CN116514978A

CN116514978A - Pd-l1特异性纳米抗体分子影像探针制备方法及应用

Info

Publication number: CN116514978A
Application number: CN202310400424.6A
Authority: CN
Inventors: 魏伟军; 张友; 刘建军
Original assignee: Renji Hospital
Current assignee: Renji Hospital
Priority date: 2023-04-14
Filing date: 2023-04-14
Publication date: 2023-08-01

Abstract

本发明涉及肿瘤诊断与治疗的分子影像、核医学和纳米抗体技术领域，尤其是涉及一种PD‑L1特异性纳米抗体、其融合蛋白、PD‑L1特异性纳米抗体分子影像探针及其制备方法和应用。本发明的PD‑L1特异性纳米抗体分子影像探针克服了单克隆抗体分子影像探针的显像周期长及辐射剂量大等缺陷，具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低、易于临床转化等优点。

Description

PD-L1特异性纳米抗体分子影像探针制备方法及应用

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断与治疗的分子影像、核医学和纳米抗体技术领域，尤其是涉及一种PD-L1特异性纳米抗体分子影像探针制备方法及应用。

背景技术

程序性死亡因子配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)通过与T细胞表面的受体程序性死亡因子(programmed cell death protein 1，PD-1)相互作用，抑制T细胞激活及抗肿瘤免疫反应。基于单克隆抗体靶向PD-1/PD-L1的免疫治疗显著延长了多种肿瘤的生存。但是，目前临床尚缺乏有效预测靶向PD-1/PD-L1免疫治疗疗效的生物标志物。尤其值得注意的是，《Nature Medicine》杂志刊登的临床研究数据表明：免疫组织化学染色所揭示PD-L1表达水平不能预测PD-L1特异性单克隆抗体阿特珠单抗(atezolizumab)的治疗疗效(Nat Med.2018；24:1852–1858.)。与此同时，另一项临床研究表明目前用于检测PD-L1表达水平的几种免疫组织化学染色方法的检测效能存在显著差异，且同一方法在不同样本间的染色结果差异较大(J Thorac Oncol.2017；12:208–222.)。此外，免疫组织化学染色还面临穿刺活检取样误差、图像判断误差等缺陷。

基于放射性核素标记单克隆抗体、抗体片段及的免疫PET(immunoPET)显像是精准医学时代分子影像的新范式，不仅不可以用于在体无创可视化肿瘤标志物的异质性表达，动态监测肿瘤标志物在治疗前后的动态演变，还可以有效预测靶向治疗或免疫治疗的疗效(Chem Rev.2020；120(8):3787-3851.)。申请人前期针对CD146(AdvancedScience.2019Feb27；6(9):1801237.)、TIM-3(Advanced Therapeutics.2020Jul；3(7):2000018.)、ICAM-1(Eur J Nucl Med Mol Imaging.2020Nov；47(12):2765-2775.)、HER2(Am J Cancer Res.2019Nov1；9(11):2413-2427.)、组织因子(Advanced Science.2020May17；7(13):1903595.)等多发个靶向或免疫治疗相关靶点制备了长半衰期金属核素(⁸⁹Zr，T1/2＝78.4h；⁶⁴Cu，T1/2＝12.7h)标记单克隆抗体探针，上述探针取得了不错的诊断效能，但单克隆抗体探针面临在体循环时间长、需要长半衰期核素标记、显像周期长达1周、辐射剂量大、临床转化应用难度大等缺陷。

1993年比利时科学家Hamers等人在《Nature》杂志中首次报道在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体(Nature.1993；363(6428):446-8.)，这种具有特殊结构域的抗体即为重链抗体(Heavy-chain antibodies,HCAbs)。通过分子生物学手段，克隆重链抗体的可变区即可得到只有重链可变区的抗原结合片段，即为纳米抗体(VHH，VariableDomain of Heavy Chain of Heavy Chain Antibody)。VHH晶体宽为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa，因此也被称为纳米抗体(Ablynx公司注册商品名)。纳米抗体是目前已知的可结合目标抗原的最小抗体单位，具有亲和力高、分子量小、制备成本低廉(既可以运用大肠杆菌表达，也可以运用酵母、中国仓鼠卵巢细胞等真核表达体系表达)、易于临床转化和推广应用的优点。纳米抗体是近年来构筑分子影像探针的热门靶向载体(Theranostics.2014；4(4):386-98)。

邢岩等人制备了^99mTc标记PD-L1特异性纳米抗体探针^99mTc-NM01(J NuclMed.2019；60(9):1213-1220.)。但值得注意的是，^99mTc属于单光子发射放射性核素，所制备探针用于单光子发射计算机断层显像(SPECT)，受限于^99mTc本身的物理特性和SPECT成像设备的低分辨率，导致上述探针的临床诊断性能较差；此外，纳米抗体NM01的亲和力较低，为2.9nM，可能无法有效检测低丰度PD-L1的表达；最后，游离^99mTc常浓聚于正常的甲状腺组织和胃粘膜组织，导致显像的假阳性显像。与此同时，欧洲学者利用已临床获批的PD-L1特异性单克隆抗体阿特珠单抗，制备了⁸⁹Zr-atezolizumab(Nat Med.2018；24:1852–1858.)。然而，克隆抗体探针不仅制备成本昂贵，而且显像周期长(长达1周)。此外，单克隆抗体探针因为Fc/FcR片段介导正常组织器官对探针的摄取，导致在正常的组织器官如肝脏、脾脏等有较高的摄取，进一步导致对正常组织器官造成的辐射损伤较大。总体来说，目前进入临床转化阶段的PD-L1特异性纳米抗体探针和单克隆抗体，均存在一定的缺陷。

因此，迫切需要一种克服传统纳米抗体探针亲和力低、脱靶效应高的缺陷，并克服单克隆抗体探针显像周期长、辐射剂量大的缺陷的新的PD-L1特异性纳米抗体探针。

发明内容

本发明旨在构建PD-L1特异性纳米抗体分子影像探针，克服单克隆抗体分子影像探针的显像周期长及辐射剂量大等缺陷，实现更为方便的对于靶向PD-L1治疗的患者进行分层以及靶向PD-L1治疗疗效监测。

PD-L1特异性纳米抗体

在一个方面，本发明提供了一种PD-L1特异性纳米抗体，其包含：

(1)具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的CDR3，

(2)具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.9所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.10所示的氨基酸序列的CDR3，

(3)具有SEQ ID No.13所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.14所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.15所示的氨基酸序列的CDR3，

(4)具有SEQ ID No.39所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.19所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.20所示的氨基酸序列的CDR3，

(5)具有SEQ ID No.23所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.24所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.25所示的氨基酸序列的CDR3，

(6)具有SEQ ID No.28所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.29所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.30所示的氨基酸序列的CDR3，或

(7)具有SEQ ID No.33所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.34所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.35所示的氨基酸序列的CDR3。

更具体地，本发明的PD-L1特异性纳米抗体具有SEQ ID No.4、6、11、16、21、26、31或36所示的氨基酸序列。

在本发明中，为了简便起见，将具有SEQ ID No.4、6、11、16、21、26、31或36所示的氨基酸序列的PD-L1特异性纳米抗体分别称为WW102、WW101、WW103、WW104、WW105、WW106、WW107或WW108。

如本文所用，术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single-domain antibody,sdAb)或VHH(Variable Domain of Heavy Chain of Heavy Chain Antibody)，它们可互换使用。

在一些实施方案中，本发明还涵盖如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“抗原结合片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文以用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过本发明纳米抗体的酶促或化学断裂产生本发明抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的纳米抗体(例如本发明提供的纳米抗体)获得纳米抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整纳米抗体的方式相同的方式就特异性筛选纳米抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。

如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

如本文中所使用的，术语“PD-L1特异性”是指特异性结合PD-L1。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以由该相互作用的平衡解离常数(K_D)表示。在本发明中，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。

两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(k_a或k_on)和“解离速率常数”(k_dis或k_off)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见MalmqvistM,Nature,1993,361:186-187)。k_dis/k_on的比率等于解离常数K_D(参见Davies等人,AnnualRev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量K_D、k_on和k_dis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。

在一些实施方案中，本发明还提供了如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体的变体，其与SEQ ID No.4、6、11、16、21、26、31或36所示的氨基酸序列的具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且基本保留了其所源自的纳米抗体的生物学功能(例如特异性结合PD-L1的生物活性)。

更具体地，所述变体与如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、至多5个或至多1个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白

在另一个方面，本发明提供了一种PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白，其包含如本文所述的纳米抗体和用于延长体内半衰期的部分。

如本文所用，用于延长体内半衰期的部分可以包括血清白蛋白或其片段、聚乙二醇、结合血清白蛋白的结构域(如抗血清白蛋白的纳米抗体)、聚乙二醇-脂质体复合体等。

本发明所提供的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白中，如本文所述的纳米抗体和用于延长体内半衰期的部分可以设有连接肽。所述连接肽可以是通过由丙氨酸(A)和/或丝氨酸(S)和/或甘氨酸(G)组成的柔性多肽链，连接肽的长度可以为3～30个氨基酸，优选为3-9个、9-12个、12-16个、16～20个。

在具体的实施方案中，本发明提供了一种PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白，其具有SEQ ID No.38所示的氨基酸序列。

在本发明中，为了简便起见，将具有SEQ ID No.38所示的氨基酸序列的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白称为ABDWW102。

本发明的纳米抗体融合蛋白ABDWW102不仅能与人PD-L1高亲和力结合，还能与人血清白蛋白(HSA)及鼠血清白蛋白(MSA)高亲和力结合(图12)。Biacore亲和力测定结果显示，ABDWW102与HSA与MSA的亲和力分别为3.38pM和52.74pM(图13)。通过以上数据可知，纳米抗体融合蛋白ABDWW102与HSA亲和力显著高于与MSA亲和力。

多核苷酸

在另一个方面，本发明还提供了编码上述纳米抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白的多核苷酸。

更具体地，所述多核苷酸具有SEQ ID No.5、7、12、17、22、27、32、37或39所示的核苷酸序列。

更具体地，编码如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体的多核苷酸具有SEQ IDNo.5、7、12、17、22、27、32或37所示的核苷酸序列。更具体地，编码如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白的多核苷酸具有SEQ ID No.39所示的核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

术语“编码多肽/蛋白/抗体的多核苷酸”可以是包括编码此多肽/蛋白/抗体的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，优选地至少70％，更优选地至少80％，最优选至少90％同一性的多核苷酸，并且它们编码的多肽/蛋白/抗体具有基本上相同的功能和活性。本发明特别涉及可在严格条件下与本发明所述多核苷酸杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同一性至少在90％以上,更优选95％以上时才发生杂交。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

载体

在另一个方面，本发明还提供了包含编码上述纳米抗体或其抗原结合片段或其融合蛋白的多核苷酸的载体。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

宿主细胞

在另一个方面，本发明还提供了包含如本文所述的载体的宿主细胞。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或其他人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。

将载体导入宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

本发明的纳米抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。优选的可检测标记物为放射性核素。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

可检测标记物或治疗剂与抗体的结合或偶联可以通过本领域技术人员熟知的常规方法进行。例如，可检测标记物可以直接或间接结合至纳米抗体，例如通过可切割或不可切割的接头肽，或掺入纳米抗体中。可检测标记物尤其可以通过替换(例如通过用酪氨酸残基水平的I替换H)，通过复合或通过螯合与纳米抗体结合。例如治疗剂可以经由可切割接头(例如肽基、二硫化物或腙接头)缀合至纳米抗体。

在优选的实施方案中，如下文更详细描述的，本发明的纳米抗体与放射性核素偶联以用作PD-L1特异性分子影像探针。

PD-L1特异性分子影像探针

在另一个方面，本发明提供了一种PD-L1特异性分子影像探针，其包含经放射性核素标记的如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体或PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白。

更具体地，如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体或PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白经由双功能螯合剂被放射性核素标记。

如本文所用，双功能螯合剂是同时具有金属螯合端和蛋白锚定端的一类螯合剂。双功能螯合剂可以选自NOTA、MAA-NOTA、p-SCN-Bn-NOTA、p-SCN-Bn-去铁胺(DFO)、p-SCN-NODA、MAA-GA-NODA、MAA-DOTA、DOTA-NHS、iEDTA或p-SCN-Bn-DTPA。

优选地，双功能螯合剂选自p-SCN-Bn-NOTA或p-SCN-Bn-去铁胺。

如本文所用，所述NOTA为1,4,7-三氮环壬烷-1,4,7-三乙酸；

所述MAA-NOTA为(2,2'-(7-(2-((2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-2-氧乙基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸；

所述p-SCN-Bn-NOTA为2-S-(4-异硫氰苯基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸；

所述p-SCN-Bn-去铁胺(DFO)是1-(4-异硫氰基苯基)-3-[6,17-二羟基-7,10,18,21-四氧代-27-(N-乙酰羟基氨基)-6,11,17,22-四氮杂庚二糖]硫脲；

所述p-SCN-NODA为1,4,7-三氮杂环辛烷-1,4-二乙酸-7-对异硫氰基苄基；

所述MAA-GA-NODA为2,2'-(7-(1-羧基-4-((2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧丁基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸；

所述MAA-DOTA为2,2',2″-(10-(1-羧基-4-((2-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)氨基)-4-氧丁基)-1,4,7,10-三氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸]；

所述DOTA-NHS为2,2',2”-(10-(2-((2,5-二氧吡咯烷-1-基)氧)-2-氧乙基)-1,4,7,10-三氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸；

所述iEDTA为1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸；

所述p-SCN-Bn-DTPA为2-(4-异硫代氰酰基苄基)-二乙烯三胺五乙酸。

更具体地，如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体经由p-SCN-Bn-NOTA被放射性核素标记。更具体地，如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白经由p-SCN-Bn-NOTA被放射性核素标记。更具体地，如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白经由p-SCN-Bn-去铁胺被放射性核素标记。

更具体地，放射性核素选自Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、I-124、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、Y-86、Mn-52、Sc-44、Lu-177、Y-90、Ac-225、At-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra-223、Ru-106、Na-24、Sr-89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169或Yb-177。

更具体地，放射性核素选自Ga-68。

更具体地，如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体经Ga-68标记(一种此类PD-L1特异性分子影像探针的例子是如实施例中所述的[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102)。更具体地，如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白经Ga-68标记(一种此类PD-L1特异性分子影像探针的例子是如实施例中所述的[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102)。更具体地，如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白经Cu-64标记(一种此类PD-L1特异性分子影像探针的例子是如实施例中所述的[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102)。

在另一个方面，本发明还提供了制备PD-L1特异性分子影像探针的方法，包括通过双功能螯合剂修饰PD-L1特异性纳米抗体，得到放射性核素标记前体；和使用放射性核素标记所述放射性核素标记前体，得到PD-L1特异性分子影像探针。

组合物

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体、PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针。所述组合物可用于检测PD-L1的表达水平、诊断PD-L1相关的肿瘤、预测PD-L1相关肿瘤的治疗效果或治疗PD-L1相关肿瘤。

在一些实施方案中，所述组合物可以是药物组合物。

在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在一些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。

在一些实施方案中，所述另外的药学活性剂是抗炎药物或免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在所述药物组合物中，如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体、PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体、PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体、PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针。“预防有效量”是指足以预防、阻止或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，其包含如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体、PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针。

所述试剂盒可用于检测PD-L1的表达水平、诊断PD-L1相关的肿瘤、预测PD-L1相关肿瘤的治疗效果或治疗PD-L1相关肿瘤。

所述试剂盒还可包含还包括容器、使用说明书、以及实际应用所需的其他试剂和缓冲液，例如用于溶解样本的裂解介质，各种缓冲液，检测标记，检测底物等。

诊断和治疗应用

本发明的PD-L1特异性纳米抗体对PD-L1具有极高的亲和力，因而可以用于检测PD-L1的表达水平、诊断PD-L1相关的肿瘤、预测PD-L1相关肿瘤的治疗效果或治疗PD-L1相关肿瘤。

特别地，由本发明的PD-L1特异性纳米抗体制备的PD-L1特异性分子影像探针具有亲和力显著提高、正常组织摄取非特异性摄取明显降低、且图像质量明显提高的特点，可用于无创、精准、高效探测人PD-L1的表达，因此特别适合用于诊断PD-L1相关的肿瘤和预测PD-L1相关肿瘤的治疗效果。在选择合适的放射性核素进行偶联后，也可以用于精准治疗PD-L1相关肿瘤。

因此，在另一个方面，本发明还涉及如本文所述的PD-L1特异性纳米抗体、PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针在制备用于检测PD-L1的表达水平、诊断PD-L1相关的肿瘤、预测PD-L1相关肿瘤的治疗效果或治疗PD-L1相关肿瘤的试剂盒或药物中的用途。

如本文所用，PD-L1相关的肿瘤可以包括本领域熟知的各种肿瘤或癌症。例如，PD-L1相关的肿瘤可以包括胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、淋巴癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。

本发明的有益效果

本发明报道一种高亲和力、高特异性纳米抗体探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102，其中PD-L1特异性纳米抗体WW102亲和力为15.29pM。为文献报道PD-L1特异性纳米抗体NM01的189.6倍。

本发明报道另一种基于纳米抗体WW102融合蛋白ABDWW102的分子影像探针[⁶⁸Ga]Ga NOTA-ABDWW102，其中PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白ABDWW102不仅能与人PD-L1高亲和力结合(亲和力为3.714pM)，还能与人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)及鼠血清白蛋白(murine serum albumin，MSA)高亲和力结合，亲和力分别为3.382pM和52.74pM。

ABDWW102能与血清蛋白高效结合，因此其在体循环时间显著长于单价纳米抗体WW102的在体循环时间，正电子核素⁶⁸Ga半衰期仅为1.1h，较难匹配ABDWW102在体循环时间。因此，本发明进一步公布一种正电子核素⁶⁴Cu(T_1/2＝12.7h)标记PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白探针[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102。

本发明所公布一种PD-L1特异性纳米抗体探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102，及两种纳米抗体融合蛋白探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102和[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102，均有无创、精准、高效探测人PD-L1的表达。

相比传统^99mTc标记纳米抗体探针(例如^99mTc-NM01，J Nucl Med.2019；60(9):1213-1220.)，本发明所报道PD-L1纳米抗体探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102具有亲和力显著提高、正常组织摄取非特异性摄取明显降低、且图像质量明显提高的特点；相比传统⁸⁹Zr标记单克隆抗体(例如⁸⁹Zr-atezolizumab，Nat Med.2018；24:1852–1858.)，本发明所报道PD-L1纳米抗体融合蛋白探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102和[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102同样具有亲和力显著提升的优势，更值得一提的是，上述探针对正常组织器官的辐射剂量明显更低，因为所使用正电子核素半衰期较短(⁸⁹Zr、⁶⁴Cu和⁶⁸Ga半衰期分别为78.4h、12.7h和1.1h)、且所使用靶向载体在体循环更短(单克隆抗体循环时间>纳米抗体融合蛋白循环时间>纳米抗体循环时间)。

本发明所公布探针，具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低、易于临床转化等优点。

目前，临床检测PD-L1表达水平主要依赖于手术切除标本或穿刺活检组织的免疫组织化学染色，但免疫组织化学染色存在取样存在误差、无法评估异质性肿瘤PD-L1表达水平全貌及无法评估转移瘤PD-L1表达水平的缺陷。更值得一提的是，最近一项临床研究表明，目前用于检测PD-L1表达水平的几种免疫组织化学染色方法的检测效能存在显著差异，且同一方法在不同样本间的染色结果差异较大(J Thorac Oncol.2017；12:208–222.)。因此，在精准医学、免疫治疗的时代，临床亟需可用于无创可视化PD-L1异质性表达的新方法及新策略。申请人团队及同行的研究表明，基于抗体、纳米抗体分子影像探针的免疫PET显像是肿瘤关键靶点及免疫检查点无创可视化的利器、是精准医学时代体内伴随诊断的理想选择(Chem Rev.2020；120(8):3787-3851.)。

本发明在开发超高亲和力PD-L1特异性纳米抗体WW102的基础上，进一步开发了三种正电子核素标记纳米抗体及纳米抗体融合蛋白分子影像探针。其中[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102的特点是可实现同日显像，即在注射探针后的1-2h即可患者显像过程，临床转化应用便捷，并且临床推广应用潜力较大。但是，几乎所有放射性核素标记单价纳米抗体分子影像探针在肾脏富集较高，有造成潜在肾毒性的可能。

在成功开发单价纳米抗体分子影像探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102的基础上，本发明进一步报道了药代动力学更优、亲和力更高的纳米抗体融合蛋白ABDWW102，该融合蛋白的特异点具有双特异性，不仅可以结合人/鼠血清蛋白，还能结合人PD-L1蛋白，其与人PD-L1蛋白的亲和力显著高于WW102与人PD-L1的亲和力(4.12倍)。更进一步，运用不同正电子核素标记纳米抗体融合蛋白ABDWW102，本发明创制了两种新型探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102和[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102。上述探针肾脏富集显著低于单价纳米抗体探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102，因此导致肾毒性的可能性明显降低。相比[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102，[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102显像性能更优、图像质量更佳，更有利于PD-L1的精准可视化。

附图说明

图1是放射性核素标记分子影像探针的一个示例性实例的示意图；

图2是本发明所公布的抗PD-L1特异性高亲和力纳米抗体WW102的SDS-PAGE测定其表达情况的实验结果图；

图3是本发明所公布的纳米抗体WW102与人PD-L1蛋白的亲和力测定结果；

图4是本发明所公布的纳米抗体WW102在与NOTA偶联之后与人PD-L1蛋白的亲和力测定结果；

图5是使用⁶⁸Ga标记纳米抗体WW102所构建的探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102的质量控制图；

图6是本发明所公布的探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102在RKO结肠癌肿瘤模型中的PET/CT显像图；

图7是本发明所公布的探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102在RKO结肠癌肿瘤模型中的ROI及体外生物分布图；

图8所公布的抗PD-L1特异性高亲和力纳米抗体融合蛋白ABDWW102的SDS-PAGE测定其表达情况的实验结果图；

图9是本发明所公布的纳米抗体融合蛋白ABDWW102与人PD-L1蛋白的亲和力测定结果；

图10是本发明所公布的纳米抗体融合蛋白ABDWW102在与NOTA偶联之后与人PD-L1蛋白的亲和力测定结果；

图11是本发明所公布的纳米抗体融合蛋白ABDWW102在与DFO偶联之后与人PD-L1蛋白的亲和力测定结果；

图12是本发明所公布的纳米抗体融合蛋白ABDWW102在体内与人及鼠血清白蛋白结合的示意图；

图13是本发明所公布的纳米抗体融合蛋白ABDWW102与人及鼠血清白蛋白结合的亲和力测定结果；

图14是使用⁶⁸Ga标记纳米抗体融合蛋白ABDWW102所构建的探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102的质量控制图；

图15是本发明所公布的探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102在RKO结肠癌肿瘤模型中的多时间点PET/CT显像图；

图16是本发明所公布的探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102在RKO结肠癌肿瘤模型中的ROI及体外生物分布图；

图17是本发明所公布的探针[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102在RKO结肠癌肿瘤模型中的多时间点PET/CT显像图；

图18是本发明所公布的探针[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102在RKO结肠癌肿瘤模型中的体外生物分布图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。需要说明的是，本发明并不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂，并且同样可改变。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。

实施例1：抗PD-L1特异性高亲和力纳米抗体的制备

本发明的抗PD-L1特异性高亲和力纳米抗体WW101-108通过用PD-L1蛋白胞外域多次免疫健康羊驼(Vicugnapacos)、噬菌体筛选及酶联免疫方法(ELISA)获得。纳米抗体WW102、WW101、WW103、WW104、WW105、WW106、WW107和WW108分别具有其具有如序列表中的SEQID No.4、6、11、16、21、26、31和36所示的氨基酸序列，以及如序列表中的SEQ ID No.5、7、12、17、22、27、32和37所示的基因序列。

然后在HEK293细胞中重组表达单价纳米抗体WW101-108，其具体步骤如下：质粒抽提、HEK293瞬转表达、抗体纯化及抗体基础质量控制。

下面以WW102为例，所述质粒抽提所使用的实验材料及实验步骤如下：

实验材料：

1)大量抽提试剂盒；

2)70％乙醇：取无水乙醇375mL加入到125mL的灭菌去离子水中，混匀后4℃保存；

3)异丙醇；

4)缓冲液P1：提前加入600μL Rnase A(20mg/mL)至120mL的P1溶液中，使Rnase A终浓度在100μg/mL。

实验步骤：

1)取50mL培养(15小时)的菌液加入做好标记干净的50mL离心管中，核对编号是否一致，4℃、5000rpm离心10分倒净上清。

2)向该离心管中加入5mL已加好Rnase A的悬浮液缓冲液P1,用漩涡混合器彻底悬浮细菌沉淀。

3)向该离心管中加入5mL的缓冲液P2(冬天放37℃预热20分钟)，立即轻柔地颠倒混匀，室温放置4分钟。此时菌液由浑浊变为清亮粘稠液体(若不是清亮粘稠液体，呈现浑浊或发白及时汇报并在表单上做上标记)。

4)向该离心管中加入5mL缓冲液P3，立即轻柔地颠倒混合,此时出现白色絮状沉淀。

5)4℃、9000rpm离心10分钟，上清用滤纸过滤至做好标记的干净的50mL离心管中，核对编号是否一致。

6)向收集的滤液中加入2mL的ER缓冲液，上下颠倒充分混匀，冰浴30分钟。

7)柱平衡：在收集菌液离心的过程中，将空柱子置于离心管架上，用ddH₂O加满空柱，清洗填料，再用洗脱液加满空柱平衡填料。

8)上样：将ER缓冲液处理后的上清在重力下过已平衡的柱子。

9)将柱子内加满Wash缓冲液重力下洗柱子一次。

10)将柱子放入做好标记的干净的50mL离心管中，核对编号是否一致。用5mL洗脱缓冲液重力下洗脱质粒。

11)向收集的滤液中加入5mL冰冷异丙醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心18min，小心轻轻倒去上清液，将其倒置在吸水纸上，随时观察沉淀的位置，防止沉淀被倒掉。

12)加入10mL、70％冰冷的乙醇充分漂洗沉淀，12000rpm离心10分钟。轻轻倒去上清液，将其倒置在吸水纸，随时观察沉淀的位置，防止沉淀被倒掉，最后将沉淀的位置做上标记。

13)将离心管于超净工作台内敞口放置10-20分钟左右，以使乙醇充分挥发。向离心管中加入500μL超纯水，用移液枪充分溶解沉淀。

14)将溶解液转移至干净的已做好标记的1.5mL离心管中，震荡混匀后取样检测浓度及内毒素水平。

所述HEK293瞬转表达所使用的实验材料及实验步骤如下：

实验材料：摇床、离心机、水浴锅、Expi293培养液、转染试剂、各种规格的移液管、各种规格的摇瓶。

试剂	厂商	编号
			293培养液	百英生物	BY20220701
293转染试剂	百英生物	BY20220701

实验步骤：

1)细胞培养。

2)瞬时转染与表达：30mL表达。

溶液1：用1mL培养液稀释60μg质粒，混匀；

溶液2：用1mL培养液稀释15μL转染试剂，混匀；

将溶液2加入溶液1中，混匀，37℃孵育15分钟后，将混合转染液逐滴加入细胞液中，边摇边加，放至摇床培养，表达一周，收集上清，8000rpm离心5min。

所述抗体纯化所使用的实验材料及实验步骤如下：

实验材料：搅拌器、1xPBS、咪唑、Ni-Smart预装柱、各种规格的离心管：

试剂	厂商	编号
			1xPBS	百英生物	BY20220807
150mM咪唑PH8.0	百英生物	BY20220801
			5mM咪唑PH8.0	百英生物	BY20220801

实验步骤：Ni-Smart亲和层析柱纯化

1)平衡层析柱:1xPBS，流速1mL/min，20mL

2)上样：流速1mL/min

3)洗杂:1xPBS，流速1mL/min，20mL；5mM咪唑，流速1mL/min

4)洗脱：15 0mM咪唑，1mL/min，分管收集，每管约500uL。共收集10管，使用NanoDrop仪器读取280nm吸光度值。

5)透析：将高浓度蛋白吸至透析袋放1XPBS的烧杯中透析。

所述抗体基础质量控制所使用的实验材料及实验步骤如下：

1)浓度检测。

2)纯度检测(SDS-PAGE)，检测结果如图2所示。

3)内毒素检测：

实验材料：旋涡振荡器、电热恒温培养箱、内毒素工作标准品、鲎试剂、内毒素检查用水。

实验步骤：

1)样品阳性对照液配制：2倍供试液浓度溶液+内毒素标准品(1.00EU/ml)，1:1混合。

2)供试液制备：

样品稀释倍数：MVD＝C·L/λ

*注：MVD：供试品最大有效稀释倍数；L：供试品细菌内毒素限值(1EU/mg)

C:供试品浓度；λ：鲎试剂标示灵敏度；110uL供试液取样量＝C/MVD*110uL。

鲎试剂(0.25EU/mL)	内毒素检查用水	样品
			阴性对照管	200uL	无
阳性对照管	100uL	100uL内毒素标准品(0.50EU/mL)
			样品阳性对照管	100uL	100uL样品阳性对照液
供试品管	100uL	100uL供试液

封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃恒温培养箱孵育60min

实验结果：鲎试剂状态是澄清透明不凝固。

实验结论：通过内毒素检测，结果是<1EU/mg，符合要求。

从以上结果可知，本实施例的抗PD-L1特异性高亲和力纳米抗体WW102在HEK293细胞中良好表达，可溶表达量为29.4-39.5mg/L。SDS-PAGE结果显示WW102的纯度大于95％(图2)。通过Biacore测定亲和力，WW102与人重组PD-L1蛋白(PD1-H5229，ACRO BiosystemsGroup)的亲和力极高，为15.29pM(图3)，显著高于同类纳米抗体的亲和力。

同样地，还证实了本发明的其他抗PD-L1特异性亲和力纳米抗体WW101和WW103-108也对人重组PD-L1蛋白具有很高的亲和力。

实施例2：⁶⁸Ga标记PD-L1特异性纳米抗体探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102的制备(示意图如图1所示)

将1mg WW102溶于1mL磷酸盐缓冲液(PBS)，用0.1mL 0.1M碳酸钠(Na₂CO₃，PH＝11.4)缓冲液将纳米抗体溶液pH调至9.0–10，反应体系体积1.1mL。以p-SCN-Bn-NOTA/WW102摩尔比为10:1，将新鲜溶于二甲基亚砜(DMSO)的p-SCN-Bn-NOTA(CAS Number：147597-66-8；Macrocyclics)加至上述纳米抗体溶液。将反应体系置于室温反应2小时，然后以PBS作为流动相，用预平衡的PD-10脱盐柱(GE Healthcare)纯化经p-SCN-Bn-NOTA修饰的纳米抗体，收集NOTA-WW102；再用截断值为10KDa的超滤管(Merck Millipore)浓缩，用NanoDrop测定NOTA-WW102浓度，分装置于-20℃备用。通过Biacore测定亲和力，与双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA(B-605，147597-66-8；Macrocyclics)随机偶联后，WW102对PD-L1的亲和力为47.23pM(图4)。

用4mL 0.05M盐酸溶液(HCl)淋洗锗镓发生器(Eckert&Ziegler RadiopharmaInc)，收集同等体积活度约370–555MBq的⁶⁸Ga淋洗液；取活度最高的中间段⁶⁸Ga淋洗液2mL，加0.1mL1M乙酸钠溶液(NaoAc)调节⁶⁸Ga淋洗液pH至4.0–4.5；取经偶联备用的NOTA-WW102100–200μg加至⁶⁸Ga淋洗液，反应体系体积<2.5mL；将反应体系置于恒温振荡器在室温反应5–10分钟；标记反应结束后以PBS作为流动相，使用预平衡的PD-10脱盐柱分离游离⁶⁸Ga、纯化终产物；按照上述步骤所得未衰减校正放射化学产率(Radiochemical yield，RCY)>50％。

[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102质量控制步骤如下：吸取10μL[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102在硅胶板上点样，用0.1M柠檬酸钠溶液(pH＝5)作为流动相，用放射性薄层色谱仪(Radio-TLC，Eckert&Ziegler Radiopharma Inc)测定探针的放射化学纯度(Radiochemical purity，RCP)，本发明所制备探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102的放射化学纯度均大于99％(图5)。

实施例3：[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102免疫PET显像通过无创可视化PD-L1表达诊断结直肠癌本研究所涉及的⁶⁸Ga标记探针的小动物PET/CT显像采集均使用IRIS小动物PET/CT扫描仪(Inviscan Imaging Systems)完成。每只皮下RKO肿瘤Balb/c裸鼠经尾静脉注射3.7-7.4MBq制备成功的[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102，在注射后的1小时用混有氧气的异氟烷(浓度为2％)麻醉小鼠，并将进入深度麻醉状态的小鼠以仰卧位姿势置于PET/CT扫描床上，续惯采集PET和CT图像，用IRIS系统自带软件完成图像重建，如图6所示，[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102探针主要通过肾脏排泄，肝脏也有少量的摄取，肿瘤部位可见探针的明显富集。如图7左半部分所示，用OsiriX Lite图像处理工作站(Pixmeo SARL)在重建后的PET图像上勾画肿瘤及主要组织脏器(心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肌肉)等感兴趣区(Region of interest，ROI)，以％ID/g(percent of injected dose per gram)为单位计算其放射性摄取值，以定量分析探针在体内的药代动力学，可以看出，肿瘤部位的摄取仅低于肾脏和肝脏。在PET/CT显像结束后，采用颈椎脱臼方法处死小鼠，收集小鼠的肿瘤及其他组织脏器，使用伽马计数仪进行放射性计数，以行体外生物分布实验，结果与PET/CT显像结果以及ROI结果一致，肿瘤部位有较明显的摄取，如图7右半部分所示。上述结果表明[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102探针可无创可视化肿瘤内部PD-L1表达情况。

因此，本实施例证明本发明的⁶⁸Ga标记PD-L1特异性纳米抗体探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102在RKO模型(PD-L1表达阳性)中可以无创、精准检测PD-L1的异质性表达。

同样地，还使用如上所述的方法制备了本发明的其他抗PD-L1特异性亲和力纳米抗体的⁶⁸Ga标记的探针，即[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW101和[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW103-108，并证实其也可以无创、精准检测PD-L1的异质性表达。

实施例4：PD-L1特异性纳米抗体的融合蛋白ABDWW102的制备

PD-L1特异性纳米抗体的融合蛋白ABDWW102的制备方法与实施例1中所述的制备WW102的方法相同，但表达体系为200mL。表达结果如下：

1)浓度检测。

2)纯度检测(SDS-PAGE)，检测结果如图8所示。

3)内毒素检测结果如下：

封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃恒温培养箱孵育60min；

实验结果：鲎试剂状态是澄清透明不凝固。

实验结论：通过内毒素检测，结果是<1EU/mg，符合要求。

从以上结果可知，本实施例的纳米抗体融合蛋白ABDWW102在HEK293细胞中良好表达，可溶表达量为75.9-76.6mg/L。SDS-PAGE结果显示WW102的纯度大于95％(图8)。通过Biacore测定亲和力，ABDWW102与人重组PD-L1蛋白(PDL1-H5229，ACRO Biosystems Group)的亲和力极高，为3.71pM(图9)。

进一步，纳米抗体融合蛋白ABDWW102不仅能与人PD-L1高亲和力结合，还能与人血清白蛋白(HSA)及鼠血清白蛋白(MSA)高亲和力结合(图12)。Biacore亲和力测定结果显示，ABDWW102与HSA与MSA的亲和力分别为3.38pM和52.74pM(图13)。通过以上数据可知，纳米抗体融合蛋白ABDWW102与HSA亲和力显著高于与MSA亲和力。

同样地，还使用如上所述的方法制备了本发明的其他抗PD-L1特异性亲和力纳米抗体的融合蛋白，即ABDWW101和ABDWW103-108，并证实其也具有与ABDWW102类似的效果。

实施例5：⁶⁸Ga标记PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102的制备

将1mg ABDWW102溶于1mL磷酸盐缓冲液(PBS)，用0.1mL 0.1M碳酸钠(Na₂CO₃，PH＝11.4)缓冲液将纳米抗体溶液pH调至9.0–10，反应体系体积1.1mL。以p-SCN-Bn-NOTA/ABDWW102摩尔比为10:1，将新鲜溶于二甲基亚砜(DMSO)的p-SCN-Bn-NOTA(CAS Number：147597-66-8；Macrocyclics)加至上述纳米抗体融合蛋白溶液。将反应体系置于室温反应2小时，然后以PBS作为流动相，用预平衡的PD-10脱盐柱(GE Healthcare)纯化经p-SCN-Bn-NOTA修饰的纳米抗体，收集NOTA-ABDWW102；再用截断值为10KDa的超滤管(MerckMillipore)浓缩，用NanoDrop测定NOTA-ABDWW102浓度，分装置于-20℃备用。通过Biacore测定亲和力，在与双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA(B-605，147597-66-8；Macrocyclics)随机偶联后，ABDWW102对PD-L1的亲和力为79.51pM(图10)，在与双功能螯合剂p-SCN-Bn-去铁胺(B-705,1222468-90-7；Macrocyclics)随机偶联后，其亲和力为105.6pM(图11)。

[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102探针的制备方式及质量控制方法较实施例2所述[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW102探针的方法一致。图14展示了所制备的[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102探针的体外放射化学纯度高达99％。

实施例6：[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102通过免疫PET显像无创可视化PD-L1表达诊断结直肠癌

将3.7-7.4MBq制备成功的[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102探针通过尾静脉注射入皮下RKO肿瘤Balb/c裸鼠，分别在注射后0.5小时、2小时、4小时和6小时行PET/CT显像，图像采集方式与前述一致。如图15所示，随着时间的增加，探针在肿瘤部位的摄取逐渐增加，心脏和肾脏的探针富集逐渐减少。图16左半部分的ROI数据分析结果证实了PET/CT显像所观察到的结果，通过统计分析，肿瘤部位探针的摄取值在0.5小时和6小时有显著差异(P<0.05)。在6小时显像结束后行体外生物分布实验，结果显示肿瘤部位有较高的摄取。

因此，本实施例证实[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW102可有效可视化RKO肿瘤PD-L1的表达水平。

同样地，还使用如上所述的方法制备了本发明的其他抗PD-L1特异性亲和力纳米抗体融合蛋白的⁶⁸Ga标记的探针，即[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW101和[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW103-108，并证实其也可以有效可视化RKO肿瘤PD-L1的表达水平。

然而，从ROI和生物分布数据可以看到，在6小时的时间点，循环中仍有较多的探针，说明在6小时时探针在体内并未达到平衡，可见正电子核素⁶⁸Ga与纳米抗体融合蛋白ABDWW102在体循环时间不能完全匹配，因此不能有效评估纳米抗体融合蛋白在体循环时间和靶向性能。为此，本发明更进一步制备了长半衰期正电子核[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102。

实施例7：⁶⁴Cu标记PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白探针[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102的制备

该探针所使用前体同实施例5所述，⁶⁴Cu标记步骤如下：使用固体靶生产⁶⁴Cu，然后收集259-296MBq ⁶⁴Cu核素，加入300μL 250mmol/L的乙酸铵，调节pH为5.5左右，然后加入500μg左右的前体，即NOTA-ABDWW102，将反应体系置于恒温振荡器在42℃条件下反应30分钟；标记反应结束后以PBS作为流动相，使用预平衡的PD-10脱盐柱分离游离⁶⁴Cu、纯化终产物。

[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102质量控制步骤如下：吸取10μL[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102在硅胶板上点样，用50mmol/L的EDTA(pH＝5)作为流动相，用放射性薄层色谱仪(Radio-TLC，Eckert&Ziegler Radiopharma Inc)测定探针的放射化学纯度(Radiochemicalpurity，RCP)，本发明所制备探针[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102的放射化学纯度满足体内显像的要求。

实施例8：[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102免疫PET显像无创可视化PD-L1表达诊断结直肠癌

将3.7-7.4MBq制备成功的[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102探针通过尾静脉注射入皮下RKO肿瘤Balb/c裸鼠，分别在注射后1小时、4小时、24小时和48小时行PET/CT显像。如图17所示，随着时间的增加，探针在肿瘤部位的摄取逐渐增加，心脏和肾脏的探针富集逐渐减少，在48小时的时间点可以看出，肿瘤部位的摄取值已明显高于心脏和肾脏等部位。图18的生物分布数据证实了PET/CT显像所观察到的结果。使用⁶⁴Cu标记纳米抗体融合蛋白ABDWW102，明确了其在体内较为完整的药代动力学，充分证实了其明显延长的在体循环时间及对于肿瘤PD-L1表达的可视化能力。纳米抗体融合蛋白ABDWW102体内显著延长的循环时间表明其可作为治疗载体实现靶向PD-L1的抗体偶联药物治疗或放射免疫治疗。

同样地，还使用如上所述的方法制备了本发明的其他抗PD-L1特异性亲和力纳米抗体融合蛋白的⁶⁴Cu标记的探针，即[⁶⁴Cu]Ga-NOTA-ABDWW101和[⁶⁴Cu]Ga-NOTA-ABDWW103-108，并证实其也具有与[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW102类似的效果。

因此，本发明已证实所制备的PD-L1特异性纳米抗体探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-WW101-108，及两种纳米抗体融合蛋白探针[⁶⁸Ga]Ga-NOTA-ABDWW101-108和[⁶⁴Cu]Cu-NOTA-ABDWW101-108，均有无创、精准、高效探测人PD-L1的表达。

需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种PD-L1特异性纳米抗体，其特征在于，包含：

(7)具有SEQ ID No.33所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.34所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.35所示的氨基酸序列的CDR3，

优选地，所述PD-L1特异性纳米抗体具有SEQ ID No.4、6、11、16、21、26、31或36所示的氨基酸序列。

2.一种PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白，其特征在于，包含根据权利要求1所述的纳米抗体和用于延长体内半衰期的部分，

优选地，用于延长体内半衰期的部分包括血清白蛋白或其片段、聚乙二醇、结合血清白蛋白的结构域或聚乙二醇-脂质体复合体，

优选地，所述PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白具有SEQ ID No.38所示的氨基酸序列。

3.一种多核苷酸，其特征在于，编码根据权利要求1所述的PD-L1特异性纳米抗体或根据权利要求2所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白，

优选地，所述多核苷酸具有SEQ ID No.5、7、12、17、22、27、32、37或39所示的核苷酸序列。

4.一种载体，其特征在于，包含根据权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求4所述的载体。

6.一种PD-L1特异性分子影像探针，其特征在于，包含经放射性核素标记的根据权利要求1所述的PD-L1特异性纳米抗体或根据权利要求2所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的分子影像探针，其特征在于，根据权利要求1所述的PD-L1特异性纳米抗体或根据权利要求2所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白经由双功能螯合剂被放射性核素标记，

优选地，双功能螯合剂选自p-SCN-Bn-NOTA或p-SCN-Bn-去铁胺。

8.根据权利要求6或7所述的分子影像探针，其特征在于，所述放射性核素选自Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、I-124、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188、Y-86、Mn-52、Sc-44、Lu-177、Y-90、Ac-225、At-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra-223、Ru-106、Na-24、Sr-89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169或Yb-177，

优选地，所述放射性核素选自Ga-68，

优选地，根据权利要求2所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白经Cu-64标记。

9.一种用于检测PD-L1的表达水平、诊断PD-L1相关的肿瘤、预测PD-L1相关肿瘤的治疗效果或治疗PD-L1相关肿瘤的试剂盒或组合物，其特征在于，包含根据权利要求1所述的PD-L1特异性纳米抗体、根据权利要求2所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白、根据权利要求3所述的多核苷酸、根据权利要求4所述的载体、根据权利要求5所述的宿主细胞或根据权利要求6-8中任一项所述的分子影像探针。

10.根据权利要求1所述的PD-L1特异性纳米抗体、根据权利要求2所述的PD-L1特异性纳米抗体融合蛋白、根据权利要求3所述的多核苷酸、根据权利要求4所述的载体、根据权利要求5所述的宿主细胞或根据权利要求6-8中任一项所述的分子影像探针在制备用于检测PD-L1的表达水平、诊断PD-L1相关的肿瘤、预测PD-L1相关肿瘤的治疗效果或治疗PD-L1相关肿瘤的试剂盒或药物中的用途。