

15360_TrRV1:ATTAGAGTCATGAGCCATTAGC的组合

(#07437用引物)

07437_TrFW1:ACCACCTGGTTTTAGGTTTCATCC、及

07437_TrRV1:TATTCTGCATATCACCCATTCC的组合

(NtLs用引物)

LS_TRV_F3:CACCGAAGAAACTGATGATCAACGG、及

LS_TRV_R3:TCGCTTGATTAGCAGTCAGC的组合

(NtBl1用引物)

N.t_BL(hit1)_TRV_F1:CACCTCAAGAAAAAGCTTATGGG、及

N.t_BL(hit1)_TRV_R1:GCAGCAGCTAACAAGTTGTA的组合

(NtREV用引物)

NtREV_TrFW2:CACCGCCTATGTAGCTTCGTCAATG、及

NtREV_TrRV2:CACTGTAGCCAGAGACCACA的组合。

如上所示，为了NtREV的表达抑制，选自位于HD-Zip结构域的下游侧(3’侧)的翻译区域的序列作为RNAi触发器序列，为了NtBl1的表达抑制，选自位于Myb结构域的下游侧(3’侧)的翻译区域的序列作为RNAi触发器序列，为了NtLS的表达抑制，选择翻译区域的5’末端侧作为RNAi触发器序列，为了#15360的表达抑制，选择包含了bHLH结构域的序列作为RNAi触发器序列，为了#07437的表达抑制，选择NAM结构域区域的序列作为RNAi触发器序列。另外，通过PCR扩增的各RNAi触发器序列设计为在5’末端添加CCAC、且RNAi触发器序列为400～500bp的长度。

将PCR产物克隆于pENTR(商标)/D-TOPO载体(Life Technology)，在确认了各RNAi触发器序列的碱基序列后，使用Gateway LR Clonase II Enzyme Mix(Life Technology)将各RNAi触发器序列导入了pSP231载体。为了确认导入的序列，将导入pSP231载体(是在pHellsgate12(参照文献：Wesley et al.,2001,Plant J.,27,581-590)的SacI部位插入了GFP(Green-fluorescent protein基因)表达盒而得到的载体，是触发器序列的倒位重复序列包夹着pdk/cat内含子而配置、且能够通过花椰菜花叶病毒35SRNA基因启动子表达RNAi序列的双元载体)的各RNAi触发器序列单独通过PCR使用TaKaRa Ex Taq及PrimeSTAR MaxDNA Polymerase(Takara Bio)对正义链及反义链分别进行扩增。在使用MiniElute(QIAGEN)对PCR产物进行了纯化后，进行了测序。导入pSP231载体的RNAi触发器序列的碱基序列如序列号31(NtREV)、序列号32(NtBl1)、序列号33(NtLS)、序列号34(#15360)及序列号35(#07437)所示。需要说明的是，在序列表所示的碱基序列中，省略了位于5’末端的CACC。

使用包含了各触发器序列的pSP231载体通过电穿孔对土壤杆菌(Agrobacteriumutumefaciens)LBA4404进行转化。在LBA4404中，通过PCR确认了各RNAi触发器序列被扩增后，将该土壤杆菌用于烟草的转化。

(b)烟草的转化、及转化后的种子的采种

使用品种MC1(NtBl1的转化)或SR-1(NtREV、NtLS、#15360及#07437各自的转化)通过如下所述的通常方法进行了烟草的转化。使转化后的上述土壤杆菌感染烟草叶的切片，在包含了卡那霉素的Linsmaier and Skoog培养基中进行培养，由此从得到的愈伤组织得到了卡那霉素耐性的再分化个体。从这些再分化个体中挑选了确认到叶整体中基于GFP的强荧光、及间隔物部分(PPDK内含子)高表达的个体。将挑选出的个体(T0个体)移植至3号盆，在23～25℃的封闭型温室中于一定条件下进行栽培。使T0个体进行自身繁殖，对T1种子进行了采种。

(c)T1重组体的挑选

将T1种子无菌地接种于Linsmaier and Skoog培养基，对苗的基于GFP的荧光进行观察。根据导入基因的基因型(纯合型(纯合)/半合型(杂合)及无效(null)分离个体(无效))的分离比，挑选了推测导入基因的基因座数为1～2的品系。

通过使用了从T1品系的叶或根分离得到的total RNA的qPCR，确定了对象基因的表达水平。以纯合的表达水平相对于无效的表达水平之比的形式评价了表达水平。在纯合或无效的品系中，挑选了该比小(即，对象基因的表达抑制的程度大)的品系。上述qPCR的详细情况如下所述。

使用专用的软件(PrimerExpress、ABI)进行qPCR的引物及探针的设计，或者委托Sigma-Aldrich Japan进行。如1-1.(b)中的记载所述，根据从叶或根分离得到的total RNA合成了cDNA。使用稀释至2～5倍的cDNA、如上所述得到的引物、以及Taq Man FastAdvanced Master Mix(ABI)进行了qPCR。作为定量化的对照，对eukaryotic elongationfactor-1α基因(accession No.AF120093、efla)进行了扩增。作为定量化用探针，使用了报告色素-淬灭剂的组合(FAM-TAMURA(分析对象的基因)及VIC-TAMURA(对照))。示出了qPCR用的引物及探针的序列。在以以下的各基因作为对象的序列中，第1个是正向引物，第2个是反向引物，第3个是探针。

(NtLS)

NtLS_qFW1:CCGGTACTGGAAATGACCTTGA

NtLS_qRV1:ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT

NtLS_P1:CCCTTCGTAGAACCGGAGATCGTTTAGCT

(NtBl1)

NtBl1_qFW1:GAGAAAACAAATGTAAGTACACCATTAGG

NtBl1_qRV1:GAAAAAGTTTGAATCTTCTTGCCAA

NtBl1_P1:GATTTGAAAGGGCGTTTGGGTATGGG

(NtREV)

NtREV1_qFW1:TCTCCAGGCTCCCCTGAAG

NtREV1_qRV1:TGTCCCCATGTGATAACTGTAGCT

NtREV1_P1:AACGTTGTCGCACTGGATCTGCCA

(#07437)

Nt_07437_1-F:ATGGCTACCCTACAAGCTTGAAA

Nt_07437_1-R:TTGCCAATGTGTAGTTGTTGTGG

Nt_07437_1-P:TCTTAACACAGCAACATCAGCAGAAGCAGC

(#15360)

Nt_15360_48821-F:ACTCCTGTTGAGAATGCACAAATAA

Nt_15360_48821-R:CCAGAAATATTAGTTTCTTCTCCTTGG

Nt_15360_48821-P:CCATCTGAAAATGCATAACCTGGAAGCTGC。

作为以上的挑选的结果，为了供于腋芽评价试验，对于表达受到了抑制的每个对象基因进行挑选得到的个体如下所述。

·NtREV：在评价了表达水平的10个个体的T1品系中，基因座数为1、且表现出明显的表达抑制的3个个体的T1品系(品系号：3、8及14)

·NtBl1：在评价了表达水平的15个个体的T1品系中，基因座数为1、且表现出明显的表达抑制的3个个体的T1品系(品系号：6、9及12)

·NtLS：在评价了表达水平的24个个体的T1品系中，基因座数为1、且表现出明显的表达抑制的3个个体的T1品系(品系号：10、15及19)

·#15360：在评价了表达水平的22个个体的T1品系中，基因座数为1或2、且表现出明显的表达抑制的3个个体的T1品系(品系号：11、14及17)

·#07437：在评价了表达水平的20个个体的T1品系中，基因座数为1、且表现出明显的表达抑制的3个个体的T1品系(品系号：1、10及22)。

将各重组体的T1品系组中的对象基因的表达水平之比(将无效的表达设定为1)示于以下。

·NtREV-品系3：0.56、品系8：0.57、品系14：0.74

·NtBl1-品系6：0.33、品系9：0.35、品系12：0.25

·NtLS-品系10：0.50、品系15：0.58、品系19：0.43

·#15360-品系11：0.07、品系14：0.10、品系17：0.08

·#07437-品系1：0.24、品系10：0.17、品系22：0.13。

(2-2.温室中的腋芽评价)

接种如上所述得到的各重组体的T1品系的种子，在封闭型温室或Koitotron(人工气候箱，小丝制作所)中进行栽培。将封闭型温室设定为保持23～25℃的室温的自然日长条件，将Koitotron设定为12小时日长、25℃(光照期)及18℃(黑暗期)的条件。在装有500mL/盆的肥料土的5号盆中栽培个体。肥料土的组成为：堆肥：40L，原野土：30L，赤玉土(小)：10L，赤玉土(中)：10L，蛭石：10L，肥料(S625)：1000g。

在从出蕾至开花前的期间中生长了12～13片真叶的时刻进行打顶，选择位于地上部的从下起第4片以上的真叶产生的腋芽作为评价对象。从打顶日起包括第1周在内，记录具有约5mm以上长度的茎的腋芽的数量，从芽根部通过手工操作摘取记录的对象的腋芽，测定了摘取的腋芽的新鲜重量(FW)。至无法确认新腋芽的发育为止，大约进行了5次，对腋芽的数量及重量进行了调查。

首先，将对抑制了NtREV表达的重组体(在封闭型温室中栽培)的腋芽发育进行评价的结果示于图1。对于抑制了NtREV表达的重组体的3个品系的全部纯合(在图1中，在品系数之后附加“H”)而言，与对应的无效(在图1中，在品系数之后附加“N”)相比，在二级腋芽的数量方面统计上显著减少，其中的2个品系未产生二级腋芽。另一方面，对于品系12的纯合而言，与对应的无效相比，除了一级腋芽的数量在统计上显示出显著增加这一点以外，在一级腋芽的数量及新鲜重量方面，未在纯合及无效之间确认到统计上的显著差异。需要说明的是，在图2～5中，“N”及“H”的含义与图1相同。

将对抑制了NtBl1表达的重组体(在Koitotron中栽培)的腋芽发育进行评价的结果示于图2。抑制了NtBl1表达的重组体的3个品系的全部纯合未产生二级腋芽，而对应的无效产生了二级腋芽。另一方面，在一级腋芽的数量及新鲜重量方面，未在纯合及无效之间确认到统计上的显著差异。

将对抑制了NtLS表达的重组体(在Koitotron中栽培)的腋芽发育进行评价的结果示于图3。对于抑制了NtLS表达的重组体的3个品系的全部纯合而言，与对应的无效相比，在二级腋芽的数量方面统计上显著减少。另外，与对应的无效相比，1个纯合在二级腋芽的新鲜重量方面统计上显著减少，其余2个纯合虽然在统计上不显著，但显示出新鲜重量减少。另一方面，在一级腋芽的数量及新鲜重量方面，未在纯合及无效之间确认到统计上的显著差异。

将对抑制了#15360表达的重组体(在Koitotron中栽培)的腋芽发育进行评价的结果示于图4。对于抑制了#15360表达的重组体的3个品系的全部纯合而言，与对应的无效相比，在二级腋芽的数量方面统计上显著减少。另外，与对应的无效相比，2个纯合在二级腋芽的新鲜重量方面统计上显著减少，其余1个纯合虽然在统计上并不显著，但显示出新鲜重量的减少。另一方面，与对应的无效相比，品系17的纯合除了在一级腋芽的新鲜重量方面统计上显著增加这一点以外，在一级腋芽的数量及新鲜重量方面未在纯合及无效之间确认到统计上的显著差异。

将对抑制了#07437表达的重组体(在Koitotron中栽培)的腋芽发育进行评价的结果示于图5。在抑制了#07437表达的重组体的3个品系中，与对应的无效相比，品系1的纯合在二级腋芽的数量及新鲜重量方面统计上显著减少。另外，与对应的无效相比，其余2个品系的纯合虽然在统计上并不显著，但显示出二级腋芽的数量及新鲜重量的减少。另一方面，在一级腋芽的数量及新鲜重量方面，未在纯合及无效之间确认到统计上的显著差异。

根据以上结果可知，5个对象基因的表达抑制未抑制一级腋芽的发育，而可以选择性地抑制二级腋芽的发育。

〔3.导入对象基因的突变对于腋芽发育的影响的确认(1)〕

(3-1.通过EMS处理生成的突变体)

(a)突变体的筛选

通过对种子进行甲磺酸乙酯(EMS)处理，制备了烟草(品种：Tsukuba 1号)的突变体实验对象集合(TUM)(文献：平成23年日本植物病理学会大会p234、烟草突变体实验对象集合的制备)。该突变体实验对象集合包含突变体自身繁殖后代种子(M2主体种子)组和主体DNA(bulk DNA)组，所述突变体自身繁殖后代种子(M2主体种子)组是对数千个种子进行以EMS作为突变原的处理，由每个培育出的个体(M1代)得到的，所述主体DNA组是接种上述M2种子，从培育出的各品系8个个体的幼苗中提取而得到的。以该DNA样品作为模板，对突变体文库的基因组进行了Single-strand conformation polymorphism(SSCP)分析或PCR扩增片段的直接测序，基于该结果，挑选了NtREV或NtLS中具有突变的突变体。在SSCP中，通过使用了结合荧光色素的PCR引物的PCR对靶部位进行扩增，使用毛细管电泳装置(ABI3130xlDNA analyzer)检测了扩增得到的片段。使用QIAGEN Multiplex PCR Kit(QIAGEN)按照试剂盒附带的手册实施了PCR。该PCR引物的序列如下所述。

(NtREV、S基因组)

Nt_in0_F1:TTGGTTTGGGATTTTGAGGTTTGAGG、及Nt_ex1_R1:TCCATCACTGATCTAACTAATCCAAG的组合

Ns_in1_F1:TTTGGAATTGAGGGTGAACATTGTGC、及Ns_in2_R1:ACGTTACCATTCGTCTACAGTAAGC的组合

Ns_in2_F1:CCAATAAACAAGAAACAGATGATGG、及Ns_in3_R1:GAATGGACACCATAGACGGAAAGGA的组合

Ns_in3_F1:TTTCCGTCTATGGTGTCCATTCTCC、及Ns_in4_R1:GAGACATGGCAATACTGAATTTTCA的组合

Ns_in4_F1:GAAAATTCAGTATTGCCATGTC、及Ns_in6_R1:AGCCTACGTGAAGATTGATGAGAAG的组合

(NtREV、T基因组)

Nt_in1_F1:TCGATTGGGTTGTATGAGTTAACCGT、及Nt_in2_R1:GTTACCATAAGCTGTGGAATATCAGG的组合

Nt_in2_F1:AACCAATGGACAAGAAACGGATGGCA、及Nt_in4_R1:TTTAGCTATCCAGTCAAAGAGGCACG的组合

Nt_in4_F1:AAAAAAATTCAGTATTGCCACGTGC、及Nt_in6_R1:AGCCTACGTGAAGATTGATGAGAAA的组合

(NtLS、S基因组)

LS_F2_seq:ATTTCCCCTCCTCCATCATTG、及LS1-R1:CAACAACA TTAGATGGTGTCAAG的组合

LS1-F2:CTTGACACCATCTAATGTTGTTG、及NtLS_QPCR_RV1:ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT的组合

LS1,2-F3:TTCGTAGAACCGGAGATCGT、及LS1,2_R3:GCAAAGTT GCTTCCAATGAAT的组合

LS1,2_F4:GTGGAGGCTTTGGATTATTATG、及N.t_LS_TRV_R2:GAAGACCTCTTTGTCCTTCACCATGCAG的组合

(NtLS、T基因组)

LS_F2_seq:ATTTCCCCTCCTCCATCATTG、及LS2-R1:AACATTAG ATGATGCATTAGGTGT的组合

LS2-F2:ACACCTAATGCATCATCTAATGTT、及NtLS_QPCR_RV1:ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT的组合

LS1,2-F3:TTCGTAGAACCGGAGATCGT、及LS1,2_R3:GCAAAGTT GCTTCCAATGAAT的组合

LS1,2_F4:GTGGAGGCTTTGGATTATTATG、及N.t_LS_TRV_R2:GAAGACCTCTTTGTCCTTCACCATGCAG的组合。

通过对来自于M2代的突变个体的基因组的PCR扩增片段进行克隆、并且确认该片段的碱基序列，进行了导入了突变的基因的序列鉴定。通过导入了突变的基因表达的多肽与野生型蛋白质(WT)的差异如下所述。

通过S基因组中导入了突变的NtREV表达的多肽(MT、Ns1630突变体、序列号36)与野生型蛋白质相比具有以下差异。

·MT：111aa、WT：838aa

由于第112号的谷氨酰胺(Q)变为终止密码子，因此全长缩短为111aa。

通过T基因组中导入了突变的NtREV表达的多肽(Nt1605突变体、序列号37)与野生型蛋白质相比具有以下差异。

·MT：116aa、WT：839aa

由于117号的谷氨酰胺(Q)变为终止密码子，因此全长缩短为116aa。

通过T基因组中导入了突变的NtREV表达的多肽(Nt5850突变体、序列号38)与野生型蛋白质相比具有以下差异。

·MT：68aa、WT：839aa

由于69号的谷氨酰胺(Q)变为终止密码子，因此全长缩短为68aa。

通过T基因组中导入了突变的NtLS表达的多肽(Nt1145突变体、序列号39)与野生型蛋白质相比具有以下差异。

·MT：398aa、WT：410aa

由于399号的谷氨酰胺(Q)变为终止密码子，因此全长缩短为398aa。

通过T基因组中导入了突变的NtLS表达的多肽(Nt1025突变体、序列号40)与野生型蛋白质相比具有以下差异。

·MT：145aa、WT：410aa

由于146号的谷氨酰胺(Q)变为终止密码子，因此全长缩短为145aa。

通过S基因组中导入了突变的NtLS表达的多肽(Ns369突变体、序列号41)与野生型蛋白质相比具有以下差异。

·MT：163aa、WT：407aa

由于164号的谷氨酰胺(Q)变为终止密码子，因此全长缩短为163aa。

(b)从M2突变体组挑选希望的突变体

从推测靶基因中具有突变的M2突变体组中按照以下步骤制备了T基因组及S基因组两者中纯合地具有靶基因突变的突变体(T⁺S⁺)、以及T基因组及S基因组两者中不具有靶基因的突变的突变体(T^-S^-)。

首先，从M2突变体组中挑选了以下的4个群组。

T基因组中纯合地具有靶基因突变的M2突变体(T⁺)

S基因组中纯合地具有靶基因突变的M2突变体(S⁺)

T基因组中不具有靶基因突变的M2突变体(T^-)

S基因组中不具有靶基因突变M2突变体(S^-)

然后，使T⁺及S⁺交配而制备得到的F1品系进行自身繁殖，制备了目标的F2突变体(T⁺S⁺)。同样地制备了T^-S^-。

在上述步骤中，为了确定有无基因组上的突变，按照下一段的记载实施了CycleavePCR法。作为确认NtREV基因的突变的CycleavePCR中的模板，使用了通过简易提取法提取出的基因组DNA。作为确认NtLS基因的突变的CycleavePCR中的模板，将从基因组DNA(T及S基因组分别)通过PCR扩增而得到的片段稀释至300～500倍来使用。该PCR使用TksGflex(商标)DNA polymerase(Takara Bio)实施，该PCR的反应条件及引物如下所述。

(反应条件)

94℃下30秒钟

以98℃下10秒钟、55℃下15秒钟及68℃下90秒钟作为1个循环，35个循环

68℃下90秒钟

(引物)

T基因组

NtLS_prePCR_Ntom_F1:CCCAGACCCCCTTTTCCTCT

NtLS_prePCR_Ntom_R1:AATTTCCCTTATAATTTAACGCC

S基因组

NtLS_prePCR_Nsyl_F1:CCCTAGAGAGACCCCTTTTTC

NtLS_prePCR_Nsyl_R1:GGGTTTTAAATTTAACGCCAA。

使用从Takara Bio的网页可用的Cycleave(注册商标)RPCR Assay Designer(SNPs)设计了CycleavePCR法用的引物及探针(表1)。与该引物及探针一起使用CycleavePCR Reacrion Mix(Takara Bio)，按照该公司提供的手册实施了CycleavePCR法。使用Applied Biosystems(注册商标)StepOnePlus(商标)实时PCR系统(Thermo Fisher)实施了PCR反应。

[表2]

(c)农田中的腋芽评价

农田中的栽培

在烟叶研究所田地中，在通常的耕作期(3月播种、4月种植)，以垄长16m、垄间120cm、株间43cm、37株/垄的条件下，通过高垄及多栽培法栽培了突变体的各品系。1个品系的栽培分配1垄，根据外观判断并预挑选在从移植起1个月后显示出相同的生长程度的10～15个个体，将其中的10个个体继续供于试验。试验中没有使用任何腋芽抑制剂(例如，CONTACT)。

开花期的确定

在开花的时期确定了地上叶数、以及在即将打顶前确定了推定的开花期。对第1花枝+1～4片的叶进行切除来打顶，在进行比较、评价的品系之间使地上叶数一致。

腋芽发育的评价

从打顶及打顶日起包括第1周在内，总计7次记录茎长度达到约5mm的腋芽的数量，通过手工操作从芽根部摘取记录的对象的腋芽，测定了摘取的腋芽的新鲜重量(FW)。对于一级腋芽、二级腋芽及三级腋芽，对每个个体总结了记录及测定的结果。

将对在NtREV中导入了突变的突变体的腋芽发育进行评价的结果示于图6。NtREV_Homo品系(T⁺S⁺)未产生二级腋芽及三级腋芽。NtREV_Null品系(T^-S^-)产生了二级腋芽及三级腋芽(与T⁺S⁺相比在统计上有显著差异)。另一方面，在一级腋芽的数量及新鲜重量方面，未在2组之间确认到在统计上有显著差异。

将对在NtLS中导入了突变的突变体的腋芽发育进行评价的结果示于图7。与NtLS_Null品系(T^-S^-)相比，NtLS_Homo品系(T⁺S⁺)在二级腋芽的数量及新鲜重量方面统计上显著减少。而且，未产生三级腋芽(与NtLS_Null品系在统计上具有显著差异)。另一方面，在一级腋芽的数量及新鲜重量方面，未在2组之间确认到在统计上有显著差异。

根据以上的结果可知，对于NtREV或NtLS的突变体而言，与基因表达的抑制相同，可以选择性地抑制二级腋芽(及三级腋芽)的发育。

(3-3.通过CRISPR/Cas9 system生成的NtBl1的突变体)

(a)转化的准备

作为转化土壤杆菌的载体，使用了双元载体pRI-201-AN(Takara Bio)。在pRI-201-AN的NdeI-SalI之间导入了对植物用途进行了密码子最优化的pcoCas9(参考文献2)，在KpnI-BamHI之间导入了sgRNA表达盒。作为引导序列GN₂₀GG用的启动子，使用了AtU6-1(参考文献3)，作为引导序列AN₂₀GG用的启动子，使用了AtU3B(参考文献4)，而且作为scaffold-polyT序列，使用了参考文献2中报道的序列。将构建而成的载体的示意图示于图8(图中的target sequence为本文中的引导序列)。即，除了3’末端的PAM序列(NGG)以外的引导序列设计为在启动子及scaffold-polyT序列之间插入的sgRNA表达盒。委托从Life Technology的GeneArt(注册商标)Strings(商标)DNA Fragments合成了在5’末端添加了KpnI位点且在3’末端于末端侧添加了BamHI位点的sgRNA表达盒(化学式1)。委托Takara Bio进行了在5’末端添加了NdeI位点且在3’末端添加了SalI的Cas9的人工合成，获得了该Cas9(化学式2及3)。

[化学式1]

下划线部分表示引导序列，其上游表示AtU3B启动子序列，其下游表示scaffold-polyT序列，末端小写字母表示KpnI、BamHI的限制酶序列。

[化学式2]Cas9序列

序列接下页

[化学式3]

Cas9序列接上页

在跨过2页以上的Cas9序列中，下划线部分表示NdeI、SalI序列。

使用导入了Cas9及sgRNA表达盒的pRI201-AN，通过电穿孔对土壤杆菌LBA4404进行了转化。在含有25μg/ml的卡那霉素的AB板上使土壤杆菌增殖，分离了单菌落的土壤杆菌。

(b)烟草的转化、以及转化体的栽培

将从播种第10天的烟草(品种：SR-1)上采集的子叶片与如上所述得到的转化后的土壤杆菌共存培养3天。然后，使用含有抗菌剂(头孢噻肟)的蒸馏水清洗子叶片，从而从子叶片上除去土壤杆菌。将清洗后的子叶片在含有抗菌剂的Linsmaier and Skoog培养基中培养4天，由此完全除去了土壤杆菌。然后，将子叶片转移至含有抗生素(卡那霉素)的Linsmaier and Skoog培养基中进行培养，得到了卡那霉素耐性的再分化个体(幼苗)。将幼苗转移至Linsmaier and Skoog培养基使其生根。从生根的幼苗中选择高表达(与对照的eukaryotic elfa相比为2倍以上的表达量)Cas9mRNA的个体，移植至装有移植用土(堆肥：40L、原野土：30L、赤玉土(小)：10L、赤玉土(中)：10L、蛭石：10L、肥料(S625)：1000g)的3号盆中，使其生长。

(c)有无突变及突变序列的确认

以从烟草转化体的叶中提取出的基因组DNA作为模板，使用Tks Gflex(商标)DNApolymerase(Takara Bio)进行了PCR。PCR中的反应条件及引物如下所述。

(反应条件)

94℃下30秒钟

以98℃下10秒钟、55℃下15秒钟及68℃下60秒钟作为1个循环，40个循环

68℃下60秒钟

(引物)

T基因组

NtBl1-1_2A_F1:AAGTATTACTACTACAAAATTCCAACG、及

Nb_Bl1_2A_R1:CCATCTGATGAAGAACAACTTGC的组合

S基因组

NtBl1-2_1A_F1:TTAAACACTAGAGAGTGAGAGAGTGC、及

NtBl1-2_2A_F1:CAGATGTTTAATTATTAAGACAAAGTTCC的组合。

在PCR反应后，在下述条件下进行了变性/退火。变性：95℃5分钟，退火：85℃1秒钟/85℃1秒钟、60℃1秒钟、30℃恒定。85～60℃的Ramp Rate(变温速率)为5％(0.1℃/秒的下降率)，60～30℃的Ramp Rate为10％(0.1℃/秒的下降率)。在10μl的反应体系中使用1U的T7 endonuclease I(New England Biolabs)处理变性/退火后的5μl的PCR产物，通过电泳进行分离，确认了PCR产物是否受到酶的切断。另行使用Zero Blunt TOPO PCR CloningKit克隆PCR产物，确定了其碱基序列。

(d)重组体的挑选

使T基因组及S基因组两者中具有突变(缺失或插入1碱基以上)的T0世代个体自身繁殖，进行采种，由此得到了T1品系。与(c)同样地确认了T1品系的个体中有无突变。根据确认的结果，使在T基因组及S基因组中纯合地具有突变的T1品系(T⁺S⁺)的个体自身繁殖而得到T2品系(T⁺S⁺)的个体，将其用于试验。

得到的T2品系的个体中的突变体多肽

·2A-1_121、2A-1_126、2A-133_1、2A-161_17(Bl1-1-T基因组：1b deletion)

WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至107个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的12个氨基酸(TGILNSRKSLWD)的多肽(序列号92、94、96、106)

·2A-1_121、2A-1_126(Bl1-2-S基因组：5b deletion)

WT由337个氨基酸构成，与此相对，生成在至106个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的3个氨基酸(LEY)的多肽(序列号91、93)

·2A-133_1(Bl1-2-S基因组：3b deletion)

生成WT的337个氨基酸中第107号N(天冬酰胺)缺失的337个氨基酸的多肽(序列号95)

·2A-161_8、2A-161_122(Bl1-1-T基因组：22b deletion)

WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至101个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的11个氨基酸(EILNSRKSLWD)的多肽(序列号104、108)

·2A-161_8、2A-161_17、2A-161_122(Bl1-2-S基因组：2b deletion)

WT由337个氨基酸构成，与此相对，生成在至106个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的4个氨基酸(KLEY)的多肽(序列号103、105、107)。

(e)温室中的腋芽评价

在温室中栽培(d)中得到的T2品系的个体(T⁺S⁺)，对腋芽进行了评价。评价的详细情况如2-2.中记载所述。

将对在NtBl1中导入了突变的突变体的腋芽发育进行评价的结果示于图9及10。如图9及10所示，在NtBL1基因中导入了突变的个体均在一级腋芽的数量及重量方面未显示出与野生型的显著差异，而在二级腋芽的数量及重量方面与野生型相比显示出在统计上显著减少。

根据以上的结果可知，对于NtBl1的突变体而言，与基因表达的抑制相同，可以选择性地抑制二级腋芽的发育。

〔4.对象基因中导入的突变对腋芽的发育位置的影响的确认〕

与WT(SR-1)同样地在Koitotron中栽培通过CRISPR/Cas9 system制备的NtBl1突变体。在从打顶起1周后确认了一级腋芽的发育位置(图11上)。从Tsukuba 1号突变体实验对象集合中进行挑选，将制备的NtLS突变体(Homo品系)与NtLS突变体(Null品系)同样地在农田中进行栽培。在移植第63天确认了一级腋芽的发育位置(图11下)。

如图11所示，在2个突变体中，一级腋芽形成于偏离叶腋的位置。因此，从这些突变体上摘取一级腋芽是极其容易的。其原因是由于在摘取腋芽时会产生如下问题。在摘取腋芽时，如果腋芽形成于叶腋，则又是会对带有收获叶的侧枝造成损伤。这样的损伤可能成为病原体的侵入途径，因此对叶的产量及品质造成严重的不良影响。

〔5.对象基因中导入的突变对于烟草植物的生长的影响的确认〕

(a)试验对象

对于使3-2.(c)中评价的品系、以及3-3.(e)中评价的Bl1_2A-1_121自身繁殖而得到的后代的T3品系，如下所述研究了各基因的突变对于植物体的生长的影响。作为比较组，使用了用于制备各突变体的品种。

(b)条件

在温室(25℃恒定)中，将种植于3号盆中的各个体栽培至出蕾。肥料土的组成与2-2.相同。在出蕾时，测定了各个体的株高、新鲜重量及干燥重量、以及各叶位的叶长及叶宽。株高是从盆的肥料土表面至最上位花枝的根部的长度。新鲜重量是刚刚收获了16片(NtLS突变体、NtREV突变体)或14片(NtBl1突变体)的地上叶后、收获叶及植物体的总重量。干燥重量是测定了新鲜重量后的收获叶及植物体在70℃及相对湿度7％下进行热风干燥后的重量。叶长是从叶柄至叶的前端在纵方向上的长度，叶宽是叶的横宽的最大长度。为了确定叶长及叶宽，按照从最下位叶(1)起至上位的顺序赋予表示叶位的编号。

(c)结果

如图12(突变体：n＝3、WT(Tsukuba 1号)：n＝2)、图13(突变体及WT(Tsukuba 1号)：n＝3)、以及图14(突变体：n＝2、WT(Tsukuba 1号)：n＝3)分别表明，对于株高、新鲜重量及干燥重量，在突变体组及对照组之间没有确认到统计上有显著差异。而且，根据这些图可知，对于叶长及叶宽，在突变体组及对照组之间也没有确认到显著差异。

以上结果表明，各突变体显示出与对照组实质上相同程度的生长及叶的产量。因此可知，对于这些实施例的突变体而言，由于(1)腋芽处理容易、(2)不发生产量降低、(3)植物体的生存性高等原因，作为以收获叶为目的的烟草植物，是极其有用的。

〔6.对象基因中导入的突变对于腋芽发育的影响的确认(2)〕

制备具有以下的特征(profile)的突变体，对该突变体的成长状态、腋芽发育及使用了腋芽抑制剂的情况下的腋芽发育进行了评价。

LS_21_Null：是使Ns369突变体与Nt1025突变体交配而得到的F1进行了2次自身繁殖而成的F3个体，是S基因组中纯合地具有Ns369突变体(表达序列号41的多肽)的突变、且T基因组中纯合地具有Nt1025突变体(表达序列号40的多肽)的突变的突变体(T⁺S⁺)。

LS19_WT：是使Ns369突变体与Nt1025突变体交配而得到的F1进行了2次自身繁殖而成的F3个体，是T基因组、S基因组两者中不具有LS基因的突变的突变体(T^-S^-)

LS15_Null、LS85_Null：是使Ns369突变体与Ns1145突变体交配而得到的F1进行2次自身繁殖而成的F3个体，是S基因组中纯合地具有Ns369突变体(表达序列号41的多肽)的突变、且T基因组中纯合地具有Nt1145突变体(表达序列号39的多肽)的突变的突变体(T⁺S⁺)。

LS_57_WT：是使Ns369突变体与Ns1145突变体交配而得到的F1进行2次自身繁殖而成的F3个体，是T基因组、S基因组两者中不具有LS基因的突变的突变体(T^-S^-)

REV_26_Nu-W及REV_89_Nu-W：T基因组中纯合地具有Nt1605突变体(表达序列号37的多肽)的突变、且S基因组中纯合地具有Ns1630突变体(表达序列号39的多肽)的突变的突变体(T⁺S⁺)与K326交配而得到了F1。使K326与F1进行1次回交而得到的BC1F1进行2次自身繁殖，得到了BC1F3个体。在该BC1F3个体当中，将T基因组中纯合地具有Nt1605突变体(表达序列号37的多肽)的突变、且S基因组中不具有REV基因的突变的突变体(T⁺S^-)作为REV_26_Nu-W及REV_89_Nu-W。

REV_26_Nu-He及REV_89_Nu-He：T基因组中纯合地具有Nt1605突变体(表达序列号37的多肽)的突变、且S基因组中纯合地具有Ns1630突变体(表达序列号39的多肽)的突变的突变体(T⁺S⁺)与K326交配而得到了F1。使K326与该F1进行1次回交而得到的BC1F1进行2次自身繁殖，得到了BC1F3个体。在该BC1F3个体当中，将T基因组中纯合地具有Nt1605突变体(表达序列号37的多肽)的突变、且S基因组中杂合地具有Ns1630突变体(表达序列号39的多肽)的突变的突变体(T⁺S^+/-)作为REV_26_Nu-He及REV_89_Nu-He。

REV35_WT：T基因组中纯合地具有Nt1605突变体(表达序列号37的多肽)的突变、且S基因组中纯合地具有Ns1630突变体(表达序列号39的多肽)的突变的突变体(T⁺S⁺)与K326交配而得到了F1。使K326与该F1进行1次回交而得到的BC1F1进行2次自身繁殖，得到了BC1F3个体。在该BC1F3个体当中，将T基因组、S基因组两者中不具有REV基因的突变的突变体(T^-S^-)为REV35_WT。

REV_F3_Null：是使Nt1605突变体与Ns1630突变体交配而得到的F1进行了2次自身繁殖而成的F3个体，是T基因组中纯合地具有Nt1605突变体(表达序列号37的多肽)的突变、且S基因组中纯合地具有Ns1630突变体(表达序列号39的多肽)的突变的突变体(T⁺S⁺)。

REV_F3_WT：是使Nt1605突变体与Ns1630突变体交配而得到的F1进行了2次自身繁殖而成的F3个体，是T基因组、S基因组两者中不具有REV基因的突变的突变体(T^-S^-)。

(1)生长状态的评价

调查中使用了3个品系的LS突变体无效品系、2个品系的作为该突变体无效品系的对照的品系、以及作为突变体的亲本品种的Tsukuba 1号。作为突变体无效品系，使用了LS_21-1_Null、LS_15_Null、以及LS_85_Null。作为突变体无效品系的对照，作为突变体无效品系LS_21-1_Null的对照，使用了F2分离品系中LS不具有突变的LS_19_WT，作为突变体无效品系LS_15_Null及LS_85_Null的对照，使用了F2分离品系中LS不具有突变的LS_57_WT。

在烟叶研究所田地中，于稍晚于通常的耕作期(3～4月播种、5月种植)在株间43cm、垄间120cm的条件下，通过高垄及多栽培法栽培了上述的各品系的个体。作为肥料，使用了2000kg/10a的堆肥，120kg/10a的Agri 622。对栽培的各品系的个体的开花天数、株高、地上叶数、鲜叶重、以及干燥重量进行了评价。需要说明的是，在本说明书中，开花天数是从播种日至第一朵花开花的天数。株高是指从地面至最上位花枝的根部的高度。地上叶数是指位于从地上至最接近第一花枝下方的叶的位置的叶的总数。将地上叶的全部叶在干燥前的总重量作为鲜叶重，将地上叶的全部叶在干燥后的重量作为干燥重量。每个品系各评价了6个个体，计算出各自的评价值的平均值和标准偏差。对突变体无效品系与对照之间在各评价值方面是否存在统计上的显著差异进行了调查。

参照图15对结果进行说明。除了LS_15_Null的株高比对照(LS_57_WT)显著增高、LS_15_Null的开花天数比对照(LS_57_WT)显著缩短这一点和LS_85_Null的地上叶数比对照(LS_57_WT)显著增多这一点以外，对照与突变体无效品系之间在评价值方面没有观察到显著差异。由此可以认为，LS基因的突变没有对生长造成很大影响。

(2)腋芽发育的评价

与(1)同样地栽培了各个体。作为LS突变体及其对照，使用突变体无效品系(LS_21)及其对照(LS_19_WT)、LS无效突变体(LS_15、LS_85)及其对照(LS57_WT)进行了试验。LS_21通过在2块田中栽培而进行了反复试验。作为REV突变体及其对照，使用了进行了回交的BC2F3分离品系(回交亲本：K326)的4个品系(REV_26_Nu-W、REV_26_Nu-He、REV89_Nu-W、REV_89_Nu-He)及其对照(REV_35_WT)。另外，作为REV突变体及其对照，使用了未进行回交的REV无效突变体(REV_F3_Null)及其对照(REV_F3_WT)。另外，试验中使用了作为各突变体的亲本品种的Tsukuba 1号及BC2F3分离品系的回交亲本K326。

在开花期于最接近第一花枝下方进行打顶，调查了地上叶上产生的腋芽。打顶当日进行第1次调查，随后每1周进行总计8次调查。以腋芽的茎长为5mm以上的腋芽作为调查对象，对每个个体记录采集腋芽时该腋芽的位置，在采集腋芽后测定了该腋芽的重量。一级腋芽、二级腋芽及三级腋芽分别单独进行总结、调查及统计。

以下，参照图16及17对结果进行说明。图16示出了LS突变体的评价结果，图17示出了REV突变体的评价结果。

如图16所示，3种LS突变体无效品系与对照相比，均观察到一级腋芽的数量多、鲜叶重(FW)少的倾向。作为LS突变体无效品系的一级腋芽的数量多的原因，作为可能性可以举出，与对照相比，LS突变体无效品系中具有地上叶数量多的倾向(图15)。另一方面，二级腋芽、三级腋芽比对照大幅减少、或者完全未形成。根据以上的结果可以确认，在LS具有不同的突变的突变体中，二级腋芽及二级以上腋芽的腋芽形成受到抑制。

如图17所示，在REV基因的全部等位基因中导入了突变的REV_F3_Null中，完全未形成二级腋芽及三级腋芽。另外，在T基因组中的2个等位基因及S基因组中的1个等位基因中具有突变的2个品系(REV_26_Nu-He、REV_89_Nu-He)中，虽然形成了二级腋芽，但与对照(REV_35_WT)相比，数量及鲜叶重均减少为1/2以下，该减少在统计上是显著的。

另一方面，在T基因组中的2个等位基因中具有突变、且S基因组中不具有突变的2个品系(REV_26_Nu-W、REV_89_Nu-W)中，二级腋芽的数量及鲜叶重与对照(REV_35_WT)相同。根据以上结果可以确认，关于REV基因，即使不在T基因组及S基因组中的全部等位基因中导入突变，只要在总计3个等位基因中导入了突变，就具有二级腋芽抑制效果。

(3)使用了腋芽抑制剂的情况下的腋芽发育

使用装有5L肥料土的菊盆(内径25cm、高24cm)，在大棚中进行了栽培。肥料土的组成为堆肥：40L，原野土：10L，桐生砂：15L，赤玉土(小)：15L，赤玉土(中)：15L，蛭石：10L，BareS625(肥料)：1000g。在5月进行播种，移植后经过了1.5个月左右后追加了2L肥料土。在开花期切除第一花枝下方2片为止(打顶)，3天后对每株喷洒了20ml的稀释至30倍的CONTACT(OAT AGRIO)。喷洒4～7天后调查了CONTACT是否接触一级腋芽，记录未接触CONTACT的一级腋芽，在伸长后出去未接触CONTACT的一级腋芽。此后，将从CONTACT未接触一级腋芽的部位形成的二级腋芽排除在调查对象以外。CONTACT未接触一级腋芽的部位在每株平均存在1～2个部位。喷洒CONTACT后，每周1次、共13次调查了二级腋芽的产生。每个品系的平均着叶数为25～31片不等，因此对单位着叶数产生的二级腋芽的比例进行了比较。对于作为LS的无效突变体的LS_15_null及LS_85_null、作为它们的对照的LS中不具有突变的LS_77_wt、作为LS的无效突变体的LS_14_null及LS24_null、作为它们的对照的LS中不具有突变的LS_19_wt进行了比较。

参照图18对结果进行了说明。喷洒CONTACT后产生的二级腋芽的数量(单位着叶数)因LS基因的突变而在统计上显著地大幅减少。

〔7.对象基因中导入的突变对于腋芽发育的影响的确认(3)〕

(7-1.REV突变体及#15360突变体)

使用CRISPR/Cas9 system制备新的突变体，评价了腋芽发育。制备的步骤按照3-3.的记载进行，因此仅对3-3.的变更点进行说明。

(a)转化的准备

在转化土壤杆菌的载体的构建中，委托Life Technology进行了sgRNA表达盒的合成。得到的sgRNA表达盒的碱基序列如下所述。

[化学式4]

[化学式5]

[化学式6]

在以上的3个sgRNA表达盒中，下划线部分表示引导序列，其上游表示AtU6-26启动子序列，其下游表示scaffold-polyT序列，末端小写字母表示KpnI、BamHI的限制酶序列。

(b)烟草的转化及转化体的栽培

烟草植物体的转化及转化体的栽培除了基于Cas9 mRNA水平进行了个体的挑选这一点以外，如3-3.(b)的记载所述。

(c)有无突变及突变序列的确认

如3-3.(c)的记载所述实施了栽培的转化体中有无突变及突变序列的确认。设计了使位于基因组DNA上的包含引导序列的区域特异性扩增的引物。将各引物的序列示于以下的表中。

[表3]

PCR的反应条件如下所述。

(REVG2)

94℃下60秒钟

以98℃下10秒钟、60℃下15秒钟及68℃下50秒钟作为1个循环，45个循环

(REVG5、ROXG1)

94℃下60秒钟

以98℃下10秒钟、62℃下15秒钟及68℃下50秒钟作为1个循环，45个循环。

(d)重组体的挑选

使T基因组及S基因组两者中具有突变(缺失或插入1个碱基以上)的T0世代个体自身繁殖，进行采种，得到了T1品系。使用表3的引物确认了T1品系的个体中有无突变及其序列。挑选S基因组及T基因组两者的等位基因的4个部位全部具有突变的T1个体，用于试验。得到的T1个体的详细情况如下所述。

REV_G2-15

T基因组：缺失了6个碱基CAAGGC。WT由839个氨基酸构成，与此相对，生成由缺失了第175～176号这2个氨基酸(KA)的837个氨基酸构成的多肽(序列号65)。

S基因组：插入了1个碱基A。WT由838个氨基酸构成，与此相对，生成在至176个氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的5个氨基酸(YRNCC)的多肽(序列号64)。

REV_G2_94

T基因组：插入了1个碱基T。WT由839个氨基酸构成，与此相对，生成在至176个氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的5个氨基酸(YRNCC)的多肽(序列号67)。

S基因组：插入了1个碱基T。WT由838个氨基酸构成，与此相对，生成在至176个氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的5个氨基酸(YRNCC)的多肽(序列号66)。

REV_G5_18

T基因组：插入了1个碱基C。WT由839个氨基酸构成，与此相对，生成在至212个氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的4个氨基酸(MWSC)的多肽(序列号68)。

S基因组：插入了5个碱基TCGAC。WT由838个氨基酸构成，与此相对，生成在至212个氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的7个氨基酸(RHVVLLV)的多肽(序列号69)。

REV_G5_59

T基因组：缺失了28个碱基。WT由839个氨基酸构成，与此相对，生成在至211氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的54个氨基酸(QRLLRSSKIDLLGSEIAGTLKFSQCFLQEMEQLNFCTRRYMLLP PWLLHVIFGL)的多肽(序列号71)。

S基因组：缺失了3个碱基GCA。WT由838个氨基酸构成，与此相对，生成由第212号的1个氨基酸(A)缺失的837个氨基酸构成的多肽(序列号70)。

ROX_G1-1(15360_G1-1)、ROXG1-30(15360_G1-30)

T基因组：插入了1个碱基A。WT由165个氨基酸构成，与此相对，生成在至40个氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的3个氨基酸(KKA)的多肽(序列号123、125)。

S基因组：缺失了1个碱基A。WT由168个氨基酸构成，与此相对，生成在至40个氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的14个氨基酸(EGIESVIVSRFCRV)的多肽(序列号122、124)。

ROX_G1-131(15360_G1-131)

T基因组：缺失1个碱基A。WT由165个氨基酸构成，与此相对，生成在至40个氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的14个氨基酸(EGIESVIVSRFCRV)的多肽(序列号129)。

S基因组：插入了39个碱基及13个碱基。WT由168个氨基酸构成，与此相对，生成在至39个氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的4个氨基酸(FLCG)的多肽(序列号128)。

ROX_G1-46(15360_G1-46)

T基因组：缺失了20个碱基。WT由165个氨基酸构成，与此相对，生成在至36个氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的3个氨基酸(ENQ)的多肽(序列号127)。

S基因组：插入了1个碱基G。WT由168个氨基酸构成，与此相对，生成在至40个氨基酸为止与WT相同的氨基酸序列的基础上添加了无关的3个氨基酸(EKA)的多肽(序列号126)。

(e)温室中的腋芽发育的评价

在温室中栽培(d)中得到的T1品系的个体，如2-2.中记载所述进行了评价。将REV突变体的评价结果示于图19及20，将#15360突变体的评价结果示于图21。

如图19及20所示，在REV中导入了突变的全部4个品系中，在一级腋芽的数量及新鲜重量方面与野生型之间没有显著差异，二级腋芽的数量及新鲜重量与野生型相比在统计上显著减少。如图21所示，在#15360中导入了突变的全部4个品系中，在一级腋芽的数量及新鲜重量方面未显示出与野生型具有显著差异，二级腋芽的数量及新鲜重量与野生型相比显示出统计上显著减少。根据以上的结果可知，对于REV而言，不仅是从通过EMS处理制备的TUM中挑选的突变体，而且通过CRISPR/Cas9 system制备的多个不同的突变体也可选择性地抑制二级腋芽的发育。对于#15360而言，在通过CRISPR/Cas9 system制备的多个不同的突变体中，与基因表达的抑制相同，确认了二级腋芽的发育受到选择性抑制。

(7-2.Bl1突变体及LS突变体)

(a)转化的准备

在转化土壤杆菌的载体的构建中，委托Life Technology从GeneArt(注册商标)Strings(商标)DNA Fragments合成在5’末端添加了KpnI位点且在3’末端于末端侧添加了BamHI位点的sgRNA表达盒。得到的sgRNA表达盒的碱基序列如下所述。

[化学式7]

在上述序列中，下划线部分表示引导序列，其上游表示AtU6-1启动子序列，其下游表示scaffold-polyT序列，末端小写字母表示KpnI、BamHI的限制酶序列。

另外，利用Eurofinsgenomics的人工基因合成服务合成了在5’末端添加了KpnI位点、且在3’末端于末端侧添加了BamHI位点的sgRNA表达盒。得到的sgRNA表达盒的碱基序列如下所述。需要说明的是，接下来，在烟草转化及转化体的栽培中从3-3.没有变更点，因此省略说明。

[化学式8]

[化学式9]

[化学式10]

在上述3个序列中，下划线部分表示引导序列，其上游表示AtU3B启动子序列，其下游表示scaffold-polyT序列，末端小写字母表示KpnI、BamHI的限制酶序列。

(b)有无突变及突变序列的确认

如3-3.(c)中记载所述实施了栽培的转化体中有无突变及突变序列的确认。设计了对位于基因组DNA上的、包含引导序列的区域特异性扩增的引物。将各引物的序列示于以下。另外，如以下所示，仅变更了一部分PCR条件实施。

(2A-1_14、2A-1_19、2A-1_119、2A-1_120、2A_133_17、2A_133_122、2A_133_142：T基因组)

NtBl1-1_2A_F1:AAGTATTACTACTACAAAATTCCAACG、及

Nb_Bl1_2A_R1:CCATCTGATGAAGAACAACTTGC的组合

(2A-1_14、2A-1_19、2A-1_119、2A-1_120、2A_133_17、2A_133_122、2A_133_142：S基因组)

NtBl1-2_1A_F1:TTAAACACTAGAGAGTGAGAGAGTGC、及NtBl1-2_2A_F1:CAGATGTTTAATTATTAAGACAAAGTTCC的组合

(2G-35_10、2G-37_103、2G-126_10、2G-126_139：T基因组)

NtBl1-1_2G_F1:ATATGTTTGAATATAGGGGGAGGG、及NtBl1-1_2G_R1:TGGTTTACAAAAGGAAAAGTTTTC

(2G-35_10、2G-37_103、2G-126_10、2G-126_139：S基因组)

NtBl1-2_2G_F1:ATATGTTTGAGTATAAAGGGAGGA、及NtBl1-2_2G_R1:TTGGTTTACTAGAGAAAAAATTTCC的组合

(LS_1A-8_4、13、LS_1A-9_32、48：T基因组)

LS_1A_F_T:TACCGGTACTGGAAATGACCTC、及LS_1A_R_T:TCC TTAACATTTCGCGGTCT的组合

(LS_1A-8_4、13、LS_1A-9_32、48：S基因组)

LS_1A_F_S:CCGGTACTGGAAATGACCTTG、及LS_1,2_R3:GCAA AGTTGCTTCCAATGAAT的组合

(LS_3A-12、LS_3A-15、及LS_3A-30：T基因组)

LS_3A_4G_F_T:GTTTGGTTCGGAAGAGAAATTATAG、及LS_3A_4G_R_T:CTTTGTCCTTCACCATGCAG的组合

(LS_3A-12、LS_3A-15、及LS_3A-30：S基因组)

LS_3A_4G_F_S:TTGGTTCGGGAGAGAAATAATTGA、及LS_3A_4G_R_S:CGCCAAGAAGATATGGAAAA的组合

(Bl_4A-11、Bl_4A-13、Bl4A-16：T基因组)

Bl_3A_4A_F_T:ATTTCTTCTGCCCACCAGC、及Bl_3A_4A_R_ST:TCTCATCATTGAACACGAACA的组合

(Bl_4A-11、Bl_4A-13、Bl4A-16：S基因组)

Bl_3A_4A_F_S:CCTAATTTGGGTGCTACAAATAAT、及Bl_3A_4A_R_ST:TCTCATCATTGAACACGAACA的组合。

(变更的一部分PCR条件)

LS_1A的T基因组

94℃下60秒钟

以98℃下10秒钟、57℃下15秒钟及68℃下50秒钟作为1个循环，40个循环

LS_1A的S基因组

94℃下60秒钟

以98℃下10秒钟、65℃下15秒钟及68℃下50秒钟作为1个循环，45个循环

LS_3A的T基因组

94℃下60秒钟

以98℃下10秒钟、55℃下15秒钟及68℃下35秒钟作为1个循环，45个循环

LS_3A的S基因组

94℃下60秒钟

以98℃下10秒钟、60℃下15秒钟及68℃下50秒钟作为1个循环，40个循环

Bl_4A的T基因组、S基因组

94℃下60秒钟

以98℃下10秒钟、60℃下15秒钟及68℃下50秒钟作为1个循环，40个循环。

(c)重组体的挑选

按照3-3.中的记载挑选了以下的T2品系及T1品系。首先，将得到的T2品系的个体中的突变体多肽示于以下。

2A-1_14

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至107个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的12个氨基酸(TGILNSRKSLWD)的多肽(序列号84)。

S基因组：WT由337个氨基酸构成，与此相对，生成与WT相同的多肽、以及与WT在至106个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的3个氨基酸(LEY)的多肽(序列号83)。

2A-1_19

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成与WT相同的多肽、以及与WT在至107个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的12个氨基酸(TGILNSRKSLWD)的多肽(序列号86)。

S基因组：WT由337个氨基酸构成，与此相对，生成在至106个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的3个氨基酸(LEY)的多肽(序列号85)。

2A_133_17

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至107个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的12个氨基酸(TGILNSRKSLWD)的多肽(序列号98)。

S基因组：由与WT相同的337个氨基酸构成的多肽(序列号97)。

2A_133_122

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至107个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的12个氨基酸(TGILNSRKSLWD)的多肽(序列号100)。

S基因组：WT由337个氨基酸构成，与此相对，生成与WT相同的多肽、以及由WT的第107号天冬酰胺缺失的336个氨基酸构成的多肽(序列号99)。

2A_133_142

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至107个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的12个氨基酸(TGILNSRKSLWD)的多肽(序列号102)。

S基因组：WT由337个氨基酸构成，与此相对，生成与WT相同的多肽、以及由WT的第107号天冬酰胺缺失的336个氨基酸构成的多肽(序列号101)。

2A_1_119

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至107个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的12个氨基酸(TGILNSRKSLWD)的多肽(序列号88)。

S基因组：由与WT相同的337个氨基酸构成的多肽(序列号87)。

2A_1_120

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至107个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的12个氨基酸(TGILNSRKSLWD)的多肽(序列号90)。

S基因组：由与WT相同的337个氨基酸构成的多肽(序列号89)。

2G-35_10

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至56个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的8个氨基酸(KMAKLSKA)的多肽(序列号110)。

S基因组：WT由337个氨基酸构成，与此相对，生成由至56个氨基酸为止相同的氨基酸构成的多肽(序列号109)。

2G-37_103

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成由第55和56号这2个氨基酸缺失的334个氨基酸构成的多肽(序列号112)。

S基因组：WT由337个氨基酸构成，与此相对，生成在至54个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的7氨基酸(MAKLFKA)的多肽(序列号111)。

2G-126_10

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至56个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的2个氨基酸(DG)的多肽(序列号114)。

S基因组：WT由337个氨基酸构成，与此相对，生成由至56个氨基酸相同的氨基酸构成的多肽(序列号113)。

2G-126_139

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至54个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的1个氨基酸(I)的多肽(序列号118)。

S基因组：WT由337个氨基酸构成，与此相对，生成在至52个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的6个氨基酸(AKLFKA)的多肽(序列号117)。

接着，得到的T1品系的个体中的突变体多肽如下所述。

LS_1A-8

T基因组：WT由410个氨基酸构成，与此相对，生成在至247个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的15氨基酸(TQALKRPRNVKDFFA)的多肽(序列号73)。

S基因组：WT由407个氨基酸构成，与此相对，生成在至243个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的15个氨基酸(PQALERPRKVKDFFA)的多肽(序列号72)。

LS_1A-9

T基因组：WT由410个氨基酸构成，与此相对，生成在至246个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的3氨基酸(TGS)的多肽(序列号76)。

S基因组：WT由407个氨基酸构成，与此相对，生成在至244个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的15个氨基酸(SQALERPRKVKDFFA)的多肽(序列号75)、以及在至244个氨基酸为止相同的氨基酸的基础上添加了无关的15个氨基酸(TQALERPRKVKDFFA)的多肽(序列号74)。

LS_3A-12

T基因组：WT由410个氨基酸构成，与此相对，生成在至394个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的18个氨基酸(SWVGKIN PFFPYLLGVKL)的多肽(序列号78)。

S基因组：WT由407个氨基酸构成，与此相对，生成在至391个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的66个氨基酸(SWVGKIN PFFPYLLGVKFKTLKNKIFIYLHGEGQRGLQSQVLFFFFYIYILFGFKVIGL MNVLILT)的多肽(序列号77)。

LS_3A-15

T基因组：WT由410个氨基酸构成，与此相对，生成在至394个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的18个氨基酸(SWVGKIN PFFPYLLGVKL)的多肽(序列号80)。

S基因组：WT由407个氨基酸构成，与此相对，生成在至391个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的66个氨基酸(SWVGKIN PFFPYLLGVKFKTLKNKIFIYLHGEGQRGLQSQVLFFFFYIYILFGFKVIGL MNVLILT)的多肽(序列号79)。

LS_3A-30

T基因组：WT由410个氨基酸构成，与此相对，生成在至397个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的14个氨基酸(LAKSTPFFHIFLAL)的多肽(序列号82)。

S基因组：WT由407个氨基酸构成，与此相对，生成在至394个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的18个氨基酸(LAKSTPFFHIFLALNLKP)的多肽(序列号81)。

Bl_4A-11

T基因组：WT由336个氨基酸构成，与此相对，生成在至301个氨基酸为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的29个氨基酸(MATMAVLLDVTTTTVCSCSMMRIITSQMR)的多肽(序列号121)。

S基因组：WT由337个氨基酸构成，与此相对，生成在至302为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的5个氨基酸(QWQQW)的多肽(序列号120)、以及在相同的至302为止与WT相同的氨基酸的基础上添加了无关的4个氨基酸(YYWM)的多肽(序列号119)。

(e)温室中的腋芽发育的评价

在温室中栽培了Bl1基因的至少1个等位基因中不具有突变的7个T2品系的个体(2A-1_14、2A-133_122、2A-133_142、2A-1_19、2A-133_17、2A-1_119及2A-1_120)，按照3-3.的记载对于腋芽进行了评价。2A-1_14、2A-133_122及2A-133_142在S基因组中的Bl1一方的等位基因中不具有突变(T^+/+S^+/-)。2A-1_19在T基因组中的Bl1一方的等位基因中不具有突变(T^+/-S^+/+)。2A-133_17、2A-1_119及2A-1_120在S基因组中的Bl1两者的等位基因中不具有突变(T^+/+S^-/-)。与作为对照的WT(SR-1)相比，评价的7个品系均在一级腋芽的数量、重量方面没有观察到差异，但在二级腋芽的数量、重量方面均显示出显著减少(图22)。因此可知，在二级腋芽的抑制中，不需要在位于S及T基因组上的NtBl1基因的全部等位基因(4个)中导入突变，只要在位于S或T基因组上的NtBl1基因的2个等位基因中导入突变即可。

对于腋芽，评价了5个T2品系(2G-35_10、2G-37_103、2G-126_10、2G-126_139、Bl_4A-11)。这些品系在不同的基因(LS或Bl1)中导入了突变，但该突变在产生移码突变、产生比野生型多肽更短的多肽这一点上是共通的。将对2G-35_10、2G-37_103、2G-126_10、2G-126_139进行评价的结果示于图23，将对Bl_4A-11进行评价的结果示于图24。需要说明的是，图23及24中总结了在打顶后实施的3次腋芽评价。对于在Bl1基因中导入了突变的2G的4个品系、Bl_4A的1个品系而言，在一级腋芽的数量、重量方面没有观察到差异，但在二级腋芽的数量、重量方面显示出显著减少。特别是对于2G的4个品系而言，完全未观察到二级腋芽的发育。根据以上的结果可知，对于Bl1基因而言，在多个不同的突变体中，选择性地抑制了二级腋芽的发育。

接着，同样地对5个T1品系(LS_1A-8、LS_1A-9、LS_3A-12、LS_3A-15、LS_3A-30)进行了评价。将对LS_1A-8、LS_1A-9进行评价的结果示于图25。将对LS_3A-12、LS_3A-15、LS_3A-30进行评价的结果示于图26。需要说明的是，图25及26中总结了在打顶后实施的3次腋芽评价。LS_1A的2个品系、LS_3A的3个品系均在一级腋芽的数量、重量方面没有观察到差异，但完全未观察到二级腋芽的发育。根据以上的结果，对于LS基因而言，与REV基因一样，不仅是从通过EMS处理制备的TUM中挑选出的突变体，而且通过CRISPR/Cas9 system制备的多个不同的突变体也选择性地抑制了二级腋芽的发育。

〔参考文献〕

1.Takahashi H,Kamakura H,Sato Y,Shiono K,Abiko T,Tsutsumi N,NagamuraY,Nishizawa NK,Nakazono M.(2010)A method for obtaining high quality RNA fromparaffin sections of plant tissues by laser microdissection.JPlant Res 123:807-813

2.Li JF,Norville JE,Aach J,McCormack M,Zhang D,Bush J,Church GM,SheenJ.(2013)Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing inArabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9.NatBiotechnol.31(8),688-91.

3.Waibel F,Filipowicz W.(1990)U6 snRNA genes of Arabidopsis aretranscribedby RNA polymerase III but contain the same two upstream promoterelements as RNA polymerase II-transcribed U-snRNA genes.Nucleic Acids Res.25；18(12),3451-8.4.Marshallsay C1,Kiss T,Filipowicz W.(1990)Amplification ofplant U3 and U6 snRNA gene sequences using primers specific for an upstreampromoter element and conserved intragenic regions.Nucleic Acids Res.25；18(12),3459-66。

工业实用性

根据本发明，由于可以抑制烟草植物在栽培时不需要的腋芽的发育，因此能够减少栽培的劳动及成本、并且使收获的叶的品质提高。另外，根据本发明，可以选择性地抑制二级腋芽的发育，因此能够提高避免因灾害等引起的损伤所导致的植物体死亡的可能性。

序列表

JT16269PCT_序列表.txt

Claims

1.一种烟草植物体的制备方法，所述烟草植物体为红花烟草，该方法包括：

导入引起(1)～(4)的基因中任一者的功能抑制的突变的步骤，

所述(1)～(4)的基因为：

(1)包含编码了相对于序列号1所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因、及包含编码了相对于序列号3所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因中的至少一者；

(2)包含编码了相对于序列号9所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因、及包含编码了相对于序列号11所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因中的至少一者；

(3)包含编码了相对于序列号13所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因、及包含编码了相对于序列号15所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因中的至少一者；以及

(4)包含编码了相对于序列号17所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因、及包含编码了相对于序列号19所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因中的至少一者，

所述(1)的基因的4个等位基因中的至少3个等位基因受到功能抑制，

所述(2)的基因的4个等位基因中的至少2个等位基因受到功能抑制，

所述(3)的基因的4个等位基因全部受到功能抑制，

所述(4)的基因的4个等位基因全部受到功能抑制，

所述功能抑制是抑制腋芽中在除去一级腋芽后发育的二级腋芽的发育，

所述导入的步骤包括将表达促进从所述基因转录而成的mRNA的分解的因子的多核苷酸插入所述基因存在的区域以外，

所述因子为反义RNA分子、或RNAi分子。

2.一种烟草植物体的制备方法，所述烟草植物体为红花烟草，该方法包括：

导入引起(1)～(5)的基因中任一者的功能抑制的突变的步骤，

所述(1)～(5)的基因为：

(2)包含编码了相对于序列号5所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因、及包含编码了相对于序列号7所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因中的至少一者；

(3)包含编码了相对于序列号9所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因、及包含编码了相对于序列号11所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因中的至少一者；

(4)包含编码了相对于序列号13所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因、及包含编码了相对于序列号15所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因中的至少一者；以及

(5)包含编码了相对于序列号17所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因、及包含编码了相对于序列号19所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的基因中的至少一者，

所述(2)的基因的4个等位基因全部受到功能抑制，

所述(3)的基因的4个等位基因中的至少2个等位基因受到功能抑制，

所述(4)的基因的4个等位基因全部受到功能抑制，

所述(5)的基因的4个等位基因全部受到功能抑制，

所述导入的步骤包括将上述突变导入上述基因。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其进一步包括从所述导入的步骤中生成的个体中挑选所述腋芽中在除去一级腋芽后发育的二级腋芽的发育受到抑制的个体的步骤。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，在所述挑选的步骤中，挑选所述二级腋芽的数量或重量比野生株植物有所减少的个体。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其中，所述导入的步骤通过自然突变、突变原处理、基因组编辑或基因敲除来实施。