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WO2012172987A1 - 表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法および表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置 - Google Patents

表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法および表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置 Download PDF

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WO2012172987A1
WO2012172987A1 PCT/JP2012/064089 JP2012064089W WO2012172987A1 WO 2012172987 A1 WO2012172987 A1 WO 2012172987A1 JP 2012064089 W JP2012064089 W JP 2012064089W WO 2012172987 A1 WO2012172987 A1 WO 2012172987A1
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WO
WIPO (PCT)
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fluorescence
light
surface plasmon
detection means
light detection
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PCT/JP2012/064089
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English (en)
French (fr)
Inventor
直樹 日影
正貴 松尾
高敏 彼谷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Konica Minolta Inc
Original Assignee
Konica Minolta Inc
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy based on the principle of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) using the surface plasmon resonance (SPR) surface plasmon resonance (SPR) phenomenon. And a surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer.
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • SPR surface plasmon resonance
  • SPR surface plasmon resonance
  • SPR surface plasmon resonance
  • SPR device As one of such specimen detection devices, a phenomenon in which electrons and light resonate in a minute region such as a nanometer level (surface plasmon resonance (SPR) phenomenon) is applied.
  • a surface plasmon resonance device (hereinafter referred to as “SPR device”) that detects a small amount of analyte can be used.
  • SPFS device based on the principle of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) using the surface plasmon resonance (SPR) phenomenon, analyte detection can be performed with higher accuracy than the SPR device.
  • SPFS device The surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer (hereinafter referred to as “SPFS device”) is also one of such specimen detection devices.
  • surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy SPFS
  • surface plasmon light is applied to the surface of a metal thin film under the condition that excitation light such as laser light emitted from a light source attenuates total reflection (ATR) on the surface of the metal thin film.
  • excitation light such as laser light emitted from a light source attenuates total reflection (ATR) on the surface of the metal thin film.
  • ATR total reflection
  • This electric field enhancement effect efficiently excites the fluorescent substance bound (labeled) with the analyte captured in the vicinity of the metal thin film.
  • a photon counting type photomultiplier tube (PMT) or a CCD (Charge Coupled) By observing this fluorescence using a light detection means such as a Device) camera, it is possible to detect an extremely small amount of analyte at a very low concentration.
  • the dynamic range of photodetection means such as a photomultiplier tube or a CCD camera may be exceeded, and accurate measurement may not be possible.
  • the light receiving element saturates when it receives light above a certain level, and the actual amount of fluorescence cannot be measured.
  • a photon counting type photomultiplier tube is used, as shown in FIG. 15, when a light exceeding a certain level is received, counting off due to pulse overlap occurs, resulting in a problem that the fluorescent signal is lowered. To do.
  • Patent Document 1 discloses that the dynamic range is widened by changing the area of the measurement region on the sample plate in order to limit the number of analytes in the measurement volume.
  • Patent Document 2 various methods for extending the dynamic range, such as extending the dynamic range of sample analysis, by combining a plurality of signals with different exposure times, and for quantifying the integrated light Signal calculation and processing are disclosed.
  • Patent Document 1 requires a measurement area having a different area depending on the analyte concentration, which leads to an increase in the size of the SPFS apparatus or each time an analyte having a different concentration is measured. It is necessary to prepare a sample plate on which different measurement areas are formed.
  • the fluorescence signal is accurately measured regardless of the type of the light detection means. It is an object of the present invention to provide a surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer and a surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer that can be used.
  • the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometry method of the present invention comprises: Surface plasmon excitation that detects the analyte by exciting the fluorescent substance labeled with analyte with the surface plasmon light generated by irradiating the metal thin film with excitation light, and receiving the generated fluorescence by the light detection means
  • An enhanced fluorescence spectroscopy method comprising: The dynamic range is widened by adjusting the amount of fluorescent light received by the light detection means.
  • the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer of the present invention is A sensor chip having a metal thin film formed on a dielectric member, a fine channel formed on the upper surface of the metal thin film, and a sensor unit formed in the fine channel is loaded and irradiated with excitation light.
  • a surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer that detects a specimen by A light source for irradiating the metal thin film with excitation light through the dielectric member;
  • a light detection means disposed above the sensor chip, Fluorescence generated by exciting the fluorescent substance immobilized on the sensor unit and labeling the analyte with surface plasmon light generated when the excitation light is irradiated onto the metal thin film is detected by the light detection means.
  • Configured to receive light The fluorescent light amount adjusting means is configured to be capable of adjusting the amount of fluorescent light received by the light detecting means.
  • the light detection means when detecting a sample solution having a high analyte concentration, even if a fluorescent substance emits a light quantity that cannot be measured by the light detection means, the light detection means.
  • the correct measurement can be performed by adjusting the amount of fluorescence received by the sensor, and it is possible to accurately detect an analyte having a wide dynamic range.
  • the light detection means is configured to adjust the amount of fluorescence received, it is possible to accurately detect an analyte having a wide dynamic range regardless of the type of the light detection means. it can.
  • the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometry method of the present invention includes a first fluorescence signal that is output when the light detection means receives fluorescence under a first condition; Output when the light detection means receives the fluorescence with the light quantity adjusted under the second condition adjusted so that the light quantity of the fluorescence received by the light detection means is smaller than the first condition.
  • a second fluorescent signal to To determine whether or not the first fluorescent signal is abnormal. When it is determined that the first fluorescent signal is abnormal, normal fluorescence is corrected by correcting the second fluorescent signal. It is characterized by obtaining a signal.
  • the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer of the present invention comprises a first fluorescence signal output when the light detection means receives fluorescence under a first condition, Under the second condition that is adjusted so that the amount of fluorescence received by the light detection means is smaller than that under the first condition, the light detection means has the light amount adjusted by the fluorescence amount adjustment means.
  • a second fluorescence signal that is output when fluorescence is received; To determine whether or not the first fluorescent signal is abnormal. When it is determined that the first fluorescent signal is abnormal, the second fluorescent signal is corrected to correct the normal fluorescent signal. It is characterized by obtaining.
  • the second fluorescence output when the light detection means receives the fluorescence with the adjusted light quantity can be used to obtain a normal fluorescent signal.
  • the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopic measurement method of the present invention is characterized in that the amount of fluorescence received by the light detection means is adjusted by adjusting the amount of fluorescence generated.
  • the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer of the present invention is characterized in that the fluorescence amount adjusting means is provided between the sensor chip and the light detecting means.
  • the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopic measurement method of the present invention is characterized in that the light amount of the fluorescence received by the light detection means is adjusted by adjusting the light amount of the excitation light.
  • the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer of the present invention is characterized in that the fluorescence amount adjusting means is provided between the light source and a dielectric member.
  • the intensity of the electric field due to surface plasmon light is reduced by reducing the amount of excitation light applied to the metal thin film, and as a result, light is emitted from the fluorescent substance that labels the analyte.
  • the amount of fluorescent light can be reduced to the amount of light that can be measured by the light detection means.
  • the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopic measurement method of the present invention receives the fluorescence by the light detection means while changing the incident angle of the excitation light to the metal thin film in a predetermined range, An abnormal fluorescence signal is discriminated based on a relationship between an incident angle of the excitation light and a fluorescence signal output when the light detection unit receives fluorescence.
  • the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer of the present invention receives the fluorescence by the light detection means while changing the incident angle of the excitation light to the metal thin film within a predetermined range using the irradiation angle adjusting means. And An abnormal fluorescence signal is discriminated based on a relationship between an incident angle of the excitation light and a fluorescence signal output when the light detection unit receives fluorescence.
  • the fluorescence amount adjustment means by adjusting the amount of fluorescence received by the light detection means by the fluorescence amount adjustment means, accurate measurement can be performed even if fluorescence exceeding the measurable range of the light detection means is generated. It is possible to detect an analyte having a wide dynamic range suitable for the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy method or the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer.
  • FIG. 1 is a schematic diagram schematically showing an outline of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer for explaining a surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer of the present invention.
  • FIG. 2 is a partially enlarged view of FIG.
  • FIG. 3 is a flowchart for explaining the flow of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy measurement.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the analyte concentration, the fluorescence signal output by the light detection means 30 in a state without dimming, and the fluorescence signal output by the light detection means 30 in a dimmed state.
  • FIG. 1 is a schematic diagram schematically showing an outline of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer for explaining a surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer of the present invention.
  • FIG. 2 is a partially enlarged view of FIG.
  • FIG. 3 is a flowchart for explaining the flow of surface plasmon excitation
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the analyte concentration, the fluorescence signal output by the light detection means 30 without correction, and the fluorescence signal output by the light detection means 30 with correction.
  • FIG. 6 is a schematic view schematically showing an outline of an SPFS apparatus for explaining the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopic measurement method of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the analyte concentration, the fluorescence signal output by the light detection means 30 in a state without dimming, and the fluorescence signal output by the light detection means 30 in a dimmed state.
  • FIG. 6 is a schematic view schematically showing an outline of an SPFS apparatus for explaining the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopic measurement method of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the analyte concentration, the fluorescence signal output by the light detection means 30 in a state without dimming, and the fluorescence signal output by the light detection means
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between the analyte concentration, the fluorescence signal output by the light detection means 30 without correction, and the fluorescence signal output by the light detection means 30 with correction.
  • FIG. 9 is a schematic view schematically showing an outline of an SPFS apparatus for explaining the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopic measurement method of the present invention.
  • FIG. 10 is a schematic view schematically showing an outline of an SPFS apparatus for explaining the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopic measurement method of the present invention.
  • FIG. 11 is a partially enlarged view of FIG.
  • FIG. 12 is a graph showing the relationship between the incident angle of excitation light and the fluorescence signal when an analyte solution having a low analyte concentration is measured.
  • FIG. 13 is a graph showing the relationship between the incident angle of excitation light and the fluorescence signal when an analyte solution having a high analyte concentration is measured.
  • FIG. 14 is a graph showing the relationship between the amount of fluorescence received and the fluorescence signal when a CCD camera is used.
  • FIG. 15 is a graph showing the relationship between the amount of received light and the fluorescence signal when a photon counting photomultiplier tube is used.
  • FIG. 1 shows an outline of a surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer (hereinafter referred to as “SPFS apparatus”) for explaining a surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer according to the present invention.
  • FIG. 2 is a partially enlarged view of FIG. 1
  • FIG. 3 is a flowchart for explaining the flow of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy measurement. 1-1.
  • the SPFS device 10 of the present invention includes a prism-shaped dielectric member 12 having a substantially trapezoidal vertical cross-sectional shape, a metal thin film 14 formed on the horizontal upper surface 12a of the dielectric member 12, and the metal A sensor chip 18 including a fine channel 16 formed on the upper surface 14 a of the thin film 14 is provided, and the sensor chip 18 is loaded in the sensor chip loading unit 20 of the SPFS device 10.
  • a sensor unit 22 on which a ligand that specifically binds to a specific analyte is fixed is provided in a part of the fine channel 16.
  • a sample solution containing a specific analyte is caused to flow into the sensor unit 22 via the fine channel 16, and then a fluorescent substance for labeling the analyte is caused to flow via the fine channel 16, thereby An analyte labeled with a fluorescent substance 22 can be immobilized.
  • the fluorescent substance is not particularly limited as long as it is a substance that emits fluorescence by irradiating predetermined excitation light or using the electric field effect.
  • fluorescence includes various types of light emission such as phosphorescence.
  • the analyte solution containing the analyte is not particularly limited, but examples of such a specimen include blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, feces, body cavity fluid (spinal fluid, ascites fluid). , Pleural effusion, etc.).
  • the analyte contained in the sample is, for example, a nucleic acid (DNA that may be single-stranded or double-stranded, RNA, polynucleotide, oligonucleotide, PNA (peptide nucleic acid), etc., or nucleoside , Nucleotides and their modified molecules), proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or their modified molecules, composites
  • Specific examples include carcinoembryonic antigens such as AFP ( ⁇ -fetoprotein), tumor markers, signal transmitters, hormones, and the like, and are not particularly limited.
  • a light source 24 is disposed on one side surface 12 b below the dielectric member 12, and excitation light 26 from the light source 24 is below the dielectric member 12.
  • the excitation light 26 enters the side surface 12b of the dielectric member 12 and passes through the dielectric member 12 toward the metal thin film 14 formed on the upper surface 12a of the dielectric member 12, and attenuates total reflection (ATR). Irradiation is performed at a predetermined incident angle (resonance angle) ⁇ 1.
  • a light detection means 30 for receiving the fluorescence 28 emitted from the fluorescent material when excited.
  • the light detecting means 30 is not particularly limited.
  • a photon counting type photomultiplier tube a CCD (Charge Coupled Device) image sensor capable of multipoint measurement, a CMOS (Complementary Metal). Oxide (Semiconductor) image sensor can be used.
  • a photon counting type photomultiplier tube is used.
  • the fluorescent light amount adjusting means 32 for adjusting the light amount of emitted fluorescent light between the sensor chip 18 and the light detecting means 30 the light amount can be reduced by 99%.
  • the filter 34 is arranged freely in and out.
  • the fluorescence amount adjusting means 32 is not particularly limited as long as the amount of light received by the light detecting means 30 can be adjusted.
  • ND neutral density
  • a wavelength selection filter, A diaphragm lens or the like may be disposed freely, and an aperture may be provided to adjust the amount of light depending on the size of the opening.
  • the fluorescence amount adjusting means 32 can also be used as the focus adjusting means of the light detecting means 30, and the amount of fluorescence received by the light detecting means 30 by defocusing the light detecting means 30. Can also be adjusted.
  • the excitation light emitted from the light source 24 is not particularly limited, but excitation light having a wavelength of 200 to 900 nm, 0.001 to 1,000 mW is preferable, and further, a wavelength of 230 to 800 nm. The excitation light of 0.01 to 100 mW is preferable.
  • the dielectric member 12 is not particularly limited, but optically transparent, for example, various inorganic materials such as glass and ceramics, natural polymers, and synthetic polymers can be used, and the chemical stability. From the viewpoints of production stability and optical transparency, those containing silicon dioxide (SiO 2 ) or titanium dioxide (TiO 2 ) are preferred.
  • the prism-shaped dielectric member 12 having a substantially trapezoidal vertical cross-sectional shape is used.
  • the vertical cross-sectional shape may be a triangle (so-called triangular prism), a semicircular shape, a semi-elliptical shape, etc.
  • the shape of the body member 12 can be changed as appropriate.
  • the material of the metal thin film 14 is not particularly limited, but is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, more preferably It is made of gold and may be made of an alloy of these metals.
  • Such a metal is suitable for the metal thin film 14 because it is stable against oxidation and, as will be described later, the electric field enhancement by surface plasmon light (dense wave) increases.
  • the method for forming the metal thin film 14 is not particularly limited, and examples thereof include a sputtering method, a vapor deposition method (resistance heating vapor deposition method, electron beam vapor deposition method, etc.), electrolytic plating, electroless plating method, and the like. . It is preferable to use a sputtering method or a vapor deposition method because it is easy to adjust the thin film formation conditions.
  • the thickness of the metal thin film 14 is not particularly limited, but preferably gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 Desirably within the range of ⁇ 500 nm and their alloys: 5 to 500 nm.
  • more preferable thicknesses of the metal thin film 14 are gold: 20 to 70 nm, silver: 20 to 70 nm, aluminum: 10 to 50 nm, copper: 20 to 70 nm, platinum: 20 to 70 nm and their alloys: preferably in the range of 10-70 nm.
  • the thickness of the metal thin film 14 is within the above range, surface plasmon light (dense wave), which will be described later, is easily generated, which is preferable.
  • the size (vertical x horizontal) size and shape are not particularly limited. 1-2. Fluorescence measurement method A surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy measurement method using the SPFS device 10 of the present invention configured as described above will be described with reference to the flowchart shown in FIG.
  • the analyte solution containing the analyte is caused to flow into the sensor unit 22 via the fine channel 16, and then the fluorescent substance for labeling the analyte is similarly caused to flow via the fine channel 16. It is assumed that the analyte labeled with a fluorescent substance is immobilized on the sensor unit 22.
  • the excitation light 26 is irradiated from the light source 24 and is incident on the side surface 12 b of the dielectric member 12 from the lower outside of the dielectric member 12.
  • the excitation light 26 is irradiated through the dielectric member 12 toward the metal thin film 14 formed on the upper surface 12a of the dielectric member 12 at a predetermined incident angle (resonance angle) ⁇ 1 at which total reflection attenuation (ATR) occurs. Is done.
  • surface plasmon light (dense wave) is emitted from the surface of the metal thin film 14, and the fluorescent substance that labels the analyte immobilized on the sensor unit 22 by this surface plasmon light (dense wave). Is excited, and fluorescence 28 is emitted.
  • the fluorescence amount adjusting means 32 is in a state without dimming, that is, a state in which the dimming (ND) filter 34 is not inserted between the sensor chip 18 and the light detecting means 30 (first condition) ).
  • the fluorescence 28 is set in a state where the light is attenuated by the fluorescence amount adjusting means 32, that is, in a state where the dimming (ND) filter 34 is inserted between the sensor chip 18 and the light detection means 30 (second condition).
  • the second fluorescence signal is output from the light detection means 30.
  • Fluorescence 28 received by the light detection means 30 is reduced to 1/100 compared to the non-dimmed state by being attenuated by the fluorescence amount adjusting means 32. For this reason, if the light detection means 30 normally receives the fluorescence 28, the second fluorescence signal will also be 1/100 compared with the first fluorescence signal output in a non-dimmed state.
  • Table 1 shows the relationship between the analyte concentration, the fluorescence signal output by the light detection means 30 in a non-dimmed state, and the fluorescence signal output by the light detection means 30 in a dimmed state.
  • FIG. 4 is a graph of Table 1.
  • the determination of such a decrease in the fluorescence signal is that the fluorescence signal when dimmed by the fluorescence amount adjusting means 32 is 1/100 compared to the fluorescence signal without dimming. Based on.
  • the fluorescence signal with dimming is not dimming.
  • the value is larger than 1/100 of the fluorescence signal.
  • an accurate fluorescence signal can be obtained by correcting the value using the fluorescence signal in the case of dimming (in this embodiment, the value of the fluorescence signal in the case of dimming is multiplied by 100). Can be obtained.
  • the fluorescence signal in the case of dimming is different from the fluorescence signal in the case of no dimming.
  • the value is larger than 1/100, this is caused by the minimum value of the light quantity measurable by the light detection means 30, and the fluorescence signal when there is dimming outputs an abnormal value. It is because it is doing.
  • the fluorescence signal without dimming can be obtained as a normal value.
  • the normal analyte concentration can be measured as shown in Table 2 and FIG.
  • FIG. 6 is a schematic view schematically showing an outline of an SPFS apparatus for explaining the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy measurement method of the present invention.
  • the SPFS device 10 of this modification has basically the same configuration as the SPFS device shown in FIGS. 1 to 5, and the principle is the same. A detailed description thereof will be omitted.
  • the fluorescence amount adjusting means 32 is provided between the light source 24 and the sensor chip 18. With this configuration, the amount of excitation light 26 irradiated from the light source 24 onto the metal thin film 14 is adjusted (dimmed), and as a result, the electric field strength due to the surface plasmon light generated on the surface of the metal thin film 14 is reduced. Can be made.
  • the amount of fluorescence emitted from the fluorescent substance that labels the analyte can be adjusted, and the amount of fluorescence received by the light detection means 30 can be adjusted as in the first embodiment.
  • a fluorescent signal corresponding to the analyte concentration can be obtained by using a method for measuring the amount of fluorescence.
  • the fluorescence amount adjusting means 32 can also have a light amount adjusting function of the light source 24, and the light amount of the excitation light 26 emitted from the light source 24 can also be adjusted.
  • Table 3 shows the relationship between the analyte concentration, the fluorescence signal output by the light detection means 30 in a non-dimmed state, and the fluorescence signal output by the light detection means 30 in a dimmed state.
  • FIG. 7 is a graph of Table 3.
  • such an abnormal output of the fluorescence signal is determined by reducing the fluorescence signal when dimmed by the fluorescence amount adjusting means 32 to 1/100 compared with the fluorescence signal without dimming. To be based on becoming.
  • the fluorescence signal with dimming is not dimming.
  • the value is larger than 1/100 of the fluorescence signal.
  • an accurate fluorescence signal can be obtained by correcting the value using the fluorescence signal in the case of dimming (in this embodiment, the value of the fluorescence signal in the case of dimming is multiplied by 100). Can be obtained.
  • the fluorescence signal in the case of dimming is different from the fluorescence signal in the case of no dimming.
  • the value is larger than 1/100, this is caused by the minimum value of the light quantity measurable by the light detection means 30, and the fluorescence signal when there is dimming outputs an abnormal value. It is because it is doing.
  • the fluorescence signal without dimming can be obtained as a normal value.
  • FIG. 9 is a schematic view schematically showing an outline of an SPFS apparatus for explaining the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometry method of the present invention.
  • the SPFS device 10 of this modification has basically the same configuration as the SPFS device shown in FIGS. 1 to 5, and the principle is the same. A detailed description thereof will be omitted. 3-1. Configuration of SPFS Device In this modification, as shown in FIG. 9, the fluorescence amount adjusting means is provided between the sensor chip 18 and the light detecting means 30 (fluorescence amount adjusting means 32a), and the light source 24 and the sensor chip 18 are arranged. (Fluorescence amount adjusting means 32b).
  • the amount of fluorescence emitted from the fluorescent substance that labels the analyte can be adjusted by the fluorescence amount adjusting means 32a, and the amount of the excitation light 26 irradiated from the light source 24 to the metal thin film 14 can be adjusted. Can do.
  • a wider dynamic range can be provided by adjusting not only the amount of fluorescence generated but also the amount of excitation light 26 caused by the generation of fluorescence 28.
  • a wider dynamic can be obtained by detecting the analyte immobilized on the sensor unit 22 while adjusting the fluorescence amount.
  • a fluorescence signal in a range can be obtained, and a sample solution having a wider range of analyte concentrations can be measured.
  • FIG. 10 is a schematic diagram schematically showing an outline of an SPFS apparatus for explaining the surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometry method of the present invention
  • FIG. 11 is a diagram of FIG. It is a partial enlarged view.
  • the SPFS device 10 of this modification has basically the same configuration as the SPFS device shown in FIGS. 1 to 5, and the principle is the same. A detailed description thereof will be omitted. 4-1. Configuration of SPFS Device In this modification, as shown in FIG. 10, the incident angle of the excitation light 26 irradiated from the light source 24 toward the metal thin film 14 via the dielectric member 12 is changed. An irradiation angle adjusting means capable of performing the above is provided as the fluorescence amount adjusting means 32.
  • the incident angle of the excitation light 26 with respect to the metal thin film 14 is made smaller than the resonance angle (that is, the angle at which the excitation light 26 attenuates total reflection (ATR)), Alternatively, the amount of fluorescence can be reduced by increasing it. 4-2. Regarding Correction of Fluorescence Signal
  • the illumination angle adjusting means is provided in the light source 24 as in this modification, the above-described angle dependency can be used for discrimination of an abnormal output of the fluorescence signal.
  • the fluorescence signal is obtained while changing the angle of incidence of the excitation light 26 within a predetermined range (45 ° to 70 ° in the present embodiment).
  • a predetermined range 45 ° to 70 ° in the present embodiment.
  • an abnormal fluorescence signal is obtained, such as the generation of a plurality of peaks.
  • the present invention has been described above, but the present invention is not limited to this.
  • the light amount of the fluorescence 28 received by the light detection means 30 is 1/100.
  • the light is attenuated by the fluorescence amount adjusting means 32, various changes can be made without departing from the object of the present invention, such as being able to be changed as appropriate according to the required dynamic range.
  • the present invention provides an accurate and wide dynamic range analyte in fields requiring high-precision detection, such as clinical tests such as blood tests using surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS). Detection can be performed.
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy

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Abstract

［課題］ＳＰＦＳ装置のダイナミックレンジを調整することによって、アナライト濃度が高濃度の場合であっても、光検出手段の種類によらず、正確に蛍光シグナルを測定することができる表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法および表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置を提供する。 ［解決手段］蛍光物質により標識されたアナライトを、金属薄膜に励起光を照射することによって発生した表面プラズモン光で励起して、発生した蛍光を光検出手段によって受光することにより、アナライトの検出を行う表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法であって、光検出手段が受光する蛍光の光量を調整することによって、ダイナミックレンジを広げる。

Description

表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法および表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置
　本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法および表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置に関する。
　従来から、極微少な物質の検出を行う場合において、物質の物理的現象を応用することでこのような物質の検出を可能とした様々な検体検出装置が用いられている。
　このような検体検出装置の一つとして、ナノメートルレベルなどの微細領域中で電子と光が共鳴する現象（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）現象）を応用し、例えば、生体内の極微少なアナライトの検出を行うようにした表面プラズモン共鳴装置（以下、「ＳＰＲ装置」と言う）が挙げられる。
　また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を応用した、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づき、ＳＰＲ装置よりもさらに高精度にアナライト検出を行えるようにした表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」と言う）も、このような検体検出装置の一つである。
　この表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザー光などの励起光が、金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；Attenuated Total Reflectance）する条件において、金属薄膜表面に表面プラズモン光（疎密波）を発生させることによって、光源より照射した励起光が有するフォトン量を数十倍～数百倍に増やして、表面プラズモン光の電場増強効果を得るようになっている。
　そして、この電場増強効果により、金属薄膜近傍に捕捉したアナライトと結合（標識）した蛍光物質を効率良く励起させ、例えば、フォトンカウンティング方式の光電子倍増管（ＰＭＴ；Photomultiplier Tube）やＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラなどの光検出手段を用いて、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトをも検出することができる。
特開２００９－７９９７０号公報 特開２００９－２４４２７０号公報
　しかしながら、アッセイエリア（測定領域）にアナライトを集積させる高感度のＳＰＦＳ装置の場合には、アナライト濃度の変化に対して、蛍光シグナル（光検出手段が出力するシグナル）の変動幅が非常に大きくなる。
　このため、アナライト濃度が高濃度の場合には、光電子倍増管やＣＣＤカメラなどの光検出手段のダイナミックレンジをオーバーしてしまい、正確な測定をすることが出来ない場合があった。
　例えば、ＣＣＤなどの撮像素子を用いたカメラの場合、図１４に示すように、一定以上の光を受けると受光素子が飽和してしまい、実際の蛍光量を測定できないという問題が発生する。また、フォトンカウンティング方式の光電子増倍管を用いた場合にも、図１５に示すように、一定以上の光を受けるとパルスオーバーラップによる数え落としが発生し、蛍光シグナルが低下するという問題が発生する。
　特許文献１では、測定体積中の被分析物質の数を制限するために、サンプルプレート上の測定領域の面積を変えることによって、ダイナミックレンジの広域化を図ることが開示されている。
　また、特許文献２では、露光時間が異なる複数の信号を合成することによって、検体分析のダイナミックレンジを拡張するなど、ダイナミックレンジを拡張するための種々の方法や、集積光を定量化するための信号の算出や処理について開示されている。
　しかしながら、特許文献１に開示された方法では、アナライト濃度に応じて面積の異なる測定領域が必要となり、ＳＰＦＳ装置の大型化に繋がるか、もしくは、異なる濃度のアナライトを測定するたびに、面積の異なる測定領域が形成されたサンプルプレートを準備する必要がある。
　また一方で、ＳＰＦＳ装置特有の問題として、アッセイエリアに集積したアナライトに蛍光標識物質が結合した際、限定されたエリアに蛍光物質が密集することで濃度消光を起こし蛍光シグナルが減少したり、アナライトと結合した蛍光物質から発光した蛍光が、金属薄膜表面に発生した表面プラズモン光とカップリングしロスしてしまうことがある。
　このような蛍光シグナルのロスが金属薄膜上で発生しているのか、光検出手段のダイナミックレンジの問題によって、蛍光シグナルが低下しているのかを判別することは、ＳＰＦＳ装置の正確性を担保する上でも重要になってくる。しかしながら、特許文献１、２に開示された発明は、ＳＰＦＳ装置に適したダイナミックレンジの拡張に必ずしも繋がるものではなかったというのが実情である。
　本発明では、このような現状を鑑み、ＳＰＦＳ装置のダイナミックレンジを調整することによって、アナライト濃度が高濃度の場合であっても、光検出手段の種類によらず、正確に蛍光シグナルを測定することができる表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法および表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置を提供することを目的とする。
　本発明は、前述したような従来技術における課題及び目的を達成するために発明されたものであって、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法は、
　金属薄膜に励起光を照射することによって発生した表面プラズモン光でアナライトを標識した蛍光物質を励起して、発生した蛍光を光検出手段によって受光することにより、アナライトの検出を行う表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法であって、
　前記光検出手段が受光する蛍光の光量を調整することによって、ダイナミックレンジを広げることを特徴とする。
　また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置は、
　誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜の上面に形成された微細流路と、前記微細流路中に形成されたセンサ部とを有するセンサチップが装填され、励起光を照射することで検体の検出を行う表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置であって、
　前記誘電体部材を介して前記金属薄膜に励起光を照射する光源と、
　前記センサチップの上方に配置された光検出手段と、を備え、
　前記センサ部に固定化された、アナライトを標識する蛍光物質を、前記励起光を前記金属薄膜に照射した際に発生する表面プラズモン光によって励起することで発生した蛍光を、前記光検出手段で受光するように構成されるとともに、
　蛍光量調整手段によって、前記光検出手段で受光する蛍光の光量を調整可能に構成されていることを特徴とする。
　このように構成することによって、アナライト濃度が高濃度の検体溶液の検出を行う場合に、蛍光物質から光検出手段で計測不可能な光量の蛍光が発光した場合であっても、光検出手段で受光する蛍光量を調整することによって正しい計測を行うことができ、正確でダイナミックレンジの広いアナライトの検出を行うことができる。
　また、本発明においては、光検出手段が受光する蛍光の光量を調整するように構成しているため、光検出手段の種類によらず、正確でダイナミックレンジの広いアナライトの検出を行うことができる。
　また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法は、第１の条件下で、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する第１蛍光シグナルと、
　前記第１の条件下よりも前記光検出手段が受光する蛍光の光量が小さくなるように調整された第２の条件下で、前記光検出手段が光量を調整された蛍光を受光した場合に出力する第２蛍光シグナルと、
を比較することによって、前記第１蛍光シグナルが異常か否かを判別し、前記第１蛍光シグナルが異常であると判断した場合には、前記第２蛍光シグナルを補正することによって、正常な蛍光シグナルを得ることを特徴とする。
　また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置は、第１の条件下で、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する第１蛍光シグナルと、
　前記第１の条件下よりも前記光検出手段が受光する蛍光の光量が小さくなるように調整された第２の条件下で、前記光検出手段が、前記蛍光量調整手段によって光量を調整された蛍光を受光した場合に出力する第２蛍光シグナルと、
を比較することによって、前記第１蛍光シグナルが異常か否かを判別し、前記第１蛍光シグナルが異常であると判断した場合には前記第２蛍光シグナルを補正することによって、正常な蛍光シグナルを得ることを特徴とする。
　このように構成することによって、蛍光物質から光検出手段で計測不可能な光量の蛍光が発光した場合であっても、光量を調整した蛍光を光検出手段が受光した場合に出力する第２蛍光シグナルを用いて、正常な蛍光シグナルを得ることができる。
　このため、アナライト濃度が低濃度の検体溶液からアナライト濃度が高濃度の検体溶液まで正確に検出することができ、ダイナミックレンジの広いアナライトの検出を行うことができる。
　また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法は、前記発生した蛍光の光量を調整することによって、前記光検出手段が受光する蛍光の光量を調整することを特徴とする。
　また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置は、前記蛍光量調整手段を、前記センサチップと光検出手段との間に設けたことを特徴とする。
　このように構成することによって、蛍光物質が表面プラズモン光によって励起されて発光した蛍光を、直接調整することができ、光検出手段が計測可能な光量に減光することが容易である。
　また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法は、前記励起光の光量を調整することによって、前記光検出手段が受光する蛍光の光量を調整することを特徴とする。
　また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置は、前記蛍光量調整手段を、前記光源と誘電体部材との間に設けたことを特徴とする。
　このように構成した場合であっても、金属薄膜に照射する励起光の光量を減光することによって、表面プラズモン光による電場強度を低下させ、その結果、アナライトを標識する蛍光物質から発光する蛍光の光量を、光検出手段が計測可能な光量に減光することができる。
　また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法は、前記金属薄膜に対する励起光の入射角を所定の範囲において変化させながら、前記光検出手段によって蛍光を受光し、
　前記励起光の入射角と、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する蛍光シグナルとの関係に基づき、異常な蛍光シグナルを判別することを特徴とする。
　また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置は、前記照射角調整手段を用いて、前記金属薄膜に対する励起光の入射角を所定の範囲において変化させながら、前記光検出手段によって蛍光を受光し、
　前記励起光の入射角と、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する蛍光シグナルとの関係に基づき、異常な蛍光シグナルを判別することを特徴とする。
　このように構成した場合であっても、蛍光物質から光検出手段で計測不可能な光量の蛍光が発光した場合に、光検出手段から異常な蛍光シグナルが出力されていると判別することができる。
　本発明によれば、蛍光量調整手段によって、光検出手段が受光する蛍光量を調整することによって、光検出手段の測定可能範囲を上回る蛍光が発生したとしても、正確な測定をすることができ、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法または表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置に適したダイナミックレンジの広いアナライトの検出を行うことができる。
図１は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明する表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置の概略を模式的に示す概略図である。 図２は、図１の部分拡大図である。 図３は、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定の流れを説明するフローチャートである。 図４は、アナライト濃度と、減光なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び減光した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表すグラフである。 図５は、アナライト濃度と、補正なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び補正した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表すグラフである。 図６は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図である。 図７は、アナライト濃度と、減光なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び減光した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表すグラフである。 図８は、アナライト濃度と、補正なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び補正した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表すグラフである。 図９は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図である。 図１０は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図である。 図１１は、図１０の部分拡大図である。 図１２は、アナライト濃度が低濃度の検体溶液を測定した場合の励起光の入射角と蛍光シグナルとの関係を表すグラフである。 図１３は、アナライト濃度が高濃度の検体溶液を測定した場合の励起光の入射角と蛍光シグナルとの関係を表すグラフである。 図１４は、ＣＣＤカメラを用いた場合の受光蛍光量と蛍光シグナルとの関係を表すグラフである。 図１５は、フォトンカウンティング方式の光電子倍増管を用いた場合の受光蛍光量と蛍光シグナルとの関係を表すグラフである。
　以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいてより詳細に説明する。
　［実施例１］
１．発生した蛍光量を調整する場合の実施例
　図１は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明する表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」と言う）の概略を模式的に示す概略図、図２は、図１の部分拡大図、図３は、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定の流れを説明するフローチャートである。
１－１．ＳＰＦＳ装置の構成
　本発明のＳＰＦＳ装置１０は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２と、この誘電体部材１２の水平な上面１２ａに形成された金属薄膜１４と、この金属薄膜１４の上面１４ａに形成された微細流路１６とからなるセンサチップ１８を備えており、このセンサチップ１８は、ＳＰＦＳ装置１０のセンサチップ装填部２０に装填されている。
　また、微細流路１６の一部には、特定のアナライトと特異的に結合するリガンドが固定化されたセンサ部２２が設けられている。このセンサ部２２に微細流路１６を介して特定のアナライトを含有した検体溶液を流入させ、その後、アナライトを標識する蛍光物質を、微細流路１６を介して流入させることで、センサ部２２に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化された状態とすることができる。
　ここで、蛍光物質としては、所定の励起光を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光を発する物質であれば、特に限定されない。なお、本明細書において、「蛍光」とは、燐光など各種の発光も含まれる。
　また、アナライトを含有した検体溶液としては、特に限定されるものではないが、このような検体としては、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられる。
　また、検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
　また、誘電体部材１２の下方の一方の側面１２ｂの側には、図１に示すように、光源２４が配置されており、この光源２４からの励起光２６が、誘電体部材１２の外側下方から、誘電体部材１２の側面１２ｂに入射して、誘電体部材１２を介して、誘電体部材１２の上面１２ａに形成された金属薄膜１４に向かって、励起光２６が全反射減衰（ＡＴＲ）する所定の入射角（共鳴角）α１で照射されるようになっている。
　また、センサチップ１８の上方には、蛍光物質が励起されて発光した蛍光２８を受光するための光検出手段３０が備えられている。
　ここで、光検出手段３０としては、特に限定されるものではないが、例えば、フォトンカウンティング方式の光電子増倍管や、多点計測が可能なＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサなどを用いることができる。なお、本実施例では、フォトンカウンティング方式の光電子倍増管を用いている。
　また、本実施例では、センサチップ１８と光検出手段３０との間には、発光した蛍光の光量を調整するための蛍光量調整手段３２として、光量を９９％カットすることができる減光（ＮＤ）フィルタ３４が出し入れ自由に配置されている。
　なお、蛍光量調整手段３２としては、光検出手段３０における受光量を調整できるものであれば、特に限定されるものではなく、減光（ＮＤ）フィルタ３４以外にも、例えば、波長選択フィルタやダイアフラムレンズなどが出し入れ自由に配置されていてもよいし、アパーチャーを設けてその開口の大きさによって光量を調整するようにしてもよい。
　また、本実施例の場合には、蛍光量調整手段３２を光検出手段３０のフォーカス調整手段とすることもでき、光検出手段３０をデフォーカスすることによって、光検出手段３０が受光する蛍光量を調整することもできる。
　本実施例において、光源２４から照射される励起光としては、特に限定されるものではないが、波長２００～９００ｎｍ、０．００１～１，０００ｍＷの励起光が好ましく、更には、波長２３０～８００ｎｍ、０．０１～１００ｍＷの励起光が好ましい。
　また、誘電体部材１２としては、特に限定されるものではないが、光学的に透明な、例えば、ガラス、セラミックスなどの各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性、製造安定性、光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むものが好ましい。
　また、この実施例では、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２を用いたが、鉛直断面形状を三角形（いわゆる三角プリズム）、半円形状、半楕円形状にするなど、誘電体部材１２の形状は、適宜変更可能である。
　また、金属薄膜１４の材質としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは、金からなり、さらに、これら金属の合金から構成してもよい。
　このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ、後述するように、表面プラズモン光（疎密波）による電場増強が大きくなるので、金属薄膜１４として好適である。
　また、金属薄膜１４の形成方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。好ましくは、スパッタリング法、蒸着法を使用するのが、薄膜形成条件の調整が容易であるので望ましい。
　さらに、金属薄膜１４の厚さとしては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金：５～５００ｎｍ、銀：５～５００ｎｍ、アルミニウム：５～５００ｎｍ、銅：５～５００ｎｍ、白金：５～５００ｎｍ、および、それらの合金：５～５００ｎｍの範囲内であるのが望ましい。
　なお、後述する電解増強効果の観点から、より好ましい金属薄膜１４の厚さとしては、金：２０～７０ｎｍ、銀：２０～７０ｎｍ、アルミニウム：１０～５０ｎｍ、銅：２０～７０ｎｍ、白金：２０～７０ｎｍ、および、それらの合金：１０～７０ｎｍの範囲内であるのが望ましい。
　金属薄膜１４の厚さが上記範囲内であれば、後述する表面プラズモン光（疎密波）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１４であれば、大きさ（縦×横）の寸法、形状は、特に限定されない。
１－２．蛍光量の測定方法について
　このように構成される本発明のＳＰＦＳ装置１０を用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法について、図３に示すフローチャートに沿って説明する。
　先ず、センサ部２２に微細流路１６を介してアナライトを含有する検体溶液を流入させ、その後、このアナライトを標識する蛍光物質を、同様に微細流路１６を介して流入させることで、センサ部２２に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化された状態とする。
　そして、この状態で光源２４から励起光２６を照射して、誘電体部材１２の外側下方から、誘電体部材１２の側面１２ｂに入射させる。そして、誘電体部材１２を介して、誘電体部材１２の上面１２ａに形成された金属薄膜１４に向かって、励起光２６が全反射減衰（ＡＴＲ）する所定の入射角（共鳴角）α１で照射される。
　励起光２６を照射することによって、金属薄膜１４の表面から表面プラズモン光（疎密波）を放出させ、この表面プラズモン光（疎密波）によりセンサ部２２に固定化されたアナライトを標識する蛍光物質が励起され、蛍光２８が発光される。
　なお、このとき、蛍光量調整手段３２は減光なしの状態、すなわち、減光（ＮＤ）フィルタ３４を、センサチップ１８と光検出手段３０との間に挿入していない状態（第１の条件）とする。
　そして、この蛍光２８を光検出手段３０で検出することによって、センサ部２２に固定化されたアナライトを検知し、光検出手段３０からはアナライト濃度に応じた蛍光シグナル（第１蛍光シグナル）が出力される。
　次いで、蛍光量調整手段３２によって減光した状態、すなわち、減光（ＮＤ）フィルタ３４を、センサチップ１８と光検出手段３０との間に挿入した状態（第２の条件）として、蛍光２８を光検出手段３０で検出することで、光検出手段３０からは第２蛍光シグナルが出力される。
　蛍光量調整手段３２によって減光したことにより、光検出手段３０が受光する蛍光２８は、減光なしの状態と比べて、１００分の１となる。このため、光検出手段３０が正常に蛍光２８を受光していれば、第２蛍光シグナルも、減光なしの状態で出力される第１蛍光シグナルと比べて１００分の１となる。
　このことに基づき、減光ありの状態の第２蛍光シグナルが、減光なしの状態の第１蛍光シグナルの１００分の１よりも大きい場合には、減光ありの状態の第２蛍光シグナルを後述するように補正することによって、正確な蛍光シグナルを得ることができる。
１－３．蛍光シグナルの補正について
　表１は、アナライト濃度と、減光なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び減光した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表しており、図４は、この表１をグラフ化したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１及び図４に示すように、蛍光量調整手段３２によって減光をしない場合には、アナライト濃度が高濃度になるにつれて、逆に、蛍光シグナルが低下してしまっている。
　このような蛍光シグナルの低下の判別は、上述したように、蛍光量調整手段３２によって減光した場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルと比べて１００分の１になることに基づいて行う。
　すなわち、本実施例においては、アナライト濃度が高濃度である１．０Ｅ－９～１．０Ｅ－７［ｇ／ｍＬ］の場合、減光ありの場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルの１００分の１よりも大きな値となっている。
　この場合には、減光ありの場合の蛍光シグナルを用いて、値を補正する（本実施例であれば、減光ありの場合の蛍光シグナルの値を１００倍する）ことによって正確な蛍光シグナルの値を得ることができる。
　一方で、アナライト濃度が低濃度である１．０Ｅ－１３～１．０Ｅ－１２［ｇ／ｍＬ］の場合も、減光ありの場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルの１００分の１よりも大きな値となっているが、これは、光検出手段３０の測定可能な光量の最低値に起因するものであり、減光ありの場合の蛍光シグナルが異常な値を出力しているためである。
　したがって、アナライト濃度が低濃度の場合には、減光なしの場合の蛍光シグナルを正常な値として得ることができる。
　このように、補正した蛍光シグナルを用いることによって、表２及び図５に示すように、正常なアナライト濃度の測定をすることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　［実施例２］
２．励起光量を調整する場合の実施例
　図６は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図である。
　この変形例のＳＰＦＳ装置１０は、図１～図５に示したＳＰＦＳ装置と基本的には同様な構成であり、また、原理も同様であるので、同一の構成部材には、同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
２－１．ＳＰＦＳ装置の構成
　この変形例では、図６に示すように、蛍光量調整手段３２を、光源２４とセンサチップ１８との間に設けている。このように構成することによって、光源２４から金属薄膜１４に照射される励起光２６の光量を調整（減光）し、その結果、金属薄膜１４の表面に発生する表面プラズモン光による電場強度を低下させることができる。
　このため、アナライトを標識する蛍光物質から発光する蛍光量を調整することができ、実施例１と同様に、光検出手段３０が受光する蛍光量を調整することができ、実施例１と同様な蛍光量の測定方法を用いて、アナライト濃度に応じた蛍光シグナルを得ることができる。
　なお、本実施例の場合、蛍光量調整手段３２を光源２４の光量調整機能とすることもでき、光源２４が出射する励起光２６の光量を調整することもできる。
２－２．蛍光シグナルの補正について
　表３は、アナライト濃度と、減光なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び減光した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表しており、図７はこの表３をグラフ化したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３及び図７が示すように、蛍光量調整手段３２によって励起光を減光しない場合には、アナライト濃度が高濃度になるにつれて頭打ちとなる異常な出力が生じている。
　このような蛍光シグナルの異常な出力の判別は、実施例１と同様に、蛍光量調整手段３２によって減光した場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルと比べて１００分の１になることに基づいて行う。
　すなわち、本実施例においては、アナライト濃度が高濃度である１．０Ｅ－９～１．０Ｅ－７［ｇ／ｍＬ］の場合、減光ありの場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルの１００分の１よりも大きな値となっている。
　この場合には、減光ありの場合の蛍光シグナルを用いて、値を補正する（本実施例であれば、減光ありの場合の蛍光シグナルの値を１００倍する）ことによって正確な蛍光シグナルの値を得ることができる。
　一方で、アナライト濃度が低濃度である１．０Ｅ－１３～１．０Ｅ－１２［ｇ／ｍＬ］の場合も、減光ありの場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルの１００分の１よりも大きな値となっているが、これは、光検出手段３０の測定可能な光量の最低値に起因するものであり、減光ありの場合の蛍光シグナルが異常な値を出力しているためである。
　したがって、アナライト濃度が低濃度の場合には、減光なしの場合の蛍光シグナルを正常な値として得ることができる。
　このように、補正した蛍光シグナルを用いることによって、表４及び図８に示すように、正常なアナライト濃度の測定をすることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　［実施例３］
３．発生した蛍光量及び励起光量を調整する場合の実施例
　図９は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図である。
　この変形例のＳＰＦＳ装置１０は、図１～図５に示したＳＰＦＳ装置と基本的には同様な構成であり、また、原理も同様であるので、同一の構成部材には、同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
３－１．ＳＰＦＳ装置の構成
　この変形例では、図９に示すように、蛍光量調整手段を、センサチップ１８と光検出手段３０との間に設ける（蛍光量調整手段３２ａ）とともに、光源２４とセンサチップ１８との間にも設ける（蛍光量調整手段３２ｂ）ように構成されている。
　このように構成することによって、アナライトを標識する蛍光物質から発光する蛍光量を蛍光量調整手段３２ａによって調整できるとともに、光源２４から金属薄膜１４に照射される励起光２６の光量を調整することができる。
　発生した蛍光量の調整だけではなく、蛍光２８の発生に起因する励起光２６の光量を調整することによって、より広いダイナミックレンジを提供することができる。
　このように構成される本発明のＳＰＦＳ装置１０では、実施例１及び２と同様に、蛍光量の調整を行いながら、センサ部２２に固定化されたアナライトを検知することで、より広いダイナミックレンジにおける蛍光シグナルを得ることができ、より広い範囲のアナライト濃度の検体溶液の測定をすることができる。
　［実施例４］
４．光源に照射角調整手段を設けた場合の実施例
　図１０は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図、図１１は、図１０の部分拡大図である。
　この変形例のＳＰＦＳ装置１０は、図１～図５に示したＳＰＦＳ装置と基本的には同様な構成であり、また、原理も同様であるので、同一の構成部材には、同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
４－１．ＳＰＦＳ装置の構成
　この変形例では、図１０に示すように、光源２４から誘電体部材１２を介して、金属薄膜１４に向かって照射される励起光２６の、金属薄膜１４に対する入射角を変えることができる照射角調整手段が蛍光量調整手段３２として設けられている。
　一般的に、金属薄膜１４に対する入射角度と蛍光シグナルには、図１２に示すような角度依存性が存在することが知られている。
　本実施例においては、この角度依存性に基づいて、励起光２６の、金属薄膜１４に対する入射角を共鳴角（すなわち、励起光２６が全反射減衰（ＡＴＲ）する角度）よりも小さくするか、もしくは、大きくすることによって、蛍光量を減光することができる。
４－２．蛍光シグナルの補正について
　この変形例のように、光源２４に照射角調整手段を設けた場合には、蛍光シグナルの異常な出力の判別に、上述した角度依存性を用いることもできる。
　すなわち、アナライトの検出を行う際に、励起光２６の入射角を所定の範囲（本実施例においては、４５°～７０°）で角度を変化させながら、蛍光シグナルを得ることによって、図１２に示すような、励起光の入射角と蛍光シグナルとの関係を得ることができる。
　通常は、アナライト濃度が高くなるにつれて、蛍光シグナルも上昇することになるが、アナライト濃度が高濃度になり、発光する蛍光量が光検出手段３０のダイナミックレンジを超えてしまうと、図１３に示すように複数のピークが発生するなど、異常な蛍光シグナルを得るようになる。
　このように、異常な蛍光シグナルを得た場合には、実施例１～３と同様に、蛍光量調整手段３２を用いて光検出手段３０が受光する蛍光量を減光した場合に得られた蛍光シグナルを補正することによって、正確でダイナミックレンジの広いアナライトの検出が可能となる。
　以上、本発明の好ましい実施の態様を説明してきたが、本発明はこれに限定されることはなく、例えば、上記実施例では、光検出手段３０が受光する蛍光２８の光量を１００分の１となるように、蛍光量調整手段３２によって減光しているが、必要とするダイナミックレンジに合わせて適宜変更可能であるなど、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
　本発明は、例えば、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いた、血液検査などの臨床試験のような、高精度の検出が要求される分野において、正確でダイナミックレンジの広いアナライトの検出を行うことができる。
１０　　　ＳＰＦＳ装置
１２　　　誘電体部材
１２ａ　　上面
１２ｂ　　側面
１４　　　金属薄膜
１４ａ　　上面
１６　　　微細流路
１８　　　センサチップ
２０　　　センサチップ装填部
２２　　　センサ部
２４　　　光源
２６　　　励起光
２８　　　蛍光
３０　　　光検出手段
３２　　　蛍光量調整手段
３２ａ　　蛍光量調整手段
３２ｂ　　蛍光量調整手段
３４　　　フィルタ

Claims (11)

  1. 　金属薄膜に励起光を照射することによって発生した表面プラズモン光でアナライトを標識した蛍光物質を励起して、発生した蛍光を光検出手段によって受光することにより、アナライトの検出を行う表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法であって、
    　前記光検出手段が受光する蛍光の光量を調整することによって、ダイナミックレンジを広げることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
  2. 　第１の条件下で、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する第１蛍光シグナルと、
    　前記第１の条件下よりも前記光検出手段が受光する蛍光の光量が小さくなるように調整された第２の条件下で、前記光検出手段が光量を調整された蛍光を受光した場合に出力する第２蛍光シグナルと、
    を比較することによって、前記第１蛍光シグナルが異常か否かを判別し、前記第１蛍光シグナルが異常であると判断した場合には、前記第２蛍光シグナルを補正することによって、正常な蛍光シグナルを得ることを特徴とする請求項１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
  3. 　前記発生した蛍光の光量を調整することによって、前記光検出手段が受光する蛍光の光量を調整することを特徴とする請求項１または２に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
  4. 　前記励起光の光量を調整することによって、前記光検出手段が受光する蛍光の光量を調整することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
  5. 　前記金属薄膜に対する励起光の入射角を所定の範囲において変化させながら、前記光検出手段によって蛍光を受光し、
    　前記励起光の入射角と、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する蛍光シグナルとの関係に基づき、異常な蛍光シグナルを判別することを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
  6. 　誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜の上面に形成された微細流路と、前記微細流路中に形成されたセンサ部とを有するセンサチップが装填され、励起光を照射することで検体の検出を行う表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置であって、
    　前記誘電体部材を介して前記金属薄膜に励起光を照射する光源と、
    　前記センサチップの上方に配置された光検出手段と、を備え、
    　前記センサ部に固定化された、アナライトを標識する蛍光物質を、前記励起光を前記金属薄膜に照射した際に発生する表面プラズモン光によって励起することで発生した蛍光を、前記光検出手段で受光するように構成されるとともに、
    　蛍光量調整手段によって、前記光検出手段で受光する蛍光の光量を調整可能に構成されていることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
  7. 　第１の条件下で、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する第１蛍光シグナルと、
    　前記第１の条件下よりも前記光検出手段が受光する蛍光の光量が小さくなるように調整された第２の条件下で、前記光検出手段が、前記蛍光量調整手段によって光量を調整された蛍光を受光した場合に出力する第２蛍光シグナルと、
    を比較することによって、前記第１蛍光シグナルが異常か否かを判別し、前記第１蛍光シグナルが異常であると判断した場合には前記第２蛍光シグナルを補正することによって、正常な蛍光シグナルを得ることを特徴とする請求項６に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
  8. 　前記蛍光量調整手段を、前記センサチップと前記光検出手段との間に設けたことを特徴とする請求項６または７に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
  9. 　前記蛍光量調整手段を、前記光源と前記誘電体部材との間に設けたことを特徴とする請求項６から８のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
  10. 　前記金属薄膜に対する励起光の入射角を調整するための照射角調整手段を設けたことを特徴とする請求項６から９のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
  11. 　前記照射角調整手段を用いて、前記金属薄膜に対する励起光の入射角を所定の範囲において変化させながら、前記光検出手段によって蛍光を受光し、
    　前記励起光の入射角と、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する蛍光シグナルとの関係に基づき、異常な蛍光シグナルを判別することを特徴とする請求項６から１０のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
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