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WO2018124735A1 - 세균 메타게놈 분석을 통한 대장종양 진단 방법 - Google Patents

세균 메타게놈 분석을 통한 대장종양 진단 방법 Download PDF

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WO2018124735A1
WO2018124735A1 PCT/KR2017/015557 KR2017015557W WO2018124735A1 WO 2018124735 A1 WO2018124735 A1 WO 2018124735A1 KR 2017015557 W KR2017015557 W KR 2017015557W WO 2018124735 A1 WO2018124735 A1 WO 2018124735A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
derived
colon
extracellular vesicles
bacteria
bacterial
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/KR2017/015557
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김윤근
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MD Healthcare Inc
Original Assignee
MD Healthcare Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020170180144A external-priority patent/KR101940426B1/ko
Application filed by MD Healthcare Inc filed Critical MD Healthcare Inc
Priority to JP2019535378A priority Critical patent/JP6914552B2/ja
Priority to CN201780081381.2A priority patent/CN110382720A/zh
Priority to US16/472,986 priority patent/US20190330687A1/en
Priority to EP17887675.1A priority patent/EP3564390B1/en
Publication of WO2018124735A1 publication Critical patent/WO2018124735A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing colon tumors by analyzing bacterial metagenome, and more specifically, by performing bacterial metagenomic analysis using a sample derived from a subject, by analyzing the increase or decrease in the content of specific bacterial-derived extracellular vesicles. And a method for diagnosing colorectal tumors such as colorectal cancer.
  • Colon cancer or colorectal cancer is a malignant tumor of the cecum, colon and rectum that occurs on the mucous membrane of the innermost surface of the large intestine.
  • colon cancer or colorectal cancer is a malignant tumor of the cecum, colon and rectum that occurs on the mucous membrane of the innermost surface of the large intestine.
  • the frequency of eating habits has been increasing rapidly as westernized aspects of the diet recently, and the mortality rate of colorectal cancer in recent 10 years is about 80%.
  • the rate of increase is increasing.
  • the age of onset occurs most frequently in the sixties, and by site, it occurs slightly more in the rectum than in the colon.
  • Colorectal cancer can occur at any age, but over 90% of people with colorectal cancer are older than 40 years of age, and their incidence doubles every 10 years.
  • colon cancers are known to originate from colon polyp or colon adenoma. Polyps are initially an abnormal growth of the epithelium in the lining of the large intestine, protruding and appearing in 15-20% of adults. It is a common disease. In addition to colorectal polyps, family members of colorectal cancer are at increased risk for colon cancer, even if they have had ulcerative colitis for a long time. In addition, colorectal cancer is a representative cancer known to be associated with food, and is known to cause low intake of fiber, high intake of animal fat, or excessive intake of refined sugar (sugar) due to westernization of diet. .
  • cancer cells can be detected by biopsy through colonoscopy.
  • Most colon cancers are asymptomatic and therefore difficult to diagnose.
  • conventional diagnostic methods are often found when solid cancers such as colorectal cancer are advanced, it is necessary to predict colon cancer and causative factors in advance in order to prevent medical costs and death due to colorectal cancer.
  • Providing a method of prevention is an effective way.
  • Microbiota refers to a microbial community including bacteria, archaea and eukarya that exist in a given settlement.Intestinal microbiota is an important role in human physiology. It is known to have a great effect on human health and disease through interaction with human cells.
  • the symbiotic bacteria secrete nanometer-sized vesicles to exchange information about genes and proteins in other cells.
  • the mucous membrane forms a physical protective film that particles larger than 200 nanometers (nm) in size can't pass through, so that the symbiotic bacteria cannot pass through the mucosa, but bacterial-derived vesicles are usually less than 100 nanometers in size. It freely speaks to the mucous membrane and is absorbed by our body.
  • Metagenomics also called environmental genomics, can be said to be an analysis of metagenomic data obtained from samples taken from the environment (Korean Patent Publication No. 2011-0073049). Recently, it has become possible to list the bacterial composition of the human microflora by a method based on 16s ribosomal RNA (16s rRNA) sequencing. Next generation sequencing of 16s rDNA sequencing gene of 16s ribosomal RNA is performed. , NGS) platform to analyze.
  • the present inventors In order to diagnose colon tumors such as colorectal polyps and colorectal cancer, the present inventors extracted a gene from bacterial vesicles using urine and stool, which are samples derived from a subject, and performed a metagenome analysis on the colon polyps and colon. Bacterial-derived extracellular vesicles that can act as causative factors of colorectal tumors, such as cancer, have been identified, and thus the present invention has been completed.
  • an object of the present invention is to provide an information providing method for diagnosing colon tumors through metagenomic analysis of genes present in bacterial extracellular vesicles.
  • the present invention provides a method for providing information for diagnosing colon tumor, comprising the following steps:
  • the present invention provides a method for diagnosing colon tumor, comprising the following steps:
  • the present invention provides a method for predicting the risk of developing colon tumor, comprising the following steps:
  • colorectal cancer may be diagnosed by comparing the increase and decrease of the bacterial-derived extracellular vesicles in a sample derived from normal and colon cancer patients by sequencing the PCR product in step (c). have.
  • step (c) Deferribacteres, Tenericutes, Actinobacteria, Acidobacteria, Armatimonadetes, Planctomycetes, Fusobacteria, Proteobacteria, and Euryarchaeota extracellular vesicles derived from (phylum) bacteria ,
  • One or more order bacterial derived extracellular vesicles selected from the group consisting of:
  • Peptococcaceae Deferribacteraceae, Turicibacteraceae, Halomonadaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae, Peptostreptococcaceae, Rhodobacteraceae, Nocardioidaceae, Sphingomonadaceae, Bartonellaceae, Cellulomonadaceae, Lactobacillaceae, Rhizobiaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Leptotrichiaceae, Coriobacteriaceae, Xenococcaceae, Aeromonadaceae, Geodermatophilaceae, Bdellovibrionaceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Streptococcaceae, One or more family or small family cells from the group consisting of Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Aerococcaceae, Comamonadaceae, Paraprevo
  • rc4-4 Proteus, Catenibacterium, Mucispirillum, Eubacterium, Turicibacter, Alloiococcus, Halomonas, Prevotella, Dialister, Anaerostipes, SMB53, Faecalibacterium, Blautia, Capnocytophaga, Sphingomonas, Lactobacillus, Fimbriicus, Achromobacus, Achromobacsium, Achromobacsium Bdellovibrio, Alkanindiges, Roseateles, Shuttleworthia, Rhizobium, Morganella, Acinetobacter, Pseudomonas, Enterococcus, Lactococcus, Coprococcus, Bacteroides, Dorea, Streptococcus, Lachnospira, Ruminococcus, Corynebacteria, Comamocobacterium, Comamocobacterium, Lacosebacteria, Mycobacterium terpenia The increase or decrease in the content of
  • the colorectal cancer through the step of comparing the increase and decrease of the content of bacterial-derived extracellular vesicles in the colon-derived patient and colorectal cancer-derived sample by sequencing the PCR product Diagnosis can be made.
  • step (c) Spirochaetes phylum bacteria-derived extracellular vesicles
  • One or more class bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Spirochaetes, and Acidobacteria-6,
  • One or more order bacterial extracellular vesicles selected from the group consisting of Spirochaetales, and Myxococcales,
  • the increase or decrease in the content of one or more genus bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Treponema, Dialister, Oscillospira, and Eubacterium can be compared.
  • the colon polyps are diagnosed by comparing the increase or decrease of the bacterial-derived extracellular vesicles in the sample from the normal and colon polyps patient by sequencing the PCR product. Can be.
  • step (c) at least one phylum bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Actinobacteria, Proteobacteria, and Euryarchaeota,
  • One or more class bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Betaproteobacteria, Solibacteres, Gammaproteobacteria, Clostridia, Methanobacteria, and 4C0d-2,
  • One or more order bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Burkholderiales, Sphingomonadales, Solibacterales, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Oceanospirillales, Desulfovibrionales, and Methanobacteriales,
  • Rhizobiaceae Group consisting of Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Exiguobacteraceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Streptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Comamonadaceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Paraprevotellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Christensenellaceae, Odoribacteraceae, Deofolioaceae, Deofolioaceae Extracellular vesicles derived from abnormal families, or
  • Sphingomonas Alkanindiges, Roseateles, Rhizobium, Morganella, Proteus, Exiguobacterium, Acinetobacter, Pseudomonas, SMB53, Lactococcus, Coprococcus, Streptococcus, Bacteroides, Ruminococcus, Corynebacterium, Odoribacter, Clonastriia Triacerocitra, Clonastriia Viracerosia, Clonastriia psi
  • the increase or decrease in the content of one or more genus bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Dialister, Phascolarctobacterium, Sutterella, Halomonas, Roseomonas, and Methanobrevibacter can be compared.
  • the subject sample may be feces or urine.
  • Extracellular vesicles secreted by the bacteria present in the environment can be absorbed into the body and directly affect inflammation and cancer development, and colon polyps and colorectal cancer are difficult to diagnose effectively because they are difficult to diagnose early.
  • Predicting the risk of colon tumors such as colorectal polyps and colorectal cancer through metagenomic analysis of bacterial or bacterial-derived extracellular vesicles using a human-derived sample according to the present invention, early diagnosis and prediction of risk groups of colon tumors and appropriate management By delaying the onset time or preventing the onset, and after the onset can be diagnosed early can reduce the incidence of colon tumors and increase the treatment effect.
  • metagenome analysis predicts causative factors in patients diagnosed with colorectal polyps or colorectal cancer, thereby avoiding exposure to causative factors and improving colon polyps and colorectal cancer, or preventing recurrence.
  • Figure 1 is for evaluating the distribution of bacteria-derived extracellular vesicles in the body
  • Figure 1a after the administration of oral intestinal bacteria (Bacteria) and bacteria-derived vesicles (EV) in the mouth hourly (0, 5min, 3h, 6h, and 12h) is a photograph taken of their distribution
  • Figure 1b is a 12 hours after oral administration of intestinal bacteria (Bacteria) and bacteria-derived extracellular vesicles (EV) to the urine and various organs (heart, Lung, liver, kidney, spleen, adipose tissue, and muscles), and the photographs of the distribution of the bacterial and extracellular vesicles.
  • Figure 2 shows the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the phylum level by separating bacterial-derived vesicles from colon cancer patients and normal feces.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 3 shows the distribution of bacterial-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at a class level by separating bacterial-derived vesicles from colon cancer patients and normal stool.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 6 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the genus level by separating bacterial-derived vesicles from colon cancer patients and normal stool.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 7 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the phylum level by separating the bacteria-derived vesicles from colon cancer patients and normal urine, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 8 shows the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at a class level by separating bacterial-derived vesicles from colorectal cancer patients and normal urine.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 9 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the order level by separating the bacteria-derived vesicles in colon cancer patients and normal urine, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 10 shows the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the family level after separation of bacteria-derived vesicles from colon cancer patients and normal urine.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • 11 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the genus level after separating the bacteria-derived vesicles in colon cancer patients and normal urine.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 7 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the phylum level by separating the bacteria-derived vesicles in the urine of colon cancer patients and colon polyps patients .
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 9 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) of significant diagnostic performance at the order (neck) by separating the bacteria-derived vesicles in the urine of colorectal cancer patients and colon polyps patients, performing a metagenome analysis .
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 10 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the family level by separating the bacteria-derived vesicles in the urine of colorectal cancer patients and colon polyps patients, and performing a metagenome analysis. .
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • 11 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the genus level after separating the bacteria-derived vesicles in the urine of patients with colorectal cancer and colon polyps. .
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 13 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the class level by separating the bacteria-derived vesicles in the stool of colon cancer patients and colon polyps patients, and performing a metagenomic analysis .
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • 16 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the genus level after separation of bacteria-derived vesicles in the bowel cancer patients and colon polyps patients stool. .
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • 17 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the order level by separating the bacteria-derived vesicles in the urine of colorectal cancer patients and colon polyps patients after performing a metagenome analysis .
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • 19 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the phylum level by separating bacterial-derived vesicles from colon polyps and normal feces.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • 21 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the order level by separating bacterial-derived vesicles from colon polyps and normal feces, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • Figure 24 shows the distribution of bacterial-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the phylum level by separating bacterial-derived vesicles from colon polyps and normal urine.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • FIG. 25 shows the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at a class level after separation of bacterial-derived vesicles from colon polyps and normal urine.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 26 shows the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the neck level after separation of bacteria-derived vesicles from colon polyps and normal urine.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 27 shows the distribution of bacterial-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the family level after separation of bacterial-derived vesicles from colon polyps and normal urine.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • FIG. 28 shows the distribution of bacterial-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at genus level after isolation of bacterial-derived vesicles from colon polyps and normal urine.
  • EVs bacterial-derived vesicles
  • the present invention relates to a method for diagnosing colorectal tumors such as colon polyps and colorectal cancer through bacterial metagenome analysis, and the present inventors extract genes from extracellular vesicles derived from bacteria using a sample derived from a subject, Bacterial-derived extracellular vesicles that could act as causative factors of colorectal tumors such as colon polyps and colorectal cancer were identified.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting DNA from the extracellular vesicles isolated from the subject sample;
  • It provides an information providing method for diagnosing colon tumors comprising comparing the increase and decrease of the content of bacterial-derived extracellular vesicles in a sample derived from normal people and colon polyps through sequencing of the PCR product.
  • diagnosisd colorectal cancer means to determine whether or not colon cancer is likely to develop, whether or not colon cancer is relatively high, or whether colorectal cancer has already occurred in a patient.
  • the method of the present invention can be used to prevent or delay the onset of the disease through special and appropriate management as a patient at high risk of developing colorectal cancer for any particular patient.
  • the methods of the present invention can be used clinically to determine treatment by early diagnosis of colon cancer and selecting the most appropriate treatment regimen.
  • the term "diagnosing colon polyps" means determining whether a colon polyp is likely to develop, whether the colon polyp is relatively high, or whether a polyp has already occurred.
  • the method of the present invention can be used to prevent or delay the onset of the disease through special and appropriate management as a patient at high risk of developing colon polyps for any particular patient.
  • the methods of the present invention can be used clinically to determine treatment by early diagnosis of colon polyps and selecting the most appropriate treatment regimen.
  • metagenome used in the present invention, also referred to as “metagenome”, refers to the total of the genome including all viruses, bacteria, fungi, etc. in an isolated area such as soil, animal intestine, It is mainly used as a concept of genome explaining the identification of many microorganisms at once using sequencer to analyze microorganisms which are not cultured.
  • metagenome does not refer to one species of genome or genome, but refers to a kind of mixed dielectric as the genome of all species of one environmental unit. This is a term from the point of view of defining a species in the course of the evolution of biology in terms of functional species as well as various species that interact with each other to create a complete species.
  • rapid sequencing is used to analyze all DNA and RNA, regardless of species, to identify all species in one environment, and to identify interactions and metabolism.
  • metagenome analysis was preferably performed using bacterial-derived extracellular vesicles isolated from serum.
  • meta-genomic analysis was performed on genes present in the extracellular vesicles in feces and urine of normal people, colon polyps, and colon cancer patients. Analyzes at the order, family, and genus levels, respectively, identified bacterial vesicles that could actually cause colon cancer and colon polyps development.
  • the present invention as a result of analyzing the bacteria-derived vesicles metagenome present in the stool at the gate level, Deferribacteres, Tenericutes, Actinobacteria, Acidobacteria, Armatimonadetes, Planctomycetes, and Fusobacteria door-derived vesicles derived from colon cancer patients There was a significant difference between and normal (see Example 4).
  • the bacterium-derived vesicle metagenome present in the feces at the river level Deferribacteres, Mollicutes, 4C0d-2, Bacilli, Alphaproteobacteria, Saprospirae, Fimbriimonadia, Acidobacteria-6, Solibacteres, Vesicles derived from Coriobacteriia, Oscillatoriophycideae, and Fusobacteriia bacterium showed significant differences between colon cancer patients and normal individuals (see Example 4).
  • the result of analyzing the bacterial-derived vesicle metagenome present in the stool at the neck level RF32, YS2, Deferribacterales, Turicibacterales, RF39, Oceanospirillales, Rhizobiales, Lactobacillales, Rhodobacterales, Saprospirales, Sphingomonadales, Fimbriimonadales, iii1-15, Solibacterales, Coriobacteriales, Chroococcales, Fusobacteriales, and Bdellovibrionales neck bacterial-derived vesicles showed significant differences between colon cancer patients and normal individuals (see Example 4).
  • the bacterium-derived vesicles metagenome present in the feces at an excessive level Peptococcaceae, Deferribacteraceae, Turicibacteraceae, Halomonadaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae, Peptostreptococcaceae, Rhodobacteraceae, Nocardioidaceae, Sphellomoaceae, Barton Cellulomonadaceae, Lactobacillaceae, Rhizobiaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Leptotrichiaceae, Coriobacteriaceae, Xenococcaceae, Aeromonadaceae, Geodermatophilaceae, and Bdellovibrionaceae were significantly different between colon cancer patients and normal colon cancer patients (see Example 4).
  • bacteria-derived vesicle metagenome present in the feces at the genus level, rc4-4, Proteus, Catenibacterium, Mucispirillum, Eubacterium, Turicibacter, Alloiococcus, Halomonas, Prevotella, Dialister, Anaerostipes, SMB53, Faecalibacterium, Blautia, Capnocytophaga, Sphingomonas, Lactobacillus, Fimbriimonas, Dermacoccus, Achromobacter, Novosphingobium, Sneathia, Agrobacterium, Blastomonas, Bdellovibrio, Alkanindiges, Roseateles, and the subcutaneous intestines of the genus There was a difference (see Example 4).
  • the bacterium-derived vesicles metagenome present in the urine was analyzed at the neck level. There was a significant difference between cancer patients and normal subjects (see Example 5).
  • the bacteria-derived vesicles metagenome present in the urine at an excessive level Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Streptococcaceae, Turicibacteraceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Aerococcaceae, Comamonadaceae, Clostridiaceae, Paraprevotellaceae, Christensenellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Gordoniaceae, Mycobacteriaceae, Desulfovibrionaceae, Halomonadaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, and Rikenellaceae and bacterial-derived vesicles showed significant differences between colon cancer patients and normal individuals (see Example 5).
  • the bacteria-derived vesicle metagenome present in the urine at the genus level Rhizobium, Proteus, Morganella, Acinetobacter, Pseudomonas, SMB53, Enterococcus, Lactococcus, Turicibacter, Coprococcus, Bacteroides, Dorea, Streptococcus, Lachnospira, Ruminococcus, Corynebacterium, Comamonas, Gordonia, Paraprevotella, Mycobacterium, Roseburia, Dialister, Slackia, Escherichia, Phascolarctobacterium, Sutterella, Virgibacillus, Eggerthella, Halomonasoc, Citrobacteriococcus, Miobacteriumobacero Derived vesicles were significantly different between colorectal cancer patients and normal subjects (see Example 5).
  • the vesicles derived from Spirochaetes, and Acidobacteria-6 strong bacteria were significant between colon cancer patients and colon polyps patients. There was a difference (see Example 6).
  • Eubacterium neck bacteria-derived vesicles had a significant difference between colon cancer patients and colon polyps patients (execution See Example 7).
  • bacteria-derived vesicles metagenome present in the feces at the genus level as a result of analyzing the bacteria-derived vesicles metagenome present in the feces at the genus level, Sphingomonas, Alkanindiges, and Roseateles bacteria-derived vesicles significant differences between the colon polyps and normal people (See Example 8).
  • the bacterium-derived vesicle metagenome present in the urine as a result of the analysis, Gammaproteobacteria, Clostridia, Methanobacteria, and 4C0d-2 strong bacteria-derived vesicles between the colon polyps and normal people There was a significant difference (see Example 9).
  • the bacterial-derived vesicle metagenome present in the urine as a result of neck analysis, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Oceanospirillales, Desulfovibrionales, and Methanobacteriales vesicles derived from the neck bacteria and normal colon colon patients There was a significant difference between them (see Example 9).
  • the bacterium-derived vesicle metagenome present in the urine at an exaggerated level Exiguobacteraceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Comamonadaceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Paraprevotellaceae, Ruminococcaceae Corynebacteriaceae, Christensenellaceae, Odoribacteraceae, Desulfovibrionaceae, Halomonadaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, and Rikenellaceae showed significant differences between colonic and normal patients (see Example 9).
  • the bacteria-derived vesicle metagenome present in the urine at the genus level Rhizobium, Morganella, Proteus, Exiguobacterium, Acinetobacter, Pseudomonas, SMB53, Lactococcus, Coprococcus, Streptococcus, Bacteroides, Differences between the normal vesicles of the genus of the genus of the genus of the strains of the genus (See Example 9).
  • the present invention through the results of the above embodiment, by performing a metagenomic analysis on the bacterial-derived extracellular vesicles isolated from feces and urine bacteria significantly changed in colorectal cancer patients compared to normal and colon polyps patients Derived vesicles were identified, and metagenome analysis confirmed that colon cancer can be diagnosed by analyzing the increase or decrease in the content of bacterial derived vesicles at each level.
  • the present invention is a bacterial-derived vesicle with a significantly changed content in colorectal patients compared to the normal by performing a metagenome analysis on the bacterial-derived extracellular vesicles isolated from feces and urine through the results as described above
  • the metagenomic analysis confirmed that colon polyps could be diagnosed by analyzing the increase and decrease of the content of bacterial-derived vesicles at each level.
  • the fluorescently labeled 50 ⁇ g of bacteria and bacteria-derived vesicles were administered in the same manner as above 12 hours.
  • Blood, Heart, Lung, Liver, Kidney, Spleen, Adipose tissue, and Muscle were extracted from mice.
  • the intestinal bacteria (Bacteria) were not absorbed in each organ, whereas the intestinal bacteria-derived extracellular vesicles (EVs) were urine, heart, lung as shown in FIG. And distribution in liver, kidney, spleen, adipose tissue, and muscle.
  • first stool and urine were put in a 10 ml tube and centrifuged (3,500 xg, 10min, 4 ° C) to settle the suspended solids to recover only the supernatant, followed by a new 10 ml. Transferred to the tube. After removing the bacteria and foreign substances from the recovered supernatant using a 0.22 ⁇ m filter, transfer to centripreigugal filters (50 kD) and centrifuged at 1500 xg, 4 °C for 15 minutes to discard the material smaller than 50 kD and 10 ml Concentrated until.
  • centripreigugal filters 50 kD
  • PCR was performed using the 16S rDNA primer shown in Table 1 to amplify the gene and perform sequencing (Illumina MiSeq sequencer). Output the result as a Standard Flowgram Format (SFF) file, convert the SFF file into a sequence file (.fasta) and a nucleotide quality score file using GS FLX software (v2.9), check the credit rating of the lead, and window (20 bps) The part with the average base call accuracy of less than 99% (Phred score ⁇ 20) was removed.
  • SFF Standard Flowgram Format
  • the Operational Taxonomy Unit performed UCLUST and USEARCH for clustering according to sequence similarity. Specifically, the clustering is based on 94% genus, 90% family, 85% order, 80% class, and 75% sequence similarity. OTU's door, river, neck, family and genus level classifications were performed, and bacteria with greater than 97% sequence similarity were analyzed using BLASTN and GreenGenes' 16S DNA sequence database (108,453 sequences) (QIIME).
  • Example 3 By the method of Example 3, vesicles were isolated from stool of 29 colon cancer patients and 358 normal patients, and then metagenome sequencing was performed. In the development of the diagnostic model, the strains whose p-value between the two groups is 0.05 or less and more than two times different between the two groups are selected in the t-test. under curve), sensitivity, and specificity.
  • Bacterial-derived vesicles in feces at the order level were analyzed by RF32, YS2, Deferribacterales, Turicibacterales, RF39, Oceanospirillales, Rhizobiales, Lactobacillales, Rhodobacterales, Saprospirales, Sphingomonadales, Fimbriimonadales, iii1-15, Solibactles, Corio
  • the diagnostic performance for colorectal cancer was significant (see Table 4 and Figure 4).
  • Bacterial-derived vesicles in feces at genus level were analyzed by rc4-4, Proteus, Catenibacterium, Mucispirillum, Eubacterium, Turicibacter, Alloiococcus, Halomonas, Prevotella, Dialister, Anaerostipes, SMB53, Faecalibacterium, Blautia, Capnocytopomonas, When diagnostic models were developed with one or more biomarkers of bacteria of the genus Lactobacillus, Fimbriimonas, Dermacoccus, Achromobacter, Novosphingobium, Sneathia, Agrobacterium, Blastomonas, Bdellovibrio, Alkanindiges, Roseateles, and Shuttleworthia, diagnostic performance for colorectal cancer was significant. (See Table 6 and FIG. 6).
  • Example 3 By the method of Example 3, the vesicles were isolated from the urine of 38 patients with colorectal cancer and 38 normal people and then subjected to metagenome sequencing. In the development of the diagnostic model, the strains whose p-value between the two groups is 0.05 or less and more than two times different between the two groups are selected in the t-test. under curve), sensitivity, and specificity.
  • Example 3 By the method of Example 3, vesicles were isolated from the stool of 29 colon cancer patients and 27 colon polyp patients, and then metagenome sequencing was performed. In the development of the diagnostic model, the strains whose p-value between the two groups is 0.05 or less and more than two times different between the two groups are selected in the t-test. under curve), sensitivity, and specificity.
  • the diagnostic performance for colon cancer was significant when the diagnostic model was developed for biomarkers of spirochaetes and Acidobacteria-6. See FIG. 13).
  • Example 7 With colon polyps Isolated from Urine Colon Cancer Patients Germ-derived parcel Metagenome Analysis-based Colorectal Cancer Diagnosis Model
  • Example 3 By the method of Example 3, the vesicles were isolated from the urine of 26 patients with colorectal cancer and 38 patients with colorectal polyps, and then metagenome sequencing was performed. In the development of the diagnostic model, the strains whose p-value between the two groups is 0.05 or less and more than two times different between the two groups are selected in the t-test. under curve), sensitivity, and specificity.
  • Example 8 Normal people Colon polyp Separated from feces Germ-derived parcel Metagenome Analytics based Colon polyp Diagnostic Model
  • Example 3 By the method of Example 3, vesicles were isolated from stool of 27 colon cancer patients and 358 normal patients, and then metagenome sequencing was performed. In the development of the diagnostic model, the strains whose p-value between the two groups is 0.05 or less and more than two times different between the two groups are selected in the t-test. under curve), sensitivity, and specificity.
  • Example 9 The normal person Colon polyp Isolated from urine Germ-derived parcel Metagenome Analytics based Colon polyp Diagnostic Model
  • Example 3 By the method of Example 3, the vesicles were isolated from the urine of 38 patients with colorectal cancer and 38 normal people and then subjected to metagenome sequencing. In the development of the diagnostic model, the strains whose p-value between the two groups is 0.05 or less and more than two times different between the two groups are selected in the t-test. under curve), sensitivity, and specificity.
  • the method for diagnosing colon tumors through bacterial metagenomic analysis is performed by performing bacterial metagenomic analysis using a sample derived from a subject to analyze the increase or decrease in the content of specific bacterial-derived extracellular vesicles, such as colon polyps and colon cancer. It can be used to predict and diagnose the risk of developing a tumor. Extracellular vesicles secreted by the bacteria present in the environment can be absorbed into the body and directly affect inflammation and cancer development, and colon polyps and colorectal cancer are difficult to diagnose effectively because they are difficult to diagnose early.
  • Predicting the risk of colon tumors such as colorectal polyps and colorectal cancer through metagenomic analysis of bacterial or bacterial-derived extracellular vesicles using a human-derived sample according to the present invention By delaying the onset time or preventing the onset, and after the onset can be diagnosed early can reduce the incidence of colon tumors and increase the treatment effect.
  • the bacterial metagenomic analysis according to the present invention in patients diagnosed with colorectal polyps or colon cancer improves the progression of colon polyps and colorectal cancer or prevents recurrence by predicting the causative factors and avoiding exposure to the causative factors. It is available.

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Abstract

본 발명은 인체 유래물에 존재하는 세균유래 소포 메타게놈 분석을 통해 대장용종 및 대장암 등의 대장종양 발생 및 원인인자를 예측하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 대변, 혹은 소변에 존재하는 세균유래 소포에 존재하는 메타게놈 염기서열을 분석하여 대장종양 원인인자 및 발생 위험도를 진단하기 위한 방법에 관한 것이다. 장내에는 수조개의 세균이 존재하고, 정보교환을 위해 세포밖으로 소포를 분비하는데, 세균인 경우에는 대장 상피세포로 흡수되지 않지만, 세균에서 분비된 소포는 점막을 통과하여 대장 상피세포로 흡수된 후, 혈액을 통해 전신적으로 분포한 후, 간과 콩팥을 통해 배설된다. 세균유래 소포는 염증, 암 발생을 증가 혹은 감소시킬 수 있는데, 본 발명은 인체 유래물에 존재하는 세균유래 소포의 유전자 메타게놈 염기서열 분석을 통해 대장종양 발생 위험도 및 원인인자를 진단하기 위한 방법으로 유용하게 이용할 수 있다. 또한, 대장용종 혹은 대장암 발병 후에도 조기진단 할 수 있소, 대장암 발병을 낮추고, 치료효과를 높일 수 있다.

Description

세균 메타게놈 분석을 통한 대장종양 진단 방법
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 대장종양을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 대장용종 및 대장암 등의 대장종양을 진단하는 방법에 관한 것이다.
대장암 (大腸癌, 영어: colon cancer) 혹은 대장직장종양(colorectal cancer)은 맹장, 결장과 직장에 생기는 악성 종양으로 대장의 가장 안쪽 표면인 점막에서 발생한 암이다. 2006년 발표에 따르면 우리나라에서는 위암에 이어 두 번째로 흔히 발생하는 암으로 근래에 식생활의 양상이 서구화되어 가면서 그 발생 빈도가 가파르게 증가하고 있고, 최근 10년 사이 대장암에 의한 사망률은 약 80%정도 증가하여 그 상승속도가 계속 높아지고 있는 추세이다. 호발 연령은 60대에 가장 빈번하게 발생하며, 부위별로 보면 직장에 발생하는 경우가 결장에 발생하는 경우보다 약간 더 많다. 모든 나이에서 대장암이 발생할 수 있지만 대장암 환자의 90%이상의 경우 나이가 40세 이상이고, 매 10년마다 그 발생률이 두 배씩 증가한다.
모든 대장암은 대장용종(colon polyp) 혹은 대장선종(colon adenoma)에서 시작된다고 알려져 있고, 용종은 처음에 대장 내벽에서 상피가 비정상적인 성장을 하여 돌출하는 것을 말하며, 성인의 15~20%에서 나타나는 아주 흔한 질병이다. 대장용종 이외에도 가족 중에 대장암에 걸린 사람이 있는 경우, 오랜 기간 동안 궤양성대장염에 시달린 경우에도 대장암이 위험이 증가한다. 또한, 대장암은 음식과 연관되어 있다고 알려져 있는 대표적인 암으로서, 식생활의 서구화로 섬유소 섭취가 적다든지, 동물성 지방 섭취가 많다든지, 혹은 정제된 당분 (설탕)의 과다 섭취 등이 유발요소로 알려져 있다.
초기 대장암의 경우에는 특별한 증상이 나타나지 않으나 증상이 없는 경우에도 눈에 띄지 않는 장출혈로 혈액이 손실되어 빈혈이 생길 수 있고, 간혹 식욕부진과 체중감소가 나타나기도 한다. 암이 진행된 경우에는 배가 아프거나 설사 또는 변비가 생기는 등 배변습관의 변화가 나타나기도 하고 항문에서 피가 나오는 직장출혈의 증세가 나타나기도 하며, 혈액은 밝은 선홍색을 띄거나 검은 색으로 나타날 수 있다. 대장암이 진행이 된 경우에는 배에서 평소에 만져지지 않던 덩어리가 만져질 수 있다. 가장 주의해야 할 증상으로는 배변 습관의 변화, 혈변, 동통 및 빈혈이며, 특히 40세 이상의 성인에서 이와 같은 변화가 있을 때에는 철저히 조사할 필요가 있다.
대장암의 확진은 대장 내시경 검사를 통한 조직검사를 통해 암세포를 발견해야 가능하다. 대부분 대장암은 조기에는 증상이 없으므로 진단이 상당히 어렵고, 현재 비침습적인 방법으로 대장암을 예측하는 방법은 전무하다. 기존 진단방법으로는 대장암 등의 고형암이 진행된 경우에 발견되는 경우가 많기 때문에, 대장암으로 인한 의료비용과 사망을 예방하기 위해선 대장종양 발생 및 원인인자를 미리 예측하여, 고위험군에서 대장암 발생을 예방하는 방법을 제공하는 것이 효율적인 방법이다.
한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통화하여 우리 몸에 흡수된다.
환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있다(국내공개특허 제2011-0073049호). 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA의 유전자인 16s rDNA 염기서열을 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS) platform을 이용하여 분석한다. 그러나 대장종양 발병에 있어서, 대변과 같은 인체 유래물에서 세균 및 세균 유래 소포를 분리하여 세균 유래 소포에 존재하는 메타게놈 분석을 통해 대장용종 및 대장암 등의 대장종양의 원인인자를 동정하여 대장종양을 진단하는 방법에 대해서는 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 대장용종 및 대장암 등의 대장종양을 진단하기 위하여, 피검체 유래 샘플인 소변 및 대변을 이용해 세균 유래 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 그 결과 대장용종 및 대장암 등의 대장종양의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 존재하는 유전자에 대한 메타게놈 분석을 통해 대장종양을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대장종양 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다 :
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 대장용종환자와 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장용종환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
그리고, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대장종양 진단방법을 제공한다 :
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 대장용종환자와 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장용종환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대장종양의 발병 위험도 예측방법을 제공한다 :
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 대장용종환자와 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장용종환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 대장암을 진단할 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 Deferribacteres, Tenericutes, Actinobacteria, Acidobacteria, Armatimonadetes, Planctomycetes, Fusobacteria, Proteobacteria, 및 Euryarchaeota로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
Deferribacteres, Mollicutes, 4C0d-2, Bacilli, Alphaproteobacteria, Saprospirae, Fimbriimonadia, Acidobacteria-6, Solibacteres, Coriobacteriia, Oscillatoriophycideae, Fusobacteriia, Gammaproteobacteria, Clostridia, 및 Methanobacteria로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
RF32, YS2, Deferribacterales, Turicibacterales, RF39, Oceanospirillales, Rhizobiales, Lactobacillales, Rhodobacterales, Saprospirales, Sphingomonadales, Fimbriimonadales, iii1-15, Solibacterales, Coriobacteriales, Chroococcales, Fusobacteriales, Bdellovibrionales, Desulfobacterales, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Desulfovibrionales, 및 Methanobacteriales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
Peptococcaceae, Deferribacteraceae, Turicibacteraceae, Halomonadaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae, Peptostreptococcaceae, Rhodobacteraceae, Nocardioidaceae, Sphingomonadaceae, Bartonellaceae, Cellulomonadaceae, Lactobacillaceae, Rhizobiaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Leptotrichiaceae, Coriobacteriaceae, Xenococcaceae, Aeromonadaceae, Geodermatophilaceae, Bdellovibrionaceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Streptococcaceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Aerococcaceae, Comamonadaceae, Paraprevotellaceae, Christensenellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Gordoniaceae, Mycobacteriaceae, Desulfovibrionaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, 및 Rikenellaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
rc4-4, Proteus, Catenibacterium, Mucispirillum, Eubacterium, Turicibacter, Alloiococcus, Halomonas, Prevotella, Dialister, Anaerostipes, SMB53, Faecalibacterium, Blautia, Capnocytophaga, Sphingomonas, Lactobacillus, Fimbriimonas, Dermacoccus, Achromobacter, Novosphingobium, Sneathia, Agrobacterium, Blastomonas, Bdellovibrio, Alkanindiges, Roseateles, Shuttleworthia, Rhizobium, Morganella, Acinetobacter, Pseudomonas, Enterococcus, Lactococcus, Coprococcus, Bacteroides, Dorea, Streptococcus, Lachnospira, Ruminococcus, Corynebacterium, Comamonas, Gordonia, Paraprevotella, Mycobacterium, Roseburia, Slackia, Escherichia, Phascolarctobacterium, Sutterella, Virgibacillus, Eggerthella, Citrobacter, Roseomonas, Serratia, Methanobrevibacter, 및 Bilophila로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서, 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 대장용종환자와 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 대장암을 진단할 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 Spirochaetes 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
Spirochaetes, 및 Acidobacteria-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
Spirochaetales, 및 Myxococcales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
Spirochaetaceae, 및 S24-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
Treponema, Dialister, Oscillospira, 및 Eubacterium로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서, 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장용종환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 대장용종을 진단할 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 Actinobacteria, Proteobacteria, 및 Euryarchaeota로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
Betaproteobacteria, Solibacteres, Gammaproteobacteria, Clostridia, Methanobacteria, 및 4C0d-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
Burkholderiales, Sphingomonadales, Solibacterales, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Oceanospirillales, Desulfovibrionales, 및 Methanobacteriales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Exiguobacteraceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Streptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Comamonadaceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Paraprevotellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Christensenellaceae, Odoribacteraceae, Desulfovibrionaceae, Halomonadaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, 및 Rikenellaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
Sphingomonas, Alkanindiges, Roseateles, Rhizobium, Morganella, Proteus, Exiguobacterium, Acinetobacter, Pseudomonas, SMB53, Lactococcus, Coprococcus, Streptococcus, Bacteroides, Ruminococcus, Corynebacterium, Odoribacter, Clostridium, Comamonas, Paraprevotella, Roseburia, Citrobacter, Klebsiella, Virgibacillus, Slackia, Dialister, Phascolarctobacterium, Sutterella, Halomonas, Roseomonas, 및 Methanobrevibacter로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교할 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 피검체 샘플은 대변 또는 소변일 수 있다.
환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 염증 및 암 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 대장용종 및 대장암은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 또는 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 대장용종 및 대장암 등의 대장종양 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 대장종양의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 대장종양의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다. 또한, 대장용종 혹은 대장암으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자를 예측하여, 원인인자에 대한 노출을 피함으로써 대장용종 및 대장암의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있다.
도 1은 체내에서 세균 유래 세포밖 소포의 분포양상을 평가하기 위한 것으로, 도 1a는 마우스에 장내 세균(Bacteria) 및 세균 유래 소포(EV)를 구강으로 투여한 후 시간별(0, 5min, 3h, 6h, 및 12h)로 이들의 분포양상을 촬영한 사진이고, 도 1b는 마우스에 장내 세균(Bacteria) 및 세균 유래 세포밖 소포(EV)를 구강으로 투여하고 12시간 후 소변 및 다양한 장기(심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육)를 적출하여 상기 세균 및 세포밖 소포의 분포양상을 촬영한 사진이다.
도 2는 대장암환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 3은 대장암환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 4는 대장암환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 5는 대장암환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 6은 대장암환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 7은 대장암환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 8은 대장암환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 9는 대장암환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 10은 대장암환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 11은 대장암환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 7은 대장암환자 및 대장용종환자 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 8은 대장암환자 및 대장용종환자 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 9는 대장암환자 및 대장용종환자 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 10은 대장암환자 및 대장용종환자 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 11은 대장암환자 및 대장용종환자 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 12는 대장암환자 및 대장용종환자 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 13은 대장암환자 및 대장용종환자 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 14는 대장암환자 및 대장용종환자 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 15는 대장암환자 및 대장용종환자 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 16은 대장암환자 및 대장용종환자 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 17은 대장암환자 및 대장용종환자 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 18은 대장암환자 및 대장용종환자 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 19는 대장용종환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 20은 대장용종환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 21은 대장용종환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 22는 대장용종환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 23은 대장용종환자 및 정상인 대변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 24는 대장용종환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 25은 대장용종환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 26은 대장용종환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 27은 대장용종환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 28은 대장용종환자 및 정상인 소변에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 대장용종 및 대장암 등의 대장종양을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 대장용종 및 대장암 등의 대장종양의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였다.
이에, 본 발명은 (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 대장용종환자와 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장용종환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는 대장종양 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대장암 진단" 이란 환자에 대하여 대장암이 발병할 가능성이 있는지, 대장암이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 대장암이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 대장암 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 대장암을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대장용종 진단" 이란 환자에 대하여 대장용종이 발병할 가능성이 있는지, 대장용종이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 대장용종이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 대장용종 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 대장용종을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖　소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.
본 발명의 실시예에서는 정상인, 대장용종환자, 및 대장암환자의 대변 및 소변 내 세균 유래 세포밖 소포에 존재하는 유전자에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 대장암 및 대장용종 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Deferribacteres, Tenericutes, Actinobacteria, Acidobacteria, Armatimonadetes, Planctomycetes, 및 Fusobacteria 문 세균 유래 소포가 대장암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Deferribacteres, Mollicutes, 4C0d-2, Bacilli, Alphaproteobacteria, Saprospirae, Fimbriimonadia, Acidobacteria-6, Solibacteres, Coriobacteriia, Oscillatoriophycideae, 및 Fusobacteriia 강 세균 유래 소포가 대장암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, RF32, YS2, Deferribacterales, Turicibacterales, RF39, Oceanospirillales, Rhizobiales, Lactobacillales, Rhodobacterales, Saprospirales, Sphingomonadales, Fimbriimonadales, iii1-15, Solibacterales, Coriobacteriales, Chroococcales, Fusobacteriales, 및 Bdellovibrionales 목 세균 유래 소포가 대장암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Peptococcaceae, Deferribacteraceae, Turicibacteraceae, Halomonadaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae, Peptostreptococcaceae, Rhodobacteraceae, Nocardioidaceae, Sphingomonadaceae, Bartonellaceae, Cellulomonadaceae, Lactobacillaceae, Rhizobiaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Leptotrichiaceae, Coriobacteriaceae, Xenococcaceae, Aeromonadaceae, Geodermatophilaceae, 및 Bdellovibrionaceae 과 세균 유래 소포가 대장암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, rc4-4, Proteus, Catenibacterium, Mucispirillum, Eubacterium, Turicibacter, Alloiococcus, Halomonas, Prevotella, Dialister, Anaerostipes, SMB53, Faecalibacterium, Blautia, Capnocytophaga, Sphingomonas, Lactobacillus, Fimbriimonas, Dermacoccus, Achromobacter, Novosphingobium, Sneathia, Agrobacterium, Blastomonas, Bdellovibrio, Alkanindiges, Roseateles, 및 Shuttleworthia 속 세균 유래 소포가 대장암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Proteobacteria, 및 Euryarchaeota 문 세균 유래 소포가 대장암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 5 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Gammaproteobacteria, Clostridia, 및 Methanobacteria 강 세균 유래 소포가 대장암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 5 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Desulfobacterales, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Turicibacterales, Desulfovibrionales, Oceanospirillales, 및 Methanobacteriales 목 세균 유래 소포가 대장암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 5 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Streptococcaceae, Turicibacteraceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Aerococcaceae, Comamonadaceae, Clostridiaceae, Paraprevotellaceae, Christensenellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Gordoniaceae, Mycobacteriaceae, Desulfovibrionaceae, Halomonadaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, 및 Rikenellaceae 과 세균 유래 소포가 대장암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 5 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Rhizobium, Proteus, Morganella, Acinetobacter, Pseudomonas, SMB53, Enterococcus, Lactococcus, Turicibacter, Coprococcus, Bacteroides, Dorea, Streptococcus, Lachnospira, Ruminococcus, Corynebacterium, Comamonas, Gordonia, Paraprevotella, Mycobacterium, Roseburia, Dialister, Slackia, Escherichia, Phascolarctobacterium, Sutterella, Virgibacillus, Eggerthella, Halomonas, Citrobacter, Roseomonas, Alloiococcus, Serratia, Methanobrevibacter, 및 Bilophila 속 세균 유래 소포가 대장암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 5 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Spirochaetes 문 세균 유래 소포가 대장암환자와 대장용종환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Spirochaetes, 및 Acidobacteria-6 강 세균 유래 소포가 대장암환자와 대장용종환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Spirochaetales 목 세균 유래 소포가 대장암환자와 대장용종환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Spirochaetaceae, 및 S24-7 과 세균 유래 소포가 대장암환자와 대장용종환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Treponema, Dialister, 및 Oscillospira 속 세균 유래 소포가 대장암환자와 대장용종환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Myxococcales 목 세균 유래 소포가 대장암환자와 대장용종환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 7 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Eubacterium 목 세균 유래 소포가 대장암환자와 대장용종환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 7 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Actinobacteria 문 세균 유래 소포가 대장용종환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 8 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Betaproteobacteria, 및 Solibacteres 강 세균 유래 소포가 대장용종환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 8 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Burkholderiales, Sphingomonadales, 및 Solibacterales 목 세균 유래 소포가 대장용종환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 8 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Rhizobiaceae, 및 Sphingomonadaceae 과 세균 유래 소포가 대장용종환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 8 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 대변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Sphingomonas, Alkanindiges, 및 Roseateles 속 세균 유래 소포가 대장용종환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 8 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Proteobacteria, 및 Euryarchaeota 문 세균 유래 소포가 대장용종환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 9 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Gammaproteobacteria, Clostridia, Methanobacteria, 및 4C0d-2 강 세균 유래 소포가 대장용종환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 9 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Oceanospirillales, Desulfovibrionales, 및 Methanobacteriales 목 세균 유래 소포가 대장용종환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 9 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Exiguobacteraceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Comamonadaceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Paraprevotellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Christensenellaceae, Odoribacteraceae, Desulfovibrionaceae, Halomonadaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, 및 Rikenellaceae 과 세균 유래 소포가 대장용종환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 9 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Rhizobium, Morganella, Proteus, Exiguobacterium, Acinetobacter, Pseudomonas, SMB53, Lactococcus, Coprococcus, Streptococcus, Bacteroides, Ruminococcus, Corynebacterium, Odoribacter, Clostridium, Comamonas, Paraprevotella, Roseburia, Citrobacter, Klebsiella, Virgibacillus, Slackia, Dialister, Phascolarctobacterium, Sutterella, Halomonas, Roseomonas, 및 Methanobrevibacter 속 세균 유래 소포가 대장용종환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 9 참조).
본 발명은 상기와 같은 실시예 결과를 통해, 대변 및 소변으로부터 분리한 세균 유래 세포밖 소포에 대하여 메타게놈 분석을 실시함으로써 정상인 및 대장용종환자와 비교하여 대장암환자에서 함량이 유의하게 변화한 세균 유래 소포들을 동정하였으며, 메타게놈 분석을 통해 상기 각 수준에서 세균 유래 소포들의 함량 증감을 분석함으로써 대장암을 진단할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기와 같은 실시예 결과를 통해, 대변 및 소변으로부터 분리한 세균 유래 세포밖 소포에 대하여 메타게놈 분석을 실시함으로써 정상인과 비교하여 대장용종환자에서 함량이 유의하게 변화한 세균 유래 소포들을 동정하였으며, 메타게놈 분석을 통해 상기 각 수준에서 세균 유래 소포들의 함량 증감을 분석함으로써 대장용종을 진단할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 장내 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석
장내 세균과 세균 유래 소포가 위장관을 통해 전신적으로 흡수되는 지를 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 마우스의 위장에 형광으로 표지한 장내세균과 장내 세균 유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 위장관으로 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다. 마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 상기 세균(Bacteria)인 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균 유래 소포(EV)인 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 3시간 후에는 방광에 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었다. 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다.
장내세균과 장내 세균유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 다음 12시간째에 마우스로부터 소변(Blood), 심장(Heart), 폐(Lung), 간(Liver), 신장(Kidney), 비장(Spleen), 지방조직(Adipose tissue), 및 근육(Muscle)을 적출하였다. 상기 적출한 조직들에서 형광을 관찰한 결과, 도1b에 나타낸 바와 같이, 상기 장내 세균(Bacteria)은 각 장기에 흡수되지 않은 반면, 상기 장내 세균 유래 세포밖 소포(EV)는 소변, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육에 분포하는 것을 확인하였다.
실시예 2. 대변 및 소변으로부터 소포 분리 및 DNA 추출
대변 및 소변으로부터 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 대변 및 소변을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10min, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.
상기 방법에 따라 대변 및 소변으로부터 분리한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액 만을 모은 후 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
primer 서열 서열번호
16S rDNA 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3 2
실시예 3. 대변 및 소변 내 소포에서 추출한 DNA를 이용한 메타게놈 분석
상기 실시예 2의 방법으로 유전자를 추출한 후, 상기 표1에 나타낸 16S rDNA 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 유전자를 증폭시키고 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 결과를 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 질이 낮은 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였으며(Sickle version 1.33), 결과 분석을 위해 Operational Taxonomy Unit(OTU)은 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME).
실시예 4. 정상인과 대장암환자 대변에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 대장암 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 대장암환자 29명과 정상인 358명의 대변에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
대변 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Deferribacteres, Tenericutes, Actinobacteria, Acidobacteria, Armatimonadetes, Planctomycetes, 및 Fusobacteria 문 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 2 및 도 2 참조).
　 대조군 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
p__Deferribacteres 0.0004 0.0018 0.0001 0.0003 0.0006 0.16 0.74 1.00 0.03
p__Tenericutes 0.0098 0.0256 0.0027 0.0064 0.0001 0.27 0.74 1.00 0.03
p__Actinobacteria 0.0353 0.0403 0.0817 0.0588 0.0003 2.32 0.80 0.99 0.14
p__Acidobacteria 0.0005 0.0024 0.0019 0.0021 0.0024 3.61 0.75 1.00 0.03
p__Armatimonadetes 0.0002 0.0007 0.0009 0.0013 0.0075 5.11 0.77 1.00 0.07
p__Planctomycetes 0.0001 0.0006 0.0011 0.0015 0.0027 7.36 0.82 0.99 0.24
p__Fusobacteria 0.0016 0.0040 0.0124 0.0202 0.0088 7.60 0.82 0.99 0.17
대변 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Deferribacteres, Mollicutes, 4C0d-2, Bacilli, Alphaproteobacteria, Saprospirae, Fimbriimonadia, Acidobacteria-6, Solibacteres, Coriobacteriia, Oscillatoriophycideae, 및 Fusobacteriia 강 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 3 및 도 3 참조).
　 대조군 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
c__Deferribacteres 0.0004 0.0018 0.0001 0.0003 0.0006 0.16 0.74 1.00 0.03
c__Mollicutes 0.0095 0.0254 0.0026 0.0064 0.0002 0.28 0.74 1.00 0.03
c__4C0d-2 0.0007 0.0028 0.0002 0.0004 0.0084 0.34 0.73 1.00 0.03
c__Bacilli 0.0820 0.0955 0.1661 0.1537 0.0078 2.03 0.75 1.00 0.03
c__Alphaproteobacteria 0.0192 0.0306 0.0491 0.0520 0.0054 2.56 0.80 1.00 0.14
c__[Saprospirae] 0.0003 0.0010 0.0008 0.0012 0.0040 2.94 0.74 1.00 0.03
c__[Fimbriimonadia] 0.0002 0.0007 0.0009 0.0013 0.0075 5.14 0.77 1.00 0.07
c__Acidobacteria-6 0.0001 0.0007 0.0007 0.0010 0.0037 5.85 0.78 0.99 0.03
c__Solibacteres 0.0001 0.0006 0.0006 0.0009 0.0090 5.86 0.75 0.99 0.07
c__Coriobacteriia 0.0040 0.0081 0.0251 0.0363 0.0046 6.33 0.80 0.99 0.17
c__Oscillatoriophycideae 0.0001 0.0005 0.0006 0.0009 0.0050 6.72 0.80 0.99 0.10
c__Fusobacteriia 0.0016 0.0040 0.0124 0.0202 0.0088 7.60 0.82 0.99 0.17
대변 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, RF32, YS2, Deferribacterales, Turicibacterales, RF39, Oceanospirillales, Rhizobiales, Lactobacillales, Rhodobacterales, Saprospirales, Sphingomonadales, Fimbriimonadales, iii1-15, Solibacterales, Coriobacteriales, Chroococcales, Fusobacteriales, 및 Bdellovibrionales 목 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 4 및 도 4 참조).
　 대조군 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
o__RF32 0.0005 0.0026 0.0000 0.0001 0.0005 0.03 0.75 1.00 0.03
o__YS2 0.0006 0.0027 0.0001 0.0002 0.0003 0.09 0.74 1.00 0.03
o__Deferribacterales 0.0004 0.0018 0.0001 0.0003 0.0006 0.16 0.74 1.00 0.03
o__Turicibacterales 0.0148 0.0493 0.0024 0.0053 0.0000 0.16 0.75 1.00 0.03
o__RF39 0.0090 0.0248 0.0017 0.0046 0.0000 0.18 0.75 1.00 0.03
o__Oceanospirillales 0.0009 0.0033 0.0002 0.0003 0.0001 0.22 0.75 1.00 0.03
o__Rhizobiales 0.0085 0.0202 0.0189 0.0215 0.0082 2.23 0.75 1.00 0.03
o__Lactobacillales 0.0519 0.0809 0.1402 0.1495 0.0044 2.70 0.76 1.00 0.10
o__Rhodobacterales 0.0019 0.0057 0.0054 0.0059 0.0020 2.81 0.76 1.00 0.03
o__[Saprospirales] 0.0003 0.0010 0.0008 0.0012 0.0040 2.94 0.74 1.00 0.03
o__Sphingomonadales 0.0050 0.0097 0.0192 0.0207 0.0012 3.87 0.85 0.99 0.21
o__[Fimbriimonadales] 0.0002 0.0007 0.0009 0.0013 0.0075 5.14 0.77 1.00 0.07
o__iii1-15 0.0001 0.0007 0.0006 0.0010 0.0090 5.67 0.78 0.99 0.03
o__Solibacterales 0.0001 0.0006 0.0006 0.0009 0.0089 5.89 0.75 0.99 0.07
o__Coriobacteriales 0.0040 0.0081 0.0251 0.0363 0.0046 6.33 0.80 0.99 0.17
o__Chroococcales 0.0001 0.0005 0.0006 0.0009 0.0050 6.63 0.80 0.99 0.14
o__Fusobacteriales 0.0016 0.0040 0.0124 0.0202 0.0088 7.60 0.82 0.99 0.17
o__Bdellovibrionales 0.0001 0.0004 0.0006 0.0009 0.0063 9.79 0.76 0.99 0.10
대변 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Peptococcaceae, Deferribacteraceae, Turicibacteraceae, Halomonadaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae, Peptostreptococcaceae, Rhodobacteraceae, Nocardioidaceae, Sphingomonadaceae, Bartonellaceae, Cellulomonadaceae, Lactobacillaceae, Rhizobiaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Leptotrichiaceae, Coriobacteriaceae, Xenococcaceae, Aeromonadaceae, Geodermatophilaceae, 및 Bdellovibrionaceae 과 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 5 및 도 5 참조).
　 대조군 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
f__Peptococcaceae 0.0020 0.0048 0.0001 0.0003 0.0000 0.07 0.80 1.00 0.03
f__Deferribacteraceae 0.0004 0.0018 0.0001 0.0003 0.0006 0.16 0.74 1.00 0.03
f__Turicibacteraceae 0.0148 0.0493 0.0024 0.0053 0.0000 0.16 0.75 1.00 0.03
f__Halomonadaceae 0.0008 0.0027 0.0002 0.0003 0.0002 0.25 0.74 1.00 0.03
f__Clostridiaceae 0.0477 0.0792 0.0129 0.0176 0.0000 0.27 0.79 1.00 0.03
f__Prevotellaceae 0.1518 0.1717 0.0454 0.0656 0.0000 0.30 0.79 1.00 0.03
f__Peptostreptococcaceae 0.0275 0.0623 0.0088 0.0134 0.0000 0.32 0.76 1.00 0.03
f__Rhodobacteraceae 0.0019 0.0057 0.0054 0.0059 0.0020 2.82 0.76 1.00 0.03
f__Nocardioidaceae 0.0004 0.0016 0.0013 0.0019 0.0037 3.58 0.75 1.00 0.03
f__Sphingomonadaceae 0.0047 0.0091 0.0187 0.0202 0.0010 4.00 0.86 0.99 0.21
f__Bartonellaceae 0.0002 0.0014 0.0009 0.0012 0.0088 4.27 0.75 1.00 0.03
f__Cellulomonadaceae 0.0001 0.0009 0.0006 0.0009 0.0084 4.48 0.74 1.00 0.03
f__Lactobacillaceae 0.0162 0.0224 0.0733 0.0967 0.0042 4.52 0.83 0.99 0.21
f__Rhizobiaceae 0.0022 0.0040 0.0102 0.0125 0.0023 4.62 0.83 1.00 0.28
f__[Fimbriimonadaceae] 0.0002 0.0007 0.0009 0.0013 0.0075 5.14 0.77 1.00 0.07
f__Dermacoccaceae 0.0003 0.0010 0.0018 0.0025 0.0047 5.58 0.81 0.99 0.14
f__Leptotrichiaceae 0.0007 0.0027 0.0042 0.0055 0.0021 5.93 0.82 0.99 0.07
f__Coriobacteriaceae 0.0040 0.0081 0.0251 0.0363 0.0046 6.33 0.80 0.99 0.17
f__Xenococcaceae 0.0001 0.0005 0.0006 0.0009 0.0049 6.72 0.81 0.99 0.14
f__Aeromonadaceae 0.0001 0.0006 0.0009 0.0013 0.0035 7.11 0.82 0.99 0.10
f__Geodermatophilaceae 0.0002 0.0008 0.0013 0.0018 0.0023 7.46 0.83 0.99 0.17
f__Bdellovibrionaceae 0.0000 0.0002 0.0006 0.0009 0.0038 23.48 0.80 1.00 0.24
대변 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, rc4-4, Proteus, Catenibacterium, Mucispirillum, Eubacterium, Turicibacter, Alloiococcus, Halomonas, Prevotella, Dialister, Anaerostipes, SMB53, Faecalibacterium, Blautia, Capnocytophaga, Sphingomonas, Lactobacillus, Fimbriimonas, Dermacoccus, Achromobacter, Novosphingobium, Sneathia, Agrobacterium, Blastomonas, Bdellovibrio, Alkanindiges, Roseateles, 및 Shuttleworthia 속 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 6 및 도 6 참조).
　 대조군 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
g__rc4-4 0.0010 0.0035 0.0000 0.0000 0.0000 0.01 0.80 1.00 0.03
g__Proteus 0.0121 0.0272 0.0005 0.0011 0.0000 0.04 0.80 1.00 0.03
g__Catenibacterium 0.0014 0.0047 0.0002 0.0004 0.0000 0.11 0.75 1.00 0.03
g__Mucispirillum 0.0004 0.0018 0.0001 0.0003 0.0006 0.16 0.74 1.00 0.03
g__[Eubacterium] 0.0008 0.0020 0.0001 0.0003 0.0000 0.16 0.74 1.00 0.03
g__Turicibacter 0.0148 0.0493 0.0024 0.0053 0.0000 0.16 0.75 1.00 0.03
g__Alloiococcus 0.0004 0.0025 0.0001 0.0002 0.0086 0.16 0.73 1.00 0.03
g__Halomonas 0.0006 0.0024 0.0002 0.0003 0.0027 0.29 0.73 1.00 0.03
g__Prevotella 0.1518 0.1717 0.0454 0.0656 0.0000 0.30 0.79 1.00 0.03
g__Dialister 0.0063 0.0186 0.0020 0.0027 0.0001 0.32 0.75 1.00 0.03
g__Anaerostipes 0.0006 0.0014 0.0002 0.0005 0.0020 0.36 0.74 1.00 0.03
g__SMB53 0.0011 0.0018 0.0004 0.0007 0.0002 0.39 0.76 1.00 0.00
g__Faecalibacterium 0.0681 0.0882 0.0285 0.0584 0.0020 0.42 0.77 1.00 0.03
g__Blautia 0.0037 0.0100 0.0017 0.0017 0.0009 0.45 0.74 1.00 0.03
g__Capnocytophaga 0.0003 0.0008 0.0007 0.0009 0.0052 2.59 0.75 1.00 0.03
g__Sphingomonas 0.0032 0.0059 0.0128 0.0138 0.0011 3.95 0.85 0.99 0.28
g__Lactobacillus 0.0160 0.0223 0.0731 0.0966 0.0041 4.58 0.83 0.99 0.21
g__Fimbriimonas 0.0002 0.0007 0.0009 0.0013 0.0079 5.10 0.77 1.00 0.07
g__Dermacoccus 0.0003 0.0010 0.0018 0.0025 0.0047 5.58 0.81 0.99 0.14
g__Achromobacter 0.0001 0.0003 0.0005 0.0008 0.0065 6.93 0.83 0.99 0.17
g__Novosphingobium 0.0002 0.0009 0.0014 0.0021 0.0046 7.84 0.82 0.99 0.10
g__Sneathia 0.0002 0.0019 0.0038 0.0050 0.0009 17.60 0.85 1.00 0.28
g__Agrobacterium 0.0002 0.0006 0.0036 0.0047 0.0005 20.68 0.87 1.00 0.41
g__Blastomonas 0.0000 0.0002 0.0006 0.0008 0.0012 22.87 0.84 0.99 0.31
g__Bdellovibrio 0.0000 0.0002 0.0006 0.0009 0.0038 23.63 0.80 1.00 0.24
g__Alkanindiges 0.0000 0.0002 0.0008 0.0014 0.0037 26.94 0.85 1.00 0.28
g__Roseateles 0.0000 0.0002 0.0011 0.0020 0.0086 51.47 0.83 0.99 0.31
g__Shuttleworthia 0.0000 0.0003 0.0020 0.0034 0.0043 51.55 0.84 1.00 0.34
실시예 5. 정상인과 대장암환자 소변에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 대장암 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 대장암환자 38명과 정상인 38명의 소변에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
소변 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Proteobacteria, 및 Euryarchaeota 문 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 7 및 도 7 참조).
대조군 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
p__Proteobacteria 0.5379 0.1871 0.2394 0.0820 0.0000 0.45 0.94 0.84 0.87
p__Euryarchaeota 0.0000 0.0001 0.0021 0.0021 0.0000 70.49 0.90 0.97 0.71
소변 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Gammaproteobacteria, Clostridia, 및 Methanobacteria 강 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 8 및 도 8 참조).
대조군 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
c__Gammaproteobacteria 0.4431 0.2104 0.1776 0.0577 0.0000 0.40 0.90 0.76 0.87
c__Clostridia 0.1286 0.0723 0.2752 0.0844 0.0000 2.14 0.93 0.87 0.82
c__Methanobacteria 0.0000 0.0001 0.0020 0.0021 0.0000 67.36 0.90 0.97 0.68
소변 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Desulfobacterales, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Turicibacterales, Desulfovibrionales, Oceanospirillales, 및 Methanobacteriales 목 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 9 및 도 9 참조).
대조군 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
o__Desulfobacterales 0.0012 0.0027 0.0000 0.0000 0.0078 0.00 0.77 0.53 0.76
o__Stramenopiles 0.0055 0.0083 0.0001 0.0004 0.0003 0.02 0.82 0.58 0.87
o__Pseudomonadales 0.3124 0.1910 0.0622 0.0401 0.0000 0.20 0.93 0.87 0.92
o__Clostridiales 0.1284 0.0725 0.2751 0.0843 0.0000 2.14 0.93 0.87 0.82
o__Turicibacterales 0.0017 0.0026 0.0038 0.0040 0.0075 2.27 0.72 0.71 0.61
o__Desulfovibrionales 0.0001 0.0005 0.0009 0.0010 0.0001 6.78 0.79 0.89 0.58
o__Oceanospirillales 0.0005 0.0012 0.0038 0.0073 0.0098 7.70 0.84 0.87 0.58
o__Methanobacteriales 0.0000 0.0001 0.0020 0.0021 0.0000 67.36 0.90 0.97 0.68
소변 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Streptococcaceae, Turicibacteraceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Aerococcaceae, Comamonadaceae, Clostridiaceae, Paraprevotellaceae, Christensenellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Gordoniaceae, Mycobacteriaceae, Desulfovibrionaceae, Halomonadaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, 및 Rikenellaceae 과 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 10 및 도 10 참조).
대조군 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
f__Moraxellaceae 0.1810 0.1401 0.0313 0.0220 0.0000 0.17 0.93 0.87 0.87
f__Pseudomonadaceae 0.1314 0.0973 0.0306 0.0204 0.0000 0.23 0.90 0.82 0.89
f__Streptococcaceae 0.0180 0.0126 0.0383 0.0167 0.0000 2.13 0.89 0.79 0.87
f__Turicibacteraceae 0.0017 0.0026 0.0038 0.0040 0.0075 2.27 0.72 0.71 0.61
f__Veillonellaceae 0.0070 0.0083 0.0168 0.0074 0.0000 2.41 0.85 0.71 0.74
f__Bacteroidaceae 0.0212 0.0207 0.0517 0.0381 0.0001 2.44 0.84 0.82 0.74
f__Aerococcaceae 0.0021 0.0033 0.0052 0.0059 0.0057 2.51 0.74 0.74 0.61
f__Comamonadaceae 0.0027 0.0036 0.0071 0.0062 0.0003 2.63 0.76 0.76 0.63
f__Clostridiaceae 0.0100 0.0114 0.0299 0.0205 0.0000 2.99 0.86 0.79 0.71
f__[Paraprevotellaceae] 0.0012 0.0036 0.0038 0.0033 0.0017 3.11 0.82 0.82 0.63
f__Christensenellaceae 0.0004 0.0013 0.0014 0.0014 0.0040 3.16 0.74 0.87 0.68
f__Ruminococcaceae 0.0379 0.0431 0.1280 0.0390 0.0000 3.38 0.95 0.92 0.87
f__Corynebacteriaceae 0.0090 0.0097 0.0366 0.0197 0.0000 4.07 0.96 0.89 0.87
f__Gordoniaceae 0.0001 0.0005 0.0004 0.0006 0.0081 5.03 0.78 0.76 0.68
f__Mycobacteriaceae 0.0002 0.0008 0.0009 0.0015 0.0090 5.82 0.76 0.92 0.58
f__Desulfovibrionaceae 0.0001 0.0005 0.0009 0.0010 0.0001 6.78 0.79 0.89 0.58
f__Halomonadaceae 0.0002 0.0008 0.0018 0.0022 0.0001 9.40 0.88 0.92 0.66
f__Alcaligenaceae 0.0001 0.0004 0.0018 0.0017 0.0000 15.77 0.90 0.95 0.79
f__[Barnesiellaceae] 0.0001 0.0004 0.0016 0.0018 0.0000 24.08 0.84 0.95 0.66
f__Methanobacteriaceae 0.0000 0.0001 0.0020 0.0021 0.0000 67.36 0.90 0.97 0.68
f__Rikenellaceae 0.0000 0.0002 0.0059 0.0040 0.0000 153.18 0.98 0.97 0.92
소변 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Rhizobium, Proteus, Morganella, Acinetobacter, Pseudomonas, SMB53, Enterococcus, Lactococcus, Turicibacter, Coprococcus, Bacteroides, Dorea, Streptococcus, Lachnospira, Ruminococcus, Corynebacterium, Comamonas, Gordonia, Paraprevotella, Mycobacterium, Roseburia, Dialister, Slackia, Escherichia, Phascolarctobacterium, Sutterella, Virgibacillus, Eggerthella, Halomonas, Citrobacter, Roseomonas, Alloiococcus, Serratia, Methanobrevibacter, 및 Bilophila 속 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 11 및 도 11 참조).
대조군 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
g__Rhizobium 0.0056 0.0056 0.0000 0.0000 0.0000 0.00 1.00 1.00 1.00
g__Proteus 0.0132 0.0192 0.0006 0.0010 0.0003 0.04 0.87 0.76 0.95
g__Morganella 0.0211 0.0295 0.0013 0.0060 0.0002 0.06 0.84 0.61 0.84
g__Acinetobacter 0.1683 0.1396 0.0172 0.0138 0.0000 0.10 0.94 0.84 0.95
g__Pseudomonas 0.1288 0.0965 0.0286 0.0201 0.0000 0.22 0.90 0.82 0.89
g__SMB53 0.0034 0.0046 0.0008 0.0012 0.0017 0.23 0.73 0.58 0.66
g__Enterococcus 0.0086 0.0108 0.0023 0.0024 0.0010 0.26 0.74 0.50 0.82
g__Lactococcus 0.0035 0.0039 0.0015 0.0019 0.0074 0.44 0.67 0.50 0.66
g__Turicibacter 0.0017 0.0026 0.0038 0.0040 0.0075 2.27 0.72 0.71 0.61
g__Coprococcus 0.0036 0.0043 0.0083 0.0052 0.0000 2.31 0.81 0.74 0.76
g__Bacteroides 0.0212 0.0207 0.0517 0.0381 0.0001 2.44 0.84 0.82 0.74
g__Dorea 0.0010 0.0015 0.0025 0.0024 0.0011 2.55 0.80 0.79 0.66
g__Streptococcus 0.0143 0.0122 0.0366 0.0166 0.0000 2.56 0.90 0.79 0.87
g__Lachnospira 0.0005 0.0012 0.0017 0.0020 0.0020 3.54 0.76 0.82 0.66
g__[Ruminococcus] 0.0010 0.0015 0.0040 0.0031 0.0000 3.83 0.85 0.79 0.58
g__Corynebacterium 0.0090 0.0097 0.0366 0.0197 0.0000 4.07 0.96 0.89 0.87
g__Comamonas 0.0003 0.0010 0.0013 0.0018 0.0050 4.32 0.77 0.87 0.61
g__Ruminococcus 0.0030 0.0043 0.0148 0.0073 0.0000 4.94 0.94 0.87 0.82
g__Gordonia 0.0001 0.0005 0.0004 0.0006 0.0081 5.03 0.78 0.76 0.68
g__Paraprevotella 0.0002 0.0007 0.0010 0.0014 0.0015 5.70 0.80 0.89 0.66
g__Mycobacterium 0.0002 0.0008 0.0009 0.0015 0.0090 5.82 0.76 0.92 0.58
g__Roseburia 0.0004 0.0017 0.0032 0.0028 0.0000 8.45 0.93 0.92 0.79
g__Dialister 0.0005 0.0012 0.0065 0.0046 0.0000 13.84 0.94 0.92 0.87
g__Slackia 0.0000 0.0003 0.0007 0.0014 0.0062 15.14 0.77 0.92 0.58
g__Escherichia 0.0001 0.0001 0.0009 0.0008 0.0000 15.98 0.95 0.95 0.84
g__Phascolarctobacterium 0.0001 0.0007 0.0026 0.0030 0.0000 20.76 0.93 0.97 0.84
g__Sutterella 0.0001 0.0003 0.0013 0.0015 0.0000 20.99 0.86 0.95 0.74
g__Virgibacillus 0.0000 0.0001 0.0008 0.0010 0.0000 21.74 0.83 0.89 0.61
g__Eggerthella 0.0000 0.0001 0.0005 0.0010 0.0044 24.82 0.76 0.76 0.55
g__Halomonas 0.0001 0.0003 0.0017 0.0022 0.0000 26.50 0.91 0.95 0.76
g__Citrobacter 0.0003 0.0005 0.0089 0.0056 0.0000 30.07 0.99 0.97 0.92
g__Roseomonas 0.0000 0.0002 0.0012 0.0016 0.0001 35.67 0.85 0.97 0.58
g__Alloiococcus 0.0000 0.0001 0.0022 0.0050 0.0097 174.52 0.88 0.95 0.74
g__Serratia 0.0000 0.0000 0.0006 0.0010 0.0007 195.10 0.81 0.92 0.55
g__Methanobrevibacter 0.0000 0.0000 0.0020 0.0021 0.0000 555.27 0.92 1.00 0.74
g__Bilophila 0.0000 0.0000 0.0005 0.0008 0.0003 873.83 0.79 0.92 0.53
실시예 6. 대장용종환자와 대장암환자 대변에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 대장암 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 대장암환자 29명과 대장용종환자 27명의 대변에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
대변 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Spirochaetes 문 세균을 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 12 및 도 12 참조).
　 대장용종 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
p__Spirochaetes 0.0005 0.0009 0.0001 0.0001 0.0216 0.12 0.87 0.74 0.79
대변 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Spirochaetes, 및 Acidobacteria-6 강 세균을 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 13 및 도 13 참조).
　 대장용종 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
c__Spirochaetes 0.0005 0.0009 0.0001 0.0001 0.0202 0.11 0.87 0.78 0.83
c__Acidobacteria-6 0.0003 0.0004 0.0007 0.0010 0.0237 2.92 0.85 0.81 0.69
대변 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Spirochaetales 목 세균을 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 14 및 도 14 참조).
　 대장용종 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
o__Spirochaetales 0.0005 0.0009 0.0001 0.0001 0.0202 0.11 0.87 0.78 0.83
대변 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Spirochaetaceae, 및 S24-7 과 세균을 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 15 및 도 15 참조).
　 대장용종 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
f__Spirochaetaceae 0.0005 0.0009 0.0001 0.0001 0.0202 0.11 0.87 0.78 0.83
f__S24-7 0.0021 0.0053 0.0103 0.0206 0.0492 4.93 0.84 0.81 0.69
대변 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Treponema, Dialister, 및 Oscillospira 속 세균을 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 16 및 도 16 참조).
　 대장용종 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
g__Treponema 0.0005 0.0009 0.0001 0.0001 0.0202 0.11 0.8685 0.7778 0.8276
g__Dialister 0.0103 0.0152 0.0020 0.0027 0.0106 0.20 0.8672 0.7778 0.8276
g__Oscillospira 0.0023 0.0019 0.0074 0.0109 0.0212 3.18 0.8378 0.7778 0.7241
실시예 7. 대장용종환자와 대장암환자 소변에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 대장암 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 대장암환자 26명과 대장용종환자 38명의 소변에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
소변 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Myxococcales 목 세균으로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 17 및 도 17 참조).
대장용종 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
o__Myxococcales 0.0000 0.0001 0.0005 0.0013 0.0442 14.52 0.78 0.69 0.82
소변 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Eubacterium 속 세균으로 진단모형을 개발하였을 때, 대장암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 18 및 도 18 참조).
대장용종 대장암 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
g__[Eubacterium] 0.0009 0.0011 0.0024 0.0028 0.0040 2.72 0.79 0.62 0.79
실시예 8. 정상인과 대장용종 대변에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 대장용종 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 대장암환자 27명과 정상인 358명의 대변에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
대변 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Actinobacteria 문 세균으로 진단모형을 개발하였을 때, 대장용종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 19 및 도 19 참조).
　 대조군 대장용종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
p__Actinobacteria 0.0353 0.0403 0.0826 0.0680 0.0016 2.34 0.84 0.99 0.11
대변 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Betaproteobacteria, 및 Solibacteres 강 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장용종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 20 및 도 20 참조).
　 대조군 대장용종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
c__Betaproteobacteria 0.0151 0.0370 0.0391 0.0369 0.0013 2.58 0.82 1.00 0.00
c__Solibacteres 0.0001 0.0006 0.0005 0.0007 0.0093 4.95 0.83 1.00 0.00
대변 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Burkholderiales, Sphingomonadales, 및 Solibacterales 목 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장용종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 21 및 도 21 참조).
　 대조군 대장용종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
o__Burkholderiales 0.0121 0.0358 0.0367 0.0365 0.0007 3.02 0.82 1.00 0.00
o__Sphingomonadales 0.0050 0.0097 0.0215 0.0216 0.0006 4.33 0.87 0.99 0.19
o__Solibacterales 0.0001 0.0006 0.0005 0.0007 0.0091 4.98 0.83 1.00 0.00
대변 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Rhizobiaceae, 및 Sphingomonadaceae 과 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장용종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 22 및 도 22 참조).
　 대조군 대장용종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
f__Rhizobiaceae 0.0022 0.0040 0.0080 0.0105 0.0091 3.64 0.83 0.99 0.19
f__Sphingomonadaceae 0.0047 0.0091 0.0208 0.0210 0.0006 4.46 0.87 0.99 0.22
대변 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Sphingomonas, Alkanindiges, 및 Roseateles 속 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장용종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 23 및 도 23 참조).
　 대조군 대장용종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
g__Sphingomonas 0.0032 0.0059 0.0155 0.0164 0.0008 4.77 0.87 0.99 0.30
g__Alkanindiges 0.0000 0.0002 0.0008 0.0015 0.0097 26.73 0.84 1.00 0.26
g__Roseateles 0.0000 0.0002 0.0006 0.0011 0.0078 30.88 0.85 0.99 0.22
실시예 9. 정상인과 대장용종 소변에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 대장용종 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 대장암환자 38명과 정상인 38명의 소변에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
소변 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Proteobacteria, 및 Euryarchaeota 문 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장용종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 24 및 도 24 참조).
대조군 대장용종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
p__Proteobacteria 0.5379 0.1871 0.2416 0.0691 0.0000 0.45 0.92 0.82 0.88
p__Euryarchaeota 0.0000 0.0001 0.0024 0.0027 0.0001 82.21 0.90 1.00 0.73
소변 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Gammaproteobacteria, Clostridia, Methanobacteria, 및 4C0d-2 강 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장용종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 25 및 도 25 참조).
대조군 대장용종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
c__Gammaproteobacteria 0.4431 0.2104 0.1807 0.0511 0.0000 0.41 0.86 0.76 0.88
c__Clostridia 0.1286 0.0723 0.2804 0.0637 0.0000 2.18 0.94 0.87 0.77
c__Methanobacteria 0.0000 0.0001 0.0024 0.0027 0.0002 79.88 0.90 1.00 0.73
c__4C0d-2 0.0000 0.0000 0.0006 0.0011 0.0099 1952.62 0.81 0.92 0.38
소변 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Oceanospirillales, Desulfovibrionales, 및 Methanobacteriales 목 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장용종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 26 및 도 26 참조).
대조군 대장용종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio Auc sensitivity specificity
o__Stramenopiles 0.0055 0.0083 0.0000 0.0000 0.0014 0.00 0.89 0.74 1.00
o__Pseudomonadales 0.3124 0.1910 0.0622 0.0414 0.0000 0.20 0.91 0.84 0.85
o__Clostridiales 0.1284 0.0725 0.2804 0.0637 0.0000 2.18 0.94 0.87 0.77
o__Oceanospirillales 0.0005 0.0012 0.0018 0.0015 0.0003 3.65 0.86 0.89 0.62
o__Desulfovibrionales 0.0001 0.0005 0.0010 0.0015 0.0064 7.61 0.83 0.92 0.54
o__Methanobacteriales 0.0000 0.0001 0.0024 0.0027 0.0002 79.88 0.90 1.00 0.73
소변 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Exiguobacteraceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Comamonadaceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Paraprevotellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Christensenellaceae, Odoribacteraceae, Desulfovibrionaceae, Halomonadaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, 및 Rikenellaceae 과 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장용종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 27 및 도 27 참조).
대조군 대장용종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
f__[Exiguobacteraceae] 0.0013 0.0026 0.0001 0.0003 0.0076 0.06 0.74 0.63 0.77
f__Moraxellaceae 0.1810 0.1401 0.0306 0.0235 0.0000 0.17 0.88 0.79 0.81
f__Pseudomonadaceae 0.1314 0.0973 0.0315 0.0201 0.0000 0.24 0.89 0.82 0.85
f__Rhizobiaceae 0.0068 0.0062 0.0025 0.0032 0.0007 0.37 0.83 0.79 0.62
f__Streptococcaceae 0.0180 0.0126 0.0373 0.0099 0.0000 2.08 0.90 0.87 0.85
f__Peptostreptococcaceae 0.0009 0.0017 0.0023 0.0017 0.0029 2.42 0.84 0.95 0.65
f__Comamonadaceae 0.0027 0.0036 0.0067 0.0067 0.0090 2.48 0.77 0.79 0.46
f__Veillonellaceae 0.0070 0.0083 0.0186 0.0056 0.0000 2.67 0.86 0.79 0.77
f__Bacteroidaceae 0.0212 0.0207 0.0571 0.0217 0.0000 2.69 0.92 0.89 0.73
f__[Paraprevotellaceae] 0.0012 0.0036 0.0037 0.0021 0.0008 3.07 0.85 0.82 0.65
f__Ruminococcaceae 0.0379 0.0431 0.1325 0.0396 0.0000 3.50 0.93 0.87 0.85
f__Corynebacteriaceae 0.0090 0.0097 0.0367 0.0159 0.0000 4.09 0.97 0.95 0.85
f__Christensenellaceae 0.0004 0.0013 0.0018 0.0021 0.0042 4.23 0.84 0.92 0.62
f__[Odoribacteraceae] 0.0005 0.0022 0.0023 0.0022 0.0026 4.30 0.83 0.89 0.54
f__Desulfovibrionaceae 0.0001 0.0005 0.0010 0.0015 0.0064 7.61 0.83 0.92 0.54
f__Halomonadaceae 0.0002 0.0008 0.0016 0.0015 0.0001 8.48 0.91 0.97 0.73
f__Alcaligenaceae 0.0001 0.0004 0.0014 0.0017 0.0006 12.38 0.82 0.92 0.50
f__[Barnesiellaceae] 0.0001 0.0004 0.0022 0.0031 0.0015 33.09 0.93 0.97 0.77
f__Methanobacteriaceae 0.0000 0.0001 0.0024 0.0027 0.0002 79.88 0.90 1.00 0.73
f__Rikenellaceae 0.0000 0.0002 0.0054 0.0033 0.0000 139.26 0.97 0.97 0.92
소변 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Rhizobium, Morganella, Proteus, Exiguobacterium, Acinetobacter, Pseudomonas, SMB53, Lactococcus, Coprococcus, Streptococcus, Bacteroides, Ruminococcus, Corynebacterium, Odoribacter, Clostridium, Comamonas, Paraprevotella, Roseburia, Citrobacter, Klebsiella, Virgibacillus, Slackia, Dialister, Phascolarctobacterium, Sutterella, Halomonas, Roseomonas, 및 Methanobrevibacter 속 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 대장용종에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 28 및 도 28 참조).
대조군 대장용종 t-test
Taxon Mean SD Mean SD p-value Ratio AUC sensitivity specificity
g__Rhizobium 0.0056 0.0056 0.0000 0.0000 0.0000 0.00 0.99 0.95 1.00
g__Morganella 0.0211 0.0295 0.0003 0.0006 0.0001 0.01 0.82 0.63 0.85
g__Proteus 0.0132 0.0192 0.0003 0.0005 0.0002 0.02 0.91 0.82 0.96
g__Exiguobacterium 0.0013 0.0026 0.0001 0.0003 0.0078 0.06 0.74 0.63 0.77
g__Acinetobacter 0.1683 0.1396 0.0152 0.0123 0.0000 0.09 0.90 0.82 0.81
g__Pseudomonas 0.1288 0.0965 0.0296 0.0195 0.0000 0.23 0.89 0.82 0.81
g__SMB53 0.0034 0.0046 0.0010 0.0010 0.0039 0.30 0.78 0.74 0.69
g__Lactococcus 0.0035 0.0039 0.0014 0.0014 0.0029 0.39 0.75 0.71 0.62
g__Coprococcus 0.0036 0.0043 0.0084 0.0047 0.0001 2.35 0.82 0.87 0.73
g__Streptococcus 0.0143 0.0122 0.0358 0.0102 0.0000 2.50 0.90 0.87 0.81
g__Bacteroides 0.0212 0.0207 0.0571 0.0217 0.0000 2.69 0.92 0.89 0.73
g__[Ruminococcus] 0.0010 0.0015 0.0041 0.0039 0.0005 3.96 0.81 0.87 0.58
g__Corynebacterium 0.0090 0.0097 0.0367 0.0159 0.0000 4.09 0.97 0.95 0.85
g__Odoribacter 0.0002 0.0009 0.0010 0.0012 0.0050 4.31 0.82 0.92 0.54
g__Clostridium 0.0003 0.0011 0.0014 0.0015 0.0016 4.39 0.84 0.95 0.58
g__Ruminococcus 0.0030 0.0043 0.0145 0.0083 0.0000 4.84 0.91 0.89 0.73
g__Comamonas 0.0003 0.0010 0.0015 0.0020 0.0087 5.17 0.78 0.92 0.50
g__Paraprevotella 0.0002 0.0007 0.0012 0.0014 0.0010 6.62 0.85 0.92 0.62
g__Roseburia 0.0004 0.0017 0.0043 0.0029 0.0000 11.30 0.96 0.95 0.88
g__Citrobacter 0.0003 0.0005 0.0034 0.0020 0.0000 11.61 0.97 0.95 0.92
g__Klebsiella 0.0002 0.0006 0.0026 0.0042 0.0070 13.68 0.89 0.95 0.58
g__Virgibacillus 0.0000 0.0001 0.0006 0.0010 0.0074 15.87 0.75 0.92 0.42
g__Slackia 0.0000 0.0003 0.0008 0.0007 0.0000 16.11 0.88 0.95 0.65
g__Dialister 0.0005 0.0012 0.0082 0.0047 0.0000 17.52 0.95 0.97 0.85
g__Phascolarctobacterium 0.0001 0.0007 0.0023 0.0025 0.0002 18.69 0.88 0.97 0.65
g__Sutterella 0.0001 0.0003 0.0012 0.0017 0.0015 19.16 0.80 0.97 0.46
g__Halomonas 0.0001 0.0003 0.0015 0.0015 0.0001 22.99 0.91 0.95 0.73
g__Roseomonas 0.0000 0.0002 0.0026 0.0043 0.0052 78.36 0.93 0.97 0.77
g__Methanobrevibacter 0.0000 0.0000 0.0024 0.0027 0.0002 661.93 0.91 1.00 0.73
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 세균 메타게놈 분석을 통해 대장종양을 진단하는 방법은 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 대장용종 및 대장암 등의 대장종양의 발병 위험도를 예측하고 진단하는데 이용할 수 있다. 환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 염증 및 암 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 대장용종 및 대장암은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 또는 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 대장용종 및 대장암 등의 대장종양 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 대장종양의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 대장종양의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다. 또한, 대장용종 혹은 대장암으로 진단받은 환자에서 본 발명에 따른 세균 메타게놈 분석은, 원인인자를 예측하여 원인인자에 대한 노출을 피함으로써 대장용종 및 대장암의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막는데 이용할 수 있다.

Claims (16)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 대장종양 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
    상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 대장용종환자와 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
    상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장용종환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 대장암을 진단하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 Deferribacteres, Tenericutes, Actinobacteria, Acidobacteria, Armatimonadetes, Planctomycetes, Fusobacteria, Proteobacteria, 및 Euryarchaeota로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    Deferribacteres, Mollicutes, 4C0d-2, Bacilli, Alphaproteobacteria, Saprospirae, Fimbriimonadia, Acidobacteria-6, Solibacteres, Coriobacteriia, Oscillatoriophycideae, Fusobacteriia, Gammaproteobacteria, Clostridia, 및 Methanobacteria로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    RF32, YS2, Deferribacterales, Turicibacterales, RF39, Oceanospirillales, Rhizobiales, Lactobacillales, Rhodobacterales, Saprospirales, Sphingomonadales, Fimbriimonadales, iii1-15, Solibacterales, Coriobacteriales, Chroococcales, Fusobacteriales, Bdellovibrionales, Desulfobacterales, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Desulfovibrionales, 및 Methanobacteriales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    Peptococcaceae, Deferribacteraceae, Turicibacteraceae, Halomonadaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae, Peptostreptococcaceae, Rhodobacteraceae, Nocardioidaceae, Sphingomonadaceae, Bartonellaceae, Cellulomonadaceae, Lactobacillaceae, Rhizobiaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Leptotrichiaceae, Coriobacteriaceae, Xenococcaceae, Aeromonadaceae, Geodermatophilaceae, Bdellovibrionaceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Streptococcaceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Aerococcaceae, Comamonadaceae, Paraprevotellaceae, Christensenellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Gordoniaceae, Mycobacteriaceae, Desulfovibrionaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, 및 Rikenellaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    rc4-4, Proteus, Catenibacterium, Mucispirillum, Eubacterium, Turicibacter, Alloiococcus, Halomonas, Prevotella, Dialister, Anaerostipes, SMB53, Faecalibacterium, Blautia, Capnocytophaga, Sphingomonas, Lactobacillus, Fimbriimonas, Dermacoccus, Achromobacter, Novosphingobium, Sneathia, Agrobacterium, Blastomonas, Bdellovibrio, Alkanindiges, Roseateles, Shuttleworthia, Rhizobium, Morganella, Acinetobacter, Pseudomonas, Enterococcus, Lactococcus, Coprococcus, Bacteroides, Dorea, Streptococcus, Lachnospira, Ruminococcus, Corynebacterium, Comamonas, Gordonia, Paraprevotella, Mycobacterium, Roseburia, Slackia, Escherichia, Phascolarctobacterium, Sutterella, Virgibacillus, Eggerthella, Citrobacter, Roseomonas, Serratia, Methanobrevibacter, 및 Bilophila로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 대장용종환자와 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 대장암을 진단하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 Spirochaetes 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    Spirochaetes, 및 Acidobacteria-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    Spirochaetales, 및 Myxococcales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    Spirochaetaceae, 및 S24-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    Treponema, Dialister, Oscillospira, 및 Eubacterium로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장용종환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 대장용종을 진단하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 Actinobacteria, Proteobacteria, 및 Euryarchaeota로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    Betaproteobacteria, Solibacteres, Gammaproteobacteria, Clostridia, Methanobacteria, 및 4C0d-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    Burkholderiales, Sphingomonadales, Solibacterales, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Oceanospirillales, Desulfovibrionales, 및 Methanobacteriales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Exiguobacteraceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Streptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Comamonadaceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Paraprevotellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Christensenellaceae, Odoribacteraceae, Desulfovibrionaceae, Halomonadaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, 및 Rikenellaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    Sphingomonas, Alkanindiges, Roseateles, Rhizobium, Morganella, Proteus, Exiguobacterium, Acinetobacter, Pseudomonas, SMB53, Lactococcus, Coprococcus, Streptococcus, Bacteroides, Ruminococcus, Corynebacterium, Odoribacter, Clostridium, Comamonas, Paraprevotella, Roseburia, Citrobacter, Klebsiella, Virgibacillus, Slackia, Dialister, Phascolarctobacterium, Sutterella, Halomonas, Roseomonas, 및 Methanobrevibacter로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 피검체 샘플은 대변 또는 소변인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  9. 하기의 단계를 포함하는, 대장종양 진단방법:
    (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
    상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 대장용종환자와 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계; 또는
    상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장용종환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 대장암을 진단하는 것을 특징으로 하는, 대장종양 진단방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 Deferribacteres, Tenericutes, Actinobacteria, Acidobacteria, Armatimonadetes, Planctomycetes, Fusobacteria, Proteobacteria, 및 Euryarchaeota로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    Deferribacteres, Mollicutes, 4C0d-2, Bacilli, Alphaproteobacteria, Saprospirae, Fimbriimonadia, Acidobacteria-6, Solibacteres, Coriobacteriia, Oscillatoriophycideae, Fusobacteriia, Gammaproteobacteria, Clostridia, 및 Methanobacteria로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    RF32, YS2, Deferribacterales, Turicibacterales, RF39, Oceanospirillales, Rhizobiales, Lactobacillales, Rhodobacterales, Saprospirales, Sphingomonadales, Fimbriimonadales, iii1-15, Solibacterales, Coriobacteriales, Chroococcales, Fusobacteriales, Bdellovibrionales, Desulfobacterales, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Desulfovibrionales, 및 Methanobacteriales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    Peptococcaceae, Deferribacteraceae, Turicibacteraceae, Halomonadaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae, Peptostreptococcaceae, Rhodobacteraceae, Nocardioidaceae, Sphingomonadaceae, Bartonellaceae, Cellulomonadaceae, Lactobacillaceae, Rhizobiaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Leptotrichiaceae, Coriobacteriaceae, Xenococcaceae, Aeromonadaceae, Geodermatophilaceae, Bdellovibrionaceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Streptococcaceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Aerococcaceae, Comamonadaceae, Paraprevotellaceae, Christensenellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Gordoniaceae, Mycobacteriaceae, Desulfovibrionaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, 및 Rikenellaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    rc4-4, Proteus, Catenibacterium, Mucispirillum, Eubacterium, Turicibacter, Alloiococcus, Halomonas, Prevotella, Dialister, Anaerostipes, SMB53, Faecalibacterium, Blautia, Capnocytophaga, Sphingomonas, Lactobacillus, Fimbriimonas, Dermacoccus, Achromobacter, Novosphingobium, Sneathia, Agrobacterium, Blastomonas, Bdellovibrio, Alkanindiges, Roseateles, Shuttleworthia, Rhizobium, Morganella, Acinetobacter, Pseudomonas, Enterococcus, Lactococcus, Coprococcus, Bacteroides, Dorea, Streptococcus, Lachnospira, Ruminococcus, Corynebacterium, Comamonas, Gordonia, Paraprevotella, Mycobacterium, Roseburia, Slackia, Escherichia, Phascolarctobacterium, Sutterella, Virgibacillus, Eggerthella, Citrobacter, Roseomonas, Serratia, Methanobrevibacter, 및 Bilophila로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 대장종양 진단방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 대장용종환자와 대장암환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 대장암을 진단하는 것을 특징으로 하는, 대장종양 진단방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 Spirochaetes 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    Spirochaetes, 및 Acidobacteria-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    Spirochaetales, 및 Myxococcales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    Spirochaetaceae, 및 S24-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    Treponema, Dialister, Oscillospira, 및 Eubacterium로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 대장종양 진단방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인과 대장용종환자 유래 샘플에서 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 통하여 대장용종을 진단하는 것을 특징으로 하는, 대장종양 진단방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 Actinobacteria, Proteobacteria, 및 Euryarchaeota로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포,
    Betaproteobacteria, Solibacteres, Gammaproteobacteria, Clostridia, Methanobacteria, 및 4C0d-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포,
    Burkholderiales, Sphingomonadales, Solibacterales, Stramenopiles, Pseudomonadales, Clostridiales, Oceanospirillales, Desulfovibrionales, 및 Methanobacteriales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포,
    Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Exiguobacteraceae, Moraxellaceae, Pseudomonadaceae, Streptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Comamonadaceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Paraprevotellaceae, Ruminococcaceae, Corynebacteriaceae, Christensenellaceae, Odoribacteraceae, Desulfovibrionaceae, Halomonadaceae, Alcaligenaceae, Barnesiellaceae, Methanobacteriaceae, 및 Rikenellaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포, 또는
    Sphingomonas, Alkanindiges, Roseateles, Rhizobium, Morganella, Proteus, Exiguobacterium, Acinetobacter, Pseudomonas, SMB53, Lactococcus, Coprococcus, Streptococcus, Bacteroides, Ruminococcus, Corynebacterium, Odoribacter, Clostridium, Comamonas, Paraprevotella, Roseburia, Citrobacter, Klebsiella, Virgibacillus, Slackia, Dialister, Phascolarctobacterium, Sutterella, Halomonas, Roseomonas, 및 Methanobrevibacter로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 대장종양 진단방법.
  16. 제9항에 있어서,
    상기 피검체 샘플은 대변 또는 소변인 것을 특징으로 하는, 대장종양 진단방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019226035A1 (ko) * 2018-05-25 2019-11-28 주식회사 엠디헬스케어 Qpcr 분석을 통한 대장암 진단방법
US20220137056A1 (en) * 2019-02-08 2022-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Isolation and detection of exosome-associated microbiome for diagnostic and therapeutic purposes

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110025603A (ko) * 2009-09-04 2011-03-10 주식회사이언메딕스 그람 양성 세균유래 세포밖 소포체 및 이의 용도
KR20110073049A (ko) 2009-12-23 2011-06-29 한국생명공학연구원 메타게놈 라이브러리 유래 효소활성의 탐색 방법
US20130121968A1 (en) * 2011-10-03 2013-05-16 Atossa Genetics, Inc. Methods of combining metagenome and the metatranscriptome in multiplex profiles
WO2016099076A1 (ko) * 2014-12-16 2016-06-23 이화여자대학교 산학협력단 세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법
KR20160110232A (ko) * 2015-03-11 2016-09-21 주식회사 엠디헬스케어 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110025603A (ko) * 2009-09-04 2011-03-10 주식회사이언메딕스 그람 양성 세균유래 세포밖 소포체 및 이의 용도
KR20110073049A (ko) 2009-12-23 2011-06-29 한국생명공학연구원 메타게놈 라이브러리 유래 효소활성의 탐색 방법
US20130121968A1 (en) * 2011-10-03 2013-05-16 Atossa Genetics, Inc. Methods of combining metagenome and the metatranscriptome in multiplex profiles
WO2016099076A1 (ko) * 2014-12-16 2016-06-23 이화여자대학교 산학협력단 세균 유래의 나노소포체를 이용한 세균성 감염질환 원인균 동정방법
KR20160110232A (ko) * 2015-03-11 2016-09-21 주식회사 엠디헬스케어 유산균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3564390A4
ZELLER, GEORGE ET AL: "Potential of fecal microbiota for early-stage detection of Colorectal Cancer", MOLECULAR SYSTEMS BIOLOGY, vol. 10, no. 11, 28 November 2014 (2014-11-28), pages 766, XP055488670, DOI: 10.15252/msb.20145645 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019226035A1 (ko) * 2018-05-25 2019-11-28 주식회사 엠디헬스케어 Qpcr 분석을 통한 대장암 진단방법
US20220137056A1 (en) * 2019-02-08 2022-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Isolation and detection of exosome-associated microbiome for diagnostic and therapeutic purposes

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