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WO2017217347A1 - ＩｇＧ結合ペプチドによる部位特異的ＲＩ標識抗体 - Google Patents

ＩｇＧ結合ペプチドによる部位特異的ＲＩ標識抗体 Download PDF

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WO2017217347A1
WO2017217347A1 PCT/JP2017/021558 JP2017021558W WO2017217347A1 WO 2017217347 A1 WO2017217347 A1 WO 2017217347A1 JP 2017021558 W JP2017021558 W JP 2017021558W WO 2017217347 A1 WO2017217347 A1 WO 2017217347A1
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WO
WIPO (PCT)
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residue
peptide
igg
xaa1
amino acid
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2017/021558
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English (en)
French (fr)
Inventor
祐二 伊東
祥生 正山
明希男 林
徳仁 中田
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kagoshima University NUC
Original Assignee
Kagoshima University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to KR1020237005091A priority patent/KR102741325B1/ko
Priority to PL17813244.5T priority patent/PL3470418T3/pl
Priority to US16/309,272 priority patent/US12037417B2/en
Priority to ES17813244T priority patent/ES2985878T3/es
Priority to DK17813244.5T priority patent/DK3470418T3/da
Priority to FIEP17813244.5T priority patent/FI3470418T3/fi
Priority to CA3026520A priority patent/CA3026520A1/en
Priority to KR1020187035255A priority patent/KR20190018423A/ko
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
    • G01N33/575—
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo

Definitions

  • the present invention includes an IgG-binding peptide containing a ligand capable of binding to a radionuclide, an IgG-binding peptide labeled with a radionuclide, a complex of the IgG-binding peptide and IgG, and the IgG-binding peptide or complex Further, the present invention relates to a nuclear medicine image diagnostic agent or a cancer diagnostic agent.
  • Antibodies have been widely used for the detection of target molecules in various researches and developments in the past, and are extremely important industrially as detection reagents and diagnostic agents. Antibodies are also attracting attention as pharmaceuticals for the treatment of diseases because of their specificity for target molecules.
  • Non-patent Document 1 In order to add an antibody function, labeling with a radioisotope is performed through iodination or addition of a chelate compound (Non-patent Document 1). These modifications have so far been performed mainly through lysine amino groups, cysteine thiol groups, and activated carboxyl groups contained in antibodies, which are specific for functional groups but are site-specific. Therefore, there are problems such as a decrease in the activity of the antibody by modification of the antibody to the antigen binding site, and a problem that it is difficult to control the number of compounds to be bound.
  • an antibody is modified by using an antibody having a specific functional group introduced site-specifically.
  • non-natural amino acids Non-Patent Documents 2 to 4
  • free cysteine Non-Patent Documents 5 to 6
  • site-specific antibody modification technology is being developed, but in many cases, it is necessary to modify the antibody itself in terms of antibody engineering. It is not necessarily an advantageous method.
  • the present inventors based on the X-ray crystal structure analysis of the complex of IgG-binding peptide and IgG Fc, the position of each amino acid of the IgG-binding peptide in the binding state and each of IgG Fc The positional relationship with amino acids was examined in detail. Furthermore, an amino acid capable of binding to a cross-linking agent is introduced into the peptide, and the amino acid is modified with the cross-linking agent to prepare an IgG-binding peptide that is site-specifically modified with the cross-linking agent. We found that it can be modified. Further, the present inventor has found that an IgG-binding peptide-IgG complex labeled with a radioactive metal nuclide can be used as a diagnostic agent for cancer, and has completed the present invention.
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine, C is a cysteine residue; H is a histidine residue; Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid, G is a glycine residue; Xaa2 is a glutamic acid residue, a glutamine residue or an asparagine residue, L is a leucine residue; V is a valine residue, and W is a tryptophan residue.
  • a peptide comprising an amino acid sequence consisting of 13 to 17 amino acid residues represented by the formula (1) and comprising a ligand capable of binding to human IgG and capable of binding to a radiometal nuclide.
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine
  • C is a cysteine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid
  • G is a glycine residue
  • Xaa2 is a glutamic acid residue, a glutamine residue or an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W
  • a peptide comprising an amino acid sequence consisting of 13 to 17 amino acid residues represented by the above and capable of binding to human IgG and labeled with a radioactive metal nuclide.
  • a method for determining the presence or absence of cancer in a subject Reacting the sample obtained from the subject with the peptide according to (2) or (3) or the complex according to (4), wherein the radionuclide is bound to the peptide, Measuring the level or presence of radioactivity derived from the radionuclide in the sample, and determining the presence or absence of cancer in the subject based on the level or presence of radioactivity; Including a method.
  • a method for determining the presence or absence of cancer in a subject Administering the peptide according to (2) or (3) or the complex according to (4) to a subject, wherein the radionuclide is bound to the peptide; Measuring in a subject the level or presence of radioactivity derived from a radionuclide, and determining whether the subject is affected by cancer based on the level or presence of radioactivity, Including a method.
  • This specification includes the disclosure of Japanese Patent Application Nos. 2016-117395 and 2016-227025, which form the basis of the priority of the present application.
  • IgG-binding peptide of the present invention can easily bind a radiometal nuclide, IgG can be specifically and easily labeled with the radiometal nuclide by using the IgG-binding peptide of the present invention.
  • the IgG-binding peptide of the present invention does not need to modify the sequence of the antibody molecule, it does not cause functional deterioration due to genetic modification of the antibody molecule.
  • a reaction for directly labeling IgG with a radioactive metal nuclide that is conventionally required is not required, and the function of the antibody is not reduced by the reaction.
  • FIG. 1 (A) shows the structure of a complex of an IgG-binding peptide (C35A-3 / 15: DCAYHRGELVWCT (SEQ ID NO: 33)) and human IgG Fc.
  • the IgG-binding peptide is a space filling model
  • the IgG ⁇ Fc is a ribbon model
  • the sugar chain of Fc is shown by a wire model.
  • FIG. 1 (B) shows a model of a cross-linked structure between an IgG-binding peptide modified with DSG (C35A-3 / 15 (R8K): DCAYHKGELVWCT (SEQ ID NO: 34)) and IgGcFc.
  • the main chain of the peptide is indicated by a ribbon model.
  • peptide-Lys8 is the 6th lysine residue of C35A-3 / 15 (R8K)
  • peptide-Tyr6-Gly9 is the 7th glycine residue from the 4th tyrosine residue of C35A-3 / 15 (R8K).
  • Fc-Lys248 indicates Fc Lys248 according to EU numbering
  • Fc-Pro247-Asp249 indicates Fc Pro247 to Asp249 according to EU numbering.
  • FIG. 2 shows the results of SDS-PAGE (A) and Western blot (B) of a mixture of labeled IgG-binding peptide and various proteins.
  • DSG indicates that the IgG-binding peptide reacted with DSG (disuccinimidyl glutarate) and DSS indicates that the IgG-binding peptide reacted with DSS (disuccinimidyl suberate) was tested.
  • hIgG represents human IgG
  • hIgA represents human IgA
  • HSA represents human serum albumin.
  • FIG. 3 shows the examination results by ELISA of reaction molar ratio (A) and reaction time (B) in the reaction of labeled IgG-binding peptide and IgG.
  • DSS R8K 0 min is obtained by adding Tris-HCl (pH 7.0) to a labeled IgG-binding peptide having a molar ratio of 10 times that of IgG, blocking NHS groups, and then adding to wells.
  • No DSS R8K uses a biotinylated IgG-binding (R8K) peptide that does not bind DSS, and no pep indicates a control with no peptide added.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the reactivity of the labeled IgG-binding peptide to each protein (hIgA, hIgG, BSA (bovine serum albumin)) using size exclusion chromatography.
  • FIG. 5 shows the human IgG Fc solution and DSG-modified IgG-binding peptide dissolved in DMF added at a molar ratio of 0.5, 1.0, 2.0, or 5.0 with respect to human IgG. The result of a liquid chromatography after having been made to show is shown.
  • FIG. 5 shows unreacted (peak 2), one peptide adduct (peak 3), and two when human IgG and DSG-modified IgG-binding peptide are reacted at each molar ratio.
  • the change in the amount of peptide adduct (peak 4) produced is shown.
  • FIG. 6 shows a DSG-modified IgG-binding peptide dissolved in DMF with respect to an Fc solution of human IgG prepared at pH 4.0 (A), pH 5.5 (B), or pH 7.0 (C).
  • FIG. 9 shows SPECT / CT images including the liver 6 hours after administration of [ 111 In] -labeled Trastuzumab-1 (A) and 4 hours after administration of [ 111 In] -labeled Trastuzumab-2 (B).
  • FIG. 10 shows a synthesis scheme of an IgG-binding peptide having an SS bridge structure with dichloropropanone prepared in Example 9.
  • FIG. 11 shows PET images including tumor sites 6 hours, 24 hours, and 48 hours after administration of [ 89 Zr] -labeled Trastuzumab-1 or 2.
  • a solid line arrow indicates a tumor tissue with high HER2 expression, and a broken line arrow indicates a tumor tissue with low HER2 expression.
  • the invention relates to an IgG binding peptide comprising a ligand that can bind to a radiometal nuclide.
  • the position of the ligand in the IgG-binding peptide is not particularly limited. For example, it can be linked to the N-terminus or C-terminus of the IgG-binding peptide, preferably the N-terminus. Methods for linking ligands to peptides are well known to those skilled in the art.
  • N-hydroxysuccinimide ester NHS
  • ITC isothiocyano group
  • sulfonic acid chloride carboxylic acid chloride, ethylene oxide, alkyl chloride, aldehyde group
  • a reactive group such as a carboxylic acid anhydride may be added to the ligand and reacted with the N-terminal amino group of the IgG-binding peptide.
  • an IgG-binding peptide containing such a ligand may be directly synthesized by a known synthesis method or the like.
  • the ligand capable of binding to the radionuclide that can be included in the IgG-binding peptide of the present invention includes a chelating agent such as diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), deferoxamine, 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1, 4,7,10-tetraacetic acid (DOTA), 1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid (NOTA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ethylenediaminediacetic acid, triethylenetetramine Acetic acid (TTHA), 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid (TETA), dipyridoxyl diphosphate (DPDP), TPPS 4 , ethylenebishydroxyphenylglycine ( EHPG), hexamethylenediaminetetraacetic acid, dimethylphosphinomethane (DMPE), methylene
  • the radioactive metal nuclide is bound to the IgG binding peptide.
  • radioactive metal nuclides include 111 In (indium), 89 Zr (zirconium), 67/68 Ga (gallium), 99m Tc (technetium), 64 Cu (copper), preferably 111 In, and 89 Zr. .
  • the radionuclide to be bound to the IgG-binding peptide can be selected according to the use of the IgG-binding peptide and the complex of IgG-binding peptide and IgG described later.
  • the detection and diagnosis of cancer 111 In, 89 Zr, 64 Cu , 67/68 Ga, and 99m Tc can be used, for example, the PET (Positron Emission Tomography) and 89 Zr and 64 Cu, SPECT ( For single photon emission computed tomography, 111 In and 99m Tc can be used.
  • the radionuclide may be directly bound to the IgG-binding peptide, but is preferably bound to the IgG-binding peptide via a ligand such as the chelating agent.
  • Preferred combinations of radionuclide and ligand can be appropriately selected by those skilled in the art (see, for example, Hiroshi Sakurai and Yo Yokoyama, Introduction to Radiopharmaceuticals), for example, 111 In and DTPA; 89 Zr and deferoxamine; 64 Cu And DOTA are NOTA; 99m Tc and dimethylphosphinomethane (DMPE), DTPA, methylene diphosphate, dimercaptosuccinic acid (DMPA), dithiosemicarbazone , or diaminoethanediol; 67/68 Ga and deferoxamine or DTPA derivatives Etc., preferably 111 In and DTPA; 89 Zr and deferoxamine; and 64 Cu And DOTA include NOTA, more
  • IgG refers to mammals, eg, primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats, mice, and rabbits, domestic animals such as pigs, cows, horses, sheep, and goats, In addition, it refers to IgG of pet animals such as dogs and cats, preferably human IgG (IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4).
  • the IgG in the present specification is more preferably human IgG1, IgG2, or IgG4, or rabbit IgG, and particularly preferably human IgG1, IgG2, or IgG4.
  • an IgG binding peptide of the invention has the following formula I: (X 1-3 ) -C- (X 2 ) -H- (Xaa1) -G- (Xaa2) -LVWC- (X 1-3 ) (I)
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine
  • C is a cysteine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid
  • G is a glycine residue
  • Xaa2 is a glutamic acid residue, a glutamine residue or an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue.
  • And is capable of binding to human IgG.
  • the notation of X 1-3 at the N-terminal or C-terminal means that 1 to 3 consecutive amino acid residues X other than cysteine (C or Cys) are independent, The amino acid residues constituting are the same or different residues, but preferably all three are composed of sequences that are not the same.
  • X 2 also means that two arbitrary amino acid residues X other than cysteine (C or Cys) are consecutive, and the amino acid residues constituting them are the same or different residues. Preferably, however, the two consecutive amino acid residues consist of sequences that are not the same residue.
  • the two cysteine residues of Formula I can be disulfide bonded to form a cyclic peptide.
  • the outer two cysteine residues (not Xaa1 when Xaa1 is a cysteine residue) are disulfide bonded.
  • the sulfide groups in the outer two cysteine residues can be represented by the following formula: It may be connected by a linker represented by A broken line part in the above formula means a bond part with a sulfide group.
  • the linker is more stable against a reduction reaction or the like than a normal disulfide bond. Therefore, the linker is preferably used when using a radionuclide that can destabilize disulfide bonds such as zirconium.
  • This peptide is, for example, the following method:
  • a broken line part in the above formula means a bond part with a sulfide group.
  • R 1 and R 2 are preferably selected from the group consisting of F, Cl, Br, and I, more preferably Cl, Br, and I.
  • R 1 and R 2 are preferably the same, more preferably R 1 and R 2 are both Cl.
  • the conditions of the mixing step in this method are not particularly limited as long as a ligation reaction occurs between cysteine residues of the peptide.
  • the reaction can be performed by mixing the peptide and the compound in a suitable buffer such as a buffer containing guanidinium chloride at room temperature (eg, about 15 ° C. to 30 ° C.).
  • the mixing step may be performed by adding an appropriate amount of a catalyst that promotes the ligation reaction as necessary.
  • the mixing ratio of peptide and compound in the mixing step of this method is not particularly limited.
  • the molar ratio of peptide to compound can be, for example, 1: 0.2 to 1:10, preferably 1: 0.5 to 1: 5 or 1: 1 to 1: 2.
  • the mixing time (reaction time) in the mixing step is not limited as long as a ligation reaction occurs between cysteine residues of the peptide, but for example, 1 minute to 5 hours, preferably 10 minutes to 2 hours or 15 minutes to It can be 1 hour.
  • the method further includes the step of separating impurities, for example, unreacted peptides and compounds from the mixture after performing the above steps, and purifying the peptide having a cysteine residue linked thereto, if necessary. Good.
  • This step can be performed by a method known in the art, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, chromatography such as HPLC, and the like.
  • the peptide represented by the formula I ′ is (X 1-3 ) -C- (X 1 ) -YH- (Xaa1) -GNLVWC- (X 1-3 ) (I ')
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine
  • C is a cysteine residue
  • Y is a tyrosine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid
  • G is a glycine residue
  • N is an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue.
  • an amino acid sequence consisting of 13 to 17 amino acid residues.
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine, C is a cysteine residue; A is an alanine residue, H is a histidine residue; Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid, G is a glycine residue; E is a glutamic acid residue, L is a leucine residue; V is a valine residue, and W is a tryptophan residue. ) And an amino acid sequence consisting of 13 to 17 amino acid residues.
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine, C is a cysteine residue; H is a histidine residue; Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid, G is a glycine residue; Xaa2 is a glutamic acid residue, a glutamine residue or an asparagine residue, L is a leucine residue; V is a valine residue; W is a tryptophan residue; Xaa3 is an alanine residue, a serine residue or a threonine residue, and Xaa4 is a t
  • amino acid sequences of the peptides of the above formula I ′, formula I ′′ and formula II when the amino acid sequence is 17 amino acid residues, the first and second amino acid residues X and the 16th and 17th amino acid residues X from the N-terminal are missing.
  • Such peptides may be 13 amino acids long.
  • “when 17 amino acid residues are used” means that when the amino acid residues of a peptide are referred to by amino acid number, from the N-terminal of 17 residues, which is the longest amino acid length for the peptide of formula I It is a term expressed for the sake of convenience in order to number from 1st to 17th in order.
  • each X is independently any amino acid residue other than cysteine, C is a cysteine residue; A is an alanine residue, Y is a tyrosine residue; H is a histidine residue; Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid, G is a glycine residue; Xaa2 is a glutamic acid residue or a glutamine residue, L is a leucine residue; V is a valine residue, and W is a tryptophan residue. ) And an amino acid sequence consisting of 13 to 17 amino acid residues.
  • amino acid sequence of the peptide of the above formula III when it is 17 amino acid residues, the first and second amino acid residues from the N-terminal, and the 16th and 17th amino acid residues X may be deleted, Such a peptide may consist of 13 amino acids in length.
  • amino acid residues other than cysteine (C) in the amino acid sequence of the peptides of the above formulas that is, amino acids 1 to 3, 5, 6, and 15 to 17 from the N-terminal in the case of 17 amino acid residues
  • the peptide represented by Formula IV is DC- (Xaa3)-(Xaa4) -H- (Xaa1) -G- (Xaa2) -LVWCT (IV)
  • D is an aspartic acid residue
  • C is a cysteine residue
  • H is a histidine residue
  • Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid
  • G is a glycine residue
  • Xaa2 is a glutamic acid residue, a glutamine residue or an asparagine residue
  • L is a leucine residue
  • V is a valine residue
  • W is a tryptophan residue
  • T is a threonine residue
  • Xaa3 is an alanine residue or a threonine residue
  • Xaa4 is a tyrosine residue or a tryptophan
  • peptides of formula I are listed below in 1) to 18), but of course are not limited to these: 1) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (SEQ ID NO: 1), 2) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 2), 3) RCAYH (Xaa1) GELVWCS (SEQ ID NO: 3), 4) GPRCAYH (Xaa1) GELVWCSFH (SEQ ID NO: 4), 5) SPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 5), 6) GDDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 6), 7) GPSCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 7), 8) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCSFH (SEQ ID NO: 8), 9) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTHH (SEQ ID NO: 9), 10)
  • peptide of formula I 1) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (SEQ ID NO: 1), 2) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 2), 13) RGNCAYH (Xaa1) GQLVWCTYH (SEQ ID NO: 13), and 14) G (Xaa2) DCAYH (Xaa1) GELVWCT (Xaa2) H (SEQ ID NO: 36)
  • Particularly preferred examples include 2) GPDCAYH (Xaa1) GELVWCTFH (SEQ ID NO: 2) (wherein Xaa1 is a lysine residue, Xaa2 is a homocysteine, preferably cysteines and / or homocysteines are They form disulfide bonds with each other).
  • the IgG-binding peptide of the present invention has the following general formula V: DC- (Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1) -G- (Xaa5) -L- (Xaa6) -WCT (V) (Where D is an aspartic acid residue; C is a cysteine residue; G is a glycine residue; L is a leucine residue; W is a tryptophan residue; T is a threonine residue; Xaa1 is a lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, or diaminopropionic acid, Xaa2 is an alanine residue, a serine residue or a threonine residue, Xaa3 is a tryptophan residue or a tyrosine residue, Xaa4 is a histidine residue, arginine residue, serine
  • the two cysteine residues of formula V can be disulfide bonded to form a cyclic peptide.
  • the two outer cysteine residues (not Xaa1 when Xaa1 is a cysteine residue) of the peptide of formula V are disulfide bonded.
  • the sulfide group in the outer two cysteine residues can be represented by the following formula: It may be connected by a linker represented by A broken line part in the above formula means a bond part with a sulfide group.
  • the linker is more stable against a reduction reaction or the like than a normal disulfide bond. Therefore, the linker is preferably used when using a radionuclide that can destabilize disulfide bonds such as zirconium.
  • This peptide can be prepared by the methods described herein.
  • the peptide of the above formula according to the present invention has at least two cysteine (C) residues that are separated in each amino acid sequence, and cysteine cysteine so that a disulfide bond can be formed between the cysteine residues.
  • a preferred peptide is characterized in that two cysteine residues are disulfide-bonded to form a cyclic peptide, and 1 or 2 is present on the N-terminal side and C-terminal side of each cysteine residue. It may have any amino acid residue other than one cysteine.
  • each cysteine residue has 1 or 2 amino acid residues on the N-terminal side and C-terminal side, the remaining amino acids 1 to 2 and 16 to 17 from the N terminal when 17 amino acid residues are used
  • the groups are those exemplified above.
  • Xaa1 is a protein-constituting amino acid such as lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, and glutamic acid residue, and non-protein such as diaminopropionic acid and 2-aminosuberic acid It is a constituent amino acid, preferably a lysine residue.
  • Xaa1 is preferably modifiable by a crosslinking agent described later.
  • non-proteinogenic amino acid refers to an amino acid that is not used to constitute a protein in a living body.
  • the peptide of the present invention has no or almost no residue in the sequence as Xaa1 (for example, 1 Preferably only one or two).
  • Xaa1 is a lysine residue
  • the peptide of the present invention preferably has no or almost no lysine residue in the sequence other than Xaa1.
  • the peptide of the present invention has a binding affinity for human IgG of about 10 times or more, preferably about 50 times or more, more preferably about 200 times or more compared to other human immunoglobulins (IgA, IgE, IgM). high.
  • the dissociation constant (Kd) relating to the binding between the peptide of the present invention and human IgG can be determined by surface plasmon resonance spectrum analysis (for example, using the BIACORE system), for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 1 M to less than 1 ⁇ 10 ⁇ 3 M , Preferably less than 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M, more preferably less than 1 ⁇ 10 ⁇ 5 M.
  • the IgG-binding peptide of the present invention binds to the Fc domain of IgG.
  • the IgG-binding peptide of the present invention has a specific region of IgG Fc, that is, Lys248 residue according to Eu numbering in human IgG Fc (hereinafter, simply referred to as “Lys248” in the present specification).
  • Lys248 residue according to Eu numbering in human IgG Fc
  • Peptides of the present invention include conventional liquid phase synthesis methods, peptide synthesis methods such as solid phase synthesis methods, peptide synthesis using an automatic peptide synthesizer, etc.
  • peptide synthesis methods such as solid phase synthesis methods, peptide synthesis using an automatic peptide synthesizer, etc.
  • the peptide may be produced by a gene recombination method using a nucleic acid encoding the peptide of the present invention, a phage display method, or the like.
  • the target peptide can be produced by incorporating a DNA encoding the amino acid sequence of the peptide of the present invention into an expression vector, introducing it into a host cell and culturing.
  • the produced peptide can be obtained by conventional methods, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, HPLC chromatography, ammonium sulfate fractionation, ultrafiltration, and immunoadsorption. It can be recovered or purified by a method or the like.
  • amino acids prepared by protecting functional groups other than the ⁇ -amino group and ⁇ -carboxyl group to be bound of each amino acid are prepared.
  • a peptide bond forming reaction is carried out between the ⁇ -amino group and ⁇ -carboxyl group of each amino acid.
  • the carboxyl group of the amino acid residue located at the C-terminus of the peptide is bound to the solid phase via an appropriate spacer or linker.
  • the amino-terminal protecting group of the dipeptide thus obtained is selectively removed, and a peptide bond is formed with the ⁇ -carboxyl group of the next amino acid.
  • the production by gene recombination method is performed, for example, by inserting a DNA encoding the peptide of the present invention into an appropriate expression vector, introducing the vector into an appropriate host cell, culturing the cell, and from inside the cell or extracellular fluid.
  • the vector is not limited, and is, for example, a vector such as a plasmid, phage, cosmid, phagemid, and virus.
  • Plasmid vectors include, but are not limited to, E.
  • Phage vectors include, but are not limited to, T7 phage display vectors (T7Select10-3b, T7Select1-1b, T7Select1-2a, T7Select1-2b, T7Select1-2c, etc.
  • ⁇ phage vectors (Charon4A, Charon21A , EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, ⁇ ZAPII, etc.).
  • viral vectors include, but are not limited to, animal viruses such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses, and Sendai viruses, and insect viruses such as baculoviruses.
  • cosmid vectors include, but are not limited to, Lorist 6, Charomid 9-20, and Charomid 9-42.
  • phagemid vectors include, but are not limited to, pSKAN, pBluescript, pBK, and pComb3H.
  • the vector may include a regulatory sequence so that the target DNA can be expressed, a selection marker for selecting a vector containing the target DNA, a multicloning site for inserting the target DNA, and the like.
  • regulatory sequences include promoters, enhancers, terminators, S-D sequences or ribosome binding sites, replication origins, poly A sites, and the like.
  • an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a dihydrofolate reductase gene, and the like can be used as the selection marker.
  • Host cells for introducing the vector include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast cells, insect cells, animal cells (for example, mammalian cells), plant cells, and the like, and transformation or transfer into these cells.
  • the effects include, for example, calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, particle gun method, PEG method and the like.
  • the transformed cells are cultured according to a usual method used for culturing host organisms. For example, a culture solution of microorganisms such as Escherichia coli and yeast cells contains a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts that can be assimilated by the host microorganism.
  • the peptide produced by expression outside the cell it is preferable to secrete the peptide produced by expression outside the cell. This can be performed by binding DNA encoding a peptide sequence that allows secretion of the peptide from the cell to the 5 ′ end of the DNA encoding the target peptide.
  • the fusion peptide transferred to the cell membrane is cleaved by signal peptidase, and the target peptide is secreted and released into the medium.
  • the target peptide accumulated in the cells can be recovered. In this case, the cells are physically or chemically destroyed, and the target peptide is recovered using protein purification techniques.
  • the present invention further relates to a nucleic acid encoding the peptide of the present invention.
  • the nucleic acid includes DNA or RNA (for example, mRNA).
  • the IgG-binding peptide of the present invention and another protein are fused, after preparing the IgG-binding peptide and the other protein separately, the IgG-binding peptide and the protein may be fused using a linker as necessary.
  • An appropriate linker may be added as necessary by gene recombination to produce a fusion protein. In this case, it is preferable to prepare a fusion protein so that the IgG-binding peptide of the present invention does not impair the binding property with IgG.
  • the IgG-binding peptide in the present invention is preferably modified with a cross-linking agent.
  • the IgG-binding peptide of the present invention is adjacent to Lys248 or Lys246, preferably Lys248 according to EuEnumbering in a specific region of IgG Fc, that is, human IgG Fc, in Xaa1, as shown in the Examples described later. Therefore, by modifying Xaa1 of the IgG-binding peptide of the present invention with a crosslinking agent and crosslinking reaction with IgG, a cross-linking structure site-specifically between Xaa1 of IgG-binding peptide and Lys248 or Lys246 of IgGLFc, preferably Lys248 Can be formed.
  • various compounds can be specifically and easily introduced into IgG by modifying Xaa1 of the IgG-binding peptide of the present invention with a crosslinking agent and various compounds and allowing it to undergo a crosslinking reaction with IgG.
  • a compound can be introduced via an IgG-binding peptide, compounds having various structures can be introduced into IgG.
  • the method of the present invention has an advantage that the yield of the obtained product is high and the antibody itself is not modified, so that the possibility of reducing the function of the antibody is low.
  • the IgG-binding peptide of the present invention can also be used for non-human animal, preferably mammalian IgG.
  • the site in IgG to which the IgG-binding peptide of the present invention binds can be easily determined by those skilled in the art who have read this specification by, for example, aligning the sequence of human IgG with the sequence of IgG from other animals. Can be specified.
  • the “crosslinking agent” is a chemical substance for linking the IgG-binding peptide of the present invention and IgG Fc by a covalent bond.
  • the cross-linking agent of the present invention can be appropriately selected by those skilled in the art, and may be selected from desired amino acids (for example, lysine residue, cysteine residue, aspartic acid residue, glutamic acid residue, 2-aminosuberic acid, Or a compound having at least two sites capable of binding to diaminopropionic acid, arginine, and the like).
  • crosslinkers preferably containing two or more succinimidyl groups such as DSG (disuccinimidyl glutarate) and DSS (disuccinimidyl glutarate), DMA (Dimethyl adipimidate ⁇ 2HCl, adipimidate dimethyl dihydrochloride), DMP (dimethyl pimelimidate ⁇ 2HCl, dimethyl dimelimidate dihydrochloride), and DMS (dimethyl suberimidate ⁇ 2HCl, dimethyl suberimidate dimethyl dihydrochloride)
  • a crosslinking agent containing 2 or more, and DTBP (dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate ⁇ 2HCl, 3,3'-dithiobispropionimidic acid dimethyl dihydrochloride) and DSP (dithiobis (succinimidyl propionate), dithiobissuccinimine)
  • the IgG-binding peptide of the present invention may be modified with other functional substances, for example, antibodies such as IgA or VHH, labeling substances and / or other drugs.
  • the IgG-binding peptide and other functional substance can be linked by a method known to those skilled in the art, for example, a reaction between an azide group and dibenzocyclooctyne or a reaction between a maleimide group and a sulfhydryl group.
  • the IgG-binding peptide of the present invention forms a complex with IgG, whereby IgG can be detected or quantified via the labeling substance.
  • labeling substance examples include, but are not limited to, radioisotope metal nuclides, fluorescent dyes, chemiluminescent dyes, fluorescent proteins such as biotin and GFP (green fluorescent protein), luminescent proteins, and enzymes such as peroxidase.
  • labeling substances are fluorescein derivatives such as fluorescein and FITC, rhodamine derivatives such as rhodamine and tetramethylrhodamine, and fluorescent dyes such as Texas Red.
  • the drug is not limited to, for example, an anticancer drug such as auristatin, maytansine, doxorubicin, bleomycin, or derivatives thereof; and the blood brain barrier Targeting agents such as a drug that binds to the above receptor and enables transfer to the central nerve, or a drug that binds to cancer cells or the like and enables the transfer of antibodies into cells.
  • an anticancer drug such as auristatin, maytansine, doxorubicin, bleomycin, or derivatives thereof
  • the blood brain barrier Targeting agents such as a drug that binds to the above receptor and enables transfer to the central nerve, or a drug that binds to cancer cells or the like and enables the transfer of antibodies into cells.
  • the IgG-binding peptide modified with the crosslinking agent of the present invention can be produced, for example, by reacting an IgG-binding peptide obtained according to the method described in the above item ⁇ IgG-binding peptide> with a crosslinking agent.
  • a crosslinking agent it is necessary to specifically modify the side chain of the amino acid residue of Xaa1 in the IgG-binding peptide, and this can be done, for example, by selecting a combination of the type of Xaa1 and a crosslinking agent.
  • a cross-linking agent containing a succinimidyl group such as DSS or DSG reacts with a primary amine present on the side chain of a lysine residue and the N-terminus of a polypeptide, the N-terminus of an IgG-binding peptide is blocked and the DSS or By reacting with DSG, only the side chain of the lysine residue can be specifically modified with DSS or DSG.
  • a cross-linking agent containing a succinimidyl group such as DSS or DSG reacts with a primary amine present on the side chain of a lysine residue and the N-terminus of a polypeptide
  • the N-terminus of an IgG-binding peptide is blocked and the DSS or By reacting with DSG, only the side chain of the lysine residue can be specifically modified with DSS or DSG.
  • Such a combination of an amino acid residue and a crosslinking agent can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the IgG-binding peptide modified with the crosslinking agent of the present invention can also be produced, for example, by performing peptide synthesis using an amino acid residue modified with the crosslinking agent.
  • an IgG-binding peptide is modified with a labeling substance and / or other drug, it is modified with the labeling substance and / or other drug by synthesizing the peptide using amino acid residues with these modifications.
  • IgG-binding peptides may be prepared.
  • the IgG-binding peptide of the present invention may be modified by, for example, N-terminal PEGylation (polyethylene glycol addition), C-terminal amidation or the like in order to improve its stability.
  • the number of PEG molecules for PEGylation is not particularly limited, and for example, 1 to 50 molecules, 1 to 20 molecules, 2 to 10 molecules, 2 to 6 molecules, or 4 molecules of PEG can be added.
  • the present invention relates to a method for producing a complex of an IgG binding peptide and IgG comprising the step of mixing IgG with an IgG binding peptide modified with a cross-linking agent of the present invention.
  • a cross-linking reaction can occur between IgG-binding peptide modified with a cross-linking agent and IgG.
  • the cross-linking reaction can particularly occur site-specifically between the amino acid residue Xaa1 of IgG-binding peptide and Lys248 or Lys246, preferably Lys248 of IgG Fc.
  • the conditions for the mixing step are not particularly limited as long as the mixing step is performed under conditions that cause a cross-linking reaction between the IgG-binding peptide of the present invention and IgG.
  • the reaction can be performed by mixing the IgG-binding peptide of the present invention and IgG in a suitable buffer at room temperature (eg, about 15 ° C. to 30 ° C.).
  • the mixing step may be performed by adding an appropriate amount of a catalyst that promotes the crosslinking reaction, if necessary.
  • the mixing ratio of the IgG-binding peptide of the present invention and IgG in the mixing step is not particularly limited.
  • the molar ratio of the IgG-binding peptide of the present invention to IgG can be, for example, 1: 1 to 20: 1, preferably 2: 1 to 20: 1 or 5: 1 to 10: 1.
  • the mixing time (reaction time) in the mixing step is not limited as long as a cross-linking reaction occurs between the IgG-binding peptide of the present invention and IgG, but for example, 1 minute to 5 hours, preferably 10 minutes to 2 hours. Or it may be 15 minutes to 1 hour.
  • the method for producing the IgG-binding peptide-IgG complex of the present invention separates impurities, for example, unreacted IgG-binding peptide, IgG, and reagents, from the mixture after the above-described steps, if necessary. And a step of purifying the complex.
  • This step can be performed by a method known in the art, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, chromatography such as HPLC, and the like.
  • the present invention relates to a complex of an IgG binding peptide of the present invention and IgG.
  • the complex can be formed by the crosslinking reaction. Therefore, the present invention is preferably an IgG binding peptide in which the amino acid residue of Xaa1 of IgG binding peptide and IgG Fc Lys248 or Lys246, preferably Lys248 are bound site-specifically via a cross-linking agent. Concerning the complex.
  • the complex of the present invention is formed by a site-specific cross-linking reaction, the cross-linking reaction is less likely to have a negative effect on the activity of IgG.
  • new functionality can be added to IgG by linking the modified IgG-binding peptide to IgG.
  • IgG linked to an IgG-binding peptide to which a radionuclide such as 111 In, 89 Zr, 64 Cu, 67/68 Ga, and 99m Tc is added can be used for detection and diagnosis of cancer.
  • IgG can be appropriately selected according to the type of cancer.
  • trastuzumab can be used for breast cancer
  • cetuximab can be used for colon cancer.
  • the present invention includes the IgG-binding peptide to which a radionuclide is bound, the IgG-binding peptide modified with the cross-linking agent, or the complex of the IgG-binding peptide and IgG modified with the cross-linking agent.
  • the present invention relates to a nuclear medicine image diagnostic agent or a cancer diagnostic agent.
  • the nuclear medicine diagnostic imaging agent of the present invention can be used for measuring the distribution state and / or pharmacokinetics of various substances in a living body.
  • the nuclear medicine diagnostic imaging agent containing the IgG-binding peptide-IgG complex of the present invention is used for measuring the distribution of antigens such as inflammation markers targeted for IgG and the pharmacokinetics of the IgG antibody itself. Can do.
  • Examples of the cancer that is a target of the diagnostic agent for cancer according to the present invention include, but are not limited to, breast cancer, liver cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, ovarian cancer, colon cancer, such as colon cancer, stomach cancer, cervical cancer, Examples include brain tumors, myeloma, osteosarcoma, lung cancer, leukemia, and malignant lymphoma.
  • the nuclear medicine diagnostic imaging agent or cancer diagnostic agent of the present invention is administered orally or parenterally (for example, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, rectal administration, or transmucosal administration). be able to.
  • the nuclear medicine diagnostic imaging agent or cancer diagnostic agent of the present invention can be made into a suitable dosage form according to the administration route. Specifically, granules, tablets, pills, capsules, syrups, emulsions, suspensions, intravenous injections, arterial injections, injections for intramuscular injections, drops, external preparations, suppositories, etc. It can be prepared in a dosage form.
  • the administration method and dosage form can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the sex, age, weight, symptoms, etc. of the patient.
  • the nuclear medicine diagnostic imaging agent or cancer diagnostic agent of the present invention can be formulated according to conventional methods (see, for example, Remington's Pharmaceutical, Science, Latest Edition, Mark Publishing, Company, Easton, USA) and pharmaceutically. It may contain both acceptable carriers and additives.
  • Examples of carriers and pharmaceutical additives that can be included in the nuclear medicine diagnostic imaging agent or cancer diagnostic agent of the present invention include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, Sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, agar, polyethylene glycol, diglycerin, glycerin, propylene glycol, petroleum jelly, paraffin , Stearyl Alcohol, Stearic Acid, Human Serum Albumin (HSA), Mannitol, Sorbitol, Lactose, and Acceptable Surfactants as Pharmaceutical Additives Etc. The.
  • the IgG binding protein of the present invention or a complex of IgG binding protein and IgG is dissolved in a solution such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • a solution such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • Tween80, Tween-20, gelatin, human serum albumin and the like can be used.
  • it may be freeze-dried to obtain a dosage form that is dissolved and reconstituted before use.
  • the stabilizer for freeze-drying include sugar alcohols such as mannitol and glucose and / or sugars. Can be used.
  • the effective dose and administration interval of the nuclear medicine image diagnostic agent or cancer diagnostic agent of the present invention can be appropriately selected according to the sex, age, weight, symptoms, etc. of the patient.
  • the present invention is a method for determining the presence or absence of cancer in a subject comprising: A step of reacting an IgG-binding peptide or a complex of IgG-binding peptide and IgG described herein with a sample obtained from a subject, wherein a radionuclide is bound to the IgG-binding peptide Process, Measuring the level or presence of radioactivity derived from the radionuclide in the sample, and determining the presence or absence of cancer in the subject based on the level or presence of radioactivity, Including a method.
  • the invention is a method of detecting an antigen or IgG in a subject comprising Reacting the IgG-binding peptide and IgG complex described herein with a sample obtained from a subject, wherein the radionuclide is bound to the IgG-binding peptide, Measuring the level or presence of radioactivity from the radionuclide in the sample, and detecting an antigen or IgG based on the level or presence of radioactivity, Including a method.
  • the distribution status and / or pharmacokinetics of the antigen or IgG in the subject can be estimated.
  • Examples of the sample used in the present method include tissues and biological samples.
  • tissues include lesion sites such as breast, liver, pancreas, prostate, ovary, large intestine, such as colon, stomach, cervix, bone marrow, lymph nodes, etc.
  • biopsy samples of these tissues are used. be able to.
  • biological samples include, for example, blood, plasma, lymph, tissue fluid, urine, and cells such as peripheral blood cells, hair matrix cells, oral cells, nasal cells, intestinal cells, vaginal cells, mucosal cells, and sputum (alveoli Cell or pneumohepatic cell etc.), preferably blood or plasma.
  • the method for measuring the level or presence of radioactivity is not particularly limited, and any method known to those skilled in the art can be used.
  • image analysis such as SPECT / CT may be performed, or the level or presence of radioactivity may be measured using a detector such as a scintillation counter.
  • the step of determining or detecting the presence or absence of cancer in a subject based on the level or presence of radioactivity is not particularly limited, and any method known to those skilled in the art can be used. For example, for a plurality of samples derived from a subject known not suffering from cancer, such as 2 or more, 3 or more, 4 or more, preferably 5 or more, from a subject to be used in the method of the present invention If the level of radioactivity in the sample is significantly high, it can be determined that the subject is likely to have cancer.
  • the present invention is a method for determining the presence or absence of cancer in a subject comprising: A step of administering to the subject an IgG-binding peptide or a complex of IgG-binding peptide and IgG described herein, wherein a radionuclide is bound to the IgG-binding peptide, Measuring the level or presence of radioactivity derived from the radionuclide in the subject, and determining whether the subject is affected by cancer based on the level or presence of radioactivity, Including a method.
  • the present invention provides a method for detecting an antigen or IgG in a subject, comprising administering a IgG-binding peptide-IgG complex described herein to the subject, the radionuclide. Is bound to the IgG-binding peptide, Measuring a level or presence of radioactivity derived from a radionuclide in a subject, and detecting an antigen or IgG based on the level or presence of radioactivity, Including a method.
  • This method is preferably a nuclear medicine imaging method. By this method, the distribution situation and / or pharmacokinetics of the antigen or IgG in the subject can be estimated.
  • the species of the subject includes, for example, primates such as humans and chimpanzees, laboratory animals such as rats, mice, and rabbits, livestock animals such as pigs, cows, horses, sheep, and goats, and dogs and cats. And the like, preferably humans.
  • Example 1 X-ray crystal structure analysis of complex of IgG-binding peptide and IgG] ⁇ Method> (1) Preparation of IgG-binding peptide solution G (HC) DCAYHRGELVWCT (HC) H-NH 2 sequence (SEQ ID NO: 31 where HC is homocysteine, 4th and 14th two Cys, 2nd A cyclic homocysteine peptide having 16th two homocysteines each forming a disulfide bond in the molecule was prepared by a peptide solid phase synthesis method by F-moc method according to a conventional method. The prepared IgG-binding peptide 0.8 mg powder was dissolved in 24 ⁇ L of 100% dimethyl sulfoxide (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to prepare an IgG-binding peptide solution.
  • HC DCAYHRGELVWCT
  • H-NH 2 sequence SEQ ID NO: 31 where HC is homocysteine, 4th and 14th
  • 63 ⁇ L of 16mg / mL human IgG Fc solution (0.1M sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries), 0.04M 2-morpholinoethanesulfonic acid (Wako Pure Chemical Industries) (pH 6.0)) was prepared in (1) above.
  • the resulting IgG-binding peptide solution was mixed with 2 ⁇ L to prepare a complex solution of Fc and IgG-binding peptide.
  • Crystal of complex of Fc and IgG binding peptide was obtained by sitting drop vapor diffusion method. That is, 0.3 ⁇ L of the complex solution of Fc and IgG-binding peptide prepared in (2) above and a crystallization agent (20% polyethylene glycol 3350 (Sigma Aldrich), 0.2M potassium iodide (Wako Pure Chemical Industries) (pH 6. 9)) 0.3 ⁇ L was mixed on the S1 well of an intelligent crystallization plate (manufactured by Veritas) using HydoraII + (manufactured by Matrix), which is a crystallization robot, to obtain a crystallization drop.
  • a crystallization agent 20% polyethylene glycol 3350 (Sigma Aldrich), 0.2M potassium iodide (Wako Pure Chemical Industries) (pH 6. 9)
  • diffraction intensity data was processed with a resolution of 3.0 angstroms using a diffraction intensity data processing program HKL2000 (manufactured by HKL Research).
  • HKL2000 manufactured by HKL Research
  • the crystal space group was P21
  • the completeness of the obtained data was 99.9% and Rmerge was 13.8%.
  • the IgG-binding peptide binds to the boundary region of the CH2 and CH3 domains overlapping the protein A binding site, and the previously reported IgG-binding peptide Fc-III (DeLano, WL et al., Science, 2000, 287, pp. 1279-1283).
  • the characteristic interaction between the IgG-binding peptide and Fc is that the side chain guanidino group of the 8th residue Arg of the IgG-binding peptide is 2.91 angstroms and the side chain of Fc Glu380 (based on EU numbering; the same applies hereinafter). It is a point which is salt-bonded to the carboxylic acid.
  • the side chain of Glu380 is salt-bound with Lys248 in human IgG Fc to form a salt-binding network in the molecule, and IgG binding peptide Arg8 and Fc Lys248 are linked to Fc Glu380.
  • the 8th residue Arg of the IgG binding peptide was changed to Lys, and the side chain amino groups of the peptide Lys8 and the antibody Lys248 were cross-linked with a cross-linking agent in a form similar to this salt-bonded network structure. Devised.
  • 0.4MCMEDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) and 0.1M onto CM5 sensor chip set in BIAcoreT200 (GE healthcare)
  • sulfo-NHS sulfo-N-hydroxysuccinimide
  • the sensor chip is activated by injecting into the sensor chip for 7 minutes at a flow rate of 10 ⁇ l / ml, pH 4.0 IgG was immobilized so that the amount of immobilization was 4000 to 5000 in terms of RU value under the condition of (10 mM mM acetic acid Na).
  • HBS-EP buffer 0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20, 3 mM mM EDTA, pH 7.0
  • Type I (R8K) peptide When each cross-linking agent is bound to Type I (R8K) peptide, the affinity for human IgG is about 330 nM (Kd) and Type I (R8K) -DSS-OH for Type I (R8K) -DSG-OH. About 390 nM (Kd), and no significant decrease in affinity due to binding of the cross-linking agent was observed. Any peptide has an affinity of ⁇ M or less in Kd value, and thus it was considered that sufficiently specific labeling was possible.
  • Example 3 Specific modification of human IgG-Fc with IgG-binding peptide
  • Method 3 A labeled reagent peptide in which an IgG-binding peptide (Type I (R8K)) with Biotin-PEG4 added to the N-terminus was modified with DSS or DSG by the same method as in Example 2, was reacted with human IgG Fc, The labeling reaction of human IgG Fc was examined.
  • IgG-binding peptide (R8K) 200 pmol / 5 ⁇ L in 0.1% TFA reacted with excess DSS or DSG by the same method as in Example 2 was purified on a reverse phase column, and then acetonitrile was removed under reduced pressure.
  • Proteins labeled with biotinylated peptides were detected with a chemiluminescent reagent (Immunostar (registered trademark) Basic, Wako Pure Chemical Industries) using SA-conjugated HRP (1000-fold dilution, Vector Laboratories).
  • chemiluminescent reagent Immunostar (registered trademark) Basic, Wako Pure Chemical Industries
  • Example 4 Examination of reaction conditions of IgG-binding peptide against IgG] ⁇ Method> (1) Examination of reaction molar ratio Each protein (IgG (Chugai Pharmaceutical), IgA (Athens Research & Technology), or Bovine gelatin (Wako Pure Chemical Industries)) is added to a well of a 96-well microplate (Nunc (registered trademark) MaxiSorp). A 0.1 M NaHCO3 solution containing (50 ng (0.33 pmol) / ⁇ l / well) was added to the plate and allowed to stand overnight at room temperature, whereby each protein was adsorbed on the surface of the plate and blocked with 0.5% BSA.
  • the biotinylated IgG binding (R8K) peptide (NO DSS R8K) not modified with DSS shows a very weak binding, which is considered to be a binding activity caused by a peptide bound by a non-covalent bond. Furthermore, even when an excess of labeled IgG-binding peptide reagent was added, no binding to other proteins (hIgA, Bovine gelatin, or BSA used as a blocking agent) was detected.
  • the IgG-binding peptide of the present invention modified with a crosslinking agent specifically binds IgG in a short time.
  • Example 5 Labeling of Fc with fluorescent IgG-binding peptide
  • ⁇ Method> 200 ⁇ L of IgG (Chugai Pharmaceutical), IgA (Athens Research & Technology), or BSA (Sigma Aldrich) (15 ⁇ g: 100 pmol in terms of IgG) and DSG cross-linked peptide or DSS cross-linked peptide (500 pmol) prepared according to Example 2 The mixture was reacted at room temperature for 60 min, and 10 ⁇ L of 1M Tris-HCl (pH 7.0) was added to stop the reaction.
  • Example 6 Analysis of modified Fc by IgG-binding peptide (pH 4.5)] ⁇ Method> Human IgG (Chugai Pharmaceutical) Fc solution (20 ⁇ M, 0.1 M acetate buffer pH 4.5) 200 ⁇ L and DSG modified IgG binding peptide (RGNCAYHXGQLVWCTYH (SEQ ID NO: 35) dissolved in DMF by the same method as in Example 2. ), X is lysine) (4 mM) (0.5, 1.0, 2.0, 5.0 ⁇ L (0.5, 1.0, 2.0, 5.0 in molar ratio)), stirred rapidly, reacted at room temperature for 15 minutes, and reacted with 1M Tris-HCl (pH 7.
  • FIG. 5B shows changes in the amount of unreacted (peak 2), one peptide adduct (peak 3), and two peptide adducts (peak 4) when reacted at each molar ratio. It is a graph. For example, even when the reaction is carried out at a molar ratio of 1: 1, the unreacted product is 20% or less, and at the molar ratio of 1: 2, the unreacted product is 10% or less, indicating that the yield is extremely high. In addition, even when the molar ratio was 1: 5, the ratio of adducts of two peptides increased relatively, but Fc with more peptides added was not detected on the ion exchange chromatogram. This indicates that this labeling reaction is very specific.
  • Example 7 Effect of pH and reaction time on Fc reaction by IgG-binding peptide
  • ⁇ Method> In 200 ⁇ L of human IgG Fc solution prepared at pH 4.0 (25 mM acetate buffer), pH 5.5 (25 mM acetate buffer), or pH 7.0 (PBS), in DMF prepared in Example 5. 1.0 ⁇ L of dissolved DSG-modified IgG-binding peptide (4 mM) was added (1.0 molar ratio), and the mixture was stirred rapidly and reacted at room temperature.
  • Example 8 Labeling of IgG-binding peptide with radionuclide and detection of cancer 1 using this] 1) Preparation of DTPA-containing IgG-binding peptide Amino-PEG4-modified IgG-binding peptide GPDCAYHKGELVWCTFH (SEQ ID NO: 37, two Cys in the molecule are SS) whose N-terminal amino group is modified with DTPA-tetra (tBu) ester (CheMatech) The bond was formed and the C-terminal was amidated) was synthesized according to a conventional method by Fmoc solid phase synthesis.
  • the purified DTPA-IgG binding peptide was dissolved in 20 ⁇ L of DMSO (19 mM). To the peptide solution, 20 ⁇ L of DSG (500 mM) dissolved in acetonitrile and 0.2 ⁇ L of pyridine (final concentration 0.5%) were added and reacted at 50 ° C. for 3 hours. The whole volume is diluted in 10 ml of 15% acetonitrile containing 0.1% TFA, and the supernatant after centrifugation is injected into an InertSustain® C18 column (7.6 mm 1 ⁇ 250 mm, GL Science), and 15% containing 0.1% TFA. To 80% acetonitrile gradient. Mass analysis of the eluate was performed, and the target product (DSG-modified DTPA-PEG4-modified IgG-binding peptide) was recovered, then the solvent was removed, and then freeze-dried.
  • DSG 500 mM
  • acetonitrile
  • the DTPA-modified human antibody (antibody drug conjugate, ADC) prepared in this manner was obtained with 0M containing 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) on an anion exchange column Shodex QA825 (8.0 mm ⁇ 75 mm, Shodex). To 0.5M NaCl gradient elution. Two peaks (peaks A and B) other than the unreacted antibody were collected, and then desalted and concentrated by centrifugation at 3000 g on Vivaspin (10000 Da cutoff, Sartorius).
  • the obtained sample was measured for mass with MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF / TOF-KG (Bruker Daltonics), peak A was 2716 (theoretical value 2722) compared to the original anti-HER2 human antibody, and peak B was the original. Since there is an increase of 5398 (theoretical value 5444) compared to the anti-HER2 human antibody, one DTPA-PEG4-modified IgG-binding peptide with DTPA added (anti-HER2 antibody-DTPA * 1) and two, respectively It was confirmed that (anti-HER2 antibody-DTPA * 2) was introduced.
  • 1M citric acid solution and 1M trisodium citrate solution were each accurately weighed with a 5 mL micropipette and transferred to a 100 mL volumetric flask. Pure water was added to make exactly 100 mL. 1 mL of 1% EDTA solution was accurately weighed with a micropipette, transferred to the 100 mL volumetric flask in Step 1, and mixed well. This was used as a developing solvent (prepared at the time of use). The developing solvent was put into the developing container up to about 1 cm from the bottom of the container. 3 ⁇ L of the test substance was accurately weighed with a micropipette, and dropped at the origin with the lower end of the filter paper 2 cm as the origin. It was made to dry immediately after dripping.
  • the solvent front was 10 cm from the origin, and the solvent was placed in the developing solvent so that the lower end was immersed in the developing solvent. After reaching the top of the solvent front, it was dried immediately. Radioactivity remaining on the filter paper was measured with a radio thin layer chromatography analyzer (conditions Counting time: 20 min, Energy Range: 125-285 keV, Binning: 2), and the ratio of the peak area at the origin was modified with [ 111 In] -labeled DTPA. The radiochemical purity [%] of Trastuzumab was calculated.
  • Table 2 shows the results of labeling studies using two types of DTPA-modified Trastuzumab with different numbers of modifications of the DTPA-binding peptide for one molecule of Trastuzumab. As shown in Table 1, all DTPA-modified Trastuzumab could be labeled with 111 In.
  • HER2 binding ability and specificity of 111 In-labeled Trastuzumab HER2-high expression cell line SK-OV-3 (human ovarian cancer cell) and HER2 low expression cell line MDA-MB-231 (human-derived breast cancer cell) All were obtained from the American Type Culture Collection) using a Trypsin-EDTA mixed solution to prepare a cell suspension adjusted to 1.5 ⁇ 10 7 cells / mL with a serum-free medium. 200 ⁇ L of the cell suspension was accurately weighed with a micropipette, placed in a 1.5 mL microtube and cooled on ice. The number of samples was 3 for each.
  • 111 In-labeled Trastuzumab prepared in 3) above was diluted with a serum-free medium to prepare a radioactivity concentration of 10 to 200 kBq / mL.
  • 111 In-labeled Trastuzumab-containing serum-free medium was accurately weighed with a 500 ⁇ L micropipette and placed in a 1.5 mL plastic tube. Note that only a plastic tube was prepared as a blank (used to measure the background value for calculating the net value of the following formula). The number of samples was 3 for each. Using the measured values measured for each sample with an autowell gamma counter (measurement conditions: Energy Range: 111-252keV, preset time: 60 seconds), the [ 111 In] -labeled Trastuzumab for each cell is calculated from the following formula: The binding rate (%) was calculated.
  • a tumor-bearing model was prepared by transplanting the HER2-high-expressing cell line SK-OV-3 to the left lower limb of BALB / c nu / nu nude mice and transplanting the HER2-low-expressing cell line MDA-MB-231 to the right lower limb. Each cell was transplanted into the same individual. Nude mice were purchased from Japan SLC Co., Ltd. and 6 6-week-old females were used. Each tumor volume was measured on the day of imaging, and two models with appropriate tumor volumes were selected for imaging experiments. Each cancer cell used in these mice was obtained from the American Type Culture Collection.
  • SPECT / CT imaging SPECT imaging
  • SPECT imaging To 13 weeks after transplantation were administered [111 an In] labeled Trastuzumab-1 solution (3.83MBq) or [111 an In] labeled Trastuzumab-2 (2.64MBq) solution model tail vein. Imaging was performed with a SPECT / CT camera (product name: FX3000 Pre-Clinical Imaging System) from 4 hours after administration. Thereafter, imaging was performed 24 hours and 48 hours after administration.
  • CT imaging CT imaging was performed before SPECT imaging to confirm that each tumor tissue was within the field of view of SPECT imaging at the same time. Anesthesia was introduced with isoflurane and the animal bed was attached while maintaining anesthesia. This model was placed in a CT apparatus, irradiated with X-rays, and positioned so that the tumor was in the center of the field of view. CT imaging was performed under the following imaging conditions, and a CT image (raw file) of the tumor was obtained. Project count: 200views Frames averaged: 1frames / view Detector binning: 2x2 X-ray tube current: Default (150 ⁇ A) X-ray tube voltage: 60kV Exposure time: 230ms Magnification: 1.8
  • the obtained raw file is reconstructed with TrifoilsConsole (reconstruction condition: HalfsRes), and the reconstructed image is further converted with image display software to create a DICOM file, which is then image analysis software (product name PMOD 3.6) ), The image was displayed, and used for the subsequent analysis.
  • SPECT / CT image analysis To produce a fused image of SPECT and CT in [111 an In] labeled Trastuzumab-1 solution or [111 an In] each time point after labeling Trastuzumab-2 solution dose, viewed in the coronal plane.
  • Table 5 shows the SPECT imaging conditions
  • Table 6 shows the image reconstruction conditions.
  • [ 111 In] -labeled Trastuzumab-1 shows non-specific accumulation in the tail because some solution leaked out of the blood vessel at the time of administration.
  • [111 an In] labeled Trastuzumab-1 and [111 In] 24 hours after administration of the labeled Trastuzumab-2 the SPECT / CT images of 48 hours, as the slice image including the tumor, as shown in FIG. SPECT images performed attenuation correction on the basis of the [111 an In] imaging time of 24 hours points after administration of the labeled Trastuzumab-1, are also shown the scale value.
  • [111 an In] labeled Trastuzumab-1 and [111 an In] labeled Trastuzumab-2 admitted accumulation to HER2 high expressing tumor tissue, but no significant accumulation in HER2 low expressing tumor tissue. The integrated into any point in time to any HER2 highly expressing tumor tissue is towards the [111 an In] labeled Trastuzumab-1 was higher than [111 an In] labeled Trastuzumab-2.
  • FIG. 9 shows SPECT / CT images obtained at 6 hours and 4 hours after administration of [ 111 In] -labeled Trastuzumab-1 and [ 111 In] -labeled Trastuzumab-2, respectively, as slice images including the liver.
  • Accumulation in administration early liver [111 an In] compared labeled Trastuzumab-1 and better in [111 an In] labeled Trastuzumab-2 was higher. The position of the liver was judged from the fact that the upper part was the chest cavity.
  • Example 9 Preparation of IgG-binding peptide having SS cross-linked structure with dichloropropanone] N-terminal acetylated RRC (Acm protected) -PEG4-synthesized synthetic peptide GPDCAYHXGELVWCTFH (SEQ ID NO: 2, X is lysine, C-terminal is amidated) on peptide synthetic beads (Rink-amide-Chemmatrix resin, Biotage) The Fmoc solid phase synthesis method was used to synthesize it according to a conventional method. After excision of the peptide from the resin and deprotection, the peptide (FIG. 10, a) was obtained.
  • Example 10 Labeling of IgG-binding peptide with radionuclide and detection of cancer using the same 2] ⁇ Method> 1) Preparation of deferoxamine-containing IgG-binding peptide AminoPEG4-modified IgG-binding peptide GPDCAYHKGELVWCTFH (SEQ ID NO: 37, two Cys in the molecule is SS) whose N-terminal amino group is modified with deferoxamine-tetra (tBu) ester (CheMatech) The bond was formed and the C-terminal was amidated) was synthesized according to a conventional method by Fmoc solid phase synthesis.
  • the purified deferoxamine-IgG binding peptide was dissolved in 40 ⁇ L (18 mM) DMSO.
  • 40 ⁇ L of DSG 500 mM
  • acetonitrile 0.5 ⁇ L
  • pyridine final concentration 0.66%
  • the whole volume is diluted in 10 ml of 15% acetonitrile containing 0.1% TFA, and the supernatant after centrifugation is injected into an InertSustain® C18 column (6.0 ⁇ 250 mm, GL Science) and 10% to 66 containing 0.1% TFA.
  • peaks A and B Two peaks (peaks A and B) other than the unreacted antibody were collected, and then desalted and concentrated by centrifugation at 3000 g on Vivaspin (registered trademark) (10000 Da cut-off, Sartorius).
  • Vivaspin registered trademark
  • the obtained sample was measured for mass with MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF / TOF-KG (Bruker Daltonics), peak A was 2716 (theoretical value 2722) compared to the original anti-HER2 human antibody, and peak B was the original.
  • the 89 Zr labeling and purification 89 Zr deferoxamine modified Trastuzumab was 200 MBq / 200 [mu] L, it was dissolved in 1M oxalic acid solution. 200 ⁇ L of 89 Zr-oxalic acid solution and 90 ⁇ L of 2M sodium carbonate were added to the microtube and left at room temperature for 3 minutes. 1030 ⁇ L of 5 M / mL gentisic acid-containing 0.5 M HEPES buffer (pH 7.1-7.3) was added to the microtube after being allowed to stand for 3 minutes while stirring.
  • 89 Zr labeled solution was developed using reverse phase modified silica gel thin layer chromatography (TLC) plate, TLC silica gel 60 RP-18 F254s (Merck Millipore) and 50 mM EDTA (pH 5.0) as a developing solvent.
  • TLC reverse phase modified silica gel thin layer chromatography
  • the developed TLC plate was exposed to an imaging plate (Fuji Film), and an autoradiogram was obtained with a fluoro image analyzer (FLA-7000, manufactured by GE Healthcare).
  • FLA-7000 fluoro image analyzer
  • the radiochemical purity [%] of [ 89 Zr] -labeled Trastuzumab was calculated from the ratio of the peak area at the origin of the obtained autoradiogram.
  • One having one deferoxamine molecule in one antibody molecule was designated as [ 89 Zr] -labeled Trastuzumab-1, and one having two molecules was designated as [ 89 Zr] -labeled Trastuzumab-2.
  • [89 Zr] labeled Trastuzumab-1 solution or [89 Zr] labeled Trastuzumab-2 solution was administered from the model tail vein. Imaging was performed with a PET camera (product name: Clairvivo (registered trademark) PET) from 6 hours after the administration. Thereafter, imaging was performed at 24 and 48 hours after administration. The 3D-DRAMA method was used for PET image reconstruction.
  • Table 7 summarizes the details of the model used in the in vivo experiment and information on [ 89 Zr] -labeled Trastuzumab-1 and [ 89 Zr] -labeled Trastuzumab-2 administered.
  • Table 8 shows the imaging time at each time point. In setting the imaging time at each time point, the dose of each label and the decay of radioactivity were considered.
  • FIG. 11 shows PET images taken at 6, 24, and 48 hours after administration of [ 89 Zr] -labeled Trastuzumab-1 and [ 89 Zr] -labeled Trastuzumab-2, respectively, as slice images containing tumors.
  • [ 89 Zr] -labeled Trastuzumab-1 and [ 89 Zr] -labeled Trastuzumab-2 showed higher accumulation in HER2-highly expressing tumor tissues compared to HER2 low-expressing tumor tissues.
  • IgG-binding peptide of the present invention can be easily bound to a radiometal nuclide, IgG can be labeled specifically and conveniently with the radiometal nuclide without impairing its function. IgG labeled with a radiometal nuclide can be used for diagnosis of cancer. All publications, patents and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

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Abstract

本発明は、放射性金属核種と結合し得るリガンドを含むIgG結合ペプチド、放射性金属核種で標識されたIgG結合ペプチド、該IgG結合ペプチドとIgGとの複合体、及び該IgG結合ペプチド又は複合体を含む、核医学画像診断剤又は癌の診断剤等に関する。

Description

ＩｇＧ結合ペプチドによる部位特異的ＲＩ標識抗体
　本発明は、放射性金属核種と結合し得るリガンドを含むIgG結合ペプチド、放射性金属核種で標識されたIgG結合ペプチド、該IgG結合ペプチドとIgGとの複合体、及び該IgG結合ペプチド又は複合体を含む、核医学画像診断剤又は癌の診断剤等に関する。
　抗体は、従来から種々の研究・開発において、標的分子の検出に多く利用されており、検出試薬や診断薬として産業面でも、極めて重要なものとなっている。また、抗体は、その標的分子に対する特異性から、疾患の治療のための医薬品としても注目されている。
　抗体の機能付加のために、ヨウ素化やキレート化合物の付加（非特許文献1）等を介して放射性同位体による標識が行われている。これらの修飾は、これまで主に抗体に含まれるリシンのアミノ基やシステインのチオール基、及び活性化されたカルボキシル基等を介して行われており、これらは官能基について特異的だが、部位特異的ではないため、抗体の抗原結合部位への修飾等により抗体の活性を低下させるといった問題や、結合する化合物の数をコントロールすることが難しい等の問題があった。
　このような問題を克服するため、特定の官能基を部位特異的に導入した抗体を使って、抗体を修飾することが行われている。例えば、非天然アミノ酸（非特許文献2～4）やフリーのシステイン（非特許文献5～6）を、特定の部位に遺伝子工学的改変により導入することで、特定の部位での修飾が可能になった。このように部位特異的な抗体修飾技術は開発されつつあるが、多くの場合、抗体そのものを抗体工学的に改変する必要があり、その改変に伴う抗体の機能低下や開発のコスト高を考えると必ずしも有利な方法とはいえない。
Rodwell, J. D. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1986, 83, pp.2632-2636 Axup, J. Y. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109, pp. 16101-16106 Tian, F. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111, pp. 1766-1771 Zimmerman, E. S. et al., Bioconjugate chemistry, 2014, 25, pp. 351-361 Shen, B. Q. et al., Nature biotechnology, 2012, 30, pp. 184-189 Bernardes, G. J. et al., Nature protocols, 2013, 8, pp. 2079-2089
　したがって、特異的かつ簡便に抗体を修飾することができる方法が必要とされている。
　上記課題を解決するために、本発明者らは、IgG結合ペプチドとIgG Fcとの複合体のX線結晶構造解析に基づいて、結合状態におけるIgG結合ペプチドの各アミノ酸の位置とIgG Fcの各アミノ酸との位置関係を詳細に検討した。さらに、架橋剤と結合可能なアミノ酸をペプチドに導入し、該アミノ酸を架橋剤により修飾することによって、架橋剤により部位特異的に修飾されたIgG結合ペプチドを調製し、これを用いて、IgGを修飾できることを見出した。また、本発明者は、放射性金属核種で標識されたIgG結合ペプチドとIgGの複合体を、癌の診断剤として用い得ることを見出し、本発明を完成させた。
　したがって、本発明は以下の実施形態を包含する。
（１）下記の式I：
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種と結合し得るリガンドを含む、ペプチド。
（２）下記の式I：
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種で標識された、ペプチド。
（３）下記の式V：
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T　　(V)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種がリガンドを介して結合している、ペプチド。
（４）ペプチドとIgGとの複合体であって、Xaa1が架橋剤で修飾されている、上記に記載のペプチドとIgGの架橋反応によって形成される、前記複合体。
（５）放射性金属核種がペプチドに結合している、（２）又は（３）に記載のペプチド又は（４）に記載の複合体を含む、核医学画像診断剤又は癌の診断剤。
（６）被験体の癌の罹患の有無を決定する方法であって、
　被験体から得られたサンプルに、放射性金属核種がペプチドに結合している、（２）又は（３）に記載のペプチド又は（４）に記載の複合体を反応させる工程、
　サンプル中の放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
　放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
を含む、方法。
（７）被験体の癌の罹患の有無を決定する方法であって、
　放射性金属核種がペプチドに結合している、（２）又は（３）に記載のペプチド又は（４）に記載の複合体を、被験体に投与する工程、
　被験体において、放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
　放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
を含む、方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-117395号、2016-227025号の開示内容を包含する。
　本発明のIgG結合ペプチドは放射性金属核種を容易に結合させることができるので、本発明のIgG結合ペプチドを用いることによって放射性金属核種によってIgGを特異的かつ簡便に標識することができる。また、本発明のIgG結合ペプチドは、抗体分子の配列を改変する必要が無いことから、抗体分子の遺伝子改変に伴う機能低下を招くことがない。さらに、従来必要となっていた放射性金属核種でIgGを直接標識する反応を必要とせず、また、当該反応による抗体の機能低下を招くことがない。
図1（A）は、IgG結合ペプチド（C35A-3/15：DCAYHRGELVWCT（配列番号33））とヒトIgG Fcとの複合体の構造を示す。IgG結合ペプチドはスペースフィリングモデルで、IgG Fcはリボンモデルで、Fcの糖鎖をワイヤーモデルで示す。図1（B）は、DSGによって修飾したIgG結合ペプチド（C35A-3/15(R8K)：DCAYHKGELVWCT（配列番号34））とIgG Fcとの架橋構造のモデルを示す。ペプチドの主鎖はリボンモデルで示す。peptide-Lys8は、C35A-3/15(R8K)の6番目のリシン残基を、peptide-Tyr6-Gly9は、C35A-3/15(R8K)の4番目のチロシン残基から7番目のグリシン残基を示す。また、Fc-Lys248は、EU numberingに従うFcのLys248を、Fc-Pro247-Asp249は、EU numberingに従うFcのPro247からAsp249を示す。 図2は、標識化IgG結合ペプチドと各種タンパク質の混合物のSDS-PAGE（A）及びウエスタンブロット（B）の結果を示す。図中、DSGは、DSG（ジスクシンイミジルグルタレート）と反応させたIgG結合ペプチドを、DSSは、DSS（ジスクシンイミジルスベレート）と反応させたIgG結合ペプチドを供試したことを示す。また、図中、hIgGはヒトIgGを、hIgAはヒトIgAを、HSAはヒト血清アルブミンをそれぞれ示す。 図3は、標識化IgG結合ペプチドとIgGの反応における、反応モル比（A）及び反応時間（B）のELISAによる検討結果を示す。DSS R8K 0 minは、IgGの10倍モル比の標識化IgG結合ペプチドにTris-HCl（pH7.0）を加えNHS基をブロッキング後、ウェルに加えたものである。No DSS R8Kは、DSSを結合させていないビオチン化IgG結合（R8K）ペプチドを使用したものであり、no pepは、ペプチドを加えていないコントロールを示す。 図4は、標識化IgG結合ペプチドの各タンパク質（hIgA、hIgG、BSA（ウシ血清アルブミン））への反応性を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて測定した結果を示す。（A）は、DSSにより修飾したIgG結合ペプチドの反応性を、（B）は、DSGにより修飾したIgG結合ペプチドの反応性を測定した結果を示す。 図5（A）は、ヒトIgGのFc溶液と、DMF中に溶解したDSG修飾したIgG結合ペプチドを、ヒトIgGに対しモル比で0.5、1.0、2.0、又は5.0加え、撹拌後、室温で反応させた後の、液体クロマトグラフィーの結果を示す。図５（B）は、ヒトIgGとDSG修飾したIgG結合ペプチドを各モル比で反応させた場合の、未反応（ピーク２）、１個のペプチドの付加物（ピーク３）、及び２個のペプチドの付加物（ピーク４）の生成量の変化を示したものである。 図6は、pH4.0（A）、pH5.5（B）、又はpH7.0（C）にて調製したヒトIgGのFc溶液に対し、DMF中に溶解したDSG修飾したIgG結合ペプチドを、モル比で1.0加え、撹拌後、室温で反応させ、反応の１、５、１０、又は３０分後の、未反応（ピーク２）、１個のペプチドの付加物（ピーク３）、及び２個のペプチドの付加物（ピーク４）の生成量の変化を示したものである。 図7は、[111In]標識Trastuzumab-1の投与6時間後の腫瘍部位を含むSPECT/CT画像（A）及びCT画像（B）、並びに[111In]標識Trastuzumab-2の投与4時間後の腫瘍部位を含むSPECT/CT画像（C）を示す。 図8は、[111In]標識Trastuzumab-1の投与24時間後（A）及び48時間後（B）の腫瘍部位を含むSPECT/CT画像、並びに[111In]標識Trastuzumab-2の投与24時間後（C）及び48時間後（D）の腫瘍部位を含むSPECT/CT画像を示す。 図9は、[111In]標識Trastuzumab-1の投与6時間後（A）、及び[111In]標識Trastuzumab-2の投与4時間後（B）の、肝臓を含むSPECT/CT画像を示す。 図10は、実施例9で調製したジクロロプロパノンによるSS架橋構造を持つIgG結合ペプチドの合成スキームを示す。 図11は、[89Zr]標識Trastuzumab-1又は2の投与6時間後、24時間後、及び48時間の腫瘍部位を含むPET画像を示す。実線矢印は、HER2高発現腫瘍組織を、破線矢印は、HER2低発現腫瘍組織を示す。
＜IgG結合ペプチド＞
　一態様において、本発明は、放射性金属核種と結合し得るリガンドを含むIgG結合ペプチドに関する。IgG結合ペプチド中におけるリガンドの位置は特に限定しないが、例えばIgG結合ペプチドのN末端又はC末端、好ましくはN末端に連結させることができる。リガンドをペプチドに連結させる方法は当業者には周知である。例えば、リガンドをIgG結合ぺプチドのN末端に連結させる場合には、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHS）、イソチオシアノ基（ITC）、スルホン酸クロリド、カルボン酸クロリド、エチレンオキシド、アルキルクロリド、アルデヒド基、及びカルボン酸無水物等の反応基をリガンドに付加し、これをIgG結合ペプチドのN末端のアミノ基と反応させればよい。あるいは、このようなリガンドを含むIgG結合ペプチドを、周知の合成法等により直接合成してもよい。
　本発明のIgG結合ぺプチドに含まれ得る放射性金属核種と結合し得るリガンドとしては、キレート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、デフェロキサミン、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸（DOTA）、1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-三酢酸（NOTA）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミン二酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸（TTHA）、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,8,11-四酢酸（TETA）、ジピリドキシルジホスフェート（DPDP）、TPPS4、エチレンビスヒドロキシフェニルグリシン（EHPG）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ジメチルホスフィノメタン（DMPE）、メチレン二リン酸、ジメルカプトコハク酸（DMPA）、及びこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　一実施形態において、IgG結合ペプチドには放射性金属核種が結合している。放射性金属核種の例として、111In（インジウム）、89Zr（ジルコニウム）、67/68Ga（ガリウム）、99mTc（テクネチウム）、64Cu（銅）、好ましくは111In、及び89Zrが挙げられる。IgG結合ペプチドに結合させる放射性金属核種は、IgG結合ペプチド、及び後述するIgG結合ペプチドとIgGの複合体の用途に応じて選択することができる。例えば、癌の検出・診断には111In、89Zr、64Cu、67/68Ga、及び99mTcを用いることができ、例えばPET（Positron Emission Tomography）には89Zr及び64Cuを、SPECT（Single Photon Emission Computed Tomography）には111In及び99mTcを用いることができる。
　放射性金属核種は、IgG結合ペプチドに直接結合していてもよいが、好ましくは、前記キレート剤等のリガンドを介してIgG結合ペプチドに結合している。放射性金属核種とリガンドの好ましい組み合わせは、当業者であれば適宜選択することができ（例えば、桜井弘及び横山陽編集、放射薬品学概論を参照されたい）、その例として、111InとDTPA；89Zrとデフェロキサミン；64Cu とDOTAはNOTA；99mTcとジメチルホスフィノメタン（DMPE）、DTPA、メチレン二リン酸、ジメルカプトコハク酸（DMPA）、ジチオセミカルバゾン、又はジアミノエタンジオール；67/68Gaとデフェロキサミン又はDTPA誘導体等、好ましくは111InとDTPA；89Zrとデフェロキサミン；及び64Cu とDOTAはNOTA、さらに好ましくは111InとDTPA；及び89Zrとデフェロキサミン、より好ましくは111InとDTPAが挙げられる。
　本発明のIgG結合ペプチドについて、以下に詳細に説明する。
　本明細書中で使用する「IgG」は、哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット、マウス、及びウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物のIgG、好ましくはヒトのIgG（IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4）を指すものとする。本明細書におけるIgGは、さらに好ましくは、ヒトIgG1、IgG2、若しくはIgG4、又はウサギIgGであり、特に好ましくはヒトIgG1、IgG2、又はIgG4である。
　一態様において、本発明のIgG結合ペプチドは、下記の式I：
(X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(I)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能である。
　上記式で、N末端又はC末端のX1-3という表記は、システイン（C又はCys）以外の独立的に任意のアミノ酸残基Xが1～3個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは3個すべてが同じ残基でない配列からなる。同様に、X2もシステイン（C又はCys）以外の独立的に任意のアミノ酸残基Xが2個連続していることを意味し、それを構成するアミノ酸残基は同じか又は異なる残基であるが、好ましくは当該2個連続しているアミノ酸残基は同じ残基でない配列からなる。
　式Iの2つのシステイン残基はジスルフィド結合して環状ペプチドを形成することができる。通常、式Iのペプチドにおいて、（Xaa1がシステイン残基である場合、Xaa1ではない）外側の2つのシステイン残基はジスルフィド結合している。或いは、式Iのペプチドにおいて、外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基は、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 で表されるリンカーにより連結されていてもよい。上記式中の破線部分は、スルフィド基との結合部分を意味する。当該リンカーは、通常のジスルフィド結合よりも、還元反応等に対して安定である。したがって、当該リンカーは、例えばジルコニウム等のジスルフィド結合を不安定化させ得る放射性金属核種を用いる際に好ましく用いられる。
　このペプチドは、例えば以下の方法：
　システイン残基を2つ以上、好ましくは2つ含むペプチドと、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 で表される化合物（式中、R1及びR2は、各々独立的に任意のハロゲン原子である）を混合し、2つ以上、好ましくは2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表されるリンカーにより連結されたペプチドを得る工程を含む方法により得ることができる。上記式中の破線部分は、スルフィド基との結合部分を意味する。
　前記化合物において、R1及びR2は、好ましくはF、Cl、Br、及びI、さらに好ましくはCl、Br、及びIからなる群から選択される。R1及びR2は好ましくは同一であり、さらに好ましくは、R1及びR2はいずれもClである。
　本方法における混合工程の条件は、ペプチドのシステイン残基間で連結反応が生じる条件であれば特に限定しない。例えば、ペプチドと前記化合物を、適当なバッファー、例えば塩化グアニジウムを含む緩衝液中において、室温（例えば約15℃～30℃）で混合することにより反応を行うことができる。該混合工程は、必要に応じて連結反応を促進する触媒を適量加えて行ってもよい。
　本方法の混合工程におけるペプチドと化合物の混合比率は、特に限定しない。ペプチドと化合物のモル比率は、例えば1：0.2～1：10、好ましくは1：0.5～1：5又は1：1～1：2とすることができる。
　該混合工程における混合時間（反応時間）は、ペプチドのシステイン残基間で連結反応が生じる限り限定するものではないが、例えば、1分～5時間、好ましくは10分～2時間又は15分～1時間とすることができる。
　本方法は、必要に応じて、上記工程を行った後の混合物から、不純物、例えば、未反応のペプチド及び化合物等を分離し、システイン残基が連結されたペプチドを精製する工程をさらに含んでよい。該工程は、本分野で公知の方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、及びHPLC等のクロマトグラフィー等により行うことができる。
　式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式I'及び式I''で表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式I'で表されるペプチドは、
(X1-3)-C-(X1)-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3)　　(I')
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Nはアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
　式I''で表されるペプチドは、
(X1-3)-C-A-(X1)-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3)　　(I'')
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Eはグルタミン酸残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
　また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IIで表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式IIで表されるペプチドは、
(X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(II)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
　上記の式I'、式I''及び式IIのペプチドのアミノ酸配列において、17アミノ酸残基とした場合の、N末端から１番目及び２番目並びに１６番目及び１７番目のアミノ酸残基Xは欠失していてもよく、そのようなペプチドは13アミノ酸長からなる。
　本明細書で使用する「17アミノ酸残基とした場合の」とは、ペプチドのアミノ酸残基をアミノ酸番号で呼ぶときに、式Iのペプチドについて最長のアミノ酸長である17残基のN末端から順番に1番目から17番目まで番号づけするために便宜的に表現した用語である。
　また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IIIで表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式IIIで表されるペプチドは、
(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(III)
(式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Aはアラニン残基であり、
Yはチロシン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、又はグルタミン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、かつ
Wはトリプトファン残基である。)
によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
　上記の式IIIのペプチドのアミノ酸配列において、17アミノ酸残基とした場合の、N末端から１番目及び２番目、並びに１６番目及び１７番目のアミノ酸残基Xは欠失していてもよく、そのようなペプチドは13アミノ酸長からなってよい。
　さらに、上記の各式のペプチドのアミノ酸配列のシステイン（C）以外のアミノ酸残基、すなわち、17アミノ酸残基とした場合のN末端から1～3、5、6、15～17番目の各アミノ酸残基は、以下のものから選択されることが好ましい。ここで、各大文字のアルファベットは、アミノ酸の一文字表記である:
1番目のアミノ酸残基= S、G、F、R又は、なし
2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン又は、なし
3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン又は、なし、
17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし。
5番目のアミノ酸残基= A又はT、
6番目のアミノ酸残基= Y又はW。
　また、式Iのペプチドのアミノ酸配列においてアミノ酸残基Xをさらに特定した式IVで表されるペプチドを以下に示す。
　すなわち、式IVで表されるペプチドは、
D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T　　(IV)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Hはヒスチジン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Gはグリシン残基であり、
Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Vはバリン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。）によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
　式Iのペプチドの具体例のいくつかを以下の1)～18)に列挙するが、これらに制限されないことはいうまでもない:
１）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１）、
２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２）、
３）RCAYH(Xaa1)GELVWCS（配列番号３）、
４）GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号４）、
５）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号５）、
６）GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号６）、
７）GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号７）、
８）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号８）、
９）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH（配列番号９）、
１０）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１０）、
１１）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１１）、
１２）SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１２）、
１３）RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH（配列番号１３）、
１４）G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H（配列番号３６）
１５）DCTYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１４）、
１６）DCAYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１５）、
１７）DCTYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１６）、及び
１８）DCAWH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１７）、
（式中、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、Xaa2はホモシステインであり、好ましくはホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している）。
　式Iのペプチドの好ましい具体例として、
１）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１）、
２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２）、
１３）RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH（配列番号１３）、及び
１４）G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H（配列番号３６）が挙げられ、
特に好ましい例として、２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２）が挙げられる（式中、Xaa1はリシン残基であり、Xaa2はホモシステインであり、好ましくはシステイン同士及び／又はホモシステイン同士は互いにジスルフィド結合を形成している）。
　また、一態様において、本発明のIgG結合ペプチドは、広義の一次構造として、下記の式V：
D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T　　(V)
(式中、
Dはアスパラギン酸残基であり、
Cはシステイン残基であり、
Gはグリシン残基であり、
Lはロイシン残基であり、
Wはトリプトファン残基であり、
Tはトレオニン残基であり、
Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
Xaa5はグルタミン酸残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む。
　式Vの2つのシステイン残基はジスルフィド結合して環状ペプチドを形成することができる。通常、式Vのペプチドの（Xaa1がシステイン残基である場合、Xaa1ではない）外側の2つのシステイン残基は、ジスルフィド結合している。或いは、式Vのペプチドにおいて、外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基は、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 で表されるリンカーにより連結されていてもよい。上記式中の破線部分は、スルフィド基との結合部分を意味する。当該リンカーは、通常のジスルフィド結合よりも、還元反応等に対して安定である。したがって、当該リンカーは、例えばジルコニウム等のジスルフィド結合を不安定化させ得る放射性金属核種を用いる際に好ましく用いられる。このペプチドは、本明細書に記載の方法により、調製することができる。
　式Vのペプチドの具体例のいくつかを以下の１８）～２９）に列挙するが、これらに制限されないことはいうまでもない:
１８）DCTYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１８）、
１９）DCAYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号１９）、
２０）DCSYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２０）、
２１）DCTWT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２１）、
２２）DCTYH(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２２）、
２３）DCTYR(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２３）、
２４）DCTYS(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２４）、
２５）DCTYT(Xaa1)GNLVWCT（配列番号２５）、
２６）DCTYT(Xaa1)GELVWCT（配列番号２６）、
２７）DCTYT(Xaa1)GRLVWCT（配列番号２７）、
２８）DCTYT(Xaa1)GDLVWCT（配列番号２８）、及び
２９）DCTYT(Xaa1)GNLIWCT（配列番号２９）、
（式中、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸である）。
　前述の通り、本発明に関わる上記式のペプチドは、各アミノ酸配列の中に離間した少なくとも2つのシステイン（C）残基を有し、該システイン残基間でジスルフィド結合を形成しうるようにシステイン残基が配置されていることを特徴としており、好ましいペプチドは、2つのシステイン残基がジスルフィド結合して環状ペプチドを形成し、各システイン残基のN末端側及びC末端側には１又は２個のシステイン以外の任意のアミノ酸残基を有していても良い。各システイン残基のN末端側及びC末端側には１又は２個のアミノ酸残基を有する場合において、17アミノ酸残基とした場合のN末端から1～2、16～17番目の各アミノ酸残基は、上記例示のものである。
　上記の通り、本発明のペプチドにおいて、Xaa1は、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、及びグルタミン酸残基等のタンパク質構成アミノ酸、並びにジアミノプロピオン酸及び2-アミノスベリン酸等の非タンパク質構成アミノ酸、好ましくはリシン残基である。Xaa1は、後述する架橋剤によって修飾可能であることが好ましい。本明細書において「非タンパク質構成アミノ酸」とは、生体においてタンパク質を構成するのに用いられないアミノ酸を指す。本発明のペプチドを架橋剤によって修飾する際の部位特異性を高めるため、本発明のペプチドは、その配列中にXaa1と同じ残基を、全く有さないか、ほとんど有さない（例えば、1個又は2個しか有さない）ことが好ましい。例えば、Xaa1がリシン残基である場合には、本発明のペプチドは、その配列中にXaa1以外の場所にリシン残基を全く有さないか、ほとんど有さないことが好ましい。
　本発明のペプチドは、ヒトIgGとの結合親和性が、他のヒト免疫グロブリン（IgA、IgE、IgM）と比較して約10倍以上、好ましくは約50倍以上、より好ましくは約200倍以上高い。本発明のペプチドとヒトIgGとの結合に関する解離定数(Kd)は、表面プラズモン共鳴スペクトル解析（例えばBIACOREシステム使用）により決定可能であり、例えば1×10-1M～1×10-3M未満、好ましくは1×10-4M未満、より好ましくは1×10-5M未満である。
　本発明のIgG結合ペプチドは、IgGのFcドメインに結合する。本発明のIgG結合ペプチドは、後述する実施例において示す通り、上記Xaa1において、IgG Fcの特定の領域、すなわち、ヒトIgG FcにおけるEu numberingに従うLys248残基（以下、本明細書では単に「Lys248」とも表記し、ヒトIgG CH2（配列番号３０）の18番目の残基に相当する）又はLys246残基（以下、本明細書では単に「Lys246」とも表記し、ヒトIgG CH2（配列番号３０）の16番目の残基に相当する）、好ましくはLys248と近接する。
　本発明のペプチドは、慣用の液相合成法、固相合成法等のペプチド合成法、自動ペプチド合成機によるペプチド合成等（Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. eds., Plenum Press NY. (1990) Vol.12, p.1-19;Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) W.H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: p.5132;「新生化学実験講座１ タンパク質IV」（1992）日本生化学会編，東京化学同人）によって製造することができる。あるいは、本発明のペプチドをコードする核酸を用いた遺伝子組換え法やファージディスプレイ法等によって、ペプチドを製造してもよい。例えば本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAを発現ベクター中に組み込み、宿主細胞中に導入し培養することにより、目的のペプチドを製造することができる。製造されたペプチドは、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法等により、回収又は精製することができる。
　ペプチド合成では、例えば、各アミノ酸（天然であるか非天然であるかを問わない）の、結合しようとするα－アミノ基とα－カルボキシル基以外の官能基を保護したアミノ酸類を用意し、それぞれのアミノ酸のα－アミノ基とα－カルボキシル基との間でペプチド結合形成反応を行う。通常、ペプチドのC末端に位置するアミノ酸残基のカルボキシル基を適当なスペーサー又はリンカーを介して固相に結合しておく。このようにして得られたジペプチドのアミノ末端の保護基を選択的に除去し、次のアミノ酸のα－カルボキシル基との間でペプチド結合を形成する。このような操作を連続して行い側基が保護されたペプチドを製造し、最後に、すべての保護基を除去し、固相から分離する。保護基の種類や保護方法、ペプチド結合法の詳細は、上記の文献に詳しく記載されている。
　遺伝子組換え法による製造は、例えば、本発明のペプチドをコードするDNAを適当な発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞にベクターを導入し、細胞を培養し、細胞内から又は細胞外液から目的のペプチドを回収することを含む方法によりなされ得る。ベクターは、限定されないが、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、及びウイルス等のベクターである。プラスミドベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌由来のプラスミド（例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等）、及び酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50等）等が挙げられる。ファージベクターとしては、限定するものではないが、T7ファージディスプレイベクター（T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen））、及びλファージベクター（Charon4A、 Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等）が挙げられる。ウイルスベクターとしては、限定するものではないが、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、及びセンダイウイルス等の動物ウイルス、並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルス等が挙げられる。コスミドベクターとしては、限定するものではないが、Lorist 6、Charomid9-20、及びCharomid9-42等が挙げられる。ファージミドベクターとしては、限定するものではないが、例えばpSKAN、pBluescript、pBK、及びpComb3H等が知られている。ベクターには、目的のDNAが発現可能なように調節配列や、目的DNAを含むベクターを選別するための選択マーカー、目的DNAを挿入するためのマルチクローニングサイト等が含まれ得る。そのような調節配列には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、S-D配列又はリボソーム結合部位、複製開始点、及びポリAサイト等が含まれる。また、選択マーカーには、例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、等が用いられ得る。ベクターを導入するための宿主細胞は、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、及び植物細胞等であり、これらの細胞への形質転換又はトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクル・ガン法、及びPEG法等を含む。形質転換細胞の培養は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物の培養液は、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、及び無機塩類等を含有する。本発明のペプチドの回収を容易にするために、発現によって生成したペプチドを細胞外に分泌させることが好ましい。これは、その細胞からのペプチドの分泌を可能にするペプチド配列をコードするDNAを、目的ペプチドをコードするDNAの5'末端側に結合することにより行うことができる。細胞膜に移行した融合ペプチドがシグナルペプチダーゼによって切断されて、目的のペプチドが培地に分泌放出される。あるいは、細胞内に蓄積された目的ペプチドを回収することもできる。この場合、細胞を物理的又は化学的に破壊し、タンパク質精製技術を使用して目的ペプチドを回収する。
　それゆえに、本発明はさらに、本発明のペプチドをコードする核酸にも関する。ここで、核酸は、DNA又はRNA（例えばmRNA）を含む。
　本発明のIgG結合ペプチドと他のタンパク質を融合させる場合、IgG結合ペプチドと他のタンパク質を別々に調製した後に、必要に応じてリンカーを用いてIgG結合ペプチドとタンパク質を融合させても良いし、遺伝子組換え法によって、必要に応じて適当なリンカーを加えて融合タンパク質として作製してもよい。この場合、本発明のIgG結合ペプチドがIgGとの結合性を損なわないように融合タンパク質を作製することが好ましい。
＜架橋剤で修飾されたペプチド＞
　一態様において、本発明における上記IgG結合ペプチドは、架橋剤により修飾されていることが好ましい。
　上記の通り、本発明のIgG結合ペプチドは、後述する実施例において示す通り、上記Xaa1において、IgG Fcの特定の領域、すなわちヒトIgG FcにおけるEu numberingに従うLys248又はLys246、好ましくはLys248と近接する。したがって、本発明のIgG結合ペプチドのXaa1を架橋剤で修飾し、IgGと架橋反応させることによって、IgG結合ペプチドのXaa1とIgG FcのLys248又はLys246、好ましくはLys248の間で部位特異的に架橋構造を形成させることができる。上記の様に、本発明のIgG結合ペプチドのXaa1を架橋剤及び種々の化合物で修飾し、IgGと架橋反応させることによって、種々の化合物を、特異的かつ簡便にIgGに導入することができる。また、本発明によれば、IgG結合ペプチドを介して化合物を導入することができるため、様々な構造の化合物をIgGに導入することができる。さらに本発明の方法は、得られる産物の収率が高く、また、抗体そのもの改変を伴わないため、抗体の機能を低下させる可能性が低いという利点も有する。
　本発明のIgG結合ペプチドは、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物のIgGに対して用いることもできる。この場合、本発明のIgG結合ペプチドが結合するIgG中の部位は、本明細書を読んだ当業者であれば、例えばヒトIgGの配列と他の動物のIgGの配列をアライメントすることにより、容易に特定することができる。
　本発明において、「架橋剤」とは、本発明のIgG結合ペプチドと、IgG Fcを、共有結合により連結させるための化学物質である。本発明の架橋剤は、当業者であれば適宜選択することが可能であり、所望のアミノ酸（例えば、リシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸、及びアルギニン等）と結合可能な部位を少なくとも２箇所有する化合物とすることができる。その例として、限定するものではないが、DSG（disuccinimidyl glutarate、ジスクシンイミジルグルタレート）、DSS（disuccinimidyl suberate、ジスクシンイミジルスベレート）等のスクシンイミジル基を好ましくは2以上含む架橋剤、DMA（dimethyl adipimidate・2HCl、アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMP（dimethyl pimelimidate・2HCl、ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びDMS（dimethyl suberimidate・2HCl、スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）等のイミド酸部分を好ましくは2以上含む架橋剤、並びにDTBP（dimethyl 3,3’-dithiobispropionimidate・2HCl、3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）及びDSP（dithiobis（succinimidyl propionate）、ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）等のSS結合を有する架橋剤が挙げられる。
　本発明のIgG結合ペプチドは、他の機能性物質、例えば、IgA又はVHH等の抗体、標識物質及び／又は他の薬剤により修飾されていてもよい。IgG結合ペプチドと他の機能性物質の連結は、当業者に公知の方法、例えばアジド基とdibenzocyclooctyneとの反応、又はマレイミド基とスルフヒドリル基の反応等により行うことができる。標識物質により標識されている場合、本発明のIgG結合ペプチドがIgGと複合体を形成することで、該標識物質を介してIgGの検出又は定量を行うことが可能となる。標識物質は、限定されないが、例えば上記の放射性同位体金属核種、蛍光色素、化学発光色素、並びにビオチン及びGFP（緑色蛍光タンパク質）等の蛍光タンパク質、発光タンパク質、並びにペルオキシダーゼ等の酵素を含み、好ましい標識物質の例は、フルオレセイン及びFITC等のフルオレセイン誘導体、ローダミン及びテトラメチルローダミン等のローダミン誘導体、並びにテキサスレッド等の蛍光色素である。本発明のペプチドを他の薬剤によって修飾する場合、薬剤として、限定するものではないが、例えば、オーリスタチン、メイタンシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、又はこれらの誘導体等の抗がん剤；並びに、血液脳関門上のレセプターに結合して中枢神経への移行を可能とする薬剤、又はがん細胞等に結合して抗体の細胞内への移行を可能にする薬剤等の標的化剤が挙げられる。
　本発明の架橋剤により修飾されたIgG結合ペプチドは、例えば上記＜IgG結合ペプチド＞の項目で記載した方法に従って得られたIgG結合ペプチドを架橋剤と反応させることにより製造することができる。この場合、IgG結合ペプチド中の上記Xaa1のアミノ酸残基の側鎖を特異的に修飾することが必要であり、これは、例えば、Xaa1の種類と架橋剤の組み合わせを選択することによりなされ得る。例えば、DSS又はDSG等のスクシンイミジル基を含む架橋剤は、リシン残基の側鎖及びポリペプチドのN末端に存在する一級アミンと反応するため、IgG結合ペプチドのN末端をブロッキングした上でDSS又はDSGと反応させることで、リシン残基の側鎖のみをDSS又はDSGで特異的に修飾することができる。このようなアミノ酸残基と架橋剤の組み合わせは、当業者であれば適宜選択することができる。
　本発明の架橋剤により修飾されたIgG結合ペプチドは、例えば、架橋剤により修飾されたアミノ酸残基を用いてペプチド合成を行うことによって製造することもできる。同様に、IgG結合ペプチドを標識物質及び／又は他の薬剤で修飾する場合には、これらの修飾を加えたアミノ酸残基を用いてペプチド合成することにより標識物質及び／又は他の薬剤で修飾されたIgG結合ペプチドを調製してもよい。
　また、本発明のIgG結合ペプチドは、その安定性の向上等のため、例えば、N末端のPEG化（ポリエチレングリコール付加）、及びC末端のアミド化等により修飾されていても良い。PEG化を行う場合のPEGの分子数は特に限定されず、例えば、1～50分子、1～20分子、2～10分子、2～6分子、又は4分子のPEGを付加することができる。
＜架橋反応＞
　一態様において、本発明は、本発明の架橋剤で修飾されているIgG結合ペプチドとIgGを混合する工程を含む、IgG結合ペプチドとIgGの複合体を生産する方法に関する。本工程により、架橋剤で修飾されているIgG結合ペプチドとIgGの間で架橋反応が生じ得る。架橋反応は、特にIgG結合ペプチドの上記Xaa1のアミノ酸残基とIgG FcのLys248又はLys246、好ましくはLys248の間で部位特異的に生じ得る。
　該混合工程の条件は、本発明のIgG結合ペプチドとIgGの間で架橋反応が生じる条件で行うものであれば特に限定しない。例えば、本発明のIgG結合ペプチドとIgGを、適当なバッファー中において、室温（例えば約15℃～30℃）で混合することにより反応を行うことができる。該混合工程は、必要に応じて架橋反応を促進する触媒を適量加えて行ってもよい。
　該混合工程における本発明のIgG結合ペプチドとIgGの混合比率は、特に限定しない。本発明のIgG結合ペプチドとIgGのモル比率は、例えば1：1～20：1、好ましくは2：1～20：1又は5：1～10：1とすることができる。
　該混合工程における混合時間（反応時間）は、本発明のIgG結合ペプチドとIgGの間で架橋反応が生じる限り限定するものではないが、例えば、1分～5時間、好ましくは10分～2時間又は15分～1時間とすることができる。
　本発明のIgG結合ペプチドとIgGの複合体を生産する方法は、必要に応じて、上記工程を行った後の混合物から、不純物、例えば、未反応のIgG結合ペプチド、IgG、及び試薬等を分離し、該複合体を精製する工程をさらに含んでよい。該工程は、本分野で公知の方法、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、及びHPLC等のクロマトグラフィー等により行うことができる。
＜複合体＞
　一態様において、本発明は、本発明のIgG結合ペプチドとIgGとの複合体に関する。該複合体は、上記架橋反応によって形成され得る。よって、本発明は、好ましくは、IgG結合ペプチドの上記Xaa1のアミノ酸残基とIgG FcのLys248又はLys246、好ましくはLys248とが部位特異的に架橋剤を介して結合したIgG結合ペプチドとIgGとの複合体に関する。
　本発明の複合体は、部位特異的な架橋反応によって形成されることから、該架橋反応が、IgGの活性に負の影響を与える可能性が少ない。また、修飾したIgG結合ペプチドをIgGに連結することによって、IgGに新たな機能性を付加することができる。例えば、111In、89Zr、64Cu、67/68Ga、及び99mTc等の放射性金属核種を付加したIgG結合ペプチドを連結させたIgGは、癌の検出・診断用に用いることができる。この場合、IgGは癌種に応じて適宜選択することができ、例えば乳癌であればトラスツズマブ、大腸癌であればセツキシマブを用いることができる。
＜核医学画像診断剤又は癌の診断剤、並びに核医学画像診断法又は癌の罹患の有無を決定する方法＞
　一態様において、本発明は放射性金属核種が結合している上記IgG結合ペプチド、上記架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチド、又は上記架橋剤で修飾されたIgG結合ペプチドとIgGの複合体を含む、核医学画像診断剤又は癌の診断剤に関する。
　本発明の核医学画像診断剤は、生体内における種々の物質の分布状況及び／又は体内動態を測定するために用いることができる。例えば、本発明のIgG結合ペプチドとIgGの複合体を含む核医学画像診断剤は、IgGの標的となる炎症マーカー等の抗原の分布状況、及びIgG抗体自体の体内動態を測定するために用いることができる。
　本発明の癌の診断剤の対象となる癌として、限定するものではないが、例えば、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、大腸癌、例えば結腸癌、胃癌、子宮頸癌、脳腫瘍、骨髄腫、骨肉腫、肺癌、白血病及び悪性リンパ腫等が挙げられる。
　本発明の核医学画像診断剤又は癌の診断剤は、経口投与又は非経口投与（例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、腹腔内投与、直腸投与、又は経粘膜投与等）で、投与することができる。また、本発明の核医学画像診断剤又は癌の診断剤は、投与経路に応じて適当な剤形とすることができる。具体的には顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、静脈注射、動脈注射、若しくは筋肉注射用の注射剤、点滴剤、外用剤、又は坐剤等の各種製剤形態に調製することができる。投与方法及び剤型は、患者の性別、年齢、体重、症状等により、当業者であれば適宜選択することができる。
　本発明の核医学画像診断剤又は癌の診断剤は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton,米国を参照されたい）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。
　本発明の核医学画像診断剤又は癌の診断剤に含まれ得る担体及び医薬添加物の例としては、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、及び医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
　実際の添加物は、本発明の核医学画像診断剤又は癌の診断剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、本発明のIgG結合タンパク質又はIgG結合タンパク質とIgGの複合体を溶液、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに容器吸着防止剤、例えばTween80、Tween 20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解して再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のため安定化剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコール及び／又は糖類を使用することができる。
　本発明の核医学画像診断剤又は癌の診断剤の有効投与量及び投与間隔は、患者の性別、年齢、体重、及び症状等に応じて適宜選択することができる。
　一態様において、本発明は、被験体の癌の罹患の有無を決定する方法であって、
被験体から得られたサンプルに、本明細書に記載のIgG結合ペプチド、又はIgG結合ペプチドとIgGの複合体を反応させる工程であって、放射性金属核種が、前記IgG結合ペプチドに結合している工程、
サンプル中の放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
を含む、方法に関する。
　一態様において、本発明は、被験体における抗原又はIgGを検出する方法であって、
被験体から得られたサンプルに、本明細書に記載のIgG結合ペプチドとIgGの複合体を反応させる工程であって、放射性金属核種が、前記IgG結合ペプチドに結合している工程、
サンプル中の放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、抗原又はIgGを検出する工程、
を含む、方法に関する。サンプルにおける抗原又はIgGを検出することで、被験体における抗原又はIgGの分布状況及び／又は体内動態を推測することができる。
　本方法において用いるサンプルとしては、組織及び生体試料が挙げられる。組織の例として、病変部位、例えば、乳房、肝臓、膵臓、前立腺、卵巣、大腸、例えば結腸、胃、子宮頸部、骨髄、リンパ節等が挙げられ、例えばこれらの組織の生検サンプルを用いることができる。生体試料の例として、例えば、血液、血漿、リンパ液、組織液、尿、並びに細胞、例えば末梢血細胞、毛母細胞、口腔細胞、鼻腔細胞、腸管細胞、膣内細胞、粘膜細胞、及び喀痰（肺胞細胞又は気肝細胞等を含み得る）等、好ましくは血液又は血漿が挙げられる。
　放射能のレベル又は存在を測定する方法は特に限定されず、当業者に知られる任意の方法を用いることができる。例えば、SPECT/CT等の画像解析を行ってもよいし、シンチレーションカウンター等の検出器を用いて放射能のレベル又は存在を測定してもよい。
　放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定又は検出する工程は、特に限定されず、当業者に知られる任意の方法を用いることができる。例えば、癌に罹患していないことが分かっている被験体由来の複数、例えば2以上、3以上、4以上、好ましくは5以上のサンプルに対して、本発明の方法に供される被験体由来のサンプルにおける放射能のレベルが有意に高い場合、被験体が癌に罹患している可能性が高いと判断することができる。
　一態様において、本発明は、被験体の癌の罹患の有無を決定する方法であって、
本明細書に記載のIgG結合ペプチド、又はIgG結合ペプチドとIgGの複合体を被験体に投与する工程であって、放射性金属核種が、前記IgG結合ペプチドに結合している工程、
被験体において、放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
を含む、方法に関する。
　一態様において、本発明は、被験体内における抗原又はIgGを検出する方法であって、本明細書に記載のIgG結合ペプチドとIgGの複合体を被験体に投与する工程であって、放射性金属核種が、前記IgG結合ペプチドに結合している工程、
被験体において、放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
放射能のレベル又は存在に基づいて、抗原又はIgGを検出する工程、
を含む、方法に関する。本方法は、好ましくは核医学画像診断法である。本方法により、被験体における抗原又はIgGの分布状況及び／又は体内動態を推測することができる。
　本方法において、投与の方法は、本発明の核医学画像診断剤又は癌の診断剤について記載したものと同様であるから記載を省略する。また、放射能のレベル又は存在を測定する工程及び、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程については、上記の通りであるから記載を省略する。
　本明細書において、被験体の生物種は、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット、マウス、ウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物が挙げられ、好ましくはヒトである。
　下記の実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されるものではない。
［実施例1：IgG結合ペプチドとIgGの複合体のX線結晶構造解析］
＜方法＞
（1）IgG結合ペプチド溶液の作製
　G(HC)DCAYHRGELVWCT(HC)H-NH2の配列（配列番号３１、ただし、HCはホモシステインであり、4番目と14番目の2つのCys、2番目と16番目の2つのホモシステインは、それぞれ分子内でジスルフィド結合を形成する）を有する環状ホモシステインペプチドを、F-moc法によるペプチド固相合成法にて常法に従い調製した。調製したIgG結合ペプチド0.8mgの粉末を24μLの100％ジメチルスルホキシド（和光純薬）で溶かし、IgG結合ペプチド溶液を調製した。
（2）FcとIgG結合ペプチドとの複合体の作製
　ヒトIgG（中外製薬）のヒンジ部分を、10mM EDTAおよび1mM L-システインを含む20mmol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)中において37℃でパパイン（ロシュ社製）を用いて切断した。続いて、ヒトIgG Fcを、陽イオン交換カラム（TSKgel SP5-PW（東ソー））を用いて、流速1mL/min、20mM 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5.0)中、0-0.3 M NaClのグラジエント溶出にて精製した。16mg/mLのヒトIgG Fcを含む63μLの溶液（0.1M 塩化ナトリウム（和光純薬）、0.04M 2－モルホリノエタンスルホン酸（和光純薬）（pH6.0））を、上記（1）で作製したIgG結合ペプチド溶液2μLと混合し、FcとIgG結合ペプチドとの複合体溶液を調製した。
（3）FcとIgG結合ペプチドとの複合体の結晶の作製
　FcとIgG結合ペプチドとの複合体の結晶は、シッティングドロップ蒸気拡散法により得た。すなわち、上記（2）で作製したFcとIgG結合ペプチドとの複合体溶液0.3μLと結晶化剤（20％ ポリエチレングリコール3350（シグマアルドリッチ）、0．2Mヨウ化カリウム（和光純薬）（pH6.9））0.3μLを、結晶化用ロボットであるHydoraII＋（マトリックス社製）を用いて、インテリ結晶化プレート（ベリタス社製）のS1ウェル上で混合し、結晶化ドロップとした。リザーバー溶液としては、上記結晶化剤70μLを分注した。プレートをPowerSeal CRISTAL VIEW（グライナーバイオ－ワン社製）で密閉後、20℃の恒温槽内に約2週間静置し、結晶を得た。
（4）FcとIgG結合ペプチドとの複合体の結晶のX線回折強度データの収集
　上記（3）で得られた結晶を、安定化母液（22％ポリエチレングリコール3350、0.2M ヨウ化カリウム、0.1M　塩化ナトリウム、25％グリセロール（w／v）、0.04M 2－モルホリノエタンスルホン酸（pH6.0））に移し、－170℃の窒素ガス気流にて急速凍結し、X線回折データを振動法にて測定した。X線の波長は1オングストローム、振動角は1°/フレームで実施した。次に、回折強度データ処理プログラムHKL2000(HKL Research社製)を使用して、回折強度データを分解能3.0オングストロームで処理した。その結果、結晶の空間群がP21であり、格子定数がa＝66.1オングストローム、b＝60.5オングストローム、c＝69.5オングストローム、α＝γ＝90°、β＝101.3°であった。得られたデータのCompletenessは99.9％、Rmergeは13.8％であった。
（5）FcとIgG結合ペプチドとの複合体の結晶構造の決定
　DCAYHRGELVWCT（配列番号33）について、上記（4）で得られた回折強度データを、CCP4（Collaborative Computational Project Number 4）に含まれるプログラムPhaserを利用して分子置換法による位相決定を試みた。分子置換法のサーチモデルにはProtein Data Bank（PDB、URL:http://www.rcsb.org/pdb/）にPDB accession code：1DN2として登録されているFc部分のモデルを利用した。その結果、非対称単位中に1分子のモデルを見出すことができた。次にCCP4に含まれる構造精密化プログラムRefmac5を用いた構造精密化とモデル構築プログラムであるX－tal viewを用いたモデルの修正を繰り返し実施し、FcとIgG結合ペプチド（DCAYHRGELVWCT（配列番号33））との複合体の結晶構造を得た。Fcのペプチド結合部位にIgG結合ペプチドに相当する電子密度が観測された。決定した結晶構造の正確さの指標であるR因子は、0.216であった。さらに、精密化の段階で計算に入れなかった全反射の5％に相当する構造因子から計算されるRfree因子は0.317であった。
（6）架橋構造モデルの作成
　上記のX線結晶解析の構造を基に、計算科学ソフトウェアMOE（Molecular Operating Environment）上で架橋構造モデルを作成した。DCAYHRGELVWCT（配列番号33）の６番目のアミノ酸をLysに置換後、このLysのεアミノ基と抗体Fcの248番目Lysのεアミノ基の間をつなぐ形で、DSG又はDSSによる架橋構造をモデル化した。
＜結果＞
　図1Aに示した様に、IgG結合ペプチドは、プロテインAの結合部位と重なるCH2とCH3ドメインの境界領域に結合し、既に報告されているIgG結合ペプチドFc-III（DeLano, W. L. et al., Science, 2000, 287, pp. 1279-1283）と類似した形でIgGと結合していると考えられた。IgG結合ペプチドとFcとの特徴的な相互作用は、IgG結合ペプチドの8番目の残基Argの側鎖のグアニジノ基が、2.91オングストロームでFcのGlu380（EU numberingに基づく。以下同じ）の側鎖のカルボン酸と塩結合している点である。このGlu380の側鎖は、ヒトIgG Fcの中で、Lys248と塩結合して分子内での塩結合のネットワークを形成しており、IgG結合ペプチドのArg8とFcのLys248は、FcのGlu380との相互作用を介して近づいていた。そこで、IgG結合ペプチドの8番目の残基ArgをLysに換え、この塩結合のネットワーク構造に類似した形で、ペプチドのLys8と抗体のLys248の側鎖のアミノ基を架橋剤で架橋することを考案した。実際に、IgG結合ペプチドとヒトIgG Fcとの複合体構造をベースに、DSG（ジスクシンイミジルグルタレート）もしくはDSS（ジスクシンイミジルスベレート）による架橋構造のモデルを作成したところ、空間的にも抗体の主鎖構造のひずみを伴わずに架橋剤の導入が可能であると考えられた（図1B）。
［実施例2：標識用ペプチドの調製と特性］
＜方法＞
　アミノ基をBiotinもしくは5/6TAMURA succinimidyl ester（AnaSpec, Inc.）（蛍光色素）で修飾したamino-PEG4化合成ペプチドGPDCAYHXGELVWCTFH（配列番号２）（ただし、C末端はアミド化）はFmoc固相合成法により常法に従って合成した。保護基を除去した後、ｐH8.5の水溶液中酸化条件下で分子内S-S結合を形成させ、逆相HPLCを用いて、流速1.0ml/min、0.1%のTFAを含む10%から60%のアセトニトリルのグラジエント溶出によって分子内S-S結合を有するペプチドを精製した。
　精製したIgG結合ペプチドを1mM含むDMF溶液100μLと100mMのDSS又はDSG（Thermo Fisher Scientific社）のアセトニトリル溶液100μLを混合後、室温で一晩反応させた。反応物を0.1% TFAで2.5倍に希釈後、Waters社製 μ Bondasphere 5C18 100オングストローム(直径3.9 mm x 150 mm)にインジェクトし、0.1% TFAを含む4％から60％までのアセトニトリルのグラジエントで溶出した。得られた生成物へ架橋剤の付加については、BEH300 C18 （1.7μm、直径2.1 mm x 50 mm）カラムを接続したLC-Mass spectrometry（Acquity SQD UPLC system, Waters Corp.)上にて、0.1%ギ酸を含む4％から60％へのアセトニトリルのグラジエントで溶出し、ピークの分子量の測定により確認した。
　得られたラベル化試薬ペプチドの親和性解析は、1M Tris-HCl (pH=7.0)を10分の１量加え15 min反応させることでNHS基を加水分解後、以下の方法で行った。BIAcoreT200（GE healthcare）にセットしたCM5センサーチップ上へ、0.4M EDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）と0.1M sulfo-NHS（sulfo-N-hydroxysuccinimide、スルホ－N－ヒドロキシスクシンイミド）を等量混合後、10 μl/mlの流速で、センサーチップに7分間インジェクトすることによりセンサーチップを活性化し、pH4.0（10 mM 酢酸Na）の条件下で、固定化量がRU値で4000～5000となるように、IgGを固定化した。HBS-EP緩衝液（0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、0.005% Tween 20、3 mM EDTA、pH 7.0）を用いながら、流速50 μl/mlにて、10nMから2μMの濃度のペプチドを180 秒間インジェクトすることで結合反応をモニターし、その後、緩衝液により600 sec洗浄することで解離反応を測定した。結合パラメーターの解析は、BIAevalution T100ソフトウェアを用いて行った。
＜結果＞
　架橋構造の導入が、IgG結合ペプチドの特異性及び親和性に影響を与えるか検討するため、架橋構造を導入したIgG結合ペプチドのIgGへの結合力をSPR解析で測定した（表1）。8残基目のアルギニンをリジンに置換したIgG結合ペプチド（以下、Type I（R8K）とも称する）のヒトIgG に対する親和性は131 nM (Kd) であり、置換前のIgG結合ペプチド（以下、Type Iとも称する）と比べ10倍親和性が低下した。Type I（R8K）ペプチドに各架橋剤を結合させたものでは、ヒトIgG に対する親和性は、Type I（R8K）-DSG-OHで約330 nM (Kd)、Type I（R8K）-DSS-OHで約390 nM (Kd) であり、架橋剤が結合することによる親和性の大きな減少は見られなかった。いずれのペプチドにしても、Kd値でμM以下の親和性を有することから、十分特異的な標識化が可能であると考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例3：IgG結合ペプチドによるヒトIgG-Fcの特異的修飾］
＜方法＞
　実施例2と同様の方法によってN末端にBiotin-PEG4を付加したIgG結合ペプチド（TypeI（R8K））をDSS又はDSGで修飾した標識化試薬ペプチドを調製し、これをヒトIgG Fcを反応させ、ヒトIgG Fcの標識化反応を検討した。即ち、実施例2と同様の方法によって過剰なDSS又はDSGと反応させたIgG結合ペプチド(R8K)（200 pmol/5μL in 0.1％ TFA）を逆相カラムにて精製後、減圧下でアセトニトリルを除去した後、0.5M Na2HPO4を約1/8加えて中和し、ただちにタンパク質サンプル（hIgG（中外製薬）、hIgA（Athens Research&Technology）、HSA（シグマアルドリッチ）、又は血清（健常者から採血したもの））（各40 pmol/5μL、血清については、PBSにより10倍希釈したものを使用）に、モル比10倍量で加え、最終量をPBS で20μLにした後、室温で5分放置した。その後、1M Tris-HCl（pH=7.0）を1μl加え反応を停止した後、4xSDSサンプル溶液6.7μl及び2-メルカプトエタノール1.4μl（最終5%）を加え、95℃、10minで処理後、プレキャストゲルSuperSepTMAce,5-20%（和光純薬）を用いてSDS-PAGEを行った。泳動後のゲルは、ホーファー・セミホールTE70（Hoefer Semiphor TE70）トランスブロットシステムを用いて35mA、60分で、PMDF膜に転写後、0.5％BSAでブロッキングを行った。ビオチン化ペプチドで標識されたタンパク質は、SAコンジュゲートHRP（1000倍希釈、Vector Laboratories）を用いて、化学発光試薬（イムノスター（登録商標）ベーシック、和光純薬）により検出した。
＜結果＞
　図2Bに示した様に、ウエスタンブロッティングにおいて、IgGと反応させた場合にのみ、複合体とみられるバンドが観察されたことから、DSG又はDSSと反応させたIgG結合ペプチドは、ともに、IgAやHAS、血清中のIgG以外のタンパク質とは結合せずに、IgGに選択的に結合していることがわかった。
［実施例4：IgGに対するIgG結合ペプチドの反応条件の検討］
＜方法＞
（1）反応モル比の検討
　96穴マイクロプレート（Nunc（登録商標）MaxiSorp）のウェルに、各タンパク質（IgG（中外製薬）、IgA（Athens Research & Technology）、又はBovine gelatin（和光純薬））(50 ng（0.33 pmol）/μl/well)を含む0.1 M NaHCO3溶液をプレートに加えて室温で一晩放置することによって、各タンパク質をプレートの表面に吸着させ、0.5 % BSAでブロッキングを行なった後、各ウェルに、実施例２と同様に調製したDSGで修飾したビオチン化IgG結合ペプチド（モル比で、0,1,2,5,10）を加え、１時間経過後、１M Tris-HCl (pH7.0)を3μL加え反応を停止した。0.5 % BSA で2000倍希釈したSA-HRP（Vector Laboratories）を50μL加え、室温で一時間反応後、0.1% PBSTで5回洗浄後、HRPの呈色にTMB溶液(Wako Chemicals)を用いて、５分の発色反応後、450nmの吸光度をELISAプレートリーダー（モデル 680 マイクロプレートリーダー（バイオラッド））にて測定した。
（2）反応時間の検討
　50ng/50μLの溶液により4℃で一晩固定化したhIgG（50 ng）に対しDSGで修飾したビオチン化IgG結合ペプチドをモル比2で加え、各反応時間（0～60分）で、１M Tris-HCl (pH7.0)を3μL加え反応を停止した。結合の検出は（A）と同様に行った。
＜結果＞
　DSS標識化IgG結合ペプチドを用いて、抗体と反応させるモル数及び反応時間の違いによる反応効率をELISAにて検討した (図3)。即ち、プラスティックプレートに固定化したIgG結合ペプチドのモル比を1から10まで変化させてhIgGと反応させたところ、ほぼモル比5のあたりで飽和がみられたことから、モル比5程度のペプチド試薬を加えれば、抗体の標識化には充分であると考えられた（図3A）。DSSで修飾していないビオチン化IgG結合(R8K)ペプチド（NO DSS R8K）では極めて弱い結合がみられているが、これは、非共有結合で結合したペプチドによる結合活性と考えられる。さらに、標識化IgG結合ペプチド試薬を過剰に加えても、他のタンパク質（hIgA、Bovine gelatinあるいはブロッキング剤として用いているBSA）への結合は全く検出されなかった。
　次に、IgGとIgG結合ペプチドのモル比1：2で反応させた際の、反応時間の検討を行った。その結果、約15分で飽和が見られたことから、反応は15分でほぼ終了していると考えられた(図3B)。
　以上の結果より、架橋剤で修飾した本発明のIgG結合ペプチドは、短時間で、かつ特異的にIgGと結合することが示された。
［実施例5：蛍光IgG結合ペプチドによるFcの標識化］
＜方法＞
　IgG（中外製薬）、IgA（Athens Research & Technology）、又はBSA（シグマアルドリッチ）（15 μg：IgG換算で100 pmol）と実施例2に従って調製したDSG架橋ペプチド又はDSS架橋ペプチド（500 pmol）を200μL中で室温にて60 min反応させ、1M Tris-HCl (pH=7.0)を10μL加え反応を停止させた。その後、SuperdexTM200 10/30GL　直径1.0cm×30cm（GEヘルスケア）；流速：0.3ml/min；ランニングバッファー：PBS　pH 7.4、にてサイズ排除クロマトグラフィーを行い、蛍光検出器　RF-10A（島津製作所）（励起光：541 nm 蛍光: 565 nm）を用いて測定を行った。
＜結果＞
　DSS又はDSGを反応させた標識化IgG結合ペプチドを各タンパク質に対するモル比1：5でタンパク質と室温にて60 min反応させ、サイズ排除クロマトグラフィーにて分析した。いずれの標識化IgG結合ペプチド（DSS又はDSG）を用いても、IgGへの反応性の特異性は同程度であり、hIgAやBSA等の他のタンパク質への蛍光標識化は、全く検出されなかった（図4）。以上のことから、作製したいずれのIgG結合ペプチドを用いても、高い特異性を持って、ヒトIgGを蛍光標識できることがわかった。
［実施例6：IgG結合ペプチドによるFcの修飾物の解析（pH4.5）］
＜方法＞
　ヒトIgG（中外製薬）のFc溶液（20μM、0.1M酢酸緩衝液pH4.5）200μLと、DMF中に溶解した、実施例2と同様の方法によってDSG修飾したIgG結合ペプチド（RGNCAYHXGQLVWCTYH（配列番号３５）、Xはリジン）（4mM）を0.5、1.0、2.0、5.0μL（モル比で0.5、1.0、2.0、5.0）加え、素早く撹拌後、室温で15分反応し、１M Tris-HCl（pH7.0）を10μL加え、反応を停止させた。反応物50μLをShodex IEC SP-825カラムを接続したNGC Chromatography system（バイオラッド）にインジェクトし、25mM Acetate buffer（pH4.5）から1M NaClを含む25mM Acetate buffer（pH4.5）へのグラジエント溶出を行い、タンパク質の溶出を、215nmの吸光度でモニターした。得られた各ピークを分取し、LC/MSによる分子量測定に供した。
　Waters ACQUITY UPLC BEH C8 （1.7μm　2.1mm×100mm）カラムを接続したShimadzu LCMS-8030に、得られたピークのフラクションを20μLインジェクションした後、0.1% ギ酸を含む4％アセトニトリルから0.1% ギ酸を含む60％アセトニトリルまでのグラジエント溶出を行った。溶出されたピークのマススペクトル分析を行い、解析ソフトを用いた多価イオンピークからのデコンボリューションによって質量を計算した。
＜結果＞
　ヒトIgG1-FcとDSG修飾したIgG結合ペプチド（4mM、Biotin-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH-NH2；分子量2760、XはDSG化したリジンで、2つのCysは分子内SS結合を形成）をモル比で0.5、1.0、2.0、又は5.0で反応させたところ、図５Aに示した様に、元のヒトIgG1-Fcの溶出位置のピーク（ピーク２）と２つのピーク３、４が現れた（ピーク１は、DSG化したIgG結合ペプチドであると考えられる）。これらの分子種を同定するために、LCMS解析を行った。反応前のIgG1-Fcは、イオン交換クロマトグラムではピーク１のところに溶出され、LCMS解析では、55084という値が得られた。反応後の２、３、４のピークのLCMS解析を行ったところ、それぞれ、55087、57735（55087＋2648）、60384（55087＋5297）という値が得られた。このことから、反応後のピーク２は、未反応のFcであり、ピーク３と４は、Fcにそれぞれ１つ及び２つのペプチドが結合したものであることがわかった。
　図５Bは、各モル比で反応させた場合の、未反応（ピーク２）、１個のペプチドの付加物（ピーク３）、２個のペプチドの付加物（ピーク４）の生成量の変化をグラフ化したものである。例えば、モル比１：１で反応させた場合でも、未反応物は20％以下となり、モル比１：２では未反応物は10％以下と極めて収量が高いことがわかる。また過剰なモル比１：５の場合でも相対的に２個のペプチドの付加物の生成比率が増えたが、それ以上のペプチドが付加されたFcはイオン交換クロマトグラム上では検出されなかったことから、この標識反応は極めて特異的であることがわかった。
［実施例7：IgG結合ペプチドによるFcの反応に対するpHと反応時間の影響］
＜方法＞
　pH4.0（25ｍM酢酸緩衝液）、pH5.5（25ｍM酢酸緩衝液）、又はpH7.0（PBS）にて調製したヒトIgGのFc溶液200μLに対し、実施例5で調製した、DMF中に溶解したDSG修飾したIgG結合ペプチド（4 mM）を1.0μL（モル比で1.0）加え、素早く撹拌後、室温で反応した。反応後１、５、１０、又は３０分に、１M Tris-HCl（pH7.0）を10μL加え、反応を停止させ、反応物50μLをShodex IEC SP-825カラムを接続したNGC Chromatography system（バイオラッド）にインジェクトし、25mM Acetate buffer（pH4.5）から1M NaClを含む25mM Acetate buffer（pH4.5）へのグラジエント溶出を行い、タンパク質の溶出を、215nmの吸光度でモニターした。得られたクロマトグラムを基に各ピークの比率を計算した。
＜結果＞
　図６に示した様に、試験したpH 4.0、pH 5.5、及びpH 7.0のいずれにおいても標識化反応は早く、反応の90％以上が１分以内に終了していることがわかった。また、pH4.0では、未反応物の残量が40％を超えており反応収率が低く、特に、２つのペプチドの付加物（ピーク４）の収量が15％程度と他のpHの場合（35-40%）に比べ低かった。pH 5.5及び7.0では、未反応物の収量も10％台と低く、効率よく反応していることがわかった。pH5.5と7.0の差としては、若干、ピーク４の収量がpH 7.0で低くなる傾向が見られた。
［実施例8：放射性金属核種によるIgG結合ペプチドの標識及びこれを用いた癌の検出1］
１）DTPA含有IgG結合ペプチドの作製
　N末のアミノ基をDTPA-tetra(tBu)ester（CheMatech社製）で修飾したアミノPEG4化IgG結合ペプチドGPDCAYHKGELVWCTFH（配列番号３７、分子内の２つのCysはSS結合を形成、C末端はアミド化）はFmoc固相合成法により常法に従って合成した。脱保護後、精製したDTPA-IgG結合ペプチドをDMSO20μL（19mM）に溶解した。ペプチド溶液へアセトニトリルに溶解したDSG（500ｍM）20μLとピリジン0.2μL（最終濃度0.5%）を加え、50℃で3時間反応させた。全量を0.1％TFAを含む15％アセトニトリル10mlに希釈し、遠心後の上清を、InertSustain(登録商標) C18 カラム（7.6mm 1×250ｍｍ, GL Science）にインジェクションし、0.1％TFAを含む15％から80%までのアセトニトリルのグラジエントで溶出した。溶出物の質量分析を行い、目的物（DSG修飾DTPA-PEG4化IgG結合ペプチド）を回収後、溶媒を除去し、その後凍結乾燥した。
２）DTPA含有IgG結合ペプチドをTrastumabに結合させた、放射性核種標識抗体「DTPA修飾Trastumab」の作製
　上記１）で調製したDSG修飾DTPA-PEG4化IgG結合ペプチドを5.0mMの濃度でDMSO中に溶解した溶液1.36μLと、10ｍM酢酸緩衝液（pH5.5）に溶解した6.8μMの抗HER2ヒト抗体（Trastuzumab）（中外製薬）1ｍLを混合し、室温で30分間反応（ペプチドと抗体のモル比＝1：1）させた。このようにして調製したDTPA修飾ヒト抗体（抗体薬物複合体、ADC）は、陰イオン交換カラムShodex QA825（8.0mm×75mm, Shodex）にて、10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.0）を含む0Mから0.5MまでのNaClのグラジエント溶出にて精製した。未反応の抗体以外の２本のピーク（ピークA,B）を分取後、Vivaspin（10000Daカットオフ、Sartorius）上で、3000ｇで遠心することによって脱塩濃縮を行った。得られたサンプルは、MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG（Bruker Daltonics）で質量を測定し、ピークAが元の抗HER2ヒト抗体に比べ2716（理論値2722）、ピークBが元の抗HER2ヒト抗体に比べ5398（理論値5444）増えていることから、それぞれ、DTPAが付加されたDTPA-PEG4化IgG結合ペプチドが、１つ（抗HER2抗体―DTPA*1）、及び２つ（抗HER2抗体―DTPA*2）導入されていることを確認した。
３）DTPA修飾Trastuzumabの111In標識、及び[111In]標識DTPA修飾Trastuzumabの放射化学純度の確認
　上記２）で調製したDTPA修飾Trastuzumabをマイクロピペットで正確に量り取り、容量1.5mLのエッペンチューブに入れた。これに10mM クエン酸含有0.15M酢酸-アンモニア緩衝液（pH5.5）を加えた。DTPA修飾Trastuzumab溶液全量をマイジェクターで抜き取り、15mL容量の無色ガラス製バイアルに入れた。DTPA修飾Trastuzumab溶液全量と同量の[111In]Cl3溶液をマイジェクターで抜き取り、無色ガラス製バイアルに入れ、よく混和した。なお、[111In]に対するDTPA修飾Trastuzumabのモル数が20-100倍となるように調製した。これを室温で30分間反応させた。反応終了後、放射能量をラジオアイソトープ・ドーズ・キャリブレーターで測定した。
　1Mクエン酸溶液及び1Mクエン酸三ナトリウム溶液をそれぞれ5mLマイクロピペットで正確に量り、100mLメスフラスコに移した。純水を加え正確に100mLにした。1%EDTA溶液1mLをマイクロピペットで正確に量り、工程1の100mLメスフラスコに移し、よく混和した。これを展開溶媒とした（用時調製）。展開容器の中に展開溶媒を容器の底から1cm程度まで入れた。被験物質3μLをマイクロピペットで正確に量り、ろ紙の下端2cmを原点とし、原点に滴下した。滴下後直ちに乾燥させた。溶媒フロントを原点より10cmとし、展開溶媒に下端が浸るよう展開溶媒に入れた。溶媒フロント上端に達した後、直ちに乾燥させた。ろ紙に残留する放射能をラジオ薄層クロマトグラフィーアナライザーで測定（条件　Counting time：20min、Energy Range：125-285keV、Binning：2）し、原点のピーク面積の割合から、[111In]標識DTPA修飾Trastuzumabの放射化学純度[%]を算出した。
　表2に、Trastuzumab一分子に対するDTPA結合ペプチドの修飾数の異なる2種類のDTPA修飾Trastuzumabを用いて標識検討を実施した結果を示す。表1に示される通り、すべてのDTPA修飾Trastuzumabに対して111Inでの標識が可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
４）111In標識TrastuzumabのHER2結合能及び特異性の評価
　HER2高発現細胞株SK-OV-3（ヒト由来卵巣癌細胞）及びHER2低発現細胞株MDA-MB-231（ヒト由来乳癌細胞）（いずれもAmerican Type Culture Collectionから入手）をTrypsin-EDTA混合液を用いて回収し、無血清培地で1.5×107個/mLに調製した細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液200μLをマイクロピペットで正確に量り取り、容量1.5mLのマイクロチューブに入れ、氷冷した。なお、サンプル数をそれぞれ3とした。
　上記３）で調製した111In標識Trastuzumabを無血清培地で希釈し、放射能濃度が10～200kBq/mLになるように調製した。
　放射能濃度を調製した111In標識Trastuzumab含有無血清培地 500μLをマイクロピペットで正確に量り取り、細胞懸濁液の入ったマイクロチューブに加え、細胞懸濁液とよく混和した。これを氷上で1時間反応させた。反応終了後、HER2を介せず非特異的に各細胞に付着している111In標識Trastuzumabを洗浄するために、遠心分離（遠心加速度：5000g、温度：4℃、時間：5分）を行い、上清をマイクロピペットで除去した。その後、冷リン酸緩衝液1mLを加え再懸濁し、遠心分離（遠心加速度：5000g、温度：4℃、時間：5分）した。この洗浄操作を3回繰り返した。最終的にペレットだけが残るように上清をマイクロピペットで完全に除去した。
　111In標識Trastuzumab含有無血清培地を500μLマイクロピペットで正確に量り取り、容量1.5mLのプラスチックチューブに入れた。なお、ブランクとしてプラスチックチューブのみを用意した（下記の計算式のnet valueを計算するためのバックグラウンドの値を計測するために使用した）。また、サンプル数をそれぞれ3とした。各サンプルの放射能量をオートウェルガンマカウンタ（測定条件：Energy Range：111-252keV、プリセットタイム：60秒）で測定した測定値を用い、以下の計算式から各細胞に対する[111In]標識Trastuzumabの結合率（%）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
 ※カウント値は、いずれもnet value（測定値からバックグランドの値を差し引いて減衰補正したもの）を示す。
　結果を表3に示す。全ての[111In]標識TrastuzumabでHER2への結合能及び特異性を有していることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
５）SPECTイメージング解析による[111In]標識Trastuzumabの腫瘍内HER2 結合能及び特異性の確認
　マウス（BALB/c、nu/nu、19週齢、♀、各1例）の左右下肢にSK-OV-3（HER2高発現細胞株）及びMDA-MB-231（HER2低発現細胞株）を移植した担癌モデルを作製し、SPECT/CTイメージングを行った。SPECTイメージングには2種類の[111In]標識Trastuzumab（Trastuzumab1分子に対してDTPA結合ペプチド1分子又は2分子を修飾したもの）を使用した。
（111In標識Trastuzumabの調製）
　111In標識Trastuzumabは上記「３）DTPA修飾Trastuzumabの111In標識、及び[111In]標識DTPA修飾Trastuzumabの放射化学純度の確認」に記載した方法で調製し、限外ろ過法にて精製したものを以降の実験に使用した。なお抗体1分子内にDTPAを1分子有するものを[111In]標識Trastuzumab-1、2分子有するものを[111In]標識Trastuzumab-2とした。
（担癌モデルの作製）
　BALB/c nu/nuヌードマウスの左下肢にHER2高発現細胞株SK-OV-3を移植し、右下肢にHER2低発現細胞株MDA-MB-231を移植した担癌モデルを作製した。なお、各細胞は同一個体に移植した。ヌードマウスは日本エスエルシー株式会社から購入し、6週齢の雌を6匹用いた。イメージング実施日当日に各腫瘍体積を測定し、イメージング実験に適切な腫瘍体積を有するモデルを2例選出した。また、これらのマウスに使用した各癌細胞は、それぞれAmerican Type Culture Collectionから入手したものを用いた。
（SPECT/CT撮像）
（SPECT撮像）
　移植後13週に、[111In]標識Trastuzumab-1溶液（3.83MBq）または[111In]標識Trastuzumab-2（2.64MBq）溶液をモデル尾静脈から投与した。投与後4時間以降よりSPECT/CTカメラ（製品名：FX3000 Pre-Clinical Imaging System）での撮像を実施した。以降、投与後24時間、48時間の時点で撮像を実施した。
（CT撮像）
　CT撮像は各腫瘍組織が同時にSPECT撮像の視野内に収まっていることを確認するためにSPECT撮像の前に実施した。イソフルランによる麻酔導入を行い、麻酔を維持した状態でアニマルベッドに装着した。当モデルをCT装置内に入れ、X線を照射し、腫瘍が視野の中心になるように位置決めを実施した。CT撮像は以下に示す撮影条件にて実施し、腫瘍のCT画像（rawファイル）を取得した。
Project count：200views
Frames averaged：1frames/view
Detector binning：2x2
X-ray tube current：Default(150 μA)
X-ray tube voltage：60kV
Exposure time：230ms
Magnification：1.8
　得られたrawファイルをTrifoil Consoleで再構成し（再構成条件：Half Res）、再構成画像を画像表示ソフトにて更に変換してDICOMファイルを作製し、これらを画像解析ソフト（製品名PMOD 3.6）にて読み込み、画像を表示させ、以降の解析に用いた。
（SPECT/CT画像解析）
　[111In]標識Trastuzumab-1溶液または[111In]標識Trastuzumab-2溶液投与後の各時間点でSPECT及びCTの融合画像を作製し、冠状面で表示した。
　表4に、in vivo実験に用いたモデルの詳細および投与した[111In]標識Trastuzumab-1、[111In]標識Trastuzumab-2の情報を記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　SPECTの撮像条件を表5に、画像再構成条件を表6に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　SPECT/CT撮像後、SPECT及びCTの融合画像を作製し、冠状面で表示した。[111In]標識Trastuzumab-1及び[111In]標識Trastuzumab-2を投与したSPECT/CT撮像の結果を図7、8及び9に示した。
　[111In]標識Trastuzumab-1及び[111In]標識Trastuzumab-2をそれぞれ投与後6時間及び投与後4時間に撮像したSPECT/CT画像を、腫瘍を含むスライス画像として、図7に示した。[111In]標識Trastuzumab-1及び[111In]標識Trastuzumab-2はHER2高発現腫瘍組織への集積を認めたが、HER2低発現腫瘍組織では集積を認めなかった。なお、[111In]標識Trastuzumab-1は尾に非特異的な集積が認められるが、これは投与時に一部の溶液が血管外に漏出したためである。
　[111In]標識Trastuzumab-1及び[111In]標識Trastuzumab-2の投与後24時間、48時間のSPECT/CT画像を、腫瘍を含むスライス画像として、図8に示した。SPECT画像は[111In]標識Trastuzumab-1の投与後24時間点の撮像時刻を基準に減衰補正を実施し、スケール値を合わせて示した。[111In]標識Trastuzumab-1及び[111In]標識Trastuzumab-2はHER2高発現腫瘍組織への集積を認めたが、HER2低発現腫瘍組織では集積を認めなかった。また、いずれの時間点にでもHER2高発現腫瘍組織への集積は[111In]標識Trastuzumab-1の方が[111In]標識Trastuzumab-2よりも高かった。
　[111In]標識Trastuzumab-1及び[111In]標識Trastuzumab-2をそれぞれ投与後6時間及び投与後4時間に撮像したSPECT/CT画像を、肝臓を含むスライス画像として、図9に表示した。投与早期の肝臓への集積は[111In]標識Trastuzumab-1と比較して[111In]標識Trastuzumab-2のほうが高かった。なお、肝臓の位置は上部が胸腔であることより判断した。
［実施例9：ジクロロプロパノンによるSS架橋構造を持つIgG結合ペプチドの調製］
　N末アセチル化RRC（Acm保護）-PEG4化合成ペプチドGPDCAYHXGELVWCTFH（配列番号２、Xはリジンで、C末端はアミド化）を、ペプチド合成ビーズ（Rink-amide-Chemmatrix resin、Biotage)上にて、Fmoc固相合成法により常法に従って合成した。樹脂からのペプチドの切り出し、脱保護を行った後、ペプチド（図10、a）を得た。得られたペプチド65mg（15.6μmol）を6 M Gn・HClを含むリン酸緩衝液 (pH =7.3)5 mLに溶解し、これにアセトニトリル120μLに溶解した1, 3-Dichloro-2-propanone (2.9 mg, 23.4 μmol, 1.5等量モル)を加えて、室温で攪拌した。1時間後、HPLC分析によって反応の終了を確認し、反応溶液を直接HPLCにて精製することによって、環化ペプチド(図10、b、33 mg、7.8 μmol、収率50％)を得た。この環化ペプチドに対して、90%酢酸水溶液(8.8 mL)に懸濁した酢酸銀(30.8 mg, 184.5 μmol)を加えて、室温下、遮光で5時間攪拌した。ジチオスレイトール(DTT:352 mg, 2.3 mmol)を加え、生じた沈殿を遠心分離によって除去し、得られた上清をHPLCによって、精製することで、環化ペプチド(図10、c、20.5 mg、5.2 μmol、収率67%)を得た。
［実施例10：放射性金属核種によるIgG結合ペプチドの標識及びこれを用いた癌の検出2］
＜方法＞
１）デフェロキサミン含有IgG結合ペプチドの作製
　N末のアミノ基をデフェロキサミン-tetra(tBu)ester（CheMatech社製）で修飾したアミノPEG4化IgG結合ペプチドGPDCAYHKGELVWCTFH（配列番号３７、分子内の２つのCysはSS結合を形成、C末端はアミド化）はFmoc固相合成法により常法に従って合成した。脱保護後、精製したデフェロキサミン-IgG結合ペプチドをDMSO40μL（18mM）に溶解した。ペプチド溶液へアセトニトリルに溶解したDSG（500ｍM）40μLとピリジン0.5μL（最終濃度0.6%）を加え、50℃で3時間反応させた。全量を0.1％TFAを含む15％アセトニトリル10mlに希釈し、遠心後の上清を、InertSustain（登録商標） C18 カラム（6.0×250ｍｍ, GL Science）にインジェクションし、0.1％TFAを含む10％から66%までのアセトニトリルのグラジエントで溶出した。溶出物の質量分析を行い、目的物（DSG修飾デフェロキサミン-PEG4化IgG結合ペプチド）を回収後、溶媒を除去し、その後凍結乾燥した。
２）デフェロキサミン含有IgG結合ペプチドをTrastuzumabに結合させた、放射性核種標識抗体「デフェロキサミン修飾Trastuzumab」の作製
　上記１）で調製したDSG修飾デフェロキサミン-PEG4化IgG結合ペプチドを13mMの濃度でDMSO中に溶解した溶液10μLと、10ｍM酢酸緩衝液（pH5.5）に溶解した22μMの抗HER2ヒト抗体（Trastuzumab）（中外製薬）1ｍLを混合し、室温で2時間反応（ペプチドと抗体のモル比＝6：1）させた。このようにして調製したデフェロキサミン修飾ヒト抗体（抗体薬物複合体，ADC）は、陰イオン交換カラムQA-825（8.0mm×75mm, Shodex）にて、10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.0）を含む0Mから0.5MまでのNaClのグラジエント溶出にて精製した。未反応の抗体以外の２本のピーク（ピークA,B）を分取後、Vivaspin（登録商標）（10000Daカットオフ，Sartorius）上で、3000ｇで遠心することによって脱塩濃縮を行った。得られたサンプルは、MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG（Bruker Daltonics）で質量を測定し、ピークAが元の抗HER2ヒト抗体に比べ2716（理論値2722）、ピークBが元の抗HER2ヒト抗体に比べ5398（理論値5444）増えていることから、デフェロキサミンが付加されたデフェロキサミン-PEG4化IgG結合ペプチドが、それぞれTrastuzumabに１分子または２分子導入されていることを確認した。
３）デフェロキサミン修飾Trastuzumabの89Zr標識及び精製
　89Zrを200MBq/200μLになるように、1Mシュウ酸溶液に溶解した。マイクロチューブに200μLの89Zr -シュウ酸溶液、90μLの2M炭酸ナトリウムを加え、室温で3分間放置した。3分間放置した後のマイクロチューブに、撹拌しながら1030μLの5mg/mLゲンチジン酸含有0.5M HEPES緩衝液（pH7.1-7.3）を加えた。この溶液650μLに、上記２）で調製したデフェロキサミン修飾Trastuzumab（1価または2価）300μLを加え混和し、反応バイアル中の反応液のpHがpH6.8-7.2であることをpH試験紙で確認した。pH確認後、1時間室温にて反応させた。その後、PD-10カラムを20mLの5mg/mLゲンチジン酸含有0.25M酢酸ナトリウム（pH5.4-5.6）で溶媒交換した後、89Zr標識溶液をPD-10カラム（GEヘルスケア）に付した。1.5mLの5mg/mLゲンチジン酸含有0.25M酢酸ナトリウム（pH5.4-5.6）を加え、溶出液を廃棄した。2mLの5mg/mLゲンチジン酸含有0.25M酢酸ナトリウム（pH5.4-5.6）を加え溶出液を0.2mLずつ分取した。放射能を含む分画を集め、限外ろ過用遠心カラム（Amicon Ultra、メルクミリポア社製）による濃縮操作を行った。逆相修飾シリカゲル薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート、TLCシリカゲル 60 RP-18 F254s（メルクミリポア）を用い、50mM EDTA（pH5.0）を展開溶媒として、89Zr標識溶液を展開した。展開後のTLCプレートをイメージングプレート（富士フィルム）に曝露し、フルオロ・イメージアナライザー（ＦＬＡ－７０００、GEヘルスケア社製）でオートラジオグラムを取得した。得られたオートラジオグラムの原点のピーク面積の割合から、[89Zr]標識Trastuzumab（1価または2価）の放射化学純度[%]を算出した。
４）89Zr標識Trastuzumabの投与及びPETイメージング
　マウス（BALB/c-nu/nu、♀、13週齢）の左右下肢にSK-OV-3（HER2高発現細胞株）及びMDA-MB-231（HER2低発現細胞株）（いずれもAmerican Type Culture Collectionから入手）を移植した担癌モデルを作製し、PETイメージングを行った。PETイメージングには上記3）に従って調製した2種類の[89Zr]標識Trastuzumab（Trastuzumab1分子に対してデフェロキサミン結合ペプチド1分子又は2分子を修飾したもの）を使用した。なお抗体1分子内にデフェロキサミンを1分子有するものを[89Zr]標識Trastuzumab-1、2分子有するものを[89Zr]標識Trastuzumab-2とした。
　[89Zr]標識Trastuzumab-1溶液または[89Zr]標識Trastuzumab-2溶液をモデル尾静脈から投与した。投与後6時間以降よりPETカメラ（製品名：Clairvivo（登録商標）PET）での撮像を実施した。その後、投与後24時間及び48時間の時点で撮像を実施した。PET画像の再構成法には3D-DRAMA法を用いた。
　表7に、in vivo実験に用いたモデルの詳細、及び投与した[89Zr]標識Trastuzumab-1、[89Zr]標識Trastuzumab-2の情報をまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表8に、各時間点における撮像時間を示した。各時間点の撮像時間設定には、各標識体の投与量及び放射能の減衰を考慮した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
＜結果＞
　[89Zr]標識Trastuzumab-1及び[89Zr]標識Trastuzumab-2をそれぞれ投与後6、24及び48時間に撮像したPET画像を、腫瘍を含むスライス画像として、図11に示した。図11に示される通り、[89Zr]標識Trastuzumab-1及び[89Zr]標識Trastuzumab-2は、HER2低発現腫瘍組織と比較して、HER2高発現腫瘍組織への高い集積を認めた。
　本発明のIgG結合ペプチドは放射性金属核種に容易に結合させることできるので、放射性金属核種によってIgGを特異的かつ簡便に、かつその機能を損なうことなく標識することができる。放射性金属核種によって標識されたIgGは、癌の診断に用いることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (25)

  1. 　下記の式I：
    (X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(I)
    (式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、かつ
    Wはトリプトファン残基である。)
    によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種と結合し得るリガンドを含む、ペプチド。
  2. 　下記の式I：
    (X1-3)-C-(X2)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(I)
    (式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、かつ
    Wはトリプトファン残基である。)
    によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種で標識された、ペプチド。
  3. 　放射性金属核種が、111In、89Zr、64Cu、67/68Ga、及び99mTcからなる群から選択される、請求項１又は２に記載のペプチド。
  4. 　放射性金属核種が、リガンドを介してペプチドに結合している、請求項２又は３に記載のペプチド。
  5. 　前記リガンドが、N末端に連結されている、請求項１又は４に記載のペプチド。
  6. 　前記リガンドが、キレート剤である、請求項１、４又は５に記載のペプチド。
  7. 　前記キレート剤が、ジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）、デフェロキサミン、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸（DOTA）、1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-三酢酸（NOTA）、及びエチレンジアミン四酢酸（EDTA）からなる群から選択される、請求項６に記載のペプチド。
  8. 　放射性金属核種とリガンドの組み合わせが、111InとDTPA、89Zrとデフェロキサミン、及び64CuとDOTA又はNOTAからなる群から選択される、請求項４又は５に記載のペプチド。
  9. 　下記の式II：
    (X1-3)-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(II)
    (式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、
    Wはトリプトファン残基であり、
    Xaa3はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、かつ
    Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)
    によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のペプチド。
  10. 　下記の式III：
    (X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3)　　(III)
    (式中、Xの各々は独立的にシステイン以外の任意のアミノ酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Aはアラニン残基であり、
    Yはチロシン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Xaa2はグルタミン酸残基、又はグルタミン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、かつ
    Wはトリプトファン残基である。)
    によって表される、13～17アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のペプチド。
  11. 　17アミノ酸残基とした場合の、N末端から1～3、15～17番目の各アミノ酸残基が、
    1番目のアミノ酸残基= S、G、F、R又は、なし
    2番目のアミノ酸残基= D、G、A、S、P、ホモシステイン、又は、なし
    3番目のアミノ酸残基= S、D、T、N、E又はR、
    15番目のアミノ酸残基= S、T又はD、
    16番目のアミノ酸残基= H、G、Y、T、N、D、F、ホモシステイン、又は、なし、
    17番目のアミノ酸残基= Y、F、H、M又は、なし
    である、請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド。
  12. 　以下の１）～１４）のいずれかのアミノ酸配列からなる、ただし、Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、以下の１４）においてXaa2はホモシステインである、請求項９に記載のペプチド。
    １）DCAYH(Xaa1)GELVWCT（配列番号１）
    ２）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号２）
    ３）RCAYH(Xaa1)GELVWCS（配列番号３）
    ４）GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号４）
    ５）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号５）
    ６）GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号６）
    ７）GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH（配列番号７）
    ８）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH（配列番号８）
    ９）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH（配列番号９）
    １０）GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１０）
    １１）SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１１）
    １２）SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY（配列番号１２）
    １３）RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH（配列番号１３）
    １４）G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H（配列番号３６）
  13. 　下記の式IV：
    D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T　　(IV)
    (式中、
    Dはアスパラギン酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Hはヒスチジン残基であり、
    Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Xaa2はグルタミン酸残基、グルタミン残基又はアスパラギン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Vはバリン残基であり、
    Wはトリプトファン残基であり、
    Tはトレオニン残基であり、
    Xaa3はアラニン残基又はトレオニン残基であり、かつ、
    Xaa4はチロシン残基又はトリプトファン残基である。)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のペプチド。
  14. 　下記の式V：
    D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T　　(V)
    (式中、
    Dはアスパラギン酸残基であり、
    Cはシステイン残基であり、
    Gはグリシン残基であり、
    Lはロイシン残基であり、
    Wはトリプトファン残基であり、
    Tはトレオニン残基であり、
    Xaa1はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、2-アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、
    Xaa2はアラニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
    Xaa3はトリプトファン残基又はチロシン残基であり、
    Xaa4はヒスチジン残基、アルギニン残基、セリン残基又はトレオニン残基であり、
    Xaa5はグルタミン酸残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、アルギニン残基、又はアスパラギン酸残基であり、かつ
    Xaa6はイソロイシン残基又はバリン残基である)によって表される、13アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含み、かつヒトIgGと結合可能であり、かつ放射性金属核種がリガンドを介して結合している、ペプチド。
  15. 　ペプチドが外側の2つのシステイン(C)残基間でジスルフィド結合を形成しているか、又はペプチドの外側の2つのシステイン残基中のスルフィド基が、以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で表されるリンカーにより連結されている、請求項１～１４のいずれか一項に記載のペプチド。
  16. 　請求項１～１５のいずれか一項に記載のペプチドにおいて、N末端がPEG化及び／又はC末端がアミド化されている、請求項１～１５のいずれか一項に記載のペプチド。
  17. 　Xaa1がリシン残基である、請求項１～１６のいずれか一項に記載のペプチド。
  18. 　Xaa1が架橋剤で修飾されている、請求項１～１７のいずれか一項に記載のペプチド。
  19. 　前記架橋剤が、DSG（ジスクシンイミジルグルタレート）、DSS（ジスクシンイミジルスベレート）、DMA（アジプイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMP（ピメルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DMS（スベルイミド酸ジメチル二塩酸塩）、DTBP（3,3'-ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル二塩酸塩）、及びDSP（ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸）からなる群より選択される、請求項１８に記載のペプチド。
  20. 　前記架橋剤がDSG（ジスクシンイミジルグルタレート）又はDSS（ジスクシンイミジルスベレート）である、請求項１９に記載のペプチド。
  21. 　GPDCAYHKGELVWCTFH（配列番号３７、分子内の２つのCys(C)はSS結合を形成）のアミノ酸配列からなる、請求項１７～２０のいずれか一項に記載のペプチド。
  22. 　ペプチドとIgGとの複合体であって、架橋剤で修飾されている、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のペプチドとIgGの架橋反応によって形成される、前記複合体。
  23. 　放射性金属核種がペプチドに結合している、請求項２～２１のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項２２に記載の複合体を含む、核医学画像診断剤又は癌の診断剤。
  24. 　被験体の癌の罹患の有無を決定する方法であって、
    　被験体から得られたサンプルに、放射性金属核種がペプチドに結合している、請求項２～２１のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項２２に記載の複合体を反応させる工程、
    　サンプル中の放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
    　放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
    を含む、方法。
  25. 　被験体の癌の罹患の有無を決定する方法であって、
    　放射性金属核種がペプチドに結合している、請求項２～２１のいずれか一項に記載のペプチド又は請求項２２に記載の複合体を、被験体に投与する工程、
    　被験体において、放射性金属核種に由来する放射能のレベル又は存在を測定する工程、及び
    　放射能のレベル又は存在に基づいて、被験体の癌の罹患の有無を決定する工程、
    を含む、方法。
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