JP6003645B2 - 蛍光検出装置およびこれを用いた蛍光検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、光源より励起光を照射することで反射面より生じたエバネッセント波を用いて、アナライトを標識した蛍光物質を励起させ、この励起された蛍光を検出することで高精度なアナライト検出を可能とする蛍光検出装置およびこれを用いた蛍光検出方法に関する。

従来より、全反射条件下で反射する反射面に光源より励起光を照射することで、この反射面からエバネッセント波が生ずるという原理に基づき、例えば生体内の極微少なアナライトの検出を行うようにした蛍光検出装置が用いられている。

このような蛍光検出装置としては、例えば表面プラズモン増強蛍光センサ１００が挙げられ、その基本的な構造は図７に示したように、まず誘電体部材１０２と、誘電体部材１０２の主面上に形成された金属薄膜１０４と、金属薄膜１０４の上面に形成され、流路１０８上の所定位置にリガンドが固定化された反応エリア１１０を備えた反応層１０６と、を有するチップ構造体１１２を備えている。本図における反応エリア１１０は、流路１０８の形成された範囲よりも小さい範囲であり、さらに金属薄膜１０４に励起光が照射される領域である励起エリアよりも小さい範囲である（図８参照）。

そして、チップ構造体１１２の誘電体部材１０２側には、誘電体部材１０２内に入射され、金属薄膜１０４に向かって全反射条件で励起光１１４を照射する光源１１６を備え、さらに光源１１６から照射され金属薄膜１０４で反射した反射光１１８を受光する受光手段１２０が備えられている。

一方、チップ構造体１１２の反応層１０６側には、反応層１０６の反応エリア１１０で固定化されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光１２２を受光する光検出手段１２４が設けられている。

なお、反応層１０６の反応エリア１１０と光検出手段１２４との間には、蛍光１２２を効率良く集光するための集光部材１２６と、蛍光１２２以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光１２２のみを選択する波長選択機能部材１２８が設けられている。

そして、表面プラズモン増強蛍光センサ１００の使用においては、反応層１０６の反応エリア１１０内に、流路１０８を介してアナライトを有する試料溶液を流入させ、その後、このアナライトを標識する蛍光物質を、同様に流路１０８を介して流入させることで、反応エリア１１０に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化された状態とする。

そして、この状態で光源１１６より誘電体部材１０２を介して金属薄膜１０４に全反射条件で励起光１１４を照射することで、金属薄膜１０４の表面からエバネッセント波を放出させ、このエバネッセント波により反応エリア１１０の全面にわたって、固定化されたアナライトを標識する蛍光１２２を励起させる。

このとき、図８に示したように反応エリア１１０の全面にわたって、固定化されたアナライトを標識する蛍光１２２が励起されるように、光源１１６から金属薄膜１０４に照射される励起光１１４の励起エリア１３０は、反応エリア１１０の全範囲またはそれ以上の範囲の大きさに設定されている。

なお励起エリア１３０を金属薄膜１０４の形成されたエリアよりも内側の範囲に設定している理由としては、励起エリア１３０を金属薄膜１０４の形成されたエリアよりも大きく設定した場合、誘電体部材１０２などからの自家蛍光の影響を受け、感度が下がるためであり、これを防止するためである。

そして、エバネッセント波によって励起された反応エリア１１０全面の蛍光１２２を光検出手段１２４で検出することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。

このような表面プラズモン増強蛍光センサ１００に代表される蛍光検出装置は、特に生体分子間などの微細な分子活動を観察するのに好適である。

ところで、上述したような従来の表面プラズモン増強蛍光センサ１００では、流路１０８を介して反応層１０６の反応エリア１１０にアナライトを有する試料溶液を流入させた際、流路１０８が一方向送液系（Onepass,循環送液系）であると、流路上流側に位置する反応エリア１１０の端部に反応量が偏ってしまう場合があった。また、流路１０８が双方向の往復送液系であると、流路上流側と下流側に位置する反応エリア１１０の両端部に反応量が偏ってしまう場合があった。

これは、送液される試料溶液が、例えば流路の高さ又は流路の幅が数１０μｍ程度のマイクロ流路内では層流となるため、反応エリア１１０の上流から下流に進むにしたがって、反応エリア１１０の表面近傍と表面から離れた位置とでアナライトの濃度差が生じ、反応エリア１１０の上流に比べて下流の反応量が低くなるためである。

このように流路１０８を介して試料溶液を反応エリア１１０に供給するようにしたフローアッセイ系の表面プラズモン増強蛍光センサ１００では、反応量が反応エリア１１０の端部に偏った状態で、反応エリア１１０の全面に励起光１１４を照射して反応エリア１１０の蛍光１２２を励起させ、励起された蛍光１２２を光検出手段１２４で検出している。

このことは、図９および図１０に示した一方向の循環送液系と双方向の往復送液系との反応エリアにおける反応量の分布状況のグラフからも明らかであり、反応エリア１１０の端部に反応量が偏って反応量分布のバラツキが大きくなってしまうと、励起エリア１３０に対して蛍光標識物質が存在する「量」及び蛍光標識物質が存在する「流路中の位置」がバラツキ、測定結果が安定しないという問題があった。なお、図９および図１０の符号１３２は、反応量が偏った箇所を示したものである。

このような問題は、極微少なアナライトの検出を目的とする表面プラズモン増強蛍光センサのような蛍光検出装置にとって、非常に重大な問題となる。

本発明はこのような現状に鑑みなされたものであって、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度にアナライトの検出を行うことのできる蛍光検出装置およびこれを用いた蛍光検出方法を提供することを目的とする。

本発明は、前述したような従来技術における問題点を解決するために発明されたものであって、
本発明の蛍光検出装置は、
光源より励起光を照射して反射面からエバネッセント波を放出させ、前記反射面上に固定化されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させ、この励起された蛍光を光検出手段で検出するようにした蛍光検出装置であって、
前記蛍光検出装置は、
反射面とその反射面上に形成された反応層とを有するチップ構造体を、装置本体に対して着脱して使用する、または装置本体に対して固定して使用するように構成されており、
前記反応層は、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備え、
前記反応層の流路が、往復送液系であり、
前記流路内に形成された前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように各エリアの大きさが規定され、
前記励起エリアが、反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部と、反応量の分布の偏りが大きい流路下流側に位置する端部と、の両端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする。

さらに、本発明の蛍光検出方法は、
反射面とその反射面の一方側に形成された反応層とを有し、前記反応層が、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備えたチップ構造体の前記反応エリアでアナライトを捕捉し、前記アナライトを蛍光物質で標識する工程と、
前記チップ構造体の前記反射面の他方側から励起光を照射して、前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程と、
励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
前記反応層の流路が、往復送液系であり、
前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための前記励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように前記励起光を照射し、
前記励起エリアが、反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部と、反応量の分布の偏りが大きい流路下流側に位置する端部と、の両端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする。

このように反応エリアと励起エリアを規定して、反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所（反応量の差が大きい箇所）を除いた箇所を励起エリアとすることで、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。
また、双方向の往復送液系であるので、一方向の送液系（Onepass,循環送液系）よりも反応量の分布が少なく（反応エリアの端部と反応エリアの中央部との反応量の差が出難くなり）、一方向の送液系（Onepass,循環送液系）と比べてさらに測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。
さらに、前記励起エリアが、前記反応エリアの流路上流側に位置する端部および流路下流側に位置する端部の両端部を除いたエリアであるので、流路が双方向の往復送液系であっても、反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所が除かれるため、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。

また、本発明の蛍光検出装置は、
光源より励起光を照射して反射面からエバネッセント波を放出させ、前記反射面上に固定化されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させ、この励起された蛍光を光検出手段で検出するようにした蛍光検出装置であって、
前記蛍光検出装置は、
反射面とその反射面上に形成された反応層とを有するチップ構造体を、装置本体に対して着脱して使用する、または装置本体に対して固定して使用するように構成されており、
前記反応層は、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備え、
前記反応層の流路が、循環送液系であり、
前記流路内に形成された前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように各エリアの大きさが規定され、
前記励起エリアが、少なくとも反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする。

さらに、本発明の蛍光検出方法は、
反射面とその反射面の一方側に形成された反応層とを有し、前記反応層が、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備えたチップ構造体の前記反応エリアでアナライトを捕捉し、前記アナライトを蛍光物質で標識する工程と、
前記チップ構造体の前記反射面の他方側から励起光を照射して、前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程と、
励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
前記反応層の流路が、循環送液系であり、
前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程において、
前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための前記励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
反応エリア＞励起エリア
の関係を満たすように前記励起光を照射し、
前記励起エリアが、少なくとも反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする。

このように反応エリアと励起エリアを規定して、反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所（反応量の差が大きい箇所）を除いた箇所を励起エリアとすることで、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。
また、励起エリアが、少なくとも前記反応エリアの流路上流側に位置する端部を除いたエリアであるので、一方向の送液系（Onepass,循環送液系）であっても、反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所が除かれるため、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。

また、本発明の蛍光検出装置は、
前記励起エリアが、前記反応エリアの流路上流側に位置する端部および流路下流側に位置する端部の両端部を除いたエリアであることを特徴とする。
さらに、本発明の蛍光検出方法は、
前記励起エリアが、前記反応エリアの流路上流側に位置する端部および流路下流側に位置する端部の両端部を除いたエリアであることを特徴とする。

このようにすれば、一方向の送液系（Onepass,循環送液系）であっても、反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所が除かれるため、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。

また、本発明の蛍光検出装置は、
前記光源より照射される励起光が、レーザ光であることを特徴とする。

このようにレーザ光であれば、励起エリアの位置および大きさの設定が容易であるため、測定結果のバラツキを飛躍的に抑え、高精度にアナライトの検出を行うことができる。

また、本発明の蛍光検出装置は、
前記反射面が、誘電体部材上に形成された金属薄膜により形成されてなることを特徴とする。

このような反射面であれば、金属薄膜によって生じたエバネッセント波で反応エリアの蛍光を励起することができ、高精度にアナライトの検出を行うことができる。

また、本発明の蛍光検出装置は、
表面プラズモン増強蛍光センサまたは全反射蛍光センサのいずれかであることを特徴とする。

このように表面プラズモン増強蛍光センサまたは全反射蛍光センサであれば、高精度に極微量および／または極低濃度のアナライトの検出を行うことができる。

本発明によれば、反応エリアに対する励起エリアの大きさを規定し、反応エリアに対して励起エリアを小さくしたので、例えば反応量の分布の少ない範囲のみ、すなわち反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所を除いた箇所を励起エリアとして測定するなど、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度にアナライトの検出を行うことのできる蛍光検出装置およびこれを用いた蛍光検出方法を提供することができる。

図１は、本発明の蛍光検出装置の一実施例である表面プラズモン増強蛍光センサの概略図である。 図２は、本発明の蛍光検出装置の一実施例である表面プラズモン増強蛍光センサにおける反応エリアと励起エリアを示した概略図である。 図３は、図２に示した反応エリアと励起エリアにおいて、循環送液系の場合における反応量の分布と反応エリア端部からの位置についての関係を示したグラフである。 図４は、本発明の蛍光検出装置の一実施例である表面プラズモン増強蛍光センサにおける反応エリアと励起エリアを示した概略図である。 図５は、図４に示した反応エリアと励起エリアにおいて、循環送液系の場合における反応量の分布と反応エリア端部からの位置についての関係を示したグラフである。 図６は、図２に示した反応エリアと励起エリアにおいて、往復送液系の場合における反応量の分布と反応エリア端部からの位置についての関係を示したグラフである。 図７は、従来の表面プラズモン増強蛍光センサの概略図である。 図８は、従来の表面プラズモン増強蛍光センサにおける反応エリアと励起エリアを示した概略図である。 図９は、図８に示した反応エリアと励起エリアにおいて、循環送液系の場合における反応量の分布と反応エリア端部からの位置についての関係を示したグラフである。 図１０は、図８に示した反応エリアと励起エリアにおいて、往復送液系の場合における反応量の分布と反応エリア端部からの位置についての関係を示したグラフである。

以下、本発明の実施の形態について、図面に基づいてより詳細に説明する。

本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法は、光源より励起光を照射することで反射面より生じたエバネッセント波を用いてアナライトを標識した蛍光物質を励起させ、この励起された蛍光を検出することで高精度にアナライトを検出するものである。

なお、本発明の実施の形態については、本発明の蛍光検出装置の一実施例である表面プラズモン増強蛍光センサを例にして説明を行う。

また、本明細書中でいう「表面プラズモン」とは、広義の意味で用いられるものであって、「局在プラズモン」についても含まれるものである。

＜表面プラズモン増強蛍光センサ１０＞
図１に示した本発明の一実施例である表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、基本的な構造について、先に図７を用いて説明した従来の表面プラズモン増強蛍光センサ１００と同じである。

このような表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、まず誘電体部材１２と、誘電体部材１２上に形成された金属薄膜１４と、金属薄膜１４上に形成され、流路１８上の所定位置にリガンドが固定化された反応エリア２０を備えた反応層１６と、を有するチップ構造体２２を備えている。

なお、チップ構造体２２は、必ずしも表面プラズモン増強蛍光センサ１０（蛍光検出装置）に予め備えられている必要はなく、チップ構造体２２を、表面プラズモン増強蛍光センサ１０（蛍光検出装置）に設けた装填部（図示せず）に着脱可能な構成とし、例えば蛍光検出を行う度に新たなチップ構造体２２を装填部（図示せず）に装填した後、測定対象のサンプルをチップ構造体２２に供給して蛍光検出するような態様であっても良く、勿論本発明はそのような態様も包含するものである。

本実施の形態における反応エリア２０は、流路１８の形成された範囲と同じ範囲としている。しかしながら反応エリアの範囲は特に限定されるものではなく、例えば金属薄膜１４の全面に形成されたり、流路の途中に区画形成されるなど自由に位置や範囲を決めることが可能である。

そして、チップ構造体２２の誘電体部材１２側には、誘電体部材１２内に入射され、金属薄膜１４に向かって全反射条件で励起光２４を照射する光源２６を備え、さらに光源２６から照射され金属薄膜１４で反射した反射光２８を受光する受光手段３０が備えられている。

光源２６から照射される励起光２４としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０〜８００ｎｍ、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザが好適である。特にレーザ光は、光の照射位置や照射面積の設定が容易であるため本発明に好適である。

一方、チップ構造体２２の反応層１６側には、反応層１６の反応エリア２０で固定化されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光３２を受光する光検出手段３４が設けられている。

光検出手段３４としては、超高精度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。

なお、反応層１６の反応エリア２０と光検出手段３４との間には、蛍光３２を効率良く集光するための集光部材３６と、蛍光３２以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光３２のみを選択する波長選択機能部材３８が設けられている。

集光部材３６としては、光検出手段３４に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであれば、任意の集光系で良い。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。

一方、波長選択機能部材３８としては、光学フィルタ，カットフィルタなどを用いることができる。

光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。

さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、チップ構造体上に位置する構造物または付着物などの影響で発生する散乱光），酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。

なお、図１に示した表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、チップ構造体２２を表面プラズモン増強蛍光センサ１０の構成の一部として説明したが、このような形態に限定されるものではなく、上述の光源２６及び光検出手段３４を少なくとも含み、さらに例えば集光部材３６や波長選択機能部材３８を表面プラズモン増強蛍光センサ１０の装置本体に備え、その装置本体に対してチップ構造体２２を着脱して使用する形態としても良く、チップ構造体２２を装置本体に対して固定して使用する形態であっても良いものである。

そして、表面プラズモン増強蛍光センサ１０の使用においては、反応層１６の反応エリア２０内に流路１８を介してアナライトを有する試料溶液を流入させ、その後、同様にこのアナライトを標識する蛍光物質を、流路１８を介して流入させることで、反応エリア２０に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化された状態とする。

そして、この状態で光源２６より誘電体部材１２を介して、反射面を形成する金属薄膜１４に全反射条件で励起光２４を反応エリア２０内の一部に照射することで、金属薄膜１４の表面からエバネッセント波を放出させ、このエバネッセント波により励起エリア４０に対応する位置に固定化されたアナライトを標識する蛍光３２を励起させる。

そして、反応エリア２０内一部において、エバネッセント波によって励起された蛍光３２を光検出手段３４で検出することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。

なお、金属薄膜１４の材質としては、好ましくは金，銀，アルミニウム，銅，および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。

このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１４の材質として好適である。

また、金属薄膜１４の形成方法としては、例えばスパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法など），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法，蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。

さらに金属薄膜１４の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。

電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。

金属薄膜１４の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１４であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されないものである。

さらに、アナライト検出時に用いられる検体としては、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられる。

また、検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。

さらに蛍光物質としては、所定の励起光２４を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光３２を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光３２とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。

また、誘電体部材１２としては、光学的に透明な各種の無機物，天然ポリマー，合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）または二酸化チタン（ＴｉＯ₂）を含むことが好ましい。

さらに、このような表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、光源２６から金属薄膜１４に照射される励起光２４による表面プラズモン共鳴の共鳴角を調整するため、角度可変部（図示せず）や、光検出手段３４に入力された情報を処理するためのコンピュータ（図示せず）などを有しても良いものである。

ここで、角度可変部（図示せず）は、サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段３０と光源２６とを同期し、４５〜８５°の角度変更を可能とし、分解能が０．０１°以上であることが好ましい。

上記した構成を有する本実施の形態の表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、特に反応エリア２０で固定化されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光３２を励起する励起エリア４０が、反応エリア２０よりも小さく設定されている点において特徴的である。

以下、このように反応エリア２０と励起エリア４０とを設定してなる表面プラズモン増強蛍光センサ１０について説明する。

＜反応エリア２０と励起エリア４０との関係＞
本発明の蛍光検出装置の一実施例である表面プラズモン増強蛍光センサ１０は、図２に示したように、反応エリア２０に対して、光源２６より照射される励起光２４による励起エリア４０が小さく設定されている。

反応エリア２０の全面における反応量の分布は、図３に示したように、一方向の循環送液系の場合、流路上流に位置する反応エリア端部（図３では左側端部）において反応量が偏った状態となる。なお、図３において、横軸の「反応エリア端部からの相対位置」は、反応エリア２０の流路方向における全長を１として、一端を「０」、他端を「１」として表したものであり、縦軸の「分布（バラツキ具合）」は、反応エリア２０全体における全反応量を単位領域で平均した反応量の平均値を１として、その平均値に対する各単位領域の反応量の比率を表したものである。この単位領域は、反応エリア２０を流路方向全長の１／１００毎に区分けした領域である。

したがって、この反応エリア２０の内、反応量の偏っていない箇所、すなわち図３に示したグラフ縦軸の分布（バラツキ具合）の幅が僅かとなるエリアを励起エリア４０に設定することにより、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度なアナライトの検出が可能である。

なお、図２に示した反応エリア２０と励起エリア４０との関係では、励起エリア４０が、反応エリア２０の流路上流側に位置する端部および流路下流側に位置する端部の両端部を除いたエリアに設定されているが、循環送液系は、流路１８の上流側に位置する反応エリア２０端部において反応量が偏り（反応量が局部的に多くなること）、流路１８の下流側では反応量の偏りは生じないため、図４および図５に示したように、励起エリア４０を反応エリア２０の上流側の端部のみを除いたエリアとしても良いものである。

一方、双方向の往復送液系の場合には図６に示したように、反応エリア２０の流路１８の上流側の端部と流路１８の下流側の端部において反応量が偏った状態となる。

このため往復送液系の場合には、反応エリア２０の流路１８の上流側の端部と流路１８の下流側の端部とを除いたエリアを励起エリア４０とすることで、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度にアナライトの検出を行うことができる。

循環送液系と往復送液系とを比べると、往復送液系の方が反応量の分布（バラツキ具合）が少ないため、表面プラズモン増強蛍光センサ１０に用いる送液系としては往復送液系の方が好適である。

なお、往復送液系については、従来より公知の技術を用いることができ、例えば流路１８の上流側に往復送液ポンプ（図示せず）を設置するとともに、流路１８の下流側に試料溶液の混合部（図示せず）を設置し、往復送液ポンプ（図示せず）の駆動により、反応エリア２０内に試料溶液を流して流路１８の下流側の混合部（図示せず）へ試料溶液を移動させ、次いで再度往復送液ポンプ（図示せず）を駆動させて今度は混合部（図示せず）内の試料溶液を往復送液ポンプ（図示せず）側へ移動させることを複数回繰り返すことで、反応エリア２０に蛍光物質で標識されたアナライトが固定化されることとなる。

また、本発明においては、金属薄膜１４の上面に形成された反応層１６において、金属薄膜１４が形成されたエリアよりも内側に反応エリア２０が形成されているが、このような構成に限定されるものではなく、金属薄膜１４の形成されたエリアの全面上に反応エリア２０を設けても良く、これらのエリアの関係は如何なるものであっても良いものである。

なお、上記説明では本発明の蛍光検出装置の一実施例として表面プラズモン増強蛍光センサ１０を用いて説明したが、表面プラズモン増強蛍光センサ１０と同様の原理を用いた全反射蛍光センサ（図示せず）であっても、反応エリア２０よりも励起エリア４０を小さくすれば、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度にアナライトの検出を行うことができる。なお、励起エリア４０は反応エリア２０内に位置するよう設定することは勿論である。

表面プラズモン増強蛍光センサ１０と全反射蛍光センサ（図示せず）の構成の違いとして、表面プラズモン増強蛍光センサ１０は誘電体部材１２の上面に金属薄膜１４が形成され、この上に反応層１６が形成されるのに対し、全反射蛍光センサ（図示せず）は誘電体部材の上面に直接反応層が形成される点が挙げられる。全反射蛍光センサ（図示せず）の場合には、誘電体部材と反応層との界面においてエバネッセント波が生ずるものであること以外、表面プラズモン増強蛍光センサと基本的な構成は同じであるため、その詳細な説明について本明細書では省略する。

上記したように本発明の蛍光検出装置およびこれを用いた蛍光検出方法は、反応エリアに対する励起エリアの大きさを規定し、反応量の分布の少ない範囲のみ、すなわち反応エリア端部の反応量の分布が大きい箇所を除いた箇所のみを励起エリアとして測定するように各エリアの大きさを規定したので、測定結果のバラツキを抑えることができ、高精度にアナライトの検出を行うことができるものであって、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能なものである。

１０・・・表面プラズモン増強蛍光センサ
１２・・・誘電体部材
１４・・・金属薄膜
１６・・・反応層
１８・・・流路
２０・・・反応エリア
２２・・・チップ構造体
２４・・・励起光
２６・・・光源
２８・・・反射光
３０・・・受光手段
３２・・・蛍光
３４・・・光検出手段
３６・・・集光部材
３８・・・波長選択機能部材
４０・・・励起エリア
４２・・・反応量が偏った箇所
１００・・・表面プラズモン増強蛍光センサ
１０２・・・誘電体部材
１０４・・・金属薄膜
１０６・・・反応層
１０８・・・流路
１１０・・・反応エリア
１１２・・・チップ構造体
１１４・・・励起光
１１６・・・光源
１１８・・・反射光
１２０・・・受光手段
１２２・・・蛍光
１２４・・・光検出手段
１２６・・・集光部材
１２８・・・波長選択機能部材
１３０・・・励起エリア
１３２・・・反応量が偏った箇所

Claims (9)

1. 光源より励起光を照射して反射面からエバネッセント波を放出させ、前記反射面上に固定化されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させ、この励起された蛍光を光検出手段で検出するようにした蛍光検出装置であって、
   前記蛍光検出装置は、
   反射面とその反射面上に形成された反応層とを有するチップ構造体を、装置本体に対して着脱して使用する、または装置本体に対して固定して使用するように構成されており、
   前記反応層は、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備え、
   前記反応層の流路が、往復送液系であり、
   前記流路内に形成された前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
   反応エリア＞励起エリア
   の関係を満たすように各エリアの大きさが規定され、
   前記励起エリアが、反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部と、反応量の分布の偏りが大きい流路下流側に位置する端部と、の両端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする蛍光検出装置。
2. 光源より励起光を照射して反射面からエバネッセント波を放出させ、前記反射面上に固定化されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させ、この励起された蛍光を光検出手段で検出するようにした蛍光検出装置であって、
   前記蛍光検出装置は、
   反射面とその反射面上に形成された反応層とを有するチップ構造体を、装置本体に対して着脱して使用する、または装置本体に対して固定して使用するように構成されており、
   前記反応層は、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備え、
   前記反応層の流路が、循環送液系であり、
   前記流路内に形成された前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
   反応エリア＞励起エリア
   の関係を満たすように各エリアの大きさが規定され、
   前記励起エリアが、少なくとも反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする蛍光検出装置。
3. 前記励起エリアが、前記反応エリアの流路上流側に位置する端部および流路下流側に位置する端部の両端部を除いたエリアであることを特徴とする請求項２に記載の蛍光検出装置。
4. 前記光源より照射される励起光が、レーザ光である請求項１から３のいずれか記載の蛍光検出装置。
5. 前記反射面が、誘電体部材上に形成された金属薄膜により形成されてなる請求項１から４のいずれかに記載の蛍光検出装置。
6. 前記蛍光検出装置が、
   表面プラズモン増強蛍光センサまたは全反射蛍光センサのいずれかである請求項１から５のいずれかに記載の蛍光検出装置。
7. 反射面とその反射面の一方側に形成された反応層とを有し、前記反応層が、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備えたチップ構造体の前記反応エリアでアナライトを捕捉し、前記アナライトを蛍光物質で標識する工程と、
   前記チップ構造体の前記反射面の他方側から励起光を照射して、前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程と、
   励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
   を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
   前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
   前記反応層の流路が、往復送液系であり、
   前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程において、
   前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための前記励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
   反応エリア＞励起エリア
   の関係を満たすように前記励起光を照射し、
   前記励起エリアが、反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部と、反応量の分布の偏りが大きい流路下流側に位置する端部と、の両端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする蛍光検出方法。
8. 反射面とその反射面の一方側に形成された反応層とを有し、前記反応層が、流路と、前記流路内に前記アナライトを捕捉するためのリガンドが形成された反応エリアと、を備えたチップ構造体の前記反応エリアでアナライトを捕捉し、前記アナライトを蛍光物質で標識する工程と、
   前記チップ構造体の前記反射面の他方側から励起光を照射して、前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程と、
   励起された蛍光を光検出手段にて測定する工程と、
   を少なくとも有する蛍光検出方法であって、
   前記アナライトを蛍光物質で標識する工程において、
   前記反応層の流路が、循環送液系であり、
   前記反応エリアの前記蛍光物質を励起させる工程において、
   前記反応エリアと、前記反応エリアで捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質を励起させるための前記励起光を照射する範囲である励起エリアと、の関係が、
   反応エリア＞励起エリア
   の関係を満たすように前記励起光を照射し、
   前記励起エリアが、少なくとも反応量の分布の偏りが大きい前記反応エリアの流路上流側に位置する端部を除いた反応量の分布の偏りが小さいエリアであることを特徴とする蛍光検出方法。
9. 前記励起エリアが、前記反応エリアの流路上流側に位置する端部および流路下流側に位置する端部の両端部を除いたエリアであることを特徴とする請求項８に記載の蛍光検出方法。