WO2007122799A1

WO2007122799A1 - 肝障害の検出方法、判定方法及び予測方法

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Publication number: WO2007122799A1
Application number: PCT/JP2007/000323
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Murayama
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 2006-03-29
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2007-11-01
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Abstract

　侵襲性が低く、感度がすぐれ、かつ、簡便なＮＡＳＨを一例とする肝障害の検査方法に関するものであって、メタボリック症候群及び／又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の血液サンプル中のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ等のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し、その測定した測定値と健常者の測定平均値とを比較することで、被験者がＮＡＳＨを一例とする肝障害であるか否かを判定する。

Description

明細書

肝障害の検出方法、判定方法及び予測方法

技術分野

[0001] 本発明は、被検者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し、測定されたミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて被験者の肝障害を検出する方法に関するものである。メタボリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患に由来する肝障害、特に非アルコール性脂肪性肝炎、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌等を検出する方法に関する。

また、本発明は、メタボリック症候群若しくは非アルコール性脂肪性肝疾患からの非アルコール性脂肪性肝炎、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌への進展を予測する方法等に関するものである。

背景技術

[0002] 過度のアルコール摂取によらない脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（NON— A LCOHO L I C FAT T Y L I V E R D I S E AS E ： NA F L D、以後 N A F L Dと称す）と呼ばれ、後述するメタボリック症候群に起因する脂肪性肝疾患もこれに含まれる。 N A F L Dの一部がさらに炎症を伴った状態のものは、非アルコール性脂肪性肝炎（NON— A LCOHO L I C S T EATOH E PAT I T I S ： NAS H, 以後 N A S Hと称する）と称される。 N AS Hは、何らかの酸化ストレスなどの要因が加わることにより、肝臓の繊維化、肝硬変、肝臓癌へと徐々に進行する慢性肝疾患である。

[0003] —方、内臓脂肪型肥満に高血糖、高血圧及び高脂血症のうち 2つ以上が併発した状態であるメタボリック症候群は別名代謝症候群とも呼ばれ、一般的には動脈硬化性疾患若しくは脂肪性肝疾患を誘発する危険因子としてその予防■治療が必要とされている。

[0004] NAS Hは、メタポリック症候群の肝臓での表現型と考えられている。メタポリック症候群や糖尿病を患う患者においては、これらの症状と共に N A S Hを併発する危険性が高いとされている。

[0005] 上述したように、 NA F LDの一部が炎症を伴った状態のものを NASH と称したが、 N AS Hの定義は現時点では確定したものではない。例えば、肝臓に炎症性細胞の浸潤が認められなくとも、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌への進展が見られる場合がある。一方では、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌への進展においては、肝臓の炎症化ではなく風船化（バル一二ング）と呼ばれる肝臓の肥大化を重要視する考え方もある。また、 NASHの大部分は、肝硬変への進展が認められないといった報告もある。そこで、本明細書においては、肝臓が炎症、バルーニング、繊維化、硬変、癌などの肝障害を呈する状態、あるいはこれらの症状を惹起し得る状態のものを総称して N ASHと称することとし、肝臓に単に脂肪が蓄積した状態で、それ以外の肝障害を呈する状態に移行しない「単純性脂肪肝」と区別して使用するものとする。

[0006] NASHは、その名が示すとおリアルコールの摂取がないのにも関わらずアルコール性肝炎と類似の所見を示し、先進国においては、 NASHは肝疾患のうち最も発症頻度が高く重篤な疾患の一つとされている。そのため、 N ASHを患う患者には積極的な治療が必要であり、また、診断の場においては単純性脂肪肝と N A S Hとを正確に判別することが極めて重要である。

[0007] 従来の NASHの診断は、腹部エコー、コンピュータ断層撮影等の画像診断によるものやグルタミン酸一ォキサ口酢酸トランスアミナーゼ（GOT) 、グルタミン酸一ビルピン酸トランスアミナーゼ（GPT) 等の肝障害マーカーの変動を血液検査によって検査するものである。しかしながら、前述した肝障害マーカー値は、全ての N AS H患者において異常値を示すわけではなく、最終的な診断は、肝生検に委ねられている。

[0008] 肝生検は、患者への侵襲性が高いうえ煩雑であり、その病理結果の判定は、熟練した専門家によってなされる必要があるため日常の一般検査としては不適切である。したがって、前述した検査方法に変わり NASH検査において信頼性が高い検査方法の開発が望まれてきた。 [0009] これまでに、動物モデルを用いて血液中の肝障害マーカーの変動を調べた研究が数多く報告されている。多くはコリンまたはメチォニン■ コリン欠乏飼料を用いて飼育した、あるいは N AS Hに近い症状を誘発する薬剤を用いたラットまたはマウスを使った実験であり、肝障害マーカーとしては G P T が主に利用されている。これらのモデルでは、肝臓が壊死を起こし、 G P T 値の上昇が観察されている。しかしながら、ヒトの N AS Hにおいては、 G P T値が上昇していなくても N A S Hから肝硬変への進展がみられることが知られており、 G P Tは必ずしも N AS H診断の肝障害マーカーとしては適切なものとは言えなかった。

[0010] G P T以外の肝障害マーカーとしては、例えばラットの実験において、ォルニチン力ルバモイルトランスフェラーゼ（OCT) の濃度値を測定している報告もある（例えば、非特許文献 1及び 2) 。

[0011] 非特許文献 1 ： B i o s c に B i o t e c h n o に B i o c h em. 20 0 1 ; 65 (4) ： 935-938

非特許文献 2： T o x i c o に L e t t . 2000 ; 1 1 4 ( 1 —3) : 1 63- 1 7 1

[0012] しカヽし、 OCTはミトコンドリアに局在するため、 OCTの血中への漏出は、細胞膜の他、ミトコンドリアの二重膜を通って漏出してくる必要があるため、細胞質由来の G P Tなどと比較して血中への漏出は遅く、 OCTが G P Tよりも有効なマーカーとなるとは考えられておらず、そのような有用性を示すデータも報告されていない。これまでの報告では単に OCTの肝臓特異性の高さを利用して肝臓における障害であることを裏付けるために用いられているか、あるいは障害がミトコンドリアまで及ぶ強い障害であるかを示す目的において用いられているにすぎない。したがって、これまでの血中のミトコンドリア由来タンパク質が G P Tよりも検出能力の高い優れたマーカ一であるとする記述はみられず、 G P Tが N AS Hをはじめとする肝臓疾患において肝障害を鋭敏に示すマーカーであると認識されてきた。このため、これまでに報告されている論文等の報告の略全ては、肝障害マーカーとして G P T値が用いられているのが現状である。

[0013] また、他の肝障害マーカーとして、特許文献 1には、アルファ 2—マクログロブリン、ヒアルロン酸、メタプロティナーゼ 1の阻害剤の有無またはこれらの阻害剤の濃度値に基づいて肝繊維症の有無または重症度を検査する方法が示されている。

また、さらに特許文献 2には、末梢血中のリン脂質とその脂肪酸組成を測定し N AS Hを識別する方法が示されている。

また、特許文献 3には、肝臓の組織サンプル中のアポリポタンパク質 A 1 、ミトコンドリア A T PァーゼのSサブユニット、ロイコトリェン A4ヒドラーゼ、ケラチン 1 8、グァニジノ酢酸 N—メチルトランスフェラーゼ、ス一パーォキシサイドジスムターゼ、アルブミン、抗酸化タンパク質 2 ( i s o f o r m 1 ) 、プロヒビチン、メチォニナデノシルトランスフェラーゼ、長鎖ァシル Co Aデヒドロゲナーゼ、セレン結合タンパク質、抗酸化タンパク質 2 ( i s o f o r m2) のいずれかのタンパク質を組み合わせて測定する N AS Hの検査法が示されている。

さらにまた、特許文献 4には、 I I I型プロコラーゲンの N末端ペプチドの濃度値を測定する N A S Hの検査方法が示されている。

[0014] 特許文献 1 ：特表 2005— 51 927 1号公報

特許文献 2： WO2005 1 09006号公報

特許文献 3： WO 2004 55520号公報

特許文献 4：特開 2006 _ 2991 9号公報

発明の開示

[0015] 上述したように、肝障害マーカーである GOT値あるいは GPT値を指標とした血液検査は、これらの肝障害マーカーが示す指標が陰性または弱陽性であった場合に、 N A S Hが見逃される場合があり満足できるものではなかつた。

[0016] また、肝障害マーカーである GOT値あるいは G P T値以外のマーカーを用いた N AS Hに対する検査法も報告されているが、これらの検査法は、測定方法が面倒である。また、検査法によっては複数のマーカーを同時に測定する必要があるため必ずしも簡便な検査方法ではなかった。

[0017] さらに、これらの肝障害マーカーが異常値を示し肝生検に踏み切った場合においても、肝生検は患者への侵襲性が高いうえ煩雑であり、その病理結果の判定は、熟練した専門家によってなされる必要がある。そのため日常の一般検査としては不適切であり、 N A S Hの疑いがあっても検査自体が敬遠される場合があった。

[0018] したがって、本発明は血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し、測定されたミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて被検者が肝障害、特に N A S Hであるか否かを判定する方法を提供することである。

[0019] 上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明者は、

(ィ）コリン欠乏食またはメチォニン■ コリン欠乏食を摂取し N A S Hに近い症状を発症したげつ歯類の動物モデルにおいては、これらの動物モデルが示す G P T値はコントロール郡に比べ有意に上昇していないこと、

(口）ヒトの N A S Hにおいては、 G P T値が正常な例が度々観察されていること、

(ハ） N A S H, 特に肝障害が軽く、 G P T値が上昇しないか、あっても軽度の上昇である N A S Hにおいて、オル二チン力ルバモイルトランスフェラーゼ（OC T) 、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（G D H) 等のミトコンドリア由来タンパク質の血中濃度値の上昇が有意に検出されること、

(二） N A S Hのみならず糖尿病を含めたメタポリック症候群の検出にもミトコンドリア由来タンパク質の測定が有用である

等の知見を見出した。この G P T値の上昇がそれほど見られない N A S Hにおいて、ミトコンドリア由来タンパク質の血中への漏出量が増加することは、本発明者が初めて見出したことである。このため、本発明者は、ミトコンドリア由来タンパク質の血中濃度値を測定することで、肝障害の一例である N A S Hを検査することが可能であることを見出しこの知見を発展させ本発明を完成させた。したがって、本発明は、以下の通りである。 ( 1 ) 被検者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し

、測定されたミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて被検者の肝障害を検出することを特徴とする検出方法。

( 2 ) 被検者の肝障害は、グルタミン酸一ビルピン酸トランスアミナーゼ値の上昇が起こりにくい機序による障害あるいはグルタミン酸一ビルピン酸トランスァミナーゼ値の上昇が起こらない程度の肝障害であることを特徴とする（1 ) に記載の検出方法。

( 3 ) 被検者の肝障害は、メタボリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患に由来することを特徴とする（1 ) に記載の検出方法。

( 4 ) 被検者の肝障害は、非アルコール性脂肪性肝炎、肝臓の繊維化、肝硬変又は肝臓癌であることを特徴とする（1 ) に記載の検出方法。

( 5 ) 被検者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し、測定されたミトコンドリア由来タンパク質量と健常者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の平均値とを比較して、被験者のミトコンドリア由来タンパク質量が健常者のミトコンドリア由来タンパク質量の平均値より高い場合を、メタポリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患に由来する肝障害であると判定することを特徴とする判定方法。

( 6 ) メタポリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の肝障害を予測するためにミトコンドリア由来のタンパク質を肝障害マーカーとして利用することを特徴とする方法。

( 7 ) メタポリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の経時変化を追跡することで肝障害の進展を予測することを特徴とする予測方法。

( 8 ) メタボリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し測定されたミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて肝障害の治療効果を判定することを特徵とする判定方法。

( 9 ) ミトコンドリア由来タンパク質は、肝臓に特異的に存在するタンパク質及び又は肝臓に豊富に存在するタンパク質であることを特徴とする（1 ) 乃至（8) の何れかに記載の方法。

( 1 0) ミトコンドリア由来タンパク質は、オル二チン力ルバモイルトランスフヱラーゼ及び又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする（1 ) 乃至（8) のいずれかに記載の方法。

( 1 1 ) ミトコンドリア由来タンパク質量はそのタンパク質濃度又はタンパク質活性を測定することで決定されることを特徴とする（1 ) 乃至（8) のいずれかに記載の方法。

( 1 2) ミトコンドリア由来タンパク質量は免疫学的手法又は酵素学的手法によって測定されることを特徴とする（1 ) 乃至（8) の何れかに記載の方法。

[0021] 本発明により、 NA F L D由来の肝障害の検出はもとより、 NAS Hと単純性脂肪肝とを的確に区別することが可能となる。さらに、本発明は、 NA S Hの確定診断または肝生検などの確定診断を行うか否かの判定根拠としての補助的検査に有用である。

[0022] さらに、本発明によれば、 NA F L D患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の経時変化を追跡することで、肝臓の炎症、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌等の NAS Hの進展を予測することができる。さらに、本発明によれば、肝障害の治療効果を判定することにも応用可能である

[0023] さらにまた、本発明によれば、 NA F L D由来の肝障害だけでなく、メタボリック症候群における肝障害を検出することも可能である。したがって、メタボリック症候群自体の検出、あるいはメタボリック症候群に由来する肝障害、具体的には肝臓の炎症、肝臓の繊維化、肝硬変及び肝臓癌等の N AS Hを予測することにも応用可能である。

図面の簡単な説明

[0024] [図 1]テトラサイクリンの投与後の経過時間と T B A RS濃度値の関係を示すグラフである。 [図 2]テトラサイクリンの投与後の経過時間と肝障害マーカー濃度値の関係を示すグラフである。

[図 3]雄の o bZo bマウスの週齢における血中における OCT値及び G P T 値の推移を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0025] 測定対象の被験サンプルとしては、血液、血清、血漿などの血液由来サンプルであれば、特に限定されない。

[0026] 本発明の方法は、 N AS Hをはじめとする肝障害を検出するに際し、ミトコンドリア由来タンパク質量を測定することを特徴とするものである。このようなミトコンドリア由来のタンパク質としては、 OCT及び又はGDH を例示することができる。

[0027] 血液サンプル中の OCT値あるいは GDH値の測定は、そのタンパク質の濃度値あるいはその活性値を指標とすることができ、測定法自体は公知の方法を採用することができる。例えば、 0〇丁値ぁるぃは〇01~1値を巳 1_ I S A法などの免疫学的測定法で測定する場合には、本発明者が開発した高感度の OCT測定法（特許文献 5 ： WO 2006 73073号公報）又は公知の方法（E n z yme P r o t e i n ( 1 994-95) 48 : 1 0- 1 7) 等を用いて測定することができる。

[0028] また、 OCT値あるいは GDH値を酵素学的手法で測定する場合も、市販のキット（例えば、和光純薬工業、 OCTテスト一ヮコ一）あるいは公知の方法（C I i n. C h i m. A c t a (1 976) 67 : 1 45— 1 52、 A n a l . L e t t . ( 1 993) 26 : 475— 486、 E u r. J . C I i n. C h e m. C I i n. B i o c h em. ( 1 992) 30 : 493 -502) 等に準じて測定することができる。

[0029] 上記した方法あるいは市販のキットを用いて測定した被験者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の測定値と健常者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量平均値とを比較して、被験者の測定値が健常者の測定平均値よりも高い場合、肝臓の障害、具体的にはメタポリック症候群及び又は N A F L Dに由来する N A S H等の肝障害の疑いありと判断することができる。また、被験者の測定値が健常者の測定平均値と同等あるいはそれよりも低い場合は、 N A S H等の肝障害ではないと判定することができる。

[0030] E L I S A法等の免疫学的手法によって、 OCTあるいは GDHの濃度値を決定する場合に用いる OCTあるいは GDHに対する抗体は、常法、例えば特許文献 5などの文献を参照することにより調整することができ、その抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。あるいは、 OC Tあるいは G D Hとの結合性を有する F a b、 F (a b' ) 2などの抗体の断片を用いてもかまわない。

[0031] 以下、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。

[0032] 実施例 1 ：コリン欠乏症 S Dラットモデルにおける血中の各種肝障害マーカーの測定

雄の SDラット 8週齢、 1 6匹を 2群に分け、 1つの群の SDラットにはコリン欠乏（CD) 食を与え、他の群の S Dラットにはコリン添加（CS) 食を摂取させた。 4週間後、麻酔下にて採血を行った。また、 SDラットの肝臓を一部採取し、ホルマリンによる固定を行った後、へマトキシリン -ェォジン染色して肝障害の程度を病理組織学的に調べた。また、 CD食を 8週間摂取させたラットについても同様に処理した。

[0033] ミトコンドリア由来タンパク質（OCT、 GDH) 及び細胞質由来タンパク質（GPT、 GOT, グアナーゼ（GU) 、イソシァネートデヒドロゲナーゼ（ I CD) 、ソルビ ! ^一ルデヒドロゲナーゼ（SDH) 、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH) ) のラット血清中における濃度値あるいは活性値を測定した結果を表 1及び 2に示した。なお、 GPT、 GOT, GU、 I CD、 S DH、 LDH、 GDHは酵素法により測定し、 O C Tは E L I S A法により測定した。 [0034] 測定の結果、表 1に示すように、 CD食群おいてミトコンドリア由来タンパク質である OCT値、 G DH値が有意に上昇した。一方、表 2に示すように細胞質由来タンパク質においては、 C D食群と C S食群との間に有意差は認められなかった。この結果は、 NAS Hの検出において、血中に含まれるミトコンドリア由来タンパク質量を指標とすることが有効であることを示している。

[0035] [表 1]

OCT GDH

(IU/L)

CS食群 23.4±9.1 19.8±2.5

CD食群 115.6±29,0* 78.7±17.7*

* ： p < 0, 05 (Student t test)

[0036] ほ 2]

GPT GOT Dn

GU ICD SDH

(Karmen (Karmen in in 、 (Wroblewski unit) unit) Uし/し _) Uし/し _) (J.し/し

unit)

CS食群 M.3±1.3 86.8±5.7 80.6±3.3 3.0±0.6 4.7±1. 0 2109±179

CD食群 29.1±7.0 109.8± 13.4 75.2 ±5.1 3.1±1.0 8,0±1. 4 1951.土 301 すべて有意差なし（Student t test)

[0037] なお、病理組織検査の結果、 CD食摂取開始から 4週間後において、 CD 食群に属するラッ卜の肝臓には脂肪の蓄積が認められたが、顕著な肝障害は認められなかった。しかしながら、 CD食摂取開始から 8週間後において、 CD食群に属するラットには肝臓の繊維化が認められた。この結果は、 CD 食摂取は SDラッ卜の肝臓にダメージを与えることを明示しており、ミトコンドリア由来タンパク質（OCT、 GDH) の上昇は、肝障害マーカーとして有用であることを示している。

[0038] 実施例 2 ：テトラサイクリン投与ラットにおける血中の各種肝障害マーカ一の測定

NASHの発症機序には、ミトコンドリア障害やそれに伴う酸化ストレスが関与しているとされている。ヒトにおいてもミトコンドリア障害を惹起する薬剤により NASHと類似した病変を起こすことが知られており、これは薬剤起因性 NASHとも呼ばれている。そこで、テトラサイクリン投与による急性肝障害における血中の各種肝障害マーカーと酸化ストレスの指標とされるチォバルビツール酸反応物質（TBARS) の肝臓組織中含量を経時的に測定した。

[0039] 雄の W i s t a rラット 8週齢にテトラサイクリン塩酸塩（1 92 m g Z k g) を腹腔内投与し、麻酔下にて採血後肝臓を摘出した。肝臓組織 1 gに対して 20 mMリン酸緩衝液 4m I を加えてホモジナイズしたものを肝臓組織サンプルとして、 TBARSの測定に供した。肝臓組織中の TBARS濃度値の変動を図 1に、テトラサイクリン投与後の血中の各種肝障害マーカーの変動を図 2に示した。なお、各時間経緯の測定ポイント毎に W i s t a r ラット 8週齢を 6匹使用した。

[0040] 測定の結果、図 1に示すように、肝臓組織中の TBARS濃度値の上昇は亍トラサイクリンの投与 24時間後から始まり、 48時間後にピークに達した。一方、図 2に示すように血中の細胞質由来タンパク質である GPT、 G OTの値の上昇は 8時間後にピークに達し、その後は徐々に GPT値、 GO T値は低下した。これに対し、血中のミトコンドリア由来タンパク質である OCTの血中濃度値は、亍トラサイクリン投与後 4時間と 24時間後にピークを示した。また、 GDHの血中濃度値は、テトラサイクリン投与後 48時間後にピークを示した。 O C T値の 2つ目のピークと G D H値のピークは、肝臓中の酸化ストレスの増加を示す T B A R S濃度値の上昇ピークとも対応している。これは、ミトコンドリア障害に伴う酸化ストレスを反映して OC 丁、 GDHの血中濃度値が上昇したものであると考えられる。これに対して、 GPT、 GOTは、 T BARS濃度値の上昇ピークに対応したピークは見受けられなかった。

[0041] 実施例 3 ：高脂肪食 KK_Ayマウスモデルにおける血中の肝障害マーカ一の測定

KK_A yマウスは、糖尿病を発症しやすい遺伝背景をもつ KKマウスに肥満遺伝子である Ayを導入することにより得られた肥満■糖尿病マウスである。 KK_ A yマウスに高脂肪食を摂取させることにより善玉アディボカインであるアディポネクチンが低下し、悪玉アディボカインである T N F— ひが増加することが報告されていることから、高脂肪食 KK_A yマウスは、メタポリック症候群のモデル動物であると考えられる。

そこで、高脂肪食を摂取させた KK_ Ayマウスにおける血中ミトコンドリア由来タンパク質量を測定した。

[0042] 雄の KK_A yマウス 1 0匹を 5匹ずつの 2群に分け、それぞれの群に対してコントロール飼料と高脂肪食飼料を 3週間与えた後、血中の O C T値及び G P T値を測定した。

[0043] その結果、表 3に示した通り、高脂肪食群において OCT値のみが有意に上昇した。メタボリック症候群に関連した肝障害、すなわち NASHの検出においては、 G P Tよりも OC Tの方が優れていることが示された。また、メタボリック症候群のモデルである高脂肪食 KK_Ayマウスにおける OC T値の上昇は、メタボリック症候群と N A S Hとの関連性を裏付けるものである。したがって、 N AS Hの検査のみならず、メタボリック症候群の検査においても血中ミトコンドリア由来タンパク質が有効であることが示された [0044] [表 3]

OCT GPT

(Karmen unit)

コントロ一ル食群 15.9±1.1 22.1 ±2. δ

高脂肪食群 20.6 ±2.1* 25.4 ±0.6

* ： ρ < 0.05 (Student t 片側検定)

[0045] これらの結果より、 OCT、 G DH等のミトコンドリア由来タンパク質を肝障害マーカーとして用いた方法は、 G P T、 GOT等の細胞質由来タンパク質よりも鋭敏に NAS Hの発症機序とされるミトコンドリァ障害やそれに伴う酸化ストレスを検出することが可能であることを示しており、 NAS H

-、、

の診断に有効であることが示された。

[0046] 実施例 4 ■■ o b o bマウスにおける血中の肝障害マーカーの測定

N A S Hは、メタポリック症候群の肝臓における発現型と考えられており、 N AS H患者の 80~90%は内臓型肥満を呈しているとされる。また、糖尿病患者の多くは脂肪肝であり、 NAS Hのリスクも健常者よりも高いとされている。 2型糖尿病のモデルマウスである o bZo bマウスは、高度の肥満と脂肪肝とを伴い、リポポリサッカライドゃアルコール摂取などの肝毒性に対して感受性を示すことから N AS Hのモデルとして用いられている。そこで、 o bZo bマウスにおける血中でのミトコンドリア由来タンパク質量について検討を行った。

[0047] 雄の o bZo bマウスとコントロールマウス各 5匹の血中における O C T 値及び G P T値を 4週齢から 8週齢まで測定した。測定した結果、図 3に示すように、 o bZo bマウスにおける血中の OCT値は肥満が顕著になる 4 週齢で既にコント口ールマウスの約 6倍上昇しており、 OCT値の上昇割合は G P T値の上昇割合よりも 2倍以上高くなつた。さらに、 6週齢、 8週齢と肥満が著しくなるのに伴い OCT値の上昇割合はさらに増加した。

[0048] 高度に肥満を伴った糖尿病モデルマウスである o bZo bマウスにおいては、糖尿病の指標である血糖値の上昇があまり見られないことが知られている。一方、 o bZo bマウスにおける血中の肝障害マーカーの上昇は、肥満や脂肪肝を伴うメタポリック症候群では糖尿病の症状が軽度であっても肝障害が起き得ることを示している。このため、 o bZo bマウスにおける血中ミトコンドリア由来蛋白濃度値測定は、 NASHのみならず糖尿病を含めたメタボリック症候群の検出においても有効であることが示された。

[0049] 通常、肝障害マーカーとして多用されている GPTよりもミトコンドリア由来タンパク質である OCTの方が、内臓型肥満を呈する o bZo bマウスの週齢経過に対する血中レベルの上昇は顕著である。したがって、 OCTは GPTよりも NA S Hの診断に有効であることが示唆された。

[0050] 本発明によれば、メタボリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の肝障害を予測するためにミトコンドリア由来タンパク質を肝障害マーカーとして初めて利用することができる。

[0051] また、本発明によれば、メタポリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の経時変化を追跡することで肝障害の進展を予測することも可能である。

[0052] さらにまた、本発明によれば、メタポリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し測定された前記ミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて肝障害の治療効果を判定することも可能である。

Claims

請求の範囲

[1 ] 被検者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し、測定された前記ミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて前記被検者の肝障害を検出することを特徴とする検出方法。

[2] 前記被検者の肝障害は、グルタミン酸一ビルピン酸トランスアミナーゼ値の上昇が起こりにくい機序による障害あるいは前記グルタミン酸一ビルピン酸トランスァミナーゼ値の上昇が起こらない程度の肝障害であることを特徴とする請求項 1に記載の検出方法。

[3] 前記被検者の肝障害は、メタポリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患に由来することを特徴とする請求項 1に記載の検出方法。

[4] 前記被検者の肝障害は、非アルコール性脂肪性肝炎、肝臓の繊維化、肝硬変又は肝臓癌であることを特徴とする請求項 1に記載の検出方法。

[5] 被検者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し、測定された前記ミトコンドリア由来タンパク質量と健常者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の平均値とを比較して、前記被験者の前記ミトコンドリア由来タンパク質量が前記健常者の前記ミトコンドリア由来タンパク質量の平均値より高い場合を、メタボリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患に由来する肝障害であると判定することを特徴とする判定方法。

[6] メタボリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の肝障害を予測するためにミトコンドリア由来のタンパク質を肝障害マーカーとして利用することを特徴とする方法。

[7] メタボリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量の経時変化を追跡することで肝障害の進展を予測することを特徴とする予測方法。

[8] メタポリック症候群及び又は非アルコール性脂肪性肝疾患患者の血液サンプル中のミトコンドリア由来タンパク質量を測定し測定された前記ミトコンドリア由来タンパク質量に基づいて肝障害の治療効果を判定することを特徴とする判定方法。

[9] 前記ミトコンドリア由来タンパク質は、肝臓に特異的に存在するタンパク質及び又は前記肝臓に豊富に存在するタンパク質であることを特徴とする請求項 1乃至 8の何れかに記載の方法。

[10] 前記ミトコンドリア由来タンパク質は、オル二チン力ルバモイルトランスフェラーゼ及び又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼであることを特徴とする請求項 1乃至 8のいずれかに記載の方法。

[1 1 ] 前記ミトコンドリア由来タンパク質量はそのタンパク質濃度又はタンパク質活性を測定することで決定されることを特徴とする請求項 1乃至 8のいずれかに記載の方法。

[1 2] 前記ミトコンドリア由来タンパク質量は免疫学的手法又は酵素学的手法によつて測定されることを特徴とする請求項 1乃至 8の何れかに記載の方法。