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WO2025164663A1 - ポリペプチド及びその使用 - Google Patents

ポリペプチド及びその使用

Info

Publication number
WO2025164663A1
WO2025164663A1 PCT/JP2025/002777 JP2025002777W WO2025164663A1 WO 2025164663 A1 WO2025164663 A1 WO 2025164663A1 JP 2025002777 W JP2025002777 W JP 2025002777W WO 2025164663 A1 WO2025164663 A1 WO 2025164663A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
amino acids
antigen
binding
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/002777
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
浩一 和田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tanabe Pharma Corp
Original Assignee
Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Tanabe Pharma Corp filed Critical Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Publication of WO2025164663A1 publication Critical patent/WO2025164663A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K4/00—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • Non-Patent Document 1 if antibodies aggregate intracellularly, not only will they not exert their intended effect, but they may also cause cytotoxicity, suggesting concerns that their use for therapeutic purposes may pose a high safety risk (see, for example, Non-Patent Document 1). Therefore, in order to obtain antibodies that act on intracellular target antigen proteins, antibody engineering is required to enable them to function intracellularly, but this is not generally easy to accomplish.
  • the present disclosure has been made in light of the above circumstances, and provides a polypeptide that can improve the intracellular binding of an antigen-binding polypeptide to an antigen.
  • a polypeptide according to one aspect of the present disclosure is a polypeptide for improving the intracellular binding of an antigen-binding polypeptide to an antigen, wherein the polypeptide consists of 3 to 20 amino acids, and more than 57.0% but less than 100.0% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids.
  • the polypeptide of the above embodiment can improve the binding ability of an antigen-binding polypeptide to an antigen within a cell.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Experimental Example 2.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Experimental Example 3.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Experimental Example 4.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Experimental Example 5.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Experimental Example 6.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Experimental Example 7.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Experimental Example 8.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Experimental Example 9.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Experimental Example 10.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Experimental Example 11.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of Experimental Example 12.
  • polypeptide is also referred to as “peptide” or "protein.”
  • Polypeptide refers to a compound in which two or more amino acids are linked by peptide bonds.
  • a polypeptide may include a structure modified by, for example, sugars.
  • the amino acids constituting a polypeptide may be naturally occurring amino acids, or may be known analogs of naturally occurring amino acids that can function in the same manner as naturally occurring amino acids.
  • the amino acids may be L-amino acids or D-amino acids.
  • amino acid refers to an amino acid with an isoelectric point of 3.9 or less.
  • Acidic amino acids may be naturally occurring amino acids or known analogs of naturally occurring amino acids. Examples of naturally occurring acidic amino acids include aspartic acid (D) and glutamic acid (E).
  • basic amino acid refers to an amino acid with an isoelectric point of 7.4 or higher.
  • a basic amino acid may be a naturally occurring amino acid or a known analogue of a naturally occurring amino acid. Examples of naturally occurring basic amino acids include histidine (H), lysine (K), and arginine (R).
  • neutral amino acid refers to an amino acid other than the above-mentioned acidic amino acids and basic amino acids.
  • a neutral amino acid refers to an amino acid with an isoelectric point greater than 3.9 and less than 7.4.
  • a neutral amino acid may be a naturally occurring amino acid or a known analogue of a naturally occurring amino acid.
  • Naturally occurring neutral amino acids include alanine (A), asparagine (N), cysteine (C), phenylalanine (F), glycine (G), isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), proline (P), glutamine (Q), serine (S), threonine (T), valine (V), tryptophan (W), and tyrosine (Y).
  • A alanine
  • N asparagine
  • cysteine C
  • F phenylalanine
  • G isoleucine
  • I leucine
  • M methionine
  • P proline
  • P glutamine
  • Q serine
  • T threonine
  • V valine
  • W tryptophan
  • Y tyrosine
  • antigen refers to any molecule to which an antigen-binding polypeptide can bind.
  • antigens include proteins, peptides, polysaccharides, glycoproteins, glycolipids, nucleic acids, portions thereof, and combinations thereof.
  • Antigens may be synthetically produced or derived from biological samples. Examples of such biological samples include, but are not limited to, tissue samples, tumor samples, cells, or other biological components, organisms, protein/antigen subunits, liquids containing killed or inactivated whole cells or cell lysates, etc.
  • antigen-binding polypeptide refers to a polypeptide that specifically binds to an antigen (target molecule).
  • An antigen-binding polypeptide has all or part of a region that has antigen-binding ability.
  • antigen-binding polypeptides include, but are not limited to, antibodies and antigen-binding fragments thereof, peptide aptamers, etc.
  • antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies may be natural antibodies or antibodies produced using genetic engineering. Natural antibodies may be derived from biological species including, but not limited to, humans, mice, rats, monkeys, goats, rabbits, camels, llamas, cows, and chickens.
  • Antibodies produced using genetic engineering include, but are not limited to, synthetic antibodies, recombinant antibodies, and mutated antibodies produced from natural antibodies. Antibodies produced using genetic engineering techniques may also be modified in the same manner as in the genetic modification of natural antibodies, as described above.
  • Monoclonal antibodies include multispecific antibodies, single-chain antibodies, Fab fragments, Fab' fragments, F(ab') fragments, F(ab') 2 fragments, variable fragments of antibodies (Fv), single-chain Fvs (scFvs), disulfide stabilized Fvs (dsFvs), single domain antibodies (dAbs), VHs, VLs, intrabodies, minibodies, nanobodies (variable domains of heavy chain antibodies, VHHs), vNARs, diabodies, and full-length or partial anti-idiotype (anti-Id) antibodies.
  • intrabody refers to an antibody that specifically binds to an antigen within a cell (intrabody).
  • nucleic acid is also referred to as “nucleotide” or “polynucleotide.” Unless otherwise specified, nucleic acid includes both DNA and RNA.
  • an expression vector refers to a vector that contains a regulatory sequence and a nucleic acid encoding a protein operably linked to the regulatory sequence, and that can transcribe mRNA encoding the protein within a cell or in a test tube.
  • An expression vector may contain, for example, an origin of replication for replication within a cell, and a regulatory sequence and a nucleic acid encoding the protein operably linked to the regulatory sequence.
  • An expression vector may also have a selection marker, such as a drug resistance gene, for selecting cells into which it has been introduced.
  • RNA polymerase II RNA polymerase II
  • promoters for RNA polymerase II such as promoters for cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE), HSV thymidine kinase, SV40 early, SV40 late, retroviral LTR, and metallothionein I.
  • Promoters for expression in E. coli include, for example, lac, trp, lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, lambda PL, and 3-phosphoglycerate kinase promoters.
  • Promoters for in vitro expression are not particularly limited, but examples include SP6, T7, and T3 promoters.
  • Expression vectors include plasmids, phages, phagemids, cosmids, fosmids, artificial chromosomes, retroviral vectors, lentiviral vectors, measles virus vectors, vaccinia virus vectors, adenoviral vectors, adeno-associated virus vectors, and Sendai virus vectors.
  • the polypeptide of this embodiment is a polypeptide for improving the intracellular antigen-binding ability of an antigen-binding polypeptide.
  • the polypeptide of this embodiment consists of 3 to 20 amino acids. More than 57.0% but less than 100.0% of the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment are acidic amino acids.
  • polypeptides that contain consecutive acidic amino acids and are relatively long (21 or more amino acids) destabilize ribosomal translation, resulting in a significant decrease in the expression level of antigen-binding polypeptides within cells. Therefore, while these are effective in inhibiting intracellular antibody aggregation, they are not suitable for medical applications.
  • antigen-binding polypeptides such as intrabodies
  • the level of expression of the antigen-binding polypeptide within cells is related to its efficacy, so there is a need to develop technologies that enable stable expression within cells and improve its ability to bind to target antigens.
  • the translation rate of ribosomes is slightly controlled, improving the folding efficiency of the antigen-binding polypeptide and increasing the proportion of antigen-binding polypeptides that remain correctly folded in cells. This is thought to result in improved antigen-binding ability of the antigen-binding polypeptide in cells.
  • the polypeptide of this embodiment can also be said to be a polypeptide that controls the translation rate of an antigen-binding polypeptide in cells and improves the folding efficiency of the antigen-binding polypeptide.
  • the polypeptide of this embodiment can also be said to be a polypeptide that increases the presence of antigen-binding polypeptides that maintain correct folding in cells.
  • the mechanism by which the intracellular antigen-binding polypeptide of this embodiment improves its antigen-binding ability is not limited to the above mechanism.
  • an expression vector containing a nucleic acid encoding an antigen-binding polypeptide with the polypeptide of this embodiment attached to its N-terminus, and an expression vector containing only a nucleic acid encoding the antigen-binding polypeptide without the polypeptide of this embodiment attached, are prepared. These expression vectors are then introduced into cells and expressed intracellularly. The antigen-binding polypeptide is then recovered by immunoprecipitation, and the amount of the antigen-binding polypeptide and the intracellular target antigen bound to it are detected using Western blotting.
  • the amount of intracellular target antigen detected per antigen-binding polypeptide is then compared between cells with and without the polypeptide of this embodiment attached, and whether the amount of intracellular target antigen bound to the polypeptide of this embodiment attached is confirmed to be higher than that of cells without the polypeptide of this embodiment attached, thereby evaluating whether intracellular antigen-binding ability of the antigen-binding polypeptide is improved.
  • the binding amount of an antigen-binding polypeptide having the polypeptide of this embodiment attached to its N-terminus to an intracellular target antigen can be, but is not limited to, 1.2 times, 1.5 times, 1.8 times, 2 times, 3 times, 4 times, 5 times, 6 times, 7 times, 8 times, 9 times, 10 times, or more times the binding amount of an antigen-binding polypeptide not having the polypeptide of this embodiment attached to an intracellular target antigen.
  • cells expressing an antigenic polypeptide exhibit suppressed cell proliferation compared to cells not expressing the antigenic polypeptide.
  • a fusion polypeptide in which the polypeptide of this embodiment is attached to the N-terminus of an antigen-binding polypeptide can reduce cell proliferation suppression compared to when the antigenic polypeptide alone is expressed in cells.
  • the fusion polypeptide in which the polypeptide of this embodiment is attached to the N-terminus of an antigen-binding polypeptide can reduce cell proliferation suppression.
  • the polypeptide of this embodiment can impart the effect of reducing cell proliferation suppression when the antigen-binding polypeptide is expressed in cells.
  • an expression vector containing a nucleic acid encoding an antigen-binding polypeptide with the polypeptide of this embodiment attached to its N-terminus and an expression vector containing only a nucleic acid encoding the antigen-binding polypeptide without the polypeptide of this embodiment attached are prepared. These expression vectors are then introduced into cells, and expressed within the cells. As a control, untreated cells without the vector are also prepared. Next, each cell is cultured using an Incucyte S3 (Sartorius) while capturing images over time. After 40 hours from the start of culture, the confluence (%) of cells in the culture vessel is calculated using the Incucyte analysis module.
  • the confluence (%) of cells with and without the polypeptide of this embodiment attached is compared 40 hours after the start of culture.
  • the presence or absence of the effect of reducing cell proliferation inhibition can be evaluated by determining whether the cell confluence (%) of cells with and without the polypeptide of this embodiment attached is higher than that of cells without the polypeptide of this embodiment attached.
  • the presence or absence of an effect of reducing cell proliferation inhibition can be evaluated by checking whether the rate of decrease in cell confluence (%) of cells to which the polypeptide of this embodiment has been administered is smaller than the rate of decrease in cell confluence (%) of untreated cells to which no vector has been introduced, compared to cells to which the polypeptide of this embodiment has not been administered.
  • the confluence (%) of cells expressing a fusion polypeptide in which the polypeptide of this embodiment is attached to the N-terminus of an antigen-binding polypeptide can be, but is not limited to, 1.1-fold, 1.2-fold, 1.5-fold, 1.8-fold, 2-fold, or more than the confluence (%) of cells expressing the antigenic polypeptide alone.
  • the rate of decrease in cell confluence Y (%) relative to the confluence X (%) of untreated cells ⁇ (1-Y/X) x 100(%) ⁇ can be, for example, 40%, 30%, 20%, 10%, or less, but is not limited to these.
  • polypeptide of this embodiment is described in detail below.
  • the polypeptide of this embodiment consists of 3 or more amino acids, preferably 4 or more, more preferably 5 or more, even more preferably 6 or more, even more preferably 7 or more, even more preferably 8 or more, and particularly preferably 9 or more.
  • the polypeptide of this embodiment consists of 20 or less, 19 or less, 18 or less, 17 or less, 16 or less, 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, 11 or less, or 10 or less amino acids.
  • the binding ability of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide to an intracellular target antigen can be improved without significantly reducing the intracellular expression level of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide.
  • the number of amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is less than the lower limit, the binding ability of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide to an intracellular target is reduced.
  • the number of amino acids constituting the polypeptide of this embodiment exceeds the upper limit, the risk of a reduction in the intracellular expression level of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide increases. Therefore, when the number of amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is within the above numerical range, the fusion polypeptide of this embodiment and the polypeptide of this embodiment is not significantly reduced in intracellular expression level, and the presence of antigen-binding polypeptides that maintain correct folding in cells increases, resulting in improved intracellular antigen-binding ability of the antigen-binding polypeptide.
  • polypeptide of this embodiment consists of, for example, 3 to 20 amino acids, 4 to 20 amino acids, 5 to 20 amino acids, 6 to 20 amino acids, 7 to 20 amino acids, 8 to 20 amino acids, or 9 to 20 amino acids.
  • polypeptide of this embodiment consists of, for example, 3 to 19 amino acids, 4 to 19 amino acids, 5 to 19 amino acids, 6 to 19 amino acids, 7 to 19 amino acids, 8 to 19 amino acids, or 9 to 19 amino acids.
  • polypeptide of this embodiment consists of, for example, 3 to 18 amino acids, 4 to 18 amino acids, 5 to 18 amino acids, 6 to 18 amino acids, 7 to 18 amino acids, 8 to 18 amino acids, or 9 to 18 amino acids.
  • polypeptide of this embodiment consists of, for example, 3 to 17 amino acids, 4 to 17 amino acids, 5 to 17 amino acids, 6 to 17 amino acids, 7 to 17 amino acids, 8 to 17 amino acids, or 9 to 17 amino acids.
  • polypeptide of this embodiment consists of, for example, 3 to 16 amino acids, 4 to 16 amino acids, 5 to 16 amino acids, 6 to 16 amino acids, 7 to 16 amino acids, 8 to 16 amino acids, or 9 to 16 amino acids.
  • polypeptide of this embodiment consists of, for example, 3 to 15 amino acids, 4 to 15 amino acids, 5 to 15 amino acids, 6 to 15 amino acids, 7 to 15 amino acids, 8 to 15 amino acids, or 9 to 15 amino acids.
  • polypeptide of this embodiment consists of, for example, 3 to 14 amino acids, 4 to 14 amino acids, 5 to 14 amino acids, 6 to 14 amino acids, 7 to 14 amino acids, 8 to 14 amino acids, or 9 to 14 amino acids.
  • polypeptide of this embodiment consists of, for example, 3 to 13 amino acids, 4 to 13 amino acids, 5 to 13 amino acids, 6 to 13 amino acids, 7 to 13 amino acids, 8 to 13 amino acids, or 9 to 13 amino acids.
  • polypeptide of this embodiment consists of, for example, 3 to 12 amino acids, 4 to 12 amino acids, 5 to 12 amino acids, 6 to 12 amino acids, 7 to 12 amino acids, 8 to 12 amino acids, or 9 to 12 amino acids.
  • polypeptide of this embodiment consists of, for example, 3 to 11 amino acids, 4 to 11 amino acids, 5 to 11 amino acids, 6 to 11 amino acids, 7 to 11 amino acids, 8 to 11 amino acids, or 9 to 11 amino acids.
  • polypeptide of this embodiment consists of, for example, 3 to 10 amino acids, 4 to 10 amino acids, 5 to 10 amino acids, 6 to 10 amino acids, 7 to 10 amino acids, 8 to 10 amino acids, or 9 to 10 amino acids.
  • the polypeptide of this embodiment preferably consists of 9 to 20 amino acids, more preferably 9 to 18, even more preferably 9 to 15, particularly preferably 9 to 12, and most preferably 9 amino acids.
  • Amino acids constituting the polypeptide of this embodiment include those exemplified in the definitions of terms above.
  • the polypeptide of this embodiment is preferably composed of L-amino acids.
  • the polypeptide of this embodiment has a main backbone made up of acidic amino acids. Specifically, of the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment, more than 57.0% but less than 100.0%, preferably 60.0% to 90.0%, more preferably 65.0% to 80.0%, even more preferably 66.0% to 78.0%, and particularly preferably 66.7% to 77.8% are acidic amino acids.
  • the binding ability of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide to an intracellular target antigen can be improved.
  • the number of amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is less than the above-mentioned upper limit or equal to or less than the above-mentioned upper limit, the binding ability of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide to an intracellular target can be improved without significantly reducing the expression level of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide.
  • the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide of this embodiment does not significantly reduce the expression level of the fusion polypeptide, and the presence of antigen-binding polypeptides that maintain correct folding in cells increases, resulting in improved antigen-binding ability of the antigen-binding polypeptide in cells.
  • the ratio of a specific amino acid to the amino acids constituting a polypeptide is expressed as a percentage (%), calculated by dividing the number of specific amino acids contained in the polypeptide by the total number of amino acids constituting the polypeptide and multiplying this value by 100.
  • Acidic amino acids constituting the polypeptide of this embodiment include those exemplified in the definitions of terms above.
  • the polypeptide of this embodiment preferably has glutamic acid at the N-terminus.
  • the polypeptide in this embodiment preferably consists of acidic amino acids and neutral amino acids.
  • amino acids constituting the polypeptide of this embodiment more than 0.0% and no more than 40.0%, preferably 10.0% to 40.0%, more preferably 20.0% to 35.0%, even more preferably 22.0% to 34.0%, and particularly preferably 22.2% to 33.3% are neutral amino acids.
  • the ratio of neutral amino acids to the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is at least the above lower limit, the binding ability of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide to an intracellular target antigen can be improved without significantly reducing the intracellular expression level of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide.
  • the ratio of neutral amino acids to the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is at most the above upper limit, the binding ability of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide to an intracellular target can be improved.
  • the ratio of neutral amino acids to the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is within the above numerical range, the presence of antigen-binding polypeptides that maintain correct folding in cells increases, and as a result, the binding ability of the antigen-binding polypeptide to an antigen in cells can be further improved.
  • Neutral amino acids constituting the polypeptide of this embodiment include those exemplified in the definitions of terms above. Among these, neutral amino acids are preferably those whose side chains are hydrophobic aliphatic groups or hydrophilic groups, more preferably proline, glycine, or serine, and particularly preferably proline.
  • amino acids constituting the polypeptide of this embodiment preferably 0.0% to 40.0%; more preferably 10.0% to 40.0%; even more preferably 20.0% to 35.0%; particularly preferably 22.0% to 34.0%; and most preferably 22.2% to 33.3%; proline is preferred.
  • the ratio of proline to the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is at least the above lower limit, the binding ability of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide to its intracellular target antigen can be improved without significantly reducing the intracellular expression level of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide.
  • the ratio of proline to the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is at most the above upper limit, the binding ability of the fusion polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide to its intracellular target can be improved.
  • the ratio of proline to the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is within the above numerical range, the presence of antigen-binding polypeptides that maintain correct folding in cells increases, and as a result, the binding ability of the antigen-binding polypeptide to its intracellular antigen can be further improved.
  • the polypeptide further contains basic amino acids in addition to acidic amino acids.
  • the polypeptide of this embodiment may consist of acidic amino acids and basic amino acids, or may consist of acidic amino acids, neutral amino acids, and basic amino acids.
  • Acidic amino acids constituting the polypeptide of this embodiment include those exemplified in the definitions of terms above.
  • the polypeptide of this embodiment preferably has glutamic acid at the N-terminus.
  • Neutral amino acids constituting the polypeptide of this embodiment include those exemplified in the definitions of terms above. Among these, neutral amino acids are preferably those whose side chains are hydrophobic aliphatic groups or hydrophilic groups, more preferably proline, glycine, or serine, and particularly preferably proline.
  • Basic amino acids constituting the polypeptide of this embodiment include those exemplified in the definitions of terms above. Among these, lysine is preferred as a basic amino acid.
  • the polypeptide of this embodiment preferably further comprises a basic amino acid, and the basic amino acid is lysine.
  • the polypeptide of this embodiment preferably consists of an acidic amino acid, a neutral amino acid, and a basic amino acid, wherein the acidic amino acid is glutamic acid or aspartic acid, the neutral amino acid is proline, and the basic amino acid is lysine.
  • the polypeptide of this embodiment preferably consists of an acidic amino acid, a neutral amino acid, and a basic amino acid, wherein the acidic amino acid is glutamic acid or aspartic acid, the neutral amino acid is proline, the basic amino acid is lysine, and the N-terminus is glutamic acid.
  • the polypeptide of this embodiment preferably consists of an acidic amino acid and a basic amino acid, wherein the acidic amino acid is glutamic acid or aspartic acid, and the basic amino acid is lysine.
  • the polypeptide of this embodiment preferably consists of an acidic amino acid and a basic amino acid, wherein the acidic amino acid is glutamic acid or aspartic acid, the basic amino acid is lysine, and the N-terminus is glutamic acid.
  • the total proportion of neutral amino acids and basic amino acids in the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is preferably 10.0% or more and 40.0% or less, more preferably 20.0% or more and 35.0% or less, even more preferably 22.0% or more and 34.0% or less, and particularly preferably 22.2% or more and 33.3% or less.
  • the binding affinity of the polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide to an intracellular target antigen can be improved without significantly reducing the intracellular expression level of the polypeptide.
  • the total ratio of neutral amino acids and basic amino acids to the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is at most the above upper limit, the binding affinity of a fusion polypeptide of the polypeptide of this embodiment and the antigen-binding polypeptide to an intracellular target is improved.
  • the total ratio of neutral amino acids and basic amino acids to the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is within the above numerical range, the presence of antigen-binding polypeptides that maintain correct folding within cells increases, and as a result, the binding affinity of antigen-binding polypeptides to antigens within cells can be further improved.
  • amino acids constituting the polypeptide of this embodiment are neutral amino acids, particularly preferably proline.
  • the proportion of neutral amino acids, preferably proline, relative to the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is within the above range, the intracellular antigen-binding ability of the antigen-binding polypeptide can be further improved.
  • the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment are basic amino acids, and lysine is particularly preferred.
  • the ratio of basic amino acids, preferably lysine, to the amino acids constituting the polypeptide of this embodiment is within the above range, the intracellular binding ability of the antigen-binding polypeptide to the antigen can be further improved.
  • polypeptide (I) includes, for example, a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by the following general formula (I) (hereinafter, sometimes referred to as "polypeptide (I)”):
  • X1 and X4 each independently represent a neutral amino acid or a basic amino acid
  • X2 is a D or neutral amino acid
  • X 3 is D or E
  • n1 and n2 each independently represent an integer of 0 to 3, and 0 ⁇ n1+n2 ⁇ 5.
  • neutral amino acids in X1 and X4 include those exemplified in the definitions of the above terms.
  • the basic amino acids in X1 and X4 include those exemplified in the definition of the above terms.
  • X1 and X4 in general formula (I) are each independently a neutral amino acid selected from the group consisting of alanine (A), asparagine (N), cysteine (C), phenylalanine (F), glycine (G), isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), proline (P), glutamine (Q), serine (S), threonine (T), valine (V), tryptophan (W), and tyrosine (Y), or a basic amino acid selected from the group consisting of histidine (H), lysine (K), and arginine (R).
  • A alanine
  • N asparagine
  • cysteine C
  • F phenylalanine
  • G isoleucine
  • I leucine
  • M methionine
  • P proline
  • P glutamine
  • Q serine
  • T threonine
  • V valine
  • W tryptophan
  • Y t
  • X1 and X4 in general formula (I) are each independently preferably a neutral amino acid whose side chain is a hydrophobic aliphatic group or a hydrophilic group, or K, more preferably G, P, S, or K.
  • n1 is 2 or more, the plural X1s may be the same or different.
  • the neutral amino acid for X2 includes those exemplified in the definition of the above term.
  • X2 in general formula (I) is D or a neutral amino acid selected from the group consisting of alanine (A), asparagine (N), cysteine (C), phenylalanine (F), glycine (G), isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), proline (P), glutamine (Q), serine (S), threonine (T), valine (V), tryptophan (W), and tyrosine (Y).
  • A alanine
  • N asparagine
  • cysteine C
  • F phenylalanine
  • G isoleucine
  • I leucine
  • M methionine
  • P proline
  • P glutamine
  • Q serine
  • T threonine
  • V valine
  • W tryptophan
  • Y tyrosine
  • X2 in general formula (I) is preferably D or a neutral amino acid whose side chain is a hydrophobic aliphatic group or a hydrophilic group, more preferably D, G, P, or S, and even more preferably D.
  • X3 is preferably E.
  • n1 and n2 are each independently an integer of 0 or greater and 3 or less, and 0 ⁇ n1+n2 ⁇ 4, more preferably an integer of 0 or greater and 3 or less, and 1 ⁇ n1+n2 ⁇ 4, and even more preferably an integer of 0 or greater and 3 or less, and 2 ⁇ n1+n2 ⁇ 4.
  • Preferred polypeptides (I) include, for example, those shown in the table below. Note that these are only examples of preferred polypeptides (I), and are not limited to these.
  • preferred polypeptides (I) are polypeptides consisting of the amino acid sequence of EX 2 X 3 , polypeptides consisting of the amino acid sequence of EX 1 DEX 2 X 3 , polypeptides consisting of the amino acid sequence of EX 2 X 3 EX 4 D, or polypeptides consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 64 to 66 and 72, and more preferred polypeptides (I) are polypeptides consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 64 to 66 and 72.
  • the basic amino acid at X5 includes those exemplified in the definition of the term above.
  • a preferred polypeptide (II) is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 82.
  • the polypeptide of this embodiment is preferably a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 23 to 25, 31, 33, 34, and 40 to 42. Furthermore, the polypeptide of this embodiment is particularly preferably a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25.
  • nucleic acid encoding a polypeptide In one embodiment, the disclosure provides a nucleic acid encoding the above polypeptide.
  • the nucleic acid of this embodiment may be a DNA molecule, an RNA molecule, or a hybrid molecule of DNA and RNA. Furthermore, the nucleic acid of this embodiment may be single-stranded or double-stranded.
  • the nucleic acid of this embodiment can be prepared by known genetic engineering techniques, chemical synthesis methods, etc. Specific base sequences of the nucleic acid of this embodiment can be easily designed by those skilled in the art from the amino acid sequence of the above-mentioned polypeptide, preferably the amino acid sequence of EX2X3 , EX1DEX2X3 , or EX2X3EX4D , or the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 64 to 66, 72, and 82 , more preferably the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 23 to 25, 31, 33, 34, and 40 to 42, for example, by referring to a codon table.
  • nucleic acids encoding preferred polypeptides include those shown in the table below.
  • the nucleic acid encoding the polypeptide of this embodiment is preferably a nucleic acid consisting of the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3 to 5, 11, 13, 14, 19, and 20 to 22. Furthermore, the nucleic acid encoding the polypeptide of this embodiment is particularly preferably a nucleic acid consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the fusion polypeptide of this embodiment comprises the above-described polypeptide and an antigen-binding polypeptide.
  • the fusion polypeptide of this embodiment comprises an antigen-binding polypeptide and the above-described polypeptide attached to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide.
  • the above polypeptide is attached to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide, thereby increasing the proportion of antigen-binding polypeptides that maintain correct folding within cells, and as a result, the binding ability of the antigen-binding polypeptide to the antigen within cells can be further improved.
  • Antigen-binding polypeptides include those exemplified by the definitions of the terms above.
  • the antigen-binding polypeptide is preferably one that is stably expressed and functions even in the above-mentioned reducing intracellular environment. Therefore, among these, the antigen-binding polypeptide is preferably a monoclonal antibody against a specific intracellular antigen, and more preferably one that contains one or more complementarity-determining regions (CDRs) of an antibody against a specific intracellular antigen.
  • CDRs complementarity-determining regions
  • antibodies include, for example, at least one of heavy chain CDR1, heavy chain CDR2, heavy chain CDR3, light chain CDR1, light chain CDR2, and light chain CDR3 of any monoclonal antibody.
  • the antibody contains at least two, at least three, at least four, at least five, or all of these.
  • preferred antigen-binding polypeptides include scFv, VH, VL, VHH, vNAR, and Fab, which are specific to a specific antigen.
  • the fusion polypeptide of this embodiment may further comprise another polypeptide at the C-terminus of the fusion polypeptide.
  • the fusion polypeptide of this embodiment may comprise a linker sequence consisting of approximately one to ten amino acids between the antigen-binding polypeptide and the other polypeptide. Examples of linker sequences include, but are not limited to, linker sequences consisting of approximately one to ten, preferably two to five, glycine residues.
  • fusion polypeptide of this embodiment When using the fusion polypeptide of this embodiment for pharmaceutical purposes, it is preferable to use a pharmaceutically acceptable polypeptide among other polypeptides, or to not include any other polypeptides.
  • polypeptides include, for example, purification tag peptides, detection peptides, degradation-promoting peptides, Neh2 domain peptides, stress-responsive degradation peptides, drug-binding peptides, etc.
  • Purification tag peptides include known tag peptides such as HA tags and His tags.
  • Detection peptides are not particularly limited, but examples include, but are not limited to, fluorescent proteins and enzymes that emit light or change color upon reaction.
  • Fluorescent proteins include, but are not limited to, BFP, EBFP, CFP, ECFP, Cypet, AmCyan1, GFP, EGFP, YFP, Venus, mKO, mOrange, RFP, DsRed, tdTomato, mcherry, mStrawberry, Azalea, mPlum, mAG, Kaede, Dronpa, Keima, KikG, KikGR, and UnaG.
  • Enzymes that produce light emission or color changes upon reaction include, but are not limited to, peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, malate dehydrogenase, penicillinase, catalase, apoglucose oxidase, urease, luciferase, and acetylcholinesterase.
  • Degradation-promoting peptides include, but are not limited to, HSC70-binding peptides, XIAP RING domain peptides, etc.
  • Neh2 domain peptides include, but are not limited to, peptides derived from Nrf2.
  • Stress-responsive degradation peptides include, but are not limited to, oxygen-dependent degradation domains, such as peptides derived from Hif1 ⁇ .
  • nucleic acid encoding a fusion polypeptide In one embodiment, the disclosure provides a nucleic acid encoding the fusion polypeptide.
  • the nucleic acid encoding the fusion polypeptide may be a DNA molecule, an RNA molecule, or a hybrid molecule of DNA and RNA. Furthermore, the nucleic acid encoding the fusion polypeptide may be single-stranded or double-stranded.
  • the nucleic acid encoding the fusion polypeptide can be prepared by known genetic engineering techniques, chemical synthesis methods, or the like.
  • the specific base sequence of the nucleic acid of this embodiment can be easily designed by a person skilled in the art from the amino acid sequence of the fusion polypeptide by referring to, for example, a codon table.
  • the nucleic acid encoding the fusion polypeptide may contain a non-coding nucleic acid consisting of one to several bases between the nucleic acid encoding the polypeptide and the nucleic acid encoding the antigen-binding polypeptide, or between the nucleic acid encoding the antigen-binding polypeptide and the nucleic acid encoding the other polypeptide.
  • the number of bases contained in the non-coding nucleic acid may be, for example, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 30, or 1 to 10.
  • the expression vector of this embodiment contains a nucleic acid encoding the above-mentioned polypeptide.
  • the expression vector comprises a nucleic acid encoding the fusion polypeptide.
  • examples of expression vectors into which the nucleic acid encoding the polypeptide or the nucleic acid encoding the fusion polypeptide is inserted include those exemplified in the definitions of the terms above.
  • the expression vector can be constructed using, for example, known genetic engineering techniques.
  • the present disclosure provides a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid encoding the fusion polypeptide or an expression vector comprising the nucleic acid, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers include, for example, pure water such as sterile water, physiological saline, or phosphate-buffered physiological saline.
  • examples of pharmaceutically acceptable carriers include organic esters that can be introduced into the body, such as glycol, glycerol, or olive oil.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment may further contain other ingredients, such as lubricants, preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, salts for adjusting osmotic pressure, buffers, stabilizers, preservatives, excipients, antioxidants, viscosity adjusters, colorants, flavors, and sweeteners.
  • lubricants such as lubricants, preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, salts for adjusting osmotic pressure, buffers, stabilizers, preservatives, excipients, antioxidants, viscosity adjusters, colorants, flavors, and sweeteners.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment may be housed in a container, pack, dispenser, or the like together with instructions for use.
  • composition of this embodiment can be used, for example, to treat or prevent a disease associated with an intracellular antigen.
  • the pharmaceutical composition of the present disclosure is prepared by introducing a nucleic acid encoding the fusion polypeptide or an expression vector containing the nucleic acid into cells of a subject, expressing the fusion polypeptide in the cells of the subject, and controlling, i.e., suppressing or activating, preferably suppressing, the function of an antigen associated with the disease via the antigen-binding polypeptide, thereby treating or preventing the disease.
  • treatment includes alleviating or mitigating, slowing the progression of, and curing at least one symptom associated with the target disease.
  • prevention includes preventing the onset of at least one symptom associated with the target disease.
  • Organisms that can be treated and prevented include, for example, humans and non-human animals.
  • specific examples of non-human animals include vertebrates such as fish, birds, and mammals. Mammals include laboratory animals such as mice, rats, rabbits, guinea pigs, and non-human primates; pet animals such as dogs and cats; and livestock such as pigs, cows, goats, sheep, and horses.
  • Diseases that can be treated or prevented include, for example, cancer, tumors, infectious diseases (viral infections, bacterial infections, etc.), autoimmune or allergic diseases, inflammatory diseases, and neurodegenerative diseases.
  • administration route and method of the pharmaceutical composition of this embodiment are not particularly limited and can be selected appropriately depending on the target disease. It may be administered directly or indirectly to the affected area. Alternatively, cells expressing the fusion polypeptide may be administered.
  • administration routes include oral, intrathecal, intracisternal, intraventricular, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonary, and intrauterine routes, as well as local administration and methods using a gene gun.
  • the dosage and frequency of administration can be selected appropriately depending on the severity of symptoms, age, sex, weight, dosage form, specific type of disease, etc.
  • the present disclosure provides a research reagent comprising a nucleic acid encoding the above-described polypeptide or an expression vector comprising the nucleic acid.
  • the research reagent may further comprise other components in addition to the nucleic acid encoding the above-described polypeptide or the expression vector comprising the nucleic acid. For such other components, see the description of the pharmaceutical composition above.
  • the research reagent of this embodiment may be housed in a container, pack, dispenser, or the like together with instructions for use.
  • the research reagent of this embodiment can be used for functional analysis of intracellular antigens, such as polypeptides, etc.
  • an antigen-binding polypeptide for the antigen to be functionally analyzed and a fusion polypeptide of the above polypeptide are expressed intracellularly, and the function of the antigen can be controlled, preferably inhibited, thereby enabling functional analysis of the antigen.
  • target cells include human cells and non-human animal cells. More specific examples of non-human animal cells include vertebrate cells such as fish cells, bird cells, and mammalian cells. Mammalian cells include cells derived from laboratory animals such as mice, rats, rabbits, guinea pigs, and primates other than humans; pet animals such as dogs and cats; and livestock such as pigs, cows, goats, sheep, and horses.
  • the cells may be cultured cells or living cells, i.e., non-isolated cells present in a living organism.
  • Preferred examples of cells are cultured human cells, living human cells, cultured cells of a non-human animal pathology model, and living cells of a non-human animal pathology model.
  • Non-viral vectors can be introduced into target cells using methods such as electroporation, microinjection, lipofection, calcium phosphate, and DEAE-dextran.
  • Indicators of the results of inhibiting antigen function include phenotypic changes observed in cells, tissues, or individuals, and antigen function can be analyzed based on these indicators.
  • Indicators of cellular changes include phenotypic changes in cells, such as quantitative and/or qualitative changes in produced substances, changes in proliferation activity, changes in cell number, changes in morphology, changes in characteristics, and induction of apoptosis. Examples of produced substances that can be used include secreted proteins, surface antigens, intracellular proteins, mRNA, and the like.
  • Morphological changes include changes in process formation and/or the number of processes, changes in flatness, changes in elongation/aspect ratio, changes in cell size, changes in internal structure, heteromorphism/uniformity of the cell population, and changes in cell density. These morphological changes can be confirmed by microscopic observation. Changes in characteristics can include anchorage dependence, cytokine-dependent responsiveness, hormone dependence, drug resistance, cell motility, cell migration activity, pulsation, and changes in intracellular substances. Examples of cell motility include cell invasion activity and cell migration activity. Furthermore, changes in intracellular substances can be detected using enzyme activity, mRNA amount, the amount of intracellular signaling substances such as Ca2 + or cAMP, the amount of intracellular protein, etc.
  • tissue system functional changes depending on the tissue used can be used as a detection indicator.
  • tissue weight changes in tissue weight
  • changes in the blood system such as changes in blood cell count, protein amount, enzyme activity, and electrolyte amount
  • changes in the circulatory system such as changes in blood pressure and heart rate
  • Radioactivity can be measured using measuring instruments such as a gamma counter depending on the type of radiation, fluorescence polarization can be measured using a BEACON (Takara Shuzo), surface plasmon resonance signal can be measured using a BIACORE (GE Healthcare), and time-resolved fluorescence, fluorescence resonance energy transfer, and the like can be measured using an ARVO (PerkinElmer). Furthermore, flow cytometers and the like can also be used for measurement. These measurement methods may measure two or more detection indicators using a single method, and if convenient, two or more types of measurements can be performed simultaneously and/or consecutively to measure even more detection indicators. For example, fluorescence and fluorescence resonance energy transfer can be measured simultaneously using a fluorometer.
  • the research reagent of this embodiment can also be used to observe the dynamics of antigens, such as polypeptides, within cells.
  • antigens such as polypeptides
  • an antigen-binding polypeptide for the antigen to be observed dynamically and a fusion polypeptide of the above polypeptide are expressed within the cell, and the reaction between the antigen and the fusion polypeptide is detected, allowing dynamic observation of the antigen.
  • Dynamic observation of antigens includes observing the expression, localization, etc. of the antigen at a certain time or over time.
  • the reaction between the antigen and the fusion polypeptide can be detected, for example, by utilizing the fluorescence, luminescence, color development, etc. of the detection peptide contained in the fusion polypeptide.
  • the present disclosure provides a method for expressing an antigen-binding polypeptide in a cell, comprising expressing in the cell a nucleic acid encoding a fusion polypeptide between the above-mentioned polypeptide and the antigen-binding polypeptide.
  • Expression may be constitutive or transient. It may also be inducible.
  • constitutive expression a nucleic acid in which a constitutive expression promoter is linked upstream of the fusion polypeptide gene may be used.
  • transient expression for example, RNA rather than DNA may be introduced into cells for expression.
  • inducible expression a nucleic acid in which an inducible promoter is linked upstream of the fusion polypeptide gene may be used. Then, when expressing the antigen-binding polypeptide, an inducer, such as IPTG, may be introduced into the cells.
  • Target cells include those listed above under research reagents.
  • the antigen-binding polypeptide is expressed in a state fused with the above-mentioned polypeptide, i.e., as a fusion polypeptide.
  • the presence of the antigen-binding polypeptide that maintains correct folding in cells increases compared to when the antigen-binding polypeptide is expressed alone.
  • the antigen-binding ability of the antigen-binding polypeptide is improved in cells compared to when the antigen-binding polypeptide is expressed alone.
  • the expression method of this embodiment further includes the step of introducing a nucleic acid encoding the above-described fusion polypeptide into a cell.
  • the nucleic acid encoding the above-described fusion polypeptide may be introduced in the form of an expression vector. Specific introduction methods include the methods described above for research reagents. Therefore, in one embodiment, the present disclosure also provides a method for producing cells that express an antigen-binding polypeptide within the cells.
  • the production method includes the step of introducing a nucleic acid encoding the above-described fusion polypeptide or an expression vector containing the nucleic acid into the cells. In another embodiment, the present disclosure also provides a cell that expresses the above-described fusion polypeptide.
  • the present disclosure provides a kit for producing a nucleic acid encoding a fusion polypeptide comprising the above-described polypeptide and an antigen-binding polypeptide, the kit comprising a nucleic acid encoding the polypeptide.
  • the kit of this embodiment can be a general-purpose kit that can easily produce nucleic acids encoding fusion polypeptides for desired antigen-binding polypeptides.
  • the nucleic acid encoding the above-mentioned polypeptide may be incorporated into an expression vector such as the above.
  • the nucleic acid may also contain factors necessary for protein expression, such as a promoter, a ribosome binding site, and a terminator, as well as a selection marker and a restriction enzyme recognition site.
  • the kit of this embodiment may further include at least one of buffers, restriction enzymes, other necessary reagents, instruments, and instructions for use.
  • a polypeptide for improving the intracellular binding of an antigen-binding polypeptide to an antigen comprising: The polypeptide consists of 3 to 20 amino acids, and more than 57.0% but less than 100.0% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids.
  • polypeptide according to any one of (1) to (4) above wherein 66.0% to 78.0% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids.
  • (4-2) The polypeptide according to any one of (1) to (4-1) above, wherein 66.7% to 77.8% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids.
  • (5) The polypeptide according to any one of (1) to (4-2) above, wherein the N-terminus of the polypeptide is glutamic acid.
  • (6) The polypeptide according to any one of (1) to (5), wherein the polypeptide consists of acidic amino acids and neutral amino acids.
  • (11-5) The polypeptide according to any one of (11) to (11-4) above, wherein more than 0.0% and not more than 11.1% of the amino acids constituting the polypeptide are neutral amino acids.
  • X1 and X4 each independently represent a neutral amino acid or a basic amino acid
  • X2 is a D or neutral amino acid
  • X 3 is D or E
  • n1 and n2 each independently represent an integer of 0 to 3, and 0 ⁇ n1+n2 ⁇ 5.
  • polypeptide (12-1) A polypeptide for improving the intracellular binding of an antigen-binding polypeptide to an antigen,
  • the polypeptide has an amino acid sequence represented by the following general formula (I):
  • X1 and X4 each independently represent a neutral amino acid or a basic amino acid
  • X2 is a D or neutral amino acid
  • X 3 is D or E
  • n1 and n2 each independently represent an integer of 0 to 3, and 0 ⁇ n1+n2 ⁇ 5.
  • (12-2) The polypeptide according to (12) or (12-1) above, wherein X1 and X4 are each independently a neutral amino acid having a hydrophobic aliphatic group or a hydrophilic group in the side chain, or lysine.
  • (12-3) The polypeptide according to any one of (12) to (12-2) above, wherein X1 and X4 are each independently glycine, proline, serine, or lysine.
  • (12-4) The polypeptide according to any one of (12) to (12-3), wherein X2 is aspartic acid or a neutral amino acid having a hydrophobic aliphatic group or a hydrophilic group in the side chain.
  • (12-10) The polypeptide according to any one of (12) to (12-9), wherein n1 and n2 satisfy 2 ⁇ n1+n2 ⁇ 4.
  • (12-11) The polypeptide according to any one of (12) to (12-10), which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of EX 2 X 3 , a polypeptide consisting of the amino acid sequence of EX 1 DEX 2 X 3 , a polypeptide consisting of the amino acid sequence of EX 2 X 3 EX 4 D, or a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 64 to 66 and 72.
  • (12-12) The polypeptide according to any one of (12) to (12-11), which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 64 to 66 and 72.
  • X1 and X4 each independently represent a neutral amino acid or a basic amino acid;
  • X2 is a D or neutral amino acid;
  • X 3 is D or E;
  • X5 is a neutral amino acid or a basic amino acid;
  • n3 and n4 each independently represent an integer of 0 or more and 1 or less, and satisfy the relation: 1 ⁇ n3+n4 ⁇ 2.
  • polypeptide for improving the intracellular binding of an antigen-binding polypeptide to an antigen
  • the polypeptide has an amino acid sequence represented by the following general formula (II):
  • X1 and X4 each independently represent a neutral amino acid or a basic amino acid;
  • X2 is a D or neutral amino acid;
  • X 3 is D or E;
  • X5 is a neutral amino acid or a basic amino acid;
  • n3 and n4 each independently represent an integer of 0 or more and 1 or less, and satisfy the relation: 1 ⁇ n3+n4 ⁇ 2.
  • polypeptide according to any one of (1) to (13-11) above consisting of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 23 to 25, 31, 33, 34, and 40 to 42.
  • 14-1 A polypeptide for improving the intracellular antigen-binding ability of an antigen-binding polypeptide, the polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 23 to 25, 31, 33, 34, and 40 to 42.
  • 14-2 The polypeptide according to any one of (1) to (14-1) above, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25.
  • 14-3 A polypeptide for improving the intracellular binding of an antigen-binding polypeptide to an antigen, the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25.
  • a fusion polypeptide comprising the polypeptide according to any one of (1) to (14-3) above and an antigen-binding polypeptide.
  • 17-1) The fusion polypeptide according to any one of (15) to (17), wherein the antigen-binding polypeptide is VH, VHH, vNAR, or scFv.
  • (18) A nucleic acid encoding the polypeptide according to any one of (1) to (14-3) above.
  • (18-1) The nucleic acid according to (18) above, consisting of a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3 to 5, 11, 13, 14, 19, and 20 to 22.
  • (18-2) A nucleic acid encoding a polypeptide for improving the intracellular antigen-binding ability of an antigen-binding polypeptide, the nucleic acid consisting of a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3 to 5, 11, 13, 14, 19, and 20 to 22.
  • (18-3) The nucleic acid according to any one of (18) to (18-2) above, consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • (18-4) A nucleic acid encoding a polypeptide for improving the intracellular antigen-binding ability of an antigen-binding polypeptide, the nucleic acid consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • (19) An expression vector comprising the nucleic acid according to any one of (18) to (18-4) above.
  • (19-1) The expression vector according to (19) above, comprising a nucleic acid consisting of a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3 to 5, 11, 13, 14, 19, and 20 to 22.
  • (19-2) An expression vector comprising a nucleic acid encoding a polypeptide for improving the intracellular antigen-binding ability of an antigen-binding polypeptide, An expression vector, wherein the nucleic acid consists of a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 3 to 5, 11, 13, 14, 19, and 20 to 22. (19-3) The expression vector according to any one of (19) to (19-2) above, which contains a nucleic acid consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • (19-4) An expression vector comprising a nucleic acid encoding a polypeptide for improving the intracellular antigen-binding ability of an antigen-binding polypeptide, An expression vector wherein the nucleic acid consists of the base sequence represented by SEQ ID NO:5. (20) A nucleic acid encoding the fusion polypeptide according to any one of (15) to (17) above. (21) An expression vector comprising the nucleic acid according to (20) above.
  • a method for improving the intracellular binding of an antigen-binding polypeptide to an antigen comprising: expressing a nucleic acid encoding the fusion polypeptide in the cell; the fusion polypeptide comprises the antigen-binding polypeptide and a polypeptide linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide; A method in which the polypeptide consists of 3 to 20 amino acids, and more than 57.0% but less than 100.0% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids.
  • (22-1) A method for improving intracellular antigen-binding ability of an antigen-binding polypeptide, comprising: expressing a nucleic acid encoding the fusion polypeptide in the cell; The method, wherein the fusion polypeptide comprises the antigen-binding polypeptide and the polypeptide according to any one of (1) to (14-3) above linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide.
  • a method for improving the folding efficiency of an antigen-binding polypeptide in a cell comprising: expressing a nucleic acid encoding the fusion polypeptide in the cell; the fusion polypeptide comprises the antigen-binding polypeptide and a polypeptide linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide; A method in which the polypeptide consists of 3 to 20 amino acids, and more than 57.0% but less than 100.0% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids.
  • (23-1) A method for improving the folding efficiency of an antigen-binding polypeptide in a cell, comprising: expressing a nucleic acid encoding the fusion polypeptide in the cell; The method, wherein the fusion polypeptide comprises the antigen-binding polypeptide and the polypeptide according to any one of (1) to (14-3) above linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide.
  • a method for increasing the proportion of antigen-binding polypeptides that maintain correct folding in cells comprising: expressing a nucleic acid encoding the fusion polypeptide in the cell; the fusion polypeptide comprises the antigen-binding polypeptide and a polypeptide linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide; A method in which the polypeptide consists of 3 to 20 amino acids, and more than 57.0% but less than 100.0% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids.
  • (24-1) A method for increasing the proportion of antigen-binding polypeptides that maintain correct folding in cells, comprising: expressing a nucleic acid encoding the fusion polypeptide in the cell; The method, wherein the fusion polypeptide comprises the antigen-binding polypeptide and the polypeptide according to any one of (1) to (14-3) above linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide.
  • a method for treating or preventing a disease associated with an intracellular antigen comprising: expressing a nucleic acid encoding the fusion polypeptide in the cell; the fusion polypeptide comprises the antigen-binding polypeptide and a polypeptide linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide; A method in which the polypeptide consists of 3 to 20 amino acids, and more than 57.0% but less than 100.0% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids.
  • a method for treating or preventing a disease associated with an intracellular antigen comprising: expressing a nucleic acid encoding the fusion polypeptide in the cell; The method, wherein the fusion polypeptide comprises the antigen-binding polypeptide and the polypeptide according to any one of (1) to (14-3) above linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide.
  • a fusion polypeptide for the manufacture of a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with an intracellular antigen, comprising: the fusion polypeptide comprises an antigen-binding polypeptide and a polypeptide linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide;
  • the polypeptide is composed of 3 to 20 amino acids, and more than 57.0% but less than 100.0% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids.
  • a nucleic acid used for treating or preventing a disease associated with an intracellular antigen encodes a fusion polypeptide; the fusion polypeptide comprises an antigen-binding polypeptide and a polypeptide linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide; A nucleic acid wherein the polypeptide consists of 3 to 20 amino acids, and more than 57.0% but less than 100.0% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids.
  • a nucleic acid used for treating or preventing a disease associated with an intracellular antigen encodes a fusion polypeptide;
  • the fusion polypeptide is a nucleic acid comprising an antigen-binding polypeptide and the polypeptide according to any one of (1) to (14-3) above linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide.
  • nucleic acid for the manufacture of a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with an intracellular antigen, comprising: the nucleic acid encodes a fusion polypeptide; the fusion polypeptide comprises an antigen-binding polypeptide and a polypeptide linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide;
  • the polypeptide is composed of 3 to 20 amino acids, and more than 57.0% but less than 100.0% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids.
  • a method for producing a cell that expresses an antigen-binding polypeptide comprising: expressing a nucleic acid encoding the fusion polypeptide in the cell; the fusion polypeptide comprises an antigen-binding polypeptide and a polypeptide linked to the N-terminus of the antigen-binding polypeptide; A method in which the polypeptide consists of 3 to 20 amino acids, and more than 57.0% but less than 100.0% of the amino acids constituting the polypeptide are acidic amino acids. (33-1) The method according to (33) above, further comprising introducing a nucleic acid encoding the fusion polypeptide into a cell before the expression.
  • the antigen-binding polypeptide used was an Intrabody (hereinafter referred to as "Y13-259-HA") based on an anti-KRAS scFv antibody (reference: Werge TM, et al., Intracellular immunization Cloning and intracellular expression of a monoclonal antibody to the p21 ras protein, FEBS Letters 274, 193-198, 1990) tagged with an HA tag at the C-terminus (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 1; amino acid sequence: SEQ ID NO: 2).
  • an antigen-binding polypeptide that recognizes an antigen different from KRAS we used an intrabody (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 83; amino acid sequence: SEQ ID NO: 84) (hereinafter referred to as "scFv13-HA") in which an HA tag was added to the C-terminus of an anti- ⁇ -galactosidase antibody (scFv) (reference: P. Martineau et al., Expression of an Antibody Fragment at High Levels in the Bacterial Cytoplasm, J. Mol. Biol. 280, 117-127, 1998).
  • an antigen-binding polypeptide with a format different from scFv we used an Intrabody (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 85; amino acid sequence: SEQ ID NO: 86) (hereinafter referred to as "iDab#6-HA") in which an HA tag was added to the C-terminus of an anti-HRAS (G12V mutant) antibody (VH) (reference: T Tanaka et al., Tumor prevention by a single antibody domain targeting the interaction of signal transduction proteins with RAS, EMBO J. 26, 3250-3259, 2007).
  • antigen-binding polypeptides that recognize antigens other than KRAS, HRAS, and ⁇ -galactosidase and have a different format from scFv and VH
  • an intrabody (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 87; amino acid sequence: SEQ ID NO: 88)
  • BsG73-HA an intrabody
  • an intrabody (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 89; amino acid sequence: SEQ ID NO: 90)
  • enhancer-HA an intrabody in which an HA tag was attached to the C-terminus of an anti-EGFP camelid antibody (VHH (also known as nanobody); reference PDB ID: 3K1K).
  • polypeptides that improve the intracellular binding of antigen-binding polypeptides to antigens The nucleotide sequences (SEQ ID NOS: 3 to 22) and amino acid sequences (SEQ ID NOS: 23 to 42) of peptides 1 to 20 used in this example are shown in the table below. Vectors expressing antibodies in which these peptides were added to the N-terminus of an antibody consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1 were constructed and used in various studies.
  • the antigen protein recognized by Y13-259-HA was KRAS tagged with a His tag at the C-terminus (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 43, amino acid sequence: SEQ ID NO: 44) (hereinafter referred to as "KRAS-His").
  • antigen protein recognized by scFv13-HA was ⁇ -galactosidase tagged with a FLAG tag at the C-terminus (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 91; amino acid sequence: SEQ ID NO: 92) (hereinafter referred to as " ⁇ -Gal-FLAG”)
  • the antigen protein recognized by iDab#6-HA was HRAS(G12V) tagged with a FLAG tag at the C-terminus (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 93; amino acid sequence: SEQ ID NO: 94) (hereinafter referred to as "HRAS(G12V)-FLAG").
  • EGFP nucleotide sequence: SEQ ID NO: 95; amino acid sequence: SEQ ID NO: 96
  • SEQ ID NO: 95 amino acid sequence: SEQ ID NO: 95
  • Y13-259-HA (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 1)
  • peptide3 (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 5)
  • KRAS-His (nucleotide sequence: SEQ ID NO: 43) were each prepared by artificial gene synthesis and inserted into the multicloning site of pcDNA3.4 (Invitrogen) using genetic engineering techniques, to construct each expression vector.
  • each expression vector was constructed by the infusion method.
  • the sequence cloned into each expression vector was a combination of the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3 to 22 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Experiment 7 immunoprecipitation of endogenous KRAS
  • Experiment 9 immunoprecipitation of HRAS (G12V)
  • cells were cultured in 6-well plates.
  • Cells were lysed with 200 ⁇ L of RIPA buffer, and 60 ⁇ L of each prepared cell lysate was mixed with 160 ⁇ L of PBS buffer and 20 ⁇ L of anti-HA-tag magnetic agarose. After washing, in Experiment 8, 24 ⁇ L of Western blotting buffer was added to the magnetic agarose.
  • the transfection reagent was changed to FuGENE 4K Transfection Reagent (Promega), and reverse transfection was performed.
  • the washing buffer was also changed to PBS-T buffer (0.01 v/v% Tween 20).
  • the cells were reacted for 1 hour with 2500-fold diluted HA-Tag (C29F4) Rabbit Monoclonal Antibody (Cell Signaling Technology) and 5000-fold diluted 6xHis, His-Tag Monoclonal Antibody (Proteintech Group Inc.) as primary antibodies.
  • the sections were washed with Tris Buffered Saline (TBS)-T buffer (0.1 v/v% Tween 20) and then reacted with 5000-fold diluted Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Highly Cross-Adsorbed (Biotium), and 2500-fold diluted StarBright Blue 700 Goat Anti-Mouse IgG (BioRad).
  • TBS-T buffer Tris Buffered Saline
  • Biotium Highly Cross-Adsorbed
  • StarBright Blue 700 Goat Anti-Mouse IgG BioRad
  • the detection antibody was changed to increase detection sensitivity.
  • a 2,000-fold diluted anti-HA high-affinity rat antibody (MERCK) was used as the primary antibody, and a 2,000-fold diluted Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, DyLight TM 800 (Thermo Fisher Scientific) was used as the secondary antibody.
  • the primary antibodies described below and a 2,500-fold diluted StarBright Blue 700 Goat Anti-Rabbit IgG (BioRad) were used as the secondary antibody.
  • Anti-His-tag pAb (Medical and Biological Laboratories) diluted 1,000 times was used as the primary antibody to detect the target antigen KRAS-His in Experimental Example 6.
  • KRAS Polyclonal antibody 12063-1-AP (Proteintech) diluted 10,000 times was used as the primary antibody to detect intracellular KRAS, the target antigen in Experimental Example 7.
  • Anti-FLAG® rabbit antibody (MERCK) diluted 500 times was used to detect ⁇ -Gal-FLAG, the target antigen in Experimental Example 8, and HRAS(G12V ) -FLAG, the target antigen in Experimental Example 9.
  • EGFP the target antigen in Experimental Examples 10 and 11, a 2,000-fold diluted eGFP Polyclonal Antibody (CAB4211, Thermo Fisher Scientific) was used.
  • the three constructed Intrabody expression vectors and the pcDNA3.4_KRAS-His expression vector were co-transfected into 293A cells, and each Intrabody expressed in the cells was recovered by immunoprecipitation. The amounts of each Intrabody and KRAS contained in the recovered samples were compared by Western blotting.
  • the top row of Figure 1 shows a photograph and graph illustrating the results of analysis of cell lysate (sample before immunoprecipitation).
  • the top left row of Figure 1 shows a photograph illustrating the results of Western blotting evaluation of the expression of each Intrabody (solid arrow) and KRAS (dotted arrow) contained in the cell lysate before immunoprecipitation.
  • the graph in the top center of Figure 1 shows the results of comparing the ratio of expression levels of each Intrabody based on the results of Western blotting, where the brightness value of each band was normalized by the total protein amount, and the logarithmically transformed values were averaged.
  • the vertical axis of the graph shows the expression level (relative value) of the Intrabody.
  • Y13-259-HA with peptide 3 attached which has an acidic amino acid backbone (shown as “Peptide 3” or “pep3” in the figure)
  • Y13-259-HA with peptide 8 attached which has a neutral amino acid backbone (shown as "Peptide 8" or “pep8” in the figure) showed a tendency for increased intrabody expression.
  • Y13-259-HA with peptide 7 attached which has a basic amino acid backbone (shown as “Peptide 7" or “pep7” in the figure), showed no difference in expression level compared to Y13-259-HA without any peptide attached.
  • the graph on the top right of Figure 1 shows the results of comparing KRAS expression levels based on the results of Western blotting, where the brightness values of each band were normalized by the total protein amount, and the logarithmically transformed values were averaged. The values were then compared to the value when only KRAS was expressed (indicated as "KRAS Only” in the figure).
  • the vertical axis of the graph shows the expression level (relative value) of KRAS.
  • the graph on the bottom right of Figure 1 shows the results of Western blotting, where the intensity values of KRAS bound to each Intrabody after immunoprecipitation were logarithmically transformed and then averaged.
  • the amount of KRAS bound to each Intrabody was evaluated based on the amount of KRAS bound to Y13-259-HA without peptide attachment.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of KRAS bound to each Intrabody (relative value).
  • KRAS was not detectable in Y13-259-HA without peptide attachment, but the amount of KRAS dramatically increased in Y13-259-HA with peptide 3, which has an acidic amino acid backbone.
  • the upper left of Figure 2 is a photograph showing the results of Western blotting of cell lysate (sample before immunoprecipitation). As a result, it was confirmed that each Intrabody and KRAS were expressed in the cell lysate.
  • the lower left of Figure 2 is a photograph showing the results of Western blotting of the sample after immunoprecipitation.
  • KRAS Only indicates the results of expressing KRAS only
  • non-pep indicates the results of expressing Y13-259-HA without peptide attached
  • pep1 indicates the results of expressing Y13-259-HA with peptide 1 attached, and so on.
  • Y13-259-HA with peptides 1 to 3 attached had a stable and improved intracellular binding function to the antibody's target antigen compared to Y13-259-HA without peptides attached.
  • the upper left panel of Figure 3 is a photograph showing the results of Western blotting of cell lysate (sample before immunoprecipitation).
  • the lower left panel of Figure 3 is a photograph showing the results of Western blotting of the sample after immunoprecipitation.
  • the right panel of Figure 3 is a graph showing the results of logarithmic transformation and averaging of the intensity values of KRAS bound to each Intrabody in the post-immunoprecipitation sample, and comparing the amount of KRAS bound to each Intrabody with the amount of KRAS bound to Y13-259-HA tethered with peptide 15 as the standard.
  • the right side of Figure 5 shows the results of a comparative evaluation of the amount of KRAS bound to each Intrabody, calculated by logarithmically transforming and averaging the intensity values of KRAS bound to each Intrabody in the post-immunoprecipitation samples, using the amount of KRAS bound to Y13-259-HA (denoted "pep0" in Figure 5) without peptide as the standard.
  • the vertical axis of the graph shows the amount of KRAS bound to each Intrabody (relative value). The results confirmed that Y13-259-HA bound to peptides 18 to 20 bound to KRAS at a level equivalent to that of peptide 3.
  • the upper left of Figure 6 is a photograph showing the results of Western blotting of cell lysate (sample before immunoprecipitation).
  • the lower left of Figure 6 is a photograph showing the results of Western blotting of the sample after immunoprecipitation.
  • KRAS only indicates the results of expressing only KRAS-His
  • Y13-259-HA indicates the results of expressing Y13-259-HA without peptide attachment
  • pep2-Y13-259-HA indicates the results of expressing Y13-259-HA with peptide 2 attached, and so on.
  • a significant decrease in expression level was observed only in Y13-259-HA with peptide 6 attached.
  • co-expression of each intrabody and KRAS was confirmed.
  • the vertical axis of the graph shows the ratio of KRAS-His amount to each intrabody amount.
  • FIG. 7 The upper left of Figure 7 is a photograph showing the results of Western blotting of cell lysate (sample before immunoprecipitation).
  • the lower left of Figure 7 is a photograph showing the results of Western blotting of the sample after immunoprecipitation.
  • Y13-259-HA indicates the results of expressing Y13-259-HA without peptide
  • pep3-Y13-259-HA indicates the results of expressing Y13-259-HA with peptide 3
  • “mock” indicates the results of transfection with pcDNA3.4 empty vector as a negative control.
  • each intrabody was expressed in the cell lysate of Y13-259-HA and pep3-Y13-259-HA, and that intracellular KRAS was present.
  • the band indicated by the arrow and marked with "*" in the lower left of Figure 7 was thought to be a non-specific band derived from the beads used for immunoprecipitation.
  • the band indicated by the arrow and marked with "**" was thought to be a possible KRAS degradation product.
  • ratio endogenous KRAS amount/intrabody amount
  • the vertical axis of the graph shows the ratio of endogenous KRAS amount to each intrabody amount.
  • the upper left of Figure 8 is a photograph showing the results of Western blotting of cell lysate (sample before immunoprecipitation).
  • the lower left of Figure 8 is a photograph showing the results of Western blotting of the sample after immunoprecipitation.
  • scFv13-HA indicates the results of expressing scFv13-HA without peptide
  • pep3-scFv13-HA indicates the results of expressing scFv13-HA with peptide 3
  • ⁇ -Gal-FLAG only indicates the results of expressing only ⁇ -Gal-FLAG as a negative control
  • “mock” indicates the results of transfection with pcDNA3.4 empty vector as a negative control.
  • ratio ⁇ -Gal-FLAG amount/intrabody amount.
  • the vertical axis of the graph shows the ratio of ⁇ -Gal-FLAG amount to each intrabody amount.
  • the upper left of Figure 9 is a photograph showing the results of Western blotting of cell lysate (sample before immunoprecipitation).
  • the lower left of Figure 9 is a photograph showing the results of Western blotting of the sample after immunoprecipitation.
  • iDab#6-HA indicates the results of expressing iDab#6-HA without peptide
  • pep3-iDab#6-HA indicates the results of expressing iDab#6-HA with peptide 3
  • HRAS-FLAG only indicates the results of expressing only HRAS(G12V)-FLAG as a negative control
  • “mock” indicates the results of transfection with pcDNA3.4 empty vector as a negative control.
  • each intrabody and HRAS(G12V)-FLAG were expressed in the cell lysate of iDab#6-HA and pep3-iDab#6-HA.
  • ratio HRAS(G12V)-FLAG amount/intrabody amount.
  • the vertical axis of the graph shows the ratio of HRAS(G12V)-FLAG amount to each intrabody amount.
  • FIG. 10 The upper left of Figure 10 is a photograph showing the results of Western blotting of cell lysate (sample before immunoprecipitation).
  • the lower left of Figure 10 is a photograph showing the results of Western blotting of the sample after immunoprecipitation.
  • BsG73-HA indicates the result of expressing BsG73-HA without peptide
  • pep3-BsG73-HA indicates the result of expressing BsG73-HA with peptide 3
  • EGFP only indicates the result of expressing only EGFP as a negative control
  • “mock” indicates the result of transfection with pcDNA3.4 empty vector as a negative control.
  • ratio EGFP amount/intrabody amount
  • the vertical axis of the graph shows the ratio of EGFP amount to each intrabody amount.
  • FIG. 11 The upper left of Figure 11 is a photograph showing the results of Western blotting of cell lysate (sample before immunoprecipitation).
  • the lower left of Figure 11 is a photograph showing the results of Western blotting of the sample after immunoprecipitation.
  • “enhancer-HA” indicates the result of expressing enhancer-HA without peptide
  • “pep3-enhancer-HA” indicates the result of expressing enhancer-HA with peptide 3
  • EGFP only indicates the result of expressing only EGFP as a negative control
  • “mock” indicates the result of transfection with pcDNA3.4 empty vector as a negative control.
  • ratio EGFP amount/intrabody amount
  • the vertical axis of the graph shows the ratio of EGFP amount to each intrabody amount.
  • the left side of Figure 12 is a graph showing cell proliferation after transfection over time, using confluence (%) as an indicator.
  • the vertical axis of the graph represents 293A cell confluence (%), and the horizontal axis represents the time elapsed since transfection.
  • the right side of Figure 12 is a bar graph with the vertical axis representing confluence (%) 40 hours after transfection.
  • "Y13-259-HA” represents the results of expressing Y13-259-HA without peptide
  • pep2-Y13-259-HA represents the results of expressing Y13-259-HA with peptide 2 attached, and so on.
  • untreated represents the results without transfection.
  • Y13-259-HA with peptide 3 had a significantly improved effect in reducing intracellular proliferation inhibition compared to Y13-259-HA with peptide 4, peptide 5, or peptide 6.
  • Y13-259-HA with peptide 2 was confirmed to have a significantly improved effect in reducing cell proliferation inhibition compared to Y13-259-HA with peptide 5 or peptide 6. Furthermore, a tendency for intracellular proliferation inhibition to be further reduced was observed compared to Y13-259-HA with peptide 4.
  • the polypeptide of this embodiment can improve the binding ability of an antigen-binding polypeptide to an antigen within a cell.

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Abstract

ポリペプチドは、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である。融合ポリペプチドは、前記ポリペプチドと、抗原結合性ポリペプチドと、を含む。

Description

ポリペプチド及びその使用
　本開示は、ポリペプチド及びその使用に関する。本願は、２０２４年１月２９日に、日本に出願された特願２０２４－０１１１８２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ファージ抗体ディスプレイや動物免疫により細胞内のタンパク質に対して選択的な抗体を取得し、それらを細胞内で発現させて標的抗原タンパク質に作用させようとすると、多くの場合、発現した抗体自身が凝集してしまい、目的の作用が十分発揮されないことが知られている。
　また細胞内で抗体が凝集すると、目的の作用が発揮されないだけでなく、細胞毒性を引き起こす可能性もあり、治療用途として使用するためには安全性面でのリスクが高くなる懸念があることが示唆されている（例えば、非特許文献１参照）。そのため、細胞内の標的抗原タンパク質に作用する抗体を取得するためには、細胞内で機能させるための抗体エンジニアリングが必要であるが、一般的に容易に実施できるものではない。
　近年、細胞内の抗体自己凝集化を抑制可能なペプチド融合技術が報告されており、細胞内で安定な抗体の取得が可能となっている（例えば、特許文献１参照）。
国際公開第２０１９／００４２１３号
H Kabayama et al., An ultra-stable cytoplasmic antibody engineered for in vivo applications, nature communications, Vol. 11, No. 336, pp. 1-20, 2020.
　しかしながら、発明者の検討において、特許文献１等に記載のペプチドを付与した抗体を細胞内で発現させる場合、融合させる該ペプチドの種類により細胞内で発現する抗体量が大きく低下し、細胞内での目的の標的抗原タンパク質への結合効果が必ずしも十分発揮されないおそれがあることが判明している。細胞内抗体等の抗原結合性ポリペプチドを医療用途として使用するためには、細胞内での発現量は薬効レベルに影響を与える可能性が高いため、より安定的に発現し、且つ、細胞内での標的抗原タンパク質へのより優れた結合機能を維持できることが求められ、このような効果を提供し得る技術の開発が望まれている。
　本開示は、上記事情に鑑みてなされたものであって、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上することができるポリペプチドを提供する。
　すなわち、本開示は、以下の態様を含む。
　本開示の一態様に係るポリペプチドは、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である。
　上記態様のポリペプチドによれば、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上することができる。
実験例１の結果を示す図である。 実験例２の結果を示す図である。 実験例３の結果を示す図である。 実験例４の結果を示す図である。 実験例５の結果を示す図である。 実験例６の結果を示す図である。 実験例７の結果を示す図である。 実験例８の結果を示す図である。 実験例９の結果を示す図である。 実験例１０の結果を示す図である。 実験例１１の結果を示す図である。 実験例１２の結果を示す図である。
＜用語の定義＞
　本明細書において、「ポリペプチド」とは、「ペプチド」又は「タンパク質」ともいう。「ポリペプチド」は、２以上のアミノ酸がペプチド結合によって連なった化合物を意味する。ポリペプチドは、例えば、糖等によって修飾された構造を含んでもよい。ポリペプチドを構成するアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、天然に存在するアミノ酸と同様に機能することができる、天然に存在するアミノ酸の既知の類似体であってもよい。アミノ酸としては、Ｌ－アミノ酸であってもよく、Ｄ－アミノ酸であってもよい。
　本明細書において、「酸性アミノ酸」とは、等電点が３．９以下のアミノ酸を意味する。酸性アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、天然に存在するアミノ酸の既知の類似体であってもよい。天然に存在する酸性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）等が挙げられる。
　本明細書において、「塩基性アミノ酸」とは、等電点が７．４以上のアミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、天然に存在するアミノ酸の既知の類似体であってもよい。天然に存在する塩基性アミノ酸としては、例えば、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）等が挙げられる。
　本明細書において、「中性アミノ酸」とは、上記酸性アミノ酸及び上記塩基アミノ酸以外のアミノ酸を意味する。すなわち、中性アミノ酸は、等電点が３．９超７．４未満のアミノ酸を意味する。中性アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、天然に存在するアミノ酸の既知の類似体であってもよい。天然に存在する中性アミノ酸としては、例えば、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）等が挙げられる。
　本明細書において、「抗原」とは、抗原結合性ポリペプチドが結合することができる任意の分子を意味する。抗原として具体的には、例えば、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、これらの一部、及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。抗原は、合成で作製されてもよく、生物学的サンプルに由来していてもよい。このような生物学的サンプルとしては、例えば、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞、又は他の生物学的成分、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、殺傷若しくは不活性化された全細胞若しくは細胞溶解物を含む液等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「抗原結合性ポリペプチド」とは、抗原（標的分子）に対して特異的に結合するポリペプチドを意味する。抗原結合性ポリペプチドは、抗原結合能を有する領域の全て又は一部分の領域を有するものである。抗原結合性ポリペプチドとしては、例えば、抗体及びその抗原結合断片、ペプチドアプタマー等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「抗体」は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体としては、天然型抗体又は遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体であってよい。天然型抗体は、特に限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、サル、ヤギ、ウサギ、ラクダ、ラマ、ウシ及びニワトリ等を含む、生物種に由来し得る。遺伝子組換え技術を用いて製造される抗体としては、特に限定はされないが、天然型抗体をもとに作製される合成抗体、組換え抗体、及び変異導入抗体等が挙げられる。既に遺伝子組換え技術を用いて製造された抗体に対して、上述のように天然型抗体を遺伝子改変する場合と同様の改変を施した抗体も含まれる。モノクローナル抗体は、多重特異性抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　Ｆｖ）、ｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ＶＨ、ＶＬ、Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ、ミニボディ、ナノボディ（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ｏｆ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＶＨＨ）、ｖＮＡＲ、ダイアボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体の全長又はその一部等を含む。
　本明細書において、「Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ」とは、細胞内で抗原に対して特異的に結合する抗体（細胞内抗体）を意味する。
　本明細書において、「核酸」とは、「ヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」ともいう。核酸は、特に明記しない限り、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を包含する。
　本明細書において、「発現ベクター」とは、制御配列と制御配列に作動可能に連結したタンパク質をコードする核酸を含み、細胞内で、又は、試験管内で、当該タンパク質をコードするｍＲＮＡを転写させることができるベクターを意味する。発現ベクターは、例えば、細胞中で複製するための複製起点、及び制御配列と制御配列に作動可能に連結したタンパク質をコードする核酸を含み得る。発現ベクターは、これを導入された細胞を選択するための選択マーカー、例えば、薬剤耐性遺伝子を有することができる。
　哺乳動物細胞で発現させるための制御配列としては、特に限定されないが例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーターが挙げられ、例えば、ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）　ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ＳＶ４０　ｅａｒｌｙ、ＳＶ４０　ｌａｔｅ、レトロウイルスのＬＴＲ、メタロチオネインＩ等のプロモーター等が挙げられる。
　大腸菌で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ラムダＰＬ、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ等のプロモーターが挙げられる。
　試験管内で発現させるためのプロモーターとしては、特に限定されないが、例えば、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３プロモーター等が挙げられる。
　発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、人工染色体、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター等が挙げられる。
＜細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチド＞
　本実施形態のポリペプチドは、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドである。本実施形態のポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなる。本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である。
　発明者らは、後述する実験例６に示すように、細胞内の抗体安定性を高めることが知られている、特許文献１等に記載のポリペプチドを抗原性ポリペプチドのＮ末端に付与した融合ポリペプチドにおいて、細胞内での発現量が著しく低く、結果として、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの機能を十分に発揮できないという課題を見出した。
　一方、リボソームのＡサイトに「Ｅ」、Ｐサイトに「Ｐ」、「Ｇ」又は「Ｄ」、Ｅサイトに「Ｅ」又は「Ｄ」などがある場合にリボソームストールに影響が大きいことや、ＤＥ／Ｐモチーフを有すること、及び／又は、Ｎ末端に分子サイズの小さいアミノを有することで、リボソームの翻訳が不安定化することが知られている（参考文献１:「K Chyzynska et al., “Deep conservation of ribosome stall sites across RNA processing genes.”, NAR Genomics and Bioinformatics, Vol. 3, Issue 2, 2021, pp.1-26.」参照）。
　発明者は、参考文献１の記載から、酸性アミノ酸が連続し、且つ、２１個以上と比較的長いアミノ酸からなるポリペプチドは、リボソームの翻訳が不安定化し、その結果、細胞内の抗原結合性ポリペプチドの発現レベルが大きく低下してしまうため、細胞内の抗体の凝集抑制という観点ではよいが、医療用途という観点では適切ではないとの仮説を立てた。
　医療用途としてＩｎｔｒａｂｏｄｙ等の抗原結合性ポリペプチドを利用する場合に、細胞内での該抗原結合性ポリペプチドの発現量は薬効に関わることから、細胞内で安定的に発現し、且つ、標的抗原への結合能を向上させる技術の開発が求められている。
　上記課題及び上記仮説に基づき、鋭意検討した結果、発明者は、酸性アミノ酸（Ｅ及びＤ）を主骨格とするアミノ酸配列からなり、且つ、特定の構成を有するポリペプチドを抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に付与することで、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの発現レベルを大きく低下することなく、かつ細胞内での標的抗原への結合性を向上できることを見出し、本実施形態のポリペプチドを完成するに至った。
　本実施形態のポリペプチドを抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に付与することで、細胞内で本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドが発現する際に、リボソームの翻訳速度がわずかに制御され、抗原結合性ポリペプチドのフォールディング効率が向上し、細胞内で正しいフォールディングを維持した抗原結合性ポリペプチドの存在率が増加する。その結果、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性が向上すると推察される。
　本実施形態のポリペプチドは、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの翻訳速度を制御し、抗原結合性ポリペプチドのフォールディング効率を向上させるためのポリペプチドということもできる。或いは、本実施形態のポリペプチドは、細胞内で正しいフォールディングを維持した抗原結合性ポリペプチドの存在率を向上させるためのポリペプチドということもできる。
　但し、本実施形態のポリペプチドにおける細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性向上のメカニズムは、上記メカニズムに限定されない。
　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性の向上は、例えば、以下の方法で評価することができる。すなわち、まず、抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に本実施形態のポリペプチドを付与したものをコードする核酸を含む発現ベクターと、本実施形態のポリペプチドを付与していない、抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸のみを含む発現ベクターを準備して、これら発現ベクターをそれぞれ細胞に導入し、細胞内で発現させる。次いで、抗原結合性ポリペプチドを免疫沈降法で回収し、抗原結合性ポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドに結合していた細胞内標的抗原量を、ウエスタンブロッティング法を用いて検出する。次いで、本実施形態のポリペプチドを付与したものと付与していないもので、検出された抗原結合性ポリペプチドあたりの細胞内標的抗原量を比較し、本実施形態のポリペプチドを付与したものが、本実施形態のポリペプチドを付与していないものよりも細胞内標的抗原との結合量が増加しているか否かを確認することで、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性の向上の有無を評価することができる。
　例えば、本実施形態のポリペプチドをＮ末端に付与した抗原結合性ポリペプチドの細胞内標的抗原への結合量は、本実施形態のポリペプチドを付与していない抗原結合性ポリペプチドの細胞内標的抗原への結合量の、例えば１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍及びそれ以上とすることができ、これに限定されない。
　また、後述する実験例１２に示すように、抗原性ポリペプチドを発現させた細胞では、抗原性ポリペプチドを発現させていない細胞と比較して、細胞増殖が抑制されるが、本実施形態のポリペプチドを抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に付与した融合ポリペプチドは、抗原性ポリペプチド単体を細胞内で発現させた場合と比較して、細胞増殖の抑制を低減することができる。さらに、細胞内の抗体安定性を高めることが知られている、特許文献１等に記載のポリペプチドを抗原性ポリペプチドのＮ末端に付与した融合ポリペプチドを細胞内で発現させた場合と比較して、本実施形態のポリペプチドを抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に付与した融合ポリペプチドは、細胞増殖の抑制を低減することができる。すなわち、本実施形態のポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドの細胞内での発現に際して、細胞増殖抑制を低減させる効果を付与することができるともいえる。
　細胞増殖抑制の低減効果は、例えば、以下の方法で評価することができる。すなわち、まず、抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に本実施形態のポリペプチドを付与したものをコードする核酸を含む発現ベクターと、本実施形態のポリペプチドを付与していない、抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸のみを含む発現ベクターを準備して、これら発現ベクターをそれぞれ細胞に導入し、細胞内で発現させる。また対照として、ベクターを導入していない未処理の細胞を準備する。次いで、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ　Ｓ３（ザルトリウス）を用いて、各細胞を経時的に撮像しながら培養する。培養開始から４０時間経過後にＩｎｃｕｃｙｔｅ解析モジュールを用いて、培養容器中の細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）を算出する。次いで、本実施形態のポリペプチドを付与したものと付与していないもので、培養開始から４０時間経過後の細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）を比較し、本実施形態のポリペプチドを付与したものが、本実施形態のポリペプチドを付与していないものよりも細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）が多いか否かを確認することで、細胞増殖抑制の低減効果の有無を評価することができる。また、ベクターを導入していない未処理の細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）に対する細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）の減少率について、本実施形態のポリペプチドを付与したものでは、本実施形態のポリペプチドを付与していないものよりも減少率が少ないか否かを確認することで、細胞増殖抑制の低減効果の有無を評価することができる。
　例えば、本実施形態のポリペプチドを抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に付与した融合ポリペプチドを細胞内で発現させた細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）は、抗原性ポリペプチド単体を細胞内で発現させた細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）の、例えば１．１倍、１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍及びそれ以上とすることができ、これに限定されない。
　また、例えば、本実施形態のポリペプチドを抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に付与した融合ポリペプチドを細胞内で発現させた細胞において、未処理の細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ　Ｘ（％）に対する細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ　Ｙ（％）の減少率｛（１－Ｙ／Ｘ）×１００（％）｝は、例えば４０％、３０％、２０％、１０％及びそれ以下とすることができ、これに限定されない。
　以下、本実施形態のポリペプチドについて詳細を説明する。
　本実施形態のポリペプチドは、３個以上、好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上、さらにより好ましくは６個以上、さらに好ましくは７個以上、よりさらに好ましくは８個以上、特に好ましくは９個以上のアミノ酸からなる。一方、本実施形態のポリペプチドは、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下のアミノ酸からなる。
　本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸の数が上記下限値以上、上記上限値以下であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドの細胞内での発現レベルを大きく低下させることなく細胞内標的抗原との結合性を向上させることができる。一方で、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸の数が下限値未満であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドの細胞内標的との結合性が低下する。また、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸の数が上限値超であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドの細胞内での発現レベルが低下するリスクが向上する。よって、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸の数が上記数値範囲内であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドが細胞内での発現量を大きく低下させることなく、かつ細胞内で正しいフォールディングを維持した抗原結合性ポリペプチドの存在率が増加し、その結果、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させることができる。
　すなわち、本実施形態のポリペプチドは、例えば、３個以上２０個以下、４個以上２０個以下、５個以上２０個以下、６個以上２０個以下、７個以上２０個以下、８個以上２０個以下、９個以上２０個以下のアミノ酸からなる。
　また、本実施形態のポリペプチドは、例えば、３個以上１９個以下、４個以上１９個以下、５個以上１９個以下、６個以上１９個以下、７個以上１９個以下、８個以上１９個以下、９個以上１９個以下のアミノ酸からなる。
　また、本実施形態のポリペプチドは、例えば、３個以上１８個以下、４個以上１８個以下、５個以上１８個以下、６個以上１８個以下、７個以上１８個以下、８個以上１８個以下、９個以上１８個以下のアミノ酸からなる。
　また、本実施形態のポリペプチドは、例えば、３個以上１７個以下、４個以上１７個以下、５個以上１７個以下、６個以上１７個以下、７個以上１７個以下、８個以上１７個以下、９個以上１７個以下のアミノ酸からなる。
　また、本実施形態のポリペプチドは、例えば、３個以上１６個以下、４個以上１６個以下、５個以上１６個以下、６個以上１６個以下、７個以上１６個以下、８個以上１６個以下、９個以上１６個以下のアミノ酸からなる。
　また、本実施形態のポリペプチドは、例えば、３個以上１５個以下、４個以上１５個以下、５個以上１５個以下、６個以上１５個以下、７個以上１５個以下、８個以上１５個以下、９個以上１５個以下のアミノ酸からなる。
　また、本実施形態のポリペプチドは、例えば、３個以上１４個以下、４個以上１４個以下、５個以上１４個以下、６個以上１４個以下、７個以上１４個以下、８個以上１４個以下、９個以上１４個以下のアミノ酸からなる。
　また、本実施形態のポリペプチドは、例えば、３個以上１３個以下、４個以上１３個以下、５個以上１３個以下、６個以上１３個以下、７個以上１３個以下、８個以上１３個以下、９個以上１３個以下のアミノ酸からなる。
　また、本実施形態のポリペプチドは、例えば、３個以上１２個以下、４個以上１２個以下、５個以上１２個以下、６個以上１２個以下、７個以上１２個以下、８個以上１２個以下、９個以上１２個以下のアミノ酸からなる。
　また、本実施形態のポリペプチドは、例えば、３個以上１１個以下、４個以上１１個以下、５個以上１１個以下、６個以上１１個以下、７個以上１１個以下、８個以上１１個以下、９個以上１１個以下のアミノ酸からなる。
　また、本実施形態のポリペプチドは、例えば、３個以上１０個以下、４個以上１０個以下、５個以上１０個以下、６個以上１０個以下、７個以上１０個以下、８個以上１０個以下、９個以上１０個以下のアミノ酸からなる。
　中でも、本実施形態のポリペプチドは、好ましくは９個以上２０個以下、より好ましくは９個以上１８個以下、さらに好ましくは９個以上１５個以下、特に好ましくは９個以上１２個以下、最も好ましくは９個のアミノ酸からなる。
　本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸としては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。中でも、本実施形態のポリペプチドは、好ましくはＬ－アミノ酸からなる。
　本実施形態のポリペプチドは、主骨格が酸性アミノ酸からなる。具体的には、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸の、５７．０％超１００．０％未満、好ましくは６０．０％以上９０．０％以下、より好ましくは６５．０％以上８０．０％以下、さらに好ましくは６６．０％以上７８．０％以下であり、特に好ましくは６６．７％以上７７．８％以下が酸性アミノ酸である。
　本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対する酸性アミノ酸の割合が上記下限値超又は上記下限値以上であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドの細胞内標的抗原との結合性を向上させることができる。一方で、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸の数が上記上限値未満又は上記上限値以下であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドの細胞内での発現レベルを大きく低下させることなく細胞内標的との結合性が向上する。よって、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対する酸性アミノ酸の割合が上記数値範囲内であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドが細胞内での発現量を大きく低下させることなく、かつ細胞内で正しいフォールディングを維持した抗原結合性ポリペプチドの存在率が増加し、その結果、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させることができる。
　なお、本明細書において、ポリペプチドを構成するアミノ酸に対する特定のアミノ酸の割合は、ポリペプチドに含まれる特定のアミノ酸の個数を、ポリペプチドを構成するアミノ酸の合計個数で除した値に１００を乗じて、百分率（％）として表したものである。
　本実施形態のポリペプチドを構成する酸性アミノ酸としては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。中でも、本実施形態のポリペプチドは、好ましくはＮ末端がグルタミン酸である。
　本実施形態におけるポリペプチドは、好ましくは酸性アミノ酸及び中性アミノ酸からなる。
　本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸の、０．０％超４０．０％以下、好ましくは１０．０％以上４０．０％以下、より好ましくは２０．０％以上３５．０％以下、さらに好ましくは２２．０％以上３４．０％以下、特に好ましくは２２．２％以上３３．３％以下が中性アミノ酸である。
　本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸の割合が上記下限値以上であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドの細胞内での発現レベルを大きく低下させることなく細胞内標的抗原との結合性を向上させることができる。一方で、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸の割合が上記上限値以下であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドの細胞内標的との結合性が向上する。よって、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸の割合が上記数値範囲内であることで、細胞内で正しいフォールディングを維持した抗原結合性ポリペプチドの存在率が増加し、その結果、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性をより向上させることができる。
　本実施形態のポリペプチドを構成する中性アミノ酸としては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。中でも、中性アミノ酸としては、好ましくは中性アミノ酸の側鎖が疎水性脂肪族基又は親水性基であり、より好ましくはプロリン、グリシン又はセリンであり、特に好ましくはプロリンである。
　本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸の、好ましくは０．０％以上４０．０％以下、より好ましくは１０．０％以上４０．０％以下、さらに好ましくは２０．０％以上３５．０％以下、特に好ましくは２２．０％以上３４．０％以下、最も好ましくは２２．２％以上３３．３％以下がプロリンである。
　本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対するプロリンの割合が上記下限値以上であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドの細胞内での発現レベルを大きく低下させることなく細胞内標的抗原との結合性を向上させることができる。一方で、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対するプロリンの割合が上記上限値以下であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドの細胞内標的との結合性が向上する。よって、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対するプロリンの割合が上記数値範囲内であることで、細胞内で正しいフォールディングを維持した抗原結合性ポリペプチドの存在率が増加し、その結果、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性をより向上させることができる。
　或いは、他の好ましい実施形態におけるポリペプチドは、酸性アミノ酸に加えて、塩基性アミノ酸を更に含む。本実施形態のポリペプチドは、酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸からなってもよく、酸性アミノ酸、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸からなってもよい。
　本実施形態のポリペプチドを構成する酸性アミノ酸としては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。中でも、本実施形態のポリペプチドは、好ましくはＮ末端がグルタミン酸である。
　本実施形態のポリペプチドを構成する中性アミノ酸としては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。中でも、中性アミノ酸としては、好ましくは中性アミノ酸の側鎖が疎水性脂肪族基又は親水性基であり、より好ましくはプロリン、グリシン又はセリンであり、特に好ましくはプロリンである。
　本実施形態のポリペプチドを構成する塩基性アミノ酸としては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。中でも、塩基性アミノ酸としては、好ましくはリシンである。
　すなわち、本実施形態のポリペプチドは、好ましくは塩基性アミノ酸を更に含み、且つ、前記塩基性アミノ酸がリシンである。或いは、本実施形態のポリペプチドは、好ましくは酸性アミノ酸、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸からなり、前記酸性アミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、前記中性アミノ酸がプロリンであり、前記塩基性アミノ酸がリシンである。或いは、本実施形態のポリペプチドは、好ましくは酸性アミノ酸、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸からなり、前記酸性アミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、前記中性アミノ酸がプロリンであり、前記塩基性アミノ酸がリシンであり、且つ、Ｎ末端がグルタミン酸である。或いは、本実施形態のポリペプチドは、好ましくは酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸からなり、前記酸性アミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、前記塩基性アミノ酸がリシンである。或いは、本実施形態のポリペプチドは、好ましくは酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸からなり、前記酸性アミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、前記塩基性アミノ酸がリシンであり、且つ、Ｎ末端がグルタミン酸である。
　本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の合計割合は、好ましくは１０．０％以上４０．０％以下、より好ましくは２０．０％以上３５．０％以下、さらに好ましくは２２．０％以上３４．０％以下、特に好ましくは２２．２％以上３３．３％以下である。
　本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の合計割合が上記下限値以上であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドの細胞内での発現レベルを大きく低下させることなく細胞内標的抗原との結合性を向上させることができる。一方で、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の合計割合が上記上限値以下であることで、本実施形態のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドの細胞内標的との結合性が向上する。よって、本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の合計割合が上記数値範囲内であることで、細胞内で正しいフォールディングを維持した抗原結合性ポリペプチドの存在率が増加し、その結果、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性をより向上させることができる。
　本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸の、好ましくは０．０％以上１１．１％以下が、中性アミノ酸、特に好ましくはプロリンである。本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸、好ましくはプロリンの割合が上記数値範囲内であることで、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性をより向上させることができる。
　本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸の、好ましくは１１．１％以上２２．２％以下が、塩基性アミノ酸、特に好ましくはリシンである。本実施形態のポリペプチドを構成するアミノ酸に対する塩基性アミノ酸、好ましくはリシンの割合が上記数値範囲内であることで、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性をより向上させることができる。
　より好ましい実施形態におけるポリペプチドとしては、例えば、以下の一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「ポリペプチド（Ｉ）」と称する場合がある）が挙げられる。
　一般式（Ｉ）中、
　Ｘ１及びＸ４はそれぞれ独立に中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；
　Ｘ２はＤ又は中性アミノ酸；
　Ｘ３はＤ又はＥ;
　ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０以上３以下の整数であり、且つ、０≦ｎ１＋ｎ２≦５である。
　Ｘ１及びＸ４における中性アミノ酸としては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。
　Ｘ１及びＸ４における塩基性アミノ酸としては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。
　すなわち、一般式（Ｉ）におけるＸ１及びＸ４はそれぞれ独立に、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）からなる群より選ばれる中性アミノ酸、又は、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、及びアルギニン（Ｒ）からなる群より選ばれる塩基性アミノ酸である。中でも、一般式（Ｉ）におけるＸ１及びＸ４はそれぞれ独立に、好ましくは側鎖が疎水性脂肪族基若しくは親水性基である中性アミノ酸又はＫ、より好ましくはＧ、Ｐ、Ｓ又はＫである。
　一般式（Ｉ）において、ｎ１が２以上の場合に、複数存在するＸ１はそれぞれ同一であってもよく、或いは異なっていてもよい。
　一般式（Ｉ）において、ｎ２が２以上の場合に、複数存在するＸ４はそれぞれ同一であってもよく、或いは異なっていてもよい。
　Ｘ２における中性アミノ酸としては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。
　すなわち、一般式（Ｉ）におけるＸ２はＤ、又は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）からなる群より選ばれる中性アミノ酸である。中でも、一般式（Ｉ）におけるＸ２は好ましくはＤ又は側鎖が疎水性脂肪族基若しくは親水性基である中性アミノ酸、より好ましくはＤ、Ｇ、Ｐ、又はＳであり、さらに好ましくはＤである。
　一般式（Ｉ）において、Ｘ３はＥであることが好ましい。
　ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に、好ましくは０以上３以下の整数であり、且つ、０≦ｎ１＋ｎ２≦４であり、より好ましくは０以上３以下の整数であり、且つ、１≦ｎ１＋ｎ２≦４であり、さらに好ましくは０以上３以下の整数であり、且つ、２≦ｎ１＋ｎ２≦４である。
　好ましいポリペプチド（Ｉ）としては例えば、以下の表に示すものが挙げられる。なお、これらは好ましいポリペプチド（Ｉ）の一例であって、これらに限定されない。
　中でも、好ましいポリペプチド（Ｉ）としては、ＥＸ２Ｘ３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＥＸ１ＤＥＸ２Ｘ３のアミノ酸配列からなるポリペプチド若しくはＥＸ２Ｘ３ＥＸ４Ｄのアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号６４～６６、７２のいずれかに表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、より好ましいポリペプチド（Ｉ）としては、配列番号６４～６６、７２のいずれかに表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
　或いは、他のより好ましい実施形態におけるポリペプチドとしては、例えば、以下の一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（以下、「ポリペプチド（ＩＩ）」と称する場合がある）が挙げられる。
　一般式（ＩＩ）中、
　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は上記一般式（Ｉ）におけるものと同じであり、
　Ｘ５は中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；
　ｎ３及びｎ４はそれぞれ独立に０以上１以下の整数であり、且つ、関係式：１≦ｎ３＋ｎ４≦２を満たす。
　Ｘ５における中性アミノ酸としては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。
　Ｘ５における塩基性アミノ酸としては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。
　すなわち、一般式（ＩＩ）におけるＸ５は、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）からなる群より選ばれる中性アミノ酸、又は、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、及びアルギニン（Ｒ）からなる群より選ばれる塩基性アミノ酸である。中でも、一般式（ＩＩ）におけるＸ５は、好ましくは側鎖が疎水性脂肪族基又は親水性基である中性アミノ酸又はＫ、より好ましくはＧ、Ｐ、Ｓ又はＫである。
　ｎ３及びｎ４はそれぞれ独立に、好ましくは１であり、且つ、ｎ３＋ｎ４＝２である。
　中でも、好ましいポリペプチド（ＩＩ）は、配列番号８２に表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
　さらに好ましい実施形態におけるポリペプチドとして具体的には、例えば、以下の表に示すものが挙げられるが、これらに限定されない。
　中でも、本実施形態のポリペプチドとして、好ましくは配列番号２３～２５、３１、３３、３４及び４０～４２のいずれかに表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。また、本実施形態のポリペプチドとして、特に好ましくは配列番号２５に表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
［ポリペプチドをコードする核酸］
　一実施形態において、本開示は、上記ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
　本実施形態の核酸は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、及びＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド分子のいずれであってもよい。また、本実施形態の核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
　本実施形態の核酸は、公知の遺伝子工学的手法又は化学合成方法等によって調製され得る。本実施形態の核酸の具体的な塩基配列は、上記ポリペプチドのアミノ酸配列、好ましくはＥＸ２Ｘ３のアミノ酸配列、ＥＸ１ＤＥＸ２Ｘ３のアミノ酸配列若しくはＥＸ２Ｘ３ＥＸ４Ｄのアミノ酸配列又は配列番号６４～６６、７２、８２のいずれかに表されるアミノ酸配列、より好ましくは配列番号２３～２５、３１、３３、３４及び４０～４２のいずれかに表されるアミノ酸配列から、例えばコドン表を参照して、当業者は容易に設計することができる。
　好ましいポリペプチドをコードする核酸として具体的には、例えば、以下の表に示すものが挙げられる。
　中でも、本実施形態のポリペプチドをコードする核酸としては、好ましくは配列番号３～５、１１、１３、１４、１９及び２０～２２のいずれかに表される塩基配列からなる核酸である。また、本実施形態のポリペプチドをコードする核酸としては、特に好ましくは配列番号５に表される塩基配列からなる核酸である。
＜融合ポリペプチド＞
　本実施形態の融合ポリペプチドは、上記ポリペプチドと、抗原結合性ポリペプチドと、を含む。或いは、本実施形態の融合ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドと、抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に付与された上記ポリペプチドと、を含むということもできる。
　本実施形態の融合ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に上記ポリペプチドが付与されていることで、細胞内で正しいフォールディングを維持した抗原結合性ポリペプチドの存在率が増加し、その結果、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性をより向上させることができる。
［抗原結合性ポリペプチド］
　抗原結合性ポリペプチドとしては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。
　なお、細胞内は細胞外に比べて還元的な状態にあるため、構造形成にジスルフィド結合の形成を必要とする通常の抗体は発現しにくいことが知られている。よって、抗原結合性ポリペプチドは、好ましくは上記還元的な細胞内環境でも安定的に発現し作用するものである。よって、中でも、抗原結合性ポリペプチドは、好ましくは細胞内の特定の抗原に対するモノクローナル抗体であり、より好ましくは細胞内の特定の抗原に対する抗体が有する１種以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むものである。そのような抗体として具体的には、例えば、任意のモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含むものである。好ましくは、これらのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又はこれら全てを含むものである。
　中でも、好ましい抗原結合性ポリペプチドとして、特定の抗原に対する、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ｖＮＡＲ、Ｆａｂが挙げられる。
［その他のポリペプチド］
　本実施形態の融合ポリペプチドは、該融合ポリペプチドのＣ末端に、その他のポリペプチドを更に含んでもよい。本実施形態の融合ポリペプチドにおいて、上記抗原結合性ポリペプチドとその他のポリペプチドの間には、１個以上１０個以下程度のアミノ酸からなるリンカー配列を含んでもよい。リンカー配列としては、例えば、１個以上１０個以下程度、好ましくは２個以上５個以下程度のグリシンからなるリンカー配列等が挙げられるが、これらに限定されない。
　なお、本実施形態の融合ポリペプチドを医薬用途で用いる場合には、その他のポリペプチドの中でも薬学的に許容されるポリペプチドを用いるか、或いは、その他ポリペプチドを含まないことが好ましい。
　その他のポリペプチドとしては、例えば、精製タグペプチド、検出用ペプチド、分解促進ペプチド、Ｎｅｈ２ドメインペプチド、ストレス応答性分解ペプチド、薬剤結合性ペプチド等が挙げられる。
　精製タグペプチドとしては、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ等の公知のタグペプチドが挙げられる。
　検出用ペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、蛍光タンパク質、反応により光の放出や色の変化を生じる酵素等が挙げられるが、これらに限定されない。
　蛍光タンパク質としては、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、Ｃｙｐｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ，ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＫＯ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍｃｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ａｚａｌｅａ、ｍＰｌｕｍ、ｍＡＧ、Ｋａｅｄｅ、Ｄｒｏｎｐａ、Ｋｅｉｍａ、ＫｉｋＧ、ＫｉｋＧＲ、ＵｎａＧ等が挙げられるが、これらに限定されない。
　反応により光の放出や色の変化を生じる酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ－ス－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ等などが挙げられるが、これらに限定されない。
　分解促進ペプチドとしては、ＨＳＣ７０結合ペプチド、ＸＩＡＰ　ＲＩＮＧドメインペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
　Ｎｅｈ２ドメインペプチドとしては、Ｎｒｆ２由来のペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ストレス応答性分解ペプチドとしては、Ｈｉｆ１α由来のペプチドに代表される酸素依存性分解ドメイン等が挙げられるが、これらに限定されない。
［融合ポリペプチドをコードする核酸］
　一実施形態において、本開示は、上記融合ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
　上記融合ポリペプチドをコードする核酸は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、及びＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド分子のいずれであってもよい。また、上記融合ポリペプチドをコードする核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。
　上記融合ポリペプチドをコードする核酸は、公知の遺伝子工学的手法又は化学合成方法等によって調製され得る。本実施形態の核酸の具体的な塩基配列は、上記融合ポリペプチドのアミノ酸配列から、例えばコドン表を参照して、当業者は容易に設計することができる。
　なお、上記融合ポリペプチドをコードする核酸において、上記ポリペプチドをコードする核酸と、上記抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸との間や、上記抗原結合性ポリペプチドをコードする核酸と、上記その他のポリペプチドをコードする核酸との間に、１個以上数個以下の塩基からなる非コード核酸を含んでもよい。非コード核酸に含まれる塩基は、例えば、１個以上１００個以下、１個以上５０個以下、１個以上３０個以下、１個以上１０個以下とすることができる。
＜発現ベクター＞
　本実施形態の発現ベクターは、上記ポリペプチドをコードする核酸を含む。
　或いは、他の実施形態における発現ベクターは、上記融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。
　本実施形態において、上記ポリペプチドをコードする核酸又は上記融合ポリペプチドをコードする核酸が挿入される発現ベクターとしては、上記用語の定義で例示されたものが挙げられる。
　発現ベクターの構築は、例えば、公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。
＜医薬組成物＞
　一実施形態において、本開示は、上記融合ポリペプチドをコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物を提供する。
　薬学的に許容される担体としては、例えば、本実施形態の医薬組成物が水溶液として形成される場合、滅菌水等の純水、生理食塩液、又はリン酸緩衝生理食塩液等が挙げられる。本実施形態の医薬組成物が他の適切な溶液として形成される場合、生体内に導入されることができる有機エステル、例えばグリコール、グリセロール、又はオリーブ油等が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物は、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調整用の塩類、緩衝剤、安定剤、保存剤、賦形剤、抗酸化剤、粘度調整剤、着色剤、香味料、甘味料等の他の成分を更に含むことができる。
　本実施形態の医薬組成物は、使用説明書と共に、容器、パック、又はディスペンサー等に収容されてもよい。
［医薬用途］
　本実施形態の医薬組成物は、例えば、細胞内の抗原が関連する疾患を治療又は予防するために用いることができる。
　一実施形態において、本開示の医薬組成物は、上記融合ポリペプチドをコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターを対象の細胞に導入し、対象の細胞内で上記融合ポリペプチドを発現させて、抗原結合性ポリペプチドにより疾患に関連する抗原の機能を制御、すなわち、抑制又は活性化、好ましくは抑制し、疾患を治療又は予防するものである。
　「治療」の一側面には、対象となる疾患に関連する少なくとも１つの症状について、軽減若しくは緩和すること、進行を遅延すること、及び治癒すること等が包含される。「予防」の一側面には、対象となる疾患に関連する少なくとも１つの症状について発症を防止すること等が包含される。
　治療及び予防の対象となる生物としては、例えば、ヒト及び非ヒト動物が挙げられる。非ヒト動物としてより具体的には、魚類、鳥類及び哺乳類等の脊椎動物が挙げられる。哺乳類としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ及びネコ等の愛玩動物（ペット）；ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ及びウマ等の家畜が挙げられる。
　治療又は予防される疾患としては、例えば、がん、腫瘍、感染性疾患（ウイルス感染、細菌感染等）、自己免疫疾患又はアレルギー疾患、炎症性疾患、神経変性疾患等が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物の投与経路及び投与方法は特に限定されず、対象とする疾患に応じて適宜選択することができる。患部に直接投与してもよく、間接的に投与してもよい。また、上記融合ポリペプチドを発現させた細胞を投与することでもよい。一例において、投与経路としては、例えば、経口、髄腔内、大槽内、脳室内、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内及び子宮内等の経路が挙げられ、局所投与、遺伝子銃を用いる方法等も挙げられる。
　用量及び投与回数は、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、疾患の具体的な種類等に応じて適宜選択することができる。
＜研究用試薬＞
　一実施形態において、本開示は、上記ポリペプチドをコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターを備える研究用試薬を提供する。研究用試薬は、上述のポリペプチドをコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクター以外の他の成分をさらに含んでいてもよい。当該他の成分は、上述の医薬組成物で説明したものを参照可能である。
　本実施形態の研究用試薬は、使用説明書と共に、容器、パック、又はディスペンサー等に収容されてもよい。
［研究ツールとしての利用方法］
　本実施形態の研究用試薬は、細胞内における抗原、例えば、ポリペプチド等の機能解析に用いることができる。一例において、機能解析の対象となる抗原に対する抗原結合性ポリペプチドと、上記ポリペプチドとの融合ポリペプチドを細胞内で発現させ、抗原の機能を制御する、好ましくは阻害することにより、抗原の機能解析を行うことができる。
　対象となる細胞は、特に限定されない。対象となる細胞としては、例えば、ヒト細胞及び非ヒト動物細胞が挙げられる。非ヒト動物細胞としてより具体的には、魚類細胞、鳥類細胞及び哺乳類細胞等の脊椎動物細胞が挙げられる。哺乳類細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ及びネコ等の愛玩動物（ペット）；ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ及びウマ等の家畜由来の細胞が挙げられる。
　また、細胞は、培養細胞でもよく、生体細胞、すなわち生体内にある単離されていない細胞でもよい。細胞の好ましい一例は、ヒトの培養細胞、ヒトの生体細胞、病態モデル非ヒト動物の培養細胞、病態モデル非ヒト動物の生体細胞である。
　ウイルスベクターを標的細胞へ導入する場合は、細胞培養液中にウイルスベクターを懸濁する方法が挙げられる。非ウイルスベクター系のベクターの標的細胞への導入は、例えば、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の方法で行うことができる。
　抗原の機能を阻害した結果の指標としては、細胞、組織、又は個体に現れる表現型の変化が挙げられ、これらの指標に基づき抗原の機能解析を行うことができる。細胞の変化の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び／又は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化、アポトーシスの誘導等が挙げられる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、ｍＲＮＡ等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び／又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度／縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変化、細胞集団としての異形性／均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察により確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイトカイン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性が挙げられる。また、細胞内物質の変化としては、酵素活性、ｍＲＮＡ量、Ｃａ２＋又はｃＡＭＰ等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質量等を用いることができる。組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては、組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
　これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなく、吸光、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することができる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルオロメータ等で測定することができる。質量は、質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンター等の測定機器を用いて、蛍光偏光度はＢＥＡＣＯＮ（宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルはＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケア）、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動等はＡＲＶＯ（パーキンエルマー）等により測定できる。さらに、フローサイトメータ等も測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で２種以上の検出指標を測定しても良く、簡便であれば、２種以上の測定を同時及び／又は連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフルオロメータで測定することができる。
　本実施形態の研究用試薬は、細胞内における抗原、例えば、ポリペプチド等の動態観察に用いることもできる。一例において、動態観察の対象となる抗原に対する抗原結合性ポリペプチドと、上記ポリペプチドとの融合ポリペプチドを細胞内で発現させ、抗原と融合ポリペプチドとの反応を検出することにより、抗原の動態観察を行うことができる。抗原の動態観察には、抗原の発現、抗原の局在等を、ある時間において、又は経時的に観察することが包含される。
　抗原と融合ポリペプチドとの反応の検出は、例えば、融合ポリペプチドに含まれる検出用ペプチドによる蛍光、発光、発色等を利用して行うことができる。
＜細胞内において抗原結合性ポリペプチドを発現させる方法＞
　一実施形態において、本開示は、細胞内において抗原結合性ポリペプチドを発現させる方法を提供する。該発現方法は、上記ポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとの融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞内において発現させる工程を含む。
　発現は、恒常的なものであってもよく、一過性のものでもよい。また、誘導性のものであってもよい。恒常的に発現させる場合には、恒常的な発現を行うプロモーターが融合ポリペプチドの遺伝子上流に連結した核酸を用いればよい。一過性に発現させる場合には、例えばＤＮＡではなくＲＮＡを細胞に導入して発現させればよい。誘導により発現させる場合には、誘導性のプロモーターが融合ポリペプチドの遺伝子上流に連結した核酸を用いればよい。そして、抗原結合性ポリペプチドを発現させる際に、誘導因子、例えば、ＩＰＴＧ等を細胞に取り込ませればよい。
　対象となる細胞としては、上記研究用試薬で列挙された細胞が挙げられる。
　本実施形態の発現方法では、抗原結合性ポリペプチドを、上記ポリペプチドと融合した状態で、すなわち、融合ポリペプチドとして発現させる。該融合ポリペプチドは、上記ポリペプチドを含むことにより、抗原結合性ポリペプチド単独で発現させた場合よりも細胞内で正しいフォールディングを維持した抗原結合性ポリペプチドの存在率が増加する。そのため、細胞内において、抗原結合性ポリペプチド単独で発現させた場合よりも、抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性が向上する。
　本実施形態の発現方法は、上述の融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入する工程をさらに含む。上述の融合ポリペプチドをコードする核酸は、発現ベクターの形態で導入されてもよい。具体的な導入方法は、上記研究用試薬で記載された方法が挙げられる。それゆえ、さらに、一実施形態において、本開示は、細胞内において抗原結合性ポリペプチドを発現させる細胞を製造する方法を提供する。該製造方法は、上述の融合ポリペプチドをコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターを細胞に導入する工程を含む。また、一実施形態において、本開示は、上述の融合ポリペプチドを発現する細胞を提供する。
＜キット＞
　一実施形態において、本開示は、上述のポリペプチドと抗原結合性ポリペプチドとを含む融合ポリペプチドをコードする核酸を作製するためのキットであって、前記ポリペプチドをコードする核酸を備える、キットを提供する。
　本実施形態のキットは、所望の抗原結合性ポリペプチドについて、融合ポリペプチドをコードする核酸を容易に作製することができる汎用的なキットであり得る。
　上述のポリペプチドをコードする核酸は、上述のような発現ベクターに組み込まれていてもよい。また、該核酸は、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーター等のタンパク質の発現に必要な因子、選択マーカー、制限酵素認識部位等を含んでいてもよい。
　本実施形態のキットは、バッファー、制限酵素、その他必要な試薬、器具、及び使用説明書等のうちの少なくとも１つをさらに含んでいてもよい。
＜付記＞
　本開示は以下の態様を含むということもできる。
（１）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドであって、
　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、ポリペプチド。
（２）　前記ポリペプチドは、９個以上２０個以下のアミノ酸からなる、上記（１）に記載のポリペプチド。
（３）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の６０．０％以上９０．０％以下が酸性アミノ酸である、上記（１）又は上記（２）に記載のポリペプチド。
（４）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の６５．０％以上８０．０％以下が酸性アミノ酸である、上記（１）～上記（３）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（４－１）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の６６．０％以上７８．０％以下が酸性アミノ酸である、上記（１）～上記（４）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（４－２）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の６６．７％以上７７．８％以下が酸性アミノ酸である上記（１）～上記（４－１）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（５）　前記ポリペプチドはＮ末端がグルタミン酸である、上記（１）～上記（４－２）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（６）　前記ポリペプチドは酸性アミノ酸及び中性アミノ酸からなる、上記（１）～上記（５）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（７）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の１０．０％以上４０．０％以下が中性アミノ酸である、上記（６）に記載のポリペプチド。
（８）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の２０．０％以上３５．０％以下が中性アミノ酸である、上記（６）又は上記（７）に記載のポリペプチド。
（８－１）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の２２．０％以上３４．０％以下が中性アミノ酸である、上記（６）～上記（８）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（８－２）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の２２．２％以上３３．３％以下が中性アミノ酸である、上記（６）～上記（８－１）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（９）　前記中性アミノ酸の側鎖が疎水性脂肪族基又は親水性基である、上記（６）～上記（８－２）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１０）　前記中性アミノ酸が、プロリン、グリシン又はセリンである、上記（６）～上記（９）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１０－１）　前記中性アミノ酸が、プロリンである、上記（６）～上記（１０）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１０－２）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の０．０％超４０．０％以下がプロリンである、上記（１０－１）に記載のポリペプチド。
（１０－３）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の１０．０％以上４０．０％以下がプロリンである、上記（１０－１）又は上記（１０－２）に記載のポリペプチド。
（１０－４）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の２０．０％以上３５．０％以下がプロリンである、上記（１０－１）～上記（１０－３）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１０－５）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の２２．０％以上３４．０％以下がプロリンである、上記（１０－１）～上記（１０－４）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１０－６）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の２２．２％以上３３．３％以下がプロリンである、上記（１０－１）～上記（１０－５）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１１）　前記ポリペプチドは、塩基性アミノ酸を更に含み、且つ、前記塩基性アミノ酸がリシンである、上記（１）～上記（５）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１１－１）　前記ポリペプチドは、中性アミノ酸を更に含み、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の合計割合が１０．０％以上４０．０％以下である、上記（１１）に記載のポリペプチド。
（１１－２）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の合計割合が２０．０％以上３５．０％以下である、上記（１１）又は上記（１１－１）に記載のポリペプチド。
（１１－３）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の合計割合が２２．０％以上３４．０％以下である、上記（１１）～上記（１１－２）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１１－４）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸に対する中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の合計割合が２２．２％以上３３．３％以下である、上記（１１）～上記（１１－３）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１１－５）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の０．０％超１１．１％以下が中性アミノ酸である、上記（１１）～上記（１１－４）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１１－６）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の０．０％以上１１．１％以下がプロリンである、上記（１１）～上記（１１－５）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１１－７）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の１１．１％以上２２．２％以下が塩基性アミノ酸である、上記（１１）～上記（１１－６）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１１－８）　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の１１．１％以上２２．２％以下がリシンである、上記（１１）～上記（１１－７）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１２）　前記ポリペプチドは、以下の一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなる、上記（１）～上記（１１－８）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
　一般式（Ｉ）中、
　Ｘ１及びＸ４はそれぞれ独立に中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；
　Ｘ２はＤ又は中性アミノ酸；
　Ｘ３はＤ又はＥ;
　ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０以上３以下の整数であり、且つ、０≦ｎ１＋ｎ２≦５である。
（１２－１）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドであって、
　前記ポリペプチドは、以下の一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
　一般式（Ｉ）中、
　Ｘ１及びＸ４はそれぞれ独立に中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；
　Ｘ２はＤ又は中性アミノ酸；
　Ｘ３はＤ又はＥ;
　ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０以上３以下の整数であり、且つ、０≦ｎ１＋ｎ２≦５である。
（１２－２）　前記Ｘ１及び前記Ｘ４はそれぞれ独立に側鎖が疎水性脂肪族基若しくは親水性基である中性アミノ酸、又はリシンである、上記（１２）又は上記（１２－１）に記載のポリペプチド。
（１２－３）　前記Ｘ１及び前記Ｘ４はそれぞれ独立にグリシン、プロリン、セリン、又はリシンである、上記（１２）～上記（１２－２）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１２－４）　前記Ｘ２はアスパラギン酸、又は側鎖が疎水性脂肪族基若しくは親水性基である中性アミノ酸である、上記（１２）～上記（１２－３）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１２－５）　前記Ｘ２はアスパラギン酸、グリシン、プロリン、又はセリンである、上記（１２）～上記（１２－４）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１２－６）　前記Ｘ２はアスパラギン酸である、上記（１２）～上記（１２－５）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１２－７）　前記Ｘ３はグルタミン酸である、上記（１２）～上記（１２－６）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１２－８）　前記ｎ１及び前記ｎ２が、０≦ｎ１＋ｎ２≦４を満たす、上記（１２）～上記（１２－７）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１２－９）　前記ｎ１及び前記ｎ２が、１≦ｎ１＋ｎ２≦４を満たす、上記（１２）～上記（１２－８）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１２－１０）　前記ｎ１及び前記ｎ２が、２≦ｎ１＋ｎ２≦４を満たす、上記（１２）～上記（１２－９）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１２－１１）　前記ポリペプチドは、ＥＸ２Ｘ３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、ＥＸ１ＤＥＸ２Ｘ３のアミノ酸配列からなるポリペプチド若しくはＥＸ２Ｘ３ＥＸ４Ｄのアミノ酸配列からなるポリペプチド又は配列番号６４～６６、７２のいずれかに表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、上記（１２）～上記（１２－１０）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１２－１２）　前記ポリペプチドは、配列番号６４～６６、７２のいずれかに表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、上記（１２）～上記（１２－１１）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１３）　前記ポリペプチドは、以下の一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなる、上記（１）～上記（１１－８）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
　一般式（ＩＩ）中、
　Ｘ１及びＸ４はそれぞれ独立に中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；
　Ｘ２はＤ又は中性アミノ酸；
　Ｘ３はＤ又はＥ;
　Ｘ５は中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；
　ｎ３及びｎ４はそれぞれ独立に０以上１以下の整数であり、且つ、関係式：１≦ｎ３＋ｎ４≦２を満たす。
（１３－１）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドであって、
　前記ポリペプチドは、以下の一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
　一般式（ＩＩ）中、
　Ｘ１及びＸ４はそれぞれ独立に中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；
　Ｘ２はＤ又は中性アミノ酸；
　Ｘ３はＤ又はＥ;
　Ｘ５は中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；
　ｎ３及びｎ４はそれぞれ独立に０以上１以下の整数であり、且つ、関係式：１≦ｎ３＋ｎ４≦２を満たす。
（１３－２）　前記Ｘ１及び前記Ｘ４はそれぞれ独立に側鎖が疎水性脂肪族基若しくは親水性基である中性アミノ酸、又はリシンである、上記（１３）又は上記（１３－１）に記載のポリペプチド。
（１３－３）　前記Ｘ１及び前記Ｘ４はそれぞれ独立にグリシン、プロリン、セリン、又はリシンである、上記（１３）～上記（１３－２）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１３－４）　前記Ｘ２はアスパラギン酸、又は側鎖が疎水性脂肪族基若しくは親水性基である中性アミノ酸である、上記（１３）～上記（１３－３）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１３－５）　前記Ｘ２はアスパラギン酸、グリシン、プロリン、又はセリンである、上記（１３）～上記（１３－４）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１３－６）　前記Ｘ２はアスパラギン酸である、上記（１３）～上記（１３－５）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１３－７）　前記Ｘ３はグルタミン酸である、上記（１３）～上記（１３－６）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１３－８）　前記Ｘ５は、側鎖が疎水性脂肪族基若しくは親水性基である中性アミノ酸、又はリシンである、上記（１３）～上記（１３－７）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１３－９）　前記Ｘ５は、グリシン、プロリン、セリン、又はリシンである、上記（１３）～上記（１３－８）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１３－１０）　前記ｎ３及び前記ｎ４は１である、上記（１３）～上記（１３－９）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１３－１１）　前記ポリペプチドは、配列番号８２に表されるアミノ酸配列からなる、上記（１３）～上記（１３－１０）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１４）　配列番号２３～２５、３１、３３、３４及び４０～４２のいずれかに表されるアミノ酸配列からなる、上記（１）～上記（１３－１１）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１４－１）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドであって、配列番号２３～２５、３１、３３、３４及び４０～４２のいずれかに表されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（１４－２）　配列番号２５に表されるアミノ酸配列からなる、上記（１）～上記（１４－１）のいずれか一つに記載のポリペプチド。
（１４－３）細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドであって、配列番号２５に表されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
（１５）　上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドと、抗原結合性ポリペプチドと、を含む、融合ポリペプチド。
（１６）　前記抗原結合性ポリペプチドが、特定の抗原に対する抗体が有する１種以上の相補性決定領域を含む、上記（１５）に記載の融合ポリペプチド。
（１７）　前記抗原結合性ポリペプチドが、Ｆａｂ、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ｖＮＡＲ又はｓｃＦｖである、上記（１５）又は上記（１６）に記載の融合ポリペプチド。
（１７－１）　前記抗原結合性ポリペプチドが、ＶＨ、ＶＨＨ、ｖＮＡＲ又はｓｃＦｖである、上記（１５）～上記（１７）のいずれか一つに記載の融合ポリペプチド。
（１８）　上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドをコードする、核酸。
（１８－１）　配列番号３～５、１１、１３、１４、１９及び２０～２２のいずれかに表される塩基配列からなる、上記（１８）に記載の核酸。
（１８－２）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドをコードする核酸であって、配列番号３～５、１１、１３、１４、１９及び２０～２２のいずれかに表される塩基配列からなる、核酸。
（１８－３）　配列番号５に表される塩基配列からなる、上記（１８）～上記（１８－２）のいずれか一つに記載の核酸。
（１８－４）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドをコードする核酸であって、配列番号５に表される塩基配列からなる、核酸。
（１９）　上記（１８）～上記（１８－４）のいずれか一つに記載の核酸を含む、発現ベクター。
（１９－１）　配列番号３～５、１１、１３、１４、１９及び２０～２２のいずれかに表される塩基配列からなる核酸を含む、上記（１９）に記載の発現ベクター。
（１９－２）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドをコードする核酸を含む、発現ベクターであって、
　前記核酸が配列番号３～５、１１、１３、１４、１９及び２０～２２のいずれかに表される塩基配列からなる、発現ベクター。
（１９－３）　配列番号５に表される塩基配列からなる核酸を含む、上記（１９）～上記（１９－２）のいずれか一つに記載の発現ベクター。
（１９－４）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドをコードする核酸を含む、発現ベクターであって、
　前記核酸が配列番号５に表される塩基配列からなる、発現ベクター。
（２０）　上記（１５）～上記（１７）のいずれか一つに記載の融合ポリペプチドをコードする、核酸。
（２１）　上記（２０）に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（２２）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させる方法であって、
　融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞内において発現させることを含み、
　前記融合ポリペプチドは、前記抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結したポリペプチドと、を含み、
　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、方法。
（２２－１）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させる方法であって、
　融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞内において発現させることを含み、
　前記融合ポリペプチドは、前記抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結した、上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドと、を含む、方法。
（２３）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドのフォールディング効率を向上させる方法であって、
　融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞内において発現させることを含み、
　前記融合ポリペプチドは、前記抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結したポリペプチドと、を含み、
　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、方法。
（２３－１）　細胞内での抗原結合性ポリペプチドのフォールディング効率を向上させる方法であって、
　融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞内において発現させることを含み、
　前記融合ポリペプチドは、前記抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結した、上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドと、を含む、方法。
（２４）　細胞内で正しいフォールディングを維持した抗原結合性ポリペプチドの存在率を向上させる方法であって、
　融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞内において発現させることを含み、
　前記融合ポリペプチドは、前記抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結したポリペプチドと、を含み、
　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、方法。
（２４－１）　細胞内で正しいフォールディングを維持した抗原結合性ポリペプチドの存在率を向上させる方法であって、
　融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞内において発現させることを含み、
　前記融合ポリペプチドは、前記抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結した、上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドと、を含む、方法。
（２５）　細胞内の抗原が関連する疾患を治療又は予防する方法であって、
　融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞内において発現させることを含み、
　前記融合ポリペプチドは、前記抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結したポリペプチドと、を含み、
　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、方法。
（２５－１）　細胞内の抗原が関連する疾患を治療又は予防する方法であって、
　融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞内において発現させることを含み、
　前記融合ポリペプチドは、前記抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結した、上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドと、を含む、方法。
（２５－２）　前記発現させることの前に、前記融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入することを更に含む、上記（２２）～上記（２５－１）のいずれか一つに記載の方法。
（２６）　細胞内の抗原が関連する疾患の治療又は予防に使用される融合ポリペプチドであって、
　前記融合ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結したポリペプチドと、を含み、
　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、融合ポリペプチド。
（２６－１）　細胞内の抗原が関連する疾患の治療又は予防に使用される融合ポリペプチドであって、
　抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結した、上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドと、を含む、融合ポリペプチド。
（２７）　細胞内の抗原が関連する疾患の治療又は予防用医薬組成物の製造のための融合ポリペプチドの使用であって、
　前記融合ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結したポリペプチドと、を含み、
　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、使用。
（２７－１）　細胞内の抗原が関連する疾患の治療又は予防用医薬組成物の製造のための融合ポリペプチドの使用であって、
　前記融合ポリペプチドは、前記抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結した、上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドと、を含む、使用。
（２８）　細胞内の抗原が関連する疾患の治療又は予防に使用される核酸であって、
　前記核酸は、融合ポリペプチドをコードし、
　前記融合ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結したポリペプチドと、を含み、
　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、核酸。
（２８－１）　細胞内の抗原が関連する疾患の治療又は予防に使用される核酸であって、
　前記核酸は、融合ポリペプチドをコードし、
　前記融合ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結した、上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドと、を含む、核酸。
（２９）　細胞内の抗原が関連する疾患の治療又は予防用医薬組成物の製造のための核酸の使用であって、
　前記核酸は、融合ポリペプチドをコードし、
　前記融合ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結したポリペプチドと、を含み、
　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、使用。
（２９－１）　細胞内の抗原が関連する疾患の治療又は予防用医薬組成物の製造のための核酸の使用であって、
　前記核酸は、融合ポリペプチドをコードし、
　前記融合ポリペプチドは、前記抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結した、上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドと、を含む、使用。
（３０）　前記核酸が発現ベクターに組み込まれている、上記（２８）～上記（２９－１）のいずれか一つに記載の使用。
（３１）　細胞内の抗原が関連する疾患の治療又は予防に使用される医薬組成物であって、
　融合ポリペプチドをコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターと、薬学的に許容される担体と、含み、
　前記融合ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結したポリペプチドと、を含み、
　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、医薬組成物。
（３１－１）　細胞内の抗原が関連する疾患の治療又は予防に使用される医薬組成物であって、
　上記（１５）～上記（１７）のいずれか一つに記載の融合ポリペプチドをコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターと、薬学的に許容される担体と、含む、医薬組成物。
（３１－２）　細胞内の抗原が関連する疾患の治療又は予防に使用される医薬組成物であって、
　融合ポリペプチドをコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターと、薬学的に許容される担体と、含み、
　前記融合ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結した、上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドと、を含む、医薬組成物。
（３２）　細胞内における抗原の機能解析に使用される研究用試薬であって、
　上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドをコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターを含む、研究用試薬。
（３３）　細胞内において抗原結合性ポリペプチドを発現させる細胞を製造する方法であって、
　融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞内において発現させることを含み、
　前記融合ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドと、該抗原結合性ポリペプチドのＮ末端に連結したポリペプチドと、を含み、
　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、方法。
（３３－１）　前記発現させることの前に、前記融合ポリペプチドをコードする核酸を細胞に導入することをさらに含む、上記（３３）に記載の方法。
（３４）　融合ポリペプチドをコードする核酸を作製するためのキットであって、
　上記（１）～上記（１４－３）のいずれか一つに記載のポリペプチドをコードする核酸又は該核酸を含む発現ベクターを備える、キット。
　以下、実施例により本開示を説明するが、本開示は以下の実施例に限定されるものではない。
［抗原結合性ポリペプチド］
　抗原結合性ポリペプチドとして、ｓｃＦｖである抗ＫＲＡＳ抗体（参考文献：Werge T.M., et al., Intracellular immunization Cloning and intracellular expression of a monoclonal antibody to the p21ras protein, FEBS Letters 274, 193-198, 1990）のＣ末側にＨＡタグを付与したもの（塩基配列：配列番号１；アミノ酸配列：配列番号２）をベースとしたＩｎｔｒａｂｏｄｙ（以下、「Ｙ１３－２５９－ＨＡ」と呼ぶ）を使用した。
　また、ＫＲＡＳとは異なる抗原を認識する抗原結合性ポリペプチドとして、ｓｃＦｖである抗β－ガラクトシダーゼ抗体（参考文献：P Martineau et al., Expression of an Antibody Fragment at High Levels in the Bacterial Cytoplasm, J. Mol. Biol. 280, 117-127, 1998）のＣ末側にＨＡタグを付与したＩｎｔｒａｂｏｄｙ（塩基配列：配列番号８３；アミノ酸配列：配列番号８４）（以下、「ｓｃＦｖ１３－ＨＡ」と呼ぶ）を使用した。
　また、ｓｃＦｖとは異なるフォーマットの抗原結合性ポリペプチドとして、ＶＨである抗ＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ変異体）抗体（参考文献：T Tanaka et al., Tumour prevention by a single antibody domain targeting the interaction of signal transduction proteins with RAS, EMBO J. 26, 3250-3259, 2007）のＣ末側にＨＡタグを付与したＩｎｔｒａｂｏｄｙ（塩基配列：配列番号８５；アミノ酸配列：配列番号８６）（以下、「ｉＤａｂ＃６－ＨＡ」と呼ぶ）を使用した。
　また、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ及びβ－ガラクトシダーゼ以外の抗原を認識し、ｓｃＦｖ及びＶＨとはフォーマットが異なる抗原結合性ポリペプチドとして、抗ＥＧＦＰサメ抗体（ｖＮＡＲ、参考特許文献：国際公開第２０２３／０７７２８７号）のＣ末側にＨＡタグを付与したＩｎｔｒａｂｏｄｙ（塩基配列：配列番号８７；アミノ酸配列：配列番号８８）（以下、「ＢｓＧ７３－ＨＡ」と呼ぶ）及び、抗ＥＧＦＰラクダ科抗体（ＶＨＨ（ナノボディとも呼ばれる）、参考ＰＤＢ　ＩＤ：３Ｋ１Ｋ）のＣ末側にＨＡタグを付与したＩｎｔｒａｂｏｄｙ（塩基配列：配列番号８９；アミノ酸配列：配列番号９０）（以下、「ｅｎｈａｎｃｅｒ－ＨＡ」と呼ぶ）を使用した。
［細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上するポリペプチド］
　本実施例で使用したｐｅｐｔｉｄｅ１～２０の塩基配列（配列番号３～２２）及びアミノ酸配列（配列番号２３～４２）をそれぞれ以下の表に示した。これらのｐｅｐｔｉｄｅを配列番号１のアミノ酸配列からなる抗体のＮ末側に付与した抗体を発現するベクターを作成し、各種検討に使用した。
［抗原タンパク質］
　Ｙ１３－２５９－ＨＡが認識する抗原タンパク質として、ＫＲＡＳのＣ末側にＨｉｓタグを付与したもの（塩基配列：配列番号４３、アミノ酸配列：配列番号４４）（以下、「ＫＲＡＳ－Ｈｉｓ」と呼ぶ）を使用した。
　また、ｓｃＦｖ１３－ＨＡが認識する抗原タンパク質として、β－ガラクトシダーゼのＣ末端側にＦＬＡＧタグを付与したもの（塩基配列：配列番号９１；アミノ酸配列：配列番号９２）（以下、「β―Ｇａｌ－ＦＬＡＧ）と呼ぶ）を使用した。
　また、ｉＤａｂ＃６－ＨＡが認識する抗原タンパク質として、ＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）のＣ末端側にＦＬＡＧタグを付与したもの（塩基配列：配列番号９３；アミノ酸配列：配列番号９４）（以下、「ＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）－ＦＬＡＧ」と呼ぶ）を使用した。
　また、ＢｓＧ７３－ＨＡ及びｅｎｈａｎｃｅｒ－ＨＡが認識する抗原タンパク質として、ＥＧＦＰ（塩基配列：配列番号９５；アミノ酸配列：配列番号９６）を使用した。
［発現ベクターの構築］
　まずＹ１３－２５９－ＨＡ（塩基配列：配列番号１）とｐｅｐｔｉｄｅ３（塩基配列：配列番号５）－Ｙ１３－２５９－ＨＡ（塩基配列：配列番号１）、ＫＲＡＳ－Ｈｉｓ（塩基配列：配列番号４３）をそれぞれ人工遺伝子合成により作製し、ｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトに遺伝子工学的手法を用いて挿入することで、各発現ベクターを構築した。次に、Ｙ１３－２５９－ＨＡを挿入したｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターを鋳型として、以下の表に示したプライマーを用いたＰＣＲによりｐｅｐｔｉｄｅ３以外の各ｐｅｐｔｉｄｅを付与したＹ１３－２５９－ＨＡの遺伝子断片を増幅し、ｉｎｆｕｓｉｏｎ法により各発現ベクターを構築した。各発現ベクターにクローニングされた配列は、配列番号３～２２のいずれかで表される塩基配列と配列番号１で表される塩基配列とが連結したものとなった。
　上記以外の発現ベクターについては、ＧｅｎｅＡｒｔサービス（サーモフィッシャーサイエンティフィック）によりｐｃＤＮＡ３．４ベクターを用いて構築した。
［免疫沈降］
　実験例１～６において、９６ウェルプレートで培養した２９３Ａ細胞を、抗原タンパク質の発現ベクター及び抗原結合性ポリペプチドの発現ベクターでコトランスフェクションした。プラスミドＤＮＡのトランスフェクションはＦｕＧＥＮＥ　ＨＤ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、添付のプロトコルに準じて行った。トランスフェクションの３日後、細胞を回収し、４０μＬのＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ（ＲＩＰＡ）－ｂｕｆｆｅｒ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）を用いて細胞を溶解した。溶解した細胞液を４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心し、約４０μＬの細胞ｌｙｓａｔｅを調製した。各細胞ｌｙｓａｔｅ　１５μＬに７５μＬのＰｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）－ｂｕｆｆｅｒを加えたものを、５μＬのａｎｔｉ－ＨＡ－ｔａｇ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ａｇａｒｏｓｅ（医学生物学研究所）と混合し、４℃で１時間反応させ、細胞内で発現した抗体を回収した。反応後、磁石を用いて上清を除去し、Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ＡｇａｒｏｓｅをＰＢＳ－Ｔ　ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｖ／ｖ％　ｔｗｅｅｎ２０）を用いて４回洗浄した。洗浄後、１２μＬのウエスタンブロッティング用ｂｕｆｆｅｒをＭａｇｎｅｔｉｃ　Ａｇａｒｏｓｅに加え、１００℃で１０分間の熱処理を行い、磁石を用いて上清を回収した。
　実験例７（内在性ＫＲＡＳの免疫沈降）、実験例９（ＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）の免疫沈降）では、６ウェルプレートを用いて細胞を培養した。２００μＬのＲＩＰＡ－ｂｕｆｆｅｒで細胞を溶解し、調製した各細胞ｌｙｓａｔｅ　６０μＬに１６０μＬのＰＢＳ－ｂｕｆｆｅｒを加えたものを、２０μＬのａｎｔｉ－ＨＡ－ｔａｇ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ａｇａｒｏｓｅと混合した。洗浄後、実験例８では２４μＬのウエスタンブロッティング用ｂｕｆｆｅｒをＭａｇｎｅｔｉｃ　Ａｇａｒｏｓｅに加えた。
　実験例９～１１では、トランスフェクション試薬をＦｕＧＥＮＥ　４Ｋ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に変更し、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法にて実施した。また、洗浄バッファーもＰＢＳ－Ｔ　ｂｕｆｆｅｒ（０．０１ｖ／ｖ％　ｔｗｅｅｎ２０）に変更した。
　実験例８（β－Ｇａｌ－ＦＬＡＧの免疫沈降）、実験例１０、１１（ＥＧＦＰの免疫沈降）では、調製した細胞ｌｙｓａｔｅ　２０μＬに８０μＬのＰＢＳ－ｂｕｆｆｅｒを加えて免疫沈降を行った。
　なお、実験例７（内在性ＫＲＡＳの免疫沈降）ではｐｅｐｔｉｄｅ付与無しもしくはｐｅｐ３を付与したｐｃＤＮＡ３．４＿Ｙ１３－２５９－ＨＡ発現ベクターを単独で用いてトランスフェクションした。実験例８～１１ではｐｅｐｔｉｄｅ付与無しもしくはｐｅｐ３を付与した各種ｐｃＤＮＡ３．４＿ｉｎｔｒａｂｏｄｙ－ＨＡ発現ベクター、及び対応する標的抗原のｐｃＤＮＡ３．４ベクターでコトランスフェクションした。
　実験例８はＮ＝６で試験を実施した。実験例１～７、９～１１はＮ＝３で試験を実施した。
［ウエスタンブロッティング］
　免疫沈降で調製した各細胞ｌｙｓａｔｅ　１０μＬ分を４～２０ｗ／ｗ％　ミニプロティアン　ＴＧＸ　Ｓｔａｉｎ－ＦｒｅｅＴＭゲル（ＢｉｏＲａｄ）に泳動した（２８０Ｖ、１５～２０分間)。また同様に免疫沈降後に回収した上清１０μＬ分を４～２０ｗ／ｗ％　Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ　ＴＧＸ　Ｐｒｅｃａｓｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｌｓ（ＢｉｏＲａｄ）に泳動した。電気泳動後、トランスブロットＴｕｒｂｏ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて低蛍光のＰｏｌｙＶｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）メンブレン（ＢｉｏＲａｄ）に転写し、ＥｖｅｒｙＢｌｏｔブロッキングバッファー（ＢｉｏＲａｄ）でブロッキングした。ブロッキング後、各Ｙ１３－２５９－ＨＡとＫＲＡＳ－Ｈｉｓを検出するため、２５００倍希釈ＨＡ－Ｔａｇ（Ｃ２９Ｆ４）Ｒａｂｂｉｔ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と５０００倍希釈６×Ｈｉｓ、Ｈｉｓ－Ｔａｇ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ　Ｇｒｏｕｐ　Ｉｎｃ．）を１次抗体として１時間反応させた。反応後、Ｔｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）－Ｔ　ｂｕｆｆｅｒ（０．１ｖ／ｖ％　ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、さらに５０００倍希釈Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｈｉｇｈｌｙ　Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）と２５００倍希釈ＳｔａｒＢｒｉｇｈｔ　Ｂｌｕｅ　７００　Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ）を反応させた。反応後、ＴＢＳ－Ｔ　ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて撮像した。
　実験例６～１１では、検出感度上昇のために検出抗体を変更した。Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ検出のためには、１次抗体として２，０００倍希釈した抗－ＨＡ高親和性ラット抗体（ＭＥＲＣＫ）、２次抗体として２，０００倍希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｒａｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＤｙＬｉｇｈｔＴＭ８００（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用した。各種標的抗原の検出のためには、後述する１次抗体と、２次抗体として２，５００倍希釈したＳｔａｒＢｒｉｇｈｔ　Ｂｌｕｅ　７００　Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ）を使用した。
　実験例６の標的抗原ＫＲＡＳ－Ｈｉｓ検出には、一次抗体として１，０００倍希釈したＡｎｔｉ－Ｈｉｓ－ｔａｇ　ｐＡｂ（医学生物学研究所）を使用した。実験例７の標的抗原である細胞内在性ＫＲＡＳ検出には、一次抗体として１０，０００倍希釈したＫＲＡＳ　Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　１２０６３－１－ＡＰ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）を使用した。実験例８の標的抗原であるβ－Ｇａｌ－ＦＬＡＧ及び実験例９の標的抗原であるＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）－ＦＬＡＧ検出には、５００倍希釈した抗ＦＬＡＧ（Ｒ）ウサギ抗体（ＭＥＲＣＫ）を使用した。実験例１０、実験例１１の標的抗原であるＥＧＦＰの検出には、２，０００倍希釈したｅＧＦＰ　Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＡＢ４２１１、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用した。
　実験例８のウエスタンブロッティングのみ、ゲルに泳動する免疫沈降後の上清サンプル量を３μＬ分とした。
［細胞増殖アッセイ］
　実験例１２において、９６ｗｅｌｌ　ｈａｌｆ　ａｒｅａ　ｐｌａｔｅで培養した２９３Ａ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．４＿ＫＲＡＳ－Ｈｉｓ発現ベクター、及び各ｐｅｐｔｉｄｅを付与したｐｃＤＮＡ３．４＿Ｙ１３－２５９－ＨＡ発現ベクターでコトランスフェクションした。プラスミドＤＮＡのトランスフェクションはＦｕＧＥＮＥ　４Ｋ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法にて実施した。トランスフェクション後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ　Ｓ３（ザルトリウス）を用いて、各ウェルの細胞を経時的に撮像しながら３７℃でインキュベーションした。更に、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ解析モジュールを用いて、各ウェルの２９３Ａ細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）を算出した。試験はＮ＝３で行った。
［実験例１］
（細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上するポリペプチドにおけるアミノ酸骨格の検討）
　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの標的となる抗原への結合機能を向上させるポリペプチドを探索するため、まずポリペプチドの骨格として、酸性アミノ酸（ｐｅｐｔｉｄｅ３）、塩基性アミノ酸（ｐｅｐｔｉｄｅ７）、中性アミノ酸（ｐｅｐｔｉｄｅ８）をそれぞれ主体とした９アミノ酸からなるｐｅｐｔｉｄｅを設計し、各ｐｅｐｔｉｄｅがＹ１３－２５９Ａ－ＨＡのＮ末側に融合したＩｎｔｒａｂｏｄｙを発現するベクターを構築した。構築した３種のＩｎｔｒａｂｏｄｙ発現ベクターとｐｃＤＮＡ３．４＿ＫＲＡＳ－Ｈｉｓ発現ベクターを２９３Ａ細胞にコトランスフェクションし、細胞内で発現した各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙを免疫沈降法により回収し、回収したサンプルに含まれる各ＩｎｔｒａｂｏｄｙとＫＲＡＳ量をウエスタンブロッティングにより比較した。
　図１上段は、細胞ｌｙｓａｔｅ（免疫沈降前の試料）の解析結果を示す写真及びグラフである。図１上段左は、免疫沈降前の細胞ｌｙｓａｔｅに含まれる各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ（実線矢印）とＫＲＡＳ（点線矢印）の発現をウエスタンブロッティングにより評価した結果を示す写真である。
　図１上段中央は、ウエスタンブロッティングの結果に基づいて、総タンパク量で各バンドの輝度値をノーマライズし、対数変換後の値を平均化し、ｐｅｐｔｉｄｅを付与していないＹ１３－２５９－ＨＡの値を基準として各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙの発現量の比率を比較した結果を示すグラフである。グラフの縦軸はＩｎｔｒａｂｏｄｙの発現量（相対値）を示す。その結果、ｐｅｐｔｉｄｅを付与しないＹ１３－２５９－ＨＡ（図中、「ｎｏｎ－ｐｅｐ」と示す。）に対し、酸性アミノ酸骨格からなるｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したＹ１３－２５９－ＨＡ（図中、「Ｐｅｐｔｉｄｅ３」又は「ｐｅｐ３」と示す。）と中性アミノ酸骨格からなるｐｅｐｔｉｄｅ８を付与したＹ１３－２５９－ＨＡ（図中、「Ｐｅｐｔｉｄｅ８」又は「ｐｅｐ８」と示す。）ではＩｎｔｒａｂｏｄｙの発現量が増加傾向を示した。一方、塩基性アミノ酸骨格からなるｐｅｐｔｉｄｅ７を付与したＹ１３－２５９－ＨＡ（図中、「Ｐｅｐｔｉｄｅ７」又は「ｐｅｐ７」と示す。）は、ｐｅｐｔｉｄｅを付与しないＹ１３－２５９－ＨＡと発現量に差が見られなかった。
　図１上段右は、ウエスタンブロッティングの結果に基づいて、総タンパク量で各バンドの輝度値をノーマライズし、対数変換後の値を平均化し、ＫＲＡＳのみを発現させた時（図中、「ＫＲＡＳ　Ｏｎｌｙ」と示す。）の値を基準としてＫＲＡＳの発現量を比較した結果を示すグラフである。グラフの縦軸はＫＲＡＳの発現量（相対値）を示す。その結果、Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと共発現することで、細胞質内に蓄積したＫＲＡＳ量が増加する傾向を示し、特にｐｅｐｔｉｄｅを付与したケースではｐｅｐｔｉｄｅを付与しない場合に比べＫＲＡＳの細胞質での蓄積量が多くなる傾向が観察された。
　図１下段は、免疫沈降後の試料の解析結果を示す写真及びグラフである。図１下段左は、免疫沈降後のサンプル中の各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ（実線矢印）とＫＲＡＳ（点線矢印）の量をウエスタンブロッティングにより評価した結果を示す写真である。
　図１下段中央は、ウエスタンブロッティングの結果に基づいて、免疫沈降後の各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙの輝度値を対数変換した後に平均化し、ｐｅｐｔｉｄｅを付与していないＹ１３－２５９－ＨＡの値を基準として各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙの量を比較した結果を示すグラフである。グラフの縦軸はＩｎｔｒａｂｏｄｙの量（相対値）を示す。その結果、免疫沈降後の各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量は、細胞ｌｙｓａｔｅと同等の比率を示したことから、免疫沈降は問題なく実施できていると判断した。
　図１下段右は、ウエスタンブロッティングの結果に基づいて、免疫沈降後の各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳの輝度値を対数変換した後に平均化し、ｐｅｐｔｉｄｅを付与していないＹ１３－２５９－ＨＡと結合していたＫＲＡＳ量を基準として、各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳ量を評価した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳ量（相対値）を示す。その結果、ｐｅｐｔｉｄｅを付与していないＹ１３－２５９－ＨＡではＫＲＡＳを検出することができなかったが、酸性アミノ酸骨格からなるｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したＹ１３－２５９－ＨＡでは、劇的にＫＲＡＳ量が増加していた。中性アミノ酸骨格からなるｐｅｐｔｉｄｅ８を付与したＹ１３－２５９－ＨＡでも、ｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したＹ１３－２５９－ＨＡより少ないながらＫＲＡＳ量が増加傾向にあることが示されたが、塩基性アミノ酸骨格からなるｐｅｐｔｉｄｅ７を付与したＹ１３－２５９－ＨＡではＫＲＡＳ量の増加傾向はさらに小さくなることが分かった。これらの結果より、付与したｐｅｐｔｉｄｅにより細胞内で発現した抗体の標的抗原への結合機能が向上していることが示唆され、細胞内での抗体の標的抗原への結合機能を向上させるｐｅｐｔｉｄｅとして、酸性アミノ酸骨格からなるｐｅｐｔｉｄｅが重要であることを見出した。
［実験例２］
（細胞内での抗体の標的抗原への結合機能向上性を維持可能なｐｅｐｔｉｄｅ長の検討）
　細胞内抗体を遺伝子治療用途で利用することを考えると、ｐｅｐｔｉｄｅ長はできるだけ短いことが望ましい。そこで細胞内での抗体の標的抗原への結合機能を発揮可能な酸性アミノ酸骨格からなるｐｅｐｔｉｄｅ長の範囲について確認するため、ｐｅｐｔｉｄｅ長が異なり、且つ、酸性アミノ酸骨格からなるｐｅｐｔｉｄｅ１（２０アミノ酸）、ｐｅｐｔｉｄｅ２（１５アミノ酸）、ｐｅｐｔｉｄｅ３（９アミノ酸）、ｐｅｐｔｉｄｅ１６（３アミノ酸）、及びｐｅｐｔｉｄｅ１７（６アミノ酸）を設計し、細胞内での抗体の標的抗原への結合機能性向上効果について免疫沈降法による評価を行った。
　図２左上は、細胞ｌｙｓａｔｅ（免疫沈降前の試料）のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、細胞ｌｙｓａｔｅに各ＩｎｔｒａｂｏｄｙとＫＲＡＳが発現していることが確認された。図２左下は、免疫沈降後の試料のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図２中、「ＫＲＡＳ　Ｏｎｌｙ」はＫＲＡＳのみを発現させた結果であることを示し、「ｎｏｎ－ｐｅｐ」はｐｅｐｔｉｄｅを付与しないＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ｐｅｐ１」はｐｅｐｔｉｄｅ１を付与したＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、以下同様である。
　図２右は、免疫沈降後のサンプルに含まれる各ＩｎｔｒａｂｏｄｙとＫＲＡＳの輝度値を算出し、Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するＫＲＡＳ量の比率（比率＝ＫＲＡＳ量／Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量）値を対数変換した後に平均化し、ｐｅｐｔｉｄｅを付与していないＹ１３－２５９－ＨＡに対するＫＲＡＳ量の比率を基準として、各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するＫＲＡＳ量の比率を比較した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するＫＲＡＳ量の比率（相対値）を示す。
　その結果、ｐｅｐｔｉｄｅを付与していないＹ１３－２５９－ＨＡに対してｐｅｐｔｉｄｅ１～３を付与したＹ１３－２５９－ＨＡは安定して細胞内での抗体の標的抗原への結合機能が向上することが分かった。
　一方、ｐｅｐｔｉｅ１６とｐｅｐｔｉｄｅ１７を付与したＹ１３－２５９－ＨＡにおいても細胞内での抗体の標的抗原への結合機能を向上させる効果は見られたが、他のｐｅｐｔｉｄｅを付与したＹ１３－２５９－ＨＡのほうが当該効果をより安定的に発揮できる可能性が高いことが示された。これらの結果より、酸性アミノ酸骨格ｐｅｐｔｉｄｅの長さが９アミノ酸～２０アミノ酸である場合において、細胞内での抗体の標的抗原への結合機能を特に安定的に向上させることが可能であることが分かった。
［実験例３］
（酸性アミノ酸骨格中の他種アミノ酸の含有量に関する検討）
　酸性アミノ酸を骨格とするｐｅｐｔｉｄｅに他種アミノ酸として中性アミノ酸であるプロリン（Ｐ）を２２．２％～２６．６％含有しても、細胞内での抗体の標的抗原への結合機能性を向上する機能を保持できることが実験例２の検討で示された。さらに、酸性アミノ酸骨格に許容される他種アミノ酸の含有量の範囲を見極めるため、酸性アミノ酸骨格のｐｅｐｔｉｄｅにおいて３３．３％、４４．４％、５５．５％、又は６６．６％の他種アミノ酸（本試験では中性アミノ酸であるＰを使用）を含むｐｅｐｔｉｄｅ（ｐｅｐｔｉｄｅ１２～１５）を設計し、細胞内での抗体の標的抗原への結合機能性向上効果について免疫沈降法による評価を行った。
　図３左上段は、細胞ｌｙｓａｔｅ（免疫沈降前の試料）のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図３左下段は、免疫沈降後の試料のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図３右は、免疫沈降後のサンプルに含まれる各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳの輝度値を対数変換した後に平均化し、ｐｅｐｔｉｄｅ１５を付与したＹ１３－２５９－ＨＡと結合していたＫＲＡＳ量を基準として、各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳ量を比較した結果を示すグラフである。図３中、「Ｐｅｐｔｉｄｅ１２」はｐｅｐｔｉｄｅ１２を付与したＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、以下同様である。グラフの縦軸は各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳ量（相対値）を示す。
　その結果、細胞ｌｙｓａｔｅ中にはすべてのｐｅｐｔｉｄｅでおおよそ同程度のＩｎｔｒａｂｏｄｙとＫＲＡＳが発現していた。しかしながら、免疫沈降後のサンプル中では、ｐｅｐｔｉｄｅ１２を付与したＹ１３－２５９－ＨＡでは比較的安定的にＫＲＡＳとの結合が確認できたが、その他のｐｅｐｔｉｄｅではＫＲＡＳとの安定的な結合が確認できなかった。
　これらの結果より、酸性アミノ酸骨格中の他種アミノ酸の含有率が３３．３％以下であることで、細胞内での抗体の標的抗原への結合機能を特に安定的に向上させることが可能であることが分かった。
［実験例４］
（酸性アミノ酸骨格中の中性アミノ酸種の検討）
　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの標的となる抗原への結合機能を向上させるポリペプチドの設計に関して、酸性アミノ酸骨格に導入可能なアミノ酸種として中性アミノ酸の１種であるプロリン（疎水性／イミノ酸）が許容されることが実験例３で示された。さらに酸性アミノ酸骨格に導入可能な中性アミノ酸種が存在するかを検証するため、疎水性／脂肪族に属するグリシン（Ｇ）、疎水性／芳香族に属するフェニルアラニン（Ｆ）、親水性に属するセリン（Ｓ）を各性質の代表アミノ酸として選択し、ｐｅｐｔｉｄｅ３のプロリンとそれぞれ置き換えたｐｅｐｔｉｄｅ（ｐｅｐｔｉｄｅ９～１１）を設計し、細胞内での抗体の標的抗原への結合機能性向上効果について免疫沈降法による評価を行った。
　図４左上は、細胞ｌｙｓａｔｅ（免疫沈降前の試料）のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図４左下は、免疫沈降後の試料のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図４中、「ｎｏｎ－ｐｅｐ」はｐｅｐｔｉｄｅを付与しないＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「Ｐｅｐｔｉｄｅ３」はｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、以下同様である。その結果、すべてのサンプルにおいて細胞ｌｙｓａｔｅ中に各ＩｎｔｒａｂｏｄｙとＫＲＡＳが発現することが確認できた。
　図４右は、免疫沈降後のサンプルに含まれる各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳの輝度値を対数変換して平均化し、ｐｅｐｔｉｄｅを付与していないＹ１３－２５９－ＨＡと結合していたＫＲＡＳ量を基準として、各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳ量を比較評価した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳ量（相対値）を示す。
　その結果、免疫沈降後、ｐｅｐｔｉｄｅ９を付与したＹ１３－２５９－ＨＡとｐｅｐｔｉｄｅ１１を付与したＹ１３－２５９－ＨＡではＫＲＡＳとの結合量の増加傾向が確認された。ｐｅｐｔｉｄｅ１０を付与したＹ１３－２５９－ＨＡでもわずかながらＫＲＡＳとの結合量の増加傾向が見られたが、増加傾向は、ｐｅｐｔｉｄｅ９を付与したＹ１３－２５９－ＨＡ、ｐｅｐｔｉｄｅ１１を付与したＹ１３－２５９－ＨＡよりも低かった。
　これらの結果より、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの標的となる抗原への結合機能を向上させるポリペプチドとして酸性アミノ酸骨格に導入可能な中性アミノ酸種としてプロリン以外のアミノ酸種も許容されうるが、疎水性／脂肪族又は親水性に属する中性アミノ酸種はその効果が特に良好であると考えられた。
［実験例５］
（酸性アミノ酸骨格中の塩基性アミノ酸種の検討）
　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの標的となる抗原への結合機能を向上させるポリペプチドの設計に関して、酸性アミノ酸骨格に中性アミノ酸の導入が許容されることが実験例４にて示された。実験例１では塩基性アミノ酸骨格は細胞内での抗体の標的抗原への結合機能性向上効果が大きく低下したが、酸性アミノ酸骨格への導入は許容されうるか否かを検証するため、ｐｅｐｔｉｄｅ３のプロリンをリジン（Ｋ）に置き換えたｐｅｐｔｉｄｅ１８～２０を設計し、細胞内での標的結合機能性向上効果について免疫沈降法による評価を行った。
　図５左上は、細胞ｌｙｓａｔｅ（免疫沈降前の試料）のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図５左下は、免疫沈降後の試料のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図５中、「ｎｏｎ－ｐｅｐ」はｐｅｐｔｉｄｅを付与しないＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「Ｐｅｐｔｉｄｅ３」はｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、以下同様である。その結果、すべてのサンプルにおいて細胞ｌｙｓａｔｅ中に各ＩｎｔｒａｂｏｄｙとＫＲＡＳが発現することが確認できた。
　図５右は、免疫沈降後のサンプルに含まれる各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳの輝度値を対数変換して平均化し、ｐｅｐｔｉｄｅを付与していないＹ１３－２５９－ＨＡ（図５中、「ｐｅｐ０」と示す。）と結合していたＫＲＡＳ量を基準として、各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳ量を比較評価した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は各Ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＫＲＡＳ量（相対値）を示す。その結果、ｐｅｐｔｉｄｅ１８～２０を付与したＹ１３－２５９－ＨＡは、ｐｅｐｔｉｄｅ３と同等レベルでＫＲＡＳと結合することが確認された。
　これらの結果より、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの標的となる抗原への結合機能を向上させるポリペプチドとして酸性アミノ酸骨格に塩基性アミノ酸の導入が許容されることが分かった。
［実験例６］
（細胞内での抗体の標的抗原への結合機能性向上効果の比較検討）
　細胞内で発現する抗体の凝集性を改善する効果が報告されているｐｅｐｔｉｄｅ４（配列番号２６、ｓ３Ｆｌａｇ）、ｐｅｐｔｉｄｅ５（配列番号２７、ＤＥ２．０）、ｐｅｐｔｉｄｅ６（配列番号２８、ＤＥ５．０）（いずれも特許文献１（国際公開第２０１９／００４２１３号）参照）を付与したＹ１３－２５９－ＨＡと、本研究で細胞内での抗体の標的抗原への結合機能性向上効果を見出したｐｅｐｔｉｄｅ２及びｐｅｐｔｉｄｅ３をＮ末端に付与したＹ１３－２５９－ＨＡの細胞内での発現と標的抗原（ＫＲＡＳ－Ｈｉｓ）への結合機能について、免疫沈降とウエスタンブロッティングによる比較評価を実施した。
　図６左上は、細胞ｌｙｓａｔｅ（免疫沈降前の試料）のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図６左下は、免疫沈降後の試料のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図６中、「ＫＲＡＳ　ｏｎｌｙ」はＫＲＡＳ－Ｈｉｓのみを発現させた結果であることを示し、「Ｙ１３－２５９－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅを付与しないＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ｐｅｐ２－Ｙ１３－２５９－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅ２を付与したＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、以下同様である。その結果、ｐｅｐｔｉｄｅ６を付与したＹ１３－２５９－ＨＡのみ発現量の大幅な低下が観察された。その他の試料では各ｉｎｔｒａｂｏｄｙとＫＲＡＳが共発現していることが確認できた。
　図６右は、免疫沈降後のサンプルに含まれる各ｉｎｔｒａｂｏｄｙとＫＲＡＳ－Ｈｉｓの輝度値を算出し、ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するＫＲＡＳ－Ｈｉｓ量の比率（比率＝ＫＲＡＳ－Ｈｉｓ量／ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量）を比較した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は各ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するＫＲＡＳ－Ｈｉｓ量の比率を示す。その結果、ｐｅｐｔｉｄｅを付与しないＹ１３－２５９－ＨＡに対し、ｐｅｐｔｉｄｅ２、ｐｅｐｔｉｄｅ３、ｐｅｐｔｉｄｅ４、ｐｅｐｔｉｄｅ５、ｐｅｐｔｉｄｅ６を付与したＹ１３－２５９－ＨＡは、ＫＲＡＳ－Ｈｉｓとの結合機能が向上していることが確認された。さらに、ｐｅｐｔｉｄｅ２又はｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したＹ１３－２５９－ＨＡは、ｐｅｐｔｉｄｅ４、ｐｅｐｔｉｄｅ５、ｐｅｐｔｉｄｅ６を付与したＹ１３－２５９－ＨＡと比較して、有意に細胞内でのＫＲＡＳ－Ｈｉｓとの結合機能が向上していることが確認された。
　この結果から、本実施形態のポリペプチドは、細胞内で発現する抗体の凝集性を改善する効果が報告されている従来のポリペプチドと比較して、細胞内での抗体などの発現レベルを安定的に保持し、かつ抗原結合性ポリペプチドの標的抗原への結合機能を顕著に向上させることが確かめられた。
［実験例７］
（抗原結合性ポリペプチドの細胞内在性標的抗原に対する結合機能向上性の検討）
　これまでの検討では、標的抗原として、細胞内に過剰発現させたＫＲＡＳ－Ｈｉｓを用いてきた。本研究で見出されたポリペプチドの結合機能性向上効果が、細胞内在性の標的抗原でも見られるのかを確認するため、内在性のＫＲＡＳへの結合機能性向上効果について免疫沈降法による評価を行った。
　図７左上は、細胞ｌｙｓａｔｅ（免疫沈降前の試料）のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図７左下は、免疫沈降後の試料のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図７中、「Ｙ１３－２５９－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅを付与しないＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ｐｅｐ３－Ｙ１３－２５９－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ｍｏｃｋ」はネガティブコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．４空ベクターをトランスフェクションした結果であることを示す。その結果、Ｙ１３－２５９－ＨＡとｐｅｐ３－Ｙ１３－２５９－ＨＡにおいて細胞ｌｙｓａｔｅ中に各ｉｎｔｒａｂｏｄｙが発現し、また細胞内在性のＫＲＡＳが存在することが確認できた。なお、図７左下の「＊」で示す矢印のバンドは、免疫沈降に使用したビーズ由来の非特異バンドと考えられた。また、「＊＊」で示す矢印のバンドはＫＲＡＳの分解物である可能性が考えられた。
　図７右は、免疫沈降後のサンプルに含まれる各ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していた内在性ＫＲＡＳの輝度値を算出し、ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対する内在性ＫＲＡＳ量の比率（比率＝内在性ＫＲＡＳ量／ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量）を比較した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は各ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対する内在性ＫＲＡＳ量の比率を示す。その結果、ｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したＹ１３－２５９－ＨＡは、ｐｅｐｔｉｄｅ付与無しと比較して、有意に細胞内在性ＫＲＡＳとの結合機能が向上していることが確認された。
　この結果より、本実施形態のポリペプチドの結合機能性向上効果は、細胞内在性の標的抗原への結合においても有効であることが分かった。
［実験例８］
（抗原結合性ポリペプチドの異なる標的抗原に対する結合機能性向上効果の検討）
　これまでの検討では、標的抗原としてＫＲＡＳを用いてきた。本研究で見出されたポリペプチドの結合機能性向上効果が、その他の標的抗原でも見られるのかを確認するため、抗β－ガラクトシダーゼ抗体ｓｃＦｖ１３のβ－ガラクトシダーゼに対する結合機能性向上効果について免疫沈降法による評価を行った。
　図８左上は、細胞ｌｙｓａｔｅ（免疫沈降前の試料）のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図８左下は、免疫沈降後の試料のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図８中、「ｓｃＦｖ１３－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅを付与しないｓｃＦｖ１３－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ｐｅｐ３－ｓｃＦｖ１３－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したｓｃＦｖ１３－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「β－Ｇａｌ－ＦＬＡＧ　ｏｎｌｙ」はネガティブコントロールとしてβ－Ｇａｌ－ＦＬＡＧのみを発現させた結果であることを示し、「ｍｏｃｋ」はネガティブコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．４空ベクターをトランスフェクションした結果であることを示す。その結果、ｓｃＦｖ１３－ＨＡとｐｅｐ３－ｓｃＦｖ１３－ＨＡにおいて細胞ｌｙｓａｔｅ中に各ｉｎｔｒａｂｏｄｙとβ－Ｇａｌ－ＦＬＡＧが発現することが確認できた。
　図８右は、免疫沈降後のサンプルに含まれる各ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたβ－Ｇａｌ－ＦＬＡＧの輝度値を算出し、ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するβ－Ｇａｌ－ＦＬＡＧ量の比率（比率＝β－Ｇａｌ－ＦＬＡＧ量／ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量）を比較した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は各ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するβ－Ｇａｌ－ＦＬＡＧ量の比率を示す。その結果、ｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したｓｃＦｖ１３－ＨＡは、ｐｅｐｔｉｄｅ付与無しと比較して、有意にβ－Ｇａｌ－ＦＬＡＧとの結合機能が向上していることが確認された。
　この結果より、本実施形態のポリペプチドの結合機能性向上効果は、ＫＲＡＳ以外の標的抗原への結合においても有効であることが分かった。
［実験例９］
（異なるフォーマットの抗原結合性ポリペプチド（ＶＨ）の異なる標的抗原に対する結合機能性向上効果の検討）
　これまでの検討では、抗原結合性ポリペプチドとしてｓｃＦｖを用いてきた。本研究で見出されたポリペプチドの結合機能性向上効果が、その他のフォーマットの抗原結合性ポリペプチドでも見られるのかを確認するため、抗ＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ変異体）抗体ＶＨであるｉＤａｂ＃６の結合機能性向上効果について免疫沈降法による評価を行った。
　図９左上は、細胞ｌｙｓａｔｅ（免疫沈降前の試料）のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図９左下は、免疫沈降後の試料のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図９中、「ｉＤａｂ＃６－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅを付与しないｉＤａｂ＃６－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ｐｅｐ３－ｉＤａｂ＃６－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したｉＤａｂ＃６－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ＨＲＡＳ－ＦＬＡＧ　ｏｎｌｙ」はネガティブコントロールとしてＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）－ＦＬＡＧのみを発現させた結果であることを示し、「ｍｏｃｋ」はネガティブコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．４空ベクターをトランスフェクションした結果であることを示す。その結果、ｉＤａｂ＃６－ＨＡとｐｅｐ３－ｉＤａｂ＃６－ＨＡにおいて細胞ｌｙｓａｔｅ中に各ｉｎｔｒａｂｏｄｙとＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）－ＦＬＡＧが発現することが確認できた。
　図９右は、免疫沈降後のサンプルに含まれる各ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）－ＦＬＡＧの輝度値を算出し、ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）－ＦＬＡＧ量の比率（比率＝ＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）－ＦＬＡＧ量／ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量）を比較した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は各ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）－ＦＬＡＧ量の比率を示す。その結果、ｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したｉＤａｂ＃６－ＨＡは、ｐｅｐｔｉｄｅ付与無しと比較して、有意にＨＲＡＳ（Ｇ１２Ｖ）－ＦＬＡＧとの結合機能が向上していることが確認された。
　この結果より、本実施形態のポリペプチドの結合機能性向上効果は、ｓｃＦｖフォーマットだけでなく、ＶＨフォーマットの抗原結合性ポリペプチドにおいても有効であることが分かった。
［実験例１０］
（異なるフォーマットの抗原結合性ポリペプチド（サメ抗体ｖＮＡＲ）の異なる標的抗原に対する結合機能性向上効果の検討）
　実験例１０のＶＨフォーマットに引き続き、サメ抗体ｖＮＡＲフォーマット抗原結合性ポリペプチドでも効果が見られるのかを確認するため、抗ＥＧＦＰ抗体ｖＮＡＲであるＢｓＧ７３の結合機能性向上効果について免疫沈降法による評価を行った。
　図１０左上は、細胞ｌｙｓａｔｅ（免疫沈降前の試料）のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１０左下は、免疫沈降後の試料のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１０中、「ＢｓＧ７３－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅを付与しないＢｓＧ７３－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ｐｅｐ３－ＢｓＧ７３－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したＢｓＧ７３－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ＥＧＦＰ　ｏｎｌｙ」はネガティブコントロールとしてＥＧＦＰのみを発現させた結果であることを示し、「ｍｏｃｋ」はネガティブコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．４空ベクターをトランスフェクションした結果であることを示す。その結果、ＢｓＧ７３－ＨＡとｐｅｐ３－ＢｓＧ７３－ＨＡにおいて細胞ｌｙｓａｔｅ中に各ｉｎｔｒａｂｏｄｙとＥＧＦＰが発現することが確認できた。
　図１０右は、免疫沈降後のサンプルに含まれる各ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＥＧＦＰの輝度値を算出し、ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するＥＧＦＰ量の比率（比率＝ＥＧＦＰ量／ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量）を比較した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は各ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するＥＧＦＰ量の比率を示す。その結果、ｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したＢｓＧ７３－ＨＡは、ｐｅｐｔｉｄｅ付与無しと比較して、有意にＥＧＦＰとの結合機能が向上していることが確認された。
　この結果より、本実施形態のポリペプチドの結合機能性向上効果は、サメ抗体ｖＮＡＲフォーマットの抗原結合性ポリペプチドにおいても有効であることが分かった。
［実験例１１］
（異なるフォーマットの抗原結合性ポリペプチド（ラクダ科抗体ＶＨＨ）の異なる標的抗原に対する結合機能性向上効果の検討）
　ラクダ科抗体ＶＨＨフォーマット抗原結合性ポリペプチドでも効果が見られるのかを確認するため、抗ＥＧＦＰ抗体ＶＨＨである「ｅｎｈａｎｃｅｒ」の結合機能性向上効果について免疫沈降法による評価を行った。
　図１１左上は、細胞ｌｙｓａｔｅ（免疫沈降前の試料）のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１１左下は、免疫沈降後の試料のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１１中、「ｅｎｈａｎｃｅｒ－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅを付与しないｅｎｈａｎｃｅｒ－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ｐｅｐ３－ｅｎｈａｎｃｅｒ－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したｅｎｈａｎｃｅｒ－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ＥＧＦＰ　ｏｎｌｙ」はネガティブコントロールとしてＥＧＦＰのみを発現させた結果であることを示し、「ｍｏｃｋ」はネガティブコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．４空ベクターをトランスフェクションした結果であることを示す。その結果、ｅｎｈａｎｃｅｒ－ＨＡとｐｅｐ３－ｅｎｈａｎｃｅｒ－ＨＡにおいて細胞ｌｙｓａｔｅ中に各ｉｎｔｒａｂｏｄｙとＥＧＦＰが発現することが確認できた。
　図１１右は、免疫沈降後のサンプルに含まれる各ｉｎｔｒａｂｏｄｙと結合していたＥＧＦＰの輝度値を算出し、ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するＥＧＦＰ量の比率（比率＝ＥＧＦＰ量／ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量）を比較した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は各ｉｎｔｒａｂｏｄｙ量に対するＥＧＦＰ量の比率を示す。その結果、ｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したｅｎｈａｎｃｅｒ－ＨＡは、ｐｅｐｔｉｄｅ付与無しと比較して、有意にＥＧＦＰとの結合機能が向上していることが確認された。
　この結果より、本実施形態のポリペプチドの結合機能性向上効果は、ラクダ科抗体ＶＨＨフォーマットの抗原結合性ポリペプチドにおいても有効であることが分かった。
　これまでの結果から、本実施形態のポリペプチドの結合機能性向上効果は、あらゆる抗体フォーマットの抗原結合性ポリペプチドと、あらゆる標的抗原において有効であることが分かった。
［実験例１２］
（細胞増殖抑制の低減効果の比較検討）
　実験例６に加えて、細胞内で発現する抗体の凝集性を改善する効果が報告されているｐｅｐｔｉｄｅ４（配列番号２６、ｓ３Ｆｌａｇ）、ｐｅｐｔｉｄｅ５（配列番号２７、ＤＥ２．０）、ｐｅｐｔｉｄｅ６（配列番号２８、ＤＥ５．０）（いずれも特許文献１（国際公開第２０１９／００４２１３号）参照）を付与したＹ１３－２５９－ＨＡと、本研究で細胞内での抗体の標的抗原への結合機能性向上効果を見出したｐｅｐｔｉｄｅ２及びｐｅｐｔｉｄｅ３をＮ末端に付与したＹ１３－２５９－ＨＡに関して、２９３Ａ細胞内に発現させた際の細胞増殖に対する影響の比較評価を実施した。各ベクターをトランスフェクション後、経時的に細胞を撮像し、この画像を元に２９３Ａ細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）を算出した。
　図１２左は、トランスフェクション後の細胞増殖について、ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）を指標に経時的に示したグラフである。グラフの縦軸は２９３Ａ細胞のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）、横軸はトランスフェクション後の経過時間を示す。図１２右は、トランスフェクション後４０時間時点のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ（％）を縦軸に取った棒グラフである。図１２中、「Ｙ１３－２５９－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅを付与しないＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、「ｐｅｐ２－Ｙ１３－２５９－ＨＡ」はｐｅｐｔｉｄｅ２を付与したＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた結果であることを示し、以下同様である。また、「ｕｎｔｒｅａｔｅｄ」はトランスフェクションを実施していない結果であることを示す。
　その結果、Ｙ１３－２５９－ＨＡを発現させた細胞では、ｕｎｔｒｅａｔｅｄと比較して細胞増殖が抑制されていることが確認された。さらに、ｐｅｐｔｉｄｅ２、ｐｅｐｔｉｄｅ３、ｐｅｐｔｉｄｅ４、ｐｅｐｔｉｄｅ６を付与したＹ１３－２５９－ＨＡを発現させた場合、細胞増殖抑制が有意に低減されたことが確認された。
　加えて、ｐｅｐｔｉｄｅ３を付与したＹ１３－２５９－ＨＡは、ｐｅｐｔｉｄｅ４、ｐｅｐｔｉｄｅ５、ｐｅｐｔｉｄｅ６を付与したＹ１３－２５９－ＨＡと比較して、細胞内増殖抑制の低減効果が有意に向上していることが確認された。
　ｐｅｐｔｉｄｅ２を付与したＹ１３－２５９－ＨＡは、ｐｅｐｔｉｄｅ５又はｐｅｐｔｉｄｅ６を付与したＹ１３－２５９－ＨＡと比較して、細胞増殖抑制の低減効果が有意に向上していることが確認された。また、ｐｅｐｔｉｄｅ４を付与したＹ１３－２５９－ＨＡと比較しても、細胞内増殖抑制をより低減する傾向が観察された。
　以上の結果から、本実施形態のポリペプチドは、細胞内で発現する抗体の凝集性を改善する効果が報告されている従来のポリペプチドと比較して、細胞増殖抑制を顕著に低減することが確かめられた。
　本実施形態のポリペプチドによれば、細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上することができる。

Claims (22)

  1. 　細胞内での抗原結合性ポリペプチドの抗原への結合性を向上させるためのポリペプチドであって、
    　前記ポリペプチドは、３個以上２０個以下のアミノ酸からなり、且つ、前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の５７．０％超１００．０％未満が酸性アミノ酸である、ポリペプチド。
  2. 　前記ポリペプチドは、９個以上２０個以下のアミノ酸からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の６０．０％以上９０．０％以下が酸性アミノ酸である、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の６５．０％以上８０．０％以下が酸性アミノ酸である、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. 　前記ポリペプチドはＮ末端がグルタミン酸である、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 　前記ポリペプチドは酸性アミノ酸及び中性アミノ酸からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
  7. 　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の１０．０％以上４０．０％以下が中性アミノ酸である、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 　前記ポリペプチドを構成するアミノ酸の２０．０％以上３５．０％以下が中性アミノ酸である、請求項７に記載のポリペプチド。
  9. 　前記中性アミノ酸の側鎖が疎水性脂肪族基又は親水性基である、請求項６に記載のポリペプチド。
  10. 　前記中性アミノ酸が、プロリン、グリシン又はセリンである、請求項９に記載のポリペプチド。
  11. 　前記ポリペプチドは、塩基性アミノ酸を更に含み、且つ、前記塩基性アミノ酸がリシンである、請求項１に記載のポリペプチド。
  12. 　前記ポリペプチドは、以下の一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
    　一般式（Ｉ）中、
    　Ｘ１及びＸ４はそれぞれ独立に中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；
    　Ｘ２はＤ又は中性アミノ酸；
    　Ｘ３はＤ又はＥ;
    　ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０以上３以下の整数であり、且つ、０≦ｎ１＋ｎ２≦５である。
    　一般式（ＩＩ）中、
    　Ｘ１及びＸ４はそれぞれ独立に中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；
    　Ｘ２はＤ又は中性アミノ酸；
    　Ｘ３はＤ又はＥ;
    　Ｘ５は中性アミノ酸又は塩基性アミノ酸；
    　ｎ３及びｎ４はそれぞれ独立に０以上１以下の整数であり、且つ、関係式：１≦ｎ３＋ｎ４≦２を満たす。
  13. 　前記ポリペプチドは、配列番号６４～６６、７２、８２のいずれかに表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１２に記載のポリペプチド。
  14. 　配列番号２３～２５、３１、３３、３４及び４０～４２のいずれかに表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
  15. 　請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドと、抗原結合性ポリペプチドと、を含む、融合ポリペプチド。
  16. 　前記抗原結合性ポリペプチドが、特定の抗原に対する抗体が有する１種以上の相補性決定領域を含む、請求項１５に記載の融合ポリペプチド。
  17. 　請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
  18. 　配列番号３～５、１１、１３、１４、１９及び２０～２２のいずれかに表される塩基配列からなる、請求項１７に記載の核酸。
  19. 　請求項１７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  20. 　前記核酸が、配列番号３～５、１１、１３、１４、１９及び２０～２２のいずれかに表される塩基配列からなる、請求項１９に記載の発現ベクター。
  21. 　請求項１５に記載の融合ポリペプチドをコードする、核酸。
  22. 　請求項２１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
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