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WO2008092607A1 - Pipetteneinrichtung, manipulationseinrichtung und verfahren zur manipulation biologischer zellen - Google Patents

Pipetteneinrichtung, manipulationseinrichtung und verfahren zur manipulation biologischer zellen Download PDF

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Publication number
WO2008092607A1
WO2008092607A1 PCT/EP2008/000597 EP2008000597W WO2008092607A1 WO 2008092607 A1 WO2008092607 A1 WO 2008092607A1 EP 2008000597 W EP2008000597 W EP 2008000597W WO 2008092607 A1 WO2008092607 A1 WO 2008092607A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pipette
cell
vibration
pipette tip
tip
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2008/000597
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Steffen Hering
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Wien
Original Assignee
Universitaet Wien
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Wien filed Critical Universitaet Wien
Publication of WO2008092607A1 publication Critical patent/WO2008092607A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/021—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components

Definitions

  • the invention relates to a pipette device which is set up for manipulating biological cells, in particular under the action of ultrasound, a manipulation device which is equipped with such a pipette device, and methods for manipulating biological cells.
  • the perfusion ring is placed with the pipette tip on the bottom of a culture vessel, so that the perfusion ring limits a region of the surface to be treated.
  • the cells can be detached by the enzyme solution and by shearing forces in the liquid.
  • a disadvantage of the method known from DE 197 42 163 may be that the detachment process is substantially dependent on the reaction time of the enzyme solution (incubation time).
  • the required incubation time is variable for different cell types, which makes fast removal of cells difficult. Long exposure times of enzyme solutions can also lead to cell damage.
  • a disadvantage may also be that the detachment process can not be standardized by the variable incubation times (for different cell types).
  • the application of the technique described in DE 197 42 163 is further limited to the fact that only a removal of cells is provided. Further processing of the cells is possible only with a considerable additional effort.
  • DE 101 08 799 A1 describes a process for the introduction of biological or pharmacological material into biological cell material under the action of ultrasonic vibrations.
  • the ultrasonic vibrations induce cavitations, which in cell membranes lead to pores through which the biological or pharmacological material is introduced.
  • the ultrasonic vibrations are generated by a vibrating glass fiber, which runs in a catheter tube and protrudes at the end of the catheter tube. Upon exposure of the glass fiber to ultrasonic vibration generated with an ultrasonic generator separate from the catheter tube, the ultrasonic vibrations propagate in the vicinity of the projecting end of the glass fiber.
  • the technique described in DE 101 08 799 A1 has, as a first disadvantage, that a local action on individual cells or cell groups is virtually impossible, since the ultrasonic waves are radiated on all sides from the end of the glass fiber into the environment.
  • Another disadvantage is the low efficiency of ultrasound generation. Much of the vibrational energy is lost along the length of the fiber.
  • the efficiency of generating ultrasonic waves on the biological material may depend on the position of the catheter tube relative to the vibration generator.
  • the operation of the conventional device is disadvantageous, as an automation, especially under sterile conditions is excluded.
  • the application of the technique according to DE 101 08 799 A1 is restricted to transfection methods.
  • Another general disadvantage of techniques known locally for local perfusion of cells is the occurrence of undesirable dead volumes in the devices used for perfusion. For perfusion, z.
  • dosages in the ⁇ l For treating or detaching cells, dosages in the ⁇ l
  • the invention has for its object to provide improved devices for manipulating biological cells, with which disadvantages in the prior art can be overcome.
  • a further object of the invention is to provide improved methods for manipulating biological cells.
  • the invention is based on the general technical teaching to provide a pipette device comprising a pipette tube and a vibrator, wherein a vibration source of the vibrator is attached to the pipette device and a vibrating element of the vibrator in the pipette tube, in a pipette tip, on the pipette tube is provided and / or arranged in a attached to the pipette tip or the pipette perfusion ring.
  • a compact construction of the vibration device is provided according to the invention, which is used to generate at least one vibration, preferably at least one vibration. raschallschwingung is set up.
  • Both the vibration source (oscillator) and the vibrating element which is arranged to introduce the vibration into an environment of the pipette device and / or into the pipette tip, form a composite with the pipette tube and the pipette tip or with the pipette tube, the pipette tip and the perfusion ring.
  • the composite is advantageously characterized by a simplified handling.
  • the conditions of generation and transmission of the oscillation are constant, so that the pipette device is characterized by stable oscillation parameters.
  • the path between the source of vibration and the location of the transfer of the oscillation into the environment is limited to the dimension of the pipette device, whereby an increased effectiveness of the oscillation generation is achieved.
  • the oscillation is localized to a narrow space.
  • the vibration is limited to an area whose dimension corresponds to the diameter of an outlet opening of the pipette tube or the pipette tip or the diameter of the perfusion ring.
  • a pipette device with a vibrating device results from the possibility, after the detachment of the cells from a cell carrier, of receiving them with the pipette device.
  • the pipette device can advantageously be used both as a separating tool and as a cell receptacle for transferring the cells for a further application or processing.
  • the oscillation is supplied to the surface of the cell carrier in a locally limited subregion (so-called effective region). In the effective range, the cells are exposed to vibrations during operation of the vibration device, while outside the effective range, the cells of the
  • Cell carrier is carried out with at least one component of the pipette device, preferably with the pipette tip or optionally provided perfusion ring.
  • a manipulation device which is set up for manipulating at least one biological cell and comprises the pipette device according to the first aspect of the invention and a positioning device, with which the pipetting device moves with respect to the at least one biological cell, in particular is positionable with respect to a cell carrier for receiving the cell.
  • the combination of the pipette and positioning means allows an accurate and reproducible adjustment of the position of the pipette device and thus the range of the action of the vibration on the cell carrier.
  • the at least one biological cell to be treated is arranged on a cell carrier in a conditioning and / or culture liquid (hereinafter generally referred to as treatment liquid).
  • the cell carrier comprises a solid surface such as a cultivation substrate or the bottom of a culture vessel.
  • the cell carrier may be part of the pipette device, in particular the pipette tip.
  • the invention is based on the general technical teaching to provide a method for manipulating at least one biological cell which is arranged in a liquid on a cell carrier and is treated under the action of a vibration associated with the pipette device according to the above-mentioned first Ge - Viewpoint is generated in a localized portion of the liquid.
  • a treatment of a single cell, a cell within a cell group, a single cell group or a cell group within a larger cell group on the cell carrier may be provided.
  • the invention enables a targeted treatment of one or more cells on surfaces with vibrations, in particular ultrasound.
  • a pipette device is equipped with an additional tool, with which the use of conventional manipulators for the treatment of cells with vibrations is considerably expanded.
  • pipette device (or: “pipette”) is generally referred to a device which is adapted for receiving and / or delivery of fluids from or into open fluid reservoirs.
  • the pipette device allows the recording, the temporary storage and the subsequent delivery of a liquid, which optionally contains at least one suspended cell.
  • the pipette device has a pipette tube and a liquid line (pipette tip), by means of which a fluidic connection with the liquid reservoir can be formed.
  • the pilot Petten having a plurality of pipette tips, which are connected to a common pipette tube.
  • a vibrating element of the vibrating device is preferably arranged in at least one of the pipette tips.
  • vibration is generally referred to herein as an apparatus for generating at least one mechanical vibration.
  • the vibration device has a vibrating element, via which the vibration is transmitted to the environment.
  • Oscillating element is adapted to stimulate a mechanical vibration in a surrounding liquid.
  • the mechanical vibration may generally include vibration at a frequency chosen in the range of infrasound, sound or ultrasound.
  • the vibrating element is arranged to excite an ultrasonic vibration in the surrounding liquid, since with this a particularly high efficiency of the cell treatment can be achieved.
  • the ultrasonic vibration preferably has a frequency in the range of 1 kHz to 1 GHz.
  • the vibration device preferably comprises an ultrasound source.
  • the vibrator is z. B. a piezoelectric vibrator, wherein the vibration source is formed by a piezoelectric body and the vibrating element by a vibration transmitter connected to the piezoelectric body.
  • the vibration transmitter is z. B. a pin for introducing the sound into a liquid or a solid material).
  • the vibrating element is positioned in the region of the pipette tip.
  • the positioning of the vibrating element in the region of the pipette tip becomes a geometric Arrangement referred to, in which the vibrating element is positioned in an immediate vicinity of the wall material of the pipette tip.
  • the vibrating element may contact the wall material of the pipette tip in order to improve the coupling of the vibrations into the wall material.
  • Oscillating element be arranged at a distance from the wall material of the pipette tip, preferably to couple the vibration in the liquid.
  • the vibration can be conducted through the liquid and / or the wall material of the pipette tip at its free end and its surroundings to the cells to be treated.
  • the cells are preferably applied outside the pipette tip with the vibration.
  • the invention makes it possible for the cells in the pipette tip to be subjected to the vibration.
  • the vibration source is arranged on the pipette tube or on the pipette tip or on the optionally provided perfusion ring.
  • the connection of the vibration source with the pipette tube or the perfusion ring is particularly preferred, as this allows an optimal alignment of the vibrating element, which is connected to the vibration source, with respect to the pipette tip.
  • the oscillating element it is possible for the oscillating element to be arranged in the region of the pipette tip at a distance from the pipette tip.
  • the vibrating element When the vibrating element is arranged in the pipette tip, the vibrating element according to a preferred embodiment of the invention is completely received by the pipette tip.
  • the oscillating element is arranged without moving in an axial direction from a free end (pipette outlet opening). stand out) of the pipette tip.
  • the arrangement of the vibrating element in the interior of the pipette tip, the vibrations can be conducted locally in the treatment liquid and to the cells.
  • the effective range is delimited by the damping of the oscillations in the vicinity of the pipette tip, a wall of the pipette tip placed on the cell carrier and / or the perfusion ring attached to the pipette tip.
  • this improves the localization of the vibration effect.
  • the vibration device in particular the vibration source or the vibration element is connected to a coupling device which connects the pipette tip with the pipette tube.
  • the vibration device can thus be arranged in the pipette device so that the vibration source in the pipette tube and the vibration element are positioned in the pipette tip.
  • the source of vibration such as the piezoelectric crystal
  • the vibration device is connected to a holding device which is arranged in the pipette tube.
  • a holding device which is arranged in the pipette tube.
  • the pipetting device can be flexibly adapted to different tasks.
  • Another advantage is the variability of the design of the holding device, the structure of which can be selected depending on the vibration source used.
  • the holding device may preferably comprise one of the following parts or a composition of these parts.
  • the holding device comprises a holding rod, which is fastened in the pipette tube and extends in an axial direction of the pipette tube.
  • the use of the holding rod has the advantage that with this the positioning of the vibration source can be easily adapted to the length of the pipette tube.
  • the holding device comprises a retaining plug.
  • Retaining plug extends in the radial direction over the inner cross section of the pipette tube.
  • the retaining plug in the pipette tube may be located near its distal end, i. H. be positioned near the pipette tip. This allows a reduction of the dead volume in the pipette tube.
  • the holding device may comprise a retaining ring, the inner diameter of which is set up for receiving the vibration source and whose outer diameter corresponds to the inner diameter of the pipette tube. The combination of retaining ring and vibration source can replace a retaining plug accordingly.
  • a composition of said parts may comprise, for example, a retaining plug with a pipette tip holding rod or a retaining plug with a retaining ring or a combination of all three parts. Furthermore, a plurality of said parts, such as a plurality of support rods or a plurality of retaining rings may be provided.
  • the vibration source is vibration-damped attached to the pipette device.
  • a greater proportion of the vibrations generated by the vibration source is conducted from the vibration source via the vibrating element in the vicinity of the pipette device, while only a small fraction Part is transferred to the pipette tube.
  • the oscillation source vibration damped attached to the pipette device in particular in the pipette tube and / or the perfusion ring.
  • an elastically deformable material may be used which is provided on the holding device, in particular on the holding bar, the holding plug and / or the retaining ring.
  • the vibration-damped fixation of the vibration source in the pipette tube by a retaining ring made of elastically deformable material, for. As provided rubber.
  • the pipette device when the pipette device has an inner shape by which the vibration from the vibrating element is directed to the pipette tip and its opening, the effectiveness of the vibration generation and the localization of the vibration effect can be advantageously improved.
  • the directed conduction of the oscillation to the pipette tip is preferably achieved by a tapering inner shape of the pipette tip, the pipette tube and / or the optionally provided perfusion ring.
  • the pipette tube has a conical view approach.
  • the conical projection includes a portion of the pipette tube in which the inner and outer diameters of the pipette tube decrease toward the pipette tip. This allows a simplified recording of the pipette tip on the end of the pipette tube and the provision of the tapering towards the pipette tip inner shape.
  • the focusing of the vibration can be further improved if, according to a further variant of the invention, the pipette device is equipped with a focusing device. equipped.
  • the focusing device With the focusing device, the oscillation in the pipette tip can be focused on its opening.
  • the focusing device comprises, for example, mechanical elements in the pipette tip that are set up for directional conduction of the vibration.
  • the focusing device comprises a surface region of the vibrating element. For example, a sound focusing with a parabolic or spherical surface of the vibrating element can be achieved.
  • the pipette tip of the pipette device according to the invention can optionally be equipped with a perfusion ring.
  • the term "perfusion ring" generally refers to an annular component which radially surrounds the pipette tip and has a sealing bearing surface which can be placed on the cell carrier in the direction of the free end of the pipette tip
  • the perfusion ring is preferably formed as the perfusion ring described in DE 197 42 163 A1 DE 197 42 163 A1 is incorporated by reference into the present description with regard to the construction and handling of the perfusion ring.
  • the perfusion ring advantageously allows a further delimitation of the vibration effect in the vicinity of the pipette tip.
  • the combination of the pipette tip with the perfusion ring makes it possible to simplify the production of cell arrays, since the perfusion ring improves local ultrasound action.
  • the cells can be transfected with the ultrasound treatment according to the invention to a cell carrier locally limited ultrasound-supported.
  • the perfusion ring is releasably attached to the pipette tip.
  • the perfusion ring can be firmly connected to the pipette tip.
  • a detachable compound is PHg, such. B.
  • the advantage of the separability of the perfusion ring from the pipette tip is the flexibility in adapting the pipette device to a specific one
  • the perfusion ring preferably has an inner holding region (tip receptacle) into which the pipette tip can be force-fitted.
  • tip receptacle an inner holding region into which the pipette tip can be force-fitted.
  • the vibrating element can be arranged outside the pipette tip in the perfusion ring. In this case, advantageously results in an enlarged, but sharply demarcated area of the vibration effect on the cell carrier.
  • the vibration source of the vibrator may be attached to the perfusion ring, so that the vibrating element projects into the free interior of the perfusion ring.
  • the vibrating element has a distance both to the pipette tip and to the perfusion ring, so that the vibration is preferably transferred into the liquid on the cell carrier and is supplied to the at least one biological cell on the cell carrier.
  • the pipette outlet opening a lateral opening, such as. B. have a notch, which can fulfill several functions.
  • the lateral opening when the pipette tip is placed with the pipette outlet opening on a cell carrier, cells are taken into the pipette tip and exposed there to the vibration effect.
  • the vibration can preferably be conducted through the lateral opening into the environment.
  • the pipette outlet opening can be obliquely formed relative to the axial longitudinal direction of the pipette tip.
  • the pipette outlet opening has a peripheral edge which extends in a plane which forms an angle not equal to 90 ° with the axis of the pipette tip.
  • the oblique peripheral edge advantageously allows an inclined placement of the pipette device on the cell carrier and thus a directed transmission of the vibration to cells on the cell carrier and a simplified recording of cells that have been detached under the action of the vibration from the cell carrier.
  • the oblique marginal edge at the free end of the pipette tip forms a tip region, with which the pipette tip can be placed on the cell carrier so that no or only a few cells on the cell carrier are injured.
  • the pipette device is equipped with a spring device and / or a metering device.
  • the spring device is preferably attached to the pipette tube.
  • One part of the spring device is firmly connected to the pipette tube, while another, elastically displaceable relative to the pipette tube. res part forms a stop for a force effect, such as a manual actuation force or a driving force of the positioning.
  • a placement force of the pipette device in particular the pipette tip and the optionally provided perfusion ring on the cell carrier can be adjusted.
  • the metering device is set up to fill an interior of the pipette tube and the pipette tip with a working fluid.
  • the volume of the supplied operating fluid can be adjusted.
  • the operating fluid preferably comprises a physiological saline solution, a liquid with at least one enzyme, in particular for the enzymatic degradation adherent to the cell carrier grown cells, and / or a liquid with at least one Schallkontraststoff.
  • this is equipped with a camera device.
  • the camera device is set up to record the pipette device, in particular the pipette tip and / or the optionally provided perfusion ring, and / or the cell carrier.
  • the camera device simplifies the setting of the pipette device with the positioning device.
  • a control device actuates the positioning device as a function of images of the pipette tip, the perfusion ring and / or the cell carrier.
  • Treatment of the cells comprises introduction of at least one active component into the cells (transfection) and / or detachment of the cells Cells from the cell carrier or a cell culture formed on the cell carrier.
  • the invention not only enables the detachment process of cells from the surfaces to be accelerated, but also predetermines arrangements (in particular microarrays) of specifically treated, adherent cells.
  • active component generally refers to a material (eg substance, substance composition or gas bubble) which can be introduced into the cell through a cell membrane and has a predetermined effect in the cell for the further state of the cell (eg, metabolism or cell division) or labeling (detectability) of the cell.
  • the introduction of the active component into the cell preferably takes place by means of a temporary, reversible interruption of the cell membrane (poration).
  • a sound contrast agent is introduced as an active component into the cells.
  • a “sound contrast agent” is generally a material that forms interfaces within the cells with respect to the cell constituents at which a reflection of sound waves occurs
  • Sound contrast agent in the cells adhering to the cell carrier has the advantage that the cells treated with the vibrations can be observed during further manipulation with sound-based detection methods.
  • the sound contrast contains at least one active substance, advantageously in addition to the said marking function of the contrast agent, a second effect, such as. B. an effect on the cell components or metabolism in the cell can be achieved.
  • the sound contrast agent with biological macromolecules, such. As DNA or RNA molecules or components, proteins, peptides, etc. loaded with which advantageously directly cell biological processes can be influenced in the cell.
  • ultrasound contrast agents used according to the invention are: free gas bubbles, precursors of gases, gas bubbles encapsulated by organic or inorganic substances, solutions, colloidal solutions, suspensions,
  • Dispersions ionophores, dissolved microparticles, dissolved polymer spheres, dissolved organic and / or inorganic molecules, sugar-containing solutions, microparticles, ferro- or paramagnetic metals, microaggregates, porous particles of organic and / or inorganic material, lipid-containing
  • Microspheres and / or emulsions wherein the gas bubbles preferably contain air, nitrogen, oxygen, carbon dioxide, fluorinated gas and / or another biocompatible gas.
  • the gas bubbles preferably contain air, nitrogen, oxygen, carbon dioxide, fluorinated gas and / or another biocompatible gas.
  • carbohydrate-based, bubble-forming ultrasound contrast agent such as Levovist (trade name) or Optison (trade name, octafluoropropane gas encapsulated in a human albumin sphere).
  • Levovist trade name
  • Optison trade name, octafluoropropane gas encapsulated in a human albumin sphere.
  • the gas inclusion in these ultrasound contrast agents advantageously leads to an improved power transmission.
  • the particles introduced into the cells as such can have a cell biological effect.
  • the particles carry an active substance, such as. B. the above-mentioned biological macromolecules.
  • at least one active substance can be bound as a layer on the surface of the nanoparticles in order to get into the interior of the cells with the nanoparticles.
  • the at least one vibration in the liquid surrounding the biological cell is generated with an energy such that cavitations occur in the liquid.
  • at least one perforation is formed in the cell membrane, which allows introduction of the sound contrast agent and / or an active substance from the liquid into the cell.
  • a physiological solution containing an enzyme for promoting cell detachment is used as the treatment liquid.
  • the enzyme preferably comprises trypsin or another proteolytic enzyme, such as e.g. Collagenase.
  • the detachment of the cells from the cell carrier takes place without contact, ie exclusively under the effect of the treatment liquid covering the cells on the cell carrier and without contact with solid surfaces of separating tools.
  • the detached cell is free of contact with mechanical tools.
  • the treatment liquid is used to transfer the vibrations to the cells. Under the effect of the vibrations, a separation of the adherent cell contacts with the cell carrier is promoted.
  • the effect The treatment liquid can optionally be increased by creating a perfusion flow.
  • the oscillation element In order to direct the oscillation, in particular the ultrasound, directly from the oscillation element of the oscillation device to the cells, the oscillation element according to a particularly preferred embodiment of the invention is arranged in the pipette device such that the oscillation element is spaced from the pipette tip walls and from the treatment liquid surrounded by the pipette tip.
  • the oscillations can be directed to the cells with the pipette tip placed on the cell carrier.
  • the cells are removed from the cell carrier by the mechanical vibration of the pipette tip.
  • a particularly advantageous embodiment of the invention is characterized by the inclusion of the at least one detached biological cell in the pipette device.
  • a vacuum is formed on the pipette tube and / or the pipette tip, preferably with the metering device, through which liquid with the detached cell is drawn into the pipette tip through the pipette outlet opening.
  • the pipette device thus fulfills a dual function, namely the function of localized application of the biological cell to a vibration and the function of recording the detached cell for further manipulations, such as, for example, transmission to another cell carrier or perfusion.
  • FIG. 1 shows a first embodiment of a pipette device according to the invention
  • FIGS. 2 and 3 variants of the pipette tip of the pipette device according to FIG. 1;
  • FIGS. 4 to 6 further embodiments of the pipette device according to the invention.
  • FIG. 7 shows an embodiment of a manipulation device according to the invention.
  • FIG. 1 shows, in a schematic perspective view, a first embodiment of the pipette device 10 according to the invention with the pipette tip 11, the pipette tube 13 and the pipette tip
  • Vibration device 20 which is arranged in the interior of the pipette device 10, in particular in an inner volume within the pipette tip 11 and / or the pipette tube 13.
  • the pipette tip 11 is connected to the pipette tube 13 by a coupling device 12.
  • the components 11, 12 and 13 in the illustrated embodiment are constructed substantially as known from conventional liquid pipettes.
  • the pipette tip 11 has a shape that tapers from the coupling device 12 to the free end of the pipette tip 11 with the pipette outlet opening 14.
  • the wall material of the pipette tip 11 is z. B. plastic.
  • Typical dimensions of the pipette tip 11 include, for. B: axial length: 5 cm, diameter of the pipette outlet opening 14: 0.1 mm to 2 mm, and diameter at the coupling device 12: 6 mm.
  • the coupling device 12 comprises a connecting piece for the detachable connection of the pipette tip 11 to the pipette tube 13. It is, for example, a screw connection made of plastic provided.
  • the pipette tube 13 includes, for example, a plastic tube or a conduit having a diameter in the range of z. B. 1 mm to 0.3 cm.
  • the vibration device 20 includes as the vibration source 21 an ultrasonic vibrator for generating ultrasound and as a vibrating element 22 a pin or a needle, which is provided for transmitting the ultrasound to the liquid in the pipette tip 11.
  • the Schwingungsquel- Ie 21 is electrically connected via connecting lines 23 to a control device (not shown).
  • the vibration source 21 includes z. B. a piezoelectric crystal, which is adapted to generate ultrasonic vibrations in the range of 0.1 to 3 MHz.
  • the vibrating element 22 is fixedly connected to the vibration source 21.
  • Vibration device 20 is attached to the coupling device 12, so that the pin 22 projects into the inner volume of the pipette tip 11.
  • the oscillating element 22 can have as a focusing device a parabolic or spherical surface region 24 which forms a hollow shape at the tip of the oscillating element 22 (see enlarged partial image in FIG. 1).
  • the hollow surface portion 24 is preferably formed on a surface of the tip or a cylinder having a diameter of at least 10 mm.
  • a preferred variant of the method according to the invention comprises the following steps. First, the pipette device 10 is placed on a cell carrier 70 in the vicinity of the cells 1 to be treated. The cells 1 form on the surface of the cell carrier 70 an adherent cell culture which is covered with a liquid (eg treatment and / or culture liquid, not shown).
  • the pipette device 10 is arranged such that the pipette outlet opening 14 is positioned at a distance from the surface of the cell carrier 70. The distance is selected, for example, in the range of 50 microns to 1 mm. In this state, the pipette tip 11 is immersed in the liquid on the cell carrier 70.
  • the pipette device 10 is actuated in order to suck the liquid into the pipette tip 11.
  • a negative pressure is formed on the pipette tube 13, as is known from conventional pipettes.
  • the volume of the liquid sucked in is selected so that the vibrating element 22 of the vibrating device 20 is at least partially covered with the liquid.
  • the pipette tip 11 is not completely filled, but a distance of the surface 2 of the liquid from the coupling device 12 is formed.
  • the positioning and actuation of the pipette device 10 is carried out with a control device (not shown), as described for example in DE 197 42 163 as a manipulator.
  • DE 197 42 163 A1 is incorporated by reference into the present description with regard to the construction and handling of the manipulator.
  • ultrasonic waves 4 are passed through the liquid within the pipette tip 11 through the pipette outlet opening 14 to the cells 1 and transferred to the surface and its boundary to the cell carrier 70.
  • the pipette tip 11 Localized contact points between the cells and the surface of the cell carrier 70 are loosely localized to a portion of the liquid and the cell carrier 70 so that cells can move freely as detached cells 3 in the liquid layer above the cell carrier 40.
  • the detached cells 3 can be sucked up with the pipette device 10.
  • the pipette outlet opening 14 may be designed in accordance with FIGS. 2 and 3.
  • a lateral opening 15 is provided, through which, when a negative pressure is produced in the pipette device 10, the liquid is sucked into the pipette tip 11.
  • the liquid supply is made possible through the opening 15 without the pipette tip 11 having to be lifted off the surface of the cell carrier 70.
  • the pipette outlet opening 14 has a peripheral edge 16, which is inclined with respect to the axial extent of the pipette tip 11.
  • the peripheral edge 16 forms a tip portion, which may alternatively be used as a mechanical ultrasonic tool acting directly on the cells.
  • FIG. 4 shows a further embodiment of the pipette device 10 according to the invention with the pipette tip 11 and the pipette tube 13.
  • the pipette tube 13 has at its end a conical projection 17 on which the pipette tip 11 can be placed.
  • the pipette tip 11 can form a clamped fit with the projection 17 in the plugged state.
  • the projection 17 and the pipette tip 11 have correspondingly identical outer and inner cone angles and at least one of the parts has an elastic deformable angle. on.
  • the pipette tip 11 can be screwed onto the pipette tube 13 with a coupling device (see FIG. 1).
  • the pipette tip 11 and the pipette tube 13 are shown in the separated state. To connect both parts, the pipette tip 11 is pushed onto the pipette tube 13 (see arrow).
  • the vibration device 20 with the vibration source 21 and the vibration element 22 is arranged with a holding device 30 in the pipette device 10 such that a part of the vibration element 22 projects into the pipette tip 11.
  • the holding device 30 includes a holding rod 31 and a retaining plug 32.
  • the retaining plug 32 is seated in the pipette tube 13, wherein a form or interference fit is formed.
  • the holding rod 31, to which the oscillation source 21 is fixed, is located on the side of the holding stopper 32 facing the pipette tip 11.
  • the holding rod 31 is made, for example, of a plastic or another vibration-damping material, such as silicone rubber, in particular hardened silicon. gum rubber.
  • the retaining plug 32 can perform a multiple function.
  • the pipette tube 13 is sealed at its rear end with the retaining plug 32.
  • the retaining plug 32 can be set up for vibration damping, so that the vibration transmission from the vibration device to the pipette tube 13 is reduced and preferably to the liquid in the pipette tip 11 takes place.
  • the retaining plug 32 preferably consists of an elastically deformable material, for example of foam or silicone rubber. Since the pipette tube 13 is closed on the back by the holding device 30, the embodiment of the pipette device 10 shown in FIG. 4 requires a further component for supplying liquid in the inner volume of the pipette device 10.
  • the pipette device 10 is preferably equipped with a metering device 50. comprising a syringe plunger with a liquid reservoir.
  • the metering device 50 is mounted laterally on the pipette tube 13 and adapted to supply liquid in the pipette tube 13 and the pipette tip 11 upon actuation of the syringe plunger or to form a negative pressure in the inner volume of the pipette device 10.
  • the metering device 50 is shown schematically reduced in size.
  • the syringe piston of the metering device 50 has a volume of, for example, 0.5 ml.
  • the metering device 50 can be operated manually or by a drive device (not shown).
  • the metering device 50 can be actuated automatically, in particular during operation of the manipulation device according to the invention (see FIG. 7).
  • the integration of the holding device 30 in the pipette tube 13 has the further advantage that the dead volume in the inner volume of the pipette device 10 can be reduced. With the metering device 50 smallest fluid volumes can be transferred to the cells to be treated with high accuracy and reproducibility.
  • the holding device 30 may be arranged adjustably in the pipette tube 13.
  • the retaining plug 32 may be connected to the pipette tube 13 via a screw connection.
  • the position of the vibrating element 22 can be changed. It can in particular an immersion depth of the vibrating element 22 varies in a liquid in the pipette tip and the dead volume in the pipette device are minimized.
  • FIGS. 5A and 5B show a further embodiment of the pipette device 10 according to the invention, which is advantageously distinguished by a further reduced dead volume.
  • the pipette device 10 comprises the pipette tip 11 and the pipette tube 13, which form a plug-in or screw connection via the conical projection 17.
  • the vibration device 20 with the vibration source 21 and the vibration element 22 is arranged in the assembled state of the pipette device 10 in the pipette tip 11.
  • the vibrating element 22 comprises a pointed needle, e.g. made of stainless steel.
  • the holding device 30 for positioning the vibrator 20 comprises a holding plug 32 which extends in the pipette tube 13 into the conical projection 17.
  • the retaining plug 32 is fixed in the pipette tube 13 by two retaining rings 33.
  • the retaining rings 33 serve to seal the pipette tube 13 and the vibration damping.
  • the retaining plug 32 includes a plurality of channels 34, 35, as shown schematically in the longitudinal view of Figure 5A and the cross-sectional view of Figure 5B.
  • the channels include the axially extending channels 34, which receive the connecting lines
  • the seals 36 comprise, for example, adhesive, with which the interior of the channels 34 is liquid-tightly separated from the environment.
  • the channels include a radial channel 35 which is adapted for distribution of liquid from the metering device 50 into the pipette tip 11 or to form an air cushion.
  • the retaining plug 32 has at least one lateral recess 37 (see FIG. 5B), with which advantageously the mechanical contact of the retaining plug 32 with the pipette tube 13 is minimized. Accordingly, the vibration transmission to the pipette tube 13 can be minimized.
  • the pipette device 10 which is constructed in accordance with the embodiment with FIG. 4, additionally comprises a spring device 60 with which a placement force can be set with which the pipette device 10 can be placed on the cell carrier 70.
  • the spring device 60 comprises a guide rod 61, which is connected to the rear side of the retaining plug 32 and is designed to guide a propulsion plate 62.
  • the propulsion plate 62 is supported by the retaining plug 32 via a coil spring 63.
  • the propulsion force is partially absorbed by the coil spring 63, so that the force with which the pipette device 10 is placed on the cell carrier 70 is reduced accordingly.
  • damage to the pipette outlet opening of the pipette tip 11 or the optionally provided perfusion ring is thus avoided.
  • a perfusion ring 40 is additionally arranged on the pipette tip 11.
  • the perfusion ring 40 comprises an annular wall 41 with an inner support region 42, which is connected to the annular wall 41 via webs 43.
  • the perfusion ring 40 is z. B. plastic.
  • the pipette tip 11 is inserted into the holding region 42, as described in DE 197 42 163 Al.
  • the oscillation device 20 ' can be arranged such that the oscillation element 22' is arranged outside the pipette tip 11 in the perfusion ring 40 (shown in dashed lines).
  • the vibrating device 20 is attached to the perfusion ring 40 or introduced into the perfusion ring 40 with an additional actuating device (not shown) as a separate component separated from the remaining parts of the pipette device 10.
  • the vibration device may be arranged such that the vibration element is in direct mechanical contact with the wall of the pipette tip 11.
  • FIG. 7 illustrates a preferred embodiment of the manipulation device 100 according to the invention, which comprises the pipette device 10, the positioning device 200 and optionally the camera device 300.
  • the pipette device 10 shown by way of example in connection with the manipulation device 100 in FIG. 7 comprises the pipette tip 11 and the pipette tube 13, which is compactly formed in the region of the conical projection 17, and an axial passage opening 18 for receiving the vibrating element 22 and a radial passage opening 19 for feeding of liquid from the metering device 50. Due to the compact construction of the pipette tube 13 in the region of the conical projection 17, the dead volume is advantageously further reduced.
  • the vibrator 20 includes the vibration source 21, which is mounted with retaining rings 33 in the pipette tube 13.
  • the pipette device 10 comprises, for example, the following dimensions: axial length a of the pipette tip 11: 35 to 40 mm, distance b of the tip of the oscillating element 22 from the pipette outlet 16: 25 to 30 mm, and distance c of the pipette outlet 16 from the cell carrier 70 (operating position for manipulation of biological cells): 0.5 to 1 mm.
  • the positioning device 200 comprises a carrier with which the pipette device 10 is adjustable relative to the cell culture carrier 70. Furthermore, the positioning device 200 may include a drive for the metering device 50. The components 200, 300 and 50 may be controlled by a common controller (not shown).

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Abstract

Eine Pipetteneinrichtung (10) umfasst eine Pipettenspitze (11), ein Pipettenrohr (13) und eine Schwingungseinrichtung (20), die zur Erzeugung von einer Schwingung eingerichtet ist und eine Schwingungsquelle (21) und ein Schwingelement (22) aufweist, wobei die Schwingungsquelle (21) an der Pipetteneinrichtung (10) befestigt und mit dieser beweglich ist, und das Schwingelement (22) im Pipettenrohr (13), in der Pipettenspitze (11) und/oder in einem an der Pipettenspitze (11) vorgesehenen Perfusionsring (40) angeordnet ist. Es werden auch eine Manipulationseinrichtung (100) zur Manipulation biologischer Zellen und ein Verfahren zur Manipulation biologischer Zellen (1) beschrieben, die in einer Flüssigkeit auf einem Zellträger (70) angeordnet sind.

Description

Pipβttenβinrichtung, Manipulationseinrichtung und Verfahren zur Manipulation biologischer Zellen
Die Erfindung betrifft eine Pipetteneinrichtung, die zur Manipulation biologischer Zellen, insbesondere unter Ultraschalleinwirkung, eingerichtet ist, eine Manipulationseinrichtung, die mit einer derartigen Pipetteneinrichtung aus- gestattet ist, und Verfahren zur Manipulation biologischer Zellen.
Es ist allgemein bekannt, Zellen mit einer enzymatisehen Behandlung (z. B. durch Behandlung mit Trypsin) von festen Oberflächen abzulösen. Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es während der Einwirkzeit des Enzyms zu Zellschäden kommen kann. Des weiteren kann, falls nur ein Teil der Zellen aus einer Kultur abgelöst werden soll, die Ablösung nur mit einem erheblichen experimentellen Aufwand auf einen Teilbereich der Oberfläche beschränkt werden, da sich die enzymatische Behandlung typischerweise auf die gesamte Oberfläche z. B. eines Kultivierungssubstrates erstreckt.
Sehr häufig ist jedoch gerade die lokale Ablösung von Zellen (insbesondere Zellklonen) von Oberflächen erwünscht. Dies ist z. B. für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern erforderlich, wenn nur bestimmte antikörperproduzierende Zeilklone aus einer Petrischale entnommen werden sollen. Eine weitere Anwendung betrifft die gezielte Ablösung von transfizierten Zellen aus einem Zellrasen. Auch in diesem Fall ist es vorteilhaft, die ggf. durch einen Marker identifizierten Zellen gezielt aus einem Zellrasen zu entnehmen. In DE 197 42 163 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben, die das lokale Perfundieren von Zellen auf abgegrenzten Oberflächen ermöglichen. Dabei wird zunächst eine Perfusionsflϋssigkeit in eine Pipettenspitze aufgenommen und anschließend ein Perfusionsring auf die Pipettenspitze gesteckt. Der Perfusionsring wird mit der Pipettenspitze auf den Boden eines Kultivierungsgefäßes aufgesetzt, so dass der Perfusionsring einen zu behandelnden Bereich der Oberfläche eingrenzt. Durch Einwirken einer Enzymlösung und eine gleich- zeitige Perfusion des abgegrenzten Bereiches können die Zellen durch die Enzymlösung und durch Scherkräfte in der Flüssigkeit abgelöst werden.
Ein Nachteil des aus DE 197 42 163 bekannten Verfahrens kann darin bestehen, dass der Ablösevorgang wesentlich von der Einwirkzeit der Enzymlösung (Inkubationszeit) abhängig ist. Die erforderliche Inkubationszeit ist für verschiedene Zelltypen variabel, was eine schnelle Entnahme der Zellen erschwert. Durch lange Einwirkzeiten von Enzymlösungen kann es ferner zu Zellschädigungen kommen. Ein Nachteil kann auch darin bestehen, dass durch die variablen Inkubationszeiten (für verschiedene Zelltypen) der Ablöseprozess nicht standardisiert werden kann. Die Anwendung der in DE 197 42 163 beschriebenen Technik ist des Weiteren dahingehend beschränkt, dass ausschließlich eine Entnahme von Zellen vorgesehen ist. Eine weitere Bearbeitung der Zellen ist jedoch nur mit einem erheblichen Zusatzaufwand möglich.
Bei bestimmten Aufgaben in der Zellbiologie kann ein Interes- se an einer lokalen Behandlung der Zellen bestehen, z. B. für das Anfertigen von so genannten Zellarrays, bei denen ein Zellrasen an verschiedenen Stellen behandelt (z. B. transfi- ziert oder Wirkstoffen ausgesetzt) wird. Die Herstellung von Microarrays (siehe z. B. Chiosis et al. in "Trends in Bio- technology", Bd. 23, 2005, S. 271) ist für viele Anwendungen in der Biologie erwünscht.
In DE 101 08 799 Al wird ein Verfahren zur Einführung von biologischem oder pharmakologischem Material in biologisches Zellmaterial unter der Wirkung von Ultraschallschwingungen beschrieben. Die Ultraschallschwingungen induzieren Kavitationen, die in Zellmembranen zu Poren führen, durch die das biologische oder pharmakologische Material eingeschleust wird. Die Ultraschallschwingungen werden durch eine schwingende Glasfaser erzeugt, die in einem Katheterrohr verläuft und am Ende des Katheterrohres vorragt. Bei Beaufschlagung der Glasfaser mit einer Ultraschallschwingung, die mit einem vom Katheterrohr getrennten Ultraschallgenerator erzeugt wird, breiten sich in der Umgebung des vorragenden Endes der Glasfaser die Ultraschallschwingungen aus.
Die in DE 101 08 799 Al beschriebene Technik hat als ersten Nachteil, dass eine lokale Einwirkung auf einzelne Zellen oder Zellgruppen praktisch nicht möglich ist, da die Ultraschallwellen allseitig vom Ende der Glasfaser in die Umgebung abgestrahlt werden. Ein weiterer Nachteil besteht in der geringen Effektivität der Ultraschallerzeugung. Ein großer Teil der Schwingungsenergie geht entlang der Länge der Glasfaser verloren. Des weiteren kann die Wirksamkeit der Erzeugung von Ultraschallwellen am biologischen Material von der Position des Katheterrohrs relativ zum Schwingungsgenerator abhängen. Der Betrieb der herkömmlichen Vorrichtung ist nachteilig, da eine Automatisierbarkeit, insbesondere unter sterilen Bedin- gungen ausgeschlossen ist. Schließlich ist die Anwendung der Technik gemäß DE 101 08 799 Al auf Transfektionsverfahren beschränkt . Ein weiterer genereller Nachteil von aus der Praxis bekannten Techniken zur lokalen Perfusion von Zellen besteht im Auftreten von unerwünschten Totvolumina in den für die Perfusion verwendeten Einrichtungen. Für die Perfusion, z. B. zum Be- handeln oder Ablösen von Zellen sind Dosierungen im μl-
Bereich erforderlich. Die Dosiergenauigkeit ist jedoch erheblich eingeschränkt, wenn Totvolumina auftreten, die ggf. sogar durch Gaspolster gefüllt sind.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Vorrichtungen zur Manipulation biologischer Zellen bereitzustellen, mit denen Nachteile im Stand der Technik überwunden werden können. Der Erfindung liegt des Weiteren die Aufgabe zugrunde, verbesserte Verfahren zur Manipulation biologischer Zellen bereitzustellen.
Diese Aufgaben werden mit einer Pipetteneinrichtung, einer Manipulationseinrichtung und Verfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt basiert die Erfindung auf der allgemeinen technischen Lehre, eine Pipetteneinrichtung bereitzustellen, die ein Pipettenrohr und eine Schwingungseinrichtung aufweist, wobei eine Schwingungsquelle der Schwingungseinrichtung an der Pipetteneinrichtung angebracht ist und ein Schwingelement der Schwingungseinrichtung im Pipettenrohr, in einer Pipettenspitze, die am Pipettenrohr vor- gesehen ist und/oder in einem an der Pipettenspitze oder dem Pipettenrohr befestigten Perfusionsring angeordnet ist. Vorteilhafterweise ist erfindungsgemäß ein kompakter Aufbau der Schwingungseinrichtung vorgesehen, die zur Erzeugung von mindestens einer Schwingung, vorzugsweise mindestens einer UIt- raschallschwingung eingerichtet ist. Sowohl die Schwingungsquelle (Schwingungsgeber) als auch das Schwingelement, das zur Einführung der Schwingung in eine Umgebung der Pipetteneinrichtung und/oder in die Pipettenspitze eingerichtet ist, bilden mit dem Pipettenrohr und der Pipettenspitze oder mit dem Pipettenrohr, der Pipettenspitze und dem Perfusionsring einen Verbund. Der Verbund zeichnet sich vorteilhafterweise durch eine vereinfachte Handhabbarkeit aus. In jeder Betriebsposition der Pipetteneinrichtung sind die Bedingungen der Erzeugung und Übertragung der Schwingung konstant, so dass sich die Pipetteneinrichtung durch stabile Schwingungsparameter auszeichnet. Der Weg zwischen der Schwingungsquelle und dem Ort der Überführung der Schwingung in die Umgebung ist auf die Dimension der Pipetteneinrichtung beschränkt, wo- durch eine erhöhte Effektivität der Schwingungserzeugung erzielt wird. Vorteilhafterweise wird des weiteren durch die Positionierung des Schwingelements im Pipettenrohr oder der Pipettenspitze oder optional im Perfusionsring eine Lokalisierung der Schwingung auf einen eng begrenzten Raum er- reicht. Die Schwingung wird auf einen Bereich begrenzt, dessen Dimension dem Durchmesser einer Austrittsöffnung des Pipettenrohres oder der Pipettenspitze oder dem Durchmesser des Perfusionsrings entspricht.
Ein weiterer wichtiger Vorteil der erfindungsgemäßen Kombination einer Pipetteneinrichtung mit einer Schwingungseinrichtung ergibt sich aus der Möglichkeit, nach der Ablösung der Zellen von einem Zellträger diese mit der Pipetteneinrichtung aufzunehmen. Die Pipetteneinrichtung kann vorteilhafterweise sowohl als Trennwerkzeug als auch als Zellaufnahme zur Überführung der Zellen für eine weitere Anwendung oder Bearbeitung verwendet werden. Erfindungsgemäß wird die Schwingung in einem lokal begrenzten Teilbereich (so genannter Wirkbereich) der Oberfläche des Zellträgers zugeführt. Im Wirkbereich sind die Zellen bei Betrieb der Schwingungseinrichtung den Schwingungen ausgesetzt, während außerhalb des Wirkbereiches die Zellen von den
Schwingungen weniger beeinflusst oder unbeeinflusst bleiben. Vorteilhafterweise kann damit eine lokale, gezielte Beeinflussung adhärent wachsender Zellen erreicht und die Erzeugung von Zell-Arrays verbessert werden. Die Abgrenzung des Wirkbereiches gegenüber anderen Oberflächenbereichen des
Zellträgers erfolgt mit mindestens einer Komponente der Pipetteneinrichtung, vorzugsweise mit der Pipettenspitze oder dem optional vorgesehen Perfusionsring.
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung wird eine Manipulationseinrichtung bereitgestellt, die zur Manipulation mindestens einer biologischen Zelle eingerichtet ist und die Pipetteneinrichtung gemäß dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung und eine Positioniereinrichtung umfasst, mit der die Pi- petteneinrichtung in Bezug auf die mindestens eine biologische Zelle, insbesondere in Bezug auf einen Zellträger zur Aufnahme der Zelle positionierbar ist. Vorteilhafterweise ermöglicht die Kombination der Pipetten- und Positioniereinrichtungen eine genaue und reproduzierbare Einstellung der Position der Pipetteneinrichtung und damit des Bereichs der Einwirkung der Schwingung auf den Zellträger.
Die mindestens eine zu behandelnde biologische Zelle ist auf einem Zellträger in einer Konditionierungs- und/oder Kulti- vierungsflüssigkeit (im folgenden allgemein als Behandlungsflüssigkeit bezeichnet) angeordnet. Der Zellträger umfasst eine feste Oberfläche wie zum Beispiel ein Kultivierungssubstrat oder den Boden eines Kultivierungsgefäßes. Alternativ kann der Zellträger ein Teil der Pipetteneinrichtung, insbesondere der Pipettenspitze sein.
Gemäß einem dritten Gesichtspunkt basiert die Erfindung auf der allgemeinen technischen Lehre, ein Verfahren zur Manipulation mindestens einer biologischen Zelle bereitzustellen, die in einer Flüssigkeit auf einem Zellträger angeordnet ist und unter Wirkung einer Schwingung behandelt wird, die mit der Pipetteneinrichtung gemäß dem oben genannten ersten Ge- Sichtspunkt in einem lokal begrenzten Teilbereich der Flüssigkeit erzeugt wird. Erfindungsgemäß kann eine Behandlung einer einzelnen Zelle, einer Zelle innerhalb einer Zellgruppe, einer einzelnen Zellgruppe oder einer Zellgruppe innerhalb eines größeren Zellverbandes auf dem Zellträger vorgese- hen sein.
Vorteilhafterweise ermöglicht die Erfindung eine gezielte Behandlung von einer oder mehreren Zellen auf Oberflächen mit Schwingungen, insbesondere Ultraschall. Mit der Schwingungs- einrichtung wird eine Pipetteneinrichtung mit einem Zusatzwerkzeug ausgestattet, mit dem die Anwendung herkömmlicher Manipulatoren zur Behandlung der Zellen mit Schwingungen erheblich erweitert wird.
Mit dem Begriff "Pipetteneinrichtung" (oder: "Pipette") wird hier allgemein eine Vorrichtung bezeichnet, die zur Aufnahme und/oder Abgabe von Flüssigkeiten aus oder in offene Flüssigkeitsreservoire eingerichtet ist. Die Pipetteneinrichtung ermöglicht die Aufnahme, die zeitweilige Speicherung und die spätere Abgabe einer Flüssigkeit, die ggf. mindestens eine suspendierte Zelle enthält. Die Pipetteneinrichtung weist ein Pipettenrohr und eine Flüssigkeitsleitung (Pipettenspitze) auf, durch die eine fluidische Verbindung mit dem Flüssigkeitsreservoir gebildet werden kann. Alternativ kann die Pi- petteneinrichtung mehrere Pipettenspitzen aufweisen, die mit einem gemeinsamen Pipettenrohr verbunden sind. In diesem Fall ist vorzugsweise in mindestens einer der Pipettenspitzen ein Schwingelement der Schwingungseinrichtung angeordnet.
Mit dem Begriff "Schwingungseinrichtung" (oder: "Schwingungserzeuger") wird hier allgemein eine Vorrichtung zur Erzeugung mindestens einer mechanischen Schwingung bezeichnet. Die Schwingungseinrichtung weist ein Schwingelement auf, über das die Schwingung in die Umgebung übertragen wird. Das
Schwingelement ist dazu eingerichtet, in einer umgebenden Flüssigkeit eine mechanische Schwingung anzuregen. Die mechanische Schwingung kann allgemein eine Schwingung mit einer Frequenz umfassen, die im Bereich des Infraschalls, Hör- schalls oder Ultraschalls gewählt ist. Vorzugsweise ist das Schwingelement zur Anregung einer Ultraschallschwingung in der umgebenden Flüssigkeit eingerichtet, da mit dieser eine besonders hohe Wirksamkeit der Zellbehandlung erreicht werden kann. Die Ultraschallschwingung weist vorzugsweise eine Fre- quenz im Bereich von 1 kHz bis 1 GHz auf. Entsprechend um- fasst die Schwingungseinrichtung vorzugsweise eine Ultraschallquelle.
Die Schwingungseinrichtung ist z. B. eine piezoelektrische Schwingungseinrichtung, bei welcher die Schwingungsquelle durch einen piezoelektrischen Körper und das Schwingelement durch einen mit dem piezoelektrischen Körper verbundenen Schwingungstransmitter gebildet wird. Der Schwingungstrans- mitter ist z. B. ein Stift zur Einleitung des Schalls in eine Flüssigkeit oder ein festes Material) .
Vorzugsweise ist das Schwingelement im Bereich der Pipettenspitze positioniert. Mit der Positionierung des Schwingelements im Bereich der Pipettenspitze wird eine geometrische Anordnung bezeichnet, bei der das Schwingelement in einer unmittelbaren Umgebung des Wandmaterials der Pipettenspitze positioniert ist. Das Schwingelement kann das Wandmaterial der Pipettenspitze berühren, um die Einkopplung der Schwingungen in das Wandmaterial zu verbessern. Alternativ kann das
Schwingelement mit Abstand von dem Wandmaterial der Pipettenspitze angeordnet sein, um die Schwingung bevorzugt in die Flüssigkeit einzukoppeln. Vorteilhafterweise kann die Schwingung durch die Flüssigkeit und/oder das Wandmaterial der Pi- pettenspitze an deren freies Ende und dessen Umgebung zu den zu behandelnden Zellen geleitet werden. Erfindungsgemäß werden die Zellen vorzugsweise außerhalb der Pipettenspitze mit der Schwingung beaufschlagt. Alternativ ermöglicht die Erfindung, dass die Zellen in der Pipettenspitze mit der Schwin- gung beaufschlagt werden.
Vorteilhafterweise bestehen keine Beschränkungen in Bezug auf den Ort der Befestigung der Schwingungsquelle an der Pipetteneinrichtung. Gemäß bevorzugten Alternativen ist die Schwingungsquelle am Pipettenrohr oder an der Pipettenspitze oder an dem optional vorgesehenen Perfusionsring angeordnet. Besonders bevorzugt ist die Verbindung der Schwingungsquelle mit dem Pipettenrohr oder dem Perfusionsring, da dies eine optimale Ausrichtung des Schwingelements, das mit der Schwin- gungsquelle verbunden ist, in Bezug auf die Pipettenspitze ermöglicht. Es wird insbesondere ermöglicht, dass das Schwingelement im Bereich der Pipettenspitze mit einem Abstand von der Pipettenspitze angeordnet ist.
Wenn das Schwingelement in der Pipettenspitze angeordnet ist, so ist das Schwingelement gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung vollständig von der Pipettenspitze aufgenommen. Das Schwingelement ist angeordnet, ohne in eine axiale Richtung aus einem freien Ende (Pipettenaustrittsöff- nung) der Pipettenspitze herauszuragen. Durch die Anordnung des Schwingelements im Inneren der Pipettenspitze können die Schwingungen lokal in die Behandlungsflüssigkeit und zu den Zellen geleitet werden. Die Abgrenzung des Wirkbereiches er- folgt durch die Dämpfung der Schwingungen in der Umgebung der Pipettenspitze, eine Wand der auf dem Zellträger aufgesetzten Pipettenspitze und/oder den an der Pipettenspitze angebrachten Perfusionsring. Vorteilhafterweise wird damit die Lokalisierung der Schwingungswirkung verbessert.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist die Schwingungseinrichtung, insbesondere die Schwingungsquelle oder das Schwingelement mit einer Kopplungseinrichtung verbunden, welche die Pipettenspitze mit dem Pipettenrohr verbindet. Vorteilhafterweise kann damit die Schwingungseinrichtung so in der Pipetteneinrichtung angeordnet sein, dass die Schwingungsquelle im Pipettenrohr und das Schwingelement in der Pipettenspitze positioniert sind. Im Pipettenrohr ist mehr Platz vorhanden, um die Schwingungsquelle, wie zum Bei- spiel den piezoelektrischen Kristall, vollständig aufzunehmen, während mit dem sich in der Pipettenspitze erstreckenden Schwingelement eine Erzeugung der Schwingung in der Pipettenspitze nahe von deren Öffnung ermöglicht wird.
Gemäß einer alternativen, bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Schwingungseinrichtung mit einer Halteeinrichtung verbunden, die im Pipettenrohr angeordnet ist. Mit dieser Variante der Erfindung kann vorteilhafterweise ein Austausch der Pipettenspitze vereinfacht werden. Die Pipet- teneinrichtung kann flexibel für verschiedene Aufgaben ange- passt werden. Ein weiterer Vorteil besteht in der Variabilität der Gestaltung der Halteeinrichtung, deren Aufbau in Abhängigkeit von der verwendeten Schwingungsquelle gewählt werden kann. Die Halteeinrichtung kann vorzugsweise eines der folgenden Teile oder eine Zusammensetzung aus diesen Teilen umfassen. In einer ersten Variante umfasst die Halteeinrichtung einen Haltestab, der im Pipettenrohr befestigt ist und sich in einer axialen Richtung des Pipettenrohres erstreckt. Die Verwendung des Haltestabes hat den Vorteil, dass mit diesem die Positionierung der Schwingungsquelle leicht an die Länge des Pipettenrohres angepasst werden kann. In einer zweiten Vari- ante umfasst die Halteeinrichtung einen Haltestopfen. Der
Haltestopfen erstreckt sich in radialer Richtung über den Innenquerschnitt des Pipettenrohres. Vorteilhafterweise kann der Haltestopfen im Pipettenrohr in der Nähe von dessen distalem Ende, d. h. in der Nähe der Pipettenspitze positio- niert werden. Dies ermöglicht eine Verringerung des Totvolumens im Pipettenrohr. In einer dritten Variante kann die Halteeinrichtung einen Haltering umfassen, dessen Innendurchmesser zur Aufnahme der Schwingungsquelle eingerichtet ist und dessen Außendurchmesser dem Innendurchmesser des Pipettenroh- res entspricht. Die Kombination aus Haltering und Schwingungsquelle kann entsprechend einen Haltestopfen ersetzen. Eine Zusammensetzung der genannten Teile kann zum Beispiel einen Haltestopfen mit einem zur Pipettenspitze weisenden Haltestab oder einen Haltestopfen mit einem Haltering oder eine Kombination aus allen drei Teilen umfassen. Des weiteren können mehrere der genannten Teile, wie zum Beispiel mehrere Haltestäbe oder mehrere Halteringe vorgesehen sein.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfin- düng ist die Schwingungsquelle schwingungsgedämpft an der Pipetteneinrichtung befestigt. Ein größerer Anteil der mit der Schwingungsquelle erzeugten Schwingungen wird von der Schwingungsquelle über das Schwingelement in die Umgebung der Pipetteneinrichtung geleitet, während nur ein geringer Bruch- teil an das Pipettenrohr übertragen wird. Vorteilhafterweise kann damit die Effektivität der Schwingungserzeugung verbessert werden. Es bestehen verschiedene Varianten, die Schwingungsquelle schwingungsgedämpft an der Pipetteneinrichtung, insbesondere im Pipettenrohr und/oder am Perfusionsring befestigen. Hierzu kann beispielsweise ein elastisch deformierbares Material verwendet werden, das an der Halteeinrichtung, insbesondere an dem Haltestab, dem Haltestopfen und/oder dem Haltering vorgesehen ist. Besonders bevorzugt wird die schwingungsgedämpfte Fixierung der Schwingungsquelle im Pipettenrohr durch einen Haltering aus elastisch deformierbarem Material, z. B. Gummi bereitgestellt.
Wenn gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform in der Erfindung die Pipetteneinrichtung eine Innenform aufweist, durch welche die Schwingung vom Schwingelement zu der Pipettenspitze und deren Öffnung gerichtet wird, kann vorteilhafterweise die Effektivität der Schwingungserzeugung und die Lokalisierung der Schwingungswirkung verbessert werden. Die ge- richtete Leitung der Schwingung zu der Pipettenspitze wird vorzugsweise durch eine sich verjüngende Innenform der Pipettenspitze, des Pipettenrohres und/oder des optional vorgesehenen Perfusionsrings erreicht. Besonders bevorzugt ist eine Variante der Erfindung, bei der das Pipettenrohr einen koni- sehen Ansatz aufweist. Der konische Ansatz umfasst einen Abschnitt des Pipettenrohrs, in dem sich die Innen- und Außendurchmesser des Pipettenrohres hin zur Pipettenspitze verringern. Dies ermöglicht eine vereinfachte Aufnahme der Pipettenspitze auf dem Ende des Pipettenrohres und die Bereitstel- lung der sich zur Pipettenspitze hin verjüngenden Innenform.
Vorteilhafterweise kann die Fokussierung der Schwingung weiter verbessert werden, wenn gemäß einer weiteren Variante der Erfindung die Pipetteneinrichtung mit einer Fokussiereinrich- tung ausgestattet ist. Mit der Fokussiereinrichtung ist die Schwingung in der Pipettenspitze auf deren Öffnung fokussier- bar. Die Fokussiereinrichtung umfasst zum Beispiel mechanische Elemente in der Pipettenspitze, die zur gerichteten Lei- tung der Schwingung eingerichtet sind. Alternativ oder zusätzlich umfasst die Fokussiereinrichtung einen Oberflächenbereich des Schwingelements. Beispielsweise kann eine Schall- fokussierung mit einer parabolisch oder kugelförmig gebildeten Oberfläche des Schwingelements erreicht werden.
Die Pipettenspitze der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung kann optional mit einem Perfusionsring ausgestattet sein. Mit „Perfusionsring" wird allgemein ein ringförmiges Bauteil bezeichnet, das die Pipettenspitze radial umgibt und in Rich- tung des freien Endes der Pipettenspitze eine abdichtende Auflagefläche aufweist, die auf den Zellträger aufsetzbar ist. Mit dem Perfusionsring wird um die Pipettenspitze ein Behandlungsvolumen geschaffen, auf das die erfindungsgemäße Schallbehandlung lokal begrenzt wird. Der Perfusionsring ist vorzugsweise so gebildet, wie der in DE 197 42 163 Al beschriebene Perfusionsring. DE 197 42 163 Al wird hinsichtlich des Aufbaus und der Handhabung des Perfusionsrings durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung eingeführt.
Der Perfusionsring ermöglicht vorteilhafterweise eine weitere Abgrenzung der Schwingungswirkung in der Umgebung der Pipettenspitze. Die Kombination der Pipettenspitze mit dem Perfusionsring ermöglicht insbesondere, dass die Herstellung von Zellarrays vereinfacht wird, da mit dem Perfusionsring die lokale Ultraschalleinwirkung verbessert wird. Die Zellen können mit der erfindungsgemäßen Schallbehandlung auf einen Zellträger lokal begrenzt Ultraschall-gestützt transfiziert werden. Vorzugsweise ist der Perfusionsring an der Pipettenspitze lösbar befestigt. Erfindungsgemäß kann der Perfusionsring mit der Pipettenspitze fest verbunden sein. Gemäß einer bevorzugten Variante der Erfindung ist jedoch eine lösbare Verbin- düng, wie z. B. eine Steckverbindung vorgesehen, um den Perfusionsring bei Bedarf an die Pipettenspitze aufzustecken o- der nach der Schallbehandlung der Zellen von der Pipettenspitze zu trennen. Der Vorteil der Trennbarkeit des Perfusionsrings von der Pipettenspitze besteht in der Flexibilität bei der Anpassung der Pipetteneinrichtung an eine konkrete
Anwendung. Vorzugsweise weist der Perfusionsring einen inneren Halterungsbereich (Spitzenaufnahme) auf, in den die Pipettenspitze kraftschlüssig einsteckbar ist. Mit der Bereitstellung der Spitzenaufnahme wird die schnelle Verbindung und Trennung des Perfusionsrings und der Pipettenspitze vereinfacht.
Wenn die Pipetteneinrichtung mit dem Perfusionsring ausgestattet ist, kann gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfüh- rungsform der Erfindung das Schwingelement außerhalb der Pipettenspitze im Perfusionsring angeordnet sein. In diesem Fall ergibt sich vorteilhafterweise ein vergrößerter, jedoch scharf abgegrenzter Bereich der Schwingungswirkung auf dem Zellträger. Beispielsweise kann die Schwingungsquelle der Schwingungseinrichtung am Perfusionsring befestigt sein, so dass das Schwingelement in den freien Innenraum des Perfusionsrings ragt. Vorzugsweise hat das Schwingelement einen Abstand sowohl zur Pipettenspitze als auch zum Perfusionsring, so dass die Schwingung bevorzugt in die Flüssigkeit auf dem Zellträger übertragen und auf die mindestens eine biologische Zelle auf dem Zellträger zugeführt wird.
Weitere Vorteile für die Anpassung der Pipetteneinrichtung an konkrete Anforderungen der Manipulation einer biologischen Zelle werden erzielt, wenn die Übertragung der Schwingung vom Schwingelement in die Umgebung durch die Form des freien Endes der Pipettenspitze beeinflusst wird. Beispielsweise kann die Pipettenaustrittsöffnung eine seitliche Öffnung, wie z. B. eine Einkerbung aufweisen, die mehrere Funktionen erfüllen kann. Durch die seitliche Öffnung können, wenn die Pipettenspitze mit der Pipettenaustrittsöffnung auf einem Zellträger aufgesetzt ist, Zellen in die Pipettenspitze aufgenommen und dort der Schwingungswirkung ausgesetzt werden. Des weiteren kann die Schwingung bevorzugt durch die seitliche Öffnung in die Umgebung geleitet werden.
Gemäß einer weiteren Variante der Erfindung kann die Pipettenaustrittsöffnung relativ zur axialen Längsrichtung der Pi- pettenspitze schräg gebildet sein. Die Pipettenaustrittsöffnung weist eine Randkante auf, die in einer Ebene verläuft, die mit der Achse der Pipettenspitze einen Winkel ungleich 90° bildet. Die schräge Randkante ermöglicht vorteilhafterweise ein geneigtes Aufsetzen der Pipetteneinrichtung auf den Zellträger und damit eine gerichtete Übertragung der Schwingung auf Zellen auf dem Zellträger und eine vereinfachte Aufnahme von Zellen, die unter der Wirkung der Schwingung vom Zellträger abgelöst wurden. Vorzugsweise bildet die schräge Randkante am freien Ende der Pipettenspitze einen Spitzenbe- reich, mit dem die Pipettenspitze auf den Zellträger aufgesetzt werden kann, so dass keine oder nur wenige Zellen auf dem Zellträger verletzt werden.
Gemäß weiteren bevorzugten Merkmalen ist die erfindungsgemäße Pipetteneinrichtung mit einer Federeinrichtung und/oder einer Dosiereinrichtung ausgestattet. Die Federeinrichtung ist vorzugsweise an dem Pipettenrohr angebracht. Ein Teil der Federeinrichtung ist mit dem Pipettenrohr fest verbunden, während ein anderes, relativ zum Pipettenrohr elastisch verschiebba- res Teil einen Anschlag für eine Kraftwirkung, wie zum Beispiel eine manuelle Betätigungskraft oder eine Antriebskraft der Positioniereinrichtung bildet. Mit der Federeinrichtung ist eine Aufsetzkraft der Pipetteneinrichtung, insbesondere der Pipettenspitze und des optional vorgesehenen Perfusionsrings auf dem Zellträger einstellbar. Die Dosiereinrichtung ist zur Befüllung eines Innenraums des Pipettenrohres und der Pipettenspitze mit einer Betriebsflüssigkeit eingerichtet. Vorteilhafterweise kann mit der Dosiereinrichtung das Volumen der zugeführten Betriebsflüssigkeit eingestellt werden. Die Betriebsflüssigkeit umfasst vorzugsweise eine physiologische Salzlösung, eine Flüssigkeit mit mindestens einem Enzym, insbesondere zum enzymatischen Abbau adhärent auf dem Zellträger gewachsener Zellen, und/oder eine Flüssigkeit mit mindestens einem Schallkontrastmittel.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Manipulationseinrichtung ist diese mit einer Kameraeinrichtung ausgestattet. Die Kameraeinrichtung ist zur Bildaufnahme der Pipetteneinrichtung, insbesondere der Pipettenspitze und/oder des optional vorgesehenen Perfusionsringes, und/oder des Zellträgers eingerichtet. Die Kameraeinrichtung vereinfacht die Einstellung der Pipetteneinrichtung mit der Positioniereinrichtung. Insbesondere wird ein automatisierter Be- trieb der Manipulationseinrichtung ermöglicht, bei dem eine Steuereinrichtung in Abhängigkeit von Bildern der Pipettenspitze, des Perfusionsringes und/oder des Zellträgers die Positioniereinrichtung ansteuert.
Ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung besteht in der Variabilität der möglichen Schwingungsbehandlungen. Die Behandlung der Zellen umfasst gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung eine Einführung mindestens einer Wirkkomponente in die Zellen (Transfektion) und/oder eine Ablösung der Zellen vom Zellträger oder einer auf dem Zellträger gebildeten Zellkultur. Mit der Erfindung wird nicht nur ermöglicht, dass der Ablösevorgang von Zellen von den Oberflächen beschleunigt wird, sondern dass auch vorbestimmte Anordnungen (insbesondere Mikroarrays) von spezifisch behandelten, adhä- renten Zellen erzeugt werden.
Mit dem Begriff "Wirkkomponente" wird hier allgemein ein Material (z. B. Substanz, Substanz-Zusammensetzung oder Gasblä- sehen) bezeichnet, das durch eine Zellmembran in die Zelle einführbar ist und in der Zelle eine vorbestimmte Wirkung für den weiteren Zustand der Zelle (z. B. den Stoffwechsel oder die Zellteilung) oder eine Markierung (Nachweisbarkeit) der Zelle hat. Die Einführung der Wirkkomponente in die Zelle er- folgt vorzugsweise durch eine vorübergehende, reversible Unterbrechung der Zellmembran (Poration) .
Gemäß einer bevorzugten Variante der Erfindung wird ein Schallkontrastmittel als Wirkkomponente in die Zellen einge- führt. In diesem Fall können sich Vorteile für eine Beobachtung der Zelle mit einem bildgebenden Verfahren unter Verwendung von Ultraschall ergeben. Ein „Schallkontrastmittel" ist allgemein ein Material, das im Innern der Zellen in Bezug auf die Zellbestandteile Grenzflächen bildet, an denen eine Re- flektion von Schallwellen erfolgt. Die Transfektion eines
Schallkontrastmittels in die adhärent auf dem Zellträger angeordneten Zellen hat den Vorteil, dass die mit den Schwingungen behandelten Zellen bei der weiteren Manipulation mit schallbasierten Nachweisverfahren beobachtet werden können.
Besonders bevorzugt ist die Einführung eines mit mindestens einer Wirksubstanz beladenen Schallkontrastmittels, das zusätzlich zur Kontrastfunktion eine Transportfunktion erfüllt. Wenn gemäß dieser Variante der Erfindung das Schallkontrast- mittel mindestens eine Wirksubstanz enthält, kann vorteilhafterweise neben der genannten Markierungsfunktion des Kontrastmittels eine zweite Wirkung, wie z. B. eine Beeinflussung der Zellbestandteile oder des Stoffwechsels in der Zelle erreicht werden. Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform der Erfindung, bei der das Schallkontrastmittel mit biologischen Makromolekülen, wie z. B. DNS- oder RNS-Molekülen oder -Bestandteilen, Proteinen, Peptiden etc. beladen wird, mit denen vorteilhafterweise direkt zellbiologische Vorgänge in der Zelle beeinflusst werden können.
Beispiele für erfindungsgemäß verwendete Ultraschallkontrastmittel sind: freie Gasbläschen, Vorläufersubstanzen von Gasen, von organischen oder anorganischen Substanzen umkapselte Gasbläschen, Lösungen, kolloidale Lösungen, Suspensionen,
Dispersionen, Ionophoren, gelöste Mikropartikel, gelöste Polymer-Sphären, gelöste organische und/oder anorganische Moleküle, zuckerhaltige Lösungen, Mikropartikel, ferro- oder paramagnetische Metalle, Mikroaggregate, poröse Partikel von organische und/oder anorganischem Material, lipidhaltigen
Mikrosphären und/oder Emulsionen, wobei die Gasbläschen vorzugsweise Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid, fluoriertes Gas und/oder ein anderes biokompatibles Gas enthalten. Erfindungsgemäß werden besonders bevorzugt kohlenhydrat- basierte, Bläschen bildende Ultraschallkontrastmittel, wie z. B. Levovist (Handelsbezeichnung) oder Optison (Handelsbezeichnung, Octafluoropropangas verkapselt in einer Sphäre aus humanem Albumin) verwendet. Der Gaseinschluss in diesen Ultraschallkontrastmitteln führt vorteilhafterweise zu einer verbesserten Kraftübertragung.
Erfindungsgemäß können die in die Zellen eingeführten Partikel als solche eine zellbiologische Wirkung haben. Besonders bevorzugt ist jedoch eine Ausführungsform der Erfindung, bei der die Partikel eine Wirksubstanz tragen, wie z. B. die oben genannten biologischen Makromoleküle. Mindestens eine Wirksubstanz kann beispielsweise als Schicht auf der Oberfläche der Nanopartikel gebunden sein, um mit den Nanopartikeln in das Innere der Zellen zu gelangen.
Vorzugsweise wird die mindestens eine Schwingung in der Flüssigkeit, welche die biologische Zelle umgibt, mit einer Energie derart erzeugt, dass in der Flüssigkeit Kavitationen auf- treten. Vorteilhafterweise wird in der Zellmembran mindestens eine Perforation gebildet, die eine Einführung des Schallkontrastmittels und/oder einer Wirksubstanz von der Flüssigkeit in die Zelle ermöglicht.
Wenn die erfindungsgemäße Zellbehandlung eine Ablösung der
Zellen vom Zellträger umfasst, wird gemäß einer weiteren bevorzugten Variante der Erfindung als Behandlungsflüssigkeit eine physiologische Lösung verwendet, die ein Enzym zur Förderung der Zellablösung enthält. Das Enzym umfasst vorzugs- weise Trypsin oder ein anderes proteolytisches Enzym, wie z. B. Kollagenase. Durch den Enzymzusatz wird die Schallwirkung unterstützt, so dass der Ablösungsvorgang vorteilhafterweise beschleunigt wird.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Ablösung der Zellen vom Zellträger berührungslos, d. h. ausschließlich unter der Einwirkung der auf dem Zellträger die Zellen überdeckenden Behandlungsflüssigkeit und ohne Kontakt mit festen Oberflächen von Trennwerk- zeugen. Die abgelöste Zelle ist frei von Berührungen durch mechanische Werkzeuge. Die Behandlungsflüssigkeit wird zur Übertragung der Schwingungen auf die Zellen verwendet. Unter der Wirkung der Schwingungen wird eine Abtrennung der adhä- renten Zellkontakte mit dem Zellträger gefördert. Die Wirkung der Behandlungsflüssigkeit kann optional gesteigert werden, indem eine Perfusionsströmung erzeugt wird. Um die Schwingung, insbesondere den Ultraschall unmittelbar von dem Schwingelement der Schwingungseinrichtung zu den Zellen zu leiten, ist das Schwingelement gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in der Pipetteneinrichtung so angeordnet, dass das Schwingelement einen Abstand von Wänden der Pipettenspitze aufweist und von der Behandlungsflüssigkeit in der Pipettenspitze umgeben ist.
Alternativ können die Schwingungen mit der auf den Zellträger aufgesetzten Pipettenspitze direkt auf die Zellen geleitet werden. Die Zellen werden in diesem Fall durch die mechanische Schwingung der Pipettenspitze vom Zellträger abgezogen.
Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung zeichnet sich durch die Aufnahme der mindestens einen abgelösten biologischen Zelle in die Pipetteneinrichtung aus. Am Pipettenrohr und/oder der Pipettenspitze wird, vorzugsweise mit der Dosiereinrichtung ein Unterdruck gebildet, durch den Flüssigkeit mit der abgelösten Zelle durch die Pipettenaustrittsöffnung in die Pipettenspitze eingesogen wird. Vorteilhafterweise erfüllt die Pipetteneinrichtung somit eine Doppelfunktion, nämlich die Funktion der lokal begrenzten Beauf- schlagung der biologischen Zelle mit einer Schwingung und die Funktion der Aufnahme der abgelösten Zelle für weitere Manipulationen, wie zum Beispiel eine Übertragung zu einem anderen Zellträger oder eine Perfusion.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindungen werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ersichtlich, die in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind. Es zeigen: Figur 1 eine erste Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung;
Figuren 2 und 3: Varianten der Pipettenspitze der Pipetten- einrichtung gemäß Figur 1;
Figuren 4 bis 6: weitere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung; und
Figur 7: eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Manipulationseinrichtung.
Figur 1 zeigt in schematischer Perspektivansicht eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10 mit der Pipettenspitze 11, dem Pipettenrohr 13 und der
Schwingungseinrichtung 20, die im Inneren der Pipetteneinrichtung 10, insbesondere in einem inneren Volumen innerhalb der Pipettenspitze 11 und/oder des Pipettenrohrs 13 angeordnet ist. Die Pipettenspitze 11 ist durch eine Kopplungsein- richtung 12 mit dem Pipettenrohr 13 verbunden. Die Komponenten 11, 12 und 13 sind bei der dargestellten Ausführungsform im wesentlichen so aufgebaut, wie es von herkömmlichen Flüssigkeitspipetten bekannt ist.
Die Pipettenspitze 11 hat eine Form, die sich von der Kopplungseinrichtung 12 zum freien Ende der Pipettenspitze 11 mit der Pipettenaustrittsöffnung 14 verjüngt. Das Wandmaterial der Pipettenspitze 11 besteht z. B. aus Kunststoff. Typische Dimensionen der Pipettenspitze 11 umfassen z. B.: axiale Län- ge: 5 cm, Durchmesser der Pipettenaustrittsöffnung 14: 0.1 mm bis 2 mm, und Durchmesser an der Kopplungseinrichtung 12: 6 mm. Die Kopplungseinrichtung 12 umfasst ein Verbindungsstück zur lösbaren Verbindung der Pipettenspitze 11 am Pipettenrohr 13. Es ist beispielsweise eine Schraubverbindung aus Kunst- stoff vorgesehen. Das Pipettenrohr 13 umfasst beispielsweise ein Kunststoffrohr oder eine Leitung mit einem Durchmesser im Bereich von z. B. 1 mm bis 0.3 cm.
Die Schwingungseinrichtung 20 umfasst als Schwingungsquelle 21 einen Ultraschallschwinger zur Erzeugung von Ultraschall und als Schwingelement 22 einen Stift oder eine Nadel, der oder die zur Übertragung des Ultraschalls auf die Flüssigkeit in der Pipettenspitze 11 vorgesehen ist. Die Schwingungsquel- Ie 21 ist über Verbindungsleitungen 23 elektrisch mit einer Steuereinrichtung (nicht dargestellt) verbunden. Die Schwingungsquelle 21 umfasst z. B. einen piezoelektrischen Kristall, der zur Erzeugung von Ultraschallschwingungen im Bereich von 0.1 bis 3 MHz eingerichtet ist. Das Schwingelement 22 ist mit der Schwingungsquelle 21 fest verbunden. Die
Schwingungseinrichtung 20 ist an der Kopplungseinrichtung 12 befestigt, so dass der Stift 22 in das innere Volumen der Pipettenspitze 11 ragt.
Das Schwingelement 22 kann als Fokussiereinrichtung einen parabolischen oder kugelförmigen Oberflächenbereich 24 aufweisen, der an der Spitze des Schwingelements 22 eine Hohlform bildet (siehe vergrößertes Teilbild in Figur 1) . Der hohlför- mige Oberflächenbereich 24 ist vorzugsweise an einer Oberflä- che der Spitze oder eines Zylinders mit einem Durchmesser von mindestens 10 mm gebildet.
Eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die folgenden Schritte. Zuerst wird die Pipettenein- richtung 10 in der Nähe der zu behandelnden Zellen 1 auf einen Zellträger 70 aufgesetzt. Die Zellen 1 bilden auf der Oberfläche des Zellträgers 70 eine adhärente Zellkultur, die mit einer Flüssigkeit (z. B. Behandlungs- und/oder Kultivierungsflüssigkeit, nicht dargestellt) überdeckt ist. Bei der in Figur 1 dargestellten Variante der Erfindung wird die Pipetteneinrichtung 10 so angeordnet, dass die Pipettenaustrittsöffnung 14 mit einem Abstand von der Oberfläche des Zellträgers 70 positioniert ist. Der Abstand wird beispielsweise im Bereich von 50 μm bis 1 mm gewählt. In diesem Zustand ist die Pipettenspitze 11 in die Flüssigkeit auf dem Zellträger 70 eingetaucht.
Anschließend wird die Pipetteneinrichtung 10 betätigt, um die Flüssigkeit in die Pipettenspitze 11 einzusaugen. Hierzu wird am Pipettenrohr 13 ein Unterdruck gebildet, wie es von herkömmlichen Pipetten bekannt ist. Das Volumen der eingesaugten Flüssigkeit wird so gewählt, dass das Schwingelement 22 der Schwingungseinrichtung 20 mit der Flüssigkeit zumindest teilweise bedeckt ist. Vorzugsweise wird die Pipettenspitze 11 nicht vollständig gefüllt, sondern ein Abstand der Oberfläche 2 der Flüssigkeit von der Kopplungseinrichtung 12 gebildet. Dadurch kann vorteilhafterweise die bevorzugte Einleitung des Ultraschalls in die Flüssigkeit und die gezielte Übertragung des Ultraschalls zu den Zellen 1 verbessert werden.
Die Positionierung und Betätigung der Pipetteneinrichtung 10 erfolgt mit einer Steuereinrichtung (nicht dargestellt) , wie sie beispielsweise in DE 197 42 163 als ein Manipulator beschrieben ist. DE 197 42 163 Al wird hinsichtlich des Aufbaus und der Handhabung des Manipulators durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung eingeführt.
Bei Betätigung der Schwingungseinrichtung 20 werden Ultraschallwellen 4 durch die Flüssigkeit innerhalb der Pipettenspitze 11 durch die Pipettenaustrittsöffnung 14 zu den Zellen 1 geleitet und auf deren Oberfläche und deren Grenze zum Zellträger 70 übertragen. Durch die mit der Pipettenspitze 11 auf einen Teilbereich der Flüssigkeit und des Zellträgers 70 begrenzte Beaufschlagung mit den Ultraschallwellen werden lokal Kontaktstellen zwischen den Zellen und der Oberfläche des Zellträgers 70 gelöst, so dass sich Zellen als abgelöste ZeI- len 3 in der Flüssigkeitsschicht über dem Zellträger 40 frei bewegen können. Im weiteren Verfahren können die abgelösten Zellen 3 mit der Pipetteneinrichtung 10 aufgesaugt werden.
Um die Aufnahme der Zellen in die Pipettenspitze 11 zu er- leichtern oder die Lokalisierung des Ultraschalls auf einen bestimmten geometrischen Bereich zu verbessern, kann die Pipettenaustrittsöffnung 14 gemäß den Figuren 2 und 3 gestaltet sein. Gemäß Figur 2 ist eine seitliche Öffnung 15 vorgesehen, durch die bei Erzeugung eines Unterdrucks in der Pipettenein- richtung 10 die Flüssigkeit in die Pipettenspitze 11 eingesaugt wird. Die Flüssigkeitszufuhr wird durch die Öffnung 15 ermöglicht, ohne dass die Pipettenspitze 11 von der Oberfläche des Zellträgers 70 abgehoben werden muss. Gemäß Figur 3 weist die Pipettenaustrittsöffnung 14 einen Umfangsrand 16 auf, der gegenüber der axialen Ausdehnung der Pipettenspitze 11 geneigt ist. Der Umfangsrand 16 bildet einen Spitzenbereich, der alternativ als unmittelbar auf die Zellen einwirkendes mechanisches Ultraschall-Werkzeug verwendet werden kann.
Figur 4 zeigt eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10 mit der Pipettenspitze 11 und dem Pipettenrohr 13. Das Pipettenrohr 13 weist an seinem Ende einen konischen Ansatz 17 auf, auf dem die Pipettenspitze 11 aufsteckbar ist. Die Pipettenspitze 11 kann im aufgesteckten Zustand mit dem Ansatz 17 eine Klemmpassung bilden. Zur Bildung der Klemmpassung weisen der Ansatz 17 und die Pipettenspitze 11 entsprechend gleiche äußere und innere Konuswinkel und mindestens eines der Teile eine elastische Deformierbar- keit auf. Alternativ oder zusätzlich kann die Pipettenspitze 11 mit einer Kopplungseinrichtung (siehe Figur 1) auf dem Pipettenrohr 13 festgeschraubt sein. In Figur 4 sind die Pipettenspitze 11 und das Pipettenrohr 13 im getrennten Zustand gezeigt. Zur Verbindung beider Teile wird die Pipettenspitze 11 auf das Pipettenrohr 13 aufgeschoben (siehe Pfeil) .
Die Schwingungseinrichtung 20 mit der Schwingungsquelle 21 und dem Schwingelement 22 ist mit einer Halteeinrichtung 30 so in der Pipetteneinrichtung 10 angeordnet, dass ein Teil des Schwingelements 22 in die Pipettenspitze 11 ragt. Die Halteeinrichtung 30 umfasst einen Haltestab 31 und einen Haltestopfen 32. Der Haltestopfen 32 sitzt im Pipettenrohr 13, wobei eine Form- oder Presspassung gebildet ist. Der Halte- stab 31, an dem die Schwingungsquelle 21 fixiert ist, steckt auf der zur Pipettenspitze 11 weisenden Seite des Haltestopfens 32. Der Haltestab 31 besteht zum Beispiel aus einem Kunststoff oder einem anderen schwingungsdämpfenden Material, wie zum Beispiel Silikongummi, insbesondere gehärteter SiIi- kongummi .
Vorteilhafterweise kann der Haltestopfen 32 eine Mehrfachfunktion erfüllen. Neben der Haltefunktion für die Schwingungseinrichtung 20 wird das Pipettenrohr 13 an seinem rück- seitigen Ende mit dem Haltestopfen 32 dicht verschlossen. Des weiteren kann der Haltestopfen 32 zur Schwingungsdämpfung eingerichtet sein, so dass die Schwingungsübertragung von der Schwingungseinrichtung auf das Pipettenrohr 13 vermindert wird und bevorzugt zu der Flüssigkeit in der Pipettenspitze 11 erfolgt. Für die Abdichtungs- und Schwingungsdämpfungs- funktionen besteht der Haltestopfen 32 vorzugsweise aus einem elastisch deformierbaren Material, zum Beispiel aus Schaumstoff oder Silikongummi. Da das Pipettenrohr 13 durch die Halteeinrichtung 30 rückseitig verschlossen ist, erfordert die in Figur 4 gezeigte Ausführungsform der Pipetteneinrichtung 10 eine weitere Komponente zur Flüssigkeitszufuhr im inneren Volumen der Pipetten- einrichtung 10. Für diese Funktion ist die Pipetteneinrichtung 10 vorzugsweise mit einer Dosiereinrichtung 50 ausgestattet, die einen Spritzenkolben mit einem Flüssigkeitsreservoir umfasst. Die Dosiereinrichtung 50 ist seitlich am Pipettenrohr 13 angebracht und dazu eingerichtet, bei Betätigung des Spritzenkolbens Flüssigkeit in das Pipettenrohr 13 und die Pipettenspitze 11 zuzuführen oder im inneren Volumen der Pipetteneinrichtung 10 einen Unterdruck zu bilden. Aus Übersichtlichkeitsgründen ist die Dosiereinrichtung 50 schematisch verkleinert dargestellt. In der Praxis weist der Sprit- zenkolben der Dosiereinrichtung 50 ein Volumen von zum Beispiel 0,5 ml auf. Die Dosiereinrichtung 50 kann manuell oder durch eine Antriebseinrichtung (nicht dargestellt) betätigt werden. Die Dosiereinrichtung 50 kann insbesondere bei Betrieb der erfindungsgemäßen Manipulationseinrichtung (siehe Figur 7) automatisiert betätigt werden.
Die Integration der Halteeinrichtung 30 in das Pipettenrohr 13 hat den weiteren Vorteil, dass das Totvolumen im Innenvolumen der Pipetteneinrichtung 10 verkleinert werden kann. Mit der Dosiereinrichtung 50 können kleinste Flüssigkeitsvolumina mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auf die zu behandelnden Zellen übertragen werden.
Gemäß einer weiteren Alternative kann die Halteeinrichtung 30 im Pipettenrohr 13 verstellbar angeordnet sein. Beispielsweise kann der Haltestopfen 32 über eine Schraubverbindung mit dem Pipettenrohr 13 verbunden sein. Vorteilhafterweise kann dadurch die Position des Schwingelements 22 verändert werden. Es kann insbesondere eine Eintauchtiefe des Schwingelements 22 in eine Flüssigkeit in der Pipettenspitze variiert und das Totvolumen in der Pipetteneinrichtung minimiert werden.
Die Figuren 5A und 5B zeigen eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10, die sich vorteilhafterweise durch ein weiter verringertes Totvolumen auszeichnet. Die Pipetteneinrichtung 10 umfasst die Pipettenspitze 11 und das Pipettenrohr 13, die über den konischen Ansatz 17 eine Steck- oder Schraubverbindung bilden. Die Schwingungseinrichtung 20 mit der Schwingungsquelle 21 und dem Schwingelement 22 ist im zusammengesetzten Zustand der Pipetteneinrichtung 10 in der Pipettenspitze 11 angeordnet. Das Schwingelement 22 umfasst eine spitz auslaufende Nadel, z.B. aus Edelstahl.
Die Halteeinrichtung 30 zur Positionierung der Schwingungseinrichtung 20 umfasst einen Haltestopfen 32, der sich im Pipettenrohr 13 bis in den konischen Ansatz 17 erstreckt. Der Haltestopfen 32 wird im Pipettenrohr 13 durch zwei Halteringe 33 fixiert. Die Halteringe 33 dienen der Abdichtung des Pipettenrohres 13 und der Schwingungsdämpfung. Im Haltestopfen 32 sind mehrere Kanäle 34, 35 enthalten, wie schematisch in der Längsansicht der Figur 5A und der Querschnittsansicht der Figur 5B gezeigt ist. Die Kanäle umfassen die axial verlau- fenden Kanäle 34, die zur Aufnahme der Verbindungsleitungen
23 der Schwingungsquelle 21 eingerichtet und zur Rückseite des Pipettenrohrs 13 mit Dichtungen 36 verschlossen sind. Die Dichtungen 36 umfassen zum Beispiel Klebstoff, mit dem das Innere der Kanäle 34 flüssigkeitsdicht von der Umgebung ge- trennt wird. Des weiteren umfassen die Kanäle einen radialen Kanal 35, der für eine Verteilung von Flüssigkeit von der Dosiereinrichtung 50 in die Pipettenspitze 11 oder zur Bildung eines Luftpolsters eingerichtet ist. Der Haltestopfen 32 weist mindestens eine seitliche Ausnehmung 37 (siehe Figur 5B) auf, mit der vorteilhafterweise der mechanische Kontakt des Haltestopfens 32 mit dem Pipettenrohr 13 minimiert wird. Entsprechend kann die Schwingungsübertragung zum Pipettenrohr 13 minimiert werden.
Eine weitere Abwandlung der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10 ist in Figur 6 gezeigt. Die Pipetteneinrichtung 10, die entsprechend der Ausführungsform mit Figur 4 aufge- baut ist, umfasst zusätzlich eine Federeinrichtung 60, mit der eine Aufsetzkraft einstellbar ist, mit der die Pipetteneinrichtung 10 auf dem Zellträger 70 aufsetzbar ist. Die Federeinrichtung 60 umfasst einen Führungsstab 61, der mit der Rückseite des Haltestopfens 32 verbunden ist und zur Führung einer Vortriebsplatte 62 eingerichtet ist. Die Vortriebsplatte 62 wird über eine Spiralfeder 63 von dem Haltestopfen 32 getragen. Bei Ausübung einer Vortriebskraft auf die Vortriebsplatte 62 wird die Vortriebskraft teilweise von der Spiralfeder 63 aufgenommen, so dass die Kraft, mit der die Pipetteneinrichtung 10 auf dem Zellträger 70 aufgesetzt wird, entsprechend verringert wird. Vorteilhafterweise wird damit eine Beschädigung der Pipettenaustrittsöffnung der Pipettenspitze 11 oder des optional vorgesehenen Perfusionsringes vermieden.
Bei der in Figur 6 gezeigten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Pipetteneinrichtung 10 ist zusätzlich auf der Pipettenspitze 11 ein Perfusionsring 40 angeordnet ist. Der Perfusionsring 40 umfasst eine Ringwand 41 mit einem inneren HaI- terungsbereich 42, der über Stege 43 mit der Ringwand 41 verbunden ist. Der Perfusionsring 40 besteht z. B. aus Kunststoff. Die Pipettenspitze 11 ist in den Halterungsbereich 42 eingesteckt, wie es in DE 197 42 163 Al beschrieben ist. Optional kann bei der Ausführungsform gemäß Figur 6 die Schwingungseinrichtung 20' derart angeordnet sein, dass das Schwingelement 22' außerhalb der Pipettenspitze 11 im Perfusionsring 40 angeordnet ist (gestrichelt gezeigt) . Hierzu wird die Schwingungseinrichtung 20' am Perfusionsring 40 befestigt oder mit einer zusätzlichen Stelleinrichtung (nicht dargestellt) als separates, von den übrigen Teilen der Pipetteneinrichtung 10 getrenntes Bauteil in den Perfusionsring 40 eingeführt. Gemäß einer weiteren Variante (nicht dargestellt) kann die Schwingungseinrichtung derart angeordnet sein, dass das Schwingelement in direktem mechanischen Kontakt mit der Wand der Pipettenspitze 11 steht.
Figur 7 illustriert eine bevorzugte Ausführungsform der er- findungsgemäßen Manipulationseinrichtung 100, welche die Pipetteneinrichtung 10, die Positioniereinrichtung 200 und optional die Kameraeinrichtung 300 umfasst. Die in Figur 7 beispielhaft in Verbindung mit der Manipulationseinrichtung 100 gezeigte Pipetteneinrichtung 10 umfasst die Pipettenspitze 11 und das Pipettenrohr 13, das im Bereich des konischen Ansatzes 17 kompakt gebildet ist und eine axiale Durchgangsöffnung 18 zur Aufnahme des Schwingelements 22 und eine radiale Durchgangsöffnung 19 zur Zuführung von Flüssigkeit von der Dosiereinrichtung 50 aufweist. Durch den kompakten Aufbau des Pipettenrohrs 13 im Bereich des konischen Ansatzes 17 wird vorteilhafterweise das Totvolumen weiter vermindert. Die Schwingungseinrichtung 20 umfasst die Schwingungsquelle 21, die mit Halteringen 33 im Pipettenrohr 13 angebracht ist. Von der Schwingungsquelle 21 ragt das stiftförmige Schwingelement 22 durch die axiale Durchgangsöffnung 19 bis in die Pipettenspitze 11. Die Schwingungsübertragung auf das Pipettenrohr 13 wird durch ein Dämpfungselement, z. B. die Halteringe 33, die insbesondere aus Gummi bestehen, eingeschränkt. Die Pipetteneinrichtung 10 gemäß Figur 7 umfasst zum Beispiel die folgenden Maße: axiale Länge a der Pipettenspitze 11: 35 bis 40 mm, Abstand b der Spitze des Schwingelements 22 von der Pipettenaustrittsöffnung 16: 25 bis 30 mm, und Abstand c der Pipettenaustrittsöffnung 16 vom Zellträger 70 (Betriebsposition zur Manipulation biologischer Zellen): 0,5 bis 1 mm.
Die Positioniereinrichtung 200 umfasst einen Träger, mit dem die Pipetteneinrichtung 10 relativ zum Zellkulturträger 70 verstellbar ist. Des weiteren kann die Positioniereinrichtung 200 einen Vortrieb für die Dosiereinrichtung 50 enthalten. Die Komponenten 200, 300 und 50 können mit einer gemeinsamen Steuereinrichtung (nicht dargestellt) gesteuert werden.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

ANSPRÜCHE
1. Pipetteneinrichtung (10), umfassend:
- eine Pipettenspitze (11) ,
- ein Pipettenrohr (13) , und
- eine Schwingungseinrichtung (20) , die zur Erzeugung von ei- ner Schwingung eingerichtet ist und eine Schwingungsquelle
(21) und ein Schwingelement (22) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass
- die Schwingungsquelle (21) an der Pipetteneinrichtung (10) befestigt und mit dieser beweglich ist, und - das Schwingelement (22) im Pipettenrohr (13), in der Pipettenspitze (11) und/oder in einem an der Pipettenspitze (11) vorgesehenen Perfusionsring (40) angeordnet ist.
2. Pipetteneinrichtung nach Anspruch 1, bei welcher die Schwingungsquelle (21) am Pipettenrohr (13), an der Pipettenspitze (11) oder dem Perfusionsring (40) befestigt ist.
3. Pipetteneinrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei der das Schwingelement (22) in der Pipettenspitze (11) angeordnet ist, ohne aus der Pipettenspitze (11) herauszuragen.
4. Pipetteneinrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welcher die Schwingungsquelle (21) und/oder das Schwingelement (22) mit einer Kopplungseinrich- tung (12) verbunden ist, über welche die Pipettenspitze (11) mit dem Pipettenrohr (13) verbunden ist.
5. Pipetteneinrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welcher die Schwingungsquelle (21) und/oder das Schwingelement (22) mit einer Halteeinrichtung (30) verbunden ist, die im Pipettenrohr (13) angeordnet ist.
6. Pipetteneinrichtung nach Anspruch 5, bei der die Halteinrichtung (30) mindestens eines der im Pipettenrohr (13) angeordneten Teile aufweist, die einen Haltestab (31), einen Haltestopfen (32) und einen Haltering (33) umfassen.
7. Pipetteneinrichtung nach Anspruch 6, bei welcher der Haltestopfen (32) durch mindestens einen Haltering (33) im Pipettenrohr (13) fixiert ist.
8. Pipetteneinrichtung nach Anspruch 6 oder 7, bei welcher der Haltestab (31) an dem Haltestopfen (32) im Pipettenrohr (13) fixiert ist.
9. Pipetteneinrichtung nach mindestens einem der vorherge- henden Ansprüche, bei welcher die Schwingungsquelle (21) in
Bezug auf das Pipettenrohr (13) schwingungsgedämpft angeordnet ist.
10. Pipetteneinrichtung nach mindestens einem der vorherge- henden Ansprüche, bei der die Pipetteneinrichtung (10) eine
Innenform aufweist, die für eine gerichtete Leitung der Schwingungen von dem Schwingelement (22) zu der Pipettenspitze (11) eingerichtet ist.
11. Pipetteneinrichtung nach Anspruch 10, bei der das Pipettenrohr (13) einen konischen Ansatz (17) aufweist, der zur Aufnahme der Pipettenspitze (11) eingerichtet ist.
12. Pipetteneinrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Schwingungseinrichtung (20) eine Fokussiereinrichtung (24) enthält, die zur Fokussierung der Schwingung eingerichtet ist.
13. Pipetteneinrichtung nach Anspruch 12, bei der die Fokussiereinrichtung (24) einen parabolisch oder kugelförmig gebildeten Oberflächenbereich des Schwingelements umfasst.
14. Pipetteneinrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welcher der Perfusionsring (40) an der Pipettenspitze (11) lösbar befestigt ist.
15. Pipetteneinrichtung nach Anspruch 14, bei welcher der Perfusionsring (40) eine innere Spitzenaufnahme (42) aufweist, in welche die Pipettenspitze (11) kraftschlüssig einsteckbar ist.
16. Pipetteneinrichtung nach Anspruch 14 oder 15, bei der das Schwingelement (22) außerhalb der Pipettenspitze (11) im
Perfusionsring (40) angeordnet ist.
17. Pipetteneinrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der die Pipettenspitze (11) eine Pipet- tenaustrittsöffnung (14) mit einer seitlichen Öffnung (15) und/oder mit einer relativ zu einer Längsausdehnung der Pipettenspitze (11) schrägen Randkante (16) aufweist.
18. Pipetteneinrichtung nach mindestens einem der vorherge- henden Ansprüche, bei der die Schwingungseinrichtung (20) eine Ultraschallquelle umfasst.
19. Pipetteneinrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, die eine Federeinrichtung (60) aufweist, die zur Einstellung einer Aufsetzkraft der Pipetteneinrichtung (100) auf einem Zellträger (70) eingerichtet ist.
20. Pipetteneinrichtung nach mindestens einem der vorherge- henden Ansprüche, die mit einer Dosiereinrichtung (50) ausgestattet ist.
21. Pipetteneinrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, die eine physiologische Salzlösung, eine Flüssigkeit mit mindestens einem Enzym und/oder eine Flüssigkeit mit mindestens einem Schallkontrastmittel enthält.
22. Manipulationseinrichtung (100), die zur Manipulation mindestens einer biologischen Zelle (1) eingerichtet ist, um- fassend:
- eine Pipetteneinrichtung (10) nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, und
- eine Positioniereinrichtung (200) , die zur Einstellung einer Position der Pipetteneinrichtung (10) relativ zu einem Zellträger (70) eingerichtet ist.
23. Manipulationseinrichtung (100) nach Anspruch 22, die eine Kameraeinrichtung (300) aufweist, die zur Bildaufnahme der Pipetteneinrichtung (10) und des Zellträgers (70) eingerich- tet ist.
24. Verfahren zur Manipulation mindestens einer biologischen Zelle (1), die in einer Flüssigkeit auf einem Zellträger (70) angeordnet ist, mit dem Schritt: - Behandlung der Zelle (1) unter der Wirkung einer Schwingung in der Flüssigkeit, die mit einer Pipetteneinrichtung (10) nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche in einem lokal begrenzten Teilbereich der Flüssigkeit erzeugt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem die Behandlung der Zelle (1) eine Einführung mindestens einer Wirkkomponente in die Zelle und/oder eine Ablösung der Zelle (1) vom Zellträger (70) umfasst.
26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem ein Schallkontrastmittel als Wirkkomponente in die Zelle (1) eingeführt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem ein mit einer Wirk- Substanz beladenes Schallkontrastmittel als Wirkkomponente in die Zelle (1) eingeführt wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem ein mit biologischen Makromolekülen beladenes Schallkontrastmittel als Wirkkompo- nente in die Zelle (1) eingeführt wird.
29. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 24 bis 28, bei dem die Einführung der mindestens einen Wirkkomponente eine Perforation der Zelle (1) unter Wirkung der Schwingung und eine Einführung mindestens einer Wirksubstanz aus der Flüssigkeit in die Zelle (1) umfasst.
30. Verfahren nach Anspruch 29, bei dem die Perforation durch eine Kavitation von Gasblasen auf einer Oberfläche der Zelle (1) unter der Wirkung der Schwingung ausgelöst wird.
31. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem die Ablösung der Zelle vom Zellträger (70) berührungslos erfolgt.
32. Verfahren nach Anspruch 31, bei dem die Ablösung der Zelle vom Zellträger (70) durch den Zusatz eines Enzyms in die Flüssigkeit gefördert wird.
33. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 25 und 31 bis 32, mit dem Schritt:
- Aufnahme der Zelle nach der Ablösung mit der Pipetteneinrichtung (10) .
34. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 24 bis 33, bei dem die Schwingung mit der auf den Zellträger (70) aufgesetzten Pipettenspitze (11) lokal begrenzt in die Flüssigkeit geleitet wird.
35. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 24 bis 33, bei dem die Schwingung durch den Perfusionsring (30), der die Pipettenspitze (11) umgibt, in der Flüssigkeit lokal begrenzt wird.
36. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 24 bis 35, bei dem die Schwingung mit der auf den Zellträger (40) aufgesetzten Pipettenspitze (11) direkt auf die Zellen geleitet wird.
37. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 24 bis 36, bei dem die Schwingung in der Pipetteneinrichtung (10) entlang einer Innenform der Pipetteneinrichtung (10) gerichtet zu einem freien Ende der Pipettenspitze (11) geleitet wird.
38. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 24 bis 37, bei dem die Schwingung mindestens eine Ultraschallschwingung umfasst .
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