WO2018170619A1 - 抑制双miRNA表达的载体及其应用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to the field of molecular biology, and more particularly to a vector for inhibiting expression of a dual miRNA and an application thereof.
- RNA is an important substance in living organisms and plays various functions in life activities. RNA can be classified into messenger RNA (mRNA) and non-coding RNA depending on whether the protein is encoded or not.
- mRNA messenger RNA
- non-coding RNA depending on whether the protein is encoded or not.
- RNA non-coding RNA, ncRNA.
- Small RNA small RNA
- RNA is an important class of ncRNAs. miRNAs are endogenous small RNAs in organisms that are typically 20-24 nt in length. The miRNA is part of the pri-miRNA (primary RNA) and is initially expressed in the nucleus by RNA polymerase ⁇ . The mature miRNA acts as a guiding molecule, binds to the target gene mRNA according to the principle of base pairing, and directs the silencing complex (RISC) to degrade mRNA or hinder its translation, thereby exerting a negative regulation effect on the expression of the target gene.
- RISC silencing complex
- miR-148a is a microRNA that has been studied more in recent years. It is reported that miR-148a is closely related to the metabolism of exogenous substances, apoptosis, the occurrence, development and epigenetics of various cancers, so it is important to study the function of miR-148a; miR-152 is a kind of With multifunctional miRNAs, it was found that miR-152 is associated with methylation, such as methyltransferase DNMT1 content and enzyme activity, miR-152 can be methylated by endometrial cancer DNA into a silent gene, and its Associated with the development of a variety of cancers, it is a tumor suppressor microRNA that is associated with many diseases such as pre-eclampsia, trophoblastic tumors, bladder cancer, gastrointestinal cancer, and ovarian cancer. By controlling the expression of miR-148a and miR-152, peers and other drugs work together to provide new epigenetic ideas for the treatment of cancer.
- MiRNA functional studies often require miRNA silencing techniques, including anti-miR, antago miR, miRNA
- Tough Decoy RNA is a novel miRNA-inhibiting miRNA that inhibits miRNA by introducing double-stranded RNA to adsorb target miRNAs. Since the inserted RNA is double-stranded and has a secondary structure of a stem loop, it is resistant to intracellular nuclease degradation and can inhibit miRNA for a long-term, stable, and efficient manner.
- the technical problem to be solved by the present invention is to provide a dual miRNA suppression expression vector which is simple in structure, low in cost and simple in operation.
- a Tud RNA targeting a dual miRNA the nucleotide sequence of which is shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
- a dual miRNA-inhibiting expression vector comprising the sequence of the invention SEQ ID NO: 1.
- the double miRNA-inhibiting expression vector can inhibit the expression of miR-148a and miR-152 by transforming Hela cells.
- a method for constructing a dual miRNA suppression expression vector according to the present invention comprises the following steps:
- the synthesized sequence is two complementary single-stranded DNAs.
- the two single-stranded DNAs were dissolved in ddH 2 0, mixed in an equimolar ratio, treated at 95 ° C for 5 min, and then allowed to cool to room temperature at room temperature.
- the digested vector was recovered using the MinElute Reaction Cleanup Kit, and the TuD obtained in the previous step was further treated with T4 DNA ligase.
- RNA sequence was ligated into the vector pLKO.l-puro to form the recombinant vector pLKO-TuD-148a-152, and finally the ligation product was transformed into competent E. coli Stbl3 and plated onto a plate containing ampicillin LB medium. Incubate at 37 °C for 14 h. Single colonies were picked and sequenced. The bacteria with the correct sequencing were expanded and extracted with a small amount of extraction kit without endotoxin plasmid. The extracted plasmid was the plasmid for the homologous interference pLKO-TuD-148a-152 required by the present invention.
- the homologous interference miR-148a and miR-152 TuD RNA sequences designed by the present invention have a stem-loop structure and are not easily degraded, and the double-stranded Tud RNA has higher binding efficiency than the currently used single-stranded miRNA sponge. And the same target for two targets, can better achieve the interference of two miRNAs, improve the efficiency of miRNA function research.
- Figure 1 shows the miRNA expression levels of 16HBE cells and TuD-148a-152 cells, wherein, a.
- the lentiviral plasmid pLKO.l-puro vector used in the present invention was purchased from Addgene; the human bronchial epithelial cells (16HBE cell strain) used in the present invention were purchased from ATCC, USA.
- TuD RNA oligonucleotide sequence targeting miR-148a and miR-152 was designed, and its sequence is SEQ ID.
- the synthesized sequence is two complementary single stranded DNAs.
- the two single-stranded DNAs were dissolved in ddH 2 0, mixed in an equimolar ratio, treated at 95 ° C for 5 min, and allowed to stand at room temperature to allow them to naturally cool to room temperature.
- RNA sequence was ligated into the vector pLKO.l-puro to form the recombinant vector pLKO-Tud-148a-152, and finally the ligation product was transformed into competent E. coli Stbl3 and plated onto a plate containing ampicillin LB medium. Incubate at 37 °C for 14 h. Single colonies were picked and sequenced. The correct sequencing bacteria were expanded and extracted with a non-endotoxin plasmid miniprep kit. The extracted plasmid was the plasmid of the same interference interference pLKO-TuD-148a-152 required by the present invention.
- 16HBE cells were seeded in 6-well plates, 1000000 cells per well, and the cell density was about 60% after 18 hours.
- the plasmid pLKO-TuD-148a-152 was transduced into 16HBE cells with Lipfectamine 2000, and culture was continued for 48 h. Thereafter, the cells were cultured for 3 days in DMEM medium containing 1.0 g/ml puromycin, and the cell line obtained by the screening was named TuD-148a-152 cell line.
- the homologous interference miR-148a and miR-152 TuD RNA sequences designed by the present invention have a stem-loop structure and are not easily degraded, and the double-stranded Tud RNA has higher binding efficiency than the currently used single-stranded miRNA sponge. And the same target for two targets, can better achieve the interference of two miRNAs, improve the efficiency of miRNA function research.
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
提供了一种双miRNA抑制表达载体及其应用。所述表达载体是将靶向miR148a和miR-152的Tud RNA连接到了pLKO.1-puro克隆载体上获得的双miRNA抑制表达载体pLKO-Tud-148a-152，其具有抑制has-miR-148a和has-miR-152活性的作用。
Description
发明名称：抑制双 miRNA表达的载体及其应用 技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学领域， 特别是涉及一种抑制双 miRNA表达的载体及其应 用。
背景技术
[0002] RNA是生物体内一种重要物质， 在生命活动中发挥着各种各样的功能。 根据是 否编码蛋白质， RNA可分为信使 RNA (messagerRNA, mRNA) 和非编码 RNA
(non-coding RNA, ncRNA) 。 小 RNA (small
RNA, smRNA) 是一类重要的 ncRNA。 miRNA是生物体内一种内源性小 RNA， 长度一般为 20-24nt。 miRNA是 pri-miRNA (primaryRNA) 的一部分， 最初在细 胞核中由 RNA聚合酶 Π转录表达。 成熟的 miRNA作为引导性分子， 根据碱基配对 原则与靶基因 mRNA结合， 引导沉默复合体 （RISC) 降解 mRNA或阻碍其翻译 ， 从而发挥对靶标基因表达的负调控作用。
[0003] miR- 148a是近几年研究得较多的一种 microRNA。 据报道， miR-148a与外源性 物质代谢、 细胞凋亡、 多种癌症的发生、 发展和表观遗传等都密切有关， 因此 研究 miR- 148a的功能至关重要； miR-152是一种具有多功能的 miRNA, 研究发现 miR-152与甲基化相关， 如与甲基转移酶 DNMT1含量和酶活性相关， miR-152可 被子宫内膜癌 DNA甲基化变为沉默基因， 并且其与多种癌症的发生发展相关， 它是一种肿瘤抑制 microRNA, 与子痫前期、 滋养细胞肿瘤、 膀胱癌、 胃肠癌、 卵巢癌等诸多疾病相关。 通过控制 miR-148a和 miR-152的表达， 同吋与其他药物 协同作用， 能为治疗癌症提供新的表观遗传思路。
技术问题
[0004] MiRNA的功能研究通常需要用到 miRNA沉默技术， 主要包括 anti-miR， antago miR, miRNA
sponge等， 这些技术均属于瞬吋转染技术， 无法保持对目的 miRNA的长期稳定 沉默， 沉默效果远未达到最优。
[0005] Tough Decoy RNA (Tud RNA) 是一种新幵发出的 miRNA抑制手段， 其通过引 入双链 RNA对目标 miRNA进行吸附， 达到抑制 miRNA的目的。 由于弓 |入的 RNA 为双链并且带有茎环的二级结构， 因此其够抵抗胞内核酸酶的降解， 能长期、 稳定和高效地抑制 miRNA。
问题的解决方案
技术解决方案
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种结构简单、 成本低、 操作简便的双 miRNA 抑制表达载体。
[0007] 一种靶向双 miRNA的 Tud RNA, 其核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 1所示。
[0008] 一种双 miRNA抑制表达载体， 其包括本发明所述的序列 SEQ ID N0:1。
[0009] 本发明所述双 miRNA抑制表达载体在肿瘤治疗研究中的应用， 所述双 miRNA 抑制表达载体转化 Hela细胞后能同吋抑制 miR-148a和 miR-152的表达。
[0010] 一种本发明所述的双 miRNA抑制表达载体的构建方法， 包括如下步骤：
[0011] (1) 根据 miR-148a和 miR-152序列以及 Tud RNA技术原理， 设计权利要求 1所 述的靶向双 miRNA的 Tud RNA Seql， 所述 miR-148a和 miR-152序列的核苷酸序 列分别如序列表中 SEQ ID NO:2和 SEQ ID NO:3所示， 所述 Seql序列的核苷酸 序列如序列表 SEQ ID NO: 1所示， 并委托上海生工进行合成。
[0012] (2) 合成好的序列是两条互补的单链 DNA。 将两条单链 DNA溶解于 ddH 20中 ， 按照等摩尔比混合后， 95°C处理 5 min， 再将其置于室温使其自然冷却至室温
[0013] (3) 提取载体 pLK0.1-puro， 使用 Age I和 Eco RI酶双酶切处理 1
h后， 用 MinElute Reaction Cleanup Kit回收酶切后的载体， 再用 T4 DNA连接酶将 上一步得到的 TuD
RNA序列连接到载体 pLKO.l-puro中， 形成重组载体 pLKO-TuD-148a-152， 最后 将连接产物转化到感受态大肠杆菌 Stbl3中， 并涂布到含氨苄青霉素 LB培养基的 平板上， 37 °C培养 14 h。 挑取单菌落并进行测序。 取测序正确的菌扩大培养并用 无内毒素质粒小量提取试剂盒提取， 提取的质粒为本发明所需的同吋干扰 pLKO- TuD-148a-152的质粒。
发明的有益效果
有益效果
[0014] 本发明设计的同吋干扰 miR-148a和 miR-152 TuD RNA序列带有茎环结构， 不容 易降解， 双链的 Tud RNA相对目前常用的单链的 miRNA sponge, 其结合效率更 高， 并且同吋针对两个靶点， 能较好地实现两个 miRNA的干扰， 提高 miRNA功 能研究的效率。
对附图的简要说明
附图说明
[0015] 图 1 16HBE细胞与 TuD-148a-152细胞的 miRNA表达水平情况， 其中， a.
miR- 148a的表达情况， b. miR-152的表达情况。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0016] 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解
， 实施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而 不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0017] 本发明所使用的慢病毒质粒 pLKO.l-puro载体购自 Addgene; 本发明所使用的人 支气管上皮细胞 （16HBE细胞株） 购自美国 ATCC。
[0018] 实施例一靶向 miR- 148a和 miR- 152的 TuD RNA的设计与合成
[0019] 根据 TuD RNA设计序列和miRBase中提供的miR-148a和miR-152的序列信息， 设计出同吋针对 miR- 148a和 miR- 152的 TuD RNA寡核苷酸序列， 其序列如 SEQ ID
ΝΟ:1所示， 委托上海生工以基因合成的方式合成。
[0020] 实施例二序列的退火
[0021] 合成好的序列是两条互补的单链 DNA。 将两条单链 DNA溶解于 ddH 20中， 按 照等摩尔比混合后， 95°C处理 5 min， 再将其置于室温使其自然冷却至室温。
[0022] 实施例三重组 pLKO-Tud-148a-152慢病毒重组载体的构建
[0023] 提取载体 pLK0.1-puro， 使用 Age I和 Eco RI酶双酶切处理 16 h后， 用 MinElute Reaction Cleanup Kit回收酶切后的载体， 再用 T4 DNA
连接酶将上一步得到的 TuD
RNA序列连接到载体 pLKO.l-puro中， 形成重组载体 pLKO-Tud-148a-152， 最后 将连接产物转化到感受态大肠杆菌 Stbl3中， 并涂布到含氨苄青霉素 LB培养基的 平板上， 37 °C培养 14 h。 挑取单菌落并进行测序。 取测序正确的菌扩大培养并用 无内毒素质粒小量提取试剂盒提取， 提取的质粒为本发明所需的同吋干扰 pLKO- TuD-148a-152的质粒。
[0024] 实施例四 pLKO-TuD-148a-152的质粒 16HBE细胞
[0025] 接种 16HBE细胞于 6孔板中， 每孔 1000000个细胞， 18h后细胞密度约为 60% ， 用 Lipfectamine 2000将 pLKO-TuD-148a-152质粒转导至 16HBE细胞中， 继续培 养 48 h后， 更换含 1.0 g/ml嘌呤霉素的 DMEM培养基筛选培养 3 d， 筛选获得的 细胞株命名为 TuD-148a-152细胞株。
[0026] 实施例五荧光定量 PCR检测 miRNA的表达水平变化
[0027] 分别接种正常 16HBE细胞、 TuD- 148a- 152细胞至 6孔板， 培养细胞约 24 h后至融 合度 80%。 用 miRcute miRNA提取分离试剂盒提取这些细胞的 miRNA, 逆转录得 到相应的 cDNA。 取 2种细胞的 cDNA各 2
为模板， 荧光定量 PCR分别检测 miR-148a和 miR-152表达水平的变化， 实验重 复 3次， 每孔设置 3个平行样，以 snord
44作为内参。 结果如图 1所示， 可以看到与 TuD-148a-152细胞的 miR-148a的表达 水平比 16HBE细胞低 52%， 1^1 -152的表达水平比161¾£细胞低61<¾， 差异有统 计学意义 （/?<0.01) ， 说明 TuD-148a-152细胞株构建成功。
工业实用性
[0028] 本发明设计的同吋干扰 miR-148a和 miR-152 TuD RNA序列带有茎环结构， 不容 易降解， 双链的 Tud RNA相对目前常用的单链的 miRNA sponge, 其结合效率更 高， 并且同吋针对两个靶点， 能较好地实现两个 miRNA的干扰， 提高 miRNA功 能研究的效率。
Claims
[权利要求 1] 一种靶向双 miRNA的 Tud RNA, 其特征在于： 其核苷酸序列如序列 表 SEQ ID NO:l所示。
[权利要求 2] —种抑制双 miRNA表达的载体， 其特征在于： 其包括权利要求 1所述 的序列。
[权利要求 3] 权利要求 2所述双 miRNA抑制表达载体在肿瘤治疗研究中的应用， 所 述双 miRNA抑制表达载体同吋抑制人源 miR-148a和 miR-152的表达。
[权利要求 4] 一种权利要求 2所述的双 miRNA抑制表达载体的构建方法， 其特征在 于： 包括如下步骤：
(1) 根据 miR-148a和 miR-152序列以及 Tud RNA技术原理， 设计权利 要求 1所述的靶向双 miRNA的 Tud RNA Seql， 所述 miR-148a和 miR-152序列的核苷酸序列分别如序列表中 SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3所示， 所述 Seql序列的核苷酸序列如序列表 SEQ ID ΝΟ:1所示， 并委托上海生工进行合成。
(2) 合成好的序列是两条互补的单链 DNA。 将两条单链 DNA溶解于 ddH 20中， 按照等摩尔比混合后， 95°C处理 5 min， 再将其置于室温 使其自然冷却至室温。
(3) 提取载体 pLK0.1-puro， 使用 Age I和 Eco RI酶双酶切处理 1 h后
， 回收酶切后的载体， 再用 T4 DNA连接酶将上一步得到的 TuD RNA 序列连接到载体 pLKO.l-puro中， 形成重组载体 pLKO-TuD-148a-152 ， 最后将连接产物转化到感受态大肠杆菌 Stbl3中， 并涂布到含氨苄 青霉素 LB培养基的平板上， 37 °C培养 14 h。 挑取单菌落并进行测序 。 取测序正确的菌扩大培养并用无内毒素质粒小量提取试剂盒提取， 提取的质粒为本发明所需的同吋干扰 pLKO-TuD-148a-152的质粒。
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2017
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