CN102229928B

CN102229928B - 人rbbp6基因的小干扰rna及其应用

Info

Publication number: CN102229928B
Application number: CN201110121411.2A
Authority: CN
Inventors: 朱向莹; 曹跃琼
Original assignee: SHANGHAI GENECHEM CO Ltd
Current assignee: Shanghai Jikai Gene Medical Technology Co ltd
Priority date: 2011-05-11
Filing date: 2011-05-11
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2031-05-11
Also published as: CN102229928A

Abstract

本发明涉及一组针对人RBBP6基因的siRNA、其核酸构建体、表达该siRNA的慢病毒载体及慢病毒、以及它们的应用。选取人RBBP6基因编码区的序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30(优选15-27，更优选19-23)个碱基序列设计siRNA。通过基因克隆，获得表达上述siRNA的核酸构建体及慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA能够序列特异性降低人RBBP6基因的表达并能够有效抑制肿瘤细胞的增殖。

Description

人RBBP6基因的小干扰RNA及其应用

技术领域

本发明涉及核酸技术领域，具体地说涉及RNA干扰技术，更具体地涉及具有抑制人RBBP6基因表达的小分子干扰核酸及其应用。

背景技术

RNA干扰是指由双链RNA诱发的基因沉默现象，主要通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。研究表明，长度为21-23nt的小RNA分子(small interfering RNA，siRNA)是引起RNA干扰的直接原因(Tuschl T，Zamore PD，Sharp PA，Bartel DP.RNAi：double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotideintervals.Cell 2000，101：25-33.)。RNA干扰在抑制基因表达方面具有高效性、简单性和特异性，目前在基因功能研究和疾病治疗中发挥了重要作用。近几年来，RNA干扰已经在肿瘤治疗方面取得了一些成果(Uprichard，Susan L.The therapeutic potential of RNAinterference.FEBS Letters 2005，579：5996-6007)。

RBBP6，全称为Retinoblastoma binding protein 6，定位于人类染色体16p12.2。RBBP6基因编码的蛋白定位于细胞核内。由于氨基端含有保守的锌指结构域，RBBP6蛋白具有泛素酯酶活性，可促进Y-box结合蛋白(细胞周期正向调控因子)的降解(Scott RE，GiannakourosT，Gao S，Peidis P.Functional potential of P2P-R：a role in the cell cycle and celldifferentiation related to its interactions with proteins that bind to matrix associated regionsof DNA？J Cell Biochem 2003；90：6-12；Chibi M，Meyer M，Skepu A，G Rees DJ，Moolman-Smook JC，Pugh DJ.RBBP6interacts with multifunctional protein YB-1throughits RING finger domain，leading to ubiquitination and proteosomal degradation of YB-1.JMol Biol 2008；384：908-16)。RBBP6可以与肿瘤抑制因子p53和/或Rb，以及核骨架附着区结合因子形成复合体，通过细胞周期和细胞分化依赖的形式影响基因转录、基因表达和对细胞核的调节(Scott RE，Giannakouros T，Gao S，Peidis P.Functional potential of P2P-R：arole in the cell cycle and cell differentiation related to its interactions with proteins that bindto matrix associated regions of DNA？J Cell Biochem 2003；90：6-12.；Li L，Deng B，Xing G，Teng Y，Tian C，Cheng X，Yin X，Yang J，Gao X，Zhu Y，Sun Q，Zhang L，Yang X，He F.PACT is a negative regulator of p53 and essential for cell growth and embryonicdevelopment.Proc Natl Acad Sci U S A 2007；104：7951-6；Scott RE，White-Grindley E，Ruley HE，Chesler EJ，Williams RW.P2P-R expression is genetically coregulated withcomponents of the translation machinery and with PUM2，a translational repressor thatassociates with the P2P-R mRNA.J Cell Physiol 2005；204：99-105)。RBBP6蛋白在食管癌组织中高水平表达(Yoshitake Y，Nakatsura T，Monji M，Senju S，Matsuyoshi H，TsukamotoH，Hosaka S，Komori H，Fukuma D，Ikuta Y，Katagiri T，Furukawa Y，Ito H，Shinohara M，Nakamura Y，Nishimura Y.Proliferation potential-related protein，an ideal esophagealcancer antigen for immunotherapy，identified using complementary DNA microarrayanalysis.Clin Cancer Res 2004；10：6437-48)。过表达的RBBP6蛋白可诱导骨肉瘤Saos2细胞的细胞周期阻滞于有丝分裂的前中期，诱导细胞凋亡，并能增强乳腺癌MCF-7细胞对抗肿瘤药物喜树碱的化疗敏感性(Scott RE，Giannakouros T，Gao S，Peidis P.Functionalpotential of P2P-R：a role in the cell cycle and cell differentiation related to its interactionswith proteins that bind to matrix associated regions of DNA？J Cell Biochem 2003；90：6-12；Scott RE，White-Grindley E，Ruley HE，Chesler EJ，Williams RW.P2P-R expression isgenetically coregulated with components of the translation machinery and with PUM2，atranslational repressor that associates with the P2P-R mRNA.J Cell Physiol2005；204：99-105；Gao S，Scott RE.P2P-R protein overexpression restricts mitoticprogression at prometaphase and promotes mitotic apoptosis.J Cell Physiol 2002；193：199-207；Gao S，Scott RE.Stable overexpression of specific segments of the P2P-Rprotein in human MCF-7cells promotes camptothecin-induced apoptosis.J Cell Physiol2003；197：445-52；Scott RE，Gao S.P2P-R deficiency modifies nocodazoleinduced mitoticarrest and UV-induced apoptosis.Anticancer Res 2002，22：3837-42)。基于目前已有的关于RBBP6基因在食管癌、骨肉瘤和乳腺癌的报道，可以推测RBBP6作为一个癌基因在肿瘤发生和进展过程中具有重要的功能，并有望成为抗肿瘤治疗的有效靶点。

发明内容

本发明的第一方面，提供了人RBBP6基因在肿瘤治疗中的用途，即所述人RBBP6基因促进肿瘤细胞增殖，可作为针对肿瘤细胞的药物治疗靶标。所述药物可以为小分子化学药，抗体药，也可以为核酸类药物。优选的，所述肿瘤细胞的RBBP6基因可作为RNA干扰药物作用靶标。

本发明的第二方面，提供了分离的人RBBP6基因小分子干扰核糖核酸(siRNA)靶序列，其中所述靶序列为SEQ ID NO 1-172中任意一条序列。

本发明还提供了包含SEQ ID NO 1-172中任意一条序列的核酸构建体和慢病毒。优选的，所述含有RBBP6基因siRNA序列的核酸构建体(也称为RNA干扰载体)为pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA(表达序列表中SEQ ID NO.4)。

本发明还提供了小分子干扰核糖核酸(siRNA)，其包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段包含SEQ ID NO 1-172中任意一条序列编码的RNA序列，其中正义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA，且能抑制人RBBP6基因的表达。所述正义RNA片段和反义RNA片段可以存在于两条不同的RNA链上，或者存在于一条RNA链上。优选的，所述核糖核酸为发夹型单链RNA分子(shRNA)，其中正义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。上述任一项所述的核糖核酸，其中正义RNA片段和反义RNA片段的长度为15-27个核苷酸，优选为19-23个核苷酸，具体为19、20或者21个核苷酸。

本发明还提供了上述任一项在制备或筛选抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤选自结直肠癌或肝癌。

综上所述，本发明设计了针对人RBBP6基因的172个RNA干扰靶点序列，构建相应的RBBP6shRNA表达载体，其中编码序列SEQ ID NO 4的RNA干扰载体pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA能够显著下调RBBP6基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNA干扰载体pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA能够靶向地将针对RBBP6基因的RNA干扰序列高效导入人结直肠肿瘤细胞RKO和人肝脏肿瘤细胞SMMC-7721，降低RBBP6基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖和生长速度，是结直肠肿瘤和肝脏肿瘤的潜在临床非手术治疗方式。本发明的有益效果

本发明提供的小干扰核酸或者包含小干扰核酸序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人RBBP6基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中RBBP6基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，在肿瘤治疗中具有重要意义。

附图说明

图1表示pGCSIL-GFP质粒DNA图谱。

图2表示pGC-FU质粒DNA图谱。

图3表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人结直肠肿瘤细胞RKO 5天后，RBBP6mRNA的表达水平显著降低。

图4表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人肝脏肿瘤细胞SMMC-77215天后，RBBP6mRNA的表达水平显著降低。

图5表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人结直肠肿瘤细胞RKO 5天后，引起细胞增殖抑制。

图6表示Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染人肝脏肿瘤细胞SMMC-77215天后，引起细胞增殖抑制。

具体实施方式

发明人发现，采用RNA干扰方法下调人RBBP6基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，表明RBBP6基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对RBBP6基因的siRNA，筛选出了可有效抑制RBBP6的表达进而抑制人结直肠肿瘤细胞RKO和人肝脏肿瘤细胞SMMC-7721进程的siRNA，在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一系列干扰人RBBP6基因的小干扰RNA(siRNA)序列，构建了可特异性沉默RBBP6基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人RBBP6基因设计的小干扰RNA及RNA干扰慢病毒，稳定并特异地下调RBBP6基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明RBBP6基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNA干扰方式沉默RBBP6基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。

本发明的设计思路为：

本发明通过如下方法来筛选获得一种人RBBP6基因RNA干扰慢病毒：从Genbank中调取人RBBP6基因序列；预测siRNA位点；合成针对RBBP6基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接；构建表达RBBP6基因siRNA序列的RNA干扰质粒及表达RBBP6基因的过表达质粒；将RNA干扰质粒与RBBP6基因过表达质粒共转染人胚肾细胞293T；Western blot检测这些RNA干扰质粒对RBBP6基因的蛋白表达水平的抑制作用，并根据抑制作用结果筛选有效干扰质粒；将筛选得到的RNA干扰质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(Packing Mix，Sigma-aldrich公司)共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默RBBP6基因的慢病毒。

基于上述方法，本发明提供了172个干扰RBBP6基因的有效靶点(具体如SEQ ID NO1-172所示)，构建了特异干扰人RBBP6基因的慢病毒。

同时本发明还公开一种人RBBP6基因RNA干扰慢病毒(Lv-RBBP6-siRNA)及其制备与应用。

本研究发现，利用慢病毒介导的RNA干扰方法，在降低RBBP6基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖和生长。本研究表明，RBBP6基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，RBBP6基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的RBBP6基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1：针对人RBBP6基因RNA干扰慢病毒的制备

1.筛选针对人RBBP6基因的有效的siRNA靶点

从Genbank调取RBBP6(NM_006910.4，NM_018703.3，NM_032626.5)基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对RBBP6基因的有效的siRNA靶点。在RBBP6基因的编码序列(CDS)区域内(针对NM_006910.4的1041位至6419位碱基)，每隔一个碱基起始获得21个碱基的序列，表1列出了其中172条针对RBBP6基因的有效siRNA靶点序列。

表1靶向于人RBBP6基因的siRNA靶点序列

编号	靶序列	起始位点
			1	GTCCTGTGTGCATTATAAATT	1043
2	CCTCTAAACTCAACTATGATA	1066
			3	CTGCGACTTAAAGAAGCAGAT	1118
4	CGACTTAAAGAAGCAGATTAT	1121
			5	CACCAATGCGCAGACGAAAGA	1184
6	TGCGCAGACGAAAGAAGAATA	1190
			7	CAGACGAAAGAAGAATATACT	1194
8	GACGAAAGAAGAATATACTGA	1196
			9	GCTCTGATTCCTAAGAATTCT	1224
10	CTGATTCCTAAGAATTCTTCT	1227
			11	GAATTCCTATTGGAGGTGTTA	1261
12	CCTATTGGAGGTGTTAAATCT	1266
			13	GTGTTAAATCTACAAGCAAGA	1276
14	CTACAAGCAAGACATATGTTA	1285
			15	CTGAACCAGCGATGGCAACTA	1315
16	GATGACTCTTCCGCGTCTATT	1347
			17	GACTCTTCCGCGTCTATTTCT	1350
18	CTCTTCCGCGTCTATTTCTCT	1352
			19	CCAGCTTACAAAGACTGCCAA	1376
20	CAGCTTACAAAGACTGCCAAT	1377
			21	GCTTACAAAGACTGCCAATCT	1379
22	CCACCTCCATCTTACACGTGT	1503
			23	CACCTCCATCTTACACGTGTT	1504
24	CACGTGTTTCCGTTGTGGTAA	1517
			25	GAATCTGGTCCTAGGATTAAA	1587
26	CAGAAGTTTCATGATGGAAGT	1625
			27	GGAAGTGAAAGATCCTAATAT	1640
28	GATGCAGAAGCATATGCAATT	1710
			29	CCTCAGAAGAAGATGATCCTA	1777
30	CAGATGAATTGTTGTGTCTCA	1801
			31	GGATATTATGACTGATGCTGT	1829
32	GGAAACAGTTACTGTGATGAA	1866
			33	GAAACAGTTACTGTGATGAAT	1867

34	CTGGAATCAGATGAGCACACA	1905
			35	GTTTCTCCTGATGCTTTAATT	1950
36	CCTGATGCTTTAATTGCCAAT	1956
			37	CAGGCTGTAAATAACTTCAAA	1989
38	CTCCGAGACCACTGATTCAGA	2074
			39	GAGACCACTGATTCAGAGGAA	2078
40	CTGATTCAGAGGAACCTACAA	2085
			41	GAGGAACCTACAACCTCTGAT	2093
42	GGAACCTACAACCTCTGATGA	2095
			43	GAGATCTCCGATATCAAGACA	2114
44	CAAGACAACAAGATCCTCTTA	2128
			45	GACAACAAGATCCTCTTATGA	2131
46	CCAGCTCCGTCTATATCTTCA	2178
			47	CAGCTCCGTCTATATCTTCAT	2179
48	GCTCCGTCTATATCTTCATTA	2181
			49	CTCCGTCTATATCTTCATTAA	2182
50	CCTGTGTCTGGAAATCCGTCT	2229
			51	CTGTGTCTGGAAATCCGTCTT	2230
52	GTGTCTGGAAATCCGTCTTCT	2232
			53	CTCCAGCTCCTGTACCTGATA	2254
54	CCAGCTCCTGTACCTGATATA	2256
			55	GCTCCTGTACCTGATATAACT	2259
56	CCTGATATAACTGCAACAGTA	2268
			57	GAACCTCCTCAATTGCAATTA	2386
58	GGTTACCAGGTGCCTGTTCTT	2427
			59	CCATCTTTGCTTGGACAGTCA	2454
60	CTTTGCTTGGACAGTCATTAT	2458
			61	GTCATTATTGCATGGACAGTT	2471
62	CACAACTGGTCCAGTAAGAAT	2498
			63	GGTCCAGTAAGAATAAATACT	2505
64	GGTTTCTCCACCACAACAAAT	2582
			65	GTTTCTCCACCACAACAAATT	2583
66	GAGAGGAGCTGCTACAGAAGT	2613
			67	GAGGAGCTGCTACAGAAGTAT	2615
68	GGAGCTGCTACAGAAGTATAA	2617
			69	GAGCTGCTACAGAAGTATAAA	2618
70	CGACACCACAGCGAAAGATCA	2646
			71	CGAAAGATCACAGAGGACTCA	2657
72	CACTACCAGCAACTCCAGTCT	2686
			73	CCAGCAACTCCAGTCTTTGTA	2691
74	GCTCCTGCCAATTTATCAACA	2859
			75	CTGCCAATTTATCAACACCTT	2863
76	GACAGCTCATTCAAATACCAT	2903
			77	CAAGCTAGATGAGTTTACAAA	3008
78	GCTAGATGAGTTTACAAATGA	3011

79	CCTATAGTGGTTCTTCGTATT	3106
			80	GTGGTTCTTCGTATTCAAGAA	3112
81	GGTTCTTCGTATTCAAGAAGT	3114
			82	GGTTCAACACGTTCACGCTCT	3162
83	CAACACGTTCACGCTCTTATT	3166
			84	CACGCTCTTATTCTCGATCAT	3175
85	GCTCTTATTCTCGATCATTCA	3178
			86	CGATCATTCAGCCGCTCACAT	3189
87	GATCATTCAGCCGCTCACATT	3190
			88	GCTCACATTCTCGTTCCTATT	3202
89	CCTATTCACGGTCACCTCCAT	3217
			90	CTATTCACGGTCACCTCCATA	3218
91	CAGAGGCAAGAGCCGCAATTA	3251
			92	CCTTACAGACGCTATCATTCA	3324
93	GACGCTATCATTCACGATCAA	3331
			94	GACAGTCTCCTAATAAACGTA	3373
95	CAGTCTCCTAATAAACGTAAT	3375
			96	CACCATATGACATGAAAGCAT	3451
97	CCATATGACATGAAAGCATAT	3453
			98	GAGAAGTGTTGACTTTAGAGA	3479
99	CCTCAGCAAATAGAGAGAACT	3598
			100	CTCAGCAAATAGAGAGAACTT	3599
101	CCACTTAACATCAGGAATTCT	3639
			102	GCAAAGTCATAGAAGTCGAAA	3698
103	GTCGAAACATAGGTAGCAACT	3712
			104	CGAAACATAGGTAGCAACTAT	3714
105	GGTCACAATCAGAAGGATAAT	3759
			106	GTCACAATCAGAAGGATAATA	3760
107	CACAATCAGAAGGATAATACA	3762
			108	GAGACTTCTAGGAAATCAAGA	3903
109	GACTTCTAGGAAATCAAGAGA	3905
			110	CCAAACGGAAGAATGATGGAT	4096
111	CTCCTCGATCTGAACCTCCAA	4195
			112	CTCGATCTGAACCTCCAATTA	4198
113	CGATCTGAACCTCCAATTAAA	4200
			114	CCAAAGAGGAGACTCCGAAGA	4225
115	GGAGACTCCGAAGACTGACAA	4232
			116	GAGACTCCGAAGACTGACAAT	4233
117	CTCCGAAGACTGACAATACTA	4237
			118	CGAAGACTGACAATACTAAAT	4240
119	GTGAAGAAGGACTATTCCAAA	4368
			120	GACTATTCCAAAGATGTCAAA	4377
121	CCAAAGATGTCAAATCAGAAA	4384
			122	CTCGAAACTAGAAGTGACTGA	4541
123	GGAGTCAACATCTAGCAAAGT	4745

124	GTCAACATCTAGCAAAGTTAA	4748
			125	CAAAGGAAAGGTCAGACGAAA	4781
126	GGAACTGAAGGATCCAGCTCA	4809
			127	CCTGTGCGGAAATCTGAAGAA	4872
128	CTGTGCGGAAATCTGAAGAAA	4873
			129	CAGATACAAAGCGAACTGTGA	4897
130	GATACAAAGCGAACTGTGATT	4899
			131	CTCAATCCAAATGGGATAAAG	4990
132	GTTAAATCCACACAGCCTATA	5037
			133	CACACAGCCTATATCAAGTGT	5045
134	GAAAGTGAGCCATCCGAGAAA	5136
			135	CCAAGGACGTGAGCCATGAAA	5170
136	CAAGGACGTGAGCCATGAAAT	5171
			137	GTGAGCCATGAAATCATACAA	5178
138	GAGCCATGAAATCATACAACA	5180
			139	CGAGATTATTCAGTGTTGGAA	5256
140	CTCAGCCAGAGAAAGAGAGTA	5308
			141	CAGCCAGAGAAAGAGAGTAAT	5310
142	CGTCTGAATGAACAAGGAAAT	5337
			143	GAGGCTAGAACGTCAGATAAA	5385
144	GCTAGAACGTCAGATAAACAT	5388
			145	GAACGTCAGATAAACATGATT	5392
146	CCACTCGTGCTTCCTCAAATA	5413
			147	CACTCGTGCTTCCTCAAATAA	5414
148	GTTCCAAACGTAGAGATGAAA	5491
			149	GACTCTCCTTCTCGGAATAAA	5535
150	CCTCATGATCACAAAGCCACT	5664
			151	CTCATGATCACAAAGCCACTT	5665
152	CATGATCACAAAGCCACTTAT	5667
			153	CACAAAGCCACTTATGATACT	5673
154	CAAAGCCACTTATGATACTAA	5675
			155	GGATCGTGAGAAGCATGTATT	5741
156	GATCGTGAGAAGCATGTATTA	5742
			157	CGTGAGAAGCATGTATTAGAA	5745
158	GCATGTATTAGAAGCAAGGAA	5753
			159	CCACCAGAGACACAGGTTGAA	5817
160	CACCAGAGACACAGGTTGAAA	5818
			161	GCAAATTGACAAGAGTACTGT	5855
162	CAAGAGTACTGTCAAGCCTAA	5864
			163	CCTCTAGACTTTCCTCTGACT	5902
164	CTCTAGACTTTCCTCTGACTT	5903
			165	CTAGACTTTCCTCTGACTTAA	5905
166	GACTTTCCTCTGACTTAACTA	5908
			167	CCTCTGACTTAACTAGAGAAA	5914
168	GACTTAACTAGAGAAACTGAT	5919

169	CAGACTATAATGAAAGTGACA	5956
			170	GACTATAATGAAAGTGACAGT	5958
171	CAGAAAGTCAGGACAGCAAGA	6202
			172	GCACTGAAGTGGAATTGGAAA	6295

针对siRNA靶点(以SEQ ID NO 4为例)合成两端含Hpa I和Xho I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表2)；以Hpa I和Xho I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

表2两端含Hpa I和Xho I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

编号	5’	颈	环	颈	3’
						1-F	T	CGACTTAAAGAAGCAGATTAT	TTCAAGAGA	ATAATCTGCTTCTTTAAGTCG	TTTTTTC
1-R	TCGAGAAAAAA	CGACTTAAAGAAGCAGATTAT	TCTCTTGAA	ATAATCTGCTTCTTTAAGTCG	A

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(双酶切反应体系如表3所示，37℃，反应1小时)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系(如表4所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNA干扰序列的上下游，设计通用PCR引物(上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’)，进行PCR鉴定实验(PGR反应体系如表5-1，反应条件如表5-2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的含有SEQ ID NO 4序列的RNA干扰载体，命名为pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA。

表3pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系

试剂	体积(μl)
		pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl)	2
10×buffer	5
		100×BSA	0.5
Hpa I(10U/μl)	1
		Xho I(10U/μl)	1

H₂O	40.5
		total	50

表4连接反应体系

试剂	阳性对照(μl)	自连对照(μl)	连接组(μl)
				线性化的载体DNA(100ng/μl)	1	1	1
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl)	1	-	1
				10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液	1	1	1
T4噬菌体DNA连接酶	1	1	1
				dd H2O	16	17	16
total	20	20	20

表5-1PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		10×buffer	2
dNTPs(2.5mM)	0.8
		上游引物	0.4
下游引物	0.4
		Taq polymerase	0.2
模板	1
		ddH₂O	15.2
Total	20

表5-2PCR反应体系程序设定

从含有人RBBP6基因的cDNA文库中，利用PCR方法(PCR反应中使用的引物见表6-1，反应体系见表6-2，反应条件见表6-3)钓取目的基因。将目的基因与酶切线性化的pGC-FU过表达载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图2)进行定向连接，其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的RBBP6过表达质粒。

表6-1cDNA过表达载体引物设计

编号	引物序列	酶切位点
			上游引物	5’-CCGCTCGAGATGTCCTGTGTGCATTATAAATTTTCCTCTAAAC-3’	Xho I
下游引物	5’-GGGGTACCGTCACAGTGACAGATTTCACTTTTTGGTCATCTTTC-3’	Kpn I

表6-2PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		5×PS Buffer	10
dNTP(2.5mM)	4
		上游引物(10uM)	1
下游引物(10uM)	1
		cDNA模板	0.2
PrimerSTAR HS DNA polymerase&Taq DNA polymerase	0.5
		ddH₂O	43.3
Total	60

表6-3PCR反应体系程序设定

将含有SEQ ID NO 4序列的pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA质粒与RBBP6过表达质粒共转染人胚肾细胞293T细胞。转染前1天，将生长良好的293T细胞按密度为5×10⁴/ml接种于24孔板中，待细胞生长至80～90％融合时，换成400μl的opti-MEM1。设置两个质粒转染用量组：(1)pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA：RBBP6过表达质粒量＝0.25∶1(低组)；(2)pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA：RBBP6过表达质粒量＝0.5∶1(高组)。分别按照上述比例，加入pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA与RBBP6过表达质粒(反应体系见表7)，转染6h后更换新鲜培养基。转染24h后，荧光显微镜观察，转染效率(大于70％)，继续培养24h，收集细胞，进行Western Blot检测。根据RBBP6蛋白的敲减效率，筛选有效的针对RBBP6基因的有效siRNA序列。

表7质粒共转染实验组别及剂量设计

注：RBBP6过表达质粒，加入0.8μg；pGCSIL-GFP-Scr-siRNA为RNA干扰阴性对照质粒(构建方法同pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA，阴性对照siRNA序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)。

2.构建RBBP6-siRNA慢病毒：

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNA干扰质粒pGCSIL-GFP-RBBP6-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSIONLentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩(工艺条件见表8)慢病毒。

表8慢病毒纯化工艺条件

实施例2：实时荧光定量RT-PCR法检测RBBP6基因的沉默效率处于对数生长期的人结直肠肿瘤细胞RKO和人肝脏肿瘤细胞SMMC-7721进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI)值，加入适宜量的病毒(SMMC-7721细胞的MOI值为20；RKO细胞的MOI值为10)，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表9)。检测RBBP6基因的引物序列为：上游引物：5’-CCAGCGATGGCAACTAC-3’和下游引物：5’-ACCACAACGGAAACACG-3’。按表10中的比例配置反应体系。设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了RBBP6mRNA的表达丰度。侵染对照病毒(Lv-Scr-siRNA)的细胞作为对照。实验结果(图3和图4)表明，RKO细胞和SMMC-7721细胞Lv-RBBP6-siRNA慢病毒侵染组中RBBP6表达水平与对照组相比分别下降了39.3％和79.6％。

表9逆转录反应体系

试剂	体积(μl)
		5×RT buffer	4
10mM dNTPs	2

RNasin	0.5
		M-MLV-RTase	1
DEPC H₂O	3.5
		Total	10

注：上述体系在42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活。

表10Real-time PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		SYBR premix ex taq	10
上游引物(2.5μM)	0.5
		下游引物(2.5μM)	0.5
cDNA	1
		水	8
Total	20

实施例3：检测侵染RBBP6-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力

处于对数生长期的人结直肠肿瘤细胞RKO和人肝脏肿瘤细胞SMMC-7721进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×10⁴/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI)值，加入适宜量的病毒(SMMC-7721细胞的MOI值为20；RKO细胞的MOI值为10)，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×10⁴/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器(Thermo Fisher)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomicsarrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线(结果如图5和图6所示)。结果表明，慢病毒侵染组细胞增殖速度减缓，远低于对照组细胞增殖速度。

Claims

1.一种分离的人RBBP6基因小分子干扰核糖核酸靶序列在制备抗肿瘤药物中的应用，所述应用具体为通过将RBBP6基因作为RNA干扰药物作用靶标，其中靶序列为SEQ ID NO 4，以降低RBBP6基因的表达水平，从而抑制肿瘤细胞的增殖和生长速度，所述肿瘤选自结直肠癌。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用具体为一种分离的人RBBP6基因小分子干扰核糖核酸靶序列的核酸构建体在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.包含一种分离的人RBBP6基因小分子干扰核糖核酸靶序列的核酸构建体的慢病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤选自结直肠癌，其中所述靶序列为SEQ ID NO 4。

4.一种小分子干扰核糖核酸在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤选自结直肠癌，所述小分子干扰核糖核酸其包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段如SEQ ID NO4所示，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段能形成双链RNA，该双链RNA能抑制人RBBP6基因的表达。

5.如权利要求4所述的应用，其中，所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于同一条RNA链上。

6.如权利要求5所述的应用，其中，所述核糖核酸为发夹型单链RNA分子，其中正义RNA片段和反义RNA片段之间的互补区域形成双链RNA区域。