[go: up one dir, main page]

WO2018062361A1 - 孤発性大腸癌発症可能性の判定方法 - Google Patents

孤発性大腸癌発症可能性の判定方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018062361A1
WO2018062361A1 PCT/JP2017/035137 JP2017035137W WO2018062361A1 WO 2018062361 A1 WO2018062361 A1 WO 2018062361A1 JP 2017035137 W JP2017035137 W JP 2017035137W WO 2018062361 A1 WO2018062361 A1 WO 2018062361A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
methylation
colorectal cancer
cpg sites
methylation rate
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2017/035137
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
楠　正人
裕二 問山
彰 三井
竹鼻　健司
努 梅澤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hanumat Co Ltd
EA Pharma Co Ltd
Original Assignee
Hanumat Co Ltd
EA Pharma Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/JP2016/078810 external-priority patent/WO2018061143A1/ja
Application filed by Hanumat Co Ltd, EA Pharma Co Ltd filed Critical Hanumat Co Ltd
Priority to KR1020197008922A priority Critical patent/KR20190054086A/ko
Priority to EP21152408.7A priority patent/EP3842543A1/en
Priority to US16/333,130 priority patent/US20190352721A1/en
Priority to EP17856310.2A priority patent/EP3521448A4/en
Priority to JP2018542835A priority patent/JP7139248B2/ja
Priority to CN201780059361.5A priority patent/CN109844139A/zh
Publication of WO2018062361A1 publication Critical patent/WO2018062361A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Instruments for taking body samples for diagnostic purposes; Other methods or instruments for diagnosis, e.g. for vaccination diagnosis, sex determination or ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/02—Instruments for taking cell samples or for biopsy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the possibility of development of sporadic colorectal cancer in a human subject having no subjective symptoms of colorectal disease.
  • Colorectal cancer is a cancer that has a high cure rate by appropriate treatment in the early stage. However, there are many cases in which there is no subjective symptom at an early stage. For this reason, it is preferable that it can be detected at an early stage by conducting a regular inspection in a medical examination or the like.
  • a fecal occult blood test is widely performed as a colorectal cancer screening. The fecal occult blood test is excellent as a screening test in that it is non-invasive because stool is used as a sample.
  • Endoscopy is an examination that more accurately examines colorectal cancer by distinguishing it from other diseases that are positive in fecal occult blood tests.
  • it is generally difficult to visually detect early colorectal cancer because it depends largely on the skill of the operator.
  • endoscopy is highly invasive and has a problem that the burden on the subject is large.
  • Patent Document 1 discloses methylation of five miRNA genes miR-1, miR-9, miR-124, miR-137, and miR-34b / c in neoplastic tissues in patients with ulcerative colitis.
  • the rate is significantly higher than that of non-tumor ulcerative colitis tissue, and the methylation rate of the five miRNA genes in the biological sample collected from the rectal mucosa, which is a non-cancerous part, is It has been reported that it can be used as a marker for the development of colorectal cancer in patients with inflammation.
  • the present invention determines the possibility of the occurrence of sporadic colorectal cancer in a human subject having no subjective symptoms of colorectal disease by a method that is less invasive than endoscopy and less burdensome on the subject. It aims to provide a method.
  • the present invention provides the following methods [1] to [29] for determining the possibility of developing sporadic colorectal cancer, a DNA methylation rate analysis marker, and a colonic mucosa collection kit.
  • [1] A method for determining the likelihood of developing sporadic colorectal cancer, One or more of the methylation variable regions represented by the methylation variable region numbers 1-121 shown in Tables 1-7 in DNA collected from a biological sample collected from a human subject.
  • the average methylation rate of the methylation variable region is an average value of the methylation rates of all CpG sites whose methylation rates were measured in the measurement step among the CpG sites in the methylation variable region
  • the reference value is a value for identifying a sporadic colorectal cancer patient and a non-spontaneous colorectal cancer patient, each set for the average methylation rate of each methylation variable region
  • the multivariate discriminant includes, as a variable, an average methylation rate of one or more methylation variable regions of the methylation variable regions represented by the methylation variable region numbers
  • an average methylation rate is preset in one or more of the methylation variable regions represented by methylation variable region numbers 8 to 15, 35 to 52, and 111 to 121.
  • the average methylation rate is preset in one or more of the methylation variable regions represented by methylation variable region numbers 1 to 7, 16 to 34, and 53 to 110 that are less than the reference value or
  • the multivariate discriminant measures the methylation rate of one or more CpG sites present in the methylation variable region including the average methylation rate as a variable
  • a discriminant value that is a value of the multivariate discriminant based on the average methylation rate of the methylation variable region calculated based on the methylation rate measured in the measurement step and the multivariate discriminant
  • the multivariate discriminant includes, as a variable, an average methylation rate of two or more methylation variable regions selected from methylation variable regions represented by methylation variable region numbers 1-121. [3] The method for determining the likelihood of developing sporadic colorectal cancer. [5] The multivariate discriminant includes, as a variable, an average methylation rate of three or more methylation variable regions selected from the methylation variable regions represented by the methylation variable region numbers 1-121. [3] The method for determining the likelihood of developing sporadic colorectal cancer.
  • the multivariate discriminant is an average methylation rate of one or more methylation variable regions selected from the group consisting of methylation variable regions represented by methylation variable region numbers 1 to 52 as a variable.
  • the multivariate discriminant is defined by using an average methylation rate of one or more methylation variable regions selected from the group consisting of methylation variable regions represented by methylation variable region numbers 1 to 15 as a variable.
  • a method for determining the likelihood of developing sporadic colorectal cancer Methylation of one or more CpG sites selected from the group consisting of CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 93 in DNA collected from biological samples collected from human subjects A measuring process for measuring the rate; Determination to determine the possibility of sporadic colorectal cancer development in the human subject based on the methylation rate measured in the measurement step and a preset reference value or a preset multivariate discriminant Having a process,
  • the reference value is a value for identifying a sporadic colorectal cancer patient and a non-spontaneous colorectal cancer patient, each set for the methylation rate of each CpG site
  • the multivariate discriminant includes, as a variable, the methylation rate of one or more CpG sites among the CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 93, and the possibility of sporadic colorectal
  • the methylation rate of the CpG site in the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 54 is measured,
  • SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 10, 11, 13, 14, 17 to 20, 23 to 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 39, 41 to 48, and 50 to At least one of the CpG sites in the base sequence represented by 54 has a methylation rate equal to or lower than a preset reference value, or SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 7 to 9, 12, Criteria in which at least one of CpG sites in the base sequences represented by 15, 16, 21, 22, 28, 31, 34, 37, 38, 40, and 49 has a methylation rate set in advance If it is greater than or equal to the value, it is determined that the human subject is likely to have sporadic colorectal cancer, and any of
  • the methylation rate of CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 8 is measured
  • at least one of the CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 4, and 6 has a methylation rate equal to or lower than a preset reference value, or SEQ ID NO:
  • the human subject when at least one of the CpG sites in the base sequences represented by 2, 3, 5, 7, and 8 has a methylation rate equal to or higher than a preset reference value;
  • the method for determining the likelihood of developing sporadic colorectal cancer according to any one of the above [8] to [10], wherein it is determined that there is a high possibility of developing sporadic colorectal cancer.
  • the methylation rate of the CpG site in the base sequence represented by SEQ ID NOs: 55 to 87 is measured
  • the determination step at least one of the CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 59, 65 to 68, 70 to 77, and 79 to 86 has a reference value in which the methylation rate is set in advance.
  • a method for determining the likelihood of any sporadic colorectal cancer is determining the likelihood of any sporadic colorectal cancer.
  • the methylation rate of the CpG site in the base sequence represented by SEQ ID NOs: 88 to 93 is measured
  • the determination step at least one of the CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 90 and 91 has a methylation rate equal to or lower than a preset reference value, or SEQ ID NOs: 88 and 89 , 92, and 93, when at least one of the CpG sites in the base sequence has a methylation rate equal to or higher than a preset reference value, the human subject is a sporadic colon.
  • the method for determining the likelihood of developing sporadic colorectal cancer according to any one of the above [8] to [10], wherein it is determined that the possibility of developing cancer is high.
  • the determination step among the CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 90 and 91, the number of CpG sites having a methylation rate equal to or lower than a preset reference value, and SEQ ID NOs: 88 and 89 , 92, and 93, the sum of the number of CpG sites having a methylation rate equal to or higher than a preset reference value among the CpG sites in the base sequences represented by the above human subjects is 2 or more.
  • the method for determining the likelihood of developing sporadic colorectal cancer according to any one of the above [8] to [10] and [17], wherein it is determined that there is a high possibility of developing sporadic colorectal cancer. [19] When the sum is 5 or more, it is determined that the human subject is likely to have sporadic colorectal cancer, [12], [14], [16], Or the determination method of sporadic colorectal cancer onset of [18].
  • the multivariate discriminant includes, as a variable, the methylation rate of one or more CpG sites selected from the group consisting of CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 55 to 87,
  • the methylation rate of the CpG site in which the multivariate discriminant includes the methylation rate as a variable is measured
  • a discriminant value that is a value of the multivariate discriminant is calculated based on the methylation rate measured in the measurement step and the multivariate discriminant, and the discriminant value is set in advance as a reference discriminant value. If it is above, it is determined that the human subject is highly likely to have sporadic colorectal cancer, [8] or [9] .
  • the multivariate discriminant includes, as a variable, the methylation rate of one or more CpG sites selected from the group consisting of CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 88 to 93,
  • the methylation rate of the CpG site in which the multivariate discriminant includes the methylation rate as a variable is measured
  • a discriminant value that is a value of the multivariate discriminant is calculated based on the methylation rate measured in the measurement step and the multivariate discriminant, and the discriminant value is set in advance as a reference discriminant value.
  • any of the above [8] to [21], wherein the multivariate discriminant is a logistic regression equation, a linear discriminant, an equation created by a naive Bayes classifier, or an equation created by a support vector machine A method for determining the likelihood of developing sporadic colorectal cancer.
  • the rectal mucosa tissue is A collection tool and a collection aid;
  • the sampling tool comprises a first sandwiching piece and a second sandwiching piece that are a pair of plate-like bodies,
  • the first clamping piece and the second clamping piece are each composed of a clamping part, a gripping part, a spring part, and a fixing part
  • the collection aid is A frustoconical sampling tool introduction part having a slit on the side wall;
  • a rod-shaped gripping part; Have One end of the gripping part is connected to the vicinity of the edge part of the larger outer diameter of the sampling tool introduction part,
  • the slit is provided from the edge of the smaller outer diameter of the sampling tool introduction part toward the edge of the larger outer diameter,
  • the width of the slit is wider than the width in a state where the first sandwiching piece and the second sandwiching piece are bonded to each other on the sandwiching part side, [24]
  • a method for determining the likelihood of developing colorectal cancer [26] The end of the surface facing the second sandwiching piece of the sandwiching portion of the first sandwiching piece, and the end of the surface facing the first sandwiching portion of the sandwiching portion of the second sandwiching piece The method for determining the likelihood of developing sporadic colorectal cancer according to [25], wherein a depression is provided in at least one of the first and second portions. [27] A colonic mucosa collection kit comprising a collection tool and a collection aid.
  • the sampling tool is It consists of a first sandwiching piece and a second sandwiching piece that are a pair of plate-like bodies,
  • the first clamping piece and the second clamping piece are each composed of a clamping part, a gripping part, a spring part, and a fixing part
  • the collection aid is A frustoconical sampling tool introduction part having a slit on the side wall;
  • a rod-shaped gripping part; Have One end of the gripping part is connected to the vicinity of the edge part of the larger outer diameter of the sampling tool introduction part,
  • the slit is provided from the edge of the smaller outer diameter of the sampling tool introduction part toward the edge of the larger outer diameter,
  • the width of the slit is wider than the width in a state where the first sandwiching piece and the second sandwiching piece are bonded to each other on the sandwiching part side,
  • a large intestine mucosa collection kit having a larger outer diameter of the collection tool introduction part of 30 to 70 mm and a length in the rotation axis direction
  • a DNA fragment comprising a DNA fragment having a partial base sequence containing one or more CpG sites selected from the group consisting of CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 93.
  • a marker for analyzing the DNA methylation rate which is used for determining the likelihood of developing colorectal cancer.
  • a specific CpG site in genomic DNA of a biological sample collected from a human subject, particularly a human subject who has no subjective symptoms of colon disease, by the method for determining the likelihood of developing sporadic colorectal cancer according to the present invention is determined by examining the methylation rate of a specific DMR or the average methylation rate of a specific DMR.
  • the rectal mucosa collection kit according to the present invention enables the rectal mucosa to be collected relatively safely and simply from the patient's anus.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram of an embodiment of the collection tool 2.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram of one embodiment of the collection assisting tool 11.
  • FIG. 3 is an explanatory diagram of a usage mode of the rectal mucosa collection kit.
  • FIG. 4 is a cluster analysis based on the methylation level of the CpG site of the 54 CpG set selected as a result of the comprehensive DNA methylation analysis in Example 1.
  • FIG. 5 is a cluster analysis based on the methylation level of the CpG site of the 8CpG set selected as a result of the comprehensive DNA methylation analysis in Example 1.
  • FIG. 4 is a cluster analysis based on the methylation level of the CpG site of the 54 CpG set selected as a result of the comprehensive DNA methylation analysis in Example 1.
  • FIG. 5 is a cluster analysis based on the methylation level of the CpG site of the 8CpG set selected as a result of the comprehensive DNA methylation analysis in Example 1.
  • FIG. 6 is a principal component analysis based on the methylation level of the CpG site of the 54 CpG set selected as a result of the comprehensive DNA methylation analysis in Example 1.
  • FIG. 7 is a principal component analysis based on the methylation level of CpG sites in the 8CpG set selected as a result of the comprehensive DNA methylation analysis in Example 1.
  • FIG. 8 is a cluster analysis based on the methylation level of the CpG site of the 33 CpG set selected as a result of the comprehensive DNA methylation analysis in Example 2.
  • FIG. 9 is a principal component analysis based on the methylation level of the CpG site of the 33 CpG set selected as a result of the comprehensive DNA methylation analysis in Example 2.
  • FIG. 10 shows the CpG site (cg01105403) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 57, the CpG site (cg06829686) in the base sequence represented by SEQ ID NO: 63, and SEQ ID NO: 77 in Example 2.
  • 3 is an ROC curve of a test for the presence or absence of sporadic colorectal cancer when the methylation rate of 3 CpG sites of the CpG site (cg14629397) in the base sequence is used as a marker.
  • FIG. 11 is a cluster analysis based on the methylation level of the CpG site of the 6CpG set selected as a result of the comprehensive DNA methylation analysis in Example 3.
  • FIG. 12 is a principal component analysis based on the methylation level of the CpG site of the 6CpG set selected as a result of the comprehensive DNA methylation analysis in Example 3.
  • FIG. 13 shows the results of cluster analysis based on the methylation rate at DMR 121 sites (121 DMR sets) selected as a result of comprehensive DNA methylation analysis in Example 4.
  • FIG. 14 shows the results of principal component analysis based on the methylation rate of 121 DMR sets selected as a result of comprehensive DNA methylation analysis in Example 4.
  • FIG. 15 shows, in Example 4, the average methylation rate of three DMRs, DMR represented by DMR number 11, DMR represented by DMR number 24, and DMR represented by DMR number 42, as a marker. It is a ROC curve of the test
  • the carbon at the 5-position can be subjected to methylation modification.
  • the methylation rate of CpG sites refers to the amount of methylated cytosine base (methylated cytosine) and methylation among CpG sites in a biological sample collected from one organism individual.
  • the amount of untreated cytosine base (unmethylated cytosine) is measured, and means the ratio (%) of the amount of methylated cytosine to the sum of both.
  • the average methylation rate of DMR is an arithmetic average value (arithmetic average value) or geometric average value (geometric average value) of methylation rates of a plurality of CpG sites present in DMR.
  • an average value other than this may be used.
  • sporadic colorectal cancer refers to an individual who has no obvious causative disease in the background and does not have a clear hereditary colorectal cancer based on family history or genetic testing. It is colorectal cancer that develops due to the accumulation of accidental genetic mutations due to environmental factors such as age, diet, and lifestyle, and it is sometimes called sporadic colorectal cancer. That is, sporadic colorectal cancer includes all colorectal cancers except colorectal cancer that develops from obvious causative diseases and hereditary colorectal cancer.
  • colorectal cancer that develops due to progression of other inflammatory diseases of the large intestine such as ulcerative colitis is not included in sporadic colorectal cancer (Cellular and Molecular Life Sciences, 2014, vol.71 (18) , P.3523-3535; Cancer Letters, 2014, vol.345, p.235-241).
  • hereditary colorectal cancers such as familial noadenomatous polyposis (FAP) and Lynch ⁇ syndrome are not included in sporadic colorectal cancer (Cancer, 2015, 9: 520).
  • the method for determining the likelihood of occurrence of sporadic colorectal cancer according to the present invention determines the likelihood of the occurrence of sporadic colorectal cancer in a human subject.
  • a method comprising: a group of healthy individuals having a methylation rate of CpG sites or DMRs in genomic DNA that do not develop colorectal cancer and have no subjective symptoms of other colorectal diseases; and sporadic colorectal cancer What is different from the group of colorectal cancer patients who developed the disease is a marker.
  • the level of the possibility that a human subject has developed colorectal cancer is determined.
  • the methylation rate of a specific CpG site or the average methylation rate of a specific DMR as a marker used to determine the likelihood of developing a sporadic colorectal cancer in a human subject, visual discrimination is greatly improved. It is possible to detect early solitary colon cancer, which is difficult, more objectively and sensitively, and early detection can be expected.
  • the average methylation rate of the CpG site or DMR used as a marker in the determination method according to the present invention can distinguish healthy individuals from those who have sporadic colorectal cancer. Therefore, the determination method according to the present invention is suitable for determining the possibility of the onset of sporadic colorectal cancer in humans who have no subjective symptoms of colorectal disease.
  • the determination method according to the present invention is more invasive than endoscopy and can more accurately determine the onset of sporadic colorectal cancer than fecal occult blood test, it is particularly useful for colorectal screening. It is useful for screening tests for such colon cancer.
  • the determination method according to the present invention can be performed on a subject who is positive in a fecal occult blood test.
  • the determination of the likelihood of developing sporadic colorectal cancer based on the methylation rate of the CpG site as a marker may be made based on the measured value of the methylation rate of the CpG site itself.
  • a multivariate discriminant including a conversion rate as a variable may be used, and the determination may be performed based on a discriminant value obtained from the multivariate discriminant.
  • Judgment of the possibility of sporadic colorectal cancer based on the average methylation rate of DMR as a marker is based on the value of the average methylation rate of DMR calculated from the methylation rate of two or more CpG sites in DMR.
  • a multivariate discriminant including the average methylation rate of DMR as a marker as a variable may be used, and the determination may be performed based on a discriminant value obtained from the multivariate discriminant.
  • the CpG site and DMR used as markers in the present invention are largely different in the methylation rate between the non-colon cancer developing group and the sporadic colorectal cancer (hereinafter, simply referred to as “colon cancer”) patient group. Those that do are preferred. The greater the difference between the two groups, the more reliably the onset of sporadic colorectal cancer can be detected.
  • the CpG site and DMR used as markers in the present invention have a significantly higher methylation rate in patients with colorectal cancer than those with non-colon cancer, that is, those with a higher methylation rate due to the development of colorectal cancer.
  • the methylation rate of colorectal cancer patients may be significantly lower than that of non-colorectal cancer patients, that is, the methylation rate may be lowered by the onset of sporadic colorectal cancer.
  • CpG site and DMR used as markers in the present invention those having a small difference in methylation rate between a non-cancerous part and a cancerous part of the large intestine are more preferable in the same colon cancer patient.
  • a CpG site methylation rate or DMR average methylation rate as an index, even when a biological sample collected from a non-cancerous part of a colon cancer patient is used, it is collected from the cancerous part.
  • the prepared biological sample it is possible to determine the presence or absence of sporadic colorectal cancer with high sensitivity.
  • the deep mucosa of the large intestine needs to be collected using an endoscope or the like, and the burden on the human subject is large, but the rectal mucosa near the anus can be collected relatively easily.
  • the rectal mucosa near the anus is used as a biological sample regardless of the location where the cancerous site is formed. It is possible to detect a human subject who has developed invasive colorectal cancer without omission.
  • the method of determining based on the measured value of the methylation rate of the CpG site itself is a method of determining the possibility of developing sporadic colorectal cancer in a human subject.
  • a measurement step of measuring methylation rates of a plurality of specific CpG sites as markers in the present invention in DNA collected from a biological sample collected from a human subject, and the methyl measured in the measurement step And a determination step of determining the possibility of the onset of sporadic colorectal cancer in the human subject based on the conversion rate and a reference value previously set for each CpG site.
  • the CpG site used as a marker in the present invention is specifically one or more CpG sites selected from the group consisting of CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 93. Each base sequence is shown in Tables 8 to 16. In the base sequences in the table, CG in parentheses is a CpG site detected by the comprehensive DNA methylation analysis shown in Examples 1 to 3. A DNA fragment having a base sequence containing these CpG sites can be used as a DNA methylation rate analysis marker for determining the possibility of the occurrence of sporadic colorectal cancer in a human subject.
  • the 54 CpG sites in parentheses in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 54 were used in the comprehensive DNA methylation analysis in Example 1 described later.
  • the methylation rate is greatly different between the non-colon cancer onset group and the colon cancer patient group.
  • those with a methylation rate of colon cancer patients considerably lower than those with non-colon cancer are SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 10, 11, 13, 14, 17-20, 23-27, 29, 30.
  • the CpG sites used as markers are not limited to these 54 CpG sites, and other CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 54 are also included.
  • CpG site used as a marker in the present invention only the CpG site in the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 8 may be used. These eight CpG sites (hereinafter, sometimes collectively referred to as “8CpG set”) have a small difference in methylation rate between the non-cancerous part and the cancerous part of the large intestine of the large intestine cancer in the 54CpG set. Is.
  • the 33 CpG sites in parentheses in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 55 to 87 were used in the comprehensive DNA methylation analysis in Example 2 described later.
  • the methylation rate is greatly different between the non-colon cancer onset group and the colon cancer patient group.
  • the CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 59, 65 to 68, 70 to 77, and 79 to 86 are those in which the methylation rate of colon cancer patients is considerably lower than that of non-colon cancer patients.
  • those whose methylation rate in colon cancer patients is significantly higher than those in non-colon cancer patients are the bases represented by SEQ ID NOs: 55-58, 60-64, 69, 78, and 87 CpG site in the sequence (“+” in the table).
  • the CpG site used as a marker is not limited to these 33 CpG sites, and includes other CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 55 to 87.
  • CpG sites in parentheses in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 88 to 93 were used in the comprehensive DNA methylation analysis in Example 3 described later.
  • the methylation rate is greatly different between the non-colon cancer onset group and the colon cancer patient group.
  • the CpG site in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 90 and 91 (“ ⁇ ” in the table) has a significantly lower methylation rate in patients with colorectal cancer than those with non-colorectal cancer.
  • a cancer patient whose methylation rate is significantly higher than those who develop non-colon cancer is a CpG site in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 88, 89, 92, and 93 (“+” in the table).
  • the CpG site used as a marker is not limited to these 6 CpG sites, and includes other CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 88 to 93.
  • CpG sites marked “+” in Tables 8-12 in 54 CpG sets CpG sites marked “+” in Tables 13-15 in 33 CpG sets, and “+” in Table 16 out of 6 CpG sets
  • CpG sites marked “+” in Tables 8-12 in 54 CpG sets CpG sites marked “+” in Tables 13-15 in 33 CpG sets
  • “+” in Table 16 out of 6 CpG sets In the case of a CpG site marked with “”, there is a possibility that the human subject has developed sporadic colorectal cancer when the measured methylation rate is equal to or higher than a preset reference value. Judged as high.
  • the reference value of each CpG site can be determined experimentally as a threshold value that can be used to measure the methylation rate of the CpG site in the colon cancer patient group and the non-colon cancer onset group, and to distinguish between the two groups.
  • the standard value for methylation of an arbitrary CpG site is obtained by a general statistical method. Examples thereof are shown below, but the method of determining the reference value in the present invention is not limited to these.
  • DNA methylation of rectal mucosa was measured for multiple non-colorectal cancer patients and multiple colorectal cancer patients, respectively. After calculating the numerical value representative of the conversion and the variation, a threshold value that distinguishes both the numerical values in consideration of the variation can be obtained and used as a reference value.
  • SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 10, 11, 13, 14, 17 to 20, 23 to 27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 39, 41 to 48, 50 to At least one of the CpG sites in the base sequence represented by 54, 59, 65-68, 70-77, 79-86, 90, and 91 has a methylation rate below a preset reference value
  • SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 7-9, 12, 15, 16, 21, 22, 28, 31, 34, 37, 38, 40, 49, 55-58, 60-64, 69 , 78, 87 to 89, 92, and 93 when at least one of the CpG sites in the nucleotide sequence has a methylation rate equal to or higher than a preset reference value,
  • the person is likely to have sporadic colorectal cancer That.
  • the 54CpG set is used as a marker in the present invention, that is, when the methylation rate of the 54CpG set is measured in the measurement step, in the determination step, SEQ ID NOs: 1, 4, 6, 10, 11, 13, 14, 17-20, 23-27, 29, 30, 32, 33, 35, 36, 39, 41-48, and at least one of the CpG sites in the base sequence represented by 50-54
  • the methylation rate is below a preset reference value, or SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 7-9, 12, 15, 16, 21, 22, 28, 31, 34, 37, 38 , 40, and 49, when at least one of the CpG sites in the base sequence has a methylation rate equal to or higher than a preset reference value, the human subject is a sporadic colon.
  • the determination step is represented by SEQ ID NOs: 1, 4, and 6. At least one of the CpG sites in the base sequence has a methylation rate not higher than a preset reference value, or in the base sequence represented by SEQ ID NOs: 2, 3, 5, 7, and 8. When at least one or more of the CpG sites has a methylation rate equal to or higher than a preset reference value, it is determined that the human subject is likely to have sporadic colorectal cancer To do.
  • the number of CpG sites having a methylation rate equal to or lower than a preset reference value among the CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 4, and 6, the number of CpG sites having a methylation rate equal to or lower than a preset reference value, and the sequence Among the CpG sites in the base sequences represented by the numbers 2, 3, 5, 7, and 8, the sum of the number of CpG sites with a methylation rate equal to or higher than a preset reference value is 2 or more, preferably 3 As described above, when it is more preferably 5 or more, it can be determined with higher accuracy by determining that the human subject has a high possibility of developing sporadic colorectal cancer.
  • the 33CpG set is used as a marker in the present invention, that is, when the methylation rate of the 33CpG set is measured in the measurement step, in the determination step, SEQ ID NOs: 59, 65 to 68, 70 to 77, And at least one of the CpG sites in the base sequence represented by 79 to 86 has a methylation rate equal to or lower than a preset reference value, or SEQ ID NOs: 55 to 58, 60 to 64, 69. , 78, and 87, when at least one of the CpG sites in the base sequence has a methylation rate equal to or higher than a preset reference value, the human subject is a sporadic colon. It is determined that there is a high possibility of developing cancer.
  • the methylation rate is below a preset reference value.
  • Number of CpG sites and CpG sites having a methylation rate of a CpG site in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 55 to 58, 60 to 64, 69, 78, and 87 being equal to or higher than a preset reference value By determining that the human subject is likely to develop sporadic colorectal cancer when the sum of the number and the number is 2 or more, preferably 3 or more, more preferably 5 or more, The determination can be performed with higher accuracy.
  • the 6CpG set is used as a marker in the present invention, that is, when the methylation rate of the 6CpG set is measured in the measurement step, in the determination step, in the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 90 and 91 Among the CpG sites, at least one or more of the CpG sites have a methylation rate that is not more than a preset reference value, or among the CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 88, 89, 92, and 93 When the methylation rate is at least a reference value set in advance at least at one place, it is determined that the human subject is likely to have sporadic colorectal cancer.
  • the number of CpG sites having a methylation rate equal to or lower than a preset reference value SEQ ID NO: 88
  • the sum of the methylation rate and the number of CpG sites having a predetermined reference value or more is preferably 2 or more, preferably 3 or more, more preferably When it is 5 or more, it can be determined more accurately by determining that the human subject has a high possibility of developing sporadic colorectal cancer.
  • one or more CpG sites selected from the group consisting of CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 93 are used as markers.
  • the CpG sites used as markers in the present invention are all 93 CpG sites in parentheses in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 93 (hereinafter, collectively referred to as “93CpG set”). It may be the 54CpG set, the 8CpG set, the 33CpG set, or the 6CpG set.
  • Both the CpG site of the 54CpG set and the CpG site of the 8CpG set have a small distribution of methylation rate between the colon cancer patient group and the non-colon cancer onset group, and the colon cancer patient group and the non-colon cancer onset group It is excellent in terms of high discrimination ability.
  • the 33CpG set and the 6CpG set are slightly less specific than the CpG site of the 54CpG set and the CpG site of the 8CpG set, the sensitivity is very high, for example, for sporadic colorectal cancer. Very suitable for primary screening tests.
  • the method of determining based on the value of the average methylation rate of a specific DMR is specifically a method of determining the likelihood of developing sporadic colorectal cancer,
  • the average methylation rate of each DMR is calculated as the average value of the methylation rates of all CpG sites whose methylation rates were measured in the measurement step among the CpG sites in the DMR.
  • the DMR used as a marker in the present invention is specifically one or more DMRs selected from the group consisting of DMRs represented by DMR numbers 1-121.
  • the positions of each DMR on the chromosome and the corresponding genes are shown in Tables 17-23.
  • the base positions of the start point and end point of DMR in the table are based on the human genome sequence data set “GRCh37 / hg19”.
  • a DNA fragment having a base sequence containing a CpG site present in these DMRs can be used as a DNA methylation rate analysis marker for determining the possibility of sporadic colorectal cancer.
  • the DMRs represented by DMR numbers 1 to 121 have a methylation rate of a plurality of CpG sites contained in each region as compared with the non-colon cancer onset group. This is significantly different from the colorectal cancer patient group. Among these, those with an average methylation rate of DMR (average value of methylation rates of a plurality of CpG sites present in DMR) of colon cancer patients are considerably lower than those with non-colorectal cancer. DMRs represented by 15, 35 to 52, and 111 to 121 (“ ⁇ ” in the table), and those having a significantly higher average methylation rate of DMR in patients with colorectal cancer than those with non-colorectal cancer. DMRs represented by numbers 1 to 7, 16 to 34, and 53 to 110 (in the table, “+”).
  • the average methylation rate of DMR when used as a marker, one of the DMRs represented by DMR numbers 1 to 121 may be used as a marker, and the DMR represented by DMR numbers 1 to 121 may be used. Any two or more locations selected from the group consisting of may be used as markers, and all of the DMRs represented by DMR numbers 1-121 may be used as markers.
  • the number of DMRs used as markers in the group consisting of DMRs represented by DMR numbers 1 to 121 is preferably 2 or more, and 3 or more. More preferably, it is more preferably 4 or more, and still more preferably 5 or more.
  • the DMR whose methylation rate is used as a marker in the present invention is a DMR represented by DMR numbers 1 to 52 (hereinafter, collectively referred to as “52 DMR set”). It is preferably at least one selected from the group consisting of, more preferably at least two selected from the 52DMR set, and even more preferably at least three selected from the 52DMR set. More preferably, there are 4 or more selected from the 52DMR set, and particularly preferably 5 or more selected from the 52DMR set.
  • the number is one or more selected from the group consisting of DMRs represented by DMR numbers 1 to 15 (hereinafter sometimes collectively referred to as “15 DMR sets”), and selected from the 15 DMR sets. 2 or more, more preferably 3 or more selected from the 15 DMR set, even more preferably 4 or more selected from the 15 DMR set, from the 15 DMR set. It is particularly preferable that the number is 5 or more selected.
  • the average methylation rate of each DMR may be an average value of the methylation rates of all CpG sites included in each DMR, and at least one CpG site is selected from all CpG sites included in each DMR. It is good also as selecting arbitrarily and making it the average value of the methylation rate of this selected CpG site.
  • the methylation rate of each CpG site can be measured in the same manner as the measurement of the methylation rate of the CpG site in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 in Tables 8 to 16.
  • a reference value for distinguishing colon cancer patients from non-colon cancer patients is set in advance.
  • the DMR marked as “+” in Tables 17 to 23 in the 121 DMR set when the measured average methylation rate of the DMR is equal to or higher than a preset reference value, Is likely to have sporadic colorectal cancer.
  • the DMRs marked with “-” in Tables 17 to 23 indicate that the human subject is in a state where the measured average methylation rate of the DMR is less than or equal to a preset reference value. It is determined that there is a high possibility that sporadic colorectal cancer has developed.
  • the standard value of the average methylation rate of each DMR is determined experimentally as a threshold value that can be used to measure the average methylation rate of the DMR in the colon cancer onset group and the non-colon cancer patient group, and to distinguish between the two groups. Can do. Specifically, the standard value of the average methylation rate of DMR is obtained by a general statistical method.
  • the determination method includes the determination step including a methylation rate measured in the measurement step and a preset multivariate. Based on the discriminant, the possibility of the onset of sporadic colorectal cancer in the human subject can be determined.
  • the multivariate discriminant includes, as a variable, the methylation rate of one or more CpG sites among the CpG sites in the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 93.
  • the determination method according to the present invention includes the methylation measured in the measurement step. Based on the average methylation rate of DMR calculated based on the conversion rate and a preset multivariate discriminant, the possibility of the onset of sporadic colorectal cancer in the human subject can be determined.
  • the multivariate discriminant includes, as a variable, the methylation rate of one or more CpG sites among the CpG sites in the 121DMR set.
  • the multivariate discriminant used in the present invention can be obtained by a general method used to discriminate between the two groups.
  • Examples of the multivariate discriminant include, but are not limited to, a logistic regression equation, a linear discriminant, a formula created with a naive Bayes classifier, or a formula created with a support vector machine. .
  • These multivariate discriminants include, for example, one or two or more of the CpG sites in the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 to 93 for the colorectal cancer patient group and the non-colon cancer onset group. The methylation rate at the CpG site can be measured, and the resulting methylation rate can be used as a variable to prepare a standard method.
  • the average methylation rate of one or more of the DMRs in the 121 DMR set was measured, and the obtained methylation rate was a variable.
  • a standard discriminant value for discriminating between colon cancer patients and non-colon cancer patients is set in advance.
  • the reference discriminant value is a discriminant value that is the value of the multivariate discriminant used for the colorectal cancer patient group and the non-colon cancer onset group, and the discriminant value of the colorectal cancer patient group and the discriminant value of the non-colon cancer onset group And can be experimentally determined as a threshold that can distinguish both groups.
  • the methylation rate of the CpG site or the average methylation rate of the DMR in which the multivariate discriminant used includes the methylation rate as a variable.
  • a discriminant value which is a value of the multivariate discriminant is calculated based on the methylation rate measured in the measurement step and the multivariate discriminant, and the discriminant value is set in advance.
  • the reference discriminant value it is determined whether or not a human subject whose CpG site methylation rate or DMR average methylation rate has been measured has developed sporadic colorectal cancer.
  • the discriminant value is greater than or equal to a preset reference discriminant value, it is determined that the human subject is likely to have sporadic colorectal cancer.
  • the multivariate discriminant used in the present invention is preferably a formula containing as a variable the methylation rate of one or more CpG sites selected from the group consisting of the 33CpG sites, and selected from the group consisting of the 33CpG sites. More preferably, the formula includes only the methylation rate of one or more CpG sites as a variable, and only the methylation rate of 2 to 10 CpG sites arbitrarily selected from the group consisting of the 33CpG sites is used as a variable. More preferably, the formula includes only the methylation rate of 2 to 5 CpG sites arbitrarily selected from the group consisting of the 33 CpG sites as a variable.
  • the multivariate discriminant used in the present invention is preferably a formula containing as a variable the methylation rate of one or more CpG sites selected from the group consisting of the 6CpG sites, and selected from the group consisting of the 6CpG sites. More preferably, the formula includes only the methylation rate of one or more CpG sites as a variable, and only the methylation rate of 2 to 6 CpG sites arbitrarily selected from the group consisting of the 6CpG sites is used as a variable. More preferably, the formula includes only the methylation rates of 2 to 5 CpG sites arbitrarily selected from the group consisting of the 6CpG sites as variables.
  • the CpG sites constituting the 33CpG set and the 6CpG set are arbitrarily selected from 2 to 10 CpG sites (2 to 6 in the case of 6CpG set), preferably 2 to 5 CpG sites. Even when only the selected CpG site is used, it is possible to determine the possibility of development of sporadic colorectal cancer with sufficient sensitivity and specificity.
  • the CpG site in the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 the CpG site in the base sequence represented by SEQ ID NO: 63, and the sequence represented by SEQ ID NO: 77
  • the possibility of developing sporadic colorectal cancer can be determined with a sensitivity of about 95% and a specificity of about 96%. In clinical examinations and the like, if the number of CpG sites for measuring the methylation rate is large, labor and cost may be excessive.
  • CpG sites to be used as markers from the 33CpG set and the CpG sites constituting the 6CpG set By selecting CpG sites to be used as markers from the 33CpG set and the CpG sites constituting the 6CpG set, one or two to ten CpG sites that can be measured in clinical examinations can be detected with high accuracy. It is possible to determine the likelihood of developing colorectal cancer.
  • the multivariate discriminant used in the present invention is preferably an expression including, as a variable, an average methylation rate of one or more DMRs selected from the group consisting of the 121 DMR set, and selected from the group consisting of the 121 DMR set. More preferably, the formula includes only the average methylation rate of two or more DMRs as a variable, and includes only the average methylation rate of three or more DMRs arbitrarily selected from the group consisting of the 121 DMR sets as a variable.
  • a formula is more preferable, and a formula including only an average methylation rate of four or more DMRs arbitrarily selected from the group consisting of the 121 DMR set as a variable is further preferable, and is arbitrarily selected from the group consisting of the 121 DMR set.
  • a formula including only the average methylation rate of 5 or more DMRs as a variable is particularly preferable.
  • a formula including an average methylation rate of one or more DMRs selected from the group consisting of the 52DMR set as a variable is preferable, and an average methyl of two or more DMRs selected from the group consisting of the 52DMR set is preferable.
  • the formula includes only the conversion rate as a variable, and more preferably includes only the average methylation rate of 2 to 10 DMRs arbitrarily selected from the group consisting of the 52 DMR set as a variable. More preferably, the formula includes only the average methylation rate of 3 to 10 DMRs arbitrarily selected from the group consisting of the variables, and 5 to 10 DMRs arbitrarily selected from the group consisting of the 52 DMR sets. Particularly preferred is a formula containing only the average methylation rate of as a variable.
  • a formula including, as a variable, an average methylation rate of one or more DMRs selected from the group consisting of the 15 DMR sets is preferable, and two or more DMRs selected from the group consisting of the 15 DMR sets are used. More preferably, the formula includes only the average methylation rate as a variable, and more preferably the formula includes only the average methylation rate of 2 to 10 DMRs arbitrarily selected from the group consisting of the 15 DMR sets as a variable. More preferably, the formula includes only the average methylation rate of 3 to 10 DMRs arbitrarily selected from the group consisting of sets as a variable, and 5 to 10 sites arbitrarily selected from the group consisting of the 15 DMR sets. Particularly preferred is a formula containing only the average methylation rate of DMR as a variable.
  • the biological sample used in the determination method according to the present invention is a biological sample collected from a human subject and is not particularly limited as long as it contains genomic DNA of the subject.
  • blood, plasma, serum, tears, saliva, or the like may be used, or tissue pieces collected from other tissues such as the digestive tract mucosa or the liver may be used.
  • the biological sample used in the determination method according to the present invention is preferably the large intestine mucosa because it more strongly reflects the state of the large intestine, and can be collected in the rectal mucosa because it can be collected with relatively low invasiveness. More preferably.
  • a biological sample is collected from a body fluid such as blood, the tissue piece, the large intestine mucosa, or the rectal mucosa, it may be collected using a collecting tool corresponding to each biological sample.
  • the biological sample may be in a state where DNA can be extracted, and may be subjected to various pretreatments.
  • it may be a formalin fixed paraffin embedded (FFPE) tissue.
  • FFPE formalin fixed paraffin embedded
  • Extraction of DNA from a biological sample can be performed by a conventional method, and various commercially available DNA extraction / purification kits can also be used.
  • the method for measuring the methylation rate of a CpG site is not particularly limited as long as it is a method capable of distinguishing and quantifying a methylated cytosine base and an unmethylated cytosine base for a specific CpG site.
  • the methylation rate of the CpG site can be measured by appropriately modifying methods known in the art as they are or as necessary. Examples of methods for measuring the methylation rate of CpG sites include bisulfite sequencing, COBRA (Combined Bisulfite Restoration Analysis), and qAMP (quantitative analysis of DNA methylation using real-time PCR). Alternatively, MIAM (I Microarray-based Integrated Analysis of Methylation by Isoschizomers) method may be used.
  • the kit for collecting large intestine mucosa comprises a collection tool for collecting with the rectal mucosa sandwiched therein, and a collection aid for expanding the anus and allowing the collection tool to reach the surface of the large intestine mucosa from the anus.
  • the colonic mucosa collection kit according to the present invention will be described below with reference to FIGS.
  • FIG. 1 (A) to FIG. 1 (C) are explanatory views of an embodiment of the collection tool 2 of the colonic mucosa collection kit 1.
  • FIG. 1 (A) is a front view showing a state where the first clamping piece 3a and the second clamping piece 3b of the sampling tool 2 are not applied with force
  • FIG. 1C is a plan view of a state in which the sandwiching piece 3a and the second sandwiching piece 3b are not applied with force
  • FIG. 1C shows the first sandwiching piece 3a and the second sandwiching piece 3b of the sampling tool 2 being applied. It is a perspective view in the state where it is not applied. As shown in FIG.
  • the collection tool 2 includes a first sandwiching piece 3a and a second sandwiching piece 3b which are a pair of elastic plate-like bodies.
  • the 1st clamping piece 3a is comprised from the clamping part 31a, the holding part 32a, the spring part 33a, and the fixing
  • the 2nd clamping piece 3b is the clamping part 31b, the holding part 32b, and the spring part 33b. It is comprised from the fixing
  • the shape of the first sandwiching piece 3a and the second sandwiching piece 3b may be plate-like or rod-like, and may be formed to have a certain length for collecting the rectal mucosa. Don't stick to the shape.
  • the material is not particularly limited as long as it is an elastic body, and may be a metal such as stainless steel or a resin.
  • the collection tool 2 is preferably a metal because the overlapping of the first sandwiching piece 3a and the second sandwiching piece 3b is stable in the applied state and the colonic mucosa can be collected more easily.
  • the first clamping piece 3a and the second clamping piece 3b are connected and fixed in a state of facing each other at the fixing portion 34a and the fixing portion 34b.
  • the method of connecting and fixing is not particularly limited. For example, by welding the end portions of the fixing portion 34a and the fixing portion 34b so that the first holding piece 3a and the second holding piece 3b overlap each other, Both can be connected and fixed.
  • the lengths of the fixing portion 34a and the fixing portion 34b are not particularly limited, but are preferably 20 to 50 mm, and more preferably 30 to 40 mm. When the length of the fixing portion is within the above range, both the clamping pieces can be easily connected and fixed, and sufficient strength against the applied force can be imparted.
  • the first clamping piece 3a is provided with a spring portion 33a having elasticity between the grip portion 32a and the fixing portion 34a.
  • the second clamping piece 3b is provided with a spring portion 33b having elasticity between the grip portion 32b and the fixing portion 34b.
  • the length of the spring portion 33a and the spring portion 33b is not particularly limited, but is preferably 2 to 10 mm, and more preferably 3 to 7 mm. When the length of the spring portion is within the above range, sufficient elasticity can be easily imparted to both sandwiching pieces.
  • the gripping part 32a is between the clamping part 31a and the spring part 33a
  • the gripping part 32b is between the clamping part 31b and the spring part 33b.
  • a human grasps the surface of the gripper 32a that faces the grip part 32b and the back surface of the grip part 32b that faces the grip part 32a (the surface gripped by the person who collects colonic mucosa). In order to prevent slipping, it may be slip-proofed.
  • the anti-slip process is not particularly limited.
  • a resin-like anti-slip part may be separately attached to a metal grip part, and the grip part may be a jagged pattern, a wedge-shaped pattern, or a paper file file part. Giving a rough texture or the like.
  • the anti-slip process as shown in FIG. 1A, a process in which a plurality of protrusions and recesses are provided substantially in parallel in the width direction so as to have a jagged pattern is preferable.
  • the length of the grip portion 32a and the grip portion 32b is preferably 20 to 50 mm, and more preferably 30 to 40 mm. When the length of the gripping portion is within the above range, gripping and applying force to both sandwiching pieces become easier.
  • the first clamping piece 3a has a clamping surface 35a for clamping the large intestine mucosa at the end of the surface of the clamping part 31a facing the second clamping piece 3b.
  • the second sandwiching piece 3b has a sandwiching surface 35b for sandwiching the mucosa of the large intestine at the end of the surface of the sandwiching portion 31b that faces the first sandwiching piece 3a.
  • the sandwiching surface 35a and the sandwiching surface 35b are in a state in which the end portion of the sandwiching portion 31a and the end portion of the sandwiching portion 31b are bonded to each other by applying force to the first sandwiching piece 3a and the second sandwiching piece 3b.
  • the clamping surface 35b is provided so as to be in close contact with each other at least at the edge portion.
  • the clamping surface 35a and the clamping surface 35b is provided with a recess. Since at least one of them is cup-shaped, a space is formed inside when the edge portion of the holding surface 35a and the edge portion of the holding surface 35b are in contact with each other. Of the large intestine mucosa sandwiched between the sandwiching surface 35a and the sandwiching surface 35b, the portion accommodated in the space does not take much load when the large intestine mucosa is torn off, and thus can suppress the destruction of the tissue.
  • the shape of the recess is not particularly limited, and can be, for example, a cup shape (hemisphere). Since it is easier to collect the mucosa of the large intestine and the destruction of the tissue can be suppressed, it is more preferable that depressions are formed on both the clamping surface 35a and the clamping surface 35b.
  • the inner diameter of the depression may be set to a size such that a necessary amount of large intestine mucosa can be collected.
  • the large intestine mucosa used in the determination method according to the present invention it is sufficient if a small amount of mucosa can be collected.
  • a sufficient amount of large intestine mucosa can be collected without excessively damaging the large intestine mucosa by setting the inner diameter of the depressions of the sandwich surfaces 35a and 35b to 1 to 5 mm, preferably 2 to 3 mm. .
  • the edge part of the clamping surface 35a and the edge part of the clamping surface 35b are only required to be in close contact with each other, and may be flat or serrated.
  • the large intestine mucosa can be cut and collected with a relatively weak force by being sandwiched between the edge of the sandwiching surface 35a and the edge of the sandwiching surface 35b.
  • the width of the first sandwiching piece 3a and the second sandwiching piece 3b is preferably 5 to 15 mm, more preferably 6 to 10 mm, in order to facilitate gripping.
  • the width of the sandwiching portion of the first sandwiching piece 3a and the second sandwiching piece 3b can be collected from the mucosa of the large intestine with a smaller force, and therefore becomes narrower toward the end where the sandwiching surface is provided.
  • the widths of the end portions of the first sandwiching piece 3a and the second sandwiching piece 3b can be set to, for example, 2 to 6 mm, preferably 3 to 4 mm, while being larger than the above-described depressions.
  • the length of the clamping part 31a and the clamping part 31b is preferably 20 to 60 mm, and more preferably 30 to 50 mm. When the length of the sandwiching portion is within the above range, it is easier to collect the mucous membrane in a state where it passes through the slit 13 of the collection aid 11.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram of one embodiment of the collection assisting tool 11.
  • FIG. 2A is a perspective view as viewed from the upper side of the collection assisting tool 11, and
  • FIG. 2B is a perspective view as viewed from the lower side.
  • 2 (C) to 2 (G) are a front view, a plan view, a bottom view, a left side view, and a right side view of the collection assisting tool 11, respectively.
  • the collection assisting tool 11 includes a collection tool introducing unit 12, a slit 13, and a gripping unit 14.
  • the sampling tool introduction part 12 is a truncated cone-shaped member having a slit 13 on the side wall.
  • the sampling tool introduction unit 12 is inserted into the anus from the distal edge 15 having a small outer diameter, and the sampling tool 2 is inserted from the proximal edge 16 having a large outer diameter.
  • the collection tool introduction part 12 may have a through hole in the rotation axis direction. From the viewpoint of easy insertion into the anus, the outer diameter of the hand edge 16 is preferably 30 to 70 mm, and more preferably 40 to 60 mm.
  • the outer diameter of the distal edge portion 15 is preferably 10 to 30 mm, and more preferably 15 to 25 mm.
  • the length of the collection tool introduction part 12 in the rotation axis direction is preferably 50 to 150 mm, more preferably 70 to 130 mm, and even more preferably 80 to 120 mm.
  • the slit 13 is provided from the front edge portion 15 of the sampling tool introduction portion 12 toward the hand edge portion 16.
  • the presence of the slit 13 reaching the distal edge 15 in a part of the side wall of the collection tool introducing portion 12 increases the freedom of movement of the distal end portion of the collection tool 2 in the intestine, and in the rectum having a complicated internal structure, Large intestine mucosa can be collected more easily.
  • the slit 13 may be set at any position of the collection tool introduction unit 12.
  • the slit 13 is preferably on the side close to the gripping portion 14 as shown in FIG.
  • the number of the slits 13 provided in the collection tool introduction part 12 may be one, or two or more.
  • the width of the slit 13 is the same as the first holding piece 3a and the second holding piece 3a of the collection tool 2 in a state where the holding surface 35a and the holding surface 35b are in contact with each other. It is designed to be wider than the width of the end portion of the sandwiching piece 3b.
  • the slit 13 end width L 2 of the peripheral portion 15 side 7 ⁇ 25 mm are preferred, preferably 15 ⁇ 20 mm.
  • the width of the slit 13 may be constant or may be narrowed in any direction.
  • two or more slits may be formed on the wall surface of the collection tool introduction part 12.
  • the gripping portion 14 may be a hollow rod shape that is open at the bottom, and may be reinforced with ribs.
  • the length of the gripping portion 14 is preferably 50 to 150 mm, more preferably 70 to 130 mm, from the viewpoint of ease of gripping with a hand.
  • the width of the gripping portion 14 is preferably 5 to 20 mm, more preferably 8 to 13 mm, and the thickness of the gripping portion 14 is preferably 10 to 30 mm, more preferably 15 to 25 mm.
  • the shape of the gripping portion 14 may be any shape as long as it is easy to grip, and may be, for example, a plate shape, a rod shape, or other shapes.
  • the gripping part 14 may be connected perpendicularly to the frustoconical center axis of the collection tool introduction part 12 in the vicinity of the proximal edge 16 of the collection tool introduction part 12, but more to the colonic mucosa. Since the collection tool 2 can be easily reached, the angle ⁇ 1 (see FIG. 2C) between the rotation axis direction of the collection tool introduction unit 12 and the central axis direction of the collection tool introduction unit 12 exceeds 90 ° and 120 °. The following is preferable, 95 to 110 ° is more preferable, and 95 to 105 ° is further preferable.
  • FIG. 3 is an explanatory view showing an aspect of use of the colonic mucosa collection kit 1 according to the present invention.
  • the collection assisting tool 11 is inserted from the distal edge portion 15 into the anus of the subject from whom the colonic mucosa is collected.
  • the sampling tool 2 is introduced from the opening on the side of the hand edge 16 in a state where the grip 14 is held and stabilized with one hand.
  • the introduced collection tool 2 penetrates the slit 13 from the tip and reaches the surface of the large intestine mucosa.
  • the colonic mucosa can be collected by pulling out the sampling tool 2 from the slit 13 in a state where the colonic mucosa is sandwiched between the clamping surface 35a and the clamping surface 35b of the sampling tool 2.
  • Example 1 Pathological diagnosis by biopsy tissue in 8 healthy subjects (5 men, 3 women) and endoscopic examination has not caused other inflammatory diseases of the large intestine such as ulcerative colitis.
  • the methylation rate of the CpG site was comprehensively analyzed for DNA in the colonic mucosa collected from 6 colon cancer patients (3 males and 3 females) diagnosed with primary colorectal cancer.
  • the concentration of the obtained DNA was determined as follows. Specifically, the fluorescence intensity of each sample was measured using Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (manufactured by Life Technologies), and the concentration was calculated using the ⁇ -DNA calibration curve attached to the kit. Next, each sample was diluted to 1 ng / ⁇ L with TE (pH 8.0), and real-time PCR was performed using Illumina FFPE QC Kit (manufactured by Illumina) and Fast SYBR Green Master Mix (manufactured by Life Technologies). Ct value was determined. The difference in Ct value between the sample and the positive control (hereinafter referred to as ⁇ Ct value) was calculated for each sample, and the quality was evaluated. Samples with a ⁇ Ct value of less than 5 were judged to have good quality and proceeded to the subsequent steps.
  • Hybridization Hybridization buffer was added to the precipitated DNA, and the mixture was reacted with Hybridization Oven (manufactured by Illumina) at 48 ° C. for 1 hour to dissolve the DNA.
  • the dissolved DNA was incubated with a 95 ° C.
  • Microsample Incubator manufactured by SciGene
  • the reaction was carried out for 16 hours or more in Hybridization Oven at 48 ° C., and the probe on the BeadChip and the single-stranded DNA were hybridized.
  • [ ⁇ value] [Methylated fluorescence intensity] ⁇ ([Methylated fluorescence intensity] + [Unmethylated fluorescence intensity] +100)
  • DiffScore approaches 0, showing a positive value when the level in colorectal cancer patients is high, and a negative value when low.
  • GenomeStudio and software Methylation Module (Version: 1.9.0) were used for DNA methylation quantification and DNA methylation level comparison analysis.
  • the setting conditions of GenomeStudio are as follows.
  • 54 CpG sites having a DiffScore absolute value exceeding 30 and a ⁇ value exceeding 0.3 were extracted from 485,577 CpG sites.
  • the 54 CpG sites are collectively referred to as a “54 CpG set”.
  • the cancer patient samples were narrowed down to those with little fluctuation in DNA methylation level. That is, the unbiased variance var of the ⁇ value of 23 cancer patient samples (4 sites ⁇ each site 6 or 7 samples) was obtained, and 8 CpG sites having an unbiased variance var value smaller than 0.02 were narrowed down.
  • these eight CpG sites are collectively referred to as “8CpG set”.
  • Tables 24 and 25 show the results of each CpG site in the 54 CpG set.
  • CpG sites with # in the “8CpG” column indicate those included in the 8CpG set.
  • Example 2 Although no other inflammatory diseases of the large intestine such as ulcerative colitis have developed due to pathological diagnosis with 28 healthy subjects and biopsy tissue in endoscopy, the large intestine diagnosed as sporadic colorectal cancer The methylation rate of CpG sites was comprehensively analyzed for DNA in rectal mucosa collected from 20 cancer patients.
  • the DNA used for the analysis of the methylation rate of the CpG site was extracted from the rectal mucosal tissue of each subject in the same manner as in Example 1, whole genome amplified, and quantification and comparison of the DNA methylation level of the CpG site. Analysis was performed, and DiffScore calculation, cluster analysis, and principal component analysis were performed using the results.
  • BeadChip Infinium® Methylation® EPIC® BeadChip (manufactured by Illumina) was used.
  • the setting conditions of GenomeStudio were the same as those in Example 1 except that “Content Descriptor” was set to “MethylationEPIC_v-1-0_B2.bpm”.
  • CpG biomarker candidates were extracted from comprehensive DNA methylation analysis data. Specifically, first, 142 CpG sites having an absolute value of ⁇ value exceeding 0.15 were extracted from 866,895 CpG sites.
  • a discriminant based on a logistic regression model was used to discriminate between colorectal cancer patients and healthy subjects.
  • the sensitivity rate evaluated as positive among colorectal cancer patients
  • the specificity rate evaluated as negative among healthy subjects
  • the rate (percentage of colorectal cancer patients evaluated as positive) was 95.0%
  • the negative predictive rate percentage of healthy individuals evaluated as negative) was 96.4%. It was as high as 90% or more.
  • Example 3 CpG biomarker candidates were extracted from the DNA methylation level ( ⁇ value) of the rectal mucosa samples obtained in Example 1 and Example 2.
  • CpG biomarker candidates Specifically, first, from 866,895 CpG sites, 42 samples of 26 samples of colorectal cancer diagnosed as sporadic colorectal cancer and 36 samples of healthy subjects whose absolute value of ⁇ is more than 0.15. CpG sites were extracted.
  • CpG sites that appear in the discriminant were selected.
  • 6 CpG sites (6CpG set) described in Table 16 were selected. The results for each CpG site are shown in Table 27.
  • Example 4 The average methylation rate of each DMR (average ⁇ value; methylation level of CpG sites present in each DMR ( ⁇ value) of specimens collected from the rectums of 20 colon cancer patients and 28 healthy subjects obtained in Example 2 DMR biomarker candidates were extracted from the arithmetic average value of ()).
  • DMR biomarker candidates Specifically, first, methylation data (IDAT format) of 866,895 CpG sites is obtained from the ChAMP pipeline (Bioinformatics, 30, 428, 2014; http://bioconductor.org/packages/release/bioc/ html / ChAMP.html), and 4,232 DMRs judged to be significant between the two groups of patients with colorectal cancer and healthy subjects were extracted. Among them, 121 locations (DMR Nos. 1 to 121) having absolute values of ⁇ values ([average ⁇ value (cancer rectum)] ⁇ [average ⁇ value (non-cancer rectum)]) exceeding 0.05 were determined as DMR biotechnology. Marker candidates were used. Tables 28 to 31 show the results of the 121 DMRs (121 DMR sets).
  • SYMBOLS 1 Colon mucosa sampling kit, 2 ... Collection tool, 3a ... 1st clamping piece, 3b ... 2nd clamping piece, 31, 31a, 31b ... clamping part, 32, 32a, 32b ... grip part, 33, 33a , 33b ... spring part, 34, 34a, 34b ... fixing part, 35, 35a, 35b ... clamping surface, 11 ... collecting aid, 12 ... collecting tool introduction part, 13 ... slit, 14 ... gripping part, 15 ... tip side Edge, 16 ... Hand edge.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)

Abstract

本願発明は、ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の特定のメチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程を有し、前記基準値が、各メチル化可変領域のメチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、前記多変量判別式が、特定のメチル化可変領域のうちの１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、孤発性大腸癌発症可能性の判定方法を提供する。

Description

孤発性大腸癌発症可能性の判定方法
　本発明は、大腸疾患の自覚症状のないヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する方法に関する。
　本願は、２０１６年９月２９日に出願されたＰＣＴ／ＪＰ２０１６／０７８８１０および２０１７年３月３１に日本に出願された特願２０１７－０７２６７４に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　大腸癌は、初期に適切な治療を行うことにより治癒率が高い癌である。しかし、初期には自覚症状がない場合が多く、このため、健康診断等で定期的に検査し、早期に発見できることが好ましい。大腸癌検診としては、便潜血検査が広く行われている。便潜血検査は、便をサンプルとするため、非侵襲的である点で、スクリーニング検査としては優れている。しかし、細菌性やウイルス性腸炎、憩室出血、肛門疾患（痔核、痔瘻、裂肛）のように、便中に血液が混じる他の疾患と区別することができないという問題がある。
　大腸癌を便潜血検査で陽性となる他の疾患と区別してより精度よく調べる検査としては、内視鏡検査がある。しかしながら、早期の大腸癌を視認により検出することは、手技者の技量によるところが大きく、一般的に困難である。また、内視鏡検査は侵襲性が高く、被検者の負担も大きいという問題もある。
　内視鏡検査よりも非侵襲的に潰瘍性大腸炎を背景とした大腸粘膜に発生した大腸癌を早期に発見する方法として、ＤＮＡのメチル化をバイオマーカーとする方法がある。例えば、特許文献１には、潰瘍性大腸炎患者において、腫瘍性組織におけるｍｉＲ－１、ｍｉＲ－９、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１３７、及びｍｉＲ－３４ｂ／cの５種のｍｉＲＮＡ遺伝子のメチル化率は、非腫瘍性潰瘍性大腸炎組織に比べて有意に高いこと、また非癌部である直腸粘膜から採取された生体試料中の前記５種のｍｉＲＮＡ遺伝子のメチル化率は、潰瘍性大腸炎患者の大腸癌発症のマーカーとし得ることが報告されている。
国際公開第２０１４／１５１５５１号
　本発明は、大腸疾患の自覚症状のないヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を、内視鏡検査よりも侵襲性が低く、より被検者の負担が小さい方法で判定する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、大腸疾患の自覚症状のないヒト被検者のゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイト（シトシン－ホスホジエステル結合－グアニン）のメチル化率を網羅的に調べたところ、大腸癌を発症した患者と孤発性大腸癌を発症していないヒト被検者においてメチル化率に顕著な差がある９３種のＣｐＧサイトを見出し、を見出し、また、別に１２１のメチル化可変領域（differentially methylated region、「ＤＭＲ」ということがある。）を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［２９］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法、ＤＮＡメチル化率分析用マーカー、及び大腸粘膜採取用キットを提供する。
［１］　孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
　ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、表１～７に記載のメチル化可変領域番号１～１２１で表される各メチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
　前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
　前記メチル化可変領域の平均メチル化率が、当該メチル化可変領域中のＣｐＧサイトのうち、前記測定工程においてメチル化率が測定された全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値であり、
　前記基準値が、各メチル化可変領域の平均メチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
　前記多変量判別式が、前記メチル化可変領域番号１～１２１で表されるメチル化可変領域のうちの１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、
孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
［２］　前記測定工程において、メチル化可変領域番号８～１５、３５～５２、及び１１１～１２１で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、メチル化可変領域番号１～７、１６～３４、及び５３～１１０で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［１］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［３］　前記測定工程において、前記多変量判別式がその平均メチル化率を変数として含むメチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
　前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［１］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［４］　前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１～１２１で表されるメチル化可変領域から選択される２か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［５］　前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１～１２１で表されるメチル化可変領域から選択される３か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［６］　前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１～５２で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［７］　前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１～１５で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、前記［３］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。　
［８］　孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
　ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、配列番号１～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
　前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
を有し、
　前記基準値が、各ＣｐＧサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
　前記多変量判別式が、前記配列番号１～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む、孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［９］　前記測定工程において、２～１０個のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する、前記［８］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１０］　前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７～２０、２３～２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１～４８、５０～５４、５９、６５～６８、７０～７７、７９～８６、９０、及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７～９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、４９、５５～５８、６０～６４、６９、７８、８７～８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］又は［９］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１１］　前記測定工程において、配列番号１～５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
　前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７～２０、２３～２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１～４８、及び５０～５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７～９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］～［１０］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１２］　前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７～２０、２３～２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１～４８、及び５０～５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７～９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］～［１１］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１３］　前記測定工程において、配列番号１～８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
　前記判定工程において、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］～［１０］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１４］　前記判定工程において、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］～［１０］、及び［１３］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１５］　前記測定工程において、配列番号５５～８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
　前記判定工程において、配列番号５９、６５～６８、７０～７７、及び７９～８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号５５～５８、６０～６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］～［１０］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１６］　前記判定工程において、配列番号５９、６５～６８、７０～７７、及び７９～８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号５５～５８、６０～６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］～［１０］、及び［１５］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１７］　前記測定工程において、配列番号８８～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
　前記判定工程において、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］～［１０］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１８］　前記判定工程において、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］～［１０］、及び［１７］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［１９］　前記和が５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［１２］、［１４］、［１６］、又は［１８］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２０］　前記多変量判別式が、配列番号５５～８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、　前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
　前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］又は［９］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２１］　前記多変量判別式が、配列番号８８～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、　前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
　前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、前記［８］又は［９］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２２］　前記多変量判別式が、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式である、前記［８］～［２１］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２３］　前記生体試料が、腸管組織である、前記［８］～［２２］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２４］　前記生体試料が、直腸粘膜組織である、前記［８］～［２３］のいずれかの孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２５］　前記直腸粘膜組織が、
　採取具と、採取補助具とを備え、
　前記採取具は、一対の板状体である第１の挟持片と第２の挟持片とからなり、
　前記第１の挟持片と前記第２の挟持片は、それぞれ、挟持部と把持部とバネ部と固定部とから構成されており、
　前記採取補助具は、
　側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
　棒状の把持部と、
を有し、
　前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
　前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
　前記スリットの幅が、前記第１の挟持片と前記第２の挟持片が挟持部側の端部同士で接着した状態の幅よりも広く、
　前記採取具導入部の大きい方の外径が３０～７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０～１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キットによって採取されたものである、前記［２４］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２６］　前記第１の挟持片の挟持部のうち第２の挟持片と対向する面の端部と、前記第２の挟持片の挟持部のうち第１の挟持片と対向する面の端部と、の少なくとも一方に窪み部が設けられている、前記［２５］の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
［２７］　採取具と、採取補助具とを備える大腸粘膜採取用キットであり、
　前記採取具は、
　一対の板状体である第１の挟持片と第２の挟持片とからなり、
　前記第１の挟持片と前記第２の挟持片は、それぞれ、挟持部と把持部とバネ部と固定部とから構成されており、
　前記採取補助具は、
　側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
　棒状の把持部と、
を有し、
　前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
　前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
　前記スリットの幅が、前記第１の挟持片と前記第２の挟持片が挟持部側の端部同士で接着した状態の幅よりも広く、
　前記採取具導入部の大きい方の外径が３０～７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０～１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キット。
［２８］　前記第１の挟持片の挟持部のうち第２の挟持片と対向する面の端部と、前記第２の挟持片の挟持部のうち第１の挟持片と対向する面の端部と、の少なくとも一方に窪み部が設けられている、前記［２７］の大腸粘膜採取用キット。
［２９］　配列番号１～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトを含む部分塩基配列を有するＤＮＡ断片からなり、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定するために用いられる、ＤＮＡメチル化率分析用マーカー。
　本発明に係る孤発性大腸癌発症可能性の判定方法により、ヒト被検者、特に大腸疾患の自覚症状のないヒト被検者から採取された生体試料について、ゲノムＤＮＡ中の特定のＣｐＧサイトのメチル化率又は特定のＤＭＲの平均メチル化率を調べることによって、孤発性大腸癌発症の可能性を判定することができる。
　また、本発明に係る直腸粘膜採取用キットにより、患者の肛門から比較的安全かつ簡便に直腸粘膜を採取することができる。
図１は、採取具２の一実施態様の説明図である。 図２は、採取補助具１１の一実施態様の説明図である。 図３は、直腸粘膜採取用キットの使用態様の説明図である。 図４は、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された５４ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析である。 図５は、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された８ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析である。 図６は、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された５４ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析である。 図７は、実施例１において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された８ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析である。 図８は、実施例２において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された３３ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析である。 図９は、実施例２において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された３３ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析である。 図１０は、実施例２において、配列番号５７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ０１１０５４０３）、配列番号６３で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ０６８２９６８６）、及び配列番号７７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ１４６２９３９７）の３個のＣｐＧサイトのメチル化率をマーカーとした場合の、孤発性大腸癌発症の有無の検査のＲＯＣ曲線である。 図１１は、実施例３において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された６ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づくクラスター解析である。 図１２は、実施例３において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された６ＣｐＧセットのＣｐＧサイトのメチル化レベルに基づく主成分分析である。 図１３は、実施例４において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜されたＤＭＲ１２１か所（１２１ＤＭＲセット）のメチル化率に基づくクラスター解析の結果である。 図１４は、実施例４において、網羅的ＤＮＡメチル化解析の結果選抜された１２１ＤＭＲセットのメチル化率に基づく主成分分析の結果である。 図１５は、実施例４において、ＤＭＲ番号１１で表されるＤＭＲ、ＤＭＲ番号２４で表されるＤＭＲ、及びＤＭＲ番号４２で表されるＤＭＲの３個のＤＭＲの平均メチル化率をマーカーとした場合の、孤発性大腸炎患者の大腸癌発症の有無の検査のＲＯＣ曲線である。
　ゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイトのシトシン塩基は、５位の炭素がメチル化修飾を受け得る。本発明及び本願明細書において、ＣｐＧサイトのメチル化率とは、一つの生物個体から採取された生体試料中のＣｐＧサイトのうち、メチル化されているシトシン塩基（メチル化シトシン）量とメチル化されていないシトシン塩基（非メチル化シトシン）量とを測定し、両者の和に対するメチル化シトシン量の割合（％）を意味する。また、本発明及び本願明細書において、ＤＭＲの平均メチル化率とは、ＤＭＲに存在する複数のＣｐＧサイトのメチル化率の相加平均値（算術平均値）又は相乗平均値（幾何平均値）を意味するが、これ以外の平均値でもよい。
　本発明及び本願明細書において、「孤発性大腸癌」とは、その背景に明らかな原因疾患を認めず、家族歴や遺伝子検査から明確な遺伝性大腸癌も認めない個人に対して、加齢や食事、生活様式等の環境因子により偶発的な遺伝子変異が蓄積することによって発症する大腸癌であり、散発性と呼ばれることもある大腸癌である。すなわち、孤発性大腸癌には、明らかな原因疾患から発症する大腸癌及び遺伝性大腸癌を除く全ての大腸癌が含まれる。例えば、潰瘍性大腸炎等の他の大腸の炎症性疾患が進行して発症する大腸癌は、孤発性大腸癌には含まれない（Cellular and Molecular Life Sciences，2014，vol.71(18)，p.3523-3535；Cancer Letters，2014，vol.345，p.235-241）。また、家族性大腸腺腫症（familial adenomatous polyposis: FAP）やリンチ症候群（Lynch syndrome）等の遺伝性大腸癌も孤発性大腸癌には含まれない（Cancer，2015, 9:520）。
＜孤発性大腸癌発症可能性の判定方法＞

　本発明に係る孤発性大腸癌発症可能性の判定方法（以下、「本発明に係る判定方法」ということがある。）は、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、ゲノムＤＮＡ中のＣｐＧサイト又はＤＭＲのうち、メチル化率が、大腸癌を発症しておらず、かつ他の大腸疾患の自覚症状もない健常者群と、孤発性大腸癌を発症した大腸癌患者群とで差があるものをマーカーとすることを特徴とする。これらのマーカーとなるＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率を指標として、ヒト被検者が大腸癌を発症している可能性の高低を判定する。特定のＣｐＧサイトのメチル化率又は特定のＤＭＲの平均メチル化率を、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定するために用いられるマーカーとすることにより、視認判別が非常に困難である早期孤発性大腸癌をより客観的かつ感度よく検出することができ、早期発見が期待できる。
　本発明に係る判定方法においてマーカーとして用いられるＣｐＧサイト又はＤＭＲの平均メチル化率は、健常者と孤発性大腸癌の発症者とを区別し得る。このため、本発明に係る判定方法は、大腸疾患の自覚症状のないヒトの孤発性大腸癌の発症の可能性の判定に好適である。また、本発明に係る判定方法は、内視鏡検査よりも非侵襲的であり、かつ便潜血検査よりも精度よく孤発性大腸癌の発症の可能性を判定し得るため、特に大腸検診のような大腸癌のスクリーニング検査に有用である。例えば、便潜血検査において陽性であった被検者に対し、本発明に係る判定方法を行うことができる。
　マーカーとするＣｐＧサイトのメチル化率に基づく孤発性大腸癌発症可能性の判定は、測定されたＣｐＧサイトのメチル化率の値自体に基づいて行ってもよく、マーカーとするＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む多変量判別式を用い、この多変量判別式から求められる判別値に基づいて行ってもよい。
　マーカーとするＤＭＲの平均メチル化率に基づく孤発性大腸癌発症可能性の判定は、ＤＭＲ中の２以上のＣｐＧサイトのメチル化率から算出されたＤＭＲの平均メチル化率の値自体に基づいて行ってもよく、マーカーとするＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む多変量判別式を用い、この多変量判別式から求められる判別値に基づいて行ってもよい。
　本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイト及びＤＭＲとしては、メチル化率が非大腸癌発症者群と孤発性大腸癌（以下、単に「大腸癌」ということがある。）患者群とで大きく相違するものが好ましい。両群の差が大きいほど、孤発性大腸癌の発症の有無をより確実に検出することができる。本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイト及びＤＭＲは、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりも有意に高い、すなわち、大腸癌の発症によりメチル化率が高くなるものであってもよく、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりも有意に低い、すなわち、孤発性大腸癌の発症によりメチル化率が低くなるものであってもよい。
　本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイト及びＤＭＲとしては、同一の大腸癌患者において、大腸の非癌部位と癌部位とのメチル化率の差が小さいものがより好ましい。このようなＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率を指標とすることにより、大腸癌患者の非癌部位から採取された生体試料が用いられた場合であっても、癌部位から採取された生体試料を用いた場合と同様に、高感度に孤発性大腸癌の発症の有無を判定することができる。例えば、大腸深部の粘膜は内視鏡等を用いて採取する必要があり、ヒト被検者の負担が大きいが、肛門付近の直腸粘膜は比較的容易に採取できる。大腸の非癌部位と癌部位とのメチル化率の差が小さいＣｐＧサイト又はＤＭＲをマーカーとすることにより、癌部位が形成される位置にかかわらず、肛門付近の直腸粘膜を生体試料として孤発性大腸癌を発症したヒト被検者を漏れなく検出することができる。
　本発明に係る判定方法のうち、測定されたＣｐＧサイトのメチル化率の値自体に基づいて判定を行う方法は、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、本発明においてマーカーとする特定の複数のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、前記測定工程において測定されたメチル化率と、各ＣｐＧサイトに対して予めそれぞれ設定された基準値に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程を有する。
　本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイトは、具体的には、配列番号１～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトである。各塩基配列を表８～１６に示す。表の塩基配列中、括弧内のＣＧは、実施例１～３で示す網羅的ＤＮＡメチル化解析で検出されるＣｐＧサイトである。これらのＣｐＧサイトを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片は、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定するためのＤＮＡメチル化率分析用マーカーとして用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　配列番号１～５４で表される塩基配列中の括弧内の５４個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「５４ＣｐＧセット」ということがある。）は、後記実施例１における網羅的ＤＮＡメチル化解析において、メチル化率が非大腸癌発症者群と大腸癌患者群とで大きく相違するものである。このうち、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり低いものが、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７～２０、２３～２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１～４８、及び５０～５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトであり（表中、「－」）、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり高いものが、配列番号２、３、５、７～９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトである（表中、「＋」）。マーカーとされるＣｐＧサイトは、これら５４個のＣｐＧサイトに限定されるものではなく、配列番号１～５４で表される塩基配列中の他のＣｐＧサイトも含まれる。
　本発明においてマーカーとされるＣｐＧサイトとしては、配列番号１～８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのみを用いてもよい。これらの８個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「８ＣｐＧセット」ということがある。）は、５４ＣｐＧセットのうち、大腸癌患者の大腸の非癌部位と癌部位とのメチル化率の差が小さいものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　配列番号５５～８７で表される塩基配列中の括弧内の３３個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「３３ＣｐＧセット」ということがある。）は、後記実施例２における網羅的ＤＮＡメチル化解析において、メチル化率が非大腸癌発症者群と大腸癌患者群とで大きく相違するものである。このうち、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり低いものが、配列番号５９、６５～６８、７０～７７、７９～８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトであり（表中、「－」）、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり高いものが、配列番号５５～５８、６０～６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトである（表中、「＋」）。マーカーとされるＣｐＧサイトは、これら３３個のＣｐＧサイトに限定されるものではなく、配列番号５５～８７で表される塩基配列中の他のＣｐＧサイトも含まれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　配列番号８８～９３で表される塩基配列中の括弧内の６個のＣｐＧサイト（以下、まとめて「６ＣｐＧセット」ということがある。）は、後記実施例３における網羅的ＤＮＡメチル化解析において、メチル化率が非大腸癌発症者群と大腸癌患者群とで大きく相違するものである。このうち、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり低いものが、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトであり（表中、「－」）、大腸癌患者のメチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり高いものが、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトである（表中、「＋」）。マーカーとされるＣｐＧサイトは、これら６個のＣｐＧサイトに限定されるものではなく、配列番号８８～９３で表される塩基配列中の他のＣｐＧサイトも含まれる。
　各ＣｐＧサイトについては、予め、大腸癌患者と非大腸癌発症者を識別するための基準値を設定しておく。５４ＣｐＧセットのうち表８～１２で「＋」と記されているＣｐＧサイト、３３ＣｐＧセットのうち表１３～１５で「＋」と記されているＣｐＧサイト、及び６ＣｐＧセットのうち表１６で「＋」と記されているＣｐＧサイトの場合には、測定されたメチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。５４ＣｐＧセットのうち表８～１２で「－」と記されているＣｐＧサイト、３３ＣｐＧセットのうち表１３～１５で「－」と記されているＣｐＧサイト、及び６ＣｐＧセットのうち表１６で「－」と記されているＣｐＧサイトの場合には、測定されたメチル化率が予め設定された基準値以下である場合に、ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。
　各ＣｐＧサイトの基準値は、大腸癌患者群と非大腸癌発症者群の当該ＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。具体的には、任意のＣｐＧサイトのメチル化の基準値は、一般的な統計学的手法によって求められる。下記にその例を示すが、本発明における基準値の決め方はこれらに限定されるものではない。
　基準値の求め方の一例としては、例えば、まず、任意のＣｐＧサイトについて、ヒト被検者のうち内視鏡検査での生検組織による病理検査により大腸癌と診断されなかった患者（非大腸癌発症者）の直腸粘膜のＤＮＡメチル化を測定する。複数のヒト被検者について測定した後に、その平均値又は中央値などによりこれらのヒト被検者群のメチル化を代表する数値を算出し、これを基準値とすることができる。
　その他、複数の非大腸癌発症者と複数の大腸癌患者に対して、それぞれ直腸粘膜のＤＮＡメチル化を測定し、平均値又は中央値などにより大腸癌患者群と非大腸癌発症者群のメチル化を代表する数値とばらつきをそれぞれ算出した後、ばらつきも考慮して両数値が区別されるような閾値を求め、これを基準値とすることができる。
　前記判定工程においては、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７～２０、２３～２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１～４８、５０～５４、５９、６５～６８、７０～７７、７９～８６、９０、及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７～９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、４９、５５～５８、６０～６４、６９、７８、８７～８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７～２０、２３～２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１～４８、５０～５４、５９、６５～６８、７０～７７、７９～８６、９０、及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７～９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、４９、５５～５８、６０～６４、６９、７８、８７～８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
　前記５４ＣｐＧセットを本発明においてマーカーとする場合、すなわち、前記測定工程において前記５４ＣｐＧセットのメチル化率を測定する場合には、前記判定工程においては、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７～２０、２３～２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１～４８、及び５０～５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７～９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７～２０、２３～２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１～４８、及び５０～５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７～９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
　前記８ＣｐＧセットを本発明においてマーカーとする場合、すなわち、前記測定工程において前記８ＣｐＧセットのメチル化率を測定する場合には、前記判定工程においては、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
　前記３３ＣｐＧセットを本発明においてマーカーとする場合、すなわち、前記測定工程において前記３３ＣｐＧセットのメチル化率を測定する場合には、前記判定工程においては、配列番号５９、６５～６８、７０～７７、及び７９～８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号５５～５８、６０～６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号５９、６５～６８、７０～７７、及び７９～８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号５５～５８、６０～６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
　前記６ＣｐＧセットを本発明においてマーカーとする場合、すなわち、前記測定工程において前記６ＣｐＧセットのメチル化率を測定する場合には、前記判定工程においては、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。本発明に係る判定方法においては、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定することにより、より精度よく判定を行うことができる。
　本発明においては、配列番号１～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトをマーカーとして用いる。本発明においてマーカーとするＣｐＧサイトとしては、配列番号１～９３で表される塩基配列中の括弧内の９３個のＣｐＧサイトの全て（以下、まとめて「９３ＣｐＧセット」ということがある。）であってもよく、前記５４ＣｐＧセットであってもよく、前記８ＣｐＧセットであってもよく、前記３３ＣｐＧセットであってもよく、前記６ＣｐＧセットであってもよい。前記５４ＣｐＧセットのＣｐＧサイト、前記８ＣｐＧセットのＣｐＧサイトは、いずれも、大腸癌患者群と非大腸癌発症者群のメチル化率の分散が小さく、大腸癌患者群と非大腸癌発症者群の識別能が高い点で優れている。一方で、前記３３ＣｐＧセット及び前記６ＣｐＧセットは、前記５４ＣｐＧセットのＣｐＧサイトや前記８ＣｐＧセットのＣｐＧサイトに比べて特異度はやや低くなるものの、感度が非常に高く、例えば、孤発性大腸癌の一次スクリーニング検査には非常に好適である。
　本発明に係る判定方法のうち、特定のＤＭＲの平均メチル化率の値自体に基づいて判定を行う方法は、具体的には、孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、本発明においてマーカーとする特定のＤＭＲ中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたＤＭＲの平均メチル化率と、各ＤＭＲの平均メチル化率に対して予めそれぞれ設定された基準値に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程を有する。なお、各ＤＭＲの平均メチル化率は、当該ＤＭＲ中のＣｐＧサイトのうち、前記測定工程においてメチル化率が測定された全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値として算出する。
　本発明においてマーカーとされるＤＭＲは、具体的には、ＤＭＲ番号１～１２１で表されるＤＭＲからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲである。各ＤＭＲの染色体上の位置及び対応する遺伝子を表１７～２３に示す。表中のＤＭＲの開始点と終点の塩基位置は、ヒトゲノム配列のデータセット「ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９」に基づく。これらのＤＭＲ中に存在するＣｐＧサイトを含む塩基配列を有するＤＮＡ断片は、孤発性大腸癌発症可能性を判定するためのＤＮＡメチル化率分析用マーカーとして用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
　ＤＭＲ番号１～１２１で表されるＤＭＲ（以下、まとめて「１２１ＤＭＲセット」ということがある。）は、各領域中に含まれる複数のＣｐＧサイトのメチル化率が、非大腸癌発症者群と大腸癌患者群とで大きく相違するものである。このうち、大腸癌患者のＤＭＲの平均メチル化率（ＤＭＲ中に存在している複数のＣｐＧサイトのメチル化率の平均値）が非大腸癌発症者よりもかなり低いものが、ＤＭＲ番号８～１５、３５～５２、及び１１１～１２１で表されるＤＭＲであり（表中、「－」）、大腸癌患者のＤＭＲの平均メチル化率が非大腸癌発症者よりもかなり高いものが、ＤＭＲ番号１～７、１６～３４、及び５３～１１０で表されるＤＭＲである（表中、「＋」）。
　本発明において、ＤＭＲの平均メチル化率をマーカーとする場合には、ＤＭＲ番号１～１２１で表されるＤＭＲのうちの１か所をマーカーとしてもよく、ＤＭＲ番号１～１２１で表されるＤＭＲからなる群より選択される任意の２か所以上をマーカーとしてもよく、ＤＭＲ番号１～１２１で表されるＤＭＲの全てをマーカーとしてもよい。本発明においては、判定精度をより高められることから、ＤＭＲ番号１～１２１で表されるＤＭＲからなる群のうちマーカーとして用いるＤＭＲは、２か所以上であることが好ましく、３か所以上であることがより好ましく、４か所以上であることがさらに好ましく、５か所以上であることがよりさらに好ましい。
　より高い判定精度が得られることから、本発明においてそのメチル化率がマーカーとして用いられるＤＭＲは、ＤＭＲ番号１～５２で表されるＤＭＲ（以下、まとめて「５２ＤＭＲセット」ということがある。）からなる群より選択される１か所以上であることが好ましく、５２ＤＭＲセットから選択される２か所以上であることがより好ましく、５２ＤＭＲセットから選択される３か所以上であることがさらに好ましく、５２ＤＭＲセットから選択される４か所以上であることがよりさらに好ましく、５２ＤＭＲセットから選択される５か所以上であることが特に好ましい。なかでも、ＤＭＲ番号１～１５で表されるＤＭＲ（以下、まとめて「１５ＤＭＲセット」ということがある。）からなる群より選択される１か所以上であることが好ましく、１５ＤＭＲセットから選択される２か所以上であることがより好ましく、１５ＤＭＲセットから選択される３か所以上であることがさらに好ましく、１５ＤＭＲセットから選択される４か所以上であることがよりさらに好ましく、１５ＤＭＲセットから選択される５か所以上であることが特に好ましい。
　各ＤＭＲの平均メチル化率は、それぞれのＤＭＲ中に含まれる全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値としてもよく、それぞれのＤＭＲ中に含まれる全てのＣｐＧサイトから少なくとも１個のＣｐＧサイトを任意に選出し、この選出されたＣｐＧサイトのメチル化率の平均値としてもよい。各ＣｐＧサイトのメチル化率は、表８～１６中の配列番号１等で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率の測定と同様にして測定することができる。
　各ＤＭＲの平均メチル化率については、予め、大腸癌患者と非大腸癌発症者を識別するための基準値を設定しておく。前記１２１ＤＭＲセットのうち表１７～２３で「＋」と記されているＤＭＲの場合には、測定されたＤＭＲの平均メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。１２１ＤＭＲセットのうち表１７～２３で「－」と記されているＤＭＲの場合には、測定されたＤＭＲの平均メチル化率が予め設定された基準値以下である場合に、ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高い、と判定する。
　各ＤＭＲの平均メチル化率の基準値は、大腸癌発症者群と非大腸癌患者群の当該ＤＭＲの平均メチル化率を測定し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。具体的には、ＤＭＲの平均メチル化率の基準値は、一般的な統計学的手法によって求められる。
　前記９３ＣｐＧセット等のＣｐＧサイトのメチル化率をマーカーとする場合には、本発明に係る判定方法は、前記判定工程を、前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被験者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定することができる。当該多変量判別式は、前記配列番号１～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む。
　前記１２１ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率をマーカーとする場合には、本発明に係る判定方法は、前記判定工程を、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたＤＭＲの平均メチル化率と、予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被験者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定することができる。当該多変量判別式は、前記１２１ＤＭＲセット中のＣｐＧサイトのうち１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む。
　本発明において用いられる多変量判別式は、２群を判別するために用いられる一般的な手法により求めることができる。当該多変量判別式としては、例えば、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの多変量判別式は、例えば、大腸癌患者群と非大腸癌発症者群について、前記配列番号１～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所又は２か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、得られたメチル化率を変数として、常法により作成することができる。また、大腸癌発症者群と非大腸癌患者群について、前記１２１ＤＭＲセット中のＤＭＲのうち１か所又は２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を測定し、得られたメチル化率を変数として、常法により作成することができる。
　本発明において用いられる多変量判別式には、予め、大腸癌患者と非大腸癌発症者を識別するための基準判別値を設定しておく。基準判別値は、大腸癌患者群と非大腸癌発症者群について、使用する多変量判別式の値である判別値を求め、大腸癌患者群の判別値と非大腸癌発症者群の判別値とを比較し、両群を区別することができる閾値として実験的に求めることができる。
　多変量判別式を用いて判定を行う場合、具体的には、前記測定工程において、使用する多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率を測定し、前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、この判別値と予め設定した基準判別値とに基づいて、ＣｐＧサイトのメチル化率又はＤＭＲの平均メチル化率が測定されたヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性の高低を判定する。当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、当該ヒト被検者が、孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する。
　本発明において用いられる多変量判別式としては、前記３３ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む式が好ましく、前記３３ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記３３ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２～１０か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記３３ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２～５か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましい。
　本発明において用いられる多変量判別式としては、前記６ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む式が好ましく、前記６ＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記６ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２～６か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記６ＣｐＧサイトからなる群より任意に選択される２～５か所のＣｐＧサイトのメチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましい。
　前記３３ＣｐＧセット及び前記６ＣｐＧセットを構成するＣｐＧサイトは、これらのセットから任意で２～１０個（６ＣｐＧセットの場合、２～６個）、好ましくは２～５個のＣｐＧサイトを選択し、この選択されたＣｐＧサイトのみを用いた場合でも、充分な感度及び特異度で、孤発性大腸癌の発症可能性を判定することができる。例えば、後記実施例２に示す通り、前記３３ＣｐＧセットのうち、配列番号５７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト、配列番号６３で表される塩基配列中のＣｐＧサイト、及び配列番号７７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトの３個のＣｐＧサイトをマーカーとして用い、これらの３個のＣｐＧサイトのメチル化率を変数としてロジスティック回帰により作成された多変量判別式を用いた場合には、感度約９５％、特異度約９６％で孤発性大腸癌の発症可能性を判定することができる。臨床検査等において、メチル化率を測定するＣｐＧサイトの数が多いと、労力とコストが過大となるおそれがある。マーカーとするＣｐＧサイトを前記３３ＣｐＧセット及び前記６ＣｐＧセットを構成するＣｐＧサイトから選抜することにより、１又は２～１０個という、臨床検査において測定可能な妥当な数のＣｐＧサイトで、精度よく孤発性大腸癌の発症可能性を判定することができる。
　本発明において用いられる多変量判別式としては、前記１２１ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む式が好ましく、前記１２１ＤＭＲセットからなる群より選択される２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記１２１ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される３か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記１２１ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される４か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましく、前記１２１ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される５か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式が特に好ましい。中でも、前記５２ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む式が好ましく、前記５２ＤＭＲセットからなる群より選択される２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記５２ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される２～１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記５２ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される３～１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましく、前記５２ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される５～１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式が特に好ましい。より好ましくは、前記１５ＤＭＲセットからなる群より選択される１か所以上のＤＭＲの平均メチル化率を変数として含む式が好ましく、前記１５ＤＭＲセットからなる群より選択される２か所以上のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がより好ましく、前記１５ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される２～１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がさらに好ましく、前記１５ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される３～１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式がよりさらに好ましく、前記１５ＤＭＲセットからなる群より任意に選択される５～１０か所のＤＭＲの平均メチル化率のみを変数として含む式が特に好ましい。
　本発明に係る判定方法に供される生体試料は、ヒト被検者から採取された生体試料であって、当該被検者のゲノムＤＮＡが含まれているものであれば特に限定されるものではなく、血液、血漿、血清、涙液、唾液等であってもよく、消化管粘膜や、肝臓等のその他の組織から採取された組織片であってもよい。本発明に係る判定方法に供される生体試料としては、大腸の状態をより強く反映していることから、大腸粘膜であることが好ましく、比較的低侵襲に採取可能であることから直腸粘膜であることがより好ましい。前記血液などの体液、前記組織片、大腸粘膜又は直腸粘膜から生体試料を採取する場合、それぞれの生体試料に応じた採取具を用いて採取すればよい。
　また、当該生体試料は、ＤＮＡが抽出可能な状態であればよく、各種前処理が施されているものであってもよい。例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織であってもよい。生体試料からのＤＮＡの抽出は常法により行うことができ、各種市販のＤＮＡ抽出・精製キットを使用することもできる。
　ＣｐＧサイトのメチル化率を測定する方法としては、特定のＣｐＧサイトについてメチル化シトシン塩基とメチル化されていないシトシン塩基を区別して定量可能な方法であれば、特に限定されるものではない。当該技術分野において公知の方法をそのまま又は必要に応じて適宜改変することによりＣｐＧサイトのメチル化率を測定できる。ＣｐＧサイトのメチル化率の測定方法としては、例えば、バイサルファイトシーケンス法、ＣＯＢＲＡ（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）法、ｑＡＭＰ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）法等が挙げられる。その他、ＭＩＡＭ（Ｉ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ－ｂａｓｅｄ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒｓ）法を用いて行ってもよい。
＜大腸粘膜採取用キット＞

　本発明に係る大腸粘膜採取用キットは、直腸粘膜を挟んで採取するための採取具と、肛門を拡張し、当該採取具を肛門から大腸粘膜表面へ到達させるための採取補助具とを備える。以下、図１～３を参照しながら、本発明に係る大腸粘膜採取用キットについて説明する。
　図１（Ａ）～図１（Ｃ）は大腸粘膜採取用キット１の採取具２の一実施態様の説明図である。図１（Ａ）は、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが加力されていない状態の正面図であり、図１（Ｂ）は、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが加力されていない状態の平面図であり、図１（Ｃ）は、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが加力されていない状態の斜視図である。図１に示すように、採取具２は、一対の弾性板状体である第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂとからなる。第１の挟持片３ａは、挟持部３１ａと把持部３２ａとバネ部３３ａと固定部３４ａとから構成されており、第２の挟持片３ｂは、挟持部３１ｂと把持部３２ｂとバネ部３３ｂと固定部３４ｂとから構成されている。第１の挟持片３ａ及び第２の挟持片３ｂの形状は、板状の他、棒状であってもよく、直腸粘膜を挟んで採取するための一定の長さを有するように形成されていれば形状にこだわらない。また、素材も弾性体であれば特に限定されるものではなく、ステンレス等の金属であってもよく、樹脂であってもよい。採取具２としては、加力状態で第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの重なりが安定し、大腸粘膜の採取がより容易であることから、金属であることが好ましい。
　第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂは、固定部３４ａと固定部３４ｂにおいて、互いに対向した状態で連結固定されている。連結固定する方法は特に限定されるものではなく、例えば、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂが互いに重なるように、固定部３４ａと固定部３４ｂの端部を溶接することにより、両者を連結固定することができる。
　固定部３４ａと固定部３４ｂの長さは、特に限定されるものではないが、２０～５０ｍｍが好ましく、３０～４０ｍｍがより好ましい。固定部の長さが前記範囲内であることにより、両挟持片の連結固着が容易であり、かつ加力に対する充分な強度を付与できる。
　第１の挟持片３ａには、把持部３２ａと固定部３４ａとの間に、弾性を備えるバネ部３３ａが設けられている。第２の挟持片３ｂには、把持部３２ｂと固定部３４ｂとの間に、弾性を備えるバネ部３３ｂが設けられている。バネ部３３ａとバネ部３３ｂにより、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂを互いに接近するように加力した場合に、挟持部３１ａの端部と挟持部３１ｂの端部を接着させることができる。
　バネ部３３ａとバネ部３３ｂの長さは、特に限定されるものではないが、２～１０ｍｍが好ましく、３～７ｍｍがより好ましい。バネ部の長さが前記範囲内であることにより、両挟持片へ充分な弾性を容易に付与できる。
　第１の挟持片３ａにおいて、挟持部３１ａとバネ部３３ａの間が把持部３２ａであり、第２の挟持片３ｂにおいて、挟持部３１ｂとバネ部３３ｂの間が把持部３２ｂである。把持部３２ａの把持部３２ｂと対抗する面と、把持部３２ｂの把持部３２ａと対抗する面の裏面（大腸粘膜の採取者が把持する面）には、ヒト（大腸粘膜の採取者）が把持した際に滑りにくいよう、滑り止め加工がなされていてもよい。滑り止め加工としては、特に限定されないが、例えば、金属状の把持部に別途樹脂状の滑り止め部を貼付してもよく、把持部をギザギザ模様、楔状模様、又は紙ヤスリのヤスリ部のようなザラザラ模様等を施すことが挙げられる。滑り止め加工としては、図１（Ａ）に示すように、ギザギザ模様となるように、突起部や窪み部を幅方向にむかって略平行に複数設ける加工が好ましい。
　把持部３２ａと把持部３２ｂの長さは、２０～５０ｍｍが好ましく、３０～４０ｍｍがより好ましい。把持部の長さが前記範囲内であることにより、把持や両挟持片への加力がより容易になる。
　第１の挟持片３ａは、挟持部３１ａのうち第２の挟持片３ｂと対向する面の端部に、大腸粘膜を挟持する挟持面３５ａが形成されている。第２の挟持片３ｂは、挟持部３１ｂのうち第１の挟持片３ａと対向する面の端部に、大腸粘膜を挟持する挟持面３５ｂが形成されている。挟持面３５ａと挟持面３５ｂは、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂに加力して挟持部３１ａの端部と挟持部３１ｂの端部が接着させた状態で、挟持面３５ａと挟持面３５ｂが少なくとも辺縁部において互いに密着するように設ける。
　第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂへの加力により、両者は互いに近接する。このため、採取具２の挟持面３５ａと挟持面３５ｂを大腸粘膜に接触させた状態で、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂに加力することによって、挟持面３５ａと挟持面３５ｂにより大腸粘膜を挟持することができる。より詳細には、挟持面３５ａの辺縁部と挟持面３５ｂの辺縁部が大腸粘膜を挟んだ状態で接する。この状態で採取具２を大腸粘膜から離すことにより、挟持面３５ａと挟持面３５ｂに挟持された大腸粘膜が引きちぎられて採取される。
　大腸粘膜を比較的組織の破損が少ない状態で採取するために、挟持面３５ａと挟持面３５ｂの少なくとも一方には窪み部が設けられていることが好ましい。両者の少なくとも一方がカップ形状の場合であるため、挟持面３５ａの辺縁部と挟持面３５ｂの辺縁部が接した場合に、内部に空間が形成される。挟持面３５ａと挟持面３５ｂに挟持された大腸粘膜のうち、当該空間内に収容された部分は、大腸粘膜を引きちぎる際に負荷があまりかからず、よって組織の破壊を抑制できる。窪み部の形状は特に限定されるものではなく、例えば、カップ形状（半球状）にすることができる。大腸粘膜の採取がより容易であり、かつ組織の破壊を抑制できることから、挟持面３５ａと挟持面３５ｂの両方に窪み部が形成されていることがより好ましい。
　挟持面３５ａと挟持面３５ｂに窪み部が形成されている場合、窪み部の内径は、必要な量の大腸粘膜が採取できる大きさに設定すればよい。本発明に係る判定方法に供される大腸粘膜の場合、少量の粘膜が採取できれば十分である。例えば、挟持面３５ａと挟持面３５ｂの窪み部の内径を、１～５ｍｍ、好ましくは２～３ｍｍとすることにより、大腸粘膜を過度に傷つけることなく、充分量の大腸粘膜を採取することができる。
　挟持面３５ａの辺縁部と挟持面３５ｂの辺縁部は、互いに密接することが可能であればよく、平坦であってもよく、鋸歯状であってもよい。鋸歯状の場合には、挟持面３５ａの辺縁部と挟持面３５ｂの辺縁部により挟持することによって比較的弱い力で大腸粘膜を切断し採取することができる。
　第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの幅は、把持しやすいように、把持部から固定部までの部分の幅は、５～１５ｍｍが好ましく、６～１０ｍｍがより好ましい。一方で、第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂのうち挟持部の幅は、より小さい力で大腸粘膜を採取できることから、挟持面が設けられている端部に向かって細くなっていることが好ましい。第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの端部の幅は、前述の窪み部よりも大きくなるようにしつつ、例えば、２～６ｍｍ、好ましくは３～４ｍｍとすることができる。
　挟持部３１ａと挟持部３１ｂの長さは、２０～６０ｍｍが好ましく、３０～５０ｍｍがより好ましい。挟持部の長さが前記範囲内であることにより、採取補助具１１のスリット１３を貫通した状態での粘膜採取がより容易になる。
　図２は、採取補助具１１の一実施態様の説明図である。図２（Ａ）は採取補助具１１の上側からみた斜視図であり、図２（Ｂ）は下側からみた斜視図である。また、図２（Ｃ）～図２（Ｇ）は、それぞれ、採取補助具１１の正面図、平面図、底面図、左側面図、及び右側面図である。図２に示すように、採取補助具１１は、採取具導入部１２と、スリット１３と、把持部１４と、を有する。
　採取具導入部１２は、側壁にスリット１３を有する円錐台形状の部材である。採取具導入部１２は、外径が小さい先端辺縁部１５から肛門に挿入し、外径が大きい手元辺縁部１６から採取具２を挿入する。採取具導入部１２は、回転軸方向に貫通孔を有していてもよい。肛門への挿入のしやすさの点から、手元辺縁部１６の外径は３０～７０ｍｍが好ましく、４０～６０ｍｍがより好ましい。また、採取具２の大腸粘膜表面への導入しやすさの点から、先端辺縁部１５の外径は１０～３０ｍｍが好ましく、１５～２５ｍｍがより好ましい。同様に、採取具導入部１２の回転軸方向の長さは５０～１５０ｍｍが好ましく、７０～１３０ｍｍがより好ましく、８０～１２０ｍｍがさらに好ましい。
　スリット１３は、採取具導入部１２の先端辺縁部１５から手元辺縁部１６に向かって設けられている。採取具導入部１２の側壁の一部分に先端辺縁部１５に達するスリット１３があることにより、腸管内における採取具２の先端部の動きの自由度が高まり、内部構造が複雑な直腸内において、大腸粘膜をより容易に採取することができる。スリット１３は、採取具導入部１２のいずれの位置に設定されていてもよい。例えば、スリット１３は、図２（Ｂ）に示すように、把持部１４に近い側にあることが好ましい。また、採取具導入部１２に設けられるスリット１３の数は、１つであってもよく、２以上であってもよい。
　スリット１３を貫通して採取具２は大腸粘膜表面に達するため、スリット１３の幅は、挟持面３５ａと挟持面３５ｂが接した状態における、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの端部の幅よりも広く設計される。例えば、挟持面３５ａと挟持面３５ｂとが接した状態における、採取具２の第１の挟持片３ａと第２の挟持片３ｂの端部の幅Ｌ１が２～５ｍｍの場合、スリット１３の先端辺縁部１５側の幅Ｌ２は７～２５ｍｍが好ましく、１５～２０ｍｍが好ましい。また、スリット１３の幅は、一定であってもよく、いずれかの方向に向けて狭くなっていてもよい。なお、スリットは、採取具導入部１２の壁面に２以上形成されていてもよい。
　把持部１４は、その一端が、採取具導入部１２の手元辺縁部１６近傍に、採取具導入部１２から遠ざかる方向に連結している。把持部１４は、下方が開口した中空の棒状であって、リブで補強されているものであってもよい。把持部１４の長さは、手による握りやすさ等から、５０～１５０ｍｍが好ましく、７０～１３０ｍｍがより好ましい。また、手による握りやすさ等から、把持部１４の幅は、５～２０ｍｍが好ましく、８～１３ｍｍがより好ましく、把持部１４の厚みは、１０～３０ｍｍが好ましく、１５～２５ｍｍがより好ましい。把持部１４の形状は、握りやすい形状であればどのような形状であってもよく、例えば、板状であってもよく、棒状であってもよく、その他の形状であってもよい。
　把持部１４は、採取具導入部１２の手元辺縁部１６近傍において、採取具導入部１２の円錐台形状の中心軸に対して、垂直に連結されていてもよいが、より大腸粘膜への採取具２の到達が容易になるため、採取具導入部１２の回転軸方向と採取具導入部１２の中心軸方向の角度θ１（図２（Ｃ）参照。）が９０°超、１２０°以下が好ましく、９５～１１０°がより好ましく、９５～１０５°がさらに好ましい。
　図３は、本発明に係る大腸粘膜採取用キット１の使用の態様を示す説明図である。まず、大腸粘膜を採取される被検者の肛門に、採取補助具１１を先端辺縁部１５から挿入する。把持部１４を片手で持ち安定させた状態で、手元辺縁部１６側の開口部から採取具２を導入する。導入された採取具２は、先端部からスリット１３を貫通して大腸粘膜表面に達する。採取具２の挟持面３５ａと挟持面３５ｂとで大腸粘膜を挟持した状態で、採取具２をスリット１３から引き出すことにより、大腸粘膜が採取できる。
　次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］

　健常者８名（男性５名、女性３名）と、内視鏡検査での生検組織による病理診断により、潰瘍性大腸炎等の他の大腸の炎症性疾患は発症していないが、孤発性大腸癌と診断された大腸癌患者６名（男性３名、女性３名）とから採取された大腸粘膜中のＤＮＡに対して、ＣｐＧサイトのメチル化率を網羅的に解析した。
＜ＣｐＧサイトのメチル化レベルの網羅的解析＞
（１）生検及びＤＮＡ抽出

　同一被検者の大腸３か所から粘膜組織を採取し、－８０℃で冷凍保存した。採取部位は、大腸癌患者は盲腸、横行結腸、直腸、及び癌部とし、健常者は盲腸、横行結腸、及び直腸とした。採取した組織を細断し、QIAmp DNA kit（Qiagen社製）を使用してＤＮＡを抽出した。
（２）ＤＮＡサンプルの品質評価

　得られたＤＮＡの濃度は次のようにして求めた。すなわち、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Life Technologies社製）を用いて各サンプルの蛍光強度を測定し、キット付属のλ－ＤＮＡの検量線を用いて濃度を算出した。
　次に、各サンプルをＴＥ（ｐＨ８．０）にて１ｎｇ／μＬに希釈し、Illumina FFPE QC Kit（Illumina社製）及びFast SYBR Green Master Mix（Life Technologies社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を求めた。サンプルとポジティブコントロールとのＣｔ値の差（以下、ΔＣｔ値）をサンプルごとに算出し、品質を評価した。ΔＣｔ値が５未満のサンプルは品質良好と判断し、以降のステップに進めた。
（３）バイサルファイト処理

　EZ DNA Methylation Kit（ZYMO RESEARCH社製）を使用して、ＤＮＡサンプルに対してバイサルファイト処理を実施した。その後、Infinium HD FFPE Restore Kit（Illumina社製）を使用して、分解ＤＮＡを修復した。
（４）全ゲノム増幅

　ＤＮＡをアルカリ変性した後、中和させ、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit（Illumina社製）の全ゲノム増幅用の酵素とプライマーを添加し、３７℃のIncubation Oven（Illumina社製）で２０時間以上、等温で反応させることによって、全ゲノムを増幅させた。
（５）全ゲノム増幅したＤＮＡの断片化と精製

　全ゲノム増幅したＤＮＡに、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit（Illumina社製）の断片化用の酵素を添加し、Microsample Incubator（SciGene）で３７℃、１時間反応させた。断片化したＤＮＡに、共沈剤と２－プロパノールを加えて遠心分離処理し、ＤＮＡを沈澱させた。
（６）ハイブリダイゼーション

　沈澱させたＤＮＡに、Hybridization bufferを加え、４８℃のHybridization Oven（Illumina社製）で１時間反応させ、ＤＮＡを溶解させた。溶解させたＤＮＡを９５℃のMicrosample Incubator（SciGene社製）で２０分間インキュベートして１本鎖に変性させた後、HumanMethylation450 DNA Analysis Kit（Illumina社製）のBeadChip上に分注した。４８℃のHybridization Ovenで１６時間以上反応させ、BeadChip上のプローブと１本鎖ＤＮＡをハイブリダイズした。
（７）標識反応及びスキャニング

　ハイブリダイゼーション後のBeadChip上のプローブを伸長反応させ、蛍光色素を結合させた。次いで、当該BeadChipをiSCANシステム（Illumina社製）でスキャンし、メチル化蛍光強度及び非メチル化蛍光強度を測定した。実験終了時に、スキャンデータが全て揃っていること、及びスキャンが正常に行われたことを確認した。
（８）ＤＮＡメチル化レベルの定量及び比較解析

　ＤＮＡメチル化解析ソフトウェアGenomeStudio（Version：V2011.1）を用いてスキャンデータを解析した。ＤＮＡメチル化レベル（β値）は、次の式により算出した。
［β値］＝
　［メチル化蛍光強度］÷ (［メチル化蛍光強度］＋［非メチル化蛍光強度］＋100)
　メチル化レベルが高い場合、β値は１に近づき、メチル化レベルが低い場合、β値は０に近づく。健常者直腸サンプル群（ｎ＝８）に対する大腸癌患者直腸サンプル群（ｎ＝６）のＤＮＡメチル化レベルの比較解析には、GenomeStudioにより算出されるDiffScoreを用いた。両者のＤＮＡメチル化レベルが近い場合、DiffScoreは０に近づき、大腸癌患者でのレベルが高い場合は正の値を示し、低い場合は負の値を示す。両群のメチル化レベルの差異が大きいほど、DiffScoreの絶対値は大きくなる。また、大腸癌患者直腸サンプル群（ｎ＝６）の平均β値から健常者直腸サンプル群（ｎ＝８）の平均β値を差し引いた値（Δβ値）も比較解析に用いた。
　なお、ＤＮＡメチル化定量とＤＮＡメチル化レベル比較解析には、GenomeStudioとソフトウェアMethylation Module（Version:1.9.0）を用いた。GenomeStudioの設定条件は、下記の通りである。
ＤＮＡメチル化定量；
　Normalization：　有り（Ｃｏｎｔｒｏｌｓ）
　Subtract Background：　有り
　Content Descriptor：　　　 HumanMethylation450_15017482_v.1.2.bpm
ＤＮＡメチル化レベル比較解析；
　Normalization：　有り(Controls)
　Subtract Background：　有り
　Content Descriptor：　HumanMethylation450_15017482_v.1.2.bpm
　Ref Group：　比較解析4. Group-3
　Error Model：　Illumina custom
　Compute False Discovery Rate：　無し
（９）多変量解析

　ＤＮＡメチル化レベルの定量及び比較解析の結果を用いて、統計解析ソフトウェアＲ（Version: 3.0.1、64bit、Windows（登録商標））を用いて、DiffScoreの算出、クラスター解析及び主成分分析を実施した。
クラスター解析のＲスクリプト：

> data.dist<-as.dist(1-cor(data.frame,use="pairwise.complete.obs",method="p"))> hclust(data.dist,method="complete")
　　　 # data.frame: CpG（行）x サンプル（列）から成るデータフレーム
　　　# 1-ピアソン相関係数を距離として定義し、complete linkage法により実施
主成分分析のＲスクリプト：

> prcomp(t(data.frame),scale=T)
# data.frame: CpG（行）x サンプル（列）から成るデータフレーム
＜ＣｐＧバイオマーカーの選択＞
（１）ＣｐＧバイオマーカー候補の抽出

　網羅的ＤＮＡメチル化解析データからＣｐＧバイオマーカー候補を選定する手段として、DiffScore及びΔβ値に基づいた絞り込みが報告されている（BMC Med genomics vol.4, p.50, 2011; Sex Dev vol.5, p.70, 2011）。前者の報告ではDiffScoreの絶対値が３０超、及びΔβ値の絶対値が０．２超に設定し、後者の報告ではDiffScoreの絶対値が３０超、及びΔβ値の絶対値が０．３超に設定して、バイオマーカー候補を抽出している。これらの方法に準じて、BeadChipに搭載されている４８５，５７７個のＣｐＧサイトからバイオマーカー候補を抽出した。
　具体的には、まず、４８５，５７７個のＣｐＧサイトから、DiffScoreの絶対値が３０超かつΔβ値の絶対値が０．３超である５４個のＣｐＧサイトを抽出した。以下、この５４個のＣｐＧサイトをまとめて「５４ＣｐＧセット」という。さらに、孤発性大腸癌を発症した癌患者を取りこぼしなく判別することを目的に、癌患者サンプル内でＤＮＡメチル化レベルの変動が少ないものを絞り込んだ。すなわち、癌患者２３サンプル（４部位×各部位６又は７サンプル）のβ値の不偏分散ｖａｒを求め、不偏分散ｖａｒの値が０．０２より小さい８個のＣｐＧサイトを絞り込んだ。以下、この８個のＣｐＧサイトをまとめて「８ＣｐＧセット」という。
　５４ＣｐＧセットの各ＣｐＧサイトの結果を表２４及び２５に示す。表中、「８ＣｐＧ」欄に＃があるＣｐＧサイトは８ＣｐＧセットに含まれるものを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
（２）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析

　前記５４ＣｐＧセット又は８ＣｐＧセットを用いて、全２３サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行ったところ、図４及び５に示すように、いずれのＣｐＧセットでも、クラスター解析では、全ての大腸癌患者サンプルが同一クラスター（図中、枠内）に集積した。また、図６及び７に示すように、主成分分析（縦軸は第２主成分）では、大腸癌患者サンプル（黒丸は非癌部から採取したサンプル、黒四角は癌部から採取したサンプル）と健常者（非癌）サンプル（黒三角）が第１主成分（横軸）方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、いずれのＣｐＧセットでも、大腸癌患者サンプルと健常者サンプルを明確に区別することができた。これらの結果から、表２４及び２５に記載の５４ＣｐＧは、ヒト被検者における孤発性大腸癌の発症のバイオマーカーとして極めて有用であり、これらを用いることにより、ヒト被検者の孤発性大腸癌の発症の有無、特に大腸疾患の自覚症状のないヒト被検者の孤発性大腸癌の発症の有無を高い感度と特異度によって判定できることが明らかである。
［実施例２］

　健常者２８名と、内視鏡検査での生検組織による病理診断により、潰瘍性大腸炎等の他の大腸の炎症性疾患は発症していないが、孤発性大腸癌と診断された大腸癌患者２０名とから採取された直腸粘膜中のＤＮＡに対して、ＣｐＧサイトのメチル化率を網羅的に解析した。
　ＣｐＧサイトのメチル化率の解析に供したＤＮＡは、各被験者の直腸の粘膜組織から実施例１と同様にしてＤＮＡを抽出し、全ゲノム増幅し、ＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化レベルの定量及び比較解析を行い、その結果を用いてDiffScoreの算出、クラスター解析及び主成分分析を実施した。なお、BeadChipはInfinium Methylation EPIC BeadChip（Illumina社製）を使用した。また、GenomeStudioの設定条件は、「Content Descriptor」を「MethylationEPIC_v-1-0_B2.bpm」とした以外は、実施例１と同一の条件とした。
（１）ＣｐＧバイオマーカー候補の抽出

　次いで、網羅的ＤＮＡメチル化解析データからＣｐＧバイオマーカー候補を抽出した。　具体的には、まず、８６６，８９５個のＣｐＧサイトから、Δβ値の絶対値が０．１５超である１４２個のＣｐＧサイトを抽出した。
　次に、下記の２種類のロジスティック回帰モデルを作成した。［モデル１］１４２個のＣｐＧサイトから選んだ２個のＣｐＧの全ての組み合わせに基づく、１０，０１１個のロジスティック回帰モデル。
［モデル２］１４２個のＣｐＧサイトから選んだ３個のＣｐＧの全ての組み合わせに基づく、４６７，１８０個のロジスティック回帰モデル。
　両ロジスティック回帰モデルの判別式について、下記の２つの基準について、それぞれ充足するＣｐＧサイトを選定した。また、［モデル２］については、出現するＣｐＧサイトの頻度も算出し、頻度が３以上のものを選定した。
［基準１］感度が９０％超、特異度が９０％超、判別式の係数ｐ値が０．０５未満、かつＡＩＣ（赤池の情報量基準）が３０未満。［基準２］感度が９５％超、特異度が８５％超、判別式の係数ｐ値が０．０５未満、かつＡＩＣ（赤池の情報量基準）が３０未満。
　２つの基準のそれぞれについて、判別式に出現するＣｐＧサイトを選択したところ、表１３～１５に記載の３３個のＣｐＧサイト（３３ＣｐＧセット）が選抜された。各ＣｐＧサイトの結果を表２６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
（２）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析

　前記３３ＣｐＧセットのメチル化レベルに基づき、全４８サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析（図８）では、大腸癌患者サンプルの殆どが同一クラスター（図中、枠内）に集積した。また、主成分分析（図９、縦軸は第２主成分）では、大腸癌患者サンプル（●）と健常者サンプル（▲）が第１主成分（横軸）方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、３３ＣｐＧセットを用いて大腸癌患者２０サンプルと健常者２８サンプルを明確に区別することができた。
（３）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの孤発性大腸癌の発症可能性の評価

　前記３３ＣｐＧセットのうち、配列番号５７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ０１１０５４０３）、配列番号６３で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ０６８２９６８６）、及び配列番号７７で表される塩基配列中のＣｐＧサイト（ｃｇ１４６２９３９７）の３個のＣｐＧサイトのメチル化率をマーカーとした場合の、孤発性大腸癌発症の有無の判定の精度を調べた。
　具体的には、２０名の孤発性大腸癌と診断された大腸癌患者及び２８名の健常者の直腸から採取された検体の前記３つのＣｐＧサイトのメチル化レベルの数値（β値）を用いてロジスティック回帰モデルに基づく判別式を作成して大腸癌患者と健常者の判別を行った。この結果、感度（大腸癌患者の中で、陽性と評価された割合）が９５．０％、特異度（健常者の中で、陰性と評価された割合）が９６．４％、陽性的中率（陽性と評価された中で、大腸癌患者の割合）が９５．０％、陰性的中率（陰性と評価された中で、健常者の割合）が９６．４％であり、いずれも９０％以上と高かった。また、図１０にＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線を示す。ＡＵＣ（ＲＯＣ曲線下面積）は０．９８９であった。これらの結果から、前記３３ＣｐＧセットから選択された２～５個のＣｐＧサイトのメチル化率に基づいて、高感度かつ高特異度で、孤発性大腸癌発症の可能性を評価できることが確認された。
［実施例３］

　実施例１及び実施例２において求めた直腸粘膜サンプルのＤＮＡメチル化レベル（β値）から、ＣｐＧバイオマーカー候補を抽出した。
（１）ＣｐＧバイオマーカー候補の抽出

　具体的には、まず、８６６，８９５個のＣｐＧサイトから、孤発性大腸癌と診断された大腸癌患者２６サンプル及び健常者３６サンプルのΔβの絶対値が０．１５超である４２個のＣｐＧサイトを抽出した。
　次に、下記の２種類のロジスティック回帰モデルを作成した。［モデル１］４２個のＣｐＧサイトから選んだ２個のＣｐＧの全ての組み合わせに基づく、８６１個のロジスティック回帰モデル。
［モデル２］４２個のＣｐＧサイトから選んだ３個のＣｐＧの全ての組み合わせに基づく、１１，４８０個のロジスティック回帰モデル。
　両ロジスティック回帰モデルの判別式について、下記の２つの基準について、それぞれ充足するＣｐＧサイトを選定した。［基準１］感度が９０％超、特異度が９０％超、判別式の係数ｐ値が０．０５未満、かつＡＩＣ（赤池の情報量基準）が３０未満。
［基準２］感度が９５％超、特異度が８５％超、判別式の係数ｐ値が０．０５未満、かつＡＩＣ（赤池の情報量基準）が３０未満。
　２つの基準のそれぞれについて、判別式に出現するＣｐＧサイトを選択した。選択されたＣｐＧサイトから実施例２で選抜されたＣｐＧを除くと、表１６に記載の６個のＣｐＧサイト（６ＣｐＧセット）が選抜された。各ＣｐＧサイトの結果を表２７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
（２）ＣｐＧバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析

　前記６ＣｐＧセットのメチル化レベルに基づき、全６２サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析（図１１）では、大腸癌患者サンプルの多くは数個のクラスター（図中、枠内）に集積した。また、主成分分析（図１２、縦軸は第２主成分）では、大腸癌患者サンプル（●）と健常者サンプル（▲）は、第１主成分（横軸）方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。すなわち、主成分分析では６ＣｐＧセットを用いて大腸癌患者２０サンプルと健常者２８サンプルを明確に区別することができた。
［実施例４］

　実施例２において取得した大腸癌患者２０名及び健常者２８名の直腸から採取した検体の各ＤＭＲの平均メチル化率（平均β値；各ＤＭＲ中に存在するＣｐＧサイトのメチル化レベル（β値）の相加平均値）から、ＤＭＲバイオマーカー候補を抽出した。
（１）ＤＭＲバイオマーカー候補の抽出

　具体的には、まず、８６６，８９５個のＣｐＧサイトのメチル化データ（ＩＤＡＴ形式）を、ＣｈＡＭＰパイプライン（Bioinformatics、30、428、2014；http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ChAMP.html）に入力し、大腸癌患者と健常者の２群間で有意と判定されたＤＭＲ４，２３２か所を抽出した。この中でΔβ値（［平均β値（癌直腸）］－［平均β値（非癌直腸）］）の絶対値が０．０５超である１２１か所（ＤＭＲ番号１～１２１）をＤＭＲバイオマーカー候補とした。この１２１か所のＤＭＲ（１２１ＤＭＲセット）の結果を表２８～３１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　次に、Ｒソフトウェアのｇｌｍ関数を用いて前記１２１ＤＭＲセットから選んだ３か所のＤＭＲ全ての組み合わせに基づく２８７，９８０個のロジスティック回帰モデルを作成した。得られた判別式について、感度が９５％より大きく、かつ、４個の係数のうちｐ値が０．０５より小さいものが３個以上である判別式４７個を選択したところ、この中に出現するＤＭＲは５２か所であった（表中、５２ＤＭＲ）。さらに、判別式４７個に出現するＤＭＲの頻度を求めたところ、３回以上出現するものは１５か所であった（表中、１５ＤＭＲ）。
（２）ＤＭＲバイオマーカー候補を用いた臨床サンプルの多変量解析

　前記１２１ＤＭＲセットのメチル化率に基づき、実施例２の全４８サンプルのクラスター解析及び主成分分析を行った。この結果、クラスター解析では、大多数の大腸癌患者サンプルが同一クラスター（図１３中、枠内）に集積した。また、主成分分析（図１４）では、大腸癌患者サンプル（●）と健常者サンプル（▲）が第１主成分方向にそれぞれ独立のクラスターを形成した。
（３）ＤＭＲバイオマーカー候補を用いて臨床サンプルの孤発性大腸癌発症可能性の評価　前記１２１ＤＭＲセットのうち、ＤＭＲ番号１１、２４、及び４２の領域のメチル化率をマーカーとした場合の、孤発性大腸癌発症の有無の判定の精度を調べた。
　具体的には、２０名の大腸癌患者及び２８名の健常者の直腸から採取された検体の前記３か所のＤＭＲのメチル化レベルの数値（β値）を用いてロジスティック回帰モデルに基づく判別式を作成して大腸癌患者と健常者の判別を行った。この結果、感度（大腸癌患者のうち、陽性と評価された患者の割合）が１００％、特異度（健常者のうち、陰性と評価された者の割合）が９２．９％、陽性的中率（陽性と評価された者のうち、大腸癌患者の割合）が９０．９％、陰性的中率（陰性と評価された者のうち、健常者の割合）が１００％であり、いずれも９０％以上と高かった。また、図１５にＲＯＣ曲線を示す。この結果、ＡＵＣ（ＲＯＣ曲線下面積）は０．９６８であった。これらの結果から、前記１２１ＤＭＲセットから選択された数か所のＤＭＲの平均メチル化率に基づいて、高感度かつ高特異度で、孤発性大腸癌発症の可能性を評価できることが確認された。
１…大腸粘膜採取用キット、２…採取具、３ａ…第１の挟持片、３ｂ…第２の挟持片、３１、３１ａ、３１ｂ…挟持部、３２、３２ａ、３２ｂ…把持部、３３、３３ａ、３３ｂ…バネ部、３４、３４ａ、３４ｂ…固定部、３５、３５ａ、３５ｂ…挟持面、１１…採取補助具、１２…採取具導入部、１３…スリット、１４…把持部、１５…先端辺縁部、１６…手元辺縁部。

Claims (29)


  1. 　孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
    　ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、表１～７に記載のメチル化可変領域番号１～１２１で表される各メチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
    　前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
    を有し、
    　前記メチル化可変領域の平均メチル化率が、当該メチル化可変領域中のＣｐＧサイトのうち、前記測定工程においてメチル化率が測定された全てのＣｐＧサイトのメチル化率の平均値であり、
    　前記基準値が、各メチル化可変領域の平均メチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
    　前記多変量判別式が、前記メチル化可変領域番号１～１２１で表されるメチル化可変領域のうちの１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、
    孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

  2. 　前記測定工程において、メチル化可変領域番号８～１５、３５～５２、及び１１１～１２１で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、メチル化可変領域番号１～７、１６～３４、及び５３～１１０で表されるメチル化可変領域のうち１か所以上が、平均メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項１に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  3. 　前記測定工程において、前記多変量判別式がその平均メチル化率を変数として含むメチル化可変領域中に存在する１個以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
    　前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率に基づいて算出されたメチル化可変領域の平均メチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項１に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  4. 　前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１～１２１で表されるメチル化可変領域から選択される２か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  5. 　前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１～１２１で表されるメチル化可変領域から選択される３か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  6. 　前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１～５２で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  7. 　前記多変量判別式が、メチル化可変領域番号１～１５で表されるメチル化可変領域からなる群より選択される１か所以上のメチル化可変領域の平均メチル化率を変数として含む、請求項３に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  8. 　孤発性大腸癌発症可能性を判定する方法であって、
    　ヒト被検者から採取された生体試料から回収されたＤＮＡ中の、配列番号１～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する測定工程と、
    　前記測定工程において測定されたメチル化率と、予め設定された基準値又は予め設定された多変量判別式に基づいて、前記ヒト被検者の孤発性大腸癌発症の可能性を判定する判定工程
    を有し、
    　前記基準値が、各ＣｐＧサイトのメチル化率に対してそれぞれ設定された、孤発性大腸癌患者と非孤発性大腸癌患者を識別するための値であり、
    　前記多変量判別式が、前記配列番号１～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含む、
    孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  9. 　前記測定工程において、２～１０個のＣｐＧサイトのメチル化率を測定する、請求項８に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  10. 　前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７～２０、２３～２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１～４８、５０～５４、５９、６５～６８、７０～７７、７９～８６、９０、及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７～９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、４９、５５～５８、６０～６４、６９、７８、８７～８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８又は９に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  11. 　前記測定工程において、配列番号１～５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
    　前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７～２０、２３～２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１～４８、及び５０～５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７～９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８～１０のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  12. 　前記判定工程において、配列番号１、４、６、１０、１１、１３、１４、１７～２０、２３～２７、２９、３０、３２、３３、３５、３６、３９、４１～４８、及び５０～５４で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７～９、１２、１５、１６、２１、２２、２８、３１、３４、３７、３８、４０、及び４９で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８～１１のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  13. 　前記測定工程において、配列番号１～８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
    　前記判定工程において、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８～１０のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  14. 　前記判定工程において、配列番号１、４、及び６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号２、３、５、７、及び８で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が３以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８～１０、及び１３のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  15. 　前記測定工程において、配列番号５５～８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
    　前記判定工程において、配列番号５９、６５～６８、７０～７７、及び７９～８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号５５～５８、６０～６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８～１０のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  16. 　前記判定工程において、配列番号５９、６５～６８、７０～７７、及び７９～８６で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号５５～５８、６０～６４、６９、７８、及び８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８～１０、及び１５のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  17. 　前記測定工程において、配列番号８８～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
    　前記判定工程において、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以下である、又は、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち少なくとも１か所以上が、メチル化率が予め設定された基準値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８～１０のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  18. 　前記判定工程において、配列番号９０及び９１で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうち、メチル化率が予め設定された基準値以下であるＣｐＧサイトの数と、配列番号８８、８９、９２、及び９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトのうちメチル化率が予め設定された基準値以上であるＣｐＧサイトの数との和が２以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８～１０、及び１７のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  19. 　前記和が５以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項１２、１４、１６、又は１８に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  20. 　前記多変量判別式が、配列番号５５～８７で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、
    　前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
    　前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８又は９に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  21. 　前記多変量判別式が、配列番号８８～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトのメチル化率を変数として含み、
    　前記測定工程において、前記多変量判別式がそのメチル化率を変数として含むＣｐＧサイトのメチル化率を測定し、
    　前記判定工程において、前記測定工程において測定されたメチル化率と前記多変量判別式に基づいて当該多変量判別式の値である判別値を算出し、当該判別値が予め設定された基準判別値以上である場合に、前記ヒト被検者が孤発性大腸癌を発症している可能性が高いと判定する、請求項８又は９に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  22. 　前記多変量判別式が、ロジスティック回帰式、線形判別式、ナイーブベイズ分類器で作成された式、又はサポートベクターマシンで作成された式である、請求項８～２１のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。
  23. 　前記生体試料が、腸管組織である、請求項８～２２のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  24. 　前記生体試料が、直腸粘膜組織である、請求項８～２３のいずれか一項に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  25. 　前記直腸粘膜組織が、
    　採取具と、採取補助具とを備え、
    　前記採取具は、一対の板状体である第１の挟持片と第２の挟持片とからなり、
    　前記第１の挟持片と前記第２の挟持片は、それぞれ、挟持部と把持部とバネ部と固定部とから構成されており、
    　前記採取補助具は、
    　側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
    　棒状の把持部と、
    を有し、
    　前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
    　前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
    　前記スリットの幅が、前記第１の挟持片と前記第２の挟持片が挟持部側の端部同士で接着した状態の幅よりも広く、
    　前記採取具導入部の大きい方の外径が３０～７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０～１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キットによって採取されたものである、請求項２４に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  26. 　前記第１の挟持片の挟持部のうち第２の挟持片と対向する面の端部と、前記第２の挟持片の挟持部のうち第１の挟持片と対向する面の端部と、の少なくとも一方に窪み部が設けられている、請求項２５に記載の孤発性大腸癌発症可能性の判定方法。

  27. 　採取具と、採取補助具とを備える大腸粘膜採取用キットであり、
    　前記採取具は、
    　一対の板状体である第１の挟持片と第２の挟持片とからなり、
    　前記第１の挟持片と前記第２の挟持片は、それぞれ、挟持部と把持部とバネ部と固定部とから構成されており、
    　前記採取補助具は、
    　側壁にスリットを有する円錐台形状の採取具導入部と、
    　棒状の把持部と、
    を有し、
    　前記把持部の一端が、前記採取具導入部の外径が大きい方の辺縁部近傍に連結しており、
    　前記スリットは、前記採取具導入部の外径が小さい方の辺縁部から外径が大きい方の辺縁部に向かって設けられており、
    　前記スリットの幅が、前記第１の挟持片と前記第２の挟持片が挟持部側の端部同士で接着した状態の幅よりも広く、
    　前記採取具導入部の大きい方の外径が３０～７０ｍｍであり、回転軸方向の長さが５０～１５０ｍｍである、大腸粘膜採取用キット。

  28. 　前記第１の挟持片の挟持部のうち第２の挟持片と対向する面の端部と、前記第２の挟持片の挟持部のうち第１の挟持片と対向する面の端部と、の少なくとも一方に窪み部が設けられている、請求項２７に記載の大腸粘膜採取用キット。
  29. 　配列番号１～９３で表される塩基配列中のＣｐＧサイトからなる群より選択される１か所以上のＣｐＧサイトを含む部分塩基配列を有するＤＮＡ断片からなり、ヒト被検者の孤発性大腸癌発症可能性を判定するために用いられる、ＤＮＡメチル化率分析用マーカー。
PCT/JP2017/035137 2016-09-29 2017-09-28 孤発性大腸癌発症可能性の判定方法 Ceased WO2018062361A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020197008922A KR20190054086A (ko) 2016-09-29 2017-09-28 고발성 대장암 발증 가능성의 판정 방법
EP21152408.7A EP3842543A1 (en) 2016-09-29 2017-09-28 Method for determining onset risk of sporadic colon cancer
US16/333,130 US20190352721A1 (en) 2016-09-29 2017-09-28 Method for determining likelihood of sporadic colorectal cancer development
EP17856310.2A EP3521448A4 (en) 2016-09-29 2017-09-28 PROCESS FOR DETERMINING THE RISK OF APPEARANCE OF SPORADIC COLON CANCER
JP2018542835A JP7139248B2 (ja) 2016-09-29 2017-09-28 孤発性大腸癌発症可能性の判定方法
CN201780059361.5A CN109844139A (zh) 2016-09-29 2017-09-28 散发性大肠癌发病可能性的判定方法

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2016/078810 WO2018061143A1 (ja) 2016-09-29 2016-09-29 孤発性大腸癌発症可能性の判定方法
JPPCT/JP2016/078810 2016-09-29
JP2017072674 2017-03-31
JP2017-072674 2017-03-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018062361A1 true WO2018062361A1 (ja) 2018-04-05

Family

ID=61763470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/035137 Ceased WO2018062361A1 (ja) 2016-09-29 2017-09-28 孤発性大腸癌発症可能性の判定方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20190352721A1 (ja)
EP (2) EP3521448A4 (ja)
JP (1) JP7139248B2 (ja)
KR (1) KR20190054086A (ja)
CN (1) CN109844139A (ja)
WO (1) WO2018062361A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112481273A (zh) * 2020-12-29 2021-03-12 南通大学附属医院 结直肠癌抑癌基因及其启动子区高dna甲基化的验证方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11898199B2 (en) 2019-11-11 2024-02-13 Universal Diagnostics, S.A. Detection of colorectal cancer and/or advanced adenomas
KR102139314B1 (ko) * 2020-02-27 2020-07-29 이화여자대학교 산학협력단 유전자의 후성학적 메틸화 변화를 이용한 알츠하이머병 치매의 조기 진단 및 예측
WO2021172864A1 (ko) * 2020-02-27 2021-09-02 이화여자대학교 산학협력단 유전자의 후성학적 메틸화 변화를 이용한 알츠하이머병의 진단 및 예측
US12467096B2 (en) 2020-05-15 2025-11-11 Universal Diagnostics, S.A. Methods and systems for identifying methylation biomarkers
US11530453B2 (en) 2020-06-30 2022-12-20 Universal Diagnostics, S.L. Systems and methods for detection of multiple cancer types
CN116479132B (zh) * 2023-04-26 2024-09-20 上海交通大学医学院附属仁济医院 膀胱癌甲基化位点标志物及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003235799A (ja) * 2002-02-14 2003-08-26 Yukiyasu Okumura 肛門鏡
WO2005021743A1 (ja) * 2003-08-29 2005-03-10 Tanaka, Noriaki 核酸増幅用プライマー及びこれを用いた大腸癌の検査方法
JP2009119219A (ja) * 2007-11-16 2009-06-04 Momoe Kohase スライド式鑷子
JP2012090919A (ja) * 2010-10-29 2012-05-17 Shoichi Nakamura 外科手術用器具
WO2014151551A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Baylor Research Institute Ulcerative colitis (uc)-associated colorectal neoplasia markers
JP2015006164A (ja) * 2013-05-29 2015-01-15 シスメックス株式会社 大腸癌に関する情報の取得方法、ならびに大腸癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
JP2017072674A (ja) 2015-10-06 2017-04-13 セイコーエプソン株式会社 波長変換装置、照明装置およびプロジェクター

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58188011U (ja) * 1982-06-09 1983-12-14 小山　喜弘 鋭匙ピンセツト
JP5323680B2 (ja) 2006-04-17 2013-10-23 エピゲノミクス アーゲー 結腸直腸細胞増殖性疾患を検出するための方法および核酸
EP2198042B1 (en) 2007-09-17 2016-11-02 MDxHealth SA Novel markers for bladder cancer detection
EP2395114B1 (en) 2007-11-30 2013-09-11 Genomictree, Inc. Diagnosis kit and chip for bladder cancer using bladder cancer specific methylation marker gene
WO2010017301A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Veridex, Llc Prostate cancer methylation assay
EP2428584A4 (en) * 2009-04-03 2012-10-10 A & T Corp COLORECTAL TUMOR DETECTION METHOD
KR101142131B1 (ko) * 2009-11-05 2012-05-11 (주)지노믹트리 장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법
WO2012167145A2 (en) * 2011-06-01 2012-12-06 University Of Southern California Genome-scale analysis of aberrant dna methylation in colorectal cancer
EP2698436A1 (en) 2012-08-14 2014-02-19 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Colorectal cancer markers
CN120700143A (zh) 2014-03-31 2025-09-26 梅奥医学教育和研究基金会 检测结直肠赘生物

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003235799A (ja) * 2002-02-14 2003-08-26 Yukiyasu Okumura 肛門鏡
WO2005021743A1 (ja) * 2003-08-29 2005-03-10 Tanaka, Noriaki 核酸増幅用プライマー及びこれを用いた大腸癌の検査方法
JP2009119219A (ja) * 2007-11-16 2009-06-04 Momoe Kohase スライド式鑷子
JP2012090919A (ja) * 2010-10-29 2012-05-17 Shoichi Nakamura 外科手術用器具
WO2014151551A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Baylor Research Institute Ulcerative colitis (uc)-associated colorectal neoplasia markers
JP2015006164A (ja) * 2013-05-29 2015-01-15 シスメックス株式会社 大腸癌に関する情報の取得方法、ならびに大腸癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット
JP2017072674A (ja) 2015-10-06 2017-04-13 セイコーエプソン株式会社 波長変換装置、照明装置およびプロジェクター

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BMC MED GENOMICS, vol. 4, 2011, pages 50
CANCER LETTERS, vol. 345, 2014, pages 235 - 241
CANCER, vol. 9, 2015, pages 520
CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES, vol. 71, no. 18, pages 3523 - 3535
GOEL, A. ET AL.: "The CpG island methylator phenotype and chromosomal instability are inversely correlated in sporadic", GASTROENTEROLOGY, vol. 132, 2007, pages 127 - 138, XP005920669, DOI: doi:10.1053/j.gastro.2006.09.018 *
GONZALO, V. ET AL.: "Multiple sporadic colorectal cancers display a uniquemethylation phenotype", PLOS ONE, vol. 9, no. 3, e91033, 2014, XP055500745 *
KIBRIYA, M. G. ET AL.: "A genome-wide DNA methylation study in colorectal carcinoma", BMC MEDICAL GENOMICS, vol. 4, 50, 2011, pages 1 - 16, XP021104259 *
See also references of EP3521448A4
SEX DEV, vol. 5, 2011, pages 70

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112481273A (zh) * 2020-12-29 2021-03-12 南通大学附属医院 结直肠癌抑癌基因及其启动子区高dna甲基化的验证方法
CN112481273B (zh) * 2020-12-29 2023-11-24 南通大学附属医院 结直肠癌抑癌基因及其启动子区高dna甲基化的验证方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN109844139A (zh) 2019-06-04
EP3521448A9 (en) 2020-02-19
JPWO2018062361A1 (ja) 2019-07-11
KR20190054086A (ko) 2019-05-21
US20190352721A1 (en) 2019-11-21
EP3842543A1 (en) 2021-06-30
EP3521448A1 (en) 2019-08-07
JP7139248B2 (ja) 2022-09-20
EP3521448A4 (en) 2020-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7094881B2 (ja) 大腸癌発症可能性の判定方法
JP7139248B2 (ja) 孤発性大腸癌発症可能性の判定方法
CN110387421A (zh) 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法
JP6606554B2 (ja) Ｙ染色体のメチル化部位を前立腺ガンの診断用マーカとする使用
TWI456197B (zh) 作為早發性大腸直腸癌之生物標記的（ｌｉｎｅ－１低甲基化作用）
CN114875140B (zh) 包括外泌体miR-106b-3p、miR-1294等在肺癌诊断中的应用
CN113724862A (zh) 一种结直肠癌生物标志物及其筛选方法和应用
JP2021511028A (ja) 肺癌を診断するためのキットおよび方法
CN115315530A (zh) 使用特定基因中cpg甲基化改变以诊断膀胱癌的组合物及其用途
US20190024181A1 (en) Method for detecting oral precancerous lesion
WO2025237289A1 (zh) 尿路上皮癌甲基化标志物试剂盒
WO2022222146A1 (zh) 用于结直肠癌检测的组合物、试剂盒及应用
JP2016201999A (ja) 大腸癌を検出する方法
CN110724743A (zh) 人血液中结直肠癌诊断相关的甲基化生物标记物及其应用
WO2018008153A1 (ja) 大腸癌発症可能性の判定方法
CN111363816B (zh) 基于pax3和zic4基因的肺癌诊断试剂及试剂盒
CN108251532B (zh) 基于ngs技术的粪便dna结直肠肿瘤多基因预测模型
CN114686588A (zh) 肠癌筛查试剂盒
WO2018061143A1 (ja) 孤発性大腸癌発症可能性の判定方法
TWI626314B (zh) 評估罹患大腸直腸癌風險的方法
CN121294652A (zh) 尿路上皮癌检测试剂及方法
CN116396960A (zh) 用于检测宫颈上皮内瘤样病变和宫颈鳞状细胞癌的核酸分子与试剂盒
TWI721414B (zh) 用於乳癌之早期預測、治療反應、復發及預後監控之方法
WO2025211164A1 (ja) 食道癌、咽頭癌又は口腔癌の発症予測及び／又はリスク判定方法、並びに食道癌、咽頭癌又は口腔癌の発症予測及び／又はリスク判定用キット
CN116445614A (zh) 用于检测宫颈鳞癌的核酸分子、试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17856310

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018542835

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20197008922

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017856310

Country of ref document: EP

Effective date: 20190429