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WO2018170624A1 - 降低微小rna-185和微小rna-424表达的方法 - Google Patents

降低微小rna-185和微小rna-424表达的方法 Download PDF

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WO2018170624A1
WO2018170624A1 PCT/CN2017/077174 CN2017077174W WO2018170624A1 WO 2018170624 A1 WO2018170624 A1 WO 2018170624A1 CN 2017077174 W CN2017077174 W CN 2017077174W WO 2018170624 A1 WO2018170624 A1 WO 2018170624A1
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mir
expression
pri
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microrna
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PCT/CN2017/077174
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Inventor
毛吉炎
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Shenzhen Biocan Technologies Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Biocan Technologies Co Ltd
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Definitions

  • the present invention relates to the field of life sciences, and more particularly to a method of reducing the expression of microRNA-185 and microRNA-424.
  • MicroRNA-185 (miR-185) is a 22 nt miRNA located in human chromosome 22ql l.
  • DNMT1 methylation-related tumor suppressor miRNA that can be directly targeted.
  • the expression of DNMT1 affects the methylation level of the whole genome, which in turn regulates the methylation status of certain genes, affecting gene expression; microRNA
  • miR-424 (miR-424) is a miRNA discovered in recent years, which affects the biological effects and development of tumor cells by acting on target genes in various tumors, thereby affecting the biological effects and development of tumor cells.
  • miR-424 is a multifunctional miRNA, which is associated with cell invasion and metastasis of cervical cancer, pancreatic cancer, etc.; it is associated with the expression of inflammatory factors such as IL-6 and TNF- ⁇ ; since the miR-424 promoter region has CpG islands It is also associated with methylation-induced gene silencing.
  • miRNA silencing is the presentation of artificially synthesized oligonucleotide small molecules into cells, and endogenous miRNAs.
  • a heteroduplex allows the miRNA to reduce the inhibition of the target gene to achieve regulation of gene function.
  • Silencing of miRNAs is currently difficult to achieve.
  • Commonly used methods for silencing miRNA mainly include anti-miR, antagomiR, miRNA sponge, etc. These methods have short effects such as short inter-turn, poor stability, complex construction, high requirements on instrument conditions, and complicated technical operations, which are difficult to achieve, simple, and effective. The effect of miR-185 and miR-424 expression was reduced.
  • the object of the present invention is to provide a method for reducing the expression of miR-185 and miR-424, which is simple in design, easy to operate, and can easily and effectively down-regulate the expression of miR-185 and miR-424, Overcoming the deficiencies of the prior art.
  • a method for the present invention a method for down-regulating expression of miR-185 and miR-424, and constructing eukaryotic expression targeting miR-185 and miR-424 on a eukaryotic vector pRI-GFP/Neo containing a HI promoter Vector pRI-185-424, which regulates the expression of miR-185 and miR-424 in eukaryotic cells; after transfecting the vector into eukaryotic cells in vitro, the expression of miR-185 and miR-424 was detected by real-time PCR Level.
  • the sequences of pRI-GFP/Neo and Tud-185-424 were double-digested with Xho I and Bgl II, and the recovered fragments were purified and ligated overnight at 4 ° C. After ligation, single colonies were picked and inoculated. In LB medium containing l (Vg/ml kanamycin, 12 hours later, the bacterial solution was extracted and sent to Shanghai Yingjun for sequencing. The correctly sequenced vector was the successfully constructed recombinant plasmid pRI-185-424.
  • the present invention utilizes a molecular biology technique to construct a eukaryotic expression vector containing Tud-185-424 based on a eukaryotic vector containing a CMV promoter, thereby down-regulating the expression of miR-185 and miR-424; After the vector was transfected into eukaryotic cells in vitro, the expression of miR-185 and miR-424 was detected by a real-time PCR instrument.
  • the invention is not only suitable for transfection of cells, but also for the production of whole horizontal transgenic animals.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the pRI-GFP/Neo vector
  • FIG. 2 is a quantitative PCR method for detecting the expression level of miRNA, wherein a. miR-185 expression, b. miR-424 expression.
  • Tud RNA targeting hsa-miR-185 and hsa-miR-424 was designed according to the design principle of Tough Decoy RNA (Tud RNA).
  • Tud RNA Tough Decoy RNA
  • Tud-185-424 The enzyme was digested to obtain the desired Tud-185-424 sequence.
  • the nucleotide sequence of Tud-185-424 is shown as SE Q ID No 1.
  • 16HBE cells were seeded in a 6-well plate at a density of 30,000/ml, and 10
  • Plasmid pRI-185-424 was transfected with Lipofectamine 2000 and continuously cultured at 5% CO 2 at 37 ° C. After 48 sputum, total RNA was extracted from each group, using Realtime.
  • miR-185 and miR-424 were detected by PCR, and the results showed that the expression levels of m iR-185 and miR-424 were significantly down-regulated in the pRI-185-424 transfection group (Fig. 2), suggesting that the vector can be used for The expression of miR-185 and miR-424 was reduced.
  • the present invention utilizes a molecular biology technique to construct a eukaryotic expression vector containing Tud-185-424 based on a eukaryotic vector containing a CMV promoter, thereby down-regulating the expression of miR-185 and miR-424; After the vector was transfected into eukaryotic cells in vitro, the expression of miR-185 and miR-424 was detected by a real-time PCR instrument.
  • the invention is not only suitable for transfection of cells, but also for the production of whole horizontal transgenic animals.

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

提供了一种降低微小RNA-185和微小RNA-424表达的方法，包括在含H1启动子的真核载体pRI-GFP/Neo上构建靶向miR-185和miR-424的真核表达载体pRI-185-424，实现下调miR-185和miR-424的表达。

Description

说明书 发明名称：降低微小 RNA-185和微小 RNA-424表达的方法 技术领域
[0001] 本发明涉及生命科学领域， 尤其是一种降低微小 RNA-185和微小 RNA-424表达 的方法。
背景技术
[0002] 微小 RNA-185 (miR-185) 是一个长度为 22nt的 miRNA, 定位于人染色体 22ql l.
21， 在结肠癌、 胃癌、 食管癌、 肺癌、 肝癌等肿瘤的发生和侵袭等方面作为一 个抑癌基因发挥重要作用， 另外它一种甲基化相关的抑瘤性 miRNA, 可通过直 接靶向 DNMT1的表达而影响全基因组的甲基化水平， 进而调控某些基因的甲基 化修饰状态， 影响基因表达； 微小 RNA
-424 (miR-424) 是近年来发现的一个 miRNA, 其在多种肿瘤中通过作用于靶基 因， 参与靶基因调控的信号通路， 从而影响肿瘤细胞生物学效应和发生发展， 发挥类似于癌基因、 抑癌基因的作用， 或促进、 抑制肿瘤的侵袭转移。 有研究 表明 miR-424是多功能 miRNA, 它与宫颈癌， 胰腺癌等细胞侵袭转移相关； 与炎 性因子如 IL-6、 TNF-α的表达相关； 由于 miR-424启动子区域具有 CpG岛， 它与 甲基化诱导的基因沉默也相关。 通过控制 miR-185和 miR-424的表达， 同吋与其 他药物协同作用， 能为治疗癌症提供新的表观遗传思路。
技术问题
[0003] 目前 miRNA功能研究一般通过 miRNA过表达和沉默来实现， miRNA沉默是把 人工合成的寡核苷酸小分子提呈到细胞内， 与内源性 miRNA
形成异源双链， 使 miRNA降低对靶基因的抑制作用， 以实现对基因功能的调控 。 miRNA沉默， 特别是长期稳定沉默目前较难以实现。 常用的沉默 miRNA的方 法主要有 anti-miR， antagomiR, miRNA sponge等， 这些方法存在作用吋间短、 稳定性差、 构建复杂、 仪器条件要求高且技术操作复杂的不足， 难以达到方便 、 简单而有效地降低 miR- 185和 miR-424表达的效果。
问题的解决方案 技术解决方案
[0004] 本发明的目的是： 提供一种降低 miR-185和 miR-424表达的方法， 它方法设计简 单， 操作容易， 能简单而有效地下调 miR-185和 miR-424表达的效果， 以克服现 有技术的不足。
[0005] 本发明的实现方法： 下调 miR-185和 miR-424表达的方法， 在含 HI启动子的 真核载体 pRI-GFP/Neo上构建靶向 miR- 185和 miR-424的真核表达载体 pRI- 185-424 ， 以下调 miR-185和 miR-424在真核细胞中的表达； 将该载体体外转染真核细胞 后， 利用荧光定量 PCR仪检测 miR-185和 miR-424的表达水平。
[0006] 所述的 pRI-185-424的构建， 具体是， 利用软件完成 Tud-185-424的序列设计
； 用 Xho I、 Bgl II双酶切骨架载体 pRI-GFP/Neo和 Tud-185-424序列， 回收片段纯 化， 再 4°C的条件下过夜连接； 连接后转化， 挑取单菌落， 接种到含 l(Vg/ml卡那 霉素的 LB培养基中， 12小吋后提取菌液并送上海英骏测序。 测序正确的载体即 为成功构建的重组质粒 pRI-185-424。
发明的有益效果
有益效果
[0007] 本发明利用分子生物学技术， 在含 CMV启动子的真核载体基础上， 构建含 Tud- 185-424的真核表达载体， 实现下调 miR-185和 miR-424的表达； 并通过将该载体 体外转染真核细胞后， 利用荧光定量 PCR仪检测 miR-185和 miR-424表达情况。 本发明不仅适于细胞的转染， 也可用于整体水平转基因动物的制作。
对附图的简要说明
附图说明
[0008] 图 1为所述 pRI-GFP/Neo载体的结构示意图； 图 2为定量 PCR检测 miRNA表达水 平情况， 其中， a. miR-185的表达情况， b. miR-424的表达情况。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0009] 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解 ， 实施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而 不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0010] 实施例下调 miR- 185和 miR-424表达的方法
[0011] ①
首先在 miRBase数据库中检索出 hsa-miR-185和 hsa-miR-424的序列， 根据 Tough Decoy RNA (Tud RNA) 的设计原则设计靶向 hsa-miR-185和 hsa-miR-424的 Tud RNA， 最后在 Tud RNA的 5'端和 3'端加上 Xho I和 Bgl
II酶切位点， 获得所需的 Tud- 185-424序列。 所述 Tud-185-424的核苷酸序列如 SE Q ID No 1所示。
[0012] ② 用 Xho l和 8§1 11双酶切骨架载体 1-0?? 60和1 1(1-185-424序列， 回收片 段纯化， 再 4°C的条件下过夜连接； 连接后转化， 挑取 6个菌落， 接种到含 10 g/ml卡那霉素的 LB培养基中， 12小吋后提取菌液并送上海英骏测序。 测序正确 的载体即为成功构建的重组质粒 pRI-185-424。
[0013] ③ 应用无内毒素质粒提取试剂盒 （天根生化） 提取重组质粒 pRI-185-424。
[0014] 按 3万 /ml的密度将 16HBE细胞接种于 6孔板中， 将 10
质粒 pRI- 185-424利用 Lipofectamine 2000瞬吋转染细胞， 继续在 5% C02、 37°C 条件下培养； 48小吋后， 抽取各组细胞总 RNA， 利用 Realtime
PCR分别检测 miR- 185和 miR-424表达情况， 结果显示， pRI- 185-424转染组中， m iR-185和 miR-424表达均水平显著下调 （图 2) ， 提示该载体可以用于降低 miR- 18 5和 miR-424的表达。
工业实用性
[0015] 本发明利用分子生物学技术， 在含 CMV启动子的真核载体基础上， 构建含 Tud- 185-424的真核表达载体， 实现下调 miR-185和 miR-424的表达； 并通过将该载体 体外转染真核细胞后， 利用荧光定量 PCR仪检测 miR-185和 miR-424表达情况。 本发明不仅适于细胞的转染， 也可用于整体水平转基因动物的制作。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 一种降低微小 RNA-185和微小 RNA-424的方法， 其特征在于： 在含 H
1启动子的真核载体 pRI-GFP/Neo上构建靶向 miR- 185和 miR-424的真 核表达载体 pRI- 185-424， 以下调 miR- 185和 miR-424在真核细胞中的 表达； 将该载体体外转染真核细胞后， 利用荧光定量 PCR仪检测 miR- 185和 miR-424的表达水平。
[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的降低微小 RNA-185和微小 RNA-424表达的方法
， 其特征在于： 所述的 pRI-185-424的构建， 具体是， 利用软件完成 T ud-185-424的序列设计； 用 Xho I、 Bgl II双酶切骨架载体 pRI-GFP/Neo 和 Tud- 185-424序列， 回收片段纯化， 再 4°C的条件下过夜连接； 连接 后转化， 挑取单菌落， 接种到含 l(Vg/ml卡那霉素的 LB培养基中， 12 小吋后提取菌液并送上海英骏测序。 测序正确的载体即为成功构建的 重组质粒 pRI- 185-424。
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