CN104046635A - 特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种特异响应外界胁迫抗性的nfiS基因的用途及其使用方法。本发明基于发现了nfiS基因为可转录的有功能性的非编码RNA基因，以及该基因可作为功能元件转入其他微生物并提高受体菌株的氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性这一成果，提供了特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法，该方法构建的具有携带nfiS基因的重组工程菌株，在高浓度的氧胁迫和高浓度的盐胁迫下，相对于不含有nfiS基因的菌株相同条件下具有更高的生存率；nfiS基因在提高菌株氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性方面具有很大的应用前景。

Description

特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种特异响应外界胁迫抗性的nfiS基因的用途及其使用方法。

背景技术

非编码RNAs（non-coding RNAs, ncRNAs）是一类非常重要的调节子，此类调节子能够使细胞调节它们的生理特性而适应环境的改变。已有的研究表明ncRNAs在细菌的蔗糖代谢、细胞外膜应激反应、群体感应和细菌毒力等方面发挥了重要的调节作用，其调控模式已经成为细菌调控网络中的重要“分支”。

生物固氮是固氮微生物的一种特殊的生理功能，已知具固氮作用的微生物约近50个属，包括细菌、放线菌和蓝细菌（即蓝藻），它们在生活方式、固氮作用类型等发面都有着较大区别。由于固氮条件本身是一个对碳、氮和氧要求较为严格的胁迫环境，而固氮微生物中开展非编码RNA功能研究的报道不多，因此非编码RNA在固氮微生物环境适应性方面发挥着怎样的作用目前仍未知。

固氮施氏假单胞菌的非编码RNA nfiS序列（基因序列为SEQ ID NO:1）中，没有起始密码子和终止密码子，现有技术中没有发现其能转录成非编码RNA，也没有其用途方面的相关报道。

发明内容

本发明提供一种特异响应抗性的nfiS基因的用途及其使用方法。发明人在进行施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）基因组研究过程中，首次发现了nfiS基因为可转录的有功能性的非编码RNA基因，并发现该基因可用于提高菌株氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性，为获得具有高效固氮活性和胁迫抗性的工程菌及其改造提供新的研究方向和理论基础。

本发明中，所述nfiS基因即为参与固氮施氏假单胞菌胁迫应答反应的非编码RNA基因，其是经核苷酸序列为SEQ ID NO:1的DNA转录而成的非编码RNA基因。

一种特异响应逆境信号的nfiS基因的用途，所述nfiS基因用于提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性。

上述方案优选的是，所述nfiS基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO:1的DNA转录而成的非编码RNA基因。 

上述任一方案优选的是，所述菌株为固氮施氏假单胞菌或大肠杆菌及其衍生菌株。

一种利用nfiS基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，包括克隆完整的nfiS基因的DNA片段序列和构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株的步骤。

上述任一方案优选的是，所述nfiS基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO:1的DNA转录而成的非编码RNA基因。

上述任一方案优选的是，所述克隆完整的nfiS基因的DNA序列包括从施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）基因组中通过PCR扩增出完整的nfiS基因的DNA片段序列。

上述任一方案优选的是，所述构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株的步骤为：

（1）将克隆出的完整的nfiS基因的DNA片段序列进行酶切；

（2）将酶切后的nfiS基因的DNA片段序列插入到表达载体的多克隆位点处；

（3）将步骤（2）中的载体通过热激转化的方法转化到菌株中，构建重组表达菌株，即具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株。

上述任一方案优选的是，所述酶切是用BamHI和HindIII酶进行双酶切。

上述任一方案优选的是，所述表达载体是pLAFR3载体。

上述任一方案优选的是，所述菌株为固氮施氏假单胞菌或大肠杆菌及其衍生菌株。

上述任一方案优选的是，在步骤（2）中，还包括在表达载体的多克隆位点处插入验证基因。

上述任一方案优选的是，包含所述验证基因的表达载体为四环素抗性。

一种通过利用nfiS基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法构建的重组菌株。

本发明中未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规技术条件。

本发明所述的特异响应逆境信号的nfiS基因的发明途径为：

1、非编码RNA对特异信号的响应体外表达分析表明nfiS基因能够特异的响应氧胁迫信号。

固氮施氏假单胞菌A1501（P. stutzeri A1501）中nfiS基因对氧胁迫信号的响应,实验步骤如下：

(1) 将施氏假单胞菌A1501菌在LB 液体培养基中活化，30oC过夜培养；

(2) 次日4000 rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次；

(3)用生理盐水悬浮菌体，调OD₆₀₀ ≈1.0；

(4)分别将菌体在以下几个时相中培养：有氮好氧条件（CNO，K 培养基）、无氮微好氧条件（CN^-O^-，K培养基中不添加氮源，并且充氩气排空气三分钟，然后注入0.5%的氧气）、氧限制条件（CN^-O^-，K培养基中不添加氮源，并且充氩气排空气三分钟）、好氧条件（CN^-O，K 培养基不添加氮源），调OD₆₀₀ ≈0.5；

(5) 培养液30oC 震荡培养0.5 h 后，8000 rpm 离心5 min，收集菌体；

(6) 采用Promega大量提取RNA 试剂盒Z3741提取细菌总RNA，将使用量相同的样品RNA进行单链DNA(cDNA)反转。

(7) 通过qRT-PCR方法对nfiS基因在不同胁迫条件下的表达水平进行了分析，结果如图1所示，图1中：纵坐标表示nfiS基因在mRNA水平上的相对表达量，横坐标代表nfiS基因。其中黑色柱状图代表氧充足条件下nfiS基因的表达量；网格柱状图代表氧限制条件下nfiS基因的表达量；灰色柱状图代表有氮有氧条件下nfiS基因的表达量；斜格柱状图代表无氮微好氧条件下nfiS基因的表达量.

本实验结果分析：固氮施氏假单胞菌A1501的全基因组中含有nfiS基因的DNA序列，从图1中可以看出，氧限制条件下（CN^-O^-）nfiS基因的转录水平显著提高，与好氧条件（CN^-O）相比提高了338倍；此外，与有氮好氧条件（CNO）相比，在无氮微好氧条件下（CN^-O^-）nfiS的转录水平也显著提高了近8倍，表明nfiS基因能够特异的感应氧胁迫信号。

2、nfiS生物信息学分析Rfam数据库和GenBank数据库中的BLASTN比对分析表明nfiS（DNA序列如SEQ ID NO:1所示）基因属于一类具有种特异性的功能仍未确定的RNA家族（如图2所示）。

nfiS基因生物信息学分析：

在NCBI数据库中下载了nfiS基因的编码序列（DNA序列如SEQ ID NO:1所示），将nfiS的核苷酸序列在Rfam数据库中进行了比对，发现nfiS的序列与数据库中的RNA家族中的任何成员不存在同源性，这表明nfiS可能属于一类新的功能仍未确定的RNA家族；而GenBank数据库中的BLASTN比对则进一步显示nfiS的同源序列仅仅在四株施氏假单胞菌（P.stutzeriDSM4166,P.stutzeri ATCC17588,P.stutzeri CCUG29243和P.stutzeri RCH2）中存在（如图2），这说明nfiS是一类功能未知的具有种特异性的非编码RNA。

3、nfiS突变株的构建分别将包含该非编码RNA上下游同源基因序列的自杀载体转至P.stutzeri A1501中，利用同源重组的原理获得nfiS的缺失突变株A15ΔnfiS。

4、nfiS表达载体的构建:首先PCR扩增获得完整的nfiS DNA片段，然后将克隆片段进行BamHI和HindIII双酶切，插入到广宿主表达载体pLAFR3的多克隆位点处，最后将nfiS表达载体转入到大肠杆菌Trans10中获得具有四环素抗性的重组表达菌株E. coli Trans10(nfiS)。

5、氧化胁迫抗性的影响H₂O₂冲击实验显示nfiS基因的缺失能够降低A1501菌在氧化胁迫条件下的生存率，与野生型相比菌株生存率降低了一个数量级，而qRT-PCR结果进一步证明nfiS的缺失能够降低氧化胁迫相关基因的转录水平，推测nfiS可能通过对氧信号的响应参与到了固氮施氏假单胞菌A1501氧化胁迫抗性的调控过程。此外，nfiS基因的重组表达能够显著提高大肠杆菌Trans10的氧化胁迫抗性，说明该基因在提高菌株氧化胁迫抗性方面具有很大的应用前景。

6、盐胁迫抗性的影响盐冲击实验表明nfiS基因的缺失也能够降低A1501菌株在盐胁迫条件下的生存率,与野生型相比生存率降低了一个数量级，表明nfiS除了影响固氮施氏假单胞菌A1501氧化胁迫抗性以外，也可能参与到了菌株渗透调节机制的反应过程。

发明人通过上述途径发现了nfiS基因为可转录的有功能性的非编码RNA基因，该基因可作为功能元件转入其他微生物并提高受体菌株的氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性，为获得具有高效固氮活性和胁迫抗性的工程菌及其改造提供新的研究方向和理论基础，同时填补了现有技术中没有发现nfiS基因能转录成非编码RNA的空白。本发明中构建的具有nfiS基因的重组菌株，在高浓度的氧胁迫下和/或高浓度的盐胁迫下，生存率较高，相同条件下，不含nfiS基因的菌株存活率低了很多；nfiS基因在提高菌株氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性方面具有很大的应用前景。

附图说明

图1为按照本发明特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法中nfiS基因对特异信号响应的分析。

图2为按照本发明特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法中固氮施氏假单胞菌A1501中nfiS基因的比对分析。

图3为按照本发明特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法一优选实施例中施氏假单胞菌A1501和nfiS缺失突变株A15ΔnfiS对氧化胁迫敏感性的比较。

图4为按照本发明特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法一优选实施例中nfiS基因缺失对施氏假单胞菌A1501氧化胁迫相关基因转录水平的影响。

图5为按照本发明特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法一优选实施例中大肠杆菌Trans10和nfiS重组表达菌株E. coliTrans10(nfiS)氧化胁迫敏感性的比较。

图6为按照本发明特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法一优选实施例中施氏假单胞菌A1501(P. stutzeri A1501)和nfiS缺失突变株A15ΔnfiS在高浓度盐冲击条件下存活率的比较。

具体实施方式

为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例对本发明做更为详细地阐述；实施例仅用于举例说明本发明，而不用于限制本发明的范围。本发明属于基因工程技术领域，具体操作过程中，在发明的基础上，本领域的技术人员可以根据实际需要做一些非实质性地修改，这些修改都应属于本发明保护的范围。

实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一、固氮施氏假单胞菌A1501（P. stutzeri A1501）中nfiS基因缺失突变株的构建：

首先利用融合PCR 技术将目的基因的上游片段、壮观霉素抗性盒基因以及目的基因的下游片段融合成一大小约为2.3 kb 的长片段，然后将克隆片段进行BamHI和HindIII双酶切，连接到自杀载体pK18mobSacB 上。将构建好的自杀重组质粒通过三亲结合的方法导入到野生型A1501菌中，通过与染色体上基因的同源重组将自杀质粒整合到了染色体上，利用抗性筛选和PCR验证得到单交换菌株，然后根据sacB基因在10%蔗糖选择压下致死的特性，将经过PCR验证的单交换克隆按照10^-3、10^-4和10^-5的稀释梯度分别涂布在含有10%蔗糖的壮观霉素抗性的LB平板，进行双交换的筛选，经PCR验证得到目的基因nfiS的缺失突变菌株A15ΔnfiS。

二、利用nfiS基因提高大肠杆菌Trans10菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，包括克隆完整的nfiS基因的DNA片段序列和构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的突变菌株。

本实施例中，所述nfiS基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO:1的DNA转录而成的非编码RNA基因。

本实施例中，所述克隆完整的nfiS基因的DNA序列包括从施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）基因组中通过PCR扩增出完整的nfiS基因的DNA片段序列，PCR扩增特异性引物序列为： ncRNA01CBF -SEQ ID NO:2和ncRNA01CHR -SEQ ID NO:3。

本实施例中，所述构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的大肠杆菌Trans10重组菌株的步骤为：

（1）将克隆出的完整的nfiS基因的DNA片段序列进行酶切；

（2）将酶切后的nfiS基因的DNA片段序列插入到表达载体的多克隆位点处；

（3）将步骤（2）中的载体通过热激转化的方法转化到菌株中，构建重组表达菌株，即具有较高氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的大肠杆菌Trans10重组菌株。

本实施例中，所述酶切是用BamHI和HindIII酶进行双酶切，所述表达载体是pLAFR3载体。

本实施例中，在步骤（2）中，还包括在表达载体的多克隆位点处插入验证基因。含有所述验证基因的表达载体为四环素抗性。

三、nfiS基因对施氏假单胞菌A1501和大肠杆菌Trans10菌株胁迫抗性的影响：

所用的菌液：野生型施氏假单胞菌A1501、本实施例中制备的nfiS缺失突变菌株A15ΔnfiS、本实施例中制备的大肠杆菌重组菌株E. coli Trans10（nfiS）、野生型大肠杆菌E. coli Trans10。

在固体平板上挑取单菌落在液体LB培养基中分别过夜培养，次日转接到LB 培养基中使OD₆₀₀约为0.1，30℃培养2-3 h，至OD₆₀₀约0.6 左右。首先各取1 ml菌体，稀释到10^-4为空白对照，然后再各取1 ml 菌体加入终浓度为20 mM H₂O₂冲击10 min，或加入终浓度1.5 M NaCl冲击60 min，最后将每个处理稀释至10^-4，取8 μl点到LB 固体平板上，30oC或37oC过夜培养。

本发明首先收集20 mM H₂O₂冲击10 min的A1501、A15△nfiS菌株，然后采用Promega大量提取RNA试剂盒Z3741提取细菌总RNA，将使用量相同的样品RNA进行单链DNA(cDNA)反转，最后利用qRT-PCR技术对菌株中氧化胁迫相关基因的转录水平进行分析。

氧化胁迫抗性的影响H₂O₂冲击实验显示：

1、nfiS基因的缺失能够降低A1501菌在氧化胁迫条件下的生存率，与野生型相比菌株生存率降低了一个数量级，如图3所示。

2、qRT-PCR结果进一步证明nfiS的缺失能够降低A1501菌中氧化胁迫相关基因的转录水平，如图4所示。表明nfiS可能通过对氧信号的响应参与到了固氮施氏假单胞菌A1501氧化胁迫抗性的调控过程。

3、nfiS基因的重组表达能够显著提高大肠杆菌Trans10的氧化胁迫抗性，如图5所示。表明该基因在提高菌株氧化胁迫抗性方面具有一定的应用前景。

4、施氏假单胞菌A1501(P. stutzeriA1501)和nfiS缺失突变株A15ΔnfiS在高浓度盐冲击条件下存活率的比较，如图6所示。从图中可以得出，nfiS缺失突变株A15ΔnfiS在高浓度盐冲击条件下存活率低于施氏假单胞菌A1501(P. stutzeriA1501)的存活率，说明nfiS基因的缺失也能够降低A1501菌株在盐胁迫条件下的生存率,与野生型相比生存率降低了一个数量级，这表明nfiS除了影响固氮施氏假单胞菌A1501氧化胁迫抗性以外，也参与到了菌株渗透调节机制的反应过程，可见，该基因在提高菌株盐胁迫抗性方面具有一定的应用前景。

实施例2

一种特异响应逆境信号的nfiS基因的用途，所述nfiS基因用于提高固氮施氏假单胞菌A1501菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性；所述nfiS基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO:1的DNA转录而成的非编码RNA基因。 

一种利用nfiS基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，包括克隆完整的nfiS基因的DNA片段序列和构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株的步骤；所述nfiS基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO:1的DNA转录而成的非编码RNA基因。

本实施例中，所述克隆完整的nfiS基因的DNA序列包括从施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）基因组中通过PCR扩增出完整的nfiS基因的DNA片段序列。

本实施例中，所述构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株的步骤为：

（1）将克隆出的完整的nfiS基因的DNA片段序列进行酶切；

（2）将酶切后的nfiS基因的DNA片段序列插入到表达载体的多克隆位点处；

（3）将步骤（2）中的载体通过热激转化的方法转化到野生型大肠杆菌Trans10中，构建重组表达菌株，即具有较高氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株。

本实施例中，所述酶切是用BamHI和HindIII酶进行双酶切；所述表达载体是pLAFR3载体。

本实施例中，在步骤（2）中，还包括在表达载体的多克隆位点处插入验证基因；包含所述验证基因的表达载体为四环素抗性。

本实施例中，野生型固氮施氏假单胞菌A1501菌株中具有nfiS基因，其本身具有较高氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性，通过本发明的利用nfiS基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，制备的重组菌株，相比于野生型大肠杆菌Trans10，其耐氧化胁迫和/或盐胁迫抗性得到了很大的提高。

本发明中发明人发现了nfiS基因为可转录的有功能性的非编码RNA基因，且该基因可作为功能元件转入其他微生物并提高受体菌株的氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性，为获得具有高效固氮活性和胁迫抗性的工程菌及其改造提供新的研究方向和理论基础，填补了现有技术中没有发现nfiS基因能转录成非编码RNA的空白。本发明中构建的具有nfiS基因的重组菌株，在高浓度的氧胁迫下和高浓度的盐胁迫下，生存率较高，相同条件下，不含nfiS基因的菌株存活率低了很多；nfiS基因在提高菌株氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性方面具有很大的应用前景。

              SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国农业科学院生物技术研究所 ;东莞市保得生物工程有限公司

 

<120>  特异响应逆境信号的nfiS基因的用途及其使用方法

 

<130>  2014

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  254

<212>  DNA

<213>  施氏假单胞菌

 

<400>  1

atcgccgatg acacgccgcc gcctccccgc ctggctcgcc agcctggcac tgctgatcca       60

 

tctgctgagc atgccgctgt ctggcctgtt gccggcggat gccaagcggc tgctcggctg      120

 

gagtgggcat tgcccgctga tgcaggcgca ggtgcagcag gcgcatgcgc tgcacccgcc      180

 

ggcagtccat ggcgagcatg attcgggcac ccatggcgcg cacggcggga tgccgccttg      240

 

ctgctgctgt gccg                                                        254

 

 

<210>  2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

aaaggatcca tccagttgag caag                                              24

 

 

<210>  3

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

tttaagcttg cccgatgaag tagttc                                            26

Claims (10)

1.一种特异响应逆境信号的nfiS基因的用途，所述nfiS基因用于提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性。

2.如权利要求1所述的特异响应逆境信号的nfiS基因的用途，其特征在于，所述nfiS基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO:1的DNA转录而成的非编码RNA基因。

3.如权利要求1所述的特异响应逆境信号的nfiS基因的用途，其特征在于，所述菌株为固氮施氏假单胞菌或大肠杆菌及其衍生菌株。

4.一种利用nfiS基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，包括克隆完整的nfiS基因的DNA片段序列和构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株的步骤。

5.如权利要求4所述的利用nfiS基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，其特征在于，所述nfiS基因是经核苷酸序列为SEQ ID NO:1的DNA转录而成的非编码RNA基因。

6.如权利要求4所述的利用nfiS基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，其特征在于，所述克隆完整的nfiS基因的DNA序列包括从施氏假单胞菌基因组中通过PCR扩增出完整的nfiS基因的DNA片段序列。

7.如权利要求4所述的利用nfiS基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，其特征在于，所述构建具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株的步骤为：

（1）将克隆出的完整的nfiS基因的DNA片段序列进行酶切；

（2）将酶切后的nfiS基因的DNA片段序列插入到表达载体的多克隆位点处；

（3）将步骤（2）中的载体通过热激转化的方法转化到菌株中，构建重组表达菌株，即具有氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的重组菌株。

8.如权利要求7所述的利用nfiS基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，其特征在于，所述酶切是用BamHI和HindIII内切酶进行双酶切。

9.如权利要求7所述的利用nfiS基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，其特征在于，所述表达载体是pLAFR3载体。

10.如权利要求7所述的利用nfiS基因提高菌株氧化胁迫抗性和/或盐胁迫抗性的方法，其特征在于，所述菌株为固氮施氏假单胞菌或大肠杆菌及其衍生菌株。