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WO2019226035A1 - Qpcr 분석을 통한 대장암 진단방법 - Google Patents

Qpcr 분석을 통한 대장암 진단방법 Download PDF

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Publication number
WO2019226035A1
WO2019226035A1 PCT/KR2019/095020 KR2019095020W WO2019226035A1 WO 2019226035 A1 WO2019226035 A1 WO 2019226035A1 KR 2019095020 W KR2019095020 W KR 2019095020W WO 2019226035 A1 WO2019226035 A1 WO 2019226035A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rdna
seq
colorectal cancer
genus
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2019/095020
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김윤근
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MD Healthcare Inc
Original Assignee
MD Healthcare Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020190060187A external-priority patent/KR102141246B1/ko
Application filed by MD Healthcare Inc filed Critical MD Healthcare Inc
Publication of WO2019226035A1 publication Critical patent/WO2019226035A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing colorectal cancer through qPCR analysis, and more particularly, to a method for diagnosing colorectal cancer by analyzing genes of microorganisms present in feces through qPCR analysis.
  • Colon cancer or colorectal cancer is a malignant tumor of the cecum, colon and rectum, and is a cancer of the mucous membrane, the innermost surface of the colon. According to the announcement in 2006, the second most common cancer after stomach cancer in Korea, the incidence of eating habits has been increasing rapidly as westernization of eating habits. In recent decades, the mortality rate of colorectal cancer has been about 80%. The rate of increase is increasing. The age of onset occurs most frequently in the sixties, and by site, it occurs slightly more in the rectum than in the colon. Colorectal cancer can occur at any age, but over 90% of people with colorectal cancer are older than 40 years of age, and their incidence doubles every 10 years. All colon cancers are known to begin with benign polyps.
  • Polyps are initially an abnormal growth of the epithelium in the lining of the large intestine, protruding, and are a very common disease in 15-20% of adults.
  • colorectal polyps if a family member has colorectal cancer, colorectal cancer is at an increased risk even if ulcerative colitis has been suffered for a long time.
  • colorectal cancer is one of the known cancers associated with food, and is known to cause low dietary fiber intake, high intake of animal fat, or excessive intake of refined sugar (sugar) due to westernization of diet. .
  • cancer cells can be detected by biopsy through colonoscopy.
  • Most colon cancers are asymptomatic and therefore difficult to diagnose.
  • Microbiota refers to a microbial community including bacteria, archaea and eukarya that exist in a given settlement.Intestinal microbiota is an important role in human physiology. It is known to have a great effect on human health and disease through interaction with human cells. Recently, colon cancer has been reported to be caused by enteric bacteria with specific toxins such as metaloprotease. However, in the diagnosis of colorectal cancer, a method of diagnosing colorectal cancer through genetic analysis by separating only bacteria from human derivatives such as feces has not been reported yet.
  • the present inventors have studied a method for predicting or diagnosing colorectal cancer with high accuracy and sensitivity, and have developed a method for diagnosing colorectal cancer having high accuracy and sensitivity by separating bacteria from fecals that can be obtained.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems in the prior art, a method for predicting or diagnosing colon cancer by separating genes of microorganisms from fecal samples that can be easily obtained and analyzing them by qPCR. Its purpose is to provide.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting DNA from the subject fecal sample;
  • the extracted DNA is selected from the group consisting of 16S rDNA of the genus Ruminococcus, Fuzobacterium, Futerobacterium, Bacteroides, and Catenibacterium. Performing quantitative PCR (qPCR) using primer pairs and probes specific for one or more of the following; And
  • (c) providing a method for providing information for diagnosing colorectal cancer, comprising quantifying the DNA by qPCR analysis and comparing it with the amount of normal fecal-derived DNA.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting DNA from the subject fecal sample;
  • the extracted DNA is selected from the group consisting of 16S rDNA of the genus Ruminococcus, Fuzobacterium, Futerobacterium, Bacteroides, and Catenibacterium. Performing quantitative PCR (qPCR) using primer pairs and probes specific for one or more of the following; And
  • (c) providing a method for diagnosing colorectal cancer, comprising quantifying the DNA by qPCR analysis and comparing the DNA with an amount of normal fecal-derived DNA.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting DNA from the subject fecal sample;
  • the extracted DNA is selected from the group consisting of 16S rDNA of the genus Ruminococcus, Fuzobacterium, Futerobacterium, Bacteroides, and Catenibacterium. Performing quantitative PCR (qPCR) using primer pairs and probes specific for one or more of the following; And
  • (c) providing a method for predicting the risk of developing colorectal cancer, comprising the step of quantifying DNA by qPCR analysis and comparing it with the amount of normal fecal-derived DNA.
  • the DNA of step (a) may be DNA isolated from extracellular vesicles derived from bacteria in feces.
  • the primer pair of step (b) may be any one or more of the following:
  • Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4 capable of specifically amplifying 16S rDNA of bacteria of the genus Ruminococcus;
  • Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10 capable of specifically amplifying 16S rDNA of bacteria of the genus Bacteroides;
  • the probe of step (b) may be any one or more of the following:
  • a probe represented by SEQ ID NO: 8 capable of specifically binding to 16S rDNA of a bacterium of the genus Fusobacterium;
  • a probe represented by SEQ ID NO: 11 capable of specifically binding to 16S rDNA of a bacterium of Bacteroides genus;
  • a probe represented by SEQ ID NO: 17 capable of specifically binding to 16S rDNA of a bacterium of Catenbacterium.
  • the step (c) is a primer pair specific for bacterial 16S rDNA (human bacterial 16S rDNA) or human 18S rDNA by the amount of gene quantified by qPCR in step (b) and
  • the method may further include normalizing the quantified gene amount as a result of performing qPCR using the probe.
  • the primer pair may specifically amplify a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 18 and 19 or human 18S rDNA capable of specifically amplifying bacterial 16S rDNA (bacterial universal 16S rDNA). It may be a primer pair consisting of SEQ ID NO: 21 and 22.
  • the probe may be specifically bound to a bacterial 16S rDNA (bacterial universal 16S rDNA) or a sequence represented by SEQ ID NO: 20 or a sequence capable of specifically binding to human 18S rDNA. It may be a probe indicated by number 23.
  • Colorectal cancer can be diagnosed when the genes of the bacteria of the genus Fuzobacterium or Bacteroides are increased compared to normal people.
  • Colorectal cancer can be diagnosed when the gene levels of bacteria of the genus Ruminococcus or Catenibacterium are reduced compared to normal individuals.
  • the diagnostic method according to the present invention is widely used in the field of colorectal cancer diagnosis because it can predict and / or diagnose colorectal cancer with high accuracy and sensitivity using feces that can be easily obtained without suffering from a subject to be diagnosed. In addition to this, it is expected that this will enable early diagnosis of colorectal cancer, thereby significantly increasing the effectiveness of colorectal cancer treatment.
  • FIG. 1 is a view showing a result of comparing the amount of a gene by separating bacteria and bacterial-derived vesicles (EV) in human feces according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of evaluating the analytical performance of Ruminococcus genus, Fusobacterium genus, Bacteroides genus, Acinetobacter genus, Catenibacterium genus, bacterial universal 16S rDNA sequence and 18S rDNA specific gene primer according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows bacterial universal 16S rDNA and human cells expressing the degree of gene expression of bacteria from the genus Ruminococcus, Fusobacterium, Bacteroides, Acinetobacter, and Catenibacterium by separating bacteria from colon cancer patients and normal control feces according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting DNA from the subject fecal sample;
  • the extracted DNA is selected from the group consisting of 16S rDNA of the genus Ruminococcus, Fuzobacterium, Futerobacterium, Bacteroides, and Catenibacterium. Performing quantitative PCR (qPCR) using primer pairs and probes specific for one or more of the following; And
  • (c) providing a method for providing information for diagnosing colorectal cancer, comprising quantifying the DNA by qPCR analysis and comparing it with the amount of normal fecal-derived DNA.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting DNA from the subject fecal sample;
  • the extracted DNA is selected from the group consisting of 16S rDNA of the genus Ruminococcus, Fuzobacterium, Futerobacterium, Bacteroides, and Catenibacterium. Performing quantitative PCR (qPCR) using primer pairs and probes specific for one or more of the following; And
  • (c) providing a method for diagnosing colorectal cancer, comprising quantifying the DNA by qPCR analysis and comparing the DNA with an amount of normal fecal-derived DNA.
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting DNA from the subject fecal sample;
  • the extracted DNA is selected from the group consisting of 16S rDNA of the genus Ruminococcus, Fuzobacterium, Futerobacterium, Bacteroides, and Catenibacterium. Performing quantitative PCR (qPCR) using primer pairs and probes specific for one or more of the following; And
  • (c) providing a method for predicting the risk of developing colorectal cancer, comprising the step of quantifying DNA by qPCR analysis and comparing it with the amount of normal fecal-derived DNA.
  • the DNA of step (a) may be DNA isolated from extracellular vesicles derived from bacteria in feces.
  • the primer pair of step (b) may be any one or more of the following:
  • Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4 capable of specifically amplifying 16S rDNA of bacteria of the genus Ruminococcus;
  • Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10 capable of specifically amplifying 16S rDNA of bacteria of the genus Bacteroides;
  • a “primer” is a nucleic acid sequence having a short free 3 ′ hydroxyl group, which may form a base pair that interacts with a complementary template.
  • short nucleic acid sequence is meant as a starting point for copying.
  • Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffers and temperatures. PCR conditions, sense and antisense primer lengths can be modified based on what is known in the art.
  • the primer pair consists of a pair of forward alignment primer and reverse alignment primer.
  • the probe of step (b) may be any one or more of the following:
  • a probe represented by SEQ ID NO: 8 capable of specifically binding to 16S rDNA of a bacterium of the genus Fusobacterium;
  • a probe represented by SEQ ID NO: 11 capable of specifically binding to 16S rDNA of a bacterium of Bacteroides genus;
  • a probe represented by SEQ ID NO: 17 capable of specifically binding to 16S rDNA of a bacterium of Catenbacterium.
  • probe means a fragment (or fragment) complementary to a specific base sequence of DNA or RNA, and has a DNA or RNA fragment having a terminal base labeled with a radioactive element or fluorescence. It usually varies in length from 100-1000 bp and has complementary sequences to find specific nucleotide sequences in DNA or RNA samples in the molecular biology domain. Probes are used to identify gene sequences in single-stranded DNA or RNA through complementary binding to target genes.
  • the step (c) is a primer pair specific for bacterial 16S rDNA (human bacterial 16S rDNA) or human 18S rDNA by the amount of gene quantified by qPCR in step (b) and Performing qPCR using a probe may further comprise the step of normalizing the quantified gene amount, wherein the primer pair can specifically amplify the bacterial universal 16S rDNA (bacterial universal 16S rDNA) Primer pairs consisting of SEQ ID NOs: 21 and 22 capable of specifically amplifying a human 18S rDNA or SEQ ID NOs: 18 and 19, wherein the probe is specific for bacterial 16S rDNA (bacterial universal 16S rDNA). It may be a probe represented by SEQ ID NO: 20 capable of binding to or a probe represented by SEQ ID NO: 23 capable of specifically binding to human 18S rDNA.
  • step (c) when corrected with bacteria 16S rDNA when the gene amount of bacteria of the genus Fuzobacterium (Fusobacterium) or Bacteroides (Bacteroides) is increased to colon cancer Can be diagnosed and corrected with human 18S rDNA in step (c), when the gene amount of bacteria of the genus Fuzobacterium or Bacteroides is increased compared to normal persons; Alternatively, colon cancer may be diagnosed when the amount of the genes of the genus Ruminococcus or Catinibacterium is reduced compared to normal people.
  • diagnosisd colorectal cancer means to determine whether or not colon cancer is likely to develop, whether or not colon cancer is relatively high, or whether colorectal cancer has already occurred in a patient.
  • the method of the present invention can be used to prevent or delay the onset of the disease through special and appropriate management as a patient at high risk of developing colorectal cancer for any particular patient.
  • the methods of the present invention can be used clinically to determine treatment by early diagnosis of colon cancer and selecting the most appropriate treatment regimen.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • qPCR quantitative PCR
  • Real-time PCR is mainly used to screen the results of high-speed and large-scale experiments by identifying the expression changes of many target genes.
  • DNA is isolated from fecal microorganisms (see Example 1), Ruminococcus genus, Fusobacterium genus, Bacteroides genus, Acinetobacter genus, Catenibacterium genus bacterial universal 16S rDNA sequence and Human 18S Primers and probes specific for the rDNA gene were constructed (see Example 2).
  • a colon cancer diagnosis model was produced by the logistic method based on the qPCR result of each microbial gene content as a variable, using the Ruminococcus genus, Fusobacterium genus, and Bacteroides obtained from the fecal sample. It was confirmed that colorectal cancer can be diagnosed using the amount of microorganisms in the genus, Genus Catenibacterium (see Example 4).
  • Example One From feces Microbial isolation and gene quantification
  • feces were added to a 10 ml tube first after removing large particles present in the feces using gauze. After centrifugation (3,500 x g, 10min, 4 °C) to separate the suspension (pellet) and supernatant (supernatant) was added to the pellet portion and the supernatant portion in a new 10 ml tube. The supernatant was removed by using a 0.22 ⁇ m filter to remove bacteria and foreign substances, and then transferred to centripreigugal filters 50 kD, centrifuged at 1500 xg and 4 ° C for 15 minutes to remove substances smaller than 50 kD and concentrated to 10 ml. I was.
  • extracellular vesicles (EV) isolated by the above method was heated at 100 ° C. of the heatblock to allow the DNA to come out of the lipid and then cooled on ice.
  • the amount of DNA was quantified using Nanodrop.
  • 9.4 ng gDNA was extracted from 1 mL of feces from which large particles were removed, and the amount of gene extracted from extracellular vesicles extracted by ultracentrifugation was 3.5 ng gDNA from 1 mL of feces. Extracted (see FIG. 1).
  • PCR was performed with the 16s rDNA primer shown in Table 1 to confirm the presence of the bacteria-derived DNA in the gene isolated from the fecal bacteria, and it was confirmed that the bacteria-derived gene was present in the extracted gene.
  • Example 2 microbial genes primer making
  • Taqman Probe and Primer specific for each 16S rDNA sequence were prepared in order to quantitate the DNA amount of each of the biomarkers in the DNA isolated from the feces by the method of Example 1 by a quantitative PCR (qPCR) method (Taqman assay). .
  • qPCR quantitative PCR
  • the sequence information submitted to the NCBI database was collected, and conserved regions and hypervariable regions of 16S rDNA sequences of each biomarker were identified through multiple alignment.
  • Taqman Probe and Primer specific to each marker were produced through BLAST in a high diversity range.
  • Bacterial universal 16S rDNA sequence-specific primers and Taqman Probes to be used as calibration markers were constructed via BLAST in the conserved region. Human 18S rDNA-specific Primer and Probe to be used as another calibration marker was prepared with reference to the literature. The prepared primer and detection probe sequences are shown in Table 2.
  • bacteria were isolated from the feces of 105 normal controls and 79 colon cancer patients, followed by DNA extraction. Then, qPCR was performed using the Ruminococcus, Fusobacterium, Bacteroides, Acinetobacter, Catenibacterium primers and the calibration markers of 18S rDNA and bacterial universal 16S rDNA sequence of Table 2, and compared the two groups by relative quantification method. . 4 ⁇ l of DNA template, Primer and Probe of each well were reacted with a total of 20 ⁇ l using 18 pmol and 5 pmol, respectively.
  • the PCR conditions were repeated 50 °C 2 minutes, 95 °C 10 minutes, 95 °C 15 seconds, 60 °C 1 minute cycle 40 times (Quantstudio standard run mode default case).
  • Example 3 Based on the results of Example 3, a model for diagnosing colorectal cancer was developed by checking the amount of microorganisms of genus Ruminococcus, Fusobacterium, Bacteroides, and Catenibacterium in fecal samples. To this end, a colon cancer diagnosis model was prepared by a logistic method using the microbial gene content as a variable based on the qPCR result of Example 3 (Table 5).
  • AUC area-under-curve
  • the colon cancer diagnosis model using the colon cancer diagnosis model of the present invention is a large intestine with a high diagnostic accuracy when the amount of microorganisms of the genus Ruminococcus, Fusobacterium, Bacteroides, and Catenibacterium is obtained as a variable It was confirmed that it can be used as a cancer diagnostic method.
  • the diagnostic method according to the present invention is not only widely available in the field of colorectal cancer diagnosis, but also enables early diagnosis of colorectal cancer, thereby significantly increasing the effect of colorectal cancer treatment.

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Abstract

본 발명은 qPCR 분석을 통한 대장암 진단 방법에 관한 것으로, 분석하고자 하는 분변 시료에 포함되어 있는 미생물의 양을 측정하여 대장암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 진단 방법은 진단하고자 하는 대상으로부터 고통 없이 용이하게 획득할 수 있는 분변을 이용하여 높은 정확성 및 민감도를 가지고 대장암을 예측 및/또는 진단할 수 있기 때문에 대장암 진단 분야에 폭 넓게 사용가능할 뿐만 아니라, 이를 통하여 대장암의 초기 진단을 가능하게 하여 대장암 치료의 효과를 현저히 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Description

QPCR 분석을 통한 대장암 진단방법
본 발명은 qPCR 분석을 통한 대장암 진단 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 qPCR 분석을 통해 분변 내에 존재하는 미생물의 유전자를 분석하여 대장암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
대장암(colon cancer) 혹은 대장결장암(colorectal cancer)은 맹장, 결장과 직장에 생기는 악성 종양으로 대장의 가장 안쪽 표면인 점막에서 발생한 암이다. 2006년 발표에 따르면 우리나라에서는 위암에 이어 두 번째로 흔히 발생하는 암으로 근래에 식생활의 양상이 서구화되어 가면서 그 발생 빈도가 가파르게 증가하고 있고, 최근 10년 사이 대장암에 의한 사망률은 약 80 %정도 증가하여 그 상승속도가 계속 높아지고 있는 추세이다. 호발 연령은 60대에 가장 빈번하게 발생하며, 부위별로 보면 직장에 발생하는 경우가 결장에 발생하는 경우보다 약간 더 많다. 모든 나이에서 대장암이 발생할 수 있지만 대장암 환자의 90%이상의 경우 나이가 40세 이상이고, 매 10년마다 그 발생률이 두 배씩 증가한다. 모든 대장암은 양성 용종 (polyp)에서 시작된다고 알려져 있고, 용종은 처음에 대장 내벽에서 상피가 비정상적인 성장을 하여 돌출하는 것을 말하며, 성인의 15~20%에서 나타나는 아주 흔한 질병이다. 대장 용종 이외에도 가족 중에 대장암에 걸린 사람이 있는 경우, 오랜 기간동안 궤양성대장염에 시달린 경우에도 대장암이 위험이 증가한다. 또한, 대장암은 음식과 연관되어 있다고 알려지 암 중에서 대표적인 것으로서, 식생활의 서구화로 섬유소 섬취가 적다든지, 동물성 지방 섭취가 많다든지, 혹은 정제된 당분(설탕)의 과다 섭취 등이 유발요소로 알려져 있다.
초기 대장암의 경우에는 특별한 증상이 나타나지 않으나 증상이 없는 경우에도 눈에 띄지 않는 장 출혈로 혈액이 손실되어 빈혈이 생길 수 있고, 간혹 식욕부진과 체중감소가 나타나기도 한다. 암이 진행된 경우에는 배가 아프거나 설사 또는 변비가 생기는 등 배변습관의 변화가 나타나기도 하고 항문에서 피가 나오는 직장출혈의 증세가 나타나기도 하며, 혈액은 밝은 선홍색을 띄거나 검은 색으로 나타날 수 있다. 대장암이 진행이 된 경우에는 배에서 평소에 만져지지 않던 덩어리가 만져질 수 있다. 가장 주의해야 할 증상으로는 배변 습관의 변화, 혈변, 동통 및 빈혈이며, 특히 40세 이상의 성인에서 이와 같은 변화가 있을 때에는 철저히 조사할 필요가 있다.
대장암의 확진은 대장 내시경 검사를 통한 조직검사를 통해 암세포를 발견해야 가능하다. 대부분 대장암은 조기에는 증상이 없으므로 진단이 상당히 어렵고, 현재 비침습적인 방법으로 대장암을 예측하는 방법은 전무하다. 기존 진단방법으로는 대장암 등의 고형암이 진행된 경우에 발견되는 경우가 많기 때문에, 대장암으로 인한 의료비용과 사망을 예방하기 위해선 대장암 발생 및 원인인자를 미리 예측하여, 고위험군에서 대장암 발생을 예방하는 방법을 제공하는 것이 효율적인 방법이다.
한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 최근에는 metaloprotease와 같은 특정 독소를 갖는 장내 세균에 의해 대장암이 발생한다고 보고된 바 있다. 그러나 대장암 진단에 있어서, 분변과 같은 인체 유래물에서 세균만을 분리하여 유전자 분석을 통해 대장암을 진단하는 방법에 대해서는 아직 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 높은 정확성 및 민감도를 가지고 대장암을 예측 또는 진단할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과, 획득할 수 있는 분변으로부터 세균을 분리하여 높은 정확성 및 민감도를 가지는 대장암 진단 방법을 개발하게 되었다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 용이하게 획득할 수 있는 분변 시료로부터 미생물의 유전자를 분리하고 이를 qPCR로 분석하여 대장암을 예측 또는 진단할 수 있는 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 루미노코커스(Ruminococcus) 속, 푸조박테리움(Fusobacterium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR(quantitative PCR)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 루미노코커스(Ruminococcus) 속, 푸조박테리움(Fusobacterium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR(quantitative PCR)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 루미노코커스(Ruminococcus) 속, 푸조박테리움(Fusobacterium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR(quantitative PCR)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 발병 위험도 예측방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 (a) 단계의 DNA는 분변 내 세균 유래 세포밖 소포로부터 분리된 DNA일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (b) 단계의 프라이머 쌍은 하기 중 어느 하나 이상일 수 있다:
루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍;
푸조박테리움(Fusobacterium) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 쌍;
박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 및
카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (b) 단계의 프로브는 하기 중 어느 하나 이상일 수 있다:
루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 5으로 표시되는 프로브;
푸조박테리움(Fusobacterium) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 8로 표시되는 프로브;
박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 11로 표시되는 프로브; 및
카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 17로 표시되는 프로브.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계는, 상기 (b) 단계에서 qPCR을 통해 정량한 유전자 양을 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA) 또는 인간 18S rDNA에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR을 수행한 결과 정량된 유전자 양으로 보정(normalization)하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 프라이머 쌍은 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 18 및 19로 이루어진 프라이머 쌍 또는 인간 18S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 프로브는 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 20으로 표시되는 프로브 또는 인간 18S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 23으로 표시되는 프로브일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계에서 세균의 16S rDNA로 보정한 경우,
푸조박테리움(Fusobacterium) 속 또는 박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 증가되어 있을 때 대장암으로 진단할 수 있다.
본 발명이 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계에서 인간 18S rDNA로 보정한 경우,
푸조박테리움(Fusobacterium) 속 또는 박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 증가되어 있을 때; 또는
루미노코커스(Ruminococcus) 속 또는 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 감소되어 있을 때 대장암으로 진단할 수 있다.
본 발명에 따른 진단 방법은 진단하고자 하는 대상으로부터 고통 없이 용이하게 획득할 수 있는 분변을 이용하여 높은 정확성 및 민감도를 가지고 대장암을 예측 및/또는 진단할 수 있기 때문에 대장암 진단 분야에 폭 넓게 사용가능할 뿐만 아니라, 이를 통하여 대장암의 초기 진단을 가능하게 하여 대장암 치료의 효과를 현저히 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 분변에서 세균과 세균 유래 소포(EV)를 분리하여, 유전자 양을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Acinetobacter 속, Catenibacterium 속, bacterial universal 16S rDNA sequence 및 18S rDNA 특이적 유전자 프라이머의 분석적 성능을 평가한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 대장암 환자 및 정상 대조군 분변에서 세균을 분리하여 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Acinetobacter 속, Catenibacterium 속 세균의 유전자 발현 정도를 bacterial universal 16S rDNA 및 인간세포의 18S rDNA 유전자로 보정하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명은 (a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 루미노코커스(Ruminococcus) 속, 푸조박테리움(Fusobacterium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR(quantitative PCR)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 루미노코커스(Ruminococcus) 속, 푸조박테리움(Fusobacterium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR(quantitative PCR)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 루미노코커스(Ruminococcus) 속, 푸조박테리움(Fusobacterium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR(quantitative PCR)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 발병 위험도 예측방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 DNA는 분변 내 세균 유래 세포밖 소포로부터 분리된 DNA일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 프라이머 쌍은 하기 중 어느 하나 이상일 수 있다:
루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍;
푸조박테리움(Fusobacterium) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 쌍;
박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 및
카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍.
본 발명에 있어서, “프라이머(primer)”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3`hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 작용하는 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로서 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 상기 프라이머 쌍은 정배열 프라이머 및 역배열 프라이머가 하나의 쌍으로 구성된다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 프로브는 하기 중 어느 하나 이상일 수 있다:
루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 5으로 표시되는 프로브;
푸조박테리움(Fusobacterium) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 8로 표시되는 프로브;
박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 11로 표시되는 프로브; 및
카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 17로 표시되는 프로브.
본 발명에 있어서, “프로브(probe)”란 DNA또는 RNA의 특정 염기 서열에 상보적인 절편(또는 단편)으로, 방사선 원소 또는 형광으로 표지된 말단 염기를 지니는 DNA 또는 RNA 절편을 의미한다. 대개 100-1000 bp 정도 길이로 다양하며 분자생물학 영역에서 DNA 혹은 RNA 샘플 내의 특정 뉴클레오티드 서열을 찾기 위한 상보적인 서열을 갖는다. Probe는 타겟 유전자와의 상보적인 결합을 통해 단일 가닥의 DNA 혹은 RNA 속에서 찾고자 하는 유전자 서열을 확인하는 데 이용된다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계는, 상기 (b) 단계에서 qPCR을 통해 정량한 유전자 양을 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA) 또는 인간 18S rDNA에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR을 수행한 결과 정량된 유전자 양으로 보정(normalization)하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이 때 상기 프라이머 쌍은 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 18 및 19로 이루어진 프라이머 쌍 또는 인간 18S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있고, 상기 프로브는 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 20으로 표시되는 프로브 또는 인간 18S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 23으로 표시되는 프로브일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 세균의 16S rDNA로 보정한 경우, 푸조박테리움(Fusobacterium) 속 또는 박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 증가되어 있을 때 대장암으로 진단할 수 있으며, 상기 (c) 단계에서 인간 18S rDNA로 보정한 경우, 푸조박테리움(Fusobacterium) 속 또는 박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 증가되어 있을 때; 또는 루미노코커스(Ruminococcus) 속 또는 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 감소되어 있을 때 대장암으로 진단할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "대장암 진단" 이란 환자에 대하여 대장암이 발병할 가능성이 있는지, 대장암이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 대장암이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 대장암 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 대장암을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, “중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)”은 특정 DNA 서열을 빠르게 증폭시키는 기술로써 계통발생학적 분석, 유전자 검사, 그리고 DNA cloning 등 다양하게 사용되고 있다. 특히 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)으로도 알려진 “정량적 중합효소 연쇄반응(quantitative PCR, qPCR)”은 다수의 표적 유전자의 발현 변화를 확인하여 고속 대량의 실험결과를 스크리닝 하는데 주로 사용된다.
본 발명의 일 실시예에서는 분변 미생물로부터 DNA를 분리하고(실시예 1 참조), Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Acinetobacter 속, Catenibacterium 속 세균 및 보정 마커로 사용되는 bacterial universal 16S rDNA sequence 및 Human 18S rDNA 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브를 제작하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 상기 프라이머 및 프로브의 분석적 민감도와 특이도를 알아보기 위하여 분석적 성능 시험을 수행한 결과, 농도 의존적으로 세균을 정량함을 확인하였으며, 분변에서 분리한 세균의 유전자 함량을 대장암환자와 정상대조군에서 비교하였을 때, 16S로 보정할 경우 Fusobacterium 속, Bacteroides 속이 유의미한 차이를 보였으며, 18S로 보정할 경우 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Catenibacterium 속이 유의미한 차이를 보이는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 qPCR 결과를 토대로 각각의 미생물 유전자 함량을 변수로 하여 로지스틱 방법으로 대장암 진단 모형을 제작하였으며, 이를 이용하여 분석 시료인 분변으로 부터 획득된 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Catenibacterium 속 미생물의 양을 변수로 하여 대장암을 진단할 수 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 분변으로부터 미생물 분리 및 상기 미생물의 유전자 정량
분변 시료로부터 미생물을 분리하기 위하여, 일차적으로 거즈를 이용하여 분변에 존재하는 큰 입자들을 제거한 후에 10 ml 튜브에 분변을 첨가하였다. 이후 원심분리법(3,500 x g, 10min, 4℃)으로 부유물 (pellet)과 상등액 (supernatant)을 분리하여 새로운 10 ml 튜브에 pellet 부분과 상등액 부분을 각각 나누어 첨가하였다. 상등액은 0.22㎛ 필터를 사용하여 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브 (centripreigugal filters 50 kD)에 옮겨서 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 제거하고 10 ml까지 농축 시켰다. 그리고 다시 한 번 0.22㎛ filter를 사용하여 미생물과 이물질을 제거한 후에 Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 용해시켰다.
상기 방법으로 분리된 세포밖 소포(extracellular vesicle; EV) 100㎕를 heatblock 100℃에서 가열하여 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 하고 그 후 얼음에 식혔다. 그리고 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 그 결과, 원심분리한 후, pellet 부분에서 추출되는 유전자 양은 큰 입자를 제거한 대변 1mL에서는 9.4ng gDNA가 추출되었고, 초원심분리 방법으로 추출한 세포밖 소포에서 추출된 유전자 양은 대변 1mL으로부터 3.5ng gDNA가 추출되었다(도 1 참조).
이후, 분변 세균에서 분리한 유전자에서 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
primer 서열 서열번호
16S rDNA 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3 2
실시예 2: 미생물 유전자 프라이머 제작
상기 실시예 1의 방법으로 분변에서 분리한 DNA에서 바이오 마커들 각각의 DNA 양을 quantitative PCR(qPCR) 방법(Taqman assay)으로 정량하기 위하여 각 16S rDNA 서열에 대해 특이적인 Taqman Probe와 Primer를 제작하였다. 우선 NCBI database에 투고된 서열 정보를 수집한 후 Multiple alignment를 통해 각 바이오마커의 16S rDNA 서열에서 보존적인 구간(Conserved region)과 다양성이 높은 구간(Hypervariable region)을 파악하였다. 그리고 다양성이 높은 구간에서 BLAST를 통하여 각 마커에 특이적인 Taqman Probe와 Primer를 제작하였다. 보정 마커로 사용될 bacterial universal 16S rDNA sequence 특이적 Primer 및 Taqman Probe의 경우 보존적인 구간(Conserved region)에서 BLAST를 통하여 제작하였다. 또 다른 보정 마커로 사용될 Human 18S rDNA 특이적 Primer 및 Probe의 경우 문헌을 참고하여 제작하였다. 제작한 프라이머 및 검출용 프로브 서열은 표 2에 나타내었다.
Ruminococcus Forward 5'-GTATGTAAAGCTCTATCAGC-3' 서열번호 3
Reverse 5'-TCCGGTACTCTAGATTGA-3' 서열번호 4
Probe 5'FAM-CCCGGGTTTTCACATCAGACTTGCCACTCCG-BHQ13' 서열번호 5
Fusobacterium Forward 5'-GAGGAACCTTACCAGCGT-3' 서열번호 6
Reverse 5'-CCCCAACTTAATGATGGTAACATAC-3' 서열번호 7
Probe 5'FAM-TTAGGAATGAGACAGAGATGTTTCAGTGTCC-BHQ13' 서열번호 8
Bacteroides Forward 5'-CGGGCTTAAATTGCAGTGGA-3' 서열번호 9
Reverse 5'-TGCAGCACCTTCACAGC-3' 서열번호 10
Probe 5'FAM-TGATGTGGAAACATGTCAGTGAGCAATCAC-BHQ13' 서열번호 11
Acinetobacter Forward 5'-CGAGGAGGAGGCTACTT-3' 서열번호 12
Reverse 5'-CGGTGCTTATTCTGCGA-3' 서열번호 13
Probe 5'FAM-TAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTAC-BHQ13' 서열번호 14
Catenibacterium Forward 5'-AGTCAACGCAATAAGTGAC-3' 서열번호 15
Reverse 5'-CACCACCTGTCTTCTCTATA-3' 서열번호 16
Probe 5'FAM-GATCTAAAAGGGATGGAGACATCCTCATAG-BHQ13' 서열번호 17
16S Forward 5'-TGTCGTCAGCTCGTGT-3' 서열번호 18
Reverse 5'-GGGTTGCGCTCGTTG-3' 서열번호 19
Probe 5'FAM-ATGTTGGGTTAAGTCCCG-BHQ13' 서열번호 20
18S Forward 5'-GCCCGAAGCGTTTACTTTGA-3' 서열번호 21
Reverse 5'-TCCATTATTCCTAGCTGCGGTATC-3' 서열번호 22
Probe 5'FAM-AAAGCAGGCCCGAGCCGCC-BHQ13' 서열번호 23
실시예 3: 분변에서 추출한 DNA를 이용한 qPCR 분석
상기 실시예 2에서 제작한 Primer 및 Taqman Probe의 분석적 민감도와 특이도를 알아보기 위하여 분석적 성능 시험을 수행하였다. 분석적 성능 시험을 위해 각 타겟 마커의 DNA 서열이 포함된 DNA Plasmid를 제작하였다(표 3).
Target 서열(5'->3') 서열번호
Ruminococcus GTATGTAAAGCTCTATCAGCAGGGAAGAAAATGACGGTACCTGACTAAGAAGCACCGGCTAAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGAGCGTAGACGGAGTGGCAAGTCTGATGTGAAAACCCGGGGCTCAACCCCGGGACTGCATTGGAAACTGTCAATCTAGAGTACCGGA 서열번호 24
Fusobacterium GAGGAACCTTACCAGCGTTTGACATCTTAGGAATGAGACAGAGATGTTTCAGTGTCCCTTCGGGGAAACCTAAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTTTCGTATGTTACCATCATTAAGTTGGGG 서열번호 25
Bacteroides CGGGCTTAAATTGCAGTGGAATGATGTGGAAACATGTCAGTGAGCAATCACCGCTGTGAAGGTGCTGCA 서열번호 26
Acinetobacter CGAGGAGGAGGCTACTTTAGTTAATACCTAGAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCG 서열번호 27
Catenibacterium AGTCAACGCAATAAGTGACCCGCCTGAGTAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCGATCTAAAAGGGATGGAGACATCCTCATAGCTATAGAGAAGACAGGTGGTG 서열번호 28
16S TGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC 서열번호 29
18S GCCCGAAGCGTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCCGAGCCGCCTGGATACCGCAGCTAGGAATAATGGA 서열번호 30
제작한 Plasmid를 10 copy 단위로 Serial Dilution (10 2~10 6)하고 그것을 Template로 qPCR을 수행하여 분석적 민감도 시험을 하였다. qPCR 실험은 Premix Ex Taq TM (Probe qPCR) (TAKARA #RR390A)와 ABI Quantstudio 3 Real-Time PCR System, 96-well, 0.2mL (A28137)을 사용하여 수행하였다. 그 결과 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Acinetobacter 속, Catenibacterium 속, bacterial universal 16S rDNA sequence 및 18S rDNA 특이적 프라이머의 성능이 농도 의존적으로 세균을 정량함을 확인하였다(도 2 참조).
이후, 정상 대조군 105명, 대장암 환자 79명의 분변에서 세균을 분리한 다음 DNA를 추출하였다. 그리고 나서, 상기 표 2의 Ruminococcus, Fusobacterium, Bacteroides, Acinetobacter, Catenibacterium 프라이머와 보정 마커인 18S rDNA 및 bacterial universal 16S rDNA sequence의 프라이머, 프로브를 사용하여 qPCR을 실시한 후, 상대 정량 방법으로 두 군을 비교하였다. 각 well 당 DNA template 4㎕, Primer와 Probe는 각각 18pmol, 5pmol 씩 사용하여 총 20㎕로 반응하였다. 이때 PCR 조건은 초기 50℃ 2분, 95℃ 10분 대기 후, 95℃ 15초, 60℃ 1분의 cycle을 40회 반복하였다(Quantstudio standard run mode default 건). 상대 정량시 각 검체의 18S rDNA와 bacterial universal 16S rDNA sequence로 보정(normalization)하였으며, 각 바이오마커의 보정값에 대해 대조군(n=105)과 대장암군(n=79)의 각 평균값(±표준오차)을 t-test 검정을 통해 비교하였다. 그 결과, 분변에서 분리한 세균의 유전자 함량을 대장암환자와 정상대조군에서 비교하였을 때, 16S로 보정할 경우 Fusobacterium 속, Bacteroides 속이 유의미한 차이를 보였으며, 18S로 보정할 경우 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Catenibacterium 속이 유의미한 차이를 보였다 (표 4 및 도 3 참조). 상기 결과를 통하여, 진단하고자 하는 대상의 분변 시료에서 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Catenibacterium 속 미생물의 양을 확인한다면, 대장암을 진단할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2019095020-appb-img-000001
실시예 4: 분변 내의 미생물 유전자 분석을 통한 대장암 진단 모형 개발
상기 실시예 3의 결과를 바탕으로, 분변 시료에서 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Catenibacterium 속 미생물의 양을 확인하여 대장암을 진단하는 방법에 대한 모형을 개발하였다. 이를 위하여 실시예 3의 qPCR 결과를 토대로 각각의 미생물 유전자 함량을 변수로 하여 로지스틱 방법으로 대장암 진단 모형을 제작하였다(표 5).
변수 auc
Fusobacterium.16s 0.568776
Bacteroides.16s 0.617842
Fusobacterium.18s 0.620735
Bacteroides.18s 0.640506
Ruminococcus.18s 0.690295
Catenibacterium.18s 0.690416
Fusobacterium.16s+Ruminococcus.18s 0.694635
Bacteroides.16s+Catenibacterium.18s 0.705365
Catenibacterium.18s+Fusobacterium.16s 0.705365
Bacteroides.18s+Catenibacterium.18s 0.708379
Bacteroides.16s+Ruminococcus.18s 0.714045
Catenibacterium.18s+Fusobacterium.18s 0.718385
Catenibacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.733574
Fusobacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.743098
Fusobacterium.16s+Fusobacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.74346
Bacteroides.18s+Fusobacterium.16s+Ruminococcus.18s 0.744424
Bacteroides.18s+Catenibacterium.18s+Fusobacterium.18s 0.744665
Bacteroides.16s+Catenibacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.745027
Catenibacterium.18s+Fusobacterium.16s+Ruminococcus.18s 0.747679
Bacteroides.16s+Fusobacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.749247
Bacteroides.18s+Catenibacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.760458
Bacteroides.18s+Fusobacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.770102
Catenibacterium.18s+Fusobacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.783725
Catenibacterium.18s+Fusobacterium.16s+Fusobacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.783846
Bacteroides.16s+Catenibacterium.18s+Fusobacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.785051
Bacteroides.18s+Catenibacterium.18s+Fusobacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.798071
Bacteroides.16s+Bacteroides.18s+Catenibacterium.18s+Fusobacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.798553
Bacteroides.18s+Catenibacterium.18s+Fusobacterium.16s+Fusobacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.799156
Bacteroides.16s+Catenibacterium.18s+Fusobacterium.16s+Fusobacterium.18s+Ruminococcus.18s 0.800121
그 결과, 진단적 유용성의 지표인 AUC (area-under-curve)가 0.568776부터 0.800121로 나타나는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, 본 발명의 대장암 진단 모형을 이용하여 분석 시료인 분변으로 부터 획득된 Ruminococcus 속, Fusobacterium 속, Bacteroides 속, Catenibacterium 속 미생물의 양을 변수로 하여 진단하면, 진단 정확성이 매우 높은 대장암 진단 방법으로 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 진단 방법은 대장암 진단 분야에 폭 넓게 사용가능할 뿐만 아니라, 이를 통하여 대장암의 초기 진단을 가능하게 하여 대장암 치료의 효과를 현저히 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (18)

  1. (a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 루미노코커스(Ruminococcus) 속, 푸조박테리움(Fusobacterium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR(quantitative PCR)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 진단을 위한 정보제공방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 DNA는 분변 내 세균 유래 세포밖 소포로부터 분리된 DNA인 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단을 위한 정보제공방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 프라이머 쌍은 하기 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단을 위한 정보제공방법:
    루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍;
    푸조박테리움(Fusobacterium) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 쌍;
    박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 및
    카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 프로브는 하기 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단을 위한 정보제공방법:
    루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 5으로 표시되는 프로브;
    푸조박테리움(Fusobacterium) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 8로 표시되는 프로브;
    박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 11로 표시되는 프로브; 및
    카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 17로 표시되는 프로브.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계는, 상기 (b) 단계에서 qPCR을 통해 정량한 유전자 양을 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA) 또는 인간 18S rDNA에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR을 수행한 결과 정량된 유전자 양으로 보정(normalization)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단을 위한 정보제공방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 프라이머 쌍은 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 18 및 19로 이루어진 프라이머 쌍 또는 인간 18S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22로 이루어진 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단을 위한 정보제공방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 프로브는 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 20으로 표시되는 프로브 또는 인간 18S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 23으로 표시되는 프로브인 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단을 위한 정보제공방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 세균의 16S rDNA로 보정한 경우,
    푸조박테리움(Fusobacterium) 속 또는 박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 증가되어 있을 때 대장암으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 인간 18S rDNA로 보정한 경우,
    푸조박테리움(Fusobacterium) 속 또는 박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 증가되어 있을 때; 또는
    루미노코커스(Ruminococcus) 속 또는 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 감소되어 있을 때 대장암으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단을 위한 정보제공방법.
  10. (a) 피검체 분변 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 루미노코커스(Ruminococcus) 속, 푸조박테리움(Fusobacterium) 속, 박테로이데스(Bacteroides) 속, 및 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR(quantitative PCR)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 qPCR 분석을 통해 DNA를 정량하여 정상인 분변 유래 DNA의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 진단방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 DNA는 분변 내 세균 유래 세포밖 소포로부터 분리된 DNA인 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 프라이머 쌍은 하기 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단방법:
    루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍;
    푸조박테리움(Fusobacterium) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 쌍;
    박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 및
    카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 프로브는 하기 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단방법:
    루미노코커스(Ruminococcus) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 5으로 표시되는 프로브;
    푸조박테리움(Fusobacterium) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 8로 표시되는 프로브;
    박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 11로 표시되는 프로브; 및
    카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 16S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 17로 표시되는 프로브.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 (c) 단계는, 상기 (b) 단계에서 qPCR을 통해 정량한 유전자 양을 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA) 또는 인간 18S rDNA에 특이적인 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 qPCR을 수행한 결과 정량된 유전자 양으로 보정(normalization)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 프라이머 쌍은 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 18 및 19로 이루어진 프라이머 쌍 또는 인간 18S rDNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 서열번호 21 및 22로 이루어진 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 프로브는 세균의 16S rDNA(bacterial universal 16S rDNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 20으로 표시되는 프로브 또는 인간 18S rDNA에 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 23으로 표시되는 프로브인 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 세균의 16S rDNA로 보정한 경우,
    푸조박테리움(Fusobacterium) 속 또는 박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 증가되어 있을 때 대장암으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 인간 18S rDNA로 보정한 경우,
    푸조박테리움(Fusobacterium) 속 또는 박테로이데스(Bacteroides) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 증가되어 있을 때; 또는
    루미노코커스(Ruminococcus) 속 또는 카테니박테리움(Catenibacterium) 속 세균의 유전자 양이 정상인에 비해 감소되어 있을 때 대장암으로 진단하는 것을 특징으로 하는, 대장암의 진단방법.
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