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WO2019004213A1 - 融合タンパク質 - Google Patents

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WO2019004213A1
WO2019004213A1 PCT/JP2018/024197 JP2018024197W WO2019004213A1 WO 2019004213 A1 WO2019004213 A1 WO 2019004213A1 JP 2018024197 W JP2018024197 W JP 2018024197W WO 2019004213 A1 WO2019004213 A1 WO 2019004213A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
scfv
peptide
intracellular
amino acids
fusion protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/024197
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
御子柴　克彦
博之 樺山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RIKEN
Original Assignee
RIKEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RIKEN filed Critical RIKEN
Priority to EP18825349.6A priority Critical patent/EP3647426A4/en
Priority to JP2019526938A priority patent/JP7162897B2/ja
Priority to AU2018292846A priority patent/AU2018292846A1/en
Priority to CN201880055237.6A priority patent/CN111032873A/zh
Priority to CA3070936A priority patent/CA3070936A1/en
Priority to US16/625,278 priority patent/US20200157210A1/en
Publication of WO2019004213A1 publication Critical patent/WO2019004213A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag

Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein having an antigen binding function that is expressed in an intracellular environment.
  • intrabodies that function in cells, ie, intrabodies (intracellular antibodies) can affect cell functions by recognizing and binding antigens (target molecules) in cells of higher organisms. These antigens can also be important intracellular therapeutic targets that can be inactivated by binding to intracellular antibodies. Further, as a research method, the use of an intracellular antibody has attracted attention as a means for specifically inhibiting the function of a protein directly by binding to the antibody inside the cell.
  • an intracellular antibody In the case of an intracellular antibody, first, a monoclonal antibody-producing hybridoma that recognizes the antigen is prepared by a standard method, and then an intracellular expression vector containing a DNA encoding a single chain Fv (scFv) is prepared from the cDNA. In general, it is constructed to construct a complex of heavy chain (VH) and light chain (VL) as an intracellular antibody.
  • VH heavy chain
  • VL light chain
  • an antibody usually circulates in the extracellular space of the body such as blood to recognize an extracellular antigen and function, and is based on an action in the extracellular environment.
  • any antibody can be expected to function as an intracellular antibody, since if the antibody is expressed in the cytoplasm, there will be problems of folding and stability leading to reduced expression levels and limited half-life of the antibody domain. Absent.
  • the scFv is obtained by linking its heavy and light chains with a flexible peptide linker, its three-dimensional structure is not necessarily as stable as the original antibody.
  • An object of the present invention is to provide a technique which utilizes any antigen binding peptide as an intracellular antibody which stably functions in cells.
  • an antigen-binding peptide having a peptide tag fused thereto is expressed in cells, the intracellular charge of the antigen-binding peptide by the peptide tag is changed by the change in the value of the charge and isoelectric point (pI). It was found that the stability of the function fluctuates.
  • an antigen-binding peptide in which the peptide tag is fused is designed by designing the peptide tag so that the charge value and the pI value are sufficiently lower based on the pH environment of the endosomal cytoplasmic side than the cytoplasmic pH environment. It succeeded in stably functioning in cells as an intracellular antibody.
  • the present inventors made further studies based on the above findings and completed the present invention.
  • the present invention is as follows: 1) A fusion protein comprising an intracellular stabilization peptide and an antigen binding peptide,
  • the intracellular stabilizing peptide consists of 10 to 39 amino acids, and at least 45% of the amino acids are acidic amino acids,
  • the antigen binding peptide comprises at least one of heavy chain CDR1, heavy chain CDR2, heavy chain CDR3, light chain CDR1, light chain CDR2, and light chain CDR3. Fusion protein.
  • the fusion protein according to 2) wherein the intracellular stabilizing peptide comprises at least one histidine as the basic amino acid.
  • the intracellular stabilizing peptide consists of 14 to 25 amino acids, and at least 50% of the amino acids are acidic amino acids, In the above-mentioned intracellular stabilized peptide, a portion in which 8 or more consecutive acidic amino acids are present, and a portion in which 4 or more consecutive amino acids other than acidic amino acids are absent, any one described in 1) to 4) Fusion protein.
  • the fusion protein according to 5 wherein in the intracellular stabilized peptide, a portion in which three or more consecutive acidic amino acids and a portion in which three or more consecutive amino acids other than acidic amino acids do not exist.
  • the intracellular stabilized peptide, the acidic amino acid X A, an amino acid other than acidic amino acid is taken as X n,
  • the fusion protein according to any one of 1) to 6), which comprises 8) The fusion protein according to 7), wherein X A is aspartic acid or glutamic acid, and X n is any amino acid selected from the group consisting of asparagine, glutamine, proline, tyrosine and valine.
  • An expression vector comprising the polynucleotide described in 9) above.
  • a method for producing a cell that expresses an antigen-binding peptide in a cell comprising the step of introducing the polynucleotide according to 9) or the expression vector according to 10) into a cell.
  • FIG. 1 shows the results of evaluation of scFv-A36 expression and binding ability.
  • FIG. 2 shows amino acid sequence information of CDRs of the V H region of scFv-A36.
  • FIG. 3 shows the results of evaluation of the expression of scFv-GFPA36 and scFv-GFPM4 in cultured neurons and the function inhibitory activity of the target molecule.
  • FIG. 4 is a diagram confirming that scFv-GFPA36 forms aggregates in cells of mouse cranial nerves.
  • FIG. 5 shows the results of evaluating the pI and net charge of scFv-A36 and scFv-M4 and the intracellular aggregation.
  • FIG. 1 shows the results of evaluation of scFv-A36 expression and binding ability.
  • FIG. 2 shows amino acid sequence information of CDRs of the V H region of scFv-A36.
  • FIG. 3 shows the results of evaluation of the expression of scFv-GFPA
  • FIG. 6 shows the results of using the other 94 scFv protein sequences obtained by NCBI blast search with scFv-A36 protein sequence, and using the s3Flag and HA peptide tags to add the intracellular antibody under low pH environment. It is a figure which shows the result of having investigated about the generality of the increase effect of negative charge of.
  • FIG. 7 shows the results of examining the biochemical properties of the s3Flag-scFvA-36-HA construct.
  • FIG. 8 shows the results of examining the intracellular expression of s3Flag-scFv-A36-HA and s3Flag-scFv-M4-HA in neurons of mouse brain.
  • FIG. 9 shows the expression pattern of s3Flag-scFv-A36-HA and s3Flag-scFv-M4-HA in the substantia nigra region.
  • FIG. 10 is a view observed for long-term (6 months) expression in dopamine neurons in both s3Flag-scFv-A36-HA and s3Flag-scFv-M4-HA.
  • FIG. 11 shows the results of examining that s3Flag-scFv-A36-HA has functional activity against Syt I in vivo in dopamine neurons.
  • FIG. 10 is a view observed for long-term (6 months) expression in dopamine neurons in both s3Flag-scFv-A36-HA and s3Flag-scFv-M4-HA.
  • FIG. 11 shows the results of examining that s3Flag-scFv-A36-HA has functional activity against Syt I in vivo in dopamine neurons.
  • FIG. 12 shows the results of motor behavior test and immunohistological staining of mice expressing s3Flag-scFv-A36-HA and mice expressing s3Flag-scFv-M4-HA.
  • FIG. 13 shows the results of investigation of STAND-Y13-259 expression and antitumor activity.
  • FIG. 14 shows the results of examining the expression and antitumor activity of DE2.0-Y13-259-HA.
  • FIG. 15 shows the results of examining that the fusion of scFv-6E with a tag changes the net negative charge of scFv-6E.
  • FIG. 16 shows the results of observation of intracellular expression of STAND-6E-LYS and DE 5.0-6E.
  • FIG. 17 shows the results of the ⁇ -synuclein aggregation assay.
  • FIG. 18 shows the results of evaluating ⁇ -synuclein aggregation.
  • amino acid refers to an amino acid whose isoelectric point is 3.99 or less.
  • the amino acids may be naturally occurring or analogues of naturally occurring amino acids.
  • Naturally occurring acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • Base amino acid refers to an amino acid whose isoelectric point is 7.40 or more.
  • the amino acids may be naturally occurring or analogues of naturally occurring amino acids.
  • Naturally occurring basic amino acids include histidine, lysine and arginine.
  • amino acid other than acidic amino acid and basic amino acid In the present specification, when focusing on the pH of the amino acid itself, an amino acid which does not meet the definition of the above-mentioned acidic amino acid or the definition of the basic amino acid is “amino acid other than acidic amino acid and basic amino acid” or Collectively referred to as neutral amino acids. That is, the isoelectric point of these amino acids is greater than 3.99 and less than 7.40.
  • the amino acids may be naturally occurring or analogues of naturally occurring amino acids.
  • the fusion protein of the present invention is a fusion protein comprising an intracellular stabilization peptide and an antigen binding peptide
  • the intracellular stabilizing peptide consists of 10 to 39 amino acids, and at least 45% of the amino acids are acidic amino acids
  • the antigen binding peptide comprises at least one of heavy chain CDR1, heavy chain CDR2, heavy chain CDR3, light chain CDR1, light chain CDR2 and light chain CDR3.
  • the fusion protein of the present invention has a function as an intracellular antibody by being expressed in any cell.
  • the intracellular stabilizing peptide is preferably a peptide consisting of up to 50 amino acids, more preferably a peptide consisting of 10 to 39 amino acids, although the number of amino acids formed is not particularly limited.
  • at least 45% of all the amino acids constituting the intracellular stabilization peptide are acidic amino acids.
  • the ratio of the acidic amino acid to the total amino acid constituting the intracellular stabilization peptide is not particularly limited, it is preferably 50% or more.
  • the ratio of the acidic amino acid to the total amino acid constituting the intracellular stabilization peptide may be, for example, 53% or more or 55% or more, and may preferably be 60% or more, and may be 65% or more or 70 % Or more may be preferable.
  • An increase in the proportion of acidic amino acids generally reduces the isoelectric point of the polypeptide comprising the acidic amino acids.
  • the acidic amino acids that constitute the intracellular stabilization peptide are preferably selected from the group consisting of aspartic acid and glutamic acid.
  • the number of amino acids constituting the intracellular stabilization peptide is preferably 14 or more, and 15 or more. More preferably, it is more preferably 18 or more, and particularly preferably 20 or more. In addition, from the viewpoint of suppressing the size of the fusion protein, the number of amino acids constituting the intracellular stabilization peptide is preferably 35 or less, more preferably 30 or less, and 25 or less. Is more preferred. If the length of the intracellular stabilization peptide (the number of constituent amino acids) is 9 amino acids or less, it may be insufficient in terms of the contribution of the intracellular stabilization peptide to the fusion protein.
  • a plurality of intracellular stabilizing peptides may be used for each intracellular stabilizing peptide. It can also be used by linking via a spacer.
  • the proportion of basic amino acids to the total amino acids constituting the intracellular stabilization peptide is not particularly limited, but is preferably 28% or less, more preferably 27% or less or 26.5% or less, and 25% It is more preferably 20% or less, 15% or less, or 10% or less, and 9% or less, 8% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less or 3% or less Is particularly preferred.
  • the intracellular stabilizing peptide does not comprise basic amino acids.
  • the preferred range of the number of basic amino acids constituting the intracellular stabilization peptide is not particularly limited as long as it satisfies any of the above ratios of basic amino acids to all amino acids constituting the intracellular stabilization peptide, for example, It is 6 or less, preferably 5 or 4 or less, more preferably 3 or less, still more preferably 2 or less, particularly preferably 1 or less.
  • the intracellular stabilization peptide contains a basic amino acid
  • the basic amino acid is preferably selected from the group consisting of lysine and histidine, and more preferably at least one histidine as the basic amino acid. Histidine is characterized by having the lowest isoelectric point among the naturally occurring basic amino acids.
  • the proportion of histidine in the basic amino acids is preferably 30% or more, more preferably 50% or more, and 60% or more. Is more preferable, and 100% is particularly preferable.
  • the number of histidines contained in the intracellular stabilization peptide is, for example, six, five, four, three, two or one.
  • the intracellular stabilizing peptide may contain amino acids other than the above-mentioned acidic amino acids and basic amino acids (collectively referred to as “substantially neutral amino acids").
  • the ratio of substantially neutral amino acids to the total amino acids constituting the intracellular stabilization peptide is 55% or less, preferably 50% or less, and more preferably 45% or less.
  • the lower limit of the ratio of the substantially neutral amino acid to the total amino acids constituting the peptide is not particularly limited, but in one aspect is 15% or more, 20% or more Or 25% or more.
  • the ratio of hydrophobic amino acids (that is, almost neutral amino acids having no polarity) to all amino acids constituting the intracellular stabilization peptide is 25% or less Is preferably 20% or less, more preferably 15% or less.
  • one or more hydrophobic amino acids be contained on the premise that the ratio of the hydrophobic amino acid is satisfied. In some cases.
  • the intracellular stabilization peptide contains hydrophobic amino acids, the number thereof is, for example, 1, 2, 3, or 4.
  • the succession of hydrophobic amino acids may be preferably up to three, and in some cases up to two may be more preferable.
  • the substantially neutral amino acid includes asparagine, phenylalanine (hydrophobic amino acid), glutamine, tyrosine, serine, methionine (hydrophobic amino acid), tryptophan ( Preferably, it is selected from the group consisting of hydrophobic amino acids), valine (hydrophobic amino acids), glycine (hydrophobic amino acids), leucine (hydrophobic amino acids), isoleucine (hydrophobic amino acids), and proline (hydrophobic amino acids) It is more preferably selected from the group consisting of: asparagine, glutamine, tyrosine, methionine, valine, glycine, leucine, isoleucine and proline, and is selected from the group consisting of asparagine, glutamine, tyrosine, valine and proline further Masui.
  • the intracellular stabilizing peptide comprises at least one proline (preferably 1 or 2) and at least one amino acid (preferably 8 or less) selected from asparagine, glutamine and tyrosine. , 6, 5, 4, 3, or 2) and at least one (preferably one or two) hydrophobic amino acids other than proline.
  • the type of the substantially neutral amino acid and the configuration thereof are, for example, the stability (resistance to oxidation, hydrolysis, etc.) of the intracellular stabilization peptide to be formed, the presence or absence of formation of an intramolecular SS bond, the molecule It may be determined in consideration of the presence or absence of the formation of an internal hydrogen bond, the presence or absence of the formation of an undesirable motif, and the like.
  • X A refers to an acidic amino acid
  • X n refers to an amino acid that is not an acidic amino acid, that is, the above-described basic amino acid and a substantially neutral amino acid.
  • the intracellular stabilizing peptide specifically exemplified here.
  • the X A true all matters described as the acidic amino acids, all of the matters described as substantially neutral amino acids and the basic amino acid is true for X n.
  • all of the matters described above can be applied to the length and the like of the intracellular stabilization peptide.
  • 28% or less of the above amino acids are basic amino acids or contain no basic amino acids (that is, all X n are substantially neutral amino acids) Some).
  • the intracellular stabilization peptide may contain at least one histidine as a basic amino acid.
  • the intracellular stabilizing peptide consists of 10 to 39 amino acids, preferably 14 to 25 amino acids. Preferably, at least 45% of the amino acids constituting the intracellular stabilization peptide are acidic amino acids and at least 50% are acidic amino acids.
  • a portion in which X A is 8 or more consecutive and a portion in which X n is 4 or more continuous are not present. That is, in the intracellular stabilization peptide, the succession of X A is up to 7 and the succession of X n is up to 3.
  • Intracellular stabilized peptide that satisfies the conditions of the above first embodiment and satisfies the conditions listed below.
  • portion X A are continuously 6 or more, and, X n does not exist successive portions 4 or more. That is, in the intracellular stabilization peptide, the succession of X A is up to 5 and the succession of X n is up to 3.
  • Intracellular stabilized peptide that satisfies the conditions of the first aspect described above and satisfies the conditions listed below.
  • sequential parts of X A is 3 or more, and, X n does not exist three or more consecutive portions. That is, in the intracellular stabilization peptide, the succession of X A is up to two and the succession of X n is up to two.
  • the intracellular stabilizing peptide consists of 10 to 39 amino acids, preferably 14 to 25 amino acids. Preferably, at least 45% of the amino acids constituting the intracellular stabilization peptide are acidic amino acids and at least 50% are acidic amino acids.
  • the intracellular stabilizing peptide consists of 10 to 39 amino acids, preferably 14 to 25 amino acids. Preferably, at least 45% of the amino acids constituting the intracellular stabilization peptide are acidic amino acids and at least 50% are acidic amino acids.
  • the amino acid sequence (2) shown in the seventh aspect further has 0 to 9 X A or X n on the left side, And 0 to 9 additional X A or X n .
  • the total number of amino acids on the left and right sides of the amino acid sequence (2) is preferably 10 or less, more preferably 9 or less, and further preferably 6 or 5 or less It may be preferable.
  • Ninth aspect The invention is applicable to any of the above first to eighth aspects, wherein X A is aspartic acid or glutamic acid, and X n is from asparagine, glutamine, proline, tyrosine and valine And any amino acid selected from the group consisting of
  • one of the second to third X n from the left of the amino acid sequence (1) is proline, and the other X n contained in the amino acid sequence (1) is Any amino acid selected.
  • X A is aspartic acid or glutamic acid
  • X N 3 of the amino acid sequence (2) A group consisting of asparagine, glutamine, tyrosine, and valine, wherein one or more of X n from 6 to 6 (preferably 3 to 5, more preferably 4 to 5) are proline, and non-proline X n is It is any amino acid selected.
  • one of the fourth to fifth X n from the left side of the amino acid sequence (2) is proline, the other one of X n is valine, and the other X n contained in the amino acid sequence (2) is asparagine, glutamine And any amino acid selected from the group consisting of and tyrosine.
  • the intracellular stabilization peptide consists of any of the following amino acid sequences.
  • the intracellular stabilizing peptide consists of 10 to 39 amino acids, preferably 14 to 25 amino acids. All of the amino acids that constitute the intracellular stabilization peptide are acidic amino acids.
  • Exemplary antibody construct units are known to include tetramers. Each tetramer is composed of two identical pairs of polypeptide chains, each pair having one light chain (in one example about 25 kDa) and one heavy chain (in one example about 50-70 kDa) .
  • the amino terminal portion of each chain has a variable region of about 100 amino acids or more, and the variable region mainly plays a role in antigen (target molecule) recognition.
  • the carboxyl terminal portion of each chain defines a constant region primarily responsible for effector function. Light chains are classified as either kappa or lambda.
  • an "antigen binding peptide” is a peptide that contributes to binding to an antigen in a peptide that specifically binds to an antigen (target molecule), as any monoclonal antibody or monoclonal antibody, and the antigen binding of the antibody It refers to one having a region of all or part of a region having a function.
  • the "antigen binding peptide” includes, for example, at least one of heavy chain CDR1, heavy chain CDR2, heavy chain CDR3, light chain CDR1, light chain CDR2 and light chain CDR3 of any monoclonal antibody. . Preferably, at least two, at least three, at least four, at least five, or all of these are included.
  • the antigen-binding peptides of the present invention are F (ab ') 2 , F (ab'), Fab ', Fab, Fv (variable fragment of antibody), scFv, dsFv (disulfhide stabilized Fv) from which these antibodies are derived , DAb (single domain antibody), diabody, minibody or a peptide comprising the full length of VHH or a portion thereof.
  • Examples of the “peptide that specifically binds to an antigen as in a monoclonal antibody” include a peptide aptamer having high binding specificity to the antigen, and binding of a biological protein (eg, fibronectin) having binding specificity to a target molecule Domain etc.
  • the purification tag peptide includes, but is not particularly limited to, a purification tag peptide containing 15% or more acidic amino acids such as HA tag sequence (YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 14)) and PA tag sequence (GVAMPGAEDDVV (SEQ ID NO: 15)). .
  • HA tag sequence YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 14)
  • PA tag sequence GVAMPGAEDDVV (SEQ ID NO: 15)
  • the purified tag peptide more preferably contains 20% or more of acidic amino acids.
  • the detection peptide is not particularly limited, and examples thereof include a fluorescent protein, an enzyme which causes light emission and a color change by reaction, and the like.
  • fluorescent proteins BFP, EBFP, CFP, ECFP, Cypet, AmCyan1, GFP, EGFP, YFP, Venus, mKO, mOrange, RFP, DsRed, tdTomato, mcherry, mStrawberry, Azalea, mPlum, mAG, Kaede, Dronpa, Keima , KikG, KikGR, UnaG, etc., but not limited thereto.
  • enzymes that cause light emission and color change by reaction include peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, malate dehydrogenase, penicillinase And catalase, apoglucose oxidase, urease, luciferase, acetylcholine esterase and the like, but not limited thereto.
  • Fusion protein refers to a protein having at least two heterologous peptides linked, either covalently or directly or via a linker.
  • the linker is not particularly limited, but preferably contains mainly an amino acid having a low molecular weight side chain such as, for example, glycine, alanine and serine, in order to provide flexibility.
  • glycine, alanine and serine a linker sequence having a low molecular weight side chain
  • 80%, 90% or more of the linker sequences comprise glycine, alanine or serine residues, in particular containing glycine or serine residues.
  • the arrangement of additional functional peptides is also optional.
  • the functional peptide is a purified tag peptide containing 15% or more acidic amino acids
  • the position at which the antigen binding peptide is sandwiched with the intracellular stabilization peptide (intracellular stabilization peptide-antigen binding peptide-purification tag peptide, or purification tag peptide
  • they are arranged in (antigen binding peptide-intracellular stabilization peptide).
  • This arrangement allows for a positional balance of the overall charge of the fusion protein. Therefore, the fusion protein can be maintained more stably in cells.
  • the arrangement of the detection peptide is also optional, but from the viewpoint of detection sensitivity, it is preferable to locate the fusion protein at the most N-terminal side or most C-terminal side.
  • the polynucleotide of the present invention can be prepared by known genetic engineering methods or chemical synthesis methods.
  • the specific base sequence of the polynucleotide of the present invention can be easily designed by those skilled in the art from the amino acid sequence of the target fusion protein, for example, with reference to the codon table.
  • viral vectors are preferably used.
  • any of viral vectors and non-viral vector based vectors may be used.
  • Vectors include, in addition to the DNA to be expressed, for example, regulatory sequences such as promoters (SV40 promoter, MMTV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter, CMV promoter, etc.), enhancers, ribosome binding sites, splice signals, terminators, etc., and necessary In accordance with the above, it may contain a selection marker sequence (ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, streptomycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, etc.) and the like.
  • the promoter may be constitutive or inducible.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise other components other than the fusion protein, polynucleotide or vector described above.
  • the other components are not particularly limited, and, for example, pharmaceutically acceptable carriers, lubricants, preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, salts for osmotic pressure adjustment, buffers, stabilizers, preservatives, Excipients, antioxidants, viscosity modifiers, colorants, flavors, sweeteners and the like can be mentioned.
  • pharmaceutical composition is formed as an aqueous solution, pure water (sterile water), physiological saline, phosphate buffered saline or the like may be used as a carrier.
  • an organic ester which can be introduced into the living body, such as glycol, glycerol or olive oil can be used as a carrier.
  • the pharmaceutical composition may be contained in a container, pack, dispenser or the like together with instructions for use.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition can be used, for example, to treat and / or prevent an antigen-related disease.
  • the fusion protein of the present invention in a target cell is a mechanism that is transferred from the extracellular environment into the cell and transported again to the extracellular environment (recycling mechanism).
  • the stability can be improved, intracellularly and / or extracellularly function as an antibody, and the disease can be treated and / or prevented.
  • Another embodiment of the pharmaceutical composition of the present invention is a cell treated to cause the harvested cells to express the fusion protein of the present invention, and the cell expressing the fusion protein of the present invention is administered to a subject
  • the disease can be treated and / or prevented.
  • the collected cells may be allogeneic cells (autologous cells) collected from an individual to be administered, or even heterologous cells collected from an individual different from the object to be administered (other cells). Good.
  • Organisms to be treated and / or prevented include, for example, human and non-human animals, and more specifically, vertebrates such as fish, birds and mammals.
  • mammals include laboratory animals such as mice, rats, rabbits, guinea pigs and non-human primates; companion animals such as dogs and cats (pets); domestic animals such as pigs, cows, goats, sheep and horses; or humans
  • cancer or tumor for example, tongue cancer, gingival cancer, malignant lymphoma, malignant melanoma (melanoma), maxillary cancer, nasal cancer, nasal cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer, glioma, meningioma, glioma , Neuroblastoma, thyroid papillary adenocarcinoma, follicular thyroid carcinoma, medullary thyroid carcinoma, primary lung cancer, squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, alveolar epithelial carcinoma, large cell undifferentiated cancer, small cell undifferentiated cancer, Carcinoid, testicular tumor, prostate cancer, breast cancer (eg, papillary adenocarcinoma, comedoma, mucinous carcinoma, medullary carcinoma, lobar carcinoma, lobular carcinoma, carcinosarcoma, metastatic tumor), breast paget disease, breast sarcoma, bone tumor, thyroid Cancer, gastric cancer, liver cancer, acute my
  • Parkinson's disease Alzheimer's disease, Huntington's disease, prion disease, frontotemporal dementia, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), spinal bulbar muscular atrophy (SBMA or Kenedy's disease), dentate red Nuclear pallidotrophy (DRPLA), spinocerebellar ataxia (eg, SCA-1 to SCA-7), dementia, schizophrenia, depression, depression, neuropathy, psychosomatic disorder, cerebral infarction, multiple sclerosis Disease, progressive upper paralysis, multiple system atrophy, spinocerebellar degeneration, cerebellar degeneration, cerebral metabolic disorder, cerebral circulatory abnormality, autonomic ataxia, various endocrine system abnormalities involving central nervous system, sleep disorder And neurological symptoms (nausea, vomiting, thirst, loss of appetite, dizziness, etc.), movement disorders, learning disorders, etc., but it is not limited thereto.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • SBMA or Kenedy's disease spinal bulbar muscular atrophy
  • infectious diseases include human immunodeficiency virus (HIV), human T cell leukemia virus (eg HTLV-I), hepatitis virus (eg A, B, C, D and E). ), Diseases caused by infection with pathogenic viruses such as influenza virus, herpes simplex virus, West Nile fever virus, human papilloma virus, encephalitis virus, Ebola virus, etc., infection infections caused by pathogenic bacteria such as chlamydia, mycobacteria, legionella etc. Diseases include diseases caused by infection with pathogenic yeasts such as Aspergillus and Candida, and diseases caused by infection with pathogenic protozoa such as malarial parasites and trypanosomal protozoa, but are not limited thereto.
  • pathogenic viruses such as influenza virus, herpes simplex virus, West Nile fever virus, human papilloma virus, encephalitis virus, Ebola virus, etc.
  • pathogenic bacteria such as chlamydia, mycobacteria,
  • the administration route and method are not particularly limited, and can be appropriately selected according to the target disease. It may be administered directly to the affected area or may be administered indirectly. Alternatively, cells expressing the fusion protein of the present invention may be administered.
  • the administration route is, for example, oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, and the like.
  • Intrauterine routes and the like can be mentioned, as can local administration, a method using a gene gun, and the like.
  • the dose and the number of administration can be appropriately selected depending on the degree of symptoms, age, sex, body weight, administration form, specific type of disease and the like.
  • the present invention also provides a research reagent comprising the polynucleotide or vector described above.
  • the research reagent may further contain other components other than the polynucleotide or vector described above.
  • the research reagent may be contained in a container, pack, dispenser or the like together with instructions for use.
  • the fusion protein of the present invention can be used for functional analysis of an antigen (eg, a protein or polypeptide etc.) in cells.
  • a functional analysis of an antigen is performed by expressing an antigen-binding peptide for an antigen to be a target of functional analysis in a cell as a fusion protein of the present invention and controlling (preferably inhibiting) the function of the antigen.
  • the target cell is not particularly limited.
  • Cells of interest include, for example, human cells and non-human animal cells, and more specifically, vertebrate cells such as fish cells, avian cells and mammalian cells.
  • mammalian cells experimental animals such as mice, rats, rabbits, guinea pigs and primates excluding humans; companion animals such as dogs and cats (pets); domestic animals such as pigs, cows, goats, sheep and horses; or humans Cells are included.
  • the cells may be cultured cells or living cells (non-isolated cells in the living body).
  • Preferred examples of the cells are cultured cells of human, living cells of human, cultured cells of non-human disease model animal, and living cells of non-human disease model animal.
  • a method of suspending the viral vector in a cell culture solution can be mentioned.
  • a non-viral vector-based vector for example, electroporation, microinjection, lipofection, calcium phosphate method, DEAE dextran method and the like can be used.
  • Morphological changes include changes in protrusion formation and / or number of protrusions, changes in flatness, changes in elongation / aspect ratio, changes in cell size, changes in internal structure, heteromorphism / uniformity as a cell population Sex, changes in cell density, etc. can be used. These changes in morphology can be confirmed by microscopic observation. As changes in properties, anchorage dependence, cytokine dependence, hormone dependence, drug resistance, cell motility, cell migration activity, pulsatility, changes in intracellular substances and the like can be used. Cell motility includes cell infiltration activity and cell migration activity.
  • tissue type a functional change according to the tissue used can be used as a detection indicator.
  • tissue weight changes in blood system, such as changes in blood cell count, protein amount, enzyme activity, changes in electrolytic mass, changes in circulatory system, such as blood pressure, heart rate Changes etc. can be used.
  • the method of measuring these detection indexes is not particularly limited, and light absorption, luminescence, color development, fluorescence, radioactivity, fluorescence polarization, surface plasmon resonance signal, time-resolved fluorescence, mass, absorption spectrum, light scattering, fluorescence Resonance energy transfer or the like can be used.
  • These measurement methods are well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • the absorption spectrum can be measured by a commonly used photometer, a plate reader, etc., light emission by a luminometer etc., and fluorescence by a fluorometer etc.
  • Mass can be measured using a mass spectrometer.
  • the radioactivity is measured by measuring instrument such as gamma counter according to the type of radiation, fluorescence polarization degree is measured by BEACON (Takara Shuzo), surface plasmon resonance signal is measured by BIACORE, time-resolved fluorescence, fluorescence resonance energy transfer is measured by ARVO etc. it can. Furthermore, a flow cytometer or the like can also be used for the measurement. These measurement methods may measure two or more types of detection indexes by one measurement method, and in the case of simplicity, more detection can be performed by simultaneously and / or successively measuring two or more types of measurement. It is also possible to measure the indicator. For example, fluorescence and fluorescence resonance energy transfer can be measured simultaneously with a fluorometer.
  • the fusion protein of the present invention can also be used to observe the kinetics of an antigen (eg, a protein or polypeptide, etc.) in cells.
  • an antigen eg, a protein or polypeptide, etc.
  • Dynamic observation of antigens includes observation of expression of antigens, localization of antigens, etc. at a certain time or over time.
  • the detection of the reaction between the antigen and the fusion protein can be performed, for example, using fluorescence, luminescence, color development, etc. by the detection peptide contained in the fusion protein.
  • the present invention also provides a method of expressing an antigen binding peptide in cells.
  • the expression method comprises the step of expressing the above-mentioned polynucleotide (ie, the polynucleotide encoding the fusion protein of the present invention) in cells.
  • Expression may be constitutive or transient. It may also be inductive.
  • constitutive expression a polynucleotide in which a promoter for constitutive expression is linked upstream of the gene of the fusion protein may be used.
  • transient expression for example, RNA rather than DNA may be introduced into cells for expression.
  • a polynucleotide may be used in which an inducible promoter is linked to the gene upstream of the fusion protein. Then, when expressing the antigen-binding peptide, an inducer (eg, IPTG etc.) may be taken into cells.
  • an inducer eg, IPTG etc.
  • an antigen binding peptide is expressed in a state of being fused with an intracellular stabilization peptide (ie, as a fusion protein).
  • the fusion protein of the present invention contains the intracellular stabilizing peptide, whereby the isoelectric point is lower than that in the case of the antigen binding peptide alone. Therefore, in the cell, aggregation is suppressed more than when expressed by the antigen-binding peptide alone, and the antibody can function as an intracellular antibody in a stable manner.
  • the expression method of the present invention further comprises the step of introducing the polynucleotide described above into cells.
  • the polynucleotides described above may be introduced in the form of a vector.
  • the specific introduction method is ⁇ 3.
  • ⁇ Method of Use> Therefore, the present invention further provides a method of producing a cell that expresses an antigen binding peptide in the cell.
  • the production method comprises the step of introducing the above-mentioned polynucleotide (ie, the polynucleotide encoding the fusion protein of the present invention) or the above-mentioned expression vector into cells.
  • the invention also provides cells expressing the fusion protein of the invention.
  • the present invention is also a kit for producing a polynucleotide encoding a fusion protein comprising the above-mentioned intracellular stabilizing peptide and an antigen-binding peptide, which comprises a polynucleotide encoding the intracellular stabilizing peptide. , To provide a kit.
  • the kit of the present invention can be a general-purpose kit that can easily produce a polynucleotide encoding a fusion protein for a desired antigen-binding peptide.
  • the polynucleotide encoding the intracellular stabilization peptide of the present invention may be incorporated into a vector as described above.
  • the polynucleotide may contain an agent (for example, a promoter, a ribosome binding site, a terminator and the like) necessary for the expression of a protein, a selection marker, or a restriction enzyme recognition site and the like.
  • kit of the present invention may further include at least one of a buffer, a restriction enzyme, other necessary reagents, a device, instructions for use, and the like.
  • mice All experimental procedures were conducted according to the guidelines of the RIKEN Animal Experiment Committee. Use mice were placed on a 12 hour light / dark cycle, with the dark cycle occurring at 20:00 to 8:00.
  • the scFv gene was isolated using a recombinant phage antibody system (RPAS) (GE Healthcare).
  • RPAS recombinant phage antibody system
  • the DNA sequence of scFv-A36 is registered in the Japan DNA Data Bank (DDBJ) under Accession No. AB 472376.
  • ScFv-GFPA36 and scFv-GFPM4 were generated using AAV1 serotype; s3Flag-scFv-A36-HA and s3Flag-scFv-M4-HA were generated using AAV9 serotype. Details of the AAV vector plasmid and its preparation are described below.
  • AAV vectors Male wild-type B6 mice or male DAT-cre (+/-) mice (8 weeks old) are anesthetized with isoflurane (Escain; Mylan) using an anesthesia machine (MK-A110; Muromachi), and the stereotactic frame is used. (Stereotaxic Just for Mouse, Muromachi). AAV vectors were injected into the substantia nigra of the right hemisphere (coordinates in millimeters for Bregma, AP; -3.08, LR; -1.25, DV; -4.5).
  • the recombinant antibody scFv-GFPA36 was purified from E. coli. E. coli strain BL21 and purified using Ni-NTA agarose chromatography under denaturing or non-denaturing conditions. In order to improve the soluble expression of foreign proteins (Yasukawa et al., 1995), E. coli cotransformed with pT-Trx vector expressing thioredoxin (Trx). The recombinant antibody s3Flag-scFv-A36-HA was purified from E. coli strain BL21 under non-denaturing conditions using anti-Flag (M2) antibody binding affinity beads (Sigma).
  • M2 anti-Flag
  • Immunostaining was performed by standard procedures. Immunofluorescence signals were visualized with Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 594 labeled secondary antibodies (Invitrogen). The fluorescently labeled samples were imaged with a Fluoview FV1000 confocal microscope (Olympus) or a BZ-9000 fluorescence microscope (Keyence).
  • the resulting PCR product was linked to a flexible (Gly4-Ser) 3 linker encoding a 15 amino acid chain.
  • the VH-glycine linker-VL complex (scFv) was subcloned into the Sfi I and Not I sites of pCANTAB 5E vector (GE Healthcare).
  • E. E. coli TG-1 cells were transformed by infection with a plasmid vector containing scFv cDNA and M13-KO7 helper phage to produce recombinant phage antibodies. Isolation of antibody reactive phage was performed by biopanning according to the manufacturer's instructions. Log phase TG-1 cells were infected with antibody reactive phage.
  • the digested EGFP fragment was then ligated to the BamHI site of pGEM-scFv-A36 to create the pGEM-scFv-GFP A36 vector.
  • the BamHI-NotI digested fragment of pGEM-scFv-GFPA36 was modified into pET3a (M. Fukuda, unpublished data) E. coli. It was ligated to BamHI and NotI sites of E. coli expression vector (Novagen).
  • ventral midbrain was dissociated by trypsinization (0.25% 20 min, 37 ° C), and fire-finished Pasteur pipette in neurobasal medium supplemented with 10% FBS containing DNase I. Crushed.
  • Dissociated cells (6 ⁇ 10 4 ) in a 24-well plate (Iwaki) onto poly-L-lysine (1 ⁇ g / mL) coated coverslip (Fisherbrand, diameter 12 mm) and then B27 (Invitrogen) The cells were cultured in 500 ⁇ L of supplemented neurobasal medium.
  • Day 7 in vitro cells (DIV) in each well are infected with 5 ⁇ L of AAV vector (titer: 1 ⁇ 10 11 microg / mL) to express GFP-tagged scFv protein and Day after day, immunocytochemistry or dopamine release assay was performed.
  • AAV vector titer: 1 ⁇ 10 11 microg / mL
  • 293T and COS-7 cells obtained from RIKEN BioResource Center Cell Bank (Tsukuba, Japan) were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS. These cells were transfected with an expression vector using Lipofectamine 2000 according to the manufacturer's instructions (Invitrogen) and used for immunochemical analysis one day after transfection.
  • E. E. coli strain BL21 (DE3) (Novagen) was used for expression of scFv-GFPA36.
  • the expression of scFv-GFPA36 was induced at 30 ° C. for 3 hours with 1 mM isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside (IPTG).
  • IPTG isopropyl-1-thio- ⁇ -D-galactopyranoside
  • ScFv-GFPA36 protein was solubilized in buffer (8 M urea, 0.1 M NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris-HCl [pH 8.0]) and purified by Ni-NTA agarose chromatography (Qiagen) according to the manufacturer's recommendations .
  • the column was washed with 4 mL of buffer (8 M urea, 0.1 M NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris-HCl [pH 6.3]) under denaturing conditions.
  • ScFv-GFPA36 was then eluted from the column with 1 mL of buffer (8 M urea, 0.1 M NaH 2 PO 4 , 0.01 M Tris-HCl [pH 4.5]).
  • the eluted scFv-GFPA36 protein was dialyzed against buffer (10 mM HEPES-KOH; pH 7.2).
  • Expressed scFv-GFPA36 was eluted from the column using a buffer containing 5 mM histidine (10 mM HEPES-KOH; pH 7.2) and then dialyzed against the buffer (10 mM HEPES-KOH; pH 7.2, 150 mM NaCl).
  • E. coli BL21 (DE3) competent cells (Novagen) are co-transformed with pET3a vector (Novagen) expressing s3Flag-scFv-A36-HA and pT-Trx vector expressing thioredoxin (Trx), The soluble expression of foreign proteins was improved (Yasukawa et al., 1995).
  • Log-phase transformed cells were induced with the addition of 1 mM IPTG. Cells were harvested by centrifugation 3 hours after induction. The cells were resuspended in PBS buffer containing a protease inhibitor cocktail.
  • the suspended cells were sonicated on ice and solubilized with Triton X-100 (1%) for 1 hour at 4 ° C. After centrifugation and filtration using a 0.45 ⁇ m pore filter, the supernatant was subjected to purification chromatography using anti-Flag (M2) antibody-bound affinity beads (Sigma). Expressed s3Flag-scFv-A36-HA was purified according to the manufacturer's recommendations.
  • s3Flag-scFv-A36-HA is eluted from the column using buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) containing 3 ⁇ Flag peptide (1 mg / mL), and buffer (20 mM Hepes-KOH, pH 7) 2. dialyzed against 2, 50 mM NaCl).
  • B represents the concentration of s3Flag-scFv-A36-HA bound to GST-Syt I-C2A
  • B max represents the concentration of all binding sites
  • [s3Flag-scFv-A36-HA] is free
  • s3Flag -Re represents the concentration of scFv-A36-HA
  • Kd represents the dissociation constant
  • Flag-tagged full-length mouse Syt I-XI was prepared as described previously (Fukuda et al., 1999). Transiently expressed Flag-tagged Syt I-XI homogenates transiently expressed in COS-7 cells were subjected to 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Transferred to Purified scFv-GFPA36 (1.6 ⁇ g / mL) was used as the primary antibody. HRP labeled anti-T7 monoclonal antibody (1/5000 dilution, Merck Millipore) was used as a secondary antibody.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • mice brain tissue was isolated and homogenized buffer (20 mM HEPES-KOH, pH 7.2, 150 mM NaCl, 0 Homogenized with 5% Trinton X-100, Complete Protease Inhibitor Cocktail; Roche) and agitated at 4 ° C. for 1 hour.
  • ECL chemiluminescence
  • COS-7 cells were cotransfected with pIRES-scFv-GFPA36 or pIRES-scFv-GFPM4 and pEF-BOS-Flag-Syt I or control vector (pEF-BOS).
  • Transfection of plasmid DNA was performed by LipofectAMINE (Invitrogen) according to the manufacturer's recommendation. Two days after transfection, the cells were broken up and homogenized in buffer (10 mM HEPES-KOH [pH 7.2], 100 mM NaCl, 1 mM ⁇ -mercaptoethanol).
  • the homogenate is centrifuged at 1,200 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant is dissolved in lysis buffer (10 mM HEPES-KOH [pH 7.2], 0.1% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM ⁇ -mercapto) Solubilized with ethanol at 4 ° C. for 1 hour. After centrifugation at 20,400 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., the supernatant was transferred to a new tube and Flag-Syt I or II was immunoprecipitated with anti-Flag antibody (Sigma) and protein A sepharose (GE Healthcare) .
  • the AAV 9/3 vector plasmid contains the human synapsin I promoter (hSynIp) followed by the target of interest between double loxP sequences (loxP-lox2722) derived from the pAAV-DIO-eNpHR-YFP vector (addgene: # 26966)
  • hSynIp human synapsin I promoter
  • loxP-lox2722 double loxP sequences
  • addgene: # 26966 A 241 bp fragment (FrgH) containing nucleotides 2519-2760 containing reverse cDNA and derived from rat tau 3'-UTR (Brun et al., 2003), Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element (WPRE), and simian
  • the virus 40 polyadenylation signal sequence (SV40pA) is included between the inverted terminal repeats of the AAV3 genome.
  • the mutated AAV9 vp cDNA (T466F) (Gao et al., 2004) was synthesized by the method previously described (Petrs-Silva et al., 2011).
  • Recombinant AAV 9/3 vector is generated by transient transfection of HEK 293 cells with vector plasmid, AAV3 rep and AAV9 vp expression plasmids, and adenovirus helper plasmid pHelper (Agilent Technologies) in the method previously described (Li et al., 2006) to obtain the vector AAV9 / 3-hSynIp-DIO-s3Flag-scFv-A36 or -M4-HA.
  • the recombinant virus was purified by isolation from two consecutive CsCl gradients and virus titer was determined by qRT-PCR.
  • the AAV1 vector plasmid contained hSynp followed by the cDNA of interest, FrgH, WPRE, and SV40 pA, between the inverted end sequences of the AAV1 genome.
  • the recombinant AAV1 vector was generated as described above to obtain the vector AAV1-hSynIp-scFvGFPA36 or M4.
  • a gauge needle and a 5 ⁇ L syringe Model 75 RN SYR, Hamilton
  • 2 ⁇ L was injected at a rate of 0.2 ⁇ L per minute.
  • the needle was left in place for 10 minutes after injection. Mice at least 33 days after injection were used for microdialysis, behavioral testing, or immunochemical analysis.
  • the cells were treated with 200 ⁇ L of PSS-HK buffer (20 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 85 mM NaCl, 60 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2 , 1.2 mM MgSO 4 , 1.2 mM KH 2 It was stimulated with PO 4 , 11 mM glucose) at 37 ° C. for 5 minutes.
  • PSS-HK buffer 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 85 mM NaCl, 60 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2 , 1.2 mM MgSO 4 , 1.2 mM KH 2 It was stimulated with PO 4 , 11 mM glucose) at 37 ° C. for 5 minutes.
  • the collected supernatant was immediately mixed with 10 ⁇ L of 0.1 M perchloric acid (PCA) containing 50 ⁇ M EDTA-2Na, sonicated for 30 seconds, and then centrifuged at 20,000 G for 15
  • the supernatant (190 ⁇ L) was transferred to a new tube and mixed with 1.7 ⁇ L of 5 M CH 3 COONa to adjust the pH to 3.0.
  • cells were lysed in 200 ⁇ L of 5 mM PCA containing 2.5 ⁇ M EDTA-2Na.
  • the sample (200 ⁇ L) was sonicated and mixed with 2.4 ⁇ L of 5 M CH 3 COONa.
  • mice were anesthetized with isoflurane (Escain; Mylan) using a small animal anesthesia machine (MK-A110; Muromachi) and placed in a stereotaxic frame (Stereotaxic Just for Mouse, Muromachi).
  • Escain isoflurane
  • MK-A110 small animal anesthesia machine
  • stereotaxic frame Stepotaxic Just for Mouse, Muromachi.
  • the guide cannula and screws for fixing were fixed with dental cement (Unifast 3; GC).
  • a microdialysis probe (AI-4-02; Eicom) was inserted into the striatum along the guide.
  • the implantation of the microdialysis probe ended between 3.5 and 4.5 hours after the onset of mouse anesthesia.
  • the mouse into which the microdialysis probe was inserted was placed on a paper towel (Kim towel, Nippon Paper Crecia) in a transparent microdialysis cage (20 cm long ⁇ 20 cm wide ⁇ 21 cm high) equipped with water and feed.
  • the day after transplantation mice were placed on fresh paper towels (Comfort 200, Nippon Paper Crecia) in clear microdialysis cages without water and feed.
  • the microdialysis probe was continuously perfused at a rate of 1 ⁇ L per minute using a syringe pump (ESP-32, Eicom) with Ringer's solution containing 147 mM NaCl, 4.02 mM KCl, 2.25 mM CaCl 2 .
  • the dialysate solution was prepared by using a refrigerated fraction collector (Refrigerated collector 820, Univentor) automatically at intervals of 10 minutes at 4 ° C. in plastic containing 5 ⁇ L of 0.1 M CH 3 COOH / 250 ⁇ M EDTA-2Na in advance. It collected in the micro tube.
  • Recovery of dialysate was performed 16.5 hours to 17.5 hours after implantation of the microdialysis probe. All dialysate samples were stored at 4 ° C. and analyzed by HPLC the following day.
  • acclimation was performed on day 1 by allowing the mice to stay on the stereotactic drum for 3 minutes. The habituation was repeated every day for 1 minute, just before the session. The rotation was set to a slow speed (5 rpm, surface speed 2.8 m / min). Immediately after the drop, the mouse was put back on the drum up to 5 times per session. The test was repeated 5 days with 1 session a day. The latency due to the fall was manually recorded and the total latency on the rod before (Day 1) and after (Day 5) of training was analyzed by a two-way repeated measures ANOVA.
  • the isoelectric point and the net charge at intracellular pH (7.4, 7.03, 6.60) can be obtained from the amino acid sequence of each intracellular antibody containing the peptide tag by the Chris Putnam Research Institute (http: Calculated using Protein calculator v3.4 developed by //protcalc.sourceforge.net/).
  • scFv-A36 Enzyme-linked immunosorbent assay
  • AB 472376 comprising 723 nucleotides in which the heavy and light chains were fused to each other with a glycine linker (FIG. 1, B, upper panel).
  • scFv-GFPA36 T7, EGFP, and His tags were fused to the amino or carboxy terminus of A36 (referred to as scFv-GFPA36; FIG. 1, B, lower panel).
  • E. coli ScFv-GFPA36 E. coli and purified through a Ni-NTA column. Western blot analysis confirmed that the purified ScFv-GFPA36 protein only recognized full-length Syt I / II and not the other 9 isoforms that were expressed exogenously in COS-7 cells (Figure).
  • cFv-GFPA36 is a specific antibody to the Syt I / II-C2A domain.
  • the amino acid sequences of the three CDRs of the variable region of the light chain of scFv-A36 are identical to those of the scFv encoding CRA5 and CRA5 is an immunoglobulin E (IgE) receptor (accession no. BAB 82458, data (Not shown) suggested that the CDRs of the light chain of scFv-A36 have no important role in determining the binding specificity with Syt I / II.
  • IgE immunoglobulin E
  • heavy chain CDR3 is the most hypervariable region in antibodies and has the potential to generate approximately 10 14 diversity in humans (Sanz, 1991), thereby contributing to the interaction of antibodies ( Chothia and Lesk, 1987) are known.
  • the amino acid sequence of the heavy chain CDR3 of scFv-A36 and the amino acid sequences of the heavy chain CDR3s of the other four scFvs accumulated in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) DNA database ( Figure 2) Diversity was found, suggesting that the heavy chain CDR3 of scFv-A36 is important for binding specificity.
  • construction of negative control antibody from scFv-GFPA36 was attempted by mutagenesis using PCR.
  • An AAV vector was constructed to express scFv-GFPA36 and scFv-GFPM4 (designated AAV-scFv-GFPA36 and AAV-scFv-GFPM4, respectively).
  • Primary cultured dopamine neurons in DIV7 prepared from the substantia nigra of mouse embryos were infected with AAV vector. Seven days after infection with AAV, cells were fixed and analyzed.
  • Example 3 Enhancement of Intracellular Antibody Stability by Addition of 3x Flag Peptide Tag Having Strong Negative Charge, and HA Peptide Tag Having Medium Negative Charge>
  • V H H-H7 intracellular antibodies with high net negative charge (-5.0) at pH 7.4 are successfully expressed without much aggregation in the mammalian cytoplasm (Kvam et al., 2010) ).
  • the unstimulated intracellular pH of hippocampal neurons has been reported to be -7.03-7.35 (Ruffin et al., 2014), and was previously used with the pH sensitive fluorescent protein pHluorin targeted to endosomes Studies have shown that the local cytosolic surface pH of endosomes is 6.73 ⁇ 0.08 (Mitsui et al., 2011). Thus, the pI and net charges of scFv-A36 and scFv-M4 at intracytoplasmic pH 6.60, 7.03 and 7.40, respectively, were compared to other peptide tags (FIG. 5A).
  • a protein has a positive net charge at a pH below its pI and a negative net charge at a pH above its pI.
  • the average of the estimated pI of the scFv protein fused to the s3Flag tag and the HA tag is the average of the estimated pI of the scFv protein fused to the T7 tag, the EGFP tag, and the His tag, or the scFv protein without added tag. It was significantly lower than that (Fig. 5A, Fig. 6B).
  • scFv-A36 and scFv-M4 intracellular antibodies fused to these peptide tags in mammalian cells was examined.
  • s3Flag-scFv-A36-HA and s3Flag-scFv-M4-HA are expressed with little aggregation and spread in HeLa cells (Fig. 5, B, lower panel), while cells It was revealed that the inner scFv-GFPA36 and scFv-GFPM4 form aggregates in the HeLa cell (FIG. 5, B, upper panel).
  • the average of cells with aggregates expressing s3Flag-scFv-A36-HA or s3Flag-scFv-M4-HA is compared to the average of cells with aggregates expressing scFv-GFPA36 or scFv-GFPM4 Decreased significantly (C in FIG. 5).
  • Example 4 s3Flag-scFv-A36-HA Interacts with the Syt I-C2A Domain and Suppresses the Ca 2+ -Dependent Interaction between Syt I and Syntaxin1-SNARE Domains
  • biochemical properties of the s3Flag-scFVA-36-HA construct were examined.
  • the binding affinity of purified s3Flag-scFv-A36-HA to GST-Syt I-C2A was measured.
  • s3Flag-scFv-A36-HA was purified from E. coli using anti-Flag antibody binding affinity beads. Purified from E. coli.
  • AAV9 / 3-hSynIp-DIO-s3Flag-scFv-A36 (or M4) -HA was injected into the substantia nigra of the right hemisphere of DAT-cre mice.
  • Immunohistochemical analysis shows that s3Flag-scFv-A36-HA and s3Flag-scFv-M4-HA stabilize in the cells of SNc and VTA dopamine neurons in the right hemisphere 33 days after injection of AAV9 / 3 vector It was revealed to be expressed (A to L in FIG. 8, arrows). These expression patterns were observed in almost all areas ( ⁇ 768 ⁇ m) of the substantia nigra region (A to J in FIG. 9).
  • mice expressing s3Flag-scFv-A36-HA mice expressing s3Flag-scFv-M4-HA, and mice not injected with AAV did.
  • Parkinson's disease is a neurodegenerative disease with movement deficits including tremors, stiffness, slowness of movement, and postural instability.
  • the most characteristic points of the patients are mainly the loss of dopamine neurons in SNc and the reduction of dopamine concentration in the striatum. Therefore, open field tests and modified rotarod tests were conducted to investigate the direct role of striatal dopamine release in motor behavior.
  • AAV9 / 3-hSynIp-DIO-s3Flag-scFv-A36 (or M4) -HA was injected on both sides of the substantia nigra of DAT-cre mice.
  • mice Four weeks after AAV injection, mice were used for open field testing and 5 or 6 days later for modified rotarod testing.
  • Total migration distance, speed of movement, center of time, and total rise between mice expressing s3Flag-scFv-A36-HA and mice expressing s3Flag-scFv-M4-HA There was no difference in the numbers (A to D in FIG. 12).
  • mouse brains were analyzed by immunohistochemistry. The expression on both sides of 3Flag-scFv-M4-HA and s3Flag-scFv-A36-HA protein in the substantia nigra DA nerve could be confirmed (F in FIG. 12, arrow).
  • Example 8 Evaluation of other peptide tags>
  • DE2.0 tag and DE5.0 tag were prepared, and their stabilization effects were examined.
  • a fusion protein using a DE 2.0 tag (DEQENDYDEPEVNDENQDYDE (SEQ ID NO: 13)) was prepared by using DE2.M in the N-terminal side of the peptide (Y13-259; SEQ ID NO: 22) derived from the anti-Kras monoclonal antibody.
  • DE 2.0-Y13-259 (SEQ ID NO: 27) fused with 0 tag; DE 2.0-Y13-259-HA (SEQ ID NO: 28); DE2.0-Y13-259-PA (SEQ ID NO: 29) in which a PA peptide is further fused to the C-terminal side of DE2.0-Y13-259 (SEQ ID NO: 29); and specific for aggregated fiberized human ⁇ -synuclein Antibodies that bind to the protein (Barkhordarian et al., 2006: Protein Engineering, Design and Selection, Volume 19, Issue 11, 1 November 20 A protein STAND-6E-LYS was prepared in which the DE 2.0 tag was fused to both the N and C ends of the scFV sequence (scFv-6E) of 06, Pages 497-502).
  • STAND-6E-LYS also includes Heat shock cognate protein 70 (HSC70) -binding peptide (MARVKKDQAEPLHRKFERQPPG (SEQ ID NO: 31)) as a functional peptide (Bauer et al., Nature Biotech (2010): Nature Biotechnology volume 28, pages 256- 263 (2010)) was fused C-terminally downstream of the DE 2.0 tag, and further downstream was a HA peptide downstream of the HSC70-binding peptide. The full length of the amino acid sequence of STAND-6E-LYS generated is shown in SEQ ID NO: 32.
  • a DE 5.0 tag is fused to the N-terminus of scFv-6E and a T7 tag (SEQ ID NO: 34: MASMTGGQQMG) is fused at the C-terminus DE5.0-6E (amino acid sequence: SEQ ID NO: 35, base sequence: SEQ ID NO: 36) was prepared. All DNAs encoding these fusion proteins were optimized for human codons and were synthesized by GenScript.
  • the DNAs encoding STAND-6E-LYS and DE5.0-6E are cloned into the mammalian expression vector pEF-BOS vector and the expression vector (STAND-6E-LYS expression vector; pEF-BOS-STAND-6E-LYS) , DE 5.0-6E expression vector; pEF-BOS-DE 5.0-6E) was constructed.
  • the STAND-6E-LYS expression vector and the DE 5.0-6E expression vector were introduced into HeLa cells by Lipofectamin 2000, and after 18 hours of culture, they were fixed with 4% PFA.
  • STAND-6E-LYS was stained by HA antibody
  • DE5.0-6E was stained by T7 antibody. It was confirmed that both STAND-6E-LYS and DE 5.0-6E were expressed without being aggregated in cells (FIG. 16).
  • the agglutination assay of ⁇ -synuclein uses ⁇ -synuclein Fibril, which is fiberized and aggregated by sonication of human recombinant ⁇ -synuclein purified from E. coli (Tarutani et al., 2018: Acta Neuropathol Commun. 2018 Apr 18; 6 (1): 29.). In this assay, human-derived SHSY5Y cells were used.
  • the HSC70 binding peptide incorporated into STAND-6E-LYS consists of the HSC70 binding motif of ⁇ -synuclein (VKKDQ (SEQ ID NO: 38)) and the HSC70 binding consensus motif (KFERQ (SEQ ID NO: 39)). It has been shown in vitro and in vivo that the degradation of mutant huntingtin protein by chaperon-mediated autophagy (CMA) can be promoted by fusing HSC70-binding peptide with a peptide that binds mutant huntingtin protein and is specific to the target protein molecule As long as it is a peptide (including scFv) that can be bound as such, it becomes possible to degrade the target protein molecule in a CMA-dependent manner.
  • CMA chaperon-mediated autophagy
  • a pEGFP- ⁇ -synuclein vector expressing a protein (EGFP-synuclein) in which the full length of human ⁇ -synuclein is fused to the green fluorescent protein EGFP, and use XtremGENE9 (Sigma) on SHSY5Y cells together with a STAND-6E-LYS expression vector Was introduced.
  • Fibril protein was introduced into cells using MultiFectam (Promega), cultured for 3 days, and then fixed with 4% PFA. Thereafter, STAND-6E-LYS was detected by an anti-HA antibody, and staining was performed by an anti-phosphorylated ⁇ -synuclein antibody (Mouse, WAKO).
  • the present invention can be used, for example, in various research applications and medical applications such as diagnostics and therapeutics.

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Abstract

任意の抗原結合性ペプチドを、細胞内で安定して機能する細胞内抗体として利用する技術を提供する。抗原結合性ペプチドに、１０～３９個のアミノ酸からなり、かつ、当該アミノ酸の少なくとも４５％が酸性アミノ酸である細胞内安定化ペプチドを融合させて、融合タンパク質として細胞内で発現させる。

Description

融合タンパク質
　本発明は細胞内環境で発現する抗原結合性の機能を有する融合タンパク質に関する。
　細胞内で機能する抗体すなわちイントラボディ（細胞内抗体）は、高等生物の細胞内で抗原（標的分子）を認識して結合することで細胞の機能に影響を及ぼすことができる。これらの抗原は、細胞内抗体に結合することにより不活化され得る重要な細胞内治療標的にもなり得る。また、研究手法として、細胞内抗体の使用は細胞の内部で抗体に結合することにより直接タンパク質の機能を特異的に阻害するための手段として着目されている。
　細胞内抗体の場合、まず標準的な方法で抗原を認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作成した後、そのcDNAから一本鎖抗体（single chain Fv：scFv）をコードするＤＮＡを含む細胞内発現ベクターを構築し、重鎖（VH）と軽鎖（VL）との複合体を細胞内抗体とすることが一般的である。
　抗体は通常、血液等の体内の細胞外空間を巡回して細胞外抗原を認識して機能するものであり、細胞外環境での作用が前提である。従って、抗体が細胞質で発現される場合、発現レベルの低下および抗体ドメインの半減期の制限に至るフォールディングおよび安定性の問題が生じるため、どのような抗体でも細胞内抗体として機能すると期待できるものではない。また、scFvは、その重鎖と軽鎖とをフレキシブルなペプチドリンカーで繋いだものであるから、その立体構造は必ずしもオリジナルの抗体ほどに安定ではない。加えて、試験管内で機能するscFvを同定したとしても、試験管内は細胞内部の環境を反映していない部分が多いため、細胞内でscFvを発現させた場合に期待通りの機能を発揮できるとも限らない。
　従って、細胞内抗体として機能する抗体のスクリーニングするため、これまでに細胞質条件に耐える抗体の規則性または予測のための手法が検討されてきた。これらの方法は、細胞内でも機能し得る抗体の選定方法であるが、実際に細胞内で安定な抗体を得ることが困難であり、既存の抗体や新しく単離した抗体を細胞内抗体として利用する技術は確立されていない。
国際公開第０３／０１４９６０号
　本発明は、任意の抗原結合性ペプチドを、細胞内で安定して機能する細胞内抗体として利用する技術を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、ペプチドタグを融合させた抗原結合性ペプチドを細胞内で発現させた際に、当該ペプチドタグによる抗原結合性ペプチドの正味の電荷および等電点（ｐＩ）の値の変化によって細胞内抗体としての機能の安定性が変動することを見出した。特に、細胞質のｐＨ環境よりもエンドソームの細胞質側表面のｐＨ環境を基準として電荷値とｐＩ値が十分に低くなるようペプチドタグを設計することで、当該ペプチドタグを融合させた抗原結合性ペプチドが細胞内抗体として細胞内で安定して機能させることに成功した。
　本発明者らは、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は下記の通りである：
１）細胞内安定化ペプチドと、抗原結合性ペプチドとを含む融合タンパク質であって、
　上記細胞内安定化ペプチドは、１０～３９個のアミノ酸からなり、かつ、当該アミノ酸の少なくとも４５％が酸性アミノ酸であり、
　上記抗原結合性ペプチドは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む、
融合タンパク質。
２）上記細胞内安定化ペプチドは、上記アミノ酸の２８％以下が塩基性アミノ酸であるか、塩基性アミノ酸を含まない、１）に記載の融合タンパク質。
３）上記細胞内安定化ペプチドは、上記塩基性アミノ酸を含まない、２）に記載の融合タンパク質。
４）上記細胞内安定化ペプチドは、上記塩基性アミノ酸として少なくとも１個のヒスチジンを含む、２）に記載の融合タンパク質。
５）上記細胞内安定化ペプチドは、１４～２５個のアミノ酸からなり、当該アミノ酸の少なくとも５０％が酸性アミノ酸であり、
　上記細胞内安定化ペプチドにおいて、上記酸性アミノ酸が８個以上連続した部分、および、酸性アミノ酸以外のアミノ酸が４個以上連続した部分が存在しない、１）～４）の何れか１つに記載の融合タンパク質。
６）上記細胞内安定化ペプチドにおいて、上記酸性アミノ酸が３個以上連続した部分、および、酸性アミノ酸以外のアミノ酸が３個以上連続した部分が存在しない、５）に記載の融合タンパク質。
７）上記細胞内安定化ペプチドは、上記酸性アミノ酸をＸＡ、酸性アミノ酸以外のアミノ酸をＸｎとしたときに、
　以下のアミノ酸配列（１）または（２）：
　　－Ｘｎ－ＸＡ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－（ＸＡまたはＸｎ）－Ｘｎ－ＸＡ－（ＸＡまたはＸｎ）－Ｘｎ－（ＸＡまたはＸｎ）－ＸＡ－　　　・・・・・・（１）、
　　－Ｘｎ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－Ｘｎ－Ｘｎ－ＸＡ－ＸＡ－Ｘｎ－Ｘｎ－ＸＡ－　　　　　　　　　　　　・・・・・・（２）、
を含んでなる、１）～６）の何れか１つに記載の融合タンパク質。
８）ＸＡはアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘｎはアスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシンおよびバリンからなる群より選択される何れかのアミノ酸である、７）に記載の融合タンパク質。
９）上記１）～８）の何れか１つに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
１０）上記９）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
１１）細胞内において抗原結合性ペプチドを発現させる細胞を製造する方法であって、９）に記載のポリヌクレオチドまたは１０）に記載の発現ベクターを細胞に導入する工程を含む、製造方法。
１２）上記１）～８）の何れか１つに記載の融合タンパク質を発現する細胞。
図１は、ｓｃＦｖ－Ａ３６の発現および結合能の評価した結果を示す図である。 図２は、ｓｃＦｖ－Ａ３６のVH領域のＣＤＲのアミノ酸配列情報を示す図である。 図３は、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６およびｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４の培養神経細胞内の発現と標的分子の機能阻害活性について評価した結果を示す図である。 図４は、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６がマウス脳神経の細胞内において凝集を形成することを確認した図である。 図５は、ｓｃＦｖ－Ａ３６およびｓｃＦｖ－Ｍ４のｐＩおよび正味の電荷並びに細胞内の凝集性を評価した結果を示す図である。 図６は、ｓｃＦｖ－Ａ３６タンパク質配列を用いたＮＣＢＩ　ｂｌａｓｔ検索により得られた他の９４種類のｓｃＦｖタンパク質配列を用いて、ｓ３ＦｌａｇおよびＨＡペプチドタグの付加による低ｐＨ環境下での細胞内抗体の正味の負電荷の増加効果の一般性について調べた結果を示す図である。 図７は、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖＡ－３６－ＨＡ構築物の生化学的な性質を調べた結果を示す図である。 図８は、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡおよびｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡに関して、マウス脳の神経の細胞内における発現を調べた結果を示す図である。 図９は、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡおよびｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡの黒質領域における発現パターンを調べた図である。 図１０は、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡおよびｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡの両方における、ドーパミン神経での長期間（６ヶ月）の発現について観察した図である。 図１１は、ドーパミン神経において、ｉｎ　ｖｉｖｏでｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡがＳｙｔ　Ｉに対し機能活性を有することを調べた結果を示す図である。 図１２は、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを発現しているマウスおよびｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡを発現しているマウスの運動行動テストおよび免疫組織染色の結果を示す図である。 図１３は、ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９の発現および抗腫瘍活性について調べた結果を示す図である。 図１４は、ＤＥ２．０－Ｙ１３－２５９－ＨＡの発現および抗腫瘍活性について調べた結果を示す図である。 図１５は、ｓｃＦｖ‐６Ｅとタグとの融合によってｓｃＦｖ‐６Ｅの正味の負電荷が変化することを調べた結果を示す図である。 図１６は、ＳＴＡＮＤ-６Ｅ‐ＬＹＳ、及びＤＥ５．０‐６Ｅの細胞内での発現を観察した結果を示す図である。 図１７は、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ凝集アッセイの結果を示す図である。 図１８は、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ凝集化を評価した結果を示す図である。
　＜０．定義＞
　（ペプチド）
　本明細書において、「ペプチド」は、「ポリペプチド」または「タンパク質」とも換言し得る。「ペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合してなる構造を含むが、さらに、例えば、糖鎖、またはイソプレノイド基などの構造を含んでいてもよい。「ペプチド」は、特に明記しない場合は、天然に存在するアミノ酸と同様に機能することができる、天然に存在するアミノ酸の既知の類似体を含有するペプチドを包含する。
　（酸性アミノ酸）
　本明細書において、「酸性アミノ酸」とはその等電点が３．９９以下のアミノ酸を指す。アミノ酸は天然に存在するものであっても、天然に存在するアミノ酸の類似体であってもよい。天然に存在する酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸とグルタミン酸とが挙げられる。
　（塩基性アミノ酸）
　本明細書において、「塩基性アミノ酸」とはその等電点が７．４０以上のアミノ酸を指す。アミノ酸は天然に存在するものであっても、天然に存在するアミノ酸の類似体であってもよい。天然に存在する塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンが挙げられる。
　（酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸以外のアミノ酸）
　本明細書において、アミノ酸自体のｐＨに着目した場合に、上記の酸性アミノ酸の定義にも、塩基性アミノ酸の定義にも当てはまらないアミノ酸を、「酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸以外のアミノ酸」または「略中性アミノ酸」と総称する。すなわち、これらのアミノ酸の等電点は３．９９を超え７．４０未満である。アミノ酸は天然に存在するものであっても、天然に存在するアミノ酸の類似体であってもよい。
　（Ａおよび／またはＢ）
　本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」は、ＡおよびＢとＡまたはＢとの双方を含む概念であり、「ＡおよびＢの少なくとも一方」とも換言できる。
　＜１．融合タンパク質＞
　本発明の融合タンパク質は、細胞内安定化ペプチドと、抗原結合性ペプチドとを含む融合タンパク質であって、
　上記細胞内安定化ペプチドは、１０～３９個のアミノ酸からなり、かつ、当該アミノ酸の少なくとも４５％が酸性アミノ酸であり、
　上記抗原結合性ペプチドは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。
　本発明の融合タンパク質は、任意の細胞において発現させることで細胞内抗体としての機能を有する。
　〔細胞内安定化ペプチド〕
　（ペプチドの長さと酸性アミノ酸の含有）
　細胞内安定化ペプチドは、構成されるアミノ酸数は特に限定されないが、好ましくは５０個までのアミノ酸からなるペプチドであり、より好ましくは１０～３９個のアミノ酸からなるペプチドである。ここで、細胞内安定化ペプチドを構成する全アミノ酸の少なくとも４５％が、酸性アミノ酸である。
　細胞内安定化ペプチドを構成する全アミノ酸に占める酸性アミノ酸の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましい。細胞内安定化ペプチドを構成する全アミノ酸に占める酸性アミノ酸の割合は、例えば、５３％以上または５５％以上であってもよく、６０％以上であることが好ましい場合があり、６５％以上または７０％以上であることが好ましい場合がある。酸性アミノ酸の割合が高まると、一般に、当該酸性アミノ酸を含んでなるポリペプチドの等電点は低下する。
　細胞内安定化ペプチドを構成する酸性アミノ酸の個数は、細胞内安定化ペプチドを構成する全アミノ酸に占める酸性アミノ酸の上記割合の何れかを満たす限りにおいて特に限定されないが、例えば、６個または７個以上であり、８個または９個以上であることが好ましく、１０個またはそれ以上であることがより好ましく、１１個またはそれ以上であることがさらに好ましく、１２個またはそれ以上であることが特に好ましい。
　細胞内安定化ペプチドを構成する酸性アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択されることが好ましい。
　融合タンパク質における細胞内安定化ペプチドの寄与を高めるという観点からは、細胞内安定化ペプチドを構成するアミノ酸の数は、１４個またはそれ以上であることが好ましく、１５個またはそれ以上であることがより好ましく、１８個またはそれ以上であることがさらに好ましく、２０個またはそれ以上であることが特に好ましい。また、融合タンパク質のサイズを抑制する観点からは、細胞内安定化ペプチドを構成するアミノ酸の数は、３５個以下であることが好ましく、３０個以下であることがより好ましく、２５個以下であることがさらに好ましい。なお、細胞内安定化ペプチドの長さ（構成するアミノ酸の個数）が９アミノ酸以下となれば、融合タンパク質における細胞内安定化ペプチドの寄与の観点で不十分となる場合がある。細胞安定化ペプチドを認識する抗体を作製する等、必要に応じて所望される細胞内安定化ペプチドの特異抗原性の観点でも不十分となる場合がある。また、細胞内安定化ペプチドの長さが４０アミノ酸以上となれば、融合タンパク質のサイズが必要以上に大きくなり、後述する抗原結合性ペプチドによる抗原認識において立体障害となり得る。ただし、細胞内安定化ペプチドと抗原結合性ペプチドの間に、抗原認識の妨げにならないようリンカーとなるペプチドを連結した場合には、４０アミノ酸以上の細胞内安定化ペプチドも使用することができる。その場合には複数の細胞内安定化ペプチド（同じ細胞内安定化ペプチドが複数もあってもよく、異なる細胞内安定化ペプチドの組み合わせであってもよい）を、それぞれの細胞内安定化ペプチドの間にスペーサーを介して連結することで使用することもできる。
　（塩基性アミノ酸を含有する場合）
　細胞内安定化ペプチドを構成する全アミノ酸に占める塩基性アミノ酸の割合は特に限定されないが、２８％以下であることが好ましく、２７％以下または２６．５％以下であることがより好ましく、２５％以下、２０％以下、１５％以下、または１０％以下であることがさらに好ましく、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下または３％以下であることが特に好ましい。特に好ましい一形態では、細胞内安定化ペプチドは、塩基性アミノ酸を含まない。
　細胞内安定化ペプチドを構成する塩基性アミノ酸の個数の好ましい範囲は、細胞内安定化ペプチドを構成する全アミノ酸に占める塩基性アミノ酸の上記割合の何れかを満たす限りにおいて特に限定されないが、例えば、６個以下であり、５個または４個以下であることが好ましく、３個以下であることがより好ましく、２個以下であることがさらに好ましく、１個以下であることが特に好ましい。
　細胞内安定化ペプチドが塩基性アミノ酸を含む場合において、当該塩基性アミノ酸はリジンおよびヒスチジンからなる群から選択されることが好ましく、当該塩基性アミノ酸として少なくとも１個のヒスチジンを含むことがより好ましい。ヒスチジンは天然に存在する塩基性アミノ酸の中で最も等電点が低いという特性を有する。細胞内安定化ペプチドが複数の塩基性アミノ酸を含む場合において、当該塩基性アミノ酸に占めるヒスチジンの割合は３０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、６０％以上であることがさらに好ましく、１００％であることが特に好ましい。細胞内安定化ペプチドに含まれるヒスチジンの個数は、例えば、６個、５個、４個、３個、２個または１個である。
　（酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸以外のアミノ酸）
　細胞内安定化ペプチドは、上記の酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸以外のアミノ酸（「略中性アミノ酸」と総称する）を含んでいてもよい。
　細胞内安定化ペプチドを構成する全アミノ酸に占める略中性アミノ酸の割合は５５％以下であり、５０％以下であることが好ましく、４５％以下であることがより好ましい。細胞内安定化ペプチドが略中性アミノ酸を含む場合、当該ペプチドを構成する全アミノ酸に占める略中性アミノ酸の割合の下限は特に限定されないが、一態様において、１５％以上であり、２０％以上であり、または、２５％以上である。
　細胞内安定化ペプチドの抗原としての特性を考慮する場合、細胞内安定化ペプチドを構成する全アミノ酸に占める疎水性アミノ酸（すなわち、極性の無い略中性アミノ酸）の割合は２５％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１５％以下であることがさらに好ましい。しかし、細胞内安定化ペプチドにおける親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とのバランスを考慮した場合に、前記の疎水性アミノ酸の割合を満たすことを前提として、疎水性アミノ酸が１個以上含まれることが好ましい場合もある。細胞内安定化ペプチドが疎水性アミノ酸を含んでいる場合、その個数は、例えば、１個、２個、３個、または４個である。なお、疎水性アミノ酸同士の連続は３個までが好ましい場合があり、２個までがより好ましい場合がある。
　細胞内安定化ペプチドが天然に存在する略中性アミノ酸を含む場合において、当該略中性アミノ酸は、アスパラギン、フェニルアラニン（疎水性アミノ酸）、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニン（疎水性アミノ酸）、トリプトファン（疎水性アミノ酸）、バリン（疎水性アミノ酸）、グリシン（疎水性アミノ酸）、ロイシン（疎水性アミノ酸）、イソロイシン（疎水性アミノ酸）、およびプロリン（疎水性アミノ酸）からなる群より選択されることが好ましく、アスパラギン、グルタミン、チロシン、メチオニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、およびプロリンからなる群より選択されることがより好ましく、アスパラギン、グルタミン、チロシン、バリン、およびプロリンからなる群から選択されることがさらに好ましい。ある態様では、細胞内安定化ペプチドはプロリンを少なくとも１個（好ましくは１個または２個）と、アスパラギン、グルタミンおよびチロシンから選択されるアミノ酸を少なくとも１個（好ましくは８個以下であり、７個、６個、５個、４個、３個、または２個である）と、プロリン以外の疎水性アミノ酸を少なくとも１個（好ましくは１個または２個）とを含んでいる。
　なお、好ましい略中性アミノ酸の種類およびその配置は、例えば、形成される細胞内安定化ペプチドの安定性（酸化や加水分解等への耐性）、分子内Ｓ－Ｓ結合の形成の有無、分子内水素結合の形成の有無、不所望なモチーフの形成の有無等を考慮して決定すればよい。
　（等電点）
　細胞内安定化ペプチドの等電点は、当該細胞内安定化ペプチドを構成するアミノ酸の種類から算出することができる。細胞内安定化ペプチドの等電点の算出は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃａｌｕｃｕｌａｔｏｒ（http://protcalc.sourceforge.net）等の記載に従って行うことができる。
　（細胞内安定化ペプチドのより具体的な例示）
　以下、細胞内安定化ペプチドのより具体的な例示について説明を行う。なお、以下の説明において、ＸＡとは酸性アミノ酸を指し、Ｘｎとは酸性アミノ酸でないアミノ酸、すなわち、上記した塩基性アミノ酸と略中性アミノ酸とを指す。
　なお、ここで具体的に例示する細胞内安定化ペプチドには、〔細胞内安定化ペプチド〕欄で記載した事項の全てを当てはめることができる。例えば、ＸＡには上記酸性アミノ酸として記載した事項の全てが当てはまり、Ｘｎには上記塩基性アミノ酸と略中性アミノ酸として記載した事項の全てが当てはまる。また、細胞内安定化ペプチドの長さ等も上記した事項の全てを当てはめることができる。具体的には、例えば、ここで例示する細胞内安定化ペプチドは、上記アミノ酸の２８％以下が塩基性アミノ酸であるか、塩基性アミノ酸を含まない（すなわち全てのＸｎが略中性アミノ酸である）ものであってもよい。また、上記細胞内安定化ペプチドは、塩基性アミノ酸として少なくとも１個のヒスチジンを含むものであってもよい。
　（１）第一の態様
　以下に箇条書きをした条件を全て満たす細胞内安定化ペプチド。
・細胞内安定化ペプチドは、１０～３９個のアミノ酸からなり、１４～２５個のアミノ酸からなることが好ましい。
・細胞内安定化ペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも４５％が酸性アミノ酸であり、少なくとも５０％が酸性アミノ酸であることが好ましい。
・細胞内安定化ペプチドにおいて、ＸＡが８個以上連続した部分、および、Ｘｎが４個以上連続した部分が存在しない。すなわち、細胞内安定化ペプチドにおいて、ＸＡの連続は７個までであり、Ｘｎの連続は３個までである。
　（２）第二の態様
　上記の第一の態様の条件を満たし、かつ、以下に箇条書きをした条件を満たす細胞内安定化ペプチド。
・細胞内安定化ペプチドにおいて、ＸＡが６個以上連続した部分、および、Ｘｎが４個以上連続した部分が存在しない。すなわち、細胞内安定化ペプチドにおいて、ＸＡの連続は５個までであり、Ｘｎの連続は３個までである。
　（３）第三の態様
　上記の第一の態様の条件を満たし、かつ、以下に箇条書きをした条件を満たす細胞内安定化ペプチド。
・細胞内安定化ペプチドにおいて、ＸＡが６個以上連続した部分、および、Ｘｎが３個以上連続した部分が存在しない。すなわち、細胞内安定化ペプチドにおいて、ＸＡの連続は５個までであり、Ｘｎの連続は２個までである。
　（４）第四の態様
　上記の第一の態様の条件を満たし、かつ、以下に箇条書きをした条件を満たす細胞内安定化ペプチド。
・細胞内安定化ペプチドにおいて、ＸＡが３個以上連続した部分、および、Ｘｎが３個以上連続した部分が存在しない。すなわち、細胞内安定化ペプチドにおいて、ＸＡの連続は２個までであり、Ｘｎの連続は２個までである。
　（５）第五の態様
　以下に箇条書きをした条件を全て満たす細胞内安定化ペプチド。なお、第五の態様は、第一～第四の態様の何れかに当てはまるものであっても、当てはまらないものであってもよい。
・細胞内安定化ペプチドは、１０～３９個のアミノ酸からなり、１４～２５個のアミノ酸からなることが好ましい。
・細胞内安定化ペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも４５％が酸性アミノ酸であり、少なくとも５０％が酸性アミノ酸であることが好ましい。
・以下に示すアミノ酸配列：
　－Ｘｎ－ＸＡ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－（ＸＡまたはＸｎ）－Ｘｎ－ＸＡ－（ＸＡまたはＸｎ）－Ｘｎ－（ＸＡまたはＸｎ）－ＸＡ－・・・・・（１）
を含んでいる。
　（６）第六の態様
　上記の第五の態様の条件を満たし、第五の態様で示したアミノ酸配列（１）の左側にさらに３個～７個のＸＡまたはＸｎを有し、右側にさらに０個～６個のＸＡまたはＸｎを有する。
　（７）第七の態様
　以下に箇条書きをした条件を全て満たす細胞内安定化ペプチド。なお、第七の態様は、第一～第四の態様の何れかに当てはまるものであっても、当てはまらないものであってもよい。
・細胞内安定化ペプチドは、１０～３９個のアミノ酸からなり、１４～２５個のアミノ酸からなることが好ましい。
・細胞内安定化ペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも４５％が酸性アミノ酸であり、少なくとも５０％が酸性アミノ酸であることが好ましい。
・以下に示すアミノ酸配列：
　－Ｘｎ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－Ｘｎ－Ｘｎ－ＸＡ－ＸＡ－Ｘｎ－Ｘｎ－ＸＡ－・・・・・・・（２）
を含んでいる。
　（８）第八の態様
　上記の第七の態様の条件を満たし、第七の態様で示したアミノ酸配列（２）の左側にさらに０個～９個のＸＡまたはＸｎを有し、右側にさらに０個～９個のＸＡまたはＸｎを有する。但し、アミノ酸配列（２）の左側と右側とにあるアミノ酸の個数の合計は１０個以下であることが好ましく、９個以下であることがより好ましく、６個または５個以下であることがさらに好ましい場合がある。
　（９）第九の態様
　上記第一～第八の態様の何れかに当てはまるものであって、ＸＡはアスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、Ｘｎはアスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される何れかのアミノ酸である。
　（１０）第十の態様
　上記第五～第六の態様の何れかに当てはまるものであって、ＸＡはアスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、Ｘｎのうちアミノ酸配列（１）の左側から２～６番目（好ましくは２～４番目、より好ましくは２～３番目）のＸｎの一つまたはそれ以上がプロリンであり、プロリンでないＸｎは、アスパラギン、グルタミン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される何れかのアミノ酸である。例えば、アミノ酸配列（１）の左側から２～３番目のＸｎの一つがプロリンであり、アミノ酸配列（１）に含まれるその他のＸｎが、アスパラギン、グルタミン、バリン、およびチロシンからなる群より選択される何れかのアミノ酸であるもの。さらには例えば、アミノ酸配列（１）の左側から２～３番目のＸｎの一つがプロリンであり、アミノ酸配列（１）に含まれるその他のＸｎが、アスパラギン、グルタミン、およびチロシンからなる群より選択される何れかのアミノ酸であるもの。
　（１１）第十一の態様
　上記第七～第八の態様の何れかに当てはまるものであって、ＸＡはアスパラギン酸、またはグルタミン酸であり、Ｘｎのうちアミノ酸配列（２）の左側から３～６番目（好ましくは３～５番目、より好ましくは４～５番目）のＸｎの一つまたはそれ以上がプロリンであり、プロリンでないＸｎは、アスパラギン、グルタミン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される何れかのアミノ酸である。例えば、アミノ酸配列（２）の左側から４～５番目のＸｎの一つがプロリン、Ｘｎの他の一つがバリンであり、アミノ酸配列（２）に含まれるその他のＸｎが、アスパラギン、グルタミン、およびチロシンからなる群より選択される何れかのアミノ酸であるもの。
　（１２）第十二の態様
　細胞内安定化ペプチドは、以下のアミノ酸配列の何れかからなる。
　　ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１）；
　　ＥＥＤＱＤＤＥＤＤＥＤＱＤＤ（配列番号２）；
　　ＮＤＥＹＥＤＰＤＥＱＤＤＥＮＤ（配列番号３）；
　　ＱＤＥＶＤＥＰＥＤＥＥＤＮＤＤ（配列番号４）；
　　ＱＤＥＶＤＥＰＥＤＥＤＥＮＤＤ（配列番号５）；
　　ＱＤＥＶＤＥＰＥＤＥＤＥＮＱＤ（配列番号６）；
　　ＱＤＮＶＤＥＰＥＤＮＤＥＮＱＤ（配列番号７）；
　　ＱＤＮＹＤＥＰＥＤＮＤＥＮＱＤ（配列番号８）；
　　ＥＤＮＹＤＥＰＥＤＮＤＥＮＱＤ（配列番号９）；
　　ＤＮＮＹＤＥＱＤＥＮＥＱＰＥＤ（配列番号１０）；
　　ＱＥＮＤＹＤＥＰＥＶＮＤＥＮＱＤ（配列番号１１）；
　　ＤＥＱＥＮＤＹＤＥＰＥＶＮＤＥＮＱＤ（配列番号１２）；
　　ＤＥＱＥＮＤＹＤＥＰＥＶＮＤＥＮＱＤＹＤＥ（配列番号１３）；。
　（１３）第十三の態様
　以下に箇条書きをした条件を全て満たす細胞内安定化ペプチド。
・細胞内安定化ペプチドは、１０～３９個のアミノ酸からなり、１４～２５個のアミノ酸からなることが好ましい。
・細胞内安定化ペプチドを構成するアミノ酸のすべてが酸性アミノ酸である。
　〔抗原結合性ペプチド〕
　（構造）
　典型的な抗体構築物ユニットは、テトラマーを含むことが知られている。各々のテトラマーは、同一の２対のポリペプチド鎖から構成され、各々の対が１本の軽鎖（一例では、約２５ｋＤａ）および１本の重鎖（一例では、約５０～７０ｋＤａ）を有する。各々の鎖のアミノ末端部分は約１００アミノ酸以上の可変領域を有し、該可変領域は主に抗原（標的分子）認識の役割を担う。各々の鎖のカルボキシル末端部分は、主にエフェクター機能の役割を担う定常領域を規定する。軽鎖は、カッパまたはラムダの何れかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはエプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および可変領域が約１２アミノ酸以上のＪ領域によって連結されており、重鎖はまた、約１０アミノ酸以上のＤ領域を含む。各々の軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。これらの鎖はすべて、３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる）によって連結される相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を示す。各対の２本の鎖由来のＣＤＲをフレームワーク領域によって並べることで、特定のエピトープへの結合を可能とする。
　「抗原結合性ペプチド」とは、任意のモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体と同様に抗原（標的分子）に対して特異的に結合するペプチドにおいて抗原と結合に寄与するペプチドであって、当該抗体の抗原結合能を有する領域のすべてまたは一部分の領域を有しているものを指す。本発明において「抗原結合性ペプチド」は、例えば、任意のモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。好ましくは、これらのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはこれら全てを含む。
　本発明の抗原結合性ペプチドのもとになるモノクローナル抗体は、天然型抗または遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体であってよい。天然型抗体は、特に限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、サル、ヤギ、ウサギ、ラクダ、ラマ、ウシおよびニワトリなどを含む、生物種に由来し得る。遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体としては、特に限定はされないが、天然型抗体をもとに作製される合成抗体、組換え抗体、および変異導入抗体等が挙げられる。既に遺伝子組換え技術を用いて製造された抗体に対して、上述のように天然型抗体を遺伝子改変する場合と同様の改変を施した抗体も含まれる。本発明の抗原結合性ペプチドは、これらの抗体を由来とするＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabilized Fv）、ｄＡｂ（single domain antibody）、ダイアボディ、ミニボディまたはＶＨＨの全長またはその一部を含むペプチドである。「モノクローナル抗体と同様に抗原に対して特異的に結合するペプチド」としては、抗原への結合特異性が高いペプチドアプタマー、標的分子との結合特異性を持つ生体由来のタンパク質（例えばフィブロネクチン）の結合ドメインなどが挙げられる。
　〔さらなる機能ペプチド〕
　本発明の融合タンパク質は、細胞内安定化ペプチドおよび抗原結合性ペプチド以外の機能ペプチドを１つ以上さらに含んでいてもよい。そのような機能ペプチドとしては、精製タグペプチド、検出用ペプチド、分解促進ペプチド（例えばＨＳＣ７０結合ペプチド、ＸＩＡＰ ＲＩＮＧドメインペプチド）、Ｎｅｈ２ドメインペプチド（Ｎｒｆ２由来のペプチド）、酸素依存性分解ドメイン（Ｈｉｆ１α由来のペプチド）等のストレス応答性分解ペプチド、及び、薬剤結合性ペプチド等が挙げられる。
　精製タグペプチドとしては、特に限定されないが、ＨＡタグ配列（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１４））、ＰＡタグ配列（ＧＶＡＭＰＧＡＥＤＤＶＶ（配列番号１５））、などの酸性アミノ酸を１５％以上含む精製タグペプチドが挙げられる。酸性アミノ酸を１５％以上含むタグ配列を含むことにより、低いｐＨにおいても、融合タンパク質の負電荷をより増加させる。精製タグペプチドは、酸性アミノ酸を２０％以上含むことがより好ましい。
　検出用ペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、蛍光タンパク質、反応により光の放出や色の変化を生じる酵素等が挙げられる。蛍光タンパク質としては、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、Ｃｙｐｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ，ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＫＯ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍｃｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ａｚａｌｅａ、ｍＰｌｕｍ、ｍＡＧ、Ｋａｅｄｅ、Ｄｒｏｎｐａ、Ｋｅｉｍａ、ＫｉｋＧ、ＫｉｋＧＲ、ＵｎａＧ等が挙げられるが、これらに限定されない。反応により光の放出や色の変化を生じる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ－ス－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ等などが挙げられるが、これらに限定されない。
　〔融合タンパク質の構造〕
　「融合タンパク質」とは、共有結合によって、直接またはリンカーを介して連結された少なくとも２種の異種ペプチドを有するタンパク質を指す。リンカーは、特に限定されないが、好ましくは、柔軟性を与えるために、例えば、グリシン、アラニン、およびセリンなどの低分子側鎖を有するアミノ酸を主に含有する。好ましくは、リンカー配列の８０％、９０％、またはそれ以上がグリシン残基、アラニン残基、またはセリン残基を含み、特にグリシン残基またはセリン残基を含有する。
　融合タンパク質に含まれる細胞内安定化ペプチドおよび抗原結合性ペプチドの連結の順序は任意である。融合タンパク質のＮ末端側から、細胞内安定化ペプチド－抗原結合性ペプチドの順、または抗原結合性ペプチド－細胞内安定化ペプチドの順に配置されてよい。また、融合タンパク質のＮ末端－Ｃ末端の向きに対して、細胞内安定化ペプチドおよび／または抗原結合性ペプチド自体のＮ末端－Ｃ末端の向きが逆になるように配置されてもよい。また、抗原結合性ペプチドの両端に複数の細胞内安定化ペプチド（同じ細胞内安定化ペプチドが複数もあってもよく、異なる細胞内安定化ペプチドの組み合わせであってもよい）が配置されていてもよい。
　さらなる機能ペプチドの配置も任意である。機能ペプチドが酸性アミノ酸を１５％以上含む精製タグペプチドの場合、抗原結合性ペプチドを細胞内安定化ペプチドと挟む位置（細胞内安定化ペプチド－抗原結合性ペプチド－精製タグペプチド、または、精製タグペプチド－抗原結合性ペプチド－細胞内安定化ペプチド）に配置されていることが好ましい。このように配置することにより、融合タンパク質の全体的な電荷の位置的なバランスが取れる。そのため、細胞内において融合タンパク質をより安定に維持することができる。検出用ペプチドの配置も任意であるが、検出感度の観点から、融合タンパク質の最もＮ末端側または最もＣ末端側に位置することが好ましい。
　また、抗原結合性ペプチドのＮ末端側とＣ末端側との両方に、同一のまたは異なる細胞内安定化ペプチドが連結されていてもよい。この場合、より低いｐＨにおいても、融合タンパク質の負電荷が多くなるため、細胞内における凝集をより防ぐことができる。
　本発明の融合タンパク質は、細胞内安定化ペプチドを含むことにより、等電点が、抗原結合性ペプチド単独で存在する場合よりも低下する。そのため、細胞内において、抗原結合性ペプチド単独で発現させた場合よりも凝集が抑制されて、安定的に細胞内抗体として機能し得る。
本発明の融合タンパク質は、一例において、ｐＨ７．４における正味の電荷が負であることが好ましく、ｐＨ６．６における正味の電荷が負であることがより好ましく、ｐＨ６．０における正味の電荷が負であることがより好ましく、ｐＨ５．０における正味の電荷が負であることがさらに好ましい。
　「融合タンパク質」を構成するアミノ酸の数は特に限定されないが、例えば、１０００個以下であり、６００個以下であることが好ましく、５５０個以下であることがより好ましい。「融合タンパク質」を構成するアミノ酸の数は、例えば１００個以上であり、２５０個以上であり、または、３００個以上である。
　＜２．ポリヌクレオチド＞
　本発明のポリヌクレオチドは、本発明の融合タンパク質をコードする。「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド分子の何れであってもよい。また、「ポリヌクレオチド」は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。
　本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または化学合成方法等によって調製され得る。本発明のポリヌクレオチドの具体的な塩基配列は、目的とする融合タンパク質のアミノ酸配列から、例えばコドン表を参照して、当業者は容易に設計することができる。
　また、必要に応じて、プロモーター（ＳＶ４０プロモーター、ＭＭＴＶ－ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーターなど）、エンハンサー、リボソーム結合部位、スプライスシグナル、およびターミネーター等の調節性配列、並びに選択マーカー配列等を含んでいてもよい。
　また、必要に応じて、核やミトコンドリア、小胞体や形質膜直下に局在させるようなシグナルペプチド配列を付加することで、本発明の融合タンパク質の局在化により細胞内抗体として機能する細胞内の場所を制御することが可能である。
　本発明のポリヌクレオチドは、ベクターに組み込まれ得る。「ベクター」とは、所望のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入し、宿主細胞において発現させるためのビヒクルを指す。ベクターとしては、ウイルスベクター、並びに、プラスミドベクター、バクテリアベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、およびコスミドベクター等の非ウイルスベクター系のベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、およびＭＯＭＬＶなど）、レンチウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルスなどが挙げられる。インビボにおいて本発明のポリヌクレオチドを細胞へ導入する場合には、ウイルスベクターを用いることが好ましい。インビトロにおいて本発明のポリヌクレオチドを細胞へ導入する場合には、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター系のベクターの何れを用いてもよい。
　ベクターは、発現されるＤＮＡの他に、例えば、プロモーター（ＳＶ４０プロモーター、ＭＭＴＶ－ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーターなど）、エンハンサー、リボソーム結合部位、スプライスシグナル、およびターミネーター等の調節性配列、並びに必要に応じて選択マーカー配列（アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子など）等を含んでいてもよい。プロモーターは恒常的なものであってもよいし、誘導性のものであってもよい。
　発現ベクターの構築は、例えば、公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。
　＜３．利用方法＞
　〔薬学的用途〕
　（薬学的組成物）
　本発明はまた、上述の融合タンパク質、ポリヌクレオチドまたはベクターを含む薬学的組成物を提供する。
　本発明の薬学的組成物は、上述の融合タンパク質、ポリヌクレオチドまたはベクター以外の他の成分をさらに含んでいてもよい。当該他の成分は特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塩類、緩衝剤、安定剤、保存剤、賦形剤、抗酸化剤、粘度調整剤、着色剤、香味料、および甘味料等が挙げられる。薬学的組成物が水溶液として形成される場合、純水（滅菌水）、生理食塩液、またはリン酸緩衝生理食塩液等を担体として使用し得る。薬学的組成物が他の適切な溶液として形成される場合、生体内に導入されることができる有機エステル、例えばグリコール、グリセロール、またはオリーブ油等を担体として使用し得る。
　薬学的組成物は、使用説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサー等に収容されてもよい。
　（疾患の治療および予防への利用）
　上述の薬学的組成物は、例えば、抗原が関連する疾患を治療および／または予防するために用いることができる。
　本発明の薬学的組成物の一態様としては、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを対象の細胞に導入し、対象の細胞内で本発明の融合タンパク質を発現させて、抗原結合性ペプチドにより疾患に関連する抗原の機能を制御し（すなわち、抑制または活性化する。好ましくは抑制する）、疾患を治療および／または予防する。
　本発明の薬学的組成物の別態様としては、細胞外環境から細胞内へと抗体を運ぶための機構を利用することで、標的とする細胞内に本発明の融合タンパク質が侵入して細胞内抗体として機能し、疾患を治療および／または予防することができる。
　本発明の薬学的組成物の別態様としては、細胞外環境から細胞内に移行し再び細胞外環境へと輸送される機構（リサイクル機構）において、標的とする細胞内における本発明の融合タンパク質の安定性を向上させ、細胞内および／または細胞外で抗体として機能させ、疾患を治療および／または予防することができる。
　本発明の薬学的組成物の別態様としては、採取された細胞に本発明の融合タンパク質を発現させるように処置させた細胞であり、本発明の融合タンパク質を発現させた当該細胞を対象に投与することで、疾患を治療および／または予防することができる。前記態様において、採取された細胞は、投与対象となる個体から採取された同種同系の細胞（自家細胞）でもよく、投与対象とは異なる個体から採取された異種同系の細胞（他家細胞）でもよい。
　いずれの態様においても、本発明の融合タンパク質を細胞内で発現させる際に、特定の細胞小器官に局在するように局在用の移行シグナルを付加してもよい。
　「治療」の一側面には、対象となる疾患に関連する少なくとも１つの症状について、軽減若しくは緩和すること、進行を遅延すること、および治癒すること等が包含される。「予防」の一側面には、対象となる疾患に関連する少なくとも１つの症状について発症を防止すること等が包含される。
　治療および／または予防の対象となる生物としては、例えば、ヒトおよび非ヒト動物が挙げられ、より具体的には、魚類、鳥類および哺乳類等の脊椎動物が挙げられる。哺乳類としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌおよびネコ等の愛玩動物（ペット）；ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジおよびウマ等の家畜；またはヒトが挙げられる。
　治療または予防される疾患としては、例えば、がん、腫瘍、神経系疾患（中枢神経系疾患、抹消神経系疾患）、感染（ウイルス感染、細菌感染等）性疾患、自己免疫疾患またはアレルギー疾患、および炎症性疾患などが挙げられる。
　がんまたは腫瘍として、例えば、舌癌、歯肉癌、悪性リンパ腫、悪性黒色腫（メラノーマ）、上顎癌、鼻癌、鼻腔癌、喉頭癌、咽頭癌、神経膠腫、髄膜腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、甲状乳頭腺癌、甲状腺濾胞癌、甲状腺髄様癌、原発性肺癌、扁平上皮癌、腺癌、肺胞上皮癌、大細胞性未分化癌、小細胞性未分化癌、カルチノイド、睾丸腫瘍、前立腺癌、乳癌（例えば、乳頭腺癌、面疱癌、粘液癌、髄様癌、小葉癌、硬癌肉腫、転移腫瘍）、乳房ペーシジェット病、乳房肉腫、骨腫瘍、甲状腺癌、胃癌、肝癌、急性骨髄性白血病、急性前髄性白血病、急性骨髄性単球白血病、急性単球性白血病、急性リンパ性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫（例えば、リンパ肉腫、細網肉腫、ホジキン病など）、多発性骨髄腫、原発性マクログロブリン血症、小児性白血病、食道癌、胃癌、胃・大腸平滑筋肉腫、胃・腸悪性リンパ腫、膵・胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、原発性肝癌（例えば、肝細胞癌、胆管細胞癌など）、肝芽腫、子宮上皮内癌、子宮頸部扁平上皮癌、子宮腺癌、子宮腺扁平上皮癌、子宮体部腺類癌、子宮肉腫、子宮癌肉腫、子宮破壊性奇胎、子宮悪性絨毛上皮腫、子宮悪性黒色腫、卵巣癌、中胚葉性混合腫瘍、腎癌、腎盂移行上皮癌、尿管移行上皮癌、膀胱乳頭癌、膀胱移行上皮癌、尿道扁平上皮癌、尿道腺癌、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、滑液膜肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、ユーイング肉腫、皮膚扁平上皮癌、皮膚基底細胞癌、皮膚ボーエン病、皮膚ページェット病、皮膚悪性黒色腫、悪性中皮癌、転移性腺癌、転移性扁平上皮癌、転移性肉腫、中皮腫（例えば、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫など）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　中枢神経系疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、プリオン疾患、前頭側頭痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、脊髄延髄筋萎縮症（SBMAまたはケネディ病）、歯状赤核淡蒼球萎縮症（DRPLA）、脊髄小脳運動失調（例えば、SCA-1～SCA-7）、認知症、統合失調症、鬱病、躁鬱病、神経症、心身症、脳梗塞、多発性硬化症、進行性各上性麻痺、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、小脳変性症、脳代謝異常、脳循環異常、自律神経失調症、中枢神経系が関与する各種内分泌系の異常、睡眠障害、神経症状（悪心、嘔吐、口渇、食欲不振、めまいなど）、運動障害、学習障害などが挙げられるが、これらに限定されない。
　感染性疾患としては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（例、ＨＴＬＶ－Ｉ）、肝炎ウイルス（例、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型肝炎ウイルス）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、西ナイル熱ウイルス、ヒトパピローマウィルス、脳炎ウイルス、エボラウイルス等の病原性ウイルスに感染して起こる疾患、クラミジア、ミコバクテリア、レジオネラ等の病原性細菌に感染して起こる疾患、アスペルギルス、カンジダ等の病原性酵母に感染して起こる疾患、マラリア原虫、トリパノソーマ原虫等の病原性原虫に感染して起こる疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。
　投与経路・方法は特に限定されず、対象とする疾患に応じて適宜選択することができる。患部に直接投与してもよいし、間接的に投与してもよい。また、本発明の融合タンパク質を発現させた細胞を投与することでもよい。一例において、投与経路としては、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が挙げられ、局所投与、遺伝子銃を用いる方法等も挙げられる。
　用量および投与回数は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、疾患の具体的な種類等に応じて適宜選択することができる。
　〔研究ツールとしての用途〕
　（研究用試薬）
　本発明はまた、上述のポリヌクレオチドまたはベクターを含む研究用試薬を提供する。研究用試薬は、上述のポリヌクレオチドまたはベクター以外の他の成分をさらに含んでいてもよい。当該他の成分は、上述の（薬学的組成物）で説明したものを参照可能である。
　研究用試薬は、使用説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサー等に収容されてもよい。
　（研究ツールとしての利用方法）
　本発明の融合タンパク質は、細胞内における抗原（例えば、タンパク質またはポリペプチド等）の機能解析に用いることができる。一例において、機能解析の対象となる抗原に対する抗原結合性ペプチドを本発明の融合タンパク質として細胞内で発現させ、抗原の機能を制御する（好ましくは阻害する）ことにより、抗原の機能解析を行うことができる。
　対象となる細胞は、特に限定されない。対象となる細胞としては、例えば、ヒト細胞および非ヒト動物細胞が挙げられ、より具体的には、魚類細胞、鳥類細胞および哺乳類細胞等の脊椎動物細胞が挙げられる。哺乳類細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌおよびネコ等の愛玩動物（ペット）；ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジおよびウマ等の家畜；またはヒトの細胞が挙げられる。また、細胞は、培養細胞でもよいし、生体細胞（生体内にある単離されていない細胞）でもよい。細胞の好ましい一例は、ヒトの培養細胞、ヒトの生体細胞、非ヒト病態モデル動物の培養細胞、非ヒト病態モデル動物の生体細胞である。
　ウイルスベクターを標的細胞へ導入する場合は、細胞培養液中にウイルスベクターを懸濁する方法が挙げられる。非ウイルスベクター系のベクターを標的細胞へ導入する場合は、例えば、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法などの方法で行うことができる。
　抗原の機能を阻害した結果の指標としては、細胞、組織、または個体に現れる表現型の変化が挙げられ、これらの指標に基づき抗原の機能解析を行うことができる。細胞の変化の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的および／または質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化、アポトーシスの誘導等が挙げられる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、ｍＲＮＡ等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成および／または突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察により確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性が挙げられる。また、細胞内物質の変化としては、酵素活性、ｍＲＮＡ量、Ｃａ２＋またはｃＡＭＰ等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質量等を用いることができる。組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては、組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
　これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、吸光、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は、質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度はＢＥＡＣＯＮ（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはＢＩＡＣＯＲＥ、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などはＡＲＶＯなどにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で２種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、２種以上の測定を同時および／または連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。
　本発明の融合タンパク質は、細胞内における抗原（例えば、タンパク質またはポリペプチド等）の動態観察に用いることもできる。一例において、動態観察の対象となる抗原に対する抗原結合性ペプチドを本発明の融合タンパク質として細胞内で発現させ、抗原と融合タンパク質との反応を検出することにより、抗原の動態観察を行うことができる。抗原の動態観察には、抗原の発現、抗原の局在等を、ある時間において、または経時的に観察することが包含される。
　抗原と融合タンパク質との反応の検出は、例えば、融合タンパク質に含まれる検出用ペプチドによる蛍光、発光、発色等を利用して行うことができる。
　＜４．細胞内において抗原結合性ペプチドを発現させる方法＞
　本発明はまた、細胞内において抗原結合性ペプチドを発現させる方法を提供する。当該発現方法は、上述のポリヌクレオチド（すなわち、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を細胞内において発現させる工程を含む。
　発現は、恒常的なものであってもよく、一過性のものでもよい。また、誘導性のものであってもよい。恒常的に発現させる場合には、恒常的な発現を行うプロモーターが融合タンパク質の遺伝子上流に連結したポリヌクレオチドを用いればよい。一過性に発現させる場合には、例えばＤＮＡではなくＲＮＡを細胞に導入して発現させればよい。誘導により発現させる場合には、誘導性のプロモーターが融合タンパク質の遺伝子上流に連結したポリヌクレオチドを用いればよい。そして、抗原結合性ペプチドを発現させる際に、誘導因子（例えば、ＩＰＴＧ等）を細胞に取り込ませればよい。
　対象となる細胞としては、＜３．利用方法＞で列挙された細胞が挙げられる。
　本発明の発現方法では、抗原結合性ペプチドを、細胞内安定化ペプチドと融合した状態で（すなわち、融合タンパク質として）発現させる。本発明の融合タンパク質は、細胞内安定化ペプチドを含むことにより、等電点が、抗原結合性ペプチド単独で存在する場合よりも低下する。そのため、細胞内において、抗原結合性ペプチド単独で発現させた場合よりも凝集が抑制されて、安定的に細胞内抗体として機能し得る。
　一実施形態において、本発明の発現方法は、上述のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程をさらに含む。上述のポリヌクレオチドは、ベクターの形態で導入されてもよい。具体的な導入方法は、＜３．利用方法＞で記載された方法が挙げられる。それゆえ、本発明はさらに、細胞内において抗原結合性ペプチドを発現させる細胞を製造する方法を提供する。該製造方法は、上述のポリヌクレオチド（すなわち、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）または上述の発現ベクターを細胞に導入する工程を含む。また、本発明はさらに、本発明の融合タンパク質を発現する細胞も提供する。
　＜５．キット＞
　本発明はまた、上述の細胞内安定化ペプチドと抗原結合性ペプチドとを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを作製するためのキットであって、当該細胞内安定化ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、キットを提供する。
　本発明のキットは、所望の抗原結合性ペプチドについて、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを容易に作製することができる汎用的なキットであり得る。
　本発明の細胞内安定化ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上述のようなベクターに組み込まれていてもよい。また、当該ポリヌクレオチドは、タンパク質の発現に必要な因子（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーター等）、選択マーカー、または制限酵素認識部位等を含んでいてもよい。
　さらに、本発明のキットは、バッファー、制限酵素、その他必要な試薬、器具、および使用説明書等のうちの少なくとも１つをさらに含んでいてもよい。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
　〔実験動物〕
　理化学研究所の動物実験委員会のガイドラインに従って、すべての実験手順を行った。使用マウスを、１２時間毎の明暗サイクルに置き、暗サイクルは２０：００から８：００に起こるようにした。
　〔抗体〕
　この研究で用いた抗体を表Ｓ１に載せた。
　〔抗体反応性ファージの単離〕
　組換えファージ抗体システム（ＲＰＡＳ）（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｓｃＦｖ遺伝子を単離した。ｓｃＦｖ－Ａ３６のＤＮＡ配列は、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）にアクセッション番号ＡＢ４７２３７６で登録されている。
　〔発現ベクターの構築〕
　特定のプライマーを用いたＰＣＲを基にして構築した発現ベクターは、下記に記載した。
　〔組換えウイルスベクターの作製〕
　ＳｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６およびｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４をＡＡＶ１血清型を用いて作製した；ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡおよびｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡは、ＡＡＶ９血清型を用いて作製した。ＡＡＶベクタープラスミド、およびその作製の詳細は、下記に記載した。
　〔ＡＡＶベクターの定位注入〕
　オスの野生型Ｂ６マウス、もしくはオスのＤＡＴ－ｃｒｅ（＋／－）マウス（８週齢）に麻酔器（ＭＫ－Ａ１１０；Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）を用いてイソフルレン（Ｅｓｃａｉｎ；　Ｍｙｌａｎ）で麻酔をかけ、定位フレーム（Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ　Ｊｕｓｔ　ｆｏｒ　Ｍｏｕｓｅ，Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）に配置した。ＡＡＶベクターは、右半球の黒質に注入した（ブレグマに対するミリメートル単位で表された座標、ＡＰ；－３．０８，ＬＲ；－１．２５，ＤＶ；－４．５）。
　〔組換えｓｃＦｖ抗体の精製〕
　組換え抗体ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６をＥ．　ｃｏｌｉ系統ＢＬ２１で発現し、変性もしくは非変性の条件下で、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースクロマトグラフィーを用いて精製した。外来タンパク質の可溶な状態での発現を向上するため（Ｙａｓｕｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）を発現しているｐＴ－Ｔｒｘベクターによって共形質転換されたＥ．　ｃｏｌｉ系統ＢＬ２１から、非変性の条件下で、抗－Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体結合アフィニティービーズ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、組換え抗体ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを精製した。
　〔免疫蛍光染色〕
　免疫染色を標準的な手法で行った。免疫蛍光シグナルは、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８もしくはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４でラベルされた二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により視覚化した。蛍光ラベルされた試料は、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ　ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）もしくはＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）により画像表示した。
　〔ＥＬＩＳＡによる抗体のアフィニティーの計測〕
　ＧＳＴ－Ｓｙｔ　Ｉ－Ｃ２Ａの抗体結合アフィニティーを、下記に記載された通りにＥＬＩＳＡにより計測した。
　〔行動テスト〕
　以前に報告されたロータロッド試験（Ｓｈｉｏｔｓｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１０）を改変し、改変ロータロッド試験を実施した。本研究では、マウス用のロータロッド（ＭＫ－６１０Ａ，Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）に、滑り止めテープ（Ｎｉｔｏｆｌｏｎ粘着テープ，Ｎｏ．９０３ＵＬ，０．１３ｍｍ厚，Ｎｉｔｔｏ　ｄｅｎｋｏ）で覆われた大きなロッド（直径９ｃｍ）を装備した。
　〔ｓｃＦｖ－Ａ３６とアラインメントしたＳｃＦｖタンパク質〕
　ｓｃＦｖ－Ａ３６とアラインメントしたｓｃＦｖタンパク質のアクセッション番号およびアミノ酸残基を、表Ｓ２に載せた。
　〔実験動物〕
　Ｄａｔ＋／ＩＲＥＳ－ｃｒｅ　マウス（Ｂａｃｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，２００６）はＪａｃｋｓｏｎ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより購入した。ｓｃＦｖ遺伝子を発現しているＡＡＶウイルスベクターを、ＤＡＴ－Ｃｒｅマウス系統とともに、黒質のドーパミン神経において抗体遺伝子を選択的に発現させるために用いた。マイクロダイアリシスおよび行動テストで用いた、ウイルスベクターを有するすべてのマウスは、一対のヘテロ接合体から生まれたオスの同腹子であった。Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｌｉｖｅｒ　Ｊａｐａｎより購入したＢａｌｂ／ｃ、Ｂａｌｂ／ｃ－ｎｕおよび野生型のＣ５７Ｂ６／Ｊマウスは、抗体産生、もしくはレンチウイルスベクターおよびＡＡＶベクターを用いた実験、ならびに初代ドーパミン神経培養に使用した。
　〔抗体反応性ファージの単離〕
　ｓｃＦｖにおいて、上記抗体の軽鎖および重鎖の可変部は、ひとつの遺伝子にコードされたグリシンリンカーによって融合している。ＲＰＡＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、ｓｃＦｖの多様なレパートリーをＭ１３ファージの表面上で提示することが可能になる。ＧＳＴ－Ｓｙｔ　ＩＩ－Ｃ２Ａにより免疫性を与えられたマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）脾臓からトータルＲＮＡを単離した（Ｆｕｋｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４；　Ｆｕｋｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。上記軽鎖および重鎖の可変部（それぞれＶＨおよびＶＬ）を、縮重プライマー（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、２つの独立した反応により増幅した。結果得られたＰＣＲ産物を、フレキシブルな（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３の１５アミノ酸鎖をコードするリンカーと結合した。ＶＨ－グリシンリンカー－ＶＬ複合体（ｓｃＦｖ）を、ｐＣＡＮＴＡＢ　５Ｅベクター（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＳｆｉ　ＩおよびＮｏｔ　Ｉ部位にサブクローニングした。Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＴＧ－１細胞をｓｃＦｖ　ｃＤＮＡを含むプラスミドベクターおよびＭ１３－ＫＯ７ヘルパーファージの感染によって形質転換することにより、組換えファージ抗体を産生した。抗体反応性ファージの単離は、製造元の使用説明書に従ってバイオパニングすることにより行った。対数期ＴＧ－１細胞を抗体反応性ファージに感染させた。別個の抗体を提示するファージを、マイクロタイターウェルに結合した組換えＧＳＴ－Ｓｙｔ　ＩＩ－Ｃ２Ａを用いたＥＬＩＳＡにより、ファージライブラリーからスクリーニングした。抗体反応性ファージを、セイヨウワサビペルオシキダーゼ（ＨＲＰ）結合抗Ｍ１３抗体を用いて視覚化した。抗体反応性ｓｃＦｖクローン（ｓｃＦｖ－Ａ３６と名付けた）の配列決定は、自動ＤＮＡシークエンサーを用いて行った。
　〔発現ベクターの構築〕
　ｓｃＦｖ－Ａ３６のｃＤＮＡ配列に基づいて、２つのリンカープライマーをＰＣＲ増幅に合わせて設計し、それにより、コザック配列、Ｔ７ペプチド、およびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位をＡ３６の５’フランキング領域に導入し、ＭｕｎＩ部位、ヘキサヒスチジン残基、およびＮｏｔ　Ｉ部位をＡ３６の３’フランキング領域に導入した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　次いで、ＰＣＲ産物を、直接ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙクローニングベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に連結した（ｐＧＥＭ－ｓｃＦｖ－Ａ３６と命名した；図８のＡ）。高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）断片を、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、下記のプライマーを用いたＰＣＲによって得た（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　次いで、消化ＥＧＦＰ断片を、ｐＧＥＭ－ｓｃＦｖ－Ａ３６のＢａｍＨＩサイトに連結し、ｐＧＥＭ－ｓｃＦｖ－ＧＦＰ　Ａ３６ベクターを作製した。ｐＥＴ－ｓｃＦｖ－ＧＦＰ　Ａ３６を構築するために、ｐＧＥＭ－ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６のＢａｍＨＩ－ＮｏｔＩ消化断片を、変更したｐＥＴ３ａ（Ｍ．　Ｆｕｋｕｄａ，未発表データ）Ｅ．　ｃｏｌｉ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位に連結した。哺乳類細胞において、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによりドライブして、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６を一過性発現するために、ｐＧＥＭ－ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６のＮｏｔＩ断片を、ｐＩＲＥＳベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、ベクターｐＩＲＥＳ－ｓｃＦｖ－ＧＦＰ　Ａ３６を作成した。ｓｃＦｖ－Ａ３６変異体の構築のために、Ａ３６の重鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ３領域を含むＤＮＡ断片を、下記の２つの縮重プライマーを用いたＰＣＲにより増幅した（表３）。なお、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、もしくはＴである（等モル）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　次いで、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３変異体断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｔＥＩＩを用いて消化し、元のＡ３６のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｓｔ　ＥＩＩ部位に連結した。これらのＤＮＡ断片から、変異体ｓｃＦｖを提示するファージライブラリーを、上記の方法で産生した。ｓｃＦｖｓのアミノ酸配列のマルチプルアラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｖｅｒｓｉｏｎ．　２．１：　ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｌａｎｇ＝ｊａ）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）により行った。３×Ｆｌａｇタグ（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１））およびＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１４））融合ｓｃＦｖ構築物（ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－ＨＡ）を合成し、マウスにおける発現のためにコドン最適化した。哺乳類細胞における一過性発現のために、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－ＨＡ断片を、ｐＥＦ－ＢＯＳベクター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ　ａｎｄ　Ｎａｇａｔａ，１９９０）にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１細胞におけるｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－ＨＡタンパク質の発現および精製のために、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－ＨＡ断片を、ｐＥＴ３ａベクターにクローニングした。
　〔細胞培養およびトランスフェクション〕
　初代ドーパミン神経培養を、胚日１３～１４日のオスおよびメスのマウス胚の腹側中脳から準備した。簡潔に言えば、腹側中脳をトリプシン処理により解離し（０．２５％　２０分、３７℃）、ＤＮａｓｅ　Ｉを含む１０％ＦＢＳを添加したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で、火で仕上げたパスツールピペットで粉砕した。解離した細胞（６×１０４）を、２４ウェルプレート（Ｉｗａｋｉ）中で、ポリ－Ｌ－リシン（１μｇ／ｍＬ）コートカバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ，直径；１２ｍｍ）上にまき、それからＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地５００μＬ中で培養した。それぞれのウェル内の７日目のｉｎ　ｖｉｔｒｏの細胞（ＤＩＶ）を、ＡＡＶベクター（タイター：１×１０１１マイクロｇ／ｍＬ）５μＬで感染させ、ＧＦＰ－タグ付きｓｃＦｖタンパク質を発現させ、感染から７日後に、免疫細胞化学もしくはドーパミン放出アッセイを行った。理研バイオリソースセンターセルバンク（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）から入手した２９３ＴおよびＣＯＳ－７細胞を、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭで培養した。これらの細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を製造元の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って用いて、発現ベクターによりトランスフェクションし、トランスフェクションから１日後に、免疫化学的分析に用いた。
　〔組換えｓｃＦｖ抗体の精製〕
　Ｅ．　ｃｏｌｉ系統ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６の発現に用いた。ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６の発現を、１ｍＭのイロプロピル－１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により、３０℃で３時間誘導した。ＳｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６タンパク質を、バッファー（８Ｍ　尿素，０．１Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ８．０］）で可溶化し、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）で製造元の推奨に従って精製した。変性条件下で、４ｍＬのバッファー（８Ｍ　尿素，０．１Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ６．３］）でカラムを洗浄した。その後ＳｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６を、１ｍＬのバッファー（８Ｍ　尿素，０．１Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４，０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ　４．５］）でカラムから溶出した。溶出したｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６タンパク質を、バッファー（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ；ｐＨ７．２）で透析した。非変性条件下でｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６を精製するために、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６を発現している細胞を、プロテアーゼインヒビターカクテルを含むＰＢＳバッファーに再度懸濁し、氷上でソニケートし、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（１％）を加えて４℃で１時間可溶化した。遠心分離の後、上清をＮｉ－ＮＴＡ（ニッケル－ニトリロ三酢酸、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）クロマトグラフィーにかけた。発現させたｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６を、５ｍＭヒスチジンを含むバッファー（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ；ｐＨ７．２）を用いてカラムから溶出し、その後バッファー（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ；ｐＨ７．２，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）で透析した。
　ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを非変性条件下で精製するために、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを発現しているｐＥＴ３ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）を発現しているｐＴ－Ｔｒｘベクターで共形質転換し、外来タンパク質の可溶な状態での発現を向上させた（Ｙａｓｕｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）。対数期の形質転換された細胞を、１ｍＭ　ＩＰＴＧの添加で誘導した。誘導から３時間後に遠心分離によって細胞を回収した。プロテアーゼインヒビターカクテルを含むＰＢＳバッファーに細胞を再度懸濁した。懸濁された細胞を氷上でソニケートし、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（１％）を添加して４℃で１時間可溶化した。遠心分離し、０．４５μｍポアフィルターを用いて濾過した後、上清を抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体結合アフィニティービーズ（Ｓｉｇｍａ）を用いた精製クロマトグラフィーにかけた。発現させたｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを、製造元の推奨に従って精製した。ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを、３×Ｆｌａｇペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）を含むバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）を用いてカラムから溶出し、バッファー（２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ，ｐＨ７．２，５０ｍＭ　ＮａＣｌ）で透析した。
　〔ＥＬＩＳＡによる抗体アフィニティーの計測〕
　バッファー中の精製されたＧＳＴ－Ｓｙｔ　Ｉ－Ｃ２Ａ（０．２５ｐｍｏｌ）を、室温で１６時間９６ウェルプレートにコートした。それぞれのウェルを、５％スキムミルクを含むＰＢＳバッファーで２時間室温でブロッキングし、０．２２～３６ｎＭの精製されたｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡとともにインキュベートした。マウスの抗体Ｆｌａｇ（Ｍ２）一次抗体、およびＨＲＰ結合抗マウス二次抗体とともにインキュベートすることにより、結合を定量した。特異的な結合は、０．２５ｐｍｏｌのＧＳＴでコートしたウェルに対するｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡの結合を差し引くことにより計算した。ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡ結合データの非線形回帰は、ヒル－ラングミュアの式により行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 　上式で、ＢはＧＳＴ－Ｓｙｔ　Ｉ－Ｃ２Ａに結合したｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡの濃度を表し、Ｂｍａｘは全結合部位の濃度を表し、［ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡ］は遊離ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡ濃度を表し、Ｋｄは解離定数を表す。
　〔免疫蛍光染色〕
　免疫細胞化学および免疫組織化学は、下記の標準的な方法で実施した。細胞を４％　ＰＦＡで室温、２分間固定し、０．３％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳで室温、２分間透過処理した。細胞をすぐにブロッキング溶液（１％　ＢＳＡおよび０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳ）で３回洗浄し、ブロッキング溶液とともに室温で１時間インキュベートし、その後２時間室温で一次抗体とともにインキュベートした。免疫蛍光シグナルは、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８もしくはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４でラベルされた二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートすることにより視覚化した。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ色素と結合した一次抗体および二次抗体は、表Ｓ１に載せた。細胞内抗体により形成された凝集体を有する細胞の割合を定量する実験において、各実験で１つのディッシュ内の少なくとも１００個の細胞を、凝集体を有する細胞の割合を定量するために数えた。データは３回の独立した実験により得た。免疫組織化学において、マウスは４％パラホルムアルデヒドで固定した。マウス脳の低温切片（１６μｍ厚）を、０．３％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を含むＰＢＳ中で室温で２時間透過処理し、一次抗体を含むブロッキング溶液（１％　ＢＳＡ,０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）とともに４℃で１６時間インキュベートした。免疫蛍光シグナルを、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８もしくはＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４でラベルされた二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて視覚化した。蛍光ラベルした試料は、Ｆｌｕｏｖｉｅｗ　ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）もしくはＢＺ－９０００蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）のもとで画像化した。
　〔免疫ブロット分析〕
　Ｆｌａｇタグつき全長マウスＳｙｔ　Ｉ－ＸＩを、以前に記載されたように調製した（Ｆｕｋｕｄａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。ＣＯＳ－７細胞の中で一過性発現させたＦｌａｇタグつきＳｙｔ　Ｉ－ＸＩの全ホモジネートを、１０％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）にかけ、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写した。精製したｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６（１．６μｇ／ｍＬ）を一次抗体として用いた。ＨＲＰラベル抗Ｔ７モノクローナル抗体（１／５０００希釈，　Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を二次抗体として用いた。免疫反応性のあるバンドを、高感度ケミルミネセンス（ＥＣＬ）検出システム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて視覚化した。等量のＦｌａｇタグつきＳｙｔｓがロードされたことを保証するため、ブロットを抗Ｆｌａｇ抗体でリプローブした。精製したｓ３Ｆｌａｇ－Ａ３６－ＨＡが、脳でマウスＳｙｔ　Ｉ／ＩＩを認識したかを調べるために、マウス脳組織を単離し、ホモジナイゼーションバッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ，ｐＨ７．２，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．５％　ＴｒｉｎｔｏｎＸ－１００，コンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル；Ｒｏｃｈｅ）でホモジナイズし、４℃で１時間アジテートした。全ホモジネートの２．５μｇのタンパク質を、精製したｓ３Ｆｌａｇ－Ａ３６－ＨＡを一次抗体として用いてウエスタンブロットした。免疫反応性のあるバンドを、抗Ｆｌａｇ抗体（二次抗体）およびＨＲＰラベル抗マウス抗体を用いたＥＣＬにより視覚化した。ＡＡＶベクターを注入したマウス脳を用いた実験では、マウス脳組織を単離し、バッファー（ＰＢＳ，０．５％　ＮＰ４０，１ｍＭ　２ＭＥ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ，およびコンプリートプロテアーゼインヒビターカクテル）内でホモジナイズし、２７Ｇニードルシリンジでせん断し、４℃で１時間アジテートした。全ホモジネートを、抗ＴＨ、抗チューブリン、抗Ｓｙｔ　Ｉ抗体を一次抗体として用いてウエスタンブロットした。
　〔免疫沈降〕
　ＣＯＳ－７細胞を、ｐＩＲＥＳ－ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６もしくはｐＩＲＥＳ－ｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４、およびｐＥＦ－ＢＯＳ－Ｆｌａｇ－Ｓｙｔ　Ｉもしくはコントロールベクター（ｐＥＦ－ＢＯＳ）で共トランスフェクションした。プラスミドＤＮＡのトランスフェクションは、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により製造元の推奨に従って行った。トランスフェクションの２日後、細胞をばらばらにし、バッファー（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ［ｐＨ７．２］，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　β－メルカプトエタノール）中でホモジナイズした。ホモジネートを、１，２００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を溶解バッファー（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ［ｐＨ７．２］，０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　β－メルカプトエタノール）で４℃で１時間可溶化した。２０，４００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、上清を新しいチューブに移し、Ｆｌａｇ－Ｓｙｔ　ＩもしくはＩＩを、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）およびプロテインＡセファロース（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により免疫沈降した。溶解バッファーでビーズを洗浄した後、ビーズを１×ＳＤＳサンプルバッファー（６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］，２％　ＳＤＳ，２％　β－メルカプトエタノール，０．００１％　ブロモフェノールブルー［ＢＰＢ］，１０％　グリセロール）中で煮沸した。１３，０００×ｇで５分間遠心分離した後、上清をウエスタンブロット分析に用いた。共免疫沈降したｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６を、はじめにＨＲＰラベル抗Ｔ７抗体により検出した。Ｆｌａｇ－Ｓｙｔ　Ｉが沈降したことを保証するため、抗Ｓｙｔ　Ｉ抗体（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）によりブロットをリプローブした。Ｓｙｔ　Ｉと細胞内ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡとの相互作用を調べるため、２９３Ｔ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてｐＥＦ－ＢＯＳ－Ｓｙｔ　ＩおよびｐＥＦ－ＢＯＳ－ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡもしくはｐＥＦ－ＢＯＳ－ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡベクターにより共トランスフェクションした。トランスフェクションの２８時間後、細胞をばらばらにし、バッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ［ｐＨ７．４］，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，プロテアーゼインヒビター（ＥＧＴＡ－ｆｒｅｅ，Ｒｏｃｈｅ））中で１時間溶解し、その後、２７ゲージニードルシリンジでせん断した。ホモジネートを１，５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上清をＣａＣｌ２（５００μＭ）を含む新しいチューブに移し、抗ＨＡアガロース（Ｓｉｇｍａ）により免疫沈降した。５００μＭ　ＣａＣｌ２を含む溶解バッファーでビーズを洗浄した後、ビーズを１×ＳＤＳサンプルバッファー中で３分間煮沸した。１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清をウエスタンブロット分析に用いた。共免疫沈降したＳｙｔ　Ｉを、一次抗Ｓｙｔ　Ｉ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）抗体および二次ＨＲＰラベル抗マウスＩｇＧ軽鎖特異的抗体で検出した。ｓｃＦｖタンパク質の沈降を保証するために、抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）一次抗体（Ｓｉｇｍａ）および抗ＨＲＰラベル抗マウスＩｇＧ軽鎖特異的二次抗体でブロットをプローブした。
　〔ＡＡＶベクターの作製〕
　ＡＡＶ９／３ベクタープラスミドは、ヒトシナプシンＩプロモーター（ｈＳｙｎＩｐ）を含み、その後ろに、ｐＡＡＶ－ＤＩＯ－ｅＮｐＨＲ－ＹＦＰベクター（ａｄｄｇｅｎｅ：　＃２６９６６）に由来するダブルｌｏｘＰ配列（ｌｏｘＰ－ｌｏｘ２７２２）の間に目的の逆向きｃＤＮＡを含み、ラットのｔａｕ　３’－ＵＴＲ（Ｂｒｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，２００３）に由来するヌクレオチド２５１９－２７６０を含む２４１ｂｐ断片（ＦｒｇＨ）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびシミアンウイルス４０ポリアデニレーションシグナル配列（ＳＶ４０ｐＡ）を、ＡＡＶ３ゲノムの逆方向末端反復の間に含む。変異を有するＡＡＶ９　ｖｐ　ｃＤＮＡ（Ｔ４６６Ｆ）（Ｇａｏ　ｅｔ　ａｌ．，２００４）を、以前に記載された方法（Ｐｅｔｒｓ－Ｓｉｌｖａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１１）で合成した。組換えＡＡＶ９／３ベクターを、ベクタープラスミド、ＡＡＶ３　ｒｅｐおよびＡＡＶ９　ｖｐ発現プラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションにより、以前に記述された方法で作製し（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，２００６）、ベクターＡＡＶ９／３－ｈＳｙｎＩｐ－ＤＩＯ－ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６もしくは－Ｍ４－ＨＡを得た。組換えウイルスを２つの一連の連続的なＣｓＣｌ勾配からの単離により精製し、ウイルスタイターをｑＲＴ－ＰＣＲにより決定した。
　ＡＡＶ１ベクタープラスミドは、ｈＳｙｎＩｐを含み、その後ろに目的のｃＤＮＡ、ＦｒｇＨ、ＷＰＲＥ、およびＳＶ４０ｐＡをＡＡＶ１ゲノムの逆向き末端配列の間に含んでいた。組換えＡＡＶ１ベクターを上記のとおりに作製し、ベクターＡＡＶ１－ｈＳｙｎＩｐ－ｓｃＦｖＧＦＰＡ３６もしくはＭ４を得た。
　〔ＡＡＶベクターの定位注入〕
　オスの野生型マウスもしくはメスのＤＡＴ－ｃｒｅ（＋／－）マウス（８週齢）をイソフルレン（Ｅｓｃａｉｎ；Ｍｙｌａｎ）により麻酔した。注入部位の頭蓋骨は、ドリル（Ｍｏｄｅｌ　１４７４　Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ　ｄｒｉｌｌ，Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）でカットした。ＡＡＶベクターを右半球の黒質（ブレグマに対するミリメートル座標，　ＡＰ；－３．０８，ＬＲ；－１．２５，ＤＶ；－４．５）に、注入ポンプ（Ｌｅｇａｔｏ　１３０，Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）により制御される３３ゲージニードルおよび５μＬシリンジ（Ｍｏｄｅｌ　７５　ＲＮ　ＳＹＲ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いて、分速０．２μＬで２μＬ注入した。ニードルは、注入後、１０分間その位置に放置した。注入の少なくとも３３日後のマウスを、マイクロダイアリシス、行動テスト、もしくは免疫化学分析に用いた。
　〔初代培養ドーパミン神経を用いたドーパミン放出の測定〕
　ＡＡＶベクターの注入７日後の初代ドーパミン神経を、５００μＬの予熱したＰＳＳ－ＬＫバッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ，ｐＨ７．４，１４０ｍＭ　ＮａＣｌ，４．７ｍＭ　ＫＣｌ，２．５ｍＭ　ＣａＣｌ２，１．２　ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１．２ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，１１ｍＭ　グルコース）で２回洗浄し、細胞を２００μＬのＰＳＳ－ＬＫバッファー中で、３７℃で５分間インキュベートした。ＰＳＳ－ＬＫバッファーを回収した後、細胞を２００μＬのＰＳＳ－ＨＫバッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ，ｐＨ７．４，８５ｍＭ　ＮａＣｌ，６０ｍＭ　ＫＣｌ，２．５ｍＭ　ＣａＣｌ２，１．２ｍＭ　ＭｇＳＯ４，１．２ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４，１１ｍＭ　グルコース）で３７℃、５分間刺激した。回収された上清を、すぐに５０μＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａを含む１０μＬの０．１Ｍ過塩素酸（ＰＣＡ）と混合し、３０秒ソニケートし、その後２０，０００Ｇ、０℃で１５分間遠心分離した。上清（１９０μＬ）を新しいチューブに移し、ｐＨを３．０あたりに調整するために１．７μＬの５Ｍ　ＣＨ３ＣＯＯＮａと混ぜた。ＰＳＳ－ＨＫバッファーを回収した後、細胞を２．５μＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａを含む２００μＬの５　ｍＭ　ＰＣＡに溶解した。サンプル（２００μＬ）をソニケートし、２．４μＬの５Ｍ　ＣＨ３ＣＯＯＮａと混合した。すべてのサンプルを、０．４５μｍポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）マイクロポアフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、濾過物を、電気化学検出システム（ＥＣＤ３００，Ｅｉｃｏｍ）と連結した高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で、以前の報告（Ｋａｂａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１３）に従って分析した。高濃度ＫＣｌにさらされた初代培養ドーパミン神経から放出されたドーパミンの量を、細胞に含まれた全ドーパミンの割合で表す。
　〔自由行動マウスのｉｎ　ｖｉｖｏマイクロダイアリシス〕
　マウスをイソフルレン（Ｅｓｃａｉｎ；Ｍｙｌａｎ）で小動物麻酔器（ＭＫ－Ａ１１０；Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）を用いて麻酔し、定位フレーム（Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ　Ｊｕｓｔ　ｆｏｒ　Ｍｏｕｓｅ，Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）に配置した。スチールガイドカニューレ（ＡＧ－４；Ｅｉｃｏｍ）の移植のために、右半球の線条体上（ブレグマに対する座標，ＡＰ；＋０．６　ｍｍ，ＬＲ；－２．０ｍｍ，ＤＶ；－２．０ｍｍ）に穴をあけ、固定するためのネジをしっかりと固定するためにもう一つの穴を設けた。ガイドカニューレおよび固定するためのネジを、歯科用セメント（Ｕｎｉｆａｓｔ３；ＧＣ）によって固定した。歯科用セメントが完全に乾いた後、マイクロダイアリシスプローブ（Ａ－Ｉ－４－０２；Ｅｉｃｏｍ）をガイドに沿って線条体に挿入した。マイクロダイアリシスプローブの移植は、マウスの麻酔の開始後、３．５時間から４．５時間の間に終了した。マイクロダイアリシスプローブを挿入したマウスを、水と飼料を備えた透明のマイクロダイアリシスケージ（２０ｃｍ長さ×２０ｃｍ幅×２１ｃｍ高さ）内のペーパータオル（キムタオル，Ｎｉｐｐｏｎ　Ｐａｐｅｒ　Ｃｒｅｃｉａ）の上に配置した。移植手術の次の日、マウスを、水と飼料を備えていない透明のマイクロダイアリシスケージ内の新しいペーパータオル（Ｃｏｍｆｏｒｔ２００，Ｎｉｐｐｏｎ　Ｐａｐｅｒ　Ｃｒｅｃｉａ）上に配置した。基底ドーパミン放出を測定するため、透析液の回収を、プローブ移植手術の次の日の１０：００から１１：００の間に行った。マイクロダイアリシスプローブは、１４７ｍＭ　ＮａＣｌ、４．０２ｍＭ　ＫＣｌ、２．２５ｍＭ　ＣａＣｌ２を含むリンガー溶液によって、シリンジポンプ（ＥＳＰ－３２，Ｅｉｃｏｍ）を用いて分速１μＬで連続的に潅流された。透析液は、冷蔵したフラクションコレクター（Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ　ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ　８２０，Ｕｎｉｖｅｎｔｏｒ）を用いて４℃で１０分の間隔で自動的に、事前に５μＬの０．１Ｍ　ＣＨ３ＣＯＯＨ／２５０μＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａをいれたプラスチックのマイクロチューブに回収した。透析液の回収は、マイクロダイアリシスプローブの移植後１６．５時間から１７．５時間後に行った。すべての透析液サンプルを４℃で保存し、次の日ＨＰＬＣで分析した。
　〔脳切片の生体組織検査〕
　脳を骨頭切除の直後に回収し、５０μｍ厚の凍結王冠切片を調製した。１２ピースの黒質切片、および８ピースの線条体切片（４ピースの前部切片が以下の座標から得られた，ＡＰ；＋０．６ｍｍ，および４ピースの後部切片が以下の座標から得られた，ＡＰ；＋０．６ｍｍ）から、直径１．５ｍｍのディスポーザブルバイオプシーニードル（Ｂｉｏｐｓｙ　Ｐｕｎｃｈ；Ｋａｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、円形の組織パンチを回収した。サンプルを０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ過塩素酸内でホモジナイズし、２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清を０．２２μｍポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）フィルター（ＧＶ　Ｄｕｒａｐｏｒｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過し、濾過したサンプルをＨＰＬＣにより分析した。
　〔ＨＰＬＣ〕
　初代培養神経に由来するサンプルおよび脳切片のバイオプシーを、ＨＰＬＣ（ＥＣＤ３００，Ｅｉｃｏｍ）により、以前に報告されたプロトコル（Ｋａｂａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．，２０１３）に従って分析した。マイクロダイアリシスサンプルを、製造元の文書に従ってＨＰＬＣ（ＥＣＤ５００，Ｅｉｃｏｍ）により分析した。
　〔行動テスト〕
　ロッド（直径３ｃｍ）を用いたロータロッド試験が、一般的にマウスの運動技能学習のために用いられてきた。以前の研究におけるマウスの改変ロータロッド試験では、大きなドラムおよび遅い回転（直径９ｃｍおよび１０ｒｐｍ）を組み合わせたロータロッド試験において、急勾配の学習曲線が得られることが実証された（Ｓｈｉｏｔｓｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１０）。本研究では、マウス用ロータロッド（ＭＫ－６１０Ａ，Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ）に、滑り止めテープ（Ｎｉｔｏｆｌｏｎ粘着テープ，Ｎｏ．９０３ＵＬ，０．１３ｍｍ厚，Ｎｉｔｔｏ　ｄｅｎｋｏ）で覆われた大きなロッド（直径９ｃｍ）を装備した。訓練セッションの前に、１日目にマウスを定位ドラムの上に３分間留まらせることにより馴化を行った。馴化は、毎日１分間、セッションの直前に繰り返した。回転は、遅い速度（５ｒｐｍ，表面速度２．８ｍ／ｍｉｎ）に設定した。マウスは、落下後すぐに、一回のセッションにつき５回までドラムの上に戻した。テストは、１日１セッションで５日間繰り返した。落下による待ち時間を手動で記録し、訓練の（Ｄａｙ１）の前、および（Ｄａｙ５）の後のロッド上での合計の待ち時間を、二元反復測定ＡＮＯＶＡで分析した。
　〔タンパク質配列分析〕
　等電点および細胞内ｐＨ（７．４，７．０３，６．６０）における正味の電荷を、ペプチドタグを含むそれぞれの細胞内抗体のアミノ酸配列から、Ｃｈｒｉｓ　Ｐｕｔｎａｍ　ａｎｔ　ｔｈｅ　Ｓｃｒｉｐｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｃａｌｃ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）により開発されたＰｒｏｔｅｉｎ　ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ　ｖ３．４を用いて計算した。
　〔統計分析〕
　すべてのデータは、少なくとも３回の独立した実験の代表値である。結果は、平均±標準誤差で表している。データはＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　４．０　ｐｒｏｇｒａｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、両側独立ｔ－検定、両側非反復ＡＮＯＶＡの後にニューマン・コイルス事後多重比較検定を行って、もしくは二元反復測定ＡＮＯＶＡの後にボンフェローニ事後多重比較検定を行って分析した。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であるとみなした。
＜実施例１：Ｓｙｔ　Ｉ／ＩＩのＣ２Ａドメインに対する抗体特異的結合の単離＞
　まず、ファージディスプレイシステムを用いて、Ｓｙｔ　Ｉ／ＩＩのＣ２Ａドメイン（Ｓｙｔ　Ｉ／ＩＩ－Ｃ２Ａ）に対する特異的抗体をコードするＳｃＦｖ遺伝子を単離した。単離されたＳｃＦｖを提示するファージの特異性を調べるために、Ｓｙｔ　Ｉ／ＩＩのＣ２Ｂドメイン（Ｓｙｔ　Ｉ／ＩＩ－Ｃ２Ｂ）をネガティブコントロールとして用いた。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、単離されたＳｃＦｖ提示ファージのうちの一つ（ｓｃＦｖ－Ａ３６と呼ぶ）がグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）－Ｓｙｔ　ＩＩ－Ｃ２Ａに結合し、ＧＳＴ－Ｓｙｔ　ＩＩ－Ｃ２ＢもしくはＧＳＴには結合しなかった（図１のＡ）。ｃＤＮＡ配列から、重鎖および軽鎖が互いにグリシンリンカーで融合された、７２３ヌクレオチドを含むオープンリーディングフレーム（３６１アミノ酸；アクセッションｎｏ．ＡＢ４７２３７６）が明らかになった（図１のＢ、上パネル）。発現したｓｃＦｖ－Ａ３６を視覚化および精製するために、Ｔ７、ＥＧＦＰ、およびＨｉｓタグを、Ａ３６のアミノ末端、もしくはカルボキシ末端に融合した（ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６と呼ぶ；図１のＢ、下パネル）。ＳｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６をＥ．　ｃｏｌｉで発現し、Ｎｉ－ＮＴＡカラムに通して精製した。ウエスタンブロット分析により、精製されたＳｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６タンパク質が全長Ｓｙｔ　Ｉ／ＩＩのみを認識し、ＣＯＳ－７細胞において外来的に発現させた他の９つのアイソフォームは認識しないことが確認された（図１のＣ）。これらの結果から、ｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６がＳｙｔ　Ｉ／ＩＩ－Ｃ２Ａドメインに対する特異的抗体であることが示された。ｓｃＦｖ－Ａ３６の軽鎖の可変領域の３つのＣＤＲのアミノ酸配列は、ＣＲＡ５をコードしているｓｃＦｖのそれらと同一であり、ＣＲＡ５は免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）受容体（アクセッションｎｏ．ＢＡＢ８２４５８、データは示されていない）に対する抗体であったことから、ｓｃＦｖ－Ａ３６の軽鎖のＣＤＲがＳｙｔ　Ｉ／ＩＩとの結合特異性の決定において重要な役割を持たないことが示唆された。一方、重鎖ＣＤＲ３は抗体中で最も超可変な領域であり、ヒトにおいて約１０１４の多様性を生み出す可能性を有し（Ｓａｎｚ，１９９１）、それにより抗体の相互作用に貢献している（Ｃｈｏｔｈｉａ　ａｎｄ　Ｌｅｓｋ，１９８７）ことが知られている。実際、ｓｃＦｖ－Ａ３６の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ＤＮＡデータベースに蓄積されている他の４つのｓｃＦｖの重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図２）との間に大きな多様性があることが見出され、ｓｃＦｖ－Ａ３６の重鎖ＣＤＲ３が結合特異性に重要であることが示唆された。次に、ＰＣＲを用いた突然変異誘発により、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６からネガティブコントロールの抗体の構築を試みた。Ａ３６の重鎖ＣＤＲ１（８アミノ酸）およびＣＤＲ３（８アミノ酸）の計１６アミノ酸が縮重プライマーにより変異した。ＥＬＩＳＡにおいて、単離された変異型ＳｃＦｖファージクローン（ｓｃＦｖ－Ｍ４と呼ぶ）がＧＳＴ－Ｓｙｔ　ＩＩ－Ｃ２Ａタンパク質に結合しなかったことを確認し（図１のＤ）、ｓｃＦｖ－Ｍ４のＣＤＲ１およびＣＤＲ３のヌクレオチド配列を決定した（図２）。以上より、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６のさらなる機能分析においてＭ４遺伝子をネガティブコントロール（ｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４と呼ぶ）として用いることにした。次に、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６を哺乳類細胞の細胞内で発現することができるか、また細胞内抗体と結合することができるのかを調べた。ＳｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６は、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６とＦｌａｇ－Ｓｙｔ　Ｉの両方がＣＯＳ－７細胞内で共発現されたときのみ、抗Ｆｌａｇ抗体とともに共免疫沈降したが、ｓｃＦｖ－Ｍ４は抗Ｆｌａｇ抗体とともに共免疫沈降しなかったことから（図１のＥ）、細胞内で発現したｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６が、発現したＳｙｔ　Ｉと結合できることが示された。
＜実施例２：インビトロおよびインビボにおける細胞内ｓｃＦｖ－Ａ３６の特徴付け＞
　Ｓｙｔ　Ｉ／ＩＩが、脳における神経伝達物質の速い放出に対する主要なＣａ２＋センサーとして働くことから、次にドーパミン放出におけるｓｃＦｖ－Ａ３６の阻害効果を調べた。ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６およびｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４を発現するためにＡＡＶベクターを構築した（それぞれ、ＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６およびＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４と呼ぶ）。マウス胚の黒質から調製したＤＩＶ７における初代培養ドーパミン神経に、ＡＡＶベクターを感染させた。ＡＡＶによる感染から７日後に細胞を固定し、分析した。ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６およびｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４の両方が、神経の細胞内において凝集なしに広がって発現した（図３，Ａ～Ｃ；ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６，Ｄ～Ｆ；ｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４）。ＳｃＦｖ発現はまた、ウエスタンブロット分析により確認した（図３のＧ，上；ＧＦＰ，中；Ｓｙｔ　Ｉ，下；アクチン）。次に脱分極により誘導されたドーパミン放出を比較した。初代培養細胞において、脱分極により誘導されたドーパミン放出は、細胞外Ｃａ２＋に依存していた（図３のＨ、右列）。このＣａ２＋依存性は、以前の報告（Ｒｏｕｇｅ－Ｐｏｎｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）と矛盾しなかった。ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６を発現している細胞において、脱分極により誘導されたドーパミン放出は、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４を発現している細胞、もしくは感染されていないコントロール細胞に比べて、有意に減少した（図３のＨ）。これらの結果から、細胞内抗体が初代培養神経の細胞内で発現することができ、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６がＳｙｔ　Ｉ／ＩＩのＣ２Ａドメインの機能を阻害することが示された。次に、これらの細胞内抗体が、マウス脳神経の細胞内において安定に発現されているのかを調べた。成体マウス（Ｐ５６）の黒質に対し、片側だけにＡＡＶ－ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６（１．６×１０８　ｖｇ／ｍｏｕｓｅ）を注入した。注入の４週間後、ほとんどすべてのドーパミン神経において、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６の細胞内での発現が観察された。しかしながら、黒質緻密部（ＳＮｃ）のいくつかの神経において、激しい凝集が観察された（図４のＡ～Ｃ，矢印）。これらの蛍光シグナルは、ＡＡＶを注入しなかった左半球のＳＮｃでは観察されなかった（図４のＤ～Ｆ）。これらの結果から、インビトロでの培養細胞の細胞内において安定に発現する細胞内抗体が、インビボで常に安定に発現するわけではないことが示された。
＜実施例３：強い負電荷を有する３ｘＦｌａｇペプチドタグ、および中程度の負電荷を有するＨＡペプチドタグの付加による細胞内抗体の安定性の向上＞
　細胞質内ｐＨ７．４における細胞内抗体の正味の負電荷と、哺乳類細胞の細胞質内の細胞内抗体の安定性との間には正の相関がある（Ｋｖａｍ　ｅｔ　ａｌ．，２０１０）。例えば、ｐＨ７．４において高い正味の負電荷（－５．０）を有するＶＨＨ－Ｈ７細胞内抗体が、哺乳類の細胞質内であまり凝集することなく、うまく発現する（Ｋｖａｍ　ｅｔ　ａｌ．，２０１０）。これは、ｐＨ７．４における正味の負電荷値が－5.0よりも小さいと、細胞内抗体の細胞内における安定な発現を予測できることを示唆している。事実、ｐＨ７．４において同じ正味の負電荷（－５．０）を有するｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６およびｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４は、初代培養ドーパミン神経の細胞内において７日間安定に発現された（図３）。しかしながら、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６およびｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４は、マウス脳のドーパミン神経において細胞内凝集物を形成する（図４）。これらの状況より、インビボにおける安定な細胞内抗体を設計するためにインシリコ解析を行った。海馬神経の非興奮時の細胞内ｐＨは～７．０３－７．３５であることが報告されており（Ｒｕｆｆｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，２０１４）、エンドソームを標的としたｐＨ感受性蛍光タンパク質ｐＨｌｕｏｒｉｎを用いた以前の研究から、エンドソームの局所的な細胞質側表面ｐＨが６．７３±０．０８であることが明らかになっている（Ｍｉｔｓｕｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１１）。そこで、細胞質内ｐＨ６．６０、７．０３、および７．４０それぞれにおけるｓｃＦｖ－Ａ３６およびｓｃＦｖ－Ｍ４のｐＩおよび正味の電荷を、他のペプチドタグと比較した（図５のＡ）。ｓｃＦｖ－Ａ３６もしくはｓｃＦｖ－Ｍ４へのＴ７タグ、ＥＧＦＰタグ、およびＨｉｓタグの融合により、ｐＨ７．４における正味の負電荷が増加した。しかしながら、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６およびｓｃＦｖＧＦＰＭ４正味の負電荷は、より低いｐＨ７．０３およびｐＨ６．６において劇的に減少した。これは、細胞質内ｐＨ７．０３および６．６において、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６およびｓＦｖ－ＧＦＰＭ４の安定性が減少することを示唆していた。細胞内抗体の正味の電荷をより低いｐＨにおいても向上させるため、２つの短いペプチドタグ、３×Ｆｌａｇタグ（ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１）；ｓ３Ｆｌａｇと呼ぶ）およびＨＡタグを検証した。これらのタグ自身はそれぞれ強い正味の負電荷（ｓ３Ｆｌａｇ；－７．０）および中程度の正味の負電荷（ＨＡ；－２．２）を有する。ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏの解析の結果、ｓｃＦｖ－Ａ３６／Ｍ４タンパク質へのｓ３ＦｌａｇタグおよびＨＡタグの融合（ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－ＨＡと呼ぶ）により、その正味の負電荷が、ｐＨ６．６においても劇的に増加することが実証された（図５のＡ）。次に、ｓｃＦｖ－Ａ３６タンパク質配列を用いたＮＣＢＩ　ｂｌａｓｔ検索により得られた他の９４種類のｓｃＦｖタンパク質配列（表Ｓ２）を用いて、ｓ３ＦｌａｇおよびＨＡペプチドタグの付加による低ｐＨ環境下での細胞内抗体の正味の負電荷の増加効果の一般性について調べた（図６）。異なるペプチドタグと融合した９４種類のｓｃＦｖタンパク質のｐＨ７．４（図６のＡ，上パネル）、およびｐＨ６．６（図６のＡ，下パネル）における正味の電荷を比較した。Ｔ７タグ、ＥＧＦＰタグ、およびＨｉｓタグと融合したｓｃＦｖタンパク質の正味の負電荷の平均は、ペプチドタグを持たないｓｃＦｖタンパク質と比較して、ｐＨ７．４において統計学的に増加した（上パネル）が、ｐＨ６．６においては増加しなかった（下パネル）。反対に、ｐＨ７．４とｐＨ６．６の両方において、ｓ３ＦｌａｇおよびＨＡタグと融合したｓｃＦｖタンパク質の正味の負電荷の平均は、他のペプチドタグを付加した、もしくはペプチドタグを付加しなかったｓｃＦｖタンパク質の正味の負電荷の平均と比較して統計学的に増加した。タンパク質は、そのｐＩより低いｐＨ下で正の正味の電荷を持ち、そのｐＩより高いｐＨ下で負の正味の電荷を有する。ｓ３ＦｌａｇタグおよびＨＡタグと融合したｓｃＦｖタンパク質の推定されたｐＩの平均は、Ｔ７タグ、ＥＧＦＰタグ、およびＨｉｓタグと融合したｓｃＦｖタンパク質、もしくはタグを付加しなかったｓｃＦｖタンパク質の推定されたｐＩの平均と比べて有意に低かった（図５のＡ，図６のＢ）。これらのことから、ｓ３ＦｌａｇタグおよびＨＡタグの付加によるｐＨ６．６でのｓｃＦｖタンパク質の正味の負電荷を増加効果は、ｓｃＦｖタンパク質のｐＩを減少させることによりもたらされたことが示唆された。また、ｓｃＦｖタンパク質のｓｃＦｖ－Ａ３６とのアミノ酸同一性と、ｓ３ＦｌａｇタグおよびＨＡタグと融合したｓｃＦｖタンパク質のｐＨ７．４における正味の電荷との間の相関を調べたところ（図６のＣ）、それらの間に統計学的相関がないことが明らかになった。このことは、ｓｃＦｖタンパク質のｓｃＦｖ－Ａ３６に対する構造的な同一性そのものは、ｓ３ＦｌａｇタグおよびＨＡタグとの融合による他のｓｃＦｖタンパク質の正味の負電荷を増加する効果に影響しないことを示している。以上より、これらの結果は、ｓｃＦｖタンパク質にｓ３ＦｌａｇペプチドタグもしくはＨＡペプチドタグを融合することで、これらのタグの強い負電荷により、およびｓｃＦｖタンパク質のｐＩが低下することにより、細胞質内ｐＨ６．６～７．４におけるｓｃＦｖタンパク質の正味の負電荷が一般的に増加することを示している。
　次に、これらのペプチドタグと融合したｓｃＦｖ－Ａ３６およびｓｃＦｖ－Ｍ４細胞内抗体の、哺乳類細胞内における安定性を調べた。免疫細胞化学分析により、ＨｅＬａ細胞の細胞内において、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡおよびｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡが殆ど凝集せず広がって発現し（図５のＢ，下パネル）、一方で細胞内ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６およびｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４はＨｅＬａ細胞の細胞内において凝集体を形成することが明らかになった（図５のＢ，上パネル）。ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡもしくはｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡを発現している凝集体を有する細胞の平均は、ｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６もしくはｓｃＦｖ－ＧＦＰＭ４を発現している凝集体を有する細胞の平均と比べて有意に減少した（図５のＣ）。これらの結果は、ｓ３ＦｌａｇタグおよびＨＡタグが、培養細胞の細胞内において細胞内抗体の安定性を改善することを示す。
＜実施例４：ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡはＳｙｔ　Ｉ－Ｃ２Ａドメインと相互作用し、Ｓｙｔ　ＩとＳｙｎｔａｘｉｎ１－ＳＮＡＲＥドメインとの間のＣａ２＋依存的な相互作用を抑制する＞
　次に、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖＡ－３６－ＨＡ構築物の生化学的な性質を調べた。精製されたｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡのＧＳＴ－Ｓｙｔ　Ｉ－Ｃ２Ａとの結合アフィニティーを計測した。ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを、抗Ｆｌａｇ抗体結合アフィニティービーズを用いてＥ．ｃｏｌｉから精製した。ＥＬＩＳＡ実験により、精製されたｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡはＳｙｔ　Ｉ－Ｃ２Ａと相互作用するが、Ｓｙｔ　Ｉ－Ｃ２Ｂとは相互作用しないことが明らかになった（図７のＡ）。このｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡの特異性は、図１に示されたｓｃＦｖ－ＧＦＰＡ３６の結果と矛盾しなかった。異なる濃度のｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを用いたＥＬＩＳＡ実験により、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡのＳｙｔＩ－Ｃ２Ａに対するＫｄ値が、約１１．９７ｎＭであることが明らかになった（図７のＢ）。加えて、ウエスタンブロット分析により、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡがマウス脳のＳｙｔ　Ｉ／ＩＩを特異的に認識することが明らかになった（図７のＣ）。これらの結果は、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡが高いアフィニティーを有する高度に特異的な細胞内抗体であることを示している。次に、細胞内ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡが細胞内においてＳｙｔ　Ｉと結合できるかを２９３Ｔ細胞を用いて調べた。Ｓｙｔ　Ｉはｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡと共免疫沈降したが、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡとは共免疫沈降しなかった（図７のＤ）。このことは、哺乳類細胞の細胞内において、細胞内ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡがＳｙｔ　Ｉと結合できることを示す。これらのことから、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡがその相互作用を阻害する可能性が考えられた。このことを調べるため、図７のＤで示された細胞溶解物を用いてＧＳＴプルダウンアッセイを行った。精製されたＧＳＴ－ｓｙｎｔａｘｉｎ１－ＳＮＡＲＥを用いて５００μＭ　Ｃａ２＋の存在下で沈降を行い、沈降物をウエスタンブロットにより分析した。ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを発現している細胞内におけるＳｙｔ　ＩおよびＧＳＴ－ｓｙｎｔａｘｉｎ１－ＳＮＡＲＥの共沈降は、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡを発現している細胞と比較して約４６．５％減少した（図７のＥ，Ｆ）。このことは、細胞内ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡが、Ｓｙｔ　ＩのＣ２Ａドメインとの相互作用によって、細胞内におけるＳｙｔ　ＩとＳｙｎｔａｘｉｎ　Ｉとの間の相互作用に干渉することを示す。
＜実施例５：インビボにおけるｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－ＨＡの安定した細胞内発現＞
　次に、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－ＨＡが、マウス脳の神経の細胞内において安定に発現するかを調べた。ＡＡＶ９／３－ｈＳｙｎＩｐ－ＤＩＯ－ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６（もしくはＭ４）－ＨＡを、ＤＡＴ－ｃｒｅマウスの右半球の黒質に注入した。免疫組織化学的解析により、ＡＡＶ９／３ベクターの注入から３３日後、右半球のＳＮｃおよびＶＴＡのドーパミン神経の細胞内において、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡおよびｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡが、安定に発現することが明らかになった（図８のＡ～Ｌ，矢印）。これらの発現パターンは、黒質領域のほとんどすべての広範囲（～７６８μｍ）において観察された（図９のＡ～Ｊ）。また、ウエスタンブロット分析を用いて、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡおよびｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡの両方のＳＮにおける発現を確認した（図９のＫ，上パネル）。線条体ニューロンが中脳ドーパミン神経から長い求心的な入力を受け取る線条体では、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡの発現レベルは、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡの発現レベルより高かった（図９のＫ，上パネル）。このことは、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡが内生的なＳｙｔ　Ｉと結合し、線条体においてＳｙｔ　Ｉとともに細胞体から軸索末端に向かって輸送されることを示唆している。加えて、ＡＡＶ９／３注入の６か月後に、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡおよびｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡ両方が、ドーパミン神経を傷つけることなく安定して発現することが観察された（図１０）。ＳＮのドーパミン神経において、ｉｎ　ｖｉｖｏでｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡがＳｙｔ　Ｉに対し機能活性を有することを確認するため、ＡＡＶ９／３注入から３３日後の覚醒時のマウスの線条体における基底ドーパミン放出を、マイクロダイアリシスにより測定した。線条体におけるドーパミン放出は、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを発現しているマウス、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡを発現しているマウス、およびＡＡＶを注入していないマウスの３つのグループで比較した。ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを発現しているマウスの線条体からのドーパミン放出は、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡを発現しているマウスと比べて５５．３％、およびＡＡＶ９／３を注入されていないマウスに比べて５２．７％と、有意に減少することがわかった（図１１のＢ、Ｃ）。しかしながら、線条体および黒質におけるドーパミンの総量は、すべての３つのグループの間で統計学的に変わらなかった（図１１のＤ）。以上より、これらの結果は、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡが神経活性とドーパミン神経の軸索末端からの細胞外Ｃａ２＋とに依存的なドーパミン放出を阻害することを示された。
＜実施例６：ドーパミン神経におけるｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡの細胞内発現による　運動学習の阻害＞
　パーキンソン病（ＰＤ）は、神経変性疾患であり、震え、硬直、動きの遅さ、および姿勢の不安定を含む運動欠損を伴う。患者の最も特徴的な点は、主にＳＮｃにおけるドーパミン神経の喪失および線条体におけるドーパミン濃度の減少である。そこで、線条体のドーパミン放出の運動行動における直接的な役割を調べるために、オープンフィールドテストおよび改変ロータロッド試験を行った。ＡＡＶ９／３－ｈＳｙｎＩｐ－ＤＩＯ－ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６（もしくはＭ４）－ＨＡをＤＡＴ－ｃｒｅマウスの黒質の両側に注入した。ＡＡＶ注入の４週間後、マウスをオープンフィールドテストに用い、５または６日後に、改変ロータロッド試験に用いた。ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを発現しているマウスとｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡを発現しているマウスとの間で、合計の移動距離、動きの速さ、ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　ｔｉｍｅ、および立ち上がりの合計数に違いはなかった（図１２のＡ～Ｄ）。次に、以前に報告されたロータロッド試験（Ｓｈｉｏｔｓｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１０）を改変し、運動学習を調べた（実験手順の欄を参照）。訓練の５日後、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡを発現しているマウスは、ｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡを発現しているマウスに比べて、ロッドの上に長くとどまった（図１２のＥ，Ｐ＝０．０１３２）。運動行動テストの後、免疫組織化学によりマウス脳を分析した。黒質のＤＡ神経における３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｍ４－ＨＡおよびｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ａ３６－ＨＡタンパク質の両側における発現を確認することができた（図１２のＦ，矢印）。
＜実施例７：抗腫瘍活性の評価＞
　次に、抗Ｋｒａｓモノクローナル抗体（Ｙ１３－２５９；配列番号２２）について、前述の実施例と同様にｓ３ＦｌａｇおよびＨＡを融合させたｓ３Ｆｌａｇ－ｓｃＦｖ－Ｙ１３－２５９－ＨＡ（ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９；配列番号２３）を作製し、抗腫瘍活性の有無を評価することにした。なお、Ｙ１３－２５９のＤＮＡ配列は、データベースに登録されていなかったため、アミノ酸配列に基づき、マウスのコドンに最適化した配列を設計した。ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９のＤＮＡ配列を配列番号２４に示す。ｍｙｃ－Ｙ１３－２５９のＤＮＡ配列を配列番号２５に示す。ＤＮＡ合成はGenescript社に委託した。
　（１）Ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏの解析
　ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９の設計にあたり、Ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏの解析を行った結果、ｓ３ＦｌａｇタグおよびＨＡタグの融合により、ｓｃＦｖ－Ｙ１３－２５９の正味の負電荷が、ｐＨ６．６においても劇的に増加することが実証された（図１３のＡ）。
　（２）ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９の結合能の評価
　次に、ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９とＧＳＴ－Ｋｒａｓとの結合アフィニティーを、前述の実施例の通りにＥＬＩＳＡにより計測した。その結果、ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９もＫｒａｓとの高い結合活性が維持されていることが確認された（図１３のＢ）。続いて、レンチウイルスにＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９、ｍｙｃ－Ｙ１３－２５９（配列番号２６）またはｓｃＦｖ－Ｙ１３－２５９のみを組み込んだベクターをＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞に感染させ、免疫細胞染色を行った。その結果、従来のｍｙｃ－Ｙ１３－２５９は不安定で発現しないか、発現しても細胞内で凝集するのに対し、ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９が安定して発現していることが確認された（図１３のＣ）。さらに、細胞内在性のＫｒａｓ細胞内相互作用を確認するために、抗ＨＡ抗体を用いて共免疫沈降を行ったところ、ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９を感染させたＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞由来の試料において、内在性ＫｒａｓとＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９との結合が確認された（図１３のＤ）。
　（３）抗腫瘍活性の評価
　次に、前述と同様にレンチウイルスベクターを用いて感染させたＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞の生存率を、感染から４日後にＭＴＳ解析によって測定した。その結果、ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９の発現によって生存率が顕著に低下することが示された（図１３のＥ）。続いて、膵臓癌細胞を皮下に移植したマウス異種移植モデルにおいて、ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９の細胞内発現によって癌の成長が抑制されるかを評価した。ヌードマウスの皮下で形成された腫瘍部分に対し、週に一度、４週に亘って前述のＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９を発現するレンチウイルスベクターを投与した結果、癌を強力に阻害することが示された（図１３のＦ、Ｇ）。最初の感染から２５日後に摘出された腫瘍においてＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９が発現していることも確認された（図１３のＨ）。
＜実施例８：他のペプチドタグの評価＞
　他のペプチドタグの性能評価を行うためＤＥ２．０タグ及びＤＥ５．０タグを作製し、その安定化の効果を検討した。実施例７と同様に、ＤＥ２．０タグ（ＤＥＱＥＮＤＹＤＥＰＥＶＮＤＥＮＱＤＹＤＥ（配列番号１３））を用いた融合タンパク質としては、抗Ｋｒａｓモノクローナル抗体由来のペプチド（Ｙ１３－２５９；配列番号２２）のＮ末端側にＤＥ２．０タグを融合させたＤＥ２．０－Ｙ１３－２５９（配列番号２７）；ＤＥ２．０－Ｙ１３－２５９のＣ末端側にさらにＨＡペプチドを融合させたＤＥ２．０－Ｙ１３－２５９－ＨＡ（配列番号２８）；ＤＥ２．０－Ｙ１３－２５９のＣ末端側にさらにＰＡペプチドを融合させたＤＥ２．０－Ｙ１３－２５９－ＰＡ（配列番号２９）；並びに、凝集繊維化したｈｕｍａｎ α‐ｓｙｎｕｃｌｅｉｎに特異的に結合する抗体（Barkhordarian et al., 2006：Protein Engineering, Design and Selection, Volume 19, Issue 11, 1 November 2006, Pages 497-502）のｓｃＦＶ配列（ｓｃＦｖ‐６Ｅ）のＮ、Ｃ両末端にＤＥ２．０タグを融合させたタンパク質ＳＴＡＮＤ－６Ｅ－ＬＹＳ；を作製した。ＳＴＡＮＤ－６Ｅ－ＬＹＳには、さらに機能ペプチドとしてＨｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｃｏｇｎａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ７０ （ＨＳＣ７０）結合ペプチド（ＭＡＲＶＫＫＤＱＡＥＰＬＨＲＫＦＥＲＱＰＰＧ（配列番号３１））（Bauer et al., Nature Biotech (2010)：Nature Biotechnology volume 28, pages 256-263 (2010)）をＣ末端側のＤＥ２．０タグの下流に融合させ、さらにＨＳＣ７０結合ペプチドの下流にはＨＡペプチドも付した。作成したＳＴＡＮＤ－６Ｅ－ＬＹＳのアミノ酸配列の全長は、配列番号３２に示す。
　ＤＥ５．０タグ（ＤＤＤＥＤＥＤＤＥＤＥＤＥＤＥＤＥＤＥＤＥＤ（配列番号３３））を用いた融合タンパク質としては、ｓｃＦｖ‐６ＥのＮ末端にＤＥ５．０タグを融合させてさらにＣ末端にＴ７タグ（配列番号３４：ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）を融合させたＤＥ５．０‐６Ｅ（アミノ酸配列：配列番号３５、塩基配列：配列番号３６）を作製した。これらの融合タンパク質をコードするＤＮＡはすべてヒトのコドンに最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって合成された。
　なお、ＤＥ２．０－Ｙ１３－２５９－ＨＡ及びＳＴＡＮＤ－６Ｅ－ＬＹＳのＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号３０、及び配列番号３７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　Ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏの解析を行った結果、ＤＥ２．０タグのみの融合でも、ｓｃＦｖ－Ｙ１３－２５９の正味の負電荷が劇的に増加することが判明した（図１３のＡ）。また、ＨＡまたはＰＡも融合させると、さらに増加することが判明した（図１３のＡ）。ｓｃＦｖ‐６Ｅについても同様にＩｎ　ｓｉｌｉｃｏの解析を行った結果、ＤＥ２．０タグとＤＥ２．０タグとＨＡタグとの融合や、ＤＥ５．０タグとの融合により、ｓｃＦｖ‐６Ｅの正味の負電荷が、ｐＨ６．６においても劇的に増加することが実証された（図１５）。
　レンチウイルスベクターを用いてＤＥ２．０－Ｙ１３－２５９－ＨＡをコードするＤＮＡを、ＭＩＡ　ＰａＣａ２細胞に導入したところ、細胞内でＤＥ２．０－Ｙ１３－２５９－ＨＡが凝集することなく発現し、ＳＴＡＮＤ－Ｙ１３－２５９よりも強く内在性Ｋｒａｓと細胞内で結合していることが確認された（図１４のＡ）。このＤＥ２．０－Ｙ１３－２５９－ＨＡを発現するレンチウイルスベクターの癌の成長抑制効果を、膵臓癌細胞を皮下に移植したマウスの異種移植モデルを用いて評価した結果、癌を強力に阻害することが示された（図１４のＢ）。これらの結果は、本発明が、抗体を細胞内で安定に発現させるペプチドタグの開発に極めて有効であることを示した。
　ＳＴＡＮＤ－６Ｅ－ＬＹＳ及びＤＥ５．０‐６ＥをコードするＤＮＡは、哺乳類発現ベクターであるｐＥＦ－ＢＯＳベクターにクローニングして発現ベクター（ＳＴＡＮＤ-６Ｅ‐ＬＹＳ発現ベクター；ｐＥＦ－ＢＯＳ－ＳＴＡＮＤ－６Ｅ‐ＬＹＳ、ＤＥ５．０‐６Ｅ発現ベクター；ｐＥＦ－ＢＯＳ－ＤＥ５．０‐６Ｅ）を作製した。ＳＴＡＮＤ-６Ｅ‐ＬＹＳ発現ベクター及びＤＥ５．０‐６Ｅ発現ベクターをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００によりＨｅＬａ細胞に導入し、１８時間培養後に４％ＰＦＡにて固定した。ＳＴＡＮＤ-６Ｅ‐ＬＹＳはＨＡ抗体、ＤＥ５．０‐６ＥはＴ７抗体によって染色を行った。ＳＴＡＮＤ-６Ｅ‐ＬＹＳ、ＤＥ５．０‐６Ｅともに細胞内で凝集することなく発現していることが確認された（図１６）。
　続いて、α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ凝集に対するＳＴＡＮＤ-６Ｅ‐ＬＹＳの効果についてＳＨＳＹ５Ｙ細胞を用いて検証した。α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎの凝集アッセイは、大腸菌から精製したヒトリコンビナントα －ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを超音波処理により、繊維化、凝集化したα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ Ｆｉｂｒｉｌを用いた（Tarutani et al., 2018：Acta Neuropathol Commun. 2018 Apr 18;6(1):29.）。本アッセイではヒト由来ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を用いた。ＳＴＡＮＤ-６Ｅ‐ＬＹＳに組み込まれたＨＳＣ７０結合ペプチドは、α‐ｓｙｎｕｃｌｅｉｎのＨＳＣ７０結合モチーフ(ＶＫＫＤＱ（配列番号３８）)と、ＨＳＣ７０結合コンセンサスモチーフ(ＫＦＥＲＱ（配列番号３９）)からなる。Ｍｕｔａｎｔ ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎと結合するペプチドとＨＳＣ７０結合ペプチドを融合することで、Ｃｈａｐｅｒｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ（ＣＭＡ）によるｍｕｔａｎｔ ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎの分解を促進できることがｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで示されており、標的タンパク質分子に特異的に結合できるペプチド（ｓｃＦｖも含む）さえあれば、標的タンパク質分子をＣＭＡ依存的に分解することが可能になる。ヒトα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎの全長を緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰに融合したタンパク質（ＥＧＦＰ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）を発現するｐＥＧＦＰ－α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎベクターを構築し、ＳＴＡＮＤ－６Ｅ－ＬＹＳ発現ベクターとともにＳＨＳＹ５Ｙ細胞へＸｔｒｅｍＧＥＮＥ９（Ｓｉｇｍａ）を用いて遺伝子導入した。６時間後にＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ｆｉｂｒｉｌタンパク質を細胞へ導入し、３日間培養したのち、４％ＰＦＡにより固定した。その後、抗ＨＡ抗体によりＳＴＡＮＤ－６Ｅ－ＬＹＳを検出し、抗リン酸化α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ抗体（Ｍｏｕｓｅ、ＷＡＫＯ）により染色を行った。ＸｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９及びＭｕｌｔｉＦｅｃｔａｍによる遺伝子導入、タンパク導入は、製造メーカーの標準プロトコールに従った。ＧＦＰ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎがドット状に凝集している細胞数の出現率、リン酸化ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ陽性細胞の出現率を測定することにより、Ｆｉｂｒｉｌによる凝集を定量化した。
　Ｃｏｎｔｒｏｌベクターを導入した細胞において、Ｆｉｂｒｉｌにより、約１４％の細胞のＥＧＦＰ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎがドッド状に局在変化した。これらドット状のｓｙｎｕｃｌｅｉｎは、パーキンソン患者脳のマーカーであるα－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎのアミノ酸１２９位のリン酸化を検出するａｎｔｉ－ＰＳｅｒ１２９－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ抗体によって共染色されることがわかった（図１７）。これは、細胞外から侵入した凝集ｓｙｎｕｃｌｅｉｎが、細胞内で発現する正常な構造をしていたＥＧＦＰ－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎを凝集化したことを示している。一方、ＳＴＡＮＤ－６Ｅ－ＬＹＳを発現する細胞では、凝集化が２％まで抑えられていた（図１８）。
　以上の結果は、本発明が、抗原結合性ペプチドが細胞内で凝集することなく機能を保持させて発現させることに極めて有効であることを示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　本発明は、例えば、各種の研究用途、並びに、診断および治療等の医学用途において利用することができる。

Claims (12)

  1. 　細胞内安定化ペプチドと、抗原結合性ペプチドとを含む融合タンパク質であって、
    　上記細胞内安定化ペプチドは、１０～３９個のアミノ酸からなり、かつ、当該アミノ酸の少なくとも４５％が酸性アミノ酸であり、
    　上記抗原結合性ペプチドは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む、
    融合タンパク質。
  2. 　上記細胞内安定化ペプチドは、上記アミノ酸の２８％以下が塩基性アミノ酸であるか、塩基性アミノ酸を含まない、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 　上記細胞内安定化ペプチドは、上記塩基性アミノ酸を含まない、請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. 　上記細胞内安定化ペプチドは、上記塩基性アミノ酸として少なくとも１個のヒスチジンを含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
  5. 　上記細胞内安定化ペプチドは、１４～２５個のアミノ酸からなり、当該アミノ酸の少なくとも５０％が酸性アミノ酸であり、
    　上記細胞内安定化ペプチドにおいて、上記酸性アミノ酸が８個以上連続した部分、および、酸性アミノ酸以外のアミノ酸が４個以上連続した部分が存在しない、請求項１～４の何れか１項に記載の融合タンパク質。
  6. 　上記細胞内安定化ペプチドにおいて、上記酸性アミノ酸が３個以上連続した部分、および、酸性アミノ酸以外のアミノ酸が３個以上連続した部分が存在しない、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 　上記細胞内安定化ペプチドは、上記酸性アミノ酸をＸＡ、酸性アミノ酸以外のアミノ酸をＸｎとしたときに、
    　以下のアミノ酸配列（１）または（２）：
    　　－Ｘｎ－ＸＡ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－（ＸＡまたはＸｎ）－Ｘｎ－ＸＡ－（ＸＡまたはＸｎ）－Ｘｎ－（ＸＡまたはＸｎ）－ＸＡ－　　　・・・・・・（１）、
    　　－Ｘｎ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－ＸＡ－Ｘｎ－ＸＡ－Ｘｎ－Ｘｎ－ＸＡ－ＸＡ－Ｘｎ－Ｘｎ－ＸＡ－　　　　　　　　　　　　・・・・・・（２）、
    を含んでなる、請求項１～６の何れか１項に記載の融合タンパク質。
  8. 　ＸＡはアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘｎはアスパラギン、グルタミン、プロリン、チロシンおよびバリンからなる群より選択される何れかのアミノ酸である、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. 　請求項１～８の何れか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  10. 　請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  11. 　細胞内において抗原結合性ペプチドを発現させる細胞を製造する方法であって、
    　請求項９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載の発現ベクターを細胞に導入する工程を含む、製造方法。
  12. 　請求項１～８の何れか１項に記載の融合タンパク質を発現する細胞。
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