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WO2013002354A1 - 生体試料の前処理方法、ｒｎａの検出方法及び前処理キット - Google Patents

生体試料の前処理方法、ｒｎａの検出方法及び前処理キット Download PDF

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Publication number
WO2013002354A1
WO2013002354A1 PCT/JP2012/066622 JP2012066622W WO2013002354A1 WO 2013002354 A1 WO2013002354 A1 WO 2013002354A1 JP 2012066622 W JP2012066622 W JP 2012066622W WO 2013002354 A1 WO2013002354 A1 WO 2013002354A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biological sample
pretreatment
rna
lactoferrin
lysozyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/066622
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
林崎　良英
健悟 臼井
砂織 合田
和仁 野村
雄輝 川井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dnaform KK
Original Assignee
Dnaform KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dnaform KK filed Critical Dnaform KK
Priority to US13/807,605 priority Critical patent/US9518901B2/en
Priority to CN201280001834.3A priority patent/CN103097531B/zh
Priority to JP2012549589A priority patent/JP5704543B2/ja
Priority to EP12801801.7A priority patent/EP2574669B1/en
Publication of WO2013002354A1 publication Critical patent/WO2013002354A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a pretreatment method for a biological sample containing RNA, a detection method for RNA, and a pretreatment kit.
  • a virus gene is amplified and detected.
  • pretreatment of the biological sample is performed to remove or inactivate the inhibitor.
  • a pretreatment method for example, there is a method in which a biological sample is treated with a surfactant, a chaotropic agent, heating or the like, and further purified with a solid carrier or ion exchange resin (Patent Documents 1 to 3).
  • Patent Documents 1 to 3 these methods are complicated because they require special equipment and a plurality of operation steps.
  • RNA gene is converted to DNA using reverse transcriptase and then the amplification operation is performed. Therefore, RNase and reverse transcriptase inactivating substances are also removed or inactivated. Since it is necessary, the conventional pretreatment method further requires a complicated operation.
  • addition of polyamine or sulfated polysaccharide is known as a pretreatment method for biological samples containing RNA viruses (Patent Document 4).
  • Patent Document 4 addition of polyamine or sulfated polysaccharide further complicates pretreatment, and polyamine and sulfated polysaccharide may bind to RNA gene and DNA produced by reverse transcriptase. May also be inhibited.
  • influenza virus is a kind of RNA virus, but it is clinically extremely important to determine whether the influenza virus is a new type or a seasonal type. Moreover, it is common to use a nasal mucosa as a biological sample for detection of influenza virus. And detection of influenza virus needs to be performed in the clinical field. For this reason, establishment of a rapid and simple detection method for influenza virus using human nasal mucosa is desired, and such a request is not limited to influenza virus, but is also required for RNA virus detection in general. Furthermore, there is a demand not only for detection of RNA viruses but also for detection of RNA itself other than genes.
  • JP 2009-247250 A International Publication WO2007 / 094506 Pamphlet JP 2006-87394 A Japanese Patent Laid-Open No. 2001-29078
  • the present invention is used in a biological sample pretreatment method that enables rapid and simple detection of RNA from a biological sample containing RNA, an RNA detection method using the same, and the biological sample pretreatment method.
  • the purpose is to provide a pretreatment kit.
  • the pretreatment method of the present invention is a pretreatment method of a biological sample containing RNA,
  • the biological sample includes lactoferrin, and the biological sample is subjected to a treatment for inhibiting RNA degradation activity of lactoferrin.
  • the detection method of the present invention is a method for detecting RNA in a biological sample
  • the biological sample contains lactoferrin, and includes a pretreatment step of pretreating the biological sample, and an RNA amplification detection step of detecting by amplifying the RNA in the pretreated biological sample,
  • the pretreatment step is performed by the biological sample pretreatment method of the present invention.
  • the pretreatment kit of the present invention is a pretreatment kit for a biological sample containing RNA,
  • the biological sample contains lactoferrin, and the pretreatment kit contains an inhibitor of RNA degradation activity of lactoferrin.
  • the present inventors first found out that the factor that inhibits the reverse transcription / DNA amplification reaction using RNA as a template contained in human nasal mucosa samples is the RNA degradation activity by lactoferrin. And it discovered that RNA decomposition
  • RNA can be detected quickly and easily from a biological sample containing RNA.
  • FIG. 1 is a graph showing an example of the detection method of the present invention.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram showing the presence of lactoferrin and lysozyme C in human nasal mucosa.
  • FIG. 3 is an electrophoretogram showing the inhibitory effect of iron and carbonate ions on lactoferrin RNA degradation activity.
  • FIG. 4 is an electrophoretogram showing an example of the effect of heat treatment of iron ions and carbonate ions.
  • FIG. 5 is a graph showing an example of inhibition of the reverse transcription inhibitory activity of lysozyme C by iron ions and carbonate ions.
  • FIG. 6 is an electrophoretogram showing an example of the synergistic effect of iron ions and carbonate ions and SDS.
  • FIG. 1 is a graph showing an example of the detection method of the present invention.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram showing the presence of lactoferrin and lysozyme C in human nasal mucosa.
  • FIG. 7a is a diagram showing an example of the mechanism of a nucleic acid amplification reaction using a turnback primer and a folding primer.
  • FIG. 7b is a diagram showing an example of the mechanism of a nucleic acid amplification reaction using a turnback primer and a folding primer.
  • FIG. 8 is a graph showing an example of the influence of SDS removal by addition of alumina.
  • FIG. 9 is a graph showing an example of the influence of an increase in iron ion concentration and SDS removal by an ultrafiltration filter.
  • FIG. 10 is a graph showing an example of mitigating effects of SDS inhibition of nucleic acid amplification of SDS during nucleic acid amplification reaction by Triton X-100.
  • FIG. 11 is a graph showing that an RNA virus contained in human nasal mucosa could be detected by RT-SmartAmp method.
  • a lactoferrin RNA degradation activity inhibition treatment on the biological sample by adding a lactoferrin RNA degradation activity inhibitor to the biological sample.
  • the biological sample is an animal nasal mucosa, sinus mucosa, tracheal mucosa, saliva, secretion from the oral cavity or pharynx, tears, milk, bile, blood (white blood cells), cervical mucosa.
  • it contains mucosa, amniotic fluid, or urine of internal and external genitals.
  • the animal is preferably a human.
  • the biological sample preferably contains human nasal mucosa.
  • a reverse transcription inhibitory activity inhibition treatment of lysozyme C (Lysozyme C) is further performed on the biological sample.
  • reverse transcription inhibition activity inhibition treatment of lysozyme C (Lysozyme C) is performed on the biological sample by adding a reverse transcription inhibition activity inhibitor of lysozyme C (Lysozyme C) to the biological sample. Is preferred.
  • At least one of the RNA degradation activity inhibitor and the reverse transcription inhibition activity inhibitor contains an iron ion agent and a carbonate ion agent.
  • the “iron ion agent” means a substance capable of supplying iron ions to the biological sample.
  • the “carbonate ion agent” refers to a substance capable of supplying carbonate ions to the biological sample.
  • the pretreatment method of the present invention it is preferable to heat-treat the biological sample to which the iron ion agent and the carbonate ion agent are added. This is because this heat treatment can efficiently inhibit RNA degradation activity and reverse transcription inhibition activity.
  • a surfactant may be further added to the biological sample.
  • a polar surfactant In order to expose the gene from the virus particle, it is necessary to remove the envelope of the virus using a nonionic surfactant, and the nonionic surfactant is selected from the iron ion agent and the carbonate ion of the present invention. There is a possibility of inhibiting the function of the agent. However, if it is a polar surfactant, the virus envelope can be removed without inhibiting the functions of the iron ion agent and the carbonate ion agent of the present invention.
  • the polar surfactant is preferably SDS. Since SDS may inhibit DNA polymerase during gene amplification, prior to gene amplification, potassium salt or alumina is added to a biological sample to aggregate SDS, and SDS is removed by centrifugation or filtration. It is preferable.
  • the RNA is amplified by a gene amplification method using reverse transcriptase.
  • the gene amplification method is preferably an isothermal amplification method using strand displacement DNA polymerase.
  • Step B is a technique in which a nonpolar surfactant is added in the gene amplification step, and the RNA gene is eluted from the virus particles by the effect of the nonpolar surfactant and heating during the gene amplification reaction.
  • Step A In the pretreatment process, the virus particles contained in the specimen are destroyed by a surfactant, and RNA is eluted from the virus. At the same time, the RNA degradation activity of lactoferrin and lysozyme C and the reverse transcription inhibitory activity are suppressed by the inhibition treatment.
  • Step B Nucleic acid amplification reaction containing a nonpolar surfactant after inhibiting the RNA degradation activity of lactoferrin and lysozyme C and the reverse transcription inhibitory activity by inhibiting treatment without destroying (holding) the virus particles in the specimen The step of eluting the RNA genome in the virus particle by the effect of a surfactant and heat denaturation and performing nucleic acid amplification from the virus genome.
  • the surfactant is preferably SDS.
  • the surfactant is preferably a nonpolar surfactant that does not inhibit the nucleic acid amplification reaction.
  • the pretreatment kit of the present invention preferably further contains a reverse transcription inhibitory activity inhibitor of lysozyme C (Lysozyme C).
  • At least one of the RNA degradation activity inhibitor and the reverse transcription inhibition activity inhibitor includes an iron ion agent and a carbonate ion agent. It is preferable that the iron ion agent and the carbonate ion agent are contained without being in contact with each other.
  • the RNA contained in the biological sample is not particularly limited, and includes all RNA taken from the living body, host RNA, and bacterial and fungal RNA.
  • RNA of a gene may be sufficient and RNA other than a gene may be sufficient.
  • the biological sample preferably contains an RNA virus, and particularly preferably an influenza virus.
  • the biological sample is a sample containing lactoferrin.
  • the biological sample is preferably a sample containing human lactoferrin.
  • Lactoferrin is known to be contained in most exocrine fluids in the body. Therefore, as the biological sample, for example, secretion from the upper respiratory tract mucosa such as nasal cavity, paranasal sinuses, larynx, trachea, bronchus, or lung, secretion from the oral cavity or pharynx (eg saliva etc.), Secretion fluid from the digestive tract mucosa, secretion from the mucosa of the internal / external genitalia (eg cervical canal), secretion from the mucosa of the renal urinary system, secretion from the intraperitoneal mucosa, secretion from the intrathoracic mucosa Biological samples including fluid, secretory fluid from the intracardiac mucosa, secretory fluid from the skin, lacrimal fluid, milk, bile, blood (white blood cells), amniotic fluid, urine, feces and the like.
  • the biological sample for example, secretion from the upper respiratory tract
  • samples such as secretion from mucous membranes such as nasal cavity and sinuses, saliva, tears, milk, bile, blood (white blood cells), secretion from cervix, amniotic fluid, urine, etc. are preferable, In fact, it is known to contain lactoferrin.
  • human nasal mucosa is particularly preferable.
  • the animal is preferably a human but may be an animal other than a human. Examples of animals other than humans include cattle, pigs, sheep, horses, camels, rats and the like.
  • lactoferrin is a protein that is expressed and secreted not only in the nasal mucosa but also in various tissues.
  • the CAGE method (Kanamori-Katayama M, et al) is one of the techniques for performing expression analysis using next-generation sequencers to determine the level of expression of RNA encoding the lactoferrin protein in various human tissues. Genome Res. (2011) May 19) The data analyzed and compared are obtained, and are shown in Table 1 for reference. As a result, it can be seen that there are various tissues having a high expression level of lactoferrin, suggesting the wide applicability of the pretreatment method of the present invention.
  • the human nasal mucosa can be collected, for example, by a nasal washing solution or a snout (nasal cavity), and more preferably by a swab.
  • the human nasal mucosa may be used as it is as a biological sample, or may be dispersed or dissolved in a physiological saline or a buffer solution as a biological sample.
  • As the buffer solution one having a buffering action against the hydrogen ion concentration in the acidic to neutral range can be used in order to prevent decomposition in alkalinization.
  • acetate buffer, phosphate buffer, tartrate buffer, borate buffer, citrate buffer, Tris buffer, phosphate buffered saline (PBS), and various Good buffers (MES, Bis) -Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS) can be used.
  • the factor that inhibits the reverse transcription / DNA amplification reaction using RNA in a biological sample as a template is the RNA degrading activity by lactoferrin. If the RNA degrading activity of lactoferrin is inhibited, RNA can be obtained without any special purification treatment. As described above, the point of the present invention is that it has been found that gene amplification of a virus is possible.
  • the treatment for inhibiting the RNA degradation activity of lactoferrin includes, for example, the addition of a lactoferrin RNA degradation activity inhibitor to the biological sample and the heat treatment of the biological sample.
  • the inhibition treatment may be performed, for example, by both the addition of an RNA degradation activity inhibitor and the heat treatment.
  • the temperature of the heat treatment is, for example, in the range of 25 to 100 ° C., preferably in the range of 30 to 75 ° C., and more preferably in the range of 37 to 65 ° C.
  • the heat treatment time is, for example, in the range of 1 to 60 minutes, preferably in the range of 2 to 45 minutes, and more preferably in the range of 5 to 30 minutes.
  • RNA degrading activity of the lactoferrin can be reduced by adding excessive RNA (decoy RNA) other than the target RNA of interest.
  • RNA degradation activity of lactoferrin various inhibitors can be used.
  • bovine placenta-derived RNase inhibitor generally used in molecular biology can be used.
  • specific IgG antibodies that can specifically bind to lactoferrin and inhibit RNA degradation activity, Affibody proteinaceous molecules, or RNA / DNA aptamers that can be screened as nucleic acid-derived specific binding molecules can be used.
  • low molecular organic compounds such as sulfates, sulfothioates, phosphates, sulfamates, and sulfochlorides found by in silico binding molecule search for lactoferrin can be used.
  • metal ions belonging to transition metals and typical metals can be preferably used.
  • metal ions include copper (Cu 2+ , Cu 3+ ), nickel (Ni 2+ ), iron (Fe 2+ , Fe 3+ ), gold (Au + , Au 3+ ), and transition metals.
  • Zinc (Zn 2+ ) can be used as a metal ion belonging to a typical metal. These metals can be used alone or as a mixed reagent of plural kinds.
  • lactoferrin RNA degradation activity it is more preferable to use an iron ion agent and a carbonate ion agent at the same time. This is because when lactoferrin becomes an apo body containing no iron (apolactoferrin), it causes high RNA degradation activity, and the lactoferrin crystal structure has a structure containing iron ions and carbonate ions in the metal binding domain. According to By simultaneously supplying carbonate ions to iron ions to apolactoferrin that does not contain metal ions, it is possible to efficiently transfer from apo bodies to holo bodies (hololactoferrin), and to suppress RNA degradation activity. Conceivable.
  • the iron ion agent alone has an activity of inhibiting the RNA degradation activity of lactoferrin
  • the iron ion agent alone when used, when the concentration of the iron ion agent is increased, the RNA degradation activity of the iron ion agent itself may be expressed.
  • the carbonate ion agent can react with the surplus iron ion agent to form insoluble iron carbonate (Fe 2 (CO 3 ) 3 ), as a means for suppressing the surplus iron ion itself from degrading RNA. It has the effect of. Therefore, if a carbonate ion agent is also added together with an iron ion agent, the RNA degradation activity of lactoferrin can be inhibited, and the RNA degradation activity of the iron ion agent itself can be inhibited.
  • iron ion agent those capable of supplying trivalent iron ions (Fe 3+ ) are preferable.
  • iron chloride (FeCl 3 ), iron nitrate (Fe (NO 3 ) 3 ), and iron sulfate (Fe 2 (SO 2 ) 4 ) 3 ) is preferable, and these aqueous solutions are more preferable. From the viewpoint of stability in an aqueous solution, it is preferable to use iron sulfate.
  • carbonate ion agent those capable of supplying carbonate ions (CO 3 2 ⁇ ) are preferable, and examples thereof include sodium hydrogen carbonate, and an aqueous solution of sodium hydrogen carbonate is preferable.
  • the concentration of Fe 3+ is in the range of 2 to 6 mM, and the concentration of CO 3 2 ⁇ is in the range of 5 to 20 mM. is there.
  • the concentrations of the iron ion agent and the carbonate ion agent for example, the concentration of Fe 2 (SO 4 ) 3 is in the range of 1 to 3 mM, and the concentration of NaHCO 3 is in the range of 5 to 20 mM. More preferably, the concentration of Fe 2 (SO 4 ) 3 is about 2.5 mM, and the concentration of NaHCO 3 is about 10 mM.
  • SDS which is the polar surfactant
  • alumina or the like is used as described above. It is preferable to remove SDS from the biological sample.
  • polar molecules other than SDS may be adsorbed on the alumina.
  • RNA and DNA contained in the biological sample are also adsorbed on the alumina and removed from the biological sample. It may be done.
  • SDS and iron ions form a precipitate by interaction. SDS can also be removed from the biological sample by utilizing this ability to form precipitates. From this viewpoint, it is preferable to set the concentration of iron ions contained in the biological sample high.
  • the concentration of the iron ion is preferably 1 mM or more, more preferably 2 mM or more, and further preferably 2.5 mM or more.
  • the upper limit of the iron ion concentration is not particularly limited, but is, for example, 10 mM or less or 5 mM or less.
  • a size exclusion filter (ultrafiltration filter) for the filtration.
  • the pore size of the ultrafiltration filter is 0.1 to 0.45 ⁇ m.
  • the thickness may be within a range of 0.22 ⁇ m.
  • trade name “Mirex HV (membrane pore diameter 0.22 ⁇ m)” manufactured by Millipore Corporation can be used.
  • Lysozyme C which is abundant in nasal mucosa samples, inhibits the reverse transcriptase activity that synthesizes DNA using RNA as a template.
  • a reverse transcription inhibitory activity inhibition treatment of lysozyme C includes, for example, addition of a reverse transcription inhibitory activity inhibitor of lysozyme C and heat treatment of the biological sample.
  • the inhibition treatment may be performed, for example, by both the addition of an RNA degradation activity inhibitor and the heat treatment.
  • RNA / DNA aptamer that can be screened can be used. More preferably, it can be suppressed by adding an iron ion agent (for example, one capable of supplying trivalent iron ions) and a carbonate ion agent.
  • the temperature of the heat treatment is, for example, in the range of 25 to 100 ° C., preferably in the range of 30 to 75 ° C., and more preferably in the range of 37 to 65 ° C.
  • the heat treatment time is, for example, in the range of 1 to 60 minutes, preferably in the range of 2 to 45 minutes, and more preferably in the range of 5 to 30 minutes.
  • the biological sample to which an iron ion agent and a carbonate ion agent are added is preferably heat-treated.
  • This heat treatment is considered to have the effect of causing the structure fluctuation of lactoferrin, and as a result, the action of iron ion agent and carbonate ion agent on lactoferrin can be improved and the RNA degradation activity can be further suppressed.
  • the conditions for the heat treatment are, for example, a temperature in the range of 37 to 60 ° C. and a time in the range of 5 to 30 minutes. For example, in the case of 37 ° C., the heat treatment is performed for 30 minutes, and in the case of 60 ° C., the heat treatment is performed for 5 minutes.
  • a trace amount of protein denaturant can be used as a process not involving the heat treatment described above.
  • guanidine hydrochloride guanidine thiocyanate
  • urea surfactants are shown below.
  • a polar surfactant is preferably an anionic one. Specifically, saponin, sodium octoate, sodium decanoate, sodium laurate, sodium myristate, sodium palmitate, sodium stearate, perfluorooctane Acid (PFOA), perfluorononanoic acid, sodium n-lauroylsarcosine, sodium cocoylglutamate, alphasulfo fatty acid methyl ester salt, sodium 1-hexanesulfonate, sodium 1-octanesulfonate, sodium 1-decanesulfonate, 1-dodecane Sodium sulfonate, perfluorobutane sulfonic acid, sodium linear alkylbenzene sulfonate, sodium naphthalene sulfonate,
  • RNA degradation activity of lactoferrin by an iron ion agent and a carbonate ion agent can be rapidly inhibited without performing the heat treatment.
  • the pretreatment of the human nasal mucosa sample with the addition of the polar surfactant is defined as a pretreatment technique according to the following step A. Step A: Viral particles contained in a specimen are destroyed by a polar surfactant in the pretreatment process, and RNA is eluted from the virus. At the same time, the RNA degradation activity of lactoferrin and lysozyme C and the reverse transcription inhibitory activity are inhibited by an inhibitor. A step of inhibiting and subjecting the pretreatment solution to nucleic acid amplification.
  • the RNA gene of the RNA virus can be amplified by the pretreatment of the present invention.
  • the RNA genome is released from the virus during the nucleic acid amplification reaction process.
  • a reverse transcription reaction is carried out at 50 to 60 ° C. in nucleic acid amplification from RNA, for example, a heat denaturation effect of the virus envelope can be expected, and the RNA genome can be released from the RNA virus.
  • a nonionic surfactant that has the effect of disrupting the virus envelope and does not inhibit the nucleic acid amplification reaction can be added to the nucleic acid amplification reaction solution.
  • nonionic surfactants include Tween (registered trademark) surfactants (Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80), Brij (registered trademark) surfactants (Brij-76, Brij-96, Brij-).
  • SDS which is the polar surfactant
  • SDS may inhibit DNA polymerase during gene amplification.
  • SDS is removed from the biological sample by the above-described method using alumina, the method of increasing the iron ion concentration and forming a precipitate of SDS and iron ions, and the like.
  • SDS may remain in the biological sample even after the SDS removal process.
  • a biological sample containing SDS is gene-amplified, it is preferable to add a nonionic surfactant that does not inhibit the aforementioned nucleic acid amplification reaction.
  • the nonionic surfactant may be added to the biological sample after the SDS removal treatment described above during gene amplification, or the SDS removal treatment described above may be performed.
  • the nonionic surfactant may be added to a biological sample that has not been subjected to gene amplification.
  • a nonionic surfactant may be added in advance to a reaction solution for nucleic acid amplification (gene amplification).
  • the nonionic surfactant is preferably Triton (registered trademark) X-100, and the addition amount of Triton (registered trademark) X-100 can be appropriately set depending on, for example, the concentration of SDS in the biological sample.
  • SDS is contained in the sample at 0.1%
  • Triton (registered trademark) X-100 is contained in the biological sample in the range of 0.1 to 1%.
  • the concentration of Triton® X-100 may be 0.5%.
  • SDS can be removed by adding a neutral potassium salt or alumina.
  • a neutral potassium salt potassium acetate, potassium citrate, potassium hydrochloride, potassium sulfate, and potassium nitrate can be used. More preferably, a water-soluble one is preferable, and potassium acetate is more preferable.
  • the alumina include alumina particles (having an average particle size of 1000 nm or less, preferably an average particle size of 200 nm or less, more preferably an average particle size of 20 to 100 nm).
  • activated alumina manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., molecular weight 101.96 can also be used.
  • the gene amplification method is not particularly limited, and examples thereof include a PCR method and an isothermal amplification method using a strand displacement DNA polymerase, and the isothermal amplification method is preferable.
  • examples of the isothermal amplification method include an SDA method (Japanese Patent Publication No. 7-114718) and an amplification method using the following turnback primer (TP), and among them, an isothermal amplification method using TP. Is preferred.
  • the turnback primer comprises a sequence (Ac ′) that hybridizes to the sequence (A) of the 3 ′ end portion of the target nucleic acid sequence at the 3 ′ end portion, and the sequence of the target nucleic acid sequence is based on the sequence (A).
  • the sequence (B ′) that hybridizes to the complementary sequence (Bc) of the sequence (B) existing on the 5 ′ side also comprises 5 ′ side of the sequence (Ac ′).
  • a symmetric form (TP-TP) using TP for both the forward primer and the reverse primer may be used, or TP is used for one of the forward primer and the reverse primer, and the other primer is used for the other.
  • An asymmetric form (TP-XP) using (XP) may be used.
  • TP-TP symmetrical form
  • LAMP method International Publication WO2000 / 028082 pamphlet
  • the LAMP method uses a pair of outer primers (OP-OP) in addition to a pair of TPs (TP-TP).
  • OP is a primer having a function of annealing on the 5 'side of TP in the template sequence and stripping off the TP extension chain by a strand displacement reaction.
  • Examples of other primers in the case of an asymmetrical form include general primers used in the PCR method and the following folding primer (FP).
  • FP folding primer
  • a combination of TP and FP is preferred.
  • SmartAmp method registered trademark
  • FIGS. 7a and 7b An example of a combination of TP and FP is shown in FIGS. 7a and 7b.
  • OP may be used. The use of OP may be used for at least one of the forward primer and the reverse primer.
  • the folding primer comprises two nucleic acid sequences comprising a sequence (Cc ′) that hybridizes to the sequence (C) of the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the target nucleic acid sequence at the 3 ′ end portion and hybridizes to each other. Is included on the 5 ′ side of the sequence (Cc ′).
  • TP-FP The mechanism of isothermal amplification using TP-FP is, for example, as follows.
  • a possible mechanism of action for the nucleic acid amplification reaction by TP and FP will be described with reference to FIG. 7 (FIGS. 7a and 7b).
  • FIG. 7 for simplification of description, the two sequences to be hybridized are mutually complementary sequences, but the present invention is not limited thereby.
  • TP hybridizes to the sense strand of the target nucleic acid, and the primer extension reaction occurs (FIG. 7 (a)).
  • a stem-loop structure is formed on the extended strand ( ⁇ ), whereby a new TP hybridizes to the sequence (A) on the target nucleic acid sense strand that has become a single strand (FIG.
  • a hairpin type double-stranded nucleic acid in which the extension strand ( ⁇ ) is bonded to the 3 ′ side of the extension strand (+) via the sequence (A) and the sequence (Bc) is generated, TP hybridizes to the sequence (A) and sequence (Bc) (FIG. 7 (g)), and an extended chain ( ⁇ ) is generated by the extension reaction (FIGS. 7 (h) and (i)).
  • a free 3 ′ end is provided by the folded sequence present at the 3 ′ end of the hairpin double-stranded nucleic acid (FIG. 7 (h)), and by an extension reaction therefrom (FIG.
  • a single-stranded nucleic acid having folding sequences at both ends and alternately containing extended strands (+) and extended strands ( ⁇ ) via sequences derived from TP and FP is generated (FIG. 7 (j)).
  • this single-stranded nucleic acid since the free 3 ′ end (starting point of complementary strand synthesis) is provided by the folded sequence present at the 3 ′ end (FIG. 7 (k)), the same extension reaction is repeated, The chain length is doubled per extension reaction (FIGS. 7 (l) and (m)).
  • the folded sequence present at the 3 ′ end provides a free 3 ′ end (complementary strand synthesis origin) (FIG. 7).
  • a stem-loop structure is formed at both ends by an extension reaction therefrom, and a single strand comprising an extended strand (+) and an extended strand (-) alternately via a sequence derived from a primer A nucleic acid is generated (FIG. 7 (o)).
  • the complementary strand synthesis starting point is sequentially provided by the loop formation at the 3 'end, so that elongation reactions occur one after another.
  • the single-stranded nucleic acid thus automatically extended contains a sequence derived from TP and FP between the extended strand (+) and the extended strand ( ⁇ ), so that each primer hybridizes. It is possible to cause an extension reaction by soy, and this significantly amplifies the sense strand and the antisense strand of the target nucleic acid.
  • RNA When amplifying an RNA gene, cDNA is generated using reverse transcriptase, and this cDNA is amplified.
  • the SmartAmp method in which RNA is amplified using reverse transcriptase in this way is referred to as the RT-SmartAmp method.
  • composition of the pretreatment kit of the present invention is not particularly limited.
  • the pretreatment kit of the present invention is divided into two liquids, liquid A and liquid B, and iron sulfate and sodium hydrogen carbonate are provided separately.
  • the solution A has a composition of 20 mM MES buffer (pH 5.8), 40 mM sodium hydrogen carbonate, 0.2% SDS.
  • Solution B has a composition of 5 mM iron sulfate, 40 mg / ml alumina. In this case, it is desirable to store the B solution containing iron sulfate in a shaded manner.
  • Liquid A and liquid B are preferably prepared as a 1: 1 mixed solution when the human nasal mucosa is suspended in a buffer.
  • Example 1 (Nucleic acid amplification of template RNA mixed in human nasal mucosa)
  • the pretreatment kit in the present invention can suppress the nucleic acid amplification inhibitory activity from the template RNA of the human nasal mucosa.
  • a kit (pretreatment reagent) was prepared.
  • This example was prepared by suspending the human nasal mucosa of a healthy person in this kit and mixing 10 7 copies of a template RNA having a partial sequence similar to that of the virus (influenza A (H1N1)) prepared below. A sample was obtained. This sample was subjected to the RT-SmartAmp method to detect the presence of RNA. As a comparative example, the same composition was prepared in the kit except that iron sulfate and sodium hydrogen carbonate were not added, and the same nucleic acid amplification was performed. These results are shown in FIG. As shown in the figure, when the kit of the present invention was used, nucleic acid amplification using RNA as a template was achieved. On the other hand, in the comparative example, nucleic acid amplification could not be performed. RT-SmartAmp was performed as follows.
  • RNA a sequence of up to 595-1048 bases of the HA region of influenza A (H1N1) was used as a template RNA to be amplified.
  • cDNA having a sequence complementary to the HA region, the following primer 1 (SEQ ID NO: 1) and primer 2 (SEQ ID NO: 2), and SYBR Premix Ex Taq (manufactured by Takara Bio Inc.) were used. PCR was performed.
  • Primer 1 SEQ ID NO: 1) 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCCATCTACTAGTGCTGACCA-3 '
  • Primer 2 SEQ ID NO: 2 5'-CCCTTCAATGAAACCGGCAA-3 '
  • PCR was achieved by reacting 3 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds, followed by incubation at 72 ° C. for 3 minutes.
  • a template RNA was synthesized using a CUGA7 in-vitro transcription kit (manufactured by Nippon Gene).
  • a final concentration of 1.4 mM dNTP, 5% DMSO, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 30 mM potassium acetate, 10 mM sodium sulfate, 8 mM magnesium sulfate, 0.1% was added to a liquid having a volume of 25 ⁇ L.
  • primers SEQ ID NOs: 3 to 7, manufactured by Danaform
  • exciton primers SEQ ID NO: 8, Danaform
  • FP primer (SEQ ID NO: 3, final concentration 1.82 ⁇ M) 5'- GCATTCGC GAAATGATAATACCAGATCC-3 ' TP primer (SEQ ID NO: 4, final concentration 1.82 ⁇ M) 5'- TTCCATTGCGAA ATGCACATTCGAAGCAAC-3 ' OP primer 1 (SEQ ID NO: 5, final concentration 0.23 ⁇ M) 5'-ACACTAGTAGAGCCGGGAGA-3 ' OP primer 2 (SEQ ID NO: 6, final concentration 0.23 ⁇ M) 5'-CTGGTGTTTATAGCACCCT-3 ' BP primer (SEQ ID NO: 7, final concentration 0.68 ⁇ M) 5'-ACCACTATAGTTCCAG-3 ' BP exciton primer (SEQ ID NO: 8, final concentration 0.23 ⁇ M) 5′-ACCACZAGATTTTCCAG-3 ′ (Z represents an exciton-labeled thymine residue)
  • a sample obtained by suspending the synthesized template RNA and human nasal mucosa with a pretreatment kit was added to make the reaction volume 25 ⁇ L, and then at a constant temperature of 60 ° C. for 90 minutes with a real-time PCR apparatus MX3000p (manufactured by Agilent).
  • the nucleic acid amplification activity was examined by carrying out the reaction in (1) and obtaining a fluorescence amplification curve through a FAM filter. As a result, as shown in FIG. 1, nucleic acid amplification was achieved from the added template RNA only in the sample treated with the pretreatment reagent in the present invention.
  • a nasal mucosa sample (upper pharyngeal mucosa) of a healthy person was collected by a swab (Menthip, manufactured by Nippon Cotton Swab Co., Ltd.) and suspended in 300 ⁇ L of phosphate buffer (PBS) per swab.
  • PBS phosphate buffer
  • the obtained suspension was subjected to gel filtration chromatography (mobile phase, phosphate buffer, column HiLoad 16/60 Superdex 200 pg, manufactured by GE Healthcare), and fractionated into four fractions (F1 to F4).
  • the suspension was applied to a Protein G affinity spin column (manufactured by Dojin Chemical) to obtain a column-bound fraction.
  • the gel filtration fraction sample and the affinity column-bound fraction are subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using SuperSep Ace 10-20% linear gradient acrylamide gel (Wako Pure Chemical Industries), and Silver MS is used. Protein bands were detected by silver staining with Stain (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). For the band surrounded by a square in FIG. 2, protein was extracted using Easy Separator (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and subjected to liquid chromatography / tandem mass spectrometry (SYNAPT LC / MS / MS, manufactured by Waters). .
  • the protein estimated from the molecular weight of the peptide fragment obtained by mass spectrometry was searched from the obtained data. As a result, it was identified that the band of about 80 kDa shown in FIG. 2 was human-derived lactoferrin and the 14 kDa band was human-derived lysozyme C.
  • Example 2 Inhibition of RNA degradation activity of human lactoferrin by iron and carbonate ions
  • FIG. 3 the RNA degradation activity inhibitory effect of human lactoferrin of iron ion and carbonate ion was confirmed.
  • RNA degradation activity RNase activity
  • a nasal mucosa sample (upper pharyngeal mucosa) of a healthy person was collected with a swab (Menthip, manufactured by Nippon Swab) and suspended in 250 ⁇ L of 40 mM Tris-HCl (pH 7.5).
  • swab Menthip, manufactured by Nippon Swab
  • 1.5 mM iron chloride was added to 9 ⁇ L of the suspension, and NaHCO 3 was added to 5, 10 or 15 mM, and the volume was finally adjusted to 18 ⁇ L.
  • the suspension was then incubated for 10 minutes at 37 ° C.
  • Example 3 (Effect of heat treatment of iron ion and carbonate ion) As shown in FIG. 4, the RNA decomposition activity inhibitory action of iron ions and carbonate ions could be improved in a short time by heat treatment.
  • a nasal mucosa sample of a healthy person was suspended in 250 ⁇ L of 20 mM MES (pH 5.8), 10% (w / v) Tween 20, and then Fe 2 (SO 4 ) 3 was added to 10 ⁇ L of the suspension. 1 mM and 6.7 mM NaHCO 3 were added, and the volume was finally adjusted to 18 ⁇ L. Thereafter, incubation was performed at 37 ° C. for 0, 1 or 5 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was subjected to 3.0% NuSieve GTG agarose gel electrophoresis (100 V, 30 minutes), and RNA degradation activity was examined by detecting RNA bands by ethidium bromide (EtBr) staining.
  • EtBr ethidium bromide
  • Example 4 Inhibition of reverse transcription inhibitory activity of lysozyme C by iron ion and carbonate ion
  • the reverse transcription inhibitory activity of human lysozyme C could be inhibited by iron ions and carbonate ions.
  • RT-SmartAmp the same RT-SmartAmp method as described above was used for examination.
  • Purified human-derived lysozyme C (manufactured by CALNIOCHEM) is added at a final concentration of 10 ng / mL in 25 ⁇ L of the RT-SmartAmp reaction solution, Fe 2 (SO 4 ) 3 is 0 or 2.5 mM, and NaHCO 3 is 0, 5
  • Example 5 (Synergistic effect of iron ion and carbonate ion with SDS) As shown in FIG. 6, in the presence of iron ions and carbonate ions, it was confirmed that RNA degradation activity was improved at a low concentration.
  • a nasal mucosa sample of a healthy person was suspended in 250 ⁇ L of 40 mM MES (pH 5.8), then Fe 2 (SO 4 ) 3 was added to 2.5 ⁇ M and NaHCO 3 was added to 20 mM in 9 ⁇ L of the suspension.
  • SDS final concentration 0, 0.01, 0.02, 0.05 or 0.1%) as a polar surfactant or Tween 20 (final concentration 0, 0.01, as a non-ionic surfactant) 0.02, 0.05, 0.1, or 0.5%)
  • the volume was finally adjusted to 18 ⁇ L. Thereafter, the suspension was incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • RNA RNA having a sequence complementary to the NA region
  • primer 3 SEQ ID NO: 9
  • primer 4 SEQ ID NO: 10
  • Prime STAR manufactured by Takara Bio Inc.
  • the PCR was achieved by reacting three temperatures of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds for 30 cycles, followed by incubation at 72 ° C. for 4 minutes. Based on the DNA fragment amplified by this PCR, a template RNA was synthesized using a CUGA7 in-vitro transcription kit (manufactured by Nippon Gene).
  • the RT-SmartAmp method uses a final concentration of 1.4 mM dNTP, 5% DMSO, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 30 mM potassium acetate, 10 mM sodium sulfate, 8 mM magnesium sulfate, 0.1% Tween 20, 12 unit Aac DNA polymerase. , And 0.125 unit AMV Reverse Transscriptase, primers (SEQ ID NOs: 11 to 15, Danaform) and exciton primers (SEQ ID NO: 16, Danaform, Patent No. 4370385) having the following sequences and concentrations: And a mixture of the synthesized template RNA was used as a reaction solution.
  • FP primer 1 (SEQ ID NO: 11, final concentration 1.82 ⁇ M) 5'-TTTATATATATAATAAACATGTCGAGGATG-3 ' TP primer 1 (SEQ ID NO: 12, final concentration 1.82 ⁇ M) 5'-CCTCGATATCCTGGTATGGGCCCTATTGGGA-3 ' OP primer 3 (SEQ ID NO: 13, final concentration 0.23 ⁇ M) 5'-GCACATTGTCAGGAAGTGC-3 ' OP primer 4 (SEQ ID NO: 14, final concentration 0.23 ⁇ M) 5'-TTTTTCTGGGGTGTCCTC-3 ' BP primer 1 (SEQ ID NO: 15, final concentration 0.68 ⁇ M) 5'-TGGTTCTGCAGAG-3 ' BP exciton primer 1 (SEQ ID NO: 16, final concentration 0.23 ⁇ M) 5′-TGTGZCTGCAGAG-3 ′ (“Z” indicates an exciton-labeled thymine residue)
  • a solution was prepared by adding 0.1% SDS to a solution containing 20 mM MES buffer (pH 5.8), 2.5 mM iron sulfate, and 20 mM sodium bicarbonate.
  • activated alumina having a final concentration of 1 mg / ml (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., molecular weight 101.96) was added and suspended by stirring with a vortex mixer. After the suspension, the suspension is placed on an empty column Micro Bio-Spin Chromatography Column (manufactured by BIO-RAD) having a glass sintered filter, and alumina adsorbed with SDS by centrifugation at 1200 ⁇ g for 1 minute.
  • BIO-RAD Micro Bio-Spin Chromatography Column
  • a filtrate from which was removed was obtained.
  • the same treatment as described above was performed under the condition that no alumina was added to obtain a filtrate.
  • the obtained filtrate was compared with the residual activity (DNA polymerase inhibitory activity) of SDS by examining the presence or absence of nucleic acid amplification activity using the reaction solution of the RT-SmartAmp method.
  • the reaction solution of RT-SmartAmp is added with 5 ⁇ L of the filtrate processed in the above-described manner to prepare a solution of 25 ⁇ L per reaction, and is prepared at 60 ° C. for 90 minutes with a real-time PCR apparatus MX3000p (manufactured by Agilent).
  • the nucleic acid amplification activity was examined by performing a reaction at a constant temperature of and obtaining a fluorescence amplification curve through a FAM filter.
  • As a result of evaluating the persistence of SDS causing inhibition of nucleic acid amplification based on the presence or absence of the rise of the amplification curve it was found that remarkable nucleic acid amplification was achieved only when alumina was added, as shown in FIG. Therefore, it was judged that SDS could be removed from the pretreatment reagent in the present invention by the alumina addition treatment.
  • a solution was prepared by adding 0.1% SDS to a solution containing 20 mM MES buffer (pH 5.8), 5 mM iron sulfate, and 20 mM sodium bicarbonate.
  • the iron ion concentration in this pretreatment reagent is set higher than that in the pretreatment reagent of Example 1.
  • the pretreatment reagent was passed through Milex HV ( ⁇ 13 mm, membrane pore diameter 0.22 ⁇ m, manufactured by Millipore) using a syringe to obtain a filtrate.
  • the obtained filtrate was examined for the presence or absence of nucleic acid amplification activity using the RT-SmartAmp method reaction solution shown in Reference Example 2 above, so that the residual activity of SDS (DNA polymerase inhibitory activity) was compared with the case of using without filtration.
  • Triton X-100 mitigates SDS nucleic acid amplification inhibition during nucleic acid amplification reaction
  • the nonionic surfactant Triton (registered trademark) X-100 is added to the nucleic acid amplification reaction solution. It was possible to alleviate inhibition of nucleic acid amplification of SDS contained in the treatment reagent.
  • SDS was added alone to RT-SmartAmp.
  • Triton X-100 is added to the RT-SmartAmp method reaction solution shown in Reference Example 2 so that the final concentration is 0% or 0.5%, and 5 ⁇ L of 0.1% SDS solution is further added. It prepared so that it might become a 25 microliters reaction solution per reaction.
  • the reaction solution was subjected to a reaction at a constant temperature of 60 ° C. for 90 minutes with a real-time PCR apparatus MX3000p (manufactured by Agilent), and a nucleic acid amplification activity was examined by obtaining a fluorescence amplification curve through a FAM filter.
  • a nucleic acid amplification activity was examined by obtaining a fluorescence amplification curve through a FAM filter.
  • RNA virus contained in human nasal mucosa
  • SDS was added to the pretreatment reagent containing iron ions and carbonate ions in the present invention
  • the steps shown in Reference Examples 2 to 4 were performed, so that they were contained in human nasal mucosa as shown in FIG.
  • RNA virus could be detected by RT-SmartAmp method.
  • a solution was prepared by adding 0.1% SDS to a solution containing 20 mM MES buffer (pH 5.8), 5 mM iron sulfate, and 20 mM sodium bicarbonate.
  • human nasal mucosa and influenza A H3N2
  • 0.1% SDS was further added to the suspension for disruption of the viral outer membrane, and then a syringe was used for Milex HV ( ⁇ 13 mm, membrane pore size 0.22 ⁇ m, manufactured by Millipore).
  • the filtrate obtained was passed through and used as a pretreated sample.
  • a sample was prepared by filtering the reagent obtained from the pretreatment without adding 0.1% SDS for disrupting the viral outer membrane.
  • the RT-SmartAmp method uses a final concentration of 1.4 mM dNTP, 5% DMSO, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 30 mM potassium acetate, 10 mM sodium sulfate, 8 mM magnesium sulfate, 0.1% Tween 20, 12 unit Aac DNA polymerase.
  • Triton X-100 was added to a solution containing 0.125 unit AMV Reverse Transscriptase to 0.5%, and primers having the sequence and concentration shown in Reference Example 2 (SEQ ID NOs: 11 to 15, Dana) were added.
  • Foam Co., Ltd.) and exciton primer SEQ ID NO: 16, manufactured by Danafoam Corporation, see Japanese Patent No. 4370385) were used as a reaction solution.
  • nucleic acid amplification activity was examined by obtaining a fluorescence amplification curve through a FAM filter. As a result, as shown in FIG. 11, nucleic acid amplification is achieved only with the pretreated reagent in which 0.1% SDS is further added to the pretreated reagent to destroy the outer membrane of the virus, and nucleic acid amplification detection from RNA viruses is possible. there were.

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Abstract

ＲＮＡを迅速かつ簡易に検出可能な前処理方法を提供する。 ヒト鼻腔粘膜を含む生体試料に、例えば、鉄イオン及び炭酸イオンを添加することにより、ヒト鼻腔粘膜に存在するラクトフェリンのＲＮＡ分解活性を阻害する。 前処理された生体試料を用いれば、逆転写酵素を用いてＲＮＡウイルスの遺伝子を増幅することができる。鉄イオン及び炭酸イオンは、ヒト鼻腔粘膜中のリゾチームＣの逆転写酵素阻害を阻害することもできる。また、ヒト鼻腔粘膜を含む生体試料にＳＤＳを添加することにより、ＲＮＡウイルスのエンベロープを除去することが好ましい。

Description

生体試料の前処理方法、ＲＮＡの検出方法及び前処理キット
　本発明は、ＲＮＡを含む生体試料の前処理方法、ＲＮＡの検出方法及び前処理キットに関する。
　血液等の生体試料中のウイルスを検出する方法として、ウイルスの遺伝子を増幅して検出する方法がある。しかし、生体試料中には、遺伝子増幅の阻害物質が含まれていることが多いため、遺伝子増幅に先立ち、生体試料を前処理して阻害物質を除去若しくは不活性化することが実施されている。前処理方法としては、例えば、界面活性剤、カオトロピック剤、加熱等により生体試料の処理後、さらに固層担体若しくはイオン交換樹脂により精製を行う方法がある（特許文献１～３）。しかしながら、これらの方法は、特殊な装置を必要とし、かつ複数の操作工程が必要であるため、煩雑である。
　特に、ＲＮＡを遺伝子とするウイルスの検出では、ＲＮＡ遺伝子を逆転写酵素によってＤＮＡにしてから増幅操作を行うため、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）及び逆転写酵素不活性化物質も除去若しくは不活性化する必要があるため、従来の前処理方法では、さらに、煩雑な操作が必要となる。例えば、ＲＮＡウイルスを含む生体試料の前処理方法としては、ポリアミンまたは硫酸化多糖の添加が知られている（特許文献４）。しかしながら、ポリアミン若しくは硫酸化多糖の添加は、さらに前処理を煩雑化にすると共に、ポリアミン及び硫酸化多糖は、ＲＮＡ遺伝子及び逆転写酵素によって生成されるＤＮＡに結合するおそれがあり、逆に遺伝子増幅を阻害する可能性もある。
　ところで、インフルエンザウイルスは、ＲＮＡウイルスの一種であるが、インフルエンザウイルスが新型か季節型かの判断は、臨床的に極めて重要である。また、インフルエンザウイルスの検出のための生体試料として鼻腔粘膜を使用することが一般的である。そして、インフルエンザウイルスの検出は、臨床現場で行う必要がある。このため、ヒトの鼻腔粘膜を用いたインフルエンザウイルスの迅速かつ簡易な検出方法の確立が望まれており、このような要請は、インフルエンザウイルスに限定されず、ＲＮＡウイルスの検出全般に対しても要請されており、さらには、ＲＮＡウイルスの検出だけでなく、遺伝子以外のＲＮＡ自体の検出に対しても要請されている。
特開２００９－２４７２５０号公報 国際公開ＷＯ２００７／０９４５０６号パンフレット 特開２００６－８７３９４号公報 特開２００１－２９０７８号公報
　本発明は、ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを迅速かつ簡易に検出することを可能とする生体試料の前処理方法、それを用いたＲＮＡの検出方法、及び、前記生体試料の前処理方法に用いる前処理キットの提供を目的とする。
　本発明の前処理方法は、ＲＮＡを含む生体試料の前処理方法であって、
前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害処理を実施することを特徴とする。
　本発明の検出方法は、生体試料中のＲＮＡの検出方法であって、
前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、前記生体試料を前処理する前処理工程と、前記前処理された生体試料中の前記ＲＮＡを増幅することで検出するＲＮＡ増幅検出工程とを含み、前記前処理工程が、前記本発明の生体試料の前処理方法により実施されることを特徴とする。
　本発明の前処理キットは、ＲＮＡを含む生体試料の前処理キットであって、
前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、前記前処理キットが、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤を含むことを特徴とする。
　本発明者等は、まず、ヒト鼻腔粘膜試料中に含まれる、ＲＮＡを鋳型とした逆転写／ＤＮＡ増幅反応を阻害する要因が、ラクトフェリンによるＲＮＡ分解活性であることを突き止めた。そして、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害処理（例えば、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤添加処理）を、ヒト鼻腔粘膜試料に実施するだけで、ＲＮＡ分解を抑制できることを見出した。さらに、ヒト鼻腔粘膜試料に存在する他の逆転写／ＤＮＡ増幅反応阻害要因の一つとして、リゾチームＣが逆転写酵素によるＲＮＡからＤＮＡへの逆転写反応を抑制することを突き止めた。そして、リゾチームＣの逆転写酵素阻害活性抑制剤を添加する事により、逆転写酵素阻害活性を抑制できる事を見出した。しかも、これら逆転写／ＤＮＡ増幅反応阻害要因の抑制処理（抑制剤を含む試薬添加）によってヒト鼻腔粘膜試料を処理した結果、特別な精製工程を経ずに、そのままＲＮＡ遺伝子の増幅が可能であることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば、ＲＮＡを含む生体試料からＲＮＡを迅速かつ簡易に検出することが可能である。
図１は、本発明の検出方法の一例を示すグラフである。 図２は、ヒト鼻腔粘膜中に、ラクトフェリン及びリゾチームＣが存在することを示す電気泳動写真である。 図３は、鉄イオン及び炭酸イオンのラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害効果を示す電気泳動写真である。 図４は、鉄イオン及び炭酸イオンの熱処理の効果の一例を示す電気泳動写真である。 図５は、鉄イオン及び炭酸イオンによるリゾチームＣの逆転写阻害活性の阻害の一例を示すグラフである。 図６は、鉄イオン及び炭酸イオンと、ＳＤＳとの相乗効果の一例を示す電気泳動写真である。 図７ａは、ターンバックプライマーおよびフォールディングプライマーによる核酸増幅反応の機序の一例を示す図である。 図７ｂは、ターンバックプライマーおよびフォールディングプライマーによる核酸増幅反応の機序の一例を示す図である。 図８は、アルミナ添加によるＳＤＳ除去の影響の一例を示すグラフである。 図９は、鉄イオン濃度の増加および限外濾過フィルターによるＳＤＳ除去の影響の一例を示すグラフである。 図１０は、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００による、核酸増幅反応中でのＳＤＳの核酸増幅阻害の緩和効果の一例を示すグラフである。 図１１は、ヒト鼻腔粘膜に含まれたＲＮＡウイルスをＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法により検出できたことを示すグラフである。
　本発明の前処理方法において、前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤を添加することで、前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害処理を実施することが好ましい。
　本発明の前処理方法において、前記生体試料が、動物の鼻腔粘膜、副鼻腔粘膜、気管粘膜、唾液、口腔または咽頭からの分泌液、涙、乳汁、胆汁、血液（白血球）、子宮頸管の粘膜、内外性器の粘膜、羊水、または尿を含むことが好ましい。
　本発明の前処理方法において、前記動物が、ヒトであることが好ましい。
　本発明の前処理方法において、前記生体試料が、ヒト鼻腔粘膜を含むことが好ましい。
　本発明の前処理方法において、さらに、前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｃ）の逆転写阻害活性阻害処理を実施することが好ましい。この場合において、前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｃ）の逆転写阻害活性阻害剤を添加することで、前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｃ）の逆転写阻害活性阻害処理を実施することが好ましい。
　本発明の前処理方法において、前記ＲＮＡ分解活性阻害剤及び前記逆転写阻害活性阻害剤の少なくとも一方が、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を含むことが好ましい。なお、本発明において、「鉄イオン剤」とは、前記生体試料に鉄イオンを供給可能なものをいう。同様に、本発明において、「炭酸イオン剤」とは、前記生体試料に炭酸イオンを供給可能なものをいう。
　本発明の前処理方法において、前記鉄イオン剤及び前記炭酸イオン剤を添加した前記生体試料を加熱処理することが好ましい。この加熱処理によって、ＲＮＡ分解活性及び逆転写阻害活性を、効率良く阻害可能だからである。
　本発明の前処理方法において、さらに、前記生体試料に、界面活性剤を添加してもよく、例えば、極性界面活性剤を添加することが好ましい。ウイルス粒子から遺伝子を露出させるためには、非イオン性界面活性剤を用いてウイルスのエンベロープを除去する必要があるが、非イオン性界面活性剤は、本発明の前記鉄イオン剤及び前記炭酸イオン剤の機能を阻害する可能性がある。しかし、極性界面活性剤であれば、本発明の前記鉄イオン剤及び前記炭酸イオン剤の機能を阻害することなくウイルスのエンベロープを除去可能である。前記極性界面活性剤は、ＳＤＳであることが好ましい。なお、ＳＤＳは、遺伝子増幅の際のＤＮＡポリメラーゼを阻害する恐れがあるため、遺伝子増幅に先立ち、カリウム塩又はアルミナを生体試料に添加してＳＤＳを凝集させ、遠心分離若しくはろ過によってＳＤＳを除去することが好ましい。
　本発明の検出方法において、前記ＲＮＡの増幅が、逆転写酵素を用いた遺伝子増幅方法により実施されることが好ましい。前記遺伝子増幅方法は、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いた等温増幅方法であることが好ましい。
　本発明の検出方法において、界面活性剤を用いたウイルス粒子からのＲＮＡ遺伝子の流出は、例えば、以下の２つの工程のどちらかを用いることができる。工程Ｂは、非極性界面活性剤を遺伝子増幅工程において添加し、非極性界面活性剤と遺伝子増幅反応の際の加熱との効果により、ウイルス粒子からＲＮＡ遺伝子を溶出させる手法である。
 
工程Ａ：前処理過程において検体中に含まれるウイルス粒子を界面活性剤によって破壊し、ウイルスからＲＮＡを溶出させると同時に、ラクトフェリンおよびリゾチームＣのＲＮＡ分解活性及び前記逆転写阻害活性を阻害処理によって抑制し、その前処理液を核酸増幅に供する工程。
工程Ｂ：検体中のウイルス粒子を破壊せず（保持したまま）、ラクトフェリン及びリゾチームＣのＲＮＡ分解活性及び前記逆転写阻害活性を阻害処理によって抑制した後、非極性界面活性剤を含む核酸増幅反応に供し、界面活性剤と熱変性の効果によってウイルス粒子中のＲＮＡゲノムを溶出させ、ウイルスゲノムからの核酸増幅を実施する工程。
　前記工程Ａにおいて、前記界面活性剤は、極性界面活性剤を用いることが好ましい。前記極性界面活性剤は、ＳＤＳであることが好ましい。前記工程Ｂにおいて、前記界面活性剤は、核酸増幅反応を阻害しない非極性界面活性剤を使用することが好ましい。
　本発明の前処理キットは、さらに、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｃ）の逆転写阻害活性阻害剤を含むことが好ましい。
　本発明の前処理キットにおいて、前記ＲＮＡ分解活性阻害剤及び前記逆転写阻害活性阻害剤の少なくとも一方が、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を含むことが好ましい。前記鉄イオン剤及び前記炭酸イオン剤が、互いに接触しない状態で含まれていることことが好ましい。
　次に、本発明を詳細に説明する。
　本発明において、生体試料に含まれるＲＮＡは特に制限されず、生体からとれるすべてのＲＮＡ、宿主ＲＮＡ、細菌や真菌のＲＮＡが含まれる。遺伝子のＲＮＡであってもよいし、遺伝子以外のＲＮＡであってもよい。遺伝子のＲＮＡの場合、生体試料に含まれるのは、ＲＮＡウイルスが好ましく、特に好ましくは、インフルエンザウイルスである。
　本発明において、前記生体試料は、ラクトフェリンを含む試料である。前記生体試料は、中でも、ヒトラクトフェリンを含む試料であることが好ましい。
　ラクトフェリンは生体のほとんどの外分泌液中に含まれていることが知られている。したがって、前記生体試料としては、例えば、動物の、鼻腔、副鼻腔、喉頭、気管、気管支、または、肺などの上気道粘膜からの分泌液、口腔または咽頭からの分泌液（例えば唾液等）、消化管粘膜からの分泌液、内・外性器（例えば子宮頸管等）の粘膜からの分泌液、腎尿路系の粘膜からの分泌液、腹腔内粘膜からの分泌液、胸腔内粘膜からの分泌液、心のう内粘膜からの分泌液、皮膚からの分泌液、涙腺分泌液、乳汁、胆汁、血液（白血球）、羊水、尿、糞便などを含む生体試料があげられる。これらの中で、例えば、鼻腔、副鼻腔などの粘膜からの分泌液、唾液、涙、乳汁、胆汁、血液（白血球）、子宮頸管からの分泌液、羊水、尿などの試料が好ましく、これらは、実際にラクトフェリンを含むことが知られている。中でも、ヒト鼻腔粘膜が特に好ましい。また、前記動物は、ヒトが好ましいが、ヒト以外の動物でも良い。ヒト以外の動物の例としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ラクダ、ラットなどがあげられる。
　ラクトフェリンは、前述のとおり鼻腔粘膜のみならず、様々な組織において発現し、分泌されるタンパク質である。ヒトの様々な組織において、ラクトフェリンのタンパク質をコードするＲＮＡ発現量がどの程度のものかを、次世代シーケンサーを利用した発現解析を行う手法の一つであるＣＡＧＥ法（Ｋａｎａｍｏｒｉ－Ｋａｔａｙａｍａ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　（２０１１）　Ｍａｙ　１９）によるデータを用いて解析、比較したデータが得られているので、参考までに表１に示す。この結果、ラクトフェリンの発現量の高い組織としてさまざまな組織があることが分かり、本発明の前処理方法の適用可能性の広さを示唆するものである。
 
（表１）
発現ランク　　　ヒト組織サンプル名　　　ＣＡＧＥスコア
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（スコア１００以上）
 
１　　　　　　　好中球（１）　　　　　　２２１２４
２　　　　　　　好中球（２）　　　　　　１３５５２
３　　　　　　　好中球（３）　　　　　　１１１７６
４　　　　　　　気管（１）　　　　　　　１９５８
５　　　　　　　好酸球　　　　　　　　　１６３２
６　　　　　　　骨髄球（１）　　　　　　７１６
７　　　　　　　目　　　　　　　　　　　５４８
８　　　　　　　精嚢　　　　　　　　　　５２５
９　　　　　　　気管（２）　　　　　　　４８１
１０　　　　　　精管　　　　　　　　　　４８０
１１　　　　　　喉　　　　　　　　　　　３８５
１２　　　　　　唾液腺　　　　　　　　　３７６
１３　　　　　　骨髄球（２）　　　　　　３５０
１４　　　　　　大動脈　　　　　　　　　２７３
１５　　　　　　精巣上体　　　　　　　　２３４
１６　　　　　　扁桃腺　　　　　　　　　２１４
１７　　　　　　顎下腺　　　　　　　　　１８０
１８　　　　　　骨髄球（３）　　　　　　１８０
１９　　　　　　好塩基球　　　　　　　　１４５
２０　　　　　　腎臓　　　　　　　　　　１３３
２１　　　　　　子宮頸管　　　　　　　　１１１
２２　　　　　　前立腺　　　　　　　　　１０８
　ヒト鼻腔粘膜は、例えば、鼻腔洗浄液やこう鼻（鼻かみ）により採取でき、より好ましくは、スワブによって採取することができる。ヒト鼻腔粘膜は、そのまま、生体試料としてもよいし、生理食塩水または緩衝液等に分散若しくは溶解させて生体試料としてもよい。緩衝液としては、アルカリ化における分解を防ぐため、酸性から中性域における水素イオン濃度に対する緩衝作用を有するものが使用できる。例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）、および種々のグッド緩衝液（ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ）が使用できる。緩衝液のｐＨは、例えば、４．０～８．０、好ましくは５．０～７．０、より好ましくは５．５～６．０の範囲であり、ＭＥＳ（ｐＫａ＝６．１５）を用いる事が最も好ましい。
　生体試料中のＲＮＡを鋳型とした逆転写／ＤＮＡ増幅反応を阻害する要因が、ラクトフェリンによるＲＮＡ分解活性であり、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性を阻害すれば、特別な精製処理をしなくても、ＲＮＡウイルスの遺伝子増幅が可能であることを見出したことが、本発明のポイントであることは、前述のとおりである。ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性の阻害処理には、例えば、生体試料へのラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤の添加と、生体試料の熱処理とが含まれる。前記阻害処理は、例えば、ＲＮＡ分解活性阻害剤の添加および前記熱処理の両方により実施してもよい。前記熱処理の温度は、例えば、２５～１００℃の範囲であり、好ましくは３０～７５℃の範囲であり、より好ましくは３７～６５℃の範囲である。前記熱処理の時間は、例えば、１～６０分の範囲であり、好ましくは２～４５分の範囲であり、より好ましくは５～３０分の範囲である。
　前記ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性は、ターゲットとなる目的ＲＮＡ以外のＲＮＡ（デコイＲＮＡ）を過剰に添加する事でも低下させることができる。
　ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性をより阻害するには、種々の阻害剤を使用できる。阻害剤としては、一般的に分子生物学で使用されるウシ胎盤由来ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを用いる事ができる。また、ラクトフェリンに対し特異的に結合し、ＲＮＡ分解活性を阻害できる特異的ＩｇＧ抗体やＡｆｆｉｂｏｄｙのタンパク質性分子、もしくは核酸由来特異的結合分子としてスクリーニングが可能なＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーを用いる事ができる。さらに、ラクトフェリンに対するｉｎ　ｓｉｌｌｉｃｏ結合分子探索によって見出された、硫酸塩、スルホチオ酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、スルホクロリド酸塩等の低分子有機化合物を用いる事ができる。
　ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤として、好ましくは、遷移金属及び典型金属に属する金属イオンを用いる事ができる。金属イオンとしては、遷移金属に属するものとして、銅（Ｃｕ２＋、Ｃｕ３＋）、ニッケル（Ｎｉ２＋）、鉄（Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋）、金（Ａｕ＋、Ａｕ３＋）、および遷移金属の中で軽希土に分類されるスカンジウム（Ｓｃ３＋）、イットリウム（Ｙ３＋）、ガドリニウム（Ｇｄ３＋）、セリウム（Ｃｅ３＋）、ネオジム（Ｎｄ３＋）が挙げられる。典型金属に属する金属イオンとしては、亜鉛（Ｚｎ２＋）が使用できる。尚、これらの金属は、単独又は複数種の混合試薬として使用する事ができる。
　ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤として、より好ましくは、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を同時に用いることが好ましい。これは、ラクトフェリンが、鉄を含まないアポ体（アポラクトフェリン）となった場合に高いＲＮＡ分解活性を引き起こす事、ならびにラクトフェリンの結晶構造において金属結合ドメインに鉄イオンと炭酸イオンを含む構造を取る事に準ずる。金属イオンを含まないアポラクトフェリンに対して鉄イオンに炭酸イオンを同時に供与する事により、アポ体からホロ体（ホロラクトフェリン）に効率よく移行させる事ができ、ＲＮＡ分解活性を抑制する事ができると考えられる。鉄イオン剤だけでもラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害活性があるが、鉄イオン剤単独だと、鉄イオン剤の濃度を高くした場合、鉄イオン剤自身のＲＮＡ分解活性が発現する恐れがある。炭酸イオン剤は、余剰の鉄イオン剤と反応し不溶性の炭酸鉄（Ｆｅ２（ＣＯ３）３）を形成する事ができるため、余剰の鉄イオン自身がＲＮＡを分解することを抑制する手段としての効果を有する。よって、鉄イオン剤と共に、炭酸イオン剤も添加すれば、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性を阻害し、かつ、鉄イオン剤自身のＲＮＡ分解活性を阻害できる。
　前記鉄イオン剤としては、三価の鉄イオン（Ｆｅ３＋）を供給できるものが好ましく、例えば、塩化鉄（ＦｅＣｌ３）、硝酸鉄（Ｆｅ（ＮＯ３）３）及び硫酸鉄（Ｆｅ２（ＳＯ４）３）が好ましく、より好ましくは、これらの水溶液である。なお、水溶液での安定性の観点から、硫酸鉄を用いることが好ましい。
　前記炭酸イオン剤としては、炭酸イオン（ＣＯ３ ２―）を供給できるものが好ましく、例えば、炭酸水素ナトリウムがあげられ、好ましくは炭酸水素ナトリウムの水溶液である。
　Ｆｅ３＋とＣＯ３ ２―が同時に存在する溶液中（生体試料中）において、例えば、Ｆｅ３＋の濃度は、２～６ｍＭの範囲、また、ＣＯ３ ２―の濃度は、５～２０ｍＭの範囲である。また、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤の濃度としては、例えば、Ｆｅ２（ＳＯ４）３の濃度は、１～３ｍＭの範囲、また、ＮａＨＣＯ３の濃度は、５～２０ｍＭの範囲である。より好ましくはＦｅ２（ＳＯ４）３の濃度は、２．５ｍＭ程度、また、ＮａＨＣＯ３の濃度は、１０ｍＭ程度である。
　前述のように、前記極性界面活性剤であるＳＤＳを前記生体試料に添加する場合、ＳＤＳは、遺伝子増幅の際のＤＮＡポリメラーゼを阻害する恐れがあるため、前述のように、アルミナ等を使用して、前記生体試料からＳＤＳを除去することが好ましい。なお、前記アルミナを使用した場合、前記アルミナには、ＳＤＳ以外の極性分子の吸着も起こり得るため、例えば、前記生体試料に含まれるＲＮＡ及びＤＮＡ等もアルミナに吸着されて、前記生体試料から除去されてしまう場合がある。ここで、ＳＤＳと鉄イオンとは、相互作用により沈殿を形成する。この沈殿形成能を利用して、前記生体試料からＳＤＳを除去することもできる。この観点から、前記生体試料に含まれる鉄イオンの濃度を高く設定することが好ましい。前記鉄イオン（例えば、Ｆｅ３＋）の濃度は、１ｍＭ以上が好ましく、２ｍＭ以上がより好ましく、２．５ｍＭ以上がさらに好ましい。前記鉄イオンの濃度の上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍＭ以下または５ｍＭ以下である。ＳＤＳと鉄イオンとから形成される沈殿は、例えば、遠心分離若しくはろ過によって、前記生体試料から除去することが好ましい。前記ろ過により前記沈殿を除去する場合、前記ろ過には、サイズ排除型フィルター（限外ろ過フィルター）を使用するのが好ましく、例えば、前記限外ろ過フィルターの孔径は、０．１～０．４５μｍの範囲であってもよく、より好ましくは０．２２μｍである。前記限外ろ過フィルターは、例えば、ミリポア社製の商品名「マイレクスＨＶ（膜孔径０．２２μｍ）等を使用できる。
　鼻腔粘膜試料に多く含まれるリゾチームＣは、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する逆転写酵素活性を阻害する。前述のように、本発明では、鼻腔粘膜試料等の生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｃ）の逆転写阻害活性阻害処理を実施することが好ましい。リゾチームＣの逆転写阻害活性阻害処理には、例えば、リゾチームＣの逆転写阻害活性阻害剤の添加と、生体試料の熱処理とが含まれる。前記阻害処理は、例えば、ＲＮＡ分解活性阻害剤の添加および前記熱処理の両方により実施してもよい。リゾチームＣの逆転写阻害活性阻害剤としては、例えば、リゾチームＣに対し特異的に結合し、逆転写阻害活性を抑制できる特異的ＩｇＧ抗体やＡｆｆｉｂｏｄｙのタンパク質性分子、もしくは核酸由来特異的結合分子としてスクリーニングが可能なＲＮＡ／ＤＮＡアプタマーを用いる事ができる。より好ましくは、鉄イオン剤（例えば、三価の鉄イオンを供給できるもの）及び炭酸イオン剤の添加によって抑制することができる。前記熱処理の温度は、例えば、２５～１００℃の範囲であり、好ましくは３０～７５℃の範囲であり、より好ましくは３７～６５℃の範囲である。前記熱処理の時間は、例えば、１～６０分の範囲であり、好ましくは２～４５分の範囲であり、より好ましくは５～３０分の範囲である。
　鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を添加した生体試料は、加熱処理することが好ましい。この加熱処理は、ラクトフェリンの構造ゆらぎを生じさせる作用があるものと考えられ、結果的に鉄イオン剤及び炭酸イオン剤のラクトフェリンへの作用を向上させ、よりＲＮＡ分解活性を抑制する事が可能である。加熱処理の条件は、例えば、温度は、３７～６０℃の範囲であり、時間は、５～３０分の範囲である。例えば、３７℃の場合は、３０分の加熱処理を行い、６０℃の場合は、５分の加熱処理を行う。
　前述した加熱処理を伴わない工程として、微量のタンパク質変性剤を使用する事ができる。具体的には、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアネート、尿素がある（界面活性剤は以下に示す）。
　鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を添加した生体試料には、ウイルス粒子のエンベロープ除去のために、極性界面活性剤を添加することが好ましい。極性界面活性剤は、アニオン系のものを使用する事が好ましく、具体的には、サポニン、オクタン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ペルフルオロオクタン酸（ＰＦＯＡ）、ペルフルオロノナン酸、ｎ－ラウロイルサルコシンナトリウム、ココイルグルタミン酸ナトリウム、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩、１－ヘキサンスルホン酸ナトリウム、１－オクタンスルホン酸ナトリウム、１－デカンスルホン酸ナトリウム、１－ドデカンスルホン酸ナトリウム、ペルフルオロブタンスルホン酸、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ナフタレンスルホン酸ナトリウム、ナフタレンジスルホン酸二ナトリウム、ナフタレントリスルホン酸三ナトリウム、ブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリルリン酸、ラウリルリン酸ナトリウム、ラウリルリン酸カリウム、Ｎ－ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ｎ－テトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）、ｎ－ドデシルスルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、グリコデオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム、タウロデヒドロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、タウロリソコール酸ナトリウム、タウロウルソデオキシコール酸ナトリウムが使用できる。より好ましくは、ｎ－ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加する事が好ましい。添加濃度は、例えば、ＳＤＳの場合は、０．１ｗ／ｖ％以下である。なお、ＳＤＳを添加した場合、前記加熱処理をせずとも、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤によるラクトフェリンのＲＮＡ分解活性を迅速に阻害できる。なお、極性界面活性剤の添加を伴うヒト鼻腔粘膜試料の前処理は、以下の工程Ａに準ずる前処理手法と定義づけられる。
工程Ａ：前処理過程において検体中に含まれるウイルス粒子を極性界面活性剤によって破壊し、ウイルスからＲＮＡを溶出させると同時に、ラクトフェリンおよびリゾチームＣのＲＮＡ分解活性及び前記逆転写阻害活性を阻害剤によって抑制し、その前処理液を核酸増幅に供する工程。
　前述した極性界面活性剤の添加は、任意であり、極性界面活性剤の添加が無くても、本発明の前処理により、ＲＮＡウイルスのＲＮＡ遺伝子の増幅が可能である。この場合、ウイルスからのＲＮＡゲノムの放出が核酸増幅反応過程で起こる事が前提となる。ＲＮＡからの核酸増幅において逆転写反応が、例えば、５０～６０℃で実施される場合、ウイルスエンベロープの熱変性効果が期待でき、ＲＮＡウイルスからのＲＮＡゲノムの放出が可能である。より好ましくは、ウイルスエンベロープを崩壊させる効果があり且つ核酸増幅反応を阻害しない非イオン性界面活性剤を核酸増幅反応液中に添加することができる。具体的な非イオン性界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）系界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０）、Ｂｒｉｊ（登録商標）系界面活性剤（Ｂｒｉｊ－７６、Ｂｒｉｊ－９６、Ｂｒｉｊ－５６、Ｂｒｉｊ－５８、Ｂｒｉｊ－３５）、Ｓｐａｎ系界面活性剤（Ｓｐａｎ－２０、Ｓｐａｎ－４０、Ｓｐａｎ－６０）、ＰＯＥ（９、１０）ノニルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｎ－１０１）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４、ジギトニン、ＡＰＯ－１０、ＡＰＯ－１２、ＢＩＧ　ＣＨＡＰ、シクロヘキシル－ｎ－エチル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－デカノイルスクロース、ｎ－ドデカノイルスクロース、ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－デシル－β－Ｄ－チオマルトシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド、ＥＬＵＧＥＮＴ（登録商標）、ＧＥＮＡＰＯＬ（登録商標）Ｃ－１００、ＧＥＮＡＰＯＬ　Ｘ－８０、ＧＥＮＡＰＯＬ　Ｘ－１００、ＨＥＣＡＭＥＧ、ｎ－ヘプチル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシド、ｎ－ヘキシル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ＭＥＧＡ－８、ＭＥＧＡ－９、ＭＥＧＡ－１０、ｎ－ノニル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ＮＰ－４０、ｎ－オクタノイル－β－グルコシルアミン（ＮＯＧＡ）、ｎ－オクタノイルスクロース、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシド、ｎ－ウンデシル－β－Ｄ－マルトシド、ＰＬＵＰＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ－１２７、ノノキシノール、ノノキシノール－９、ラウリン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリン酸ジエタノールアミド、オレイン酸ジエタノールアミド、ステアリン酸ジエタノールアミド、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、が使用できる。
　前述のように、前記極性界面活性剤であるＳＤＳを前記生体試料に添加する場合、ＳＤＳは、遺伝子増幅の際のＤＮＡポリメラーゼを阻害する恐れがある。このため、前述のアルミナを使用する方法、鉄イオン濃度を高めてＳＤＳと鉄イオンとの沈殿を形成する方法等により、前記生体試料からＳＤＳを除去している。しかしながら、前記生体試料には、ＳＤＳ除去処理後もＳＤＳが残存する場合がある。本発明において、ＳＤＳが含まれる生体試料を遺伝子増幅する際に、前述の核酸増幅反応を阻害しない非イオン性界面活性剤を添加することが好ましい。このようにすることで、前記生体試料に含まれるＳＤＳが前記非イオン性界面活性剤のミセル中に取り込まれ、ＳＤＳによる遺伝子増幅の際のＤＮＡポリメラーゼ阻害が抑制される。なお、前述のメカニズムは推定であり、この記載により本発明は何ら制限されない。本発明では、前記目的のために、例えば、前述のＳＤＳ除去処理後の生体試料に、遺伝子増幅する際に前記非イオン性界面活性剤を添加してもよいし、前述のＳＤＳ除去処理を行っていない生体試料に、遺伝子増幅する際に前記非イオン性界面活性剤を添加してもよい。また、例えば、非イオン性界面活性剤を予め核酸増幅（遺伝子増幅）の反応液中に添加しておいてもよい。前記非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００が好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００の添加量は、例えば、前記生体試料におけるＳＤＳの濃度により適宜設定できるが、前記生体試料にＳＤＳが、０．１％で含まれている場合には、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００が、０．１～１％の範囲で、前記生体試料に含まれていることがより好ましく、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００の濃度は、０．５％であってもよい。
　ＳＤＳは、中性のカリウム塩またはアルミナの添加によって除去可能であることは、前述のとおりである。中性のカリウム塩は、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、塩酸カリウム、硫酸カリウム、硝酸カリウムが使用できる。より好ましくは水溶性のものが好ましく、酢酸カリウムがより好ましい。アルミナとしては、例えば、アルミナ粒子（平均粒径１０００ｎｍ以下のもの、好ましくは平均粒径２００ｎｍ以下のもの、より好ましくは平均粒径２０～１００ｎｍのもの）である。または、活性アルミナ（和光純薬社製、分子量１０１．９６）等も使用できる。
　遺伝子増幅法としては、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ法、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いた等温増幅法があるが、前記等温増幅法が好ましい。前記等温増幅法としては、例えば、ＳＤＡ法（特公平７－１１４７１８号公報）、下記のターンバックプライマー（ＴＰ）を用いた増幅方法があげられるが、この中で、ＴＰを用いた等温増幅法が好ましい。
（ターンバックプライマー）
　前記ターンバックプライマーは、標的核酸配列の３’末端部分の配列（Ａ）にハイブリダイズする配列（Ａｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（Ａ）よりも５’側に存在する配列（Ｂ）の相補配列（Ｂｃ）にハイブリダイズする配列（Ｂ’）を前記配列（Ａｃ’）の５’側に含んでなるものである。
　ＴＰを用いた等温増幅法において、フォワードプライマー及びリバースプライマーの双方にＴＰを用いた対称の形態（ＴＰ－ＴＰ）でもよいし、フォワードプライマー及びリバースプライマーの一方にＴＰを用い、他方にその他のプライマー（ＸＰ）を用いた非対称の形態（ＴＰ－ＸＰ）であってもよい。
　対称の形態（ＴＰ－ＴＰ）の具体例としては、例えば、ＬＡＭＰ法（国際公開ＷＯ２０００／０２８０８２号パンフレット）があげられる。ＬＡＭＰ法は、一対のＴＰ（ＴＰ－ＴＰ）に加え、一対のアウタープライマー（ＯＰ－ＯＰ）を使用する方法である。ＯＰは、鋳型配列において、ＴＰよりも５’側にアニ―ルし、ＴＰ伸長鎖を鎖置換反応により剥ぎ取る機能を持つプライマーである。
　非対称の形態の場合のその他のプライマーとしては、ＰＣＲ法に使用する一般的なプライマー、下記のフォールディングプライマー（ＦＰ）があげられる。非対称の形態では、ＴＰとＦＰの組合せが好ましい。ＴＰとＦＰの組合せの形態としては、ＳｍａｒｔＡｍｐ法（登録商標）（国際公開ＷＯ２００５／０６３９７７号パンフレット）があげられる。ＴＰとＦＰの組合せの一例を図７ａおよび図７ｂに示す。ＴＰとＦＰの組合せに加え、さらに、ＯＰを使用してもよい。ＯＰの使用は、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方に使用してもよい。
（フォールディングプライマー）
　前記フォールディングプライマーは、標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（Ｃ）にハイブリダイズする配列（Ｃｃ’）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（Ｄ－Ｄｃ’）を前記配列（Ｃｃ’）の５’側に含んでなるものである。
　ＴＰ－ＦＰを用いた等温増幅の仕組みは、例えば、次のとおりである。ＴＰおよびＦＰによる核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図７（図７ａおよび図７ｂ）を用いて説明する。なお、図７では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする２つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、ＴＰが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、該プライマーの伸長反応が起きる（図７（ａ））。次いで、伸長鎖（－）上においてステム－ループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（Ａ）に新たなＴＰがハイブリダイズし（図７（ｂ））、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（－）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（－）上の配列（Ｃ）にＦＰがハイブリダイズし（図７（ｃ））、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（図７（ｄ））。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（－）の５’末端ではステム－ループ構造が形成され（図７（ｅ））、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（－）が脱離する（図７（ｆ））。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（Ａ）および配列（Ｂｃ）を介して伸長鎖（－）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（Ａ）および配列（Ｂｃ）にＴＰがハイブリダイズし（図７（ｇ））、その伸長反応により伸長鎖（－）が生成する（図７（ｈ）および（ｉ））。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され（図７（ｈ））、そこからの伸長反応により（図７（ｉ））、両端に折返し配列を有し、ＴＰおよびＦＰに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（－）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図７（ｊ））。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図７（ｋ））、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる（図７（ｌ）および（ｍ））。また、図７（ｉ）において脱離したＴＰからの伸長鎖（－）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図７（ｎ））、そこからの伸長反応により、両端にステム－ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（－）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図７（ｏ））。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、ＴＰおよびＦＰに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（－）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。
　ＲＮＡ遺伝子を増幅させる場合、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡを増幅する。このように、逆転写酵素を用いてＲＮＡを増幅するＳｍａｒｔＡｍｐ法を、ＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法という。
　本発明の前処理キットの組成は、特に制限されないが、例えば、２０ｍＭ　ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ５．８）、２．５ｍＭ　硫酸鉄、２０ｍＭ　炭酸水素ナトリウム、０．１％　ＳＤＳ及び　２０ｍｇ／ｍｌアルミナ（Ａｌ２Ｏ３）という組成があげられる。
　硫酸鉄と炭酸水素ナトリウムは、混合溶液として保存した場合、迅速に沈殿を形成する。そのため、本発明の前処理キットでは、Ａ液及びＢ液の２液に分け、硫酸鉄と炭酸水素ナトリウムが別々に提供されることが好ましい。この場合、例えばＡ液は、２０ｍＭ　ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ５．８）、４０　ｍＭ　炭酸水素ナトリウム、０．２％　ＳＤＳの組成とする。Ｂ液は、５ｍＭ　硫酸鉄、４０ｍｇ／ｍｌ　アルミナの組成とする。この場合、硫酸鉄を含むＢ液は遮光保存することが望ましい。Ａ液及びＢ液は、１：１の混合液としてヒト鼻腔粘膜を緩衝液に懸濁時に調製することが好ましい。
　次に、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、実施例により制限及び限定されない。
［実施例１］
（ヒト鼻腔粘膜中に混合した鋳型ＲＮＡの核酸増幅）
　本実施例では、ヒト鼻腔粘膜が有する鋳型ＲＮＡからの核酸増幅阻害活性を、本発明における前処理キットが抑制できるかについて示した。前処理キットとして、１０ｍＭ　ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．８）、２．５ｍＭ　硫酸鉄、２０ｍＭ　炭酸水素ナトリウム、０．１％　ＳＤＳ及び２０ｍｇ／ｍｌ活性アルミナ（和光純薬社製、分子量１０１．９６）を組成とするキット（前処理試薬）を調製した。このキットに、健常人のヒト鼻腔粘膜を懸濁し、さらに、下記において調製した、ウイルス（インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１））と同様の部分配列を有する鋳型ＲＮＡを１０７コピー混合することにより、本実施例での試料とした。この試料を、ＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法に供し、ＲＮＡの存在を検出した。なお、比較例として、前記キットにおいて、硫酸鉄及び炭酸水素ナトリウムを添加しなかった以外は、同じ組成のものを調製し、同様の核酸増幅を行った。これらの結果を、図１に示す。同図に示すように、本発明のキットを用いた場合は、ＲＮＡを鋳型とした核酸増幅が達成された。一方、比較例では、核酸増幅できなかった。なお、ＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐは、下記のようにして実施した。
　本実施例におけるＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法では、増幅する鋳型ＲＮＡとしてインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）のＨＡ領域５９５－１０４８塩基までの配列を用いた。鋳型ＲＮＡの調製にあたり、まずＨＡ領域に相補的な配列を有するｃＤＮＡ、以下のプライマー１（配列番号１）及びプライマー２（配列番号２）、ならびにＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを実施した。
 
プライマー１（配列番号１）
５’－ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡ－３’
プライマー２（配列番号２）
５’－ＣＣＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＡ－３’
　なお、前記ＰＣＲは、９５℃３０秒、６０℃３０秒、及び７２℃３０秒の３つの温度を３５サイクル反応させた後、７２℃３分のインキュベーションによって達成した。このＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を元に、ＣＵＧＡ７　ｉｎ－ｖｉｔｒｏ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用い、鋳型ＲＮＡを合成した。
　ＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法は、容積２５μＬの液体中に、最終濃度として１．４ｍＭ　ｄＮＴＰ、５％　ＤＭＳＯ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　酢酸カリウム、１０ｍＭ　硫酸ナトリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１２ｕｎｉｔ　Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．１２５ｕｎｉｔ　ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを含む溶液に、以下に示す配列及び濃度のプライマー（配列番号３～７、ダナフォーム社製）及びエキシトンプライマー（配列番号８、ダナフォーム社製、特許第４３７０３８５号公報参照）を加えたものを反応溶液とした。
 
ＦＰプライマー（配列番号３、最終濃度１．８２μＭ）
５’－ＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＡＡＴＧＡＴＡＡＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣ－３’
ＴＰプライマー（配列番号４、最終濃度１．８２μＭ）
５’－ＴＴＣＣＡＴＴＧＣＧＡＡＴＧＣＡＣＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＡＣ－３’
ＯＰプライマー１（配列番号５、最終濃度０．２３μＭ）
５’－ＡＣＡＣＴＡＧＴＡＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＡ－３’
ＯＰプライマー２（配列番号６、最終濃度０．２３μＭ）
５’－ＣＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＡＧＣＡＣＣＣＴＴ－３’
ＢＰプライマー（配列番号７、最終濃度０．６８μＭ）
５’－ＡＣＣＡＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＡＧ－３’
ＢＰエキシトンプライマー（配列番号８、最終濃度０．２３μＭ）
５’－ＡＣＣＡＣＺＡＧＡＴＴＴＣＣＡＧ－３’（Ｚはエキシトン標識されたチミン残基を示す）
　さらに前記合成した鋳型ＲＮＡとヒト鼻腔粘膜を前処理キットで懸濁した試料を加え、反応容積を２５μＬとした後、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。その結果、図１に示すように、本発明における前処理試薬で処理した試料のみにおいて、添加した鋳型ＲＮＡから核酸増幅が達成された。
［参考例１］
（ヒト鼻腔粘膜中のラクトフェリン及びリゾチームＣの存在）
　図２の電気泳動写真に示すように、ヒト鼻腔粘膜中に、ラクトフェリン及びリゾチームＣの存在を確認した。なお、ヒト鼻腔粘膜中のラクトフェリン及びリゾチームＣの存在は、以下のようにして確認した。
　健常者の鼻腔粘膜試料（咽頭上部粘膜）をスワブ（メンティップ、日本綿棒社製）によって採取し、スワブ１本あたり３００μＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に懸濁した。得られた懸濁液をゲルろ過クロマトグラフィー（移動相　リン酸緩衝液、カラム　ＨｉＬｏａｄ　１６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ、ＧＥヘルスケア製）に供し、４つのフラクション（Ｆ１～Ｆ４）にサイズ分画した。また、同懸濁液をＰｒｏｔｅｉｎＧアフィニティースピンカラム（同仁化学製）に供し、カラム結合画分を得た。上記、ゲル濾過分画標品及びアフィニティーカラム結合画分をＳｕｐｅｒＳｅｐ　Ａｃｅ１０－２０％リニアグラジエントアクリルアミドゲル（和光純薬工業製）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供し、Ｓｉｌｖｅｒ　ＭＳ　Ｓｔａｉｎ（和光純薬工業製）にて銀染色を行うことでタンパク質のバンドを検出した。図２に四角で囲んだバンドについて、Ｅａｓｙ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（和光純薬工業製）を用いてタンパク質を抽出し、液体クロマトグフィー／タンデムマススペクトロメトリー（ＳＹＮＡＰＴ　ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、Ｗａｔｅｒｓ社製）に供した。得られたデータからＭＡＳＣＯＴプログラムを用い、マススペクトロメトリーによって得られたペプチドフラグメントの分子量から推定されるタンパク質を検索した。その結果、図２に示す約８０ｋＤａのバンドがヒト由来ラクトフェリン、１４ｋＤａのバンドがヒト由来リゾチームＣであるものと同定された。
［実施例２］
（鉄イオン及び炭酸イオンのヒトラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害効果）
　図３に示すように、鉄イオン及び炭酸イオンのヒトラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害効果を確認した。
　本実施例では、前記合成した鋳型ＲＮＡと同様のものをＲＮＡ分解活性（ＲＮａｓｅ活性）に対する基質として使用した。図３左図では、健常者の鼻腔粘膜試料（咽頭上部粘膜）をスワブ（メンティップ、日本綿棒製）によって採取し、２５０μＬの４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で懸濁した。次に、懸濁液９μＬに１．５ｍＭの塩化鉄を添加し、さらにＮａＨＣＯ３を５、１０又は１５ｍＭを加えたものを調製し、最終的に１８μＬとなるよう定容した。その後、懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートした。その２．５μＬの懸濁液に対し、５０ｎｇ／μＬのＲＮＡを１０μＬ加え、２５℃で１０分間インキュベートした。反応終了後、反応液を３．０％　ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、３０分間）に供し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色法によりＲＮＡのバンドを検出した。
　図３右図では、健常者の鼻腔粘膜試料を２５０μＬの４０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．８）で懸濁した後、その懸濁液９μＬにＦｅ２（ＳＯ４）３を１．５、２．０、２．５ｍＭ、及びＮａＨＣＯ３を１０、１５、２０又は２５ｍＭ加え、最終的に１８μＬとなるよう定容した。以降は前述と同様の操作を行い、アガロース電気泳動によってＲＮＡのバンドを検出した。
［実施例３］
（鉄イオン及び炭酸イオンの熱処理の効果）
　図４に示すように、熱処理をすることによって、短時間で、鉄イオン及び炭酸イオンのＲＮＡ分解活性阻害作用を向上させることができた。
　本実施例では、健常者の鼻腔粘膜試料を２５０μＬの２０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．８）、１０％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で懸濁した後、その懸濁液１０μＬにＦｅ２（ＳＯ４）３を１ｍＭ、及びＮａＨＣＯ３を６．７ｍＭ加え、最終的に１８μＬとなるよう定容した。その後、３７℃で０、１又は５分間のインキュベートを行なった。反応終了後、反応液を３．０％　ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、３０分間）に供し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色法によりＲＮＡのバンドを検出することによって、ＲＮＡ分解活性を調べた。
［実施例４］
（鉄イオン及び炭酸イオンによるリゾチームＣの逆転写阻害活性の阻害）
　図５に示すように、ヒトリゾチームＣの逆転写阻害活性は、鉄イオン及び炭酸イオンによって阻害することができた。
　本実施例では、前述と同様のＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法を用いて検討した。ＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法の反応溶液２５μＬ中、ヒト由来精製リゾチームＣ（ＣＡＬＮＩＯＣＨＥＭ製）を最終濃度１０ｎｇ／ｍＬで添加し、Ｆｅ２（ＳＯ４）３を０又は２．５ｍＭ、及びＮａＨＣＯ３を０、５、１０又は２０ｍＭのいずれかで反応液に添加した場合の核酸増幅活性を蛍光増幅曲線により比較した。
［実施例５］
（鉄イオン及び炭酸イオンと、ＳＤＳとの相乗効果）
　図６に示すように、鉄イオン及び炭酸イオンの存在下では、低濃度で、ＲＮＡ分解活性の向上が確認できた。
　本実施例では、健常者の鼻腔粘膜試料を２５０μＬの４０ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ５．８）で懸濁した後、その懸濁液９μＬにＦｅ２（ＳＯ４）３を２．５ｍＭ、及びＮａＨＣＯ３を２０ｍＭ加え、さらに極性界面活性剤としてＳＤＳ（最終濃度０、０．０１、０．０２、０．０５又は０．１％）もしくは非イオン性界面活性剤としてＴｗｅｅｎ　２０（最終濃度０、０．０１、０．０２、０．０５、０．１又は０．５％）で添加し、最終的に１８μＬとなるよう定容した。その後、懸濁液を３７℃で１０分間のインキュベートを行った。その２．５μＬの懸濁液に対し、５０ｎｇ／μＬのＲＮＡを１０μＬ加え、２５℃で１０分間インキュベートした。反応終了後、反応液を３．０％ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、３０分間）に供し、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色法によりＲＮＡのバンドを検出した。
［参考例２］
（アルミナ添加による前処理試薬からのＳＤＳ除去の影響）
　図８に示すように、アルミナを前処理試薬中に添加することにより、本発明における前処理試薬中に含まれるＳＤＳを除去することができ、この結果、鋳型ＲＮＡの核酸増幅が達成された。なお、本参考例では、ＳＤＳの核酸増幅抑制に対する活性のみを判断するため、ヒト鼻腔粘膜を含まない条件で実施した。
　本参考例におけるＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法では、増幅する鋳型ＲＮＡとしてインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）のＮＡ領域６７５－１０７５塩基までの配列を用いた。鋳型ＲＮＡの調製にあたり、まずＮＡ領域に相補的な配列を有するｃＤＮＡ、以下のプライマー３（配列番号９）及びプライマー４（配列番号１０）、ならびにＰＣＲの酵素としてＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを実施した。
 
プライマー３（配列番号９）
５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＡＴＧＣＧＴＴＴ－３’
プライマー４（配列番号１０）
５’－ＧＣＣＴＴＴＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣ－３’
　なお、前記ＰＣＲは、９８℃１０秒、５５℃５秒、及び７２℃３０秒の３つの温度を３０サイクル反応させた後、７２℃４分のインキュベーションによって達成した。このＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を元に、ＣＵＧＡ７　ｉｎ－ｖｉｔｒｏ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ニッポンジーン製）を用い、鋳型ＲＮＡを合成した。
　ＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法は、最終濃度として１．４ｍＭ　ｄＮＴＰ、５％　ＤＭＳＯ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　酢酸カリウム、１０ｍＭ　硫酸ナトリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１２ｕｎｉｔ　Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．１２５ｕｎｉｔ　ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを含む溶液に、以下に示す配列及び濃度のプライマー（配列番号１１～１５、ダナフォーム社製）及びエキシトンプライマー（配列番号１６、ダナフォーム社製、特許第４３７０３８５号公報参照）および前記合成した鋳型ＲＮＡを加えたものを反応溶液とした。
 
ＦＰプライマー１（配列番号１１、最終濃度１．８２μＭ）
５’－ＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＧＴＣＧＡＧＧＡＧＴＧ－３’
ＴＰプライマー１（配列番号１２、最終濃度１．８２μＭ）
５’－ＣＣＴＣＧＡＴＡＴＣＣＴＧＧＴＡＴＧＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＡ－３’
ＯＰプライマー３（配列番号１３、最終濃度０．２３μＭ）
５’－ＧＣＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧＧＡＡＧＴＧＣ－３’
ＯＰプライマー４（配列番号１４、最終濃度０．２３μＭ）
５’－ＴＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＣ－３’
ＢＰプライマー１（配列番号１５、最終濃度０．６８μＭ）
５’－ＴＧＴＧＴＣＴＧＣＡＧＡＧ－３’
ＢＰエキシトンプライマー１（配列番号１６、最終濃度０．２３μＭ）
５’－ＴＧＴＧＺＣＴＧＣＡＧＡＧ－３’（“Ｚ”はエキシトン標識されたチミン残基を示す）
　前処理試薬として、２０ｍＭ　ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．８）、２．５ｍＭ　硫酸鉄、２０ｍＭ　炭酸水素ナトリウムを含む溶液に０．１％　ＳＤＳを添加した溶液を調製した。この前処理試薬に、最終濃度１ｍｇ／ｍｌの活性アルミナ（和光純薬社製、分子量１０１．９６）を添加し、ボルテックスミキサーにより撹拌して懸濁した。前記懸濁後、ガラス焼結フィルターを有する空カラムMicro　Bio-Spin　Chromatography　Column（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）に、前記懸濁液をのせ、１２００×ｇ、1分間の遠心により、ＳＤＳを吸着したアルミナを除去した濾液を得た。また、比較対照として、アルミナを添加しない条件で前述と同様の処理を行い、濾液を得た。得られた濾液を、前記ＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法の反応溶液を用いて、核酸増幅活性の有無を調べる事で、ＳＤＳの残存活性（ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性）を比較した。
　前記ＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐの反応溶液に、前述の方法で処理を行なった濾液５μＬを加え、１反応あたり２５μＬの溶液となるよう調製し、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。増幅曲線の立ち上がりの有無により、核酸増幅の阻害を生ずるＳＤＳの残存性を評価した結果、図８に示すとおり、アルミナを添加した場合のみ顕著な核酸増幅が達成されることが認められた。よって、アルミナ添加処理によって、本発明における前処理試薬中からＳＤＳを除去する事が可能であると判断された。
［参考例３］
（限外濾過フィルターによる前処理試薬からのＳＤＳ除去の影響）
　図９に示すように、本発明における前処理試薬中に含まれる鉄イオン濃増加させることにより、ＳＤＳの沈殿形成を促進させ、その沈殿を、前記限外濾過フィルターを通過（濾過）させる処理を施すことにより、前処理試薬中に含まれるＳＤＳを除去することができ、鋳型ＲＮＡの核酸増幅を達成できた。なお、本参考例では、ＳＤＳの核酸増幅抑制に対する活性のみを判断するため、ヒト鼻腔粘膜を含まない条件で実施した。
　前処理試薬として、２０ｍＭ　ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．８）、５ｍＭ　硫酸鉄、２０ｍＭ　炭酸水素ナトリウムを含む溶液に０．１％　ＳＤＳを添加した溶液を調製した。この前処理試薬における鉄イオン濃度は、前記実施例１の前処理試薬と比較して高く設定されている。この前処理試薬を、マイレクスＨＶ（φ１３ｍｍ、膜孔径０．２２μｍ、ミリポア社製）にシリンジを用いて通過させ、濾液を得た。得られた濾液を、前記参考例２で示したＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法の反応溶液を用いて、核酸増幅活性の有無を調べる事で、ＳＤＳの残存活性（ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性）を、前記前処理試薬をフィルター濾過せずに用いた場合と比較した。
　前記ＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ反応溶液に、前述の方法で処理を行なった濾液を５μＬ加え、１反応あたり２５μＬの溶液となるよう調製し、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。増幅曲線の立ち上がりの有無により、核酸増幅の阻害を生ずるＳＤＳの残存性を評価した結果、図９に示すとおり、フィルター濾過を行なっていない場合では、核酸増幅が認められなかったが、０．２２μｍの膜孔径を有する限外濾過フィルターを通過させた場合では、顕著な核酸増幅が達成されることが認められた。よって、前処理試薬中の鉄イオン濃度の増加に伴い生じたＳＤＳの沈殿物を、限外濾過フィルター処理により除去する事で、本発明における前処理試薬中からＳＤＳを除去する事が可能であると判断された。
［参考例４］
（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００による、核酸増幅反応中でのＳＤＳの核酸増幅阻害の緩和効果）
　図１０に示すように、ＳＤＳを、核酸増幅反応溶液に直接添加した場合、核酸増幅反応溶液に非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ（登録商標）　Ｘ－１００を添加しておく事により、前処理試薬中に含まれるＳＤＳの核酸増幅阻害を緩和することができた。なお、本参考例では、ＳＤＳの核酸増幅抑制に対する活性のみを判断するため、ＳＤＳを単独でＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐに加えることで実施した。
　前記参考例２で示したＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法の反応溶液に、最終濃度が０％または０．５％となるようにＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を添加し、さらに、０．１％　ＳＤＳ溶液を５μＬ添加し、１反応あたり２５μＬの反応溶液となるよう調製した。
　この反応溶液について、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。増幅曲線の立ち上がりの有無により、核酸増幅のＳＤＳによる阻害効果を評価した結果、図１０に示すとおり、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を前記反応溶液中に添加した場合、有意な核酸増幅が認められた。よって、核酸増幅反応液中にＳＤＳが共存した場合でも、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００によりＳＤＳの核酸増幅阻害を緩和でき、鋳型ＲＮＡからの核酸増幅が達成できると判断された。
［実施例６］
（ヒト鼻腔粘膜に含まれたＲＮＡウイルスの検出）
　本発明における鉄イオンおよび炭酸イオンを含む前処理試薬にＳＤＳを加えた条件において、前記参考例２～４で示した工程を施す事により、図１１に示すとおり、ヒト鼻腔粘膜中に含まれたＲＮＡウイルスをＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法によって検出できた。
　前処理試薬として、２０ｍＭ　ＭＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．８）、５ｍＭ　硫酸鉄、２０ｍＭ　炭酸水素ナトリウムを含む溶液に０．１％　ＳＤＳを添加した溶液を調製した。この前処理試薬５００μＬに、ヒト鼻腔粘膜、および１０４ｐｆｕ／ｍＬ相当のインフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）を懸濁した。前記懸濁後、この懸濁液に、ウイルス外膜の破壊のために０．１％　ＳＤＳをさらに添加した後、マイレクスＨＶ（φ１３ｍｍ、膜孔径０．２２μｍ、ミリポア社製）にシリンジを用いて通過させ、得られた濾液を前処理済試料とした。また比較対照として、ウイルス外膜破壊用の０．１％　ＳＤＳを加えずに、前処理得試薬をフィルター濾過した試料を調製した。
　ＲＴ－ＳｍａｒｔＡｍｐ法は、最終濃度として１．４ｍＭ　ｄＮＴＰ、５％　ＤＭＳＯ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　酢酸カリウム、１０ｍＭ　硫酸ナトリウム、８ｍＭ　硫酸マグネシウム、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、１２ｕｎｉｔ　Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．１２５ｕｎｉｔ　ＡＭＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを含む溶液に、０．５％となるようにＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を添加し、さらに前記参考例２に示した配列及び濃度のプライマー（配列番号１１～１５、ダナフォーム社製）及びエキシトンプライマー（配列番号１６、ダナフォーム社製、特許第４３７０３８５号公報参照）を加えたものを反応溶液とした。
　その反応溶液に、前述した前処理済試料５μＬ加え、１反応あたり２５μＬの溶液となるよう調製し、リアルタイムＰＣＲ装置ＭＸ３０００ｐ（アジレント社製）にて６０℃、９０分間の一定温度下での反応を行い、ＦＡＭフィルターを通して蛍光増幅曲線を得ることにより、核酸増幅活性を調べた。その結果、図１１に示すとおり、前処理試薬にウイルス外膜破壊のために０．１％　ＳＤＳを更に添加した前処理済試薬のみ核酸増幅が達成され、ＲＮＡウイルスからの核酸増幅検出が可能であった。

Claims (23)

  1. ＲＮＡを含む生体試料の前処理方法であって、
    前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、
    前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害処理を実施することを特徴とする生体試料の前処理方法。
  2. 前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤を添加することで、前記生体試料に、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害処理を実施することを特徴とする、請求項１記載の生体試料の前処理方法。
  3. 前記生体試料が、動物の鼻腔粘膜、副鼻腔粘膜、気管粘膜、唾液、口腔または咽頭からの分泌液、涙、乳汁、胆汁、血液（白血球）、子宮頸管の粘膜、内外性器の粘膜、羊水、または尿を含むことを特徴とする、請求項１または２記載の生体試料の前処理方法。
  4. 前記動物が、ヒトであることを特徴とする、請求項３記載の生体試料の前処理方法。
  5. 前記生体試料が、ヒト鼻腔粘膜を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の生体試料の前処理方法。
  6. さらに、前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｃ）の逆転写阻害活性阻害処理を実施することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の生体試料の前処理方法。
  7. 前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｃ）の逆転写阻害活性阻害剤を添加することで、前記生体試料に、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｃ）の逆転写阻害活性阻害処理を実施することを特徴とする、請求項６記載の生体試料の前処理方法。
  8. 前記ＲＮＡ分解活性阻害剤及び前記逆転写阻害活性阻害剤の少なくとも一方が、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を含むことを特徴とする請求項７記載の生体試料の前処理方法。
  9. 前記鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を添加した前記生体試料を加熱処理することを特徴とする請求項８記載の生体試料の前処理方法。
  10. さらに、前記生体試料に、極性界面活性剤を添加することを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の生体試料の前処理方法。
  11. 前記極性界面活性剤が、ＳＤＳであることを特徴とする請求項１０記載の生体試料の前処理方法。
  12. 生体試料中のＲＮＡの検出方法であって、
    前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、
    前記生体試料を前処理する前処理工程と、
    前記前処理された生体試料中の前記ＲＮＡを増幅することで検出するＲＮＡ増幅検出工程とを含み、
    前記前処理工程が、請求項１から１１のいずれか一項に記載の生体試料の前処理方法により実施されることを特徴とする検出方法。
  13. 前記前処理工程が、請求項１から９のいずれか一項に記載の生体試料の前処理方法により実施され、
    前記ＲＮＡ増幅検出工程において、前記前処理された生体試料中に、さらに、界面活性剤を添加することを特徴とする請求項１２記載の検出方法。
  14. 前記界面活性剤が、非極性界面活性剤であることを特徴とする請求項１３記載の検出方法。
  15. 前記ＲＮＡの増幅が、逆転写酵素を用いた遺伝子増幅方法により実施されることを特徴とする請求項１２から１４のいずれか一項に記載の検出方法。
  16. 前記遺伝子増幅方法が、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを用いた等温増幅方法であることを特徴とする請求項１５記載の検出方法。
  17. ＲＮＡを含む生体試料の前処理キットであって、
    前記生体試料が、ラクトフェリン（Ｌａｃｔｆｅｒｒｉｎ）を含み、
    前記前処理キットが、ラクトフェリンのＲＮＡ分解活性阻害剤を含むことを特徴とする前処理キット。
  18. さらに、リゾチームＣ（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｃ）の逆転写阻害活性阻害剤を含むことを特徴とする請求項１７記載の前処理キット。
  19. 前記ＲＮＡ分解活性阻害剤及び前記逆転写阻害活性阻害剤の少なくとも一方が、鉄イオン剤及び炭酸イオン剤を含むことを特徴とする請求項１８記載の前処理キット。
  20. 前記鉄イオン剤及び前記炭酸イオン剤が、互いに接触しない状態で含まれていることを特徴とする請求項１９記載の前処理キット。
  21. さらに、極性界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１７から２０のいずれか一項に記載の前処理キット。
  22. 前記極性界面活性剤が、ＳＤＳであることを特徴とする請求項２１記載の前処理キット。
  23. さらに、非極性界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１７から２０のいずれか一項に記載の前処理キット。
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