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JP5949761B2 - 表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法および表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置 - Google Patents

表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法および表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置 Download PDF

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Description

本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）現象を応用した表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法および表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置に関する。
従来から、極微少な物質の検出を行う場合において、物質の物理的現象を応用することでこのような物質の検出を可能とした様々な検体検出装置が用いられている。
このような検体検出装置の一つとして、ナノメートルレベルなどの微細領域中で電子と光が共鳴する現象（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Surface Plasmon Resonance）現象）を応用し、例えば、生体内の極微少なアナライトの検出を行うようにした表面プラズモン共鳴装置（以下、「ＳＰＲ装置」と言う）が挙げられる。
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を応用した、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づき、ＳＰＲ装置よりもさらに高精度にアナライト検出を行えるようにした表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」と言う）も、このような検体検出装置の一つである。
この表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザー光などの励起光が、金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；Attenuated Total Reflectance）する条件において、金属薄膜表面に表面プラズモン光（疎密波）を発生させることによって、光源より照射した励起光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やして、表面プラズモン光の電場増強効果を得るようになっている。
そして、この電場増強効果により、金属薄膜近傍に捕捉したアナライトと結合（標識）した蛍光物質を効率良く励起させ、例えば、フォトンカウンティング方式の光電子倍増管（ＰＭＴ；Photomultiplier Tube）やＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラなどの光検出手段を用いて、この蛍光を観察することによって、極微量、極低濃度のアナライトをも検出することができる。
特開２００９−７９９７０号公報 特開２００９−２４４２７０号公報
しかしながら、アッセイエリア（測定領域）にアナライトを集積させる高感度のＳＰＦＳ装置の場合には、アナライト濃度の変化に対して、蛍光シグナル（光検出手段が出力するシグナル）の変動幅が非常に大きくなる。
このため、アナライト濃度が高濃度の場合には、光電子倍増管やＣＣＤカメラなどの光検出手段のダイナミックレンジをオーバーしてしまい、正確な測定をすることが出来ない場合があった。
例えば、ＣＣＤなどの撮像素子を用いたカメラの場合、図１４に示すように、一定以上の光を受けると受光素子が飽和してしまい、実際の蛍光量を測定できないという問題が発生する。また、フォトンカウンティング方式の光電子増倍管を用いた場合にも、図１５に示すように、一定以上の光を受けるとパルスオーバーラップによる数え落としが発生し、蛍光シグナルが低下するという問題が発生する。
特許文献１では、測定体積中の被分析物質の数を制限するために、サンプルプレート上の測定領域の面積を変えることによって、ダイナミックレンジの広域化を図ることが開示されている。
また、特許文献２では、露光時間が異なる複数の信号を合成することによって、検体分析のダイナミックレンジを拡張するなど、ダイナミックレンジを拡張するための種々の方法や、集積光を定量化するための信号の算出や処理について開示されている。
しかしながら、特許文献１に開示された方法では、アナライト濃度に応じて面積の異なる測定領域が必要となり、ＳＰＦＳ装置の大型化に繋がるか、もしくは、異なる濃度のアナライトを測定するたびに、面積の異なる測定領域が形成されたサンプルプレートを準備する必要がある。
また一方で、ＳＰＦＳ装置特有の問題として、アッセイエリアに集積したアナライトに蛍光標識物質が結合した際、限定されたエリアに蛍光物質が密集することで濃度消光を起こし蛍光シグナルが減少したり、アナライトと結合した蛍光物質から発光した蛍光が、金属薄膜表面に発生した表面プラズモン光とカップリングしロスしてしまうことがある。
このような蛍光シグナルのロスが金属薄膜上で発生しているのか、光検出手段のダイナミックレンジの問題によって、蛍光シグナルが低下しているのかを判別することは、ＳＰＦＳ装置の正確性を担保する上でも重要になってくる。しかしながら、特許文献１、２に開示された発明は、ＳＰＦＳ装置に適したダイナミックレンジの拡張に必ずしも繋がるものではなかったというのが実情である。
本発明では、このような現状を鑑み、ＳＰＦＳ装置のダイナミックレンジを調整することによって、アナライト濃度が高濃度の場合であっても、光検出手段の種類によらず、正確に蛍光シグナルを測定することができる表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法および表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置を提供することを目的とする。
本発明は、前述したような従来技術における課題及び目的を達成するために発明されたものであって、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法は、
金属薄膜に励起光を照射することによって発生した表面プラズモン光でアナライトを標識した蛍光物質を励起して、発生した蛍光を光検出手段によって受光することにより、アナライトの検出を行う表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法であって、
第１の条件下で、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する第１蛍光シグナルと、前記第１の条件下よりも前記光検出手段が受光する蛍光の光量が小さくなるように調整された第２の条件下で、前記光検出手段が光量を調整された蛍光を受光した場合に出力する第２蛍光シグナルと、を比較することによって、前記第１蛍光シグナルが異常か否かを判別し、前記第１蛍光シグナルが異常であると判断した場合には、前記第２蛍光シグナルを補正することによって、正常な蛍光シグナルを得ることを特徴とする。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置は、
誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜の上面に形成された微細流路と、
前記微細流路中に形成されたセンサ部とを有するセンサチップが装填され、励起光を照射することで検体の検出を行う表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置であって、
前記誘電体部材を介して前記金属薄膜に励起光を照射する光源と、
前記センサチップの上方に配置された光検出手段と、を備え、
前記センサ部に固定化された、アナライトを標識する蛍光物質を、前記励起光を前記金属薄膜に照射した際に発生する表面プラズモン光によって励起することで発生した蛍光を、前記光検出手段で受光するように構成されるとともに、
蛍光量調整手段によって、前記光検出手段で受光する蛍光の光量を調整可能に構成されており、
第１の条件下で、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する第１蛍光シグナルと、前記第１の条件下よりも前記光検出手段が受光する蛍光の光量が小さくなるように調整された第２の条件下で、前記光検出手段が、前記蛍光量調整手段によって光量を調整された蛍光を受光した場合に出力する第２蛍光シグナルと、を比較することによって、前記第１蛍光シグナルが異常か否かを判別し、
前記第１蛍光シグナルが異常であると判断した場合には前記第２蛍光シグナルを補正することによって、正常な蛍光シグナルを得ることを特徴とする。
このように構成することによって、アナライト濃度が高濃度の検体溶液の検出を行う場合に、蛍光物質から光検出手段で計測不可能な光量の蛍光が発光した場合であっても、光量を調整した蛍光を光検出手段が受光した場合に出力する第２蛍光シグナルを用いて、正常な蛍光シグナルを得ることができる。
このため、アナライト濃度が低濃度の検体溶液からアナライト濃度が高濃度の検体溶液まで正確に検出することができ、ダイナミックレンジの広いアナライトの検出を行うことができる。
また、本発明においては、光検出手段が受光する蛍光の光量を調整するように構成しているため、光検出手段の種類によらず、正確でダイナミックレンジの広いアナライトの検出を行うことができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法は、前記発生した蛍光の光量を調整することによって、前記光検出手段が受光する蛍光の光量を調整することを特徴とする。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置は、前記蛍光量調整手段を、前記センサチップと光検出手段との間に設けたことを特徴とする。
このように構成することによって、蛍光物質が表面プラズモン光によって励起されて発光した蛍光を、直接調整することができ、光検出手段が計測可能な光量に減光することが容易である。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法は、前記励起光の光量を調整することによって、前記光検出手段が受光する蛍光の光量を調整することを特徴とする。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置は、前記蛍光量調整手段を、前記光源と誘電体部材との間に設けたことを特徴とする。
このように構成した場合であっても、金属薄膜に照射する励起光の光量を減光することによって、表面プラズモン光による電場強度を低下させ、その結果、アナライトを標識する蛍光物質から発光する蛍光の光量を、光検出手段が計測可能な光量に減光することができる。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法は、前記金属薄膜に対する励起光の入射角を所定の範囲において変化させながら、前記光検出手段によって蛍光を受光し、
前記励起光の入射角と、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する蛍光シグナルとの関係に基づき、異常な蛍光シグナルを判別することを特徴とする。
また、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置は、前記照射角調整手段を用いて、前記金属薄膜に対する励起光の入射角を所定の範囲において変化させながら、前記光検出手段によって蛍光を受光し、
前記励起光の入射角と、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する蛍光シグナルとの関係に基づき、異常な蛍光シグナルを判別することを特徴とする。
このように構成した場合であっても、蛍光物質から光検出手段で計測不可能な光量の蛍光が発光した場合に、光検出手段から異常な蛍光シグナルが出力されていると判別することができる。
本発明によれば、蛍光量調整手段によって、光検出手段が受光する蛍光量を調整することによって、光検出手段の測定可能範囲を上回る蛍光が発生したとしても、正確な測定をすることができ、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法または表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置に適したダイナミックレンジの広いアナライトの検出を行うことができる。
図１は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明する表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置の概略を模式的に示す概略図である。 図２は、図１の部分拡大図である。 図３は、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定の流れを説明するフローチャートである。 図４は、アナライト濃度と、減光なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び減光した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表すグラフである。 図５は、アナライト濃度と、補正なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び補正した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表すグラフである。 図６は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図である。 図７は、アナライト濃度と、減光なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び減光した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表すグラフである。 図８は、アナライト濃度と、補正なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び補正した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表すグラフである。 図９は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図である。 図１０は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図である。 図１１は、図１０の部分拡大図である。 図１２は、アナライト濃度が低濃度の検体溶液を測定した場合の励起光の入射角と蛍光シグナルとの関係を表すグラフである。 図１３は、アナライト濃度が高濃度の検体溶液を測定した場合の励起光の入射角と蛍光シグナルとの関係を表すグラフである。 図１４は、ＣＣＤカメラを用いた場合の受光蛍光量と蛍光シグナルとの関係を表すグラフである。 図１５は、フォトンカウンティング方式の光電子倍増管を用いた場合の受光蛍光量と蛍光シグナルとの関係を表すグラフである。
以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいてより詳細に説明する。
［実施例１］
１．発生した蛍光量を調整する場合の実施例
図１は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明する表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」と言う）の概略を模式的に示す概略図、図２は、図１の部分拡大図、図３は、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定の流れを説明するフローチャートである。
１−１．ＳＰＦＳ装置の構成
本発明のＳＰＦＳ装置１０は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２と、この誘電体部材１２の水平な上面１２ａに形成された金属薄膜１４と、この金属薄膜１４の上面１４ａに形成された微細流路１６とからなるセンサチップ１８を備えており、このセンサチップ１８は、ＳＰＦＳ装置１０のセンサチップ装填部２０に装填されている。
また、微細流路１６の一部には、特定のアナライトと特異的に結合するリガンドが固定化されたセンサ部２２が設けられている。このセンサ部２２に微細流路１６を介して特定のアナライトを含有した検体溶液を流入させ、その後、アナライトを標識する蛍光物質を、微細流路１６を介して流入させることで、センサ部２２に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化された状態とすることができる。
ここで、蛍光物質としては、所定の励起光を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光を発する物質であれば、特に限定されない。なお、本明細書において、「蛍光」とは、燐光など各種の発光も含まれる。
また、アナライトを含有した検体溶液としては、特に限定されるものではないが、このような検体としては、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられる。
また、検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
また、誘電体部材１２の下方の一方の側面１２ｂの側には、図１に示すように、光源２４が配置されており、この光源２４からの励起光２６が、誘電体部材１２の外側下方から、誘電体部材１２の側面１２ｂに入射して、誘電体部材１２を介して、誘電体部材１２の上面１２ａに形成された金属薄膜１４に向かって、励起光２６が全反射減衰（ＡＴＲ）する所定の入射角（共鳴角）α１で照射されるようになっている。
また、センサチップ１８の上方には、蛍光物質が励起されて発光した蛍光２８を受光するための光検出手段３０が備えられている。
ここで、光検出手段３０としては、特に限定されるものではないが、例えば、フォトンカウンティング方式の光電子増倍管や、多点計測が可能なＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサなどを用いることができる。なお、本実施例では、フォトンカウンティング方式の光電子倍増管を用いている。
また、本実施例では、センサチップ１８と光検出手段３０との間には、発光した蛍光の光量を調整するための蛍光量調整手段３２として、光量を９９％カットすることができる減光（ＮＤ）フィルタ３４が出し入れ自由に配置されている。
なお、蛍光量調整手段３２としては、光検出手段３０における受光量を調整できるものであれば、特に限定されるものではなく、減光（ＮＤ）フィルタ３４以外にも、例えば、波長選択フィルタやダイアフラムレンズなどが出し入れ自由に配置されていてもよいし、アパーチャーを設けてその開口の大きさによって光量を調整するようにしてもよい。
また、本実施例の場合には、蛍光量調整手段３２を光検出手段３０のフォーカス調整手段とすることもでき、光検出手段３０をデフォーカスすることによって、光検出手段３０が受光する蛍光量を調整することもできる。
本実施例において、光源２４から照射される励起光としては、特に限定されるものではないが、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷの励起光が好ましく、更には、波長２３０〜８００ｎｍ、０．０１〜１００ｍＷの励起光が好ましい。
また、誘電体部材１２としては、特に限定されるものではないが、光学的に透明な、例えば、ガラス、セラミックスなどの各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性、製造安定性、光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むものが好ましい。
また、この実施例では、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２を用いたが、鉛直断面形状を三角形（いわゆる三角プリズム）、半円形状、半楕円形状にするなど、誘電体部材１２の形状は、適宜変更可能である。
また、金属薄膜１４の材質としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは、金からなり、さらに、これら金属の合金から構成してもよい。
このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ、後述するように、表面プラズモン光（疎密波）による電場増強が大きくなるので、金属薄膜１４として好適である。
また、金属薄膜１４の形成方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。好ましくは、スパッタリング法、蒸着法を使用するのが、薄膜形成条件の調整が容易であるので望ましい。
さらに、金属薄膜１４の厚さとしては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、および、それらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であるのが望ましい。
なお、後述する電解増強効果の観点から、より好ましい金属薄膜１４の厚さとしては、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、および、それらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であるのが望ましい。
金属薄膜１４の厚さが上記範囲内であれば、後述する表面プラズモン光（疎密波）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１４であれば、大きさ（縦×横）の寸法、形状は、特に限定されない。
１−２．蛍光量の測定方法について
このように構成される本発明のＳＰＦＳ装置１０を用いた、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法について、図３に示すフローチャートに沿って説明する。
先ず、センサ部２２に微細流路１６を介してアナライトを含有する検体溶液を流入させ、その後、このアナライトを標識する蛍光物質を、同様に微細流路１６を介して流入させることで、センサ部２２に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化された状態とする。
そして、この状態で光源２４から励起光２６を照射して、誘電体部材１２の外側下方から、誘電体部材１２の側面１２ｂに入射させる。そして、誘電体部材１２を介して、誘電体部材１２の上面１２ａに形成された金属薄膜１４に向かって、励起光２６が全反射減衰（ＡＴＲ）する所定の入射角（共鳴角）α１で照射される。
励起光２６を照射することによって、金属薄膜１４の表面から表面プラズモン光（疎密波）を放出させ、この表面プラズモン光（疎密波）によりセンサ部２２に固定化されたアナライトを標識する蛍光物質が励起され、蛍光２８が発光される。
なお、このとき、蛍光量調整手段３２は減光なしの状態、すなわち、減光（ＮＤ）フィルタ３４を、センサチップ１８と光検出手段３０との間に挿入していない状態（第１の条件）とする。
そして、この蛍光２８を光検出手段３０で検出することによって、センサ部２２に固定化されたアナライトを検知し、光検出手段３０からはアナライト濃度に応じた蛍光シグナル（第１蛍光シグナル）が出力される。
次いで、蛍光量調整手段３２によって減光した状態、すなわち、減光（ＮＤ）フィルタ３４を、センサチップ１８と光検出手段３０との間に挿入した状態（第２の条件）として、蛍光２８を光検出手段３０で検出することで、光検出手段３０からは第２蛍光シグナルが出力される。
蛍光量調整手段３２によって減光したことにより、光検出手段３０が受光する蛍光２８は、減光なしの状態と比べて、１００分の１となる。このため、光検出手段３０が正常に蛍光２８を受光していれば、第２蛍光シグナルも、減光なしの状態で出力される第１蛍光シグナルと比べて１００分の１となる。
このことに基づき、減光ありの状態の第２蛍光シグナルが、減光なしの状態の第１蛍光シグナルの１００分の１よりも大きい場合には、減光ありの状態の第２蛍光シグナルを後述するように補正することによって、正確な蛍光シグナルを得ることができる。
１−３．蛍光シグナルの補正について
表１は、アナライト濃度と、減光なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び減光した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表しており、図４は、この表１をグラフ化したものである。
Figure 0005949761
表１及び図４に示すように、蛍光量調整手段３２によって減光をしない場合には、アナライト濃度が高濃度になるにつれて、逆に、蛍光シグナルが低下してしまっている。
このような蛍光シグナルの低下の判別は、上述したように、蛍光量調整手段３２によって減光した場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルと比べて１００分の１になることに基づいて行う。
すなわち、本実施例においては、アナライト濃度が高濃度である１．０Ｅ−９〜１．０Ｅ−７［ｇ／ｍＬ］の場合、減光ありの場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルの１００分の１よりも大きな値となっている。
この場合には、減光ありの場合の蛍光シグナルを用いて、値を補正する（本実施例であれば、減光ありの場合の蛍光シグナルの値を１００倍する）ことによって正確な蛍光シグナルの値を得ることができる。
一方で、アナライト濃度が低濃度である１．０Ｅ−１３〜１．０Ｅ−１２［ｇ／ｍＬ］の場合も、減光ありの場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルの１００分の１よりも大きな値となっているが、これは、光検出手段３０の測定可能な光量の最低値に起因するものであり、減光ありの場合の蛍光シグナルが異常な値を出力しているためである。
したがって、アナライト濃度が低濃度の場合には、減光なしの場合の蛍光シグナルを正常な値として得ることができる。
このように、補正した蛍光シグナルを用いることによって、表２及び図５に示すように、正常なアナライト濃度の測定をすることができる。
Figure 0005949761
［実施例２］
２．励起光量を調整する場合の実施例
図６は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図である。
この変形例のＳＰＦＳ装置１０は、図１〜図５に示したＳＰＦＳ装置と基本的には同様な構成であり、また、原理も同様であるので、同一の構成部材には、同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
２−１．ＳＰＦＳ装置の構成
この変形例では、図６に示すように、蛍光量調整手段３２を、光源２４とセンサチップ１８との間に設けている。このように構成することによって、光源２４から金属薄膜１４に照射される励起光２６の光量を調整（減光）し、その結果、金属薄膜１４の表面に発生する表面プラズモン光による電場強度を低下させることができる。
このため、アナライトを標識する蛍光物質から発光する蛍光量を調整することができ、実施例１と同様に、光検出手段３０が受光する蛍光量を調整することができ、実施例１と同様な蛍光量の測定方法を用いて、アナライト濃度に応じた蛍光シグナルを得ることができる。
なお、本実施例の場合、蛍光量調整手段３２を光源２４の光量調整機能とすることもでき、光源２４が出射する励起光２６の光量を調整することもできる。
２−２．蛍光シグナルの補正について
表３は、アナライト濃度と、減光なしの状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナル及び減光した状態で光検出手段３０が出力する蛍光シグナルの関係を表しており、図７はこの表３をグラフ化したものである。
Figure 0005949761
表３及び図７が示すように、蛍光量調整手段３２によって励起光を減光しない場合には、アナライト濃度が高濃度になるにつれて頭打ちとなる異常な出力が生じている。
このような蛍光シグナルの異常な出力の判別は、実施例１と同様に、蛍光量調整手段３２によって減光した場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルと比べて１００分の１になることに基づいて行う。
すなわち、本実施例においては、アナライト濃度が高濃度である１．０Ｅ−９〜１．０Ｅ−７［ｇ／ｍＬ］の場合、減光ありの場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルの１００分の１よりも大きな値となっている。
この場合には、減光ありの場合の蛍光シグナルを用いて、値を補正する（本実施例であれば、減光ありの場合の蛍光シグナルの値を１００倍する）ことによって正確な蛍光シグナルの値を得ることができる。
一方で、アナライト濃度が低濃度である１．０Ｅ−１３〜１．０Ｅ−１２［ｇ／ｍＬ］の場合も、減光ありの場合の蛍光シグナルが、減光なしの場合の蛍光シグナルの１００分の１よりも大きな値となっているが、これは、光検出手段３０の測定可能な光量の最低値に起因するものであり、減光ありの場合の蛍光シグナルが異常な値を出力しているためである。
したがって、アナライト濃度が低濃度の場合には、減光なしの場合の蛍光シグナルを正常な値として得ることができる。
このように、補正した蛍光シグナルを用いることによって、表４及び図８に示すように、正常なアナライト濃度の測定をすることができる。
Figure 0005949761
［実施例３］
３．発生した蛍光量及び励起光量を調整する場合の実施例
図９は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図である。
この変形例のＳＰＦＳ装置１０は、図１〜図５に示したＳＰＦＳ装置と基本的には同様な構成であり、また、原理も同様であるので、同一の構成部材には、同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
３−１．ＳＰＦＳ装置の構成
この変形例では、図９に示すように、蛍光量調整手段を、センサチップ１８と光検出手段３０との間に設ける（蛍光量調整手段３２ａ）とともに、光源２４とセンサチップ１８との間にも設ける（蛍光量調整手段３２ｂ）ように構成されている。
このように構成することによって、アナライトを標識する蛍光物質から発光する蛍光量を蛍光量調整手段３２ａによって調整できるとともに、光源２４から金属薄膜１４に照射される励起光２６の光量を調整することができる。
発生した蛍光量の調整だけではなく、蛍光２８の発生に起因する励起光２６の光量を調整することによって、より広いダイナミックレンジを提供することができる。
このように構成される本発明のＳＰＦＳ装置１０では、実施例１及び２と同様に、蛍光量の調整を行いながら、センサ部２２に固定化されたアナライトを検知することで、より広いダイナミックレンジにおける蛍光シグナルを得ることができ、より広い範囲のアナライト濃度の検体溶液の測定をすることができる。
［実施例４］
４．光源に照射角調整手段を設けた場合の実施例
図１０は、本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法を説明するＳＰＦＳ装置の概略を模式的に示す概略図、図１１は、図１０の部分拡大図である。
この変形例のＳＰＦＳ装置１０は、図１〜図５に示したＳＰＦＳ装置と基本的には同様な構成であり、また、原理も同様であるので、同一の構成部材には、同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
４−１．ＳＰＦＳ装置の構成
この変形例では、図１０に示すように、光源２４から誘電体部材１２を介して、金属薄膜１４に向かって照射される励起光２６の、金属薄膜１４に対する入射角を変えることができる照射角調整手段が蛍光量調整手段３２として設けられている。
一般的に、金属薄膜１４に対する入射角度と蛍光シグナルには、図１２に示すような角度依存性が存在することが知られている。
本実施例においては、この角度依存性に基づいて、励起光２６の、金属薄膜１４に対する入射角を共鳴角（すなわち、励起光２６が全反射減衰（ＡＴＲ）する角度）よりも小さくするか、もしくは、大きくすることによって、蛍光量を減光することができる。
４−２．蛍光シグナルの補正について
この変形例のように、光源２４に照射角調整手段を設けた場合には、蛍光シグナルの異常な出力の判別に、上述した角度依存性を用いることもできる。
すなわち、アナライトの検出を行う際に、励起光２６の入射角を所定の範囲（本実施例においては、４５°〜７０°）で角度を変化させながら、蛍光シグナルを得ることによって、図１２に示すような、励起光の入射角と蛍光シグナルとの関係を得ることができる。
通常は、アナライト濃度が高くなるにつれて、蛍光シグナルも上昇することになるが、アナライト濃度が高濃度になり、発光する蛍光量が光検出手段３０のダイナミックレンジを超えてしまうと、図１３に示すように複数のピークが発生するなど、異常な蛍光シグナルを得るようになる。
このように、異常な蛍光シグナルを得た場合には、実施例１〜３と同様に、蛍光量調整手段３２を用いて光検出手段３０が受光する蛍光量を減光した場合に得られた蛍光シグナルを補正することによって、正確でダイナミックレンジの広いアナライトの検出が可能となる。
以上、本発明の好ましい実施の態様を説明してきたが、本発明はこれに限定されることはなく、例えば、上記実施例では、光検出手段３０が受光する蛍光２８の光量を１００分の１となるように、蛍光量調整手段３２によって減光しているが、必要とするダイナミックレンジに合わせて適宜変更可能であるなど、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
本発明は、例えば、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いた、血液検査などの臨床試験のような、高精度の検出が要求される分野において、正確でダイナミックレンジの広いアナライトの検出を行うことができる。
１０ ＳＰＦＳ装置
１２ 誘電体部材
１２ａ 上面
１２ｂ 側面
１４ 金属薄膜
１４ａ 上面
１６ 微細流路
１８ センサチップ
２０ センサチップ装填部
２２ センサ部
２４ 光源
２６ 励起光
２８ 蛍光
３０ 光検出手段
３２ 蛍光量調整手段
３２ａ 蛍光量調整手段
３２ｂ 蛍光量調整手段
３４ フィルタ

Claims (10)

  1. 金属薄膜に励起光を照射することによって発生した表面プラズモン光でアナライトを標識した蛍光物質を励起して、発生した蛍光を光検出手段によって受光することにより、アナライトの検出を行う表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法であって、
    第１の条件下で、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する第１蛍光シグナルと、前記第１の条件下よりも前記光検出手段が受光する蛍光の光量が小さくなるように調整された第２の条件下で、前記光検出手段が光量を調整された蛍光を受光した場合に出力する第２蛍光シグナルと、を比較することによって、前記第１蛍光シグナルが異常か否かを判別し、前記第１蛍光シグナルが異常であると判断した場合には、前記第２蛍光シグナルを補正することによって、正常な蛍光シグナルを得ることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
  2. 前記発生した蛍光の光量を調整することによって、前記光検出手段が受光する蛍光の光量を調整することを特徴とする請求項１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
  3. 前記励起光の光量を調整することによって、前記光検出手段が受光する蛍光の光量を調整することを特徴とする請求項１または２に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
  4. 前記金属薄膜に対する励起光の入射角を所定の範囲において変化させながら、前記光検出手段によって蛍光を受光し、
    前記励起光の入射角と、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する蛍光シグナルとの関係に基づき、異常な蛍光シグナルを判別することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
  5. 誘電体部材上に形成された金属薄膜と、前記金属薄膜の上面に形成された微細流路と、前記微細流路中に形成されたセンサ部とを有するセンサチップが装填され、励起光を照射することで検体の検出を行う表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置であって、
    前記誘電体部材を介して前記金属薄膜に励起光を照射する光源と、
    前記センサチップの上方に配置された光検出手段と、を備え、
    前記センサ部に固定化された、アナライトを標識する蛍光物質を、前記励起光を前記金属薄膜に照射した際に発生する表面プラズモン光によって励起することで発生した蛍光を、前記光検出手段で受光するように構成されるとともに、
    蛍光量調整手段によって、前記光検出手段で受光する蛍光の光量を調整可能に構成されており、
    第１の条件下で、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する第１蛍光シグナルと、前記第１の条件下よりも前記光検出手段が受光する蛍光の光量が小さくなるように調整された第２の条件下で、前記光検出手段が、前記蛍光量調整手段によって光量を調整された蛍光を受光した場合に出力する第２蛍光シグナルと、を比較することによって、前記第１蛍光シグナルが異常か否かを判別し、
    前記第１蛍光シグナルが異常であると判断した場合には前記第２蛍光シグナルを補正することによって、正常な蛍光シグナルを得ることを特徴とする表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
  6. 前記補正は、前記光検出手段が正常に受光している場合における前記第１蛍光シグナルと前記第２蛍光シグナルとの比率と、前記第１蛍光シグナルが異常であると判断した場合の前記第２蛍光シグナルと、の積を、前記正常な蛍光シグナルとして算出することを特徴とする請求項５に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
  7. 前記蛍光量調整手段を、前記センサチップと前記光検出手段との間に設けたことを特徴とする請求項５または６に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
  8. 前記蛍光量調整手段を、前記光源と前記誘電体部材との間に設けたことを特徴とする請求項５から７のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
  9. 前記金属薄膜に対する励起光の入射角を調整するための照射角調整手段を設けたことを特徴とする請求項５から８のいずれかに記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
  10. 前記照射角調整手段を用いて、前記金属薄膜に対する励起光の入射角を所定の範囲において変化させながら、前記光検出手段によって蛍光を受光し、
    前記励起光の入射角と、前記光検出手段が蛍光を受光した場合に出力する蛍光シグナルとの関係に基づき、異常な蛍光シグナルを判別することを特徴とする請求項９に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置。
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