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WO2011101345A1 - Verfahren zur erzeugung eines peptidreinigungsmaterials auf graphitbasis und verfahren zur peptidaufreinigung - Google Patents

Verfahren zur erzeugung eines peptidreinigungsmaterials auf graphitbasis und verfahren zur peptidaufreinigung Download PDF

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Publication number
WO2011101345A1
WO2011101345A1 PCT/EP2011/052214 EP2011052214W WO2011101345A1 WO 2011101345 A1 WO2011101345 A1 WO 2011101345A1 EP 2011052214 W EP2011052214 W EP 2011052214W WO 2011101345 A1 WO2011101345 A1 WO 2011101345A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
graphite
acid
purification
producing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2011/052214
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Oliver J. Kreuzer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PEPTIDES&ELEPHANTS GmbH
PEPTIDES AND ELEPHANTS GmbH
Original Assignee
PEPTIDES&ELEPHANTS GmbH
PEPTIDES AND ELEPHANTS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PEPTIDES&ELEPHANTS GmbH, PEPTIDES AND ELEPHANTS GmbH filed Critical PEPTIDES&ELEPHANTS GmbH
Priority to EP11704215A priority Critical patent/EP2536740A1/de
Publication of WO2011101345A1 publication Critical patent/WO2011101345A1/de
Priority to US13/586,196 priority patent/US20120329989A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for the generation of a peptide ⁇ supply cleaning material based on graphite, so ⁇ as a method for peptide purification, in which the peptide purification material is used based on graphite.
  • the amino acids in the Rei ⁇ hen represent the sequence of the peptide are joined together.
  • the peptide chain which grows by one amino acid at each step in the synthesis, is bound to a solid support in solid-phase synthesis.
  • the one end of each amino acid, the C-terminus is linked to the other end of the preceding amino acid, the N-terminus.
  • Both terms are reak ⁇ tive, so that must be ensured in the peptide synthesis that the amino acid does not react with itself or in several amino acids, these do not connect in the wrong order.
  • the selectivity hither pose ⁇ therefore, the carboxyl and amino groups which should not be linked, see ⁇ with a protective group ver.
  • the detachment of the finished peptide from the carrier is carried out with a strong acid, preferably trifluoroacetic acid (TFA).
  • a strong acid preferably trifluoroacetic acid (TFA).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the permanent protecting groups of the side chains of the peptides are simultaneously cleaved off.
  • the temporary protecting group at the N-terminus is usually cleaved with a base.
  • the free peptide, and start at ⁇ split protecting groups of the side chains then in the TFA solution.
  • one or more additional purification steps are erfor ⁇ sary for the preservation of the pure peptide.
  • this separation can be extremely difficult. th.
  • undesirable by-products which have in their length only marginally deviate from the desired peptide ⁇ Chen, almost same physicochemical characteristics on ⁇ .
  • the purification is so far not so efficient.
  • the peptide is purified by high performance liquid chromatography (HPLC) in a preparative HPLC system.
  • a further disadvantage is the limited parallelizability of the method, since only one peptide can be purified on one HPLC system at a time. To parallelize the cleaning, additional HPLC systems with the corresponding costs must be used.
  • Jacob et al. describe in international application WO 2005/118617 A2 a purification process in which the protective group of the N-terminus is not split off, but used for the purification.
  • the peptide-with-protecting group is transferred to a lipophilic surface to which the protecting group binds. Subsequently, unbound impurities are washed off. This is followed by a washing step in which the bond between the peptide and the protective group is broken.
  • Characterized ver ⁇ is the protective group on the lipophilic material and the free peptide is washed down.
  • Various substances, for example reverse phase materials, are used.
  • This cleaning variant has the disadvantage that a trailing cleavage of the peptide from the protective group is done directly during purification, which can lead to side reactions. In addition, it may be partially beneficial to maintain the protecting group for the time being. Furthermore, Jacob et al. various, sometimes very costly, lipophilic materials.
  • the object of the invention is to create a graphite material prepared ⁇ , which overcomes the above mentioned disadvantages.
  • a method should be provided which allows the purification of peptides with terminal planar aromatic protecting group based on this material.
  • the object is achieved by a process for producing a peptide cleaning material on Gra ⁇ phitbasis, which is characterized in that graphite by at least one incubation in at least one organic or inorganic acid for at least one minute to a pH ⁇ 7 (acid ) is set.
  • a pH ⁇ 7 acid
  • the object is achieved by a method for Peptidauf- cleaning, wherein the peptide has a terminal planar aromatic protective group, wherein using graphite in packed form as a cleaning material, this method is characterized in that acid pre-adjusted graphite (pH ⁇ 7) is used as a purification material.
  • a peptide or peptides are understood as meaning polypeptides having 2 to 100 amino acids, preferably 2 to 40 amino acids, most preferably 2 to 20 amino acids.
  • Planar aromatic protecting groups include all entspre ⁇ sponding protecting groups which are ⁇ sets in peptide synthesis. Included are in particular fluorenylmethoxycarbonyl groups (Fmoc groups), tetrabenzofluorenylmethoxycarbonyl groups (Tbfmoc groups) and benzyloxycarbonyl groups (Z groups), as well as their derivatives with fused benzene rings. Particularly preferred is an Fmoc group application.
  • Fmoc groups fluorenylmethoxycarbonyl groups
  • Tbfmoc groups tetrabenzofluorenylmethoxycarbonyl groups
  • Z groups benzyloxycarbonyl groups
  • the required column material is preferably produced by a method for generating a Peptidtherapies- material based on graphite, in which the Gra ⁇ phit acid is provided by successive incubations in at least two acids for at least two minutes, a ⁇ , wherein after the respective Inkubationsschrit ⁇ th is treated to remove free acid residues with at least one organic solvent and after the first incubation step to remove protease residues first treated with boiling water.
  • the inorganic acids are preferably Salzkla ⁇ acid, nitric acid and sulfuric acid.
  • the organic acids are selected from unsubstituted or substituted C 1 -C 6 -carboxylic acids, wherein the substituted C 1 -C 6 -carboxylic acids are preferably selected from the mono- or polysubstituted C 1 -C 6 -carboxylic acids, more preferably from the mono- or poly-halogenated C 1 -C 6 -carboxylic acids.
  • acetic acid is most preferably used, and of the polyhalogenated C 1 -C 6 -carboxylic acids TFA.
  • both incubation steps are carried out in organic acids, it being ⁇ Sonders be preferred to allow the first incubation step carried out in egg ⁇ ner first organic acid and the second incubation step in a second organic acid.
  • a very preferred embodiment of the method of He ⁇ generation of a peptide purification material is characterized labeled in ⁇ lines, which takes place the first incubation step in a halogenated hydro ⁇ ned Cl-C6-carboxylic acid, and the second incubation step in one unsubstituted Ci-C6-carboxylic acid.
  • treatment is carried out with at least one organic solvent both after the first and after the second incubation step.
  • organic solvents which are used alone or mixed with each other or in admixture with water. If mixtures are used, these volume ratios are from 1: 9 to 9: 1.
  • polar organic aprotic solvents which are used alone or mixed with each other or in admixture with water. If mixtures are used, these volume ratios are from 1: 9 to 9: 1.
  • Especially mixtures with water have volume ratios of from 1: 9 to 9: 1, preferably 1: 5 to 5: 1, particular ⁇ DERS preferably 1: 1.
  • a preferred solvent is acetonitrile (ACN).
  • ACN acetonitrile
  • the acidified graphite (pH ⁇ 7) can be used as a material for peptide purification. It is used for the purification in packed form.
  • packed form is meant that the material is in a device, preferably in a column,
  • the "acidic aqueous solution of the peptide having a terminal planar aromatic protecting group” involves dissolving the protected peptide in a mixture of water and an acid, preferably TFA,
  • the mixture may have a volume ratio of 1: 9 to 9: 1, preferably 1: 5 to 5: 1, particular ⁇ DERS preferably 1: 3 (TFA: water) have from anhydrous.
  • Acid for example, pure TFA or the cleavage solution in which the protected peptide is present after the synthesis of the solid phase, there is no attachment to the Gra ⁇ phit.
  • organic solvent again refers to the organic polar aprotic solvents already described above, which can be used alone or in a mixture with one another, a preferred solvent being again acetonitrile.
  • Aqueous bases are selected from the group of Anorga ⁇ African and organic bases, preferably organic bases, particularly preferably ammonia (NH 3) (aq) is used.
  • the aqueous base is preferably used in a concent ⁇ ration between 5 and 50% (V / V), more preferably Zvi ⁇ 's 20 and 40% (V / V), are used.
  • the treatment with the aqueous base is used to "transform buffer" the environment on the graphite.
  • the elution of the peptide-with-protecting group is prepared.
  • the ge ⁇ protected peptide is eluted only from graphite, when previously with an aqueous base was washed. Here, no cleavage of the N-terminal protecting group does not occur.
  • An elution of the peptide-with-protective group is in the ⁇ sem step, or only in very small amounts ( ⁇ 5%).
  • Elution of the peptide-with-protecting group is accomplished by washing with a mixture of at least one organic solvent and water. After elution from the graphite, the peptide with attached protecting group is obtained in a purity between 70% and 99%, preferably at least 80%, most preferably at least 95%. On this way The protected peptide is purified without ether precipitation from the TFA solution.
  • the invention relates to a speaking ent ⁇ Peptidaufgraphyskit comprising a Vorrich ⁇ tung, the acidic preset graphite (pH ⁇ 7) in a packaged form contains.
  • the Pepti ⁇ dillergraphyskit comprises a device which contains a peptide cleaning on graphite-based, ie sour preset graphite ⁇ generated or acidified by the method described above, in packed form.
  • the "device” here ie normal columns or spraying with a suitable retaining device comprises, in particular any kind of kla ⁇ le, (for example, a frit).
  • Scheme ⁇ schematically a suitable apparatus in Figure 1 is shown.
  • the graphite is as described above by at least once Incubation in at least one organic or inorganic acid for at least one minute to a pH ⁇ 7 (acidic) Preferred embodiments are as already described above. Description of the pictures
  • FIG. 1 Schematic representation of a device for carrying out the Peptidaufthesesver-.
  • Fig. 3 Shown is the HPLC-MS chromatogram of
  • Fig. 4 Shown is the HPLC-MS chromatogram of
  • Fig. 5 Shown is the HPLC-MS chromatogram of
  • Fig. 6 Depicted is the HPLC-MS chromatogram of
  • Free peptide and Fmoc-protected peptide are detectable only in very small quantities ( ⁇ 5%).
  • Fig. 8 Shown is the HPLC-MS chromatogram after classical ether precipitation for the same peptide but without Fmoc group, i. LSETKPAV-OH.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass Graphit durch mindestens einmalige Inkubation in mindestens einer organischen oder anorganischen Säure für mindestens eine Minute auf einen pH-Wert <7 (sauer) eingestellt wird. Umfasst ist weiterhin ein Verfahren zur Peptidaufreinigung, wobei das Peptid eine endständige planare aromatische Schutzgruppe aufweist, unter Verwendung von Graphit in gepackter Form als Auf reinigungsmaterial, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass sauer voreingestellter Graphit (pH <7), hergestellt nach dem Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis als Aufreinigungsmaterial verwendet wird.

Description

Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis und Verfahren zur Peptidaufreinigung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeu¬ gung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis, so¬ wie ein Verfahren zur Peptidaufreinigung, in welchem das Peptidaufreinigungsmaterial auf Graphitbasis eingesetzt wird .
Bei der Peptid-Synthese werden die Aminosäuren in der Rei¬ henfolge der Sequenz des Peptides aneinander gefügt. Die bei jedem Syntheseschritt um eine Aminosäure wachsende Pep- tidkette ist bei der Festphasensynthese auf einem festen Träger gebunden. Das eine Ende jeder Aminosäure, der C- Terminus, wird mit dem anderen Ende der vorhergehenden Aminosäure verbunden, dem N-Terminus. Beide Termini sind reak¬ tiv, so dass bei der Peptidsynthese sichergestellt werden muss, dass die Aminosäure nicht mit sich selbst reagiert bzw. bei mehreren Aminosäuren diese sich nicht in der falschen Reihenfolge verbinden. Um die Selektivität herzu¬ stellen, werden daher die Carboxyl- und Aminogruppen, die nicht verknüpft werden sollen, mit einer Schutzgruppe ver¬ sehen .
Bei der Festphasensynthese wird zuerst eine am N-Terminus geschützte Aminosäure mit ihrem C-Terminus an die Oberflä¬ che der festen Phase gebunden. Zu diesem Zweck wird der N- Terminus der anzufügenden Aminosäure mit einer temporären Schutzgruppe blockiert. Diese Schutzgruppe muss vor jedem neuen Syntheseschritt entfernt werden. Die funktionellen Gruppen der Seitenketten der Aminosäuren werden während der gesamten Synthese mit so genannten permanenten Schutzgruppen blockiert. Am Ende einer Synthese wird die als erstes eingeführte Aminosäure vom Substrat entfernt und proto- niert, wodurch man das fertige Peptid erhält. Letztendlich liegt dann ein freies Peptid in einer Abspalt-Lösung vor.
Die Ablösung des fertigen Peptids vom Träger erfolgt mit einer starken Säure, vorzugsweise Trifluoressigsäure (TFA) . Bei diesem Vorgang werden gleichzeitig die permanenten Schutzgruppen der Seitenketten der Peptide abgespalten. Die temporäre Schutzgruppe am N-Terminus wird normalerweise mit einer Base abgespalten. Das freie Peptid, sowie die ab¬ gespaltenen Schutzgruppen der Seitenketten liegen dann in der TFA- Lösung vor.
Gebräuchlich für die Abtrennung des Peptids aus der Lösung ist eine Etherfällung . Durch die Zugabe von Ether wird das Peptid ausgefällt, während die Seitenketten-Schutzgruppen in der Lösung verbleiben.
Die Reinheit von Peptiden aus einer Festphasensynthese ist sehr unterschiedlich. Nicht jede Aminosäure lässt sich vollständig anknüpfen. Weiterhin entstehen neben der gewünschten Zielsequenz eine Reihe von Fehlsequenzen. Diese Fehlsequenzen werden bei der Fällung mit Ether nicht abgetrennt .
Dies hat zur Folge, dass für den Erhalt des reinen Peptids ein oder mehrere zusätzliche Aufreinigungsschritte erfor¬ derlich sind. Abhängig von der Länge des Peptids und dessen physiko-chemischen Eigenschaften sowie denen der Nebenprodukte kann diese Abtrennung sich äußerst schwierig gestal- ten. Beispielsweise können unerwünschte Nebenprodukte, die in ihrer Länge nur marginal vom gewünschten Peptid abwei¬ chen, nahezu gleiche physiko-chemische Charakteristika auf¬ weisen. Erschwerend kommt weiterhin hinzu, dass zwar die Synthese an der Festphase mit hohem Durchsatz möglich ist, die Aufreinigung aber bisher bei weitem nicht so effizient ist. Üblicherweise wird das Peptid mittels Hochleistungs- Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) in einer präparativen HPLC-Anlage gereinigt.
Eine solche HPLC-Anlage ist kostenintensiv und ermöglicht in etwa die Reinigung eines einzelnen Peptids pro Stunde. Hinzu kommen weitere Kosten für die Anschaffung und Entsorgung der Lösemittel der Flüssigkeits-Chromatographie.
Ein weiterer Nachteil ist die eingeschränkte Parallelisier- barkeit der Methode, denn es kann immer nur ein Peptid auf einer HPLC- Anlage gereinigt werden. Für eine Parallelisie- rung der Reinigung müssen weitere HPLC-Anlagen mit den entsprechenden Kosten eingesetzt werden.
Jacob et al . beschreiben in der internationalen Anmeldung WO 2005/118617 A2 ein Aufreinigungsverfahren, bei welchem die Schutzgruppe des N-Terminus nicht abgespalten, sondern für die Aufreinung genutzt wird. Dabei wird das Peptid-mit- Schutzgruppe auf eine lipophile Oberfläche übertragen, an welche die Schutzgruppe bindet. Anschließend werden nicht gebundene Verunreinigungen heruntergewaschen. Danach erfolgt ein Waschschritt, in welchem die Bindung zwischen dem Peptid und der Schutzgruppe aufgebrochen wird. Dadurch ver¬ bleibt die Schutzgruppe auf dem lipophilen Material und das freie Peptid wird heruntergewaschen. Als lipophile Materia- lien werden verschiedene Stoffe, beispielsweise Reverse- Phase-Materialien eingesetzt.
Diese Reinigungsvariante hat den Nachteil, dass eine Ab¬ spaltung des Peptids von der Schutzgruppe direkt während der Aufreinigung geschieht, was zu Nebenreaktionen führen kann. Außerdem kann es teilweise von Vorteil sein, die Schutzgruppe vorerst beizubehalten. Weiterhin verwenden Jacob et al . verschiedene, teilweise sehr kostenintensive li- pophile Materialen.
Ein kostengünstigeres und leicht zugängliches Aufreini¬ gungsmaterial wäre Graphit. Dies wurde bereits von Ramage und Raphy untersucht, wobei verschiedene planare aromati¬ sche Systeme als Schutzgruppe eingesetzt wurden (Tetra¬ hedron Letters, 33, 3, 385-388, 1992). Dabei zeigte sich allerdings eine große Diversität im Verhalten der einzelnen Schutzgruppen. Insbesondere die Fluorenylmethoxycarbonyl- Gruppe (Fmoc-Gruppe) , von welcher ein guter Rückhalt auf dem Graphit erwartet wurde, erwies sich als ungeeignet. Al¬ lein die Tetrabenzofluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe (Tbfmoc- Gruppe) ergab bei Ramage und Raphy eine ausreichende Bin¬ dung zum Graphit.
Aufgabe der Erfindung war es, ein Graphit-Material bereit¬ zustellen, welches die oben genannten Nachteile überwindet. Ebenso sollte ein Verfahren bereitgestellt werden, welches auf Basis dieses Materials die Aufreinigung von Peptiden mit endständiger planarer aromatischer Schutzgruppe ermöglicht .
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Graphitbasis gemäß An- spruch 1 sowie durch ein Verfahren zur Peptidaufreinigung gemäß Anspruch 6. Weitere bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
In anderen Worten wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungsmaterials auf Gra¬ phitbasis, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass Graphit durch mindestens einmalige Inkubation in mindestens einer organischen oder anorganischen Säure für mindestens eine Minute auf einen pH-Wert <7 (sauer) eingestellt wird. Wei¬ terhin wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Peptidauf- reinigung gelöst, wobei das Peptid eine endständige planare aromatische Schutzgruppe aufweist, wobei unter Verwendung von Graphit in gepackter Form als Aufreinigungsmaterial dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass sauer voreingestellter Graphit (pH <7) als Aufreinigungsmaterial verwendet wird.
Unter einem Peptid bzw. Peptiden werden Polypeptide mit 2 bis 100 Aminosäuren, vorzugsweise mit 2 bis 40 Aminosäuren, höchst bevorzugt mit 2 bis 20 Aminosäuren verstanden.
Planare aromatische Schutzgruppen umfassen alle entspre¬ chenden Schutzgruppen, welche bei der Peptidsynthese einge¬ setzt werden. Umfasst sind insbesondere Fluorenylmethoxy- carbonyl-Gruppen (Fmoc-Gruppen) , Tetrabenzofluorenylmetho- xycarbonyl-Gruppen (Tbfmoc-Gruppen) und Benzyloxycarbonyl- Gruppen (Z-Gruppen) , sowie deren Derivate mit annelierten Benzolringen. Besonders bevorzugt findet eine Fmoc-Gruppe Anwendung .
Diese temporären Schutzgruppen, insbesondere die Fmoc- Schutzgruppe, werden in der Festphasensynthese verwendet. Nach jedem Kopplungsschritt werden alle Fehlsequenzen, die nicht mit der nächsten Aminosäure reagiert haben, acety- liert und damit blockiert. Einzig das vollständig syntheti¬ sierte Zielpeptid trägt am Ende der Synthese noch die tem¬ poräre Schutzgruppe.
Anschließend wird eine Festphasenextraktion mit einem spe¬ ziell auf die Schutzgruppe abgestimmten Säulenmaterial durchgeführt, wodurch das geschützte Zielpeptid ohne Ether- fällung aus der TFA- Lösung erhalten wird. Dabei werden gleichzeitig die Fehlsequenzen abgetrennt. Die Schutzgruppe am N-Terminus bleibt erhalten.
Das erforderliche Säulenmaterial wird vorzugsweise mittels eines Verfahrens zur Erzeugung eines Peptidreinigungs- materials auf Graphitbasis hergestellt, in welchem der Gra¬ phit durch aufeinander folgende Inkubationen in mindestens zwei Säuren für jeweils mindestens zwei Minuten sauer ein¬ gestellt wird, wobei nach den jeweiligen Inkubationsschrit¬ ten zur Entfernung von freien Säureresten mit mindestens einem organischen Lösungsmittel behandelt wird und nach dem ersten Inkubationsschritt zur Entfernung von Proteaseresten zuerst mit kochendem Wasser behandelt wird.
Dabei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, einen ersten Inkubationsschritt in einer ersten Säure für mindestens zwei Minuten und einen zweiten Inkubationsschritt in einer zweiten Säure für mindestens zehn Minuten durchzuführen.
Verwendung finden sowohl anorganische als auch organische Säuren. Die anorganischen Säuren sind vorzugsweise Salzsäu¬ re, Salpetersäure und Schwefelsäure. Die organischen Säuren sind ausgewählt aus den unsubstituierten oder substituier- ten Ci-C6-Carbonsäuren, wobei die substituierten C1-C6- Carbonsäuren vorzugsweise ausgewählt sind aus den einfach oder mehrfach substituierten Ci-C6-Carbonsäuren, besonders bevorzugt aus den einfach oder mehrfach halogenierten Ci- C6~Carbonsäuren . Höchst bevorzugt werden von den unsubsti- tuierten Ci-C6-Carbonsäuren Essigsäure, von den mehrfach halogenierten Ci-C6-Carbonsäuren TFA eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden beide Inkubationsschritte in organischen Säuren ausgeführt, wobei es be¬ sonders bevorzugt ist, den ersten Inkubationsschritt in ei¬ ner ersten organischen Säure und den zweiten Inkubationsschritt in einer zweiten organischen Säure erfolgen zu lassen .
Eine sehr bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens zur Er¬ zeugung eines Peptidreinigungsmaterials ist dadurch gekenn¬ zeichnet, das der erste Inkubationsschritt in einer haloge¬ nierten Cl-C6-Carbonsäure und der zweite Inkubationsschritt in einer unsubstituierten Ci-C6-Carbonsäure erfolgt.
Zur Entfernung von freien Säureresten wird sowohl nach dem ersten als auch nach dem zweiten Inkubationsschritt mit mindestens einem organischen Lösungsmittel behandelt. Davon umfasst sind organische polare aprotische Lösungsmittel, welche allein oder in Mischung miteinander oder in Mischung mit Wasser eingesetzt werden. Falls Mischungen eingesetzt werden, weisen diese Volumenverhältnisse von 1:9 bis 9:1 auf. Insbesondere Mischungen mit Wasser weisen Volumenverhältnisse von 1:9 bis 9:1, vorzugsweise 1:5 bis 5:1, beson¬ ders bevorzugt 1:1 auf. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist Acetonitril (ACN) . Nach abgeschlossener Behandlung des Graphits wird dieser getrocknet. Der auf diesem Weg sauer eingestellte Graphit (pH <7) ist als Material zur Peptidaufreinigung einsetzbar. Er wird für die Aufreinigung in gepackter Form verwendet. Unter „gepackter Form" ist zu verstehen, dass das Material in einer Vorrichtung, vorzugsweise in einer Säule, eingefüllt und komprimiert vorliegt, d.h. Aufschlämmungen sind hiervon nicht umfasst.
Das Verfahren zur Peptidaufreinigung zeichnet sich durch die folgenden Schritte aus:
a) mindestens einmaliges Aufbringen einer sauren wässrigen Lösung eines Peptids mit endständiger planarer aromatischer Schutzgruppe auf sauer voreingestellten Graphit in gepackter Form, so dass die Schutzgruppe zwischen die Ebenen des Graphits interkalieren kann,
b) Waschen des Peptid-mit-Schutzgruppe haltigen Graphits in sukkzessiven Waschschritten mit Wasser, Mischungen aus Wasser und mindestens einem organischen Lösungsmit¬ tel, sowie mit wasserfreiem organischem Lösungsmittel, c) Waschen des Peptid-mit-Schutzgruppe haltigen
Graphits mit einer wässrigen Base,
d) Waschen des Peptid-mit-Schutzgruppe haltigen Graphits mit einer Mischung aus mindestens einem organischen Lösungsmittel und Wasser zur Eluation des Peptids mit da¬ ran gebundener Schutzgruppe vom Graphit.
Die „saure wässrige Lösung des Peptids mit endständiger planarer aromatischer Schutzgruppe" bedingt das Lösen des geschützten Peptids in einer Mischung aus Wasser und einer Säure, vorzugsweise TFA. Die Mischung kann ein Volumenverhältnis von 1:9 bis 9:1, vorzugsweise 1:5 bis 5:1, beson¬ ders bevorzugt 1:3 (TFA:Wasser) haben. Aus wasserfreier Säure, beispielsweise reiner TFA oder der Abspaltlösung, in welcher das geschützte Peptid nach der Synthese an der Festhphase vorliegt, erfolgt keine Anlagerung an den Gra¬ phit .
Der Begriff „organisches Lösungsmittel" bezeichnet hier wieder die oben bereits beschriebenen organischen polaren aprotischen Lösungsmittel. Diese können allein oder in Mischung miteinander zur Anwendung kommen. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist auch hier wieder Acetonitril.
„Wässrige Basen" sind ausgewählt aus der Gruppe der anorga¬ nischen und organischen Basen, vorzugsweise der organischen Basen, besonders bevorzugt wird Ammoniak (NH3) (aq) verwendet. Die wässrige Base wird vorzugsweise in einer Konzent¬ ration zwischen 5 und 50% (V/V) , besonders bevorzugt zwi¬ schen 20 und 40% (V/V), eingesetzt.
Die Behandlung mit der wässrigen Base dient dazu, das Milieu auf dem Graphit „umzupuffern" . Auf diesem Weg wird die Eluation des Peptids-mit-Schutzgruppe vorbereitet. Das ge¬ schützte Peptid wird nur vom Graphit eluiert, wenn dieses zuvor mit einer wässrigen Base gewaschen wurde. Dabei erfolgt noch keine Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe. Eine Eluation des Peptids-mit-Schutzgruppe erfolgt in die¬ sem Schritt nicht oder nur in sehr geringen Mengen (<5%) .
Die Eluation des Peptids-mit-Schutzgruppe geschieht durch Waschen mit einer Mischung aus mindestens einem organischen Lösungsmittel und Wasser. Nach Eluation vom Graphit wird das Peptid mit daran gebundener Schutzgruppe in einer Reinheit zwischen 70% und 99%, vorzugsweise mindestens 80%, höchst bevorzugt mindestens 95% erhalten. Auf diesem Weg wird das geschützte Peptid ohne Etherfällung aus der TFA- Lösung gereinigt.
Mit Hilfe der Reinigung an Gaphit ist es möglich eine Pa- rallelisierung der Reinigung von Peptiden durchzuführen, was bei der HPLC nicht möglich ist. Bei der HPLC-Reinigung muss für jedes Peptid ein individueller Gradient (z.B.
AC :H20 oder MeOH:H20) etabliert werden. Auf einer prärara- tiven HPLC-Analage kann auch immer nur ein einziges Peptid gleichzeitig gereinigt werden. Durch die Parallelisierung können sehr viel mehr Peptide im gleichen Zeitraum gereinigt werden.
Zur Anwendung des Verfahrens betrifft die Erfindung ent¬ sprechend ein Peptidaufreinigungskit , welcher eine Vorrich¬ tung umfasst, die sauer voreingestellten Graphit (pH <7) in gepackter Form enthält. Vorzugsweise umfasst der Pepti¬ daufreinigungskit eine Vorrichtung, welche ein Peptidreini- gungsmaterials auf Graphitbasis, d.h. sauer voreingestell¬ ten Graphit, erzeugt bzw. sauer eingestellt nach dem oben beschriebenen Verfahren, in gepackter Form enthält. Die „Vorrichtung" umfasst dabei insbesondere jede Art von Säu¬ le, d.h. normale Säulen oder Spritzen mit einer geeigneten Rückhalteeinrichtung (beispielsweise einer Fritte) . Schema¬ tisch ist eine passende Vorrichtung in Abbildung 1 gezeigt. Der Graphit wird wie oben beschrieben durch mindestens einmalige Inkubation in mindestens einer organischen oder anorganischen Säure für mindestens eine Minute auf einen pH- Wert <7 (sauer) eingestellt. Bevorzugte Ausführungsformen sind wie oben bereits beschrieben. Beschreibung der Abbildungen
Abb. 1 Schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des Peptidaufreinigungsver- fahrens .
Abb. 2 Dargestellt ist eine Kontrollmessung (HPLC-
MS) für ein Fmoc-geschütztes Peptid (Fmoc- LSETKPAV-COOH auch bezeichnet als Fmoc- LSETKPAV-OH) nach der Festphasensynthese. Das geschützte Peptid ist gelöst in einer TFA-Wasser-Mischung .
Abb .3 Gezeigt ist das HPLC-MS-Chromatogramm des
Eluats nach Aufbringung des Fmoc-geschützten Peptids auf den sauer eingestellten Graphit. Das Chromatogramm zeigt, dass die Probe vollständig angelagert wurde, d.h. es ist kein Peptid detektierbar .
Abb. 4 Gezeigt ist das HPLC-MS-Chromatogramm des
Eluats nach dem ersten Waschschritt mit Was¬ ser. Das Chromatogramm zeigt, dass die Probe vollständig angelagert bleibt, d.h. das Elu- at weist keinen Peptid-Peak auf.
Abb. 5 Gezeigt ist das HPLC-MS-Chromatogramm des
Eluats nach einem Waschschritt mit reinem Acetonitril. Das Chromatogramm zeigt, dass die Probe vollständig angelagert bleibt, d.h. das Eluat weist keinen Peptid-Peak auf.
Abb. 6 Abgebildet ist das HPLC-MS-Chromatogramm des
Eluats nach Waschen mit 30%iger Ammoniaklö¬ sung (Volumenverhältnis H3iH20 = 3:7).
Freies Peptid sowie Fmoc-geschütztes Peptid sind nur in sehr geringen Mengen detektier- bar (<5%) .
Abb. 7 Das Eluat, welches nach der finalen Behand¬ lung mit 50%igem ACN (Volumenverhältnis ACN:H20 = 1:1) erhalten wird, weist im Chro- matogramm das Peptid mit Fmoc-Gruppe auf, neben gerinen Mengen des freien Peptids (ohne Schutzgruppe) .
Abb. 8 Gezeigt ist das HPLC-MS-Chromatogramm nach einer klassischen Etherfällung für das gleiche Peptid allerdings ohne Fmoc-Gruppe, d.h. LSETKPAV-OH.
Bezugszeichenliste
1 erste Fritte
2 zweite Fritte
3 dritte Fritte
4 Filter
5 Graphit
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen erläu- tert .
Beispiele
Beispiel 1 - Vorbehandlung des Graphits
Ca. 5 g Graphit (technische Qualität) werden in eine 20 ml Spritze mit Fritte und Filter eingewogen. Der Graphit wird manuell komprimiert durch Stempeldruck im oberen Bereich der Spritze.
Es wird mit ca. 10 ml einer TFA-Wasser-Mischung (Volumenverhältnis 1:3; 2,5ml TFA und 7,5ml H2O) gewaschen und da¬ bei 2 Minuten inkubieren gelassen. Anschließend wird lx mit ca. 10 ml kochendem Wasser gewaschen, wodurch eventuelle Proteasen auf dem Graphit abgetötet werden, dabei wird für 2 Minuten inkubiert.
Es folgen Waschschritte:
lx mit ca. 10 ml AC :H20 1:1, 2 Minuten Inkubation, lx mit ca. 10 ml ACN, 2 Minuten Inkubation,
2x mit ca. 10 ml 10%iger Essigsäure waschen, jeweils 10 Minuten Inkubation und
lx mit ca. 10 ml Acetonitril ; 5 Minuten Inkubation.
Anschließend wird der Graphit getrocknet.
Beispiel 2 - Auftragen des Peptids mit Fmoc-Gruppe
Zu Kontrollzwecken werden vor Versuchsbeginn 1,8 mg des Peptids mit Fmoc-Gruppe (Fmoc-LSETKPAV-COOH) in 300 μΐ TFA und 900 μΐ Wasser (1:3, v/v) gelöst und zur Kontrolle HPLC- MS analysiert (siehe Abbildung 2) . Es ist zu erkennen, dass in der Lösung Fmoc-Peptid (Sequenz Fmoc-LSETKPAV-COOH) ent- halten ist. Die Ergebnisse zu Abb. 2 sind in Tabelle 1 wie¬ dergegeben .
Tabelle 1
Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1
min mAU*min mAU %
1 8.90 1 .557 17.028 2.98
2 16.09 0.861 7.996 1 .65
3 17.70 1 .179 14.441 2.26
4 17.84 39.512 364.054 75.70 Fmoc-Peptid
5 17.99 4.231 54.785 8.1 1
6 18.12 2.768 27.060 5.30
7 24.02 2.090 19.808 4.00
Für die Aufreinigung wird das Peptid, hier Fmoc-LSETKPAV- COOH ( = Fmoc-LSETKPAV-OH) mit Fmoc-Gruppe am N-Terminus, ebenfalls in einer Mischung aus TFA und Wasser (Volumenverhältnis 1:3) gelöst und 3-mal durch den trockenen, sauer voreingestellten Graphit gedrückt.
Das Eluat nach Auftragen der Probe weist bei HPLC-MS- Analyse keinen Peptid-Peak auf, d.h. das Peptid-mit- Schutzgruppe wurde vollständig an den Graphit angelagert. Die Ergebnisse sind graphisch in Abb. 3 und in Tabelle 2 dargestellt . Tabelle 2
Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
UV VIS 1 UV VIS 1 UV VIS 1 UV VIS 1 UV VIS 1
min mAU*min mAU %
1 8.59 18.056 144.630 100.00
Beispiel 3 - Waschen . des Peptids mit Fmoc-Gruppe auf dem
Graphit
Das am Graphit gebundene Fmoc-Peptid aus Beispiel 2 wird wie folgt gewaschen:
1. Ix mit 1,5ml Wasser (siehe Abb. 4),
2. Ix mit 1,5ml einer Mischung aus AC :H20 im
Volumenverhältnis 1:1,
3. Ix mit 1,5ml ACN (siehe Abb. 5) ;
4. Ix mit 1,5ml 30% H3 in Wasser; Volumenverhältnis
NH3:H20 3:7 (siehe Abb. 6)
5. Ix mit 1,5ml einer Mischung aus AC :H20 im Volumenverhältnis 1:1, dabei wird das Fmoc-Peptid wieder vom Gra¬ phit eluiert (siehe Abb. 7) .
Die Eluate der jeweiligen Waschschritte werden mittels HPLC-MS analysiert und sind in den Abbildungen 4-7 gezeigt. Das Ergebnis aus Abb. 5 ist ebenfalls in Tabelle 3, das aus Abb. 6 in Tabelle 4 und das aus Abb. 7 in Tabelle 5 wieder¬ gegeben :
Tabelle 3
Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
UV VIS 1 UV VIS 1 UV VIS 1 UV VIS 1 UV VIS 1
min mAU*min mAU %
1 17.84 0.614 6.545 100.00 Tabelle 4
Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
UV VIS 1 UV VIS 1 UV VIS 1 UV VIS 1 UV VIS 1
min mAU*min mAU %
Ί 8^62 1.869 16.672 Z7Ö
2 8.90 6.351 73.704 9.18 Freies Peptid
3 11.35 1.128 11.530 1.63
4 13.94 0.324 3.320 0.47
5 15.10 0.846 8.427 1.22
6 16.09 1.378 14.565 1.99
7 17.84 15.026 139.837 21.71 Fmoc-Peptid
8 18.12 0.075 2.163 0.11
9 22.45 1.679 13.895 2.43
10 27.04 40.524 460.444 58.56
Tabelle 5
Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1
min mAU*min mAU %
1 8.20 1 .068 10.320 0.16
2 8.50 2.259 14.177 0.34
3 8.75 0.981 12.858 0.15
4 8.89 55.472 591 .596 8.31 Freies Peptid
5 9.04 2.456 31.448 0.37
6 9.52 0.440 5.179 0.07
7 10.60 2.732 28.941 0.41
8 12.00 3.049 8.097 0.46
9 16.09 10.710 107.795 1 .61
10 16.49 1 .852 22.1 16 0.28
1 1 17.69 13.716 152.854 2.06
12 17.90 462.506 3873.036 69.31 Fmoc-Peptid
13 18.12 31.422 270.677 4.71
14 19.09 3.070 30.774 0.46
15 20.25 0.897 9.356 0.13
16 21.22 0.441 5.166 0.07
17 24.02 47.518 427.910 7.12
18 24.49 8.480 53.085 1 .27
19 25.30 18.208 51.438 2.73
Lediglich das Eluat des letzten Schrittes, d.h. der Behand¬ lung mit ACN-H2O, zeigt freigesetztes Fmoc-Peptid in rele¬ vanten Mengen.
Zu Vergleichszwecken wurde das gleiche Peptid (ohne Fmoc- Gruppe) auch nach der Etherfällungsmethode aufgereinigt . Dessen HPLC-MS-Analyse (siehe Abb. 8) ergibt nahezu dassel¬ be Ergebnis, d.h. die Reinheit, welche mit dem erfindungs- gemäßen Verfahren erzielt wird, entspricht mindestens der Reinheit des klassischen Verfahrens. Das Ergebnis aus Abb. 8 ist ebenfalls in Tabelle 6 wiedergegeben.
Tabelle 6
Nr. Zeit Fläche Höhe Rel. Fläche
UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1 UV_VIS_1
min mAU*min mAU %
1 7.79 5.013 40.658 6.34
2 8.05 0.065 1 .463 0.08
3 8.40 0.371 3.497 0.47
4 8.64 51.929 507.273 65.66 Freies Peptid
5 8.80 1 .133 13.083 1 .43
6 9.39 0.323 3.638 0.41
7 9.57 0.154 2.272 0.20
8 9.72 0.045 0.921 0.06
9 9.87 0.015 0.277 0.02
10 10.54 10.618 98.488 13.43
1 1 20.02 4.725 7.695 5.97
12 21.65 4.697 10.718 5.94
Eine nachfolgende Optimierung des Verfahrens ermöglichte Reinheiten von mindestens 80%.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungs- materials auf Graphitbasis, dadurch gekennzeichnet, dass Graphit durch mindestens einmalige Inkubation in mindestens einer organischen oder anorganischen Säure für mindestens eine Minute auf einen pH-Wert <7 (sauer) eingestellt wird.
Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungs- materials auf Graphitbasis nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Graphit durch aufeinander folgende Inkubationen in mindestens zwei Säuren für jeweils mindestens zwei Minuten sauer eingestellt wird, wobei nach den jeweiligen Inkubationsschrit¬ ten zur Entfernung von freien Säureresten mit mindestens einem organischen Lösungsmittel behandelt wird und nach dem ersten Inkubationsschritt zur Entfernung von Proteaseresten zuerst mit kochendem Wasser behandelt wird.
Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungs- materials auf Graphitbasis nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, das ein erster Inkubations¬ schritt in einer ersten Säure für mindestens zwei Minuten und ein zweiter Inkubationsschritt in einer zweiten Säure für mindestens zehn Minuten erfolgt.
Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungs- materials auf Graphitbasis nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, das die organi¬ schen Säuren ausgewählt sind aus den unsubstituier- ten oder substituierten Ci-C6-Carbonsäuren, wobei die substituierten Ci-C6-Carbonsäuren vorzugsweise ausgewählt sind aus den einfach oder mehrfach substituierten Ci-C6-Carbonsäuren, besonders bervorzugt aus den einfach oder mehrfach halogenierten Ci-C6_ Carbonsäuren .
Verfahren zur Erzeugung eines Peptidreinigungs- materials auf Graphitbasis nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, das der erste In¬ kubationsschritt in einer halogenierten Ci-C6_ Carbonsäure und der zweite Inkubationsschritt in einer usubstituierten Ci-C6-Carbonsäure erfolgt.
Verfahren zur Peptidaufreinigung, wobei das Peptid eine endständige planare aromatische Schutzgruppe aufweist, unter Verwendung von Graphit in gepackter Form als Aufreinigungsmaterial , dadurch gekenn¬ zeichnet, dass sauer voreingestellter Graphit als Aufreinigungsmaterial verwendet wird.
Verfahren zur Peptidaufreinigung nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
e) mindestens einmaliges Aufbringen einer sauren wässrigen Lösung eines Peptids mit endständiger planarer aromatischer Schutzgruppe auf sauer voreingestellten Graphit in gepackter Form, so dass die Schutzgruppe zwischen die Ebenen des Graphits interkalieren kann,
f) Waschen des Peptid-mit-Schut zgruppe haltigen
Graphits in sukkzessiven Waschschritten mit Wasser, Mischungen aus Wasser und mindestens einem organischen Lösungsmittel und wasserfreiem organischem Lösungsmittel, g) Waschen des Peptid-mit-Schutzgruppe haltigen Graphits mit einer wässrigen Base,
h) Waschen des Peptid-mit-Schutzgruppe haltigen
Graphits mit einer Mischung aus mindestens einem organischen Lösungsmittel und Wasser zur Eluati- on des Peptids mit daran gebundener Schutzgruppe vom Graphit.
8. Verfahren zur Peptidaufreinigung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel Acetonitril ist.
9. Verfahren zur Peptidaufreinigung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Base H3(aq) in einer Konzentration zwischen 5 und 50% (V/V) , vorzugsweise zwischen 20 und 40% (V/V), ist.
10. Verfahren zur Peptidaufreinigung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Peptid als endständige planare aromatische Schutzgruppe eine Fluorenyl- methoxycarbonyl-Gruppe (fmoc) aufweist.
11. Peptidaufreinigungskit , umfassend eine Vorrichtung, welche sauer voreingestellten Graphit, erzeugt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, in gepackter Form enthält.
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