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WO2005021743A1 - 核酸増幅用プライマー及びこれを用いた大腸癌の検査方法 - Google Patents

核酸増幅用プライマー及びこれを用いた大腸癌の検査方法 Download PDF

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WO2005021743A1
WO2005021743A1 PCT/JP2004/012256 JP2004012256W WO2005021743A1 WO 2005021743 A1 WO2005021743 A1 WO 2005021743A1 JP 2004012256 W JP2004012256 W JP 2004012256W WO 2005021743 A1 WO2005021743 A1 WO 2005021743A1
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WO
WIPO (PCT)
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region
cytosine
cpg region
cpg
gene
Prior art date
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Ceased
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PCT/JP2004/012256
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English (en)
French (fr)
Inventor
Nagahide Matsubara
Takeshi Nagasaka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
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Publication of WO2005021743A1 publication Critical patent/WO2005021743A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting methylation of a CpG region of a gene, a method using the same, a primer, a primer set, a test reagent, and a test reagent kit for use in these methods.
  • the present invention relates to a method for discriminating (screening) sporadic colorectal cancer from hereditary non-adenomatous colorectal cancer in the field of colorectal cancer clinical examination, primers, primer sets, and test methods for use in the method.
  • the present invention relates to a reagent and a test reagent kit.
  • hereditary colorectal cancer familial adenomatous colorectal cancer (hereinafter referred to as “8?”)
  • hereditary non-adenomatous colorectal cancer hereinafter “HNPCC”.
  • FAP has been found to be caused by an abnormality in the APC gene, and diagnosis is relatively easy due to the characteristic feature of producing a large amount of polyps.
  • MMR genes DNA mismatch repair proteins
  • HNPCC DNA mismatch repair proteins
  • HMSH2 gene the gene encoding hMSH2 (hereinafter appropriately referred to as “hMSH2 gene”) and the gene encoding hMLH1 (hereinafter appropriately referred to as “hMLH1 gene”), are clearly the main causes. became.
  • hMSH2 gene the gene encoding hMSH2
  • hMLH1 gene the gene encoding hMLH1
  • MMR genes such as the hMLHl gene have been found to be associated with abnormalities in microsatellite repeat sequences in DNA. That is, in some types of cancer cells, the number of repetitions of the microsatellite represented by the repetitive sequence of CA and the like is larger or smaller than that of normal cells.
  • MSI + Microsatellite instability
  • microsatellite stability (microsatellite
  • MSI + is a feature found in HNPCC.
  • MSI + is present at a frequency of 12 to 30% in many tumors that are not related to HNPCC, such as sporadic colorectal cancer and gastric cancer (MSI +
  • the sporadic colorectal cancer indicated is referred to as “sporadic MSI + colorectal cancer” as appropriate.
  • hMLHl promoter Promoter methylation occurs in one region, revealing that hMLHl protein expression has been lost Became.
  • CCAAT box a CBP binding factor that is a protein that expresses hMLHl, is located in the motor region of the gene that encodes hMLHl. Methylation of the upstream CpG region was found to be frequently observed. On the other hand, in HNPCC cell lines, methylation of this region has been found to occur at a low rate.
  • CIMP CpG Island Methylator Phenotype
  • methods for detecting methylation of a gene include the MSP method (WO97 / 46705, Table 2000-511776), the MCA method (WO00 / 26401, Table 2002-533061), the COBRA method, and the like. I do.
  • the MCA method amplifies gene fragments that have been cleaved with a methylation-sensitive restriction enzyme and added a linker at the end, and are intended to search for “unknown” methylated genes. Suitable, but unsuitable for performing a specific gene of interest.
  • the COBRA method requires a step of digestion with a restriction enzyme, is time-consuming and costly, and can only examine the recognition site of the restriction enzyme to be used. If it cannot be analyzed, it has disadvantages.
  • the MSP method does not use restriction enzymes, two PCRs, one using only methylation-specific primers and the other using only non-methylation-specific primers, are performed for each gene region to be analyzed for methylation. I need.
  • the determination of the presence or absence of the methylation is performed based on the presence or absence of the PCR product, there is a disadvantage that errors in the PCR itself cannot be confirmed.
  • the inventors of the present invention therefore simply determined the presence or absence of methylation of the CpG region of the promoter region of the gene encoding hMLHl, and in particular, the presence or absence of methylation of the CpG region upstream of the CCAAT box. If there is a method that can be used for detection of spontaneous MSI + colorectal cancer, it is possible to identify sporadic MSI + colorectal cancer by detecting the methylation. I thought it could be identified.
  • the present inventors have developed a primer specifically recognizing a methylated cytosine in any CpG region in the promoter region of a gene (DNA) encoding hMLH1; Regardless of the presence or absence of the methylation, it binds to any region in the promoter region of the gene encoding hMLHl (a region other than any of the above CpG regions is preferred), and binds to any of the above CpG
  • the presence or absence of methylation in the CpG region can be identified, whereby MSI + mosquito MSI- They found that it was possible to accurately identify whether they had colorectal cancer. This detection method is simpler and cheaper than other HNPCC gene diagnosis.
  • the detection principle is basically applicable to any gene, and the gene to be analyzed whose methylation status is to be examined may be any gene.
  • the method of the present invention differs from other general methods for detecting the methylation state of a gene and does not include a step of digestion with a restriction enzyme. This is particularly advantageous in inspections. That is, according to the method of the present invention, it is possible to make up for all the drawbacks of the conventional detection technology. It is possible, and errors in the amplification process itself can be confirmed by PCR products with non-specific primers. As in the case of the COBRA method, restriction enzymes are not used. In addition, since errors in the amplification process itself, in which the number of nucleic acid amplifications is smaller than in the MSP method, can be confirmed, the method is simple and reliable.
  • MSI analysis microsatellite repetitive sequence analysis
  • IHC immunohistochemical analysis
  • the present invention has been completed in combination with a detection reagent and a detection reagent kit using the primer.
  • a first aspect of the present invention is a primer for nucleic acid amplification that selects at least one of the oligonucleotides according to 1) to 10) below:
  • An oligo comprising at least one CPG region in the promoter region of the gene encoding hMLH1 represented by SEQ ID NO: 1 and comprising a nucleotide sequence in which cytosines other than cytosine present in the CpG region have been converted to thymine or peracyl. Nucleotides;
  • a base comprising at least one CpG region in the promoter region of the gene encoding hMLHl represented by SEQ ID NO: 1, wherein cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region have been converted to thymine or peracyl.
  • An oligonucleotide consisting of a sequence
  • a base comprising at least one CpG region in the promoter region of the gene encoding hMLH1 represented by SEQ ID NO: 1, wherein cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region have been converted to thymine or peracyl.
  • An oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the sequence;
  • a base comprising at least one CpG region in the complementary strand of the sequence of the promoter region of the gene encoding hMLH1 represented by SEQ ID NO: 1, wherein a cytosine other than cytosine present in the CpG region has been converted to thymine or peracinole An oligonucleotide consisting of a sequence; 7) A base in which at least one CpG region in the complementary strand of the sequence of the promoter region of the gene encoding hMLHl represented by SEQ ID NO: 1 is included, and a cytosine other than cytosine present in the CpG region is converted to thymine or peracinole An oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the sequence;
  • It contains one or more CpG regions in the complementary chain of the sequence of the promoter region of the gene encoding hMLHl represented by SEQ ID NO: 1, and the cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region are expressed in thymine or perasinole.
  • An oligonucleotide comprising the converted base sequence
  • the cytosine present in the complementary chain of the sequence of the promoter region of the gene encoding hMLHl represented by SEQ ID NO: 1 contains at least one CpG region, and cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region are expressed in thymine or perasinole.
  • one or more of the above 9) force 9) one or more bases in the oligonucleotide sequence of the oligonucleotide according to 1 are composed of a mutated base sequence such as substitution, deletion, insertion or addition; and a cytosine of the CpG region.
  • a second embodiment of the present invention is a primer set for nucleic acid amplification for selecting two or more of the oligonucleotides described in 1) to 10) below:
  • An oligo comprising at least one CpG region in the promoter region of the gene encoding hMLH1 represented by SEQ ID NO: 1 and comprising a nucleotide sequence in which cytosines other than cytosine present in the CpG region have been converted to thymine or peracyl. Nucleotides;
  • a base comprising at least one CpG region in the promoter region of the gene encoding hMLHl represented by SEQ ID NO: 1, wherein cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region have been converted to thymine or peracyl.
  • An oligonucleotide consisting of a sequence 4) a base comprising at least one CpG region in the promoter region of the gene encoding hMLH1 represented by SEQ ID NO: 1, wherein cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region have been converted to thymine or peracyl.
  • a base comprising at least one CpG region in the complementary strand of the sequence of the promoter region of the gene encoding hMLH1 represented by SEQ ID NO: 1, wherein a cytosine other than cytosine present in the CpG region has been converted to thymine or peracinole
  • It contains one or more CpG regions in the complementary chain of the sequence of the promoter region of the gene encoding hMLHl represented by SEQ ID NO: 1, and the cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region are expressed in thymine or perasinole.
  • An oligonucleotide comprising the converted base sequence
  • the cytosine present in the complementary chain of the sequence of the promoter region of the gene encoding hMLHl represented by SEQ ID NO: 1 contains at least one CpG region, and cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region are expressed in thymine or perasinole.
  • An oligonucleotide comprising a sequence and having a primer function capable of detecting methylation of cytosine in the CpG region.
  • the third embodiment of the present invention is used to identify the presence or absence of cytosine methinolayin in the 5 'region in the promoter region of the gene encoding hMLHl in the tissue or in the CpG region in the CCAAT region.
  • Primer set, wherein the melting temperature of at least one methylated cytosine non-specific primer is The primer set for nucleic acid amplification according to the above (2), which is higher by 115 ° C. than the melting temperature of the mer.
  • a fourth aspect of the present invention is a primer used to identify the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the CCAAT region in the promoter region of the gene encoding hMLHl in a tissue.
  • the fifth aspect of the present invention relates to the oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 3.
  • a seventh aspect of the present invention relates to the oligonucleotide of SEQ ID NO: 6 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 6.
  • nucleic acid amplification primer according to the above (1) is used,
  • This is a method for distinguishing sporadic colorectal cancer from hereditary non-adenomatous colorectal cancer, which comprises examining the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the promoter region of the gene encoding LH1.
  • the tenth aspect of the present invention uses as an index the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the 5 ′ region or the CCAAT region in the promoter of the gene encoding hMLHl in a tissue. This is a method for distinguishing sporadic colorectal cancer from hereditary non-adenomatous colorectal cancer characterized by the following characteristics.
  • the detection of the presence or absence of cytosine methylation is performed by nucleic acid amplification.
  • a twelfth aspect of the present invention is the identification method according to any one of (9) to (11), which is characterized by combining microsatellite repeat sequence analysis.
  • a thirteenth aspect of the present invention is the identification method according to any one of (9) to (12), wherein the method is combined with immunostaining analysis of a DNA mismatch repair protein. .
  • a fourteenth aspect of the present invention is a detection reagent containing the primer according to (1).
  • a fifteenth aspect of the present invention is a detection reagent kit comprising the primer according to (1).
  • a sixteenth aspect of the present invention is a primer for nucleic acid amplification which selects at least one of the oligonucleotides according to any one of 1) to 9) below, Primers to detect the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region of the gene:
  • an oligonucleotide comprising at least one CpG region in the gene to be analyzed and comprising a nucleotide sequence in which a cytosine other than cytosine present in the CpG region has been converted to thymine or peracyl;
  • an oligonucleotide comprising at least one CpG region in the gene to be analyzed and comprising a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence obtained by converting a cytosine other than cytosine present in the CpG region into thymine or peracyl;
  • an oligonucleotide comprising one or more CpG regions in the gene to be analyzed and comprising a base sequence IJ in which cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region have been converted to thymine or peracinole;
  • an oligonucleotide comprising one or more CpG regions in the gene to be analyzed and comprising a base sequence complementary to a base sequence obtained by converting cytosine present in the CpG region and cytosine other than the CpG region to thymine or peracinole;
  • an oligonucleotide comprising at least one CpG region in the complementary strand of the sequence of the gene to be analyzed and comprising a base sequence in which a cytosine other than cytosine present in the CpG region has been converted to thymine or peracinole; 6) An oligo comprising at least one CpG region in the complementary strand of the sequence of the gene to be analyzed and comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence obtained by converting a cytosine other than cytosine present in the CpG region into thymine or peracinole. nucleotide;
  • an oligonucleotide comprising at least one CpG region in a complementary strand of the sequence of the gene to be analyzed, and having a base sequence in which cytosine present in the CpG region and cytosine other than the CpG region have been converted to thymine or peracyl;
  • a seventeenth aspect of the present invention is a nucleic acid amplification primer for detecting the presence or absence of methylation of a CpG region in a gene to be analyzed, comprising at least three of the primers of the above (16).
  • b) binds to the gene to be analyzed only when cytosine in the CpG region to be detected is cytosine after modification with the modifying agent, and binds to cytosine in the CpG region to be detected after modification with the modifying agent; Or, if it is converted to thymine, it will not bind to the gene to be analyzed, at least one methylated cytosine-specific primer
  • An eighteenth aspect of the present invention provides a method for analyzing a gene to be analyzed in the CpG region (
  • nucleic acid derived from a sample is modified with a modifying agent, (2) Using the nucleic acid as type III, the following primers:
  • b) binds to the gene to be analyzed only when cytosine in the CpG region to be detected is cytosine after modification with the modifying agent, and binds to cytosine in the CpG region to be detected after modification with the modifying agent; Or, if it is converted to thymine, it will not bind to the gene to be analyzed, at least one methylated cytosine-specific primer
  • a nineteenth aspect of the present invention is directed to at least one of the oligonucleotides according to any one of the following 1) to 9), wherein the methylated cytosine-specific primer and the methylated cytosine non-specific primer are respectively:
  • an oligonucleotide comprising at least one CpG region in the gene to be analyzed and comprising a nucleotide sequence in which a cytosine other than cytosine present in the CpG region has been converted to thymine or peracyl;
  • an oligonucleotide comprising at least one CpG region in the gene to be analyzed and comprising a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence obtained by converting a cytosine other than cytosine present in the CpG region into thymine or peracyl;
  • an oligonucleotide comprising one or more CpG regions in the gene to be analyzed and comprising a base sequence IJ in which cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region have been converted to thymine or peracinole;
  • an oligonucleotide comprising one or more CpG regions in the gene to be analyzed and comprising a base sequence complementary to a base sequence obtained by converting cytosine present in the CpG region and cytosine other than the CpG region to thymine or peracinole; 5) an oligonucleotide comprising at least one CpG region in the complementary strand of the sequence of the gene to be analyzed and comprising a base sequence in which a cytosine other than cytosine present in the CpG region has been converted to thymine or peracinole;
  • An oligo comprising at least one CpG region in the complementary strand of the sequence of the gene to be analyzed and comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence obtained by converting a cytosine other than cytosine present in the CpG region into thymine or peracinole.
  • an oligonucleotide comprising at least one CpG region in a complementary strand of the sequence of the gene to be analyzed, and having a base sequence in which cytosine present in the CpG region and cytosine other than the CpG region have been converted to thymine or peracyl;
  • oligonucleotide according to 1) wherein one or more bases in the oligonucleotide sequence according to any one of (1) and (8) have a mutated base sequence such as substitution, deletion, insertion or addition, and a cytosine of the CpG region. Oligonucleotides having a primer function capable of detecting methylidani.
  • the gene to be analyzed is a group of genes encoding DNA mismatch repair proteins including hMLH1, hMSH2, hMSH6, hPMS1, and hPMS2, and other colon cancer-related genes.
  • a twenty-first aspect of the present invention provides a method for associating the presence or absence of cytosine methyl in the CpG region to be detected in the gene to be analyzed with the presence or classification of colon cancer in the individual from which the sample is derived. This is the method according to the above (18).
  • the CpG region to be detected is at two or more sites
  • FIG. 1 shows methylation in the promoter region of the gene encoding hMLHl.
  • a base sequence indicating the presence or absence.
  • [En. 2] is a schematic view showing an outline of the inspection method of the present invention.
  • FIG. 3 is an example of immunostaining of hMLH1.
  • the hMLH1 gene will be described in detail when the gene to be analyzed is the hMLH1 gene.
  • the present invention is applicable to any gene, and the gene to be analyzed in the present invention is the hMLH1 gene. Not limited.
  • methylated base is not modified.
  • methylated cytosine is less likely to be deaminated by bisulfite modification, and exists as cytosine. You. On the other hand, all or most of the unmethylated cytosine is converted to lacinole by bisulfite modification, and the converted peracyl is amplified when single-stranded DNA containing it is amplified. , Replicated as thymine.
  • cytosine in any CpG region is cytosine after bisulfite modification, it binds to the gene encoding hMLHl, and A primer that does not bind to the gene encoding hMLH1 if cytosine is converted to peracil after bisulfite modification (methylidazocytosine-specific primer, hereinafter appropriately referred to as “methylation-specific primer”); Even if the cytosine in the CpG region remains cytosine after bisulfite modification, even if the cytosine remains unchanged after the bisulfite modification, in the oligonucleotide (amplified by gene amplification), the site (position) Will bind to the gene encoding hMLHl, and will be used for nucleic acid amplification in the region including the CpG region where cytosine is present.
  • At least two types of primers that form oligonucletides are paired with each of these primers to form the CpG region.
  • a methyl-specific non-specific primer hereinafter appropriately referred to as a “methylated non-specific primer”
  • a methyl-specific non-specific primer is paired with each of these primers to form the CpG region.
  • the product amplified by the nucleic acid amplification method is detected using another non-methylated non-specific primer capable of amplifying a region containing
  • only one amplification product from the non-methylated primer is detected. Therefore, the presence or absence of methylation of the CpG region can be identified based on the difference between the detected amplification products.
  • the primer comprises at least one CpG region (a methylated cytosine is present in the CpG region). Select nucleotides.
  • the primer selects an oligonucleotide containing at least one CpG region
  • the primer binds to a region of the oligonucleotide containing the at least one CpG region in the nucleic acid
  • the at least one Forming a nucleic acid containing an oligonucleotide containing a CpG region into a type II means forming a nucleic acid containing a region corresponding to the CpG region (generally complementary to the CpG region) by nucleic acid amplification.
  • the primer and the oligonucleotide it selects (ie binds to) have essentially complementary sequences to each other.
  • the methylation-specific primer is designed to bind to the CpG region where the methylated cytosine to be detected exists.
  • the non-methylated primer is designed so as not to bind to the CpG region where the methylated cytosine exists, but may be one that binds to the CpG region where the methylated cytosine exists.
  • a region between base numbers 1031 and 1216 (hereinafter, this region is referred to as appropriate)
  • a region between base numbers 1369 and 1600 (this region is referred to as A primer set has been found that can identify the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region of the “CCAAT region” or “CCAAT region”).
  • the latter primer set is considered to be important in the diagnosis of HNPCC.
  • Fig. 1 shows the CC of the sample diagnosed as sporadic colorectal cancer and the sample diagnosed as HNPCC.
  • the base sequence of the portion of the AAT region that has been subjected to bisulfite treatment and nucleic acid amplification is shown.
  • the base at the position indicated by the arrow upstream of the CCAAT box was detected as cytosine in all sporadic MSI + colorectal cancer samples, whereas in the HNPCC sample, all were thymine. Has been detected as.
  • the methylation-specific primer is a base corresponding to cytosine only in the portion corresponding to cytosine in the CpG region of the promoter region of the gene encoding hMLH1 to be subjected to methylation analysis
  • Other sites corresponding to cytosine in the promoter region are designed to correspond to peracil or thymine.
  • Methylation-specific primers are preferably designed to include more than one CpG region to reduce false positives.
  • non-methylated primers are designed so as to correspond to both the sequence in which cytosine in the CpG region of the promoter region of the gene encoding hMLHl is converted to peracil or thymine, and the sequence as it is.
  • methylation-specific PCR DNA amplification occurs only when the primer sequence and the DNA sequence IJ after bisulfite modification are completely complementarily annealed, and the primer sequence and the bisulfite-modified When there is a mismatch of one or more bases with the DNA sequence, design the primer and PCR reaction system so that DNA will not be amplified. Thus, in methylation-specific PCR, the presence or absence of one-base methylation can be identified.
  • the oligonucleotide used as a primer in the present invention can form a base pair with a complementary strand while maintaining the specificity required for various nucleic acid synthesis reactions.
  • the primer is a nucleic acid amplification primer that selects at least one of the oligonucleotides described in any one of 1) to 10) below.
  • An oligo comprising at least one CpG region in the promoter region of the gene encoding hMLH1 represented by SEQ ID NO: 1 and comprising a nucleotide sequence in which cytosines other than cytosine present in the CpG region have been converted to thymine or peracyl. nucleotide.
  • This oligonucleotide is derived from, for example, single-stranded DNA of a double-stranded DNA of a gene collected from a biological sample after modification with bisulfite.
  • the primer that selects the oligonucleotide is capable of selecting the oligonucleotide.
  • the primer that selects the oligonucleotide is not limited to the methylation-specific primer, and may be a non-specific primer that is the methylation-specific.
  • oligonucleotides consisting of different base sequences. This oligonucleotide has the same base sequence as a part of the base sequence of the amplified product formed when the nucleic acid containing the oligonucleotide represented by 1) is subjected to nucleic acid amplification with the ⁇ type. The amplified product is used as type III in the next stage of nucleic acid amplification.
  • the methylation-specific primer is capable of selecting this oligonucleotide.
  • the primer for selecting this oligonucleotide is not limited to the methylation-specific primer, and may be a non-methylation-specific primer.
  • a base comprising at least one CpG region in the promoter region of the gene encoding hMLHl represented by SEQ ID NO: 1, wherein cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region have been converted to thymine or peracyl.
  • An oligonucleotide consisting of a sequence. This oligonucleotide is derived from the single-stranded DNA of the double-stranded DNA of the gene collected from the biological sample after bisulfite modification.
  • the primer that selects this oligonucleotide is a non-methylated specific primer.
  • a base comprising at least one CpG region in the promoter region of the gene encoding hMLH1 represented by SEQ ID NO: 1, wherein cytosine present in the CpG region and cytosines other than the CpG region have been converted to thymine or peracyl.
  • An oligonucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the sequence. This oligonucleotide has the same nucleotide sequence as a part of the nucleotide sequence of the amplified product formed when the nucleic acid is amplified, using the nucleic acid containing the oligonucleotide represented by 3) as a type III. The amplicon is used as type ⁇ in the next stage of nucleic acid amplification .
  • the primer for selecting this oligonucleotide is a non-methylated primer.
  • oligonucleotide consisting of a sequence.
  • This oligonucleotide is, for example, derived from a single-stranded (opposite strand) DNA that is complementary to the single-stranded DNA shown in 1) of the double-stranded DNA of the gene collected from the biological sample. Things. Methylidani specific primers can select this oligonucleotide
  • the primer for selecting this oligonucleotide is not limited to a methylation-specific primer, and may be a non-methylation-specific primer.
  • Methylation-specific primer has the ability to select this oligonucleotide
  • the primer that selects this oligonucleotide is not limited to a methylation-specific primer, and may be a non-methylation-specific primer.
  • oligonucleotide consisting of the converted base sequence.
  • This oligonucleotide is, for example, one derived from single-stranded (opposite strand) DNA that is complementary to the single-stranded DNA shown in 3) of the double-stranded DNA of the collected gene. It is.
  • the primer for selecting this oligonucleotide is a non-methylation-specific primer.
  • oligonucleotide consisting of a base sequence complementary to the converted base sequence. This oligonucleotide has the same base sequence as the base sequence of the amplified product formed when nucleic acid amplification is performed using the oligonucleotide shown in 8) as type III. The amplified product is used as type III in the next stage of nucleic acid amplification. Primers selecting this oligonucleotide are non-methylated specific primers
  • oligonucleotides described in 1) 1 or more of the oligonucleotides according to 1), wherein one or more bases are mutated such as substitution, deletion, insertion or addition.
  • the methyl ligne-specific primer used to identify the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the 5 'region has at least one This is to select an oligonucleotide having a sequence in which cytosine other than cytosine in one CpG region is converted to perasinole or thymine.
  • this primer is characterized in that the cytosine in the at least one CpG region in the 5 'region remains cytosine even after bisulfite modification, and the at least one CpG region in the 5' region Even if cytosine other than cytosine in it is converted to peracyl after bisulfite modification (for oligonucleotides amplified by gene amplification, thymine is placed at this peracinole site), it remains unchanged. Even if it is present as cytosine, an oligonucleotide having that sequence is selected.
  • the methylidani-specific primer used for discriminating the presence or absence of cytosine methylidani in the CpG region in the 5 'region includes an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 3. . This primer recognizes the site of nucleotide sequence 1097 to 1118 of the gene encoding the hMLH1 protein and binds to the gene.
  • the methylated non-specific primer used to identify the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the 5 'region binds to a region other than the CpG region in the 5' region.
  • it is designed as follows. If it is necessary to bind to the region containing the CpG region, it is designed to bind to the region containing the CpG region regardless of the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region. Things.
  • the non-methylated primer is preferably designed to bind to a region other than the CpG region in the 5 'region. If it is inevitable to bind to a region containing the CpG region, it is not affected by the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region, that is, cytosine in the CpG region is converted to peracil. It is preferably designed to amplify both sequences when they are converted and when they are not converted as they are cytosine.
  • telomere sequence in which a mixed base or inosine (hypoxanthine) derived from inosine triphosphate (ITP) is arranged at a site of a non-specific primer corresponding to a cytosine in the CpG region.
  • Oligonucleotides are such nonspecific primers.
  • the non-specific primer for methylidani used to identify the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the 5 'region includes the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 2 or 4. There is.
  • the primer represented by SEQ ID NO: 2 recognizes a site at the nucleotide sequence from 1031 to 1055 of the gene encoding the hMLH1 protein and binds to the gene.
  • the primer represented by SEQ ID NO: 4 recognizes a site at nucleotide sequence 1191 to 1216 of a gene encoding the hMLH1 protein and binds to the gene.
  • a 5′_MS primer (methylation-specific upstream primer) represented by SEQ ID NO: 3, which is a methylation-specific primer
  • 5'_S primer non-methylated upstream primer
  • 5'_AS primer represented by SEQ ID NO: 4 which is a non-methylated non-specific primer
  • the nucleic acid is amplified by the nucleic acid amplification method using three types of primers (a non-specific downstream primer for methylation).
  • the 5'-S primer and the 5'- AS primers also form only 184-base unmethylated fragments formed by nucleic acid amplification. Therefore, the presence or absence of methylation in the CpG region can be identified based on the difference between the detected amplification products.
  • the methylidani-specific primer used to identify the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the CCAAT region comprises at least one CpG region in the CCAAT region.
  • An oligonucleotide having a sequence obtained by converting cytosine other than cytosine into peracyl or thymine is selected (that is, binds to the oligonucleotide).
  • this primer is characterized in that the cytosine in the at least one CpG region in the CCAAT region remains cytosine even after bisulfite modification, and the at least one CpG region in the CCAAT region
  • the cytosine other than the cytosine is converted to peracyl after bisulfite modification (in the oligonucleotide amplified by gene amplification, thymine is placed at the peracyl site), but remains unchanged as cytosine. Even if present, an oligonucleotide having that sequence is selected.
  • an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 6 is used as a methylidani-specific primer used to identify the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the CCAAT region. This primer recognizes the site from nucleotide sequence 1479 to 1502 of the gene encoding hMLH1 protein and binds to the gene.
  • the methylidani non-specific primer used to identify the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the CCAAT region is designed to bind to a region other than the CpG region in the CCAAT region. Is preferred. If it is necessary to recognize the region including the CpG region and bind to the region, cytosine in the CpG region It is designed to bind to the region including the CpG region, regardless of the presence or absence of methylation.
  • the non-methylated primer is designed to bind to a region other than the CpG region in the CCAAT region. If it is inevitable to bind to the region containing the CpG region, it is not affected by the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region, that is, cytosine in the CpG region is converted to peracinole. Preferably, it is designed to amplify both sequences when they are inserted and when they are not converted as they are.
  • telomere sequence in which a mixed base or inosine (hypoxanthine) derived from inosine triphosphate (ITP) is arranged at a site of a non-methylated primer corresponding to a site of cytosine in the CpG region.
  • Oligonucleotides are such methylated non-specific primers.
  • the non-specific primer for methylidani used to identify the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the CCAAT region includes an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 5 or 7. is there.
  • the primer represented by SEQ ID NO: 5 recognizes the base sequence from 1368 to 1394 of the gene encoding the hMLH1 protein and binds to the gene.
  • the primer represented by SEQ ID NO: 7 recognizes a site at the nucleotide sequence from 1575 to 1600 of the gene encoding the hMLH1 protein and binds to the gene.
  • the total of the methylation-specific primer represented by SEQ ID NO: 6, the methylated non-specific primer represented by SEQ ID NO: 5, and the methylated non-specific primer represented by SEQ ID NO: 7 The use of the three types of primer sets makes it possible to identify the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the CCAAT region.
  • a CCAAT-MS primer (methylation-specific upstream primer) represented by SEQ ID NO: 6, which is a methylation-specific primer, CCAAT-S primer (SEQ ID NO: 5), a non-methylated primer, and CCAAT-AS primer (SEQ ID NO: 7, a non-methylated primer) Methylation non-specific downstream primer Amplify nucleic acid by nucleic acid amplification using the three primers 1). Then this C In the case of cytosine-cut samples in the pG region, all three types of primers, including the CCAAT-MS ply, bind to the gene.
  • the CCAAT-MS primer and the CCAAT-AS primer were amplified by a nucleic acid amplification of 122 nucleotides, and the CCAAT-S primer and the CCAAT-AS primer were amplified by a nucleic acid amplification of 232 nucleotides. Two DNA fragments of methylated fragments are formed. On the other hand, the cytosine force of this CpG region is S-methylated, and only the two primers, except for the CCAAT-MS ply, bind to the gene. — S primer and CCAAT— AS primers also form only 232 base non-methylated fragments formed by nucleic acid amplification. Therefore, the presence or absence of methylation in the CpG region can be identified based on the difference between the detected amplification products.
  • the ply oligonucleotide can be produced by a known method, and for example, a solid phase chemical synthesis method such as a phosphate triester method, a phosphate amidite method, or a method for protecting a phosphate group site can be used. Specifically, it can be synthesized using an oligonucleotide synthesizer (Applied Biosystem, Expedite Model 8909) or the like. Oligonucleotides in which one or more bases are mutated such as substitution, deletion, insertion or addition can also be synthesized by a known solid-phase chemical synthesis method.
  • the ply set of the present invention contains two or more, and preferably at least three, of the above-mentioned plies of the present invention. These at least three primers
  • cytosine in the CpG region to be detected is cytosine after modification with the modifying agent, it binds to the gene to be analyzed, and the cytosine in the CpG region to be detected is modified after the modification with the modifying agent. Or, if it is converted to thymine, it will not bind to the gene to be analyzed, at least one methylated cytosine-specific primer
  • the embodiment in which the gene to be analyzed is hMLHl will be described.
  • cytosine methylidylase in the CpG region in the 5 'region or the CCAAT region in the promoter region of the gene encoding hMLHl in a tissue is described.
  • the melting temperature of at least one non-methylated cytosine non-specific primer should be higher than the melting temperature of the methylated cytosine-specific primer by 115 ° C. It is preferable to design the primer so as to be higher.
  • the primer it is more preferable to design the primer so that the melting temperature of any methylated cytosine non-specific primer is higher than the melting temperature of any methylated cytosine-specific primer by 115 ° C.
  • the melting temperature of the primer refers to the optimum temperature at which the primer binds to the oligonucleotide.
  • the annealing temperature for nucleic acid amplification should be lower than the melting temperature of any of the non-specific primers, or higher than the melting temperature of the methylated cytosine-specific primer.
  • a methylation-specific primer for example, it is possible to prevent a methylation-specific primer from binding to a type I oligonucleotide and producing a false positive result even though cytosine in a CpG region is not cytosine after bisulfite modification. Because.
  • designing primers in this manner makes it easier to detect control products in PCR (that is, products synthesized by two types of non-specific methylated primers) without considering the presence or absence of methylation.
  • the difference between the GC contents of the two be within 20%.
  • the GC content of the primer refers to the ratio of the total number of bases of guanine and cytosine in the entire base sequence of the primer. For example, if there are two primers each consisting of 100 bases and the number of GCs in the first primer is 50, the difference in GC content is 5% if the number of GCs in the other primer is 50. You. At this time, the GC content of the primer should be lower for the methylated cytosine-specific primer. In this way, designing primers can prevent false-positive results, and can improve reproducibility and results.
  • test method in the present invention specifically includes a process of sample preparation, DNA extraction, DNA modification, gene amplification using primers, and DNA detection.
  • the human sample used in the detection method of the present invention is not particularly limited as long as it contains a gene encoding the hMLH1 protein.
  • Specific examples include blood, serum, feces, semen, saliva, cerebrospinal fluid, and the like, in addition to tissues collected from living bodies.
  • tissue collected from the living body for example, a tissue of colon cancer removed by surgery or a biopsy material used for endoscopic examination or the like before surgery is suitably used in terms of effective use of the sample.
  • the human sample to be subjected to the detection method of the present invention is obtained by crushing a tissue using a blender, and then extracting DNA by a known gene extraction method such as a phenol-chloroform method, and using it as a test sample. Used.
  • the DNA is modified by bisulfite.
  • methylated cytosine is present as cytosine.
  • Non-methylated cytosine is once converted to peracil and then expressed as thymine.
  • the bisulfite used in the present invention is not particularly limited, but sodium bisulfite is preferably used. Further, those having the same function as the above bisulfite can be used as the modifier.
  • the denaturation conditions may be any conditions suitable for the PCR measurement system.
  • the denaturation is carried out at 37 ° C. for 5 to 30 minutes in a 0.2 M to 0.3 M NaOH solution.
  • a hydroquinone solution and a sodium bisulfite solution at pH 5.0 so that the final concentrations are 0.5 mM and 3. ImM, respectively, and incubate at 50 55 ° C for 16-40 hours.
  • Methylidani cytosine is modified.
  • excess bisulfite is removed by performing stepwise dialysis. The dialyzed sample is concentrated in a vacuum oven or precipitated with ethanol, and then dissolved in an appropriate buffer or pure water, and can be used for ordinary PCR or methylation specific PCR.
  • Gene “nucleic acid amplification”) in the present invention, a known method can be used as a gene amplification method, and examples thereof include a PCR method, a NASBA method, and a LAMP method. Preferably, a PCR method is used.
  • Detection of DNA amplified by methylation-specific PCR is carried out, for example, by general agarose gel or polyacrylamide gel electrophoresis followed by staining of DNA.
  • the staining method include a method using silver staining and a method using a fluorescent dye such as ethidium bromide and SYBRR Green.
  • a fluorescent dye such as ethidium bromide and SYBRR Green.
  • homogenous detection using 5 'exonuclease attraction fluorescence resonance energy transfer is also possible.
  • the test method of the present invention comprises first performing microsatellite repeat sequence analysis (MSI analysis) to identify (screen) sporadic MSI + colorectal cancer and HNPCC samples showing microsatellite instability (MSI +). If used, the MSI + based on the mutation of the gene encoding hMLH1 can be identified with higher accuracy as to whether it is sporadic MSI + colorectal cancer or HNPCC.
  • MSI analysis can be performed, for example, by PCR-amplifying a region containing a microsatellite region between a cancer cell gene and a normal cell gene, and examining the chain length of the amplified product by electrophoresis.
  • the base sequence is determined based on this, and the microsatellite is unstable (MSI +) or stable. (MSI- or MSS).
  • the presence or absence of methylation in the CpG region can be identified, and the mutation of the gene encoding hMLHl is The ability to be sporadic colorectal cancer or HNPCC can be more accurately identified.
  • IHC immunostaining analysis
  • the CpG domain is S-methylated, hMLHl is less likely to be expressed, and the rate of negative immunostaining is increased.
  • the CpG region is not ligated, hMLH1 is easily expressed, and the rate of positive immunostaining increases.
  • sporadic MSI + colorectal cancer when a methylation-specific PCR test is performed, in sporadic colorectal cancer specimens showing MSI +, the cytosine methylation is 80% or more in two places of the 5 ′ region and the CCAAT region. In contrast, in HNPCC samples showing MSI +, cytosine methylation is detected at a low rate of 20% or less in the 5 ′ region and the CCAAT region. Therefore, sporadic MSI + colorectal cancer can be distinguished from HNPCC by identifying the presence or absence of cytosine methylation in the CpG region in the promoter region of the gene encoding hMLHl.
  • the present invention also provides a test wherein the presence or absence of cytosine methylation of CpG in the CpG region in the promoter region of the gene encoding hMLHl in a tissue is used as an index for determining sporadic colorectal cancer and hereditary non-adenomatous colorectal cancer.
  • test reagents and test reagent kits used in the method.
  • the test reagent may be any of the reagents used in the method of the present invention, such as primers for methylation-specific nucleic acid amplification, exonucleases, and labels for detecting nucleic acids.
  • test reagent kit may be any one that uses at least two or more of all the reagents used in the test method of the present invention as a kit.
  • a primer specific to methylation of the CpG region in the promoter region of the gene (DNA) encoding hMLHl and a non-specific primer set for methylation are exemplified.
  • DNA probed with a fluorescent label may be included in the kit.
  • MSI analysis was performed on the collected 234 colorectal cancer tissue samples, and colorectal cancer was classified into two types, MSI + and MSI. MSI analysis was performed according to a known technique.
  • FIG. 2 shows the outline of the method of this example, that is, the relationship between the primers and amplification products used in this example and the outline of the determination of the result.
  • DNA was extracted from the biological sample by the usual phenol-cloth-form method. Unmethylated cytosine was modified with sodium bisulfite using DNA modification kit “CpGenome” (Intergen) on DNA lOOng extracted from a biological sample.
  • Methylation-specific PCR and non-methylation-specific PCR were performed on a portion of the bisulfite-modified DNA prepared as described in 1. above.
  • Bisulfite-modified DNA (type)) was added to 1X PCR buffer (containing 15 mM MgCl) and 1.25 units of DNA polymerase.
  • HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen) ", 50 ⁇ l of each PCR reaction containing 200 ⁇ l each of dATP, dGTP, dTTP and dCTP, and 2 ⁇ l primers (described below). For this, 35 cycles of 95 ° C / 0.5 min, 54 ° C / 0.5 min, 72 ° C / 0.5 min, and 35 cycles were performed.
  • a primer specific for methylidani for detecting cytosine methylidani in the CpG region of the 5 'region of the promoter region of the gene encoding hMLHl is represented by SEQ ID NO: 1.
  • the following oligonucleotides were selected from the sequence obtained by converting all cytosines other than cytosine except for the CpG region of the 5 'region of the promoter region of the gene encoding hMLHl into thymine or peracyl and their complementary strands (hereinafter referred to as salt).
  • the base number represents the number of the corresponding base in SEQ ID NO: 1).
  • hMLHl represented by SEQ ID NO: 1 is encoded.
  • the following oligonucleotides were selected from the sequence in which all cytosines in the CpG region of the 5 'region of the promoter region of the gene were converted to thymine or peracil and their complementary strands.
  • the second R in SEQ ID NO: 4 represents adenine A or guanine G (ie, purine).
  • the DNA of the 5 'region of the gene encoding hMLHl is amplified by a pair of 5,1 S primer and 5,1 AS primer, and the 184 base DNA fragment shown in FIG. ) Is detected by the 5'_MS primer and the 5'-AS primer pair, the DNA of the 5 'region of the gene encoding hMLHl is not amplified, and the 118 base DNA fragment ("Methylated fragment" )) Is not detected, the presence of methylated cytosine in the region amplified by the primer is not present, or even if present, it is so small that it is below the detection limit, and methylation is negative. It was judged.
  • the DNA of the 5 'region of the gene encoding hMLHl was amplified by the pair of 5'_S primer and 5'-AS primer, and the 184-base DNA fragment shown in Fig. 2 was detected.
  • the DNA of the 5 'region of the gene encoding hMLHl is also amplified, and when the 118-base DNA fragment shown in Fig. 2 is also detected, the DNA is amplified with the primer. It is considered that methylated cytosine and unmethylated cytosine coexist in the region, and in this case, methylidani was determined to be positive.
  • Methylation-specific PCR and non-methylation-specific PCR were performed on a portion of the bisulfite-modified DNA prepared as described in 1. above.
  • Bisulfite-modified DNA (type)) was added to 1X PCR buffer (containing 15 mM MgCl) and 1.25 units of DNA polymerase.
  • HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen) ", 200 ⁇ each of dATP, dGTP, dTTP and dCTP, and 50 ⁇ L of PCR reaction solution containing 2 ⁇ M primer (described later), and detection of CC AAT region methylation For this, 35 cycles of 95 ° C / 0.5 min, 58 ° CZ0.5 min, 72 ° CZ0.5 min, 35 cycles were performed.
  • a methylidani-specific primer for detecting cytosine methylidani in the CpG region of the CCAA T region of the promoter region of the gene encoding hMLHl is represented by SEQ ID NO: 1.
  • the following oligonucleotides were selected as primers from the sequence in which all cytosines other than cytosine except for the CpG region of the CCAAT region in the promoter region of the gene encoding hMLHl except for cytosine were converted to thymine or peracil and their complementary chains. .
  • Methylation-specific upstream primer (CCAAT-MS primer)
  • the first Y in SEQ ID NO: 6 represents cytosine C or thymine T (that is, pyrimidine)
  • hMLHl represented by SEQ ID NO: 1
  • the following oligonucleotides were selected from the sequence obtained by converting all cytosines in the CpAT region of the CCAAT region of the promoter region of the gene to be converted into thymine or peracinole, and the complementary strand thereof.
  • Non-specific upstream primer for methylation (CCAAT-S primer)
  • Non-methylated downstream primer (CCAAT—AS primer) (Base numbers 1575-1600) (SEQ ID NO: 7)
  • the 12th I in SEQ ID NO: 7 is inosine (hypoxa) derived from inosine triphosphate (ITP).
  • the DNA of the CCAAT region of the gene encoding hMLH1 is amplified by a pair of CCAAT-S primer and CCAAT-AS primer, and a 232 base DNA fragment ("No-specific fragmentj") shown in FIG.
  • the CCAAT-MS primer and the CCAAT-AS primer pair did not amplify the DNA in the CCAAT region of the gene encoding hMLHl, and the 122-base DNA fragment (“Methylated fragment”) shown in Figure 2
  • Method 2 When no is detected, methylated cytosine was not present in the region amplified by the primer, or was present in a trace amount below the detection limit, and methylation was judged to be negative. .
  • the DNA of the CCAAT region of the gene encoding hMLHl is amplified by a pair of the CCAAT-S primer and the CCAAT-AS primer, and a 232 base DNA fragment shown in Fig. 2 is detected.
  • CCAAT When the DNA of the CCAAT region of the gene encoding hMLHl is also amplified by the primer of the AS primer and the DNA fragment of 122 bases shown in FIG. 2 is also detected, methyl is included in the region amplified by the primer. It is considered that methylated cytosine and methylated rare cytosine coexist, and in this case, methylidani was determined to be positive.
  • Immunostaining was performed on a total of 75 samples.
  • hMLHl, hMSH2, hPMSl, hPMS2, and hMSH6 were analyzed for 5 gene mutations by direct sequencing and immunostaining on 35 samples diagnosed with MSI +. Performed by law.
  • the above method was used to examine 234 cases of colorectal cancer as a whole.
  • 234 colorectal cancers were classified into 35 MSI + cancers (including HNPCC) and 199 MSI- cancers. That is, cytosine methylation and non-methylation of the 5 'region of the promoter region of the gene encoding hMLHl and the CpG region of the CCAAT region in 35 biological samples of MSI + cancer (including HNPCC) and 199 MSI-cancer was examined.
  • Methylation of the 5 'region and the CCAAT region was significantly (Fisher's exact test ⁇ ⁇ 0.0001) observed in MSI + cancer.
  • methylation of the 5 'region was also observed in MSI-cancer, whereas methylation of the CCAAT region was not observed in MSI-cancer at all.
  • Table 1 also shows the sensitivity and specificity of MSI + cancer to MSI-cancer, positive likelihood ratio, and negative likelihood ratio in the detection of methylation of the 5 'region and the CCAAT region.
  • the sensitivity is 50% to 60% for both the 5 'region and the CCAAT region in the case of positive methylidani. This is because MSI + cancer includes HNPCC and sporadic MSI + cancer as described below.
  • the specificity is 85.9% for methylation detection in the 5 'region, whereas it is 100 for methylation detection in the CCAA T region. /. Met.
  • Table 2 shows the relationship between hMLHl protein and immunostaining (IHC).
  • FIG. 3 shows positive and negative examples of immunostaining (IHC) of hMLH1 protein.
  • FIG. 4 (a) shows the products of the nucleic acid amplification of the 5 ′ region and the CCAAT region of the seven cases of sporadic MSI + colorectal cancer in Table 3, Case No. 1 and No. 7, in Table 3. .
  • ⁇ 5 '' regionj and ⁇ CCAAT boxj '' indicate the case numbers in Table 3 with ⁇ 1 '' and ⁇ 7 '' at the top, respectively.
  • T in the lower row indicates the DNA extracted from the tumor part
  • ⁇ indicates the analysis result obtained from the DNA extracted from the normal mucosal part
  • ⁇ on the right end indicates a control for methylated DNA
  • U indicates a control for unmethylated DNA.
  • M below the photograph indicates that methylidani cytosine was detected.
  • Fig. 4 (b) the products of the nucleic acid amplification of the 5 'region and the CCAAT region in the seven cases of HNPCC colorectal cancer No. 3 to No. 9 in Table 4 are shown in Fig. 4 (b). This indicates that HNPCC colorectal cancer had cytosine methylated in the 5 region of 2 cases of No. 4 and 5, and the CCAAT region of 1 case of No. 4.
  • the symbols in Fig. 4 (b) are the same as above.
  • any one of the detections is sufficiently useful depending on the purpose, but by performing both the detections, it is possible to accurately detect MSI + colorectal cancer patients with sporadic MSI + colorectal cancer patients. It was confirmed that HNPCC patients could be accurately identified by distinguishing sporadic MSI + colorectal cancer patients from these MSI + colorectal cancer patients.
  • hMLHl is encoded.
  • the sensitivity and specificity of MSI + cancer to HNPCC, the positive likelihood ratio, and the negative likelihood ratio in the detection of methylation of the 5 ′ region of the gene and the CCAAT region were determined. The results are shown in the lower two rows of Table 5.
  • the positive likelihood ratio and the negative likelihood ratio in each of the above embodiments are calculated as sensitivity / (100% -specificity), and the negative likelihood ratio is calculated as (100% -sensitivity). ) / Calculated by specificity. For example, when a test method for detecting a certain disease is performed, if there is a possibility that the disease exists before the test (probability before the test), the likelihood ratio indicates that the test after the test is performed. It is possible to obtain the possibility (post-test probability) of the disease. Therefore, the larger the numerical value of the positive likelihood ratio and the smaller the numerical value of the negative likelihood ratio, the less error will be made in the diagnosis after the detection.
  • the positive likelihood ratios in each of the above examples were all relatively high, indicating values, and the negative likelihood ratios were all relatively low, indicating values.
  • the presence / absence of methylation of the CpG region in the gene to be analyzed can be determined easily and quickly. Can be detected.
  • the presence or absence of methylation of the CpG region in the promoter region of the gene encoding hMLHl can be easily identified. It is possible to determine whether it is due to. By performing this determination, it is possible to accurately identify whether the disease is sporadic MSI + colorectal cancer or HNPCC.

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Abstract

　本発明は、遺伝子中のＣｐＧ領域、特にｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域中のＣｐＧ領域のメチル化の有無を簡便に識別できる方法、この方法に用いるためのプライマー、プライマーセット、検査用試薬及び検査用試薬キットを提供する。 　本発明の方法は、ｈＭＬＨ１遺伝子のような解析対象遺伝子（ＤＮＡ）中のいずれかのＣｐＧ領域のメチル化されたシトシンを特異的に認識するプライマーと、前記メチル化の有無によらず目的遺伝子中のいずれかの領域に結合し、前記いずれかのＣｐＧ領域の存在する領域で核酸増幅により増幅産物を形成するプライマーの少なくとも２種のプライマーを、これらの２種のプライマーと一緒になって前記ＣｐＧ領域を含む領域を増幅することができる別のメチル化非特異的プライマーとともに用いる。  

Description

明 細 書
核酸増幅用プライマー及びこれを用いた大腸癌の検査方法
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子の CpG領域のメチル化の検出方法及びそれを利用した方法、こ れらの方法に使用するためのプライマー、プライマーセット、検查用試薬及び検查用 試薬キットに関する。特に、本発明は、大腸癌の臨床検査の分野において、散発性 大腸癌と遺伝性非腺腫性大腸癌とを識別 (スクリーニング)する方法、これに用いるた めのプライマー、プライマーセット、検查用試薬及び検查用試薬キットに関する。
^景技術
[0002] ヒトの大腸癌は、散発性 (非遺伝性)大腸癌と遺伝性大腸癌の 2種類に大別される。
そして、遺伝性大腸癌には、家族性腺腫性大腸癌 (以下適宜 八？」という。）と遺伝 性非腺腫性大腸癌 (以下「HNPCC」という。）の 2種類が存在する。
[0003] FAPは APC遺伝子の異常によるものであることが分かっており、多量のポリープを 産生するという形質的特徴により診断は比較的容易である。
[0004] 一方、 HNPCCは FAPのような形質的特徴を示さないため、その診断は困難であ つた。これまでは、 HNPCCの診断は、専ら家族歴を追跡することにより行われてい た力 依然として信頼できる診断基準（diagnostic criteria)が確立されていない。
[0005] 1993年に HNPCCの原因力 DNAミスマッチ修復タンパク質（mismatch repair protein； MMR proteins)をコードする遺伝子群（MMR genes； 以下適宜「MMR遺 伝子」という。 )に変異が起こって、その遺伝子修復タンパク質が機能しなくなり、その 結果、ヒトの遺伝子修復機構が機能しなくなることであることが分かった。具体的には 、 HNPCCの病理検体においては、 hMLHl、 hMSH2、 hMSH6、 hPMSl、 hPM S2の 5種の MMRタンパク質をコードする MMR遺伝子のいずれ力、 1つ以上に生殖 細胞変異が認められ、通常は、前 3種のタンパク質をコードする遺伝子のいずれか 1 つ以上に変異が認められる。このうち、 hMSH2をコードする遺伝子（以下適宜「hM SH2遺伝子」という。 )と hMLHlをコードする遺伝子（以下適宜「hMLHl遺伝子」と いう。 )の 2つの遺伝子の変異が主因であることが明らかになった。 [0006] また、免疫染色によるタンパク発現の検査において、この 3種のうち hMSH2と hMS H6のタンパク質発現が陰性である場合は、まず、間違いなく HNPCCであることが分 かっている。
[0007] 一方、 hMLHlタンパク質の異常は、 HNPCCのみでなぐ散発性（非遺伝性）大 腸癌の場合にも認められ、この両者を hMLHlタンパク質の免疫染色によって識別 することは困難である。もし識別するとするならば、 hMLHlタンパク質の免疫染色の みでなぐ hMLHlタンパク質をコードする遺伝子領域すベてをシーケンスするとい つた、 hMLHl遺伝子の突然変異の確認を行わなければならなレ、。し力、し、現在のと ころ、 HNPCCと臨床診断された患者のうち、遺伝子突然変異解析で遺伝子突然変 異を検出できるのは約 50%程度であり、残りについては原因の変異が検出できない 。また、この検出法には高い検出費用もかかる。 HNPCCは遺伝性疾患であり、その 診断には社会的 '倫理的'法的に注意を必要とする。そのため、効率良ぐ低コストで 、かつ、精度の高い検出方法が求められている。
[0008] 近年、 hMLHl遺伝子等の MMR遺伝子の変異は、 DNA中のマイクロサテライト（ microsatellite)反復配列の異常と関連していることが分かってきた。即ち、ある種の癌 細胞においては CAの繰り返し配列等に代表されるマイクロサテライトの反復回数が 、正常細胞のそれに比べて多くなつたり、少なくなつたりしている。こうした DNA内の 塩基配列の異常をマイクロサテライト不安定性（microsatellite instability, MSI + ,
MSI— Η)と呼ぶ。一方、マイクロサテライト反復配列の異常を示さないことをマイクロ サテライト安定 '性 (microsatellite
stability, MSS, MSI—， MSI—L)という。
[0009] この MSI+は HNPCCに認められる特徴である。一方、 HNPCCとは関係のない 散発性の大腸癌、胃癌などの多くの腫瘍で MSI +の性質を示す例が 12— 30 %の 頻度で存在することが明らかになった（以下において MSI +を示す散発性大腸癌を 適宜「散発性 MSI +大腸癌」という）。これら非遺伝性の MSI +腫瘍においては、 h MLH1や hMSH2遺伝子の突然変異の頻度が非常に低ぐ別の機序が考えられた が、近年、これらの腫瘍では 75— 90%以上の頻度で hMLHl遺伝子のプロモータ 一領域にメチルイ匕が起こり、 hMLHlタンパク質の発現が消失していることが明らか になった。
[0010] また、散発性 MSI +大腸癌細胞株においては、 hMLHlをコードする遺伝子のプ 口モーター領域内にある、 hMLHlを発現させるタンパク質である CBP結合因子（ CBP binding factor)である CCAAT boxの上流の CpG領域のメチル化が多く見ら れることが分かった。一方、 HNPCCの細胞株においては、この領域のメチル化は、 低い割合で起こっていることも分かってきた。
[0011] さらに、大腸癌の約 10— 20%を占める CIMP (CpG Island Methylator Phenotype) 癌においては、 hMLHlをコードする遺伝子を含む特定の遺伝子又は遺伝子座 (例 えば、 MINT2、 MINT31、及び pl6)において高頻度のメチル化が観察されることも わかっている。
[0012] また、 hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域内にある CpG領域の部位 によっては正常細胞にもメチル化が存在することも分かってきた。
[0013] 一般に、遺伝子のメチル化を検出する方法としては、 MSP法 (WO97/46705、 特表 2000-511776)、 MCA法（WO00/26401、特表 2002—533061)、 COB RA法などが存在する。しかし、 MCA法は、メチル化感受性制限酵素で切断し、末 端にリンカ一を付加した遺伝子断片をランダムに増幅するものであり、「未知の」メチ ル化されている遺伝子を探索する目的に適しているが、特定の解析対象遺伝子につ いて行うには不向きである。また、 COBRA法は、制限酵素による切断の工程を必要 とし、手間及びコストがかかり、使用する制限酵素の認識部位のみしか調べることが できず、そのため、メチルイ匕の有無を検討したい CpG領域を必ずしも解析できないと レ、う欠点を持つ。 MSP法は、制限酵素を用いないが、メチル化の解析を行う遺伝子 領域ひとつにつき、メチル化特異的プライマーのみを用いた PCRと非メチルイ匕特異 的プライマーのみを用いた PCRという 2回の PCRを必要とする。また、そのメチルイ匕 の有無の判定は、その PCR産物の有無によって行うため、 PCR自体のエラーを確認 できないという欠点を持つ。
発明の開示
[0014] 本発明者らは、そこで、 hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の CpG領 域のメチル化の有無、特に CCAAT box上流の CpG領域のメチル化の有無を簡便 に検出できる方法があれば、そのメチル化を検出することにより、散発性 MSI +大腸 癌を識別することが可能と考え、また、散発性 MSI +大腸癌を除外することにより HN PCCを効率よく識別することが可能と考えた。
[0015] そこで、本発明の目的は、制限酵素による切断の工程を必要とせず、遺伝子のメチ ル化状態、特に hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域中の CpG領域のメ チル化の有無を簡便に識別できる方法を提供することである。さらに、この検查方法 に用いるためのプライマー、プライマーセット、検查用試薬及び検查用試薬キットを 提供することである。
[0016] 力、かる実情において、本発明者らは、 hMLHlをコードする遺伝子（DNA)のプロ モーター領域中のいずれかの CpG領域のメチルイ匕されたシトシンを特異的に認識す るプライマーと、前記メチル化の有無によらず hMLHlをコードする遺伝子のプロモ 一ター領域中のいずれかの領域 (前記いずれかの CpG領域以外の領域が好ましレ、 。）に結合し、前記いずれかの CpG領域の存在する領域で核酸増幅によりオリゴヌク レオチドを形成するプライマーの少なくとも 2種のプライマーとを用いれば、前記 CpG 領域のメチルイ匕の有無を識別でき、これにより、 MSI +大腸癌であるカ MSI—大腸 癌であるかを精度よく識別することができることを見出した。そして、この検出方法は、 他の HNPCCの遺伝子診断よりも簡便で、かつ、低コストである。
[0017] また、検出原理は基本的にあらゆる遺伝子に適応可能であって、メチル化状態を 調べたい解析対象遺伝子は、何であってもよい。さらに、本発明の方法は、他の一般 的な遺伝子のメチル化状態検出方法と異なり、制限酵素での切断の工程を含まない ので、それらの方法と比較しても迅速 ·簡便であり、臨床検査において特に有利であ る。即ち、本発明の方法によれば、従来の検出技術の欠点をすベて補うことが可能 であり、核酸増幅は 1回のみでよぐメチルイ匕の有無を検討したい任意の CpG領域の 検討が可能であり、増幅過程自体のエラーはメチルイ匕非特異的プライマーによる PC R産物によって確認することが可能である。 COBRA法のように制限酵素を用いなレ、 ため、手間及びコストもかからなレ、。また、 MSP法よりも核酸増幅の回数が少なぐ増 幅過程自体のエラーの確認も可能なため、簡便かつ確実である。
[0018] また、この方法に、マイクロサテライト反復配列分析（以下適宜「MSI分析」という。 ) を組み合わせることにより、散発性 MSI +大腸癌であるか、 HNPCCであるかをより 精度よく識別することができることを見出した。
[0019] その上にまた、 DNAミスマッチ修復タンパク質の免疫染色分析（
immunohistochemical analysis ;以下適宜「IHC」という。）を組み合わせることにより、 散発性 MSI +大腸癌である力、、 HNPCCであるかを精度よく識別することができるこ とを見出した。
[0020] また、前記プライマーを用いた検查用試薬及び検查用試薬キットと合わせて本発明 を完成した。
[0021] 即ち、（1)本発明の第 1の態様は、以下の 1)一 10)のいずれ力、 1に記載のオリゴヌ クレオチドのうち少なくとも 1つを選択する核酸増幅用プライマーである：
1)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C PG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン 又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
2)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン 又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
3)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシ トシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
4)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシ トシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリ ゴヌクレ才チド；
5)配列番号 2— 7に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
6)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外 のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド； 7)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外 のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなる オリゴヌクレオチド；
8)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び C pG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列からなるオリゴヌ クレ才チド；
9)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び C pG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列に相補的な塩基 配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
10)前記 1)力 9)のいずれ力 1に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の 1ないし 複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり 、 CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
(2)本発明の第 2の態様は、以下の 1)一 10)のいずれ力 1に記載のオリゴヌクレオ チドのうち 2つ以上を選択する核酸増幅用プライマーセットである：
1)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン 又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
2)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン 又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
3)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシ トシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド； 4)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシ トシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリ ゴヌクレ才チド；
5)配列番号 2— 7に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
6)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外 のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
7)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外 のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなる オリゴヌクレオチド；
8)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び C pG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列からなるオリゴヌ クレ才チド；
9)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び C pG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列に相補的な塩基 配列からなるオリゴヌクレオチド；
10)前記 1)力 9)のいずれ力 1に記載のオリゴヌクレオチドのうち 1又は複数のオリゴ ヌクレオチドについて、 1ないし複数個の塩基が置換、欠失、揷入若しくは付加といつ た変異された塩基配列を含み、 CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出可能なプライ マー機能を有するオリゴヌクレオチド。
(3)本発明の第 3の態様は、組織中の hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター 領域の中にある 5 '領域又は CCAAT領域における CpG領域におけるシトシンのメチ ノレイ匕の有無を識別するために用いられるプライマーセットであって、少なくとも 1つの メチル化シトシン非特異的プライマーの融解温度が、メチルイ匕シトシン特異的プライ マーの融解温度より 1一 5°C高いことを特徴とする前記（2)記載の核酸増幅用プライ マーセットである。
[0024] (4)本発明の第 4の態様は、組織中の hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター 領域の中にある CCAAT領域における CpG領域におけるシトシンのメチル化の有無 を識別するために用いられるプライマーセットであって、プライマー同士の GC含有率 の差が 20%以内であることを特徴とする前記の（2)又は（3)記載の核酸増幅用ブラ イマ一セットである。
[0025] (5)本発明の第 5の態様は、配列番号 3に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号
4に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする前記（2)又は（3)記載の核 酸増幅用プライマーセットである。
(6)本発明の第 6の態様は、配列番号 2に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号
4に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする前記（2)又は（3)記載の核 酸増幅用プライマーセットである。
[0026] (7)本発明の第 7の態様は、配列番号 6に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号
7に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする前記（2)から (4)のレ、ずれ 力 1項記載の核酸増幅用プライマーセットである。
(8)本発明の第 8の態様は、配列番号 5に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号
7に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする前記（2)から (4)のレ、ずれ 力 1項記載の核酸増幅用プライマーセットである。
[0027] (9)本発明の第 9の態様は、前記（1)記載の核酸増幅用プライマーを使用し、 hM
LH1をコードする遺伝子のプロモーター領域における CpG領域のシトシンのメチル 化の有無を検査することを特徴とする散発性大腸癌と遺伝性非腺腫大腸癌の識別 方法である。
(10)本発明の第 10の態様は、組織中の hMLHlをコードする遺伝子のプロモータ 一領域の中にある 5 '領域又は CCAAT領域における CpG領域におけるシトシンのメ チル化の有無を指標とすることを特徴とする散発性大腸癌と遺伝性非腺腫大腸癌の 識別方法である。
[0028] (11)本発明の第 11の態様は、前記シトシンのメチル化の有無の検查を核酸増幅 方法により行う前記（9)又は（10)に記載の識別方法である。
(12)本発明の第 12の態様は、マイクロサテライト反復配列分析を組み合わせたこ とを特徴とする前記（9)から（11)のレ、ずれか 1項に記載の識別方法である。
(13)本発明の第 13の態様は、 DNAミスマッチ修復タンパク質の免疫染色分析を 組み合わせたことを特徴とする前記（9)から（12)のレ、ずれか 1項に記載の識別方法 である。
[0029] (14)本発明の第 14の態様は、前記（1)記載のプライマーを含む検查用試薬であ る。
(15)本発明の第 15の態様は、前記（1)記載のプライマーを含む検查用試薬キット である。
[0030] (16)本発明の第 16の態様は、以下の 1)一 9)のいずれか 1に記載のオリゴヌクレオ チドのうち少なくとも 1つを選択する核酸増幅用プライマーであって、解析対象遺伝 子の CpG領域中のシトシンのメチル化の有無を検出するためのプライマーである：
1)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリ ゴヌクレ才チド；
2)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な 塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
3)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配 歹 IJからなるオリゴヌクレオチド；
4)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配 列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
5)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基 配列からなるオリゴヌクレオチド； 6)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基 配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
7)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変 換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
8)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変 換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
9)前記 1)力、ら 8)のいずれ力、 1に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の 1ないし 複数個の塩基が置換、欠失、揷入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり 、 CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
[0031] (17)本発明の第 17の態様は、前記（16)記載のプライマーを少なくとも 3つ含む解 析対象遺伝子中の CpG領域のメチル化の有無を検出するための核酸増幅用プライ マーセットであって、この少なくとも 3つのプライマーが、
a)前記解析対象遺伝子中の少なくとも 1つの検出対象 CpG領域を含む部分が増 幅されるように選択され、かつ CpG領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後に シトシンのままであっても、ゥラシル又はチミンに転換されても、前記解析対象遺伝子 に結合する、 1対のメチルイヒ非特異的プライマー、及び
b)前記検出対象 CpG領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンで ある場合にのみ前記解析対象遺伝子に結合し、前記検出対象 CpG領域中のシトシ ンが前記修飾剤による修飾の後にゥラシノレ又はチミンに変換されれば前記解析対象 遺伝子に結合しなレ、、少なくとも 1つのメチル化シトシン特異的プライマー
である、プライマーセットである。
[0032] (18)本発明の第 18の態様は、解析対象遺伝子の CpG領域中（
化を検出する方法であって、
( 1 )試料由来の核酸を修飾剤によって修飾し、 (2)前記核酸を铸型として、以下のプライマー：
a)前記解析対象遺伝子中の少なくとも 1つの検出対象 CpG領域を含む部分が増 幅されるように選択され、かつ CpG領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後に シトシンのままであっても、ゥラシノレ又はチミンに転換されても、前記解析対象遺伝子 に結合する、 1対のメチルイヒ非特異的プライマー、及び
b)前記検出対象 CpG領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンで ある場合にのみ前記解析対象遺伝子に結合し、前記検出対象 CpG領域中のシトシ ンが前記修飾剤による修飾の後にゥラシノレ又はチミンに変換されれば前記解析対象 遺伝子に結合しなレ、、少なくとも 1つのメチル化シトシン特異的プライマー
を用いて前記解析対象遺伝子核酸を増幅し、
(3)前記増幅産物を検出する
工程を含むことを特徴とする方法である。
(19)本発明の第 19の態様は、前記メチル化シトシン特異的プライマー及び前記メ チル化シトシン非特異的プライマーカ それぞれ以下の 1)一 9)のいずれ力 1に記載 のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも 1つを選択するプライマーである、前記（18)記 載の方法である：
1)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリ ゴヌクレ才チド；
2)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な 塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
3)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配 歹 IJからなるオリゴヌクレオチド；
4)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配 列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド； 5)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基 配列からなるオリゴヌクレオチド；
6)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基 配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
7)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変 換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
8)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変 換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
9)前記 1)力 8)のいずれ力 1に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の 1ないし 複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり 、 CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
[0034] (20)本発明の第 20の態様は、前記解析対象遺伝子が、 hMLHl、 hMSH2、 hM SH6、 hPMSl、 hPMS2を含む DNAミスマッチ修復タンパク質をコードする遺伝子 群及びその他の大腸癌関連遺伝子群から選択される、前記（18)記載の方法である
[0035] (21)本発明の第 21の態様は、前記解析対象遺伝子における検出対象 CpG領域 におけるシトシンのメチルの有無を、試料の由来する個体における大腸癌の存在又 は分類と関連づけるための、前記（18)記載の方法である。
[0036] (22)本発明の第 22の態様は、前記検出対象 CpG領域が 2力所以上であり、前記
)のメチルイ匕シトシン特異的プライマーを 2種類以上用いる、前記（18)記載の方法で める。
図面の簡単な説明
[0037] [図 1]は、 hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域においてメチル化された )有無を示す塩基配列の例である。
園 2]は、本発明の検査方法の概要を示す模式図である。
[図 3]は、 hMLHlの免疫染色の実施例である。
園 4]は、本発明の実施に係る核酸増幅の産物の例を示す写真図である。
発明を実施するための最良の形態
[0038] 以下、 hMLH 1遺伝子を解析対象遺伝子とした場合にっレ、て詳細に説明するが、 本発明は任意の遺伝子に対して適用可能であり、本発明における解析対象遺伝子 は hMLHl遺伝子に限定されない。
(検出原理）
核酸を修飾剤によって修飾すると、メチル化されている塩基は修飾されない。
[0039] 例えば、 hMLHlをコードする遺伝子（一本鎖 DNA)のプロモーター領域中の Cp G領域においては、メチルイ匕されたシトシンは重亜硫酸修飾によって脱ァミノ化され にくく、シトシンのままで存在するとされる。一方、メチル化されていないシトシンは、そ のすベて又はその殆んどが重亜硫酸修飾によってー且ゥラシノレに転換され、この転 換されたゥラシルは、これを含む一本鎖 DNAを増幅すると、チミンとして複製される。
[0040] そこで、基本的に、いずれかの CpG領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシト シンである場合にのみ前記 hMLHlをコードする遺伝子に結合し、前記いずれかの CpG領域 CpG領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にゥラシルに変換されれば前 記 hMLHlをコードする遺伝子に結合しなくなるプライマー（メチルイ匕シトシン特異的 プライマー、以下適宜「メチル化特異的プライマー」という。）と、前記いずれかの CpG 領域 CpG領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンのままであっても、ゥラシ ル（遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおレ、ては、このゥラシノレの部位（ 位置）にはチミンが置かれる。）に転換されても、前記 hMLHlをコードする遺伝子に 結合し、前記シトシンの存在する CpG領域を含む領域で核酸増幅によりオリゴヌタレ ォチドを形成するプライマー（メチルイヒシトシン非特異的プライマー、以下適宜「メチ ル化非特異的プライマー」という。）との少なくとも 2種を、これらの両方の各々と対に なって前記 CpG領域を含む領域を増幅し得る別のメチル化非特異的プライマーとと もに用いて、核酸増幅方法にて増幅した産物を検出すると、前記メチル化されたシト シンを含む遺伝子に対しては、メチル化特異的プライマーとメチルイヒ非特異的プライ マー由来の 2種の増幅産物が検出される力 S、メチル化されていないシトシンのみを含 む遺伝子に対しては、メチル化非特異的プライマー由来の 1種の増幅産物のみが検 出される。よって、検出される増幅産物の違いに基づいて、前記 CpG領域のメチル 化の有無を識別することができる。
[0041] 本発明においては、メチル化特異的プライマーであれ、メチル化非特異的プライマ 一であれ、プライマーが少なくとも 1つの CpG領域（その CpG領域中にメチル化シト シンが存在する）を含むオリゴヌクレオチドを選択する。ここで、「プライマーが少なくと も 1つの CpG領域を含むオリゴヌクレオチドを選択する」とは、そのプライマーが核酸 中の前記少なくとも 1つの CpG領域を含むオリゴヌクレオチドの領域に結合し、前記 少なくとも 1つの CpG領域を含むオリゴヌクレオチドを含む核酸を铸型として、核酸増 幅により前記 CpG領域に対応する領域 (一般には前記 CpG領域に対して相補的で ある。）を含む核酸を形成することをいう。したがって、プライマーと、そのプライマーが 選択する（即ち結合する)オリゴヌクレオチドとは、基本的に互いに相補的な配列を有 する。
[0042] 本発明においては、メチル化特異的プライマーは、検出しょうとするメチル化シトシ ンの存在する CpG領域に結合するように設計される。一方、メチル化非特異的プライ マーは、前記メチル化シトシンの存在する CpG領域に結合しないように設計されるが 、前記メチル化シトシンの存在する CpG領域に結合するものとなってもよい。
[0043] 本発明においては、配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子（一本鎖 D NA)のプロモーター領域中で、塩基番号 1031から 1216の間の領域（以下、この領 域を適宜「5 '領域」若しくは「5 ' region]とレ、う。）の CpG領域のシトシンのメチル化の 有無を識別できるプライマーセットと、塩基番号 1369から 1600の間の領域（以下こ の領域を適宜「CCAAT領域」若しくは「CCAAT region」という。）の CpG領域のシ トシンのメチル化の有無を識別できるプライマーセットが見出された。特に、 CCAAT 領域のシトシンのメチルイ匕は hMLHlの発現に深く関与している可能性があるので、 後者のプライマーセットは、 HNPCCの診断において重要であると考えられる。
[0044] 図 1に、散発性大腸癌と診断された試料と HNPCCと診断された試料について CC AAT領域にぉレ、て重亜硫酸処理をして核酸増幅した部分の塩基配列を示す。図中 、 CCAAT boxの上流の矢印で示される位置の塩基は、散発性 MSI +大腸癌の試 料では、いずれもシトシンとして検出されているのに対して、 HNPCCの試料では、い ずれもチミンとして検出されている。即ち、散発性大腸癌の試料では、いずれもこの 部位のシトシンがメチル化されているため、重亜硫酸処理の後もシトシンのまま存在 し、シトシンとして検出されるのに対して、 HNPCCの試料では、いずれもこの部位の シトシン力 Sメチル化されていないため、重亜硫酸処理の後にー且ゥラシルに転換され 、核酸増幅の後にチミンとして検出されている。
(プライマーとプライマー用のオリゴヌクレオチド）
本発明においては、メチル化特異的プライマーは、メチル化解析の対象となる hM LH1をコードする遺伝子のプロモーター領域の CpG領域中のシトシンに対応する部 位のみがシトシンに対応した塩基であり、前記プロモーター領域中のそれ以外のシト シンに対応する部位は、ゥラシル若しくはチミンに対応するように設計される。メチル 化特異的プライマーは、擬陽性を低減させるためには、好ましくは 2力所以上の CpG 領域を含むように設計する。一方、メチル化非特異的プライマーは、 hMLHlをコー ドする遺伝子のプロモーター領域の CpG領域のシトシンがゥラシル若しくはチミンに 転換された配列、シトシンのままの配列の双方に対応するように設計される。
[0045] 一般に、メチル化特異的 PCRでは、プライマー配列と重亜硫酸修飾後の DNA配 歹 IJとが完全に相補的にアニーリングしたときにのみ DNAの増幅が起こり、プライマー 配列と重亜硫酸修飾後の DNA配列との間に 1塩基以上のミスマッチが存在するとき には DNAの増幅がおこらないようにプライマー及び PCRの反応系を設計する。この ことによって、メチル化特異的 PCRでは、 1塩基のメチルイ匕の有無も識別することが できる。
[0046] 本発明においてプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、各種の核酸合成 反応において必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができ る。
[0047] 具体的には、プライマーは、以下の 1)一 10)のいずれか 1に記載のオリゴヌクレオ チドのうち少なくとも 1つを選択する核酸増幅用プライマーである。 1)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン 又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチ ドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の 2本鎖 DNAのうちの重亜硫酸修飾後 による 1本鎖 DNA由来のものである。メチルイ匕特異的プライマーはこのオリゴヌタレ ォチドを選択し得る力 このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化特 異的プライマーに限られず、メチルイ匕非特異的プライマーであってもよい。
2)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン 又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド 。このオリゴヌクレオチドは、 1)で表されるオリゴヌクレオチドを含む核酸を錡型として 、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列の一部と同じ塩基配列を 有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で铸型として用いられる。メチル化特 異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得る力 このオリゴヌクレオチドを選 択するプライマーは、メチル化特異的プライマーに限られず、メチル化非特異的ブラ イマ一であってもよい。
3)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシ トシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。このォ リゴヌクレオチドは、生体試料力 採取した遺伝子の 2本鎖 DNAのうちの重亜硫酸修 飾後による 1本鎖 DNA由来のものである。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマ 一はメチル化非特異的プライマーとされる。
4)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシ トシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリ ゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、 3)で表されるオリゴヌクレオチドを含む核 酸を錡型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列の一部と同 じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で铸型として用いられる 。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化非特異的プライマーとされ る。
5)配列番号 2— 7に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。プライマーが別の プライマーを認識して結合すれば、核酸増幅に好適である。
6)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外 のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。こ のオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の 2本鎖 DNAのうち の 1)において示した 1本鎖 DNAに相補的に結合していた 1本鎖（反対鎖） DNA由 来のものである。メチルイ匕特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが
、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化特異的プライマーに限ら れず、メチル化非特異的プライマーであってもよい。
7)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外 のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなる オリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、 6)で表されるオリゴヌクレオチドを铸型 として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有 する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で铸型として用いられる。メチル化特異 的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得る力 このオリゴヌクレオチドを選択 するプライマーは、メチル化特異的プライマーに限られず、メチル化非特異的プライ マーであってもよい。
8)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び C pG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列からなるオリゴヌ クレオチド。このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料力 採取した遺伝子の 2本 鎖 DNAのうちの 3)において示した 1本鎖 DNAに相補的に結合していた 1本鎖（反 対鎖） DNA由来のものである。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル 化非特異的プライマーとされる。 9)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び C pG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列に相補的な塩基 配列からなるオリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、 8)で表されるオリゴヌタレ ォチドを铸型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ 塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で铸型として用いられる。 このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化非特異的プライマーとされる
10)前記 1)力 9)のいずれ力、 1に記載のオリゴヌクレオチドのうち 1又は複数のオリゴ ヌクレオチドについて、 1ないし複数個の塩基が置換、欠失、揷入若しくは付加といつ た変異された塩基配列を含み、 CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出可能なプライ マー機能を有するオリゴヌクレオチド。
[0048] より具体的には、ある実施態様においては、 5'領域中の CpG領域のシトシンのメチ ル化の有無を識別するために用いられるメチルイヒ特異的プライマーは、 5'領域中の 少なくとも 1つの CpG領域中のシトシン以外のシトシンをゥラシノレ又はチミンに変換し た配列を持ったオリゴヌクレオチドを選択するものである。
[0049] 詳しくは、このプライマーは、 5 '領域中の前記少なくとも 1つの CpG領域中のシトシ ンは重亜硫酸修飾後もシトシンのままで存在して、 5'領域中の前記少なくとも 1つの CpG領域中のシトシン以外のシトシンは、重亜硫酸修飾後にゥラシルに変換されても (遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおレ、ては、このゥラシノレの部位に はチミンが置かれる）、変換されずにシトシンのままで存在しても、その配列をもった オリゴヌクレオチドを選択するものである。
[0050] 本実施形態においては、 5'領域中の CpG領域のシトシンのメチルイ匕の有無を識別 するために用いられるメチルイ匕特異的プライマーとしては、配列番号 3で表されるオリ ゴヌクレオチドがある。このプライマーは、 hMLHlタンパク質をコードする遺伝子の 塩基配列 1097から 1118の部位を認識して、その遺伝子に結合する。
[0051] 5'領域中の CpG領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメ チル化非特異的プライマーは、 5 '領域中における CpG領域以外の領域に結合する ように設計されることが好ましい。もし、 CpG領域を含む領域に結合するようにせざる を得ない場合には、前記 CpG領域中のシトシンのメチル化の有無によらず、前記 Cp G領域を含む領域に結合するように設計されるものである。
[0052] 詳しくは、このメチル化非特異的プライマーは、 5'領域中における CpG領域以外の 領域に結合するように設計されることが好ましい。もし、 CpG領域を含む領域に結合 するようにせざるを得ない場合には、前記 CpG領域中のシトシンのメチルイ匕の有無に 影響を受けないように、すなわち、 CpG領域中のシトシンがゥラシルに変換された場 合、また、シトシンのまま変換されない場合の双方の配列を増幅するように設計される ことが好ましい。具体的には、前記 CpG領域中のシトシンの部位に対応するメチルイ匕 非特異的プライマーの部位に混合塩基、又はイノシン 3リン酸 (ITP)由来のイノシン（ ヒポキサンチン）を配置した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがこの種のメチルイ匕 非特異的プライマーである。
[0053] 本実施形態においては、 5'領域中の CpG領域のシトシンのメチル化の有無を識別 するために用いられるメチルイ匕非特異的プライマーとしては、配列番号 2又は 4で表 されるオリゴヌクレオチドがある。配列番号 2で表されるプライマーは、 hMLHlタンパ ク質をコードする遺伝子の塩基配列 1031から 1055の部位を認識して、その遺伝子 に結合する。また、配列番号 4で表されるプライマーは、 hMLHlタンパク質をコード する遺伝子の塩基配列 1191から 1216の部位を認識して、その遺伝子に結合する。
[0054] 上記配列番号 3で表されるメチル化特異的プライマーと、配列番号 2で表されるメチ ル化非特異的プライマーと、配列番号 4で表されるメチル化非特異的プライマーとの 合計 3種のプライマーセットを用いれば、 5 '領域中の CpG領域のシトシンのメチル化 の有無を識別できる。
[0055] 即ち、図 2の模式図に示されるように、 5 '領域において、メチル化特異的プライマー である配列番号 3で表される 5' _MSプライマー（メチル化特異的上流プライマー）と 、メチル化非特異的プライマーである配列番号 2で表される 5' _Sプライマー（メチル 化非特異的上流プライマー）と、メチル化非特異的プライマーである配列番号 4で表 される 5 '— ASプライマー（メチル化非特異的下流プライマー）の 3種のプライマーを 用いて、核酸増幅法にて核酸を増幅する。そのとき、この CpG領域のシトシン力 Sメチ ノレィ匕された試料においては、 5， -MSプライマーも含めた 3種のプライマーがすべて 遺伝子に結合する。そして、 5 '— MSプライマーと 5'— ASプライマーから核酸増幅し て形成される 118塩基のメチル化断片と、 5 ' _Sプライマーと 5'_ASプライマーから 核酸増幅して形成される 184塩基の非メチル化断片の 2つの DNA断片が形成され る。一方、この CpG領域のシトシンカ^チル化されていない試料においては、 5 '— M Sプライマーを除いた 2種のプライマーのみが遺伝子に結合するため、結果的に、 5 ' —Sプライマーと 5 '— ASプライマーカも核酸増幅して形成される 184塩基の非メチル 化断片のみが形成される。よって、検出される増幅産物の違いに基づいて、前記 Cp G領域のメチルイ匕の有無を識別することができる。
[0056] また、別の実施態様によれば、 CCAAT領域中の CpG領域のシトシンのメチル化 の有無を識別するために用いられるメチルイ匕特異的プライマーは、 CCAAT領域中 の少なくとも 1つの CpG領域中のシトシン以外のシトシンをゥラシル又はチミンに変換 した配列を持ったオリゴヌクレオチドを選択する（即ち、前記オリゴヌクレオチドに結合 する）ものである。
[0057] 詳しくは、このプライマーは、 CCAAT領域中の前記少なくとも 1つの CpG領域中の シトシンは重亜硫酸修飾後もシトシンのままで存在して、 CCAAT領域中の前記少な くとも 1つの CpG領域中のシトシン以外のシトシンは、重亜硫酸修飾後にゥラシルに 変換されても（遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおいては、このゥラシ ルの部位にはチミンが置かれる）、変換されずにシトシンのままで存在しても、その配 列をもったオリゴヌクレオチドを選択するものである。
[0058] 本実施形態においては、 CCAAT領域中の CpG領域のシトシンのメチル化の有無 を識別するために用いられるメチルイ匕特異的プライマーとしては、配列番号 6で表さ れるオリゴヌクレオチドがある。このプライマーは、 hMLHlタンパク質をコードする遺 伝子の塩基配列 1479から 1502の部位を認識して、その遺伝子に結合する。
[0059] CCAAT領域中の CpG領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いら れるメチルイ匕非特異的プライマーは、 CCAAT領域中における CpG領域以外の領 域に結合するように設計されることが好ましい。もし、 CpG領域を含む領域を認識し てその領域に結合するようにせざるを得ない場合には、前記 CpG領域中のシトシン のメチル化の有無によらず、前記 CpG領域を含む領域に結合するように設計される ものである。
[0060] 詳しくは、このメチル化非特異的プライマーは、 CCAAT領域中における CpG領域 以外の領域に結合するように設計されることが好ましい。もし、 CpG領域を含む領域 に結合するようにせざるを得ない場合には、前記 CpG領域中のシトシンのメチル化の 有無に影響を受けないように、すなわち、 CpG領域中のシトシンがゥラシノレに変換さ れた場合、また、シトシンのまま変換されない場合の双方の配列を増幅するように設 計されることが好ましい。具体的には、前記 CpG領域中のシトシンの部位に対応する メチル化非特異的プライマーの部位に混合塩基、又はイノシン 3リン酸 (ITP)由来の イノシン (ヒポキサンチン）を配置した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがこの種の メチル化非特異的プライマーである。
[0061] 本実施形態においては、 CCAAT領域中の CpG領域のシトシンのメチル化の有無 を識別するために用いられるメチルイ匕非特異的プライマーとしては、配列番号 5又は 7で表されるオリゴヌクレオチドがある。配列番号 5で表されるプライマーは、 hMLHl タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列 1368から 1394の部位を認識して、その 遺伝子に結合する。また、配列番号 7で表されるプライマーは、 hMLHlタンパク質を コードする遺伝子の塩基配列 1575から 1600の部位を認識して、その遺伝子に結合 する。
[0062] 上記配列番号 6で表されるメチル化特異的プライマーと、配列番号 5で表されるメチ ル化非特異的プライマーと、配列番号 7で表されるメチル化非特異的プライマーとの 合計 3種のプライマーセットを用いれば、 CCAAT領域中の CpG領域のシトシンのメ チル化の有無を識別できる。
[0063] 即ち、図 2の模式図に示されるように、 CCAAT領域において、メチル化特異的プラ イマ一である配列番号 6で表される CCAAT— MSプライマー（メチル化特異的上流 プライマー）と、メチル化非特異的プライマーである配列番号 5で表される CCAAT— Sプライマー (メチル化非特異的上流プライマー）と、メチル化非特異的プライマーで ある配列番号 7で表される CCAAT— ASプライマー (メチル化非特異的下流プライマ 一）の 3種のプライマーを用いて、核酸増幅法にて核酸を増幅する。そのとき、この C pG領域のシトシンカ チル化された試料にぉレ、ては、 CCAAT— MSプライ も含 めた 3種のプライマーがすべて遺伝子に結合する。そして、 CCAAT— MSプライマ 一と CCAAT— ASプライマーカ 核酸増幅して形成される 122塩基のメチルイ匕断片 と、 CCAAT— Sプライマーと CCAAT— ASプライマーカ 核酸増幅して形成される 2 32塩基の非メチル化断片の 2つの DNA断片が形成される。一方、この CpG領域の シトシン力 Sメチル化されてレヽなレ、試料にぉレ、ては、 CCAAT— MSプライ を除レヽ た 2種のプライマーのみが遺伝子に結合するため、結果的に、 CCAAT— Sプライマ 一と CCAAT— ASプライマーカも核酸増幅して形成される 232塩基の非メチルイ匕断 片のみが形成される。よって、検出される増幅産物の違いに基づいて、前記 CpG領 域のメチルイ匕の有無を識別することができる。
プライ オリゴヌクレオチドは、公知の方法により製造することができ、例えば、リ ン酸トリエステル法や、リン酸アミダイト法、リン酸基部位無保護法といった固相化学 的合成法を用いることができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置 (Applied Biosystem社製、 Expedite Model 8909)等を用いて合成することができる。また、 1な いし複数個の塩基を置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異させたオリゴヌタレ ォチドも公知の固相化学的合成法で合成することができる。
(プライ セット）
本発明のプライ セットは、上述の本発明のプライ を 2つ以上、好ましくは少 なくとも 3つ含む。この少なくとも 3つのプライマーは、
a)解析対象遺伝子中の少なくとも 1つの検出対象 CpG領域を含む部分が増幅され るように選択され、かつ CpG領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシ ンのままであっても、ゥラシル又はチミンに転換されても、前記解析対象遺伝子に結 合する、 1対のメチル化非特異的プライ 及び
b)前記検出対象 CpG領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンで ある場合にのみ前記解析対象遺伝子に結合し、前記検出対象 CpG領域中のシトシ ンが前記修飾剤による修飾の後にゥラシ 又はチミンに変換されれば前記解析対象 遺伝子に結合しなレ、、少なくとも 1つのメチル化シトシン特異的プライマー
であると好都合である。 [0065] 解析対象遺伝子が hMLHlである実施態様について説明すれば、本発明で組織 中の hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の中にある 5'領域又は CCA AT領域における CpG領域におけるシトシンのメチルイ匕の有無を識別するために用 レ、られる核酸増幅用プライマーセットにおいては、少なくとも 1つのメチルイ匕シトシン 非特異的プライマーの融解温度を、メチル化シトシン特異的プライマーの融解温度よ り 1一 5°C高くなるようにプライマーを設計することが好ましい。また、いずれのメチル 化シトシン非特異的プライマーの融解温度も、いずれのメチル化シトシン特異的ブラ イマ一の融解温度より 1一 5°C高くなるようにプライマーを設計するとより好ましい。ここ に、プライマーの融解温度とは、プライマーがオリゴヌクレオチドに結合する至適温度 のことをいう。このように、プライマーを設計した後、核酸増幅のアニーリング時の温度 を、いずれかのメチルイ匕シトシン非特異的プライマーの融解温度よりも低ぐまたメチ ル化シトシン特異的プライマーの融解温度より高くすれば、ある CpG領域中のシトシ ンが重亜硫酸修飾の後にシトシンでないにもかかわらず、メチル化特異的プライマー が铸型のオリゴヌクレオチドと結合して、擬陽性の結果を生ずることを防止することが できるからである。また、このようにプライマーを設計すればメチルイ匕の有無を考慮し なレ、、 PCRにおけるコントロール産物（すなわち、 2種類のメチル化非特異的プライマ 一により合成される産物）を検出しやすくなる。
[0066] 本発明で組織中の hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の中にある C CAAT領域における CpG領域におけるシトシンのメチルイ匕の有無を識別するために 用いられる核酸増幅用プライマーセットにおいては、プライマー同士の GC含有率の 差を 20%以内にすることが好ましい。ここに、プライマーの GC含有率とは、プライマ 一の全塩基配列中グァニンとシトシンを合わせた塩基数の割合のことをレ、う。例えば 、それぞれ 100塩基からなる 2つのプライマーがあり、 1つ目のプライマーの GCの数 力 で、もう 1つのプライマーの GCの数が 50であれば GC含有率の差は 5%である とされる。このとき、プライマーの GC含有率は、メチル化シトシン特異的プライマーを 低くするとよい。このように、プライマーを設計すれば、擬陽性の結果を生ずることを 防止することができ、かつ再現性のょレ、結果を得やすくなるので好ましレ、。
(検査方法） 本発明における検査方法は、具体的には、試料の準備、 DNAの抽出、 DNAの修 飾、プライマーを用いた遺伝子増幅、 DNAの検出の過程を含む。
[0067] (検査用試料'病理検体の準備）
本発明の検查方法に供される、ヒトの試料は hMLHlタンパク質をコードする遺伝 子を含むものであればよぐ特に限定されない。具体的には、生体から採取した組織 の他、血液、血清、糞便、精液、唾液、脳脊髄液等が挙げられる。生体から採取した 組織としては、例えば、手術により切除した大腸癌の組織や、手術前の内視鏡検查 等に用レ、る生体検查材料等が、試料の有効利用の点で好適に用レ、られる。
[0068] (DNAの抽出）
本発明の検查方法に供される、ヒトの試料は、プレンダーを用いて組織を破砕し、 次いで、フエノール'クロロフォルム法等の公知の遺伝子抽出法により、 DNAを抽出 し、検查用試料として用いる。
[0069] (DNAの修飾）
前記 DNAは重亜硫酸塩によって修飾される。これにより、メチル化されたシトシン は、シトシンのまま存在する力 メチル化されていないシトシンは、一旦ゥラシルに転 換された後、チミンとして発現することになる。本発明に使用される重亜硫酸塩は特 に限定されないが、重亜硫酸ナトリウムが好適に用いられる。また、上記のような重亜 硫酸塩と同等の機能を有するものを修飾剤として用いることができる。
[0070] さらに具体的には、例えば、まず、 200pg力ら 50 μ gの DNAをアルカリ条件下にて 変性させる。変性の条件は、 PCRの測定系に適した条件であればよいが、例えば、 0 . 2M— 0· 3Mの NaOH溶液中にて、 37°Cで 5— 30分インキュベートする。次いで、 ハイドロキノン溶液及び pH5. 0の重亜硫酸ナトリウム溶液を終濃度がそれぞれ 0. 5 mM及び 3. ImMになるように添加し、 50 55°Cにて 16— 40時間インキュベートす ることで、非メチルイ匕シトシンが修飾される。さらに、段階的な透析を行うことで余剰の 重亜硫酸を除去する。透析された試料は、真空オーブンによる濃縮又はエタノール 沈殿の後、適当な緩衝液又は純水に溶解し、通常の PCR又はメチルイ匕特異的 PCR に用いることができる。
[0071] (遺伝子'核酸増幅） 本発明において、遺伝子増幅方法としては、公知の方法を使用することができ、例 えば、 PCR法、 NASBA法、 LAMP法等が挙げられる。好ましくは、 PCR法が用いら れる。
[0072] PCR法により増幅された産物の塩基配列を決定する方法としては、 Frommer et. al.
(Pro Natl. Acad. Sci. USA 89, 1827-1831(1992))及び Clark et. al. (Nucleic Acids Research 22, 2990-2997 (1994))等の方法がある。
[0073] (DNAの検出）
メチル化特異的 PCRによって増幅された DNAの検出は、例えば、一般的なァガロ ースゲル又はポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、 DNAの染色によって行われる。 染色方法としては、銀染色による方法、ェチジゥムブロマイド、 SYBRR Green等の 蛍光性染色剤等による方法がある。また、電気泳動以外の方法として、 5'ェキソヌク レアーゼアツセィゃ蛍光共鳴エネルギー転移を利用したホモジニァス検出も可能であ る。
[0074] (MSI分析）
本発明の検査方法は、まず、マイクロサテライト反復配列分析 (MSI分析）を行って 、マイクロサテライト不安定性 (MSI + )を示す散発性 MSI +大腸癌と HNPCCの検 体を識別（スクリーニング）した後に用いれば、 hMLHlをコードする遺伝子の変異に 基づく前記 MSI +が、散発性 MSI +大腸癌である力、 HNPCCであるかを、より精 度よく識別することできる。 MSI分析は、例えば、癌細胞の遺伝子と正常細胞の遺伝 子とでマイクロサテライト領域を含む領域を PCR増幅し、電気泳動によって増幅産物 の鎖長を調べることにより解析できる。即ち、癌細胞の遺伝子と正常細胞の遺伝子と では、増幅産物の鎖長が異なるので、これを基に塩基配列を決定し、マイクロサテラ イトが不安定である（MSI + )か、安定である（MSI—又は MSS)かを判定できる。
[0075] (hMLHlの免疫染色）
本発明の検查方法は、前記 MSI分析に加えて、 hMLHlの免疫染色分析 (IHC) を組み合わせることにより、前記 CpG領域のメチルイ匕の有無を識別できて、 hMLHl をコードする遺伝子の変異が、散発性大腸癌であるか、 HNPCCである力、をさらに精 度よく識別することできる。図 3に示すように、 hMLHlの免疫染色分析においては、 CpG領域力 Sメチル化されていれば、 hMLHlが発現されにくくなり、免疫染色におい て陰性となる率が高くなる。一方、 CpG領域カ チルイ匕されていなければ、 hMLHl は発現されやすくなるので、免疫染色において陽性となる率が高くなる。 hMLHlの 免疫染色分析においては、抗体として hMLHlのモノクローナル抗体を用レ、、色素と してダイアミノベンチジン（diaminobenzidine)を用いるのが好適である。
[0076] (生体試料の判定）
本発明において、メチル化特異的 PCR検查を実施すると、 MSI +を示す散発性大 腸癌の検体においては、 5'領域と CCAAT領域の 2箇所において、シトシンのメチル ィ匕が 80%以上の高い割合で検出されるのに対して、 MSI +を示す HNPCCの検体 においては、 5 '領域と CCAAT領域の 2箇所において、シトシンのメチル化が 20% 以下の低い割合で検出される。よって、 hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター 領域における CpG領域のシトシンのメチル化の有無を識別することで、散発性 MSI +大腸癌と HNPCCを識別することができる。
[0077] (検査用試薬及び検査用試薬キット）
本発明はまた、組織中の hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における CpG領域における CpGのシトシンのメチルイ匕の有無を散発性大腸癌と遺伝性非腺 腫大腸癌の判定のための指標とする検査方法に用いられる検査試薬及び検査試薬 キットを含む。検査試薬としては、メチル化特異的核酸増幅用のプライマー、ェキソヌ クレアーゼ、核酸検出用の標識等、本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいず れであってもよい。
[0078] また、検査用試薬キットは、本発明の検査方法に使用されるあらゆる試薬のうち少 なくとも 2以上をキットとして使用するものであればよレ、。例えば、 hMLHlをコードす る遺伝子（DNA)のプロモーター領域中の CpG領域のメチル化特異的プライマーと メチル化非特異的プライマーセット等が例示される。その他、蛍光標識をプローブし た DNAも本キットに含めてもよい。
実施例
[0079] 以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例 に限定されるものではない。 (実施例 1)
採取された大腸癌 234症例の組織試料について、 MSI分析を行い、 MSI +と MSI 一の 2種類に大腸癌を分類した。 MSI分析は、公知の手法にしたがって行った。
[0080] MSI +、 MSI—と診断された癌患者について、 hMLHlをコードする遺伝子のプロ モーター領域の 5 '領域中及び CCAAT領域中の 2箇所の CpG領域のシトシンのメ チル化の有無を調べた。具体的には以下のようにして行った。この実施例の方法の 概要、即ちこの実施例において使用したプライマー及び増幅産物の関係、及び結果 の判定の概略を図 2に示す。
[0081] 1.試料の用意
生体試料から DNAを通常のフエノール'クロ口ホルム法で抽出した。生体試料より 抽出した DNA lOOngに、 DNA修飾キット「CpGenome (Intergen社）」を用いて重 亜硫酸ナトリウムによる非メチル化シトシンの修飾を行った。
[0082] 2— A 5'領域の CpG領域のシトシンのメチル化の検出
上記 1.のように用意した重亜硫酸修飾済みの DNAの一部に対してメチル化特異 的 PCR及びメチル化非特異的 PCRを実施した。重亜硫酸修飾済みの DNA (铸型） を、 1 X PCR緩衝液（15mM MgClを含む）、 1. 25ユニットの DNAポリメラーゼ「
2
HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen社）」、各々 200 μ Μの dATP、 dGTP、 dTTP 及び dCTP、及び 2 μ Μプライマー（後述）を含む 50 の PCR反応液に加え、 5 '領 域のメチルイ匕の検出のために、 95°C/0. 5分、 54°C/0. 5分、 72°C/0. 5分、 35 サイクルの PCR反応を実施した。
[0083] 本実施例においては、 hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の 5'領域 の CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出するためのメチルイ匕特異的なプライマーとし ては、配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の 5 ' 領域の CpG領域以外にあるシトシン以外のすべてのシトシンをチミン又はゥラシルに 変換した配列及びその相補鎖から、下記のオリゴヌクレオチドを選択した（以下、塩 基番号は配列番号 1中の対応する塩基の番号を表す)。
[0084] メチル化特異的上流プライマー（5，一 MSプライマー）
(塩基番号 1097 - 1118) (配列番号 3) 5， -CGTTCGTCGTTCGTTCGTTATATATC-3 '
また、 hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の 5'領域の CpG領域のシ トシンのメチル化を検出するためのメチルイ匕非特異的なプライマーとしては、配列番 号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の 5'領域の CpG領 域にあるすベてのシトシンをチミン又はゥラシルに変換した配列及びその相補鎖から 、下記のオリゴヌクレオチドを選択した。
[0085] メチル化非特異的上流プライマー（5 '_Sプライマー）
(塩基番号 1031—1055) (配列番号 2)
5， -TTTTTTTTAGGAGTGAAGGAGGTTA-3 '
メチル化非特異的下流プライマー（5 '— ASプライマー）
(塩基番号 1191 - 1216) (配列番号 4)
5， -CRATAAAACCCTATACCTAATCTATC-3 '
なお、配列番号 4中の 2番目の Rは、アデニン A又はグァニン G (つまりプリン）を表 す。
[0086] 例えば、 5，一 Sプライマー及び 5，一 ASプライマーのペアにより hMLHlをコードする 遺伝子の 5 '領域の DNAが増幅され、図 2に示される 184塩基の DNA断片ひ No-specific fragment」）が検出される力 5 '_MSプライマー及び 5 '— ASプライマー のペアにより hMLHlをコードする遺伝子の 5 '領域の DNAが増幅されず、図 2に示 される 118塩基のDNA断片（「Methylated fragment」）が検出されない場合には、前 記プライマーで増幅される領域中にメチルイ匕されたシトシンが存在しなレ、か、存在し ても検出限界を下回るほど微量であり、メチル化は陰性と判断した。
[0087] 一方、 5 ' _Sプライマー及び 5 '— ASプライマーのペアにより hMLHlをコードする 遺伝子の 5 '領域の DNAが増幅され、図 2に示される 184塩基の DNA断片が検出さ れ、 5 ' _MSプライマー及び 5'_ASプライマーのペアにより hMLHlをコードする遺 伝子の 5 '領域の DNAも増幅され、図 2に示される 118塩基の DNA断片も検出され る場合には、前記プライマーで増幅される領域中にメチル化されたシトシンとメチル 化されていないシトシンが共存していると考えられ、この場合、メチルイ匕は陽性と判断 した。 [0088] 2-B CCAAT領域の CpG領域のシトシンのメチル化の検出
上記 1.のように用意した重亜硫酸修飾済みの DNAの一部に対してメチル化特異 的 PCR及びメチル化非特異的 PCRを実施した。重亜硫酸修飾済みの DNA (铸型） を、 1 X PCR緩衝液（15mM MgClを含む）、 1. 25ユニットの DNAポリメラーゼ「
2
HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen社）」、各々 200 μ Μの dATP、 dGTP、 dTTP 及び dCTP、及び 2 μ Mプライマー（後述）を含む 50 μ Lの PCR反応液に加え、 CC AAT領域のメチル化の検出のために、 95°C/0. 5分、 58°CZ0. 5分、 72°CZ0. 5分、 35サイクルの PCR反応を実施した。
[0089] 本実施例においては、 hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の CCAA T領域の CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出するためのメチルイ匕特異的なプライ マーとしては、配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領 域の CCAAT領域の CpG領域以外にあるシトシン以外のすべてのシトシンをチミン 又はゥラシルに変換した配列及びその相補鎖から、下記のオリゴヌクレオチドをブラ イマ一として選択した。
[0090] メチル化特異的上流プライマー（CCAAT— MSプライマー）
(塩基番号 1479-1502) (配列番号 6)
5 ' -YGTATTTTTCGAGTTTTTAAAAAC-3 '
なお、配列番号 6中の 1番目の Yはシトシン C又はチミン T (つまりピリミジン）を表す
[0091] また、 hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の CCAAT領域の CpG領 域のシトシンのメチルイ匕を検出するためのメチル化非特異的なプライマーとしては、 配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の CCAAT 領域の CpG領域にあるすベてのシトシンをチミン又はゥラシノレに変換した配列及び その相補鎖から、下記のオリゴヌクレオチドを選択した。
[0092] メチル化非特異的上流プライマー（CCAAT— Sプライマー）
(塩基番号 1369—1394) (配列番号 5)
5 ' -GAGGAGGAGTTTGAGAAGIGTTAAGT-3 '
メチル化非特異的下流プライマー（CCAAT— ASプライマー） (塩基番号 1575 - 1600) (配列番号 7)
5， -TAAATCTCTTCITCCCTCCCTAAAAC-3 '
なお、配列番号 7中の 12番目の Iはイノシン 3リン酸（ITP)由来のイノシン（ヒポキサ
[0093] 例えば、 CCAAT—Sプライマー及び CCAAT—ASプライマーのペアにより hMLH 1をコードする遺伝子の CCAAT領域の DNAが増幅され、図 2に示される 232塩基 の DNA断片（「No-specific fragmentj )が検出されるが、 CCAAT—MSプライマー及 び CCAAT—ASプライマーのペアにより hMLHlをコードする遺伝子の CCAAT領 域の DNAが増幅されず、図 2に示される 122塩基の DNA断片（「Methylated fragment」）が検出されない場合には、前記プライマーで増幅される領域中にメチル 化されたシトシンが存在しなレ、か、存在しても検出限界を下回るほど微量であり、メチ ル化は陰性と判断した。
[0094] 一方、 CCAAT—Sプライマー及び CCAAT—ASプライマーのペアにより hMLHl をコードする遺伝子の CCAAT領域の DNAが増幅され、図 2に示される 232塩基の DNA断片が検出され、 CCAAT— MSプライマー及び CCAAT— ASプライマーのぺ ァにより hMLHlをコードする遺伝子の CCAAT領域の DNAも増幅され、図 2に示さ れる 122塩基の DNA断片も検出される場合には、前記プライマーで増幅される領域 中にメチル化されたシトシンとメチル化されてレヽなレヽシトシンが共存してレ、ると考えら れ、この場合、メチルイ匕は陽性と判断した。
[0095] 3. hMLHlタンパクの免疫染色法
免疫染色は、合計 75例の試料にっレ、て行った。
[0096] 定法にしたがってホルマリン固定し、パラフィンに包埋した組織試料に、 Tyramide signal Amplincation Biotin system (Perkin Elmer, Boston,
MA)を使用した。
[0097] 4. 遺伝子修復タンパク質遺伝子の変異分析 (mutation
analysis;
hMLHl, hMSH2、 hPMSl、 hPMS2、及び hMSH6の 5個の遺伝子変異分析 は、 MSI +と診断された 35例の試料についてダイレクトシーケンス法及び免疫染色 法によって行った。
[0098] 5. 結果
上記の手法により、 234症例の大腸癌全体に対して検討を行った。 MSI分析の結 果、 234症例の大腸癌は、 35例の MSI +癌（HNPCCを含む）及び 199例の MSI— 癌に分類された。すなわち、 35例の MSI +癌（HNPCCを含む）及び 199例の MSI —癌の生体試料について hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の 5'領域 と CCAAT領域の CpG領域のシトシンのメチル化及び非メチル化を調べた。
[0099] その結果を表 1に示す。
[0100] [表 1]
Figure imgf000032_0001
P <0.0001
5'領域及び CCAAT領域のメチル化は有為に（フィッシャーの正確検定 ρ< 0· 00 01) MSI +癌に認められた。一方、 5 '領域のメチル化が MSI—癌においても認めら れたのに対し、 CCAAT領域のメチル化は MSI—癌においては一切認められなかつ た。
[0101] また、この 5 '領域及び CCAAT領域のメチル化検出検查における MSI +癌の MS I -癌に対する感度及び特異度、陽性尤度比及び陰性尤度比も併せて表 1に示す。 5 '領域及び CCAAT領域のメチルイ匕陽性の場合は共に感度は 50%から 60%である 。これは後述するように MSI +癌に HNPCC及び散発性 MSI +癌が含まれるためで ある。一方、特異度は、 5 '領域のメチル化検出では 85. 9%であるのに対し、 CCAA T領域のメチル化検出では 100。/。であった。 [0102] このことより CCAAT領域のメチル化検出検査を行うことは、 MSI +癌を見逃す（ false-negative)可能性が 5'領域のメチル化検出よりもやや高いが、特異度が極めて 高いため、誤診 (false-positive)を避けることが可能であると考えられる。逆に、 5'領 域のメチル化検出検查を行うことは、 false-negativeの可能性が CCAAT領域のメチ ル化検出よりもやや低いが、特異度がやや劣るため、わずかながら false-positiveが 生じる可能性を有すると考えられる。いずれの検查も、 MSI +癌の発見に有用である ことが明らかになった。
[0103] また、 hMLHlタンパクの免疫染色（IHC)との関係を表 2に示す。図 3に、 hMLHl タンパクの免疫染色（IHC)の陽性例及び陰性例を示す。
[0104] [表 2]
Figure imgf000033_0001
pく 0. 0001 免疫染色は合計 75症例に対して行われた。 5 '領域及び CCAAT領域のメチル化 は hMLHlタンパク発現との間に強い相関関係を示した（フィッシャーの正確検定 p < 0. 0001)。し力し、 5 '領域にメチル化を認めた症例 25例のうち 6症例に hMLHl 免疫染色陽性が認められたのに対し、 CCAAT領域にメチル化を認めた症例 18症 例はすべて陰性であった。なお、この免疫染色陰性症例の中には hMLHl遺伝子 に突然変異を持つ HNPCC症例も含まれている。このため、 5'領域にメチル化を認 めない、かつ、 hMLHl免疫染色陰性例 6症例のうち 2症例に hMLHl遺伝子に突 然変異を認めた。また、同様に CCAAT領域にメチル化を認めなレ、、かつ、 hMLHl 免疫染色陰性例 7症例のうち、 2症例に hMLHl遺伝子に突然変異を認めた（後出 の表 3、表 4参照）。
[0105] 次に、 MSI +と診断された 35症例に対して検討を行った。 MSI +と診断された 35 症例のうち、散発性大腸癌と診断された 19症例と、家族歴の追跡等により HNPCC と診断された 16症例に対して、上記と同様の解析を行った。結果を表 3及び表 4の左 側の欄にそれぞれ示す。
[0106] [表 3]
Figure imgf000035_0001
逢節C HN316 θ
o
Figure imgf000036_0001
s 表 3及び表 4において、「M」=メチル化検出、「U」=メチルイ匕検出せず、「n」=陰 性、「p」=陽性を表す。
[0108] 表 3に示す散発性 MSI +大腸癌の 19症例においては、 5'領域のシトシンのメチノレ ィ匕（「M」 )が 18症例で見られ、 CCAAT領域のシトシンのメチル化（「M」 )が 16症例 で見られた。一方、表 4に示す HNPCCの 16症例においては、 5 '領域のシトシンの メチル化は 3症例でしか見られず、 CCAAT領域のシトシンのメチル化（「M」）も 2症 例でしか見られなかった。このこと力、ら、散発性 MSI +大腸癌と 5'領域及び CCAAT 領域のシトシンのメチルイ匕（「M」）との間には有為な相関関係が認められた（フイツシ ヤーの正確検定 p< 0. 0001)。一方、 HNPCCと 5'領域及び CCAAT領域のシトシ ンの非メチルイ匕（「U」 )との間にも有為な相関関係が認められることが分かった（フイツ シヤーの正確検定 p < 0. 0001)。
[0109] また、表 3における散発性 MSI +大腸癌の症例 No. 1力、ら No. 7までの 7例の 5 '領 域及び CCAAT領域の核酸増幅の産物を図 4 (a)に示す。これは、散発性 MSI +大 腸癌の症例 No. 1力ら No. 7までの 7例がすべて、 5 '領域及び CCAAT領域におい てメチル化されたシトシンを有したことを示すものである。なお、図 4 (a)において、「5' regionj及び「CCAAT boxjの各々につレ、て、最上段の「1」一「7」はぞれぞれ表 3に おける症例 No.を示し、その下の段の「T」は腫瘍部分から抽出された DNAを、「Ν」 はその正常粘膜部分から抽出された DNAより得られた解析結果を示す。右端の「Μ 」はメチル化 DNAのコントロールを、「U」は非メチル化 DNAのコントロールを示す。 写真の下の「M」は、メチルイ匕シトシンが検出されたことを示す。
[0110] また、表 4における HNPCC大腸癌の症例 No. 3力ら No. 9までの 7例の 5'領域及 び CCAAT領域の核酸増幅の産物を図 4 (b)に示す。これは、 HNPCC大腸癌の症 例 No. 4と 5の 2例の 5，領域、及び No. 4の 1例の CCAAT領域においてメチル化さ れたシトシンを有したことを示すものである。図 4 (b)中の記号については上記と同様 である。
[0111] また、上記 35症例について、遺伝子修復（MMR)タンパク質である hMLHl、 hM SH2、 hPMSl、 hPMS2、及び hMSH6の 5個について、遺伝子の変異分析（ mutation analysis)及びタンパク質の免疫染色分析（IHC)を行った。表 3の中央（「 Mutation Analysis]の欄及び「IHC
of MMR」の欄）に示すように、散発性 MSI +大腸癌の 19症例においては、遺伝子の 変異及び hMLHl以外の遺伝子修復タンパク質の消失を示すデータは現れなかつ た（空欄は変異又はタンパク質の消失が検出されなかったことを示す)。一方、表 4に 示すように、 HNPCCの 16症例においては、比較的多くの症例において、遺伝子の 変異とそれによる遺伝子修復タンパク質の消失が見られた。
[0112] さらに、上記 35症例について、大腸癌と関連する他の 6種の遺伝子又は遺伝子座 、即ち、 MINT2、 pl6、 MINT31、 CACNA1G、 MINT1、 pl4をコードする遺伝子 又は遺伝子座のメチル化の状態を調べた。表 3の右側（「Methylation」 )の欄に示す ように、散発性 MSI +大腸癌の 19症例においては、どの遺伝子又は遺伝子座にお いても高レ、割合でメチル化（「M」）が検出された (表中、「U」は非メチル化を示す)。 一方、表 4に示すように、 HNPCCの 16症例においては、どの遺伝子又は遺伝子座 においてもメチル化の検出された割合は低かった。
[0113] この 35症例の検査結果のもとに、 MSI +大腸癌症例に対して hMLHlをコードす る遺伝子の 5'領域及び CCAAT領域のメチル化の検出検査における MSI +癌の H NPCCに対する感度及び特異度、陽性尤度比及び陰性尤度比を求めた。結果を表 5の上 2段に示す。
[0114] [表 5]
Figure imgf000039_0001
表 5に示すように、 MSI +大腸癌において、散発性 MSI +大腸癌を見逃さずに検 出する場合は、 5'領域のメチルイヒ検出検査の方が CCAAT領域のメチル化の検出 検査よりも優れていることが感度より示された。一方、散発性 MSI +大腸癌を誤診せ ずに検出する場合は、 CCAAT領域のメチルイヒの検出検査の方が 5 '領域のメチル 化検出検査よりも優れてレ、ることが特異度より示された。
[0115] 以上から、 目的に応じていずれか一方の検查でも充分有用であるが、双方の検查 を行うことにより、 MSI +大腸癌患者力 散発性 MSI +大腸癌患者を精度よく検出 することが可能であり、そしてこの MSI +大腸癌患者から散発性 MSI +大腸癌患者 を識別することにより HNPCC患者を精度よく識別できることが確認された。
[0116] また、遺伝子修復タンパク質である hMLHl、 hMSH2、 hPMSl、 hPMS2、及び hMSH6の 5個についての免疫染色分析（MMR IHC)において、どれかに陰性 (一 )を示す症例において、 hMLHlをコードする遺伝子の 5'領域及び CCAAT領域の メチル化の検出検查における MSI +癌の HNPCCに対する感度及び特異度、陽性 尤度比及び陰性尤度比を求めた。結果を表 5の下 2段に示す。
[0117] 表 5に示すように、 MMR IHC (—)大腸癌において、散発性 MSI +大腸癌を見逃 さずに検出する場合は、 5'領域のメチルイヒ検出検査の方が CCAAT領域のメチル 化の検出検査よりも優れていることが感度より示された。一方、散発性 MSI +大腸癌 を誤診せずに検出する場合は、 CCAAT領域のメチル化の検出検査の方が 5 '領域 のメチルイヒ検出検査よりも優れていることが特異度より示された。
[0118] 以上から、遺伝子修復タンパク質である hMLHl、 hMSH2、 hPMSl、 hPMS2、 及び hMSH6の 5個の免疫染色分析（MMR IHC)を行った際においても、 5 '領域 及び CCAAT領域のメチルイヒ検出検査を行うことによって、 MSI +大腸癌患者から 散発性 MSI +大腸癌患者を精度よく検出することが可能であり、そしてこの MSI + 大腸癌患者から散発性 MSI +大腸癌患者を識別することにより HNPCC患者を精 度よく識別できることが確認された。
2-C 他の遺伝子のメチルイヒ状態の検出
さらに、 MSI +大腸癌症例に対して MINT2、 pl6、 MINT31、 CACNA1G、 MI NT1、 pl4をコードする遺伝子座及び遺伝子のメチル化の検出感度及び特異度、 陽性尤度比及び陰性尤度比を求めた。結果を表 6に示す。
[0119] この例においても散発性 MSI +大腸癌患者の HNPCC患者に対する MINT2、 pi 6、 MINT31、 CACNA1G、 MINT1、 p l 4をコードする遺伝子座及び遺伝子のメチ ル化 5 ¾fの検出感度及び特異度は高いことが分かった。
[表 6] ミ画 +
0
8
O
00〉 1 ¾ ,
Figure imgf000041_0001
上記の各実施例に於ける陽性尤度比及び陰性尤度比であるが、陽性尤度比は、 感度/ (100%-特異度）で算出され、陰性尤度比は（100%-感度) /特異度で算 出される。例えばある疾患を検出する検査方法を行うとした場合、その検査前におけ るその疾患である可能性 (検查前確率）があるとすると、尤度比により、その検查を行 つた後のその疾患である可能性 (検查後確率）を求めることが可能である。よって、陽 性尤度比の数値は大きければ大きい程、陰性尤度比の数値は小さければ小さい程、 その検查を行った後の診断に誤りがなくなる。上記の各実施例における陽性尤度比 はすべて比較的高レ、値を示し、陰性尤度比はすべて比較的低レ、値を示した。
[0121] このように、本実施例によれば、 MSI +という表現型を持つ、又は MMR IHC (-) が認められる大腸癌の検体に対し、 hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領 域の 5 '領域と CCAAT領域の CpG領域のシトシンのメチルイ匕の検出を行うことにより 、散発性 MSI +大腸癌を精度よく識別することによって、 MSI +という表現型を持つ 、又は MMR IHC (一）が認められる大腸癌症例から散発性 MSI +大腸癌を除外 することにより、 HNPCC症例を精度よく識別することができることが確認された。
[0122] 以上説明したように、本発明に係る核酸増幅用プライマー及びこれを用いた遺伝 子のメチル化検出方法によれば、解析対象遺伝子中の CpG領域のメチル化の有無 を簡便 ·迅速に検出することができる。特に、大腸癌の検査方法としての態様におい ては、 hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域中の CpG領域のメチル化の 有無を簡便に識別でき、それに基づいて、 hMLHlタンパク質の失活がメチル化に よるものなのかどうかを判定することが可能である。この判定を行うことにより、散発性 MSI +大腸癌である力、 HNPCCであるかを精度よく識別することができる。
[0123] この出願は、平成 15年 8月 29日出願の日本特許出願、特願 2003—209838に基 づくものであり、特願 2003—209838の明細書及び特許請求の範囲に記載された内 容は、すべてこの出願明細書に包含される。

Claims

請求の範囲
[1] 以下の 1)一 10)のいずれ力、 1に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも 1つを選 択する核酸増幅用プライマー：
1)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C PG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン 又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
2)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン 又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
3)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシ トシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
4)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシ トシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリ ゴヌクレ才チド；
5)配列番号 2— 7に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
6)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外 のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
7)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外 のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなる オリゴヌクレオチド；
8)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び C
：ン又はゥラシノレに変換された塩基配列からなるオリゴヌ クレ才チド；
9)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び C pG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列に相補的な塩基 配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
10)前記 1)力 9)のいずれ力、 1に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の 1ないし 複数個の塩基が置換、欠失、揷入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり 、 CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
[2] 以下の 1)一 10)のいずれ力、 1に記載のオリゴヌクレオチドのうち 2つ以上を選択す る核酸増幅用プライマーセット：
1)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン 又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
2)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン 又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
3)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシ トシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
4)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域における C pG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシ トシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリ ゴヌクレ才チド；
5)配列番号 2— 7に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
6)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外 のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
7)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン以外 のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなる オリゴヌクレオチド；
8)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び C pG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列からなるオリゴヌ クレ才チド；
9)配列番号 1で表される hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の 相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在するシトシン及び C pG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配列に相補的な塩基 配列からなるオリゴヌクレオチド；
10)前記 1)力 9)のいずれ力 1に記載のオリゴヌクレオチドのうち 1又は複数のオリゴ ヌクレオチドについて、 1ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といつ た変異された塩基配列を含み、 CpG領域のシトシンのメチルイヒを検出可能なプライ マー機能を有するオリゴヌクレオチド。
[3] 組織中の hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の中にある 5'領域又は CCAAT領域における CpG領域におけるシトシンのメチルイ匕の有無を識別するため に用いられるプライマーセットであって、少なくとも 1つのメチル化シトシン非特異的プ ライマーの融解温度が、メチルイ匕シトシン特異的プライマーの融解温度より 1一 5°C高 レ、ことを特徴とする請求の範囲 2記載の核酸増幅用プライマーセット。
[4] 組織中の hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の中にある CCAAT領 域における CpG領域におけるシトシンのメチルイ匕の有無を識別するために用いられ るプライマーセットであって、プライマー同士の GC含有率の差が 20%以内であること を特徴とする請求の範囲 2又は 3記載の核酸増幅用プライマーセット。
[5] 配列番号 3に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号 4に記載のオリゴヌクレオチド を選択することを特徴とする請求の範囲 2又は 3記載の核酸増幅用プライマーセット。
[6] 配列番号 2に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号 4に記載のオリゴヌクレオチド を選択することを特徴とする請求の範囲 2又は 3記載の核酸増幅用プライマーセット。
[7] 配列番号 6に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号 7に記載のオリゴヌクレオチド を選択することを特徴とする請求の範囲 2から 4のいずれ力、 1項記載の核酸増幅用プ フ マ" ~セット。
[8] 配列番号 5に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号 7に記載のオリゴヌクレオチド を選択することを特徴とする請求の範囲 2から 4のいずれ力、 1項記載の核酸増幅用プ フ マ" ~セット。
[9] 請求の範囲 1記載の核酸増幅用プライマーを使用し、 hMLHlをコードする遺伝子 のプロモーター領域における CpG領域のシトシンのメチル化の有無を検查することを 特徴とする散発性大腸癌と遺伝性非腺腫大腸癌の識別方法。
[10] 組織中の hMLHlをコードする遺伝子のプロモーター領域の中にある 5'領域又は CCAAT領域における CpG領域におけるシトシンのメチルイ匕の有無を指標とすること を特徴とする散発性大腸癌と遺伝性非腺腫大腸癌の識別方法。
[11] 前記シトシンのメチルイヒの有無の検査を核酸増幅方法により行う請求の範囲 9又は
10に記載の識別方法。
[12] マイクロサテライト反復配列分析を組み合わせたことを特徴とする請求の範囲 9から
11のレ、ずれか 1項に記載の識別方法。
[13] DNAミスマッチ修復タンパク質の免疫染色分析を組み合わせたことを特徴とする 請求の範囲 9から 12のいずれ力 1項に記載の識別方法。
[14] 請求の範囲 1記載のプライマーを含む検査用試薬。
[15] 請求の範囲 1記載のプライマーを含む検查用試薬キット。
[16] 以下の 1)一 9)のいずれ力、 1に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも 1つを選択 する核酸増幅用プライマーであって、解析対象遺伝子の CpG領域中のシトシンのメ チル化の有無を検出するためのプライマー：
1)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリ ゴヌクレ才チド； 2)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な 塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
3)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配 歹 IJからなるオリゴヌクレオチド；
4)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配 列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
5)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基 配列からなるオリゴヌクレオチド；
6)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基 配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
7)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変 換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
8)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変 換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
9)前記 1)力、ら 8)のいずれ力、 1に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の 1ないし 複数個の塩基が置換、欠失、揷入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり 、 CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
[17] 請求の範囲 16記載のプライマーを少なくとも 3つ含む解析対象遺伝子中の CpG領 域のメチル化の有無を検出するための核酸増幅用プライマーセットであって、この少 なくとも 3つのプライマーが、 a)前記解析対象遺伝子中の少なくとも 1つの検出対象 CpG領域を含む部分が増 幅されるように選択され、かつ CpG領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後に シトシンのままであっても、ゥラシル又はチミンに転換されても、前記解析対象遺伝子 に結合する、 1対のメチルイヒ非特異的プライマー、及び
b)前記検出対象 CpG領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンで ある場合にのみ前記解析対象遺伝子に結合し、前記検出対象 CpG領域中のシトシ ンが前記修飾剤による修飾の後にゥラシノレ又はチミンに変換されれば前記解析対象 遺伝子に結合しなレ、、少なくとも 1つのメチル化シトシン特異的プライマー
である、プライマーセット。
[18] 解析対象遺伝子の CpG領域中のシトシンのメチル化を検出する方法であって、
( 1 )試料由来の核酸を修飾剤によって修飾し、
(2)前記核酸を錡型として、以下のプライマー：
a)前記解析対象遺伝子中の少なくとも 1つの検出対象 CpG領域を含む部分が増 幅されるように選択され、かつ CpG領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後に シトシンのままであっても、ゥラシル又はチミンに転換されても、前記解析対象遺伝子 に結合する、 1対のメチルイヒ非特異的プライマー、及び
b)前記検出対象 CpG領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンで ある場合にのみ前記解析対象遺伝子に結合し、前記検出対象 CpG領域中のシトシ ンが前記修飾剤による修飾の後にゥラシノレ又はチミンに変換されれば前記解析対象 遺伝子に結合しない、少なくとも 1つのメチル化シトシン特異的プライマー
を用いて前記解析対象遺伝子核酸を増幅し、
(3)前記増幅産物を検出する
工程を含むことを特徴とする方法。
[19] 前記メチル化シトシン特異的プライマー及び前記メチルイヒシトシン非特異的プライ マーが、それぞれ以下の 1)一 9)のいずれか 1に記載のオリゴヌクレオチドのうち少な くとも 1つを選択するプライマーである、請求の範囲 18記載の方法：
1)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在
-ミン又はゥラシルに変換された塩基配列からなるオリ ゴヌクレ才チド；
2)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変換された塩基配列に相補的な 塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
3)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配 歹 IJからなるオリゴヌクレオチド；
4)前記解析対象遺伝子における CpG領域を 1以上含み、前記 CpG領域中に存在 するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基配 列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
5)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基 配列からなるオリゴヌクレオチド；
6)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はゥラシノレに変換された塩基 配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
7)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変 換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
8)前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖における CpG領域を 1以上含み、前記 Cp G領域中に存在するシトシン及び CpG領域以外のシトシンがチミン又はゥラシルに変 換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
9)前記 1)力、ら 8)のいずれ力、 1に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の 1ないし 複数個の塩基が置換、欠失、揷入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり 、 CpG領域のシトシンのメチルイ匕を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌタレ ォチド。
[20] 前記解析対象遺伝子が、 hMLHl、 hMSH2、 hMSH6、 hPMSl、 hPMS2を含 む DNAミスマッチ修復タンパク質をコードする遺伝子群及びその他の大腸癌関連遺 伝子群から選択される、請求の範囲 18記載の方法。
[21] 前記解析対象遺伝子における検出対象 CpG領域におけるシトシンのメチルの有無 を、試料の由来する個体における大腸癌の存在又は分類と関連づけるための、請求 の範囲 18記載の方法。
[22] 前記検出対象 CpG領域が 2力所以上であり、前記 b)のメチルイ匕シトシン特異的ブラ イマ一を 2種類以上用いる、請求の範囲 18記載の方法。
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