CN116479132B - 膀胱癌甲基化位点标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了膀胱癌甲基化位点标志物及其应用。本发明筛选出一组膀胱癌DNA甲基化位点标志物，包括cg01362243、cg07351192、cg06829686和cg26595643四个甲基化位点。本发明还提供了上述位点标志物的筛选方法、检测试剂盒及其用途，以及基于上述位点标志物构建的膀胱癌辅助诊断模型、该模型的构建方法和膀胱癌辅助诊断系统。本发明通过筛选膀胱癌特异性DNA甲基化位点标志物，并基于筛选出的标志物的甲基化水平构建膀胱癌辅助诊断系统，为膀胱癌的早期诊断和大规模筛查提供了切实有效的技术手段。

Description

膀胱癌甲基化位点标志物及其应用

技术领域

本发明涉及膀胱癌甲基化位点标志物及其应用，具体涉及以尿液甲基化DNA作为生物标志物的膀胱癌诊断试剂盒、膀胱癌辅助诊断模型及该模型的构建方法和辅助诊断系统，属于生物医学诊断技术领域。

背景技术

膀胱癌是发生在膀胱黏膜上的泌尿系统最常见的恶性肿瘤。根据2020年癌症临床统计数据，膀胱癌在总人群中发病率排名第12位，而在男性人群中发病率排名第6位，死亡率排名第9位。临床诊断中膀胱癌分为2种病理类型：70％～75％新发患者被诊断为非肌层浸润性膀胱癌(Non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)，约25％新发患者被诊断为肌层浸润性膀胱癌(Muscle invasive bladder cancer，MIBC)，其中有5％～10％MIBC患者会发生肿瘤转移。NMIBC包括发病于膀胱上皮黏膜层的Ta期、发病于黏膜下层浸润的T1期和发病于原位的Tis期肿瘤，它们在NMIBC中分别占约70％、20％和10％。膀胱癌早期Ta期患者占据大部分比例，因此对膀胱癌Ta期进行无创精准检测是十分必要的。而在治疗方面，目前针对NMIBC患者采取的一线治疗方案是经尿道膀胱肿瘤切除术(Trans urethralresection of bladder tumor，TURBt)，术后约有70％患者复发，而15％患者向晚期病理进展，因此膀胱癌患者需要长期诊断监控，人均终身治疗费用最高。

在膀胱癌诊断监控方面，膀胱镜检查是金标准，具有高灵敏度，但是它属于侵入性的有创检测，会引起患者不适，而且检测花费高昂。另外临床有2种尿液无创诊断——尿细胞学检查和UroVysion荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)。尿细胞学检查具有高特异性，但灵敏度很低，只有25％～35％，对于低分级膀胱癌Ta期检测甚至只有4％～15％。而FISH检测的灵敏度稍微高一些，在60％～80％，但同样对低分级膀胱癌的检测灵敏度也很低。因此，目前亟需开发无创有效的膀胱癌分子诊断技术，以降低患者痛苦并提高诊断及治疗监控效果。在无创诊断技术开发中，尿液样本因其与膀胱癌病灶直接接触而具备天然的肿瘤早期检测优势。

尿液活检是目前主要的肿瘤无创诊断手段，该非侵入性诊断方法通过对尿液中肿瘤DNA分子进行分析以获取有效的诊断信息，而甲基化是液体活检无创诊断的主流分子标志物。DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下改变分子遗传表现。研究发现在许多肿瘤发生早期，抑癌基因甲基化增强，因此DNA甲基化是肿瘤早期检测的优秀生物标记物。以往研究发现某些甲基化基因可以作为膀胱癌候选生物标记物。目前已经有一些研究团队开发了膀胱癌生物标志物检测方法，其中不少是尿液DNA甲基化检测。例如，广州基准医疗开发的utMeMA，通过飞行时间质谱平台检测尿液肿瘤多个DNA甲基化位点，建立基于2个甲基化标志物的诊断模型，该模型在膀胱癌早期检测的灵敏度仅有64.5％。再如广州达健生物科技开发的泌安健，通过qMSP(quantitative methylation-specific polymerase chain reaction，甲基化特异性荧光定量PCR)技术检测尿液膀胱癌多个DNA甲基化位，仅依据检测位点的PCR delta CT数值阈值进行膀胱癌阳性和阴性判断，缺乏系统的诊断模型，单个甲基化位点依靠单个阈值判断容易引起误诊和漏诊。这些方法的灵敏度和特异度仍有待提高，尤其是在膀胱癌早期的诊断。另外，基于飞行时间质谱平台(如utMeMA)或者二代高通量测序平台的检测成本较高，且检测结果受不同仪器设备的影响非常大，不适合膀胱癌大规模人群的诊断筛查。

发明内容

本发明的目的是：针对现有技术中膀胱癌诊断手段和诊断标志物的不足，本发明提供一种膀胱癌甲基化位点标志物及其应用，基于本发明的膀胱癌甲基化位点标志物制备诊断试剂盒和构建诊断模型，有助于通过无创检测实现临床上膀胱癌的早期诊断和大规模筛查。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种用于检测膀胱癌的DNA甲基化位点标志物，所述甲基化位点标志物选自chr20:45160389、chr3：5137773、chr1：47910843和chr10：118899291中的至少一种；

其中，所述chr20:45160389的位点编号为cg01362243；

所述chr3：5137773的位点编号为cg07351192；

所述chr1：47910843的位点编号为cg06829686；

所述chr10：118899291的位点编号为cg26595643。

本发明的第二方面提供提供了上述用于检测膀胱癌的DNA甲基化位点标志物或检测其甲基化水平的试剂在制备膀胱癌检测产品中的应用。

优选地，所述检测产品包括检测试剂盒。

优选地，所述检测甲基化水平的试剂为通过甲基化特异性荧光定量PCR方法检测所述DNA甲基化位点标志物的甲基化水平所用到的试剂，其中，检测样本为受试者尿液。

优选地，所述试剂包括检测所述DNA甲基化位点标志物的甲基化检测引物对和探针。

优选地，所述甲基化检测引物对包括以下引物对中的至少一组：

用于检测位点cg01362243的引物对，其序列如SEQ ID NO:1～2所示；

用于检测位点cg07351192的引物对，其序列如SEQ ID NO:3～4所示；

用于检测位点cg06829686的引物对，其序列SEQ ID NO:5～6所示；

用于检测位点cg26595643的引物对，其序列如SEQ ID NO:7～8所示；

和/或，所述甲基化检测探针包括以下探针中的至少一种：

用于检测位点cg01362243的探针，其序列如SEQ ID NO:11所示；

用于检测位点cg07351192的探针，其序列如SEQ ID NO:12所示；

用于检测位点cg06829686的探针，其序列如SEQ ID NO:13所示；

用于检测位点cg26595643的探针，其序列如SEQ ID NO:14所示。

优选地，还包括用于检测内参基因GAPDH的引物对，所述引物对的序列如SEQ IDNO:9～10所示；

和/或，还包括用于检测内参基因GAPDH的探针，所述探针的序列如SEQ ID NO:15所示

本发明的第三方面提供了一种基于上述用于检测膀胱癌的DNA甲基化位点标志物构建诊断模型的方法，所述诊断模型包括膀胱癌辅助诊断模型、上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型或膀胱癌特异性辅助诊断模型，所述方法具体包括以下步骤：

步骤1)：分别收集用作膀胱癌辅助诊断模型、上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型或膀胱癌特异性辅助诊断模型的训练队列的尿液样本；

步骤2)：对步骤1)收集的尿液样本进行qMSP检测，获得每个样本的甲基化位点标志物的甲基化值；

步骤3)：以所述甲基化值作为分子特征，利用随机森林的机器学习分类算法，分别训练随机森林模型，获得膀胱癌辅助诊断模型、上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型或膀胱癌特异性辅助诊断模型。

其中，步骤3)中所述膀胱癌辅助诊断模型的训练数据为每个样本所属的编号为cg01362243和cg07351192的位点的甲基化值；所述上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型的训练数据为每个样本所属的编号为cg01362243的位点的甲基化值；所述膀胱癌特异性辅助诊断模型的训练数据为每个样本所属的编号为cg06829686和cg26595643的位点的甲基化值。

本发明的第四方面提供了上述方法构建得到的诊断模型在膀胱癌辅助诊断系统中的应用。

本发明的第五方面提供了一种膀胱癌辅助诊断系统，包括膀胱癌辅助诊断系统，和/或上尿路尿路上皮癌辅助诊断系统，和/或膀胱癌特异性辅助诊断系统，所述诊断系统包括：

数据模块，用于获取待测样本甲基化标志物的甲基化水平数据，所述甲基化标志物为权利要求1所述的用于诊断膀胱癌的DNA甲基化位点标志；

评分模块，用于基于待测样本甲基化标志物的甲基化水平数据，通过诊断模型获得概率数值，所述诊断模型为权利要求8所述的方法构建得到的诊断模型；

判断模块，用于基于所述概率数值判断受试者是否患有相应的癌症类型。

其中，所述膀胱癌辅助诊断系统用于判断受试者是否患有膀胱癌，所述上尿路尿路上皮癌辅助诊断系统用于判断受试者是否患有上尿路尿路上皮癌，所述膀胱癌特异性辅助诊断系统用于判断受试者患癌类型为膀胱癌或非尿路上皮癌。

本发明的第六方面提供了上述用于检测膀胱癌DNA甲基化位点标志物的筛选方法，该方法主要包括以下步骤：

步骤1)：获取发现队列和验证队列的甲基化芯片数据集；

步骤2)：对步骤1)获取的每套甲基化芯片数据集中的甲基化探针的甲基化水平进行标准化；

步骤3)：从发现队列的甲基化芯片数据集中筛选甲基化位点标志物组合。

优选地，所述步骤1)中，所述发现队列包括两套甲基化芯片数据集，一套甲基化芯片数据集为获取自TCGA数据库的BLCA项目的膀胱癌与正常组织样本的甲基化芯片数据集，另一套甲基化芯片数据集为获取自TCGA数据库BLCA项目的膀胱癌与GEO数据库E-GEOD-40279项目的正常血液样本的甲基化芯片数据集；所述验证队列为获取自GEO数据库GSE52955项目和GSE111933项目的膀胱癌与正常组织样本的甲基化芯片数据集。

优选地，所述步骤2中进行标准化的方法包括如下步骤：

步骤21)：对甲基化探针进行质量过滤；过滤掉的探针可以是：检测p值>0.01的探针，或在超过5％样本中的磁珠数<3的探针，或非CpG探针，或SNP相关探针，或映射到多个基因组位置的探针，或X和Y染色体探针。

步骤22)：对经步骤21)过滤后的甲基化探针的缺失值进行填补；

步骤23)：以Ⅰ型甲基化探针为参照，将Ⅱ型甲基化探针的甲基化水平拉伸到Ⅰ型甲基化探针的甲基化水平。

优选地，所述步骤3)包括以下步骤：

步骤31)：基于标准化的甲基化探针的甲基化水平进行差异甲基化位点分析，计算差异甲基化位点；

步骤32)：挑选同时在发现队列的不同甲基化芯片数据集中具有重现性的差异甲基化位点；

步骤33)：挑选在发现队列的每套甲基化芯片数据集中的差异数值均大于0.3且组内标准差小于0.12的差异甲基化位点，作为候选甲基化位点标志物；

步骤34)：利用随机森林模型对候选甲基化位点标志物进行模型重要性评估，筛选重要性排名靠前的甲基化位点作为优化的甲基化位点标志物集合一；

步骤35)：筛选在膀胱癌样本中的甲基化水平大于0.5，同时在正常样本中的甲基化水平小于0.2的甲基化位点，针对每个筛选出的甲基化位点，构建随机森林模型并进行模型验证，挑选灵敏度、特异性和AUC均在93％以上的甲基化位点作为优化的甲基化位点标志物集合二；

步骤36)：针对所述甲基化位点标志物集合一和甲基化位点标志物集合二中的甲基化位点，设计甲基化引物和探针，分别以CpG非甲基化和CpG全甲基化的DNA为模板，进行亚硫酸盐转化，然后对检测位点的引物进行相对定量和熔解曲线检测，选取熔解曲线只有单一熔解峰，并且检测位点和内参基因的ΔCt值相差较大的位点，作为最终的区分膀胱癌与正常组织的DNA甲基化位点标志物。

本发明的第七方面提供了一种用于检测上述膀胱癌DNA甲基化位点标志物的甲基化水平的引物组，包括以下引物对中的至少一组：

用于检测位点cg01362243的引物对，其序列如SEQ ID NO:1～2所示；

用于检测位点cg07351192的引物对，其序列如SEQ ID NO:3～4所示；

用于检测位点cg06829686的引物对，其序列SEQ ID NO:5～6所示；

用于检测位点cg26595643的引物对，其序列如SEQ ID NO:7～8所示。

优选地，还包括用于检测内参基因GAPDH的引物对，所述引物对的序列如SEQ IDNO:9～10所示。

本发明的第八方面提供了一中用于检测上述膀胱癌DNA甲基化位点标志物的甲基化水平的探针，包括以下探针中的至少一种：

用于检测位点cg01362243的探针，其序列如SEQ ID NO:11所示；

用于检测位点cg07351192的探针，其序列如SEQ ID NO:12所示；

用于检测位点cg06829686的探针，其序列如SEQ ID NO:13所示；

用于检测位点cg26595643的探针，其序列如SEQ ID NO:14所示。

优选地，还包括用于检测内参基因GAPDH的探针，所述探针的序列如SEQ ID NO:15所示。。

本发明通过筛选区分膀胱癌与正常组织的DNA甲基化位点标志物，并应用qMSP方法对筛选出的4个甲基化位点标志物进行膀胱癌特异性甲基化位点检测，然后基于检测获得的4个甲基化位点标志物的甲基化水平构建膀胱癌辅助诊断系统；与现有膀胱癌诊断技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.采用qMSP检测技术，基于DNA通过亚硫酸盐氢钠处理之后所产生的甲基化和非甲基化DNA单链序列的差异来设计不同的PCR引物，甲基化检测灵敏度高，可以检测百分含量低至0.1％的甲基化(也即是50ng总DNA中的50pg甲基化DNA)或1％的甲基化(也即是10ng总DNA中的0.1ng甲基化DNA)；另外，检测成本低，检测结果不容易受到检测仪器设备差异性的影响，检测鲁棒性更强，更适合膀胱癌大规模人群的辅助诊断筛查；

2.本发明构建了完整的膀胱癌辅助诊断系统，可以有效提高膀胱癌辅助诊断的灵敏度和特异性；该系统包含三个辅助诊断模型：膀胱癌辅助诊断模型、与膀胱癌病理相似的上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型以及膀胱癌特异性辅助诊断模型；其中，联用膀胱癌辅助诊断模型和上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型可以有效防止与膀胱癌病理类似的上尿路尿路上皮癌患者漏诊，提高膀胱癌与上尿路尿路上皮癌检测灵敏度。而膀胱癌特异性辅助诊断模型可以有效降低膀胱癌误诊为其它非尿路上皮癌(比如肾癌和前列腺癌)的概率。

附图说明

图1是膀胱癌辅助诊断模型的独立验证性能图；

图2是膀胱癌不同分期的膀胱癌辅助诊断模型的U-Me分数图；

图3是上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型的独立验证性能图；

图4是膀胱癌特异性辅助诊断模型的独立验证性能图。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例1膀胱癌DNA甲基化位点标志物筛选

1.获取甲基化芯片数据集

从TCGA(肿瘤基因组图谱)数据库的BLCA(膀胱癌特异性核基质蛋白)项目获取发现队列—膀胱癌与正常组织样本的甲基化芯片数据集(数据集一)，以及TCGA数据库BLCA项目的膀胱癌与GEO(Gene Expression Omnibus data base，基因表达数据库)数据库E-GEOD-40279项目的正常血液样本的甲基化芯片数据集(数据集二)；同时获取验证队列—GEO数据库GSE52955项目和GSE111933项目的膀胱癌与正常组织样本的甲基化芯片数据集(数据集三)。

2.甲基化探针的甲基化水平标准化

对上述每套甲基化芯片数据集进行以下操作：

1)利用ChAMP甲基化芯片流程处理包提供的champ.filter函数对甲基化芯片的探针(通常一共有约45万个探针，靶向人类基因组的CpG岛、增强子区域、转录起始位点和甲基化组的其他重要区域)进行质量过滤，过滤掉以下探针：(1)检测p值>0.01的探针；(2)在超过5％样本中的磁珠数<3的探针；(3)非CpG探针；(4)SNP相关探针；(5)映射到多个基因组位置的探针；(6)X和Y染色体探针。

2)利用ChAMP甲基化芯片流程处理包提供的champ.impute函数对上述经过滤的甲基化探针的缺失值进行填补，选择方法是K-近邻算法(k-nearest neighbors，KNN)。

3)对甲基化探针的甲基化水平进行标准化。

在甲基化芯片中，通常混合使用了Ⅰ型探针和Ⅱ型探针。在Ⅰ型探针中，对于每个甲基化位点，都对应设计有两种探针：M型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部为G，用来检测甲基化位点；U型磁珠尾部为A，用来检测未甲基化位点。基因组上的某一位点如果被甲基化了，那么在亚硫酸氢盐的处理下，GC仍为GC，与M型磁珠配对，荧光标记的核苷酸掺入后能被检测到荧光信号，M型磁珠发光。反之，如果没有被甲基化，那么在亚硫酸氢盐的处理下，GC变为GT，与U型磁珠配对，延伸后U型磁珠发光。而在Ⅱ型探针中只使用一种磁珠，探针末端为C，配对后只掺入单个碱基，根据荧光类型判断掺入的碱基类型，即可判断是否被甲基化。

甲基化水平标准化的具体方法是：采用ChAMP甲基化芯片流程处理包提供的champ.norm函数中的Beta混合分位数膨胀方法(Beta MIxture Quantile dilation，BMIQ)，以Ⅰ型探针作参照，基于ebayes的原理，将Ⅱ型探针的甲基化水平拉伸到Ⅰ型探针水平，从而将Ⅱ型探针甲基化值标准化。

3.甲基化位点标志物筛选

针对发现队列的甲基化芯片数据集，进行以下操作：

1)基于标准化的甲基化探针水平进行差异甲基化位点分析：采用ChAMP甲基化芯片流程处理包提供的champ.DMP函数中线性模型和经验贝叶斯(Linear Models andEmpirical Bayes Methods，limma)方法，计算差异甲基化位点(DifferentiallyMethylated Positions，DMP)。

2)挑选同时在数据集一和数据集二中具有重现性的DMP。

3)挑选在膀胱癌与正常组织样本或血液样本中DMP差异数值>0.3，并且在每套数据集中的膀胱癌组和正常组织样本组或膀胱癌组和血液样本组的组内标准差<0.12的DMP，作为候选甲基化位点标志物。

4)基于上述候选甲基化位点标志物，以及在上述甲基化水平标准化步骤中获得的发现队列中膀胱癌与正常组织样本的甲基化谱，基于随机森林模型对候选甲基化位点标志物进行模型重要性评估，进一步筛选重要性排名前五的甲基化位点作为优化的甲基化位点标志物集合一。

5)基于上述候选甲基化位点标志物，筛选在膀胱癌样本中甲基化水平>0.5，同时在正常组织和正常血液样本中甲基化水平<0.2的甲基化位点，针对每个筛选出的甲基化位点，以在上述甲基化水平标准化步骤中获得的发现队列中膀胱癌与正常组织样本的甲基化谱构建随机森林模型，同时用上述甲基化水平标准化步骤中获得的验证队列中膀胱癌与正常组织样本的甲基化谱进行模型验证，获得灵敏度、特异性和接收者操作特征曲线面积(Area under the Curve of Receiver operating characteristic，AUC)。挑选灵敏度、特异性和AUC均>93％的22个甲基化位点作为优化的甲基化位点标志物集合二。

结合甲基化位点标志物集合一和集合二，共筛选出27个甲基化位点标志物，针对这27个位点进行MethyLight甲基化引物和探针设计，每对引物和探针含有多个CpG序列。分别以CpG非甲基化和CpG全甲基化的DNA为模板，进行Bisulfite转化后，用SYBR Green染料法对检测位点的引物进行相对定量(GAPDH内参基因)和熔解曲线检测，选取熔解曲线只有单一产物(即单一熔解峰)，并且检测位点和GAPDH内参基因的ΔCt值相差较大的位点，作为最终的区分膀胱癌与正常组织的DNA甲基化位点标志物，一共获得4个甲基化位点，包括cg01362243(lncRNA RP11-89)、cg07351192(BHLHE40基因和ARL8B基因之间的基因间区))、cg06829686(FOXD2基因和TRAD2B基因的基因间区)和cg26595643(VAX1基因的TSS1500区域)，具体信息如表1所示。

表1甲基化位点标志物信息

实施例2尿液qMSP检测

1)尿液分离：收取晨尿尿液样本60mL，至宁波艾捷康宁生物科技有限公司的常温尿液保存管中。收集的尿液样本经过1600g、20min离心后，弃上清，得到尿液沉渣样本。用200μL PBS将沉渣细胞重悬，待抽提。

2)尿液沉渣DNA提取：利用康为世纪基因组DNA提取试剂盒对尿液沉渣DNA进行抽提和纯化。抽提纯化得到的DNA，利用qubit4.0荧光定量仪对DNA进行定量分析。

3)尿液沉渣DNA亚硫酸氢盐(Bisulfite)转化：取20～80ng尿液沉渣DNA，使用诺唯赞EpiArt DNA Methylation Bisulfite Kit试剂盒进行DNA的转化。按照诺唯赞试剂盒说明书方法和步骤进行尿液沉渣DNA的转化和纯化回收。

Bisulfite转化的体系包括：Bisulfite转化溶液130μL，DNA20～80ng，补水至150μL。配好的体系，至于PCR仪上，按表2程序进行转化。

表2尿液沉渣DNABisulfite转化程序

温度	时间
		热盖105℃	ON
98℃	10min
		64℃	40min
98℃	5min
		64℃	40min
98℃	5min
		64℃	40min
4℃	保持(<24h)

反应结束后，按照诺唯赞试剂盒要求步骤，进行DNA的纯化。

4)针对表1中的4个膀胱癌甲基化位点标志物，设计甲基化检测引物序列和探针序列，分别如表3、表4所示。

表3甲基化检测引物

引物名称	引物序列
		cg01362243-F	5’-CGGTTTTGCGATGTATTTTTTCG-3’(SEQ ID NO:1)
cg01362243-R	5’-CGAAACCACCGTTCCCGC-3’(SEQ ID NO:2)
		cg07351192-F	5’-GTTGCGCGTTAGAGC-3’(SEQ ID NO:3)
cg07351192-R	5’-CAACTAATAATCGCGAAACG-3’(SEQ ID NO:4)
		cg06829686-F	5’-TCGTTGTTCGCGATTTTG-3’(SEQ ID NO:5)
cg06829686-R	5’-ATAAAACCTAAAACTCGATTACtG-3’(SEQ ID NO:6)
		cg26595643-F	5’-TAGTTCGTAGCGACGC-3’(SEQ ID NO:7)
cg26595643-R	5’-CCGCGAAATAACGACG-3’(SEQ ID NO:8)
		GAPDH-F	5’-TGGGTGGTTATTGTGAAAAGTT-3’(SEQ ID NO:9)
GAPDH-R	5’-CTCCAATCCCTAACCCTACCTT-3’(SEQ ID NO:10)

表4甲基化检测探针

其中，cg01362243-P和cg07351192-P标记为FAM探针，淬灭基团为BHQ1；cg01362243-P和cg07351192-P标记为CY5探针，淬灭基团为BHQ2；GAPDH-P标记为HEX探针，淬灭基团为BHQ1。探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

5)配制甲基化检测10X引物探针反应液

将引物、探针，按照管身上建议加入的无酶水的体积，分别溶解，获得终浓度为100μM的引物溶液的存储液和探针溶液的存储液，然后分别配制针对每个甲基化位点标志物的甲基化检测10X引物探针反应液。10X引物探针反应液体系包括：甲基化位点标志物的甲基化检测正向引物2μL、反向引物2μL、探针1μL，内参基因的正向引物2μL、反向引物2μL、探针1μL，水90μL。例如，以膀胱癌甲基化位点标志物cg01362243为例，检测cg01362243位点的甲基化水平的10X引物探针反应液体系为：100μM cg01362243-F 2μL、100μM cg01362243-R 2μL、100μM cg01362243-P 1μL、100μM GAPDH-F 2μL、100μM GAPDH-R 2μL、100μMGAPDH-P 1μL、水90μL。

6)甲基化荧光定量PCR

配制甲基化荧光定量PCR反应体系(参见表5所示)，使体系中引物的终浓度为200nM，探针的终浓度为100nM；每次反应加入的DNA的模板量为10～40ng；PCR反应酶为普通荧光定量PCR酶。

表5甲基化荧光定量PCR反应体系

同一个样本cg01362243、cg07351192、cg06829686和cg26595643四个位点分别配制PCR反应体系，使用Roche LightCycler 480II进行甲基化荧光定量PCR检测和分析。同时，每次反应还需要设置一个Bisulfite转化后的甲基化阳性DNA(CpG甲基化人类基因组DNA，Thermo Fisher)样本的反应作为对照。PCR反应程序勾选FAM(465-510)、CY5(618-660)和VIC/HEX/Yellow555(533-580)作为荧光检测通道。PCR反应程序请参见表6所示。

表6甲基化荧光定量PCR反应程序

7)甲基化荧光定量PCR结果分析

通过“Abs Quant/Fit Point”法分析甲基化荧光定量PCR结果，输出样本检测结果的Ct值。例如，以样本1的cg01362243位点的甲基化荧光定量PCR检测结果为例，样本1的cg01362243位点的Ct值为X1，甲基化阳性DNA Ct值为Xp1；样本1的内参基因GAPDH的Ct值为Y1，甲基化阳性DNA Ct值为Yp1，则样本1的cg01362243位点的检测结果为：cg01362243位点甲基化值＝(X1-Xp1)-(Y1-Yp1)。

实施例3基于尿液甲基化位点qMSP检测数据构建完整的膀胱癌辅助诊断系统

1.基于甲基化位点cg01362243和cg07351192构建膀胱癌辅助诊断模型

收集47名膀胱癌患者和39名健康志愿者尿液样本作为训练队列，按实施例2的方法进行甲基化位点标志物qMSP检测，以膀胱癌组vs健康正常组的位点cg01362243和cg07351192的甲基化值作为分子特征，利用随机森林的机器学习分类算法，即利用randomForest工具的randomForest函数，进行随机森林模型构建，获得膀胱癌辅助诊断模型。

具体构建方法如下：随机森林以N(本实施例中N＝500)个决策树作为基本学习器，组成集成学习器。在决策树训练过程中加入随机属性，包括每个决策树的样本由自助采样法(bootstrap sampling，即每个决策树所用样本的抽样过程属于有放回的随机抽样)获得，以及每个决策树的分类属性随机选择(即用于随机森林决策树分类的甲基化位点从cg01362243和cg07351192这两个位点随机选择获得)。输入的训练数据为每个样本所属的标签(label，即阳性或者阴性样本)、cg01362243和cg07351192位点的甲基化值。用随机森林算法评估每个甲基化特征的重要性程度，以及每个样本对模型构建的重要性程度。随机森林中N个决策树的分类投票结果以百分比的形式展示，即每个样本属于每个标签的结果用百分比概率表示。

应用该模型时，使用R语言的predict函数对测试样本进行判别，predict参数type设置为prob，可以判别测试样本归类为膀胱癌和健康正常的概率，具体由随机森林中的N个决策树的分类投票决定，计算公式如下：

样本归类为膀胱癌的概率：P1＝N1/N；

其中，N1表示预测样本为膀胱癌的决策树数量，N为随机森林中的决策树数量。

当测试样本归类为膀胱癌的概率P1≥0.4时，判断该测试样本为阳性样本(即膀胱癌)；当测试样本归类为膀胱癌的概率P1<0.4时，判断该测试样本为阴性样本(即健康正常)。

膀胱癌辅助诊断模型验证：收集23名膀胱癌患者和27名健康志愿者尿液样本作为独立验证队列，按实施例2的方法进行甲基化位点标志物qMSP检测，获得位点cg01362243和cg07351192的甲基化值，基于上述膀胱癌辅助诊断模型，使用R语言的predict函数进行预测，predict参数type设置为prob，获得验证样本归类为膀胱癌的概率P1，计算公式同上。

当验证样本归类为膀胱癌的概率(即辅助诊断模型U-Me分数)≥0.4时，判断该验证样本为阳性样本(即膀胱癌)；当验证样本归类为膀胱癌的概率<0.4时，判断该验证样本为阴性样本(即健康正常)。将验证队列样本的模型预测结果与实际临床分组标签(膀胱癌和健康正常)进行比较，计算膀胱癌诊断模型的灵敏度、特异性和AUC，结果如图1所示，该膀胱癌辅助诊断模型的灵敏度＝84％，特异性＝93.33％，AUC＝87.53％。同时，膀胱癌不同分期与健康正常的比较中，辅助诊断模型U-Me分数具有显著差异(参见图2所示)，即使在膀胱癌最早期Ta期患者中，其辅助诊断模型U-Me分数也能显著区分于健康正常人群。

2.基于甲基化位点cg01362243构建上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型

收集19名UTUC(upper tract urothelial cancer，上尿路尿路上皮癌)患者和45名健康志愿者尿液样本作为训练队列，按实施例2的方法进行甲基化位点标志物qMSP检测，以UTUC组vs健康正常组的位点cg01362243的甲基化值作为分子特征，利用随机森林的机器学习分类算法，即利用randomForest工具的randomForest函数，进行随机森林模型构建，获得上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型。

具体构建方法如下：随机森林以N(本实施例中N＝500)个决策树作为基本学习器，组成集成学习器。在决策树训练过程中加入随机属性，即每个决策树的样本由自助采样法获得，输入的训练数据为每个样本所属的标签(label，即阳性或者阴性样本)和cg01362243位点的甲基化值。用随机森林算法评估每个甲基化特征因素的重要性程度，以及每个样本对模型构建的重要性程度。随机森林中N个决策树的分类投票结果以百分比的形式展示，即每个样本属于每个标签的结果用百分比概率表示。

应用该模型时，使用R语言的predict函数对测试样本进行判别，predict参数type设置为prob，可以判别测试样本归类为UTUC和健康正常的概率，具体由随机森林中N个决策树的分类投票决定，计算公式如下：

样本归类为UTUC的概率：P2＝N2/N；

其中，N2表示预测样本为UTUC的决策树数量，N为随机森林中的决策树数量。

当测试样本归类为UTUC的概率P2≥0.5时，判断测试样本为阳性样本(即UTUC)；当测试样本归类为UTUC的概率P2<0.5时，判断测试样本为阴性样本(即健康正常)。

上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型验证：收集7名UTUC患者和30名健康志愿者尿液样本作为独立验证队列，按实施例2的方法进行甲基化位点标志物qMSP检测，获得位点cg01362243的甲基化值，基于上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型使用R语言的predict函数进行预测，predict参数type设置为prob，获得验证样本归类为UTUC的概率P2，计算公式同上。

当验证样本归类为UTUC的概率P2≥0.5时，判断验证样本为阳性样本(即UTUC)；当验证样本归类为UTUC的概率P2<0.5时，判断验证样本为阴性样本(即健康正常)。将验证队列样本的模型预测结果与实际临床分组标签(UTUC和健康正常)进行比较，计算上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型的灵敏度、特异性和AUC，结果如图3所示，上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型的灵敏度＝85.71％，特异性＝93.33％，AUC＝88.33％。

3.基于甲基化位点cg06829686和cg26595643构建膀胱癌特异性辅助诊断模型

收集23名膀胱癌患者和18名非尿路上皮癌患者(包括肾癌和前列腺癌等泌尿癌症)尿液样本作为训练队列，按实施例2的方法进行甲基化位点标志物qMSP检测，以膀胱癌组vs非尿路上皮癌患组的位点cg06829686和cg26595643的甲基化值作为分子特征，利用随机森林的机器学习分类算法，即利用randomForest工具的randomForest函数，进行随机森林模型构建，获得膀胱癌特异性辅助诊断模型。

具体构建方法如下：随机森林以N(本实施例中N＝500)个决策树作为基本学习器，组成集成学习器。在决策树训练过程中加入随机属性，包括每个决策树的样本由自助采样法获得，以及每个决策树的分类属性随机选择(即用于随机森林决策树分类的甲基化位点从cg06829686和cg26595643这两个位点随机选择获得)。输入的训练数据为每个样本所属的标签(label，即阳性或者阴性样本)、cg06829686和cg26595643位点的甲基化值。用随机森林算法评估每个甲基化特征因素的重要性程度，以及每个样本对模型构建的重要性程度。随机森林中N个决策树的分类投票结果以百分比的形式展示，即每个样本属于每个标签的结果用百分比概率表示。

应用该模型时，使用R语言的predict函数对测试样本进行判别，predict参数type设置为prob，可以判别测试样本归类为膀胱癌和非尿路上皮癌的概率，具体由随机森林中N个决策树的分类投票决定，计算公式如下：

样本归类为膀胱癌的概率：P3＝N3/N；

其中，N3表示预测样本为膀胱癌的决策树数量，N为随机森林中的决策树数量。

当测试样本归类为膀胱癌的概率P3≥0.5时，判断测试样本为阳性样本(即膀胱癌)；当测试样本归类为膀胱癌的概率P3<0.5时，判断测试样本为阴性样本(非尿路上皮癌)。

膀胱癌特异性辅助诊断模型验证：收集24名膀胱癌患者和8名非尿路上皮癌患者尿液样本作为独立验证队列，按实施例2的方法进行甲基化位点标志物qMSP检测，获得位点cg06829686和cg26595643的甲基化值，基于膀胱癌特异性辅助诊断模型，使用R语言的predict函数进行预测，predict参数type设置为prob，获得验证样本归类为膀胱癌的概率P3，计算公式同上。

当验证样本归类为膀胱癌的概率P3≥0.5时，判断验证样本为阳性样本(即膀胱癌)；当验证样本归类为膀胱癌的概率P3<0.5时，判断验证样本为阴性样本(即非尿路上皮癌)。将验证队列样本的模型预测结果与实际临床分组标签(膀胱癌和非尿路上皮癌)进行比较，计算膀胱癌特异性辅助诊断模型的灵敏度、特异性和AUC，结果如图4所示，膀胱癌特异性辅助诊断模型的灵敏度＝83.33％，特异性＝75％，AUC＝69.01％。

4.三个辅助诊断模型的联合应用

取膀胱癌高风险人群或者正常体检人群的尿液样本，对4个膀胱癌特异性甲基化位点进行qMSP检测，获得4个膀胱癌特异性甲基化位点的甲基化值。利用膀胱癌辅助诊断模型和上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型进行分析。如果膀胱癌辅助诊断模型和上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型的判断结果均为阴性，则判定该被测者健康正常，只需要保持随访筛查。如果膀胱癌辅助诊断模型或者上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型的判断结果为阳性，则需要用膀胱癌特异性辅助诊断模型对被测样本做进一步分析，若膀胱癌特异性辅助诊断模型的判断结果为阳性，则被测者需要进一步做膀胱镜检查，确定是否患有膀胱癌或者UTUC；若膀胱癌特异性辅助诊断模型的判断结果为阴性，则被测者需要进一步同时做膀胱镜检查和其它泌尿癌症检查，确定是否患有膀胱癌以及其它泌尿癌症。

实施例4

按实施例2的方法，对25例膀胱癌患者、7例UTUC患者、8例非尿路上皮癌患者和30例健康正常人的尿液样本进行甲基化qMSP检测，获得4个膀胱癌特异性甲基化位点的甲基化数值，应用实施例3构建的膀胱癌辅助诊断系统进行分析。结果如表7所示(表中斜杠“/”表示为模型训练集样本)，在25例膀胱癌患者中，20例患者被诊断为“膀胱癌”，2例患者被诊断为“膀胱癌或非尿路上皮癌癌症”，2例患者被诊断为“非尿路上皮癌”，1例患者被诊断为“健康正常”；在7例UTUC患者中，6例患者被诊断为“UTUC”，1例患者被诊断为“健康正常”；在8例非尿路上皮癌患者中，6例患者被诊断为“非尿路上皮癌”；2例患者被诊断为“膀胱癌”；在30例健康正常人中，26例健康正常人被诊断为“健康正常”，2例健康正常人被诊断为“膀胱癌”，2例健康正常人被诊断为“UTUC”。上述结果证明本发明构建的膀胱癌辅助诊断系统具有临床应用价值，且诊断性能较高。

表7 70例尿液样本的膀胱癌辅助诊断系统分析结果

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.用于检测膀胱癌的DNA甲基化位点标志物甲基化水平的试剂在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂包括甲基化检测引物对；

所述甲基化检测引物对包括以下引物对：

用于检测位点cg01362243的引物对，其序列如SEQ ID NO:1～2所示；

用于检测位点cg07351192的引物对，其序列如SEQ ID NO:3～4所示；

用于检测位点cg06829686的引物对，其序列如SEQ ID NO:5～6所示；

用于检测位点cg26595643的引物对，其序列如SEQ ID NO:7～8所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，还包括甲基化检测探针；

所述甲基化检测探针包括以下探针：

用于检测位点cg01362243的探针，其序列如SEQ ID NO:11所示；

用于检测位点cg07351192的探针，其序列如SEQ ID NO:12所示；

用于检测位点cg06829686的探针，其序列如SEQ ID NO:13所示；

用于检测位点cg26595643的探针，其序列如SEQ ID NO:14所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，检测样本为受试者尿液。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，还包括用于检测内参基因GAPDH的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO:9～10所示；

和/或，还包括用于检测内参基因GAPDH的探针，所述探针的序列如SEQ ID NO:15所示。

5.一种基于权利要求1所述应用的构建诊断模型的方法，其特征在于，所述诊断模型包括膀胱癌辅助诊断模型、上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型和膀胱癌特异性辅助诊断模型，所述方法具体包括以下步骤：

步骤1)：分别收集用作膀胱癌辅助诊断模型、上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型和膀胱癌特异性辅助诊断模型的训练队列的尿液样本；

步骤2)：对步骤1)收集的尿液样本进行qMSP检测，获得每个样本的甲基化位点标志物的甲基化值；

步骤3)：以所述甲基化值作为分子特征，利用随机森林的机器学习分类算法，分别训练随机森林模型，获得膀胱癌辅助诊断模型、上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型和膀胱癌特异性辅助诊断模型；

其中，步骤3)中所述膀胱癌辅助诊断模型的训练数据为每个样本所属的编号为cg01362243和cg07351192的位点的甲基化值；所述上尿路尿路上皮癌辅助诊断模型的训练数据为每个样本所属的编号为cg01362243的位点的甲基化值；所述膀胱癌特异性辅助诊断模型的训练数据为每个样本所属的编号为cg06829686和cg26595643的位点的甲基化值。

6.权利要求5所述的方法构建得到的诊断模型在膀胱癌辅助诊断系统中的应用。

7.一种膀胱癌辅助诊断系统，其特征在于，包括膀胱癌辅助诊断系统、上尿路尿路上皮癌辅助诊断系统和膀胱癌特异性辅助诊断系统，所述诊断系统包括：数据模块，用于获取待测样本甲基化标志物的甲基化水平数据，通过权利要求1所述的应用检测获得；

评分模块，用于基于待测样本甲基化标志物的甲基化水平数据，通过诊断模型获得概率数值，所述诊断模型为权利要求5所述的方法构建得到的诊断模型；

判断模块，用于基于所述概率数值判断受试者是否患有相应的癌症类型。