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WO2009090882A1 - 非アルコール性脂肪性肝疾患の診断方法 - Google Patents

非アルコール性脂肪性肝疾患の診断方法 Download PDF

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Publication number
WO2009090882A1
WO2009090882A1 PCT/JP2009/000145 JP2009000145W WO2009090882A1 WO 2009090882 A1 WO2009090882 A1 WO 2009090882A1 JP 2009000145 W JP2009000145 W JP 2009000145W WO 2009090882 A1 WO2009090882 A1 WO 2009090882A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ptx3
antibody
liver
fatty liver
fibrosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2009/000145
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Atsushi Nakajima
Masato Yoneda
Koji Fujita
Takao Hamakubo
Hiroyuki Aburatani
Tatsuhiko Kodama
Mina Sagara
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Perseus Proteomics Inc
University of Tokyo NUC
Yokohama City University
Original Assignee
Perseus Proteomics Inc
University of Tokyo NUC
Yokohama City University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Perseus Proteomics Inc, University of Tokyo NUC, Yokohama City University filed Critical Perseus Proteomics Inc
Publication of WO2009090882A1 publication Critical patent/WO2009090882A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method and a diagnostic agent for determining the occurrence of liver fibrosis or progressive nonalcoholic steatohepatitis.
  • Nonalcoholic fatty liver disease is characterized by the presence of predominantly large droplets of liver fat similar to alcoholic liver injury as liver histological findings despite no apparent alcohol consumption It is a general term for liver damage.
  • NAFLD is a disease concept including simple fatty liver with good prognosis and progressive non-alcoholic fatty liver (NASH) (Non-patent Document 1), and it is considered that a severe disease type of NAFLD is NASH. .
  • NASH non-patent Document 1
  • the prognosis of simple fatty liver and NASH is very different, and the pathological condition rarely progresses in simple fatty liver, whereas in NASH, 5-20% of cases progress to cirrhosis in 5-10 years.
  • Non-patent document 2 Non-patent document 2
  • non-patent document 3 liver cancer
  • NASH often has few subjective symptoms, and about 10 to 20% of NASH cases have already progressed to cirrhosis at the time of diagnosis. In other words, it is very important to diagnose NASH at an early stage and start treatment.
  • NAFLD patients have been increasing in recent years, NASH, which has a poor prognosis, accounts for approximately 10% of NAFLD, and the number of patients is estimated to be approximately 8.5 million in the United States.
  • Liver fibrosis refers to a disease state that shows an increase in connective tissue resulting from repeated necrosis and repair due to chronic inflammation.
  • hepatic fibrosis is considered to be an important index, and type IV collagen, hyaluronic acid, etc. are used as liver fibrosis markers. Therefore, there is a need for a marker that is low in invasiveness and that can be detected sensitively and accurately at an early stage of liver fibrosis.
  • PTX3 is also called Pentraxin, Pentaxin, TSG-14, and MPTX3, and is found in the Pentraxin family that was discovered to be expressed in human umbilical cord endothelial cells stimulated with interleukin 1 (IL-1). It belongs to a secreted protein (Non-patent Document 4).
  • C reactive protein C reactive protein
  • SAP serum amyloid P component
  • An object of the present invention is to provide a method for determining liver fibrosis and a method for determining NASH.
  • the present inventors have measured the concentration of PTX3 in blood using an anti-PTX3 monoclonal antibody and investigated the relationship between the concentration and various diseases.
  • NASH which is a severe form of NAFLD
  • NASH can be diagnosed separately from simple fatty liver.
  • PTX3 can become an index of liver fibrosis was also obtained.
  • an appropriate treatment guideline can be determined for each NAFLD patient by measuring the PTX3 concentration, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides a method for determining progressive nonalcoholic fatty liver, characterized by measuring PTX3 concentration in a test sample derived from a patient with nonalcoholic fatty liver disease.
  • the present invention measures the PTX3 concentration in a test sample derived from a patient with nonalcoholic fatty liver disease, and a reference value obtained from the distribution of PTX3 concentration in a healthy person or a patient diagnosed with simple fatty liver
  • the present invention provides a method for determining progressive non-alcoholic fatty liver, characterized by distinguishing from progressive non-alcoholic fatty liver at a higher concentration.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for progressive nonalcoholic fatty liver containing a PTX3 measurement reagent.
  • the present invention also provides the use of an anti-PTX3 antibody for the manufacture of a diagnostic agent for progressive nonalcoholic fatty liver.
  • the present invention also provides the use of an anti-PTX3 antibody for the diagnosis of progressive nonalcoholic fatty liver.
  • the present invention provides a method for determining liver fibrosis, which comprises measuring the PTX3 concentration in a test sample.
  • the present invention also provides a method for determining liver fibrosis, characterized by measuring PTX3 concentration in a test sample and determining that the higher the PTX3 concentration is, the higher the severity of liver fibrosis is. To do.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for liver fibrosis containing a PTX3 measurement reagent.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for liver fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease containing a PTX3 measurement reagent.
  • the present invention also provides use of an anti-PTX3 antibody for producing a diagnostic agent for liver fibrosis or a diagnostic agent for liver fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease.
  • the present invention also provides use of an anti-PTX3 antibody for diagnosis of liver fibrosis in liver fibrosis or nonalcoholic fatty liver disease.
  • simple fatty liver which is a non-alcoholic fatty liver disease, and NASH can be differentiated and diagnosed.
  • the severity of liver fibrosis can be diagnosed. Furthermore, it is useful for formulating an appropriate treatment policy for each NAFLD patient by making diagnosis in a short time with low invasiveness.
  • the plasma PTX3 concentrations of 17 patients with simple fatty liver and 22 patients with NASH are shown.
  • concentration of a liver fibrosis mild group and a liver fibrosis progression group is shown.
  • the plasma PTX3 concentrations of the patients of liver fibrosis determination stage 0 (16 persons), stage 1 (12 persons), stage 3 (6 persons), and stage 4 (5 persons) are shown.
  • the plasma PTX3 concentrations of 28 patients with simple fatty liver and 42 patients with NASH are shown.
  • concentration of a liver fibrosis mild group and a liver fibrosis progression group is shown.
  • the plasma PTX3 concentrations of stage 0 (28 patients), stage 1 (21 persons), stage 2 (4 persons), stage 3 (11 persons), and stage 4 (6 persons) patients with liver fibrosis are shown.
  • the plasma PTX3 concentrations of hepatic steatosis grades 1 to 3 are shown.
  • the PTX3 values of grade 0 to 3 groups of necrotic inflammation findings are shown.
  • the receiver operating characteristic analysis (ROC analysis) by the PTX3 measurement value of a simple fatty liver and a NASH patient is shown.
  • movement characteristic analysis (ROC analysis) by the PTX3 measurement value of the patient of a light case of NAFLD fibrosis and a progressive case is shown.
  • measurement includes quantitative or non-quantitative measurement.
  • non-quantitative measurement whether or not PTX3 protein is present, whether PTX3 protein is present in a certain amount or more is used. Measurement of whether or not, measurement of comparing the amount of PTX3 protein with other samples (for example, control samples, etc.) can be mentioned.
  • quantitative measurement include measurement of the concentration of PTX3 protein, measurement of the amount of PTX3 protein, and the like.
  • Information on the base and amino acid sequence of the PTX3 gene can be obtained from a public database such as Genbank, and is disclosed in Genbank accession number NM_002852, for example. Furthermore, it is disclosed in International Publication Gazette WO2007 / 055340.
  • the test sample is not particularly limited as long as it may contain PTX3 protein, but is preferably a sample collected from the body of an organism such as a mammal, more preferably a sample collected from a human.
  • Specific examples of the test sample include blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph fluid, saliva, urine, liver tissue, and the like. Preferred are blood, serum, and plasma.
  • a sample obtained from a test sample such as a collected liver tissue culture solution is also included in the test sample of the present invention.
  • a test sample from a NAFLD patient measure the PTX3 concentration of the test sample, and be higher than the reference value obtained from the distribution of PTX3 concentration in healthy subjects or patients diagnosed with simple fatty liver. NASH is suspected.
  • a cutoff value can be set in advance, and NASH can be diagnosed based on this cutoff value.
  • the reference value may be set to an appropriate value in consideration of sensitivity and specificity for each measurement system. Specific examples are given below, but the cutoff value is not limited to the following numerical values.
  • NASH can be used if the cutoff value is set to 1.85 to 1.93 ng / mL and the test sample has a PTX3 concentration of 1.85 to 1.93 ng / mL or more, as described in Examples below. Judgment is high.
  • the reference value of a healthy person is 1.98 to 2.28 ng / mL or less (Inoue K et al., Aterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27; 161-167, 2007), As described in Examples below, the distribution of PTX3 concentration in the group of simple fatty liver patients was almost the same as the distribution of PTX3 concentration in healthy individuals. For this reason, you may compare with the reference value calculated
  • the reference value may be set to an appropriate value in consideration of sensitivity and specificity for each measurement system.
  • the cutoff value is not limited to the following numerical values. As an example, if the cutoff value is set to 1.98 to 2.28 ng / mL, and the PTX3 concentration of the test sample is 1.98 to 2.28 ng / mL or more, it is determined that the possibility of NASH is high. May be.
  • NAFLD patients may be identified according to a conventional method, and a case of fatty liver disorder similar to alcoholic liver disorder is diagnosed as NAFLD even though there is no clear alcohol drinking calendar (Japanese Society of Hepatology) Hen, NASH / NAFLD Medical Guide). As an example, it can be performed as follows. (1) Non-drinker (20 g / day or less in terms of ethanol). (2) Clear chronic liver diseases are excluded (metabolic diseases such as viral hepatitis, autoimmune liver disease, hemochromatosis, Wilson's disease are excluded). In addition to satisfying (1) and (2), a definite diagnosis is made by liver biopsy in cases where fat deposits are detected by image examination. In addition, even when fat deposition is recognized in the image examination before performing a liver biopsy, it is good also as a test subject as a patient suspected of NAFLD.
  • hepatic steatosis grade (grade 0 to 3) is determined by the proportion of hepatocytes in which large lipid accumulation is observed, and those who are grade 1 to 3 are identified as NAFLD. It may be certified as a patient.
  • Grade 0 No fatty liver.
  • Grade 1 Less than 33% hepatocytes with large droplet fat accumulation.
  • Grade 2 33-66% hepatocytes with large droplet fat accumulation.
  • Grade 3 More than 66% hepatocytes with large droplet fat accumulation.
  • the following cutoff value may be set, but is not limited thereto. As an example, if the cutoff value is set to 1.6 ng / mL, and the PTX3 concentration of the test sample is 1.6 ng / mL or more, it may be determined that the possibility of NASH is high.
  • a test sample is collected from a patient, the PTX3 concentration of the test sample is measured, and the higher the PTX3 concentration, the more severe the liver fibrosis can be diagnosed.
  • Hepatic fibrosis occurs due to chronic inflammation of the liver, so that the accuracy of the diagnosis is improved, so that it originates from a patient who has developed or suspected to have chronic inflammation of the liver (also simply referred to as a “liver disease patient”). It is preferable to use a test sample.
  • diseases that cause chronic inflammation of the liver include viral chronic hepatitis, autoimmune hepatitis, hereditary / metabolic diseases (Wilson disease, hemochromatosis, ⁇ 1 antitrypsin deficiency, amyloidosis, etc.), alcoholic liver Disorder, drug-induced hepatic disorder, NASH, NAFLD, primary biliary cirrhosis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC) (by Michio Imanaka, Hiromitsu Kumada, Hirohito Tsubouchi, Norio Hayashi Liver Pathology Asakura Shoten (2006) )).
  • liver fibrosis markers such as type IV collagen and hyaluronic acid are commonly used.
  • a test sample from a NAFLD patient it is particularly preferable to collect a test sample from a NAFLD patient and measure the PTX3 concentration of the test sample.
  • Liver fibrosis is found in both NASH and non-NASH patients, but is the most important indicator of NASH pathology and prognosis, and the more severe the fibrosis, the worse the prognosis and the more severe NASH (Farrell GC et al .: Hepatology. 43 (2 Suppl 1), S99-112 (2006), Hashimoto E et al .: Hepatol Res. 200533 (2), 72-76 (2005)) The higher the value, the worse the prognosis and the more severe NASH can be diagnosed.
  • NAFLD patients may be identified according to a conventional method, and a case in which fatty liver disorder similar to alcoholic liver disorder is observed despite the absence of an apparent drinking calendar is diagnosed as NAFLD (edited by the Japan Society of Liver Studies).
  • NASH / NAFLD medical care guide can be performed in the same manner as described above.
  • the PTX3 concentration when determining the severity of liver fibrosis of the patient by the method of the present invention, it can be determined that the higher the PTX3 concentration, the higher the severity of fibrosis. It can also be determined based on the off value.
  • This cut-off value can be set for each fibrosis stage, or can be set based on another fibrosis index. The cutoff value may be set to an appropriate value in consideration of sensitivity / specificity for each measurement system.
  • the cutoff value is not limited to the following numerical values.
  • the cut-off value is set to 2.5 ng / mL. If the PTX3 concentration is less than 2.5 ng / mL, it is determined that there is a high possibility that it is a light case, and if it is 2.5 ng / mL or more, it is likely to be an advanced case.
  • the stage 3 or It can also be determined as stage 4. If the cut-off value is set to 4.0 ng / mL, and the PTX3 concentration in the test sample is 4.0 ng / mL or more, it can be determined as stage 4.
  • stage 0 when the severity of liver fibrosis is evaluated as a stage (stage 0 to 4) as described above, the following is based on the classification of Brunt (Brunt EM. Semin Liver Dis 2004; 24: 3-20) Can be determined.
  • Stage 0 No fibrosis
  • Stage 1 Perivenular / perisinusoidal / pericellular fibrosis is present in part or extensively around Zone 3
  • Stage 2 Fibrosis is observed in the portal vein region in addition to Stage 1
  • Stage 3 Bridging fibrosis Partial or widespread
  • Stage 4 Liver cirrhosis
  • the measurement of PTX3 concentration is preferably an immunological measurement method using an anti-PTX3 antibody.
  • the measurement method using the anti-PTX3 antibody will be described in detail.
  • the anti-PTX3 antibody used in the present invention may specifically bind to the PTX3 protein.
  • the antibody exhibits a high binding affinity for the three-dimensional structure of PTX3, more preferably a high binding affinity for the three-dimensional structure of PTX3, and does not cross-react with CRP or SAP. More preferred are PPMX0102 (FERM P-10326), PPMX0104 (FERM BP-10719) and PPMX0105 (FERM BP-10720), and most preferred are PPMX0104 (FERM BP-10719) and PPMX0105 (FERM BP-10720). is there.
  • PPMX0102 (FERM P-10326), PPMX0104 (FERM BP-10719), and PPMX0105 (FERM BP-10720) described in this specification are the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as of September 22, 2005. (Address: Tsukuba City, Ibaraki Pref. 1-1-1 Central 6th)
  • the origin, type (monoclonal, polyclonal) and shape of the antibody are not limited. Specifically, known antibodies such as mouse antibodies, rat antibodies, human antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies can be used.
  • the antibody may be a polyclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the anti-PTX3 antibody immobilized on the support in the immunoassay and the anti-PTX3 antibody labeled with the labeling substance may recognize the same epitope of the PTX3 molecule or different epitopes.
  • the anti-PTX3 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammal-derived monoclonal antibody is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be basically produced using known techniques as follows. That is, using PTX3 as a sensitizing antigen, this is immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and monoclonal antibodies are obtained by a normal screening method. It can be produced by screening antibody-producing cells.
  • the monoclonal antibody can be produced as follows. First, PTX3 used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is obtained by purifying it from an available cell culture supernatant. Alternatively, it can be obtained according to the method disclosed in JP-T-2002-503642.
  • this purified PTX3 protein is used as a sensitizing antigen.
  • a partial peptide of PTX3 can also be used as a sensitizing antigen.
  • the partial peptide can be obtained by chemical synthesis from the amino acid sequence of human PTX3, or a part of the PTX3 gene can be incorporated into an expression vector, and further, natural PTX3 is degraded by a proteolytic enzyme. Can also be obtained.
  • the part and size of PTX3 used as the partial peptide are not particularly limited.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Animals such as mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys, etc. are used.
  • Immunization of animals with a sensitizing antigen can be performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected into a mammal intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline, and mixed with an appropriate amount of an ordinary adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if desired, and emulsified.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • an ordinary adjuvant for example, Freund's complete adjuvant, if desired, and emulsified.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cell to be fused with the immune cells.
  • This myeloma cell is known from various known cell lines such as P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81,1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6,511-519), MPC-11 (Margulies DHet al., Cell (1976) 8,405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • Cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Kohler and Milstein et al. (Kohler. G. and stein Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3- 46) etc.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to increase the fusion efficiency if desired.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be arbitrarily set.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture solution suitable for growth of the myeloma cell line, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this kind of cell culture can be used.
  • Serum replacement fluid such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a polyethylene glycol (PEG) (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000) solution preheated to about 37 ° C. is usually 30.
  • PEG polyethylene glycol
  • the target fused cell (hybridoma) is formed by adding and mixing at a concentration of ⁇ 60% (w / v). Subsequently, cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of the hybridoma are removed by sequentially adding an appropriate culture medium and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma thus obtained is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. Subsequently, a normal limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of a hybridoma that produces the target antibody are performed.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is continued for a sufficient time (usually several days to several weeks) for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die.
  • a normal limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of a hybrido
  • Screening and single cloning of the target antibody may be performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • an antigen is bound to a carrier such as beads made of polystyrene or a commercially available 96-well microtiter plate, reacted with the culture supernatant of the hybridoma, washed with the carrier, and then reacted with an enzyme-labeled secondary antibody or the like.
  • a hybridoma producing the target antibody can be cloned by limiting dilution or the like. In this case, the antigen used for immunization may be used.
  • human lymphocytes are sensitized to PTX3 in vitro, and the sensitized lymphocytes are fused with human-derived myeloma cells having permanent mitotic potential, A desired human antibody having binding activity to PTX3 can also be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • PTX3 as an antigen may be administered to a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes to obtain anti-PTX3 antibody-producing cells, and human antibodies against PTX3 may be obtained from the immortalized cells. (See WO94 / 25585 pamphlet, WO93 / 12227 pamphlet, WO92 / 03918 pamphlet, WO94 / 02602 pamphlet).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a usual method and obtained as a culture supernatant thereof, or the hybridoma is administered to a mammal compatible therewith to proliferate, and as ascites is obtained.
  • the method of obtaining is adopted.
  • the former method is suitable for obtaining highly pure antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • a method can be used in which genes encoding these antibody fragments are constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell.
  • these antibodies may be low molecular weight antibodies such as antibody fragments (fragments) or modified antibodies as long as they do not lose the property of recognizing the full length or part of the protein encoded by the PTX3 gene.
  • Specific examples of the antibody fragment include Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv, Diabody, and the like.
  • Such antibody fragments can be obtained by digesting the Fc part of IgG with pepsin or papain, constructing genes encoding these antibody fragments, introducing them into expression vectors, and expressing them in appropriate host cells. (E.g., Co, MSet al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M.
  • the antibody produced as described above can be isolated from cells and host animals and purified to homogeneity. Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed using an affinity column.
  • an affinity column For example, as a column using a protein A column, Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (manufactured by GE Healthcare) and the like can be mentioned.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography columns other than the affinity column, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis and the like (Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow, David Lane). , Cold Spring Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • an anti-PTX3 antibody bound to various molecules such as a labeling substance can also be used as a modified antibody.
  • the “antibody” in the present invention includes these modified antibodies.
  • Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
  • the PTX3 measured in the present invention is not particularly limited, and may be the full length PTX3 or a fragment thereof.
  • the detection method of PTX3 protein contained in the test sample is not particularly limited, it is preferably detected by an immunological method using an anti-PTX3 antibody.
  • the immunological method include radioimmunoassay, enzyme immunoassay, fluorescent immunoassay, luminescence immunoassay, immunoprecipitation method, immunoturbidimetric method, Western blot, immunostaining, immunodiffusion method, etc.
  • An immunoassay is particularly preferred, which is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (for example, a sandwich ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the above-described immunological methods such as ELISA can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • the anti-PTX3 antibody is immobilized on a support, a test sample is added thereto, and incubation is performed to bind the anti-PTX3 antibody and the PTX3 protein, followed by washing.
  • a method of detecting PTX3 protein in a test sample by detecting PTX3 protein bound to a support via an anti-PTX3 antibody can be mentioned.
  • Examples of the support used in the present invention include insoluble polysaccharides such as agarose and cellulose, synthetic resins such as silicone resins, polystyrene resins, polyacrylamide resins, nylon resins, and polycarbonate resins, and insoluble supports such as glass. Can be mentioned. These supports can be used in the form of beads or plates. In the case of beads, a column packed with these can be used. In the case of a plate, a multiwell plate (96-well multiwell plate or the like), a biosensor chip, or the like can be used. The anti-PTX3 antibody and the support can be bound by a commonly used method such as chemical bonding or physical adsorption. All of these supports can be commercially available.
  • the binding between the anti-PTX3 antibody and the PTX3 protein is usually performed in a buffer solution.
  • a buffer solution for example, phosphate buffer solution, Tris buffer solution, citrate buffer solution, borate buffer solution, carbonate buffer solution and the like are used.
  • Incubation is performed under conditions often used, for example, incubation at 4 ° C. to room temperature for 1 to 24 hours.
  • the washing after the incubation may be anything as long as it does not interfere with the binding between the PTX3 protein and the anti-PTX3 antibody.
  • a buffer containing a surfactant such as Tween 20 is used.
  • a control sample may be installed in addition to the test sample for detecting PTX3 protein.
  • the control sample include a negative control sample not containing PTX3 protein and a positive control sample containing PTX3 protein.
  • it is possible to detect the PTX3 protein in the test sample by comparing the result obtained with the negative control sample not containing PTX3 protein and the result obtained with the positive control sample containing PTX3 protein.
  • a series of control samples with varying concentrations are prepared, the detection results for each control sample are obtained as numerical values, a standard curve is created, and a test curve is created based on the standard curve from the test sample values. It is also possible to quantitatively detect the PTX3 protein contained in the sample.
  • the measurement of the PTX3 protein bound to the support via the anti-PTX3 antibody there can be mentioned a method using an anti-PTX3 antibody labeled with a labeling substance.
  • test sample is brought into contact with the anti-PTX3 antibody immobilized on the support, and after washing, detection is performed using a labeled antibody that specifically recognizes the PTX3 protein.
  • the labeling of the anti-PTX3 antibody can be performed by a generally known method.
  • labeling substances known to those skilled in the art such as fluorescent dyes, enzymes, coenzymes, chemiluminescent substances, radioactive substances and the like can be used.
  • radioisotopes 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, etc.
  • fluorescein rhodamine
  • dansyl chloride umbelliferone
  • luciferase peroxidase
  • alkaline phosphatase ⁇ -galactosidase
  • ⁇ -glucosidase horseradish peroxidase
  • lysozyme saccharide Examples include oxidase, microperoxidase, and biotin.
  • biotin When biotin is used as the labeling substance, it is preferable to further add avidin to which an enzyme such as alkaline phosphatase is bound after adding the biotin-labeled antibody.
  • avidin For binding of the labeling substance and the anti-PTX3 antibody, a known method such as glutaraldehyde method, maleimide method, pyridyl disulfide method, or periodic acid method can be used.
  • the enzyme enzyme labeling method includes, but is not limited to, a hinge method and a non-hinge method.
  • Fab ′ and an enzyme molecule are separated from each other by using a thiol group generated by reducing a disulfide bond in a portion called a hinge portion between an F (ab ′) 2 portion having an antigen-binding ability of antibody IgG. It is a way to combine.
  • the non-hinge method does not specify which reactive group of the antibody is used, but in many cases, it is a method of binding the antibody molecule and the enzyme molecule using the amino group of the antibody.
  • a solution containing an anti-PTX3 antibody is added to a support such as a plate, and the anti-PTX3 antibody is fixed to the support. After washing the plate, it is blocked with, for example, BSA, gelatin, albumin or the like in order to prevent nonspecific binding of proteins. Wash again and add the test sample to the plate. After incubation, wash and add labeled anti-PTX3 antibody. After moderate incubation, the plate is washed and the labeled anti-PTX3 antibody remaining on the plate is detected. Detection can be performed by methods known to those skilled in the art. For example, in the case of labeling with a radioactive substance, it can be detected by liquid scintillation or RIA.
  • a substrate is added, and an enzymatic change of the substrate, such as color development, can be detected with an absorptiometer.
  • the substrate include 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 1,2-phenylenediamine (ortho-phenylenediamine), 3,3 ′ , 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) and the like.
  • ABTS 2,2-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt
  • TMB 5,5′-tetramethylbenzidine
  • a fluorescent substance it can be detected by a fluorometer.
  • the method for measuring PTX3 protein of the present invention there is a method using an antibody labeled with a method described in a general enzyme labeling method after removing an Fc portion unrelated to the antigen-binding ability of antibody IgG. Can do.
  • a solution containing an anti-PTX3 antibody is added to a support such as a plate to fix the anti-PTX3 antibody. After washing the plate, it is blocked with, for example, BSA in order to prevent non-specific protein binding. Wash again and add the test sample to the plate. After incubation, wash and add peroxidase directly labeled anti-PTX3 antibody. After appropriate incubation, the plate is washed, a substrate corresponding to the enzyme is added, and the PTX3 protein is detected using an enzymatic change of the substrate as an indicator.
  • a method for measuring PTX3 protein of the present invention there may be mentioned a method using one or more primary antibodies that specifically recognize PTX3 protein and one or more secondary antibodies that specifically recognize the primary antibody. Can do.
  • test sample is brought into contact with one or more types of anti-PTX3 antibody immobilized on a support, incubated, washed, and the PTX3 protein bound after washing is identified with the primary anti-PTX3 antibody and the primary antibody. It is detected by one or more secondary antibodies that are recognized automatically.
  • the secondary antibody is preferably labeled with a labeling substance.
  • a detection method using an agglutination reaction can be mentioned.
  • PTX3 can be detected using a carrier sensitized with an anti-PTX3 antibody.
  • the carrier for sensitizing the antibody any carrier may be used as long as it is insoluble, does not cause a non-specific reaction, and is stable.
  • latex particles, bentonite, collodion, kaolin, fixed sheep erythrocytes and the like can be used, but it is preferable to use latex particles.
  • polystyrene latex particles for example, polystyrene latex particles, styrene-butadiene copolymer latex particles, polyvinyl toluene latex particles and the like can be used, and polystyrene latex particles are preferably used.
  • the sensitized particles are mixed with the sample and stirred for a certain time. The higher the concentration of the anti-PTX3 antibody in the sample, the greater the degree of aggregation of the particles. Therefore, PTX3 can be detected by viewing the aggregation with the naked eye. It is also possible to detect turbidity due to aggregation by measuring with a spectrophotometer or the like.
  • a biosensor using the surface plasmon resonance phenomenon can observe a protein-protein interaction as a surface plasmon resonance signal in real time using a trace amount of protein and without labeling.
  • a biosensor such as BIAcore (Pharmacia).
  • BIAcore BIAcore
  • a test sample is brought into contact with a sensor chip on which an anti-PTX3 antibody is immobilized, and PTX3 protein that binds to the anti-PTX3 antibody can be detected as a change in resonance signal.
  • the measurement method of the present invention can be automated using various automatic inspection devices, and a large number of samples can be inspected at a time.
  • the present invention can also be used for immunohistochemical staining.
  • Tissue obtained by biopsy or surgery can be stained with anti-PTX3 antibody by methods known to those skilled in the art.
  • the present invention is also aimed at providing a diagnostic agent for distinguishing liver fibrosis and simple fatty liver from NASH in NAFLD, and the diagnostic agent preferably contains an anti-PTX3 antibody.
  • the diagnostic agent includes a kit.
  • the diagnostic agent may contain a carrier for immobilizing the antibody, and the antibody may be bound to the carrier in advance.
  • the diagnostic agent is based on an agglutination method using a carrier such as latex, it may contain a carrier to which an antibody is adsorbed.
  • the diagnostic agent may appropriately contain a blocking solution, a reaction solution, a reaction stop solution, a reagent for treating the sample, and the like.
  • ⁇ Target of Example 1> The study was conducted on 39 cases of NAFLD that were evaluated by performing liver biopsy. A total of 39 NAFLD patients were studied, including 17 patients diagnosed with simple fatty liver and 22 patients diagnosed with NASH. The diagnosis of NAFLD and NASH was performed as follows. (1) Non-drinker (20 g / day or less in terms of ethanol). (2) Clear chronic liver diseases are excluded (metabolic diseases such as viral hepatitis, autoimmune liver disease, hemochromatosis, Wilson's disease are excluded). (3) In addition to satisfying (1) and (2), cases in which fat deposition was observed by imaging examination were confirmed by liver biopsy.
  • hepatic steatosis is as follows depending on the percentage of hepatocytes in which large droplets of fat accumulate. A grade (0-3) was determined, and grades 1 to 3 were defined as NAFLD patients.
  • hepatic steatosis grade Grade 0 No fatty liver Grade 1: Less than 33% of hepatocytes with large droplets of fat accumulation Grade 2: 33-66% of hepatocytes with large droplets of fat accumulation Grade 3: More than 66% hepatocytes with large droplet fat accumulation Furthermore, a pathological diagnosis was made regarding the degree of fibrosis and whether it was NASH.
  • liver fibrosis Fibrosis was evaluated using the Brunt classification (Brunt EM. Semin Liver Dis 2004; 24: 3-20).
  • Stage 0 No fibrosis
  • Stage 1 Perivenular / perisinusoidal / pericellular fibrosis is present in part or extensively centering on Zone 3
  • Stage 2 Fibrosis enlargement in the portal vein region in addition to Stage 1
  • Stage 3 bridging fibrosis Partial or widespread
  • Stage 4 Liver cirrhosis
  • Table 1 shows the PTX3 concentrations and determination results of the targeted patient groups.
  • the PTX3 concentration was determined by the ELISA method of Example 2 below.
  • a PTX3 sandwich ELISA system was constructed as follows. That is, for the antibody coated on the 96-well plate, F (ab ′) 2 -modified PPMX0104 (FERM BP-10719) prepared according to WO2007 / 055340 was incubated overnight at 5 ⁇ g / mL, 100 ⁇ L / well, 4 ° C. Made.
  • PPMX0104 (FERM BP-10719) was deposited on September 22, 2005 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center (address: 1-1-1 Higashi 1-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture). .
  • ABI immunoassay stabilizer (ABI # 10-601-001) was added to perform blocking. Stored overnight at 4 ° C.
  • the ELISA method is disclosed in application number PCT / JP2006 / 322505. Plasma was diluted appropriately with a dilution buffer containing animal serum (50 mM Tris-Cl pH 8.0, 0.15 M NaCl), and incubated for 2 hours at room temperature.
  • HRPO horseradish peroxidase
  • Fab′-modified PPMX0105 (FERM BP-10720) antibody diluted to 20 ⁇ g / mL with PBS ( ⁇ ) containing animal serum and the like was added and incubated at room temperature for 2 hours. After discarding the reaction solution, the plate was washed 5 times with a 300 ⁇ L / well wash buffer, and then developed using Scytek's TMB (Cat # TM4999) according to the attached protocol, and the absorbance was measured with a microplate reader. The PTX3 protein concentration in the sample was converted using a spreadsheet software GraphPad PRISM (GlaphPad software Inc. ver. 3.0).
  • PPMX0105 (FERM BP-10720) was deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (address: 1-1-1 Higashi 1-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) on September 22, 2005. .
  • the cases in which the determination of liver fibrosis was stage 0, stage 1, and stage 2 were the mild fibrosis group, and those in stage 3 and stage 4 were the fibrosis progression case group.
  • the plasma PTX3 value was measured by the ELISA method of Example 2, and the measured value was compared by t-test.
  • Mean value ⁇ standard deviation of the mild fibrosis group is 1.628 ⁇ 0.735 ng / mL
  • mean value ⁇ standard deviation of the fibrosis progression group is 4.076 ⁇ 2.548 ng / mL
  • p ⁇ 0.0001 A significant difference was observed (FIG. 2).
  • stage 0 16 persons
  • stage 3 6 persons
  • stage 4 5 persons
  • the average value ⁇ standard deviation was stage 0. 1.454 ⁇ 0.518 ng / mL in the group, 1.819 ⁇ 0.889 ng / mL in the stage 1 group, 3.968 ⁇ 2.809 ng / mL in the stage 3 group, 4.206 ⁇ 2. It was 516 ng / mL.
  • Stage 0 group and Stage 3 group 0.0019
  • Example 5 Further cases were added and examined in the same manner as in Example 1 except that the patient group was changed. Targeting 70 cases of NAFLD (28 patients with simple fatty liver and 70 NAFLD patients with NASH) evaluated using the same experiment and measurement method as in Examples 2 to 4 above. Various studies were conducted as in Examples 6-10.
  • Example 6 Differential diagnosis between simple fatty liver and NASH>
  • the blood PTX3 concentrations of 28 simple fatty liver patients and 42 NASH patients described in Example 5 were measured, and the measured values were compared by t-test.
  • p 0.0021
  • a significant difference was recognized (FIG. 4).
  • the mean value ⁇ standard deviation of the simple fatty liver patient group and the NASH group were 1.335 ⁇ 0.515 ng / mL and 2.417 ⁇ 1.739 ng / mL.
  • Example 7 Severity of NAFLD fibrosis and PTX3
  • the NAFLD patients described in Example 5 are classified as those in which fibrosis is determined as stage 0, stage 1, and stage 2 as mild fibrosis groups, and those that are as stage 3 and stage 4 as fibrosis progression cases.
  • plasma PTX3 value was measured by ELISA method and compared by t-test.
  • the mean value ⁇ standard deviation of the mild fibrosis group is 1.515 ⁇ 0.617 ng / mL
  • the mean value ⁇ standard deviation of the fibrosis progression group is 3.447 ⁇ 2.277 ng / mL.
  • the NAFLD patients of Example 5 were compared by t-test using existing fibrosis markers.
  • type IV collagen 7s is used as a marker
  • the mean ⁇ standard deviation of type IV collagen 7s in the mild fibrosis group and the advanced group are 4.65 ⁇ 0.93 ng / dL and 5.94 ⁇ 1.53 ng / dL, respectively.
  • the p value was 0.0018.
  • the mean value ⁇ standard deviation of the hyaluronic acid concentration in the mild fibrosis group and the advanced group are 32.7 ⁇ 27.8 ng / dL and 72.4 ⁇ 68.1 ng / dL, respectively.
  • the mean ⁇ standard deviation of the platelet count concentration in the mild fibrosis group and the advanced group is 25.8 ⁇ 6.6 ng / dL and 20.0 ⁇ 8.7 ng / mL, respectively.
  • the p value was 0.0134.
  • PTX3 showed a highly significant difference compared to any existing liver fibrosis marker.
  • ⁇ standard deviation is 1.328 ⁇ 0.523 ng / mL in stage 0 group, 1.687 ⁇ 0.714 ng / mL in stage 1 group, 1.768 ⁇ 0.356 ng / mL in stage 2 group, and in stage 3 group It was 3.082 ⁇ 2.320 ng / mL, and it was 4.117 ⁇ 2.234 ng / mL in the stage 4 group.
  • Stage 0 and Stage 3 0,0009
  • Example 8 Liver steatosis grade and necrotic inflammation findings and PTX3> NAFLD patients described in Example 5 were grouped according to hepatic steatosis grade, and plasma PTX3 values were measured by ELISA as in Example 2 and compared by t-test. As a result, no association was found between hepatic steatosis grade and PTX3 measurement (FIG. 7). Moreover, as a result of classifying the same patient group according to the grade of the necrosis inflammation findings and comparing the PTX3 values, there was no significant difference between the necrosis inflammation findings and PTX3 (FIG. 8).
  • Cutoff value of simple fatty liver and NASH> Receiver operating characteristic analysis (ROC analysis) was performed from PTX3 measurement values of patients with simple fatty liver and NASH (FIG. 9). The cut-off value with the most excellent sensitivity and specificity in distinguishing between simple fatty liver and NASH patients was 1.61 ng / mL. Sensitivity was 66.7%, specificity was 78.6%, positive median was 82.4%, and negative median was 61.1%.
  • Example 10 Cutoff value of mild case and advanced case of severity of NAFLD fibrosis> Receiver operating characteristic analysis (ROC analysis) was performed from PTX3 measured values of patients with mild and advanced cases of NAFLD fibrosis (FIG. 10). The cut-off value with the highest sensitivity and specificity was 2.45 ng / mL in distinguishing between mild and severe cases of fibrosis of NAFLD. Sensitivity was 70.6%, specificity was 94.3%, positive median was 80.8%, and negative median was 90.9%.
  • ROC analysis Receiver operating characteristic analysis

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Abstract

　進行性の非アルコール性脂肪性肝の判定方法および非アルコール性脂肪性肝疾患における肝線維化の判定方法の提供。 　非アルコール性脂肪性肝疾患患者由来の被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする進行性の非アルコール性脂肪性肝の判定方法；被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする肝線維化の判定方法。

Description

非アルコール性脂肪性肝疾患の診断方法
　本発明は、肝線維化、または進行性の非アルコール性脂肪性肝炎の罹患を判定するための方法および診断薬に関する。
　非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）とは、明らかな飲酒歴がないにもかかわらず、肝組織所見としてアルコール性肝障害に類似した主に大滴性の肝脂肪沈着を認めることを特徴とする肝障害の総称である。ＮＡＦＬＤは、予後良好な単純性脂肪肝と進行性の非アルコール性脂肪性肝（ＮＡＳＨ）を含む疾患概念であり（非特許文献１）、ＮＡＦＬＤの重症病型がＮＡＳＨであると考えられている。しかし、単純性脂肪肝とＮＡＳＨの予後は大きく異なり、単純性脂肪肝では病態が進行することはほとんどないのに対して、ＮＡＳＨでは５～１０年で５～２０％の症例が肝硬変に進行し（非特許文献２）、さらには肝癌を発症するとされている（非特許文献３）。
　ＮＡＳＨは自覚症状が少ないことが多く、ＮＡＳＨ症例の１０～２０％程度においては診断時にすでに肝硬変に進行している例が認められる。つまり、ＮＡＳＨであることを早期に診断し治療を開始することは非常に重要である。ＮＡＦＬＤ患者は近年増加傾向にあるが、予後不良な病型であるＮＡＳＨはＮＡＦＬＤのおよそ１０％を占め、患者数は米国の例でおよそ８５０万人であると推定されている。
　ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの診断には、臨床所見、画像検査、生化学検査等が用いられるが、確定診断には肝生検が必要である。侵襲を伴う肝生検に代わりＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨの診断に有用な血液マーカーの探索が望まれている。特に、ＮＡＦＬＤのうちＮＡＳＨを鑑別診断する血液マーカーは非常に有用性が高い。
　また、肝線維化とは、慢性炎症による壊死と修復の繰り返しに起因する結合組織の増加を示す病態をいう。慢性肝炎から肝硬変、肝臓癌へ進展する過程において、肝線維化は重要な指標であるとされ、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸等が肝線維化マーカーとして用いられているが、確定診断には肝生検が必要であるため、侵襲性が低く、さらに肝線維化の早期に鋭敏に精度よく検出が可能なマーカーが要求されている。
　ところで、ＰＴＸ３は、Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ、Ｐｅｎｔａｘｉｎ、ＴＳＧ－１４、ＭＰＴＸ３とも呼ばれ、インターロイキン１（ＩＬ－１）刺激を受けたヒト臍帯内皮細胞に発現しているものとして発見されたペントラキシン（Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ）ファミリーに属する分泌タンパク質である（非特許文献４）。
　ペントラキシンファミリーはLong PentraxinとShort Pentraxinに大別される。炎症性タンパクとして知られているC reactive protein（ＣＲＰ）やserum amyloid P component（ＳＡＰ）はShort Pentraxinに属し、炎症により生じるＩＬ－６に反応して肝臓で産生される。しかし、ＰＴＸ３はＣＲＰやＳＡＰと異なりＩＬ－６による誘導を受けないことが知られている。（非特許文献４、５）。
　しかしながら、ＮＡＦＬＤの重症病型であるＮＡＳＨへの罹患や肝線維化とＰＴＸ３濃度との関連についての十分な知見は得られていない。
ＮＡＳＨ・ＮＡＦＬＤの診療ガイド（２００６） Farrell GC et al.:Hepatology.43(2 Suppl 1),S99-112(2006) Hashimoto E et al.:Hepatol Res.200533(2),72-76(2005) Breviario et al.:J.Biol.Chem.,267(31),22190-7(1992) Domyaku Koka(Arteriosclerosis),24(7-8),375-80(1996)
　本発明の目的は、肝線維化の判定方法、およびＮＡＳＨの判定方法を提供することにある。
　本発明者らは、抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体を用いて血中ＰＴＸ３濃度を測定し、その濃度と種々の疾患との関係について検討してきたところ、ＮＡＦＬＤの重症型であるＮＡＳＨにおいて血中にＰＴＸ３が増加することを見出し、特にＮＡＳＨを単純性脂肪肝と区別して診断できることを見出した。また、ＰＴＸ３が肝線維化の指標となり得る結果も得た。その結果、ＰＴＸ３濃度の測定によりＮＡＦＬＤの患者毎に適切な治療指針を決定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患患者由来の被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする進行性の非アルコール性脂肪性肝の判定方法を提供するものである。
　また、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患患者由来の被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定し、健常人または単純性脂肪肝と診断された患者のＰＴＸ３濃度の分布により求められた基準値と比較し、これより高濃度の場合に進行性の非アルコール性脂肪性肝と鑑別することを特徴とする進行性の非アルコール性脂肪性肝の判定方法を提供するものである。
　また、本発明は、ＰＴＸ３測定試薬を含有する進行性の非アルコール性脂肪性肝の診断薬を提供するものである。
　また、本発明は、抗ＰＴＸ３抗体の、進行性の非アルコール性脂肪性肝の診断薬の製造のための使用を提供するものである。
　また、本発明は、進行性の非アルコール性脂肪性肝の診断のための、抗ＰＴＸ３抗体の使用を提供するものである。
　本発明は、被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする肝線維化の判定方法を提供するものである。
　また、本発明は、被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定し、当該ＰＴＸ３濃度が高濃度であるほど肝線維化の重症度が高いと判定することを特徴とする肝線維化の判定方法を提供するものである。
　また、本発明は、ＰＴＸ３測定試薬を含有する肝線維化の診断薬を提供するものである。
　また、本発明は、ＰＴＸ３測定試薬を含有する非アルコール性脂肪性肝疾患における肝線維化の診断薬を提供するものである。
　また、本発明は、抗ＰＴＸ３抗体の、肝線維化の診断薬又は非アルコール性脂肪性肝疾患における肝線維化の診断薬の製造のための使用を提供するものである。
　また、本発明は、肝線維化又は非アルコール性脂肪性肝疾患における肝線維化の診断のための、抗ＰＴＸ３抗体の使用を提供するものである。
　本発明によれば、非アルコール性脂肪性肝疾患の単純性脂肪肝とＮＡＳＨとを鑑別して診断することができる。また、本発明によれば、肝線維化の重症度を診断することができる。さらに、侵襲性が低く簡便に短時間で診断することにより、ＮＡＦＬＤ患者毎の適切な治療方針を策定するために有用である。
単純性脂肪肝患者１７人、ＮＡＳＨ患者２２人の血漿ＰＴＸ３濃度を示す。 肝線維化軽症群、肝線維化進行群の血漿ＰＴＸ３濃度を示す。 肝線維化の判定ステージ０（１６人）、ステージ１（１２人）、ステージ３（６人）、ステージ４（５人）の患者の血漿ＰＴＸ３濃度を示す。 単純性脂肪肝患者２８人、ＮＡＳＨ患者４２人の血漿ＰＴＸ３濃度を示す。 肝線維化軽症群、肝線維化進行群の血漿ＰＴＸ３濃度を示す。 肝線維化のステージ０（２８人）、ステージ１（２１人）、ステージ２（４人）ステージ３（１１人）、ステージ４（６人）の患者の血漿ＰＴＸ３濃度を示す。 肝脂肪化グレード１～３群の血漿ＰＴＸ３濃度を示す。 壊死炎症所見のグレード０～３群のＰＴＸ３値を示す。 単純性脂肪肝とＮＡＳＨ患者のＰＴＸ３測定値による受信者動作特性解析（ＲＯＣ解析）を示す。 ＮＡＦＬＤの線維化の軽症例と進行症例の患者のＰＴＸ３測定値による受信者動作特性解析（ＲＯＣ解析）を示す。
発明を実施するための形態
　本発明において測定とは、定量的または非定量的な測定を含み、例えば、非定量的な測定としては、単にＰＴＸ３タンパク質が存在するか否かの測定、ＰＴＸ３タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、ＰＴＸ３タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができる。定量的な測定としては、ＰＴＸ３タンパク質の濃度の測定、ＰＴＸ３タンパク質の量の測定などを挙げることができる。なおＰＴＸ３遺伝子の塩基およびアミノ酸配列の情報はＧｅｎｂａｎｋ等の公共データベースより得ることができ、例えばＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００２８５２に開示されている。さらに、国際公開公報パンフレットＷＯ２００７／０５５３４０等に開示されている。
　被検試料とは、ＰＴＸ３のタンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、肝組織などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。又、採取された肝組織の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
　ＮＡＦＬＤ患者より被検試料を採取し、被検試料のＰＴＸ３濃度を測定し、健常人または単純性脂肪肝と診断された患者のＰＴＸ３濃度の分布より求められた基準値と比較して高値であればＮＡＳＨの存在が疑われる。また、予めカットオフ値を設定し、このカットオフ値に基づきＮＡＳＨと診断することもできる。基準値の設定は、測定系毎に感度・特異性等を考慮して適切な値を設定すればよい。
　具体的な例を以下に挙げるが、カットオフ値は以下の数値に限定されない。
　一例として、後記実施例記載から、カットオフ値を１．８５～１．９３ｎｇ／ｍＬと設定し、被検試料のＰＴＸ３濃度が１．８５～１．９３ｎｇ／ｍＬ以上であればＮＡＳＨである可能性が高いと判定する。
　また、健常人の基準値は１．９８～２．２８ｎｇ／ｍＬ以下であることが知られており(Inoue K et al.,Aterioscler.Thromb.Vasc.Biol.27;161-167,2007)、後記実施例記載のように単純性脂肪肝患者群のＰＴＸ３濃度の分布は健常人のＰＴＸ３濃度の分布とほぼ同様であった。
　このため、健常人のＰＴＸ３濃度の分布より求められた基準値と比較してもよく、この場合健常人の基準値と比較して高値であればＮＡＳＨの存在が疑われる。基準値の設定は、測定系毎に感度・特異性等を考慮して適切な値を設定すればよい。
　具体的な例を以下に挙げるが、カットオフ値は以下の数値に限定されない。
　一例として、カットオフ値を１．９８～２．２８ｎｇ／ｍＬと設定し、被検試料のＰＴＸ３濃度が１．９８～２．２８ｎｇ／ｍＬ以上であればＮＡＳＨである可能性が高いと判定してもよい。
　ここで、ＮＡＦＬＤ患者の認定は、常法に従って行えばよく、明らかな飲酒暦がないにもかかわらずアルコール性肝障害に類似した脂肪性肝障害を認める症例がＮＡＦＬＤと診断される（日本肝臓学会編、ＮＡＳＨ・ＮＡＦＬＤの診療ガイド）。一例として次のように行うことができる。
　（１）非飲酒者である（エタノール換算で２０ｇ／日以下）。
　（２）明らかな慢性肝疾患が除外される（ウィルス性肝炎、自己免疫性肝疾患、ヘモクロマトーシス、Ｗｉｌｓｏｎ病等の代謝性疾患を除外する）。
　（１）、（２）を満たすことに加えて画像検査で脂肪沈着を認める例は肝生検により確定診断をする。なお、肝生検を行う前の画像検査で脂肪沈着を認める場合でもＮＡＦＬＤの疑いのある患者として被検の対象としてもよい。
　また、上記（３）の肝生検の際、大滴性の脂肪蓄積が認められる肝細胞の割合によって肝脂肪化グレード（グレード０～３）を判定し、グレード１～３の該当者をＮＡＦＬＤ患者として認定しても良い。
　グレード０：脂肪肝なし。
　グレード１：大滴性の脂肪蓄積を有する肝細胞が３３％未満である。
　グレード２：大滴性の脂肪蓄積を有する肝細胞が３３－６６％である。
　グレード３：大滴性の脂肪蓄積を有する肝細胞が６６％より多い。
　肝脂肪化グレードでＮＡＦＬＤ患者を判定した場合、以下のようなカットオフ値を設定してもよいが、これに限定されない。
　一例として、カットオフ値を１．６ｎｇ／ｍＬと設定し、被検試料のＰＴＸ３濃度が１．６ｎｇ／ｍＬ以上であればＮＡＳＨである可能性が高いと判定してもよい。
　本発明においては、患者より被検試料を採取し、被検試料のＰＴＸ３濃度を測定し、ＰＴＸ３濃度が高値であるほど肝線維化が重症であることを診断することができる。肝線維化は肝の慢性炎症に起因して生じるので当該診断の精度を高める点から、肝の慢性炎症を生じた患者またはこれが疑われる患者（単に、「肝疾患患者」ともいう。）由来の被検試料を用いることが好ましい。
　ここで、肝の慢性炎症を生じる疾患としては、ウィルス性慢性肝炎、自己免疫性肝炎、遺伝性・代謝性疾患（Ｗｉｌｓｏｎ病、ヘモクロマトーシス、α１アンチトリプシン欠損症、アミロイドーシスなど）、アルコール性肝障害、薬物性肝障害、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）（今廻道夫・熊田博光・坪内博仁・林紀夫著　肝臓病学　朝倉書店（２００６））が挙げられる。これらの疾患ではいずれも病態の進行に伴い線維化が認められ、肝線維化のメカニズムは共通している(Gresser OA et al.:J.Cell.Mol.Med.11(5),1031-1051(2007))。実際にいずれの疾患においても、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸等の肝線維化マーカーは共通して用いられている。
　本発明において、特に、ＮＡＦＬＤ患者より被検試料を採取し、被検試料のＰＴＸ３濃度を測定することが好ましい。肝線維化は、ＮＡＳＨ患者にも非ＮＡＳＨ患者にも認められるが、ＮＡＳＨの病態および予後の最も重要な指標であり、線維化が重症であるほど予後が悪く重症なＮＡＳＨであると診断することができる(Farrell GC et al.:Hepatology.43(2 Suppl 1),S99-112(2006)、Hashimoto E et al.:Hepatol Res.200533(2),72-76(2005))ので、ＰＴＸ３濃度が高値であるほど予後が悪く重症なＮＡＳＨであるとも診断することができる。
　ここでＮＡＦＬＤ患者の認定は、常法に従って行えばよく、明らかな飲酒暦がないにもかかわらずアルコール性肝障害に類似した脂肪性肝障害を認める症例がＮＡＦＬＤと診断される（日本肝臓学会編、ＮＡＳＨ・ＮＡＦＬＤの診療ガイド）が、一例として上述と同様にして行うことができる。
　本発明方法により、患者の肝線維化の重症度を判定する場合、ＰＴＸ３濃度が高値であるほど線維化の重症度が高いと判定することができるが、予めカットオフ値を設定し、このカットオフ値に基づき判定することもできる。このカットオフ値は線維化のステージ毎に設定することもでき、他の線維化の指標に基づいて設定することもできる。カットオフ値の設定は、測定系毎に感度・特異性等を考慮して適切な値を設定すればよい。
　具体的な例を以下に挙げるが、カットオフ値は以下の数値に限定されない。
　一例として、肝線維化の重症度を軽症例（ステージ０～２）または進行症例（ステージ３、４）と判定する場合、カットオフ値を２．５ｎｇ／ｍＬに設定し、被検試料中のＰＴＸ３濃度が２．５ｎｇ／ｍＬ未満であれば軽症例、２．５ｎｇ／ｍＬ以上であれば進行症例である可能性が高いと判定する。
　一例として、後記実施例記載から、カットオフ値を２．１３～２．３７ｎｇ／ｍＬと設定し、被検試料中のＰＴＸ３濃度が２．１３～２．３７ｎｇ／ｍＬ以上であればステージ３またはステージ４と判定することもできる。カットオフ値を４．０ｎｇ／ｍＬと設定し、被検試料中のＰＴＸ３濃度が４．０ｎｇ／ｍＬ以上であればステージ４と判定することもできる。
　ここで、上記のように肝線維化の重症度をステージ（ステージ０～４）として評価する場合、Ｂｒｕｎｔの分類(Brunt EM. Semin Liver Dis 2004;24:3-20)に基づき、下記のように判定することができる。
　　ステージ０：線維化なし
　　ステージ１：Ｚｏｎｅ　３を中心としてperivenular/perisinusoidal/pericellular fibrosisが部分的ないし広範に存在する
　　ステージ２：ステージ　１に加え門脈域に線維性拡大を認める
　　ステージ３：ｂｒｉｄｇｉｎｇ　ｆｉｂｒｏｓｉｓが部分的ないし広範に存在する
　　ステージ４：肝硬変
　本発明方法においては、ＰＴＸ３濃度の測定は、抗ＰＴＸ３抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。以下、抗ＰＴＸ３抗体を用いた測定法について詳細に説明する。
　本発明で用いられる抗ＰＴＸ３抗体はＰＴＸ３タンパク質に特異的に結合すればよい。好ましくは、ＰＴＸ３の立体構造に高い結合親和性を示し、より好ましくはＰＴＸ３の立体構造に高い結合親和性を示し、且つ、ＣＲＰやＳＡＰに交差反応しない抗体である。さらに好ましくは、ＰＰＭＸ０１０２（ＦＥＲＭ　Ｐ－１０３２６）、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７１９）およびＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７２０）であり、最も好ましくは、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７１９）およびＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７２０）である。
　本明細書に記載したＰＰＭＸ０１０２（ＦＥＲＭ　Ｐ－１０３２６）、ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７１９）およびＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７２０）は平成１７（２００５）年９月２２日付で産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１－１－１　中央第６）に寄託したものである。
　抗体の由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
　また、免疫学的測定法において支持体に固定される抗ＰＴＸ３抗体と標識物質で標識される抗ＰＴＸ３抗体はＰＴＸ３分子の同じエピトープを認識してもよいし、異なるエピトープを認識してもよい。
　本発明で使用される抗ＰＴＸ３抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＰＴＸ３抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＰＴＸ３を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
　具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
　まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＰＴＸ３を、入手可能な細胞の培養上清から精製して得る。あるいは、特表２００２－５０３６４２号公報に開示された方法に従い得ることもできる。
　次に、この精製ＰＴＸ３タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＰＴＸ３の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、当該部分ペプチドはヒトＰＴＸ３のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ＰＴＸ３遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のＰＴＸ３をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるＰＴＸ３の部分および大きさは特に限定されない。
　感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、その他、サル等が使用される。
　感作抗原の動物への免疫は公知の方法に従って行うことができる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４～２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
　このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
　前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３(P3x63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123,1548-1550)、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、ＮＳ－１(Kohler.G.and Milstein,C.Eur.J.Immunol.(1976)6,511-519)、ＭＰＣ－１１(Margulies.D.H.et al.,Cell(1976)8,405-415)、ＳＰ２／０(Shulman,M.et al.,Nature(1978)276,269-270)、ＦＯ(de St.Groth,S.F.et al.,J.Immunol.Methods(1980)35,1-21)、Ｓ１９４(Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.(1978)148,313-323)、Ｒ２１０(Galfre,G.et al.,Nature(1979)277,131-133)等が好適に使用される。
　前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法(Kohler.G.and Milstein,C.、Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等に準じて行うことができる。
　より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１～１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば平均分子量１０００～６０００程度）溶液を通常３０～６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
　このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日～数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
　目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏでＰＴＸ３に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＰＴＸ３への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１－５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＰＴＸ３を投与して抗ＰＴＸ３抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＰＴＸ３に対するヒト抗体を取得してもよい（ＷＯ９４／２５５８５号パンフレット、ＷＯ９３／１２２２７号パンフレット、ＷＯ９２／０３９１８号パンフレット、ＷＯ９４／０２６０２号パンフレット参照）。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
　当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
　これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる方法がもちいられる。
　また、これらの抗体は、ＰＴＸ３遺伝子によってコードされる蛋白質の全長または一部を認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、ペプシンやパパインによりＩｇＧのＦｃ部分を消化する方法や、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co,M.S.et al.,J.Immunol.(1994)152,2968-2976;Better,M.and Horwitz,A.H.,Methods Enzymol.(1989)178,476-496;Pluckthun,A.and Skerra,A.,Methods Enzymol.(1989)178,497-515;Lamoyi,E.,Methods Enzymol.(1986)121,652-663;Rousseaux,J.et al.,Methods Enzymol.(1986)121,663-669;Bird,R.E.and Walker,B.W.,Trends Biotechnol.(1991)9,132-137参照)。
　前記のように産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。
　抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗ＰＴＸ３抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
　本発明において測定するＰＴＸ３は、特に限定されず、全長ＰＴＸ３でも、その断片でもよい。
　被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗ＰＴＸ３抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
　抗ＰＴＸ３抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質を検出することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
　本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコーン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＰＴＸ３抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
　抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃～室温にて１時間～２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
　本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法においては、ＰＴＸ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。
　抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質の測定の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＰＴＸ３抗体を用いる方法を挙げることができる。
　例えば、支持体に固定された抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
　抗ＰＴＸ３抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＰＴＸ３抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
　抗体の酵素標識法としては、ヒンジ法とノンヒンジ法の２つが挙げられるがこれに限定しない。ヒンジ法は、抗体ＩｇＧの抗原結合能を有するＦ（ａｂ’）２部分との間のヒンジ部と呼ばれる部分にあるジルスフィド結合を還元して生成するチオール基を利用してＦａｂ’と酵素分子を結合する方法である。一方、ノンヒンジ法は、抗体のいずれの反応基を利用するかは特定しないが、多くの場合、抗体のアミノ基を利用して抗体分子と酵素分子を結合する方法である。
　具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＰＴＸ３抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２－アジノビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２－フェニレンジアミン（オルソ－フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
　本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法の特に好ましい態様として、抗体ＩｇＧの抗原結合能とは関係のないＦｃ部分を除去し、一般的な酵素標識法記載の方法で標識をした抗体を用いる方法を挙げることができる。
　具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ペルオキシダーゼ直接標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＰＴＸ３タンパク質を検出する。
　本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法の他の態様として、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
　例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＰＴＸ３タンパク質を、一次抗ＰＴＸ３抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
　本発明のＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＰＴＸ３抗体を感作した担体を用いてＰＴＸ３を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン－ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中に抗ＰＴＸ３抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＰＴＸ３を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
　本発明のＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質－タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia社製）等のバイオセンサーを用いることによりＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗ＰＴＸ３抗体に結合するＰＴＸ３タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
　本発明の測定方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
　本発明は、免疫組織化学染色に用いることもできる。バイオプシーや手術によって得られた組織を当業者に公知の方法で抗ＰＴＸ３抗体を用いて染色することができる。
　本発明は、ＮＡＦＬＤにおける肝線維化および単純性脂肪肝とＮＡＳＨの鑑別を行う診断薬の提供をも目的とするが、該診断薬は抗ＰＴＸ３抗体を含むことが好ましい。ここで診断薬には、キットも含まれる。該診断薬がＥＬＩＳＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
＜実施例１　対象＞
　肝生検を施行し評価しえたＮＡＦＬＤの３９症例を対象とし検討を行った。
　単純性脂肪肝と診断された患者１７名、ＮＡＳＨと診断された患者２２名の合計３９名のＮＡＦＬＤ患者を対象とした。
　ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの診断は次のように行った。
　（１）非飲酒者である（エタノール換算で２０ｇ／日以下）。
　（２）明らかな慢性肝疾患が除外される（ウィルス性肝炎、自己免疫性肝疾患、ヘモクロマトーシス、Ｗｉｌｓｏｎ病等の代謝性疾患を除外する）。
　（３）（１）、（２）を満たすことに加えて画像検査で脂肪沈着を認める例は肝生検により確定診断した。病理診断により肝細胞に脂肪滴が存在し、核が細胞の辺縁部に移動していることを確認後、大滴性の脂肪蓄積が認められる肝細胞の割合によって次のように肝脂肪化グレード（０～３）と判定し、当該グレード１～３をＮＡＦＬＤ患者とした。
・肝脂肪化グレードの判定
　グレード０：脂肪肝なし
　グレード１：大滴性の脂肪蓄積を有する肝細胞が３３％未満
　グレード２：大滴性の脂肪蓄積を有する肝細胞が３３－６６％
　グレード３：大滴性の脂肪蓄積を有する肝細胞が６６％より多い
　さらに、線維化の度合いおよびＮＡＳＨか否かについての病理診断がなされた。
・肝線維化の判定
　Ｂｒｕｎｔの分類(Brunt EM.Semin Liver Dis 2004;24:3-20)を用いて線維化の評価を行った。
　　ステージ０：線維化なし
　　ステージ１：Ｚｏｎｅ　３を中心としてperivenular/perisinusoidal/pericellular fibrosisが部分的ないし広範に存在する
　　ステージ２：ステージ　１に加え門脈域に線維性拡大を認める
　　ステージ３：bridging fibrosisが部分的ないし広範に存在する
　　ステージ４：肝硬変
・ＮＡＳＨの判定
　脂肪化（大滴性＞小滴性、小葉中心部に多い）、小葉内炎症（軽度、好中球や単核球浸潤）、肝細胞の風船様変性（脂肪化周辺、小葉中心部に多い）または線維化の３所見が認められた場合にＮＡＳＨと判定した(米国肝臓学会 Single Topic Conference 2002、Neuschwander-Tetri BA,et al:Nonalcoholic steatohpatitis:summary of an AASLD SingleTopic Conference.)。
　対象とした患者群のＰＴＸ３濃度および判定結果を表１に示す。
　なお、ＰＴＸ３濃度は下記実施例２のＥＬＩＳＡ法にて判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜実施例２　ＥＬＩＳＡ法によるＰＴＸ３濃度の測定＞
　血中のＰＴＸ３タンパク質を検出するため、ＰＴＸ３のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を以下のように構築した。すなわち、９６ウェルプレートにコートする抗体には、ＷＯ２００７／０５５３４０に従って調製したＦ（ａｂ’）２化ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７１９）を５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ｗｅｌｌ、４℃、一晩インキュベーションし固相化を行った。
　ＰＰＭＸ０１０４（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７１９）は平成１７（２００５）年９月２２日付で産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１－１－１　中央第６）に寄託したものである。
　翌日３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄緩衝液（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で３回洗浄後、ＡＢＩ社のイムノアッセイスタビライザー（ＡＢＩ　＃１０－６０１－００１）を１５０μＬ加え、ブロッキングを行い、４℃で一晩保管した。本ＥＬＩＳＡ法については、出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２２５０５に開示されている。血漿を、動物血清などを含む希釈緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－Ｃｌ　ｐＨ８．０，０．１５Ｍ　ＮａＣｌ）で適当に希釈したものを加え２時間室温でインキュベートした。次いで、動物血清などを含むＰＢＳ（－）で２０μｇ／ｍＬとなるように希釈したＨＲＰＯ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識Ｆａｂ’化ＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７２０）抗体を加え２時間室温でインキュベートした。反応液を捨てた後、３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄緩衝液で５回洗浄した後、添付のプロトコールに従いＳｃｙｔｅｋ社のＴＭＢ（Ｃａｔ＃ＴＭ４９９９）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。サンプル中のＰＴＸ３タンパク質濃度の換算には、表計算ソフトＧｌａｐｈＰａｄ　ＰＲＩＳＭ(GlaphPad software Inc.ver.3.0)を用いて解析した。
　ＰＰＭＸ０１０５（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０７２０）は平成１７（２００５）年９月２２日付で産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１－１－１　中央第６）に寄託したものである。
　＜実施例３　単純性脂肪肝とＮＡＳＨの鑑別診断＞
　実施例１に記載の単純性脂肪肝患者１７人、ＮＡＳＨ患者２２人の血漿ＰＴＸ３濃度を実施例２のＥＬＩＳＡ法で測定し、測定値をｔ検定により比較した。単純性脂肪肝患者群とＮＡＳＨ群の平均値±標準偏差は１．４２９±０．５１２ｎｇ／ｍＬと２．９８４±２．１７３ｎｇ／ｍＬであり、ｐ＝０．００６６と有意差が認められた（図１）。
＜実施例４　ＮＡＦＬＤの肝線維化の重症度＞
　実施例１に記載のＮＡＦＬＤ患者を、肝線維化の判定がステージ０、ステージ１、ステージ２であったものを線維化軽症群、ステージ３、ステージ４であったものを線維化進行症例群とし、血漿ＰＴＸ３値を実施例２のＥＬＩＳＡ法で測定し測定値をｔ検定により比較した。線維化軽症群の平均値±標準偏差は１．６２８±０．７３５ｎｇ／ｍＬ、線維化進行群の平均値±標準偏差は４．０７６±２．５４８ｎｇ／ｍＬであり、ｐ＜０．０００１と有意差が認められた（図２）。
　また、線維化の判定がステージ０（１６人）、ステージ１（１２人）、ステージ３（６人）、ステージ４（５人）それぞれについて比較を行ったところ、平均値±標準偏差はステージ０群で１．４５４±０．５１８ｎｇ／ｍＬ、ステージ１群で１．８１９±０．８８９ｎｇ／ｍＬ、ステージ３群で３．９６８±２．８０９ｎｇ／ｍＬ、ステージ４群で４．２０６±２．５１６ｎｇ／ｍＬであった。（ステージ０群とステージ３群（ｐ＝０．００１９）、ステージ０群とステージ４群（ｐ＝０．０００４）、ステージ１群とステージ３群（ｐ＝０．０２４７）、ステージ１群とステージ４群（ｐ＝０．００９４）の間に有意差を認めた（図３）。
＜実施例５　対象＞
　患者グループを変更した以外は実施例１と同様にしてさらに症例を追加し、検討した。
　これにより評価しえたＮＡＦＬＤの７０症例（単純性脂肪肝患者２８名、ＮＡＳＨ患者４２名のＮＡＦＬＤ患者７０名）を対象とし、上記実施例２～４と同様の実験・測定方法を用いて、実施例６～１０のような種々の検討を行った。
＜実施例６　単純性脂肪肝とＮＡＳＨの鑑別診断＞
　実施例５に記載の単純性脂肪肝患者２８名、ＮＡＳＨ患者４２名の血中ＰＴＸ３濃度を測定し、当該測定値をｔ検定により比較したところ、単純性脂肪肝患者群とＮＡＳＨ群では、ｐ＝０．００２１と有意差が認められた（図４）。また、単純性脂肪肝患者群とＮＡＳＨ群の平均値±標準偏差は１．３３５±０．５１５ｎｇ／ｍＬと２．４１７±１．７３９ｎｇ／ｍＬであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜実施例７　ＮＡＦＬＤの線維化の重症度とＰＴＸ３＞
　実施例５に記載のＮＡＦＬＤ患者を、線維化の判定がステージ０、ステージ１、ステージ２であったものを線維化軽症群、ステージ３、ステージ４であったものを線維化進行症例群として分類し、血漿ＰＴＸ３値をＥＬＩＳＡ法で測定しｔ検定により比較した。線維化軽症群の平均値±標準偏差は１．５１５±０．６１７ｎｇ／ｍＬ、線維化進行群の平均値±標準偏差は３．４４７±２．２７７ｎｇ／ｍＬであり、線維化軽症群と線維化進行症例群の間には、ｐ＜０．０００１と有意差が認められた（図５）。
　一方、既存の繊維化マーカーを用いて実施例の５のＮＡＦＬＤ患者についてｔ検定により比較した。ＩＶ型コラーゲン７ｓをマーカーとしたとき線維化軽症群と進行群のＩＶ型コラーゲン７ｓ濃度の平均値±標準偏差は、それぞれ４．６５±０．９３ｎｇ／ｄＬと５．９４±１．５３ｎｇ／ｄＬであり、ｐ値は０．００１８であった。ヒアルロン酸をマーカーとしたとき線維化軽症群と進行群のヒアルロン酸濃度の平均値±標準偏差は、それぞれ３２．７±２７．８ｎｇ／ｄＬと７２．４±６８．１ｎｇ／ｄＬでｐ値が０．００９、血小板数をマーカーとしたとき線維化軽症群と進行群の血小板数濃度の平均値±標準偏差は、それぞれ２５．８±６．６ｎｇ／ｄＬと２０．０±８．７ｎｇ／ｍＬであり、ｐ値は０．０１３４であった。
　線維化の重症度との関連において、ＰＴＸ３はいずれの既存の肝線維化マーカーと比較しても高い有意差を示した。
　また、線維化のステージによるＰＴＸ３測定値をクルスカル・ワリス検定を行ったところ、ｐ＜０．０００１とＰＴＸ３濃度と繊維化のステージとの間に関連があることが示された（図６）。
　また、線維化の判定がステージ０（２８人）、ステージ１（２１人）、ステージ２（４人）ステージ３（１１人）、ステージ４（６人）それぞれについて比較を行ったところ、平均値±標準偏差はステージ０群で１．３２８±０．５２３ｎｇ／ｍＬ、ステージ１群で１．６８７±０．７１４ｎｇ／ｍＬ、ステージ２群で１．７６８±０．３５６ｎｇ／ｍＬ、ステージ３群で３．０８２±２．３２０ｎｇ／ｍＬ、ステージ４群で４．１１７±２．２３４ｎｇ／ｍＬであった。（ステージ０群とステージ３群（ｐ＝０，０００９）、ステージ０群とステージ４群（ｐ＜０．０００１）、ステージ１群とステージ３群（ｐ＝０．０１３６）、ステージ１群とステージ４群（ｐ＝０．０００１）、ステージ２群とステージ４群　（ｐ＝０．０４６５）の間に有意差を認めた。（図６）。
＜実施例８　肝脂肪化グレードおよび壊死炎症所見とＰＴＸ３＞
　実施例５に記載のＮＡＦＬＤ患者を肝脂肪化グレード毎に群分けし、実施例２の通り血漿ＰＴＸ３値をＥＬＩＳＡ法で測定しｔ検定により比較した。その結果、肝脂肪化グレードとＰＴＸ３測定値の間には、関連が見出されなかった（図７）。
　また、同じ患者群を壊死炎症所見のグレードにより分類し、ＰＴＸ３値を比較した結果、壊死炎症所見とＰＴＸ３との間には有意な差は認められなかった（図８）。
＜実施例９　単純性脂肪肝とＮＡＳＨのカットオフ値＞
　単純性脂肪肝とＮＡＳＨの患者のＰＴＸ３測定値より受信者動作特性解析（ＲＯＣ解析）を行った（図９）。単純性脂肪肝とＮＡＳＨ患者の鑑別において感度、特異性が最も優れたカットオフ値は１．６１ｎｇ／ｍＬであった。感度は６６．７％、特異性は７８．６％、陽性的中度は８２．４％、陰性的中度は６１．１％であった。
＜実施例１０　ＮＡＦＬＤの線維化の重症度の軽症例と進行症例のカットオフ値＞
　ＮＡＦＬＤの線維化の重症度の軽症例と進行症例の患者のＰＴＸ３測定値より受信者動作特性解析（ＲＯＣ解析）を行った（図１０）。ＮＡＦＬＤの線維化の重症度の軽症例と進行症例患者の鑑別において感度、特異性が最も優れたカットオフ値は２．４５ｎｇ／ｍＬであった。感度は７０．６％、特異性は９４．３％、陽性的中度は８０．８％、陰性的中度は９０．９％であった。

Claims (17)

  1. 　非アルコール性脂肪性肝疾患患者由来の被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする進行性の非アルコール性脂肪性肝の判定方法。
  2. 　非アルコール性脂肪性肝疾患患者由来の被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定し、健常人または単純性脂肪肝と診断された患者のＰＴＸ３濃度の分布により求められた基準値と比較し、これより高濃度の場合に進行性の非アルコール性脂肪性肝と鑑別することを特徴とする進行性の非アルコール性脂肪性肝の判定方法。
  3. 　被検試料が、血液、血清または血漿である請求項１または２記載の判定方法。
  4. 　ＰＴＸ３測定試薬を含有する進行性の非アルコール性脂肪性肝の診断薬。
  5. 　被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする肝線維化の判定方法。
  6. 　被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定し、当該ＰＴＸ３濃度が高濃度であるほど肝線維化の重症度が高いと判定することを特徴とする肝線維化の判定方法。
  7. 　被検試料が肝疾患患者由来のものである請求項５または６記載の判定方法。
  8. 　被検試料が非アルコール性脂肪性肝疾患患者由来のものである請求項５または６記載の判定方法。
  9. 　被検試料が、血液、血清または血漿である請求項５～８のいずれか１項記載の判定方法。
  10. 　ＰＴＸ３測定試薬を含有する肝線維化の診断薬。
  11. 　ＰＴＸ３測定試薬を含有する非アルコール性脂肪性肝疾患における肝線維化の診断薬。
  12. 　抗ＰＴＸ３抗体の、進行性の非アルコール性脂肪性肝の診断薬の製造のための使用。
  13. 　抗ＰＴＸ３抗体の、肝線維化の診断薬の製造のための使用。
  14. 　抗ＰＴＸ３抗体の、非アルコール性脂肪性肝疾患における肝線維化の診断薬の製造のための使用。
  15. 　進行性の非アルコール性脂肪性肝の診断のための、抗ＰＴＸ３抗体の使用。
  16. 　肝線維化の診断のための、抗ＰＴＸ３抗体の使用。
  17. 　非アルコール性脂肪性肝疾患における肝線維化の診断のための、抗ＰＴＸ３抗体の使用。
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